DE10251144A1

DE10251144A1 - Makroporöses Kunststoffperlenmaterial

Info

Publication number: DE10251144A1
Application number: DE10251144A
Authority: DE
Inventors: Stefan Dr. Menzler; Hans-Ulrich Petereit; Christian Dr. Meier; Thomas Boller; Thomas Dr. Süfke; Klaus Dr. Schultes; Roger Recktenwald
Original assignee: Roehm GmbH Darmstadt
Current assignee: Roehm GmbH Darmstadt
Priority date: 2002-10-31
Filing date: 2002-10-31
Publication date: 2004-05-19
Also published as: CN1612903A; US20050065224A1; IL162081A; WO2004039854A2; JP2006504816A; WO2004039854A3; KR20050084753A; EP1556427A2; CN1283680C; AU2003270100A1; US7381552B2; HK1076634A1; IL162081A0

Abstract

Die Erfindung betrifft ein makroporöses Kunststoffperlenmaterial mit einem mittleren Teilchendurchmesser von 10 bis 1000 mum, enthaltend ein Mischpolymerisat aus a) 5-60 Gew.-% vinylisch polymerisierbaren Monomeren mit einer Wasserlöslichkeit von mindestens 1% bei 20 DEG C, b) 1-40 Gew.-% vinylisch polymerisierbaren Monomeren mit einer zusätzlichen funktionellen Gruppe, die in einer polymeranalogen Reaktion mit den nucleophilen Gruppen der Liganden kovalente Bindungen eingehen kann, c) 10-40 Gew.-% hydrophilen, vernetzenden radikalisch polymerisierbaren Monomeren mit zwei oder mehr ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Gruppen und d) 10-60 Gew.-% vinylisch polymerisierbare Monomere mit einer Wasserlöslichkeit von höchstens 1% bei 20 DEG C enthalten sind, wobei sich die Monomeren a) bis d) in der Regel zu 100% ergänzen.

Description

Die Erfindung betrifft das Gebiet der Polymerträgersysteme und insbesondere ein makroporöses Kunststoffperlenmaterial, enthaltend ein Mischpolymerisat aus vernetztem (Meth)acrylat-Kunststoff.
Stand der Technik
Polymerträgersysteme, enthaltend Mischpolymerisate aus vernetztem (Meth)acrylat-Kunststoff sind bekannt, z. B. aus EP-A 0 328767 , EP-A 424 130 , EP-A 579 928 oder aus WO 99/33964.
WO 99/40122 ( DE-A 19804518 ) betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines perlförmigen, vernetzten hydrophilen, gegenüber Liganden mit nucleophilen Gruppen bindungsaktiven Mischpolymerisats durch inverse Suspensionspolymerisation einer Monomerenphase. Die Erfindung betrifft weiterhin die daraus erhältlichen Trägerpolymermaterialien mit hoher Bindungskapazität für Penicillinamidase und niedriger Quellzahl sowie deren Verwendung.
Das Mischpolymerisat aus vernetztem (Meth)acrylat-Kunststoff wird durch inverse Suspensionspolymerisation der folgenden Monomere erhalten:

a) 5 – 40 Gew.-% hydrophile radikalisch polymerisierbare Monomere mit einer Vinylgruppe, die bei Raumtemperatur wenigstens 10 %-ige wäßrige Lösungen bilden
b) 30 – 50 Gew.-% radikalisch polymerisierbaren Monomere mit einer Vinylgruppe und einer zusätzlichen funktionellen Gruppe, die in einer polymeranalogen Reaktion mit den nucleophilen Gruppen der Liganden kovalente Bindungen eingehen kann
c) 20 – 60 Gew.-% hydrophile, vernetzende radikalisch polymerisierbare Monomere mit zwei oder mehr ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Gruppen

Das Mischpolymerisat eignet sich als Trägermaterial für verschiedene Enzymtypen.
Aufgabe und Lösung
Ausgehend von der WO 99/40122 sollten weitere makroporöse Kunststoffperlenmaterialien bereitgestellt werden, die sich als effiziente Trägermaterialien insbesondere für Enzyme eignen, die relativ hydrophobe Substrate umzusetzen vermögen, bevorzugt für Lipasen. Dabei sollten die vorteilhaften Eigenschaften der bekannten Materialien gemäß der WO 99/40122, z. B. deren niedrige Quellungszahlen, nach Möglichkeit nicht beeinträchtigt werden. Es sollten weiterhin makroporöse Kunststoffperlenmaterialien bereitgestellt werden, die nach Bindung von Lipasen vergleichsweise hohe Aktivitäten in Testsystemen wie der Tributyrin-Hydrolyse, der Triacetin-Hydrolyse, der Phenylethylacetat-Hydrolyse und/oder Phenylethylacetat-Synthese zeigen.
