CN109055441B - 一种利用毕赤酵母固态废弃物高效发酵生产丁醇的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用毕赤酵母固态废弃物高效发酵生产丁醇的方法，属于发酵工程以及废物资源化技术领域。本发明的方法为先将丙酮丁酸梭菌接种于玉米粉培养基中进行ABE发酵，当发酵进入到产溶剂期后，再按照一定的比例在玉米粉培养基中加入毕赤酵母固态废弃物继续发酵；利用本发明的方法生产丁醇，可同时实现固体废物(毕赤酵母固态废弃物)的资源化、减量化以及发酵原料(玉米粉)的节省化，提高ABE发酵的经济性能。

Description

一种利用毕赤酵母固态废弃物高效发酵生产丁醇的方法
技术领域
本发明涉及一种利用毕赤酵母固态废弃物高效发酵生产丁醇的方法，属于发酵工程以及废物资源化技术领域。
背景技术
生物丁醇(Bio-butanol)是一种重要的平台化合物，可用于制造邻苯二甲酸、脂肪族二元酸及磷酸等的正丁酯类增塑剂以及丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸酯等喷漆产品，是生产抗生素、维生素、激素的优良溶剂，也是制造丁醛、丁酸、丁胺、乳酸丁酯、乙二醇醚、乙酸丁酯等化工产品的重要中间体，同时，更是一种清洁可再生的高效液态燃料和燃料添加剂。因此，它在制备化工产品、溶剂、以及高效液态燃料/燃料添加剂等领域均具有很重要的应用。
目前，生物丁醇主要是通过丙酮-丁醇-乙醇发酵(也称为丁醇发酵或ABE发酵)生产的，但是，由于ABE发酵所用的传统淀粉类原料(如玉米、木薯等)价格昂贵，导致生产丁醇的原料成本占到ABE生产总成本的70％以上。因此，以淀粉类原料的ABE发酵生产基本处于亏损状态，并且，ABE发酵使用大量淀粉类原料(如玉米、木薯等)还存在与人争粮等问题。
为了解决上述问题，利用秸秆、玉米芯、木材屑等纤维素类农业废弃物进行丁醇/ABE发酵已经成了本领域的研究主流，但是，农业废弃物存在生物质密度低、收集困难、运输成本高的缺陷，另外，使用上述农业废弃物生产丁醇产量极低(发酵液中丁醇浓度仅有3～6g/L 左右)、废水生成量大，其工业应用还有待时日。因此，急需找到一种既可降低丁醇生产成本，又不会降低丁醇产量的方法。
重组毕赤酵母是生产异源蛋白、生物酶等高附加值产品的重要宿主，它能够在高细胞密度下、以甲醇为诱导剂，发酵生产异源蛋白、生物酶等高附加值产品。上述产品大都分泌到胞外，主要存在于发酵上清液中。许多工厂为节省成本，常简单地将发酵上清液中的目标产品取走/精制，而剩下的大量的毕赤酵母半固体残渣，这些残渣因环境安全的原因不能简单地抛弃/排放，只能简单地储存。
这些毕赤酵母半固体残渣未进行离心分离时，重组毕赤酵母细胞干重就可以达到125～150g-DCW/L左右，将重组毕赤酵母发酵液高速离心分离后，毕赤酵母细胞的干重率约为35％，可以认作是一种半固体废弃物(含有65％左右的水分)，现常它称为毕赤酵母固态废弃物。
由于毕赤酵母固态废弃物含水较高、含毒性极强的甲醇、异味大，不能用传统的焚烧/填埋/堆肥化方法处理，也很难作为饲料蛋白得到使用、实现资源化，它们的处理逐渐成为一个很大的问题。
但是，也由于毕赤酵母固体废弃物生物质密度大，它具有收集容易的优势，并且，有研究表明，毕赤酵母菌体含有36％的多糖(碳水化合物)、46％的蛋白质、12％的脂肪，因此，利用废弃毕赤酵母菌体替代或部分替代传统淀粉质原料进行生物能源(ABE/乙醇)生产具有很大前景。
发明内容
如果以毕赤酵母固体废弃物替代或部分替代传统淀粉质原料发酵生产丁醇，既可以降低发酵生产丁醇的成本，又可以完成毕赤酵母固体废弃物的再利用和减量化，可谓是一举两得。但是，由于酵母固体废弃物难以作为发酵底物而被直接利用，前处理酵母固体废弃物、得到可被丙酮丁醇梭菌直接利用的单糖非常困难等原因，此想法想要实现还需进一步研究。并且，由于毕赤酵母固体废弃物对丙丁梭菌发酵生产丁醇(ABE)的生物毒性、前处理产生的大量无机产物也有可能影响ABE发酵性能/经济性等原因，以毕赤酵母固体废弃物替代或部分替代传统淀粉质原料发酵生产丁醇的产量也难以保证。
为解决上述问题，本发明提供了一种利用毕赤酵母固态废弃物高效发酵生产丁醇的方法。此方法为先将丙酮丁酸梭菌接种于玉米粉培养基中进行ABE发酵，当发酵进入到产溶剂期后，再按照一定的比例在玉米粉培养基中加入经过处理的毕赤酵母固态废弃物继续发酵；利用此方法生产丁醇，可同时实现固体废物(毕赤酵母固态废弃物)的资源化、减量化以及发酵原料(玉米粉)的节省化，提高ABE发酵的经济性能。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种利用毕赤酵母固态废弃物高效发酵生产丁醇的方法，所述方法为先将丙酮丁酸梭菌接种于玉米粉培养基中进行ABE发酵，当发酵进入到产溶剂期后，再按照一定的比例在玉米粉培养基中加入经过处理的毕赤酵母固态废弃物继续发酵；所述玉米粉培养基是通过将玉米粉与水进行混合后依次进行糊化处理、液化处理以及糖化处理得到的。
