DE3855007T2

DE3855007T2 - METHODE ZUR REINIGUNG REKOMBINANTER t-PA VON DEN IHREN ENTSPRECHENDEN WIRTSZELLPROTEINEN

Info

Publication number: DE3855007T2
Application number: DE3855007T
Authority: DE
Inventors: Vincent Anicetti; Stuart Builder; Billie Marks; John Ogez; Eric Patzer; David Vetterlein
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1987-11-05
Filing date: 1988-11-02
Publication date: 1996-09-19
Anticipated expiration: 2008-11-03
Also published as: EP0389538B1; JPH03500842A; ATE134218T1; EP0389538A1; US5411864A; JP2756162B2; DE3855007D1; WO1989004367A1

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung rekombinanter Proteine von diesbezüglichen Wirtszellenproteinen. Die Erfindung betrifft weiters die bei der Reinigung verwendeten monoklonalen Antikörper und einen Assay für das diesbezügliche Wirtszellenprotein.

Hintergrund der Erfindung

Die Erzeugung rekombinanter Proteine in eukaryotischen Zellen kann zur Co-Reinigung diesbezüglicher Wirtszellenproteine führen. Die Produktion von menschlichem Gewebeplasminogenaktivator ("tissue plasminogen activator", t-PA) in chinesischen Hamstereierstock-(CHO-)Zellen kann daher zur Co-Reinigung des/der chinesischen Hamster-Plasminogenaktivators/en (PA) führen, der/die durch CHO-Zellen erzeugt wird/werden (CHO-PA).
Menschlicher t-PA ist ein äußerst wichtiges, neues, biologisches Pharmazeutikum, das sich aufgrund seiner hohen Spezifität und seiner hochwirksamen Fähigkeit zur Auflösung von Blutgerinnseln in vivo als sehr vielversprechend zur Behandlung von Gefäßerkrankungen herausgestellt hat. Demzufolge wurde t-PA in der medizinischen Forschung als eines der beeindruckendsten, neuen Mittel der jüngsten Zeit zur Behandlung von Gefäßverschlußerkrankungen, insbesondere von Herzerkrankungen, gepriesen. Aus diesem und aus anderen Gründen wird t-Pa die klinische Behandlung schwerer Gefäßerkrankungen wahrscheinlich revolutionieren.
Menschliches t-PA-Protein sowie die zugrundeliegenden, dafür kodierenden Gensequenzen waren in den letzten jahren Gegenstand zahlreicher wissenschaftlicher Veröffentlichungen. Beispielsweise wurde seine Isolierung aus natürlichen Quellen von Rijken et al., J. Biol. Chem., 256, 7035 (1981), und in EP-A-041.766, beschrieben. Außerdem wurden eine Patentschrift und verschiedene Patentanmeldungen veröffentlicht, welche die Struktur und die Isolierung von t-PA aus rekombinanten Quellen detailliert darlegen (siehe z.B. UK-Patent Nr. 2.119.804; und EP-A-093.619).
Monoklonale Antikörper, die sich an menschlichen t-PA binden, sich aber nicht an Schweine-t-PA binden, wurden bereits hergestellt; EP-A-190.711 betrifft beispielsweise monoklonale Antikörper, die für jenen menschlichen Gewebeplasminogenaktivator spezifisch sind, der aus einer Gewebekulturbrühe normaler, aus menschlichem Gewebe stammender Zellen erhalten wird. Es wird die Verwendung dieser monoklonalen Antikörper bei der Reinigung von menschlichem t-PA und in einem Assay auf menschlichen t-PA geoffenbart. Monoklonale Antikörper X-21 und X-23 zeigten keine Kreuzreaktion mit Urokinase oder Plasminogenaktivator (aus Schweineherzen extrahiert).
EP-A-210.870 offenbart ein Affinitätsreagens, das einen immobilisierten Kunitz-Inhibitor enthält, der in den Samen von Erythrina Iatissima und anderen Erythrina-Pflanzen produziert wird. Das Affinitätsreagens ist angeblich in der Lage, von menschlichen Zellen stammenden t-PA und von Wirtszellen stammenden Plasminogenaktivator voneinander zu trennen.
Verheijen et al., EMBO Journal, Bd. 5, Nr. 13, S.3525-3530 (1986) offenbaren die Gegenwart von CHO-PA beim Exprimieren von menschlichem t-PA in CHO-Zellen.
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Reinigung eines rekombinanten Proteins, z.B. von menschlichem t-PA, bis zu einem hohen Reinheitsgrad durch eine wesentliche Herabsetzung des entsprechenden endogenen Proteins der Wirtszelle, z.B. des chinesischen Hamster-Plasminogenaktivators, bereitzustellen.
Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, monoklonale Antikörper gegen den chinesischen Hamster-Plasminogenaktivator bereitzustellen.
Ein weiteres Ziel besteht darin, einen Assay auf chinesischen Hamster- Plasminogenaktivator bereitzustellen.
Andere Ziele, Merkmale und Eigenschaften der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung in Verbindung mit den beigelegten Ansprüchen.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung eines rekombinanten Proteins von einem entsprechenden endogenen Protein der Wirtszelle, umfassend die Schritte des In-Kontakt-Bringens der das rekombinante Protein enthaltenden Flüssigkeit mit Antikörpern, die das entsprechende endogene Protein spezifisch binden, und des Gewinnens des rekombinanten Proteins. Die Erfindung betrifft auch einen Assay auf das entsprechende endogene Protein, sowie die monoklonalen Antikörper, die das entsprechende endogene Protein spezifisch binden.