DE3743402C2

DE3743402C2 - Verfahren zur Krebsdiagnose beim Menschen

Info

Publication number: DE3743402C2
Application number: DE19873743402
Authority: DE
Inventors: Fumitsugu Hino; Masahiko Katayama; Kyoko Kamihagi; Hiroko Yokota; Kaoru Katayama; Ikunoshin Kato
Original assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Current assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Priority date: 1986-12-26
Filing date: 1987-12-21
Publication date: 1994-04-14
Anticipated expiration: 2007-12-22
Also published as: DE3743402A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Krebsdiagnose beim Menschen.

Human Fibronektin (Human-FN) ist ein adhärentes Glycoprotein, das auf den Zelloberflächen von Fibroblasten und Endothelzellen, auf Basalmembranoberflächen und im Blut vorkommt. Es handelt sich dabei um eine polymere Substanz mit einem Molekulargewicht von ca. 400 000, die aus alpha- und β -Untereinheiten besteht, welche durch zwei Disulfidbrücken miteinander verknüpft sind. Die Substanz hat Affinität zu Kollagen, Heparin und Fibrin, fördert die Haftung und Proliferation von Zellen und ist an der Schaffung von die Immunantwort begünstigenden Bedingungen beteiligt (s. Molecular and Cellular Biochemistry, 29, 103-128, 1980).

Als ein Ergebnis des raschen Fortschritts auf dem Gebiet der Forschung über Human-Fibronectin in den letzten Jahren konnten die funktionellen Domänen dieses Glycoproteins durch Analyse der durch Verdauung mit verschiedenen Proteasen erhaltenen Fragmente charakterisiert und aus der Basensequenz der cDNA die komplette Aminosäuresequenz abgeleitet werden. Außerdem konnte der auf der Oberfläche von Zellmembranen vorhandene humane Fibronektin-Rezeptor identifiziert werden, und die derzeitige Forschung gilt dem Mechanismus, durch welchen dessen biologische Aktivität auf Zellen exprimiert wird (J Biol Chem, 258, 3332-3340, 1983).

Monoklonale Antikörper gegen Human-Fibronectin sind für diese Forschung von großem Nutzen. In der JA-OS Nr. 33 295/84 werden zwei Arten derartiger monoklonaler Antikörper beschrieben.

Yamada et al. (Proc Natl Acad Sci USA, 71, 3492, 1974) fanden, daß, wenn Zellen zu Krebszellen transformiert werden, das auf ihrer Oberfläche vorhandene Fibronektin verschwindet oder mengenmäßig abnimmt. Bei einigen Arten von Krebs (Malignomen) nimmt jedoch die Konzentration von Fibronektin im Serum zu und gleichzeitig findet sein Abbau statt (Cancer Res, 39, 4341, 1979).

Kürzlich wurde die Möglichkeit einer Krebsdiagnose durch Messung von Human-Fibronektin im Urin mit einem polyklonalen Antikörper gegen Human-Fibronektin beschrieben (JA-OS Nr. 91264/85).

Diese Befunde legen nahe, daß Human-Fibronektin in irgendeiner Weise zur Entstehung und Proliferation von Karzinomzellen in Beziehung steht. Ziel der vorliegenden Erfindung ist daher ein neues Verfahren zur Messung der Anzahl von Human-Fibronektin-Fragmenten, die die Entdeckung von Karzinomen beim Menschen ermöglicht.

Erfindungsgemäß wird dies durch ein Verfahren erreicht, das sich durch die immunologische Bestimmung der Menge an Fibronektinfragmenten im menschlichen Urin unter Verwendung von als FN10 und FN30 bezeichneten, monoklonalen gegen Human-Fibronektin gerichteten und die folgenden physikochemischen Eigenschaften aufweisenden Antikörpern auszeichnet:

1) monoklonaler Antikörper FN10:
- a) Molekulargewicht: 150 000 ± 5000;
- b) IgG-Subklasse: G₁;
- c) Isoelektrischer Punkt: 6,6 bis 7,1;
- d) Bindungsstelle am Antigen:
  im Bereich der Aminosäuren 1408 bis 1517 der durch Thermolysinspaltung erhaltenen Human-Fibronektindomäne 4 vom Molekulargewicht 105 000;
2) monoklonaler Antikörper FN30:
- a) Molekulargewicht: 150 000 ± 5000;
- b) IgG-Subklasse: G₁;
- c) Isoelektrischer Punkt: 5,3 bis 5,8;
- d) Bindungsstelle am Antigen:
  im Bereich der Aminosäuren 1235 bis 1407 der durch Thermolysinspaltung erhaltenen Human-Fibronektindomäne 4 vom Molekulargewicht 105 000;
- e) biologische Aktivität:
  Reaktion mit Human-Fibronektin, dadurch spezifische Inhibierung der Bindung von Malignomzellen an Human-Fibronektin.

