CH672028A5

CH672028A5 -

Info

Publication number: CH672028A5
Application number: CH6699/83A
Authority: CH
Inventors: Richard M Bartholomew; Daniel E Beidler; Gary S David
Original assignee: Hybritech Inc
Priority date: 1982-04-12
Filing date: 1983-04-12
Publication date: 1989-10-13
Also published as: AU7256987A; WO1983003678A1; ES8506902A1; DK192191A; ATA901983A; GB8332644D0; ES528001A0; FI88403C; GB2128630B; DK192191D0; AU622099B2; IT8320550A0; IT1219779B; GB2128630A; AT393386B; ES8404858A1; EP0105359A4; ES521371A0; ES8706964A1; FI834530A0

Description

BESCHREIBUNG DESCRIPTION

Diese Erfindung bezieht sich auf die Reinigung von Antigenen und Antikörpern durch Affinitätschromatographie. Sie bezieht sie sich auch auf monoklonale Antikörper. This invention relates to the purification of antigens and antibodies by affinity chromatography. It also refers to monoclonal antibodies.

Die Reinigung eines Antigens durch Affinitätschromatographie unter Verwendung von durch die Reaktion eines Wirtstiers auf ein Antigen hergestellten Antikörpern, welche an einen festen Träger gebunden sind, als Immunoadsorbens, ist ein Verfahren, welches schon seit vielen Jahren verwendet wird. Dieses Verfahren hat jedoch mindestens zwei ernste Mängel, welche seine Nützlichkeit beeinträchtigen. Wenn Antikörper von hoher Affinität zur Extraktion des Antigens aus der Probe verwendet werden, sind nämlich rauhe Bedingungen erforderlich, um das Antigen von den Antikörpern zu dissoziieren, nachdem die nichtabsorbierten Verunreinigungen vom Körper des Immunoadsorbens ausgewaschen worden sind. Die dazu erforderlichen Bedingungen, z.B. ,ein pH von weniger als 3 oder grösser als 11, oder ein konzentriertes chaotropes Mittel, wie eine Guanidin-oder Harnstofflösung, kann das Antigen und die Antikörper denaturieren, die immunochemischen und/oder biologischen Eigenschaften des Antigens vermindern wenn nicht zerstören und die nützliche Lebenszeit des Immunoadsorbens kürzen. Purification of an antigen by affinity chromatography using antibodies, which are bound to a solid support and are produced by the reaction of a host animal to an antigen, as an immunoadsorbent is a method which has been used for many years. However, this method has at least two serious shortcomings that affect its usefulness. Namely, when high affinity antibodies are used to extract the antigen from the sample, harsh conditions are required to dissociate the antigen from the antibodies after the non-absorbed contaminants have been washed out of the body of the immunoadsorbent. The conditions required for this, e.g. , a pH of less than 3 or greater than 11, or a concentrated chaotropic agent such as a guanidine or urea solution, can denature the antigen and the antibodies, reduce if not destroy the immunochemical and / or biological properties of the antigen and destroy the useful life of the immunoadsorbent.

Zur Vermeidung der Probleme, welche im Zusammenhang mit der Verwendung von Antikörpern, mit einer hohen Affinität zum Antigen auftreten, ist es übliche Praxis geworden, dass immobilisierte Antikörper von niedriger Affinität als Immunoadsorbens verwendet werden. Die Verwendung dieser Antikörper erlaubt die Elution des Antigens vom Körper des Immunoadsorbens unter Verwendung von milden, nicht denaturierenden Bedingungen. Der erforderliche Schritt des Waschens der Säule, um Unreinheiten vom gebundenen Antigen zu eluieren, eluiert jedoch auch einige der Antigene so stark, dass die Wirksamkeit der Trennung stark vermindert wird. Zusätzlich können Antikörper mit niedriger Affinität nicht wirksam an Antigene gebunden werden, welche in einem Medium in verhältnismässig kleinen Konzentrationen, d.h. weniger als etwa 10 mg/ml vorhanden sind. To avoid the problems associated with the use of antibodies with high affinity for the antigen, it has become common practice to use immobilized antibodies of low affinity as an immunoadsorbent. The use of these antibodies allows the antigen to be eluted from the body of the immunoadsorbent using mild, non-denaturing conditions. However, the step of washing the column required to elute impurities from the bound antigen also elutes some of the antigens so much that the effectiveness of the separation is greatly reduced. In addition, low affinity antibodies cannot be effectively bound to antigens that are present in a medium in relatively small concentrations, i.e. less than about 10 mg / ml is present.

Mit der Einführung der Hybridom-Technologie ist es möglich geworden, monoklonale Antikörper zu erhalten, die, wie später vorgeschlagen wurde, als Immunoadsorbenzien in der Affinitätsreinigung von Antigenen, gegen welche sie gebildet wurden, zu verwenden. Siehe z.B. Stenman et al, J. Immunological Meth-ods, 46, 337 (1981); Stallcup et al, J. Immunology, 127, 924 (1981) und Katzman et al, Proc. Nati. Acad. Sei. USA, 78, 162 (1981). Diese Berichte schlagen vor, dass die verwendeten monoklonalen Antikörper am besten nur eine bescheidene Affinität für die Antigene aufweisen, was ihre Desorption von Immunoadsorbens unter milden Bedingungen erlaubt. So legt die bisherige Erfahrung nahe, dass die Verwendung von monoklonalen Antikörpern als Immunoadsorbenzien in ihren Eigenschaften parallel zu denjenigen der «polyklonalen» Antikörper der konventionellen Antiseren laufen sollten, d.h. dass die Verwendung von Antikörpern mit niedriger Affinität eine Elution des Antigens unter milden Bedingungen erlaubt, während die Verwendung eines Antikörpers mit hoher Affinität rauhe Bedingungen erfordert, um das Antigen vom Antikörper zu dissoziieren. With the advent of hybridoma technology, it has become possible to obtain monoclonal antibodies which, as later suggested, can be used as immunoadsorbents in the affinity purification of antigens against which they have been formed. See e.g. Stenman et al, J. Immunological Meth-ods, 46, 337 (1981); Stallcup et al, J. Immunology, 127, 924 (1981) and Katzman et al, Proc. Nati. Acad. Be. USA, 78, 162 (1981). These reports suggest that the monoclonal antibodies used best have modest affinity for the antigens, allowing their desorption from immunoadsorbent under mild conditions. Previous experience suggests that the use of monoclonal antibodies as immunoadsorbents should run parallel to those of the "polyclonal" antibodies of conventional antisera, i.e. that the use of low affinity antibodies allows elution of the antigen under mild conditions, while the use of a high affinity antibody requires harsh conditions to dissociate the antigen from the antibody.

