CZ20002843A3 - Opatření k přípravě nosičových polymerních materiálů ve formě porézních polymerních perliček - Google Patents

Abstract

Způsob přípravy perličkového, síťovaného hydrofílního, vůči ligandům s nukleoftlními skupinami vazebně aktivního směsného polymerizátu inverzní perličkovou polymerací monomerní fáze. Dále se týká nosičových polymerních materiálů s vysokou vazebnou kapacitou pro penicilinacylázu a nízkým číslem bobtnavosti jakož i jejich použití.

Description

OPATŘENÍ K PŘÍPRAVĚ NOSIČOVÝCH POLYMERNÍCH MATERIÁLŮ VE

FORMĚ PORÉZNÍCH POLYMERNÍCH PERLIČEK

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu přípravy perličkového, síťovaného hydrofilního, vůči ligandům s nukleofilními skupinami vazebně aktivního směsného polymerizátu inverzní suspenzní polymerací monomerní fáze. Vynález se dále týká nosičových polymerních materiálů s vysokou vazebnou kapacitou pro penicilinamidázu a nízkým číslem bobtnavosti jakož i jejich použití.

Dosavadní stav techniky

Porézní polymerní nosičové materiály pro proteiny, zejména enzymy, jsou dostatečně známy. Oblasti použití leží v lékařské oblasti, například při enzymatickém štěpení antibiotik s β-laktamovým kruhem jako penicilín G na kyselinu 6-aminopenicilanovou (6-APA) pomocí penicilinacylázy (penicilinamidázy). Důležité cíle vývoje jsou především pokud možno vysoká vazebná kapacita, avšak také nízká bobtnavost jakož i co možná nejmenší obsahy zbytkových rozpouštědel. Halogenová rozpouštědla by měla být při přípravě zásadně vyloučena.

DE-OS 22 37 316 popisuje způsob přípravy perličkového síťovaného směsného polymerizátu radikálovou polymerizací monomerní směsi obsahující radikál tvořící iniciátor, který obsahuje oproti biologickým substancím vazebně aktivní monomer, síťovaný komonomer a alespoň jeden další komonomer, přičemž tato směs monomerů je suspendována v nepolární organické kapalině na kapky a polymerizována. Jako nepolární ·· 4444 ·· ·· ·· «4 • · · · 4 · <«·· • 4 44 44 9 9 4 * n-heptanu a ke kontinuální organická kapalina se hodí zejména alifatické uhlovodíky, především takové, které mají osm a více C-atomů. V příkladech byly použity směsi perchlorethylenu. Poměr monomerní fáze organické fázi může ležet mezi 1:1 a 1:10, avšak přednost se dává poměrům mezi 1:1,5 a 1:4. DE-A 31 06 456 popisuje zlepšený postup oproti DE-OS 22 37 316 pokud jde o vazebnou kapacitu polymerních perliček. Zvláště se obdrží vysoké kapacity pro proteiny, obzvláště pro enzym (penicilinamidáza) , jestliže nosičové vysoké obsahy síťovaných monomerů a fáze, tvořená vazebné penicilin-acyláza polymery vykazují monomerní jestliže obsahuj e

Vhodné směsi mohou být například voda/methanol nebo formamid/methanol. Monomery a ředidla jsou v poměru přibližně 1:2,6. Pro organickou kontinuální fázi se používá směs n-hexanu a perchlorethylenu. Poměr monomerní fáze ke kontinuální organické fázi leží v příkladech u cca 1:2,8. U síťovaných podílů 50 % hmotn. v monomerní směsi a použití voda/methanol jako ředidla mohou být obdrženy nosičové polymery s vazebnou kapacitou, měřeno jako aktivita penicilin-acylázy, až do 125 IU/g.

směs rozpouštědel jako z monomeru zřeďovacího a ředidla, prostředku.