所述ABE发酵是指梭菌属细菌通过厌氧发酵产生含有丙酮(A)、丁醇(B)和乙醇(E)等溶剂的溶剂混合物的过程，属于两阶段发酵，包括产酸期和产溶剂期。
所述产酸期是指发酵过程中，细胞处于指数生长期的阶段，主要产生乙酸、丁酸，并产生大量H2和CO2；所述产溶剂期是指发酵过程中，细胞处于稳定期的阶段，产生的乙酸和丁酸转变为丙酮、丁醇和乙醇等溶剂，同时产生大量H2和CO2。
在本发明的一种实施方式中，所述毕赤酵母固态废弃物与玉米粉培养基的质量比为1:4。
在本发明的一种实施方式中，所述玉米粉培养基中，玉米粉原料的含量为60～100g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述玉米粉培养基中，玉米粉原料的含量为6～10％(w/v)。
在本发明的一种实施方式中，所述玉米粉培养基中，玉米粉原料的含量为7～9％(w/v)。
在本发明的一种实施方式中，所述玉米粉培养基中，玉米粉原料的含量为8％(w/v)。
在本发明的一种实施方式中，所述糊化处理为将原材料置于95-105℃沸水中糊化处理。
在本发明的一种实施方式中，所述液化处理为在糊化处理后的原材料中加入α-淀粉酶进行液化处理。
在本发明的一种实施方式中，所述液化处理的时间为45min。
在本发明的一种实施方式中，所述α-淀粉酶在糊化处理后的原材料中的添加量为8U/g。
在本发明的一种实施方式中，所述糖化处理为在液化处理后的原材料中加入糖化酶进行糖化处理。
在本发明的一种实施方式中，所述糖化处理为将液化处理后的原材料置于60～65℃水浴中后在液化处理后的原材料中加入糖化酶进行糖化处理。
在本发明的一种实施方式中，所述糖化处理为将液化处理后的原材料置于62℃水浴中后在液化处理后的原材料中加入糖化酶进行糖化处理。
在本发明的一种实施方式中，所述糖化处理的时间为1h。
在本发明的一种实施方式中，所述糖化酶在液化处理后的原材料中的添加量为120U/g。
在本发明的一种实施方式中，所述玉米粉培养基的初始葡萄糖浓度为60g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基需在灭菌锅中于121℃灭菌20min。
在本发明的一种实施方式中，所述毕赤酵母固态废弃物是指高密度毕赤酵母诱导发酵生产得到目标蛋白后，取走目标蛋白得到的剩余发酵液。
在本发明的一种实施方式中，所述毕赤酵母固态废弃物中的毕赤酵母含量为200～600g/L；其中，g指经离心分离后得到的毕赤酵母湿重，WCW。
在本发明的一种实施方式中，所述毕赤酵母固态废弃物中的毕赤酵母含量为350～450g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述毕赤酵母固态废弃物中的毕赤酵母含量为400g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述毕赤酵母固态废弃物中的毕赤酵母在玉米粉培养基中的添加量为80g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述毕赤酵母固态废弃物需进行预处理后才可加入玉米粉培养基中；所述预处理为先用碱溶液浸泡毕赤酵母固态废弃物形成固液悬浊液，然后将形成的固液悬浊液在沸水浴中进行蒸煮后冷却至室温，最后用酸溶液将冷却至室温的固液悬浊液的pH调节至5～6。
在本发明的一种实施方式中，所述碱溶液为NaOH溶液。
在本发明的一种实施方式中，所述NaOH在毕赤酵母固态废弃物中的浓度为30～50g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述毕赤酵母固态废弃物中的毕赤酵母干重为30～40％。
在本发明的一种实施方式中，所述毕赤酵母固态废弃物中的毕赤酵母干重为35％。
在本发明的一种实施方式中，所述毕赤酵母固态废弃物的含水量为60～70％。
在本发明的一种实施方式中，所述毕赤酵母固态废弃物的含水量为65％。
在本发明的一种实施方式中，所述用碱溶液浸泡毕赤酵母固态废弃物的时间为2～5d。
在本发明的一种实施方式中，所述用碱溶液浸泡毕赤酵母固态废弃物的时间为2～3d。
在本发明的一种实施方式中，所述蒸煮的时间为100min。
在本发明的一种实施方式中，所述酸溶液为H2SO4溶液。
在本发明的一种实施方式中，所述丙酮丁酸梭菌为Clostridium acetobutylicumATCC 824。
在本发明的一种实施方式中，所述ABE发酵的条件为温度37℃、严格厌氧、静态无搅拌；所述加入毕赤酵母固态废弃物继续进行ABE发酵的条件为温度37℃、严格厌氧、静态无搅拌；所述两次ABE发酵的总发酵时间为45～55h。
本发明提供了上述一种利用毕赤酵母固态废弃物高效发酵生产丁醇的方法在丁醇制备以及毕赤酵母固态废弃物资源化方面的应用。
有益效果：
