DE2402809C2 - Verfahren zur Herstellung eines mit Bromcyan aktivierten, trockenen hydrophilen polymeren Trägers für biologisch wirksame Verbindungen - Google Patents
Verfahren zur Herstellung eines mit Bromcyan aktivierten, trockenen hydrophilen polymeren Trägers für biologisch wirksame VerbindungenInfo
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Description
Die Umsetzung von Bromcyan gehört zu den «> beliebten Aktivierungsmethoden der üblichen Träger
für biologisch aktive Verbindungen, die in der Affinitätschromatographie oder als Katalysatoren angewandt
werden. Dieses von Axen und Mitarbeitern ausgearbeitete Verfahren (Nature, 214, 1302-1304, r>
(1967); 215. 1491-1492 (1967)) hat sich besonders bei Trägern, wie aus Polysacchariden bestehen, sehr gut
bewährt. Nach diesem Verfahren läßt man Bromcyan mit Agarose-Gel in alkalischem Milieu reagieren. Nach
beendeter Reaktion muß man die Suspension des aktivierten Gels rasch auswaschen und dann sofort mit
der Lösung der biologisch aktiven Verbindung (dem Affinant) verrühren. Die Waschoperation und das
Verrühren mit dem Affinat dürfen nicht länger als 90Sekunden dauern. Diese Forderung stellt natürlich ·>>
hohe Ansprüche an die Erfahrung und die technische Geschicklichkeit der die Reaktion ausführenden Fachkräfte.
Die mit der notwendigen Aktivierung des Gels unmittelbar vor der Bindung der biologisch aktiven '>
<> Substanz verbundenen Komplikationen werden durch die Erzeugung eines trockenen aktivierten Agarose-Gel*:
beseitigt, mit dem die Arbeit bequemer ist.
Die Nachteile der Polysaccharid-Träger bei der Affinitätschromatographie, d. i. die niedrige mechani- >5
sehe Stabilität und geringe hydrolytische Beständigkeit, die leichte Anfälligkeit durch Mikroorganismen, die für
bestimmte Anwendungen unzureichende Porosität, die in bestimmten Fällen auftretende unspezifische Sorption
und schließlich der hohe Preis können durch das &o den Gegenstand dieser Erfindung bildende Verfahren
zur Herstellung eines mit Bromcyan aktivierten, trockenen makroporösen Trägers überwunden werden.
Der Vergleich der mechanischen Stabilität des homogenen und des makroporösen Gels in Berührung t>5
mit einem Lösungsmittel spricht eindeutig zugunsten des makroporösen Materials mit einer starren inneren
Struktur. Diese Eigenschaft gewinnt enorme Bedeutung insbesondere bei der technologischen Anwendung unter
Heranziehung einer größeren Materialmenge in einer größeren dimensionierten Apparatur. Die chemische
Beständigkeit des aktivierten Materials kann man bekanntlich durch Fixierung reaktiver Gruppen an der
festen Oberfläche wesentlich steigern. Es ist also nicht
überraschend, daß das mit Bromcyan aktivierte makroporöse Gel auch nach sehr langer Zeit aktiv ist,
und dies auch ohne Anwendung stabilisierender Zusätze, die bei der Aktivierung und Lagerung der
homogenen Materialien unentbehrlich sind. Es entfällt auch das bei den homogenen Gelen unerläßliche
Auswaschen des Stabilisators vor der Bindung der biologisch aktiven Substanz. Wenn eine besonders hohe
Lagerbeständigkeit gefordert wird, kann man durch Stabilisierung des makroporösen Gels eine fast
vollständige Unterdrückung der desaktivi-renden Reaktionen
erreichen.
Bei der Hersteilung des trockenen aktiven Gels für
die Affinantbildung spielt auch der Kostenaufwand für seine Trocknung eine erhebliche Roiie. Evident ist die
leichte Trocknung des nichtquellenden starren polymeren
Gerüstes des makroporösen Gels gegenüber dem stark gequollenem homogenen Material sowohl hinsichtlich
der Trocknungszeit als auch der zu entfernenden Wassermenge. Angesichts der geringen thermischen
Stabilität der aktiven funktioneilen Gruppen am Gel muß man bei der Trocknung eine sehr delikate
Technologie heranziehen unter Anwendung einer niedrigen Temperatur. In Betracht kommen nur
erheblich aufwendige Trocknungstechnologien, wie die Lyophilisierung, d. i. Abdünsten des Wassers im Vakuum
bei einer Temperatur unterhalb des Schmelzpunktes oder die Dehydratisierung mit Lösungsmitteln.
