WO2006084490A1 - Makroporöses kunststoffperlenmaterial - Google Patents

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WO2006084490A1
WO2006084490A1 PCT/EP2005/011907 EP2005011907W WO2006084490A1 WO 2006084490 A1 WO2006084490 A1 WO 2006084490A1 EP 2005011907 W EP2005011907 W EP 2005011907W WO 2006084490 A1 WO2006084490 A1 WO 2006084490A1
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plastic bead
bead material
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polymerizable monomers
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PCT/EP2005/011907
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Stefan Menzler
Christian Meier
Roger Recktenwald
Sabine Schwarz-Barac
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Röhm Gmbh
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    • C08F222/385—Monomers containing two or more (meth)acrylamide groups, e.g. N,N'-methylenebisacrylamide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer

Definitions

  • the invention relates to a macroporous plastic bead material.
  • the plastic bead material is a crosslinked copolymer of hydrophilic, vinylic polymerizable monomers and bond active against ligands with nucleophilic groups.
  • the invention further relates to a process for the preparation of the macroporous plastic bead material by inverse suspension polymerization of a monomer phase, as well as its uses.
  • Porous polymeric support materials for proteins, in particular enzymes are well known.
  • Application areas are in the medical field, eg. B. in the enzymatic cleavage of ß-lactam antibiotics such as penicillin G to 6-aminopenicillan acid (6-APA) by means of penicillin acylase (penicillin amidase).
  • ß-lactam antibiotics such as penicillin G to 6-aminopenicillan acid (6-APA) by means of penicillin acylase (penicillin amidase).
  • penicillin acylase penicillin amidase
  • DE-OS 22 37 316 describes a process for the preparation of peripiform crosslinked copolymers by free-radical polymerization of a radical-forming initiator-containing monomer mixture containing a biologically active substances binding monomer, a crosslinking comonomer and at least one other comonomer, wherein the monomer mixture in a nonpolar organic Liquid is suspended to droplets and polymerized.
  • Suitable as non-polar organic liquid in particular aliphatic hydrocarbons, especially those having 6 or more carbon atoms.
  • the examples use mixtures of n-heptane and perchlorethylene.
  • the ratio of the monomer phase to the continuous organic phase may be between 1: 1 and 1:10, but ratios between 1: 1, 5 and 1: 4 are preferred.
  • DE-A 31 06 456 describes a comparison with DE-OS 22 37 316 improved in relation to the binding capacity of the polymer beads method.
  • Particularly high binding capacities for proteins, in particular for the enzyme penicillin acylase (penicillin amidase) are obtained when the carrier polymers have high contents of crosslinking monomers and when the monomer phase, formed from the monomers and the diluent, contains a solvent mixture as diluent. Suitable mixtures may, for. B be water / methanol or formamide / methanol. Monomers and diluents are approximately in the ratio of 1: 2.6.
  • a mixture of n-hexane and perchlorethylene is used for the organic, continuous phase.
  • the ratio of the monomer phase to the continuous organic phase is approximately 1: 2.8 in the examples.
  • carrier polymers with a binding capacity, measured as penicillin acylase activity, of up to 125 U / g can be obtained.
  • the carrier polymer material is characterized inter alia by a binding capacity for penicillin amidase of at least 220 [U / g wet] and at the same time a low swelling number of at most 1.5.
  • EP 1 352 957 A1 describes binding active carrier materials containing epoxide groups for the immobilization of enzymes.
  • the described support material has the advantage that enzymes can be covalently bonded even at low ionic strengths.
  • the functionality is achieved in a process in which, in the case of carrier bead materials having epoxide groups on the surface, part of the epoxide groups are subsequently reacted with various reagents. This results in additional amino groups, which favor the binding of the enzymes at low ionic strengths in the surrounding medium.
  • the disadvantages include u.a.
  • the biomacromolecules to be immobilized may be partially affected or denatured by a high salt content.
  • EP 1 352 957 A1 proposes a solution to this problem by reacting some of the epoxide groups subsequently with different reagents, starting from carrier bead materials having epoxide groups on the surface. This results in additional amino groups, which favor the binding of the enzymes at low ionic strengths in the surrounding medium. This process has the disadvantage that it is expensive and thereby makes the production of the carrier polymer materials more expensive.
  • a macroporous plastic bead material should be provided, which enables a covalent binding of biomacromolecules at comparatively low ionic strength.
  • a complex subsequent modification as described in EP 1 352 957 A1, should be avoided.
  • the swelling number should have an acceptable value of not higher than 2.5.
  • macroporous plastic bead material having an average particle diameter of 10 to 1000 ⁇ m radically polymerized from the following monomer types
  • hydrophilic monomers are meant those monomers which form at room temperature at least 10% aqueous solutions and preferably contain no ionic or ionizable by acid or base addition groups.
  • the monomers a), b), c) and d) add up to 100 wt .-%.
  • the monomers a) are 5 to 40, preferably 5 to 20, in particular 6 to 10,% by weight of hydrophilic free-radically polymerizable monomers having a vinyl group which form at room temperature at least 10% aqueous solutions.
  • Monomers a) are not vinylically polymerizable monomers having a quaternary amino group. The monomers a) are therefore always different from the monomers d).
  • monomers a in particular acrylamide and / or methacrylamide are suitable, with methacrylamide being preferred.
  • hydroxyalkyl esters of unsaturated polymerizable carboxylic acids such as hydroxyethyl acrylate and hydroxyethyl methacrylate or N-vinylpyrrolidone.
  • Monomers b) are 5 to 50, preferably 32 to 40,% by weight of free-radically polymerizable monomers having a vinyl group and an additional functional group, preferably an oxirane group (epoxy group), which can form covalent bonds in a polymer-analogous reaction with the nucleophilic groups of the ligands ,
  • oxirane groups are suitable for binding ligands while maintaining their biological activity.
  • Preferred monomers b) are glycidyl methacrylate and / or allyl glycidyl ether. Both monomers are particularly preferably simultaneously used in approximately equal amounts, so that they together give a proportion of 30-50, preferably 32-40 wt .-%.
  • Monomers c) are 20-60, in particular 25-55, particularly preferably 40-55 wt .-% hydrophilic, crosslinking radically polymerizable monomers having two or more ethylenically unsaturated polymerizable groups.
  • Preferred monomers c) are N, N 'methylene-bis-acrylamide or N, N' - methylene-bis-methacrylamide. NN 'methylene-bis-methacrylamide is particularly preferred.
  • Suitable are hydrophilic di (meth) acrylates, such as.
  • Monomers d) are 1 to 20, preferably 5 to 15, in particular 8 to 12 wt .-% vinylic polymerizable monomers having a quaternary amino group, preferably alkyl (meth) acrylate monomers having a quaternary amino group in the alkyl radical.
  • Monomers d) are preferably trimethylammoniumethyl methacrylate or trimethylammoniumethyl methacrylate chloride.
