DE69629127T2 - TRENNMEDIUM FÜR IgG UND PROTEIN A VARIANTE - Google Patents

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Description

  • Adsorbtionsmittel, welche IgG-Bindeproteine aufweisen, sind mehr als zwanzig Jahre lang zum Binden von IgG in wässrigen Medien verwendet worden. Anfänglich wurde das native Protein A (GB 1,441,979 (Sjöqvist)) verwendet. Später wurden rekombinant erzeugte Formen von Protein A und Protein G (WO 8400773 (Löfdahl, et al) und EP 262,192 (Guss, et al) und US 5,082,773 (Fahnestock)) entwickelt.
  • Protein A besitzt eine breite IgG-Spezifität in Bezug auf tierische Arten, jedoch kann die Spezifität in Bezug auf Subklassen (zum Beispiel wird humanes IgG3 nicht ein Protein A binden) variieren. Protein G bindet an alle IgG Subklassen einer Vielzahl wichtiger Säugetierspezies. Der Vorteil von Protein A im Vergleich zu Protein G ist der, dass die Bindung von IgG schwächer ist, und dementsprechend mildere Bedingungen verwendet werden können, um IgG von Protein A abzulösen. Dies ist wichtig für die Aufreinigung einzelner monoklonaler Antikörper.
  • Rekombinante Techniken erlauben eine einfache Kartierung von IgG-Bindeproteinen in Bezug auf die Funktionalität unterschiedlicher Domänen. Im Fall von Protein A, wurde herausgefunden, dass die native Form fünf aufeinanderfolgend angeordnete IgG-Bindedomänen (E, D, A, B und C) enthält, gefolgt von einer X-Domäne, welche nicht an IgG bindet. Die neuartige Technik erleichterte die Darstellung von IgG-Bindefragmenten und von Varianten, bei denen eine oder mehrere Aminosäuren ausgetauscht, hinzugefügt oder entfernt worden waren. Es sei denn anderweitig angegeben, weist die in Bezugnahme von Protein A auf die native Form oder IgG-bindende Fragmente und Varianten von Protein A hin, die dieselbe IgG-Spezifität wie natives Protein A besitzen. Varianten von Protein A, welche Cystein enthalten, wurden schon verhältnismäßig früh hergestellt, und der eingeführte Cysteinrest wurde zur Bindung an Grundmatrizen verwendet. Es wurde als wichtig erachtet, dass kein Cystein als C-terminalem Rest platziert wird. Eine Variante, die Cystein als vorletzte Aminosäure im C-terminalen Anteil besaß, wurde über Disulfid-Brückenbildung an Thiolsepharose® (Pharmacia Biotech AB, Uppsala Sweden) gebunden und aktiviert und in der Funktion als IgG-Trennungsmedium untersucht (T. Profy (Repligen); EP 284,368 und US 5,084,559 ). Vergleichbare Untersuchungen wurden in FASEB 87, 29. März-2. April 1987 (Poster N44, Profy et al) aufgezeigt. Die mit drei anderen Varianten erhaltenen Ergebnisse (1,2 und 5 Domänen) von Protein A mit Cystein in einer C-terminalen Linkersequenz (Aminosäure 10, ausgehend vom C-Terminus) (Ljungquist et al, Eur. J. Biochem. 186 (1989) 557–561) wurden später vorgestellt. Diese letzteren Varianten waren darüberhinaus kovalent über die Bildung von Disulfid-Bindungen an Thiopropylsepharose® gebunden. Die Immobilisierung an Tresylchlorid- oder Tolsylchlorid-aktivierte Gele wurde als eine Alternative vorgeschlagen, mit der Absicht, Verknüpfungsgruppen zu umgehen, welche anfällig für eine Reduktion sind. Es wurde eine äquimolare Beziehung zwischen der IgG-Bindekapazität und der Anzahl an Domänen für 1-Domänen- und 2-Domänenvarianten gefunden. Die 5-Domänenvariante band nie mehr als die doppelte molare Menge an IgG. Es wurden IgG-Kapazitäten erreicht, welche vergleichbar waren mit denen, die früher mit löslichen Formen von nativem Protein A erreicht wurden (es wurde später herausgefunden, dass bei bestimmten Anwendungen nicht-Cys-enthaltende Varianten molare Bindungsverhältnisse ergeben können, welche zwischen zwei und drei liegen).
