DE3810331A1 - Monoklonale vac-antikoerper - Google Patents

Description

In den meisten Säugetieren existieren Proteine, die blutgerinnungshemmende Eigenschaften aufweisen. Diese Proteine können in drei Gruppen eingeteilt werden, wobei die Einteilung auf den unterschiedlichen Wirkmechanismen beruht.

• 1. Proteine, die mit dem Gerinnungsfaktor einen Komplex bilden und dadurch den Gerinnungsfaktor unwirksam machen. Dazu gehören die Proteine:
  • a) Antithrombin-III (Thromb.Res.5, 439-452 (1974))
  • b) α ₁-Protease Inhibitor (Ann. Rev. Biochem. 52, 655-709 (1983))
  • c) α ₂-Makroglobulin (Ann. Rev. Biochem. 52, 655-709 (1983))
  • d) C₁-Inhibitor (Biochemistry 20, 2738-2743 (1981))
  • e) Protease Nexin (J. Biol. Chem. 258, 10439-10444, (1983)).
• 2. Proteine, die einen Gerinnungsfaktor proteolytisch zerschneiden und dadurch den Gerinnungsfaktor desaktivieren. Als einziges Protein dieser Art ist bisher Protein C beschrieben (J. Biol. Chem. 251, 355-363, (1976)).
• 3. Proteine, die die negativ geladenen Phospholipide abschirmen und/oder hydrolisieren, so daß die Phospholipid-abhängigen Reaktionen des Blutgerinnungsmechanismus gehemmt werden. Bisher sind nur Phospholipasen, die aus verschiedenen Schlangengiftsorten isoliert wurden, beschrieben worden (Eur. J. Biochem. 112, 25-32 (1980)).

Alle bisher als Antikoagulantien eingesetzten Mittel, ob körpereigener oder synthetischer Natur machen in irgendeiner Weise die Gerinnungsfaktoren unwirksam und führen dadurch zu Nebenwirkungen, die sich nachteilig auf den Gerinnungsprozeß auswirken können.

Überraschenderweise konnten nun neben diesen Proteinen weitere körpereigene Stoffe isoliert werden, die zwar die gewünschten blutgerinnungshemmenden Eigenschaften unter besonderen Bedingungen zeigen, hierbei aber die Blutungsgefahr nicht erhöhen. Bei größeren Blutungen verlieren diese Proteine ihre blutgerinnungshemmenden Eigenschaften und stören dadurch bei deren Verwendung nicht die in solchen Fällen überlebensnotwendigen Gerinnungsprozesse. Da sie erstmals isoliert wurden aus stark vaskularisiertem Gewebe, wurden sie "vascular anticoagulating proteins", VAC genannt.

Die aus stark vaskularisierten Geweben wie Nabelschnurgefäßen und Placenta isolierten Proteine weisen Molekulargewichte von ca. 70×10³, ca. 60×10³, ca. 34×10³ und ca. 32×10³ auf, von denen die Substanzen mit den Molekulargewichten 34 respektive 32×10³ aus einer einzigen Polypeptidkette bestehen. Die genaue biochemische Charakterisierung dieser Proteine, sowie deren Isolierung und Reinigung findet sich in der EP-A-01 81 465 vom 21. Mai 1986.

Ihre Eigenschaften machen die Proteine zu interessanten, pharmakologisch äußerst wertvollen Wirkstoffen. Um sie jedoch in ausreichenden Mengen in hochreiner Form zur Verfügung zu haben war deren Herstellung auf anderen als proteinreinigendem Weg aus natürlichem Gewebe, nämlich auf gentechnischem Wege erforderlich.

Hierzu wurden anhand der Aminosäuresequenz von Teilen der aus stark vaskularisiertem Gewebe isolierten und hochgereinigten Proteine mit VAC-Aktivität (EPA 01 81 465) synthetische DNA-Sonden hergestellt und hiermit geeignete cDNA-Bibliotheken durchsucht. Nach Isolierung von mit den Sonden hybridisierender cDNA, deren Sequenzbestimmung sowie entsprechender Manipulation wurden diese cDNA in geeigneten Wirtssystemen beispielsweise in Bakterien, Hefen oder Säugetierzellen zur Expression gebracht. Auf diese Weise erhielt man zunächst zwei unterschiedliche cDNA, die für VAC-α bzw. VAC-β kodierten. Die Aminosäure- und DNA-Sequenz dieser Proteine ist in Fig. 1 bzw. Fig. 2 dargestellt. Bei eingehender Untersuchung stellte sich heraus, daß das natürliche und rekombinant hergestellte VAC-Protein sowohl in seiner Struktur als auch in seinen biologischen Eigenschaften praktisch übereinstimmen.

