CH672028A5

CH672028A5 -

Info

Publication number: CH672028A5
Application number: CH6699/83A
Authority: CH
Inventors: Richard M Bartholomew; Daniel E Beidler; Gary S David
Original assignee: Hybritech Inc
Priority date: 1982-04-12
Filing date: 1983-04-12
Publication date: 1989-10-13
Also published as: FI88403C; AU7256987A; AT393386B; IT1219779B; FI834530A; GB8332644D0; IT8320550A0; ES521371A0; ES528001A0; ES8506902A1; ES8404858A1; WO1983003678A1; AU622099B2; ATA901983A; FI834530A0; GB2128630B; ES8706964A1; EP0105359A1; CA1209907A; FI88403B

Description

BESCHREIBUNG

Diese Erfindung bezieht sich auf die Reinigung von Antigenen und Antikörpern durch Affinitätschromatographie. Sie bezieht sie sich auch auf monoklonale Antikörper.

Die Reinigung eines Antigens durch Affinitätschromatographie unter Verwendung von durch die Reaktion eines Wirtstiers auf ein Antigen hergestellten Antikörpern, welche an einen festen Träger gebunden sind, als Immunoadsorbens, ist ein Verfahren, welches schon seit vielen Jahren verwendet wird. Dieses Verfahren hat jedoch mindestens zwei ernste Mängel, welche seine Nützlichkeit beeinträchtigen. Wenn Antikörper von hoher Affinität zur Extraktion des Antigens aus der Probe verwendet werden, sind nämlich rauhe Bedingungen erforderlich, um das Antigen von den Antikörpern zu dissoziieren, nachdem die nichtabsorbierten Verunreinigungen vom Körper des Immunoadsorbens ausgewaschen worden sind. Die dazu erforderlichen Bedingungen, z.B. ,ein pH von weniger als 3 oder grösser als 11, oder ein konzentriertes chaotropes Mittel, wie eine Guanidin-oder Harnstofflösung, kann das Antigen und die Antikörper denaturieren, die immunochemischen und/oder biologischen Eigenschaften des Antigens vermindern wenn nicht zerstören und die nützliche Lebenszeit des Immunoadsorbens kürzen.

Zur Vermeidung der Probleme, welche im Zusammenhang mit der Verwendung von Antikörpern, mit einer hohen Affinität zum Antigen auftreten, ist es übliche Praxis geworden, dass immobilisierte Antikörper von niedriger Affinität als Immunoadsorbens verwendet werden. Die Verwendung dieser Antikörper erlaubt die Elution des Antigens vom Körper des Immunoadsorbens unter Verwendung von milden, nicht denaturierenden Bedingungen. Der erforderliche Schritt des Waschens der Säule, um Unreinheiten vom gebundenen Antigen zu eluieren, eluiert jedoch auch einige der Antigene so stark, dass die Wirksamkeit der Trennung stark vermindert wird. Zusätzlich können Antikörper mit niedriger Affinität nicht wirksam an Antigene gebunden werden, welche in einem Medium in verhältnismässig kleinen Konzentrationen, d.h. weniger als etwa 10 mg/ml vorhanden sind.

Mit der Einführung der Hybridom-Technologie ist es möglich geworden, monoklonale Antikörper zu erhalten, die, wie später vorgeschlagen wurde, als Immunoadsorbenzien in der Affinitätsreinigung von Antigenen, gegen welche sie gebildet wurden, zu verwenden. Siehe z.B. Stenman et al, J. Immunological Meth-ods, 46, 337 (1981); Stallcup et al, J. Immunology, 127, 924 (1981) und Katzman et al, Proc. Nati. Acad. Sei. USA, 78, 162 (1981). Diese Berichte schlagen vor, dass die verwendeten monoklonalen Antikörper am besten nur eine bescheidene Affinität für die Antigene aufweisen, was ihre Desorption von Immunoadsorbens unter milden Bedingungen erlaubt. So legt die bisherige Erfahrung nahe, dass die Verwendung von monoklonalen Antikörpern als Immunoadsorbenzien in ihren Eigenschaften parallel zu denjenigen der «polyklonalen» Antikörper der konventionellen Antiseren laufen sollten, d.h. dass die Verwendung von Antikörpern mit niedriger Affinität eine Elution des Antigens unter milden Bedingungen erlaubt, während die Verwendung eines Antikörpers mit hoher Affinität rauhe Bedingungen erfordert, um das Antigen vom Antikörper zu dissoziieren.

Es ist bekannt, dass Hybridome durch zufällige Fusion von B-Lymphocyten mit Myelomzellen in Gegenwart eines fusionie-rungsfördernden Mittels gebildet werden. Jedes Hybridom, der grossen Population von Hybridomen, welche durch eine Fusion erzeugt werden kann, scheidet verschiedene monoklonale Antikörper aus. Typischerweise wird die Population der Hybridome einem Screening unterworfen, um für weiteres Klonen diejenigen auszuwählen, welche einen Antikörper mit der gewünschten antigenischen Spezifität ausscheiden, um nützliche Mengen des Antikörpers zu erhalten. Wir haben gefunden, dass unter der Population von Hybridomen, welche Antikörper gegen ein spezifisches Antigen ausscheiden und der Subpopulation von solchen, welche Antikörper, welche eine hohe Affinität für das Antigen ausscheiden, eine sehr viel kleinere Population vorhanden ist, welche Antikörper ausscheidet, welche eine hohe Affinität für das Antigen in einer ersten Umgebung hat, aber eine sehr viel kleinere Affinität in einer zweiten Umgebung hat. Keine der Umgebungen beeinträchtigt jedoch die immunochemischen oder biologischen Eigenschaften des Antigens oder des Antikörpers. Wir glauben, dass die Existenz dieser Antikörper in hochaffinen Antiseren unerkannt blieb, weil die Mehrheit der hochaffinen Antikörper in den Antiseren diejenigen sind, welche rauhe Bedingungen benötigen, um das Antigen von den Antikörpern abzutrennen und weil diese die immunochemischen Eigenschaften der Antiseren dominieren.

Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis, dass eine Population von Hybridomen, welche das Produkt von mehrfachen Fusionen sein kann, einem Screening unterworfen werden kann und diejenigen Hybridome, welche einen monoklonalen Antikörper mit einer hohen Affinität in einer ersten Umgebung und einer niederen Affinität in einer zweiten Umgebung produzieren, identifiziert werden können und mindestens eines der Hybridome geklont werden kann, um eine ausreichende Menge des produzierten Antikörpers zu erhalten, was seine Verwendung als hochaktives Immunoadsorbens für Affinitätschromatographie erlaubt.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind demzufolge die in den Ansprüchen 1,8, 11, 23 und 27 definierten Produkte bzw. Verfahren.

Antikörper mit einer hohen Affinität sind beispielsweise solche, deren Affinitätskonstante (Ka) > 109 beträgt und Antikörper mit einer niederen Affinität sind beispielsweise solche, deren Ka < 108 beträgt. Die Affinitätskonstante wird als Gleichgewichtskonstante (K) der folgende Reaktion definiert: Ab + Ap = AbAp (Ab = Antikörper; Ap = Hapten).

Die entsprechende Massenwirkungsgleichung lautet demnach K = [AbAp]/[Ab][Ap], wobei [Ab] die Konzentration der Bindungsstelle des Antikörpers und [Ap] die Konzentration des Haptens darstellt.

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Die Fig. 1 und 2 sind graphische Darstellungen von Daten, welche den Effekt von pH-Wertänderungen auf die Desorption von radiomarkiertem humanen Wachstumshormon, welches an vier verschiedene an einer festen Phase immobilisierten monoklonalen Antikörpern gebunden ist, wiedergeben.

Die erfindungsgemässe Reinigung eines Antigens umfasst die folgenden Schritte:

a) Auswählen eines Antikörpers, welcher eine hohe Affinität für ein Antigen in einer ersten Umgebung und eine niedere Affinität für das Antigen in einer zweiten Umgebung aufweist, wobei keine der Umgebungen wesentliche irreversible Änderungen in den gewünschten immunochemischen Eigenschaften des Antigens verursacht;

b) Immobilisieren des Antikörpers auf einem festen Träger;

c) Bindung des Antigens an den Antikörper in einer ersten Umgebung z.B. durch in Kontakt bringen des immobilisierten Antikörpers mit einer Probe, welche das unreine Antigen in der ersten Umgebung enthält;

d) Abtrennen der nichtgebundenen Verunreinigungen vom gebundenen Antigen; und e) Elution des Antigens in einer gereinigten Form vom immobilisierten Antikörper unter Verwendung eines Mediums, welches die zweite Umgebung ist, als Elutionsmittel.

Wie schon erwähnt, können erfindungsgemässe Antikörper, durch ein Screening von Antikörpern erhalten werden, die durch eine Population von Hybridomen produziert werden, welche durch Fusion von Myelom-Zellen mit B-Lymphocyten unter Verwendung von bekannten Methoden erhalten wurden. Die B-Lymphocyten sind typische Milzzellen, welche aus einem hyperimmunisierten Tier, welchem das Zielantigen vorher als Immunogen verabreicht wurde, erhalten wurden. Nach der Identifizierung der Hybridomen, welche monoklonale Antikörper, deren Spezifitäten gegen das gewünschte Antigen gerichtet sind, können sie einem weiteren Screening unterworfen werden, um diejenigen zu identifizieren, welche Antikörper produzieren, deren Affinitäten mit Umgebungsänderungen, welche das Antigen oder den Antikörper nicht beeinträchtigen, variieren. Beispielsweise sind Antigene üblicherweise stabil in einer Lösung mit einem pH-Bereich von 4 bis 10,5. Um einen pH-empfindlichen Antikörper für die Verwendung als Immunoadsorbens zu erhalten, wird die Population des monoklonalen Antikörpers einem Screening unterworfen, um diejenigen zu identifizieren, welche eine hohe Affinität für das Antigen bei einem pH innerhalb des Bereiches, z.B. ein Ka von etwa 109 und vorzugsweise < IO10 und eine niedere Affinität bei einem zweiten pH, beispielsweise Ka von etwa 108 und vorzugsweise weniger als 106 im gleichen Bereich aufweisen. Diese Art von Screening kann durchgeführt werden, indem die Antikörper auf einem festen Träger immobilisiert werden und nach der Bindung des Antigens das Ausmass der Desorption, welche durch die verschiedenen pH-Stufen verursacht wird, gemessen wird, wobei die Messung beispielsweise durch Verwendung von radiomarkiertem Antigen und Zählung der Strahlung, welche durch die feste Phase und/oder dem Überstand emittiert wird, erfolgt. Ein ähnliches Screening kann durchgeführt werden, um die Antikörper, welche auf andere Arten des Umgebungswechsels reagieren, zu identifizieren.

