DE2102514B2 - Verfahren zur chemischen kupplung von biologisch wirksamen stoffen an ein hydrophiles polymer - Google Patents

Verfahren zur chemischen kupplung von biologisch wirksamen stoffen an ein hydrophiles polymer

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Description

35
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur chemischen Kupplung von biologisch wirksamen Stoffen, die mindestens eine Aminofunktion, Iminofunktion, wobei hierunter die Amido-, Imido-, Amidino-, Guanidino-, Hydroxylamino- und Hydrazino-Gruppe fallen, Hydroxyl- oder Carboxylfunktion enthalten, an ein hydrophiles Polymer.
Proteine, Nucleine und deren Hydrolyseprodukte, Aminosäuren, Peptide und Nucleotide sowie eine Anzahl anderer in lebenden Zellen, Gewebeflüssigkeiten oder Pflanzensäften vorkommende Stoffe können als amphotere Elektrolyten klassifiziert werden, sie enthalten also sowohl basische als auch saure funktioneile Gruppen. Zu diesen biologisch wirksamen Stoffen gehören auch Enzyme, Hormone und andere biologische Regulatoren und Metaboliten.
In lebenden Zellen katalysieren Enzyme die Depolymerisierung biologischer Makromoleküle, die Esterund Amidhydrolyse, biochemische Oxydationen und Reduktionen, die Anlagerung und Abspaltung von Wasser usw. Diese Reaktionen können in gewissen Fällen nur schwer, oder oftmals überhaupt nicht mit den üblichen organisch-chemischen Methoden ausgeführt werden, und deshalb ist es von außerordentlicher Bedeutung, daß die Eigenschaften der Enzyme auch technisch in rationeller Weise ausgenutzt werden können.
Enzyme sind sehr wertvoll und unstabil, und deshalb ist es besonders wichtig, daß man das Enzym an ein unlösliches Trägerpolymer binden kann, und zwar auf eine Art, die eine leichte Wiedergewinnung desselben ermöglicht Dadurch dürfte sogar möglich werden, ein derart unlöslich gemachtes, granuliertes Enzympolymer in Reaktorbetten zu verwenden. I» diesen Betten kann danach ein Substrat ohne Nebenreaktionen in ein gewisses Produkt umgewandelt werden, allein indem man eine Substratlösung durch das Bett passieren läßt
Enzyme und andere Proteine, die an eine chemisch resistente, in Wasser jedoch quellende Polymersubstanz fixiert sind, können ebenfalls angewendet werden, um Stoffe, die zusammen mit dem fixierten Protein . reversible Komplexe bilden, spezifisch zu adsorbieren. Dieses Prinzip ist gegebenenfalls auch bei anderen Systemen verwendbar, z. B. bei Peptiden, Nucleinsäuren und anderen Stoffen, die fähig sind, reversible Komplexe zu bilden. Indem man das Molekülgewicht, den Querbindungsgrad usw. des Polymeren variiert, kann man für verschiedene Zwecke unterschiedliche Härtegrade, Quellungseingenschaften u.dgl. mehr erhalten, und folglich verschiedene Abstände zwischen den aktiven Gruppen. Man kann allerdings auch zum äußersten Grenzfall greifen und die Enzyme oder andere biologisch wirksame Stoffe an lösliche Polymere fixieren und dadurch die Gelegenheit zu stufenweisen oder kontinuierlichen Reaktionen mit verschiedenen Zirkulationswegen erhalten. Die Polymerlösung kann beispielsweise kontinuierlich zwischen der Adsorbierungsstufe und der Eluierungsstufe in einem Dialyseapparat mit mehreren Zellen zirkulieren.
Es ist wichtig, daß der biologisch interessante Stoff, ein Enzym oder dergleichen, unter möglichst milden Bedingungen am Polymer verankert wird, und zwar so, daß die ursprünglichen Aktivitätseigenschaften maximal beibehalten oder möglicherweise sogar verbessert werden. Weil die in diesem Zusammenhang aktuellen Stoffe eine so verschiedene Stabilität und Reaktivität besitzen, ist es notwendig, Zugang zu und Wahlmöglichkeit zwischen verschiedenen Fixierungsmethoden zu haben. So kann man dann für jeden speziellen aktiven Stoff die günstigste Fixierungsmethode wählen.