Die Eigenschaft von Antikörpern, spezifische Antigene zu binden, findet außerhalb des Körpers praktische Anwendung bei der qualitativen und quantitativen Bestimmung (Immuno-Assay) und bei der Reinigung der Antigene (Immunoaffinitätschromatographie) und innerhalb des Organismus bei der Therapie, z.B. bei der Bindung und/oder Neutralisierung ihrer Antigene. Serum immunisierter Tiere enthält normalerweise eine Vielzahl verschiedener Antikörper, die mit dem gleichen Antigen an verschiedenen Bindungsstellen mit verschiedener Affinität reagieren, dazu aber auch Antikörper gegen andere Antigene, die die früheren Erfahrungen des Individuums widerspiegeln. Die erfolgreiche Anwendung von Antikörpern zur Bestimmung und Reinigung von Antigenen erfordert aber hohe Spezifität und Reproduzierbarkeit.

Homogene Antikörper, die diese Anforderungen erfüllen, sind durch die von Köhler und Milstein (17) beschriebene Hybridoma-Technik zugänglich geworden. Prinzipiell besteht die Technik darin, daß Antikörper ausscheidende B-Lymphozyten, z.B. aus der Milz, immunisierter Tiere mit Tumorzellen verschmolzen ("fusioniert") werden. Die gebildeten Hybridoma-Zellen kombinieren die Fähigkeit zur unbegrenzten Vermehrung durch Teilung mit der Fähigkeit, einen einheitlichen Typ Antikörper zu bilden und auszuscheiden. Durch Kultivierung in einem selektiven Medium, in dem nicht fusionierte Tumorzellen absterben, Hybridoma-Zellen sich aber vermehren, und durch geeignete Manipulationen können Klone, d.h. Zellpopulationen, die sich von einer einzigen Hybridoma-Zelle ableiten und genetisch identisch sind, gewonnen und kultiviert und die durch die Zellen produzierten monoklonalen Antikörper isoliert werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft monoklonale Antikörper gegen VAC, Hybridomazellen, die solche Antikörper produzieren und Verfahren zu ihrer Herstellung. Bevorzugt sind Hybridomazellinien und die von diesen ausgeschiedenen monoklonalen Antikörper, die spezifisch mit VAC reagieren. Das Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Anti-VAC-α und Anti-VAC-β-Antikörpern ist dadurch gekennzeichnet, daß man Mäuse mit VAC immunisiert, B-Lymphozyten derart immunisierter Tiere mit Myelomazellen fusioniert, die gebildeten Hybridomazellen kloniert, dann in vitro oder durch Injektion in Mäusen kultiviert und aus den Kulturen Antikörper isoliert.

Die Erfindung betrifft ferner Immuno-Affinitäts­ chromatographie-Säulen und Test-Kits für Immunoassays, die diese Antikörper enthalten.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren werden Mäuse, z.B. Balb/c-Mäuse, auf an sich bekannte Weise immunisiert. In einer bevorzugten Ausführungsform wird VAC etwa wöchentlich oder auch in größeren Abständen während mehreren Wochen, beispielsweise 5 bis 12 Wochen, injiziert, bis sich eine genügende Zahl Antikörper-produzierender B-Lymphozyten gebildet hat.

Zur Steigerung der Immunogenität von Antigenen können diese an immunogene Träger gekoppelt werden. Eine besondere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sieht daher die Kopplung des eingesetzten VAC an stark immunogene Träger wie beispielsweise heterologes Albumin oder "keyhole limpet hemocyanin" (KLH) vor, wobei nach einem Immunisierungsschema so lange immunisiert wurde, bis sich genügend Antikörper-produzierende Zellen gebildet hatten, beispielsweise bis zu ca. 40 Wochen.

B-Lymphozyten enthaltende Organe, z. B. Milzzellen, der immunisierten Mäuse werden entnommen und mit solchen Myelomazellen fusioniert, die aufgrund einer Mutation in einem selektiven Kulturmedium nicht wachsen. Solche Myelomazellen sind bekannt und sind beispielsweise jene mit der Bezeichnung K 63-Ag8, K 63-Ag8.6.5.3, MPC-11, NS1-Ag4/1, MOPC-21 NS/1 oder SP 2/0. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Milzzellen immunisierter Mäuse mit Myelomazellen der Zell-Linie X 63-Ag8.6.5.3 fusioniert.

