AT393386B

AT393386B - Verfahren zur herstellung eines monoklonalen antikoerpers

Info

Publication number: AT393386B
Application number: AT9019/83A
Authority: AT
Original assignee: Hybritech Inc
Priority date: 1982-04-12
Filing date: 1983-04-12
Publication date: 1991-10-10
Also published as: FI834530A0; ES521371A0; ES8506902A1; GB8332644D0; DK192191A; CH672028A5; AU7256987A; FI88403C; DK192191D0; ES528000A0; ES8404858A1; CA1209907A; ES528001A0; FI88403B; GB2128630A; AU622099B2; EP0105359A1; IT1219779B; ATA901983A; EP0105359A4

Description

AT 393 386 B

Diese Erfindung bezieht sich auf die Herstellung von monoklonalen Antikörpern sowie auf die Reinigung von Antigenen und Antikörpern durch Affinitätschromatographie.

Die Reinigung eines Antigens durch Affinitätschromatographie, unter Verwendung von durch die Antwort eines Wirtstieres auf das Antigen produzierten Serumantikörpem, die an einen festen Träger als ein Immunoadsorbens gebunden sind, ist ein Verfahren, das seit vielen Jahren Anwendung findet. Dieses Verfahren hat jedoch wenigstens zwei erhebliche Nachteile, welche seine Brauchbarkeit beeinträchtigen. So sind, falls Antikörper hoher Affinität zur Extraktion des Antigens aus einer Probe verwendet werden, strenge Bedingungen erforderlich, um das Antigen von den Antikörpern zu dissoziieren, nachdem nicht absorbierte Verunreinigungen aus dem Körper des Immunoadsorbens ausgewaschen worden sind. Die Bedingungen, die dafür erforderlich sind, zum Beispiel ein pH von weniger als 3 oder mehr als 11 oder ein konzentriertes Chaotrop, wie Guanidin- oder Hamstoffiösung, können das Antigen und die Antikörper denaturieren, die immunochemischen und/oder biologischen Eigenschaften des Antigens verringern, wenn nicht zerstören, und die Nutzungsdauer des Immunoadsorbens abkürzen.

Um die Probleme zu vermeiden, die mit der Verwendung von Antikörpern mit einer hohen Affinität für das Antigen verbunden sind, ist es übliche Praxis geworden, immobilisierte Antikörper niedriger Affinität als ein Immunoadsorbens zu verwenden. Die Verwendung dieser Antikörper gestattet die Eluierung des Antigens aus dem Körper des Immunoadsorbens unter Anwendung milder, nicht-denaturierend wirkender Bedingungen. Bei der erforderlichen Stufe des Waschens der Säule zur Eluierung von Verunreinigungen aus dem gebundenen Antigen wird jedoch auch etwas vom Antigen eluiert, und zwar so viel, daß die wirksame Trennung erheblich beeinträchtigt ist. Außerdem können Antikörper niedriger Affinität Antigene nicht wirksam binden, die in den Medien in relativ niedrigen Konzentrationen, d. h. weniger als etwa 10 ng/ml, vorhanden sind.

Mit dem Aufkommen der Hybridomatechnologie ist es möglich geworden, monoklonale Antikörper zu erhalten, die in der Folge zur Verwendung als Immunoadsorbenzien in der Affinitätsreinigung der Antigene, gegen die sie gezüchtet waren, vorgeschlagen worden sind. Siehe zum Beispiel Stenman und Mitarbeiter, J. Immunological Methods, 46, 337 (1981); Stallcup und Mitarbeiter, J. Immunology, 127, 924 (1981) und Katzman und Mitarbeiter, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 78, 162 (1981). Diese Berichte geben an, daß die angewendeten monoklonalen Antikörper bestenfalls nur eine mäßige Affinität für die Antigene hatten, wodurch deren Desorption von dem Immunoadsorbens unter Anwendung milder Bedingungen möglich war. Somit legt die heutige Erfahrung bei der Verwendung monoklonaler Antikörper als Immunoadsorbenzien nahe, daß deren Eigenschaften mit jenen der "polyklonalen" Antikörper üblicher Antiseren parallel laufen sollen, d. h. die Verwendung eines Antikörpers niedriger Affinität gestattet die Eluierung des Antigens unter milden Bedingungen, wohingegen die Verwendung eines Antikörpers hoher Affinität strenge Bedingungen erfordert, um das Antigen von dem Antikörper zu dissoziieren.

Wie gut bekannt ist, werden Hybridomen durch die zufällige Fusion von B-Lymphozyten mit Myelomazellen in Gegenwart eines fusionsbegünstigenden Mittels gebildet. Jede Hybridoma der großen Population von Hybridomen, die durch eine Fusion produziert werden kann, sondert einen unterschiedlichen monoklonalen Antikörper ab. Typischerweise wird die Population von Hybridomen ausgesondert, um für eine weitere Klonung solche auszuwählen, die einen Antikörper der gewünschten antigenischen Spezifität absondem, um brauchbare Mengen an Antikörper zu erhalten. Wir haben gefunden, daß unter der Population von Hybridomen, welche Antikörper gegen ein spezifisches Antigen absondem, und der Subpopulation solcher, welche Antikörper mit einer hohen Affinität für das Antigen absondem, eine viel kleinere Population Antikörper absondert, welche eine hohe Affinität für das Antigen in einem rasten Milieu, jedoch eine viel niedrigere Affinität in einem zweiten Milieu haben, wobei kein Milieu die immunochemischen oder biologischen Eigenschaften des Antigens Odra* der Antikörper schädigt Wir nehmen an, daß das Vorliegen dieser Antikörper in Antiseren hoher Affinität unerkannt geblieben ist, weil der überwiegende Teil der Antikörper hoher Affinität in den Antiseren solche sind, die strenge Bedingungen erfordern, bevor das Antigen aus den Antikörpern abgetrennt werden kann, und weil sie die immunochemischen Eigenschaften der Antisera dominieren.