Die Aufgabe wird gelöst durch ein
makroporöses Kunststoffperlenmaterial mit einem mittleren Teilchendurchmesser im Bereich von 10 bis 1000 μm, enthaltend ein Mischpolymerisat aus

a) 5 – 60 Gew.-% vinylisch polymerisierbaren Monomeren mit einer Wasserlöslichkeit von mindestens 1 % bei 20 °C,
b) 1 – 40 Gew.-% vinylisch polymerisierbaren Monomeren mit einer zusätzlichen funktionellen Gruppe, die in einer Reaktion mit nucleophilen Gruppen von Liganden kovalente Bindungen eingehen kann,
c) 10 – 40 Gew.-% hydrophilen, vernetzenden radikalisch polymerisierbaren Monomeren mit zwei oder mehr ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Gruppen,

d) 10 – 60 Gew.-% vinylisch polymerisierbare Monomere mit einer Wasserlöslichkeit von höchstens 1 % bei 20 °C enthalten sind, wobei sich die Monomeren a) bis d) in der Regel zu 100 % ergänzen.

Ausführung der Erfindung
Mittlerer Teilchendurchmesser V₅₀
Das Makroporöse Kunststoffperlenmaterial hat einen mittleren Teilchendurchmesser V₅₀ von 10 bis 1000, bevorzugt von 50 bis 600, besonders bevorzugt von 100 bis 500, insbesondere von 200 bis 400 μm.
Die Bestimmung von des mittleren Teilchendurchmessers V₅₀ kann z. B. mit einem Teilchenanalysator erfolgen. Dabei wird in der Regel eine Probe mit einer Teilchenkonzentration im Bereich von 10³–10⁶ Teilchen mit etwas Detergenz als Benetzungshilfe versetzt und zusätzlich vor der Messung mit Ultraschall zur Separierung der Teilchen behandelt.
Porosität
Das makroporöse Kunststoffperlenmaterial kann eine Porosität aufweisen, die sich durch einen K_PS10-Wert von 0,3 bis 0,9, insbesondere von 0,35 bis 0,6, meßbar z. B. mittels inverser Größenausschlußchromatographie in Tetrahydrofuran, charakterisieren läßt.
Quellungszahl in Wasser
Das makroporöse Kunststoffperlenmaterial kann eine Quellungszahl in Wasser von 1 bis 1,5, insbesondere von 1,05 bis 1,2 aufweisen.
Monomerzusammensetzung
Das Mischpolymerisat besteht erfindungsgemäß aus den radikalisch polymerisierten Einheiten der Monomertypen a) bis d), die in den angegebenen Mengenverhältnissen vorliegen und sich in der Regel zu 100 Gew.-% addieren. Die Eigenschaften zur Umsetzung hydrophober Substrate wird dabei wesentlich durch die Auswahl der Monomeren im Einzelnen und deren mengenmäßige Anteile bestimmt. Insbesondere die Balance der hydrophileren Monomertypen a) und der hydrophoberen Monomertypen d) scheinen einen wichtigen Einfluß auf die Umsetzung hydrophober Substrate zu haben.
Die Bindungseigenschaften für Enzyme wird insbesondere von der Auswahl und dem Anteil des Monomertyps b) beeinflußt. Der Monomertyp c) beeinflußt als Vernetzer die Größe und Porosität der Kunststoffperlen. Größe und Porosität beeinflussen wiederum die Bindungskapazität für Enzyme und deren Katalyseverhalten im gebundenen Zustand.
Es ist für einen Fachmann ersichtlich, daß die Mischpolymerisate auch in geringen Anteilen weitere vinylisch polymerisierbare Monomere enthalten können, ohne daß deren wesentliche Eigenschaften im Einzelfall davon wesentlich beeinträchtigt werden müssen. In der Regel bestehen die Mischpolymerisate jedoch zu 100 % aus radikalisch polymerisierten Einheiten die Monomere a) bis d).
Monomere a)
Als Monomere a) sind 5 – 60, bevorzugt 10 bis 50 Gew.-% vinylisch polymerisierbare Monomere mit einer Wasserlöslichkeit von mindestens 1 bei 20 °C im Mischpolymerisat enthalten.
Als Monomere a) sind insbesondere Acrylamid und/oder Methacrylamid, Hydroxyalkylester von ungesättigten polymerisierbaren Carbonsäuren, wie Hydroxyethylacrylat, Hydroxyethylmethacrylat, Hydroxypropylacrylat, Hydroxypropylmethacrylat geeignet. Weiterhin eignen sich z. B. N-Vinylpyrrolidon, Methylmethacrylat oder 3-Allyloxy-1,2-propandiol. Bevorzugt sind Methylmethacrylat und Methoxypolyethylenglykolmethacrylat (MPEGMA), Polyethylenglykolmethacrylat (PEGMA), insbesondere Methoxypolyethylenglykolmethacrylat 350 (MPEGMA350) und Polyethylenglykolmethacrylat (PEGMA).
Gute Resultate werden insbesondere erhalten, wenn gleichzeitig Methoxypolyethylenglykolmethacrylat, z. B. MPEGMA350, und Methylmethacrylat im Mischpolymerisat enthalten sind. In Summe können z. B. 30 bis 45 Gew.-% der beiden Monomere enthalten sein.
