EP1556427A2 - Makroporöses kunststoffperlenmaterial - Google Patents

Makroporöses kunststoffperlenmaterial

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Publication number
EP1556427A2
EP1556427A2 EP03750435A EP03750435A EP1556427A2 EP 1556427 A2 EP1556427 A2 EP 1556427A2 EP 03750435 A EP03750435 A EP 03750435A EP 03750435 A EP03750435 A EP 03750435A EP 1556427 A2 EP1556427 A2 EP 1556427A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
monomers
material according
perien
macroporous plastic
macroporous
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP03750435A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Stefan Menzler
Hans-Ulrich Petereit
Christian Meier
Thomas Boller
Thomas Süfke
Klaus Schultes
Roger Recktenwald
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Roehm GmbH Darmstadt
Original Assignee
Roehm GmbH Darmstadt
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Filing date
Publication date
Application filed by Roehm GmbH Darmstadt filed Critical Roehm GmbH Darmstadt
Publication of EP1556427A2 publication Critical patent/EP1556427A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F246/00—Copolymers in which the nature of only the monomers in minority is defined
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F2/00—Processes of polymerisation
    • C08F2/12—Polymerisation in non-solvents
    • C08F2/16—Aqueous medium
    • C08F2/18—Suspension polymerisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F220/00—Copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride ester, amide, imide or nitrile thereof
    • C08F220/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms; Derivatives thereof
    • C08F220/10—Esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F220/00—Copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride ester, amide, imide or nitrile thereof
    • C08F220/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms; Derivatives thereof
    • C08F220/10—Esters
    • C08F220/26—Esters containing oxygen in addition to the carboxy oxygen
    • C08F220/28—Esters containing oxygen in addition to the carboxy oxygen containing no aromatic rings in the alcohol moiety
    • C08F220/285—Esters containing oxygen in addition to the carboxy oxygen containing no aromatic rings in the alcohol moiety and containing a polyether chain in the alcohol moiety
    • C08F220/286—Esters containing oxygen in addition to the carboxy oxygen containing no aromatic rings in the alcohol moiety and containing a polyether chain in the alcohol moiety and containing polyethylene oxide in the alcohol moiety, e.g. methoxy polyethylene glycol (meth)acrylate
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
    • Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
    • Y10S530/815—Carrier is a synthetic polymer

Definitions

  • the invention relates to the field of polymer carrier systems and, in particular, to a macroporous plastic bead material containing a copolymer of crosslinked (meth) acrylate plastic.
  • Polymer carrier systems containing copolymers of crosslinked (meth) acrylate plastic are known, for. B. from EP-A 0 328767, EP-A 424 130, EP-A 579 928 or from WO 99/33964.
  • WO 99/40122 (DE-A 19804518) relates to a process for the preparation of a bead-shaped, crosslinked hydrophilic copolymer which is active against ligands with nucleophilic groups by inverse suspension polymerization of a monomer phase.
  • the invention further relates to the carrier polymer materials obtainable therefrom with a high binding capacity for penicillin amidase and a low swelling number and the use thereof.
  • copolymer of crosslinked (meth) acrylate plastic is obtained by inverse suspension polymerization of the following monomers:
  • the copolymer is suitable as a carrier material for various types of enzymes.
  • macroporous plastic bead materials should be provided which are suitable as efficient carrier materials, in particular for enzymes which are able to convert relatively hydrophobic substrates, preferably for lipases.
  • macroporous plastic bead materials should be provided which, after binding lipases, show comparatively high activities in test systems such as tributyrin hydrolysis, triacetin hydrolysis, phenylethyl acetate hydrolysis and / or phenylethyl acetate synthesis.
  • the object is achieved by a macroporous plastic bead material with an average particle diameter in the range from 10 to 1000 ⁇ m, containing a copolymer
  • the macroporous plastic bead material has an average particle diameter V 50 of 10 to 1000, preferably from 50 to 600, particularly preferably from 100 to 500, in particular from 200 to 400 ⁇ m.
  • the determination of the average particle diameter V 50 can, for. B. with a particle analyzer.
  • a sample with a particle concentration in the range of 10 3 -10 6 particles is mixed with some detergent as a wetting aid and additionally treated with ultrasound before the measurement to separate the particles.
  • the macroporous plastic bead material can have a porosity which can be measured by a Kp S ⁇ o value of 0.3 to 0.9, in particular from 0.35 to 0.6.
  • B. characterizes by inverse size exclusion chromatography in tetrahydrofuran.
  • the macroporous plastic bead material can have a swelling number in water from 1 to 1.5, in particular from 1.05 to 1.2.
  • the copolymer consists of the free-radically polymerized units of the monomer types a) to d) which are present in the proportions given and generally add up to 100% by weight.
  • the properties for the implementation of hydrophobic substrates are essentially determined by the selection of the monomers in detail and their quantitative proportions. In particular, the balance of the more hydrophilic monomer types a) and the more hydrophobic monomer types d) seem to have an important influence on the implementation of hydrophobic substrates.
  • the binding properties for enzymes are influenced in particular by the selection and the proportion of the monomer type b).
  • the monomer type c) influences the size and porosity of the plastic beads. Size and porosity in turn influence the binding capacity for enzymes and their catalysis behavior in the bound state.
  • the copolymers can also contain small amounts of further vinyl-polymerizable monomers without their essential properties having to be significantly impaired in individual cases.
  • the copolymers consist of 100% radical-polymerized units, the monomers a) to d).
  • Monomers a) contain 5-60, preferably 10 to 50% by weight of vinylically polymerizable monomers with a water solubility of at least 1% at 20 ° C. in the copolymer.
  • Particularly suitable monomers a) are acrylamide and / or methacrylamide, hydroxyalkyl esters of unsaturated polymerizable carboxylic acids, such as hydroxyethyl acrylate, hydroxyethyl methacrylate, hydroxypropyl acrylate, hydroxypropyl methacrylate.
  • z. B N-vinyl pyrrolidone, methyl methacrylate or 3-allyloxy-1, 2-propanediol.
  • Methyl methacrylate and methoxypolyethylene glycol methacrylate are preferred.
  • MPEGMA methoxypolyethylene glycol methacrylate
  • PEGMA polyethylene glycol methacrylate
  • MPEGMA350 methoxypolyethylene glycol methacrylate 350
  • PEGMA polyethylene glycol methacrylate
  • Monomers b) contain 1-40, preferably 10 to 30% by weight of vinylically polymerizable monomers which have an additional functional group, preferably an oxirane group (epoxy group) which can form covalent bonds in a reaction with nucleophilic groups of ligands, are provided.
  • an additional functional group preferably an oxirane group (epoxy group) which can form covalent bonds in a reaction with nucleophilic groups of ligands
  • ligands are preferably biologically active molecules, especially macromolecules, e.g. B. amino acids, peptides, proteins, especially enzymes such as. B. lipases, but also nucleic acids or polysaccharides. Oxirane groups in particular are suitable for binding ligands while maintaining their biological activity.