Demgemäß haben wir gefunden, daß wir eine Population von Hybridomen aussondem können, welche das Produkt von Mehrfachfusionen sein können, und solche identifizieren können, die einen monoklonalen Antikörper mit einer hohen Affinität in einem ersten Milieu und einer niedrigen Affinität in einem zweiten Milieu produzieren, und wenigstens eine der Hybridomen Klonen können, um eine genügende Menge des von ihr produzierten Antikörpers zu erhalten, um dessen Verwendung als ein hoch wirksames Immunoadsorbens zur Affinitätschromatographie zu ermöglichen. Im Rahmen der hier vorgesehenen Verwendung wird ein Antikörper als eine hohe Affinität zeigend betrachtet, wenn dessen Affinitätskonstante (Ka) etwa > 10^ ist, und als eine niedrige Affinität zeigend, wenn seine Ka etwa < 10^ ist

Die Fig. 1 und 2 sind graphische Darstellungen von Daten, welche die Wirkung von Änderungen des pH auf die Desorption von radiomarkiertem humanem Wachstumshormon zeigen, das an vier verschiedene monoklonale Antikörper gebunden ist die an einer festen Phase immobilisiert sind.

Gemäß der Erfindung umfaßt das Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers mit einer hohen Affinität für das Antigen, gegen welches er gerichtet ist in einem rasten Milieu und einer niedrigen Affinität für das Antigen in einem zweiten Milieu, wobei kein Milieu die immunochemischen oder biologischen -2-

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Eigenschaften des Antigens oder des Antikörpers im wesentlichen irreversibel ändert, die folgenden Schritte: a) Screening der Hybridomen und Auswählen einer Population von Hybridomen, die für das Antigen spezifische monoklonale Antikörper ansscheiden; b) Screening der Population von (a) und Auswählen einer Subpopulation von Hybridomen, die monoklonale Antikörper mit einer hohen Affinität für das Antigen in einem ersten Milieu ausscheiden; c) Screening der Subpopulation von (b) und Auswählen einer Subpopulation von Hybridomen, die monoklonale Antikörper mit einer niedrigen Affinität für das Antigen in einem zweiten Milieu ausscheiden; und d) Klonieren wenigstens eines der ausgewählten Hybridome von (c) zur Gewinnung einer ausreichenden Menge der monoklonalen Antikörper.

Gemäß einem weitmen Aspekt der Erfindung wird die Reinigung eines Antigens mittels eines Verfahrens bewirkt, welches die folgenden Stufen umfaßt: a) Selektion eines monoklonalen Antikörpers mit einer hohen Affinität für das Antigen in einem ersten Milieu und einer niedrigen Affinität für den Antikörper in einem zweiten Milieu, wobei kein Milieu wesentliche irreversible Änderungen der gewünschten immunochemischen Eigenschaften des Antigens verursacht; b) Immobilisierung des Antikörpers an einem festen Träger, c) Inberührungbringen des immobilisierten Antikörpers in dem ersten Milieu mit einer Probe, die unreines Antigen enthält, um das Antigen an den Antikörper zu binden; d) Abtrennung ungebundener Verunreinigungen aus dem gebundenen Antigen; und e) Eluierung des Antigens in einer gereinigten Form aus dem immobilisierten Antikörper, wobei als ein Eluierungsmittel ein Medium verwendet wird, welches das zweite Milieu ist

Wie bereits angegeben, können im Rahmen unserer Erfindung brauchbare Antikörper erhalten werden, indem die Antikörper ausgesondert werden, die durch eine Population von Hybridomen produziert werden, welche unter Anwendung bekannter Methoden durch die Fusion von Myelomazellen mit B-Lymphozyten erhalten werden. Die B-Lymphozyten sind typischerweise Milzzellen, die einem hyperimmunisierten Tier entnommen wurden, dem das Targetantigen vorher als ein Immunogen verabreicht worden ist

Nachdem solche Hybridomen identifiziert worden sind, die monoklonale Antikörper produzieren, deren Spezifitäten gegen das gewünschte Antigen gerichtet sind, können sie weiterhin ausgesondert werden, um solche zu identifizieren, die Antikörper produzieren, deren Affinitäten bei Milieuänderungen, die das Antigen oder den Antikörper nicht schädigen, variieren. Beispielsweise sind Antigene üblicherweise in Lösung innerhalb des pH-Bereiches von 4 -10,5 stabil. Zur Gewinnung eines pH-sensitiven Antikörpers für die Verwendung als ein Immunoadsorbens wird die Population von monoklonalen Antikörpern ausgesondert, um solche zu identifizieren, die eine hohe Affinität für das Antigen bei einem pH in diesem Bereich, d. h. eine Ka von etwa 10^ und

1Λ O vorzugsweise > 10 , und eine niedrige Affinität bei einem zweiten pH, d. h. eine Ka von etwa 10 und vorzugsweise weniger als 10^, innerhalb desselben Bereiches, haben. Diese Art von Aussonderung kann «folgen, indem der Antikörper auf einem festen Träger immobilisiert und, nachdem ihm das Binden von Antigen ermöglicht wurde, das Ausmaß der Desorption des Antigens gemessen wird, das bei verschiedenen pH-Werten auftritt, eine Messung, die zum Beispiel unter Anwendung von radiomarkiertem Antigen und Zählen der von der festen Phase und/oder der überstehenden Flüssigkeit emittierten Strahlung erfolgen kann. Eine ähnliche Aussonderung kann ausgeführt werden, um Antikörper zu identifizieren, die auf andere Arten von Milieuänderung ansprechen.