Es ist bekannt, dass Hybridome durch zufällige Fusion von B-Lymphocyten mit Myelomzellen in Gegenwart eines fusionie-rungsfördernden Mittels gebildet werden. Jedes Hybridom, der grossen Population von Hybridomen, welche durch eine Fusion erzeugt werden kann, scheidet verschiedene monoklonale Antikörper aus. Typischerweise wird die Population der Hybridome einem Screening unterworfen, um für weiteres Klonen diejenigen auszuwählen, welche einen Antikörper mit der gewünschten antigenischen Spezifität ausscheiden, um nützliche Mengen des Antikörpers zu erhalten. Wir haben gefunden, dass unter der Population von Hybridomen, welche Antikörper gegen ein spezifisches Antigen ausscheiden und der Subpopulation von solchen, welche Antikörper, welche eine hohe Affinität für das Antigen ausscheiden, eine sehr viel kleinere Population vorhanden ist, welche Antikörper ausscheidet, welche eine hohe Affinität für das Antigen in einer ersten Umgebung hat, aber eine sehr viel kleinere Affinität in einer zweiten Umgebung hat. Keine der Umgebungen beeinträchtigt jedoch die immunochemischen oder biologischen Eigenschaften des Antigens oder des Antikörpers. Wir glauben, dass die Existenz dieser Antikörper in hochaffinen Antiseren unerkannt blieb, weil die Mehrheit der hochaffinen Antikörper in den Antiseren diejenigen sind, welche rauhe Bedingungen benötigen, um das Antigen von den Antikörpern abzutrennen und weil diese die immunochemischen Eigenschaften der Antiseren dominieren. Hybridomas are known to be formed by random fusion of B lymphocytes with myeloma cells in the presence of a fusion-promoting agent. Each hybridoma, the large population of hybridomas that can be generated by fusion, secretes different monoclonal antibodies. Typically, the hybridoma population is screened to select for further cloning those that secrete an antibody with the desired antigenic specificity to obtain useful amounts of the antibody. We have found that among the population of hybridomas that secrete antibodies to a specific antigen and the subpopulation of those that antibodies that secrete high affinity for the antigen, there is a much smaller population that secrete antibodies that secrete one has high affinity for the antigen in a first environment, but has a much smaller affinity in a second environment. However, none of the environments interfere with the immunochemical or biological properties of the antigen or antibody. We believe that the existence of these antibodies in high affinity antisera remained undetected because the majority of the high affinity antibodies in the antisera are those that require harsh conditions to separate the antigen from the antibodies and because these dominate the immunochemical properties of the antisera.

Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis, dass eine Population von Hybridomen, welche das Produkt von mehrfachen Fusionen sein kann, einem Screening unterworfen werden kann und diejenigen Hybridome, welche einen monoklonalen Antikörper mit einer hohen Affinität in einer ersten Umgebung und einer niederen Affinität in einer zweiten Umgebung produzieren, identifiziert werden können und mindestens eines der Hybridome geklont werden kann, um eine ausreichende Menge des produzierten Antikörpers zu erhalten, was seine Verwendung als hochaktives Immunoadsorbens für Affinitätschromatographie erlaubt. The present invention is based on the recognition that a population of hybridomas, which can be the product of multiple fusions, can be screened and those hybridomas which have a monoclonal antibody with a high affinity in a first environment and a low affinity in one second environment, can be identified and at least one of the hybridomas can be cloned to obtain a sufficient amount of the antibody produced, which allows its use as a highly active immunoadsorbent for affinity chromatography.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind demzufolge die in den Ansprüchen 1,8, 11, 23 und 27 definierten Produkte bzw. Verfahren. The present invention accordingly relates to the products and processes defined in claims 1, 8, 11, 23 and 27.

Antikörper mit einer hohen Affinität sind beispielsweise solche, deren Affinitätskonstante (Ka) > 109 beträgt und Antikörper mit einer niederen Affinität sind beispielsweise solche, deren Ka < 108 beträgt. Die Affinitätskonstante wird als Gleichgewichtskonstante (K) der folgende Reaktion definiert: Ab + Ap = AbAp (Ab = Antikörper; Ap = Hapten). Antibodies with a high affinity are, for example, those whose affinity constant (Ka) is> 109 and antibodies with a low affinity are, for example, those whose Ka is <108. The affinity constant is defined as the equilibrium constant (K) of the following reaction: Ab + Ap = AbAp (Ab = antibody; Ap = hapten).

Die entsprechende Massenwirkungsgleichung lautet demnach K = [AbAp]/[Ab][Ap], wobei [Ab] die Konzentration der Bindungsstelle des Antikörpers und [Ap] die Konzentration des Haptens darstellt. The corresponding mass action equation is therefore K = [AbAp] / [Ab] [Ap], where [Ab] is the concentration of the binding site of the antibody and [Ap] is the concentration of hapten.

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

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40 40

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4 4th

Die Fig. 1 und 2 sind graphische Darstellungen von Daten, welche den Effekt von pH-Wertänderungen auf die Desorption von radiomarkiertem humanen Wachstumshormon, welches an vier verschiedene an einer festen Phase immobilisierten monoklonalen Antikörpern gebunden ist, wiedergeben. Figures 1 and 2 are graphs of data representing the effect of pH changes on the desorption of radiolabeled human growth hormone bound to four different monoclonal antibodies immobilized on a solid phase.

Die erfindungsgemässe Reinigung eines Antigens umfasst die folgenden Schritte: The purification of an antigen according to the invention comprises the following steps:

a) Auswählen eines Antikörpers, welcher eine hohe Affinität für ein Antigen in einer ersten Umgebung und eine niedere Affinität für das Antigen in einer zweiten Umgebung aufweist, wobei keine der Umgebungen wesentliche irreversible Änderungen in den gewünschten immunochemischen Eigenschaften des Antigens verursacht; a) selecting an antibody which has a high affinity for an antigen in a first environment and a low affinity for the antigen in a second environment, neither environment causing significant irreversible changes in the desired immunochemical properties of the antigen;

b) Immobilisieren des Antikörpers auf einem festen Träger; b) immobilizing the antibody on a solid support;

c) Bindung des Antigens an den Antikörper in einer ersten Umgebung z.B. durch in Kontakt bringen des immobilisierten Antikörpers mit einer Probe, welche das unreine Antigen in der ersten Umgebung enthält; c) binding of the antigen to the antibody in a first environment e.g. by contacting the immobilized antibody with a sample containing the impure antigen in the first environment;

d) Abtrennen der nichtgebundenen Verunreinigungen vom gebundenen Antigen; und e) Elution des Antigens in einer gereinigten Form vom immobilisierten Antikörper unter Verwendung eines Mediums, welches die zweite Umgebung ist, als Elutionsmittel. d) separating the unbound contaminants from the bound antigen; and e) elution of the antigen in a purified form from the immobilized antibody using a medium which is the second environment as the eluent.

Wie schon erwähnt, können erfindungsgemässe Antikörper, durch ein Screening von Antikörpern erhalten werden, die durch eine Population von Hybridomen produziert werden, welche durch Fusion von Myelom-Zellen mit B-Lymphocyten unter Verwendung von bekannten Methoden erhalten wurden. Die B-Lymphocyten sind typische Milzzellen, welche aus einem hyperimmunisierten Tier, welchem das Zielantigen vorher als Immunogen verabreicht wurde, erhalten wurden. Nach der Identifizierung der Hybridomen, welche monoklonale Antikörper, deren Spezifitäten gegen das gewünschte Antigen gerichtet sind, können sie einem weiteren Screening unterworfen werden, um diejenigen zu identifizieren, welche Antikörper produzieren, deren Affinitäten mit Umgebungsänderungen, welche das Antigen oder den Antikörper nicht beeinträchtigen, variieren. Beispielsweise sind Antigene üblicherweise stabil in einer Lösung mit einem pH-Bereich von 4 bis 10,5. Um einen pH-empfindlichen Antikörper für die Verwendung als Immunoadsorbens zu erhalten, wird die Population des monoklonalen Antikörpers einem Screening unterworfen, um diejenigen zu identifizieren, welche eine hohe Affinität für das Antigen bei einem pH innerhalb des Bereiches, z.B. ein Ka von etwa 109 und vorzugsweise < IO10 und eine niedere Affinität bei einem zweiten pH, beispielsweise Ka von etwa 108 und vorzugsweise weniger als 106 im gleichen Bereich aufweisen. Diese Art von Screening kann durchgeführt werden, indem die Antikörper auf einem festen Träger immobilisiert werden und nach der Bindung des Antigens das Ausmass der Desorption, welche durch die verschiedenen pH-Stufen verursacht wird, gemessen wird, wobei die Messung beispielsweise durch Verwendung von radiomarkiertem Antigen und Zählung der Strahlung, welche durch die feste Phase und/oder dem Überstand emittiert wird, erfolgt. Ein ähnliches Screening kann durchgeführt werden, um die Antikörper, welche auf andere Arten des Umgebungswechsels reagieren, zu identifizieren. As already mentioned, antibodies according to the invention can be obtained by screening antibodies which are produced by a population of hybridomas which have been obtained by fusing myeloma cells with B lymphocytes using known methods. The B-lymphocytes are typical spleen cells which were obtained from a hyperimmunized animal to which the target antigen had previously been administered as an immunogen. After identifying the hybridomas, which monoclonal antibodies, the specificities of which are directed against the desired antigen, they can be subjected to a further screening in order to identify those which produce antibodies, whose affinities with environmental changes which do not impair the antigen or the antibody, vary. For example, antigens are usually stable in a solution with a pH range of 4 to 10.5. To obtain a pH sensitive antibody for use as an immunoadsorbent, the population of the monoclonal antibody is screened to identify those who have a high affinity for the antigen at a pH within the range, e.g. have a Ka of about 109 and preferably <IO10 and a low affinity at a second pH, for example Ka of about 108 and preferably less than 106 in the same range. This type of screening can be carried out by immobilizing the antibodies on a solid support and after the binding of the antigen, the extent of the desorption, which is caused by the different pH levels, is measured, the measurement, for example, using radiolabeled antigen and counting the radiation which is emitted by the solid phase and / or the supernatant. Similar screening can be performed to identify the antibodies that respond to other types of environmental changes.