Podstata vynálezu

Úkolem vynálezu je poskytnout zlepšený způsob přípravy perličkových síťovaných směsných polymerizátů. Při tom by neměla být použita halogenovaná rozpouštědla v organické kontinuální fázi a současně by měla být dosažena vazebná kapacita enzymu penicilinamidáza (EC 3.5.1.11) za standardizovaných podmínek (vazebné spojení lg nosičového polymerního materiálu s 1530 jednotkami penicilinamidázy) alespoň 220 [IU/g za vlhka]. Dále by výslovně neměla mít bobtnavost polymerních perliček ve vodě číslo bobtnavosti (ml za vlhka / ml za sucha) větší než 1,5.

• · ·· ·· ·· • · · · · · · φ ~φφ φ φφφφ ·

.......φφφφ •φφφ Φ··· φφ·· ·· ·Φ ·· ·· ·· ··

Úloha byla řešena způsobem přípravy perličkového, síťovaného hydrofilního, vůči ligandům s nukleofilními skupinami vazebně aktivního směsného polymerizátu inverzní perličkovou polymerizací monomerní fáze, která sestává z monomerů a ředidla, přičemž jako monomery jsou obsaženy

a) 5 - 40 % hmot. hydrofilní radikálově polymerizovatelné monomery s vinylskupinou, které při pokojové teplotě tvoří alespoň 10% vodné roztoky

b) 30 - 50 % hmotn. radikálově polymerizovatelné monomery s vinylskupinou a další funkční skupinou, která v polymerové analogické reakci · s nukleofilními skupinami ligandů může vytvářet kovalentní vazbu

c) 20 - 60 % hmotn. síťované radikálově polymerizovatelné monomery se dvěma nebo více ethylenově nenasycenými polymerizovatelnými skupinami s pravidlem, že se a), b) a c) sčítají do 100 %, a jako ředidla se používá směs methanolu a vody v poměru 1 : 1,0 až 1 : 4,0, přičemž monomerní fáze je distribuována v kapkách do kontinuální fáze z organického rozpouštědla z alifatického uhlovodíku s 5 - 7 atomy uhlíku, přičemž poměr fáze monomerů ke kontinuální fázi obnáší 1 : 2,0 až 1 :

4,0, a v této formě za přítomnosti iniciátoru polymerizace a ochranného koloidu se radikálově polymerizuje, s pravidlem, že poměr monomerů k ředidlu je 1 : 1,7 až 1 : 2,4.

Za použití způsobu podle vynálezu se získá nosičový polymerní materiál nového druhu, který vykazuje vazebnou kapacitu pro penicilinamidázu alespoň 220 [IU/g za vlhka], získaný reakcí s 1530 jednotkami penicilin-acylázy s lg nosičového polymerního materiálu a číslem bobtnavosti maximálně 1,5.

··♦· • ·· • ·♦

Nebylo předvídatelné, že stanovení různých parametrů procesu jeden vedle druhého by mohlo vést k výrazně zvýšené vazebné kapacitě pro enzym penicilinamidáza, avšak současně by se mohla snížit bobtnavost. Překvapivé bylo též, že za použití způsobu podle vynálezu, výběrem organických rozpouštědel z alifatických uhlovodíků s 5 - 7 uhlíkovými atomy, bylo možno nenasazovat halogenované uhlovodíky jako perchlorethylen, které se až dosud používaly, především pro podobnou hustotu fází.

Monomery

Aby se zajistila hydrofilita monomerní směsi, musí směs převážně sestávat z hydrofilních monomerů. Za hydrofilní monomery se považují takové monomery, které při pokojové teplotě tvoří alespoň 10 % vodné roztoky a s výhodou neobsahují žádné iontové nebo ionizovatelné skupiny, přidáním kyselin nebo zásad.

Monomery a) jsou 5-40, 8-35, zejména 9-12 % hmotn.

hydrofilní radikálově polymerizovatelné monomery s vinylskupinou, které při pokojové teplotě tvoří alespoň 10 % vodné roztoky.

Jako monomery a) se hodí zejména akrylamid a/nebo metakrylamid, přičemž přednost se dává metakryamidu. Dalšími hydroxyakylestery nenasycených karboxylových kyselin, a hydroxyethylmetakrylát jako nebo hmotn.

příklady jsou polymerizovatelných hydroxyethýlakrylát N-vinylpyrrolidon.