  • the macroporous plastic bead material is preferably a copolymer of the following monomers:
  • a particularly preferred composition is where the proportions of the five stated monomers of the monomer types a), b), c) and d) add up to 100% by weight:
  • the invention thus relates to a
  • a), b) c) and d) add up to 100 wt .-% and the ratio of the monomers to the diluent 1: 1, 5 to 1: 2.5, preferably 1: 1, 7 to 1 Is 2.3, and the diluent used is a mixture of methanol and water in the ratio 1: 1, 0 to 1: 4.0, the monomer phase being in a continuous phase of an organic solvent of an aliphatic hydrocarbon having 5 to 7 Carbon atoms is distributed to droplets, wherein the ratio of monomer phase to continuous phase
  • the monomer phase consists of the monomers a), b), c) and d), which are dissolved in a diluent, which must be a mixture of methanol and water in the ratio 1: 1, 0 to 1: 4.0.
  • a diluent which must be a mixture of methanol and water in the ratio 1: 1, 0 to 1: 4.0.
  • Particularly favorable mixing ratios for methanol and water are 1: 1, 2 to 1: 2.5, in particular 1: 1, 3 to 1: 1, 7.
  • ratio of monomers to diluents This must be in the range from 1: 1, 5 to 1: 2.5, preferably 1: 1, 7 to 1: 2.3, particularly preferably in the range of 1, 9 to 2.1.
  • an organic solvent which is an aliphatic hydrocarbon having 4 to 7 carbon atoms is suitable. Preference is given to n-heptane and particularly preferably cyclohexane.
  • the ratio of the monomer phase to the continuous phase formed by the organic solvent must be 1: 1.5 to 1: 4.0, preferably 1: 2.0 to 1: 3.0.
  • Other Anlagensbedinqunqen
  • the suspended monomer phase contains in a conventional manner polymerization initiators, preference is given to sulfur-free initiators, particular preference is given to 4,4 * azobis (4-valeric acid), as well as protective colloids (emulsifiers), such as.
  • B a copolymer of 95 parts of n-butyl methacrylate and 5 parts of 2-trimethylammoniumethlyl methacrylate chloride having molecular weights (weight average) in the range of 30,000 to 80,000.
  • the perl polymerization (also referred to as suspension polymerization) is otherwise carried out in a known manner by z. B.
  • the continuous phase is presented with the protective colloid and the monomer phase, in which the initiator is, with stirring z. B. at 40 to 60 0 C in the organic phase and then heated to 60 - 70 0 C.
  • the water / methanol mixture may, for. B. are removed almost completely azeotropically over a period of 6 hours.
  • the batch is allowed to finish for about 3 to 5 hours and then cooled to room temperature.
  • the resulting beads are sucked off and z. B. dried for 12 hours in vacuo.
  • the bead polymers can also be filtered off and washed with water and then used moist or dried.
  • the drying is preferably carried out in a fluidized-bed dryer, since in this way solvent residues can be removed particularly effectively.
  • An important application of the carrier polymer material according to the invention is the cleavage of penicillin G to 6-aminopenicillan-acid (6-APA) by means of bound penicillin amidase from E. coli.
  • the binding capacity is understood as meaning that enzymatic activity which can be achieved with maximum loading of the carrier polymer material with a specific enzyme.
  • the binding capacity is expressed as penicillin amidase activity in units per g of carrier polymer beads [U / g wet].
  • the binding capacity of the carrier polymer beads according to the invention is at least 200 [U / g wet] in this measurement method.
  • the macroporous bead plastic material of the invention has a binding capacity for penicillin amidase from E. coli of at least 200 [U / g wet], resulting from the reaction of 1530 units (units) of penicillin amidase with 1 g of carrier polymer material, in the presence of a salt concentration of at most 0.1 at most 0.05 [mol / l], on.
  • the salt concentration is calculated from the salt optionally present in the enzyme solution and the immobilized salt or buffer salt in the immobilization mixture.
  • carrier polymer material 1 g is added to 1530 units of penicillin amidase in 5 ml of sterile potassium phosphate buffer pH 7.5 and incubated for 48 hours at 23 0 C.
  • the polymer beads are then placed on a sintered glass frit (porosity 2 or 3) and washed twice with deionized water and then twice with 0.1 M potassium phosphate buffer pH 7.5 containing 0.05% ethyl 4-hydroxybenzoate Absauggen washed on the frit. The wet weight of the resulting penicillin-acylase loaded beads is determined.
  • the polymer beads are obtained as in a) via a glass frit by means of suction through 20 ml of deionized water.
  • Binding capacity is reported as penicillin amidase units per g of wet carrier polymer material (U / g wet). One unit corresponds to one ⁇ mole of hydrolyzed penicillin G per minute ( ⁇ mol / min);
  • 1 l of 0.5M NaOH is equivalent to 500 ⁇ mol of hydrolyzed penicillin G. (The water content of the carrier polymer material is approximately constant and can therefore be neglected.)
  • PcA units used PcA per g of polymer carrier dry matter Pavliere
  • the swellability of the polymer beads in water is expressed by the swelling number [ml wet / ml dry].
  • the macroporous plastic bead material according to the invention has a swelling index in water of greater than 1.5 to 2.5, preferably from 1.7 to 2.3.
  • the swelling number is thus higher than in the case of the plastic bead material according to DE 198 04 518 C2 ( ⁇ 1, 5) and lower than in the case of the plastic bead material according to DE 34 04 021 A1 (about 3.0).
  • the carrier polymer materials of this invention can be used to covalently bond ligands using the existing oxirane groups in stirred or flow-through reactors. This can be z. B. by addition of proteins, in particular enzymes, from concentrated solutions covalent bonding while maintaining their biological activity. Furthermore, peptides, amino acids, ß-lactam antibiotics, lipids, nucleotides, polynucleotides, low molecular weight nucleophilic compounds or metalloraganische compounds with the oxirane groups of the carrier beads can be implemented.
  • the polymer beads loaded with ligands can be prepared in a manner known per se for the stereospecific synthesis of chiral substances, such as amino acids (D-phenylalanine, p-hydroxy-D-phenylalanine, L-tert-leucine) or medicaments, for.
  • ibuprofen used. They are also used as carriers in the enzymatic cleavage of penicillin G to 6-aminopenicillinic acid (6-APA), cephalosporin G to 7-aminodesacetoxycephalosporanic acid (7-ADCA) or cephalosporin C to 7-aminocephalosporanic acid (7-ACA). The method is described in DECHEMA Annual Meeting 1996 - Abstracts, Vol. 1, DECHEMA eV.
  • polymer beads can also be used in the separation technique for adsorption chromatography or gel permeation chromatography. For specific adsorption, the polymer beads may be loaded with immunoglobulin fractions from antisera or with monoclonal antibody.
  • a further field of use is the use of the carrier polymer material loaded with enzymes or antibodies as an adsorbent in extracorporeal therapy, in which pathogenic or toxic substances are removed from whole blood.
  • the macroporous plastic bead material according to the invention can be used in particular:
  • the macroporous plastic bead material of the present invention because of the vinylic polymerizable monomers having a quaternary amino group, enables the physical adsorption of ligands, e.g. B enzymes, via ionic interactions independent of the pH of the immobilization mixture.
  • ligands e.g. B enzymes
  • the preparation of the plastic bead material is possible in one step without post-treatments of the polymer.
  • ligands can be covalently bound in good yield even at extremely low salt content in a manner similar to that of the material EP 1 352 957 A1.