Es wird gegenwärtig bevorzugt, monoklonale Antikörper einzusetzen, deren Bindungsfähigkeit an Antigen auf Wechsel des pH empfindlich ist. Im Hinblick darauf wird der Antikörper so ausgewählt, dass er eine hohe Affinität bei einem pH und eine tiefe Affinität bei einem zweiten pH, welcher höher oder tiefer als der erste pH ist, aufweist. Üblicherweise wird der erste pH bei oder in der Nähe von pH 7 sein, obwohl dies nicht notwendig ist. Es fällt jedoch auch unter den Bereich der Erfindung, Antikörper auszuwählen, welche auf eine andere Art von Wechsel der Umgebungsbedingungen reagieren. Z.B. kann ein monoklonaler Antikörper ausgewählt werden, welcher einem It is currently preferred to use monoclonal antibodies whose binding ability to antigen is sensitive to changes in pH. In view of this, the antibody is selected to have a high affinity at one pH and a low affinity at a second pH that is higher or lower than the first pH. Usually the first pH will be at or near pH 7, although this is not necessary. However, it is also within the scope of the invention to select antibodies that respond to a different type of change in environmental conditions. E.g. a monoclonal antibody can be selected which

Wechsel von hoher zu niedriger Affinität in Gegenwart einer Chaotropen-Lösung als Elutionsmedium unterworfen ist. Unter passenden Chaotropen sind KBr, KI, KSCN, Guanidin, Harnstoff und MgCl2. Somit können solche monoklonale Antikörper ausgewählt werden, die eine Ka > 109 in Gegenwart eines Chaotropen, jedoch eine Ka von < 108, in Gegenwart des besonderen Chaotropen aufweisen, dessen Konzentration das in Frage stehende Antigen nicht beeinträchtigt. Die Auswahl auf Empfindlichkeit auf Chaotrope kann ebenfalls in Puffern bei einem spezifischen pH durchgeführt werden. Alternativ können Antikörper ausgewählt werden, welche auf Wechsel im pH empfindlich sind, in Gegenwart einer Konstanten Konzentration des Chaotropen. Change from high to low affinity in the presence of a chaotropic solution as the elution medium. Suitable chaotropes include KBr, KI, KSCN, guanidine, urea and MgCl2. Thus, monoclonal antibodies can be selected which have a Ka> 109 in the presence of a chaotropic, but a Ka of <108 in the presence of the special chaotropic, the concentration of which does not impair the antigen in question. The selection for sensitivity to chaotropes can also be made in buffers at a specific pH. Alternatively, antibodies can be selected that are sensitive to changes in pH in the presence of a constant concentration of the chaotropic.

Monoklonale Antikörper, deren Affinität für ein Antigen ausreichend erniedrigt werden kann durch andere als pH- oder Konzentrationsänderungen des Chaotropen, können ebenfalls ausgewählt werden. Unter den Arten der Medienempfindlichkeit, für welche Antikörper einem Screening unterworfen werden können, um diejenigen, dessen Antigenbindungsfähigkeit durch einen Wechsel im Elutionsmedium beeinträchtigt werden, umfassen Borat-Empfindlichkeit, Methylmannosid-Empfind-lichkeit und Empfindlichkeit auf nichionische oder ionische De-tergenzien und Reagenzien, welche auf spezifische Aminosäuren, wie Tryptophan und Tyrosin wirken. Monoclonal antibodies whose affinity for an antigen can be lowered sufficiently by changes other than pH or concentration changes of the chaotrope can also be selected. The types of media sensitivity for which antibodies can be screened for those whose antigen binding ability is affected by a change in the elution medium include borate sensitivity, methylmannoside sensitivity and sensitivity to nonionic or ionic detergents and reagents, which act on specific amino acids such as tryptophan and tyrosine.

Für die Verwendung bei der Affinitätschromatographie kann ein ausgewählter monoklarer Antikörper an jeden der festen Träger, welche üblicherweise in der Affinitätschromatographie verwendet werden, gebunden werden. Diese umfassen Se-pharose, Polystyrol, Glas, Nylon, Cellulose, Polymethylmeth-acrylat, Silicagel, Polyacrylamid und Nitrocellulose. For use in affinity chromatography, a selected monoclear antibody can be bound to any of the solid supports that are commonly used in affinity chromatography. These include Se-pharose, polystyrene, glass, nylon, cellulose, polymethyl methacrylate, silica gel, polyacrylamide and nitrocellulose.

Die folgenden Beispiele illustrieren die Anwendung der vorliegenden Erfindung, um monoklonale Antikörper zu erhalten, deren Bindungsaffinität für ein Antigen von hoher Affinität in einer ersten Umgebung zu niedriger Affinität in einer zweiten Umgebung variiert, wobei keine der Umgebungen Schaden an den immunochemischen Eigenschaften des Antigens und ihrer Nützlichkeit als Immunoadsorbenzien für Affinitätschromatographie verursacht. The following examples illustrate the use of the present invention to obtain monoclonal antibodies whose binding affinity for an antigen varies from high affinity in a first environment to low affinity in a second environment, none of which harm the immunochemical properties of the antigen and their Usefulness as immunoadsorbents for affinity chromatography causes.

