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Die Erfindung betrifft ein Verfahren
zur Herstellung von Cephalexin mit Hilfe einer auf einem perlförmigen,
vernetzten hydrophilen, gegenüber
Liganden mit nucleophilen Gruppen bindungsaktiven Mischpolymerisat
immobilisierten Penicillinamidase.
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Stand der
Technik
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Verfahren zur Synthese von halbsynthetischen
Betalaktam Antibiotika durch Acylierung eines Betalaktam Rests (Betalaktamkern)
mit einer aktivierten Seitenkette, wie etwa einem Amid oder einem
Ester, unter Verwendung des Enzyms Penicillinacylase (Penicillinamidase)
sind dem Fachmann gut bekannt.
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Zumeist wird das Enzym dabei an einen
festen, wasserunlöslichen
Träger
gebunden, und anschließend
in wässriger
Lösung
mit dem Betalaktamkern und der aktivierten Seitenkette in Kontakt
gebracht.
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Nachteilig an den bisher offenbarten
Verfahren ist die Tatsache, dass das Verhältnis der Synthese der gewünschten
Verbindung durch das Enzym gegenüber
der Hydrolyse der aktivierten Seitenkette zu wertlosen Seitenkettensäuren sowie
auch zur Hydrolyse des gewünschten
Produktes, der so genannte S/H-Wert, oft ungünstig ist, und eine wirtschaftliche
Produktion erschwert.
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Aus der WO 93/12250 ist es bekannt,
dass der S/H-Wert bei der Synthese der halbsynthetischen Betalaktam-Antibiotika,
Cephadroxil und Cephalexin durch auf Eupergit® (Röhm GmbH & Co. KG, Darmstadt, Deutschland,
siehe auch Vergleichsbeispiel 1) immobilisierter Penicillinamidase
aus E. coli durch die Wahl der Reaktionsbedingungen günstig beeinflusst
werden kann. Ein Einfluss der Natur des Trägermaterials wird hingegen
nicht gelehrt. Nachteilig an dem in der WO 93/12250 gelehrten Verfahren
ist insbesondere, dass das Cephalexin im Komplex mit beta-Naphthol
aus dem Reaktionsgemisch isoliert wird, so dass nachfolgende Aufreinigungsschritte
nötig sind,
und Produktverluste auftreten.
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Es wurde daher versucht, optimierte
Trägermaterialen
zu entwickeln. So offenbart die W097/04086 eine Penicillinamidase
aus E. coli, die auf einem Trägermaterial
aus einem Quellmittel und einem Polymer mit freien Aminogruppen
immobilisiert ist, sowie deren Verwendung zur Herstellung von Betalaktamderivaten.
Das offenbarte Verfahren zur Herstellung von Cephalexin weist jedoch
den Nachteil auf, dass der Betalaktamkern 7-Aminodesacetoxycephalosporansäure (7-ADCA)
im dreifachen molaren Überschuss
zu der aktivierten Seitenkette D-Phenylglycinamid (PGA) eingesetzt
wird. Werden überstöchiometrische
Mengen Betalaktamkern eingesetzt, muss der Kern im industriellen
Maßstab
recycelt werden, um wirtschaftlich arbeiten zu können. Dies ist teuer und führt zu Ausbeuteverlusten.
Außerdem
führt dieser
Umstand auch zu Verunreinigungen im Produkt, da der Kern labil ist.
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Die
EP
0 730 035 lehrt ebenfalls die Herstellung von Cephalexin
auf einem spezifischen Träger
in akzeptablen Ausbeuten. Allerdings beträgt die Korngröße des verwendeten
Trägermaterials
(Emphaze
TM) nur 60-80 μm. Dies ist von großem Nachteil
für technische
Anwendungen. So haben mit solchem Material gepackte Chromatographiesäulen nur
eine geringe Fließgeschwindigkeit.
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Ein Trägermaterial für Enzyme
wird in der
DE 198 04 518 beschrieben.