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Es wurde entdeckt, daß rekombinante Proteine aus verwandten Wirtszellenproteinen durch Immunreinigung unter Verwendung monoklonaler Antikörper isoliert werden können. Die Erfindung betrifft ein Verfahren, worin eine Flüssigkeit, die durch Kultivieren einer Wirtszelle erhalten wird, welche ein rekombinantes Protein sowie die entsprechenden endogenen Proteine der Wirtszelle exprimiert, mit Antikörpern in Kontakt gebracht wird, die das entsprechende endogene Protein spezifisch binden. Die monoklonalen Antikörper binden das entsprechende endogene Protein, woraufhin das menschliche rekombinante Protein gewonnen wird. Genauer gesagt, wenn der menschliche Gewebeplasminogenaktivator (t-PA) in rekombinanter Weise in chinesischen Hamstereierstock-(CHO-)Zellen erzeugt wird, kann der menschliche t-PA mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens aus dem oder den endogenen chinesischen Hamster-Plasminogenaktivator(en) (CHO-PA) isoliert werden.
Die vorliegende Erfindung bietet ein Verfahren, worin eine Flüssigkeit, die durch Kultivieren von CHO-Zellen erhalten wird, welche menschlichen t-Pa sowie den chinesischen Hamster-Plasminogenaktivator (PA) exprimieren, mit Antikörpern, günstigerweise monoklonalen Antikörpern, in Kontakt gebracht wird, die den chinesischen Hamster-PA binden. Der menschliche t-PA wird nicht gebunden und eine Trennung bewirkt. Die vorliegende Erfindung betrifft auch monoklonale Antikörper, die für chinesischen Hamster-PA spezifisch sind, sowie einen Assay zum Nachweis der Gegenwart von chinesischem Hamster-PA.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist gegenüber dem Einsatz von menschlichen t-PA spezifisch bindenden Antikörpern vorzuziehen, da letzteres Verfahren ein Reinigungsmittel, wie z.B. eine Säule, erfordert, das mehrere Größenordnungen größer ist als das erfindungsgemäße Verfahren, da die Konzentration von menschlichem t-PA mehrere Größenordnungen höher ist als die Konzentration von CHO-PA. Im erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt außerdem keine Behandlung des interessierenden Produkts mit denaturierenden Mitteln oder unter anderen rauhen Bedingungen, um das Produkt aus dem Antikörper zu eluieren.
Die hierin verwendeten Ausdrücke "menschlicher Gewebeplasminogenaktivator", "menschlicher t-PA" oder "t-PA" beziehen sich auf den menschlichen exogenen (Gewebetyp-)Plasminogenaktivator, der beispielsweise durch Extraktion aus natürlicher Quelle und Reinigung (siehe Collen et al., oben) sowie durch hierin beschriebene rekombinante Zellkultursysteme produziert wird. Seine Sequenz und Eigenschaften sind z.B. in EP-A-93.619 (veröffentlicht am 9. November 1983), die auf einer ersten Anmeldung vom 5. Mai 1982 basiert, dargelegt. Siehe auch EP-A-41.766 (veröffentlicht am 16. Dezember 1981), die auf einer ersten Anmeldung vom 11. Juni 1980 basiert, und Rijken et al., Journal of Biol. Chem. 256, 7035 (1981). Die Ausdrücke umfassen ebenso biologisch aktive Äquivalente zu menschlichem Gewebeplasminogenaktivator, die sich in der Gesamtsequenz in einer oder mehreren Aminosäuren oder im Glykosylierungsmuster unterscheiden. Die hierin verwendeten Ausdrücke umfassen die weiters Substitutions-, Löschungs- und Einfügungs-Aminosäurevarianten von t-PA oder posttranslationale Modifikationen.
Menschlicher t-PA kann durch Transfizieren einer Vielzahl von eukaryotischen Zellen, wie z.B. Babyhamster-Nierenzellen, Myelomzellen, Insektenzellen, 3T3-Zellen, und anderen transfizierbaren Zellen mit einer geeigneten posttransfektionalen Lebensdauer hergestellt werden. Günstigerweise werden chinesische Hamstereierstock-(CHO-)Zellen verwendet.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurden spezifisch CHO-PA bindende monoklonale Antikörper aus kontinuierlichen Hybridzellinien isoliert, die durch Fusion von antigengeprimten Immunlymphozyten mit Myelomzellen gebildet wurden. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden spezifisch CHO-PA bindende polyklonale Antikörper verwendet.
Monoklonale Antikörper sind äußerst spezifisch, da sie gegen eine einzelne antigene Stelle gerichtet sind. Im Gegensatz zu herkömmlichen (polyklonalen) Antikörperpräparaten, zu denen typischerweise unterschiedliche Antikörper zählen, die gegen unterschiedliche Determinanten (Epitope) gerichtet sind, ist weiters jeder monoklonale Antikörper gegen eine einzelne Determinante auf dem Antigen gerichtet. Monoklonale Antikörper eignen sich zur Verbesserung der Selektivität und Spezifität diagnostischer und analytischer Assayverfahren unter Nutzung der Antigen-Antikörper- Bindung. Ein zweiter Vorteil monoklonaler Antikörper liegt darin, daß sie mittels der Hybridomkultur nicht durch andere Immunglobuline kontaminiert synthetisiert werden. Monoklonale Antikörper können aus den Überständen kultivierter Hybridomzellen oder aus durch intraperitoneale Impfung von Hybridomzellen in Mäuse induziertem Aszites erhalten werden.
Die ursprünglich von Kohler und Milstein, Eur. J. Immunol. 6, 511 (1976) beschriebene Hybridom-Technik wird sehr häufig angewandt, um Hybridzellinien zu erzeugen, die große Mengen an monoklonalen Antikörpern gegen zahlreiche spezifische Antigene sekretieren.