  • the swelling number of the plastic bead material is in acceptable ranges. Examples
  • carrier polymer material 1 g is added to 1530 units of penicillin amidase in 5 ml of sterile potassium phosphate buffer pH 7.5 and incubated for 48 hours at 23 0 C.
  • the polymer beads are then placed on a sintered glass frit (porosity 2 or 3) and washed twice with deionized water and then twice with 0.1 M potassium phosphate buffer pH 7.5 containing 0.05% ethyl 4-hydroxybenzoate Absauggen washed on the frit. The wet weight of the resulting penicillin-acylase loaded beads is determined. b) Determination of the binding capacity
  • the polymer beads are obtained as in a) via a glass frit by means of suction through 20 ml of deionized water.
  • Binding capacity is reported as penicillin amidase units per g of wet carrier polymer material (U / g wet). One unit corresponds to one ⁇ mole of hydrolyzed penicillin G per minute ( ⁇ mol / min);
  • PcA units used PcA per g of polymer carrier dry matter

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Makroporöses Kunststoffperlenmaterial mit einem mittleren Teilchendurchmesser von 10 bis 1000 pm, radikalisch polymerisiert aus den folgenden Monomer-Typen a) 5 - 40 Gew.-% vinylisch polymerisierbaren Monomeren mit einer Wasserlöslichkeit von mindestens 1 bei 20 °C, das kein vinylisch polymerisierbaren Monomermit einer quaternären Aminogruppe ist, b) 5 - 50 Gew.-% vinylisch polymerisierbaren Monomeren mit einer zusätzlichen funktionellen Gruppe, die in einer Reaktion mit nucleophilen Gruppen von Liganden kovalente Bindungen eingehen kann, c) 20 - 60 Gew.-% hydrophilen, vernetzenden radikalisch polymerisierbaren Monomeren mit zwei oder mehr ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Gruppen, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich d) 1 bis 20 Gew.-% eines vinylisch polymerisierbaren Monomeren mit einer quaternären Aminogruppe für das Polymerisat eingesetzt werden. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung des makroporösen Kunststoffperlenmaterials durch inverse Suspensionspolymerisation einer Monomerenphase, sowie dessen Verwendungen.

Description

Makroporöses Kunststoffperlenmaterial
Die Erfindung betrifft ein makroporöses Kunststoffperlenmaterial. Das Kunststoffperlenmaterial ist ein vernetztes Mischpolymerisat aus hydrophilen, vinylisch polymerisierbaren Monomeren und bindungsaktiv gegenüber Liganden mit nucleophilen Gruppen. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung des makroporöses Kunststoffperlenmaterials durch inverse Suspensionspolymerisation einer Monomerenphase, sowie dessen Verwendungen.
Stand der Technik
Poröse polymere Trägermaterialien für Proteine, insbesondere Enzyme sind hinreichend bekannt. Anwendungsgebiete liegen im medizinischen Bereich, z. B. bei der enzymatischen Spaltung von ß-Lactamantibiotika wie Penicillin G zu 6-Aminopenicillan-Säure (6-APA) mittels der Penicillin-Acylase (Penicillinamidase). Wichtige Entwicklungsziele sind vor allem eine möglichst hohe Beladungskapazität, aber auch eine niedrige Quellbarkeit sowie möglichst geringe Restlösemittelgehalte. Halogenierte Lösungsmittel sollen bei der Herstellung grundsätzlich vermieden werden.
DE-OS 22 37 316 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung periförmiger, vernetzter Mischpolymerisate durch radikalische Polymerisation eines einen radikalbildenden Initiator enthaltenden Monomergemisches, das ein gegenüber biologischen Substanzen bindungsaktives Monomer, ein vernetzendes Comonomer und wenigstens ein weiteres Comonomer enthält, wobei das Monomerengemisch in einer unpolaren organischen Flüssigkeit zu Tröpfchen suspendiert und polymerisiert wird. Als unpolare organische Flüssigkeit eignen sich insbesondere aliphatische Kohlenwasserstoffe, vor allem solche mit 6 und mehr C-Atomen. In den Beispielen werden Mischungen aus n-Heptan und Perchlorethylen eingesetzt. Das Verhältnis der Monomerenphase zur kontinuierlichen organischen Phase kann zwischen 1 : 1 und 1 : 10 liegen, jedoch werden Verhältnisse zwischen 1 : 1 ,5 und 1 : 4 bevorzugt.
DE-A 31 06 456 beschreibt ein gegenüber DE-OS 22 37 316 in Bezug auf die Bindungskapazität der Polymerperlen verbessertes Verfahren. Besonders hohe Bindungskapazitäten für Proteine, insbesondere für das Enzym Penicillin- Acylase (Penicillinamidase) werden erhalten, wenn die Trägerpolymere hohe Gehalte an vernetzenden Monomeren aufweisen und wenn die Monomerenphase, gebildet aus den Monomeren und dem Verdünnungsmittel, ein Lösungsmittelgemisch als Verdünnungsmittel enthält. Geeignete Gemische können z. B Wasser/Methanol oder Formamid/Methanol sein. Monomere und Verdünnungsmittel liegen etwa im Verhältnis von 1 : 2,6 vor. Für die organische, kontinuierliche Phase wird ein Gemisch aus n-Hexan und Perchlorethylen verwendet. Das Verhältnis der Monomerenphase zur kontinuierlichen organischen Phase liegt in den Beispielen bei ca. 1 : 2,8. Bei Vernetzeranteilen von 50 Gew.-% im Monomerengemisch und der Verwendung von Wasser/Methanol als Verdünnungsmittel können Trägerpolymere mit einer Bindungskapazität, gemessen als Penicillinacylase-Aktivität, von bis zu 125 U/g erhalten werden.
DE 34 04 021 A1 beschreibt makroporöse Perlpolymerisate, bei denen im Gegensatz zur vorliegenden Erfindung nachträglich Epoxy-Gruppen eingeführt werden. Die u. a. beschriebene Beladung mit Penicillin-Acylase ist mit dem Verfahren der vorliegenden Anmeldung vergleichbar. Es werden relativ hohe Bindungskapazitäten am nutschenfeuchten Material erreicht. Betrachtet man den jeweils ebenfalls angegebenen Wert bezogen auf das Trockengewicht, so kann indirekt die Quellzahl errechnet werden (U/g feucht/ U/g trocken). Die dabei erhaltenen Werte liegen im Bereich von ca. 3,0.
DE 198 04 518 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von periförmigen Mischpolymerisaten auf Acrylatbasis, danach hergestellte Trägerpolymermaterialien und deren Verwendungen. Das Trägerpolymermaterial zeichnet sich unter anderem durch eine Bindungskapazität für Penicillinamidase von mindestens 220 [U/g feucht] und gleichzeitig eine niedrige Quellzahl von höchstens 1 ,5 aus.
EP 1 352 957 A1 beschreibt bindungsaktive Trägermaterialien, enthaltend Epoxidgruppen zur Immobilisierung von Enzymen. Das beschriebene Trägermaterial bietet den Vorteil, dass Enzyme schon bei niedrigen lonenstärken kovalent gebunden werden können. Die Funktionalität wird in einem Verfahren erreicht, bei dem bei Trägerperlenmaterialien mit Epoxidgruppen an der Oberfläche ein Teil der Epoxid-Gruppen nachträglich mit verschiedenen Reagenzien umgesetzt werden. Es entstehen so zusätzliche Aminogruppen, die die Bindung der Enzyme bei niedrigen lonenstärken im umgebenden Medium begünstigen.