Es wird erwähnt,
dass das Material Verwendung finden könne für die enzymatische Synthese
von Amoxycillin und Ampicillin. Eine Eignung für die Synthese von Cephalexin
mittels immobilisierter Penicillinamidase wird nicht erwähnt.
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Aufgabe und
Lösung
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Angesichts des oben diskutierten
Stands der Technik lag der vorliegenden Erfindung daher die Aufgabe
zugrunde, ein verbessertes Verfahren für die Synthese von Cephalexin
zur Verfügung
zu stellen, welches die oben genannten Nachteile überwindet.
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Insbesondere sollte dieses Verfahren
die Realisierung eines günstigen
S/H-Wertes ermöglichen.
Weiterhin sollte das verwendete Trägermaterial eine für industrielle
Verfahren günstige
Korngröße von 120
bis 250 um aufweisen.
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Diese Aufgabe wird gelöst durch
das in Anspruch 1 definierte Verfahren. Bevorzugte Ausführungsformen
des erfindungsgemäßen Verfahrens
sind in den auf Anspruch 1 zurückbezogenen
Unteransprüchen
definiert.
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Insbesondere gelingt es auf nicht
vorhersehbare und technisch einfache Weise, die obige Aufgabe zu lösen, indem
man perlförmige,
vernetzte hydrophile, gegenüber
Liganden mit nucleophilen Gruppen bindungsaktive Trägerpolymermaterialien,
die herstellbar sind durch inverse Perlpolymerisation einer Monomerenphase,
die aus Monomeren und einem Verdünnungsmittel
bestehen, wobei als Monomere
- (a) 5 – 40 Gew.-%
hydrophile radikalisch polymerisierbare Monomere mit einer Vinylgruppe,
die bei Raumtemperatur wenigstens 10 %ige wässrige Lösungen bilden
- (b) 30 – 50
Gew.-% radikalisch polymerisierbaren Monomere mit einer Vinylgruppe
und einer zusätzlichen funktionellen
Gruppe, die in einer polymeranalogen Reaktion mit den nucleophilen
Gruppen der Liganden kovalente Bindungen eingehen kann
- (c) 20 – 60
Gew.-% vernetzende radikalisch polymerisierbare Monomere mit zwei
oder mehr ethylenisch ungesättigten
polymerisierbaren Gruppen
mit der Maßgabe, dass sich a), b) und
c) zu 100 Gew.-% addieren, enthalten sind und als Verdünnungsmittel
ein Gemisch aus Methanol und Wasser im Verhältnis 1 : 1,0 bis 1 : 4,0 verwendet
wird, wobei die Monomerenphase in einer kontinuierlichen Phase aus
einem organischen Lösungsmittel
aus einem aliphatischen Kohlenwasserstoff mit 5 – 7 Kohlenstoffatomen zu Tröpfchen verteilt
ist, wobei das Verhältnis
Monomerenphase zu kontinuierlicher Phase 1 : 2,0 bis 1 : 4,0 beträgt, und
in dieser Form in Gegenwart von eines Polymerisationsinitiators
und eines Schutzkolloids radikalisch polymerisiert werden, mit der
Maßgabe,
dass das Verhältnis
der Monomeren zum Verdünnungsmittel
1 : 1,7 bis 1 : 2,4 beträgt,
mit Penicillinamidase beschichtet, und diese beschichteten Träger in Kontakt
bringt mit einer wässrigen
Lösung,
die
- (i) 7-Aminodesacetoxycephalosporansäure und
- (ii) D-Phenylglycinamid
in Verhältnissen von 1 : 2 bis 2 :
1, bevorzugt 1,5 : 1 bis 1 : 1,5, besonders bevorzugt in annähernd equimolaren
Verhältnissen,
d.h. in Verhältnissen
von 1,2:1 bis 1:1,2 enthält.
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Das verwendete Trägermaterial und das Verfahren
zu seiner Herstellung sind in der
DE
198 04 518 beschrieben.
