DE69917574T2 - Methode zur Immobilisierung von Verbindungen - Google Patents

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Description

  • Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Immobilisierung einer SH (Sulfhydryl)-Gruppen enthaltenden Verbindung auf einem lösungsmittelunlöslichen Träger.
  • Stand der Technik
  • Als Verfahren zur Immobilisierung einer Verbindung auf einem lösungsmittelunlöslichen Träger zur Verwendung als Ligand für spezifische Adsorption wurden in den vielfältigen Bereichen der immobilisierten Enzyme, der Affinitätschromatographie, der Ionenaustauschchromatographie, etc. zahlreiche Untersuchungen unternommen, und einige Verfahren werden in industriellen Anwendungen verwendet.
  • Auf dem Gebiet der immobilisierten Enzyme können folgende bekannten, repräsentativen Verfahren zur Immobilisierung angeführt werden: (1) das Verfahren, welches die Bildung eines Imidocarbonats auf dem Träger durch das Verfahren der Cyanogenbromid-Aktivierung und anschließend dessen Umsetzung mit der Aminogruppe der als Ligand dienenden Gruppe umfasst; (2) das sogenannte Säureazidderivat-Verfahren, das nacheinander das Verestern einer Carboxylgruppe auf einem Träger, das Bilden eines Hydrazides, die Umwandlung in das Azid und dessen Substitution mit der Aminogruppe der als Ligand dienenden Verbindung umfasst; (3) das sogenannte Diazo-Verfahren, welches das Bilden eines Diazoniumsalzes auf einem Träger und dessen Umsetzung mit der Aminogruppe der als Ligand dienenden Verbindung umfasst; (4) das sogenannte Kondensationsreagens-Verfahren, welches das Kondensieren einer Amino- oder Carboxylgruppe auf dem Träger mit der Carboxyl- oder Aminogruppe der als Ligand dienenden Verbindung in Gegenwart eines Kondensationsmittels umfasst; (5) das sogenannte Alkylierungsverfahren, welches das Modifizieren des Trägers mit Bromacetyl oder 4,6-Dichlor-s-triazinyl und das Umsetzen des so erhaltenen Derivates mit der Aminogruppe der als Ligand dienenden Verbindung umfasst; und (6) das sogenannte Matrix-Vernetzungsverfahren, welches das Vernetzen einer Aminogruppe auf dem Träger und der Aminogruppe der als Ligand dienenden Verbindung mit Glutaraldehyd und anschließende Reduktion umfasst (Atsuo Tanaka & Takuo Kawamoto: Modern Chemistry, 24 bis 30, Juli 1992).
  • Diese Verfahren weisen jedoch Nachteile auf, nämlich (a) falls die als Ligand dienende Verbindung eine SH-Gruppe enthält, ist die Wirksamkeit der Immobilisierung relativ gering; und (b) falls die als Ligand dienende Verbindung ein SH-Gruppen enthaltendes Peptid oder Protein ist, wird insbesondere die inhärente Aktivität der Verbindung (Enzymaktivität, Bindungsaktivität, etc.) manchmal preisgegeben.
  • Die Erfinder der vorliegenden Erfindung fanden, dass, falls ein als Ligand dienendes Peptid oder Protein eine SH-Gruppe enthält, die vorstehend erwähnten Erscheinungen (a) und (b) während dessen Immobilisierung auf einem lösungsmittelunlöslichen Träger auftreten. Ähnliche Erscheinungen wurden auch an anderen Verbindungen als Peptiden und Proteinen beobachtet, vorausgesetzt diese enthalten SH-Gruppen. Es gibt keine Informationen in der verfügbaren Literatur über den Effekt, dass die vorstehenden Erscheinungen auftreten, wenn eine als Ligand dienende Verbindung auf einem inerten Träger immobilisiert wird.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Hinsichtlich des vorgenannten Standes der Technik besteht die Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, ein Verfahren zur Immobilisierung zur Verfügung zu stellen, das geeignet ist, die Wirksamkeit der Immobilisierung bei der Umsetzung einer SH-Gruppen enthaltenden Verbindung mit einem lösungsmittelunlöslichen Träger zu verbessern und die durch die Immobilisierung verursachte Verschlechterung der inhärenten Eigenschaften der SH-Gruppen enthaltenden Verbindung zu unterdrücken.
  • Um die vorstehende Aufgabe zu erfüllen, führten die Erfinder der vorliegenden Erfindung eine umfassende Untersuchung hinsichtlich verschiedenartiger Reaktionsbedingungen durch und bemühten sich, ein Verfahren zur Immobilisierung zu entwickeln, welches geeignet ist, die Wirksamkeit der Immobilisierung zu verbessern und die Verschlechterung der inhärenten Eigenschaften der SH-Gruppen enthaltenden Verbindung zu unterdrücken. Als Ergebnis entdeckten die Erfinder die Beteiligung der SH-Gruppe als einen wichtigen Faktor in den vorstehend erwähnten Erscheinungen (a) und (b). Unter Berücksichtigung der Tatsache, dass diese Erscheinungen überwiegend bei in wässriger Lösung im hohen ph-Bereich (> 7) durchgeführten Reaktionen auftreten, nahmen die Erfinder darüber hinaus an, dass unter den Bedingungen der Immobilisierungsreaktionen SH-Gruppen oxidiert werden, um beispielsweise die S-S-Bindung zu ergeben.