Monomere b)
Als Monomere b) sind 1 – 40, bevorzugt 10 bis 30 Gew.-% vinylisch polymerisierbare Monomere enthalten, die mit einer zusätzlichen funktionellen Gruppe, bevorzugt einer Oxirangruppe (Epoxygruppe), die in einer Reaktion mit nucleophilen Gruppen von Liganden kovalente Bindungen eingehen kann, versehen sind.
Unter Liganden sind bevorzugt biologisch aktive Moleküle, insbesondere Makromoleküle, z. B. Aminosäuren, Peptide, Proteine, insbesondere Enzyme wie z. B. Lipasen, aber auch Nucleinsäuren oder Polysaccharide zu verstehen. Insbesondere Oxirangruppen sind geeignet, um Liganden unter Erhaltung ihrer biologischen Aktivität zu binden.
Geeignete Monomere b) sind Glycidylmethacrylat und/oder Allylglycidylether und/oder Vinylazlacton.
Bevorzugt ist Glycidylmethacrylat, besonders bevorzugt in einer Menge von 15 bis 25 Gew.-%.
Monomere c)
Als Monomere c) sind 10 – 40, bevorzugt 20 bis 35 Gew.-% von hydrophilen, vernetzenden radikalisch polymerisierbaren Monomeren mit zwei oder mehr ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Gruppen enthalten.
Geeignet sind z. B. hydrophile Di(meth)acrylate, wie z. B. Ethylenglykoldi(meth)acrylat und Polyethylenoxid-Di(meth)acrylate. Geeignete Monomere c) sind weiterhin N,N'-Methylen-bis-Acrylamid oder N,N'-Methylen-bis-Methacrylamid.
Bevorzugtes Monomer c) ist 1,4-Butandioldimethacrylat.
Monomere d)
Als Monomere d) sind 10 – 60, bevorzugt 10 bis 30 Gew.-% vinylisch polymerisierbare Monomere mit einer Wasserlöslichkeit von höchstens 1 % bei 20 °C enthalten.
Geeignete Monomere d) sind z. B. Isobutylmethacrylat, n-Butylmethacrylat, Cyclohexylmethacrylat, Benzylmethacrylat und 2-Ethylhexylmethacrylat.
Herstellungsverfahren
Die aus den Mischpolymerisate bestehende makroporöse Kunststoffperlenmaterial kann in an sich bekannter Weise mittels Suspensionspolymerisation (Perlpolymerisation) hergestellt werden. Dabei wird eine wäßrige Phase, die insbesondere Verteiler, z. B. ausgefälltes Aluminiumhydroxid, enthält, in einem Rührreaktor vorgelegt. Die Monomeren werden anschließend zusammen mit einem Polymerisationsinitiator, z. B. Dilaurylperoxid, in einer organischen Phase, z. B. Cyclohexan, zugegeben. Die Phasen werden dabei unter Rühren dispergiert, wobei die Polymerisation der Monomeren z. B. in einem Temperaturbereich von 60 bis 80 °C erfolgen kann. Das makroporöse Kunststoffperlenmaterial kann durch Filtration und Trocknung aus dem Ansatz gewonnen werden.
Varianten der Mischpolymerisate/Testsysteme
Varianten der Mischpolymerisate, auf denen das Enzym Lipase aus Candida antarctica immobilisiert wurde, sollen in folgenden Testsystemen gute Resultate aufweisen. Die Enzymimmobilisierung kann z. B. durch Inkubation des makroporösen Kunststoffperlenmaterials mit einer handelsüblichen Enzymlösung (z. B. Novozym^® 525F) in wäßriger Lösung für 1 bis 2 Tage bei Raumtemperatur erfolgen. Anschließend wird das mit dem Enzym gekoppelte Kunststoffperlenmaterial gewaschen und getrocknet. Die so erhaltenen Immobilisate können in den folgenden Testsystemen geprüft werden.
Hydrolyse von Tributyrin (wässriges System und wasserlösliches Substrat). Das Immobilisat aus makroporösen Kunststoffperlenmaterial und Lipase aus Candida antarctica kann z. B. eine Tributyrin-Hydrolyse-Aktivität von mindestens 150 [U/g], bevorzugt mindestens 300 [U/g], insbesondere von mindestens 500 [U/g] aufweisen.
Hydrolyse von Triacetin (wässriges System, wasserunlösliches Substrat). Das Immobilisat aus makroporösen Kunststoffperlenmaterial und Lipase aus Candida antarctica kann z. B. eine Triacetin-Hydrolyse-Aktivität von mindestens 50 [U/g], bevorzugt mindestens 100 [U/g], insbesondere von mindestens 150 [U/g] aufweisen.