Aus der deutschen Offenlegungsschrift 19 15 970 ist ein Verfahren zur Herstellung von Produkten auf der Basis aktiver Proteinsubstanzen bekannt, bei dem man einen Träger mit einer Lösung mindestens einer aktiven Proteinsubstanz in Gegenwart eines Brückenbildners in Berührung bringt und dadurch die Proteinsubstanz auf dem Träger fixiert. Als Träger dienen unter anderem Amylose, Polysaccharide, Alginate, Collagen. Als Brückenbildner werden unter anderem die Epoxide, Triepoxide, Epihalogenhydrine und Dialdehyde verwendet Bei dem bekannten Verfahren wird nicht nur eine Fixierung der aktiven Proteine an die Trägersubstanz erhalten, sondern es findet auch eine Vernetzung der aktiven Proteine untereinander statt. Bei aktiven Proteinen mit ausgeprägter Spezifität oder Empfindlichkeit ist deshalb damit zu rechnen, daß diese Eigenschaften verändert oder in ihrem Wert beeinträchtigt werden. Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, die Kupplung so vorzunehmen, daß eine möglichst eindeutige Kupplungsreaktion zwischen Polymer und aktivem Stoff erhalten wird.
Es wurde nun gefunden, daß unerwünschte Quervernetzungen der aktiven Stoffe vermieden werden können, wenn die Kupplungsreaktion in zwei Abschnitten durchgeführt wird. Im ersten Abschnitt werden in das hydrophile Polymer Epoxigruppen eingeführt und zwar in Abwesenheit der aktiven Stoffe. Nach
Reinigung der aktivierten Polymere kann die chemische Kupplungsreaktion dann in eindeutiger Weise durchgeführt werden, und zwar in einem Milieu, das für die Aufrechterhaltung der biologischen Wirksamkeit geeignet ist
Die Erfindung ist somit dadurch gekennzeichnet, daß man in das Polymer zunächst Epoxigruppen einführt und daß sodann die Kupplung an den biologisch wirksamen Stoff in einem Milieu vollzogen wird, in dem der biologisch wirksame Stoff völlig oder teilweise seine Aktivität behält
Die Reaktion wird geeignetermaßen in einer gepufferten wäßrigen Lösung durchgeführt Unter biologisch wirksamen Stoffen werden hier unter anderem verstanden Aminosäuren, Mononucleotiode, Oligonucleotide, Nucleinsäuren oder deren Derivate, Enzyme oder Enzymderivate, mit Enzym spezifisch komplexbildende Substanzen oder deren Derivate, so daß man spezifische Adsorptionsmittel für die Enzyme erhält, Hormone oder Hormonderivate, wobei man spezifische Adsorptionsmittel für Hormontransportsubstanzen und andere mit Hormonen spezifisch komplexbildende Stoffe erhält, mit Hormonen spezifisch komplexbildende Substanzen, wobei man spezifische Adsorptionsmittel für Hormone erhält, Antikörper, wobei man spezifische Adsorptionsmittel für ein entsprechendes Antigen erhält, oder Antigene, wobei man spezifische Adsorptionsmittel für entsprechende Antikörper erhält
Das epoxihaltige Polymer kann dargestellt werden, indem man ein hydroxylhaltiges Polymer mit nicht ionenbildenden Epoxiden (Oxiranen), die mindestens zwei stark reaktive Gruppen enthalten, beispielsweise Epihalogenhydrin oder Bisepoxid, behandelt, und zwar so, daß das Epoxid auf das Polymer unter Bedingungen reagiert die im großen Ausmaße zu einer »einseitigen« Substitution führt Hierbei werden reaktive Gruppen auf das Polymer eingeführt und danach kann das chemisch reaktive Produkt in ein Milieu überführt werden, das sich für eine weitere Reaktion mit biologisch aktiven Stoffen eignet. Der Reaktionsverlauf für ein Kohlehydrat wie Agarose, Cellulose usw. mit Epichlorhydrin und einer Aminoverbindung in alkalischem Milieu wird durch die folgende Formel veranschaulicht
ROH + Cl-CH1-CH
CH2
indem man in einem geeigneten Puffermilieu ■ die folgende Reaktion durchführt:
. R-O-CH2-CH CH2 + H2NB
-»R-O-CH2-CH-CH2-NH-B OH
wo -B den biologisch aktiven Stoff, ein Protein oder ähnliches, repräsentiert
Bei der Kupplung an eine Carboxylgruppe sieht der Reaktionsverlauf beim Fixieren so aus:
R-O-CH2-CH CH2 + B-COOH
V
-* R-O-CH2-CH-CH2-OCO-B
OH
und mit einem Diepoxid mit langer Kette und Aminkupplung erhält man als Endprodukt:
R—O—CH2-CH-...CH-CH2-NH-B OH OH
Für ein Polyamid ist der Reaktionsverlauf beim Kuppeln an ein lösliches Amin wie folgt:
R-CONH2 +X—CH2-CH CH2 R-CO-NH-CH2-CH CH2
♦ r—o—CH2-CH-CH2 + HCl
R-CO-NH-CH2-CH CH2 + H2NB
O
-> R-CO-NH-CH2-Ch-CH2-NHB
OH
wo R Kohlenhydrat, Cellulose, Agarose, Dextran usw. repräsentiert
Das epoxihaltigi: Polymer kann ebenfalls durch eine Reaktion zwischen einem amidhaltigen Polymer, z. B. Polyacrylamid oder quergebundenem Polyacrylamid oder eines Derivat« derselben und einem bifunktionellen Epoxid, z. B. einem Bisepoxid, dargestellt werden.