Die Art und Weise sowie der Zeitplan der Immunisierung des Wirtstiers oder dessen kultivierten, antikörper-produzierenden Zellen entsprechen im allgemeinen etablierten und herkömmlichen Verfahren zur Antikörperstimulation und -produktion. Die Anmelder verwendeten Mäuse als Versuchsmodell, obwohl es gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung auch möglich ist, jedes beliebige Säugetier einschließlich des Menschen und der daraus stammenden antikörper-produzierenden Zellen zu manipulieren, um als Grundlage der Produktion von Säugetier-Hybridzellinien (einschließlich von menschlichen) zu dienen.
Nach der Immunisierung werden Immunlymphzellen mit Myelomzellen fusioniert, um eine Hybridzellinie zu erzeugen, die kultiviert und unbegrenzt subkultiviert werden kann, um große Mengen an monoklonalen Antikörpern zu produzieren. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung sind die zur Fusion ausgewählten Immunlymphzellen Lymphozyten und deren normale, differenzierte Nachkommenschaft, die entweder aus dem Lymphknotengewebe oder Milzgewebe immunisierter Tiere entnommen wurden. Die Anmelder ziehen es vor, immune Milzzellen zu verwenden, da diese hinsichtlich des Mäusesystems eine konzentriertere und bequemere Quelle für antikörperproduzierende Zellen bieten. Die Myelomzellen liefern die Grundlage für die kontinuierliche Vermehrung des fusionierten Hybrids. Myelomzellen sind Tumorzellen, die von Plasmazellen abstammen.
Es ist möglich, Zellen einer Spezies mit einer anderen zu fusionieren. Es ist jedoch vorzuziehen, daß die Quelle der immunisierten, antikörper-produzierenden Zellen und des Myeloms von der gleichen Spezies stammt.
Die Hybridzellinien können in vitro im Zellkulturmedium in Kultur gehalten werden. Die erfindungsgemäßen Zellinien können selektiert und/oder im wesentlichen unbegrenzt in einer Zusammensetzung gehalten werden, die die kontinuierliche Zellinie im bekannten Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin-(HAT-)Medium enthält. Sobald die Hybridomzellinie gebildet wurde, kann sie auf vielerlei hinsichtlich der Nährstoffe geeigneten Medien gehalten werden. Außerdem können die Hybridzellinien auf jede beliebige, herkömmliche Weise gelagert und konserviert werden, z.B. durch Einfrieren und Lagern unter flüssigem Stickstoff. Eingefrorene Zellinien können bei wiedereinsetzender Synthese und Sekretion von monoklonalem Antikörper wiederbelebt und unbegrenzt lange kultiviert werden. Der sekretierte Antikörper wird nach herkömmlichen Verfahren, wie z.B. Fällung, Ionenaustausch, Affinitätschromatographie od.dgl. aus dem Gewebekulturüberstand gewonnen.
Als Alternative zum Zellfusionsverfahren werden EBV-immortalisierte B-Zellen zur Produktion der monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung herangezogen. Andere Verfahren zur Erzeugung monoklonaler Antikörper, wie z.B. rekombinante DNA-Verfahren, sind auch denkbar.
Es werden hierin serologische Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart von CHO-PA beschrieben. Im wesentlichen umfassen die erfindungsgemäßen Verfahren das Inkubieren oder auf andere Weise erfolgende In-Kontakt-Bringen der zu testenden Probe mit monoklonalen Antikörpern und das Nachweisen der Gegenwart eines Reaktionsprodukts. Für Fachleute auf dem Gebiet ist offenkundig, daß es viele Variationen dieser grundlegenden Vorgangsweisen gibt. Dazu zählen beispielsweise RIA, ELISA, Fällung, Agglutination, Komplementfixierung und Immunofluoreszenz. In den derzeit bevorzugten Vorgangsweisen werden die monoklonalen Antikörper in geeigneter Weise markiert. Ein geeigneter Marker für diesen Assay ist ein radioaktives Isotop, insbesondere ¹²&sup5;I. Es sind jedoch auch Enzyme, insbesondere Peroxidase, von Nutzen.
Der Antikörper wird mit einem radioaktiven Element, einem Enzym oder einem fluoreszierenden Material markiert. Der Radiomarker kann nach beliebigen, derzeit verfügbaren Zählverfahren nachgewiesen werden. Die bevorzugten Isotopmarker sind ¹&sup4;C, ¹³¹I, ¹²&sup5;I, ³H und ³&sup5;S. Der Enzymmarker kann nach jedem der derzeit angewandten kolon metrischen, spektrophotometrischen, fluoreszenzspektrophotometrischen oder gasometrischen Verfahren nachgewiesen werden. Das Enzym wird mit dem Antikörper über Brückenmoleküle, wie z.B. Carbodiimiden, Periodat, Diisocyanaten, Glutaraldehyd u.dgl., kombiniert. Viele Enzyme, die in diesen Verfahren zum Einsatz kommen können, sind bekannt und können verwendet werden. Beispiele dafür sind Peroxidase, alkalische Phosphatase, β-Glucuronidase, β-D-Glucosidase, β-D- Galactosidase, Urease, Glucoseoxidase + Peroxidase, Galactoseoxidase + Peroxidase und saure Phosphatase. Geeignete fluoreszierende Materialien sind z.B. Fluorescein, Rhodamin und Auram in. In Morrison, Methods in Enzymology 32b, 103 (1974); Syvanen et al., J. Biol. Chem. 284, 3762 (1973) und Bolton und Hunter, Biochem. J. 133, 529 (1973), werden verschiedene Markierungsverfahren beschrieben.
Die folgenden Beispiele dienen dazu, die Erfindung ausführlicher zu beschreiben und beschränken keinesfalls deren Schutzumfang.