Beispiel 1 example 1

Milzzellen, genommen von Balb/c-Mäusen, welche mit humanem Wachstumshormon (HGH) hyperimmunisiert wurden, wurden unter Verwendung von Polyethylenglykol mit Mäuse-myelom-Zellen (NS-1 oder SP-2/0 Linien) verflüssigt. Die erhaltenen Hybridome werden geklont und einem Screening unterworfen, um diejenigen sekretierenden Antikörper zu bestimmen, welche für HGH spezifisch sind, durch einen Radioimmu-noassay unter Verwendung von l25I-HGH und Pferde-Antimaus IgG auf Sepharose-Betten. Die Hybridome, welche Anti-HGH produzieren, wurden weiter einem Screening unterworfen, um diejenigen zu identifizieren, deren erzeugte Antikörper eine Ka von mindestens etwa 109 bei pH 7 aufweisen. Diese wurden einem weiteren Screening unterworfen, um diejenigen zu identifizieren, deren Affinitäten auf Wechsel der pH über einen Bereich von 4 bis 10,5 empfindlich sind. Die Daten, welche die pH-Empfindlichkeit von 4 monoklonalen Antikörpern wiedergeben, sind in den Tabellen 1 und 2 und in Fig. 1 und 2 dargestellt. Die einzelnen Antikörper sind durch die Buchstaben A, B, C bzw. D bezeichnet. Diese Daten wurden in folgender Weise erhalten: HGH, welches mit 125I markiert wurde, wurde bei pH 7 an jeden Antikörper, welcher vorher aus Polystyrolkugeln immobilisiert wurde, gebunden. Jede Kugel enthielt etwa 1 mg Antigen und 10 000 cpm. Je drei wurden in 1 ml PBS in 10% Pferdeserum für 4 h beim angegebenen pH inkubiert. Die Einstellungen der pH wurden durchgeführt durch Zugabe entweder eines Natriumcarbonatpuffers (10% in Pferdeserum) um pH 7 zu erhalten oder durch Zugabe von Natriumacetatkupfer (10% in Pferdeserum) um pH 7 zu erhalten. Nach der Inkubation Spleen cells taken from Balb / c mice hyperimmunized with human growth hormone (HGH) were liquefied with mouse myeloma cells (NS-1 or SP-2/0 lines) using polyethylene glycol. The hybridomas obtained are cloned and screened to determine those secreting antibodies specific for HGH by radioimmunoassay using I25I-HGH and horse anti-mouse IgG on Sepharose beds. The hybridomas that produce anti-HGH were further screened to identify those whose antibodies produced have a Ka of at least about 109 at pH 7. These were subjected to further screening to identify those whose affinities are sensitive to pH changes over a range of 4 to 10.5. The data representing the pH sensitivity of 4 monoclonal antibodies are shown in Tables 1 and 2 and in FIGS. 1 and 2. The individual antibodies are identified by the letters A, B, C and D. These data were obtained in the following way: HGH, which was labeled with 125I, was bound at pH 7 to any antibody which had previously been immobilized from polystyrene beads. Each ball contained approximately 1 mg of antigen and 10,000 cpm. Three were incubated in 1 ml PBS in 10% horse serum for 4 h at the stated pH. The pH adjustments were made either by adding a sodium carbonate buffer (10% in horse serum) to maintain pH 7 or by adding sodium acetate copper (10% in horse serum) to maintain pH 7. After incubation

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

5 5

672 028 672 028

wurden 800 (il des Überstandes gezählt. Die Auszählung des de-sorbierten Antigens bei jedem pH wurde in den Tabellen 1 und 2 aufgezeichnet und in den Figuren 1 und 2 dargestellt. 800 (il of the supernatant was counted. The count of the desorbed antigen at each pH was recorded in Tables 1 and 2 and shown in Figures 1 and 2.

TABELLE 1 TABLE 1

Impulse/min (cpm) X 10~3 Pulses / min (cpm) X 10 ~ 3

von desorbiertem HGH* from desorbed HGH *

pH pH

Antikörper A Antibody A

Antikörper B Antibody B

3,0 3.0

4,810 4,810

2,442 2,442

3,5 3.5

4,625 4,625

0,803 0.803

4,0 4.0

4,156 4,156

0,357 0.357

4,5 4.5

1,608 1.608

0,248 0.248

5,0 5.0

0,449 0.449

0,206 0.206

5,5 5.5

0,176 0.176

0,162 0.162

6,0 6.0

0,220 0.220

0,176 0.176

6,5 ' 6.5 '

0,336 0.336

0,167 0.167

7,0 7.0

0,328 0.328

0,162 0.162

* Mittelwert der drei Überstände * Average of the three supernatants

TABELLE 2 TABLE 2

Impulse/min (cpm) x 10-3 Pulses / min (cpm) x 10-3

von desorbiertem HGH* from desorbed HGH *

pH pH

Antikörper C Antibody C

Antikörper D Antibody D

7,0 7.0

0,236 0.236

0,187 0.187

7,5 7.5

0,208 0.208

0,336 0.336

8,0 8.0

0,240 0.240

0,321 0.321

8,5 8.5

0,666 0.666

0,277 0.277

9,0 9.0

0,401 0.401

0,237 0.237

9,5 9.5

1,038 1,038

0,287 0.287

10,0 10.0

3,030 3,030

0,364 0.364

10,5 10.5

4,809 4,809

0,584 0.584

11,0 11.0

5,508 5.508

3,460 3,460

* Mittelwert der drei Überstände * Average of the three supernatants

Die Daten in Tabelle 1, insbesondere wie in Fig. 1 aufgezeichnet, zeigen, dass die Bindung von HGH durch Antikörper B besonders unempfindlich gegen pH-Änderungen über dem Bereich von pH 3,5-7 war, jedoch dass die Bindung von HGH an Antikörper A signifikant abnahm im Bereich von pH 4,5-4,0, was angibt, dass der Antikörper das Antigen bei einem pH von 4,0 nicht mehr wirksam binden würde. The data in Table 1, particularly as recorded in Figure 1, show that the binding of HGH by antibody B was particularly insensitive to pH changes over the range of pH 3.5-7, but that the binding of HGH to antibodies A decreased significantly in the range of pH 4.5-4.0, indicating that the antibody would no longer bind the antigen effectively at pH 4.0.

Die Daten in Tabelle 2 und Fig. 2 auf der anderen Seite zeigen, dass die Bindung von HGH durch Antikörper D im wesentlichen unempfindlich war gegen pH-Änderungen über dem Bereich pH 7,0-10,5 während die Bindung von HGH durch Antikörper C signifikant abnahm im Bereich von pH 9,5-10,5, was angibt, dass der Antikörper das Antigen bei einem pH von 10,5 nicht mehr wirksam binden würde. The data in Table 2 and Figure 2 on the other hand show that the binding of HGH by antibody D was essentially insensitive to pH changes over the pH 7.0-10.5 range while the binding of HGH by antibody C. decreased significantly in the range of pH 9.5-10.5, indicating that the antibody would no longer bind the antigen effectively at pH 10.5.

Die eluierten Überstände von Antikörpern A und C bei pH 4,0 und 10,5 wurden zu PBS-Puffer (10% in Pferdeserum) zugegeben und auf pH 7 eingestellt und die Proben wurden ge-poolt. Die gepoolten Proben wurden mit Polystyrolkugeln, welche mit den Antikörpern A, B, C und D und zwei weiteren monoklonalen Antikörpern gegen HGH beschichtet. Jede dieser Antikörper erkannte verschiedene Bereiche des HGH-Moleküls. Die Immunoreaktivität des eluierten Antigens bei entweder pH 4 oder pH 10,5 mit fünf oder sechs Antikörpern, welche die Antikörper A, B, C und D einschliessen, war nicht beeinträchtigt und war nur schwach vermindert gegenüber dem sechsten. Diese Daten zeigen, dass die Elution des Antigens bei entweder pH 4,0 oder pH 10,5 seine immunochemischen Eigenschaften nicht nachteilig beeinflusste. The eluted supernatants from antibodies A and C at pH 4.0 and 10.5 were added to PBS buffer (10% in horse serum) and adjusted to pH 7 and the samples were pooled. The pooled samples were coated with polystyrene balls, which were coated with antibodies A, B, C and D and two further monoclonal antibodies against HGH. Each of these antibodies recognized different areas of the HGH molecule. The immunoreactivity of the eluted antigen at either pH 4 or pH 10.5 with five or six antibodies, including antibodies A, B, C and D, was not affected and was only slightly reduced compared to the sixth. These data show that elution of the antigen at either pH 4.0 or pH 10.5 did not adversely affect its immunochemical properties.

