JPH08511945A - カルボン酸と第三アルコールのエステル化法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 低水分条件下で、カンジダ・アンタルクティカ（Ｃａｎ ｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）のリパーゼＡ又は第三アルコールエステルに関してカンジダ・アンタルクティカのリパーゼＡと同様の基質活性をもつリパーゼ種を用いて、アルコール部分がそのエステル結合付近に立体障害をもつエステル（すなわち、第三アルコールから誘導されるエステル）を酵素的に製造する。

Description

【発明の詳細な説明】 カルボン酸と第三アルコールのエステル化法 本発明は、リパーゼを使用してカルボン酸を酵素的にエステル化するための方 法に関する。 例えば国際公開ＷＯ-Ａ-８８/０２７７５号（Ｎｏｖｏ Ｉｎｄｕｓｔｒｉ Ａ/Ｓ）などから、エステルの加水分解、エステル合成及びエステル交換（アシ ドリシス、アルコーリシス、エステル相互交換）の各反応にリパーゼを使用する ことが知られているが、これらすべての反応は第一アルコール及び第二アルコー ルの使用に限定されている。 さらに、仏国特許明細書ＦＲ-Ａ-２６１７５０１号（Ｓｏｃ．Ｎａｔ．Ｅｌｆ Ａｑｕｉｔａｉｎｅ）には、溶媒としてのｔ-ブタノールやｔ-アミルアルコー ルのような第三アルコール中で酵素反応を行うことさえ提案されており、酵素処 理すべき基質とこのような溶媒との間では反応は全く起こらないと予測されてい たことが分かる。この見解は、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ５ ７５ ，１５６-１６５（１９７９）のＳ．Ｏｋｕｍｕｒａ他の報文によって実験 的に確認されており、この報文では微生物リパーゼによるエステル合成について 調べられている。アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅ ｒ ）、リゾプス・デレマー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｄｅｌｅｍａｒ）、ゲオトリク ム・カンジダム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ）及びペニシラム・ シクロピウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｕｍ ｃｙｃｌｏｐｉｕｍ）のリパーゼのいず れも第三アルコール類、フェノール類及び糖アルコール類のエステルを合成でき なかった（特に表Ｉを参照されたい）。 ブタ膵リパーゼが９９％有機媒質中でのトリブチリンと各種の第一及び第二ア ルコールとの間のアルコーリシス反応を触媒することがＡ．Ｚａｋｓ及びＡ．Ｍ ．Ｋｌｉｂａｎｏｖによって発見されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４（１９８ ４年６月１５日号）１２４９-１２５１）。乾燥リパーゼは第三アルコール類を 用いたアルコーリシス反応には完全に不活性であることが分かったが、 表Ｉには湿潤ブタ膵リパーゼ（酵素中の水分量３．６重量％）で触媒されるトリ ブチリンとｔ-ブタノールとのアルコーリシス反応の初速度がリパーゼ１００ｍ ｇ当り毎時２２μモルであることが示されている。ただし、生成物の収量に関し ては何の示唆もない。 最後にＩ．Ｌ．Ｇａｔｆｉｅｌｄの報文（Ｌｅｂｅｎｓｍ．-Ｗｉｓｓ．ｕ．- Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９（１９８６）８７-８８）には、ムーコル・ミエヘイ（Ｍ ｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）の酵素（仏国セクラン（Ｓｅｃｌｉｎ）のＲａｐｉｄ ａｓｅ社製）を作用させた非水不均一系での酵素的エステル合成について記載さ れている。第一アルコール類及び第二アルコール類共に効率的にエステル化され るが、第三アルコール類はそうではないことが分かった。表１には、ｔ-ブタノ ールがオレイン酸と１４％のエステル化度（等モル比の酸とアルコール；ムーコ ル・ミエヘイの酵素を３重量％の量で使用；室温で３日間密閉容器内で磁気撹拌 ）を呈することが示されている。