  • Suitable monomers b) are glycidyl methacrylate and / or allyl glycidyl ether and / or vinyl azlactone.
  • Glycidyl methacrylate is preferred, particularly preferably in an amount of 15 to 25% by weight.
  • Monomers c) contain 10-40, preferably 20 to 35% by weight of hydrophilic, crosslinking, radically polymerizable monomers with two or more ethylenically unsaturated polymerizable groups.
  • B. hydrophilic di (meth) acrylates such as. B. ethylene glycol di (meth) acrylate and polyethylene oxide di (meth) acrylates.
  • Suitable monomers c) are also N, N ' -methylene-bis-acrylamide or N, N ' -methylene-bis-methacrylamide.
  • Preferred monomer c) is 1,4-butanediol dimethacrylate.
  • Monomers d) contain 10-60, preferably 10-30% by weight of vinylically polymerizable monomers with a water solubility of at most 1% at 20 ° C.
  • Suitable monomers d) are, for. B. isobutyl methacrylate, n-butyl methacrylate, cyclohexyl methacrylate, benzyl methacrylate and 2-ethylhexyl methacrylate. production method
  • the macroporous plastic bead material consisting of the copolymers can be prepared in a manner known per se by means of suspension polymerization (bead polymerization).
  • An aqueous phase, which in particular distributors, for. B. contains precipitated aluminum hydroxide, placed in a stirred reactor.
  • the monomers are then used together with a polymerization initiator, e.g. B. dilauryl peroxide, in an organic phase, e.g. B. cyclohexane added.
  • the phases are dispersed with stirring, the polymerization of the monomers z. B. can be done in a temperature range of 60 to 80 ° C.
  • the macroporous plastic bead material can be obtained from the batch by filtration and drying.
  • Variants of the copolymers on which the enzyme lipase from Candida antarctica was immobilized are said to have good results in the following test systems.
  • the enzyme immobilization can e.g. B. by incubating the macroporous plastic bead material with a commercially available enzyme solution (z. B. Novozym® 525F) in aqueous solution for 1 to 2 days at room temperature. The plastic bead material coupled with the enzyme is then washed and dried. The immobilizates obtained in this way can be tested in the following test systems.
  • tributyrin hydrolysis activity of have at least 150 [U / g], preferably at least 300 [U / g], in particular at least 500 [U / g].
  • the immobilizate of macroporous plastic bead material and lipase from Candida antarctica can e.g. B. have a triacetin hydrolysis activity of at least 50 [U / g], preferably at least 100 [U / g], in particular at least 150 [U / g].
  • the immobilizate of macroporous plastic bead material and lipase from Candida antarctica can e.g. B. have a phenylethyl acetate hydrolysis activity of at least 80 [U / g], preferably at least 100 [U / g], in particular at least 150 [U / g].
  • Racemate resolution of 1-phenylethanol by transesterification (non-aqueous system).
  • the immobilizate of copolymer and lipase from Candida antarctica can, for. B. have a phenylethanol racemate cleavage activity of at least 100 [U / g], preferably at least 120 [U / g], in particular at least 180 [U / g].
  • the macroporous plastic bead material can be used for the immobilization of peptides, proteins, nucleic acids or polysaccharides, preferably for the immobilization of lipases from Rhizopus, Aspergillus, Mucor, Alcaligenes, Candida, Pseudomonas, Thermomyces, Chromobacterium, porcine pancreas, and for the immobilization of phospholipases Streptomyces and Actinomadura, as well as for the immobilization of esterases from pig liver and orange peel.
  • the macroporous plastic bead materials according to the invention can be used as carrier materials for the covalent binding of ligands by means of the oxirane groups present in stirred or flow reactors.
  • This can e.g. B. by addition of proteins, in particular enzymes, from concentrated solutions via covalent binding while maintaining their biological activity.
  • proteins, in particular enzymes from concentrated solutions via covalent binding while maintaining their biological activity.
  • peptides, amino acids, lipids, nucleotides, polynucleotides, low molecular weight nucleophilic compounds or organometallic compounds can also be reacted with the oxirane groups of the carrier beads.
  • the polymer beads loaded with ligands can be used in a manner known per se for the stereospecific synthesis of chiral substances, such as amino acids (d-phenylalamine, p-hydroxy-d-phenylalanine, l-tert.-leucine) or drugs, e.g. B. ß-lactam antibiotics, ibuprofen can be used.
  • amino acids d-phenylalamine, p-hydroxy-d-phenylalanine, l-tert.-leucine
  • drugs e.g. B. ß-lactam antibiotics, ibuprofen can be used.
  • the polymer beads can also be used in the separation technique for adsorption chromatography or gel permeation chromatography. For specific adsorption, the polymer beads can be loaded with immunoglobulin fractions from antisera or with monoclonal antibodies.
  • Another area of application is the use of the carrier polymer material loaded with enzymes or antibodies as an adsorbent in extracorporeal therapy, in which pathogenic or toxic substances are removed from whole blood.
  • MPEGMA350 methoxypolyethylene glycol methacrylate 350
  • Example 1 Manufacturing instructions for mixed polymer variant 13
  • the total amount of water [810g] and the aluminum sulfate [5.4g] are placed in a 2L stirred reactor comprising a thermocouple, bath thermostat, reflux condenser, nitrogen inlet tube with stirring and nitrogen inlet and heated to 70 ° C.
  • the soda solution [24g] is added in one go to precipitate the aluminum hydroxide.
  • the auxiliary distributors C15 paraffin sulfonate, Na salt and polyethylene glycol 5000/6000 [0.05 g each] are then added.
  • the pH of the water phase is approximately 5.5. After that:
  • the total amount of water [810g] and the aluminum sulfate [5.4g] are placed in a 2L stirred reactor, comprising a thermocouple, bath thermostat, reflux condenser, nitrogen inlet tube with stirring and nitrogen inlet and heated to 70 ° C.
  • a 2L stirred reactor comprising a thermocouple, bath thermostat, reflux condenser, nitrogen inlet tube with stirring and nitrogen inlet and heated to 70 ° C.
  • the soda solution [24g] is added in one go to precipitate the aluminum hydroxide.
  • the auxiliary distributors C15 paraffin sulfonate, Na salt and polyethylene glycol 5000/6000 [0.05 g each] are then added.
  • the pH of the water phase is approximately 5.5. After that:
  • the average particle diameter is measured with a CIS1 particle analyzer from LOT GmbH.
  • Sample preparation Place enough sample in a 400 ml beaker to reach a concentration of 10 3 -10 6 particles. Then a few drops of detergent are added to the sample as a wetting aid. Then it is filled up with 350 ml deionized water. The suspension obtained is treated with ultrasound for about 1 minute and then measured in the CIS1 device, measuring range 5-600 ⁇ m.