Beispiel 2 Example 2

Ein hochaffiner monoklonaler Antikörper (Ka = 5 x 1010) gegen Prostansäurephosphatase (PAP), einem aussergewöhn-lich labilen Enzym, erhalten durch Screening von Hybridomen, welche Anti-PAP monoklonale Antikörper erzeugen, welche von Fusionen von Milzzellen aus einer Balb/c-Maus, welche gemäss Beispiel 1 mit PAP und Mäuse-Myelomzellen hyperimmu-nisiert wurde, zeigte eine Antigenbindungsempfindlichkeit im pH-Bereich von 6,0-4,9. Der Antikörper war an Sepharosekü-gelchen gebunden, wobei die CNBr-Technik bei einer Konzentration von 1 mg Antikörper pro 1 ml gepackten Sepharosekü-gelchen verwendet wurde und zur Reinigung von PAP von se-minalen Flüssigkeiten wie folgt verwendet wurde. Eine 170 p.1 Probe der seminalen Flüssigkeit, welche 0,912 mg/ml PAP (bestimmt durch einen immunoradiometrischen Versuch) enthielt, wurde unter Verwendung eines TANDEM-(Warenzeichen) As-say-Kits für PAP (Hybritech, Inc., San Diego, Ca.) auf 5 ml mit Acetatpuffer (10% Natriumacetat in Pferdeserum enthaltend 0,15 M NaCl) verdünnt, um eine Lösung von 31 |xg PAP/ml einer Lösung mit einem pH von 6 zu erhalten. A high affinity monoclonal antibody (Ka = 5 x 1010) against prostanoic acid phosphatase (PAP), an exceptionally labile enzyme, is obtained by screening hybridomas which produce anti-PAP monoclonal antibodies, which result from fusions of spleen cells from a Balb / c mouse which was hyperimmunized according to Example 1 with PAP and mouse myeloma cells showed an antigen binding sensitivity in the pH range of 6.0-4.9. The antibody was bound to Sepharose beads using the CNBr technique at a concentration of 1 mg antibody per 1 ml of packed Sepharose beads and used to purify PAP from terminal liquids as follows. A 170 p.1 sample of the seminal fluid containing 0.912 mg / ml PAP (determined by an immunoradiometric assay) was prepared using a TANDEM (trademark) as-say kit for PAP (Hybritech, Inc., San Diego, Approx.) To 5 ml with acetate buffer (10% sodium acetate in horse serum containing 0.15 M NaCl) to obtain a solution of 31 xg PAP / ml of a solution with a pH of 6.

Die PAP-Lösung wurde durch eine Säule, enthaltend 1,5 ml Sepharosekügelchen mit einer Durchlaufrate von 1 ml/h durch-fliessengelassen und die Säule wurde mit 7,5 ml des Ausgangspuffers gewaschen. Immunometrische Versuche des Elutions-mittels (5 ml der Probe und 7,4 ml der Waschflüssigkeit) zeigten, dass 99,3% des PAP in der Säule adsorbiert war. Das PAP wurde mit 0,1 M Acetatpuffer, pH 4, enthaltend 0,15 M NaCl eluiert. Drei 1 ml Fraktionen wurden gesammelt und über Nacht gegen 50 mM Citrat bei pH 6,0 dialysiert. Der PAP-Ge-halt der gepoolten und dialysierten Fraktionen wurde durch den immuno-radiometrischen Assay als 54% des auf die Säule gegebenen bestimmt. Die Reinheit des dialysierten Materials wurde durch Natriumdodecylsulfat und Ornstein-Davis PAGE bestimmt. Es wurde ein einziges Band in allen Fällen beobachtet. Es wurden Messungen der enzymatischen Aktivität durchgeführt und gezeigt, dass die gereinigte PAP ihre enzymatische Aktivität beibehielt. The PAP solution was passed through a column containing 1.5 ml of Sepharose beads at a flow rate of 1 ml / h, and the column was washed with 7.5 ml of the starting buffer. Immunometric tests of the eluent (5 ml of the sample and 7.4 ml of the washing liquid) showed that 99.3% of the PAP was adsorbed in the column. The PAP was eluted with 0.1 M acetate buffer, pH 4, containing 0.15 M NaCl. Three 1 ml fractions were collected and dialyzed overnight against 50 mM citrate at pH 6.0. The PAP content of the pooled and dialyzed fractions was determined to be 54% of that applied to the column by the immuno-radiometric assay. The purity of the dialyzed material was determined by sodium dodecyl sulfate and Ornstein-Davis PAGE. A single band was observed in all cases. Measurements of the enzymatic activity were carried out and it was shown that the purified PAP retained its enzymatic activity.

Das Zurückhalten von 46% des PAP auf der Säule ist wahrscheinlich mindestens teilweise das Resultat einer nichtspezifischen Bindung und der Verwendung eines grossen Überschusses von Antikörpern, welcher den Antigen-«Trail» von der Säule verursachte. Das erstere kann durch Vorbehandlung der Säule mit der Probe unter Elutions-Bedingungen und anschliessendes ausgedehntes Auswaschen, um das eluierbare Material zu entfernen, reduziert werden. Das letztere kann durch Herabsetzung der Konzentration des gebundenen Antikörpers reduziert werden. Schliesslich ist Sepharose nicht die ideale Matrix für Affinitätschromatographie wegen der Heterogenität der Po-rengrösse, was die Diffusion und sterische Probleme zur Folge hat. The retention of 46% of the PAP on the column is probably at least in part the result of non-specific binding and the use of a large excess of antibodies which caused the antigen "trail" from the column. The former can be reduced by pretreating the column with the sample under elution conditions and then washing extensively to remove the elutable material. The latter can be reduced by lowering the concentration of the bound antibody. Finally, Sepharose is not the ideal matrix for affinity chromatography because of the heterogeneity of the pore size, which leads to diffusion and steric problems.

Beispiel 3 Example 3

Die Reinigung des mit Chlamydia vereinigten Antigens ist kompliziert, da es schwierig zu solubilisieren ist. Es kann jedoch in verschiedenen Detergenzien solubilisiert werden. Hybridome, welche monoklonale Antikörper gegen chlamodyale Antigene erzeugen, die durch Fusion von Milzzellen von hyperim-munisierten Balb/c-Mäusen mit Mäuse-Myelom-Zellen gemäss Beispiel 1 erhalten wurden, wurden einem Screening auf Empfindlichkeit auf Detergenzkonzentration unterworfen. Die Wirkung der Detergenzien auf die Bindung von 4 solchen Antikörpern wird in Tabelle 3 dargestellt. Die verwendeten Detergenzien waren Deoxychlolat (DOC), Natriumdodecylsulfat (SDS) The purification of the antigen associated with Chlamydia is complicated because it is difficult to solubilize. However, it can be solubilized in various detergents. Hybridomas which produce monoclonal antibodies against chlamodyal antigens, which were obtained by fusing spleen cells from hyperimmunized Balb / c mice with mouse myeloma cells according to Example 1, were subjected to a screening for sensitivity to detergent concentration. The effect of the detergents on the binding of 4 such antibodies is shown in Table 3. The detergents used were deoxychlolate (DOC), sodium dodecyl sulfate (SDS)

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20 20th

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und Octylphenoxypolyethoxyethanol [im Handel als Nonidet P-40 (NP 40)]. Ehrlich-Ascites wurden als Kontrolle verwendet. and octylphenoxypolyethoxyethanol [commercially available as Nonidet P-40 (NP 40)]. Ehrlich ascites were used as controls.