(1)本发明首次提出了以玉米粉/毕赤酵母固态废弃物混合原料高效发酵生产丁醇的方法，此方法不仅实现了固体废物(毕赤酵母固态废弃物)的资源化、减量化，同时，还实现了发酵原料(玉米粉)的节省化，大大提高了ABE发酵的经济性能，达成了ABE发酵的正收益；
(2)利用本发明的方法发酵生产丁醇，可将丁醇的产量稳定在10g/L左右、总ABE产量稳定在18g/L左右，不低于使用传统15％玉米粉发酵培养基发酵生产丁醇的水平；
(3)本发明在发酵培养基中添加毕赤酵母固态废弃物，使得发酵过程中自然形成高氨基酸(含量约为2g/L)和高SO4 2-(含量约为7g/L)的发酵环境，此环境可使得本发明使用的玉米粉/毕赤酵母固态废弃物的混合底物中的2糖/3糖得到充分利用，进而使得混合底物中的总糖利用效率从不到50％(使用传统15％玉米粉发酵培养基)大幅提高到90％以上，最终将玉米粉用量可以节省57％以上，实现了玉米粉的节省化；
(4)本发明在ABE发酵培养基(即玉米粉培养基)中添加毕赤酵母固态废弃物，使得发酵过程中自然形成高氨基酸(含量约为2g/L)和高SO4 2-(含量约为7g/L)的发酵环境，此环境可使得本发明使用的毕赤酵母固态废弃物中的碳水化合物利用效率提高至52％左右，也可使得本发明发酵自产气中的CO2重量比率从56％(使用传统15％玉米粉发酵培养基)大幅增加到70％，更可使得本发明发酵液中的有机酸浓度提高，进而使得毕赤酵母固态废弃物进一步向气体/液体物质的转化，实现了毕赤酵母固态废弃物的资源化、减量化；
(5)本发明以玉米粉/毕赤酵母固态废弃物混合原料高效发酵生产丁醇，成功规避了使用15％玉米粉发酵培养基发酵生产丁醇时，溶剂产量时高时低、发酵性能不稳定的问题，使得平均丁醇/ABE产量均稳定在最高水平的85％左右；
(6)本发明使用的玉米粉/毕赤酵母固态废弃物混合原料的ABE发酵体系的残余渣量 (毕赤酵母固态废弃物的原有干重率约为35％，预处理得到的废弃物固/液悬浊液中的毕赤酵母含量约为400g/L、湿重率约40％)可以降低到使用传统15％与8％玉米粉发酵培养基发酵的残余渣量的中间水平(湿重率约为7％)，表观减量率达到82％，有利于后续处理。
附图说明
图1：实施例1条件下的ABE发酵性能；
其中，●：总ABE；■：丁醇；□：总糖；△：葡萄糖；○：总糖利用效率；
图2：实施例2条件下的ABE发酵性能；
其中，●：总ABE；■：丁醇；□：总糖；△：葡萄糖；○：总糖利用效率；
图3：实施例3条件下的ABE发酵性能；
其中，●：总ABE；■：丁醇；□：总糖；△：葡萄糖；○：总糖利用效率；
图4：实施例4条件下的ABE发酵性能；
其中，●：总ABE；■：丁醇；□：总糖；△：葡萄糖；○：总糖利用效率；
图5：实施例2条件下的二糖/三糖、总氨基酸浓度的变化情况；
其中，●：二糖；○：三糖；▲：总氨基酸；
图6：实施例4条件下的二糖/三糖、总氨基酸浓度的变化情况；
其中，●：二糖；○：三糖；▲：总氨基酸；
图7：100mL厌氧瓶、不同操作条件下ABE总产量与废弃酵母中碳水化合物利用/资源化率之间的关系；
其中，实线：添加80g/L的废酵母处理液时理论废酵母中碳水化合物利用率；□：10％玉米粉加废酵母处理液(80g/L酵母，10g/L NaOH)的实际废酵母中的碳水化合物利用率；△：8％玉米粉加废酵母处理液(80g/L酵母，6g/L NaOH)的碳水化合物利用率；●：8％玉米粉加废酵母处理液(80g/L酵母，10g/L NaOH)的碳水化合物利用率；■：8％玉米粉加废酵母处理液(120g/L酵母，10g/L NaOH)的碳水化合物利用率。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中涉及的菌株如下：
下述实施例中使用的丙酮丁酸梭菌为Clostridium acetobutylicum ATCC 824，重组巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)来源于上海农业科学院畜牧研究所重点研究室，用于生产猪α干扰素。
下述实施例中涉及的培养基如下：
15％玉米粉发酵培养基：将玉米粉(市售)与蒸馏水一起配料，玉米粉含量为15％(w/v)，pH自然；混合均匀后，先置于95-105℃沸水中糊化处理，再加入α-淀粉酶，加酶量为8.0U/g-corn，液化处理45min；液化处理结束后，将培养基置于62℃水浴中、再加入糖化酶，加酶量为120.0U/g-corn，糖化处理1h，糖化后的寡糖水解液为可被梭菌直接利用的还原性单糖，初始葡萄糖浓度约为50g/L(发酵培养基在灭菌锅中于121℃高温下灭菌20min)。
10％玉米粉发酵培养基：将玉米粉(市售)与蒸馏水一起配料，玉米粉含量为10％(w/v)， pH自然；混合均匀后，先置于95-105℃沸水中糊化处理，再加入α-淀粉酶，加酶量为8 U/g-corn，液化处理45min；液化处理结束后，将培养基置于62℃水浴中、再加入糖化酶，加酶量为120U/g-corn，糖化处理1h，糖化后的寡糖水解液为可被梭菌直接利用的还原性单糖，初始葡萄糖浓度约为30g/L(发酵培养基在灭菌锅中于121℃高温下灭菌20min)。