  • Parallel dazu hat Genex ( US 4,977,247 (Fahnstock et al)) eine rekombinante Variante des Proteins G-cys hergestellt, in dem Cystein in der C-terminalen Position in einer IgG-Bindedomäne vorliegt. Bei der Herstellung von Trennungsmedien basierend auf dieser Protein G-Variante wurde rProtein G-cys vorzugsweise kovalent an Aminohexyl-Agarose gebunden, die mit dem bifunktionellen Reagensmittel N-Sulfosuccinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)butyrat aktiviert war ( US 4,977,247 , Anspruch 1 und Spalte 18, Zeilen 22–37). GammaBindG® Plus (Pharmacia Biotech AB) ist ein kommerziell erhältliches Festphasen rProtein G-cys Produkt mit Cystein als C-terminalem Rest. Das Produkt wird durch Kopplung des Cysteinylrestes an Aminohexyl-Agarose synthetisiert, welche mit N-Sulfosuccinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)cyclohexan-1-carboxylat aktiviert ist.
  • Soweit es bekannt ist, hat sich die Variante des matrixgebundenen durch Repligen hergestellten rProtein A-cys, bisher nicht kommerziell durchgesetzt. Der Grund dafür kann sein, dass die Kopplung an die Matrix über instabile Strukturen (-S-S-) erfolgt, obwohl dies natürlich auch auf anderen Faktoren basieren kann, die uns nicht bekannt sind. Was auch immer der Grund sein mag, das Adsorbens, das vollständig den Markt dominiert, verwendet natives Protein A oder unterschiedliche Formen des rekombinanten Proteins A, welchen Cystein fehlt. Der Markt für Produkte, die auf Protein G basieren, war wesentlich kleiner, wahrscheinlich da Protein A vorteilhaftere Bindungseigenschaften besitzt.
  • Ziel der Erfindung
  • Das Ziel der Erfindung kann zusammengefaßt werden in dem Wunsch, Adsorbtionsmedien vorzusehen, welche a) die IgG-Bindespezifität von Protein A besitzen; b) mindestens die gleiche Stabilität besitzen, wie andere Adsorbentien, die auf nativem Protein A basieren; c) dieselbe oder eine verbesserte Kapazität besitzen, um IgG zu binden, im Vergleich zu schon bekannten Varianten von matrixgebundenem rProteinen A-cys (hauptsächlich berechnet als das Verhältnis Mol IgG pro Mol cys-Variante von Protein A mit einer, zwei, oder mehreren IgG-Bindedomänen). Für Varianten mit zwei oder mehr Domänen bedeutet dies Molarverhältnisse von ≥ 2. Das Erreichen dieser Ziele wird es erlauben, wirksamere Verfahren für die Reinigung von IgG zu verwenden, ausgehend von unterschiedlichen Ausgangsmaterialien.
  • Die Erfindung
  • Der Hauptaspekt der Erfindung ist ein Trennmedium, welches eine Grundmatrix umfasst, die mit den Gruppen gemäß der Formel I substituiert ist: -B-X-rProtein A-cys, worin
    a. rProtein A-cys ein rekombinant hergestelltes Protein A ist, das Cystein in seiner Aminosäuresequenz trägt;
    b. B eine Brücke ist, die an die Grundmatrix bindet; und
    c. X ein Heteroatom S enthält, abgeleitet aus rProtein A-cys.
  • Das charakteristische Merkmal ist, dass X ein Thioetherschwefel ist (-S-).
  • Das optimale Molarverhältnis zwischen IgG-Gesamtbindekapazität und der Menge an IgG an der Matrix kann abhängig von der Anzahl von IgG-Bindedomänen, die im Protein A des Adsorbens vorliegen, variieren. Für Ein-Domänenvarianten beträgt das Verhältnis 1 und für Zwei-Domänenvarianten beträgt das Verhältnis ≈ 2. Für Drei-, Vier- und Fünf-Domänenvarianten beträgt das Verhältnis ≈ 2 oder vorzugsweise > 2. Der Maximalwert wird durch die Anzahl an IgG-Bindedomänen, abhängig von der verwendeten Protein A-Konstruktion, festgelegt.