Die Daten in Tabelle 3 wurden erhalten indem das Antigen auf Mikrotiterplatten aufgetragen und mit einer Lösung von je- s dem der Antikörper in einem Puffer bei der Konzentration des Detergenz wie in der Tabelle angegeben inkubiert wurde. Nach der Inkubation wurde die Platte gewaschen und mit polyklona-len Schaf-Antimaus-Antikörpern, welche mit Meerrettich-Per-oxidase (HRP) markiert waren, umgesetzt. Die Inkubationszeit io betrug 1 h bei Zimmertemperatur. Die Platte wurde wieder gewaschen und mit einer Lösung von Ortophenylendiamin (ODP) einem Chromagensubstrat für HRP umgesetzt. Die Adsorption in jeder Vertiefung wurde bei 490 nm gemessen und in Tabelle 3 dargestellt. is The data in Table 3 were obtained by applying the antigen to microtiter plates and incubating with a solution of each of which the antibody was in a buffer at the concentration of the detergent as indicated in the table. After the incubation, the plate was washed and reacted with polyclonal sheep anti-mouse antibodies which were labeled with horseradish peroxidase (HRP). The incubation time was 1 hour at room temperature. The plate was washed again and reacted with a solution of ortophenylenediamine (ODP), a chromagen substrate for HRP. The adsorption in each well was measured at 490 nm and shown in Table 3. is

TABELLE 3 TABLE 3

Wirkungen von Detergenzien auf die Bindung durch Anti-chlamydia-monoklonalen Antikörpern Effects of detergents on binding by anti-chlamydia monoclonal antibodies

Antikörper- O.D.1 O.D.1 O.D.1 O.D.1 O.D.1 Antibody O.D.1 O.D.1 O.D.1 O.D.1 O.D.1

reaktionsmischung Ehrlich- Antiköper Antikörper Antikörper Antikörper reaction mixture Ehrlich-Antibody Antibody Antibody Antibodies

Ascites 1 2 3 4 Ascites 1 2 3 4

wässeriger Puffer 0,00 1,06 1,15 1,02 0,95 aqueous buffer 0.00 1.06 1.15 1.02 0.95

2% DOC 0,02 1,10 0,70 0,11 0,25 2% DOC 0.02 1.10 0.70 0.11 0.25

2% NP-40 0,00 0,20 0,11 0,80 0,06 2% NP-40 0.00 0.20 0.11 0.80 0.06

0,5% DOC 0,03 1,37 1,36 1,22 1,25 0.5% DOC 0.03 1.37 1.36 1.22 1.25

0,1% SDS 0,05 1,17 1,20 1,30 1,05 0.1% SDS 0.05 1.17 1.20 1.30 1.05

1. O.D. bei 490 nm wurde als Mittel von 2 Proben mit einer Standardabweichung von 0,05 erhalten. 1st O.D. at 490 nm was obtained as an average of 2 samples with a standard deviation of 0.05.

2. Wässriger Püffer ist Autopow-Gewebekulturmediüm mit 8% Pferdeserum, 2% fetalem Kalbssèrum. Alle Detergenzien, welche im Experiment verwendet wurden, waren mit diesem Puffer verdünnt. 2. Aqueous Püffer is Autopow tissue culture medium with 8% horse serum, 2% fetal calf serum. All detergents used in the experiment were diluted with this buffer.

3. Verwendet als Kontrolle. 3. Used as a control.

Diese Daten zeigen den Effekt von verschiedenen Detergenzien und Detergenz-Konzentrationen auf die Bindung von ausgewählten monoklonalen Antikörpern. Antikörper Nr. 1 und 2 haben eine verhältnismässig hohe Affinität für Chlamydia in wässrigem Puffer, was durch keines der Detergenzien mit Ausnahme von 2% NP-40 beeinträchtigt wurde. Antikörper 3 hatte eine niedere Affinität in 2% DOC; doch wurde seine hohe Affinität in anderen Medien zurückerhalten. Antikörper 4 hatte eine niedere Affinität in 2% DOC und 2% NP-40 aber eine hohe Affinität in anderen Medien. These data show the effect of different detergents and detergent concentrations on the binding of selected monoclonal antibodies. Antibodies # 1 and # 2 have a relatively high affinity for Chlamydia in aqueous buffer, which was not affected by any of the detergents except for 2% NP-40. Antibody 3 had a low affinity in 2% DOC; however, his high affinity has been regained in other media. Antibody 4 had a low affinity in 2% DOC and 2% NP-40 but a high affinity in other media.

In anderen Experimenten wurden die mit Antigen beschichteten Microtiterplatten zuerst mit Detergenz in den Konzentrationen, wie in Tabelle 1 gezeigt, während 1 h inkubiert und dann gewaschen. Anschliessend wurden die Antichlamydia-Antikör-per nach dem Waschen in den Vertiefungen inkubiert danach mit dem HRP-markierten Antimaus-Antikörper inkubiert. Nach dem Waschen folgte dieser Inkubation eine Inkubation mit dem Enzymsubstrat. Die optischen Dichten in jedem Behälter wurden mit Behältern verglichen, welche mit der wässrigen Pufferlösung vorbehandelt wurden, weisen darauf hin, dass das Antigen durch die Detergenzien nicht beeinträchtigt wurde. Demzufolge konnten die monoklonalen Antikörper für die Affinitätsreinigung von Chlamydia-Antigen verwendet werden, indem das Antigen in einem für die Antikörper kompatiblen Reagenz gelöst und einer Passage durch eine Säule mit immobilisiertem Antikörper unterworfen wurde, um das Antigen zu binden. Anschliessend wurde das Antigen durch eine Elution der Säule mit einer anderen Detergenzzusammensetzung, in welcher der Antikörper nicht an das Antigen gebunden wird, freigesetzt. In other experiments, the antigen-coated microtiter plates were first incubated with detergent in the concentrations shown in Table 1 for 1 h and then washed. The antichlamydia antibodies were then incubated after washing in the wells and then incubated with the HRP-labeled anti-mouse antibody. After washing, this incubation was followed by an incubation with the enzyme substrate. The optical densities in each container were compared to containers pretreated with the aqueous buffer solution, indicating that the antigen was not affected by the detergents. Accordingly, the monoclonal antibodies could be used for the affinity purification of Chlamydia antigen by dissolving the antigen in a reagent compatible with the antibodies and subjecting it to passage through an immobilized antibody column to bind the antigen. The antigen was then released by eluting the column with a different detergent composition in which the antibody is not bound to the antigen.

Vom vorhergehenden wird für den Fachmann klar, dass eine wirkungsvolle Reinigung eines Antigens durch das Mittel 40 der Affinitätschromatographie unter Verwendung eines ausgewählten monoklonalen Antikörpers als Immunoadsorbens unter Bedingungen durchgeführt werden kann, welche das Antigen nicht denaturieren. Spezifische Anwendungen dieses Verfahrens umfassen seine Verwendung zur Reinigung von Antigenen in 45 Proben, worin sie natürlicherweise vorkommen und zur Reinigung von radiomarkiertem Antigen, welches durch Lagerung entartet wurde. Eine besondere Anwendung ist die Reinigung von Proteinprodukten, welche durch die rekombinierende DNA-Technologie erhalten wurden. Unter solchen Produkten so kann das Insulin und das humane Wachstumshormon erwähnt werden. Die Isolierung von komplexen Proteinen aus Serum, z.B. Faktor V und Faktor VIII ist möglich unter Verwendung des Verfahrens dieser Erfindung. From the foregoing, it will be apparent to those skilled in the art that effective purification of an antigen by affinity chromatography agent 40 using a selected monoclonal antibody as an immunoadsorbent can be performed under conditions that do not denature the antigen. Specific uses of this method include its use to purify antigens in 45 samples, which are naturally occurring, and to purify radiolabeled antigen that has been degenerated by storage. A special application is the purification of protein products, which were obtained by the recombining DNA technology. Among such products, insulin and human growth hormone can be mentioned. Isolation of complex proteins from serum, e.g. Factor V and factor VIII are possible using the method of this invention.

Es ist ebenfalls möglich das Verfahren umzukehren und den 55 monoklonalen Antikörper unter Verwendung eines immobilisierten Antigens als Immunoadsorbens zu reinigen. Z.B. kann ein radiomarkierter Antikörper, welcher in einem immunora-diometrischen Versuch verwendet wurde, und in Folge von Lagerung entartet wurde, auf diese Weise gereinigt werden. Der 60 monoklonale Antikörper kann ebenfalls von Ascites-Flüssigkeit oder Kulturmedium unter Verwendung des immobilisierten Antigens als Immunoadsorbens gewonnen werden. It is also possible to reverse the procedure and purify the 55 monoclonal antibody using an immobilized antigen as an immunoadsorbent. E.g. For example, a radiolabeled antibody used in an immunorodiometric assay that has degenerated as a result of storage can be purified in this way. The 60 monoclonal antibody can also be obtained from ascites fluid or culture medium using the immobilized antigen as an immunoadsorbent.