Ist das aktivierte Polymer ein unlösliches, granuliertes Gel, wird das GeS vorzugsweise auf Filter gewaschen. Gleicherweise bellreit man ein lösliches Polymer vom Überschuß an Epichlorhydrin durch Dialyse.
Der biologisch aktive Stoff wird chemisch fixiert,
wo X z. B. ein Halogen oder eine Epoxignippe und R das Polymer ist v
Hier ist der biologisch interessante Stoff B an das Polymer R mit einem langen, hydrophilen, flexiblen
Gelenk fixiert, das den biologisch wichtigen Stoff nicht daran hindert, seine normalen Reaktionen gegenüber anderen biologisch wichtigen Substanzen auszuüben, wie Enzymbindungen, falls B ein Inhibitor/ist und das Enzym zusammen mit B einen Molekülkomplex in freier
Lösung bildet Falls B ein Enzym ist, ist es um so wahrscheinlicher, daß es auch im fixierten Zustand seine starke Katalysatorwirkung behält, wenn das vereinigende Segment lang ist und hydrophilen Charakter hat
Das epoxihaltige Polymer kann auch vom Polymer dargestellt werden, das Hydroxylgruppen in 1-, 2-Stellung enthält, z.B. über Tosylester und der darauf folgenden Behandlung mit Natriumäthylat,
—C OH
/ \l
f1 __
I/ -c
OH
C— \
Tosylchlorid \
» —C O H C-
OH
NaOCH3 \ / > —C H H C—
C C
wonach die Kupplung durchgeführt wird:
CH HC
\l I/
C C
H2NR
H OH
CH H C—+ HOOC-R
\l I/ \ c—c
COR
Man kann auch einen ungesättigten Alkylüther oxydieren, z. B.
H H
\ I I /
/ I I \
O OH
CH2
CH
20 CH2
organisches Peroxid
oder Persäure
H H
—C—C—C
I /
I \
OH
CH2
CH
\
CH
wonach die Kupplung wie oben durchgeführt wird
Um die Erfindung weitgehend zu verdeutlichen und leichter verständlich zu machen, folgen eine Anzahl von Beispielen sowie Fällen praktischer Anwendung.
Beispiel 1
Aktivierung von Agarose mit Epichlorhydrin
H OH Gereinigte Agarose in Form einer Suspension von sphärischen Partikeln mit einem Agarosegehalt von 6% wurde auf Glasfilter in destilliertem Wasser gewaschen.
Das abgesaugte Gel wurde danach in einen Rundkolben überführt unter Zusetzung von 1 N-NaOH sowie Epichlorhydrin. Nach der Aktivierungsreaktion, die beim kräftigen Rühren während einer Stunde bei 6O0C erfolgte, wurde der Epichlorhydrinüberschuß in destilliertem Wasser zu neutralen pH verwaschen. Das aktivierte Gel konnte in diesem Milieu bei 5°C gelagert werden.
Beispiel 2
Kupplung des Soyabohnen-Trypsin-Inhibitors (STI)
an erfindungsgemäß aktivierte Agarose
Die aktivierte Agarose nach Beispiel 1 mit Bicarbonat pH 9,5 gepuffert, wurde mit einem Soyabohnen-Trypsin-Inhibitor (STI), der im gleichen Puffer gelöst worden war, umgesetzt. Die Kupplung wurde bei Zimmertemperatur unter langsamen Rühren und einer Reaktionszeit von 20 Stunden vollzogen. Das erhaltene Produkt wurde gründlich gewaschen, und zwar im Kupplungspuffer, im Acetatpuffer pH 3,0 mit einem Gehalt von 1 M NaCl und schließlich im Tris-Puffer pH 73.