EXPERIMENTELLER TEIL

1. MONOKLONALE ANTIKÖRPER GEGEN CHO-PA

A. Immunisierungsverfahren

Eine weibliche Balb/c-Maus wurde 12 Wochen lang mit Proteinlösungen immunisiert, die im wesentlichen an chinesischem Hamster-Plasminogenaktivator angereichert waren, der aus Wirtszellen gereinigt worden war, die das menschliche t-PA-Gen nicht aufwiesen. Es erfolgten fünf Injektionen von jeweils etwa 30 µg. Die erste Injektion wurde mit vollständigem Freund'schem Adjuvans emulgiert und an einer subkutanen Stelle verabreicht. Die zweite Injektion (1,5 Wochen später) wurde mit unvollständigem Freund'schem Adjuvans emulgiert sowie zur Hälfte subkutan und zur Hälfte intraperitoneal verabreicht. Die übrigen drei Injektionen wurden in den Wochen 3, 6 und 12 in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) an einer intraperitonealen Stelle verabreicht.

B. Fusion und Selektion CHO-PA-spezifischer monoklonaler Antikörper

Die Milz der immunisierten Maus wurde in Woche 13 entfernt und die Milzzellen mit der Mäus-Myelomzellinie NP3X63-Ag8.653 gemäß den allgemeinen Verfahren nach S. Fazekas, de St. Groth und D. Scheidegger (J. Immunol. Methods 35, 1 (1980)) und Lane, R.D. (J. Immunol. Methods 81, 223 (1985)) fusioniert. Die fusionierten Zellen wurden auf 10 Mikrotiterplatten mit jeweils 96 Näpfen verteilt. Jeder Napf wurde mittels der Reaktivitätsdifferenz in zwei ELISA-Versuchen (enzymgebundene Immunadsorptions- Assays) auf die Produktion spezifischer Antikörper gescreent. In einem ELISA konnten Antikörper gegen CHO-PA spezifisch nachgewiesen werden, im zweiten wurden Antikörper nachgewiesen, die mit rekombinantem menschlichem Gewebeplasminogenaktivator (t-PA) kreuz reagierten.
Für den CHO-PA-spezifischen ELISA wurden 50 ng/ml CHO-PA in 50 mM Carbonatpuffer (pH 9,6) über Nacht bei 4ºC an Mikrotiter-Näpfe adsorbiert. Das Antigen wurde entfernt und die Näpfe mit phosphatgepufferter Salzlösung, die 0,05% Tween 20 enthielt (PBS-TW20), gewaschen. Weitere Adsorption wurde durch Zugabe von 1% Gelatine in Tris-gepufferter Salzlösung (TBS; 0,15 M NACl, 0,05 M Tris, pH 7,4) zu den Näpfen und durch einstündiges Inkubieren bei Raumtemperatur inhibiert. Nach dem Abdampfen des Inhalts wurden 0,05 ml PBS mit 5 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA) in jeden Napf gefüllt, bevor 0,1 ml Überstand aus jedem Napf der Fusionsplatte zugegeben wurde. Nach zweistündigem Inkubieren bei Raumtemperatur wurde der Inhalt jedes Napfes abgesaugt und dreimal mit PBS-TW20 gewaschen. An Meerrettich- Peroxidase gebundenes Ziegen-Anti-Mäuse-Immunoglobulin wurde zugegeben, gefolgt von einstündiger Inkubation bei Raumtemperatur. Die Näpfe wurden dreimal mit PBS- TW20 gewaschen und o-Phenylendiamin als Substrat zugegeben; dann erfolgte eine 30- minütige Inkubation bei Raumtemperatur. Die Reaktion wurde mit 2,5 M H&sub2;SO&sub4; abgebrochen und das Absorptionsvermögen jedes Napfes bei 492 nm abgelesen.
Der für menschlichen t-PA spezifische ELISA unterschied sich bezüglich des ersten Schritts vom CHO-PA-spezifischen ELISA. 200 ng/ml t-PA in 50 mM Carbonatpuffer (pH 9,6) wurden über Nacht bei 4ºC an Mikrotiternäpfe adsörbiert. Der übrige ELISA war identisch.
Etwa 5% aller Näpfe reagierten nur mit CHO-PA und 3% nur mit CHO-PA und menschlichem t-PA. Hybridomzellen aus Näpfen mit CHO-PA-spezifischen Antikörpern wurden expandiert und mittels Grenzverdünnung kloniert (Oi, V.T. und Herzenberg, L.A. 1980, Immunoglobin-Producing Hybrid Cell Lines, S. 351-372, in: Selected Methods in Cellular Immunology, Mishell, B.B. und Shiigi, S.M. (Hrsg.), W.H. Freeman and Co.). Große Mengen spezifischer monoklonaler Antikörper wurden durch Zellkultur der Hybridomzellen oder durch Injektion der Hybridomzellen in Mäuse produziert, wodurch Aszitestumoren entstanden.