  • the proportion of the pore volume which is accessible to the probe molecule used is determined by inverse size exclusion chromatography (SEC).
  • SEC inverse size exclusion chromatography
  • the distribution coefficient obtained in this way is a measure of the porosity of the sample.
  • a Merck Superformance glass column 300x10 mm is filled with the bead polymer using THF and tetrachlorethylene according to the balanced density principle. The column is then packed and equilibrated by delivering 150 ml of THF at a flow rate of 15 ml / min. The column is then closed and a further 150 ml of tetrahydrofuran (THF) are pumped at a flow rate of 10 ml / min.
  • THF tetrahydrofuran
  • probe molecules are placed one after the other on the column and eluted at a flow rate of 0.2 ml / min.
  • the exclusion limits are determined with o-dichlorobenzene and polystyrene 6770000 (molecular weight 6770000 daltons), polystyrene 10200 (molecular weight 10200 daltons) is used as the probe molecule.
  • the distribution coefficient is calculated from the elution volumes as follows:
  • KpsiO VE (PS10200) - VE (PS6770000) / VE (o-dichlorobenzene) - VE (PS6770000)
  • KPSIO distribution coefficient for polystyrene 10200
  • VE (PS ⁇ 77 OO OO ) elution volume of the exclusion marker polystyrene 6770000
  • VE (o-dichlorobenzene) elution volume of the exclusion marker o-dichlorobenzene.
  • pH stat titrator e.g. B. Mettler DL 50
  • pH stat titrator e.g. B. Schott Titroline Alpha 100 ml double-walled glass vessel Thermostatic water bath stirring station Radiometer TTA 80 pH electrode Schott Blue Line 10 ml burette
  • the reaction vessel is thermostatted to 25 ° C. 16 ml of 0.05M potassium phosphate buffer pH 7.0 are introduced, 100 mg of the investigating immobilisates are added. Then the stirring is started. The reaction is started by adding 400 ⁇ l triacetin. The connected titrator registers the alkali consumption depending on the hydrolysis time. The activity of the enzyme is determined from the linear slope of the curve. The activity in U / g immobilizate can be calculated directly from the value obtained therefrom in ml NaOH / min per amount of enzyme used.
  • pH stat titrator e.g. B. Mettler DL 50
  • Table A Examples of polymer supports produced according to the invention, immobilization method M3-aMEK.
  • Table B Examples of polymer supports produced according to the invention, immobilization method M2.
  • Polymer A Commercially available, macroporous, crosslinked plastic bead material
  • Polymer B Commercially available, macroporous, crosslinked plastic bead material
  • polymer C corresponds to polymer A, but has a lower swelling number ( ⁇ 1.5) (preparation according to DE-A 19804518).

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Makroporöses Kunststoffperlenmaterial mit einem mittleren Teilchendurchmesser von 10 bis 1000 µm, enthaltend ein Mischpolymerisat aus a) 5 - 60 Gew.-% vinylisch polymerisierbaren Monomeren mit einer Wasserlöslichkeit von mindestens 1 % bei 20 °C, b) 1 - 40 Gew.-% vinylisch polymerisierbaren Monomeren mit einer zusätzlichen funktionellen Gruppe, die in einer polymeranalogen Reaktion mit den nucleophilen Gruppen der Liganden kovalente Bindungen eingehen kann, c) 10 - 40 Gew.-% hydrophilen, vernetzenden radikalisch polymerisierbaren Monomeren mit zwei oder mehr ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Gruppen und d) 10 - 60 Gew.-% vinylisch polymerisierbare Monomere mit einer Wasserlöslichkeit von höchstens 1% bei 20 °C enthalten sind, wobei sich die Monomeren a) bis d) in der Regel zu 100 % ergänzen.

Description

Makroporöses Kunststoffperlenmaterial
Die Erfindung betrifft das Gebiet der Polymerträgersysteme und insbesondere ein makroporöses Kunststoffperlenmaterial, enthaltend ein Mischpolymerisat aus vernetztem (Meth)acrylat-Kunststoff.
Stand der Technik
Polymerträgersysteme, enthaltend Mischpolymerisate aus vernetztem (Meth)acrylat-Kunststoff sind bekannt, z. B. aus EP-A 0 328767, EP-A 424 130, EP-A 579 928 oder aus WO 99/33964.
WO 99/40122 (DE-A 19804518) betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines perlförmigen, vernetzten hydrophilen, gegenüber Liganden mit nucleophilen Gruppen bindungsaktiven Mischpolymerisats durch inverse Suspensionspolymerisation einer Monomerenphase. Die Erfindung betrifft weiterhin die daraus erhältlichen Trägerpolymermaterialien mit hoher Bindungskapazität für Penicillinamidase und niedriger Quellzahl sowie deren Verwendung.
Das Mischpolymerisat aus vernetztem (Meth)acrylat-Kunststoff wird durch inverse Suspensionspolymerisation der folgenden Monomere erhalten:
a) 5 - 40 Gew.-% hydrophile radikalisch polymerisierbare Monomere mit einer Vinylgruppe, die bei Raumtemperatur wenigstens 10 %-ige wäßrige Lösungen bilden b) 30 - 50 Gew.-% radikalisch polymerisierbaren Monomere mit einer Vinylgruppe und einer zusätzlichen funktioneilen Gruppe, die in einer polymeranalogen Reaktion mit den nucleophilen Gruppen der Liganden kovalente Bindungen eingehen kann
c) 20 - 60 Gew.-% hydrophile, vernetzende radikalisch polymerisierbare Monomere mit zwei oder mehr ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Gruppen
Das Mischpolymerisat eignet sich als Trägermaterial für verschiedene Enzymtypen.
Aufgabe und Lösung
Ausgehend von der WO 99/40122 sollten weitere makroporöse Kunststoffperlenmaterialien bereitgestellt werden, die sich als effiziente Trägermaterialien insbesondere für Enzyme eignen, die relativ hydrophobe Substrate umzusetzen vermögen, bevorzugt für Lipasen. Dabei sollten die vorteilhaften Eigenschaften der bekannten Materialien gemäß der WO 99/40122, z. B. deren niedrige Quellungszahlen, nach Möglichkeit nicht beeinträchtigt werden. Es sollten weiterhin makroporöse Kunststoffperlenmaterialien bereitgestellt werden, die nach Bindung von Lipasen vergleichsweise hohe Aktivitäten in Testsystemen wie der Tributyrin- Hydrolyse, der Triacetin-Hydrolyse, der Phenylethylacetat-Hydrolyse und/oder Phenylethylacetat-Synthese zeigen. Die Aufgabe wird gelöst durch ein makroporöses Kunststoffperlenmaterial mit einem mittleren Teilchendurchmesser im Bereich von 10 bis 1000 μm, enthaltend ein Mischpolymerisat aus
a) 5 - 60 Gew.-% vinylisch polymerisierbaren Monomeren mit einer Wasserlöslichkeit von mindestens 1 % bei 20 °C,
b) 1 - 40 Gew.-% vinylisch polymerisierbaren Monomeren mit einer zusätzlichen funktionellen Gruppe, die in einer Reaktion mit nucleophilen Gruppen von Liganden kovalente Bindungen eingehen kann,
c) 10 - 40 Gew.-% hydrophilen, vernetzenden radikalisch polymerisierbaren Monomeren mit zwei oder mehr ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Gruppen,
dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich
d) 10 - 60 Gew.-% vinylisch polymerisierbare Monomere mit einer Wasserlöslichkeit von höchstens 1 % bei 20 °C enthalten sind, wobei sich die Monomeren a) bis d) in der Regel zu 100 % ergänzen.
