CN1085252C - 微生物脂肪酶酶法合成酯的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明采用自产微生物脂肪酶(Rhizopus chinensis)酶法合成酿酒、食品、医药、日用化学品工业中使用得酯类物质。在15-40℃左右条件下，使用微生物发酵产生的脂肪酶非水相中催化酯化反应，取代目前工业中使用的化学催化剂在高温条件下酯化的工艺方法。此方法具有反应条件温和，节约能源；反应特异性强，有毒害的副产物少；在有机溶剂进行酶催化的酯化反应，反应效率更高的特点。所转化的产品品质高，属于天然产物。本发明生产的产品经过数家大企业的使用，酶法转化的芳香酯的使用效果优于化学产品。该方法对于提高我国酯类物质的品质和档次，增加其使用的安全性和感官效果有积极的社会和经济价值。

Description

微生物脂肪酶酶法合成酯
本发明涉及生物化工，具体的说是一种用微生物脂肪酶在有机溶剂中转化脂肪酸酯的方法。酯类物质是酿酒、食品、饮料、医药、日用化工等许多工业常用的化学物质。但是长期以来工业上是通过化学方法进行生产。即用无机催化剂(如浓硫酸等)在高温下催化醇酸酯化反应完成。化学方法生产有如下缺点：第一、使用的无机催化剂易带入铅、砷等重金属，在高温下化学催化会发生一些副反应而产生对人体有害的物质，尽管目前标有“食品级”的字样，但安全性不够高；第二、高温条件下反应生产中耗能高；第三、化学方法生产产品的档次低，在某些产品的使用中效果也差。例如，在大曲酒的调香中会产生不同于大曲酒自然香味的异香或浮香味，影响产品的质量。第四、从环境保护的角度来讲，目前应用生物技术替代化学途径转化生产化合物符合国际上发展潮流。尽管也有通过生物催化剂转化酯类物质的研究报道，如微生物直接发酵生产，但产物浓度低，无法进行经济规模的生产，微生物代谢产物的复杂性也影响了使用的范围。酶法转化目前则由于酶的催化合成能力低和稳定性不高，加上反应产物的浓度低等原因，只停留在研究阶段。
因此本发明的目的是为了解决上述方法的不足，采用微生物发酵产生的脂肪酶取代无机催化剂，利用酶在有机溶剂中生物催化酯化反应，在避免无机催化剂对人体造成的伤害，降低能耗，提高产品的使用效果，改善环境的同时，选用合成能力高的华根霉脂肪酶，采用表面活性剂非共价修饰脂肪酶来提高脂肪酶在有机溶剂中催化能力的稳定性。
本发明的主要技术内容如下：
a、加料：将底物醇酸按一定的等摩尔浓度(0.25～0.80mol/L)加入含有有机溶剂的常规酶反应器中搅拌溶解后，再加入6000～10000u/L的脂肪酶后开始反应。在脂肪酶加入反应系统之前，先将脂肪酶加入含有0.1％表面活性剂的有机溶剂中搅拌3小时后，过滤出脂肪酶用于上述反应系统。
b、反应：在30℃±10℃反应温度条件下，搅拌反应10-36小时，底物的摩尔转化率可达90-98％。
c、分离：反应结束后，由于脂肪酶不溶于有机溶剂，用过滤方法分离出脂肪酶，用有机溶剂洗涤后可以再次使用。分离出的反应液进行步骤四。
d、蒸馏：在减压蒸馏-0.05～0.08MPa的条件下，蒸发出反应媒体有机溶剂，得到产物酯。蒸发出来的有机溶剂经过冷凝、冷却和除水处理后可回收复用。整个过程基本上无废物排出。该发明是在有机溶剂中完成的酯化反应方程式为：
Figure C9811156600041
R-OH：脂肪醇    R’COOH：脂肪酸    R’COOR：脂肪酸酯其中mol/L：摩尔/升，u/L：单位/升，MPa：兆帕。整个反应工艺流程如下：
Figure C9811156600042
本发明采用本研究室筛选的华根霉(Rhizopus chinesis)生产的脂肪酶为酯化反应的催化剂。粗酶粉的酶活为360IU/g。Lypozyme IM脂肪酶(固定化Mucor miehei，Novo Nordisk公司)和Novozyme 435脂肪酶(固定化Candida antarctica，Novo Nordisk公司)在底物醇酸的浓度小于0.3mol/L时，效果也不错。其它市售的微生物脂肪酶的效果则较差。
IU的定义为：37℃条件下，pH为7.0的磷酸缓冲液中水解橄榄油，每分钟释放出1ug分子脂肪酸的酶量。