8％玉米粉发酵培养基：将玉米粉(市售)与蒸馏水一起配料，玉米粉含量为8％(w/v)， pH自然；混合均匀后，先置于95-105℃沸水中糊化处理，再加入α-淀粉酶，加酶量为8U/g-corn，液化处理45min；液化处理结束后，将培养基置于62℃水浴中、再加入糖化酶，加酶量为120U/g-corn，糖化处理0.8h，糖化后的寡糖水解液为可被梭菌直接利用的还原性单糖，初始葡萄糖浓度约为25g/L(发酵培养基在灭菌锅中于121℃高温下灭菌20min)(2 糖/3糖/3糖以上寡糖和总氨基酸的含量见表2)。
5％玉米粉发酵培养基：将玉米粉(市售)与蒸馏水一起配料，玉米粉含量为5％(w/v)， pH自然；混合均匀后，先置于95-105℃沸水中糊化处理，再加入α-淀粉酶，加酶量为8U/g-corn，液化处理45min；液化处理结束后，将培养基置于62℃水浴中、再加入糖化酶，加酶量为120U/g-corn，糖化处理0.8h，糖化后的寡糖水解液为可被梭菌直接利用的还原性单糖，初始葡萄糖浓度约为20g/L(发酵培养基在灭菌锅中于121℃高温下灭菌20min)。
下述实施例中涉及的毕赤酵母固态废弃物的制备方法如下：
具体步骤如下：
(1)毕赤酵母固态废弃物A
具体步骤如下：将来源于上海农业科学院畜牧研究所重点研究室的重组巴斯德毕赤酵母 (Pichia pastoris)，于30℃的条件下进行高密度发酵/甲醇诱导约100h后，在12000rpm下离心20min，将得到的发酵上清液取走，即得毕赤酵母固态废弃物(经检测，毕赤酵母固态废弃物中废弃菌体的规格为菌体干重约0.35、含水量在65％左右)，储存时间在1～6月内。
(2)毕赤酵母固态废弃物B
来源于上海农业科学院畜牧研究所重点研究室的重组巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)，发酵条件同毕赤酵母固态废弃物A，但储存时间超过4年。
(3)毕赤酵母固态废弃物C
毕赤酵母Pichia pastoris KM71，菌株由武汉轻工业大学构建并提供，生产甜味蛋白 (Monellin)，发酵条件同毕赤酵母固态废弃物A，储存时间在1～6月内。
(4)毕赤酵母固态废弃物D
毕赤酵母Pichia pastoris KM71，菌株由武汉轻工业大学构建并提供，生产人源溶菌酶 (Human lysozyme,hLYZ)，发酵条件同毕赤酵母固态废弃物A，储存时间在1～6月内。
在得到的毕赤酵母固态废弃物A-D中以1:12～1:2.5(g/g)的重量比加入NaOH固体和水后、浸泡2～3d形成不同规格的固液悬浊液，然后将形成的固液悬浊液在沸水浴中进行蒸煮100min 后冷却至室温，最后用H2SO4溶液将冷却至室温的固液悬浊液的pH调节至5～6，得到不同规格的废弃毕赤酵母处理液(经检测，用浓度为50g/L的NaOH溶液处理后的废弃毕赤酵母处理液中，单糖(葡萄糖)/2糖含量很低、有约2g/L，但3糖/总氨基酸含量较高、分别有约 20g/L和10g/L，其中，总氨基酸含有17种氨基酸，包括对梭菌细胞生存/丁醇合成“有益”的氨基酸：苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、缬氨酸、亮氨酸，具体2糖/3糖/3糖以上寡糖和总氨基酸的含量见表2)。
下述实施例中涉及的培养及发酵方法如下：
丙丁梭菌活化培养：按10％的接种量将丙丁梭菌孢子悬浮液转接于5％玉米醪培养基中，抽真空1.5min，然后在沸水浴和冰水浴分别处理1min，后置于37℃恒温水浴槽中培养24h。
7L静态厌氧发酵罐发酵：初始装液量为3.0L(含接种液)，初始pH为6.0，无搅拌、利用自动循环水浴槽控制发酵液温度在37℃；发酵开始前，通入氮气30min，除去培养基中的游离氧气，按10％的接种量将活化培养得到的种子液转接到罐中，持续通入氮气10min；利用压力调节阀将发酵罐内的压力维持在0.03-0.06MPa；产气开始后，通过排水法计量发酵自产气；当发酵进入到产溶剂期，pH探底回弹0.10～0.20后(24h左右)，按照需要添入不同规格的废弃毕赤酵母处理液、添加量为1:4(最终装液量为3.75L)，所用发酵罐购自上海保兴生物设备工程有限公司、型号BIOTECH-7JG。
100mL厌氧瓶发酵：初始装液量为50mL(对照)或40mL(投放废弃毕赤酵母处理液)，将活化培养得到的种子液按10％的接种量转接于玉米培养基中，抽真空1min除去瓶中的游离氧气，置37℃恒温水浴槽中培养；当开始产气后，每隔34h放气一次，当产气明显减弱时结束发酵；发酵进入到产溶剂期后(24h)，按照需要投入不同规格的废弃毕赤酵母处理液、添加量为1:4即10mL(最终装液量为50mL，以初始装液量为50mL玉米培养基，不投放废弃毕赤酵母处理液为对照)。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