Hydrolytische Racematspaltung von 1-Phenylethylacetat (wässriges System, wasserunlösliches Substrat). Das Immobilisat aus makroporösen Kunststoffperlenmaterial und Lipase aus Candida antarctica kann z. B. eine Phenylethylacetat-Hydrolyse-Aktivität von mindestens 80 [U/g], bevorzugt mindestens 100 [U/g], insbesondere von mindestens 150 [U/g] aufweisen.
Racematspaltung von 1-Phenylethanol durch Transesterifizierung (nichtwässriges System). Das Immobilisat aus Mischpolymerisat und Lipase aus Candida antarctica kann z. B. eine Phenylethanol-Racematspaltungs-Aktivität von mindestens 100 [U/g], bevorzugt mindestens 120 [U/g], insbesondere von mindestens 180 [U/g] aufweisen.
Verwendungen
Das makroporöse Kunststoffperlenmaterial kann zur Immobilisierung von Peptiden, Proteinen, Nucleinsäuren oder Polysacchariden verwendet werden, bevorzugt zur Immobilisierung von Lipasen aus Rhizopus, Aspergillus, Mucor, Alcaligenes, Candida, Pseudomonas, Thermomyces, Chromobacterium, Schweinepankreas, sowie zur Immobilisierung von Phospholipasen aus Streptomyces und Actinomadura, sowie zur Immobilisierung von Esterasen aus Schweineleber und Orangenschalen.
Die erfindungsgemäßen makroporösen Kunststoffperlenmaterialien können als Trägermaterialien zur kovalenten Bindung von Liganden mittels der vorhandenen Oxirangruppen in Rühr- oder Durchflußreaktoren eingesetzt werden. Dies kann z. B. durch Anlagerung von Proteinen, insbesondere Enzymen, aus konzentrierten Lösungen über kovalente Bindung unter Beibehaltung ihrer biologischen Aktivität erfolgen. Weiterhin können auch Peptide, Aminosäuren, Lipide, Nucleotide, Polynukleotide, niedermolekulare nucleophile Verbindungen oder metallorganische Verbindungen mit den Oxirangruppen der Trägerperlen umgesetzt werden.
Die mit Liganden beladenen Polymerperlen können in an sich bekannter Weise zur stereospezifischen Synthese von chiralen Substanzen, wie Aminosäuren (d-Phenylalamin, p-Hydroxy-d-phenylalanin, I-tert.-Leucin) oder Arzneimitteln, z. B. β-Lactamantibiotika, Ibuprofen, eingesetzt werden.
Ein weiteres Anwendungsgebiet sind Synthesen von Feinchemikalien oder Grundprodukten für chemische Synthesen (z. B. Apfelsäure).
Die Polymerperlen können auch in der Separationstechnik zur Adsorptionschromatographie oder Gelpermeationschromatographie verwendet werden. Zur spezifischen Adsorption können die Polymerperlen mit Immunglobulin-Fraktionen aus Antiseren oder mit monoklonalen Antikörpern beladen werden. Als weiteres Einsatzgebiet ist die Verwendung des mit Enzymen oder Antikörpern beladenen Trägerpolymermaterials als Adsorbens in der extrakorporalen Therapie, in der pathogene bzw. toxische Substanzen aus Vollblut entfernt werden, zu nennen.
BEISPIELE
1. Beispiele für Mischpolymerisatvarianten
Übersichtstabelle der Mischpolymerisatvarianten
Beispiel 1: Herstellvorschrift für die Mischpolymerisatvariante 13
Phasenverhältnisse:
Wasser:Monomeres (+ Lösemittel) = 2:1 ( ist variierbar), z. B. 1:1 oder 1:2.
Monomere:Lösungsmittel = 2:1 ( ist variierbar), z. B. 1:1 oder 1:2
Die gesamte Wassermenge [810g] und das Aluminiumsulfat [5,4g] werden in einem 2L Rührreaktor, umfassend Thermoelement, Badthermostat, Rückflusskühler, Stickstoff-einleitrohr unter Rühren und Stickstoffeinleitung vorgelegt und auf 70°C aufgeheizt. Bei Erreichen der vorgegebenen Innentemperatur wird in einem Zug die Sodalösung [24g] zur Fällung des Aluminiumhydroxids zugegeben. Anschließend erfolgt die Zugabe der Hilfsverteiler C15-Paraffinsulfonat, Na-Salz und Polyethylenglykol 5000/6000 [je 0,05g]. Der pH-Wert der Wasserphase beträgt ca 5,5 .
Danach werden
74g Isobutylmethacrylat,
74g Methylmethacrylat,
54g Glycidylmethacrylat,
67,5g 1,4-Butandioldimethacrylat
sowie
5,4g Dilauroylperoxid
in 135g Cyclohexan gelöst, zugegeben. In den nächsten 20 Minuten steigt die Innentemperatur von 70°C auf 72°C an. Nach dem Temperaturmaximum wird noch 2 Stunden bei 70°C nacherhitzt. Anschließend wird auf 40°C abgekühlt und mit 10ml 50%iger Schwefelsäure angesäuert. Der Ansatz wird weiter abgekühlt, auf eine Porzellannutsche (Tuchfilter) abgelassen und mit 5L deion. H₂O gewaschen. Die feuchten Perlen werden im Wirbelschichttrockner bei 50– 60°C 90 Minuten getrocknet.