Die monoklonalen Antikörper FN10 und FN30 werden von den Hybridomen FN10 bzw. FN30 produziert (vgl. nachstehendes Beispiel 1).

Die Erfindung wird im folgenden anhand der beiliegenden Abbildungen näher erläutert. Abb. 1 ist eine schematische Darstellung der Struktur von Fibronektin sowie der durch Thermolysinspaltung erhaltenen Fragmente; die in den Abb. 2, 3 und 4 gezeigten Kurven zeigen die im Urin von Gesunden und von Malignompatienten jeweils unter Verwendung der monoklonalen Antikörper FN10 und FN30 (Abb. 2), der monoklonalen Antikörper FN4 und FN9 (Abb. 3), sowie mit einem polyklonalen Antikörper (Abb. 4) gemessenen Mengen an Fibronektin; die Abb. 5 schließlich zeigt die Rate, mit der Fibronektin im Urin von Gesunden und von Malignompatienten jeweils in Fragmente gespalten wird.

Unsere Untersuchungen haben ergeben, daß eine große Menge an fragmentiertem Fibronektin (abgekürzt fFN), das im Urin von Malignompatienten, nicht aber von Gesunden gebildet wird, durch Verwendung von für Human-Fibronektin-Domänen spezifischen monoklonalen Antikörpern nachgewiesen werden kann, und daß durch Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens Malignome beim Menschen entdeckt werden können.

Der Begriff "Domäne" soll in der vorliegenden Anmeldung eine Erkennungsstelle des Antigens bezeichnen.

In der vorliegenden Erfindung können Hybridome, die die erfindungsgemäß verwendeten monoklonalen Antikörper produzieren, nach bekannten Verfahren, wie etwa dem in Nature, 256, 495-497 (1975) beschriebenen, hergestellt werden.

Als Human-Fibronektin-Antigen kann aus Körperflüssigkeiten, wie etwa menschlichem Plasma oder Fruchtwasser, oder aus Zelloberflächen isoliertes Fibronektin verwendet werden. Fibronektin aus Human-Plasma wird dabei bevorzugt. Fibronektin kann aus derartigen Körperflüssigkeiten oder aus Zellkulturmedium auf übliche Weise (Int J Cancer, 20, 1-5 (1975)) isoliert und gereinigt werden.

Alternativ hierzu können vorteilhaft auch im Handel erhältliche, nach dem oben erwähnten Verfahren gereinigte Produkte eingesetzt werden.

Es gibt keine besonderen Einschränkungen bei der Wahl der für die Immunisierung verwendeten Tierspezies, jedoch werden üblicherweise Mäuse für diesen Zweck eingesetzt.

In einem typischen Beispiel wird auf obige Weise erhaltenes Human-Fibronektin intraperitoneal einer Balb/c-Maus injiziert. Eine zweite Immunisierung wird vier Wochen später durchgeführt, und die Milz wird drei Tage nach der zweiten Immunisierung entfernt. Die so erhaltenen Milzzellen werden durch die Wirkung von Polyethylenglycol mit Maus-Myelomzellen (P3-X63-Ag8-U1) fusioniert und das erhaltene Gemisch wird in einer 96-Loch-Mikrotiterplatte inkubiert. Am Ende der Inkubation werden die Kulturüberstände gesammelt, die Zellen werden durch ELISA auf die Produktion spezifischer Antikörper gescreent und schließlich durch die limiting dilution-Methode kloniert, wobei man Hybridome erhält, die monoklonale Antikörper gegen Human-Fibronektin produzieren können.

Diese Hybridome sezernieren monoklonale Antikörper in das Kulturmedium. Man kann daher jedes Hybridom in einem käuflichen serumfreien Medium kultivieren und durch Aufarbeiten des Kulturüberstandes auf übliche Weise, beispielsweise durch Aussalzen mit Ammonsulfat oder andere Verfahren, eine Antikörperfraktion erhalten. Man kann die Hybridome auch in einer syngenen Maus züchten und die Antikörperfraktion in gleicher Weise aus der Körperflüssigkeit der Maus erhalten.