丁醇产量检测方法：使用气相色谱仪(上海精密科学仪器有限公司，GC126)测定，色谱柱为ALPHA-Col PEG毛细管柱(澳大利亚，SGE Int’l Pty.Ltd.公司产)。利用异丁醇内标法测定其含量，进样量0.6μL。进样器温度200℃，检测器温度220℃，色谱条件为三阶段升温程序法：初始温度40℃，初始时间1min；升温速率3℃·min-1、5℃·min-1和15℃·min-1；终止温度70℃、140℃和200℃；保留时间为1min、1min、5min。异丁醇和丁醇出峰时间分别为9min和11min。
丙酮产量检测方法：同上，出峰时间为3min。
乙醇产量检测方法：同上，出峰时间为5min。
糖利用率检测方法：定义为(初始玉米培养基中总糖浓度-发酵终点的总残糖浓度)/初始玉米培养基中的总糖浓度。
葡萄糖含量检测方法：用SBA-40C型生物传感分析仪(山东省科学院生物研究所)测定。
甘露糖含量检测方法：使用DNS法测定。
2糖含量检测方法：使用高效液相色谱仪(美国沃特世公司，Waters 1525EF)测定。
3糖含量检测方法：同上。
3糖以上寡糖含量检测方法：同上。
总氨基酸含量检测方法：使用高效液相色谱仪(美国安捷伦公司，Agilent 1100)测定。
色谱条件：流动相A：20mmol·L–1的乙酸钠溶液；流动相B：为20mmol·L–1的乙酸钠与乙腈、甲醇按体积比1:2:2混合后的溶液；分析柱：Hypersil ODS C18(4×125)mm卡套柱；柱温：40℃；流速：1.0mL·min–1；紫外检测器：338nm 262nm(Pro,Hypro)；荧光检测器：激发波长340nm发射波长450nm；激发波长266nm发射波长305nm(Pro,Hypro)。
经济性评价方法：丙酮和丁醇价格设定在￥8000/t；乙醇价格设定在￥4000/t；玉米粉价格设定在￥1800/t，酵母固形物处理费设定在￥3000/t(参照废水泥处理标准，仅考虑湿菌体处理成本、不考虑干菌体重量比率≈0.35)；NaOH价格设定在￥3000/t；H2SO4价格设定在￥500/t。经济评价中没有考虑电力(静态发酵需求量小)，蒸汽灭菌，特别是添加废弃酵母后蒸馏废水中COD增加、污水处理可能需要的额外费用。
表2 8％玉米粉培养基/废弃酵母处理液中的2糖/3糖/3糖以上寡糖和总氨基酸的含量
Figure BDA0001783092180000091
注：*表示按1:4的比例投入废弃酵母、形成混合培养基，混合培养基中各物质的浓度。
从表2可知，废弃酵母处理液的糖中，以三糖和三糖以上寡糖为主，基本没有单糖和二糖，这就是直接将丙丁梭菌添入到废弃酵母处理液中、发酵无法进行的原因。
实施例1：7L静态厌氧发酵罐发酵
在7L罐上以15％的玉米粉培养基进行ABE发酵。
发酵56h结束，丁醇浓度、ABE总浓度、总糖利用率和总残糖浓度分别为9.78g/L、15.72g/L、43％、55.00g/L(ABE发酵性能见图1)。
实施例2：7L静态厌氧发酵罐发酵
在7L罐上以8％的玉米粉培养基进行ABE发酵。
发酵37h结束，丁醇浓度、ABE总浓度、总糖利用率和总残糖浓度分别为4.79g/L、7.75g/L、 45％、17.60g/L(ABE发酵性能见图2、二糖/三糖、总氨基酸浓度的变化情况见图5)。
实施例3：7L静态厌氧发酵罐发酵
在7L罐上以8％的玉米粉培养基进行ABE发酵，废弃毕赤酵母处理液的规格为酵母含量400g/L、NaOH用量50g/L(调节pH后，SO4 2-约为58g/L)，在产溶剂期开始、pH触底反弹回升0.1～0.2后，添入0.75L上述废弃毕赤酵母处理液，处理液稀释了5倍，最终总装液量为3.75L，混合原料中的玉米粉(实际)含量、废弃酵母含量和SO4 2-含量分别为6.4g/L、80g/L、11.6g/L(利用毕赤酵母固态废弃物A进行3批次的发酵后，取平均值)。
发酵44h结束，丁醇浓度、ABE总浓度、总糖利用率和总残糖浓度分别为10.63g/L、16.57g/L、91％、4.80g/L(ABE发酵性能见图3)。
实施例4：7L静态厌氧发酵罐发酵
在7L罐上以8％的玉米粉培养基进行ABE发酵，废弃毕赤酵母处理液的规格为酵母含量400g/L、NaOH用量30g/L(调节pH后，SO4 2-约为35g/L)，在产溶剂期开始、pH触底反弹回升0.1～0.2后，添入0.75L上述废弃毕赤酵母处理液，处理液稀释了5倍，最终总装液量为3.75L，混合原料中的玉米粉(实际)含量、废弃酵母含量和SO4 2-含量分别为6.4g/L、80g/L、7.0g/L(利用毕赤酵母固态废弃物A进行3批次的发酵后，取平均值)。
发酵44h结束，丁醇浓度、ABE总浓度、总糖利用率和总残糖浓度分别为9.44g/L、15.25g/L、99％、0.51g/L(ABE发酵性能见图4、二糖/三糖、总氨基酸浓度的变化情况见图6)。
图1-4是7L静态厌氧发酵罐中的ABE发酵结果。