Aufgabe und Lösung
DE 198 04 518 C2 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von periförmigen Mischpolymerisaten auf Acrylatbasis und danach hergestellte Trägerpolymermaterialien mit hervorragenden Eigenschaften, insbesondere hoher Bindungskapazität für Penicillinamidase und gleichzeitig niedriger Quellzahl. Ein Nachteil dieses Trägerpolymermaterials wird darin gesehen, dass die kovalente Bindung von Biomakromolekülen bei vergleichsweise hoher lonenstärke erfolgen muss.
Die Nachteile bestehen u.a. darin, dass die hierbei anfallenden Abwässer aufgrund des hohen Salzgehalts eine Belastung für die Umwelt darstellen. Auch können die zu immobilisierenden Biomakromoleküle teilweise durch einen hohen Salzgehalt in Mitleidenschaft gezogen bzw. denaturiert werden.
EP 1 352 957 A1 schlägt eine Lösung dieses Problems vor, indem ausgehend von Trägerperlenmaterialien mit Epoxidgruppen an der Oberfläche ein Teil der Epoxid-Gruppen nachträglich mit verschiedenen Reagenzien umgesetzt werden. Es entstehen so zusätzliche Aminogruppen, die die Bindung der Enzyme bei niedrigen lonenstärken im umgebenden Medium begünstigen. Dieses Verfahren hat den Nachteil, dass es aufwendig ist und dadurch die Herstellung der Trägerpolymermaterialien verteuert.
Ausgehend von der DE 198 04 518 sollte eine makroporöses Kunststoffperlenmaterial bereitgestellt werden, das eine kovalente Bindung von Biomakromolekülen bei vergleichsweise niedriger lonenstärke ermöglicht. Eine aufwendige nachträgliche Modifizierung, wie in der EP 1 352 957 A1 beschrieben, sollte dabei vermieden werden. Gleichzeitig soll die Quellzahl einen noch akzeptablen Wert von nicht höher als 2,5 aufweisen. Die Aufgabe wird gelöst durch ein
makroporöses Kunststoffperlenmaterial mit einem mittleren Teilchendurchmesser von 10 bis 1000 μm, radikalisch polymerisiert aus den folgenden Monomer-Typen
a) 5 - 40 Gew.-% vinylisch polymerisierbaren Monomeren mit einer Wasserlöslichkeit von mindestens 1 % bei 20 0C, die keine vinylisch polymerisierbaren Monomeren mit einer quaternären Aminogruppe sind,
b) 5 - 50 Gew.-% vinylisch polymerisierbaren Monomeren mit einer zusätzlichen funktionellen Gruppe, die in einer Reaktion mit nucleophilen Gruppen von Liganden kovalente Bindungen eingehen kann,
c) 20 - 60 Gew.-% hydrophilen, vernetzenden radikalisch polymerisierbaren Monomeren mit zwei oder mehr ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Gruppen,
dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich
d) 1 bis 20 Gew.-% eines vinylisch polymerisierbaren Monomeren mit einer quaternären Aminogruppe für das Polymerisat eingesetzt werden. Ausführung der Erfindung
Monomere
Um die Hydrophilie des Monomerengemischs zu gewährleisten, muß dieses zum überwiegenden Teil aus hydrophilen Monomeren bestehen. Unter hydrophilen Monomeren sind solche Monomere zu verstehen, die bei Raumtemperatur wenigstens 10 %-ige wäßrige Lösungen bilden und vorzugsweise keine ionischen oder durch Säure- oder Basenzusatz ionisierbaren Gruppen enthalten.
Die Monomere a), b), c) und d) addieren sich jeweils zu 100 Gew.-%.
Monomere a)
Die Monomere a) sind 5 - 40, bevorzugt 5 - 20, insbesondere 6 - 10 Gew.-% hydrophile radikalisch polymerisierbare Monomere mit einer Vinylgruppe, die bei Raumtemperatur wenigstens 10 %-ige wäßrige Lösungen bilden. Monomere a) sind keine vinylisch polymerisierbaren Monomere mit einer quaternären Aminogruppe. Die Monomere a) sind deshalb stets von den Monomeren d) verschieden.
Als Monomere a) sind insbesondere Acrylamid und/oder Methacrylamid geeignet, wobei Methacrylamid bevorzugt wird. Weitere Beispiele sind Hydroxyalkylester von ungesättigten polymerisierbaren Carbonsäuren, wie Hydroxyethylacrylat und Hydroxyethylmethacrylat oder N-Vinylpyrrolidon. Monomere b)
Monomere b) sind 5 - 50, bevorzugt 32 - 40 Gew.-% radikalisch polymerisierbare Monomere mit einer Vinylgruppe und einer zusätzlichen funktionellen Gruppe, bevorzugt einer Oxirangruppe (Epoxygruppe), die in einer polymeranalogen Reaktion mit den nucleophilen Gruppen der Liganden kovalente Bindungen eingehen kann. Insbesondere Oxirangruppen sind geeignet, um Liganden unter Erhaltung ihrer biologischen Aktivität zu binden.
Bevorzugte Monomere b) sind Glycidylmethacrylat und/oder Allylglycidylether. Besonders bevorzugt werden gleichzeitig beide Monomere in etwa gleichen Mengen eingesetzt, so dass sie zusammen einen Anteil von 30 - 50, bevorzugt 32 - 40 Gew.-% ergeben.
Monomere c)
Monomere c) sind 20 - 60, insbesondere 25 - 55, besonders bevorzugt 40 - 55 Gew.-% hydrophile, vernetzende radikalisch polymerisierbare Monomere mit zwei oder mehr ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Gruppen. Bevorzugte Monomere c) sind N,N'-Methylen-bis-Acrylamid oder N, N'- Methylen-bis-Methacrylamid. N.N'-Methylen-bis-Methacrylamid wird besonders bevorzugt. Gegebenenfalls können auch 0 - 10 Gew.-% weiterer vernetzender, radikalisch polymerisierbarer Monomere mit zwei oder mehr ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Gruppen eingesetzt werden. Geeignet sind hydrophile Di(meth)acrylate, wie z. B. Polyethyenoxid-Di(meth)acrylate. Monomere d)
Monomere d) sind 1 bis 20, bevorzugt 5 bis 15, insbesondere 8 bis 12 Gew.-% vinylisch polymerisierbaren Monomere mit einer quaternären Aminogruppe, bevorzugt Alkyl(meth)acrylat-Monomere mit einer quaternären Aminogruppe in Alkylrest. Monomere d) sind bevorzugt Trimethylammoniumethylmethacrylat bzw. Trimethylammoniumethylmethacrylat-Chlorid.