Trotzdem wir nicht an eine besondere Theorie gebunden sein wollen, ist der Wechsel der Ka mit Wechseln im pH wahr-65 scheinlich die Wirkung der Protonierung von Histidinresten oder der Deprotonierung von Lysin oder möglicherweise Tyrosin- oder Arginin-Resten im Antikörper oder im Antigen oder in beiden, was die Fähigkeit des Antigens und des Anti Although we do not want to be bound by any particular theory, changing the Ka with changes in pH is probably the effect of protonating histidine residues or deprotonating lysine or possibly tyrosine or arginine residues in the antibody or in the antigen or in both what the ability of the antigen and the anti

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körpers miteinander einander Komplex einzugehen ändert. Spezifische beeinträchtigte Reste können oder können nicht in den Bindungsgebieten des Moleküls liegen. body to interact with each other complex changes. Specific impaired residues may or may not be in the binding regions of the molecule.

Basierend auf der Entdeckung, dass die Antikörper, welche durch eine Immunreaktion eines Tieres auf ein Antigen erzeugt s wurden, Antikörper enthalten, welche in ihrer Empfindlichkeit auf Wechsel in der Umgebung veränderlich sind, fällt es unter den Bereich unserer Erfindung, polyklonale Antiseren zu fraktionieren, um eine Mischung von Antikörpern, welche sich in ähnlicher Weise wie die erfindungsgemässen umgebungsemp- io findlichen monoklonalen Antikörper verhalten, zu erhalten. Based on the discovery that the antibodies generated by an animal's immune response to an antigen contain antibodies that are variable in their sensitivity to changes in the environment, it is within the scope of our invention to fractionate polyclonal antisera. in order to obtain a mixture of antibodies which behave in a manner similar to that of the environmentally sensitive monoclonal antibodies according to the invention.

Diese Fraktionierung kann durchgeführt werden durch Inkon-taktbringen des immobilisierten Antigens mit einem Überschuss des Antiserums in einer ersten gewünschten Umgebungsbedingung, gefolgt durch Waschen des Immunoadsorbens, um das 15 ungebundene Material zu entfernen. Diesem Schritt folgt das Inkontaktbringen des Immunoadsorbens mit einem Medium, welches die zweite Umgebung darstellt, um die Antikörper, welche unter den ersten Umgebungsbedingungen nicht eluiert wurden, zu eluieren. Wünscht man z.B. Antikörper zu erhalten, 20 welche eine hohe Affinität bei pH 7, und eine niedere Affinität bei pH 4 aufweisen, wird das immobilisierte Antigen mit einem Überschuss des Antiserums bei pH 7 in Kontakt gebracht, und das immobilisierte Antigen wird mit einem Medium bei pH 7 gewaschen, um die Antikörper, welche eine niedere Affinität 25 bei pH 7 aufweisen, zu eluieren. Das Immunoadsorbens wird dann bei pH 4 eluiert, um die Antikörper, welche eine niedere Affinität bei pH 4 aufweisen, zu eluieren. Das Elutionsmittel wird die Fraktionen der Antikörper enthalten, deren Bindung mit dem Antigen empfindlich auf Wechsel im pH über dem 30 pH-Bereich 7-4 ist. Ähnliche Fraktionierungen können mit Harnstoff und anderen Inhibitoren der Antigen-Antikörperbin-dung durchgeführt werden. Die resultierenden Populationen von Antikörpern können weitere Unterfrâktionierungen erfordern, welche eher wegen einer intrinsischen niederen Affinität 35 eluiert werden als durch einen Ka-«Schalter». This fractionation can be performed by contacting the immobilized antigen with an excess of the antiserum in a first desired environmental condition, followed by washing the immunoadsorbent to remove the unbound material. This step is followed by contacting the immunoadsorbent with a medium which is the second environment in order to elute the antibodies which were not eluted under the first environmental conditions. Do you want e.g. To obtain antibodies that have a high affinity at pH 7 and a low affinity at pH 4, the immobilized antigen is contacted with an excess of the antiserum at pH 7 and the immobilized antigen is washed with a medium at pH 7 to elute the antibodies which have a low affinity 25 at pH 7. The immunoadsorbent is then eluted at pH 4 to elute the antibodies which have a low affinity at pH 4. The eluent will contain the fractions of the antibodies whose binding with the antigen is sensitive to changes in pH over the pH range 7-4. Similar fractionations can be performed with urea and other inhibitors of antigen-antibody binding. The resulting antibody populations may require further sub-fractionations, which are eluted more because of an intrinsic lower affinity than through a Ka "switch".

Erfindungsgemäss können ebenfalls Hybride monoklonaler Antikörper verwendet werden, welche zweifache Spezifitäten für die Affinitätsreinigung aufweisen. Ein Verfahren für die Herstellung von hybriden monoklonalen Antikörper ist in der 40 USA-Anmeldung von Martinis et al, «Antibodies Having Dual Hybrid monoclonal antibodies which have two-fold specificities for affinity purification can also be used according to the invention. A method for the production of hybrid monoclonal antibodies is described in Martinis et al. 40 US application, “Antibodies Having Dual

Specificities, Their Préparation And Uses Therefor», Serial No. 367-781, auf welche ausdrücklich Bezug genommen wird. Specificities, Their Preparation And Uses Therefor », Serial No. 367-781, to which express reference is made.

Der hybride monoklonale Antikörper hat zwei Spezifitäten, welche gegen verschiedene Antigene gerichtet sein können. Für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung wird der hybride Antikörper so ausgewählt, dass er pH- oder andere Umgebungsempfindlichkeiten in der Spezifität für das Antigen, für welches er als Immunoadsorbens bei der Affinitätschromatographie verwendet werden soll, aufweist. Die andere Spezifität, welche das Hybrid zeigt, ist so ausgewählt, dass es eine hohe Affinität gegen ein zweites Antigen, welches an einen festen Träger gebunden ist, hat. Wenn der hybride Antikörper auf einen festen Träger gegeben wird, wird er durch das zweite Antigen an den Träger gebunden. Natürlich braucht die Affinität des Hybrids für das zweite Antigen unter den Umgebungsbedingungen, welche eine Elution des ersten, oder Zielantigen erlauben, nicht wesentlich niederer zu sein. Vorzugsweise ist die Bindung des zweiten Antigens zum Antikörper auf eine verschiedene Umgebungsbedingung empfindlich und nicht diejenige, welche die Elution des Zielantigens vom Immunoadsorbens erlaubt. Z.B. kann der hybride Antikörper so ausgewählt sein, dass die Affinität für das Zielantigen durch eine Erniedrigung des pH reduziert wird und die Affinität für das zweite Antigen durch eine Erhöhung des pH reduziert wird. Dies erlaubte, dass der hybride monoklonale Antikörper leicht von einem festen Träger desorbiert werden kann, falls dies bei einer Kontamination des Trägers durch Verunreinigungen oder aus anderen, seine Nützlichkeit beeinträchtigenden Gründen erwünscht ist. The hybrid monoclonal antibody has two specificities, which can be directed against different antigens. For use in the present invention, the hybrid antibody is selected to have pH or other environmental sensitivities in the specificity for the antigen for which it is to be used as an immunoadsorbent in affinity chromatography. The other specificity that the hybrid exhibits is selected to have high affinity for a second antigen bound to a solid support. When the hybrid antibody is placed on a solid support, it is bound to the support by the second antigen. Of course, the affinity of the hybrid for the second antigen need not be significantly lower under the environmental conditions that allow elution of the first or target antigen. Preferably, the binding of the second antigen to the antibody is sensitive to a different environmental condition and not that which allows the target antigen to be eluted from the immunoadsorbent. E.g. the hybrid antibody can be selected such that the affinity for the target antigen is reduced by lowering the pH and the affinity for the second antigen is reduced by increasing the pH. This allowed the hybrid monoclonal antibody to be easily desorbed from a solid support if so desired when the support is contaminated by contaminants or for other reasons that impair its utility.