Monomery b) jsou 30-50, s výhodou 35-45 radikálově polymerizovatelné monomery s vinylskupinou a další funkční skupinou, s výhodou oxiranovou skupinou (epoxiskupinou) , které mohou polymerní analogickou reakcí reagovat s nukleofilními skupinami za tvorby kovalentní vazby s ligandy. Zejména oxiranové skupiny jsou vhodné k tomu, aby vázaly ligandy při zachování jejich biologické ·· ···· • ·· • · 9 9 r· · * ·

Ο· · · · 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

99 99 99 99 99 aktivity. Monomery b) jsou s výhodou glycidylmetakrylát a/nebo allylglycidylether. Zejména výhodně se použijí současně oba monomery v přibližně stejných množstvích.

Monomery c) jsou 20-60 %, zvláště 25-55 %, obzvláště výhodně 40-55 % hmotn. hydrofilní, síťované radikálově, polymerizovatelné monomery se dvěma nebo více ethylenově nenasycenými polymerizovatelnými skupinami. Upřednostněné monomery c) jsou N,N'-methylen-bis-akrylamid nebo N,N'-methylen-bis-metakrylamid. Přednost se dává zejména N,N'-methylen-bis-metakrylamidu.

použity 0-10 % hmotn.

polymerizovatelné monomery se nenasycenými polymerizovatelnými skupinami. Vhodné jsou hydrofilní di(meth)akryláty, jako například polyethylenoxiddi(meth)akrylát.

Rovněž mohou vícesíťované 2 nebo více být také radikálově ethylenově

Ředidlo

Monomerní fáze sestává z monomerů a) až c) , které jsou rozpuštěny v ředidle, které musí být směsí methanolu a vody v poměru 1:1,0 až 1:4,0. Obzvláště příznivý poměr směsi methanolu a vody je 1: 1,2 až 1: 2,5, zejména 1:1,3 až

1:1,7.

Poměr monomerů k ředidlu

Obzvláště kritický je poměr monomerů k ředidlu. Ten musí ležet v oblasti od 1:1,7 do 1:2,4, zvláště výhodně v oblasti od 1,9 do 2,1.

Kontinuální fáze

Jako kontinuální fáze se hodí organické rozpouštědlo, které je alifatickým uhlovodíkem se 4 až 7 C-atomy. S výhodou je to n-heptan a obzvláště výhodně cyklohexan.

Poměr monomerní fáze/kontinuální fáze

Poměr monomerní fáze ke kontinuální fázi, tvořený ·<· ··»· ·· ·· ·· ·· • · · ···« · · · * r · · · ···· · · · ·

Ό · · · · · · · · · · · · · • · · · ··«· ·«·· ·· ·· ·· ·· 99 99 organickým rozpouštědlem, musí být 1:20 až 1:4,0, s výhodou mezi 1:2,8 až 1:3,3.

Další podmínky způsobu

Jako další součásti obsahuje suspendovaná monomem! fáze vlastně již známé polymerizační iniciátory, s výhodou iniciátory neobsahující síru, obzvláště výhodná je 4,4'-azobis(4-valerová kyselina), jakož i ochranné koloidy (emulgátory), jako například směsný polymerizát z 95 dílů nbutylmetakrylátu a 5 dílů 2-trimethylamonimummethylmetakrylát-chloridu s molekulovými hmotnostmi (hmotnostní prostředek) v oblasti 30.000 až 80.000.

Perličková polymerizace (označovaná také jako suspenzní polymerizace) se provádí ostatně známým způsobem tím, že se předloží například kontinuální fáze a? ochrannému koloidu a monomem! fáze, ve které se také nachází iniciátor, se za míchání například při 40 až 60 °C rozdělí do organické fáze a potom se zahřívá na 60 - 70 °C. Směs voda/methanol může například být po 6 hodinách blízko úplnému azeotropu. Vsádka se nechá reagovat do konce cca 3-5 hodin a potom se ochladí na pokojovou teplotu. Vzniklé perličky se odsají a například 12 hodin suší za vakua. Alternativně k tomu se perličkové polymerizáty mohou také odfiltrovat a promývat vodou. S výhodou se sušení provádí ve fluidační sušárně, protože tímto způsobem lze obzvlášť efektivně odstranit rozpouštědlo.