Es wird gegenwärtig bevorzugt, monoklonale Antikörper einzusetzen, deren Bindungsfähigkeit an Antigen auf Wechsel des pH empfindlich ist. Im Hinblick darauf wird der Antikörper so ausgewählt, dass er eine hohe Affinität bei einem pH und eine tiefe Affinität bei einem zweiten pH, welcher höher oder tiefer als der erste pH ist, aufweist. Üblicherweise wird der erste pH bei oder in der Nähe von pH 7 sein, obwohl dies nicht notwendig ist. Es fällt jedoch auch unter den Bereich der Erfindung, Antikörper auszuwählen, welche auf eine andere Art von Wechsel der Umgebungsbedingungen reagieren. Z.B. kann ein monoklonaler Antikörper ausgewählt werden, welcher einem

Wechsel von hoher zu niedriger Affinität in Gegenwart einer Chaotropen-Lösung als Elutionsmedium unterworfen ist. Unter passenden Chaotropen sind KBr, KI, KSCN, Guanidin, Harnstoff und MgCl2. Somit können solche monoklonale Antikörper ausgewählt werden, die eine Ka > 109 in Gegenwart eines Chaotropen, jedoch eine Ka von < 108, in Gegenwart des besonderen Chaotropen aufweisen, dessen Konzentration das in Frage stehende Antigen nicht beeinträchtigt. Die Auswahl auf Empfindlichkeit auf Chaotrope kann ebenfalls in Puffern bei einem spezifischen pH durchgeführt werden. Alternativ können Antikörper ausgewählt werden, welche auf Wechsel im pH empfindlich sind, in Gegenwart einer Konstanten Konzentration des Chaotropen.

Monoklonale Antikörper, deren Affinität für ein Antigen ausreichend erniedrigt werden kann durch andere als pH- oder Konzentrationsänderungen des Chaotropen, können ebenfalls ausgewählt werden. Unter den Arten der Medienempfindlichkeit, für welche Antikörper einem Screening unterworfen werden können, um diejenigen, dessen Antigenbindungsfähigkeit durch einen Wechsel im Elutionsmedium beeinträchtigt werden, umfassen Borat-Empfindlichkeit, Methylmannosid-Empfind-lichkeit und Empfindlichkeit auf nichionische oder ionische De-tergenzien und Reagenzien, welche auf spezifische Aminosäuren, wie Tryptophan und Tyrosin wirken.

Für die Verwendung bei der Affinitätschromatographie kann ein ausgewählter monoklarer Antikörper an jeden der festen Träger, welche üblicherweise in der Affinitätschromatographie verwendet werden, gebunden werden. Diese umfassen Se-pharose, Polystyrol, Glas, Nylon, Cellulose, Polymethylmeth-acrylat, Silicagel, Polyacrylamid und Nitrocellulose.

Die folgenden Beispiele illustrieren die Anwendung der vorliegenden Erfindung, um monoklonale Antikörper zu erhalten, deren Bindungsaffinität für ein Antigen von hoher Affinität in einer ersten Umgebung zu niedriger Affinität in einer zweiten Umgebung variiert, wobei keine der Umgebungen Schaden an den immunochemischen Eigenschaften des Antigens und ihrer Nützlichkeit als Immunoadsorbenzien für Affinitätschromatographie verursacht.

Beispiel 1

Milzzellen, genommen von Balb/c-Mäusen, welche mit humanem Wachstumshormon (HGH) hyperimmunisiert wurden, wurden unter Verwendung von Polyethylenglykol mit Mäuse-myelom-Zellen (NS-1 oder SP-2/0 Linien) verflüssigt. Die erhaltenen Hybridome werden geklont und einem Screening unterworfen, um diejenigen sekretierenden Antikörper zu bestimmen, welche für HGH spezifisch sind, durch einen Radioimmu-noassay unter Verwendung von l25I-HGH und Pferde-Antimaus IgG auf Sepharose-Betten. Die Hybridome, welche Anti-HGH produzieren, wurden weiter einem Screening unterworfen, um diejenigen zu identifizieren, deren erzeugte Antikörper eine Ka von mindestens etwa 109 bei pH 7 aufweisen. Diese wurden einem weiteren Screening unterworfen, um diejenigen zu identifizieren, deren Affinitäten auf Wechsel der pH über einen Bereich von 4 bis 10,5 empfindlich sind. Die Daten, welche die pH-Empfindlichkeit von 4 monoklonalen Antikörpern wiedergeben, sind in den Tabellen 1 und 2 und in Fig. 1 und 2 dargestellt. Die einzelnen Antikörper sind durch die Buchstaben A, B, C bzw. D bezeichnet. Diese Daten wurden in folgender Weise erhalten: HGH, welches mit 125I markiert wurde, wurde bei pH 7 an jeden Antikörper, welcher vorher aus Polystyrolkugeln immobilisiert wurde, gebunden. Jede Kugel enthielt etwa 1 mg Antigen und 10 000 cpm. Je drei wurden in 1 ml PBS in 10% Pferdeserum für 4 h beim angegebenen pH inkubiert. Die Einstellungen der pH wurden durchgeführt durch Zugabe entweder eines Natriumcarbonatpuffers (10% in Pferdeserum) um pH 7 zu erhalten oder durch Zugabe von Natriumacetatkupfer (10% in Pferdeserum) um pH 7 zu erhalten. Nach der Inkubation

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wurden 800 (il des Überstandes gezählt. Die Auszählung des de-sorbierten Antigens bei jedem pH wurde in den Tabellen 1 und 2 aufgezeichnet und in den Figuren 1 und 2 dargestellt.