Die jeweilige besondere Domäne des Human-Fibronektins, mit welcher ein auf die obige Weise erhaltener monoklonaler Antikörper spezifisch reagiert, kann durch bekannte Methoden identifiziert werden (J Biol Chem, 260, 5105-5114 (1985)). Die Domäne, die ein monoklonaler Antikörper spezifisch erkennt, kann nachgewiesen werden, indem man Human-Fibronektin mit Thermolysin, einer von Sigma Chemical Co., vertriebenen Protease, spaltet, das so erhaltene Reaktionsgemisch durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (Nature, 227, 680-685 (1970)) auftrennt, durch Western Blotting auf Nitrocellulosefolie überträgt (Proc Natl Acad Sci USA, 76, 4350-4354 (1979)) und die Nitrocellulose mit dem monoklonalen Antikörper reagieren läßt (s. "Useful Immunological Experiments", Kodansha Scientific, 1984).

Die biologische Aktivität und Funktion jeder einzelnen Domäne von Human-Fibronektin sind bekannt. Insbesondere konnten die biologischen Aktivitäten aller durch Thermolysinspaltung von Human-Fibronektion gebildeten Domänen aufgeklärt werden (Biochem Biophys Res Commun, 116, 534-540 (1983)).

Die Abb. 1 zeigt schematisch die durch Spaltung von Human-Fibronektin mit Thermolysin gebildeten Fragmente, deren Funktion in Tabelle 1 aufgeführt ist.

Tabelle 1

Die monoklonalen Antikörper gegen Human-Fibronektion FN4, FN9, FN10 und FN30 wurden jeweils aus den Hybridomen FN4, FN9, FN10, bzw. FN30 erhalten. Die Bindungseigenschaften dieser monoklonalen Antikörper an Fibronektin-Domänen sind in der Tabelle 2 zusammengestellt.

Tabelle 2

Die weitere Untersuchung der monoklonalen Antikörper FN10 und FN30 zeigte, daß die Bindungsstelle des MAK FN30 auf dem Fibronektinmolekül in der Gegend von Aminosäuren Nr. 1235 bis1407 (gezählt vom N-Terminus her), die des MAK FN10 dagegen in der Gegend von Aminosäure Nr.1408 bis 1517 liegt (EMBO J, 4, 1755-1759 (1985)).

Für die quantitative Untersuchung von Human-Fibronektin unter Verwendung von für seine Domänen spezifischen Antikörpern können verschiedene Arten von dem Fachmann bekannten Immunoassays angewandt werden, wie etwa Enzymimmunoassays, Radioimmunassays, turbidimetrische immunologische Assays, Latexagglutinationstests, Hämagglutinationstests und Immuno diffusionsverfahren, wie die radiale Immundiffusion. Von den genannten Methoden ist der Enzymimmunoassay, was Empfindlichkeit und einfache Durchführung betrifft, am besten geeignet. Bei diesem Verfahren wird ein für eine Human- Fibronektin-Domäne spezifischer Antikörper an einen unlöslichen Träger, wie etwa Polystyrolkügelchen oder eine Polystyrol-Mikrotiterplatte, kovalent gebunden oder physikalisch adsorbiert, wobei man einen unlöslichen antikörper beschichteten Träger erhält. Getrennt davon wird der für eine Human-Fibronektin-Domäne spezifische MAK enzymmarkiert. Dazu wird das verwendete Enzym zuerst mit einer für das jeweilige Enzym am besten geeigneten Substanz, beispielsweise N-Maleinimidester für β-Galaktosidase, oder Periodsäure für Peroxidase, und dann mit dem MAK zur Reaktion gebracht, wobei ein für eine Human-Fibronektin-Domäne spezifischer, enzymmarkierter monoklonaler Antikörper erhalten wird.