しかし、本願出願人がこの実験を繰り返したと ころ、オレイン酸ｔ-ブチルは全く生成せず、１４％のエステル化度という測定 値は実際にはｔ-ブタノール中に存在する不純物（特に第二ブタノール）に関連 したものではないかと推論される。それは、そこで用いられた検出法が滴定によ るものであって、個々のエステル種を識別することができないからである。 この報文には酸価及びエステル価について何も記載されていないのでそれ以上 の結論を下すことはできないが、その同じ著者らの独国特許出願ＤＥ-Ａ-３１０ ８９２７号（上記報文にも引用）で彼等はこの種の反応での慣例通り酸価とエス テル価から変換度を算出しており、その特許出願でもムーコル・ミエヘイのリパ ーゼ（商品名Ｅｓｔｅｒａｓｅ ３００００，仏国セクランのＲａｐｉｄａｓｅ 社製）を使用しているにもかかわらずその発明が第一及び第二アルコールに明確 に限定されていることから、この酵素反応では第三アルコールが非反応性である ことを明らかに表明している。 このように、アルコールと酸からの酵素的エステル合成では、アルコール部分 がそのエステル結合付近に立体障害をもつエステル類（すなわち、第三アルコー ルから誘導されたエステル類）を合成することはこれまで不可能であると考えら れてきた。しかしながら、このような酵素的エステル合成法を利用することがで きれば有用であり、特に、痕跡量の触媒も副生物も存在せず、しかも着色の危険 性もない「化学的にクリーンな」エステルの合成に有用である。 本発明はこのような立体障害性エステルを製造するための酵素法に関する。今 回、ある種のリパーゼ、すなわち、アルコール部分がそのエステル結合付近に立 体障害をもつエステル類に対して加水分解活性をもつリパーゼが、かかるエステ ルをその構成要素たるアルコール及び酸から合成する活性をもっていることが判 明した。 したがって、本発明は、低水分条件下でリパーゼを用いてカルボン酸のエステ ルを酵素的に製造する方法にして、アルコール部分がそのエステル結合付近に立 体障害をもつエステルを、当該エステルに対して加水分解活性をもつリパーゼ種 からなる群から選択されるリパーゼを使用して合成することを特徴とする方法に 関する。好ましいリパーゼはカンジダ・アンタルクティカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａ ｎｔａｒｃｔｉｃａ ）のリパーゼＡである。カンジダ・アンタルクティカのリパ ーゼにはリパーゼＡとリパーゼＢの２種類の成分が存在することが知られており 、これらは上記リパーゼからゲル濾過などによって生産することができる。組換 えＤＮＡ技術でそれらを生産することも可能である。リパーゼＡはリパーゼＢよ りも熱安定性が高いが、リパーゼＢは本発明による立体障害性エステルの合成能 力を有していないことが判明した。第三アルコールエステルに関してカンジダ・ アンタルクティカのリパーゼＡと同様の基質活性をもつリパーゼ種を使用するこ ともできる。 本発明で用いられる特異的リパーゼの突然変異体及び変異型も本発明の技術的 範囲内に含まれると考えられる。本発明に適していることの判明したリパーゼは 、カンジダ・ルゴーサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）、ゲオトリクム・カン ジダム及びカンジダ・シリンドラカエ（Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃａ ｅ ）由来のリパーゼである。 好ましくは、本発明に用いられる特異的リパーゼは不溶性の無機又は有機担体 に固定化される。固定化は、例えばＫ．Ｍｏｓｂａｃｈ（編）のＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第４４巻の“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｅｎｚｙｍｅｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（米国ニューヨーク）１９７ ６年発行に記載されているような、それ自体公知の如何なる方法で行ってもよい 。 特に好ましい固定化方法は、欧州特許明細書ＥＰ-Ｂ-０２３２９３３号（ＡＫ ＺＯ ＮＶ）並びにＥＰ-Ｂ-０３２２２１３号及びＥＰ-Ａ-０４２４１３０号（ 共にＵｎｉｌｖｅ ＮＶ）に記載された方法である。