  • Die S-S-Bindung kann gelegentlich innerhalb des Moleküls der als Ligand dienenden Verbindung gebildet werden oder kann auch zwischen den Molekülen auftreten. Es kann angenommen werden, dass, falls die nötige Reaktionsstelle (funktionelle Gruppe) für die Verwendung zur Immobilisierung der als Ligand dienenden Verbindung eine SH-Gruppe ist, die Bildung der S-S-Bindung die Reaktionsstelle deaktiviert und dass, falls die Reaktionsstelle eine andere funktionelle Gruppe als die SH-Gruppe ist, die Reaktionsstelle bei der Bildung der S-S-Bindung im Innern des Moleküls verborgen wird. Es kann angenommen werden, dass die Abnahme in der Wirksamkeit der Immobilisierung möglicherweise in derartigen Situationen auftritt. Es kann darüber hinaus auch angenommen werden, dass die Bildung der S-S-Bindung die Verschlechterung der inhärenten Eigenschaften der SH-Gruppen enthaltenden Verbindung bewirkt.
  • Auf der Grundlage der vorstehenden Erfahrung und Annahme, schenkten die Erfinder der Bedeutung des Vermeidens der Bildung der S-S-Bindung ihre Aufmerksamkeit und fanden nach zahlreichen Versuchen, dass die vorstehend erwähnte Aufgabe durch Durchführen der Umsetzung zwischen einem lösungsmittelunlöslichen Träger und einer SH-Gruppen enthaltenden Verbindung in Gegenwart eines Antioxidans erfüllt werden kann. Die vorliegende Erfindung wurde auf der Grundlage der vorstehenden Befunde entwickelt.
  • Die vorliegende Erfindung zielt daher auf ein Verfahren zur Immobilisierung einer SH-Gruppen enthaltenden Verbindung, welches das Umsetzen eines lösungsmittelunlöslichen Trägers mit der vorstehend erwähnten Verbindung in Gegenwart eines Antioxidans umfasst.
  • Kurzbeschreibung der Abbildung
  • 1 zeigt einen pUCNT MP47C-Vektor
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung wird nun ausführlich beschrieben.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung bedeutet der lösungsmittelunlösliche Träger einen Träger, der in einem zu verwendenden Lösungsmittel nicht löslich ist. In der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der lösungsmittelunlösliche Träger ein lösungsmittelunlöslicher Träger für den Fall, dass Wasser als das Lösungsmittel verwendet wird, d. h. ein wasserunlöslicher Träger.
  • Der vorstehend erwähnte wasserunlösliche Träger ist nicht besonders eingeschränkt, schließt jedoch anorganische Träger, wie Glaskügelchen, Kieselgel, etc.; organische Träger, wie synthetische Polymere, z. B. vernetzten Polyvinylalkohol, vernetztes Polyacrylat, vernetztes Polyacrylamid, vernetztes Polystyrol, etc.; und Polysaccharide, z. B. kristalline Zellulose, vernetzte Zellulose, vernetzte Agarose, vernetztes Dextran, etc.; und organisch-organische, organisch-anorganische oder andere komplexe Träger, wie sie aus der Verwendung von Kombinationen der Trägermaterialien erhalten werden, ein.
  • Darüber hinaus ist, falls eine auf einem lösungsmittelunlöslichen Träger immobilisierte, SH-Gruppen enthaltende Verbindung für die Chromatographie oder als Adsorbens verwendet werden soll, der lösungsmittelunlösliche Träger bevorzugt ein hydrophiler Träger. Der Grund hierfür ist, dass ein hydrophiler Träger vergleichsweise geringe unspezifische Adsorption aufweist und zufrieden stellend bezüglich der durch den Liganden (immobilisierte, SH-Gruppen enthaltende Verbindung) bewirkten Adsorptionsspezifität ist. Der hydrophile Träger bedeutet in dieser Beschreibung einen Träger, der einen Kontaktwinkel bezüglich Wasser von nicht mehr als 60° aufweist, wenn die den Träger bildende Verbindung in Form einer Platte geprüft wird.
  • Der vorstehend genannte hydrophile Träger ist nicht besonders eingeschränkt, schließt jedoch beispielsweise Träger, die verschiedene Polysaccharide und deren Derivate umfassen, wie Zellulose, Acetylzellulose, Chitosan, Chitin, Agarose, Dextran, etc.; und andere derartige Träger, wie unter anderem Polyvinylalkohol, Co(ethylen-vinylacetat)-Polymerhydrolysat, Polyacrylamid, Polyacrylsäure, Polymethacrylsäure, Polymethylmethacrylat, Polyacrylsäure-Polyethylen-Pfropfpolymer, Polyacrylamid-Polyethylen-Pfropfpolymer und Glas, ein.
  • Unter diesen hydrophilen Trägern werden Hydroxylgruppen enthaltende Träger hinsichtlich der Adsorptionsaffinität und -selektivität bevorzugt. Insbesondere ist, falls der an einer SH-Gruppen enthaltenden Verbindung immobilisierte Träger als Adsorbens verwendet wird, ein poröses Zellulosegel eine der am besten geeigneten Arten von Trägern, da es die folgenden vorteilhaften Eigenschaften aufweist:
    • (1) Da derartige Gele vergleichsweise hohe mechanische Festigkeit und Widerstandsfähigkeit aufweisen, werden sie durch Rühren oder andere mechanische Verfahren nicht zersetzt oder ergeben keinen Staub und falls sie in Säulen gepackt werden, tritt keine Verdichtung oder Verstopfung auf, auch nicht wenn eine Flüssigkeit mit hoher Flussrate hindurchgeleitet wird, so dass Prozesse bei hohen Flussraten möglich sind. Darüber hinaus werden deren Porenstrukturen nicht leicht, z. B. durch Autoklavieren, verändert.