Obdržené polymerní perličky (= nosičovy polymerní materiál) mají velikost v oblasti 50 až 500 μιη , zejména 120 až 250 μιη. Vazebnou kapacitou se rozumí taková enzymatická aktivita, které lze dosáhnout při maximálním vazebném spojení nosičového polymerního materiálu s určitým enzymem. Důležitá oblast použití nosičového polymerního materiálu je štěpení penicilinu G na 6-aminopenicilanovou kyselinu (6APA) pomocí vázané penicilinamidázy z E.coií. Vazebná kapacita se vyjádří jako aktivita penicilinamidázy

0000 »0 00 00 00 0 0*00 0·00 η 0 · 0 0000 0 000 / 0 0 000 00 000 00 0 • ·0 0 0 00 0 0 0 0 · 00 00 00 00 00 00 v jednotkách na gram nosičových polymerních perliček [IU/g za vlhka]. Vazebná kapacita nosičových polymerních perliček obnáší při této měřicí metodě minimálně 220 [IU/g za vlhka].

Bobtnavost polymerních perliček ve vodě se vyjádří číslem bobtnavosti [ml za vlhka/ml za sucha]. Podle vynálezu tyto nosičové polymerní perličky nevykazují číslo bobtnavosti větší než 1,5.

Použití nosičových polymerních materiálů podle vynálezu

Nosičové polymerní materiály podle vynálezu mohou být použity ke kovalentní vazbě ligandů prostřednictvím přítomných oxiranových skupin v míchaných nebo průtokových reaktorech. To může být provedeno například adicí proteinů, zejména enzymů, z koncentrovaných roztoků kovalentní vazbou při zachování jejich biologické aktivity. Dále mohou reagovat s oxiranovými skupinami nosičových perliček také peptidy, aminokyseliny, β-laktamová antibiotika, lipidy, nukleotidy, polynukleotidy, nízkomolekulární nukleofilní sloučeniny nebo organokovové sloučeniny.

Polymerní perličky opatřené ligandy se mohou použít vlastně již známým způsobem ke stereospecifické syntéze chirálních substancí, jako aminokyselin (D-fenylalaninu, phydroxy-D-fenylalaninu, L-terc.-leucinu), nebo léčivých látek, například ibuprofenu. Právě tak mohou být použity jako nosiče v enzymatickém štěpení penicilinu G na 6aminopenicilanovou kyselinu (6-APA), cefalosporinu G na 7aminodesacetoxycefalosporanovou kyselinu (7-ADCA) nebo cefalosporinu C na 7-aminocefalosporanovou kyselinu. Způsob je popsán v DECHEMA Jahrestagung 1996 - Kurzfassungen, Sv. 1, DECHEMA e.V. Další oblasti použití jsou specifické enzymatické syntézy na substrátech jako například výše uvedené produkty štěpení na amoxicilin a ampicilin. Další oblastí aplikace jsou syntézy čistých chemikálií nebo základní produkty pro chemické syntézy (například kyseliny *· ·44· t· 44 ♦* • · · · 9 4 · 444 4 β · » · 4 4 4* 444 4 ^U 4 4 444 44 444 «4 4

4444 4444 «444

44 44 4* 4 4 4 4 jablečné). Polymerní perličky je možno použít také v separační technice při adsorpční chromatografii nebo gelové permeační chromatografii. Ke specifické adsorpci se mohou polymerní perličky naplnit frakcemi imunoglobulinu z antisér nebo monoklonálními protilátkami . Jako další oblast aplikace je možno jmenovat použití nosičových polymerních materiálů s navázanými enzymy nebo protilátkami jako adsorbentu v extrakorporální terapii k odstraňování patogenních respektive toxických látek z krve.

Příklady provedení vynálezu (Následující metody stanovení jsou odborníkovi na porézní nosičové polymerní materiály běžné a jsou uvedeny jen částečně.)