TABELLE 1

Impulse/min (cpm) X 10~3

von desorbiertem HGH*

pH

Antikörper A

Antikörper B

3,0

4,810

2,442

3,5

4,625

0,803

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4,156

0,357

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1,608

0,248

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0,449

0,206

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0,176

0,162

6,0

0,220

0,176

6,5 '

0,336

0,167

7,0

0,328

0,162

* Mittelwert der drei Überstände

TABELLE 2

Impulse/min (cpm) x 10-3

von desorbiertem HGH*

pH

Antikörper C

Antikörper D

7,0

0,236

0,187

7,5

0,208

0,336

8,0

0,240

0,321

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0,666

0,277

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0,401

0,237

9,5

1,038

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3,030

0,364

10,5

4,809

0,584

11,0

5,508

3,460

* Mittelwert der drei Überstände

Die Daten in Tabelle 1, insbesondere wie in Fig. 1 aufgezeichnet, zeigen, dass die Bindung von HGH durch Antikörper B besonders unempfindlich gegen pH-Änderungen über dem Bereich von pH 3,5-7 war, jedoch dass die Bindung von HGH an Antikörper A signifikant abnahm im Bereich von pH 4,5-4,0, was angibt, dass der Antikörper das Antigen bei einem pH von 4,0 nicht mehr wirksam binden würde.

Die Daten in Tabelle 2 und Fig. 2 auf der anderen Seite zeigen, dass die Bindung von HGH durch Antikörper D im wesentlichen unempfindlich war gegen pH-Änderungen über dem Bereich pH 7,0-10,5 während die Bindung von HGH durch Antikörper C signifikant abnahm im Bereich von pH 9,5-10,5, was angibt, dass der Antikörper das Antigen bei einem pH von 10,5 nicht mehr wirksam binden würde.

Die eluierten Überstände von Antikörpern A und C bei pH 4,0 und 10,5 wurden zu PBS-Puffer (10% in Pferdeserum) zugegeben und auf pH 7 eingestellt und die Proben wurden ge-poolt. Die gepoolten Proben wurden mit Polystyrolkugeln, welche mit den Antikörpern A, B, C und D und zwei weiteren monoklonalen Antikörpern gegen HGH beschichtet. Jede dieser Antikörper erkannte verschiedene Bereiche des HGH-Moleküls. Die Immunoreaktivität des eluierten Antigens bei entweder pH 4 oder pH 10,5 mit fünf oder sechs Antikörpern, welche die Antikörper A, B, C und D einschliessen, war nicht beeinträchtigt und war nur schwach vermindert gegenüber dem sechsten. Diese Daten zeigen, dass die Elution des Antigens bei entweder pH 4,0 oder pH 10,5 seine immunochemischen Eigenschaften nicht nachteilig beeinflusste.

Beispiel 2

Ein hochaffiner monoklonaler Antikörper (Ka = 5 x 1010) gegen Prostansäurephosphatase (PAP), einem aussergewöhn-lich labilen Enzym, erhalten durch Screening von Hybridomen, welche Anti-PAP monoklonale Antikörper erzeugen, welche von Fusionen von Milzzellen aus einer Balb/c-Maus, welche gemäss Beispiel 1 mit PAP und Mäuse-Myelomzellen hyperimmu-nisiert wurde, zeigte eine Antigenbindungsempfindlichkeit im pH-Bereich von 6,0-4,9. Der Antikörper war an Sepharosekü-gelchen gebunden, wobei die CNBr-Technik bei einer Konzentration von 1 mg Antikörper pro 1 ml gepackten Sepharosekü-gelchen verwendet wurde und zur Reinigung von PAP von se-minalen Flüssigkeiten wie folgt verwendet wurde. Eine 170 p.1 Probe der seminalen Flüssigkeit, welche 0,912 mg/ml PAP (bestimmt durch einen immunoradiometrischen Versuch) enthielt, wurde unter Verwendung eines TANDEM-(Warenzeichen) As-say-Kits für PAP (Hybritech, Inc., San Diego, Ca.) auf 5 ml mit Acetatpuffer (10% Natriumacetat in Pferdeserum enthaltend 0,15 M NaCl) verdünnt, um eine Lösung von 31 |xg PAP/ml einer Lösung mit einem pH von 6 zu erhalten.

Die PAP-Lösung wurde durch eine Säule, enthaltend 1,5 ml Sepharosekügelchen mit einer Durchlaufrate von 1 ml/h durch-fliessengelassen und die Säule wurde mit 7,5 ml des Ausgangspuffers gewaschen. Immunometrische Versuche des Elutions-mittels (5 ml der Probe und 7,4 ml der Waschflüssigkeit) zeigten, dass 99,3% des PAP in der Säule adsorbiert war. Das PAP wurde mit 0,1 M Acetatpuffer, pH 4, enthaltend 0,15 M NaCl eluiert. Drei 1 ml Fraktionen wurden gesammelt und über Nacht gegen 50 mM Citrat bei pH 6,0 dialysiert. Der PAP-Ge-halt der gepoolten und dialysierten Fraktionen wurde durch den immuno-radiometrischen Assay als 54% des auf die Säule gegebenen bestimmt. Die Reinheit des dialysierten Materials wurde durch Natriumdodecylsulfat und Ornstein-Davis PAGE bestimmt. Es wurde ein einziges Band in allen Fällen beobachtet. Es wurden Messungen der enzymatischen Aktivität durchgeführt und gezeigt, dass die gereinigte PAP ihre enzymatische Aktivität beibehielt.