图5-6是8％玉米粉培养基(实施例2)和8％玉米粉培养基并投放酵母处理液发酵(实施例4)时，二糖/三糖、总氨基酸浓度的变化情况。
从图1-4可以看出，向发酵液中投入废酵母处理液后，发酵液形态逐步发生变化。投入后发酵罐内液体分成三层：废酵母处理液的固体残渣沉底、中间为废酵母水解清液和发酵液、发酵后产生的玉米废渣在最上层。随着ABE发酵的进行，产气量逐渐旺盛起来，沉底的固体残渣逐渐变少，液体主相越来越浑浊。最后，固态相基本消失、残渣均匀地悬浮在发酵液主相中。发酵过程散发出很浓的臭鸡蛋气味，与前期研究的结果相一致。在此条件下，丙丁梭菌消耗了电子受体Na2SO4，产生了H2S气体，造成e-/H+发生迁移，形成了高CO2(70％)、低H2(30％)的发酵环境。值得一提的是，添入废酵母处理液后(～24h)、在发酵25-40h 期间，3批次发酵丁醇合成速度均比实施例1和实施例2大幅提高，ABE发酵生产效率得到改善。
从图6可以看出，添入废弃酵母处理液前，17种氨基酸的总浓度约为0.28g/L，投入后急剧上升到2.00g/L左右，但之后基本停留在该水平不变。虽然氨基酸既没有消耗也没有积累，但是，较高水平的氨基酸浓度对于丁醇合成无疑是有益的。废弃酵母处理液中的单糖/二糖浓度很低，但三糖/三糖以上寡糖的浓度分别有20g/L和30g/L左右。玉米粉培养基中也存在三糖以上寡糖。在ABE发酵过程中、丙丁梭菌具有分泌淀粉酶、特别是糖化酶的能力，原则上它可以将多糖分解为葡萄糖/二糖/三糖。
从图2、5可以看出，添入废弃酵母处理液前，葡萄糖浓度很高，二糖/三糖基本没有任何消耗。而实施例4，添入废弃酵母处理液后、部分由于稀释的作用，葡萄糖已经降低到2-3 g/L的低水平，糖化酶得到诱导、其分解二糖/三糖的活性得到强化。这时，二糖从最高时的 8.97g/L下降到0.62g/L，三糖从5.33g/L下降到0.24g/L。投入废酵母处理液后，二糖/三糖浓度大幅下降，混合培养基中的二糖/三糖得到了有效利用，导致总糖利用效率大幅提升。这可能主要得宜于混合培养基中的高氨基酸和SO4 2-盐浓度环境、以及其他不明因素。废酵母处理液和玉米培养基中都存在有难以被梭菌利用的三糖以上寡糖，添入废酵母处理液后、其浓度也能从18.93g/L降低到14.73g/L。在此条件下，30.0g/L的葡萄糖、8.4g/L的二糖、5.1g/L 的三糖以及3.8g/L的寡糖得到消耗，总糖耗量达到47.3g/L，这与使用盐酸水解法得到的总糖消耗(50g/L×99％＝49.5g/L)是基本一致的。这时，总碳/氮源的液化率为54％。废弃酵母的水解/液化对提高总糖利用效率并不是没有意义的，比如说，将蛋白质液化成氨基酸，氨基酸本身并没有被梭菌代谢利用，但是高浓氨基酸却可以加快丁醇的合成、葡萄糖的消耗以及二糖/三糖的利用，这实际上间接促进了总糖的利用和废弃酵母的资源化。
实施例5：100mL厌氧瓶发酵
使用传统15％玉米粉培养基(进行了5批次的发酵)。
丁醇浓度、ABE总浓度和总糖利用率的范围为8.16～13.38g/L、12.78～20.65g/L、27.6～46.9％ (ABE发酵性能见表1)。
实施例6：100mL厌氧瓶发酵
使用传统8％玉米粉培养基(进行了2批次的发酵)。
丁醇浓度、ABE总浓度和总糖利用率的范围为5.51～6.32g/L、8.55～9.93g/L、38.2～38.5％ (ABE发酵性能见表1)。
实施例7：100mL厌氧瓶发酵
使用传统5％玉米粉培养基(进行了2批次的发酵)。
丁醇浓度、ABE总浓度和总糖利用率的范围为4.22～4.40g/L、6.61～6.92g/L、39.1～43.8％ (ABE发酵性能见表1)。
实施例8：100mL厌氧瓶发酵
使用传统5％玉米粉培养基，实质玉米粉、废弃毕赤酵母和NaOH投放量分别为4％，80g/L 和20g/L(分别利用毕赤酵母固态废弃物A进行实施例8(A#1)批次的发酵，利用毕赤酵母固态废弃物B进行实施例8(B#1)批次的发酵。)。
丁醇浓度、ABE总浓度和总糖利用率为6.81～6.84g/L、9.72～9.73g/L、77.1～91.7％(ABE 发酵性能见表1)。
实施例9：100mL厌氧瓶发酵
使用传统5％玉米粉培养基，实质玉米粉、废弃毕赤酵母和NaOH投放量分别为4％，80g/L 和32g/L(利用毕赤酵母固态废弃物A进行实施例9(A#1)批次的发酵)。
丁醇浓度、ABE总浓度和总糖利用率为5.80g/L、8.60g/L、77.1％(ABE发酵性能见表1)。
实施例10：100mL厌氧瓶发酵
使用传统8％玉米粉培养基，实质玉米粉、废弃毕赤酵母和NaOH投放量分别为6.4％， 80g/L和6g/L(分别利用毕赤酵母固态废弃物A进行实施例10(A#1)批次的发酵，利用毕赤酵母固态废弃物D进行实施例10(D#1)批次的发酵。)。
丁醇浓度、ABE总浓度和总糖利用率的范围为10.63～10.72g/L、17.22～17.38g/L、 93.4～94.4％(ABE发酵性能见表1)。