Ausführung der Erfindung
Mittlerer Teilchendurchmesser Vm
Das Makroporöse Kunststoffperlenmaterial hat einen mittleren Teilchendurchmesser V50 von 10 bis 1000, bevorzugt von 50 bis 600, besonders bevorzugt von 100 bis 500, insbesondere von 200 bis 400 μm.
Die Bestimmung von des mittleren Teilchendurchmessers V50 kann z. B. mit einem Teilchenanalysator erfolgen. Dabei wird in der Regel eine Probe mit einer Teilchenkonzentration im Bereich von 103-106 Teilchen mit etwas Detergenz als Benetzungshilfe versetzt und zusätzlich vor der Messung mit Ultraschall zur Separierung der Teilchen behandelt.
Porosität
Das makroporöse Kunststoffperlenmaterial kann eine Porosität aufweisen, die sich durch einen KpSιo-Wert von 0,3 bis 0,9, insbesondere von 0,35 bis 0,6, meßbar z. B. mittels inverser Größenausschlußchromatographie in Tetrahydrofuran, charakterisieren läßt.
Quellungszahl in Wasser
Das makroporöse Kunststoffperlenmaterial kann eine Quellungszahl in Wasser von 1 bis 1 ,5, insbesondere von 1 ,05 bis 1 ,2 aufweisen. Monomerzusammensetzunq
Das Mischpolymerisat besteht erfindungsgemäß aus den radikalisch polymerisierten Einheiten der Monomertypen a) bis d), die in den angegebenen Mengenverhältnissen vorliegen und sich in der Regel zu 100 Gew.-% addieren. Die Eigenschaften zur Umsetzung hydrophober Substrate wird dabei wesentlich durch die Auswahl der Monomeren im Einzelnen und deren mengenmäßige Anteile bestimmt. Insbesondere die Balance der hydrophileren Monomertypen a) und der hydrophoberen Monomertypen d) scheinen einen wichtigen Einfluß auf die Umsetzung hydrophober Substrate zu haben.
Die Bindungseigenschaften für Enzyme wird insbesondere von der Auswahl und dem Anteil des Monomertyps b) beeinflußt. Der Monomertyp c) beeinflußt als Vernetzer die Größe und Porosität der Kunststoffperlen. Größe und Porosität beeinflussen wiederum die Bindungskapazität für Enzyme und deren Katalyseverhalten im gebundenen Zustand.
Es ist für einen Fachmann ersichtlich, daß die Mischpolymerisate auch in geringen Anteilen weitere vinylisch polymerisierbare Monomere enthalten können, ohne daß deren wesentliche Eigenschaften im Einzelfall davon wesentlich beeinträchtigt werden müssen. In der Regel bestehen die Mischpolymerisate jedoch zu 100 % aus radikalisch polymerisierten Einheiten die Monomere a) bis d).
Monomere a)
Als Monomere a) sind 5 - 60, bevorzugt 10 bis 50 Gew.-% vinylisch polymerisierbare Monomere mit einer Wasserlöslichkeit von mindestens 1 % bei 20 °C im Mischpolymerisat enthalten. Als Monomere a) sind insbesondere Acrylamid und/oder Methacrylamid, Hydroxyalkylester von ungesättigten polymerisierbaren Carbonsäuren, wie Hydroxyethylacrylat, Hydroxyethylmethacrylat, Hydroxypropylacrylat, Hydroxypropylmethacrylat geeignet. Weiterhin eignen sich z. B. N- Vinylpyrrolidon, Methylmethacrylat oder 3-Allyloxy-1 ,2-propandiol. Bevorzugt sind Methylmethacrylat und Methoxypolyethylenglykolmethacrylat (MPEGMA), Polyethylenglykolmethacrylat (PEGMA), insbesondere Methoxypolyethylenglykolmethacrylat 350 (MPEGMA350) und Polyethylenglykolmethacrylat (PEGMA).
Gute Resultate werden insbesondere erhalten, wenn gleichzeitig Methoxypolyethylenglykolmethacrylat, z. B. MPEGMA350, und Methylmethacrylat im Mischpolymerisat enthalten sind. In Summe können z. B. 30 bis 45 Gew.-% der beiden Monomere enthalten sein.
Monomere b)
Als Monomere b) sind 1 - 40, bevorzugt 10 bis 30 Gew.-% vinylisch polymerisierbare Monomere enthalten, die mit einer zusätzlichen funktionellen Gruppe, bevorzugt einer Oxirangruppe (Epoxygruppe), die in einer Reaktion mit nucleophilen Gruppen von Liganden kovalente Bindungen eingehen kann, versehen sind.
Unter Liganden sind bevorzugt biologisch aktive Moleküle, insbesondere Makromoleküle, z. B. Aminosäuren, Peptide, Proteine, insbesondere Enzyme wie z. B. Lipasen, aber auch Nucleinsäuren oder Polysaccharide zu verstehen. Insbesondere Oxirangruppen sind geeignet, um Liganden unter Erhaltung ihrer biologischen Aktivität zu binden. Geeignete Monomere b) sind Glycidylmethacrylat und/oder Allylglycidylether und/oder Vinylazlacton.
Bevorzugt ist Glycidylmethacrylat, besonders bevorzugt in einer Menge von 15 bis 25 Gew.-%.
Monomere c)
Als Monomere c) sind 10 - 40, bevorzugt 20 bis 35 Gew.-% von hydrophilen, vernetzenden radikalisch polymerisierbaren Monomeren mit zwei oder mehr ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Gruppen enthalten.
Geeignet sind z. B. hydrophile Di(meth)acrylate, wie z. B. Ethylenglykoldi(meth)acrylat und Polyethylenoxid-Di(meth)acrylate. Geeignete Monomere c) sind weiterhin N,N'-Methylen-bis-Acrylamid oder N,N'-Methylen- bis-Methacrylamid.
Bevorzugtes Monomer c) ist 1 ,4-Butandioldimethacrylat.
Monomere d)
Als Monomere d) sind 10 - 60, bevorzugt 10 bis 30 Gew.-% vinylisch polymerisierbare Monomere mit einer Wasserlöslichkeit von höchstens 1 % bei 20 °C enthalten.