  • Unter diesem Aspekt der Erfindung kann B prinzipiell alles sein, was eine befriedigende Stabilität unter den bei der Adsorbtion/Desorption von IgG angewendeten Bedingungen besitzt (Zeit, Temperatur, pH, usw.). Beispiele relevanter Strukturen in der Brücke -B- sind Amid, Ester, Ether, Thioether, Kohlenwasserstoffketten, Azo, Carbamat usw. Kohlenwasserstoffketten, die in -B- vorliegen, können geradkettig, verzweigtkettig oder zyklisch sein und besitzen normalerweise nur gesättigte Kohlenstoffatome (2–10 Kohlenstoffatome, vorzugsweise 2, 3 oder 4 Kohlenstoffatome, um einen ausgeprägten hydrophilen Charakter zu behalten). Es wird bevorzugt, dass die Brücke -B- über eine Etherstruktur oder eine Amid/ Esterstruktur an die Grundmatrix bindet. Es ist weiterhin bevorzugt, dass B eine geradkettige oder zyklische gesättigte Kohlenwasserstoffkette umfasst, welche wahlweise durch ein oder mehrere Sauerstoff-/Stickstoffatome unterbrochen und mit einer oder mehreren Amino- oder Hydroxygruppen substituiert sein kann. Aus Stabilitätsgründen sollte ein und dasselbe Kohlenstoffatom höchstens ein Sauerstoff- oder Stickstoffatom binden. Strukturen, welche absolut bevorzugt in -B- sind, sind solche, die auftreten können, wenn rProtein A-cys an die Matrix über eine Epoxygruppe oder Epihalogengruppe gebunden ist, das heißt, B zeigt in seinem Rest auf der rechten Seite (am nahesten zu X) die Struktur -CH2-CHOH-CH2 wobei X ein sekundäres Amin oder Thioether wird, abhängig davon, ob die ε-Aminogruppe in Lysin oder die N-terminale Aminogruppe oder eine Thiogruppe im Cystein gekoppelt ist.
  • Die vorher genannten Brückenstrukturen können in Übereinstimmung mit heutigen Techniken gebildet werden, zum Beispiel durch die Verwendung bifunktionaler Kopplungsreaktionsmittel, wie beispielsweise Epichlorhydrin, Bisepoxid (wie beispielsweise 1,4-Bis(2,3-epoxypropoxy)butan, N-Sulfosuccinimidyl-4-(N-Maleimidomethyl)-cyclohexan-1-carboxylat, usw. Relevante Grundmatrizen können mit solchen Reaktionsmitteln aktiviert werden, so dass sie Gruppen enthalten werden, die mehr oder weniger selektiv mit Thiol- oder Aminogruppen reagieren. Bevorzugte Kopplungsreaktionsmittel und Bedingungen zeigen eine sehr geringe Kopplung bei primären Aminogruppen (ε-Amino in Lysyl und der N-Aminoterminus).
  • Relevante Formen von rProtein A-cys besitzen in der nativen Sequenz eine Aminosäure, die durch Cystein ersetzt ist. Alternativ dazu kann Cystein in einer Aminosäuresequenz (Linker) vorliegen, die an ein Ende fusioniert wurde, oder als Insert in der nativen Sequenz oder einem IgG-Bindeanteil davon vorliegt. Cystein kann auch in einem Peptidlinker eingeschlossen werden, welcher vorzugsweise N-terminal oder C-terminal zu einer IgG-Bindedomäne vorliegt. Allgemein gesprochen wird terminales Cystein gegenüber einem internen Cystein bevorzugt. Die Länge des verwendeten Linkers ist normalerweise nicht kritisch und kann zum Beispiel von einer bis zu 50 Aminosäureresten variieren. Für sämtliche Cysteinmodifikationen ist es zwingend, dass die IgG-Bindungsfähigkeit nicht verloren geht.