    • (2) Diese Gele sind, bestehend aus Zellulose, hydrophil und enthalten zahlreiche Hydroxylgruppen, die zur Ligandenbindung verfügbar sind, und sie weisen außerdem eine relativ geringe unspezifische Adsorption auf.
    • (3) Da diese Gele sogar im Falle des Vergrößerns des Hohlraumvolumens eine vergleichsweise hohe Festigkeit aufweisen, können hohe, mit denen der Weichgele vergleichbare Adsorptionskapazitäten erreicht werden.
  • Das Zellulosegel in dieser Beschreibung bedeutet jedes Zellulosederivat, dessen Polymergerüstkette aus Zellulose besteht, wie Zellulose oder Acetylzellulose. Die vorliegende Erfindung ist jedoch auf die Verwendung derartiger Gele nicht beschränkt.
  • Die SH-Gruppen enthaltende Verbindung bedeutet erfindungsgemäß eine auf einem lösungsmittelunlöslichen Träger zu immobilisierende Verbindung, die eine oder mehrere -SH-(Sulfhydryl)gruppen innerhalb des Moleküls aufweist. Die SH-Gruppe in einer derartigen Verbindung kann eine ionische Form annehmen, z. B. -S–Na+, -S–K+, abhängig von der Art der Lösung, in der diese vorliegt, oder kann in Form eines Salzes, z. B. -SNa oder -SK, zum Zeitpunkt der Reaktion zugegeben werden. Da diese Formen jedoch im Wesentlichen gleich sind, wird hier der Begriff SH-Gruppe im allgemeinen Sinn, der die vorstehenden Fälle einschließt, verwendet.
  • Die vorstehend erwähnte SH-Gruppen enthaltende Verbindung ist nicht besonders eingeschränkt, umfasst jedoch beispielsweise Cystein, Peptide oder Proteine, die Cystein als Aminosäurebestandteil enthalten, und Thiolverbindungen (hoch-, mittel- oder niedermolekulare Verbindungen mit einer SH-Gruppe in der Gerüstkette oder in Seitenketten, einschließlich Ethanthiol, Aminoethanthiol, Benzylthiol, Thiophenol und Verbindungen mit derartigen Gruppen in Seitenketten oder an den Enden). Die vorstehend erwähnte SH-Gruppen enthaltende Verbindung ist bevorzugt ein aus einer Aminosäure, einem Peptid und Protein ausgewählter Bestandteil.
  • Das Molekulargewicht der SH-Gruppen enthaltenden Verbindung war ein Thema unserer intensiven Untersuchung. Die Untersuchung ergab, dass mit steigendem Molekulargewicht die Wirksamkeit der Erfindung beeinträchtigt wird. Was also SH-Gruppen enthaltende Verbindungen mit Molekulargewichten bis zu 3 × 104 betrifft, so wurde ein signifikanter Unterschied in der Wirksamkeit der Erfindung festgestellt, je nachdem ob ein Antioxidans zugegeben wird oder nicht. Andererseits war für Proteine, die mit Molekulargewichten in der Größe von 1,5 × 105 hochpolymer sind, die Differenz in der Wirksamkeit der Erfindung relativ gering. Es ist daher das Molekulargewicht der SH-Gruppen enthaltenden Verbindung bevorzugt nicht größer als 3 × 104.
  • Das erfindungsgemäße Antioxidans bedeutet einen Stoff, der die Eigenschaft aufweist, Oxidation einer Verbindung in einem Reaktionssystem zu verhindern oder zu unterdrücken, und schließt zum Beispiel einen Stoff, der entweder direkt die Oxidation einer Verbindung verhindert oder der oxidiert wird und dadurch die Oxidation einer Verbindung in einem Reaktionssystem verhindert, und einen Stoff mit der Eigenschaft, gelösten Sauerstoff aus dem Reaktionssystem zu entfernen, ein. Natürlich könnte eine ähnliche Wirkung durch wesentliches Verringern des gelösten Sauerstoffes durch Entgasen oder Kühlen des Reaktionslösungsmittels erreicht werden, aber hinsichtlich der Durchführbarkeit und der Allgemeingültigkeit in der Anwendung stellt die Zugabe eines Antioxidans eine bessere Wahl dar und führt wirksamer und sicherer zu einem besseren Ergebnis.
  • Das vorstehend erwähnte Antioxidans schließt eine große Vielfalt an Stoffen ein, und schließt unter anderem auch SH-Gruppen enthaltende Verbindungen ein. Mercaptoethanol ist ein repräsentatives Beispiel. Falls jedoch die Immobilisierungsreaktion fortschreitet während der lösungsmittelunlösliche Träger einer nukleophilen Reaktion unterzogen wird, so wie es für einen Träger mit Glycidyl-(Epoxy-)Gruppen der Fall ist, könnte das Antioxidans Mercaptoethanol selbst reagieren und immobilisiert werden. Wenn derartige Fälle in Betracht gezogen werden, unterliegt die Verwendung eines Antioxidans mit nukleophilen Eigenschaften hinsichtlich der Anwendungsbreite Einschränkungen. Obwohl natürlich sogar ein derartiges Antioxidans für gewisse Reaktionen ausreichend nützlich ist, wird ein breiter nutzbares Antioxidans bevorzugt, das ohne derartiges Risiko verwendbar ist.