II. CHO-PA-SPEZIFISCHER ELISA

Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen Assay auf Basis monoklonaler Antikörper zur Quantifizierung des chinesischen Hamstereierstockzellen-Plasminogenaktivators (CHO-PA). Immunassays unter Verwendung spezifischer monoklonaler Antikörper stellen einen Ansatz zur Quantifizierung geringer Mengen einer solchen Proteinverunreinigung dar, die in Gegenwart eines großen Überschusses des biochemisch verwandten, rekombinanten Produkts vorliegt. Ein ELISA, der CHO-PA und nicht menschlichen t-PA spezifisch nachweist, wurde unter Verwendung von zwei CHO-PA-spezifischen, als 335 und 361 bezeichneten monoklonalen Antikörpern (MABs) entwickelt. Diese MABs wurden nach ihrer Fähigkeit, ¹²&sup5;I-markierten CHO-PA zu binden, ihrer minimalen Kreuzreaktivität mit menschlichem t-PA und aufgrund der Tatsache ausgewählt, daß sie sich jeweils an ein anderes Epitop auf CHO-PA banden. Diese Antikörper zeigten eine positive Reaktivität mit CHO-PA, reagierten jedoch nicht mit menschlichem t-PA, der kein CHO-PA mehr aufwies. Die Fähigkeit jedes MABs zur Bildung von CHO-PA wurde ermittelt, indem die Menge an ¹²&sup5;I-markiertem CHO-PA bestimmt wurde, die sich an jeden MAB band, der nicht-spezifisch an Mikrotiternäpfen adsorbiert war. Um festzuhalten, daß sich die MABs 361 und 335 an verschiedene Epitope banden, wurde der ¹²&sup5;I-markierte CHO-PA mit einem MAB in Lösung vorinkubiert, bevor das Gemisch dem den zweiten MAB enthaltenden Mikrotiternapf zugegeben wurde. Wenn der erste MAB die Bindung des ¹²&sup5;I-markierten CHO-PA an den zweiten MAB nicht hemmte, wurden sie als gegen unterschiedliche Epitope gerichtet eingestuft.
Die Kreuzreaktivität der MABs mit menschlichem t-PA wurde durch ELISA ermittelt. Jeweils 100 ng von CHO-PA oder t-PA wurden an Mikrotiternäpfe adsorbiert. Verschiedene Verdünnungen der gereinigten MABs wurden mit jedem Antigen umgesetzt und die Menge an gebundenem Antikörpers mittels an Meerrettich- Peroxidase konjugiertem Ziegen-Anti-Mäuse-Antikörper bestimmt. Die Kreuzreaktivität wurde aus den Verdünnungen errechnet, die für einen bestimmten MAB bei CHO-PA und menschlichem t-PA zum gleichen Absorptionsvermögen führten.
Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wurde ein CHO-PA-spezifischer "Sandwich"-ELISA unter Verwendung von MAB 335 entwickelt, um Mikrotiternäpfe zu beschichten; MAB 361 wurde an Meerrettich-Peroxidase konjugiert, um gebundenen CHO-PA nachzuweisen. Der Assaystandard ist klonierter CHO-PA, der in CHO-Zellen exprimiert wurde. Der Assay ist präzise und für den Nachweis und die Quantifizierung von CHO- PA spezifisch. Die Empfindlichkeit (Nachweisgrenze) dieses ELISA beträgt etwa 3,9 ng/ml CHO-PA und die Kreuzreaktivität mit menschlichem t-PA weniger als etwa 0,002%.
Zur Untersuchung der Spezifität des Assays selbst wurde menschlicher t-PA, der CHO- PA enthielt, über eine Sepharose 4B-Säule laufen gelassen, an die der monoklonale Antikörper 341 gekoppelt war, welcher für CHO-PA spezifisch ist. Das Material, das durch diese Säule hindurchfloß, war menschlicher t-PA, der kein CHO-PA mehr aufwies und daher eine geeignete Probe zur Bestimmung der Assayspezifität darstellte. Antikörper 341 ist gegen eine andere antigen Determinante auf CHO-PA gerichtet als die Antikörper 335 oder 361. Somit verhindert die Reinigung von menschlichem t-PA mit diesem Antikörper die Reinigung und anschließende Messung von CHO-PA mittels des gleichen Antikörpers (d.h. gegen die gleiche antigene Determinante gerichtet). Tabelle 1 zeigt die Assaywerte, die bei der Immunaffinitätsreinigung von CHO-PA von menschlichem t-PA unter Verwendung dieses Antikörpers erhalten werden. Tabelle 1 REINIGUNG VON MENSCHLICHEM t-PA VON CHO-PA MITTELS MONOKLONALER ANTIKÖRPER-SÄULE (Nr. 341)a 1A. Senkung der Menge an CHO-PA im Eluat der Säule b Eluat-Fraktion Nr. CHO-PA (% der Anfangskonzentration) Menschlicher t-PA (% der Anfangskonzentration) x-fache Senkung der Menge an CHO-PA-Menge 1B. Elution von CHO-PA aus der monoklonalen Antikörper-Säule mit 0,2 M Glycin-HCl, pH 2,4 c Probe CHO-PA (µg) Menschlicher t-PA (µg) %-Reinheit des CHO-PA Glycin-HCl-Säuleneluat
a: Die Lösung mit menschlichem t-PA (100 ml) wurde durch die Säule geschickt und Fraktionen (jeweils 1,67 ml) des Eluats abgenommen. Bei Fraktion 51 begann das Waschen mit PBS, die 1 M NaCl enthielt. Bei Fraktion 100 begann die Elution mit Glycin-HCl, und das Volumen der Fraktionen wurde auf 2,5 ml angehoben.
b: Drei repräsentative Fraktionen des Eluats wurden auf CHO-PA untersucht. Die Konzentration an menschlichem t-PA wurde durch das Absorptionsvermögen bei 280 nm unter Annahme eines Extinktionskoeffizienten von 1,9 für menschlichen t-PA bestimmt.
c: Die spezifische Entfernung von CHO-PA wurde durch den Assay des Glycin-HCl- Eluats auf CHO-PA und menschlichen t-PA aufgezeigt. Der Gehalt an menschlichem t- PA wurde mittels eines auf monoklonalen Antikörper basierenden ELISA auf menschlichen t-PA bestimmt.
Aus diesen Daten ist ersichtlich, daß die CHO-PA-Menge etwa um das 100fache oder stärker gesenkt wurde, was durch Vergleich des Prozentsatzes an CHO-PA im Ausgangsmaterial mit dem höchsten der Eluatfraktionen bestimmt wurde. Der adsorbierte CHO-PA, der mit 0,1 M Glycin-CHl oder 3 M NaSCN aus dieser Säule eluiert wurde, wies weiters eine Reinheit von 67-94% auf, wobei der Glycin-HCl-Pool 95% CHO-PA enthielt. Bei Anwendung einer konservativen Methode, die davon ausgeht, daß im Assay die gesamte Reaktivität im Eluat das Ergebnis von Kreuzreaktivität ist, ergibt dies eine Kreuzreaktivität von höchstens 0,002%.
Zur Bestimmung der Genauigkeit wurde rekombinanter CHO-PA in eine rt-PA-Probe gespiked, die durch Immunaffinitätschromatographie von endogenem CHO-PA befreit worden war. Die Spike-Rückgewinnungsanalyse von unabhängig voneinander in Konzentrationen von 11,5 und 31,5 ng/ml zugesetzten CHO-PA zeigte eine mittlere Rückgewinnung von 103 bzw 105%. Diese Daten beweisen, daß der Assay CHO-PA in Gegenwart von menschlichem t-PA genau nachweisen kann. Tabelle 2 RÜCKGEWINNUNG VON ZU MENSCHLICHEM t-PA ZUGEGEBENEM CHO-PA Endogener CHO-PA ng/ml Zugegebener CHO-PA ng/ml Erwarteter a CHO-PA ng/ml Rückgewonnener CHO-PA ng/ml %-Rückgewinnung b a: Erwartet = Endogen + Zugegeben b: Rückgewinnung = Rückgewonnen/Erwartet x 100