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Ausführung der
Erfindung
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Herstellung
des Trägermaterials
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Monomere
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Um die Hydrophilie des Monomerengemischs
zu gewährleisten,
muss dieses zum überwiegenden
Teil aus hydrophilen Monomeren bestehen. Unter hydrophilen Monomeren
sind solche Monomere zu verstehen, die bei Raumtemperatur wenigstens
10%-ige wässrige
Lösungen
bilden und vorzugsweise keine ionischen oder durch Säure- oder
Basenzusatz ionisierbaren Gruppen enthalten.
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Die Monomere a) sind 5 – 40, 8 – 35, insbesondere
9 – 12
Gew.-% hydrophile radikalisch polymerisierbare Monomere mit einer
Vinylgruppe, die bei Raumtemperatur wenigstens 10 %-ige wässrige Lösungen bilden.
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Als Monomere a) sind insbesondere
Acrylamid und/oder Methacrylamid geeignet, wobei Methacrylamid bevorzugt
wird. Weitere Beispiele sind Hydroxyalkylester von ungesättigten
polymerisierbaren Carbonsäuren,
wie Hydroxyethylacrylat und Hydroxyethylmethacrylat oder N-Vinylpyrrolidon.
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Monomere b) sind 30 – 50, bevorzugt
35 – 45
Gew.-% radikalisch polymerisierbaren Monomere mit einer Vinylgruppe
und einer zusätzlichen
funktionellen Gruppe, bevorzugt einer Oxirangruppe (Epoxygruppe), die
in einer polymeranalogen Reaktion mit den nucleophilen Gruppen der
Liganden kovalente Bindungen eingehen kann. Insbesondere Oxirangruppen
sind geeignet, um Liganden unter Erhaltung ihrer biologischen Aktivität zu binden.
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Bevorzugte Monomere b) sind Glycidylmethacrylat
und/oder Allylglycidylether. Besonders bevorzugt werden gleichzeitig
beide Monomere in etwa gleichen Mengen eingesetzt.
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Monomere c) sind 20 – 60, insbesondere
25 – 55,
besonders bevorzugt 40 – 55
Gew.-% hydrophile, vernetzende radikalisch polymerisierbare Monomere
mit zwei oder mehr ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Gruppen.
Bevorzugte Monomere c) sind N,N'-Methylen-bis-Acrylamid
oder N,N"-Methylen-bis-Methacrylamid.
N,N'-Methylen-bis-Methacrylamid
wird besonders bevorzugt. Gegebenenfalls können auch 0 – 10 Gew.-%
weiterer vernetzender, radikalisch polymerisierbarer Monomere mit
zwei oder mehr ethylenisch ungesättigten
polymerisierbaren Gruppen eingesetzt werden. Geeignet sind hydrophile
Di(meth)acrylate, wie z. B. Polyethylenoxid-Di(meth)acrylate.
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Die Monomere a), b) und c) addieren
sich jeweils zu 100 Gew.-%.
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Verdünnungsmittel
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Die Monomerenphase besteht aus den
Monomeren a) bis c), die in einem Verdünnungsmittel, das ein Gemisch
aus Methanol und Wasser im Verhältnis
1 : 1,0 bis 1 : 4,0 sein muss, gelöst sind. Besonders günstige Mischungsverhältnisse
für Methanol
und Wasser liegen bei 1 : 1,2 bis 1: 2,5, insbesondere bei 1: 1,3
bis 1 : 1,7.
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Verhältnis Monomere
zu Verdünnungsmittel
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Besonders kritisch ist das Verhältnis Monomere
zu Verdünnungsmittel.
Dieses muss im Bereich von 1 : 1,7 bis 1 : 2,4, besonders bevorzugt
im Bereich von 1,9 bis 2,1 liegen.
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Kontinuierliche
Phase
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Als kontinuierliche Phase eignet
sich ein organisches Lösungsmittel,
das ein aliphatischer Kohlenwasserstoff mit 4 bis 7 C-Atomen ist.
Bevorzugt ist n-Heptan
und besonders bevorzugt Cyclohexan.