  • In der vorliegenden Erfindung ist das Antioxidans bevorzugt mindestens ein aus Natriumpyrosulfit (Natriumdisulfit), Natriumsulfit, Natriumhydrogensulfit, Natriumhydrosulfit und L-Ascorbinsäure ausgewählter Bestandteil. Diese Antioxidantien haben den Vorteil, dass sie in der Immobilisierungsreaktion einer großen Mehrheit an SH-Gruppen enthaltenden Verbindungen mit einem lösungsmittelunlöslichen Träger verwendet werden können.
  • In der vorliegenden Erfindung beträgt das molare Konzentrationsverhältnis der SH-Gruppen enthaltenden Verbindung bevorzugt 1000 : 1 bis 1 : 1000. Außerhalb dieses Bereichs beträgt die Konzentration des Antioxidans bevorzugt 1 μmol/l bis 1 mol/l. Es wird stärker bevorzugt, wenn beide Bedingungen erfüllt sind. In derartigen Fällen zeigt das Antioxidans seine antioxidative Wirkung ausreichend, um die Immobilisierungsrate der SH-Gruppen enthaltenden Verbindung und den Erhalt deren Aktivität nach der Immobilisierung zu maximieren. Es sollte angemerkt werden, dass die vorstehend erwähnte molare Konzentration die molare Konzentration in einem Reaktionssystem darstellt.
  • Bei der Umsetzung des lösungsmittelunlöslichen Trägers mit der SH-Gruppen enthaltenden Verbindung gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Immobilisierung kann die Wirksamkeit der Immobilisierung durch Aktivieren des lösungsmittelunlöslichen Trägers vorab auf irgendeine Weise verbessert werden.
  • In der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der lösungsmittelunlösliche Träger ein Träger, der mindestens mit einer aus einer Glycidyl(Epoxy)-, Imidocarbonato-, Tosyl-, Tresyl-, Carboxyl-, Amino-, Azido- und Hydroxylgruppe ausgewählten funktionellen Gruppe aktiviert wurde. Wenn die Reaktion des Trägers mit einer SH-Gruppen enthaltenden Verbindung in Gegenwart eines Antioxidans durchgeführt wird, ist nicht nur die Immobilisierungsrate der SH-Gruppen enthaltenden Verbindung sondern auch der Erhalt deren Aktivität nach der Immobilisierung hoch, und daher ist die Verwendung eines derartigen aktivierten lösungsmittelunlöslichen Trägers wirksam.
  • Die folgenden Beispiele sind lediglich zur Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung in weiteren Einzelheiten gedacht.
  • Beispiel 1
  • Immobilisierung von Aminoethanthiol auf Sephacryl S1000 (Sephacryl-AET-a)
  • (1) Epoxy-Aktivierung von Sephacryl S1000
  • Zu 83 ml Sephacryl S1000 (Amersham Pharmacia Biotech) wurde eine ausreichende Menge Wasser zugegeben um ein Volumen von 186 ml herzustellen, und es wurden weiter 113 ml 2 M Natriumhydroxid-Wasser zugegeben. Die Temperatur wurde anschließend auf 40°C eingestellt. Zu diesem Gemisch wurden 38 ml Epichlorhydrin (Wako Pure Chemical Ind.) zugegeben, und die Reaktion wurde bei 40°C 2 h lang durchgeführt. Nach Vervollständigung der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch gründlich mit Wasser auf einem Glasfilter gewaschen, um Epoxy-aktiviertes Sephacryl S1000 zu ergeben.
  • (2) Immobilisierung von Aminoethanthiol und Quantifizierung von immobilisiertem Aminoethanthiol
  • In 15 ml 0,05 M Boratpuffer (pH 10,0) wurden 1,20 mg 2-Aminoethanthiol (Wako Pure Chemical Ind.) und 150 mg Natriumsulfat (Wako Pure Chemical Ind.) gelöst, und die Lösung wurde erneut mit 0,01 N Natriumhydroxid-Wasser auf einen pH-Wert von 10 eingestellt und auf 25 ml aufgefüllt. Zu 5 ml des vorstehenden Epoxy-aktivierten Sephacryl 51000 wurde die vorstehende Aminoethanthiol-Lösung (gesamte Menge) zugegeben, und nach 18 h Schütteln bei 37°C wurde das Gemisch (Aminoethanthiol : Natriumsulfat = 1 : 76, Natriumsulfat = 47,6 mmol/l) mit einer ausreichenden Menge physiologischer Kochsalzlösung auf einem Glasfilter gewaschen, um Sephacryl-AET-a (0,20 mg/ml-Gel) zu ergeben. Die Menge an immobilisiertem Aminoethanthiol wurde durch die TNBS (Trinitrobenzolsulfonsäure)-kolorimetrische Analyse von Aminogruppen unter Verwendung des Überstandes vor und nach der Reaktion bestimmt.