Beispiel 2: Herstellvorschrift für die Mischpolymerisatvariante 60
Die gesamte Wassermenge [810g] und das Aluminiumsulfat [5,4g] werden in einem 2L Rührreaktor, umfassend Thermoelement, Badthermostatt, Rückflusskühler, Stickstoff-einleitrohr unter Rühren und Stickstoffeinleitung vorgelegt und auf 70°C aufgeheizt. Bei Erreichen der vorgegebenen Innentemperatur wird in einem Zug die Sodalösung [24g] zur Fällung des Aluminiumhydroxids zugegeben. Anschließend erfolgt die Zugabe der Hilfsverteiler C15-Paraffinsulfonat, Na-Salz und Polyethylenglykol 5000/6000 (je 0,05g]. Der pH-Wert der Wasserphase beträgt ca 5,5 .
Danach werden
54g Isobutylmethacrylat,
54g Methylmethacrylat,
54g Glycidylmethacrylat,
67,5g 1,4-Butandioldimethacrylat
40,5g Methoxypolyethylenglykolmethacrylat
sowie
5,4g Dilauroylperoxid
in 135g Cyclohexan gelöst, zugegeben. In den nächsten 20 Minuten steigt die Innentemperatur von 70°C auf 72°C an. Nach dem Temperaturmaximum wird noch 2 Stunden bei 70°C nacherhitzt. Anschließend wird auf 40°C abgekühlt und mit 10ml 50%iger Schwefelsäure angesäuert. Der Ansatz wird weiter abgekühlt, auf eine Porzellannutsche (Tuchfilter) abgelassen und mit 5L deion. H₂O gewaschen. Die feuchten Perlen werden im Wirbelschichttrockner bei 50-60°C 90 Minuten getrocknet.
Beispiel 3: Polymeranalytik der Mischpolymerisatvarianten
Bestimmung von des mittleren Teilchendurchmessers V₅₀:
Der mittlere Teilchendurchmesser wird mit einem CIS1-Teilchenanalysator der Firma L.O.T. GmbH gemessen. Probenvorbereitung: Es wird soviel Probe in ein 400ml-Becherglas gegeben, dass eine Konzentration von 10³–10⁶ Teilchen erreicht wird. Dann werden einige Tropfen eines Detergenz als Benetzungshilfe auf die Probe gegeben. Dann wird mit 350ml VE-Wasser aufgefüllt. Die erhaltene Suspension wird ca. 1 Minute mit Ultraschall behandelt und dann im CIS1-Gerät, Messbereich 5–600μm, vermessen.
Bestimmung des Verteilungskoeffizienten K_PS10:
Durch inverse Größenausschlußchromatographie (SEC) wird der Anteil des Porenvolumens bestimmt, der dem eingesetzten Sondenmolekül zugänglich ist. Der so erhaltene Verteilungskoeffizient ist ein Maß für die Porosität der Probe. Eine Merck Superformance-Glassäule 300×10 mm wird nach dem balanced density-Prinzip mit THF und Tetrachlorethylen mit dem Perlpolymerisat befüllt. Dann wird die Säule gepackt und äquilibriert, indem 150 ml THF mit einer Flussrate von 15 ml/min gefördert werden. Danach wird die Säule verschlossen und es werden weitere 150 ml Tetrahydrofuran (THF) mit einer Flussrate von 10 ml/min gefördert. Drücke von > 20bar sind dabei zu vermeiden, da die Säule dann zu stark komprimiert und keine geeignete Säulenpackung erreicht wird. Dann werden nacheinander die Sondenmoleküle auf die Säule gegeben und bei einer Flussrate von 0.2 ml/min eluiert. Die Ausschlussgrenzen werden mit o-Dichlorbenzol und Polystyrol 6770000 (Molekulargewicht 6770000 Dalton) bestimmt, als Sondenmolekül dient Polystyrol 10200 (Mokulargewicht 10200 Dalton).
Der Verteilungskoeffizient wird aus den Elutionsvolumina wie folgt berechnet: KPS10 = VE(PS10200) – VE(PS6770000) / VE(o-Dichlorbenzol) – VE(PS6770000) Wobei: K_PS10 = Verteilungskoeffizient für Polystyrol 10200, V_E(PS10200) = Elutionsvolumen des Sondenmoleküls Polystyrol 10200, V_E(PS6770000) = Elutionsvolumen des Ausschlussmarkers Polystyrol 6770000, V_{E(o-Dichlorbenzol)} = Elutionsvolumen des Ausschlußmarkers o-Dichlorbenzol.