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Verhältnis Monomerenphase/kontinuierlicher
Phase Das Verhältnis
von der Monomerenphase zur kontinuierlichen Phase, gebildet durch
das organische Lösungsmittel
muss bei 1 : 2,0 bis 1 : 4,0, bevorzugt zwischen 1 : 2,8 bis 1 :
3,3.
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Weitere Verfahrensbedingungen
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Als weitere Bestandteile enthält die suspendierte
Monomerphase in an sich bekannter Weise Polymerisations-Initiatoren,
bevorzugt sind schwefelfreie Initiatoren, besonders bevorzugt ist
4,4'-Azobis-(4-Valeriansäure), sowie
Schutzkolloide (Emulgatoren), wie z. B. ein Mischpolymerisat aus
95 Teilen n-Butylmethacrylat und
5 Teilen 2-Trimethylammoniumethlymethacrylat-Chlorid mit Molekulargewichten
(Gewichtsmittel) im Bereich von 30.000 bis 80.000.
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Die Perlpolymerisation (auch als
Suspensionspolymerisation bezeichnet) wird ansonsten in bekannter Weise
ausgeführt,
indem z. B. die kontinuierliche Phase und dem Schutzkolloid vorgelegt
wird und die Monomerenphase, in der sich auch der Initiator befindet
unter Rühren
z. B. bei 40 bis 60 °C
in der organischen Phase verteilt wird und anschließend auf
60 – 70 °C erhitzt
wird. Das Wasser/Methanol-Gemisch kann z. B. über einen Zeitraum von 6 Stunden
nahezu vollständig
azeotrop ausgekreist werden. Man lässt den Ansatz für ca. 3 – 5 Stunden
zu Ende reagieren und kühlt
anschließend
auf Raumtemperatur ab. Die entstandenen Perlen werden abgesaugt
und z. B. für
12 Stunden im Vakuum getrocknet. Alternativ dazu können die
Perlpolymerisate auch abfiltriert und mit Wasser gewaschen werden.
Bevorzugt wird ein Trocknung in einem Wirbelschichttrockner vorgenommen,
da sich auf diese Weise Lösungsmittelreste
besonders effektiv entfernen lassen.
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Die erhaltenen Polymerperlen (= Trägerpolymermaterial)
haben eine Größe im Bereich
von 50 bis 500 μm,
insbesondere von 120 bis 250 μm.
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Unter der Bindungskapazität wird diejenige
enzymatische Aktivität
verstanden, die sich bei maximaler Beladung des Trägerpolymermaterials
mit einem bestimmten Enzym erreichen lässt. Die Bindungskapazität wird ausgedrückt als
Penicillinamidase-Aktivität
in Units pro g Trägerpolymerperlen
[U/g feucht]. Die Bindungskapazität der erfindungsgemäßen Trägerpolymerperlen
beträgt
bei dieser Meßmethode
mindestens 220 [U/g feucht].
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Die Quellbarkeit der Polymerperlen
in Wasser wird ausgedrückt
durch die Quellungszahl [ml feucht / ml trocken]. Die erfindungsgemäßen Trägerpolymerperlen
weisen eine Quellungszahl von nicht mehr als 1,5 auf.
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Beschichtung
des erfindungsgemäß verwendbaren
Trägermaterials
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In den Beispielen wird das Trägermaterial
bei pH 7,5 in Kaliumphosphatpuffer beschichtet. Es ist dem Fachmann
jedoch klar, dass es eine ganze Vielzahl von weiteren Verfahren
gibt, mit denen eine zufriedenstellende Beschichtung gewährleistet
wird.
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Synthese von
Cephalexin
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Die Edukte (i) 7-Aminodesacetoxycephalosporansäure und
(ii) D-Phenylglycinamid
werden in Konzentrationen von 10-500 mM, bevorzugt 50-300 mM und besonders
bevorzugt von 150-250 mM eingesetzt.