III. Selektion von monoklonalen Antikörpern gegen CHO-PA zur Entfernung von CHO- PA im t-PA-Herstellungsverfahren

In Modellversuchen senkte der immobilisierte monoklonale Antikörper Nr. 354 die Menge an CHO-PA in einem einzigen Säulendurchgang um mehr als das 100fache. Der Antikörper ist gegenüber mehereren unterschiedlichen Arten der Immobilisierungschemie und gegenüber rauhen Waschbedingungen stabil. Geeignet konfigurierte MAB 354-Affinitätssäulen können oftmals wiederverwendet werden, um CHO-PA aus abgenommenen, rekombinanten, menschlichen t-PA-Flüssigkeiten ohne nennenswerte Verluste der Bindungsaktivität zu entfernen. Somit eignet sich eine MAB 354-Säule zur Verwendung als wiederverwendbarer, biospezifischer Filter zur Entfernung von Spurenmengen an CHO-PA aus menschlichem t-PA, wie unten dargestellt.
Acht verschiedene, gegen CHO-PA gerichtete Aszites-Flüssigkeiten wurden durch ELISA auf direkte Bindung an die CHO-PA-Beschichtung getestet. Polystyrol-ELISA-Platten wurden mit 1 µg affinitätsgereinigtem CHP-PA pro Napf in Carbonatpuffer (pH 9,6) bei 4ºC über Nacht passiv beschichtet und anschließend mit 0,5% BSA in PBS blockiert. Protein A-gereinigte MABs wurden titriert und nach der CHO-PA-Bindung gereiht. Jeder MAB wurde im ersten Napf 1/200 verdünnt, danach in Reihenversuchen jeweils auf das Doppelte verdünnt und bei Raumtemperatur 2 Stunden lang inkubiert. Ziegen-Anti- Mäuse-IgG-HRP-Konjugat wurde anschließend zum Nachweis von gebundenem Antikörper verwendet (1 Stunde lang bei RT bei einer Verdünnung von 1/40.000 inkubiert). Die Farbentwicklung wurde durch Zugabe von OPD-Substrat über 30 min und durch Abbruch der Reaktion mittels Zugabe von Säure erzielt. Die OD&sub4;&sub9;&sub2; wurde dann mittels eines ELISA-Plattenlesers abgelesen. Wenn die ELISA-Titer nach der Konzentration gereiht wurden, wurde die folgende Reihung erhalten: CHO-PA MAB 354 = 359 = 361 = 335 (waren nicht zu unterscheiden) banden sich jedoch fester an CHO-PA-beschichtete Platten als 327 > 360 > 341 > 325.
Elutionsuntersuchungen auf der Grundlage von ELISA wurden ebenfalls durchgeführt. Die Analyse des Elutionsverhaltens bei den verschiedenen MABs erfolgte mit mehreren Puffern, z.B.: Essigsäure (pH 3,0 und 2,0) mit wenig (0,15 M) und viel (1,5 M) NACl; Natriumthiocyanat 3M, pH 8,5, pH 10,0; 2 M Natriumthiocyanat pH 8,5 und pH 5,2; 2,0 M MgCl&sub2;, pH 5,2; und Glycin, pH 5,2 (alles potentielle Affinitätssäulen- Elutionsmittel). Die monoklonalen Antikörper zeigten gegenüber diesen Reagentien unterschiedliche Empfindlichkeitsmuster. Beispielsweise wurden 354 und 361 vom plattenbeschichteten CHO-PA unter sauren Bedingungen leicht entfernt; 359 und 361 waren gegenüber 3 M NaSCN (pH 8,5) als Puffer resistent. Der 354-MAB wurde durch ein breites Spektrum an Elutionsmitteln entfernt.
Um unter jenen, die zur Entfernung von CHO-PA aus abgenommenen Flüssigkeiten mit rekombinantem t-PA gebildet wurden, den besten MAB zu definieren, wurden sieben unterschiedliche CHO-MABs in einer Kupplungsmenge von 1 mg pro ml Harz an mit CNBr aktivierte Sepharose CL 4B immobilisiert (ein allgemein angewandtes Verfahren zur MAB-Immobilisierung). Nicht umgesetzte Stellen wurden mit Ethanolamin blockiert. Sieben getrennte, kleine Säulen wurden mit jeweils 1 ml Affinitätsharz gepackt. Die Affinitätssäulen wurden dann mit Essigsäure 0,1 M, 0,15 M NACl, pH 3,0, gewaschen, gefolgt von PBS, pH 7,4, mit 0,5 M L-Arginin (PBS). Jede Säule wurde dann auf die Fähigkeit getestet, CHO-PA-Verunreinigungen aus der aus Zellkultur stammenden abgenommenen Flüssigkeit mit rekombinantem t-PA zu entfernen.