Stanovení vazebné kapacity pro penicilinamidázu (= acylázu penicilinu G) z E. coli (EC 3.5.1.11)

a) Kovalentní vazba penicilinamidázy na nosičový polymerní materiál g nosičového polymerního materiálu se přidá k 1530 jednotkám penicilinamidázy v 5 ml sterilním 1 M kaliumfosfátovém pufru o pH 7,5 a inkubuje se 48 hodin při 23 °C.

Potom se polymerní perličky dají na fritu ze sintrovaného skla (o porozitě 2 nebo 3) a dvakrát se promyjí deionisovanou vodou a potom se za odsávání na fritě promyjí 0,1 M kaliumfosfátovým pufrem o pH 7,5 obsahujícím 0,05 % ethyl-4-hydroxybenzoátu. Stanoví se vlhká hmotnost (za mokra) získaných perliček s navázanou penicilin-acylázou.

b) Stanovení vazebné kapacity *4 4444 • 4 · 4 44 4 4444 a · · · » r ·· · 4 · · y · · * · · · · ««· · · <

• 4 · · 4 4 · 4 4 4 4 4

44 44 *4 MS·

250 - 300 mg vlhkého nosičového polymerního materiálu (polymerních perliček) spojeného s penicilinamidázou se přidává do 20 ml 2% roztoku penicilinu G v 0,05 M kaliumfosfátového pufru o pH 7,5, obsahujícího 0,05 % ethyl4-hydroxybenzoát při 37 °C. Za rovnoměrného míchání se provádí titrace uvolněné kyseliny fenyloctové s 0,5 M NaOH při konstantní hodnotě pH 7.8 po dobu 10 minut, přičemž se zaznamenává spotřeba NaOH.

Potom se získají polymerní perličky jako v bodě a) prosátím přes skleněnou fritu 20 ml 0,05 M kaliumfosfátového pufru o pH 7,5, který obsahuje 0,05 % ethyl-4hydroxybenzoátu.

c) Výpočet vazebné kapacity

Lineární oblast naměřených křivek ( obvykle oblasti 1 5 min) se pokládá za základ výpočtu a extrapoluje na 10 min interval.Vazebná kapacita se udává jako jednotky penicilinamidázy na g vlhkého nosičového polymerního materiálu (IU/g za vlhka). Jedna jednotka odpovídá jednomu μπιοί hydrolyzovatelného penicilinu G za minutu (μιηοΐ/min) ; 1 1 0,5 M NaOH je přitom ekvivalentní 500 pmol hydrolyzovatelného penicilinu G. ( Obsah vody nosičového polymerního materiálu je téměř konstantní a lze ho proto zanedbat.)

Příklady 1-3

Souhlasné pokusné podmínky do příkladů 1-3

V míchané 2 1 baňce s teploměrem, odlučovačem vody, zpětným chladičem, přívodem dusíku trubkou se předloží organické rozpouštědlo, 3 g směsného polymerizátu z 95 dílů n-butylmetakrylátu a 5 dílů 2-trimethylamoniumethyl• ·

			• · · · · · * · ·	·· ·· ·· • · · · · «	• ·
		10	• · · • · · • · · · ·· ··	• · ·· · · • * ♦· · · · · • · · · · · ·· ·· ··	• • • • ·
metakrylát-chloridu	jako	ochranného	koloidu	a 5 g suchého
ledu. Za míchání	a při	prohánění	dusíkem	se při 50	°c
rozděluje monomerní	fáze	sestáváj ící	z vody	a methanolu	a
v poměru 1:1,5 jako	ředidla, jakož i

g metakrylamidu, g allylglycidyletheru, g glycidylmetakrylátu a 50 g methylen-bis-metakrylamidu jakož i g 4,4'-azo-bis-4-kyanovalerové kyseliny ( jako iniciátoru polymerizace) v organické fázi a potom se zahřívá k varu při 65-70 °C.

Vsádka se inkubuje cca 6 hodin a potom se ochladí na pokojovou teplotu. Vzniklé polymerní perličky se odsají, promyjí a suší ve fluidační sušárně. Nakonec se určí vazebná kapacita penicilinamidázy [IU/g za vlhka] a číslo bobtnavosti.