Geeignete Monomere d) sind z. B. Isobutylmethacrylat, n-Butylmethacrylat, Cyclohexylmethacrylat, Benzylmethacrylat und 2-Ethylhexylmethacrylat. Herstellungsverfahren
Die aus den Mischpolymerisate bestehende makroporöse Kunststoffperlenmaterial kann in an sich bekannter Weise mittels Suspensionspolymerisation (Perlpolymerisation) hergestellt werden. Dabei wird eine wäßrige Phase, die insbesondere Verteiler, z. B. ausgefälltes Aluminiumhydroxid, enthält, in einem Rührreaktor vorgelegt. Die Monomeren werden anschließend zusammen mit einem Polymerisationsinitiator, z. B. Dilaurylperoxid, in einer organischen Phase, z. B. Cyclohexan, zugegeben. Die Phasen werden dabei unter Rühren dispergiert, wobei die Polymerisation der Monomeren z. B. in einem Temperaturbereich von 60 bis 80 °C erfolgen kann. Das makroporöse Kunststoffperlenmaterial kann durch Filtration und Trocknung aus dem Ansatz gewonnen werden.
Varianten der Mischpolymerisate/Testsysteme
Varianten der Mischpolymerisate, auf denen das Enzym Lipase aus Candida antarctica immobilisiert wurde, sollen in folgenden Testsystemen gute Resultate aufweisen. Die Enzymimmobilisierung kann z. B. durch Inkubation des makroporösen Kunststoffperlenmaterials mit einer handelsüblichen Enzymlösung (z. B. Novozym® 525F) in wäßriger Lösung für 1 bis 2 Tage bei Raumtemperatur erfolgen. Anschließend wird das mit dem Enzym gekoppelte Kunststoffperlenmaterial gewaschen und getrocknet. Die so erhaltenen Immobilisate können in den folgenden Testsystemen geprüft werden.
Hydrolyse von Tributyrin (wässriges System und wasserlösliches Substrat). Das Immobilisat aus makroporösen Kunststoffperlenmaterial und Lipase aus Candida antarctica kann z. B. eine Tributyrin-Hydrolyse-Aktivität von mindestens 150 [U/g], bevorzugt mindestens 300 [U/g], insbesondere von mindestens 500 [U/g] aufweisen.
Hydrolyse von Triacetin (wässriges System, wasserunlösliches Substrat). Das Immobilisat aus makroporösen Kunststoffperlenmaterial und Lipase aus Candida antarctica kann z. B. eine Triacetin-Hydrolyse-Aktivität von mindestens 50 [U/g], bevorzugt mindestens 100 [U/g], insbesondere von mindestens 150 [U/g] aufweisen.
Hydrolytische Racematspaltung von 1 -Phenylethylacetat (wässriges System, wasserunlösliches Substrat). Das Immobilisat aus makroporösen Kunststoffperlenmaterial und Lipase aus Candida antarctica kann z. B. eine Phenylethylacetat -Hydrolyse-Aktivität von mindestens 80 [U/g], bevorzugt mindestens 100 [U/g], insbesondere von mindestens 150 [U/g] aufweisen.
Racematspaltung von 1-Phenylethanol durch Transesterifizierung (nichtwässriges System). Das Immobilisat aus Mischpolymerisat und Lipase aus Candida antarctica kann z. B. eine Phenylethanol -Racematspaltungs- Aktivität von mindestens 100 [U/g], bevorzugt mindestens 120 [U/g], insbesondere von mindestens 180 [U/g] aufweisen.
Verwendungen
Das makroporöse Kunststoffperlenmaterial kann zur Immobilisierung von Peptiden, Proteinen, Nucleinsäuren oder Polysacchariden verwendet werden, bevorzugt zur Immobilisierung von Lipasen aus Rhizopus, Aspergillus, Mucor, Alcaligenes, Candida, Pseudomonas, Thermomyces, Chromobacterium, Schweinepankreas, sowie zur Immobilisierung von Phospholipasen aus Streptomyces und Actinomadura, sowie zur Immobilisierung von Esterasen aus Schweineleber und Orangenschalen.
Die erfindungsgemäßen makroporösen Kunststoffperlenmaterialien können als Trägermaterialien zur kovalenten Bindung von Liganden mittels der vorhandenen Oxirangruppen in Rühr- oder Durchflußreaktoren eingesetzt werden. Dies kann z. B. durch Anlagerung von Proteinen, insbesondere Enzymen, aus konzentrierten Lösungen über kovalente Bindung unter Beibehaltung ihrer biologischen Aktivität erfolgen. Weiterhin können auch Peptide, Aminosäuren, Lipide, Nucleotide, Polynukleotide, niedermolekulare nucleophile Verbindungen oder metallorganische Verbindungen mit den Oxirangruppen der Trägerperlen umgesetzt werden.
Die mit Liganden beladenen Polymerperlen können in an sich bekannter Weise zur stereospezifischen Synthese von chiralen Substanzen, wie Aminosäuren (d- Phenylalamin, p-Hydroxy-d-phenylalanin, l-tert.-Leucin) oder Arzneimitteln, z. B. ß-Lactamantibiotika, Ibuprofen, eingesetzt werden.
Ein weiteres Anwendungsgebiet sind Synthesen von Feinchemikalien oder Grundprodukten für chemische Synthesen (z. B. Apfelsäure). Die Polymerperlen können auch in der Separationstechnik zur Adsorptionschromatographie oder Gelpermeationschromatographie verwendet werden. Zur spezifischen Adsorption können die Polymerperlen mit Immunglobulin-Fraktionen aus Antiseren oder mit monoklonalen Antikörpern beladen werden. Als weiteres Einsatzgebiet ist die Verwendung des mit Enzymen oder Antikörpern beladenen Trägerpolymermaterials als Adsorbens in der extrakorporalen Therapie, in der pathogene bzw. toxische Substanzen aus Vollblut entfernt werden, zu nennen. BEISPIELE
1. Beispiele für Mischpolymerisatvarianten
Übersichtstabelle der Mischpolymerisatvarianten
MPEGMA350 = Methoxypolyethylenglykolmethacrylat 350
Beispiel 1 : Herstellvorschrift für die Mischpolvmerisatvariante 13
Phasenverhältnisse:
WasseπMonomeres (+ Lösemittel) = 2:1 ( ist variierbar), z. B. 1 :1 oder 1 :2.