实施例11：100mL厌氧瓶发酵
使用传统8％玉米粉培养基，实质玉米粉、废弃毕赤酵母和NaOH投放量分别为6.4％， 80g/L和10g/L(分别利用毕赤酵母固态废弃物A进行实施例11(A#1-#2)批次的发酵，利用毕赤酵母固态废弃物D进行实施例11(D#1-#2))。
丁醇浓度、ABE总浓度和总糖利用率的范围为11.02～11.70g/L、17.75～18.30g/L、 93.9～94.4％(ABE发酵性能见表1)。
实施例12：100mL厌氧瓶发酵
使用传统8％玉米粉培养基，实质玉米粉、废弃毕赤酵母和NaOH投放量分别为6.4％， 120g/L和10g/L(分别利用毕赤酵母固态废弃物A进行实施例12(A#1)批次的发酵，利用毕赤酵母固态废弃物D进行实施例12(D#1)批次的发酵.)。
丁醇浓度、ABE总浓度和总糖利用率的范围为10.67～10.92g/L、16.99～17.25g/L、 94.6～94.9％(ABE发酵性能见表1)。
实施例13：100mL厌氧瓶发酵
使用传统8％玉米粉培养基，实质玉米粉、废弃毕赤酵母和NaOH投放量分别为6.4％， 40g/L和6g/L(利用毕赤酵母固态废弃物A进行实施例13(A#1)批次的发酵)。
丁醇浓度、ABE总浓度和总糖利用率为8.83g/L、14.05g/L、75.0％(ABE发酵性能见表 1)。
实施例14：100mL厌氧瓶发酵
使用传统8％玉米粉培养基，实质玉米粉、废弃毕赤酵母和NaOH投放量分别为4.8％， 160g/L和40g/L(分别利用毕赤酵母固态废弃物A进行实施例14(A#1)批次的发酵)。
丁醇浓度、ABE总浓度和总糖利用率为6.11g/L、9.25g/L、64.1％(ABE发酵性能见表1)。
实施例15：100mL厌氧瓶发酵
使用传统10％玉米粉培养基，实质玉米粉、废弃毕赤酵母和NaOH投放量分别为8.0％， 80g/L和10g/L(分别利用毕赤酵母固态废弃物A进行实施例15(A#1)批次的发酵，利用毕赤酵母固态废弃物B进行实施例15(B#1)批次的发酵)。
丁醇浓度、ABE总浓度和总糖利用率的范围为9.84～10.34g/L、15.20～16.30g/L、71.6～77.9％ (ABE发酵性能见表1)。
实施例16：100mL厌氧瓶发酵
使用传统8％玉米粉培养基，实质玉米粉、废弃毕赤酵母和NaOH投放量分别为6.4％， 80g/L和32g/L(利用毕赤酵母固态废弃物A进行实施例16(A#1)批次的发酵)。
丁醇浓度、ABE总浓度和总糖利用率为6.90g/L、11.16g/L、55.0％(ABE发酵性能见表 1)。
图7为不同操作条件下、ABE总产量与废弃酵母中碳水化合物利用率/资源化之间的理论 /实验关系。
从图7可以看出，初始玉米粉用量过大(10％)、废弃酵母利用率低，起不到废弃酵母固形物资源化的作用；废弃酵母投放量过小，废弃固形物也得不到有效利用；在废弃酵母/NaOH投料量为80g/L-broth和6～10g/L-broth的范围内，废弃固形物的利用率水平较佳。酵母处理液中至少有18％的蛋白质可以得到液化分解、形成各种氨基酸。虽然氨基酸对提高ABE 浓度没有直接贡献，但它们均能为丁醇合成/梭菌生成营造出有益的环境。与此同时，较高水平的氨基酸浓度也有利于CO2的释放和液态有机酸的形成，对于废弃固体的减量化也是有好处的。
从图7也可以看出，若总ABE浓度能够达到～18g/L的水平，废弃固体中的碳水化合物最大理论利用效率约为65％，废弃酵母悬浊液中的碳水化合物液化率仅为36％；但利用玉米粉/废酵母悬浊液进行ABE发酵过程中，最大碳水化合物利用率却可达到52％。在发酵过程中，因为丙酮丁醇梭菌具有分泌淀粉酶的能力，可以进一步液化混合培养基中一些不溶性多碳寡糖/低聚糖，液化率的提高必须依靠ABE发酵。这时，52％废弃酵母中的碳水化合物有一部分可以用来合成ABE、这是资源化的问题；还有另一部分经过液化/气化转化成了有机酸 /CO2、这则是固体废弃物减量化的问题。因此，废弃酵母中碳水化合物的利用，两者兼而有之。
表1不同操作条件下的ABE发酵性能比较(100mL厌氧瓶)
Figure BDA0001783092180000141
从表1可以看出，废弃酵母和NaOH的投放量要控制适中，在80～120g/L和6～10g/L的范围内比较合适，废弃酵母投放量过大，发酵体系无法承受/负担；投放量过小，其作用又无法得到体现，两者均可造成发酵性能恶化。
表3不同操作条件下ABE发酵的有机酸积累和CO2释放情况(100mL厌氧发酵瓶)
Figure BDA0001783092180000151
注：总装液量均为50mL。
从表3可以看出，与传统发酵(只使用玉米淀粉)相比，本发明所提出的玉米粉/废弃酵母混合底物ABE发酵体系有如下特征：ABE发酵体系的总产气特别大，相比于15％玉米粉对照、总产气增幅在30％以上。根据丙丁梭菌的代谢模式，每消耗1摩尔葡萄糖，有2.5摩尔的CO2生成，折合成重量得率约为61％。与文献报道的经验公式的对应得率(56％)相接近，该经验公式对于元素C、H和O是完全平衡的。