Das Zurückhalten von 46% des PAP auf der Säule ist wahrscheinlich mindestens teilweise das Resultat einer nichtspezifischen Bindung und der Verwendung eines grossen Überschusses von Antikörpern, welcher den Antigen-«Trail» von der Säule verursachte. Das erstere kann durch Vorbehandlung der Säule mit der Probe unter Elutions-Bedingungen und anschliessendes ausgedehntes Auswaschen, um das eluierbare Material zu entfernen, reduziert werden. Das letztere kann durch Herabsetzung der Konzentration des gebundenen Antikörpers reduziert werden. Schliesslich ist Sepharose nicht die ideale Matrix für Affinitätschromatographie wegen der Heterogenität der Po-rengrösse, was die Diffusion und sterische Probleme zur Folge hat.

Beispiel 3

Die Reinigung des mit Chlamydia vereinigten Antigens ist kompliziert, da es schwierig zu solubilisieren ist. Es kann jedoch in verschiedenen Detergenzien solubilisiert werden. Hybridome, welche monoklonale Antikörper gegen chlamodyale Antigene erzeugen, die durch Fusion von Milzzellen von hyperim-munisierten Balb/c-Mäusen mit Mäuse-Myelom-Zellen gemäss Beispiel 1 erhalten wurden, wurden einem Screening auf Empfindlichkeit auf Detergenzkonzentration unterworfen. Die Wirkung der Detergenzien auf die Bindung von 4 solchen Antikörpern wird in Tabelle 3 dargestellt. Die verwendeten Detergenzien waren Deoxychlolat (DOC), Natriumdodecylsulfat (SDS)

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und Octylphenoxypolyethoxyethanol [im Handel als Nonidet P-40 (NP 40)]. Ehrlich-Ascites wurden als Kontrolle verwendet.

Die Daten in Tabelle 3 wurden erhalten indem das Antigen auf Mikrotiterplatten aufgetragen und mit einer Lösung von je- s dem der Antikörper in einem Puffer bei der Konzentration des Detergenz wie in der Tabelle angegeben inkubiert wurde. Nach der Inkubation wurde die Platte gewaschen und mit polyklona-len Schaf-Antimaus-Antikörpern, welche mit Meerrettich-Per-oxidase (HRP) markiert waren, umgesetzt. Die Inkubationszeit io betrug 1 h bei Zimmertemperatur. Die Platte wurde wieder gewaschen und mit einer Lösung von Ortophenylendiamin (ODP) einem Chromagensubstrat für HRP umgesetzt. Die Adsorption in jeder Vertiefung wurde bei 490 nm gemessen und in Tabelle 3 dargestellt. is

TABELLE 3

Wirkungen von Detergenzien auf die Bindung durch Anti-chlamydia-monoklonalen Antikörpern

Antikörper- O.D.1 O.D.1 O.D.1 O.D.1 O.D.1

reaktionsmischung Ehrlich- Antiköper Antikörper Antikörper Antikörper

Ascites 1 2 3 4

wässeriger Puffer 0,00 1,06 1,15 1,02 0,95

2% DOC 0,02 1,10 0,70 0,11 0,25

2% NP-40 0,00 0,20 0,11 0,80 0,06

0,5% DOC 0,03 1,37 1,36 1,22 1,25

0,1% SDS 0,05 1,17 1,20 1,30 1,05

1. O.D. bei 490 nm wurde als Mittel von 2 Proben mit einer Standardabweichung von 0,05 erhalten.

2. Wässriger Püffer ist Autopow-Gewebekulturmediüm mit 8% Pferdeserum, 2% fetalem Kalbssèrum. Alle Detergenzien, welche im Experiment verwendet wurden, waren mit diesem Puffer verdünnt.

3. Verwendet als Kontrolle.

Diese Daten zeigen den Effekt von verschiedenen Detergenzien und Detergenz-Konzentrationen auf die Bindung von ausgewählten monoklonalen Antikörpern. Antikörper Nr. 1 und 2 haben eine verhältnismässig hohe Affinität für Chlamydia in wässrigem Puffer, was durch keines der Detergenzien mit Ausnahme von 2% NP-40 beeinträchtigt wurde. Antikörper 3 hatte eine niedere Affinität in 2% DOC; doch wurde seine hohe Affinität in anderen Medien zurückerhalten. Antikörper 4 hatte eine niedere Affinität in 2% DOC und 2% NP-40 aber eine hohe Affinität in anderen Medien.

In anderen Experimenten wurden die mit Antigen beschichteten Microtiterplatten zuerst mit Detergenz in den Konzentrationen, wie in Tabelle 1 gezeigt, während 1 h inkubiert und dann gewaschen. Anschliessend wurden die Antichlamydia-Antikör-per nach dem Waschen in den Vertiefungen inkubiert danach mit dem HRP-markierten Antimaus-Antikörper inkubiert. Nach dem Waschen folgte dieser Inkubation eine Inkubation mit dem Enzymsubstrat. Die optischen Dichten in jedem Behälter wurden mit Behältern verglichen, welche mit der wässrigen Pufferlösung vorbehandelt wurden, weisen darauf hin, dass das Antigen durch die Detergenzien nicht beeinträchtigt wurde. Demzufolge konnten die monoklonalen Antikörper für die Affinitätsreinigung von Chlamydia-Antigen verwendet werden, indem das Antigen in einem für die Antikörper kompatiblen Reagenz gelöst und einer Passage durch eine Säule mit immobilisiertem Antikörper unterworfen wurde, um das Antigen zu binden. Anschliessend wurde das Antigen durch eine Elution der Säule mit einer anderen Detergenzzusammensetzung, in welcher der Antikörper nicht an das Antigen gebunden wird, freigesetzt.