Podstatné parametry způsobu a výsledky příkladů 1-3 jsou uvedeny v tabulce 1.

Tabulka 1

	Příklad 1 (podle vynálezu)	Příklad 2 (srovnávací)	Příklad 3 (srovnávací)
Organické rozpouštědlo (kontinuální fáze)	952 g cyklohexanu	669 g cyklohexanu	530 g n-heptanu + 530 g perchlorethylenu
Monomery celkem	100 g	100 g	100 g
Ředidlo	80 g methanolu + 120 g vody ( = 1:1,5)	263 g formamidu	264 g formamidu
Monomery + ředidlo (monomerní fáze)	300 g	363 g	364 g

·· ····

Poměr momomery/ředidlo	1:2	1:2,63	1:2,64
Poměr monomerní fáze/ kontinuální fáze	1:3,2	1:1,8	1:2,9
Vazebná kapacita pro penicilinamidázu (1530 IU) [IU/g za vlhka]	252	194	192
číslo bobtnavosti [ml za vlhka/ml za sucha]	1,3	4,0	3,9

PATENTOVÉ

Claims (4)

1. Způsob přípravy perličkového, síťovaného hydrofilního, vůči ligandům s nukleofilními skupinami vazebně aktivního směsného polymerizátu inverzní perličkovou polymerizací monomerní fáze, která sestává z monomerů a ředidla, přičemž jako monomery jsou obsaženy

a) 5 - 40 % hmotn. hydrofilní radikálově polymerizovatelné monomery s vinylskupinou, které při pokojové teplotě tvoří alespoň 10 % vodné roztoky

b) 30 - 50 % hmotn. radikálově polymerizovatelné monomery s vinylskupinou a jednou další funkční skupinou, která v polymerové analogické reakci může vytvářet s nukleofilními skupinami ligandů kovalentní vazbu

c) 20 - 60 % hmotn. síťované radikálově polymerizovatelné monomery se dvěma nebo více ethylenově nenasycenými polymerizovatelnými skupinami s pravidlem, že se a), b) a c) sčítají do 100 %, a jako ředidla se používá směsi methanolu a vody v poměru 1 : 1,0 až 1 : 4,0, přičemž monomerní fáze je distribuována v kapkách do kontinuální fáze z organického rozpouštědla z alifatického uhlovodíku s 5 - 7 atomy uhlíku, přičemž poměr monomerní fáze ke kontinuální fázi obnáší 1 : 2,0 až 1 :

4,0, a v této formě za přítomnosti iniciátoru polymerizace a ochranného koloidu se radikálově polymerizuje, s pravidlem, že poměr monomerů k ředidlu je 1 : 1,7 až 1 : 2,4.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že jako monomery se používají

a) akrylamid a/nebo metakrylamid ·· ·« • · · • · · I • · ·

b) glycidylmetakrylát a/nebo allylglycidylether

c) methylen-bis-akrylamid nebo methylen-bis metakrylamid.

3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že jako organické rozpouštědlo se používá cyklohexan.

4. Nosičový polymerní materiál zhotovený způsobem podle některého z nároků 1 až 3 , vyznačující se tím, že vykazuje vazebnou kapacitu pro penicilinamidázu z E. coli alespoň 220 [IU/g za vlhka], jako výsledek reakce 1530 jednotek penicilinamidázy s 1 g nosičového polymerního

materiáli a, a číslo bobtnavosti nejvýše 1,5. 5. nároku 4 Používání nosičového polymerního k tvorbě proteinů. materiálu podle 6. nároku 5 Používání nosičového polymerního k tvorbě enzymů. materiálu podle 7 . nároku 5 Používání nosičového polymerního k tvorbě protilátek. materiálu podle 8. nároku 4 Používání nosičového polymerního v chromatografií. materiálu podle 9. nároku 4 Používání nosičového polymerního k syntéze léčivých látek. materiálu podle 10 Používání nosičového polymerního materiálu podle nároku 4 ke specifické syntéze chirálních substancí.