一般に、これらの方法は、 オレフィンの単独重合体又は共重合体やポリスチレンやポリアクリレートやポリ アミドのような疎水性ポリマー或いはシラン化処理したシリカやガラスやセラミ ックスのような疎水性無機材料から選択される疎水性粒状多孔質固体上にリパー ゼを水溶液から吸着させることからなる。このような固体材料は、固体材料は不 溶性であるがリパーゼを不活性化しない水と混和性の極性有機溶媒（例えばエタ ノールなど）で前処理される。 好適な材料は例えばＡｃｃｕｒｅｌ ＥＰ１００（商品名，オランダＡＫＺＯ 社製）及びシラン化処理されたシリカであるＧｒａｃｅ ６ １５００ＭＰ（商 品名，ドイツのＷ．Ｒ．Ｇｒａｃｅ社製）である。 また、リパーゼは、欧州特許明細書ＥＰ-Ｂ-１４０５４２号（Ｎｏｖｏ Ｎｏ ｒｄｉｓｋ Ａ/Ｓ）に記載されているように、イオン交換樹脂に固定化するこ ともできる。例えばＤｕｏｌｉｔｅ ＥＳ-５６８（商品名，フランスの 液から吸着させる。 本発明の方法は連続式でも回分式でも実施できる。好ましくは、生成した反応 水を蒸留や浸透気化（ｐｅｒｖａｐｏｒａｔｉｏｎ）やモレキュラーシーブでの 吸着によって連続的に除去する。反応の行われる温度は約２０℃から約９０℃で あるが、好ましくは約５０℃〜８０℃である。 アルコール及びカルボン酸それぞれの量はいろいろ変化させることができるが 、等モル量で用いるのが好ましい。本発明の方法における反応は、共蒸留、乾燥 剤（モレキュラーシーブなど）の添加、凝縮、低温表面技術又は浸透気化などに よる系からの水の除去によって駆動される。 酵素使用量は、エステル化すべきアルコールと酸の合計重量を基準にして、最 高３０重量％までであるが、好ましくは１〜２０重量％の酵素が使用される。 本発明の方法は水を全く添加しなくても実施することができるが、水を必要と する酵素については、水の存在量（最初の反応混合物全体を基準）は最大で５重 量％であり、好ましくは最大２．５重量％である。エステル化することのできる 酸は炭素数２〜５４の不飽和又は飽和の直鎖又は枝分れ鎖モノカルボン酸であり 、例えば酢酸、カプリン酸、ラウリン酸、ステアリン酸、イソステアリン酸、ミ リスチン酸、並びにオレイン酸、リノール酸などの不飽和又は多不飽和脂肪酸な どである。アゼライン酸のようなポリカルボン酸並びにトリマー酸やダイマー酸 や水添ダイマー酸のような重合酸（炭素数８〜２４の不飽和脂肪酸の重合によっ て得られるもの）も使用することができる。 本発明で使用することのできる第三アルコールは炭素数４〜５４のものであり 、例えばｔ-ブタノール、ｔ-アミルアルコール、ゲルベ（Ｇｕｅｒｂｅｔ）アル コール類、テルペンアルコール類などである。好ましくは、側鎖の炭素数は２以 下である。好ましくは、第三アルコールは一価アルコールである。 エステル混合物の製造では、様々なモノカルボン酸混合物を使用することがで きる。 ここで本発明を以下の実施例によってさらに説明する。実施例Ｉ オレイン酸（純度９０％；１７１．５５ｇ）を、撹拌した容器内で、ｔ-ブタ ノール（純度９９％以上；４５．０ｇ）及び４．３ｇの蒸留水と混合した。これ に、カンジダ・アンタルクティカのリパーゼＡ（デンマークのＮｏｖｏ Ｉｎｄ ｕｓｔｒｉ社製，コード番号ＳＰ４３３）の固定化標品（ＡＫＺＯ社製の多孔質 ポリプロピレンビーズであるＡｃｃｕｒｅｌ ＥＰ１００に固定化）２５ｇを加 えた。反応混合物の温度を６０℃に上げ、その温度に１１７時間維持した。約２ ４時間毎に混合物を真空（典型的には２０ｍｂａｒで１時間）に引いて、ｔ-ブ タノールとの共蒸留によって水を除去した。真空除去操作を行った後は、毎回、 ４５ｇのｔ-ブタノールを反応混合物に追加した。 反応終了後、３００ｇのアルミナ（基本活性２）及び溶離液として６０-８０ 石油エーテルを使用したカラム精製法で遊離脂肪酸を除去した。これによって、 ６６ｇの無色透明の生成物が得られたが、この生成物はＧＣ分析によってオレイ ン酸ｔ-ブチルであることが判明した。変換率はオレイン酸を基準にして３２％ であった。こうして得られた最終生成物は遊離脂肪酸を極少量しか含んでいなか った（酸価＝０．１５）。実施例II オレイン酸（純度９９％以上；８２８ｍｇ）を、ｔ-アミルアルコール（純度 ９９％以上；２５８ｍｇ）及び２３ｍｇの蒸留水と混合した。これに、実施例Ｉ に記載の固定化されたカンジダ・アンタルクティカのリパーゼＡ（デンマークの Ｎｏｖｏ Ｉｎｄｕｓｔｒｉ社製，コード番号ＳＰ４３３）６２．５ｍｇを加え た。