Bevorzugte Monomerzusammensetzungen
Das makroporöse Kunststoffperlenmaterial ist bevorzugt ein Mischpolymerisat aus den folgenden Monomeren:
a) Acrylamid und/oder Methacrylamid b) Glycidylmethacrylat und/oder Allylglycidylether c) N,N'-Methylen-bis-Acrylamid oder N,N'-Methylen-bis-Methacrylamid d) Trimethylammoniumethylmethacrylat bzw./oder Trimethylammoniumethylmethacrylat-Chlorid
Eine besonders bevorzugte Zusammensetzung ist, wobei sich die Anteile der fünf genannten Monomere der Monomeretypen a), b), c) und d) zu 100 Gew.-% addieren:
a) 6 bis 10 Gew.-% Methacrylamid b) 16 bis 20 Gew.-% Glycidylmethacrylat und 16 bis 20 Gew.-% Allylglycidylether c) 46 bis 50 Gew.-% N,N'-Methylen-bis-Methacrylamid d) 8 bis 12 Gew.-% Trimethylammoniumethylmethacrylat-Chlorid
Verfahren zur Herstellung des Mischpolymerisats
Das Verfahren entspricht weitgehend dem der DE 198 04 518 C2, mit der Maßgabe, dass das Monomere d) ein zwingend erforderlicher Bestandteil der Monomerenmischung ist.
Die Erfindung betrifft somit ein
Verfahren zur Herstellung eines periförmigen, vernetzten hydrophilen, gegenüber Liganden mit nucleophilen Gruppen bindungsaktiven Mischpolymerisats durch an sich bekannte inverse Perlpolymerisation einer Monomerenphase, die aus Monomeren und einem Verdünnungsmittel bestehen, wobei als Monomere
a) 5 bis 40 Gew.-% hydrophile radikalisch polymerisierbare Monomere mit einer Vinylgruppe, die bei Raumtemperatur wenigstens 10 %-ige wäßrige Lösungen bilden und die keine vinylisch polymerisierbaren Monomere mit einer quatemären Aminogruppe sind, b) 5 bis 50 Gew.-% radikalisch polymerisierbaren Monomere mit einer Vinylgruppe und einer zusätzlichen funktionellen Gruppe, die in einer polymeranalogen Reaktion mit den nucleophilen Gruppen der Liganden kovalente Bindungen eingehen kann und
c) 20 bis 60 Gew.-% hydrophile vernetzende radikalisch polymerisierbare Monomere mit zwei oder mehr ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Gruppen sowie
d) 1 bis 20 Gew.-% eines vinylisch polymerisierbaren Monomeren mit einer quaternären Aminogruppe für das Mischpoylmerisat enthalten sind,
mit der Maßgabe, daß sich a), b) c) und d) zu 100 Gew.-% addieren und das Verhältnis der Monomeren zum Verdünnungsmittel 1 : 1 ,5 bis 1 : 2,5, bevorzugt 1 : 1 ,7 bis 1 : 2,3, beträgt und als Verdünnungsmittel ein Gemisch aus Methanol und Wasser im Verhältnis 1 : 1 ,0 bis 1 : 4,0 verwendet wird, wobei die Monomerenphase in einer kontinuierlichen Phase aus einem organischen Lösungsmittel aus einem aliphatischen Kohlenwasserstoff mit 5 bis 7 Kohlenstoffatomen zu Tröpfchen verteilt ist, wobei das Verhältnis Monomerenphase zu kontinuierlicher Phase
1 : 1 ,5 bis 1 : 4,0, bevorzugt 1 : 2,0 bis 1 : 3,0, beträgt, und in dieser Form in Gegenwart eines Polymerisationsinitiators und eines Schutzkolloids radikalisch polymerisiert werden. Verdünnungsmittel
Die Monomerenphase besteht aus den Monomeren a), b), c) und d), die in einem Verdünnungsmittel, das ein Gemisch aus Methanol und Wasser im Verhältnis 1 : 1 ,0 bis 1 : 4,0 sein muß, gelöst sind. Besonders günstige Mischungsverhältnisse für Methanol und Wasser liegen bei 1 : 1 ,2 bis 1 : 2,5, insbesondere bei 1: 1 ,3 bis 1 : 1 ,7.
Verhältnis Monomere zu Verdünnungsmittel
Besonders kritisch ist das Verhältnis Monomere zu Verdünnungsmittel. Dieses muß im Bereich von 1 : 1 ,5 bis 1 : 2,5, bevorzugt 1 : 1 ,7 bis 1 : 2,3, besonders bevorzugt im Bereich von 1 ,9 bis 2,1 liegen.
Kontinuierliche Phase
Als kontinuierliche Phase eignet sich ein organisches Lösungsmittel, das ein aliphatischer Kohlenwasserstoff mit 4 bis 7 C-Atomen ist. Bevorzugt ist n- Heptan und besonders bevorzugt Cyclohexan.
Verhältnis Monomerenphase/kontinuierlicher Phase
Das Verhältnis von der Monomerenphase zur kontinuierlichen Phase, gebildet durch das organische Lösungsmittel muß bei 1 : 1 ,5 bis 1 : 4,0, bevorzugt 1 : 2,0 bis 1 : 3,0 liegen. Weitere Verfahrensbedinqunqen
Als weitere Bestandteile enthält die suspendierte Monomerphase in an sich bekannter Weise Polymerisations-Initiatoren, bevorzugt sind schwefelfreie Initiatoren, besonders bevorzugt ist 4,4*-Azobis-(4-Valeriansäure), sowie Schutzkolloide (Emulgatoren), wie z. B. ein Mischpolymerisat aus 95 Teilen n- Butylmethacrylat und 5 Teilen 2-Trimethylammoniumethlylmethacrylat-Chlorid mit Molekulargewichten (Gewichtsmittel) im Bereich von 30.000 bis 80.000.
Die Perl Polymerisation (auch als Suspensionspolymerisation bezeichnet) wird ansonsten in bekannter Weise ausgeführt, indem z. B. die kontinuierliche Phase mit dem Schutzkolloid vorgelegt wird und die Monomerenphase, in der sich auch der Initiator befindet, unter Rühren z. B. bei 40 bis 60 0C in der organischen Phase verteilt und anschließend auf 60 - 70 0C erhitzt wird. Das Wasser/Methanol-Gemisch kann z. B. über einen Zeitraum von 6 Stunden nahezu vollständig azeotrop ausgekreist werden. Man lässt den Ansatz für ca. 3 - 5 Stunden zu Ende reagieren und kühlt anschließend auf Raumtemperatur ab. Die entstandenen Perlen werden abgesaugt und z. B. für 12 Stunden im Vakuum getrocknet. Alternativ dazu können die Perlpolymerisate auch abfiltriert und mit Wasser gewaschen und dann wasserfeucht verwendet oder getrocknet werden. Bevorzugt wird die Trocknung in einem Wirbelschichttrockner vorgenommen, da sich auf diese Weise Lösungsmittelreste besonders effektiv entfernen lassen. Die erhaltenen Polymerperlen (= Trägerpolymermaterial) haben eine Größe im Bereich von 50 bis 500 μm, insbesondere von 120 bis 250 μm. Bindungskapazität
Ein wichtiges Anwendungsgebiet des erfindungsgemäßen Trägerpolymermaterials ist die Spaltung von Penicillin G zu 6-Aminopenicillan- Säure (6-APA) mittels gebundener Penicillinamidase aus E. coli.