Beispiel 3
Kupplung von Trypsin an erfindungsgemäß
aktivierte Agarose
Im Bicarbonatpuffer pH 9,0 gelöstes Trypsin wurde mit aktivierter Agarose nach Beispiel 1 umgesetzt.
Kupplung und Waschen des erhaltenen Produkts erfolgte gleichermaßen wie im Beispiel 2.
Versuch 1
Reinigung von Trypsin
Eine Lösung aus partiell gereinigtem Trypsin wurde durch ein aus Inhibitor-Agarose (STI) gekuppelt an Agarose gemäß Beispiel 2 bestehendes Kolonnenbett gepumpt Danach wurde die Kolonne in einem schwach alkalischen Puffer gewaschen, bis kein UV-adsorbierendes Material im Eluat mehr vorgefunden wurde. Durch Eluierunr der Kolonne mit einem Puffer mit saurem pH erhielt man einen UV-Gipfel (Desorptionsgipfel), der mit Hinsicht auf die Trypsinaktivität untersucht wurde. Diese bestimmte man, mit Benzoylarginin-p-Nitroanilid (BAPA) als Substrat, durch Messen der Extinktionsveränderung bei 405 mm.
Die spezifische Trypsinaktivität des Desorptionsgipfels war 177% des Ausgangsmaterials.
Die Kapazität der Inhibitor-Agarose in bezug auf die Fähigkeit, das Trypsin zu binden, wurde auf ca. 1 mg Trypsin pro ml Inhibitorgel berechnet
Aus dem Versuch geht hervor, daß STI erfindungsgemäß mit Epoxiden an Agarose gekuppelt, nach der Kupplung die Aktivität behält, d. h. das Inhibitorgel ist fähig, mit aktivem Trypsin Komplexe zu bilden, wonach der Komplex gespalten werden kann und das dabei erhaltene freie Enzym seine volle Aktivität behält.
Versuch 2
Reinigung des Soyabohnentrypsin-Inhibitors
Eine Lösung aus partiell gereinigtem Trypsin-Inhibitor ließ man ein Kolonnenbett passieren, das aus an gereinigte Agarose in Form einer Suspension von sphärischen Partikeln mit einem Agarosegehalt von 6% gekuppeltem Trypsin bestand. Nach Waschen des Gels wurde der gebundene Inhibitor in einem Puffer mit saurem pH eluiert. Der erhaltene Desorptionsgipfel wurde auf die Trypsin-Inhibitoraktivität hin untersucht.
Diese bestimmte man, indem man die Testlösung und das Trypsin inkubierte, und danach die resultierende Trypsinaktivität nach Beispiel 4 bestimmte.
Dabei wies der erhaltene Desorptionsgipfel eine hohe Try sin-Inhibitoraktivität auf. Die Kapazität des Try psingels berechnete man auf 1 mg STI pro 3 ml Trypsingel.
Das erfindungegemäß gebundene Trypsin behielt ebenfalls seine Aktivität bezüglich der Fähigkeit, mit dem aktiven Soyabohnentrypsin-Inhibitor Komplexe zu bilden. Der nach Spaltung des Enzyminhibitor-Komplexes erhaltene Trypsin-Inhibitor besaß eine hohe Aktivität.
Beispiel 4 I. Aktivierung von Cellulose II. Kupplung des Inhibitors an aktivierte
Cellulose
UI. Adsorption von Trypsin an lnhlbitorcellulose
Tosylester aus Cellulose wurde mit Na-Methylat Na in Methanol) bei ca. -20" C (Els-Kochsalzgemlsoh) während einer Stunde und dreißig Minuten behandelt Man wusch das Produkt in Methanol, Wasser und Bicarbonat-Puffer, pH 8,8.
II. Ein Soyabohnen-Trypsin-Inhibitor wurde mit Cellulose während 24 Stunden bei Zimmertemperatur umgesetzt. Den Inhibitorüberschuß wusch man in einem Bicarbonat-Puffer pH 8,8, Acetat-Puffer pH 3,0 und schließlich in einem Bicarbonat-Puffer pH 7,8 aus.
III. Ein Trypsinpräparat wurde der Inhibitor-Cellulose bei pH 7,8 zugesetzt Nach dem Waschen wurde das
ίο Enzym vom Adsorptionsmittel desorbiert in einem Puffer mit saurem Milieu. Das erhaltene Enzym wies hohe spezifische Aktivität auf.