Die Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Herstellung eines mit Bromcyan aktivierten, trockenen
hydrophilen polymeren Trägers, der sich außerordentlich gut zur Bindung von biologisch wirksamen
Verbindungen eignet, deren Molekül eine oder mehrere primäre Aminogruppen enthält.
Gegenstand der Erfindung ist das Verfahren der Ansprüche I und 2.
Das für die Aktivierung angewandte Gel muß neben der makroporösen Struktur in hinreichender Menge
freie Hydroxylgruppen enthalten, die mit Bromcyan reagieren können. Deshalb wurden die nach der
britischen Patentschrift 13 70 477 durch Suspensionscopolymerisation von Hydroxyalkylacrylaten oder -methacrylaten
mit vernetzenden Convnomeren aus der Gruppe Acrylate oder Methacrylate zwei- oder
mehrwertiger Alkohole, die zwei oder mehrere Acryl- oder Methacrylgruppen im Molekül enthalten, Bisacrylamide
oder Divinylbenzol bereitete Gele gewählt.
Die biologische Aktivität der durch Bindung der biologisch aktiven Verbindungen bereiteten Substanzen
wurde in der üblichen Weise bestimmt.
Die Erfindung wird durch nachstehende Beispiele näher erläutert.
5 Gewichtsteile des durch Fällungs-Suspensionscopolymerisation von 2-Hydroxyäthylmethacrylat mit Äthylenglykoldimethacrylat
(3 :2) in Gegenwart eines 9 : 1 Cyclohexanol-Dodecylalkohol-Lösungsmittelgemisches
bereiteten hydrophilen makroporösen Gels der Molekular-Gewichts-Ausschlußgrenze
300 000 wurden in destilliertem Wasser gleichgewichtsgequollen. Das gequollene Gel wurde dann mit dem gleichen Volumen Wasser
A) Die erste Hälfte — die Fraktion Α— wurde sofort
in 10 ml 0,In-NaHCO3, pH 9, verrührt und die
Suspension mit 1 g Chymotrypsin versetzt. Sodann wurde die Suspension bei 4° C 24 Stunden mit
einem Magnetrührer gerührt. Hierauf wurde das
Gel aufeinanderfolgend mit den folgenden Puffern gewaschen: O.lm-Natriumborat und 0,Im-NaCl
(pH 8,5); 0,1 m-Natriumacetat und 1 m-NaCI (pH 4,1); 0,01 m-Natriumacetat (pH 4,1). Bei der
Aktivierung von mehr als 10 ml Gel wurde die Waschoperation an einer Säule einer entsprechenden
Dimension vorgenommen, wobei man die Durchflußgeschwindigkeit auf 8 ml/h einsiellte.
Mit dem ersten Puffer wurde die Gelsäule 48 Stunden und mit den beiden weiteren Puffern
jeweils 24 Stunden ausgewaschen. Bei der Aktivierung von weniger als 10 ml gequollenem Gel wurde
die Waschoperation auf einem Filter mit Glasfritte durchgeführt Das Volumen des ersten Puffers
entsprach <ism vierzigfachen Gelvolumen in gequollenem Zustand und die Volumina der beiden
weiteren Puffer jeweils dem dreißigfachen Gelvolumen. Das in dieser Weise bereitete Gel wurde für
die Affinitälschromatographie verwendet und seine proteolytische und Esterase-Aktivität durch
Analyse bestimmt. Die Kapazität betrug 12.2 mg Chymotrypsin/ml gequollenes Gel.