  • Beispiel 2
  • Immobilisierung von Cystein auf Tresyl-Toyopearl (Toyopearl-Cys-a) und Quantifizierung des immobilisierten Cysteins
  • In 4 ml eines Kupplungspuffers (pH 8,2, 0,5 M Natriumchlorid – 0,1 M Carbonatpuffer) wurden 0,50 mg L-Cystein-Hydrochlorid-Monohydrat (Wako Pure Chemical Ind.) und 1,0 mg Natriumpyrosulfit (Wako Pure Chemical Ind.) gelöst. Anschließend wurden 800 mg AF-Tresyl-Toyopearl 650 in trockenem Zustand zugegeben und die Reaktion wurde bei Raumtemperatur über Nacht durchgeführt.
  • Das Reaktionsgemisch wurde mit 0,5 M Natriumchlorid-Wasser gewaschen, anschließend wurde ein Blockpuffer (pH 8,0, 0,5 M Natriumchlorid – 0,1 M Tris-HCl-Puffer) zugegeben, und die Reaktion wurde bei Raumtemperatur 2 h lang durchgeführt (Cystein : Natriumpyrosulfit = 1 : 1,89, Natriumpyrosulfit = 1,3 mmol/L). Das Reaktionsgemisch wurde weiterhin mit 0,5 M Natriumchlorid-Wasser gewaschen, um Toyopearl-Cys-a (0,11 mg/ml-Gel) zu ergeben. Die Menge an immobilisiertem Cystein wurde wie in Beispiel 1 durch die Aminogruppenanalyse bestimmt.
  • Beispiel 3
  • Immobilisierung eines IgG-bindenden Peptides (MP47C) auf einem porösen Träger (Kac) unter Verwendung von Natriumhydrosulfit (Kac-MP47C-a) und Evaluierung der IgG-Bindungsaktivität
  • (1) Herstellung des Peptids MP47C
  • Um das im Sequenzlisting unter SEQ Id. Nr. 1 gezeigte Peptid MP47C zu gewinnen, wurde, wie im Sequenzlisting unter SEQ Id. Nr. 2 gezeigt, ein DNA-Code für das Peptid MP47C entworfen und hergestellt, so dass es an den pUCNT-Vektor [Japanische Kokai Publikation Hei-4-212692] unter Verwendung der Nde I bzw. Hind III Restriktionsenzymstellen für das 5'-Ende bzw. das 3'-Ende ligiert werden konnte.
  • Die DNA mit der vorstehenden Sequenz wurde an den pUCNT-Vektor nach Spaltung mit den Restriktionsenzymen Nde I und Hind III (Takara Shuzo) ligiert unter Verwendung des DNA- Ligation-Kit Ver. 2 (Takara Shuzo) gemäß der Vorschrift zur Herstellung eines pUCNT-MP47C-Vektors (1).
  • Unter Anwendung eines Routineverfahrens wurde diese pUCNT-MP47C-Vektor-DNA in Escherichia coli HB101 (Funakoshi Hanbai) eingeführt und ein Transformant wurde unter Verwendung der Resistenz gegenüber dem Antibiotikum Ampicillin als Marker ausgewählt.
  • Von diesem Transformant wurde die Plasmid-DNA extrahiert und die Gensequenz wurde im Routineverfahren analysiert, um zu bestätigen, dass dieser pUCNT-MP47C-Vektor die entworfene DNA-Sequenz aufwies. Anschließend wurde dieser Transformant unter Schütteln in 6 l L-Nährmedium (5 g/l NaCl, 10 g/l Bactotrypsin, 5 g/l Hefeextrakt) bei 37°C 20 h lang kultiviert, und die Zellen wurde durch Zentrifugieren gewonnen (Hitachi RPR9-2 Rotor, 4°C, 6000 Upm, 20 min). Das erhaltene Pellet wurde in 300 ml TE-Puffer (20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA; pH 7,5) suspendiert und mit Ultraschall behandelt (BRANSON 250, 6 min. × 3, auf Eis), und der Überstand wurde durch Zentrifugieren gewonnen (Hitachi RPR16 Rotor, 4°C, 15000 Upm, 20 min). Der so gewonnene Überstand wurde bei 70°C 10 min lang hitzebehandelt, anschließend erneut zentrifugiert (Hitachi RPR16 Rotor, 4°C, 15000 Upm, 20 min), um 300 ml eines Überstandes zu gewinnen. Der Überstand wurde durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gereinigt (Säule: Waters μ-BONDASPHERE 5 μ C18 300A, 19,0 × 150 mm). Die Säule wurde erst durch Hindurchleiten von 40 ml Acetonitril bei einer Flußrate von 5 ml/min aktiviert, und anschließend wurden 300 ml einer Probe bei der gleichen Flußrate durchgeleitet. Die Säule wurde anschließend mit 200 ml 0,1% TFA + 64% Acetonitril gewaschen und das gewünschte Peptid MP47C wurde mit 200 ml 0,1% TFA + 40% Acetonitril eluiert und gewonnen. Das Eluat wurde unter Verwendung eines Verdampfers auf 100 ml aufkonzentriert und gefriergetrocknet, um 1,3 g hochreines Produkt zu ergeben.