Es wird derzeit bevorzugt, monoklonale Antikörper auszuwerten, deren Fähigkeit, Antigen zu binden, gegenüber pH-Änderungen empfindlich ist. In dieser Hinsicht wird der Antikörper derart ausgewählt, daß er eine hohe Affinität bei einem pH und eine niedrige Affinität bei einem zweiten pH, der höh«’ oder niedriger als der erste pH sein kann, hat Üblicherweise wird der erste pH bei oder nahe pH 7 liegen, obgleich dies nicht der Fall zu sein braucht Es liegt jedoch auch im Rahmen der Erfindung, Antikörper auszuwählen, die auf eine verschiedene Art von Änderung der Milieubedingung ansprechen. Beispielsweise kann ein monoklonaler Antikörper ausgewählt werden, der eine Änderung von hoher zu niedriger Affinität in Gegenwart einer chaotropischen Lösung als Eluierungsmittel eingeht Zu geeigneten Chaotropika gehören KBr, KJ, KSCN,

Guanidin, Harnstoff und MgC^. Somit können monoklonale Antikörper ausgewählt werden, die eine Ka i 10^ bei Abwesenheit von Chaotrop haben, welche aber eine Ka von < 10^ in Gegenwart des besonderen Chaotrops haben, dessen Konzentration für das in Frage stehende Antigen nicht schädlich ist Die Auswahl hinsichtlich Chaotropempfindlichkeit kann auch in Puffern bei einem spezifischen pH «folgen. Alternativ können Antikörper ausgewählt werden, die gegen pH-Änderungen in Gegenwart einer konstanten Konzentration eines Chaotrops empfindlich sind.

Monoklonale Antikörper, deren Affinität für ein Antigen durch andere Änderungen als solche des pH oder der Konzentration an Chaotrop angemessen erniedrigt wird, können gleichfalls ausgewählt werden. Zu den Arten von Medienempfindlichkeit für die die Antikörper ausgesondert werden können, um solche auszuwählen, deren Antigen-Bindungsfähigkeit durch eine Änderung im Eluierungsmedium beeinflußt wird, können Boratempfindlichkeit Methylmannosidempfindlichkeit und Empfindlichkeit gegen nichtionische oder ionische Detergenzien und Reagenzien gehören, welche spezifische Aminosäuren, wie Tryptophan und Tyrosin, -3-

AT 393 386 B beeinflussen.

Zur Verwendung in der Affinitätschromatographie kann ein ausgewählter monoklonaler Antikörper an irgendeinen der festen Träger gefunden werden, wie sie üblicherweise in der Affinitätschromatographie verwendet werden. Diese umfassen Sepharose, Polystyrol, Glas, Nylon, Cellulose, Polymethylmethacrylat, Kieselsäuregel, Polyacrylamid und Nitrocellulose.

Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Anwendung der vorliegenden Erfindung zur Gewinnung monoklonaler Antikörper, deren Bindungsafflnität für ein Antigen von einer hohen Affinität in einem ersten Milieu zu einer niedrigen Affinität in einem zweiten Milieu variiert, wobei kein Milieu eine Schädigung der immunochemischen Eigenschaften des Antigens und deren Brauchbarkeit als Immunoadsorbentien für die Affinitätschromatographie verursacht.

Beispiel 1

Milzzellen, die mit humanem Wachstumshormon (HGH) hyperimmunisierten Balb/c-Mäusen entnommen wurden, wurden unter Verwendung von Polyethylenglykol mit Mäusemyelomazellen (NS-1 oder SP-2/0-Linien) fusioniert. Die entstandenen Hybridomen wurden geklont und durch einen Radioimmunotest unter Anwendung von ^I'HGH und Pferdeantimaus-IgG an Sepharosekügelchen ausgesondert, um solche zu bestimmen, die für HGH spezifischen Antikörper absondem. Die Anti-HGH produzierenden Hybridomen wurden weiterhin ausgesondert, um solche zu identifizieren, die Antikörper mit einer Ka von wenigstens etwa 10^ bei pH 7 produzieren. Diese wurden weiterhin ausgesondert, um solche zu identifizieren, deren Affinitäten gegen pH-Änderungen innerhalb des Bereiches von 4 bis 10,5 empfindlich waren. Daten, welche die pH· Empfindlichkeit von vier monoclonischen Antikörpern wiedergeben, sind in den Tabellen 1 und 2 und den Fig. 1 und 2 angegeben. Die einzelnen Antikörper werden mit den Buchstaben A, B, C bzw. D bezeichnet. Diese Daten wurden in folgender Weise erhalten: HGH, das mit markiert war, wurde bei pH 7 an jeden Antikörper gebunden, der vorher an Polystyrolkugeln immobilisiert worden ist Jede Kugel enthielt annähernd 1 ng des Antigens und 10.000 cpm. Drei von jeder Sorte wurden in 1 ml PBS in 10 %igem Pferdeserum vier Stunden bei dem angegebenen pH bebrütet Die pH-Einstellungen erfolgten entweder durch Zugabe eines Puffers von Natriumcarbonat (10 % in Pferdeserum), um pH 7 zu erhalten, oder durch Zugabe von Natriumacetatpuffer (10 % in Pferdeserum), um pH 7 zu erhalten. Nach Bebrütung wurden 800 μΐ der überstehenden Flüssigkeit ausgezählt Die Zählungen von desoibiertem Antigen bei jedem pH wurden in den Tabellen 1 und 2 aufgezeichnet und in den Fig. 1 und 2 aufgetragen.