Die Fusion wird nach an sich bekannten Verfahren durch Mischen der B-Lymphozyten und der Myelomazellen unter Zugabe eines Zellfusionsagens, wie Polyethylenglykol, Sendai-Virus, Calciumchlorid oder Lysolecithin durchgeführt. Vorzugsweise wird in Gegenwart von Polyethylenglykol, beispielsweise mit einem Molekulargewicht zwischen 1000 und 4000, fusioniert. Nach der Fusion werden die entstandenen Hybride nach einem an sich bekannten Verfahren in einem selektiven Kulturmedium, das mit Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin (HAT-Medium) komplementiert ist, kultiviert. Nicht fusionierte Myelomazellen können in diesem Medium nicht wachsen und sterben ebenso wie normale Lymphozyten.

Die Überstände der Hybridoma-Kulturen können mit an sich bekannten Verfahren auf ihren Gehalt an spezifischen Antikörpern geprüft werden, beispielsweise mit Radio-Immunoassay, Enzymtests oder Agglutinierung. Dabei wird überraschenderweise festgestellt, daß mit dem beschriebenen Verfahren Hybridoma-Zellen gewonnen werden können, die spezifisch gegen VAC gerichtete Antikörper, wie VAA-8 und VAA-9 ausscheiden. Die Hybridomazellen, die Antikörper der gewünschten Spezifität produzieren, werden aus dem aus der Fusionierung hervorgegangenen Gemisch verschiedenster Hybridomazellen durch Klonieren herausselektioniert. Dazu werden nach einem an sich bekannten Verfahren, das "limiting dilution" genannt wird, Kulturen ausgehend von einer einzigen wachsenden Zelle angesetzt.

Zur Massenproduktion werden die Hybridoma-Zellklone, die Antikörper der gewünschten Spezifität produzieren, entweder in an sich bekannten Medien in vitro kultiviert oder zur Vermehrung in Mäuse injiziert. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Hybridomazellen in mit Pristan vorbehandelte Mäuse injiziert, Aszites-Flüssigkeit entnommen und daraus durch Fällung mit Ammoniumsulfat-Lösung Antikörper isoliert.

Die mit Hilfe dieser Hybridomazellen gewonnenen VAC spezifischen Antikörper können auf an sich bekannte Weise für die Herstellung von Immuno-Affinitätschromatographie- Säulen verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein geeignetes Trägermaterial (suspendiert in einer Pufferlösung) mit einer Antikörper-Lösung versetzt, ungebundene Anteile werden anschließend ausgewaschen und unbesetzte Stellen des Trägermaterials blockiert.

Die mit Hilfe der Hybridomazellen gewonnenen VAC spezifischen Antikörper können auf an sich bekannte Weise für die Herstellung von Test-Kits verwendet werden. Diese Test-Kits können auf verschiedenen Methoden beruhen, beispielsweise auf Radio-Immuno-Assay, Latex-Agglutinierung, Tüpfel-Tests, Kompetitive oder Sandwich-Radio-Immunoassay, Enzym-Immunoassay, Immuno-Fluoreszenz oder immunochemischen Enzym-Tests. Solche Kits können neben gewöhnlichen Antikörpern verschiedener Herkunft Antikörper-Konjugate mit Enzymen oder Fluoreszenzträgern enthalten, dazu VAC markiert mit radioaktiven Isotopen wie J¹²⁵, oder konjugiert mit Enzymen, beispielsweise mit Meerrettich-Peroxidase oder alkalischer Phosphatase, ferner Enzymsubstrate, geeignete Puffer, Gele, Latex, Polystyrol oder andere Füllmaterialien und Träger. Ebenfalls möglich ist der Einsatz der erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper bei der therapeutischen Behandlung beispielsweise zur Bindung und/oder Neutralisierung ihrer Antigene.

Beispiel 1 Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen VAC-α

1. Kopplung von VAC-α an "keyhole limpet" - Hämocyanin (KLH)

VAC-α wurde folgenderma8en kovalent an "keyhole limpet" - Hämocyanin (KLH; SIGMA chemical company, St. Louis, USA, Katalog-Nummer H-2133) gekoppelt.
1.1 VAC-α/KLH Präparation 1:

0,51 mg VAC-α wurden in 1,5 ml isotoner phosphat-gepufferter Natriumchlorid-Lösung pH 7,2 (im folgenden "PGS" abgekürzt) gelöst und mit 0,12 ml einer KLH-Lösung (8 mg/ml in PGS) gemischt. 0,017 ml einer 25%igen Glutardialdehydlösung wurden hinzugefügt und das Gemisch 45 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurde über Nacht gegen 1 l PGS dialysiert. Portionen dieser Lösung wurden bei -20°C gelagert.
1.2 VAC-a/KLH Präparation 2:

2,54 mg VAC-α wurden in 2 ml 0,1 M Kaliumphosphat-Puffer pH 7,0 gelöst und mit 0,3 ml KLH-Lösung (siehe 1.1) gemischt. 0,023 ml einer 25%igen Glutardialdehyd-Lösung wurden hinzugefügt und das Gemisch 45 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurde über Nacht gegen 1 l PGS (siehe 1.1) dialysiert. Portionen dieser Lösungen wurden bei -20°C gelagert.
2. Immunisierung

Eine 10 Wochen alte weibliche Balb/c-Maus wurde folgendermaßen immunisiert:

Alle Immunisierungen, ausgenommen die letzte, erfolgten durch intraperitoneale Injektion einer Emulsion gleicher Volumina von Antigen-Lösung und Freund′schem Adjuvans.
3. Zellfusion und Hybridom-Selektion

Peritoneale Zellen wurden aus Balb/c Mäusen durch Spülen mit einer sterilen Saccharose-Lösung (110 g/l in deionisiertem Wasser) gewonnen, durch Zentrifugation gesammelt und in Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium mit Natrium-Penicillin G (100 Einheiten/ml) und Streptomycin (50 Einheiten/ml) (im folgenden "Kulturmedium genannt) mit 10% fötalem Kalbsserum in einer Zelldichte von etwa 3,5×10⁴ Zellen/ml suspendiert. 0,1 ml - Aliquots wurden in die Vertiefungen von Gewebekulturplatten (96 Vertiefungen pro Platte) pipettiert; die Platten wurden über Nacht inkubiert.

Einen Tag nach der letzten Immunisierung wurde die Maus in Äther anästhesiert und getötet. Die Milz wurde aseptisch entnommen und die Milzzellen wurden durch vorsichtiges Schaben auf einem Stahlgitter gewonnen. Die Zellen wurden in 10 ml Kulturmedium suspendiert und durch Zentrifugation gesammelt.

P3x63Ag8,653 Maus-Myelomzellen (Kerney et al., J. Immunol. 123, 1548, 1979) wurden in stationärer Suspensionskultur in Kulturmedium mit 10% fötalem Kalbsserum gezüchtet. Etwa 10⁸ Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt. Die Myelomzellen wurden zu den Milzzellen zugegeben; die gemischte Zellpopulation wurde neuerlich durch Zentrifugation gesammelt und in 3 ml einer sterilen Lösung von 40% Polyäthylenglycol 4000 (Merck, Darmstadt BRD, Katalognummer 9727) in Kulturmedium suspendiert. Die Suspension wurde 1,5 Minuten bei Raumtemperatur vorsichtig geschüttelt und anschließend 1 Minute stehen gelassen. 3 ml Kulturmedium wurden unter ständigem Schütteln über einen Zeitraum von 1,5 Minuten zugetropft, die Suspension dann eine Minute stehengelassen. Anschließend wurden weitere 6 ml Kulturmedium unter Schütteln über 1,5 Minuten zugetropft und 1 Minute stehen gelassen. Die Suspension wurde in der Folge unter Schütteln mit 12 ml Kulturmedium mit 10% fötalem Kalbsserum tropfenweise während drei Minuten verdünnt, dann 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt und in 150 ml Kulturmedium mit 20% fötalem Kalbsserum, Thymidin (1,6×10^-5 M), Hypoxanthin (10^-4 M) und Aminopterin (4×10^-7) (in der Folge "HAT-Medium" genannt) suspendiert. Je 0,1 ml dieser Suspension wurden in die Vertiefungen einer Zellkultur-Platte pipettiert, in die am Vortag peritoneale Zellen eingesetzt worden waren (siehe oben); die Platten wurden drei Tage inkubiert. 0,075 ml HAT-Medium wurden zugegeben, anschließend wurden die Kulturen weitere 8 Tage inkubiert. Alle Inkubationen der Zellkulturen wurden bei 37°C in einer wasserdampf-gesättigten Atmosphäre von 5% CO₂ in Luft ausgeführt.
3. Screening nach Hybridomen, die Antikörper gegen VAC-α produzieren