Die erfindungsgemässen umgebungsempfindlichen Antikörper können ebenfalls zur Lagerung von Antigenen in einer festen Phase verwendet werden, welche in Lösung instabil sind. Z.B. kann ein radiomarkiertes Antigen zur Lagerung an einen immobilisierten Antikörper gebunden werden und wenn nötig desorbiert werden. Der Desorption kann ein Waschen des Immunoadsorbens vorausgehen, um die Entartungsprodukte, welche sich während der Lagerung gebildet haben, zu entfernen. Der umgekehrte Prozess ist ebenfalls möglich. D.h. das Antigen kann verwendet werden, um unstabile Antikörper in einer festen Phase zu lagern. Z.B. kann ein radiomarkierter Antikörper der in einem Radioassay verwendet wird, als Antigen-Antikör-per-Komplex gelagert und nötigenfalls desorbiert werden. The environment-sensitive antibodies according to the invention can also be used to store antigens in a solid phase which are unstable in solution. E.g. For example, a radiolabeled antigen can be bound to an immobilized antibody for storage and desorbed if necessary. Desorption can be preceded by washing the immunoadsorbent to remove the degenerate products that have formed during storage. The reverse process is also possible. I.e. the antigen can be used to store unstable antibodies in a solid phase. E.g. a radiolabeled antibody that is used in a radioassay can be stored as an antigen-antibody complex and desorbed if necessary.

v v

1 Blatt Zeichnungen 1 sheet of drawings

Claims

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2nd

PATENT CLAIMS

1. Monoclonal antibody, characterized in that it has a high affinity for the antigen against which it was formed in a first environment and a low affinity for the same antigen in a second environment, and none of the environments have the immunochemical properties of the antigen or the antibody changes significantly irreversibly.

2. Monoclonal antibody according to claim 1, characterized in that the affinity constant for the antibody to the antigen in the first environment is> 109 and the affinity constant for the antibody to the antigen in the second environment is <108.

3. Monoclonal antibody according to claim 2, characterized in that the affinity constant in the first environment is> IO10 and the affinity constant in the second environment is ^ 106.

4. Monoclonal antibody according to claim 1, 2 or 3, characterized in that the first environment is a liquid medium with a first pH and the second environment is a liquid medium with a second pH.

5. Monoclonal antibody according to claim 4, characterized in that the pH of the first environment and the pH of the second environment is in the range from 4 to 10.5.

6. Monoclonal antibody according to claims 1, 2 or 3, characterized in that the second environment is a solution containing a chaotropic agent.

7. Monoclonal antibody according to claim 6, characterized in that the chaotropic agent is selected from the group urea, guanidine, KSCN, KBr, KI and MgCh.

8. Hybrid monoclonal antibody with double specificity, characterized in that one specificity is directed against a first antigen and the second specificity against a second antigen, wherein the specificity directed against the first antigen has a high affinity in a first environment and a low affinity in represents a second environment, wherein none of the environments substantially irreversibly changes the immunochemical properties of the first antigen or the antibody and the affinity of the hybrid antibody for the second antigen is not significantly different in the said first and second environments.

9. Hybrid monoclonal antibody according to claim 8, characterized in that the antibody has a high affinity for the second antigen in a first environment and a low affinity for the second antigen in a third environment.

10. Hybrid monoclonal antibody according to claim 9, characterized in that the first environment is a liquid medium with a first pH, the second environment is a liquid medium with a second pH and the third environment is a liquid medium with a third pH. Is worth.

11. Procedure for the purification of an antigen, characterized by the steps:

a) selecting an antibody which has a high affinity for an antigen in a first environment and a low affinity in a second environment, none of the environments substantially irreversibly changing the immunochemical or biological properties of the antigen or antibody;

b) immobilization of the antibody on a solid support;

c) binding of the antigen to the antibody in the first environment;

d) separation of the unbound impurities from the bound antigen; and e) elution of the antigen in purified form from the immobilized antibody using a medium which is the second environment as the eluent.

12. The method according to claim 11, characterized in that the antibody is a monoclonal antibody.

13. The method according to claim 11 or 12, characterized in that the affinity constant for the antibody to the antigen in the first environment is> 109 and the affinity constant for the antibody to the antigen in the second environment is <108.

14. The method according to claim 11 or 12, characterized in that the affinity constant in the first environment is> IO10 and the affinity constant in the second environment is <106.

15. The method according to claim 11 or 12, characterized in that the first environment is a liquid medium with a first pH and the second environment is a liquid medium with a second pH.

16. The method according to claim 15, characterized in that the pH of the first environment and the pH of the second environment is in the range from 4 to 10.5.

17. The method according to claim 11 or 12, characterized in that the second environment is a solution containing a chaotropic agent.

18. The method according to claim 17, characterized in that the chaotropic agent is selected from the group urea, guanidine, KSCN, KBr, KI and MgCl2.

19. The method according to claim 12, characterized in that the monoclonal antibody is a hybrid monoclonal antibody which has a first specificity against an antigen to be purified and a second specificity with a high affinity for a second antigen, the second antigen being on a solid Carrier is immobilized and represents the means by which the antibody is immobilized on the solid support and the affinity of the antibody for the second antigen is not significantly reduced in the second environment.

20. The method according to claim 19, characterized in that the antibody has a low affinity for the second antigen in a third environment.

21. The method according to claim 20, characterized in that the first environment is a liquid medium with a first pH, the second environment is a liquid medium with a second pH and the third environment is a third medium with a third pH is.

22. The method according to claim 11, characterized in that the antibody is an antiserum fraction.

23. A method for producing a fraction of antibodies with a high affinity for an antigen in a first environment and a low affinity for the same antigen in a second environment, wherein none of the environments significantly irreversibly changes the immunochemical properties of the antigen or the antibody Fractionation of serum antibodies characterized in that the antigen is immobilized on a solid support, the antigen is brought into contact with the serum antibodies in the first environment in order to bind the antibodies to the antigen and a fraction of the antibody is eluted, using as an eluent Medium is used which is the second environment and the eluted antibodies have a low affinity for the antigen in the second environment.

24. The method according to claim 23, characterized in that the first environment is a liquid medium with a first pH and the second environment is a liquid medium with a second pH.

25. The method according to claim 24, characterized in that the pH of the first environment and the pH of the second environment is in the range from 4 to 10.5.

26. The method according to claim 23, characterized in that the second environment is a solution containing a chaotropic agent.

27. A method for the purification of an antibody, which

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has a high affinity for an antigen in a first environment and a low affinity for the antigen in a second environment, none of the environments significantly irreversibly changing the immunochemical properties of the antigen or the antibody, characterized by the steps:

a) immobilization of the antigen on a solid support;

b) binding of the antibody to the antigen in the first environment;

c) separation of the unbound contaminants from bound antibodies; and d) elution of the antibody in purified form from the immobilized antigen, using a medium which represents the second environment as the eluent.

28. The method according to claim 27, characterized in that the antibody is a monoclonal antibody.

29. The method according to claim 27, characterized in that the first environment is a liquid medium with a first pH and the second environment is a liquid medium with a second pH.

30. The method according to claim 29, characterized in that the first pH and said second pH is in the range from 4 to 10.5.

31. The method according to claim 27, characterized in that the second environment is a solution containing a chaotropic agent.

32. The method according to claim 31, characterized in that the chaotropic agent is selected from the group consisting of urea, guanidine, KSCN, KBr, KI and MgCh.