Tabelle 1 Zählungen/Minute x 10'^ von desorbiertem HGH 1

pH Antikörper A Antikörper B 3,0 4,810 2,442 3,5 4,625 0,803 4,0 4,156 0357 4,5 1,608 0348 5,0 0,449 0,206 5,5 0,176 0,162 6,0 0,220 0,176 6,5 0,336 0,167 7,0 0328 0,162 -4- 1

Mittelwert von drei überstehenden Flüssigkeiten

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Tabelle 2 Zählungen/Minute x 10'^ von desorbiertem HGH *

pH Antikörper C Antikörper D 7,0 0,236 0,187 7,5 0,208 0,336 8,0 0,240 0,321 8,5 0,666 0,277 9,0 0,401 0,237 9,5 1,038 0,287 10,0 3,030 0364 10,5 4,809 0384 11,0 5,508 3,460 * Mittelwert von drei Uberstehenden Flüssigkeiten

Die Daten in Tabelle 1, insbesondere, wie sie in Fig. 1 aufgetragen sind, zeigen, daß die Bindung von HGH durch Antikörper B im wesentlichen gegen pH-Änderungen im Bereich von pH 3,5 - 7 unempfindlich war, daß aber die Bindung von HGH an Antikörper A im Bereich von 4,5 - 4,0 signifikant vermindert war, was anzeigt, daß der Antikörper das Antigen bei pH 4,0 nicht wirksam binden würde.

Die Daten in Tabelle 2 und Fig. 2 anderseits zeigen, daß die Bindung von HGH durch Antikörper D gegen Änderungen im pH innerhalb des Bereiches pH 7,0 bis 10,5 im wesentlichen unempfindlich war, wohingegen die Bindung von HGH durch Antikörper C im Bereich von pH 9,5 -10,5 signifikant vermindert war, was anzeigt, daß der Antikörper das Antigen bei pH 10,5 nicht wirksam binden würde.

Die aus den Antikörpern A und C bei pH 4,0 und 10,5 eluierten überstehenden Flüssigkeiten wurden zu PBS-Puffer (10 % in Pferdeserum) gegeben, auf pH 7 eingestellt und die Proben wurden zusammengegeben. Die zusammengegebenen Proben wurden mit Polystyrolkugeln, die mit Antikörpern A, B, C und D und zwei anderen monoclonischen Antikörpern gegen HGH überzogen waren, bebrütet. Jeder dieser Antikörper erkannte unterschiedliche Bereiche des HGH-Moleküls. Die Immunoreaktivität des bei entweder pH 4 oder pH 10,5 eluierten Antigens mit fünf der sechs Antikörper, einschließlich Antikörpern A, B, C und D, war nicht beeinträchtigt und nur gegenüber dem sechsten geringfügig vermindert. Diese Daten zeigen, daß die Eluierung des Antigens bei entweder pH 4,0 oder pH 10,5 dessen immunochemische Eigenschaften nicht nachteilig beeinflußte.

PeispM.2

Ein monoklonaler Antikörper hoher Affinität (Ka = 5 x 10^ gegen Prostatinsäurephosphatase (PAP), ein extrem labiles Enzym, das durch Aussondem von Hybridomen erhalten wurde, die monoklonale Anti-PAP-Antikörper produzieren und aus Fusionen von Milzzellen stammen, welche einer mit PAP und Mäusemyelomazellen hyperimmunisierten Balb/c-Maus, wie in Beispiel 1 beschrieben, entnommen wurden, zeigte, wie gefunden wurde, eine Antigenbindungsempfindlichkeit in dem pH-Bereich 6,0 - 4,0. Der Antikörper wurde an Sepharosekügelchen unter Anwendung der CNBr-Methode bei einer Konzentration von 1 mg Antikörper je 1 ml gepackten Sepharosekügelchen gebunden und zur Reinigung von PAP aus Samenflüssigkeit wie folgt verwendet Eine 170 μΙ-Probe von Samenflüssigkeit, welche 0,912 mg/ml PAP, bestimmt durch einen immunoradiometrischen Test, unter Verwendung eines TANDEM-Testbestecks für PAP, hergestellt von Hybritech, Inc., San Diego, Ca., enthielt, wurde mit Acetatpuffer (10 % Natriumacetat in Pferdeserum, das 0,15 Mol NaCl enthält) auf 5 ml verdünnt, wobei eine Lösung von 31 pg PAP/ml Lösung mit einem pH von 6 erhalten wurde.