  • rProtein A-cys kann auch auf andere Arten modifiziert werden. Zum Beispiel kann rProtein A-cys ein Fusionsprotein sein, welches zusätzlich zu der IgG-Bindedomäne aus Protein A eine oder mehrere IgG-Bindedomänen aus Protein G oder aus einem anderen IgG-Bindeprotein umfasst (siehe Guss, et al, EP 262,192 ). Die nativen Domänen können permutiert sein, ein oder mehrmals vorkommen oder einige können sogar fehlen. Native nicht-IgG-bindende Domänen können teilweise oder sogar vollständig fehlen.
  • rProtein A-cys kann in Analogie zu herkömmlichen Techniken hergestellt werden (Profy T, Ep 294,386 ; und Ljungquist et al, Eur. J. Biochem. 186 (1989), 557-561).
  • Die Grundmatrix ist ein hydrophiles Polymer, welches eine Vielzahl von Aminogruppen und/oder Hydroxygruppen enthält, hauptsächlich letztere. Die Grundmatrix ist normalerweise in wässrigen Medien unlöslich. Die Grundmatrix kann aus einem Polysaccharid abgeleitet sein, wie beispielsweise Dextran, Cellulose, Stärke, Aggarose, Pullulan, Xylan, usw., kann quervernetzt sein und/oder mit unterschiedlichen Gruppen ausgestattet sein, die für die angestrebte Verwendung geeignet sind. Unter den synthetischen Polymeren können Polymere von Hydroxyalkylacrylaten oder korrespondierenden Methacrylaten, Polyvinylalkoholen, Polymeren von Vinylhydroxyalkylethern, usw. genannt werden. Sollte ein Polymer löslich sein, kann es unlöslich gemacht werden, zum Beispiel quervernetzt oder adsorbiert oder kovalent an einen Träger gebunden werden, welcher in wässrigem Medium unlöslich ist, zum Beispiel ein Styrol-Divinylbenzol-Copolymer. Die Grundmatrix kann darüberhinausgehend in Form von Teilchen vorliegen, die mehr oder weniger sphärisch und/oder porös oder nichtporös sein können. Ein spezieller Typ von Matrizen besteht aus porösen hydrophoben Teilchen, welche aus Divinylbenzol-Styrol-Coplolymer hergestellt sind oder einem anderen hydrophoben Polymer/Copolymer, wobei die innere und/oder äußere Oberfläche hydrophilisiert und mit OH-Gruppen ausgestattet wurde. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Matrix normalerweise in wässrigen Medien unlöslich, porös und basiert auf einem Polysaccharid.
  • Eine Verwendung der Erfindung schließt die Bindung (Adsorbtion) von IgG an ein Trennungsmedium ein. IgG wird anschließend in Übereinstimmung mit dem Vorangehenden mit einem Trennungsmedium in Kontakt gebracht. Die Adsorbtion findet normalerweise ausgehend von einer wässrigen Lösung statt, abgeleitet aus Serum oder einer Zellkultur, die zur Produktion von IgG fähig ist. Geeignete Bedingungen liegen im Bereich von 0–35°C, pH 6–8, Salzkonzentration 0,1–3 M (abhängig von der Art des zu bindenden IgGs). Vor der Desorption des gebundenen IgGs wird das Trennungsmedium normalerweise gewaschen, geeigneterweise mit einem Puffer, welcher im wesentlichen denselben pH wie der Adsorbtionspuffer besitzt, wonach die Desorption auf herkömmliche Art und Weise durchgeführt wird, zum Beispiel durch Behandlung mit einem Puffer, der einen pH unterhalb von 5 besitzt. Die Bedingungen sollten nicht denaturierend sein.