另外，前期研究结果表明，在SO4 2-存在的条件下，丙丁梭菌可将SO4 2-还原成H2S，造成e-/H+发生迁移，更多的H+用于NADH生成途径而不是H2的合成途径中，最后形成了高 CO2(70％)、低H2(30％)的发酵环境。由于CO2的分子量远大于H2，CO2释放量的提高可以消耗更多的碳源。经验公式为：95C6H12O6＝60C4H9OH(丁醇)+30CH3OCH3(丙酮) +10C2H5OH(乙醇)+220CO2+120H2+30H2O。2)有机酸积累量大，总有机酸(乙酸和丁酸)/ABE总溶剂的比例从传统发酵的4％(可以忽略)提高到11％～19％、平均15％的水平。特别是乙酸的提高幅度更大，而且废弃固体的投料量越大、乙酸浓度越大。
文献表明，梭菌Clostridium种属的细菌也可以在厌氧条件下，将固态有机物中的多糖、蛋白质和脂肪分别转化成单糖、氨基酸和脂肪酸。在梭菌等的作用下、上述物质还可以继续降解成乙酸、丙酸、CO2和H2等，这也是在玉米粉/废弃毕赤酵母混合原料的ABE发酵体系下、总产气/有机酸大幅提高/积累的另一个重要原因。这时，尽管有机酸和氨基酸不能再对 ABE溶剂产品的提高再做出贡献，它毕竟增加了废弃固体中总碳/氮源的液化/气化率、与废弃酵母的减量化直接关联。必须承认，处理废弃酵母导致有机酸大幅积累、SO4 2-浓度上升，这增加了ABE溶剂产品蒸馏废水中的COD和污水处理的负担，会对水环保产生负面影响。但是，由于此时ABE溶剂浓度较高(相比于使用农业废弃物的ABE发酵)，污水质量差但绝对处理量少，理论上污水处理的负担应该没有大的增加。
表4玉米粉/废弃毕赤酵母混合原料ABE发酵体系的经济性评价
Figure BDA0001783092180000161
注：*代表4个发酵批次的平均值。
其中，丙酮和丁醇价格设定在￥8000/t；乙醇价格设定在￥4000/t；玉米粉价格设定在￥1800/t，酵母固形物处理费设定在￥3000/t(参照废水泥处理标准，仅考虑湿菌体处理成本、不考虑干菌体重量比率≈0.35)；NaOH价格设定在￥3000/t；H2SO4价格设定在￥500/t。
评价一个发酵系统优劣的最终标准还是其经济性。在此，对玉米粉/废弃毕赤酵母混合原料ABE发酵体系进行了简单的经济性分析。这里，丁醇、丙酮、乙醇、玉米、NaOH和H2SO4的价格参照近期网站所公布的价格，酵母固形物处理费设定在￥3000/t的水平(参照废水泥处理标准)、并假定总废弃酵母固形物的减量化率为82％。但是没有考虑电力(静态发酵需求量小)，蒸汽灭菌，特别是添加废弃酵母后蒸馏废水中COD增加、污水处理可能需要的额外费用。
从表4可以看出，使用传统玉米粉进行ABE发酵基本都是亏损的。主要得宜于固形物处理费的正利润，玉米粉/废弃毕赤酵母混合原料ABE发酵体系在经济上可以扭亏为盈，尽管它需要投入相当量的NaOH和H2SO4。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (7)

1.一种利用毕赤酵母固态废弃物高效发酵生产丁醇的方法，其特征在于，所述方法为先将丙酮丁酸梭菌接种于玉米粉培养基中进行ABE发酵，当发酵进入到产溶剂期后，再按照毕赤酵母固态废弃物与玉米粉培养基质量比为1:4的比例在玉米粉培养基中加入80-120g/L的毕赤酵母固态废弃物继续进行ABE发酵；所述玉米粉培养基是通过将玉米粉与水进行混合后依次进行糊化处理、液化处理以及糖化处理得到的，所述毕赤酵母固态废弃物需进行预处理后才可加入玉米粉培养基中；所述预处理为先用6~10g/L碱溶液浸泡毕赤酵母固态废弃物形成固液悬浊液，然后将形成的固液悬浊液在沸水浴中进行蒸煮后冷却至室温，最后用酸溶液将冷却至室温的固液悬浊液的pH调节至5~6。
2.如权利要求1所述的一种利用毕赤酵母固态废弃物高效发酵生产丁醇的方法，其特征在于，所述玉米粉培养基中，玉米粉原料的含量为60~100g/L。
3.如权利要求1或2所述的一种利用毕赤酵母固态废弃物高效发酵生产丁醇的方法，其特征在于，所述毕赤酵母固态废弃物是指高密度毕赤酵母诱导发酵生产得到目标蛋白后，取走目标蛋白得到的剩余发酵液。
4.如权利要求3所述的一种利用毕赤酵母固态废弃物高效发酵生产丁醇的方法，其特征在于，所述毕赤酵母固态废弃物中的毕赤酵母干重为30~40%，含水量为60~70%。
5.如权利要求4所述的一种利用毕赤酵母固态废弃物高效发酵生产丁醇的方法，其特征在于，所述用碱溶液浸泡毕赤酵母固态废弃物的时间为2~3d。
6.如权利要求5所述的一种利用毕赤酵母固态废弃物高效发酵生产丁醇的方法，其特征在于，所述蒸煮的时间为100min。
7.权利要求1-6任一所述的一种利用毕赤酵母固态废弃物高效发酵生产丁醇的方法在丁醇制备以及毕赤酵母固态废弃物资源化和减量化方面的应用。
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