反応混合物の温度を６０℃に上げた。２２時間後にこの反応におけるオレイ ン酸ｔ-アミルの生成量を試料のＧＣ分析で測定した。７０．４ｍｇを採取して 、溶離液として６０-８０石油エーテルを用いたアルミナカラム（基本活性２） に当該混合物を流して遊離脂肪酸を除去した。２．５ｍｇのエイコサンをＧＣ分 析の内部標準として使用した。最終生成物の収率はオレイン酸を基準にして１４ ．８％であった。この生成物の正体はＧＣＭＳによって確認した。実施例III 実施例IIと同様にして、７８０ｍｇのリナロール（純度９７％）と１４２７ｍ ｇのオレイン酸（純度９９％）及び４４ｍｇの水を用いてオレイン酸リナリルを 製造した。これに固定化されたカンジダ・アンタルクティカのリパーゼＡ（デン マークのＮｏｖｏ Ｉｎｄｕｓｔｒｉ社製，コード番号ＳＰ４３３）１２５ｍｇ を加えた。反応混合物の温度を６０℃に上げた。オレイン酸を基準にして３．０ ％の最終生成物が得られた。この生成物の正体はＧＣＭＳによって確認した。実施例IV この例では、多数の固定化リパーゼ（実施例Ｉと同様にマクロ多孔質ポリプロ ピレンに固定化（Ａｃｃｕｒｅｌ，欧州特許明細書ＥＰ-Ｂ-０３２２２１３号に 記載の方法による））について、立体障害性エステルの合成に関するそれらの適 性について調べた。 オレイン酸（純度９９％以上；５４８ｍｇ）を、磁気撹拌した容器内で、ｔ- ブタノール（純度９９％以上；１４４ｍｇ）及び１４ｍｇの蒸留水と混合した。 これに、４０ｍｇのリパーゼ触媒（表１参照）を加えた。反応混合物の温度を４ ０℃に上げて、６４時間維持した。 反応終了後、アルミナ（基本活性２）及び溶離液として６０-８０石油エーテ ルを使用したカラム精製法で遊離脂肪酸を除去した。 この反応におけるオレイン酸ｔ-ブチルの生成量を、２．５ｍｇのエイコサン を内部標準として用いた試料のＧＣ分析で求めた。 これらの実験から、本発明の方法にはほんの数種類の特定のリパーゼしか使用 できないことが明らかである。比較例Ａ オレイン酸（純度９９％以上；８５８ｍｇ）を、磁気撹拌した容器内で、ｔ- ブタノール（純度９９％以上；２２５ｍｇ）及び２２ｍｇの蒸留水と混合した。 これに、６２．５ｍｇの固定化リパーゼ触媒（天然型ムーコル・ミエヘイ；デン マークのＮｏｖｏ Ｉｎｄｕｓｔｒｉ社製，コード番号ＳＰ２８２）を加えた。 別個の実験で、６２．５ｍｇの固定化リパーゼ触媒（クローン化ムーコル・ミエ ヘイ；デンマークのＮｏｖｏ Ｉｎｄｕｓｔｒｉ社製，コード番号ＳＰ３９２） を加えた。 反応混合物の温度を４０℃に上げて、この温度に２０時間維持した。反応終了 後、溶離液として６０-８０石油エーテルを使用したアルミナ（基本活性２）で のカラム精製で遊離脂肪酸を除去した。この反応におけるオレイン酸ｔ-ブチル の生成量を、２．５ｍｇのエイコサンを内部標準として用いた試料のＧＣ分析で 求めた。 比較例Ｂ Ｚａｋｓ及びＫｌｉｂａｎｏｖの報文（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４， １２４９ -５１，１９８４）に記載された通り、ブタ膵リパーゼを用いて比較実験を行っ た。さらに、カンジダ・アンタルクティカリパーゼＡとの対比実験並びに２通り のアルコーリシス型エステル交換反応を行った。 グリセロールトリブチリン（純度９９％以上；０．９７５ｇ）をｔ-ブタノー ル （純度９９％以上；０．２３９２ｇ）及び８．５ｍｇの蒸留水（０．７重量％） と混合した。これに１２５ｍｇのブタ膵リパーゼ（ＰＰＬ／ＥＰ１００ ＳＴ６ ２３）を加えた。この反応混合物の温度を４０℃に上げて、２４時間維持した。 さらに、同様にして、ブタ膵リパーゼを用いて２通りのアルコーリシス反応を 調べた。 オレイン酸メチル（純度９９％以上；０．８５９ｇ）をｔ-ブタノール（純度 ９９％以上；０．２１４６ｇ）及び７．５ｍｇの蒸留水（０．７重量％）と混合 した。これに１２５ｍｇの適当なリパーゼを加え、４０℃で２４時間インキュベ ーションした。 同様に、一連の対照反応として上記例と同じ手順でオレイン酸メチルをｎ-ブ タノールと混合した。生成物の生成を試料のＧＣ分析で求めた。結果を下記の表 ３にまとめた。 これらの実験から、Ｚａｋｓ及びＫｌｉｂａｎｏｖの結果が第三アルコール存 在下では否定的であることは明らかである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９５年７月４日 【補正内容】 請求の範囲 １．