  • Die Bindung von IgG an das erfindungsgemäße Trennungsmedium besitzt ein breites Feld der Verwendung. Es kann in Verfahren verwendet werden, welche das Fangen von IgG aus einer Lösung einschließen, das heisst, um gelöstes IgG in einer wässrigen Lösung von anderen Komponenten, die darin vorliegen, zu trennen. Die Bindung von IgG kann ein Teilschritt in einem Chromatographieverfahren sein oder ein chargenweises Verfahren. Die Bindung von IgG kann darüber hinausgehend Teil eines sogenannten Immunoassays sein oder in einem extracorporealen Verfahren zur Entfernung von IgG aus dem gesamten Blut oder Plasma sein. Das primäre Gebiet der Verwendung wird in der Aufreinigung von IgG gesehen (eingeschlossen monoklonale IgG-Antikörper).
  • Eine sehr praktische Ausführungsform der Erfindung ist die Kopplung von rProtein A-cys über ein C-terminales Cystein an eine teilchenförmige Chromatographiematrix, die verdichtende Füllteilchen enthält, wie beispielsweise Anval® (Anval, Torshälla, Sweden). Der so erhaltene chromatographische Träger hat sich als für chromatographische Trennungen von IgG in stabilisierten Wirbelbetten geeignet herausgestellt. Vergleiche die aktuelle Patentanmeldung SE 9503926-9 betreffend "Adsorptionsverfahren und Trennungsmedium". In Bezug auf die Chromatographie auf expandierten/Wirbelbetten, wird Bezug auf die WO 9218237 (Pharmacia Biotech AB) genommen.
  • Experimenteller Teil
  • Die Herstellung von rProtein A-cys
  • rProtein A-cys wurde analog zur Beschreibung, wie sie im EP 284,368 oder durch Ljungquist et al, Eur. J. Biochem. 186 (1989), 557–561 gegeben wurde, hergestellt. Die Sequenz war dieselbe, wie in EP 284,365 beschrieben, mit Ausnahme davon, dass die ersten 18 Amiosäuren fehlten (Signalsequenz) und dass die letzten 103 Aminosäuren mit einer Hexapeptidsequenz vertauscht wurden, die Cystein als C-Terminus besitzt.
  • Kopplung von rProtein A-cys an die Grundmatrix
  • Aktivierung mit Hilfe von 1,4 Bis(2,3-epoxypropoxylbutan (BPR-Butan)
  • Ein Liter trockengelegte Sepharose® FF (Aggarose in Kügelchenform, quervernetzt mit Epichlorhydrin, Pharmacia Biotech Ab, Uppsala, Schweden) wurde auf einem Filtertrichter mit destilliertem Wasser gewaschen und mit 55 g NaOH, aufgelöst in 300 ml destillierten Wasser, 35°C, in einem mit Thermostat kontrolliertem Reaktionsgefäß, unter Rühren des Systems vermischt. 390 ml BPR-Butan wurden zugegeben. Das System wurde für zwei Stunden bei 35°C gerührt, gefolgt von Waschen mit 15 l Wasser.
  • Kopplung von rProtein A-cys.
  • Das aktivierte Gel wurde auf einem Trichterfilter mit 3 × 1 l Stickstoffgas gesättigtem, 0,1 M Natriumphosphat, 1 mM EDTA pH 8,5, gewaschen und trockengelegt. Das Gel wurde anschließend mit 5,5 g rProtein A-cys, aufgelöst in einer Stickstoffgas-gesättigten wässrigen Lösung von 0,1 M Na-Phosphat, 1 mM EDTA pH 8,5, vermischt. Das System wurde bei 37°C unter Einblasen von Stickstoffgas gerührt. Natriumsulfat (370 g) wurde zugegeben. Nach Rühren des Systems für zwei Stunden bei 37°C wurde das Gel mit drei Liter destilliertem Wasser gewaschen und mittels Absaugen abgezogen.
  • Deaktivierung
  • Das abgezogene Gel wurde mit 100 ml Thioglycerin, aufgelöst in 900 ml, 0,2 M Natriumbicarbonat, 0,5 M NaCl, 1 mM EDTA pH 10, unter Rühren des Systems vermischt. Das System wurde über Nacht bei 37°C gerührt, wonach das Gel über einen Filtertrichter mit 0,1 M Tris, 0,15 M NaCl, pH 8, und 0,05 M Essigsäure in drei Zyklen mit je 3 × 1 Gelvolumen bei jedem Zyklus, gewaschen wurde. Das Gel wurde am Schluß mit Wasser gewaschen.