Monomere:Lösungsmittel = 2:1 ( ist variierbar), z. B. 1 :1 oder 1 :2
Die gesamte Wassermenge [810g] und das Aluminiumsulfat [5,4g] werden in einem 2L Rührreaktor, umfassend Thermoelement, Badthermostat, Rückflusskühler, Stickstoff-einleitrohr unter Rühren und Stickstoffeinleitung vorgelegt und auf 70°C aufgeheizt. Bei Erreichen der vorgegebenen Innentemperatur wird in einem Zug die Sodalösung [24g] zur Fällung des Aluminiumhydroxids zugegeben. Anschließend erfolgt die Zugabe der Hilfsverteiler C15-Paraffinsulfonat,Na-Salz und Polyethylenglykol 5000/6000 [je 0,05g]. Der pH-Wert der Wasserphase beträgt ca 5,5 . Danach werden :
74g Isobutylmethacrylat,
74g Methylmethacrylat,
54g Glycidylmethacrylat,
67,5g 1 ,4-Butandioldimethacrylat sowie
5,4g Dilauroylperoxid in 135g Cyclohexan gelöst, zugegeben. In den nächsten 20 Minuten steigt die Innentemperatur von 70°C auf 72°C an. Nach dem Temperaturmaximum wird noch 2 Stunden bei 70°C nacherhitzt. Anschließend wird auf 40°C abgekühlt und mit 10ml 50%iger Schwefelsäure angesäuert. Der Ansatz wird weiter abgekühlt, auf eine Porzellannutsche (Tuchfilter) abgelassen und mit 5L deion. H20 gewaschen. Die feuchten Perlen werden im Wirbelschichttrockner bei 50- 60°C 90 Minuten getrocknet. Beispiel 2: Herstellvorschrift für die Mischpolvmerisatvariante 60
Die gesamte Wassermenge [810g] und das Aluminiumsulfat [5,4g] werden in einem 2L Rührreaktor, umfassend Thermoelement, Badthermostatt, Rückflusskühler, Stickstoff-einleitrohr unter Rühren und Stickstoffeinleitung vorgelegt und auf 70°C aufgeheizt. Bei Erreichen der vorgegebenen Innentemperatur wird in einem Zug die Sodalösung [24g] zur Fällung des Aluminiumhydroxids zugegeben. Anschließend erfolgt die Zugabe der Hilfsverteiler C15-Paraffinsulfonat,Na-Salz und Polyethylenglykol 5000/6000 [je 0,05g]. Der pH-Wert der Wasserphase beträgt ca 5,5 . Danach werden :
54g Isobutylmethacrylat,
54g Methylmethacrylat,
54g Glycidylmethacrylat,
67,5g 1 ,4-Butandioldimethacrylat
40,5g Methoxypolyethylenglykolmethacrylat sowie
5,4g Dilauroylperoxid in 135g Cyclohexan gelöst, zugegeben. In den nächsten 20 Minuten steigt die Innentemperatur von 70°C auf 72°C an. Nach dem Temperaturmaximum wird noch 2 Stunden bei 70°C nacherhitzt. Anschließend wird auf 40°C abgekühlt und mit 10ml 50%iger Schwefelsäure angesäuert. Der Ansatz wird weiter abgekühlt, auf eine Porzellannutsche (Tuchfilter) abgelassen und mit 5L deion. H20 gewaschen. Die feuchten Perlen werden im Wirbelschichttrockner bei 50- 60°C 90 Minuten getrocknet. Beispiel 3: Polymeranalytik der Mischpolymerisatvarianten
Bestimmung von des mittleren Teilchendurchmessers V50:
Der mittlere Teilchendurchmesser wird mit einem CIS1-Teilchenanalysator der Firma L.O.T. GmbH gemessen. Probenvorbereitung: Es wird soviel Probe in ein 400ml-Becherglas gegeben, dass eine Konzentration von 103-106 Teilchen erreicht wird. Dann werden einige Tropfen eines Detergenz als Benetzungshilfe auf die Probe gegeben. Dann wird mit 350ml VE-Wasser aufgefüllt. Die erhaltene Suspension wird ca. 1 Minute mit Ultraschall behandelt und dann im CIS1 -Gerät, Messbereich 5-600μm, vermessen.
Bestimmung des Verteilungskoeffizienten KPSι0:
Durch inverse Größenausschlußchromatographie (SEC) wird der Anteil des Porenvolumens bestimmt, der dem eingesetzten Sondenmolekül zugänglich ist. Der so erhaltene Verteilungskoeffizient ist ein Maß für die Porosität der Probe. Eine Merck Superformance-Glassäule 300x10 mm wird nach dem balanced density-Prinzip mit THF und Tetrachlorethylen mit dem Perlpolymerisat befüllt. Dann wird die Säule gepackt und äquilibriert, indem 150 ml THF mit einer Flussrate von 15 ml/min gefördert werden. Danach wird die Säule verschlossen und es werden weitere 150 ml Tetrahydrofuran (THF) mit einer Flussrate von 10 ml/min gefördert. Drücke von > 20bar sind dabei zu vermeiden, da die Säule dann zu stark komprimiert und keine geeignete Säulenpackung erreicht wird. Dann werden nacheinander die Sondenmoleküle auf die Säule gegeben und bei einer Flussrate von 0.2 ml/min eluiert. Die Ausschlussgrenzen werden mit o- Dichlorbenzol und Polystyrol 6770000 (Molekulargewicht 6770000 Dalton) bestimmt, als Sondenmolekül dient Polystyrol 10200 (Mokulargewicht 10200 Dalton).
Der Verteilungskoeffizient wird aus den Elutionsvolumina wie folgt berechnet:
KpsiO = VE(PS10200) - VE(PS6770000) / VE(o-Dichlorbenzol) — VE(PS6770000)
Wobei:
KPSIO = Verteilungskoeffizient für Polystyrol 10200,
VE(PSIO2OO> = Elutionsvolumen des Sondenmoleküls Polystyrol 10200,
VE(PSΘ77OOOO) = Elutionsvolumen des Ausschlussmarkers Polystyrol 6770000,
VE(o-Dichiorbenzoi) = Elutionsvolumen des Ausschlußmarkers o-Dichlorbenzol.
Bestimmung der Quellungszahl:
3g Träger werden in einen 25 ml-Meßzylinder mit 0,5ml-Graduierung eingewogen. Die Oberfläche wird durch leichtes Aufstampfen des Messzylinders geglättet und das Füllvolumen VT in ml notiert. Nun werden 9 ml 0.01 % Polysorbat 80-Lösung in ultrafiltriertem Wasser zugegeben und der Messzylinder verschlossen. Innerhalb einer Stunde der Messzylinder viermal in 15 Minuten-Abständen kräftig geschüttelt. Danach werden die an der Wandung anhängenen Perlen mit 2 bis 3 ml 0.01% Polysorbat 80-Lösung in ultrafiltriertem Wasser heruntergespült. Der Messzylinder wird 2 Stunden ruhig stehengelassen, dann wird das Volumen des abgesetzten und des notierenden Materials abgelesen und addiert zu VQ. Die Quellungszahl ist definiert als der Quotient VQΛ T. Beispiel 4: Immobilisierungsmethoden:
Methode M2:
4 ml Enzymiösung Novozym 525F in 16 ml einer 10 Vol-%igen Lösung von tert.-Amylalkohol in dest. Wasser geben. Diese Lösung zu 2 g trockenem Träger geben. Ansatz bei 20°C 1.5 d schwenken. Dann die Perlen auf eine Glasfritte Por 2 spülen und waschen mit 6x50ml dest. Wasser. Nach dem letzten Spülen scharf absaugen. Im Exsiccator über Trockengel trocknen.