非共价修饰用的表面活性剂中效果较好的有：1)气溶胶硫代琥珀酸2-(2-乙己酸)酯钠盐(AOT)；2)十二烷基磺酸钠(LAS)；3)聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)。表面活性剂的浓度高于或低于0.1％则都会影响脂肪酶的催化能力。
脂肪酸为3C～18C的饱和一元酸，如乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸：不饱和酸：18C的油酸。
脂肪醇为2C～18C的伯醇，如乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇、庚醇、辛醇、壬醇、癸醇和油醇；4C～5C的仲醇，如异丁醇和异戊醇。
有机溶剂为Log P 3.5～4.0的有机溶剂，如己烷(Log P 3.5)、庚烷(Log P 4.0)。
反应温度：15～40℃。其中28℃最适，低于15℃或高于40℃，转化率都会有所降低。
脂肪醇酸的浓度比为3∶1到1∶1转化率都比较好。
本发明与目前其他合成酯类物质的方法相比较具有如下优点：第一、不同微生物所产生的脂肪酶在有机溶剂中表现出的催化能力和稳定性相差颇大。而且在有机溶剂中脂肪酶的合成能力与其分解能力不成正比。本发明选用本研究室筛选的华根霉(Rhizopus chinesis)，液态深层发酵产生脂肪酶，并制成粗酶粉。该华根霉是从我国高酯含量的蒸馏酒-----大曲酒生产中使用的糖化发酵剂大曲中分离出来的。其酯合成能力较强，在有机溶剂中且较稳定。该脂肪酶属1，3位特异。经过与目前国内外的其他微生物脂肪酶进行对比该脂肪酶单位酶活催化酯合成的能力和反应速度都优于所有国内外的脂肪酶。第二、由于表面活性剂的两性特征使得有机溶剂中脂肪酶处于一种良好的微水环境中，因此不仅可以提高反应底物的浓度，而且大大改善脂肪酶在有机溶剂中催化反应的催化性。第三、酶法生产的酯类物质由于是采用生物技术转化产生，在微生物发酵的食品或酒类中使用产生的风味效果更接近自然、协调。第四、脂肪酶(EC.3.1.1.3，又称甘油酯水解酶)一直是用来催化酯的分解反应。利用酶在有机溶剂中催化其逆反应------酯化反应，由于在有机溶剂的微水环境中，酯化反应的热力学平衡的移动，反应向着酯合成的方向进行，使得酯合成的转化率和反应速度比在水相中高出许多。在水相中则酶促反应时间太长；将酶直接加入底物中的无溶剂反应则由于底物对酶的作用，尤其是在极性较强的底物中，严重影响了反应的转化率。而合适的溶剂和微水环境又使得脂肪酶保持了很好的催化活性和稳定性。第五、与微生物发酵法生成酯的方法进行相比，由于酶法催化途径简单，不存在代谢物对生物体的抑制作用，反应速度快，底物浓度高，转化率高。在反应的效率和产量上都远远的优于微生物代谢发酵。并且下游工程也比较简单。第六、酶法生物催化反应的特异性强，副产物少，而且避免了无机催化剂可能产生的对人体有毒害的物质；酶促反应温度低，大大减少了能源的消耗以及高温条件下可能产生的其他副产物。其中重金属含量低于国家标准1000倍。因此产品的安全性强，品质和档次高。生物技术转化的产品可以被认为是天然产物。
本发明得到的酯类物质可使用在酿酒、食品、医药和日用化学工业等工业中。
实施例
实施例一0.25g脂肪酶(90IU)加入含有等0.8mol/L浓度己酸和乙醇的15ml的己烷中，28℃条件下，反应10hr后，反应的转化率达95％。半衰期长达1010小时。经过在-0.05MPa压力下减压蒸馏得到产物丁酸乙酯。质量符合GB8315-87标准。在几家大曲酒厂调配浓香型大曲酒后认为：用该己酸乙酯调配的大曲酒香味自然、协调，没有化学法生产的己酸乙酯所带来的浮香感，使用效果优于化学产品。
实施例二0.25g脂肪酶(90IU)加入含有等0.4mol/L浓度乙酸和0.8mol/L乙醇的15ml的庚烷中，15℃条件下反应24hr后，反应的转化率达92％。经过在-0.05MPa压力下减压蒸馏得到产物乙酸乙酯。
实施例三0.3g脂肪酶(120IU)加入含有等0.25mol/L浓度丁酸和0.75mol/L乙醇的15ml的庚烷中，28℃条件下反应24hr后，反应的转化率达90％。经过在-0.08MPa压力下减压蒸馏得到产物丁酸乙酯。
实施例四0.3g脂肪酶(150IU)加入含有等0.25mol/L浓度丙酸和乙醇的15ml的庚烷中，28℃条件下反应24hr后，反应的转化率达92.0％。经过在-0.08MPa压力下减压蒸馏得到产物丙酸乙酯。