Die PAP-Lösung wurde durch eine 1,5 ml der Sepharosekügelchen enthaltende Säule bei einer Geschwindigkeit von 1 ml/h geführt, und die Säule wurde mit 7,5 ml des Ausgangspuffers gewaschen. Ein immunometrischer Test des Eluierungsmittels (5 ml Probe und 7,4 ml Waschflüssigkeit) zeigte, daß 99,3 % der PAP an der Säule adsorbiert wurden. Die PAP wurde mit 0,1M Acetatpuffer vom pH 4, der 0,15 Mol NaCl enthielt, eluiert Drei 1 ml-Fraktionen wurden gesammelt und über Nacht gegen 50 mMol Citrat vom pH 6,0 dialysiert Der PAP-Gehalt der vereinigten und dialysierten Fraktionen wurde mittels immunoradiometrischem Test zu 54 % der gesamten, auf die Säule aufgebrachten Menge bestimmt Die Reinheit des dialysierten Materials -5-

AT 393 386 B wurde mittels Natriumdodecylsulfat und Qmstein-Davis-PAGE bestimmt. In jedem Fall wurde eine einzige Bande beobachtet. Es erfolgten Messungen der enzymatischen Aktivität, die dokumentierten, daß die gereinigte PAP ihre enzymatische Aktivität beibehielt

Die Retention von 46 % der PAP an der Säule ist voraussichtlich wenigstens zum Teil das Ergebnis nichtspezifischer Bindung und der Verwendung eines großen Überschusses an Antikörper, welche zu einer Antigennverschleppung" aus der Säule fährt Die erstgenannte kann verringert werden, indem die Säule mit der Probe unter den Bedingungen vorbehandelt wird, bei welchen die Eluierung bewirkt werden wird, worauf ein ausgedehntes Waschen anschließt, um irgendwelches Material, das eluiert werden wird, zu entfernen. Die letztgenannte kann dadurch verringert werden, daß die Konzentration an gebundenem Antikörper verringert wird. Schließlich ist Sepharose nicht eine ideale Matrix der Affinitätschromatographie, weil die Porengrößen-Heterogenität zu Diffusion und sterischen Problemen führt

Beispiel 3

Die Reinigung des mit Chlamydia assoziierten Antigens ist kompliziert weil es schwierig löslich zu machen ist Es kann jedoch in verschiedenen Detergenzien löslich gemacht werden. Hybridomen, welche monoklonale Antikörper gegen Chlamydialantigen erzeugen und die durch Fusionierung von Milzzellen aus mit Mäuse-myelomazellen hyperimmunisierten Balb/c-Mäusen, wie in Beispiel 1 beschrieben, erhalten worden sind, wurden hinsichtlich Empfindlichkeit auf Detergenskonzentration ausgesondert. Die Wirkung der Detergenzien auf die Bindung von vier solcher Antikörper ist in Tabelle 3 angeführt Die verwendeten Detergenzien waren Deoxycholat (DOC), Natriumdodecylsulfat (SDS) und Octylphenoxypolyethoxyethanol, das unter der Bezeichnung Nonidet P-40 (NP40) vertrieben wird. Als Kontrolle wurden Ehrlich’sche Asciten verwendet

Die in Tabelle 3 enthaltenen Daten wurden durch Überziehen des Antigens auf Mikrotiteiplatten und Bebrüten desselben mit einer Lösung jedes der Antikörper in einem Puffer bei der in der Tabelle angegebenen Konzentration des Detergens erhalten. Nach der Bebrütung wurde die Platte gewaschen und mit polyclonischen Schaf-Anti-Maus-Antikörpem umgesetzt, die mit Meerrettichperoxidase (HRP) markiert waren. Die Bebrütungen erfolgten während 1 Stunde bei Zimmertemperatur. Die Platte wird erneut gewaschen und mit einer Lösung von Qrthophenylendiamin (ODP), einem Chromagensubstrat für HRP, zur Umsetzung gebracht. Die Absorption in jedem Napf wurde bei 490 nm gemessen und ist in Tabelle 3 angegeben.

Tabelle 3

Wirkungen von Detergenzien auf die Bindung von monoklonalen Anti-Chlamydia-Antikörpem

Antikörper- Reaktions gemisch O.D.1 Ehrlich’sche Asciten O.D.1 Antikörper 1 O.D.1 Antikörper 2 O.D.1 Antikörper 3 O.D.1 Antikörper 4 Wässeriger^

Puffer 0,00 1,06 1,15 1,02 0,95 2% DOC 0,02 1,10 0,70 0,11 0,25 2% NP-40 0,00 0,20 0,11 0,80 0,06 0,5 % DOC 0,03 1,37 1,36 1,22 1,25 0,1 % SDS 0,05 1,17 1,20 1,30 1,05 1. Außendurchmesser bei 490 nm, erhalten als ein Mittelwert von 2 Proben mit einer Standardabweichung von 0,05. 2. Der wässerige Puffer ist Autopow-Gewebekulturmedium mit 8 % Pferdeserum und 2 % Fetalkalbsserum. Alle bei diesem Versuch verwendeten Detergenzien wurden in diesem Puffer verdünnt. 3. Als Kontrolle verwendet.

Diese Daten zeigen die Wirkung verschiedener Detergenzien und Detergenskonzentrationen auf die Bindung der ausgewählten monoklonalen Antikörper. Antikörper Nr. 1 und Antikörper 2 haben eine relativ hohe Affinität für Chlamydia in wässerigem Puffer, die durch irgendwelche der Detergenzien, ausgenommen 2 % NP-40, nicht beeinflußt wurde. Antikörper 3 hatte eine niedrige Affinität in 2 % DOC, behielt aber dennoch seine hohe Affinität in den anderen Medien bei. Antikörper 4 hatte eine niedrige Affinität in 2 % DOC und 2 % NP-40, aber -6-

AT 393 386 B eine hohe Affinität in den anderen Medien.