５重量％以下の水の存在下でリパーゼを用いてカルボン酸とアルコールのエ ステルを酵素的に製造する方法にして、上記アルコールが第三アルコールであっ て、上記リパーゼが、当該エステルに対して加水分解活性をもつリパーゼ種から なる群から選択されることを特徴とする方法。 ２．請求項１記載の方法において、上記リパーゼがカンジダ・アンタルクティカ （Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）のリパーゼＡであることを特徴とす る方法。 ３．請求項１記載の方法において、上記リパーゼが、第三アルコールエステルに 関してカンジダ・アンタルクティカのリパーゼＡと同様の基質活性をもつリパー ゼ種であることを特徴とする方法。 ４．請求項１記載の方法において、上記立体障害をもつエステルのアルコール部 分が、炭素数４〜５４の第三アルコール及びそれらの混合物からなる群から選択 されることを特徴とする方法。 ５．請求項１記載の方法において、上記第三アルコールの側鎖の炭素数が２以下 であることを特徴とする方法。 ６．請求項１記載の方法において、上記立体障害をもつエステルのアルコール部 分が、第三テルペンアルコールであることを特徴とする方法。 ７．請求項１記載の方法において、上記立体障害をもつエステルのアルコール部 分が一価の第三アルコールであることを特徴とする方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ， ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，Ｓ Ｅ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 マックレイ、アラスダイアー・ロビン 英国、エムケイ43・８エイエヌ、ベッドフ ォード、ニュートン・ブラッサムビル、ア イビー・コテージ（番地なし) (72)発明者 マイコック、ゲイリー 英国、エヌエヌ９・５エルエイチ、ノーザ ンプトンシャー、ハイアム・フェリーズ、 プレスランド・ドライブ ８

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．低水分条件下でリパーゼを用いてカルボン酸のエステルを酵素的に製造す る方法にして、アルコール部分がそのエステル結合付近に立体障害をもつエステ ルを、当該エステルに対して加水分解活性をもつリパーゼ種からなる群から選択 されるリパーゼを使用して合成することを特徴とする方法。 ２．請求項１記載の方法において、上記リパーゼがカンジダ・アンタルクティ カ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）のリパーゼＡであることを特徴と する方法。 ３．請求項１記載の方法において、上記リパーゼが、第三アルコールエステル に関してカンジダ・アンタルクティカのリパーゼＡと同様の基質活性をもつリパ ーゼ種であることを特徴とする方法。 ４．請求項１記載の方法において、上記立体障害をもつエステルのアルコール 部分が、炭素数４〜５４の第三アルコール及びそれらの混合物からなる群から選 択されることを特徴とする方法。 ５．請求項１記載の方法において、上記第三アルコールの側鎖の炭素数が２以 下であることを特徴とする方法。 ６．請求項１記載の方法において、上記立体障害をもつエステルのアルコール 部分が、第三テルペンアルコールであることを特徴とする方法。 ７．請求項１記載の方法において、上記立体障害をもつエステルのアルコール 部分が一価の第三アルコールであることを特徴とする方法。 ８．請求項１記載の方法において、上記立体障害をもつエステルの構成成分た る酸が、炭素数２〜５４の飽和又は不飽和の直鎖又は枝分れ鎖モノカルボン酸、 ポリカルボン酸及びそれらの混合物からなる群から選択されることを特徴とする 方法。 ９．請求項１記載の方法において、水の存在量が、最初の反応混合物全体を基 準にして、５重量％以下であることを特徴とする方法。 １０．請求項１記載の方法において、水の存在量が、最初の反応混合物全体を基 準にして、２．５重量％以下であることを特徴とする方法。 １１．請求項１記載の方法において、リパーゼが不溶性の無機又は有機担体に固 定化されていることを特徴とする方法。 １２．請求項１記載の方法において、反応を、系からの水の除去によって駆動す ることを特徴とする方法。