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Vorteilhafte
Wirkungen der Erfindung
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Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die
Synthese von Cephalexin mit günstigem
S/H-Verhältnis
(Synthese/Hydrolyse). Vorteilhaft ist es dabei, daß dies unter
Verwendung eines Trägermaterials
mit Teilchengrößen im Bereich
von 50 – 500 μm, insbesondere
von 120 bis 250 μm
erreicht wird. Dadurch werden bessere anwendungstechnische Eigenschaften
erzielt, z. B. höhere
Fließgeschwindigkeiten
in Festbettreaktoren. Aus den höheren
Fließgeschwindigkeiten
resultieren bessere Raum-Zeit-Ausbeuten. Auch in Batchverfahren
bieten die größeren Trägerteilchen
Vorteile, da sie schneller abfiltriert werden können. Dies erhöht wiederum
die Raum-Zeit-Ausbeute und damit die Wirtschaftlichkeit des Prozesses.
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Beispiele
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(Die folgende Bestimmungsmethode
ist dem Fachmann auf den Gebiet poröser Trägerpolymermaterialien an sich
geläufig
und wird nur der Vollständigkeit
halber aufgeführt)
Bestimmung der Bindungskapazität für Penicillinamidase
( = Penicillin G-Acylase)
aus E. coli (EC 3.5.1.11)
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a) Kovalente Bindung von
Penicillinamidase an das Trägerpolymermaterial
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1 g Trägerpolymermaterial werden zu
1530 Units Penicillinamidase in 5 ml sterilem 1 M Kalium-Phosphat-Puffer
pH 7,5 gegeben und für
48 h bei 23 °C
inkubiert.
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Anschließend werden die Polymerperlen
auf eine Fritte aus gesintertem Glas (Porösität 2 oder 3) gegeben und zweimal
mit entionisierten Wasser und anschließend zweimal mit 0,1 M Kalium-Phosphatpuffer
pH 7,5, enthaltend 0,05 % Ethyl-4-hydroxybenzoat, mittels Absaugens
auf der Fritte gewaschen. Das Feuchtgewicht der erhaltenen, mit
Penicillin-Acylase beladenen Perlen wird bestimmt.
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b) Bestimmung der Bindungskapazität
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250 – 300 mg feuchtes mit Penicillinamidase
gekoppeltes Trägerpolymermaterial
(Polymerperlen) werden in 20 ml einer 2 %-igen Penicillin-G-Lösung in
0,05 M Kalium-Phosphatpufter pH 7,5, enthaltend 0,05 Ethyl-4-hydroxybenzoat,
bei 37 °C
gegeben. Unter gleichmäßiger Rührung erfolgt
eine Titration frei gewordener Phenylessigsäure mit 0,5 M NaOH bei einem
konstantem pH-Wert von 7.8 für
die Dauer von 10 Minuten, wobei der Verbrauch an NaOH aufgezeichnet
wird.
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Anschließend werden die Polymerperlen
wie unter a) über
eine Glasfritte mittels Durchsaugen von 20 ml 0,05 M Kalium-Phosphatpuffer
pH 7,5, enthaltend 0,05 % Ethyl-4-hydroxybenzoat, gewonnen und die
Messung zweimal wiederholt.
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c) Berechnung der Bindungskapazität
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Der lineare Bereich der Messkurven
(üblicherweise
der Bereich von 1 – 5
min) wird für
die Berechnung zugrunde gelegt und auf ein 10 min Intervall extrapoliert.
Die Bindungskapazität
wird als Penicillinamidase Einheiten pro g feuchten Trägerpolymermaterials
(U/g feucht) angegeben. Eine Einheit entspricht einem μmol hydrolysiertem
Penicillin G pro Minute (μmol/min);
1 l 0,5M NaOH ist dabei äquivalent
zu 500 μmol
hydrolysiertem Penicillin G. (Der Wassergehalt des Trägerpolymermaterials
ist in etwa konstant und kann daher vernachlässigt werden.)