Bei anderen Versuchen wurden die antigenüberzogenen Mikrotiterplatten zuerst mit Detergenzien in den in Tabelle 3 angegebenen Konzentrationen 1 Stunde bebrütet und dann gewaschen. Anschließend wurden die Antichlamydia-Antikörper in den Näpfen bebrütet, worauf nach Waschen eine Bebrütung mit den HRP-markierten Anti-Maus-Andkörpem erfolgte. Dieser Bebrütung folgte nach Waschen eine Bebrütung mit dem Enzymsubstrat. Die in jedem Napf gemessenen optischen Dichten, verglichen mit Näpfen, die mit dem wässerigen Puffer vorbehandelt waren, lassen erkennen, daß das Antigen durch die Detergenzien nicht geschädigt war. Demgemäß könnten die monoklonalen Antikörper für die Affinitätsreinigung des Chlamydia-Antigens durch Löslichmachen des Antigens in einem mit Antikörper verträglichen Detergens, Binden und Überführen der Präparation über eine Säule von immobilisiertem Antikörper, zwecks Bindung des Antigens, verwendet werden. Anschließend wird das Antigen durch Eluierung der Säule mit einer anderen Detergenszusammensetzung, in welch» sich dar Antikörper an das Antigen nicht bindet, freigesetzt.

Aus dem vorstehenden wird dem Sachverständigen klar, daß die wirksame Reinigung eines Antigens mittels Affinitätschromatographie unter Verwendung eines ausgewählten monoklonalen Antikörpers als das Immunoadsorbens unter Bedingungen bewirkt werden kann, die das Antigen nicht denaturieren. Spezifische Anwendungen dieses Verfahrens umfassen seine Verwendung für die Reinigung von Antigenen in Proben, in welchen sie natürlich Vorkommen, und zur Reinigung radiomarkierten Antigens, welches bei der Lagerung abgebaut worden ist. Eine besondere Anwendung ist die Reinigung von bei der Recombinations-DNA-Technologie erhaltenen Proteinprodukten. Unter solchen Produkten können Insulin und humanes Wachstumshormon genannt werden. Die Isolierung von komplexen Proteinen aus Serum, zum Beispiel Fakt» V oder Faktor VIII, ist unter Anwendung des Verfahrens dieser Erfindung möglich.

Es ist auch möglich, das Verfahren umzukehren und den monoklonalen Antikörper durch Verwendung von immobilisiertem Antigen als ein Immunoadsorbens zu reinigen. Beispielsweise kann in einem immunoradiometrischen Test verwendet» radiomarkiert» Antikörper, der als Ergebnis ein» Lagerung abgebaut worden ist, in dieser Weise g»einigt werden. Der monoklonale Antikörper kann auch aus Ascitenflüssigkeit od» Kulturmedium unter Verwendung des immobilisi»ten Antigens als ein Immunoadsorbens gewonnen w»den.

Obgleich wir nicht an eine besondere Theorie gebunden sein wollen, ist die Änderung der Ka mit Änderungen des pH wahrscheinlich die Wirkung der Protonisierung von Histidinresten oder der Entprotonisierung von Lysin oder möglicherweise Tyrosin- od» Argininresten in entweder dem Antikörper, dem Antigen oder beiden, welche die Fähigkeit des Antigens und Antikörpers, miteinander Komplexbildung einzugehen, ändert. Beeinflußte spezifische Reste können innerhalb d» Bindungsbereiche der Moleküle liegen oder auch nicht

Auf Basis unserer Entdeckung, daß die durch eine Immunantwort eines Tieres auf ein Antigen produzierten Antikörper Antikörper umfassen, deren Empfindlichkeit auf Milieuänderungen Variationen unterliegt liegt es im Bereich unserer Erfindung, polyclonische Antiseren zu fraktionieren, um ein Gemisch von Antikörpern zu erhalten, die sich in ein» Weise verhalten, die jener der milieuempfindlichen monoclonischen Antikörp» dies» Erfindung ähnlich ist Diese Fraktionierung kann durch Inb»ühningbringen des immobilisierten Antigens mit einem Überschuß der Antiseren in einem ersten erwünschten Milieuzustand bewirkt werden, worauf ein Waschen des Immunoadsorbens zur Entfernung ungebundenen Materials erfolgt. Dieser Stufe folgt das Inberührungbringen des Immunoadsorbens mit einem Medium, welches das zweite Milieu zum Eluieren von Antikörpern bildet, die unter den Bedingungen des »sten Milieus nicht eluiert worden sind. Wenn man zum Beispiel Antikörper zu erhalten wünscht die eine hohe Affinität bei pH 7 und eine niedrige Affinität bei pH 4 zeigen, wird das immobilisierte Antigen mit einem Überschuß an Antiseren bei pH 7 in Berührung gebracht und das immobilisierte Antigen wird mit einem Medium bei pH 7 gewaschen, um Antikörper zu entfernen, die eine niedrige Affinität bei pH 7 zeigen. Das Immunoadsorbens wird dann bei pH 4 eluiert, um Antikörper zu entfernen, die eine niedrige Affinität bei pH 4 zeigen. Das Eluierungsmittel wird die Fraktion von Antikörpern enthalten, deren Bindung mit dem Antigen für Änderungen im pH üb» den B»eich pH 7 bis pH 4 empfindlich ist Ähnliche Fraktionierungen können mit Harnstoff und anderen Inhibitoren für Antigen-Antikörperbindung ausgeführt werden. Die entstandenen Populationen von Antikörpern können eine weitere Subfraktionierung erfordern, um solche Antikörper, welche eher aufgrund einer inhärenten niedrigen Affinität als eines Ka-nSchaltersn eluieren, weit» zu entfernen.