Bestimmung der Quellungsaahl:
3g Träger werden in einen 25 ml-Meßzylinder mit 0,5ml-Graduierung eingewogen. Die Oberfläche wird durch leichtes Aufstampfen des Messzylinders geglättet und das Füllvolumen V_T in ml notiert. Nun werden 9 ml 0.01 % Polysorbat 80-Lösung in ultrafiltriertem Wasser zugegeben und der Messzylinder verschlossen. Innerhalb einer Stunde der Messzylinder viermal in 15 Minuten-Abständen kräftig geschüttelt. Danach werden die an der Wandung anhängenen Perlen mit 2 bis 3 ml 0.01 % Polysorbat 80-Lösung in ultrafiltriertem Wasser heruntergespült. Der Messzylinder wird 2 Stunden ruhig stehengelassen, dann wird das Volumen des abgesetzten und des flotierenden Materials abgelesen und addiert zu V_Q. Die Quellungszahl ist definiert als der Quotient V_Q/V_T.
Beispiel 4: Immobilisierungsmethoden:
Methode M2:
4 ml Enzymlösung Novozym 525F in 16 ml einer 10 Vol-%igen Lösung von tert.-Amylalkohol in dest. Wasser geben. Diese Lösung zu 2 g trockenem Träger geben. Ansatz bei 20°C 1.5 d schwenken. Dann die Perlen auf eine Glasfritte Por 2 spülen und waschen mit 6×50ml dest. Wasser. Nach dem letzten Spülen scharf absaugen. Im Exsiccator über Trockengel trocknen.
Methode M3:
4 ml Enzymlösung Novozym 525F und 6 ml Reinstwasser mischen. Mischung zu 2 g trockenem Träger geben. Umschwenken, dann 1.5d bei Raumtemp. überkopfschütteln. Dann die Perlen auf eine Glasfritte Por 2 spülen und waschen mit 3×50ml dest. Wasser und 3×50ml 0.1 M Kaliumphosphatpuffer pH 7.5. Nach der letzten Waschung scharf absaugen und über Trockengel im Exsiccator trocknen.
Methode M3-aMEK:
4 ml Enzymlösung Novozym 525F und 6 ml Reinstwasser mischen. Mischung zu 2 g trockenem Träger geben. Umschwenken, dann 1.5d bei Raumtemp. überkopfschütteln. Dann die Perlen auf eine Glasfritte Por 2 spülen und waschen mit 6×50ml dest. Wasser. Zur Trocknung scharf absaugen und auf der Glasfritte mit 6×50ml Methylethylketon (MEK) chromatographisch waschen, dann zur Trockne absaugen (ca. 30 min). Statt MEK können auch andere, teilweise oder komplett wassermischbare Lösungsmittel wie THF, tert.-Amylalkohol, Isopropanol, Aceton verwendet werden.
Methode M4:
4 ml Enzymlösung Novozym 525F und 6 ml 1 M KPP pH 7.5 mischen. Mischung zu 2 g trockenem Träger geben. Umschwenken, dann 1.5d bei 23°C stehen lassen. Dann die Perlen auf eine Glasfritte Por 2 spülen und waschen mit 3×50ml dest. Wasser und 3×50ml 0.1 M Kaliumphosphatpuffer pH 7.5. Nach dem letzten Spülen scharf absaugen. Im Exsiccator über Trockengel trocknen.
Beispiel 5: Aktivitätstests:
5.1 Tributyrin-Hydrolyse
Im Aktivitätstest wird die Freisetzung von Buttersäure durch Titration mit 1 M NaOH-Lösung unter konstanten pH-Bedingungen gemessen.
Geräte:
pH-stat-Titrator, z. B. Mettler DL 50
100 ml Glasgefäß (dem Standardgefäß von Mettler-Toledo ähnlich)
pH-Elektrode DG-111-SC
10 ml-Bürette
Mettler-Propellerrührer Geschwindigkeit 80%
Ansatzgröße:
48,5 ml Puffer pH 7,0 Fluka 82571
5 mmol Tributyrin (100 mM)
50 mg Enzym-Immobilisat
Durchführung:
1,47 ml (5 mmol) Tributyrin wurden in 48,5 ml 0,5 M Phosphatpuffer pH 7,0 mit Hilfe eines Propellerrührers bei Raumtemp. 5 min emulgiert. Der pH-Wert der Emulsion wurde duch Zugabe von 1 M Natronlauge auf pH 7,0 eingestellt (Vortitration). Anschließend fügt man 50 mg Immobilisat hinzu, womit die Reaktion gestartet wird. Der angeschlossene Titrator registriert den Laugenverbrauch in Abhängigkeit von der Hydrolysezeit. Die Aktivität des Enzyms wird aus der linearen Steigung der Kurve bestimmt. Aus dem daraus erhaltenen Wert in ml/min pro eingesetzte Enzymmenge kann direkt die Aktivität in U/g Immobilisat berechnet werden.
5.2 Triacetin-Hydrolyse
Im Aktivitätstest wird die Freisetzung von Essigsäure durch Titration mit 0.1 M NaOH-Lösung unter konstanten pH-Bedingungen gemessen.