Vom vorhergehenden wird für den Fachmann klar, dass eine wirkungsvolle Reinigung eines Antigens durch das Mittel 40 der Affinitätschromatographie unter Verwendung eines ausgewählten monoklonalen Antikörpers als Immunoadsorbens unter Bedingungen durchgeführt werden kann, welche das Antigen nicht denaturieren. Spezifische Anwendungen dieses Verfahrens umfassen seine Verwendung zur Reinigung von Antigenen in 45 Proben, worin sie natürlicherweise vorkommen und zur Reinigung von radiomarkiertem Antigen, welches durch Lagerung entartet wurde. Eine besondere Anwendung ist die Reinigung von Proteinprodukten, welche durch die rekombinierende DNA-Technologie erhalten wurden. Unter solchen Produkten so kann das Insulin und das humane Wachstumshormon erwähnt werden. Die Isolierung von komplexen Proteinen aus Serum, z.B. Faktor V und Faktor VIII ist möglich unter Verwendung des Verfahrens dieser Erfindung.

Es ist ebenfalls möglich das Verfahren umzukehren und den 55 monoklonalen Antikörper unter Verwendung eines immobilisierten Antigens als Immunoadsorbens zu reinigen. Z.B. kann ein radiomarkierter Antikörper, welcher in einem immunora-diometrischen Versuch verwendet wurde, und in Folge von Lagerung entartet wurde, auf diese Weise gereinigt werden. Der 60 monoklonale Antikörper kann ebenfalls von Ascites-Flüssigkeit oder Kulturmedium unter Verwendung des immobilisierten Antigens als Immunoadsorbens gewonnen werden.

Trotzdem wir nicht an eine besondere Theorie gebunden sein wollen, ist der Wechsel der Ka mit Wechseln im pH wahr-65 scheinlich die Wirkung der Protonierung von Histidinresten oder der Deprotonierung von Lysin oder möglicherweise Tyrosin- oder Arginin-Resten im Antikörper oder im Antigen oder in beiden, was die Fähigkeit des Antigens und des Anti

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körpers miteinander einander Komplex einzugehen ändert. Spezifische beeinträchtigte Reste können oder können nicht in den Bindungsgebieten des Moleküls liegen.

Basierend auf der Entdeckung, dass die Antikörper, welche durch eine Immunreaktion eines Tieres auf ein Antigen erzeugt s wurden, Antikörper enthalten, welche in ihrer Empfindlichkeit auf Wechsel in der Umgebung veränderlich sind, fällt es unter den Bereich unserer Erfindung, polyklonale Antiseren zu fraktionieren, um eine Mischung von Antikörpern, welche sich in ähnlicher Weise wie die erfindungsgemässen umgebungsemp- io findlichen monoklonalen Antikörper verhalten, zu erhalten.

Diese Fraktionierung kann durchgeführt werden durch Inkon-taktbringen des immobilisierten Antigens mit einem Überschuss des Antiserums in einer ersten gewünschten Umgebungsbedingung, gefolgt durch Waschen des Immunoadsorbens, um das 15 ungebundene Material zu entfernen. Diesem Schritt folgt das Inkontaktbringen des Immunoadsorbens mit einem Medium, welches die zweite Umgebung darstellt, um die Antikörper, welche unter den ersten Umgebungsbedingungen nicht eluiert wurden, zu eluieren. Wünscht man z.B. Antikörper zu erhalten, 20 welche eine hohe Affinität bei pH 7, und eine niedere Affinität bei pH 4 aufweisen, wird das immobilisierte Antigen mit einem Überschuss des Antiserums bei pH 7 in Kontakt gebracht, und das immobilisierte Antigen wird mit einem Medium bei pH 7 gewaschen, um die Antikörper, welche eine niedere Affinität 25 bei pH 7 aufweisen, zu eluieren. Das Immunoadsorbens wird dann bei pH 4 eluiert, um die Antikörper, welche eine niedere Affinität bei pH 4 aufweisen, zu eluieren. Das Elutionsmittel wird die Fraktionen der Antikörper enthalten, deren Bindung mit dem Antigen empfindlich auf Wechsel im pH über dem 30 pH-Bereich 7-4 ist. Ähnliche Fraktionierungen können mit Harnstoff und anderen Inhibitoren der Antigen-Antikörperbin-dung durchgeführt werden. Die resultierenden Populationen von Antikörpern können weitere Unterfrâktionierungen erfordern, welche eher wegen einer intrinsischen niederen Affinität 35 eluiert werden als durch einen Ka-«Schalter».

Erfindungsgemäss können ebenfalls Hybride monoklonaler Antikörper verwendet werden, welche zweifache Spezifitäten für die Affinitätsreinigung aufweisen. Ein Verfahren für die Herstellung von hybriden monoklonalen Antikörper ist in der 40 USA-Anmeldung von Martinis et al, «Antibodies Having Dual

Specificities, Their Préparation And Uses Therefor», Serial No. 367-781, auf welche ausdrücklich Bezug genommen wird.