  • (2) Epoxy-Aktivierung eines Zellulose-Gels
  • Zu 90 ml des Gel-Prototypen Kac des Anmelders, das ein poröses Hartgel auf Zellulosebasis mit einer Ausschlussgrenze bezüglich des Molekulargewichts von nicht weniger als 5 × 106 für kugelförmige Proteine ist, wurde eine ausreichende Menge an Wasser zugefügt, um 180 ml zu ergeben. Anschließend wurden 60 ml 2 M Natriumhydroxid-Wasser zugegeben und die Temperatur wurde auf 40°C eingestellt. Zu dieser Lösung wurden 21 ml Epichlorhydrin gegeben und die Reaktion wurde bei 40°C unter Rühren 1 h lang durchgeführt. Nach Vervollständigung der Reaktion wurde das Reaktionsprodukt gründlich mit Wasser gewaschen, um ein Epoxy-aktiviertes Zellulosegel zu liefern.
  • (3) Immobilisierung des Peptids MP47C und Quantifizierung des immobilisierten Peptids
  • In 0,5 ml 0,05 M Boratpuffer (pH 10,0) wurden 10 mg des Peptids MP47C und 50 μg Natriumhydrosulfit (Wako Pure Chemical Ind.) gelöst, und die Lösung wurde erneut auf einen pH-Wert von 10 eingestellt und mit 0,01 N Natriumhydroxid-Wasser auf 1 ml aufgefüllt. Die Lösung von MP47C (gesamte Menge) wurde zu 1 ml des vorstehenden Epoxy-aktivierten Zellulosegels gegeben, und nach 16 h Schütteln bei 37°C (Peptid MP47C : Natriumhydrosulfit = 1 : 372, Natriumhydrosulfit = 0,58 mmol/l) wurde das Reaktionsgemisch mit einer ausreichenden Menge an PBS (10 mM Phosphatpuffer, 150 mM Natriumchlorid enthaltend) gewaschen, um Kac-MP47C-a (8 mg/ml-Gel) zu ergeben. Die Menge an immobilisiertem Peptid MP47C wurde aus den Flächenverhältnissen vor und nach der Reaktion in der HPLC berechnet. μ-Bondasphere C18 (Nippon Waters, 3,9 mm ID × 150 mm L) wurde als Säule verwendet und (A): 0,1% TFA/H2O und (B): 80% Acetonitril/0,1% TFA/H2O wurden als mobile Phase verwendet. Die Elution wurde mit (A) : (B) = 95 : 5 begonnen und der Anteil an (B) wurde mit einem Gradienten von 3%/min gesteigert. Die Flußrate betrug 1 ml/min.
  • (4) Berechnung der IgG-Bindungsaktivität von Kac-MP47C-a
  • Kac-MP47C-a oder der Träger ohne Ligand (Kac) (1 ml) wurden in ein Probenröhrchen aufgenommen und nach Zugabe von 6 ml eines gesunden menschlichen Serums wurde das Probenröhrchen bei 37°C 2 h lang geschüttelt. Anschließend wurde diese Suspension bei 5000 Upm 1 min lang zentrifugiert und die IgG-Konzentration des Überstandes wurde durch einen turbidimetrischen Immuntest mit Shionogi Biolaboratories bestimmt. Die IgG-Adsorptionsrate wurde durch die folgende Formel berechnet: Adsorptionsrate (%) = {(Ir – It)/Ir} × 100Ir: IgG-Konzentration des Überstandes des Kac-Trägers
    It: IgG-Konzentration des Überstandes des Kac-MP47C-a-Trägers mit Adsorbens
  • Als Ergebnis wurde festgestellt, dass die IgG-Adsorptionsrate von Kac-MP47C-a 61% beträgt.
  • Beispiel 4
  • Immobilisierung eines Teils (Fab) des anti-IgG-Antikörpers auf Tresyl-aktivierter Sepharose 4B (Sepharose 4B-Fab-a)
  • (1) Immobilisierung eines Teils (Fab) des anti-IgG-Antikörpers auf Tresyl-aktivierter Sepharose 4B und Quantifizierung des immobilisierten Fab
  • Unter Verwendung einer kleinen Menge 1 mM HCl-Wasser ließ man 4 g Tresyl-aktivierte Sepharose 4B (Amersham Pharmacia Biotech) 15 min lang quellen. Der Träger wurde anschließend mit 1 mM HCl-Wasser und weiter mit einem Kupplungspuffer (pH 8,0, 0,5 M NaCl – 0,1 M NaHCO3) gewaschen. In 2 ml des Kupplungspuffers wurden 2 mg des durch Papain- Verdauung (PIERCE, ImmunoPure Fab Preparation Kit) aus anti-human IgG (Fab)-Antikörper (Bindungsstelle) gewonnen Fab und 4,2 μg Natriumhydrogensulfit gelöst. Zu dieser Lösung wurden 0,4 ml des vorstehenden gewaschenen Gels gegeben, und die Reaktion wurde bei 25°C 4 h lang durchgeführt. Das Reaktionsprodukt wurde mit dem Kupplungspuffer gewaschen, anschließend wurde ein Blockpuffer (pH 9, 1 M Ethanolamin – 0,5 M Natriumchlorid – 0,1 M NaHCO3) zugegeben, und die Reaktion wurde bei Raumtemperatur 2 h lang durchgeführt (Fab : Natriumhydrogensulfit = 1 : 1, Natriumhydrogensulfit = 20 μmol/l). Das Reaktionsprodukt wurde mit zwei verschiedenen Puffern zur Nachbehandlung abwechselnd jeweils 3 Mal gewaschen (pH 4,0, 0,5 M Natriumchlorid – 0,1 M Essigsäure-Natriumacetatpuffer; pH 8,0, 0,5 M Natriumchlorid – 0,1 M Tris-HCl-Puffer), um Sepharose 4B-Fab-a (4,0 mg/ml-Gel) zu ergeben. Die immobilisierte Menge wurde aus den Konzentrationen des Anti-IgG Fab in den Überständen vor und nach der Reaktion gemäß der Bestimmung mit Micro BCAProtein Assay Reagent Kit (PIERCE) berechnet.