  • Feststellen der Gesamtkapazität für humanes IgG
    Figure 00080001
  • 1,0 ml des trockengelegten Gels wurden in die Säule gepackt und mit Puffer A äquillibriert. Die IgG-Lösung wurde durch den "superloop" bei einer Fließrate von 0,15 ml/Minute aufgetragen, bis das Gel in Bezug auf IgG gesättigt war. Nach dem Waschen mit Puffer A bei derselben Fließrate wurde gebundenes IgG mit 9 ml Puffer B bei einer Fließrate von 0,30 ml/Minute eluiert. Das Eluat mit Puffer B wurde gesammelt und dessen Volumen bestimmt (gewogen). Die A280 wurde nach Verdünnung auf 1 : 10 abgelesen. Die auf die Bestimmung der IgG-Kapazität angewendete Formel war: Eluatvolumen in ml × A280 des verdünnten Eluats × 7,244 = mg IgG/ml des trockengelegten Gels.
  • Bestimmung der Durchbruchskapazität QB für humanes IgG
    Figure 00080002
  • Die Auftragung der IgG-Lösung wurde unterbrochen, wenn der im Eluat gemessene c/c0 1% erreichte (c und c0 sind Proteinkonzentration im Eluent, direkt nach oder vor dem Durchlauf durch die Säule). Adsorbiertes IgG wurde anschließend mit Puffer B eluiert und sein Volumen als mg IgG pro ml des trockengelegten Gels festgestellt.
  • Ergebnisse und Bedingungen für das Kopplungsexperiment, die die höchste dynamische Kapazität ergaben, waren: Natriumsulfat 1,3 M; geladene Menge an rProtein A-cys 7,1 mg/min Gel; Kopplungspuffer pH 8,5; Kopplungstemperatur 37°C, Kopplungszeit 2 Stunden, Gesamtkapazität 52,2 mg IgG pro ml Gel; Durchbruchskapazität 31,3 mg pro ml Gel bei c/c0 = 1%. Größtenteils vergleichbare dynamische Kapazitäten konnten in Versuchen erhalten werden, in denen 5-6 mg rProtein A-cys für jeden ml Gel beladen wurden.
  • Andere Kopplungsverfahren
  • Die Epoxykopplung von rProtein A-cys wurde mit nativem Protein A (dem Cystein fehlt), gekoppelt an N-Hydroxysuccinimid (NHS) und rProtein A-cys, gekoppelt an N-Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclo-hexan-1-carboxylat (Sulfo-SMCC) verglichen. Bei der Kopplung von nativen Proteinen mit NHS oder Epoxid wird die Kopplung allein durch die Aminogruppe bewirkt. Im Fall des Reaktionsmittels Sulfo-SMCC wird die Kopplung von rProtein A-cys über eine Thiolgruppe bewirkt. Bei der Kopplung von rProtein A-cys mit Epoxy (BPR) kann die Kopplung gleichzeitig durch eine Thiolgruppe und eine Aminogruppe bewirkt werden, wobei die jeweilige Bevorzugung durch den pH erfolgt. Bei vergleichbaren Substitutionsgraden verstärkte sich die Gesamtkapazität in der Reihenfolge NHS, Epoxy, Sulfo-SMCC. Die Unterschiede sind wahrscheinlich durch sterische Effekte begründet, bedingt durch Aminkopplung über Gruppen, die nicht terminal lokalisiert sind. Vergleichstests mit rProtein G und rProtein G-cys werden ebenso unten angeführt.
  • Tabelle 1.
    Figure 00100001
  • Tabelle 2.
    Figure 00100002
  • 4) GammBindG®Typ 2 ist Protein G und GammBindG®Typ 3 ist Protein G mit Cystein als C-Terminus. Beide Varianten besitzen zwei IgG-Bindedomänen.
  • Die Ergebnisse zeigen, dass eine sehr gute Gesamtkapazität und Durchbruchskapazität erreicht wurde, und dass die Kapazität in Mol IgG pro Mol rProtein A-cys weitaus größer war, als früher für Cys-enthaltende IgG-Bindeproteine erzielt wurde.