Beispiel 5
'5 I. Aktivierung von Agarose
(gereinigte Agarose in Form einer Suspension
von sphärischen Partikeln)
II. Kupplung desTrypsininhibitors an die
aktivierte Agarose
III. Adsorption desTrypsins in Inhibitor-Agarose
I. Agarose wurde in 1 N-NaOH aufgeschlämmt und Epibromhydrin bei 6O0C unter Rühren zugesetzt Die Reaktionszeit: 1 Stunde. Das erhaltene Produkt wurde in Wasser und Kupplungspuffer gewaschen.
II. Soyabohnentrypsin-Inhibitor wurde mit der aktivierten Agarose 24 Stunden bei Zimmertemperatur und pH 9,5 umgesetzt. Der ungekuppelte Inhibitor wurde in Bicarbonat-Puffer pH 9,5, Acetat-Puffer pH 3,0 und
Tris-Puffer pH 7,8 ausgewaschen.
III. Partiell gereinigtes Trypsin (kommerzielles Trypsin) wurde der Inhibitor-Agarose bei pH 7,8 zugesetzt. Nicht adsorbiertes Protein wurde ausgewaschen und das adsorbierte Enzym mit saurem pH desorbiert. Das desorbierte Enzym enthielt eine spez.
Trypsinaktivität, die ungefähr der eines doppelten
Ausgangsmaterials entsprach.
1 ml Inhibitor-Agarose adsorbierte 1 mg Trypsin, das
mit beibehaltener Aktivität wiedergewonnen werden konnte.
Beispiel 6
1. Aktivierung von quergebundenem Polyacrylamid
mit Bisepoxid
II. Kupplung des Trypsin Inhibitors zum
aktivierten Gel
III. Adsorption von Trypsin in Inhibitor-Gel
I. Quergebundenes Polyacrylamid, das mit einem Bicarbonat-Puffer pH 9,5 ausgeglichen worden war, ließ man bei Zimmertemperatur während 20 Stunden und Rühren mit Bisepoxid reagieren. Das Produkt wurde in Wasser und Kupplungspuffer pH 9,5 gewaschen.
II. Der Soyabohnentrypsin-Inhibitor wurde mit dem ss aktivierten Gel pH 9,5 während 24 Stunden bei Zimmertemperatur umgesetzt Der ungekuppelte Inhibitor wurde in Bicarbonatpuffer pH 9,5, Acetatpuffer pH 3,0 und Tris-Puffer pH 7,8 ausgewaschen.
UI. Trypsin wurde dem Inhibitor-Gel bei pH 7,£
zugesetzt Nicht adsorbiertes Enzym wurde ausgewa· sehen und adsorbiertes Enzym mit saurem pH desorbiert. Das erhaltene Enzym war völlig aktiv.
10 ml Inhibitor-Gel Adsorbierte 400 mg Enzym, dai mit völlig beibehaltener Aktivität wiedergewönnet
ös werden konnte.
709 633/4

Claims (3)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur chemischen Kupplung von biologisch wirksamen Stoffen, die mindestens eine Aminofunktion, Iminofunktion, wobei hierunter die Amido-, Imido-, Amidino-, Guanidino-, Hydroxylamino- und Hydrazino-Gruppe fallen, Hydroxyl- oder Carboxylfunktion enthalten, an ein hydrophiles Polymer, dadurch gekennzeichnet, daß (0 man in das Polymer zunächst Epoxigruppen einführt und daß sodann die Kupplung an den biologisch wirksamen Stoff in einem Milieu vollzogen wird, in dem der biologisch wirksame Stoff völlig oder teilweise seine Aktivität behält.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Polymer, das eine oder mehrere der folgenden Gruppen Hydroxyl-, Carboxyl-, Amino-, Imino-, Amido-, Imido-, Guanidino-, Hydroxylamino- und Hydrazinogruppen enthält, mit Epihalogenhydrin oder einem Bisepoxid, Tris- oder höherem Polyepoxid in Kontakt und so zum Reagieren gebracht wird, daß Epoxigruppen in das Polymer eingeführt werden, wonach das nicht reagierte, niedermolekulare Epoxid vom epoxihaltigen Polymer entfernt und die Kupplung hergestellt wird, indem man das Polymer in Kontakt mit dem biologisch wirksamen Stoff bringt
3. Verfahren nach Anspruch 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer unlöslich ist.
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