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Vergleichsbeispiel 1
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1530 Units Penicillinamidase aus
E. coli werden in 6 ml sterilem 1 M Kaliumphosphatpuffer, pH 7,5 gelöst. Die
Lösung
wird zu 1 g Eupergit ® C
(Röhm GmbH & Co. KG, Darmstadt,
Deutschland) gegeben, und die erhaltene Suspension wird 72 Stunden
bei 23° C
inkubiert. Die Polymerperlen werden auf einem gesinterten Glasfilter
gesammelt und mit 0,1 M Kaliumphosphat-Puffer gewaschen. Die nachfolgende
Cephalexin-Synthese und die Bestimmung des S/N-Wertes folgen den
Beispielen 5 bzw. 6.
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Eupergit® C (ein Copolymer aus N,N'-methylenbis-methacrylamid,
Allylglycidylether und Methacrylamid) sowie Verfahren zu seiner
Herstellung werden in der
DE-C
27 22 751 , der
US-A
4 90 713 bzw. der
US-A 45
11 694 beschrieben.
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Vergleichsbeispiel 2
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Der WO 97/04086 folgend wird unter
Verwendung des dort offenbarten Typ A Enzyms bzw. Typ B Enzyms eine
Cephalexin-Synthese wie in Beispiel 6 beschrieben durchgeführt.
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Vergleichsbeispiel 3
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Auf Sepabeads® FP-EP bzw. Sepabeads® FP-EP/G
(Resindion S.R.I., Mailand, Italien) wird Penicillinamidase aus
E. coli immobilisiert wie in Vergleichsbeispiel 1 gezeigt. Die nachfolgende
Cephalexin-Synthese und die Bestimmung des S/H-Wertes folgen den
Beispielen 5 bzw. 6.
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Sepabeads® FP-EP bzw. Sepabeads® FP-EP/G
ist ein hochpolymeres vernetztes acrylisches Copolymer, welches
wie Eupergit ® Oxirangruppen
trägt.
Die durchschnittliche Teilchengröße beträgt nach
Herstellerangaben 150-300 μm.
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Vergleichsbeispiel 4
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Ermittlung der Fließgeschwindigkeit
einer mit EmphazeTM bzw. dem erfindungsgemäß verwendbaren Material gepackten
Chromatographiesäule.
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Material: Emphaze UltralinkTM Biosupport Medium, Lot#DC53515, Pierce,
mittlere Teilchengröße nach Herstellerangaben
50-80 μm;
Erfindungsgemäß verwendbares
Material, mittlere Teilchengröße 208 μm.
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Chromatographiesäulen aus Borsilikatglas mit
Glasfrittenboden und Polypropylenendkappen (Abmessung der Säule 1×20 cm)
wurden leer auf eine vergleichbare Auslaufgeschwindigkeit geprüft. Die
Trägermaterialien
wurden über
Nacht in Wasser suspendiert und anschließend mit Wasser in die jeweilige
Säule gespült und durch
Sedimentation und langsames Auslaufen der Flüssigkeit wurde ein gepacktes
Bett mit einer Höhe von
6,5 cm erhalten. Durch leichtes Klopfen wurden eventuelle Hohlräume entfernt.
Die oben offenen Säulen hatten
durch Wasserzulauf eine konstante Wassersäule von 23 cm. Die Fließgeschwindigkeit
wurde nur durch den hydrostatischen Druck erzielt. Mittels Stoppuhr
und 10ml-Meßzylinder
wurde die Fließgeschwindigkeit
bestimmt.
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Für
das erfindungsgemäß verwendbare
Präparat
wurde eine Fließgeschwindigkeit
von 4,25 ml pro Minute bestimmt. Für EmphazeTM wurde eine Fließgeschwindigkeit
von 0.71 ml pro Minute bestimmt. Die Eignung sphärischer Partikel zum Betrieb
in Festbettreaktoren ist umso besser, je höher die Fließgeschwindigkeit ist
(höhere
Raum-Zeit-Ausbeute). Der Druckabfall in Festbettreaktoren lässt sich
auch mathematisch berechnen: K. Buchholz und B. Gödelmann
in „Characterization
of immobilized biocatalysts",
Dechema Monographien Band 84, Hrsg. K. Buchholz, VCH Weinheim 1979,
Seiten 128-129).