Methode M3:
4 ml Enzymiösung Novozym 525F und 6 ml Reinstwasser mischen. Mischung zu 2 g trockenem Träger geben. Umschwenken, dann 1.5d bei Raumtemp. überkopfschütteln. Dann die Perlen auf eine Glasfritte Por 2 spülen und waschen mit 3x50ml dest. Wasser und 3x50ml 0.1 M Kaliumphosphatpuffer pH 7.5. Nach der letzten Waschung scharf absaugen und über Trockengel im Exsiccator trocknen.
Methode M3-aMEK:
4 ml Enzymiösung Novozym 525F und 6 ml Reinstwasser mischen. Mischung zu 2 g trockenem Träger geben. Umschwenken, dann 1.5d bei Raumtemp. überkopfschütteln. Dann die Perlen auf eine Glasfritte Por 2 spülen und waschen mit 6x50ml dest. Wasser. Zur Trocknung scharf absaugen und auf der Glasfritte mit 6x50ml Methylethylketon (MEK) chromatographisch waschen, dann zur Trockne absaugen (ca. 30 min). Statt MEK können auch andere, teilweise oder komplett wassermischbare Lösungsmittel wie THF, tert.- Amylalkohol, Isopropanol, Aceton verwendet werden. Methode M4:
4 ml Enzymiösung Novozym 525F und 6 ml 1M KPP pH 7.5 mischen. Mischung zu 2 g trockenem Träger geben. Umschwenken, dann 1.5d bei 23°C stehen lassen. Dann die Perlen auf eine Glasfritte Por 2 spülen und waschen mit 3x50ml dest. Wasser und 3x50ml 0.1 M Kaliumphosphatpuffer pH 7.5. Nach dem letzten Spülen scharf absaugen. Im Exsiccator über Trockengel trocknen.
Beispiel 5: Aktivitätstests:
5.1 Tributyrin-Hydrolvse
Im Aktivitätstest wird die Freisetzung von Buttersäure durch Titration mit 1 M
NaOH-Lösung unter konstanten pH-Bedingungen gemessen.
Geräte: pH-stat-Titrator, z. B. Mettler DL 50
100 ml Glasgefäß (dem Standardgefäß von Mettler-Toledo ähnlich) pH-Elektrode DG-111-SC
10 ml-Bürette
Mettler-Propellerrührer Geschwindigkeit 80%
Ansatzgröße:
48,5 ml Puffer pH 7,0 Fluka 82571
5 mmol Tributyrin (100 mM) 50 mg Enzym-Immobilisat
Durchführung:
1 ,47 ml (5 mmol) Tributyrin wurden in 48,5 ml 0,5 M Phosphatpuffer pH 7,0 mit Hilfe eines Propellerrührers bei Raumtemp. 5 min emulgiert. Der pH-Wert der Emulsion wurde duch Zugabe von 1 M Natronlauge auf pH 7,0 eingestellt (Vortitration). Anschließend fügt man 50 mg Immobilisat hinzu, womit die Reaktion gestartet wird. Der angeschlossene Titrator registriert den Laugenverbrauch in Abhängigkeit von der Hydrolysezeit. Die Aktivität des Enzyms wird aus der linearen Steigung der Kurve bestimmt. Aus dem daraus erhaltenen Wert in ml/min pro eingesetzte Enzymmenge kann direkt die Aktivität in U/g Immobilisat berechnet werden.
5.2 Triacetin-Hydrolyse
Im Aktivitätstest wird die Freisetzung von Essigsäure durch Titration mit 0.1 M
NaOH-Lösung unter konstanten pH-Bedingungen gemessen.
Geräte: pH-stat-Titrator, z. B. Schott Titroline Alpha 100 ml Doppelmantel-Glasgefäß Thermostatisierbares Wasserbad Rührstand Radiometer TTA 80 pH-Elektrode Schott Blue Line 10 ml-Bürette
Ansatzgröße:
16 ml 0.05M Kaliumphosphatpuffer pH 7,0 400 μl Triacetin Merck No. 108238 100 mg Enzym-Immobilisat
Durchführung:
Das Reaktionsgefäß wird auf 25°C thermostatisiert. 16 ml 0.05M Kaliumphosphatpuffer pH 7,0 werden vorgelegt, 100 mg des zu untersuchenden Immobilisats werden hinzgefügt. Dann wird die Rührung begonnen. Die Reaktion wird durch Zugabe von 400 μl Triacetin gestartet. Der angeschlossene Titrator registriert den Laugenverbrauch in Abhängigkeit von der Hydrolysezeit. Die Aktivität des Enzyms wird aus der linearen Steigung der Kurve bestimmt. Aus dem daraus erhaltenen Wert in ml NaOH / min pro eingesetzte Enzymmenge kann direkt die Aktivität in U/g Immobilisat berechnet werden.
5.3 Phenylethylacetat-Hydrolyse
Im Aktivitätstest wird die Freisetzung von Essigsäure aus (±)-1- Phenylethylacetat durch Titration mit 1 M NaOH-Lösung unter konstanten pH- Bedingungen gemessen.
Geräte: pH-stat-Titrator, z. B. Mettler DL 50
25 ml Halbmikrogefäß aus Glas (Standardgefäß von Mettler-Toledo)
Mikro-pH-Elektrode Mettler N 6000 A
5 ml-Bürette
Mettler Mikro-Propellerrührer Geschwindigkeit 100%
Ansatzgröße:
19,2 ml Puffer pH 7,0 Fluka 82571
5 mmol (±)-1-Phenylethylacetat (250 mM)
100 mg Enzym-Immobilisat
Durchführung:
800 μl (5 mmol) (±)-1-Phenylethylacetat wurden in 19,2 ml 0,5 M Phosphatpuffer pH 7,0 mit Hilfe eines Mikro-Propellerrührers bei RT 5 min emulgiert. Der pH-Wert der Emulsion wurde duch Zugabe von 1 M Natronlauge auf pH 7,0 eingestellt (Vortitration). Anschließend fügt man 100 mg Immobilisat hinzu, womit die Reaktion gestartet wird. Der angeschlossene Titrator registriert den Laugenverbrauch in Abhängigkeit von der Hydrolysezeit. Die Aktivität des Enzyms wird aus der linearen Steigung der Kurve bestimmt. Aus dem daraus erhaltenen Wert in ml/min pro eingesetzte Enzymmenge kann direkt die Aktivität in U/g Immobilisat berechnet werden.