20 ml der abgenommenen Flüssigkeit mit rekombinantem t-PA wurde auf jede Säule aufgebracht, die alle mit dem 30fachen Säulenvolumen an PBS gewaschen wurden. Das Eluat der abgenommenen Flüssigkeit mit rekombinantem t-PA wurde nach der chromatographischen Trennung auf CHO-PA geprüft. Die verschiedenen Affinitätssäulen wurden auf der Grundlage der im Eluat verbleibenden CHO-PA-Menge gereiht (Tabelle 3). In einem Vergleichsversuch wurde abgenommene Flüssigkeit mit rekombinantem t-PA auf eine mit Ethanolamin blockierte und keinen Antikörper enthaltende Sepharose CL 4B-Säule aufgebracht. Wie unten gezeigt, war MAB 354 hinsichtlich der Entfernung von CHO-PA überlegen. Man beachte weiters, daß die Essigsäure-Elutionsmittel aus jeder Säule mittels SDS-Gel-Analyse analysiert und mit der abgenommenen Flüssigkeit mit rekombinantem t-PA und gereinigten rekombinanten CHO-PA-Standards verglichen wurden. Eluiertes Protein, das aus den meisten Äffinitätssäulen erhalten wurde, wanderte zusammen mit dem rekombinanten CHO-PA- Standard, was ein Anzeichen dafür ist, daß die untersuchten MABs hinsichtlich CHO- PA-Spurenverunreinigungen stark selektiv und mit menschlichem t-PA nicht kreuzreaktiv waren. Tabelle 3 REIHUNG DER SÄULEN Reihung (beste zuerst) Immobilisierter CHO-PA MAb Gesamtprozentsatz an CHO-PA im Eluat Vergleich mit Ethanolamin blockiert
Beweise für die 354 MAB-Stabilität gegenüber verschiedenen Arten von Immobilisierungschemie, chaotropen Elutionsmitteln, niedrigen pH-Werten und mehrfachen Wiederverwendungen der Säulen wurden mit drei verschiedene Arten von Chromatographieversuchen erhalten. Zunächst wurde MAB 354 an mit CNBr aktivierte Sepharose CL 4B immobilisiert und in Affinitätssäulenversuchen eingesetzt, um rekombinanten CHO-PA aus Zellkulturflüssigkeiten zu reinigen. MAB 354 schien in mehreren Reinigungszyklen stabil zu sein, wenn NaSCN 2M, pH 8,5 und pH 3,0 Glycin zur CHO-PA-Elution und Säulenregeneration verwendet wurde.
Zweitens wurde MAB 354 an Sepharose 6 Fast Flow immobilisiert, die nach dem Verfahren von Bethell et al. (J. Biol. Chem. 254 (8), S. 2572-2574, 1979) durch Carbonyldiimidazol aktiviert worden war. Dieses Harz diente dazu, CHO-PA aus teilweise gereinigten Präparaten von menschlichem t-PA zu entfernen. Die Mengen an CHO-PA wurden um das zumindest 100fache gesenkt, und das Harz zeigte über zumindest 60 Zyklen, worin 3 M NaSCN, pH 8, als Regenerationsmittel verwendet wurde, keine Funktionsänderung.
Drittens wurde MAB 354 an ein mit N-Hydroxysuccinimid aktiviertes AffiPrep-Harz von BioRad immobilisiert und bei 4ºC auf die Fähigkeit getestet, den aus abgenommener t- PA-Flüssigkeit stammenden CHO-PA zu entfernen. Die Möglichkeit, die 354- Affinitätssäule wiederzuverwenden, wurde ebenfalls untersucht. Monoklonaler Antikörper wurde in 3 mg/ml Harz angekoppelt. Die Säulenflußrate wurde auf das 20fache Säulenvolumen pro Stunde fixiert. Die Säule wurde mit dem 25fachen Säulenvolumen an unkonzentrierter, abgenommener t-PA-Flüssigkeit beladen, mit dem 20fachen Säulenvolumen PBS-Puffer gewaschen, mit dem 5fachen Säulenvolumen 2,0 M Guanidin-HCl in 0,2 M Essigsäure, pH 3,0, regeneriert und anschließend mit dem 10fachen Säulenvolumen an PBS erneut äquilibriert. Die Mengen an CHO-PA in den t- PA-Ausgangsflüssigkeiten wurden in einem einzigen Säulendurchgang um mehr als das 100fache gesenkt, wobei nach 100 Wiederverwendungen der Säule kein nachweisbarer Verlust an Bindungsaktivität zu beobachten war. Somit wurde 354 MAb unter simulierten Verfahrensbedingungen erfolgreich als wiederverwendbarer, biospezifischer Filter zur Entfernung von CHO-PA eingesetzt.
Obwohl die dargelegten Ausführungsformen die Abtrennung von CHO-PA aus menschlichem t-PA betreffen, kann das erfindungsgemäße Verfahren auch in all jenen Fällen angewandt werden, wo eine transfizierte Wirtszelle ein endogenes Protein produziert, das einem rekombinanten Protein entspricht, wobei das entsprechende endogene Protein spezifisch bindende Antikörper gebildet werden können. Die Erfindung wurde zwar in Zusammenhang mit ihren offensichtlich bevorzugten Ausführungsformen beschrieben, ist jedoch nicht darauf beschränkt, sondern erstreckt sich vielmehr auch auf verschiedene Modifikationen und Äquivalente, die im Sinne und im Schutzumfang der beigelegten Ansprüche enthalten sind, welcher Schutzumfang in der umfassendsten Weise auszulegen ist, um alle derartigen Modifikationen und Äquivalente einzuschließen.