Der hybride monoklonale Antikörper hat zwei Spezifitäten, welche gegen verschiedene Antigene gerichtet sein können. Für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung wird der hybride Antikörper so ausgewählt, dass er pH- oder andere Umgebungsempfindlichkeiten in der Spezifität für das Antigen, für welches er als Immunoadsorbens bei der Affinitätschromatographie verwendet werden soll, aufweist. Die andere Spezifität, welche das Hybrid zeigt, ist so ausgewählt, dass es eine hohe Affinität gegen ein zweites Antigen, welches an einen festen Träger gebunden ist, hat. Wenn der hybride Antikörper auf einen festen Träger gegeben wird, wird er durch das zweite Antigen an den Träger gebunden. Natürlich braucht die Affinität des Hybrids für das zweite Antigen unter den Umgebungsbedingungen, welche eine Elution des ersten, oder Zielantigen erlauben, nicht wesentlich niederer zu sein. Vorzugsweise ist die Bindung des zweiten Antigens zum Antikörper auf eine verschiedene Umgebungsbedingung empfindlich und nicht diejenige, welche die Elution des Zielantigens vom Immunoadsorbens erlaubt. Z.B. kann der hybride Antikörper so ausgewählt sein, dass die Affinität für das Zielantigen durch eine Erniedrigung des pH reduziert wird und die Affinität für das zweite Antigen durch eine Erhöhung des pH reduziert wird. Dies erlaubte, dass der hybride monoklonale Antikörper leicht von einem festen Träger desorbiert werden kann, falls dies bei einer Kontamination des Trägers durch Verunreinigungen oder aus anderen, seine Nützlichkeit beeinträchtigenden Gründen erwünscht ist.

Die erfindungsgemässen umgebungsempfindlichen Antikörper können ebenfalls zur Lagerung von Antigenen in einer festen Phase verwendet werden, welche in Lösung instabil sind. Z.B. kann ein radiomarkiertes Antigen zur Lagerung an einen immobilisierten Antikörper gebunden werden und wenn nötig desorbiert werden. Der Desorption kann ein Waschen des Immunoadsorbens vorausgehen, um die Entartungsprodukte, welche sich während der Lagerung gebildet haben, zu entfernen. Der umgekehrte Prozess ist ebenfalls möglich. D.h. das Antigen kann verwendet werden, um unstabile Antikörper in einer festen Phase zu lagern. Z.B. kann ein radiomarkierter Antikörper der in einem Radioassay verwendet wird, als Antigen-Antikör-per-Komplex gelagert und nötigenfalls desorbiert werden.

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1 Blatt Zeichnungen

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PATENTANSPRÜCHE

1. Monoklonaler Antikörper, dadurch gekennzeichnet, dass er für das Antigen, gegen welches er gebildet wurde, in einer ersten Umgebung eine hohe Affinität und für das gleiche Antigen in einer zweiten Umgebung eine niedere Affinität besitzt, und keine der Umgebungen die immunochemischen Eigenschaften des Antigens oder des Antikörpers wesentlich irreversibel ändert.
2. Monoklonaler Antikörper gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Affinitätskonstante für den Antikörper zum Antigen in der ersten Umgebung > 109 und die Affinitätskonstante für den Antikörper zum Antigen in der zweiten Umgebung < 108 ist.
3. Monoklonaler Antikörper gemäss Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Affinitätskonstante in der ersten Umgebung > IO10 ist und die Affinitätskonstante in der zweiten Umgebung ^ 106 ist.
4. Monoklonaler Antikörper gemäss Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Umgebung ein flüssiges Medium mit einem ersten pH-Wert ist und die zweite Umgebung ein flüssiges Medium mit einem zweiten pH-Wert ist.
5. Monoklonaler Antikörper gemäss Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert der ersten Umgebung und der pH-Wert der zweiten Umgebung im Bereich von 4 bis 10,5 liegt.
6. Monoklonaler Antikörper gemäss den Ansprüchen 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Umgebung eine Lösung ist, die ein chaotropes Mittel enthält.
7. Monoklonaler Antikörper gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das chaotrope Mittel aus der Gruppe Harnstoff, Guanidin, KSCN, KBr, KI und MgCh ausgewählt ist.
8. Hybrider monoklonaler Antikörper mit zweifacher Spezifität, dadurch gekennzeichnet, dass eine Spezifität gegen ein erstes Antigen und die zweite Spezifität gegen ein zweites Antigen gerichtet ist, wobei die gegen das erste Antigen gerichtete Spezifität eine hohe Affinität in einer ersten Umgebung und eine niedere Affinität in einer zweiten Umgebung darstellt, wobei keine der Umgebungen die immunochemischen Eigenschaften des ersten Antigens oder des Antikörpers wesentlich irreversibel ändert und die gegen das zweite Antigen gerichtete Affinität des Hybriden Antikörpers in den genannten ersten und zweiten Umgebungen nicht wesentlich verschieden ist.
9. Hybrider monoklonaler Antikörper gemäss Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper eine hohe Affinität für das zweite Antigen in einer ersten Umgebung und eine niedere Affinität für das zweite Antigen in einer dritten Umgebung besitzt.
10. Hybrider monoklonaler Antikörper gemäss Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Umgebung ein flüssiges Medium mit einem ersten pH-Wert, die zweite Umgebung ein flüssiges Medium mit einem zweiten pH-Wert und die dritte Umgebung ein flüssiges Medium mit einem dritten pH-Wert ist.
11. Verfahren für die Reinigung eines Antigens, gekennzeichnet durch die Schritte:

a) Auswählen eines Antikörpers, welcher eine hohe Affinität für ein Antigen in einer ersten Umgebung und eine niedere Affinität in einer zweiten Umgebung hat, wobei keine der Umgebungen die immunochemischen oder biologischen Eigenschaften des Antigens oder Antikörpers wesentlich irreversibel ändern;

b) Immobilisierung des Antikörpers auf einem festen Träger;

c) Bindung des Antigens an den Antikörper in der ersten Umgebung;

d) Abtrennung der ungebundenen Verunreinigungen vom gebundenen Antigen; und e) Elution des Antigens in gereinigter Form vom immobilisierten Antikörper unter Verwendung eines Mediums, welches die zweite Umgebung ist, als Elutionsmittel.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Affinitätskonstante für den Antikörper an das Antigen in der ersten Umgebung > 109 ist und die Affinitätskonstante für den Antikörper an das Antigen in der zweiten Umgebung < 108 ist.
14. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Affinitätskonstante in der ersten Umgebung > IO10 ist und die Affinitätskonstante in der zweiten Umgebung < 106 ist.
15. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Umgebung ein flüssiges Medium mit einem ersten pH-Wert und die zweite Umgebung ein flüssiges Medium mit einem zweiten pH-Wert ist.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert der ersten Umgebung und der pH-Wert der zweiten Umgebung im Bereich von 4 bis 10,5 ist.
17. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Umgebung eine Lösung ist, welche ein chaotropes Mittel enthält.
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass das chaotrope Mittel aus der Gruppe Harnstoff, Guanidin, KSCN, KBr, KI und MgCl2 ausgewählt ist.
19. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der monoklonale Antikörper ein hybrider monoklonaler Antikörper ist, welcher eine erste Spezifität gegen ein zu reinigendes Antigen und eine zweite Spezifität mit einer hohen Affinität gegen ein zweites Antigen hat, wobei das zweite Antigen auf einem festen Träger immobilisiert ist und das Mittel darstellt, mit welchem der Antikörper am festen Träger immobilisiert wird und die Affinität des Antikörpers für das zweite Antigen nicht wesentlich erniedrigt wird in der zweiten Umgebung.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper eine niedere Affinität für das zweite Antigen in einer dritten Umgebung hat.
21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Umgebung ein flüssiges Medium ist mit einem ersten pH-Wert, die zweite Umgebung ein flüssiges Medium mit einem zweiten pH-Wert und die dritte Umgebung ein drittes Medium mit einem dritten pH-Wert ist.
22. Verfahren gemäss Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper eine Antiserumfraktion ist.
23. Verfahren zur Herstellung einer Fraktion von Antikörpern mit einer hohen Affinität für ein Antigen in einer ersten Umgebung und einer niederen Affinität für das gleiche Antigen in einer zweiten Umgebung, wobei keine der Umgebungen die immunochemischen Eigenschaften des Antigens oder des Antikörpers wesentlich irreversibel ändert, durch Fraktionierung von Serumantikörpern dadurch gekennzeichnet, dass das Antigen auf einem festen Träger immobilisiert wird, das Antigen mit den Serumantikörpern in der ersten Umgebung in Kontakt gebracht wird, um die Antikörper an das Antigen zu binden und eine Fraktion des Antikörpers eluiert wird, wobei als Elutionsmittel ein Medium verwendet wird, welches die zweite Umgebung darstellt und die eluierten Antikörper eine niedere Affinität für das Antigen in der zweiten Umgebung haben.
24. Verfahren gemäss Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Umgebung ein flüssiges Medium mit einem ersten pH-Wert ist und die zweite Umgebung ein flüssiges Medium mit einem zweiten pH-Wert ist.
25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert der ersten Umgebung und der pH-Wert der zweiten Umgebung im Bereich von 4 bis 10,5 liegt.
26. Verfahren gemäss Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Umgebung eine Lösung, welche ein chaotropes Mittel enthält, ist.
27. Verfahren für die Reinigung eines Antikörpers, welcher

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eine hohe Affinität für ein Antigen in einer ersten Umgebung und eine niedere Affinität für das Antigen in einer zweiten Umgebung hat, wobei keine der Umgebungen die immunochemischen Eigenschaften des Antigens oder des Antikörpers wesentlich irreversibel verändert, gekennzeichnet durch die Schritte:

a) Immobilisierung des Antigens auf einem festen Träger;

b) Bindung des Antikörpers an das Antigen in der ersten Umgebung;

c) Trennung der ungebundenen Verunreinigungen von gebundenen Antikörpern; und d) Elution des Antikörpers in gereinigter Form vom immobilisierten Antigen, wobei als Elutionsmittel ein Medium verwendet wird, welches die zweite Umgebung darstellt.
28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
29. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Umgebung ein flüssiges Medium mit einem ersten pH-Wert und die zweite Umgebung ein flüssiges Medium mit einem zweiten pH-Wert ist.
30. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass der erste pH-Wert und der genannte zweite pH-Wert im Bereich von 4 bis 10,5 liegt.
31. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Umgebung eine Lösung, welche ein chaotropes Mittel enthält, ist.
32. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass das chaotrope Mittel aus der Gruppe Harnstoff, Guanidin, KSCN, KBr, KI imd MgCh ausgewählt ist.