Das Screening wurde mit Hilfe eines Enzym-Immuntest durchgeführt. Die Vertiefungen einer für Enzym-Immuntests geeigneten Mikrotiter-Platte wurden mit VAC-α beschichtet (0,005 mg/ml in 0,1 M Natriumkarbonat-Puffer pH 9,6; über Nacht bei 2-8°C oder eine Stunde bei 37°C). Die Lösung wurde entfernt und die Platten wurden einmal mit deionisiertem Wasser gewaschen. Freie Protein-Bindungsstellen wurden mit einer Lösung von Rinderserum-Albumin (5 mg/ml in isotoner phosphat-gepufferter Kochsalzlösung pH 7,2 [PGS]) eine Stunde bei Raumtemperatur blockiert, anschließend einmal mit Wasser gewaschen. In jede Vertiefung wurden 0,1 ml Hybridom-Überstand zugegeben und 2-3 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die Überstände entfernt, die Vertiefungen wurden dreimal mit Wasser gewaschen. 0,05 ml einer Lösung von mit Meerrettich-Peroxidase konjugierten Kaninchen-Antikörpern gegen Maus-Immunglobuline (Dakopatts, Kopenhagen, Dänemark, Katalognummer P 161; 1:2000 in PGS mit 5 mg/ml Rinderserumalbumin wurden zugegeben und drei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, anschließend dreimal mit Wasser gewaschen. 0,1 ml einer frisch hergestellten Mischung gleicher Volumina von Lösungen von ortho-Phenylendiamin (8,65 mg/ml in 0,1 M Kaliumzitrat pH 5), Natrium Perborat (3,75 mg/ml in 0,1 M Kaliumzitrat pH 5) und Wasser wurden zugegeben. Nach 30 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur wurden 0,1 ml 4 N H₂SO₄ zugegeben. Die optische Dichte der Lösungen wurde in einem Mehrkanal-Photometer für Mikrotiter-Platten bei 492 nm bestimmt. Zellkultur-Medium mit 20% fötalem Kalbsserum wurde als negative Kontrolle, Serum der immunisierten Maus (in PGS mit 5 mg/ml Rinderserumalbumin verdünnt) als positive Kontrolle verwendet. Kulturüberstände aller Hybridom-Kulturen wurden in zwei unabhängigen Tests 11 bzw. 13 Tage nach der Zellfusion getestet. Kulturen, die in beiden Tests ein positives Signal gaben, wurden in weiteren Screening-Test untersucht, in denen sowohl unbeschichtete als auch mit VAC-α beschichtete Testplatten eingesetzt wurden. Zwei der Kulturen gaben wiederholt positive Ergebnisse mit beschichteten, nicht aber mit unbeschichteten Platten. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt:

Die positiven Kulturen wurden kloniert und in flüssigem Stickstoffen nach bekannten Verfahren tiefgefroren.

Claims (13)

1. Hybrid-Zellinien, dadurch gekennzeichnet, daß sie monoklonale Antikörper gegen VAC-Polypeptide sezernierten.

2. Hybrid-Zellinie VAA-8.

3. Hybrid-Zellinie VAA-9.

4. Monoklonale Antikörper dadurch gekennzeichnet, daß sie spezifisch die Wirkung der VAC-Polypeptide ganz oder teilweise neutralisieren oder spezifisch an eines der besagten Polypeptide binden.

5. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß er von der Hybrid-Zellinie VAA-8 sezerniert wird.

6. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß er von der Hybrid-Zellinie VAA-9 sezerniert wird.

7. Verwendung der monoklonalen Antikörper nach einem der Ansprüche 4 bis 6 zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung eines der VAC-Polypeptide.

8. Verwendung der monoklonalen Antikörper nach einem der Ansprüche 4 bis 6 zur Reinigung eines der VAC-Polypeptide.

9. Verwendung der monoklonalen Antikörper nach einem der Ansprüche 4 bis 6 zur therapeutischen Behandlung.

10. Test Kit zur Bestimmung von VAC-Polypeptiden, dadurch gekennzeichnet, daß er monoklonale Antikörper nach einem der Ansprüche 4 bis 6 enthält.

11. Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß Wirtstiere mit einem VAC-Polypeptid immunisiert, B-Lymphozyten dieser Wirtstiere mit Myelomzellen fusioniert, die die monoklonalen Antikörper ausscheidenden Hybrid-Zellinien subklohiert und in vitro oder in vivo kultiviert werden.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das VAC-Polypeptid an einem immunogenen Träger gekoppelt ist.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der immunogene Träger heterolges Albumin oder "keyhole limpet"- Hämocyanin (KLH) ist.