Erfindungsgemäßes Verfahren
verrührt, das Gefäß mit der Suspension mit einem Magnetrührer versahen und in die Suspension eine
Glaselektrode getaucht. Nun wurde ^ie Suspension mit
Gewichteilen lOproz. wäßriger Bromcyanlösung
versetzt. Die Bromcyanlösung 'wurdr: einige Minuten
vor Durchführung der Reaktion jeweils frisch bereitet. Sofort nach dem Zusatz des Bromcyans wurde die
Suspension mit 4n-NaOH auf pH 11 eingestellt und unter stetigem Rühren durch Zutropfen von 4n-NaOH
der pH 12 Minuten bei diesem Wert gehalten. Dann wurde die Suspension am Glasfilter mit dem zwanzigfachen
Volumen gekühltem 0,1 m-NaHCOj, pH 9, bezogen
auf das Volumen des ursprünglichen gequollenen Gels, ausgewaschen. Die Waschoperation dauerte
maximal zwei Minuten. Nach dem Waschen und Absaugen wurde das aktivierte Gel in zwei als
Fraktionen Λ und B bezeichnete Hälften geteilt.
Vergleich
B) Die zweite Hälfte des mit Bromcyan aktivierten
Gels — die Fraktion B — wurde bei Raumtemperatur mit wäßrigem Äthanol von steigender Konzentration
(50%, 60%, 70%, 80% und 90%) verrührt und die wäßrige Äthanollösung jeweils durch
Zentrifugieren vom Gel entfernt, im letzten Dehydratisierungsstadium wurde das Gel mit
absolutem Äthanol verrührt, abzentrifugiert und im Vakuumexsiccator bei Raumtemperatur getrocknet
(die Trocknung dauerte ca. 24 Stundend Die Aktivität des so getrockneten Gels betrug 70% der
Aktivität der Fraktion A. Nach 6 Wochen langer Lagerung bei 4°C wurde das Gel in 0,In-NaHCO1
gequollen und dann mittels des gleichen Verfahrens wie in Abschnitt A die Bindung des Chymotrypsin
bewerkstelligt. Die Kapazität des Gels betrug 6,6 mg Chymotrypsin/ml gequollenes Gel. Die
proteolytische Aktivität, ausgedrückt in A2m pro
mg gebundenes Chymotrypsin, betrug bei den beiden Fraktionen gleichermaßen 0,038/min.mg.
Das hydrophile makroporöse Gel wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 aktiviert. Nach dem Waschen
und Absaugen wurde das Gel mit einer Lösung von Gewichtsteilen Dextran vom Molekulargewicht
000 und 5 Gewichtsteilen Lactose in 100 Gewichtsteilen Wasser verrührt, abzenirifugiert und lyophilisicrt.
Das trockene lyophilisierte Gel hatte nach der Reaktion mit Chymotrypsin eine Kapazität von ι 1,8 mg Chymotrypsin/ml
Gel. wobei der in Beispiel 1 beschriebenen Reaktion des aktivierten Gels mit Chymotrypsin
Waschen mit 50 Gewichtsteilen 0,Im-NaHCOj voranging.
Claims (2)
1. Verfahren zur Herstellung eines mit Bromcyan aktivierten, trockenen hydrophilen polymeren Trägers
für biologisch wirksame Verbindungen, da- >
durch gekennzeichnet, daß man ein durch Suspensionscopolymerisation von Hydroxyalkylnsethacrylaten
oder -acrylaten mit vernetzenden Comonomeren, die zur Copolymerisation mit diesen
Hydroxyalkylestern fähig sind aus der Gruppe m Acrylate oder Methacrylate zwei- oder mehrwertiger
Alkohole, deren Molekül zwei oder mehrere Acryl- oder Methacrylgruppen enthält, Bisacrylamide
oder Divinylbenzol, bereitete Hydroxylgruppen enthaltendes, hydrophiles makroporöses Gel in an ι
> sich bekannter Weise mit Bromcyan aktiviert und das aktivierte Gel durch Dehydratisierung mit
organischen Lösungsmitteln und anschließendem Abdünsten dieser Lösungsmittel oder durch Lyophilisierung
von Wasser befreit. -<>
2. Verfahren nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet,
daß man zur Stabilisierung des mit Bromcyan aktivierten Gels bei der Lyophilisierung
ein Polysaccharid und einen Zucker, wie Dextran und Lactose, zusetzt. ->
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