Es liegt auch im Rahmen unserer Erfindung, monoklonale Hybrid-Antikörp» mit Doppelspezifitäten zur Affinitätsreinigung anzuwenden. Ein Verfahren zur Gewinnung monoklonal» Hybrid-Antikörper ist in der WO-Al- 83/03679 beschrieben, deren Offenbarung durch Bezugnahme darauf hi» einbezogen wird. D» monoklonale Hybrid-Antikörp» hat zwei Spezifitäten, die v»schiedene Antigene betreffen können. Zur Verwendung in unserer Erfindung wird der Hybrid-Antikörper so ausgewählt, daß er pH- und andere Milieuempfindlichkeit in der Spezifität für das Antigen zeigt, für das er als ein Immunoadsorbens in einer Affinitätschromatographie zu verwenden ist Die and»e von dem Hybrid gezeigte Spezifität wird so ausgewählt daß sie eine hohe Affinität gegen ein zweites Antigen hat welches an einen festen Träger gebunden ist Wenn d» Hybrid-Antikörper auf den festen Träger aufgebracht wird, wird er an den Träger durch das zweite Antigen gebunden. Selbstverständlich braucht die Affinität des Hybrids für das zweite Antigen unter den Milieubedingungen, welche die Eluierung des ersten oder Targetantigens gestatten, nicht wesentlich niedriger sein. Vorzugsweise ist jedoch die Bindung des zweiten Antigens an den Antikörper für einen anderen -7-