Die Bestimmung von Human-Fibronektin im Urin unter Verwendung eines für eine Human-Fibronektin-Domäne spezifischen, enzymmarkierten monoklonalen Antikörpers und eines mit einem Antikörper-beschichteten, unlöslichen Trägers (unlöslicher Antikörper) zeigte, daß im Urin von Malignompatienten mehr fragmentiertes Fibronektin (fFN) vorkommt als im Urin von Gesunden, und daß die Menge an fFN mit einem Immunoassay unter Verwendung der MAK FN10 und FN30 spezifisch bestimmt werden kann.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 1. Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen Human- Fibronektin

Als Antigen wurde in diesem Versuch Human-Fibronektin aus Plasma (vertrieben von Collaborative Research) verwendet. 0,100 mg Antigen wurden in 0,1 ml physiologischer Kochsalzlösung gelöst und die gleiche Menge komplettes Freund′s Adjuvans zugesetzt. Die so erhaltene Emulsion wurde einer Balb/c-Maus i. p. injiziert. Nach vier Wochen wurden nochmals 0,100 mg Antigen ohne Adjuvans i. p. injiziert. Nach drei Tagen wurde die Milz entfernt und die Milzzellen wurden im Verhältnis 10 : 1 mit Maus-Myelomzellen (P3-x63-Ag8-U1) gemischt. Das Gemisch wurde eine Minute in Gegenwart von 50% Polyethylenglycol (PEG) und 20% Dimethylsulfoxid (DMSO) inkubiert, um die Zellfusion zu ermöglichen. Die so behandelten Zellen wurden dann in DMEM-Medium mit 10% fötalem Kälberserum (FCS) suspendiert und die Suspension wurde in einer Konzentration von 2 × 10⁴ Zellen pro Loch in eine 96-Loch- Mikrotiterplatte ausgesät. Alle ein bis drei Tage wurde die Hälfte des Mediums durch HAT-Medium ersetzt. Die Kulturüberstände der Löcher, in denen Hybridomwachstum festgestellt wurde, wurden 10 bis 20 Tage danach abgenommen und auf das Vorhandensein von Antikörpern durch ELISA oder eine andere geeignete Methode untersucht. Antikörper produzierende Hybridome wurden aus 39 Kulturen isoliert. Jede Gruppe dieser Hybridome wurde zweimal durch limiting dilution (Verdünnung zur Herstellung von Einzelzell-Kulturen) kloniert, und bei den vier Hybridom-Klonen FN4, FN9, FN10 und FN30 wurden die höchsten Titer an produzierten MAK gefunden. Um große Mengen dieser MAK zu erhalten, wurden die Hybridome FN4, FN9, FN10 und FN30 jeweils i. p. einer Balb/c-Maus zur Induktion von Aszitestumoren injiziert. Durch Abnehmen des Aszites von der betroffenen Maus erhielt man eine Lösung des monoklonalen Antikörpers gegen Human-Fibronektin.

Die Hybridome FN10 und FN30 wurden unter der Bezeichnung FERM BP-1532 bzw. FERM BP-1533 beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan, am 22. Oktober 1987 hinterlegt.

2. Testung der Eigenschaften der monoklonalen Antikörper gegen Human-Fibronektin

Die in Abschnitt 1 erhaltene Lösung von monoklonalen Antikörpern gegen Human-Fibronektin wurde mit Ammonsulfat behandelt, gefolgt von einer Säulenchromatografie auf DEAE-Zellulose, und man erhielt einen gereinigten monoklonalen Antikörper gegen Human-Fibronektin. Das Molekulargewicht des Antikörpers wurde durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese abgeschätzt, sein isoelektrischer Punkt durch Elektrofokussierung bestimmt, und die IgG-Subklasse durch ELISA unter Verwendung von Antiseren gegen Maus-IgG-Subklassen (vertrieben von Seikagaku, Kogyo, Ltd., Japan) geprüft. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengestellt.

Tabelle 3

3. Hemmung der Bindung von kultivierten Zellen an Human- Fibronektin

Fibronektin aus menschlichem Plasma (Collaborative Research) wurde auf einer Gelatine-beschichteten Mikroschale (Corning) in einer Konzentration von 0,100 mg/ml ausgestrichen und die Platte wurde mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen, um überschüssiges Human-Plasma-Fibronektin zu entfernen. Man ließ dann jeweils einen monoklonalen Antikörper (FN4, FN9, FN10 bzw. FN30) auf die Platte einwirken, inkubierte sechs Stunden und wusch mit physiologischer Kochsalzlösung überschüssigen MAK ab. Unabhängig davon wurden HeLa-Zellen oder normale menschliche Fibroblasten in Serum-freiem DMEM-Medium (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) dispergiert, so daß eine Einzelzell-Suspension entstand. Diese wurde auf die oben beschriebene Kulturschale aufgebracht und dann inkubiert. Die Zellen wurden nach einem festgelegten Zeitraum unter dem Mikroskop daraufhin untersucht, ob ihre Fähigkeit, sich auszubreiten und adhärent zu werden durch den MAK beeinträchtigt wurde. Keiner der untersuchten MAK inhibierte Ausbreitung und Adhäsion normaler menschlicher Fibroblasten. Nur der MAK FN30 hemmte Ausbreitung und Adhäsion von HeLa-Zellen.