Unter der Bindungskapazität wird diejenige enzymatische Aktivität verstanden, die sich bei maximaler Beladung des Trägerpolymermaterials mit einem bestimmten Enzym erreichen läßt. Die Bindungskapazität wird ausgedrückt als Penicillinamidase-Aktivität in Units pro g Trägerpolymerperlen [U/g feucht]. Die Bindungskapazität der erfindungsgemäßen Trägerpolymerperlen beträgt bei dieser Meßmethode mindestens 200 [U/g feucht].
Das erfindungsgemäße makroporöse Kunststoffperlenmaterial weist eine Bindungskapazität für Penicillinamidase aus E. coli von mindestens 200 [U/g feucht], resultierend aus der Umsetzung von 1530 Einheiten (Units) Penicillinamidase mit 1 g Trägerpolymermaterial, in Gegenwart einer Salzkonzentration von höchstens 0,1 , bevorzugt höchstens 0,05 [mol/l], auf. Die Salzkonzentration wird rechnerisch aus dem gegebenenfalls in der Enzymlösung vorhandenen Salz und dem zur Immobilisierung zugesetzten Salz oder Puffersalz in der Immobilisierungsmischung bestimmt. Methoden:
Bestimmung der Bindungskapazität für Penicillinamidase bei verschiedenen Salzkonzentrationen
Bestimmung der Bindungskapazität für Penicillinamidase ( = Penicillin G- Acylase) aus E. coli (EC 3.5.1.11)
a) Kovalente Bindung von Penicillinamidase an das Trägerpolymermaterial
1 g Trägerpolymermaterial werden zu 1530 Units Penicillinamidase in 5 ml sterilem Kalium-Phosphat-Puffer pH-Wert 7,5 gegeben und für 48 Stunden bei 23 0C inkubiert.
Anschließend werden die Polymerperlen auf eine Fritte aus gesintertem Glas (Porosität 2 oder 3) gegeben und zweimal mit entionisiertem Wasser und anschließend zweimal mit 0,1 M Kalium-Phosphatpuffer pH 7,5, enthaltend 0,05 % Ethyl-4-hydroxybenzoat, mittels Absaugens auf der Fritte gewaschen. Das Feuchtgewicht der erhaltenen, mit Penicillin-Acylase beladenen Perlen wird bestimmt.
b) Bestimmung der Bindungskapazität
400 - 700 mg feuchtes mit Penicillinamidase gekoppeltes Trägerpolymermaterial (Polymerperlen) werden in 30 ml einer 2 %-igen Penicillin-G-Lösung in 0,05 M Kalium-Phosphatpuffer pH-Wert 7,5, enthaltend 0,05 % Ethyl-4-hydroxybenzoat, bei 37 X gegeben. Unter gleichmäßiger Rührung erfolgt eine Titration frei gewordener Phenylessigsäure mit 0,5 M NaOH bei einem konstantem pH-Wert von 7.8 für die Dauer von 4 Minuten, wobei der Verbrauch an NaOH aufgezeichnet wird.
Anschließend werden die Polymerperlen wie unter a) über eine Glasfritte mittels Durchsaugen von 20 ml deionisiertem Wasser gewonnen.
c) Berechnung der Bindungskapazität
Der lineare Bereich der Meßkurven (üblicherweise der Bereich von 1 - 3 min) wird für die Berechnung zugrunde gelegt. Die Bindungskapazität wird als Penicillinamidase Einheiten pro g feuchten Trägerpolymermaterials (U/g feucht) angegeben. Eine Einheit entspricht einem μmol hydrolysiertem Penicillin G pro Minute (μmol/min);
1 I 0,5M NaOH ist dabei äquivalent zu 500 μmol hydrolysiertem Penicillin G. (Der Wassergehalt des Trägerpolymermaterials ist in etwa konstant und kann daher vernachlässigt werden.)
Bestimmung der Penicillinamidase-Bindungsausbeute in [%]
Die Berechung der Penicillinamidase(PcA)-Bindungsausbeute erfolgt gemäß der Formel
PcA-Bindungsausbeute [%] = A [U/g] x F[g] x 100 / PcA[U]
A = Immobilisierte Aktivität PcA/g feuchtem Immobilisat
F = Feuchtausbeute = Feuchtgewicht von 1g Polymerträger-Trockenmasse
PcA = eingesetzte Units PcA pro g Polymerträger-Trockenmasse Quellzahl
Die Quellbarkeit der Polymerperlen in Wasser wird ausgedrückt durch die Quellungszahl [ml feucht / ml trocken]. Das erfindungsgemäße makroporöse Kunststoffperlenmaterial weist eine Quellzahl in Wasser von größer 1 ,5 bis 2,5, bevorzugt von 1 ,7 bis 2,3 auf.
Die Quellzahl liegt somit höher als bei dem Kunststoffperlenmaterial gemäß der DE 198 04 518 C2 (< 1 ,5) und niedriger als bei dem Kunststoffperlenmaterial gemäß der DE 34 04 021 A1 (ca. 3,0).
Bestimmung der Quellzahl [ml feucht/ ml trocken]
1 g Polymerträger-Trockenmasse wird in einen 25 ml Messzylinder eingewogen. Die Füllhöhe in ml wird bestimmt (= Trockenvolumen). Der Messzylinder wird anschließend zu 2/3 mit 0,01 % wäßriger Polysorbat 80- Lösung gefüllt. Der Messzylinder wird 6-mal in 10 min Abständen geschüttelt. An der Wand hängende Perlen werden mit 5 ml wäßriger Polysorbat 80-Lösung zurückgespült. Nach 3 h wird das Feuchtvolumen der am Boden des Messzylinders abgesetzten Polymerträger-Feuchtmasse in ml abgelesen. Der Quotient aus Feuchtvolumen/Trockenvolumen ergibt die Quellzahl.
Verwendungen
Die erfindungsgemäßen Trägerpolymermaterialien können zur kovalenten Bindung von Liganden mittels der vorhandenen Oxirangruppen in Rühr- oder Durchflußreaktoren eingesetzt werden. Dies kann z. B. durch Anlagerung von Proteinen, insbesondere Enzymen, aus konzentrierten Lösungen über kovalente Bindung unter Beibehaltung ihrer biologischen Aktivität erfolgen. Weiterhin können auch Peptide, Aminosäuren, ß-Lactamantibiotika, Lipide, Nucleotide, Polynukleotide, niedermolekulare nucleophile Verbindungen oder metalloraganische Verbindungen mit den Oxirangruppen der Trägerperlen umgesetzt werden.