  • (2) Berechnung der IgG-Bindungsaktivität von Sepharose 4B-Fab-a
  • Sepharose 4B-Fab-a oder der Träger ohne Ligand (Sepharose 4B), 0,2 ml, wurden in ein Probenröhrchen aufgenommen und nach Zugabe von 0,6 ml eines gesunden menschlichen Serums wurde das Probenröhrchen bei 37°C 2 h lang geschüttelt. Anschließend wurde diese Suspension bei 5000 Upm 1 min lang zentrifugiert und die IgG-Konzentration des Überstandes wurde durch einen turbidimetrischen Immuntest mit Shionogi Biolaboratories bestimmt. Die IgG-Adsorptionsrate wurde durch die folgende Formel berechnet: Adsorptionsrate (%) = {(Ir – It)/Ir} × 100Ir: IgG-Konzentration des Überstandes des Sepharose 4B-Trägers
    It: IgG-Konzentration des Überstandes des Sepharose 4B-Fab-a-Adsorbens
  • Als Ergebnis wurde festgestellt, dass die IgG-Adsorptionsrate von Sepharose 4B-Fab-a 82% beträgt.
  • Vergleichsbeispiel 1
  • Immobilisierung von Aminoethanthiol auf Sephacryl S1000 und Quantifizierung von immobilisiertem Aminoethanthiol (Sephacryl S1000-AET-b)
  • Außer dass Natriumsulfat nicht verwendet wurde, wurde im übrigen das Verfahren aus Beispiel 1 wiederholt, um Aminoethanthiol auf Sephacryl S1000 zu immobilisieren und Sephacryl S1000-AET-b (0,13 mg/ml-Gel) zu ergeben.
  • Vergleichsbeispiel 2
  • Immobilisierung von Cystein auf Tresyl-Toyopearl und Quantifizierung von immobilisiertem Cystein (Toyopearl-Cys-b)
  • Außer dass Natriumpyrosulfit nicht verwendet wurde, wurde im übrigen das Verfahren aus Beispiel 2 wiederholt, um Cystein auf Tresyl-Toyopearl zu immobilisieren und Toyopearl-Cys-b (0,07 mg/ml-Gel) zu ergeben.
  • Vergleichsbeispiel 3-1
  • Immobilisierung eines IgG-bindenden Peptids (MP47C) auf einem porösen Träger (Kac) (Kac-MP47C-b)
  • (1) Immobilisierung von MP47C und Quantifizierung des immobilisierten MP47C
  • Außer dass Natriumpyrosulfit nicht verwendet wurde, wurde im übrigen das Verfahren aus Beispiel 3 wiederholt, um MP47C auf Kac zu immobilisieren und Kac-MP47C-b (5 mg/ml) zu ergeben.
  • (2) Berechnung der IgG-Bindungsaktivität von Kac-MP47C-b
  • Außer dass Kac-MP47C-b statt Kac-MP47C-a verwendet wurde, wurde das in Beispiel 3 unter "Berechnung der IgG-Bindungsaktivität von Kac-MP47C-a" beschriebene Verfahren genau befolgt, um die IgG-Bindungsaktivität zu berechnen. Als Ergebnis wurde festgestellt, dass die IgG-Adsorptionsrate von Kac-MP47C-b 38% beträgt.
  • Vergleichsbeispiel 3-2
  • Immobilisierung eines IgG-bindenden Peptides (MP47C) auf einem porösen Träger (Kac) (Kac-MP47C-c) und Evaluierung der IgG-Bindungsaktivität von Kac-MP47C-c
  • (1) Immobilisierung von MP47C und Quantifizierung des immobilisierten MP47C
  • Außer dass die Menge an MP47C auf 20 mg verändert wurde, wurde im übrigen das Verfahren aus Vergleichsbeispiel 3-1 wiederholt, um MP47C auf Kac zu immobilisieren und Kac-MP47C-c (8 mg/ml) zu ergeben.
  • (2) Berechnung der IgG-Bindungsaktivität von Kac-MP47C-c
  • Außer dass Kac-MP47C-c statt Kac-MP47C-a verwendet wurde, wurde das in Beispiel 3 unter "Berechnung der IgG-Bindungsaktivität von Kac-MP47C-a" beschriebene Verfahren genau befolgt, um die IgG-Bindungsaktivität zu berechnen. Als Ergebnis wurde festgestellt, dass die IgG-Adsorptionsrate von Kac-MP47C-c 47% beträgt.