Geräte:
pH-stat-Titrator, z. B. Schott Titroline Alpha
100 ml Doppelmantel-Glasgefäß
Thermostatisierbares Wasserbad
Rührstand Radiometer TTA 80
pH-Elektrode Schott Blue Line
10 ml-Bürette
Ansatzgröße:
16 ml 0.05M Kaliumphosphatpuffer pH 7,0
400 μl Triacetin Merck No. 108238
100 mg Enzym-Immobilisat
Durchführung:
Das Reaktionsgefäß wird auf 25°C thermostatisiert. 16 ml 0.05M Kaliumphosphatpuffer pH 7,0 werden vorgelegt, 100 mg des zu untersuchenden Immobilisats werden hinzgefügt. Dann wird die Rührung begonnen. Die Reaktion wird durch Zugabe von 400 μl Triacetin gestartet. Der angeschlossene Titrator registriert den Laugenverbrauch in Abhängigkeit von der Hydrolysezeit. Die Aktivität des Enzyms wird aus der linearen Steigung der Kurve bestimmt. Aus dem daraus erhaltenen Wert in ml NaOH / min pro eingesetzte Enzymmenge kann direkt die Aktivität in U/g Immobilisat berechnet werden.
5.3 Phenylethylacetat-Nydrolyse
Im Aktivitätstest wird die Freisetzung von Essigsäure aus (±)-1-Phenylethylacetat durch Titration mit 1 M NaOH-Lösung unter konstanten pH-Bedingungen gemessen.
Geräte:
pH-stat-Titrator, z. B. Mettler DL 50
25 ml Halbmikrogefäß aus Glas (Standardgefäß von Mettler-Toledo)
Mikro-pH-Elektrode Mettler N 6000 A
5 ml-Bürette
Mettler Mikro-Propellerrührer Geschwindigkeit 100%
Ansatzgröße:
19,2 ml Puffer pH 7,0 Fluka 82571
5 mmol (±)-1-Phenylethylacetat (250 mM)
100 mg Enzym-Immobilisat
Durchführung:
800 μl (5 mmol) (±)-1-Phenylethylacetat wurden in 19,2 ml 0,5 M Phosphatpuffer pH 7,0 mit Hilfe eines Mikro-Propellerrührers bei RT 5 min emulgiert. Der pH-Wert der Emulsion wurde duch Zugabe von 1 M Natronlauge auf pH 7,0 eingestellt (Vortitration). Anschließend fügt man 100 mg Immobilisat hinzu, womit die Reaktion gestartet wird. Der angeschlossene Titrator registriert den Laugenverbrauch in Abhängigkeit von der Hydrolysezeit. Die Aktivität des Enzyms wird aus der linearen Steigung der Kurve bestimmt. Aus dem daraus erhaltenen Wert in ml/min pro eingesetzte Enzymmenge kann direkt die Aktivität in U/g Immobilisat berechnet werden.
Nach ca. 50 %-igem Umsatz des Acetates wird die Reaktion abgebrochen, das Enzym abfiltriert und mit Methyl-tert.-butylether (MTBE) nachgewaschen. Das Hydrolysat wird 3 mal mit MTBE extrahiert und die vereinigten organischen Phasen über MgSO₄ getrocknet und das Lösungsmittel einrotiert. Im Rückstand bestimmt man mittels HPLC an einer chiralen Säule (Daicel Chiralcel OD-H) den Umsatz sowie die Enantiomerenüberschüsse für Edukt und Produkt. HPLC-Methode:
Bed.: Hexan : t-Butanol 98,0:2,0
Flow 0,5 ml/min > 1,0 ml/min
Detektion 254 nm
Säulenofentemp. 20°C
(±)-1-Phenylethylacetat (R) bzw. (S) Rt = 11,1 min ; Rt = 11,9 min Phenylaceton Rt = 14.9 min
(±)-1-Phenylethanol (R) bzw. (S) Rt = 25,6 min ; Rt = 39,1 min
5.4 Phenylethylacetat-Synthese
Es wir die Veresterung von (±)-1-Phenylethanol mit Vinylacetat zu (R)-1-Phenylethylacetates bestimmt. Der Reaktionsfortschritt wird mittels HPLC bestimmt. Dabei wird die Synthese des (R)-1-Phenylethylacetates und die Abnahme von (R)-1-Phenylethanol beobachtet. Aus der Steigung der Synthesekurve wird dann die spezifische Aktivität des Enzyms berechnet.