Die mit Liganden beladenen Polymerperlen können in an sich bekannter Weise zur stereospezifischen Synthese von chiralen Substanzen, wie Aminosäuren (D-Phenylalanin, p-Hydroxy-D-phenylalanin, L-tert.-Leucin) oder Arzneimitteln, z. B. von Ibuprofen, eingesetzt werden. Ebenso werden sie als Träger eingesetzt in der enzymatischen Spaltung von Penicillin G zu 6- Aminopenicillinansäure (6-APA) , Cephalosporin G zu 7- Aminodesacetoxycephalosporansäure (7-ADCA) oder Cephalosporin C zu 7- Aminocephalosporansäure (7-ACA) . Das Verfahren ist beschrieben in DECHEMA Jahrestagung 1996 - Kurzfassungen, Bd. 1 , DECHEMA e.V.. Weitere Anwendungsgebiete sind spezifische enzymatische Synthesen an Substraten wie z. B. obigen Spaltprodukten zu Amoxicillin und Ampicillin. Ein weiteres Anwendungsgebiet sind Synthesen von Feinchemikalien oder Grundprodukten für chemische Synthesen (z. B. Apfelsäure, Malat). Weitere Verwendungen sind die Hydrolyse von Lactose mit trägerfixierter ß- Galactosidase und die Zersetzung von Wasserstoffperoxid mit trägerfixierter Katalase. Die Polymerperlen können auch in der Separationstechnik zur Adsorptionchromatographie oder Gelpermeationschromatographie verwendet werden. Zur spezifischen Adsorption können die Polymerperlen mit Immunglobulin-Fraktionen aus Antiseren oder mit monoklonalen Antikörper beladen werden. Als weiteres Einsatzgebiet ist die Verwendung des mit Enzymen oder Antikörpern beladenen Trägerpolymermaterials als Adsorbens in der extrakorporalen Therapie, in der pathogene bzw. toxische Substanzen aus Vollblut entfernt werden, zu nennen. Das erfindungsgemäße makroporöse Kunststoffperlenmaterial kann insbesondere verwendet werden:
■ zur Bindung von Proteinen.
■ in der Chromatographie.
■ zur Synthese von Arzneistoffen.
■ zur stereospezifischen Synthese zur Gewinnung von enatiomerenreinen Substanzen.
■ zur Bindung von Enzymen.
■ zur Bindung von Antikörpern
Vorteilhafte Eigenschaften der Erfindung
Das erfindungsgemäße makroporösen Kunststoffperlenmaterial ermöglicht aufgrund der vinylisch polymerisierbaren Monomeren mit einer quatemären Aminogruppe die physikalische Adsorption von Liganden, z. B Enzymen, über ionische Wechselwirkungen unabhängig vom pH-Wert der Immobilisierungsmischung. Im Gegensatz zur EP 1 352 957 A1 ist die Herstellung des Kunststoffperlenmaterials in einem Schritt ohne Nachbehandlungen des Polymerisats möglich. Liganden können jedoch in ähnlicher Weise wie beim Material EP 1 352 957 A1 schon bei extrem niedrigen Salzgehalt mit guter Ausbeute kovalent gebunden werden. Trotz Einführung der hydrophilen vinylisch polymerisierbaren Monomeren mit einer quatemären Aminogruppe liegt die Quellzahl des Kunststoffperlenmaterials in akzeptablen Bereichen. Beispiele
Methoden:
Bestimmung der Bindungskapazität für Penicillinamidase bei verschiedenen Salzkonzentrationen
Bestimmung der Bindunqskapazität für Penicillinamidase ( = Penicillin G- Acylase) aus E. coli (EC 3.5.1.11 )
a) Kovalente Bindung von Penicillinamidase an das Trägerpolymermaterial
1 g Trägerpolymermaterial werden zu 1530 Units Penicillinamidase in 5 ml sterilem Kalium-Phosphat-Puffer pH-Wert 7,5 gegeben und für 48 Stunden bei 23 0C inkubiert.
Anschließend werden die Polymerperlen auf eine Fritte aus gesintertem Glas (Porosität 2 oder 3) gegeben und zweimal mit entionisiertem Wasser und anschließend zweimal mit 0,1 M Kalium-Phosphatpuffer pH 7,5, enthaltend 0,05 % Ethyl-4-hydroxybenzoat, mittels Absaugens auf der Fritte gewaschen. Das Feuchtgewicht der erhaltenen, mit Penicillin-Acylase beladenen Perlen wird bestimmt. b) Bestimmung der Bindungskapazität
400 - 700 mg feuchtes mit Penicillinamidase gekoppeltes Trägerpolymermaterial (Polymerperlen) werden in 30 ml einer 2 %-igen Penicillin-G-Lösung in 0,05 M Kalium-Phosphatpuffer pH-Wert 7,5, enthaltend 0,05 % Ethyl-4-hydroxybenzoat, bei 37 0C gegeben.
Unter gleichmäßiger Rührung erfolgt eine Titration frei gewordener Phenylessigsäure mit 0,5 M NaOH bei einem konstantem pH-Wert von 7.8 für die Dauer von 4 Minuten, wobei der Verbrauch an NaOH aufgezeichnet wird.
Anschließend werden die Polymerperlen wie unter a) über eine Glasfritte mittels Durchsaugen von 20 ml deionisiertem Wasser gewonnen.
c) Berechnung der Bindungskapazität
Der lineare Bereich der Meßkurven (üblicherweise der Bereich von 1 - 3 min) wird für die Berechnung zugrunde gelegt. Die Bindungskapazität wird als Penicillinamidase Einheiten pro g feuchten Trägerpolymermaterials (U/g feucht) angegeben. Eine Einheit entspricht einem μmol hydrolysiertem Penicillin G pro Minute (μmol/min);
1 I 0.5M NaOH ist dabei äquivalent zu 500 μmol hydrolysiertem Penicillin G. (Der Wassergehalt des Trägerpolymermaterials ist in etwa konstant und kann daher vernachlässigt werden.) Bestimmung der Penicillinamidase-Bindungsausbeute in [%]
Die Berechung der PenicillinamidaseCPcAJ-Bindungsausbeute erfolgt gemäß der Formel
PcA-Bindungsausbeute [%] = A [U/g] x F[g] x 100 / PcA[U]
A = Immobilisierte Aktivität PcA/g feuchtem lmmobilisat
F = Feuchtausbeute = Feuchtgewicht von 1g Polymerträger-Trockenmasse
PcA = eingesetzte Units PcA pro g Polymerträger-Trockenmasse
Bestimmung der Quellzahl [ml feucht/ ml trocken]
1 g Polymerträger-Trockenmasse wird in einen 25 ml Messzylinder eingewogen. Die Füllhöhe in ml wird bestimmt (= Trockenvolumen). Der Messzylinder wird anschließend zu 2/3 mit 0,01 % wäßriger Polysorbat 80- Lösung gefüllt. Der Messzylinder wird 6-mal in 10 min Abständen geschüttelt. An der Wand hängende Perlen werden mit 5 ml wäßriger Polysorbat 80-Lösung zurückgespült. Nach 3 h wird das Feuchtvolumen der am Boden des Messzylinders abgesetzten Polymerträger-Feuchtmasse in ml abgelesen. Der Quotient aus Feuchtvolumen/Trockenvolumen ergibt die Quellzahl.