实施例五0.3g脂肪酶(120IU)加入含有等0.25mol/L浓度丁酸和异丁醇的15ml的庚烷中，30℃条件下反应24hr后，反应的转化率达90.5％。经过在-0.08MPa压力下减压蒸馏得到产物丁酸异丁酯。
实施例六0.3g脂肪酶(120IU)加入含有等0.25mol/L浓度丙酸和异戊醇的15ml的庚烷中，30℃条件下反应24hr后，反应的转化率达98％。经过在-0.08MPa压力下减压蒸馏得到产物丙酸异戊酯。
实施例七0.25g脂肪酶(90IU)加入含有等0.5mol/L浓度癸酸和丁醇的15ml的庚烷中，28℃条件下反应22hr后，反应的转化率达97％。经过在-0.05MPa压力下减压蒸馏得到产物癸酸丁酯。
实施例八0.25g脂肪酶(90IU)加入含有等0.5mol/L浓度己酸和己醇的15ml的庚烷中，28℃条件下反应20hr后，反应的转化率达94％。经过在-0.07MPa压力下减压蒸馏得到产物己酸己酯。
实施例九0.25g脂肪酶(90IU)加入含有等0.4mol/L浓度油酸和油醇的15ml的己烷中，15℃条件下反应36hr后，反应的转化率达92％。经过在-0.08MPa压力下减压蒸馏得到产物油酸油醇酯。
实施例十0.25g脂肪酶(90IU)加入含有等0.4mol/L浓度棕榈酸和异丁醇的15ml的庚烷中，40℃条件下反应36hr后，反应的转化率达90％。经过在-0.08MPa压力下减压蒸馏得到产物棕榈酸酸异丁酯。
实施例十一0.25g脂肪酶(90IU)加入含有等0.4mol/L浓度月桂酸和乙醇的15ml的庚烷中，28℃条件下反应36hr后，反应的转化率达90％。经过在-0.08MPa压力下减压蒸馏得到产物月桂酸乙酯。
实施例十二0.25g脂肪酶(90IU)加入含有等0.4mol/L浓度月桂酸和丁醇的15ml的庚烷中，反应36hr后，反应的转化率达85％。经过在-0.08MPa压力下减压蒸馏得到产物月桂酸丁酯。
实施例十三0.25g脂肪酶(90IU)加入含有等0.4mol/L浓度肉豆蔻酸和异丙醇的15ml的庚烷中，反应36hr后，反应的转化率达91％。经过在-0.08MPa压力下减压蒸馏得到产物肉豆蔻酸异丙酯。

Claims (8)

1、微生物脂肪酶酶法合成脂的方法，其特征是a、加料：将底物脂肪醇、脂肪酸按等摩尔浓度、并且摩尔浓度为0.25～0.80摩尔/升加入含有有机溶剂的常规酶反应器中搅拌溶解后，再加入6000～10000单位/升的脂肪酶后开始反应；b、反应：在30℃±10℃的反应温度条件下，搅拌反应10～36小时；c、分离：反应结束后，用过滤方法分离出脂肪酶和反应液；d、蒸馏：在减压蒸馏-0.05～0.08兆帕的条件下，蒸发出反应酶体有机溶剂，得到产物脂。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征是在将脂肪酶加入酶反应器前，先将脂肪酶加入含有0.1％表面活性剂的有机溶剂中搅拌3小时左右后，过滤出脂肪酶再用于反应器中。
3、根据权利要求1所述的方法，其特征是在反应工序b中，反应温度是28℃。
4、根据权利要求1所述的方法，其特征是在分离工序c中，分离出的脂肪酶用有机溶剂洗涤后，再次回到工序a中重复使用。
5、根据权利要求1所述的方法，其特征是在d中蒸发出的有机溶剂经过冷凝、冷却和除水处理后，回收使用。
6、根据权利要求3所述的方法，其特征是所用的表面活性剂是气溶胶硫代琥珀酸2-(2-乙己酸)酯钠盐；十二烷基磺酸钠；聚乙二醇辛基醚。
7、根据权利要求1所述的方法，其特征是脂肪酸为3C～18C的饱和一元酸、不饱和酸；脂肪醇为2C～18C的伯醇、4C～5C的仲醇。
8、根据权利要求7所述的方法，其特征是饱和一元酸为丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸或棕榈酸；不饱和酸为18C的油酸；2C～18C的伯醇为乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇、庚醇、辛醇、壬醇、癸醇或油醇；4C～5C的仲醇为异丁醇或异戊醇。
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