Nach ca. 50 %-igem Umsatz des Acetates wird die Reaktion abgebrochen, das Enzym abfiltriert und mit Methyl-tert.-butylether (MTBE) nachgewaschen. Das Hydrolysat wird 3 mal mit MTBE extrahiert und die vereinigten organischen Phasen über MgSO4 getrocknet und das Lösungsmittel einrotiert. Im Rückstand bestimmt man mittels HPLC an einer chiralen Säule (Daicel Chiralcel OD-H) den Umsatz sowie die Enantiomerenüberschüsse für Edukt und Produkt. HPLC-Methode:
Bed.: Hexan : .-Butanol 98,0:2,0
Flow 0,5 ml/min > 1 ,0 ml/min
Detektion 254 nm
Säulenofentemp. 20°C
(±)-1-Phenylethylacetat (R) bzw. (S) Rt = 11 ,1 min ; Rt = 11 ,9 min
Phenylaceton Rt = 14.9 min
(±)-1-Phenylethanol (R) bzw. (S) Rt = 25,6 min ; Rt = 39,1 min
5.4 Phenylethylacetat-Svnthese
Es wir die Veresterung von (±)-1-Phenylethanol mit Vinylacetat zu (R)-1- Phenylethylacetates bestimmt. Der Reaktionsfortschritt wird mittels HPLC bestimmt. Dabei wird die Synthese des (R)-1 -Phenylethylacetat.es und die Abnahme von (R)-I-Phenylethanol beobachtet. Aus der Steigung der Synthesekurve wird dann die spezifische Aktivität des Enzyms berechnet. Geräte:
25 ml und 10 ml Schraubdeckelgläschen Ika Orbitalschüttler (500 rpm)
Ansatzgröße:
20 ml bzw. 8 ml MTBE
2 mmol bzw. 0,8 mmol (±)-1-Phenylethanol
6 mmol bzw. 2,4 mmol Vinylacetat
50 mg Enzym-Immobilisat
Durchführung:
0,8 mmol (±)-1-Phenylethanol und 2,4 mmol Vinylacetat wurden in 8 ml MTBE in 10 ml Schraubdeckelgläschen bei 40 °C Reaktionstemperatur auf einem Orbitalschüttler bei 500 rpm geschüttelt. In definierten Zeitabständen von 10 min wurden bis zur ersten Stunde 20 μl Proben entnommen, mit 400 μl Acetonitril versetzt und auf einer HPLC-Säule analysiert. Der Umsatz zur Bestimmung der Enzymaktivität wird auf einer RP-18-HPLC-Säule bestimmt (Säule Lichrospher RP-18 (250mm x 5μm), Wasser : Acetonitril 50:50; Flow 0,5 ml; 254nm; RT). Der Enantiomerenüberschuß wird mittels HPLC an einer chiralen Phase (Daicel Chiralcel OD-H) bestimmt. HPLC-Methode siehe oben.
Beispiel 6: Aktivität der Immobilisate:
Tabelle A: Beispiele erfindungsgemäß hergestellter Polymerträger, Immobilisierungsmethode M3-aMEK.
Betrifft die beiden rechten Spalten: Enantiomerenreinheit der Produkte in allen Fällen >99%ee.
Tabelle B: Beispiele erfindungsgemäß hergestellter Polymerträger, Immobilisierungsmethode M2.
n.b. = nicht bestimmt Betrifft die beiden rechten Spalten: Enantiomerenreinheit der Produkte in allen Fällen >99%ee. Tabelle C: Vergleichsbeispiele (Immobilisierungsmethoden M3 und M4).
Betrifft die beiden rechten Spalten: Enantiomerenreinheit der Produkte in allen Fällen >99%ee.
Polymer A: Handelsübliches makroporöses vernetztes Kunststoffperlenmaterial aus
10 Gew.-% Methacrylamid
20 Gew.-% Glycidylmethacrylat
20 Gew.-% Allylglycidylether
50 Gew.-% N,N'-Methylenbismethacrylamid,
Polymer B: Handelsübliches makroporöses vernetztes Kunststoffperlenmaterial aus
30 Gew.-% Methacrylamid
20 Gew.-% Glycidylmethacrylat
20 Gew.-% Allylglycidylether
30 Gew.-% N,N'-Methylenbismethacrylamid,
Polymer C entspricht in der Monomer-Zusammensetzung Polymer A, weist jedoch eine geringere Quellungszahl (< 1 ,5) auf (Herstellung gemäß DE-A 19804518).

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Makroporöses Kunststoffperlenmaterial mit einem mittleren Teilchendurchmesser von 10 bis 1000 μm, enthaltend ein Mischpolymerisat aus
a) 5 - 60 Gew.-% vinylisch polymerisierbaren Monomeren mit einer Wasserlöslichkeit von mindestens 1 % bei 20 °C,
b) 1 - 40 Gew.-% vinylisch polymerisierbaren Monomeren mit einer zusätzlichen funktionellen Gruppe, die in einer Reaktion mit nucleophilen Gruppen von Liganden kovalente Bindungen eingehen kann,
c) 10 - 40 Gew.-% hydrophilen, vernetzenden radikalisch polymerisierbaren Monomeren mit zwei oder mehr ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Gruppen,
dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich
d) 10 - 60 Gew.-% vinylisch polymerisierbare Monomere mit einer Wasserlöslichkeit von höchstens 1 % bei 20 °C enthalten sind, wobei sich die Monomeren a) bis d) in der Regel zu 100 % ergänzen.
2. Makroporöses Kunststoffperlenmaterial nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Porosität durch einen KPsιo-Wert von 0,3 bis 0,9, gemessen mittels inverser Größenausschlußchromatographie in Tetrahydrofuran, charakterisiert ist.
3. Makroporöses Kunststoffperienmaterial nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Quellungszahl in Wasser von 1 bis 1 ,5 aufweist.
4. Makroporöses Kunststoffperienmaterial nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Monomere a) Methoxypolyethylenglykolmethacrylat und Methylmethacrylat im Mischpolymerisat enthalten sind.
5. Makroporöses Kunststoffperienmaterial nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es nach Immobilisierung von Lipase aus Candida antarctica Tributyrin-Hydrolyse- Aktivität von mindestens 150 [U/g] erreicht.
6. Makroporöses Kunststoffperienmaterial nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es nach Immobilisierung von Lipase aus Candida antarctica eine Phenylethylacetat -Hydrolyse-Aktivität von mindestens 80 [U/g] erreicht.
7. Makroporöses Kunststoffperienmaterial nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es nach Immobilisierung von Lipase aus Candida antarctica eine Phenylethanol - Racematspaltungs-Aktivität von mindestens 100 [U/g] erreicht.
8. Verfahren zur Herstellung eines makroporösen Kunststoffperlenmaterials nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 7 mittels Suspensionspolymerisation.
. Verwendung des makroporöses Kunststoffperienmaterials nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 7 zur kovalenten Bindung von Liganden wie z. B. Aminosäuren, Peptiden, Proteinen, insbesondere Enzymen oder Antikörpern, Nucleinsäuren oder Polysacchariden.
10. Verwendung nach Anspruch 9 zur Immobilisierung von Lipasen.
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