Claims

1. Verfahren zur Reinigung von aus chinesischen Hamster-Eierstock-Zellen stammendem menschlichem Gewebeplasminogenaktivator, umfassend die folgenden Schritte:

das In-Kontakt-Bringen einer den menschlichen Gewebeplasminogenaktivator enthaltenden Flüssigkeit mit Antikörpern, die den chinesischen Hamster- Plasminogenaktivator spezifisch binden, und

das Gewinnen des Gewebeplasminogenaktivators.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Antikörper monoklonale Antikörper sind, die eine antigene Determinante des chinesischen Hamster-Plasminogenaktivators binden.

3. Verfahren nach Anspruch 2, worin die monoklonalen Antikörper monoklonale Mäuse-Antikörper sind.

4. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Antikörper zwei oder mehrere antigene Determinanten des chinesischen Hamster-Plasminogenaktivators spezifisch binden.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der Schritt des In- Kontakt-Bringens das Leiten einer den menschlichen Gewebeplasminogenaktivator enthaltenden Flüssigkeit durch ein Chromatographie-Bett mit den darauf immobilisierten Antikörpern umfaßt.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die den menschlichen Gewebeplasminogenaktivator enthaltende Flüssigkeit ein Kulturmedium ist, das durch Kultivieren chinesischer Hamster-Eierstock-Zellen erhalten wird, die den menschlichen Gewebeplasminogenaktivator exprimieren können.

7. Monoklonaler Antikörper, der für den chinesischen Hamster-Plasminogenaktivator spezifisch ist.

8. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 7, der ein monoklonaler Mäuse-Antikörper ist.

9. Hybridom, das einen für den chinesischen Hamster-Plasminogenaktivator spezifischen monoklonalen Antikörper erzeugen kann.

10. Hybridom nach Anspruch 9, das ein Mäuse-Hybridom ist.

11. Verfahren zum Testen des chinesischen Hamster-Plasminogenaktivators in Gegenwart von menschlichem Gewebeplasminogenaktivator, umfassend die folgenden Schritte:

das Bereitstellen von Antikörpern, die den chinesischen Hamster-Plasminogenaktivator einer Wirtszelle spezifisch binden, wobei die Antikörper den menschlichen Gewebeplasminogenaktivator nicht binden;

das In-Kontakt-Bringen einer Flüssigkeit, die sowohl den chinesischen Hamster- Plasminogenaktivator als auch den menschlichen Gewebeplasminogenaktivator enthalten kann, mit den Antikörpern; und

das Bestimmen der Menge des an die Antikörper gebundenen chinesischen Hamster- Plasminogenaktivators.

12. Verfahren nach Anspruch 11, worin die Schritte des Bereitstellens, des In-Kontakt- Bringens und des Bestimmens einen ELISA-Assay umfassen.

13. Verfahren nach Anspruch 11, worin die Antikörper monoklonale Antikörper sind.

14. Verfahren zur Reinigung von menschlichem Gewebeplasminogenaktivator als Protein rekombinanter Expression in einer Wirtszelle von einem chinesischen Hamster- Plasminogenaktivator der Wirtszelle, umfassend die folgenden Schritte:

das In-Kontakt-Bringen einer Flüssigkeit, die den menschlichen Gewebeplasminogenaktivator und den chinesischen Hamster-Eierstock- Plasminogenaktivator enthält, mit Antikörpern, die den chinesischen Hamster- Plasminogenaktivator spezifisch binden, um einen Komplex davon zu bilden; und

das Gewinnen des menschlichen Gewebeplasminogenaktivators aus dem Komplex.

15. Verfahren nach Anspruch 14, worin die Antikörper monoklonale Antikörper sind.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 13, worin die Flüssigkeit Medium von kultivierten, rekombinanten chinesischen Hamster-Eierstock-Zellen ist.

17. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, worin die Flüssigkeit Medium von kultivierten, rekombinanten chinesischen Hamster-Eierstock-Zellen ist.