Claims

AT 393 386 B Milieuzustand empfindlicher als jener, der dann das Eluieren des Targetantigens aus dem Immunoadsorbens gestattet. Beispielsweise kann der Hybrid-Antikörper derart ausgewählt werden, daß die Affinität für das Targetantigen durch eine Erniedrigung des pH verringert und die Affinität für das zweite Antigen durch Erhöhung des pH verringert wird. Dies gestattet es, den monoklonalen Hybrid-Antikörper bequem von einem festen Träger zu desorbieren, wenn es erwünscht ist, so vorzugehen, weil der Träger durch Verunreinigungen oder aus anderen Gründen, welche dessen Brauchbarkeit beeinträchtigen, vergiftet worden ist. Die milieuempfindlichen Antikörper unserer Erfindung können auch zur Lagerung von Antigenen, die in Lösung instabil sind, in einer Festphase verwendet werden. Beispielsweise kann radiomarkiertes Antigen an den immobilisierten Antikörper für die Lagerung gebunden und im Gebrauchsfalle desarbiert werden. Der Desorption kann ein Waschen des Immunoadsorbens zur Entfernung etwaiger Abbauprodukte, die während der Lagerung entstanden vorangehen. Das umgekehrte Verfahren ist ebenfalls möglich, d. h. das Antigen kann zur Lagerung instabiler Antikörper in einer Festphase verwendet werden. Beispielsweise kann radiomarkierter Antikörper, der in einem Radiotest verwendet worden ist, als der Antigen:Antikörperkomplex gelagert und nach Erfordernis desoibiert werden. PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers mit einer hohen Affinität für das Antigen, gegen welches er gerichtet ist, in einem ersten Milieu und einer niedrigen Affinität für das Antigen in einem zweiten Milieu, wobei kein Milieu die immunochemischen oder biologischen Eigenschaften des Antigens oder des Antikörpers im wesentlichen irreversibel ändert, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt: a) Screening der Hybridomen und Auswählen einer Population von Hybridomen, die für das Antigen spezifische monoklonale Antikörper ausscheiden; b) Screening der Population von (a) und Auswählen einer Subpopulation von Hybridomen, die monoklonale Antikörper mit einer hohen Affinität für das Antigen in einem ersten Milieu ausscheiden; c) Screening der Subpopulation von (b) und Auswählen einer Subpopulation von Hybridomen, die monoklonale Antikörper mit ein« niedrigen Affinität für das Antigen in einem zweiten Milieu ausscheiden; und d) Klonieren wenigstens eines der ausgewählten Hybridome von (c) zur Gewinnung einer ausreichenden Menge der monoklonalen Antikörper.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindungskonstante für den Antikörper an das Antigen in dem ersten Milieu etwa > 10^ und die Bindungskonstante für den Antikörper an das Antigen in dem zweiten Milieu etwa < 1$ ist
3. Verfahren nach Anbruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindungskonstante in dem ersten Milieu 1101° und die Bindungskonstante in dem zweiten Milieu < 10° ist
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das erste Milieu ein flüssiges Medium mit einem ersten pH ist und das zweite Milieu ein flüssiges Medium mit einem zweiten, vom ersten pH unterschiedlichen pH ist
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der pH des ersten Milieus und der pH des zweiten Milieus innerhalb des Bereiches von 4 bis 10,5 liegen.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das zweite Milieu eine ein chaotropes Mittel enthaltende Lösung ist
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das chaotrope Mittel aus der aus Harnstoff, Guanidin, KSCN, KBr, KI und MgC^ bestehenden Gruppe ausgewählt ist
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das erste Milieu ein flüssiges Medium mit ein« ersten Detergenskonzentration ist und das zweite Milieu ein flüssiges Medium mit ein« zweiten, von der ersten unterschiedlichen Detergenskonzentration ist -8- AT 393 386 B
9. Verfahren nach einem der Ansprache 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß der monoklonale Antikörper an einen festen Träger gebunden wird.
10. Verfahren nach Anbruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der feste Träger aus der aus Sepharose, Polystyrol, Glas, Nylon, Cellulose, Polymethylmethacrylat, Kieselsäuregel, Polyacrylamid und Nitrocellulose bestehenden Gruppe ausgewählt wird.
11. Verfahren zur Reinigung eines Antigens, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Stufen umfaßt: a) Auswahl eines Antikörpers mit einer hohen Affinität für das Antigen in einem ersten Milieu und einer niedrigen Affinität für das Antigen in einem zweiten Milieu, wobei kein Milieu die immunochemischen oder biologischen Eigenschaften des Antigens oder Antikörpers im wesentlichen irreversibel ändert; b) Immobilisieren des Antikörpers an einem festen Träger, c) Binden des Antigens an den Antikörper in dem ersten Milieu; d) Abtrennung ungebundener Verunreinigungen von dem gebundenen Antigen; und e) Eluieren des Antigens in einer gereinigten Form aus dem immobilisierten Antikörper, wobei als ein Eluierungsmittel ein Medium verwendet wird, welches das zweite Milieu ist.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindungskonstante für den Antikörper an das Antigen in dem ersten Milieu etwa > 10^ ist und die Bindungskonstante für den Antikörper an das Antigen in dem zweiten Milieu etwa < 10^ ist
14. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindungskonstante in dem asten Milieu Ϊ10^ ist und die Bindungskonstante in dem zweiten Milieu <, 10^ ist
15. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß das erste Milieu ein flüssiges Medium mit einem ersten pH und das zweite Milieu ein flüssiges Medium mit einem zweiten, vom ersten pH unterschiedlichen pH ist
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der pH des ersten Milieus und da pH des zweiten Milieus innerhalb des Bereiches von 4 bis 10,5 liegen.
17. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß das zweite Milieu eine ein chaotropes Mittel enthaltende Lösung ist
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß das chaotrope Mittel aus der aus Harnstoff, Guanidin, KSCN, KBr, KI und MgC^ bestehenden Gruppe ausgewählt ist
19. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der monoklonale Antikörper ein monoklonaler Hybrid-Antikörper mit einer ersten Spezifität gegen das zu reinigende Antigen und einer zweiten Spezifität mit einer hohen Affinität gegen ein zweites Antigen ist, das zweite Antigen an dem festen Träger immobilisiert ist und das Mittel liefert, durch das der Antikörper an dem festen Träger immobilisiert ist, wobei die Affinität des Antikörpers für das zweite Antigen in dem zweiten Milieu nicht wesentlich erniedrigt ist
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper eine niedrige Affinität für das zweite Antigen in einem dritten Milieu hat
21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß das erste Milieu ein flüssiges Medium mit einem ersten pH, das zweite Milieu eine Flüssigkeit mit einem zweiten, vom ersten pH unterschiedlichen pH und das dritte Milieu eine dritte Flüssigkeit mit einem dritten, vom zweiten pH unterschiedlichen pH ist
22. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper eine Antiserumfraktion ist
23. Verfahren zur Fraktionierung von Serumantikörpem zur Gewinnung einer Fraktion mit einer hohen Affinität für ein Antigen in einem ersten Milieu und einer niedrigen Affinität für das Antigen in einem zweiten Milieu, wobei kein Milieu die immunochemischen Eigenschaften des Antigens oder der Antikörper im wesentlichen irreversibel ändert dadurch gekennzeichnet, daß es die Immobilisierung des Antigens an einem festen Träger und das Inberührungbringen des Antigens mit den Serumantikörpem in dem ersten Milieu, um die Antikörper an das Antigen zu binden und eine Fraktion der Antigene zu eluieren, wobei als ein Eluierungsmittel ein Medium -9- AT 393 386 B verwendet wird, welches das zweite Milieu ist, und die eluierten Antikörper eine niedrige Affinität für das Antigen in dem zweiten Milieu haben, umfaßt
24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß das erste Milieu ein flüssiges Medium mit 5 einem ersten pH und das zweite Milieu ein flüssiges Medium mit einem zweiten, vom ersten pH unterschiedlichen pH ist
25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß der pH des ersten Milieus und der pH des zweiten Milieus innerhalb des Bereiches von 4 bis 10,5 liegen. 10
26. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß das zweite Milieu eine Lösung ist, die ein chaotropes Mittel enthält
27. Verfahren zur Reinigung eines Antikörpers mit einer hohen Affinität für ein Antigen in einem ersten Milieu 15 und einer niedrigen Affinität für das Antigen in einem zweiten Milieu, wobei kein Milieu die immunochemischen Eigenschaften des Antigens oder Antikörpers im wesentlichen irreversibel ändert, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Stufen umfaßt a) Immobilisierung des Antigens an einem festen Träger, b) Bindung des Antikörpers an das Antigen in dem ersten Milieu; 20 c) Abtrennung der ungebundenen Verunreinigungen aus dem gebundenen Antikörper, und d) Eluierung des Antikörpers in einer gereinigten Form aus dem immobilisierten Antigen unter Verwendung eines Mediums, welches das zweite Milieu ist, als ein Eluierungsmittel.
28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper ein monoklonaler Antikörper 25 ist.
29. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß das erste Milieu ein flüssiges Medium mit einem ersten pH und das zweite Milieu ein flüssiges Medium mit einem zweiten, vom ersten pH unterschiedlichen pH ist. 30
30. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte erste pH und der genannte zweite pH innerhalb des Bereiches von 4 bis 10,5 liegen.
31. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß das zweite Milieu eine Lösung ist, die ein 35 chaotropes Mittel enthält.
32. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß das chaotrope Mittel aus der aus Harnstoff, Guanidin, KSCN, KBr, KI und MgC^ bestehenden Gruppe ausgewählt ist 40 Hiezu 1 Blatt Zeichnung 45 -10-