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Man erkennt deutlich die gegenüber EmphazeTM
besseren anwendungstechnischen Eigenschaften des erfindungsgemäß einsetzbaren
Materials für
den Einsatz in Festbettreaktoren.
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Beispiele 1 - 3
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Übereinstimmende
Versuchsbedingungen in den Beispielen 1 – 3:
In einem 2 l Rührkolben
mit Thermometer, Wasserabscheider, Rückflusskühler, Stickstoffeinleitungsrohr
werden ein organisches Lösungsmittel,
3 g eines Mischpolymerisats aus 95-Teilen n-Butylmethacrylat und
5 Teilen 2-Trimethylammoniumethlymethacrylat-Chlorid als Schutzkolloid
und 5 g Trockeneis vorgelegt. Unter Rühren und Durchleiten von Stickstoff
wird bei 50 °C
eine Monomerenphase bestehend aus Wasser und Methanol im Verhältnis 1
: 1,5 (Beispiel 1) bzw. aus Formamid (Beispiele 2 und 3) als Verdünnungsmittel,
sowie
10 g Methacrylamid,
20 g Allylglycidylether,
20
g Glycidylmethacrylat und
50 g Methylen-bis-methacrylamid sowie
2 g 4,4'-Azobis-4-cyanovaleriansäure (als
Polymerisationsinitiator) in der organischen Phase verteilt und
anschließend
zum Sieden bei 65 – 70 °C erhitzt.
Der Ansatz wird für
ca. 6 h inkubiert und anschließend
auf Raumtemperatur abgekühlt.
Die entstandenen Polymerperlen werden abgesaugt, gewaschen und im
Wirbelschichttrockner getrocknet. Anschließend wird die Bindungskapazität für Penicillinamidase
(U/g feucht] und die Quellzahl bestimmt [ml feucht/ml trocken] bestimmt.
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Die wesentlichen Versuchsparameter
und die Ergebnisse der Beispiele 1 – 3 sind der nachstehenden Tabelle
zu entnehmen.
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Beispiel 4
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Synthese von
Cephalexin
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Die Reaktion wird bei 25° C und pH
7.5 in einem Festbettreaktor durchgeführt. 10 ml einer wässrigen Lösung eines
Gemisches aus 0,2 M 7-ADCA und 0,2 M D-Phenlyglycinamid werden über eine
Säule mit
0,5 ml der immobilisierten Penicillinamidase geführt. Während der Reaktion wird der
pH-Wert durch Zusatz von HCl in einem angeschlossenen gerührten Vorratsbehälter konstant
gehalten. Zu bestimmten Zeitabständen werden
Proben entnommen und wie in Beispiel 5 gezeigt mittels HPLC analysiert.
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Beispiel 5
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Die Produkte der Reaktion aus Beispiel
4 sowie der Vergleichsbeispiele 1 bis 3 wurden durch HPLC unter
Verwendung einer RP -8 Säule
(Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) analysiert. Als Laufmittel
wurde steriler 67 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,5 verwendet. Cephalexin
wurde mit einer 30 %igen (Volumen/Volumen) wässrigen Methanol-Lösung eluiert.
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Aus der HPLC-Analyse wurde die Synthesegeschwindigkeit
von Cephalexin (V
Ceph) sowie die Hydrolysegeschwindigkeit
von D-Phenylglycin (V
D-PhG) bestimmt und
daraus der S/H-Wert (Verhältnis
Synthesegeschwindigkeit/Hydrolysegeschwindigkeit (V
Ceph/V
D-PhG) errechnet. Die Ergebnisse sind in
der folgenden Tabelle dargestellt:
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Der Wert für das erfindungsgemäße Verfahren
setzt sich aus 7 parallel durchgeführten Versuchsreihen zusammen,
die folgende S/H-Werte ergaben: 5,3; 4,7; 3,6; 4,6; 4,3; 5,2; 4,7;
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Man erkennt deutlich den gegenüber den
Vergleichsbeispielen signifikant um ca. 30% verbesserten S/H-Wert,
der mit dem erfindungsgemäßen Verfahren
erreichbar ist.