  • Durchbruchkapazität für humanes IgG. Vergleichsstudien für unterschiedliche Protein A Adsorbtionsmittel
  • Verfahrensweise:
  • Protein A Matrizen (rProtein A-Sepharose® Fast Flow (diese Erfindung, Immobilisierung über Epoxy); Protein A Sepharose® Fast Flow (Immobilisierung über CNBr, Pharmacia Biotech AB); PROSEP A® (Bioprocessing Ltd., UK) und Protein A Hyper D® (BioSepra S.A., Frankreich) wurden in XK 16/20 Säulen bis auf eine Betthöhe von 10 cm gepackt. Die Gele wurden in 20 mM Phosphatpuffer, pH 7,4, äquilibriert. Eine Probe, bestehend aus humanem polyclonalen IgG (1 mg/ml) im gleichen Puffer, wurde auf entsprechende Gele bei einem linearen Fluß von 190 cm/Stunde aufgetragen. Die Probenauftragung wurde unterbrochen, wenn die Konzentration von IgG im Eluat 10% der IgG-Ausgangs-Konzentration der Probenlösung erreicht hatte. Nichtgebundenes IgG wurde ausgewaschen und das gebundene IgG mit 0,1 M Citrat, pH 3, eluiert. Die Durchbruchkapazität QB wurde aus der Menge von IgG, das pro ml Gel gebunden hatte, errechnet, wenn die IgG-Konzentration im Eluat 5% der IgG-Ausgangs-Konzentration der Probe betrug.
  • Die Konzentration von Protein A in der eluierten IgG-Fraktion wurde mittels ELISA festgestellt. Die Menge an Protein A in der IgG-Fraktion wird als ng Protein A/ mg IgG angegeben.
  • Ergebnisse:
    Figure 00120001
  • Diese Werte zeigen, dass die Erfindung es erlaubt, Protein A Adsorptionsmittel herzustellen, deren Durchbruchkapazitäten höher sind als die anderer kommerziell erhältlicher Matrizen. Verglichen mit denselben Matrizen ist die Stabilität in Bezug auf die Freisetzung von Protein A ungefähr gleich oder besser.

Claims (6)

  1. Trennmedium, umfassend eine Grundmatrix und Matrix-gebundene Gruppen, welche rekombinantes Protein A, enthaltend ein Cystein, zeigen, wobei die Gruppen der Formel entsprechen -B-X-rProtein A-cys worin B eine Brücke ist, welche an die Grundmatrix bindet, und X ein Heteroatom von rProtein A-cys beinhaltet, und Protein A die native Form oder IgG-Bindungsfragmente und Varianten von Protein A, welche die gleiche IgG-Spezifizität wie natives Protein A besitzen, angibt, dadurch gekennzeichnet, daßX Thioether-Schwefel (-S-) ist.
  2. Trennmedium nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Brücke -B- an die Grundmatrix über eine Etherstruktur bindet und eine gerade, verzweigte oder cyclische gesättigte Kohlenwasserstoffkette umfaßt, welche wahlweise unterbrochen ist durch ein oder mehrere Sauerstoff-/Stickstoffatome und substituiert mit einer oder mehreren Aminogruppen oder Hydroxygruppen, wobei ein und dasselbe Kohlenstoffatom höchstens ein Sauerstoffatom oder Stickstoffatom bindet.
  3. Trennmedium nach einem der Ansprüche 1–2, dadurch gekennzeichnet, daß Cystein in einem terminalen Peptidlinker beinhaltet ist.
  4. Trennmedium nach mindestens einem der Ansprüche 1–3, dadurch gekennzeichnet, daß der Peptidlinker C-terminal ist.
  5. Trennmedium nach mindestens einem der Ansprüche 1–4, dadurch gekennzeichnet, daß Cystein der C-terminale Aminosäurerest in rProtein A-cys ist.
  6. Trennmedium nach mindestens einem der Ansprüche 1–5, dadurch gekennzeichnet, daß die Grundmatrix ein Polyhydroxypolymer ist, vorzugsweise ein insolubilisiertes Polysaccharid.
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