Geräte:
25 ml und 10 ml Schraubdeckelgläschen
Ika Orbitalschüttler (500 rpm)
Ansatzgröße:
20 ml bzw. 8 ml MTBE
2 mmol bzw. 0,8 mmol (±)-1-Phenylethanol
6 mmol bzw. 2,4 mmol Vinylacetat
50 mg Enzym-Immobilisat
Durchführung:
0,8 mmol (±)-1-Phenylethanol und 2,4 mmol Vinylacetat wurden in 8 ml MTBE in 10 ml Schraubdeckelgläschen bei 40 °C Reaktionstemperatur auf einem Orbitalschüttler bei 500 rpm geschüttelt. In definierten Zeitabständen von 10 min wurden bis zur ersten Stunde 20 μl Proben entnommen, mit 400 μl Acetonitril versetzt und auf einer HPLC-Säule analysiert. Der Umsatz zur Bestimmung der Enzymaktivität wird auf einer RP-18-HPLC-Säule bestimmt (Säule Lichrospher RP-18 (250mm × 5μm), Wasser : Acetonitril 50:50; Flow 0,5 ml; 254nm; RT). Der Enantiomerenüberschuß wird mittels HPLC an einer chiralen Phase (Daicel Chiralcel OD-H) bestimmt. HPLC-Methode siehe oben.
Beispiel 6: Aktivität der Immobilisate:
Tabelle A: Beispiele erfindungsgemäß hergestellter Polymerträger, Immobilisierungsmethode M3-aMEK.
Betrifft die beiden rechten Spalten: Enantiomerenreinheit der Produkte in allen Fällen >99%ee.
Tabelle B: Beispiele erfindungsgemäß hergestellter Polymerträger, Immobilisierungsmethode M2.
Betrifft die beiden rechten Spalten: Enantiomerenreinheit der Produkte in allen Fällen >99%ee.
Tabelle C: Vergleichsbeispiele (Immobilisierungsmethoden M3 und M4).
Betrifft die beiden rechten Spalten: Enantiomerenreinheit der Produkte in allen Fällen >99%ee.
Polymer A: Handelsübliches makroporöses vernetztes Kunststoffperlenmaterial aus
10 Gew.-% Methacrylamid
20 Gew.-% Glycidylmethacrylat
20 Gew.-% Allylglycidylether
50 Gew.-% N,N'-Methylenbismethacrylamid,
Polymer B: Handelsübliches makroporöses vernetztes Kunststoffperlenmaterial aus
30 Gew.-% Methacrylamid
20 Gew.-% Glycidylmethacrylat
20 Gew.-% Allylglycidylether
30 Gew.-% N,N'-Methylenbismethacrylamid,
Polymer C entspricht in der Monomer-Zusammensetzung Polymer A, weist jedoch eine geringere Quellungszahl (< 1,5) auf (Herstellung gemäß DE-A 19804518 ).

Claims

Makroporöses Kunststoffperlenmaterial mit einem mittleren Teilchendurchmesser von 10 bis 1000 μm, enthaltend ein Mischpolymerisat aus a) 5 – 60 Gew.-% vinylisch polymerisierbaren Monomeren mit einer Wasserlöslichkeit von mindestens 1 % bei 20 °C, b) 1 – 40 Gew.-% vinylisch polymerisierbaren Monomeren mit einer zusätzlichen funktionellen Gruppe, die in einer Reaktion mit nucleophilen Gruppen von Liganden kovalente Bindungen eingehen kann, c) 10 – 40 Gew.-% hydrophilen, vernetzenden radikalisch polymerisierbaren Monomeren mit zwei oder mehr ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Gruppen, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich d) 10 – 60 Gew.-% vinylisch polymerisierbare Monomere mit einer Wasserlöslichkeit von höchstens 1 % bei 20 °C enthalten sind, wobei sich die Monomeren a) bis d) in der Regel zu 100 % ergänzen.
Makroporöses Kunststoffperlenmaterial nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Porosität durch einen K_PS10-Wert von 0,3 bis 0,9, gemessen mittels inverser Größenausschlußchromatographie in Tetrahydrofuran, charakterisiert ist.
Makroporöses Kunststoffperlenmaterial nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Quellungszahl in Wasser von 1 bis 1,5 aufweist.
Makroporöses Kunststoffperlenmaterial nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Monomere a) Methoxypolyethylenglykolmethacrylat und Methylmethacrylat im Mischpolymerisat enthalten sind.
Makroporöses Kunststoffperlenmaterial nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es nach Immobilisierung von Lipase aus Candida antarctica Tributyrin-Hydrolyse-Aktivität von mindestens 150 [U/g] erreicht.
Makroporöses Kunststoffperlenmaterial nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es nach Immobilisierung von Lipase aus Candida antarctica eine Phenylethylacetat-Hydrolyse-Aktivität von mindestens 80 [U/g] erreicht.
Makroporöses Kunststoffperlenmaterial nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es nach Immobilisierung von Lipase aus Candida antarctica eine Phenylethano-Racematspaltungs-Aktivität von mindestens 100 [U/g] erreicht.
Verfahren zur Herstellung eines makroporösen Kunststoffperlenmaterials nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 7 mittels Suspensionspolymerisation.
Verwendung des makroporöses Kunststoffperlenmaterials nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 7 zur kovalenten Bindung von Liganden wie z. B. Aminosäuren, Peptiden, Proteinen, insbesondere Enzymen oder Antikörpern, Nucleinsäuren oder Polysacchariden.
Verwendung nach Anspruch 9 zur Immobilisierung von Lipasen.