  • Vergleichsbeispiel 4-1
  • Immobilisierung eines Teils (Fab) des anti-IgG-Antikörpers auf Tresyl-aktivierter Sepharose 4B (Sepharose 4B-Fab-b)
  • (1) Immobilisierung von Fab auf Tresyl-aktivierter Sepharose 4B und Quantifizierung des immobilisierten Fab
  • Außer dass Natriumhydrogensulfit nicht verwendet wurde, wurde im übrigen das Verfahren aus Beispiel 4 wiederholt, um einen Teil (Fab) des anti-IgG-Antikörpers auf Sepharose 4B zu immobilisieren und Sepharose 4B-Fab-b (2,5 mg/ml-Gel) zu ergeben.
  • (2) Berechnung der IgG-Bindungsaktivität von Sepharose 4B-Fab-b
  • Außer dass Sepharose 4B-Fab-b statt Sepharose 4B-Fab-a verwendet wurde, wurde das in Beispiel 4 unter "Berechnung der IgG-Bindungsaktivität von Sepharose 4B-Fab-a" beschriebene Verfahren genau befolgt, um die IgG-Bindungsaktivität zu berechnen. Als Ergebnis wurde festgestellt, dass die IgG-Adsorptionsrate von Sepharose 4B-Fab-b 65% beträgt.
  • Vergleichsbeispiel 4-2
  • Immobilisierung eines Teils (Fab) des anti-IgG-Antikörpers auf Tresyl-aktivierter Sepharose 4B (Sepharose 4B-Fab-c)
  • (1) Immobilisierung von Fab auf Tresyl-aktivierter Sepharose 4B und Quantifizierung des immobilisierten Fab
  • Außer dass die Menge an Fab auf 3 mg verändert wurde, wurde im übrigen das Verfahren aus Vergleichsbeispiel 4-1 wiederholt, um einen Teil (Fab) des anti-IgG-Antikörpers auf Sepharose 4B zu immobilisieren und Sepharose 4B-Fab-c (4,0 mg/ml-Gel) zu ergeben.
  • (2) Berechnung der IgG-Bindungsaktivität von Sepharose 4B-Fab-c
  • Außer dass Sepharose 4B-Fab-c statt Sepharose 4B-Fab-a verwendet wurde, wurde das in Beispiel 4 unter "Berechnung der IgG-Bindungsaktivität von Sepharose 4B-Fab-a" beschriebene Verfahren genau befolgt, um die IgG-Bindungsaktivität zu berechnen. Als Ergebnis wurde festgestellt, dass die IgG-Adsorptionsrate von Sepharose 4B-Fab-c 72% beträgt.
  • Die immobilisierten Mengen und Aktivitäten der SH-Gruppen enthaltenden Verbindungen in den vorstehend erwähnten Beispielen und Vergleichsbeispielen sind in Tabelle 1 zusammengefasst.
  • Tabelle 1
    Figure 00160001
  • Aus Tabelle 1 wird ersichtlich, dass in den Beispielen unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Immobilisierung SH-Gruppen enthaltende Verbindungen auf lösungsmittelunlöslichen Trägern in guten Ausbeuten immobilisiert werden konnten, und dass die inhärente Aktivität der SH-Gruppen enthaltenden Verbindung gut erhalten werden konnte.
  • In der Art wie vorstehend beschrieben, stellt die vorliegende Erfindung ein neuartiges Verfahren zur Immobilisierung zur Verfügung, durch das SH-Gruppen enthaltende Verbindungen auf lösungsmittelunlöslichen Trägern in guten Ausbeuten und unter guter Erhaltung der inhärenten Aktivitäten derartiger SH-Gruppen enthaltender Verbindungen immobilisiert werden können.
  • Sequence listings
    Figure 00170001

Claims (8)

  1. Verfahren zur Immobilisierung einer SH-Gruppen enthaltenden Verbindung, das Umsetzen eines lösungsmittelunlöslichen Trägers mit der Verbindung in Gegenwart eines Antioxidans umfasst.
  2. Verfahren zur Immobilisierung gemäß Anspruch 1, wobei der lösungsmittelunlösliche Träger ein wasserunlöslicher Träger ist.
  3. Verfahren zur Immobilisierung gemäß Anspruch 1, wobei die SH-Gruppen enthaltende Verbindung ein Molekulargewicht von nicht mehr als 3 × 104 aufweist.
  4. Verfahren zur Immobilisierung gemäß Anspruch 1, wobei die SH-Gruppen enthaltende Verbindung mindestens ein aus einer Aminosäure, einem Peptid und einem Protein ausgewähltes Mitglied ist.
  5. Verfahren zur Immobilisierung gemäß Anspruch 1, wobei das Antioxidans mindestens ein aus Natriumpyrosulfit (Natriumdisulfit), Natriumsulfat, Natriumhydrogensulfit, Natriumhydrosulfit und L-Ascorbinsäure ausgewähltes Mitglied ist.
  6. Verfahren zur Immobilisierung gemäß Anspruch 1, wobei das molare Konzentrationsverhältnis des Antioxidans zur der SH-Gruppen enthaltenden Verbindung 1000 : 1 bis 1 : 1000 ist.
  7. Verfahren zur Immobilisierung gemäß Anspruch 1, wobei die molare Konzentration des Antioxidans 1 μmol/l bis 1 mol/l ist.
  8. Verfahren zur Immobilisierung gemäß Anspruch 1, wobei der lösungsmittelunlösliche Träger durch mindestens eine aus einer Glycidyl-, Imidocarbonato-, Tosyl-, Tresyl-, Carboxyl-, Amino-, Azido- und Hydroxylgruppe ausgewählte funktionelle Gruppe aktiviert wurde.
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