Beispiele 1 bis 3
Übereinstimmende Versuchsbedinqunqen in den Beispielen 1 bis 3:
In einem 2 I Rührkolben mit Thermometer, Rückflußkühler, Stickstoffeinleitungsrohr werden ein organisches Lösungsmittel und 3 g eines Mischpolymerisats aus 95-Teilen n-Butylmethacrylat und 5 Teilen 2-Trimethylammoniumethlymethacrylat-Chlorid als Schutzkolloid vorgelegt. Unter Rühren und Durchleiten von Stickstoff wird bei 50 0C eine Monomerenphase bestehend aus Verdünnungsmittel, sowie 100 g der in Tabelle 1 angegebenen Monomermischung
sowie 2 g 4,4'-Azobis-4-cyanovaleriansäure (als Polymerisationsinitiator)
in der organischen Phase verteilt und anschließend zum Sieden bei 65 - 70 0C erhitzt. Der Ansatz wird für ca. 6 Stunden gerührt und anschließend auf Raumtemperatur abgekühlt. Die entstandenen Polymerperlen werden abgesaugt, gewaschen und im Wirbelschichttrockner getrocknet. Anschließend wird die Bindungskapazität für Penicillinamidase [U/g feucht] bei verschiedenen Salzkonzentrationen, die Bindungsausbeute und die Quellzahl [ml feucht/ml trocken] bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasst.
Tabelle 1
Figure imgf000024_0001
Tabelle 2
Figure imgf000025_0001

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Makroporöses Kunststoffperlenmaterial mit einem mittleren
Teilchendurchmesser von 10 bis 1000 μm, radikalisch polymerisiert aus den folgenden Monomer-Typen
a) 5 - 40 Gew.-% vinylisch polymerisierbaren Monomeren mit einer Wasserlöslichkeit von mindestens 1 % bei 20 0C, die keine vinylisch polymerisierbaren Monomere mit einer quaternären Aminogruppe sind,
b) 5 - 50 Gew.-% vinylisch polymerisierbaren Monomeren mit einer zusätzlichen funktionellen Gruppe, die in einer Reaktion mit nucleophilen Gruppen von Liganden kovalente Bindungen eingehen kann,
c) 20 - 60 Gew.-% hydrophilen, vernetzenden radikalisch polymerisierbaren Monomeren mit zwei oder mehr ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Gruppen,
dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich
d) 1 bis 20 Gew.-% eines vinylisch polymerisierbaren Monomeren mit einer quaternären Aminogruppe für das Polymerisat eingesetzt werden.
2. Makroporöses Kunststoffperlenmaterial nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass Monomere d) ein Alkyl(meth)acrylat mit einer quaternären Aminogruppe im Alkylrest ist, insbesondere Trimethylammoniumethylmethacrylat bzw. Trimethylammoniumethylmethacrylat-Chlorid.
3. Makroporöses Kunststoffperlenmaterial nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Quellzahl in Wasser von größer 1 ,5 bis 2,5 aufweist und eine Bindungskapazität für Penicillinamidase aus E. coli von mindestens 200 [U/g feucht], resultierend aus der Umsetzung von 1530 Einheiten Penicillinamidase mit 1 g Trägerpolymermaterial, in Gegenwart einer Salzkonzentration von höchstens 0,1 [mol/l], aufweist.
4. Makroporöses Kunststoffperlenmaterial nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Mischpolymerisat aus den folgenden Monomeren ist:
a) Acrylamid und/oder Methacrylamid b) Glycidylmethacrylat und/oder Allylglycidylether c) N,N'-Methylen-bis-Acrylamid oder N,N'-Methylen-bis-Methacrylamid d) Trimethylammoniumethylmethacrylat bzw. Trimethylammoniumethylmethacrylat-Chlorid
5. Makroporöses Kunststoffperlenmaterial nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Polymerisat aus den folgenden Monomeren ist, wobei sich die Bestandteile zu 100 Gew.-% addieren:
a) 6 bis 10 Gew.-% Methacrylamid b) 16 bis 20 Gew.-% Glycidylmethacrylat und 16 bis 20 Gew.-% Allylglycidylether c) 46 bis 50 Gew.-% N,N'-Methylen-bis-Methacrylamid d) 8 bis 12 Gew.-% Trimethylammoniumethylmethacrylat-Chlorid
6. Verfahren zur Herstellung eines periförmigen, vernetzten hydrophilen, gegenüber Liganden mit nucleophilen Gruppen bindungsaktiven Mischpolymerisats durch inverse Perlpolymerisation einer Monomerenphase, die aus Monomeren und einem Verdünnungsmittel bestehen, wobei als Monomere
a) 5 bis 40 Gew.-% hydrophile radikalisch polymerisierbare Monomere mit einer Vinylgruppe, die bei Raumtemperatur wenigstens 10 %-ige wäßrige Lösungen bilden und die keine vinylisch polymerisierbaren Monomere mit einer quaternären Aminogruppe sind,
b) 5 bis 50 Gew.-% radikalisch polymerisierbaren Monomere mit einer Vinylgruppe und einer zusätzlichen funktionellen Gruppe, die in einer polymeranalogen Reaktion mit den nucleophilen Gruppen der Liganden kovalente Bindungen eingehen kann und
c) 20 bis 60 Gew.-% hydrophile vernetzende radikalisch polymerisierbare Monomere mit zwei oder mehr ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Gruppen sowie
d) 1 bis 20 Gew.-% eines Alkylmethacrylat-Monomeren mit einer quaternären Aminogruppe in Alkylrest für das Mischpoylmerisat enthalten sind,
mit der Maßgabe, daß sich a), b) c) und d) zu 100 Gew.-% addieren und das Verhältnis der Monomeren zum Verdünnungsmittel 1 : 1 ,5 bis 1 : 2,5 beträgt und als Verdünnungsmittel ein Gemisch aus Methanol und Wasser im Verhältnis 1 : 1 ,0 bis 1 : 4,0 verwendet wird, wobei die Monomerenphase in einer kontinuierlichen Phase aus einem organischen Lösungsmittel aus einem aliphatischen Kohlenwasserstoff mit 5 bis 7 Kohlenstoffatomen zu Tröpfchen verteilt ist, wobei das Verhältnis Monomerenphase zu kontinuierlicher Phase 1 : 1 ,5 bis 1 : 4,0 beträgt, und in dieser Form in Gegenwart eines Polymerisationsinitiators und eines Schutzkolloids radikalisch polymerisiert werden.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Monomere
a) Acrylamid und/oder Methacrylamid b) Glycidylmethacrylat und/oder Allylglycidylether c) N.N'-Methylen-bis-Acrylamid oder N,N'-Methylen-bis-Methacrylamid d) Trimethylammoniumethylmethacrylat-Chlorid
eingesetzt werden.
8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß als organisches Lösungsmittel Cyclohexan verwendet wird.
9. Verwendung des Kunststoffperlenmaterials nach Anspruch 1 bis 5 zur Bindung von Proteinen.
10. Verwendung des Kunststoffperlenmaterials nach Anspruch 1 bis 5 in der Chromatographie.
11. Verwendung des Kunststoffperlenmaterials nach Anspruch 1 bis 5 zur Synthese von Arzneistoffen.
12. Verwendung des Kunststoffperlenmaterials nach Anspruch 1 bis 5 zur stereospezifischen Synthese zur Gewinnung von enatiomerenreinen Substanzen.
13. Verwendung des Kunststoffperlenmaterials nach Anspruch 1 bis 6 zur Bindung von Enzymen.
14. Verwendung des Kunststoffperlenmaterials nach Anspruch 1 bis 5 zur Bindung von Antikörpern
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