Beispiel 2 Bestimmung von Human-Fibronektin durch EIA

1. Zu 20 ml 0,1 M Phosphatpuffer, pH 8,0, mit 1 mg MAK gegen Human-Fibronektin (FN4 oder FN30) aus Beispiel 1, wurden 100 Polystyrolkügelchen einer Teilchengröße von 6,35 mm (Sekisui Chemical Co., Ltd.) gegeben. Das Gemisch wurde 16 h bei 5°C stehen gelassen und dann eine Stunde auf 37°C erwärmt, um den Antikörper an die Polystyrolkugeln zu fixieren. Nach sorgfältigem Waschen mit physiologischer Kochsalzlösung wurden die Kugeln über Nacht in 10 mM Phosphatpuffer, pH 7,4 mit 1% Rinderserumalbumin, 0,05% Natriumazid und 0,9% Natriumchlorid eingetaucht. Auf diese Weise wurden mit MAK gegen Human-Fibronektin beschichtete Kügelchen erhalten.

2. Durch Bindung von Peroxidase (Boehringer, Mannheim) an die in Beispiel 1 erhaltenen monoklonalen Antikörper FN9 und FN10 gegen Human-Fibronektin nach dem Verfahren von Nakane et al., J Histochem Cytochem 22: 1084 (1974), wurden markierte Antikörper hergestellt. Zu einer Lösung von 10 mg Peroxidase in 2 ml reinem Wasser wurden 0,2 ml einer 0,1 M Kaliumperiodatlösung zugegeben. Das Gemisch wurde 20 min bei Raumtemperatur stehengelassen und dann über Nacht gegen 1 mM Acetatpuffer, pH 4,0, dialysiert. Das Dialysat wurde durch Zugabe von 0,2 M Carbonatpuffer, pH 9,5, auf pH 9 bis 9,5 eingestellt. Getrennt davon wurden jeweils 2 mg der monoklonalen Antikörper gegen Human-Fibronektin in je 1,5 ml phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung, pH 7,4, (PBS) gelöst und die erhaltenen Lösungen wurden über Nacht bei 4°C gegen 10 mM Carbonatpuffer, pH 9,5, dialysiert. Das jeweils erhaltene Dialysat wurde mit der Periodat-behandelten Peroxidase gemischt und das Gemisch wurde 2 h bei Raumtemperatur stehengelassen. Nach Zugabe von 0,1 ml einer wäßrigen Natriumborhydridlösung, 4 mg/ml, wurde die Reaktion bei 4°C zwei Stunden weitergeführt, dann wurde das Reaktionsgemisch durch Gelfiltration auf mit PBS äquilibriertem Ultrogel AcA22^Wz (LKB) fraktioniert. Die Fraktionen, in denen sowohl Peroxidaseaktivität als auch Antikörper nachweisbar war, wurden gesammelt und unter Zusatz von Natriummethylthiolat in einer Endkonzentration von 0,01% bei 4°C gelagert.

3. Polyklonaler Antikörper gegen Human-Fibronektin

Ein insolubilisierter Antikörper und ein markierter Antikörper wurden aus polyklonalem Antikörper gegen Human-Fibronektin (Igaku Seibutsugaku Kenkyusho) auf die gleiche Weise, wie in Abschn. 1 und 2 beschrieben, hergestellt.

4. Herstellung von nicht-fragmentiertem Human-Fibronektin (nFN) und von Human-Fibronektin-Fragmenten (fFN)

FN aus menschlichem Blutplasma (Funakoshi Co., Ltd.) wurde als Human-nFN verwendet. Human-fFN wurde nach dem Verfahren von Borsi et al., Anal Biochem 155: 335 (1986), wie folgt hergestellt: Zu einer Lösung von 500 mg Fibronektin aus menschlichem Blutplasma in 500 ml 35 mM Tris-HCl-Puffer mit 0,5 mM EDTA und 25 mM CaCl₂, ph 7,6, wurde Thermolysin (Sigma) in einer Endkonzentration von 0,005 mg/ml zugegeben. Das Gemisch wurde für 4 Stunden zur Verdauung auf 22°C gehalten, danach wurde die Reaktion durch Zugabe von EDTA in einer Endkonzentration von 5 mM gestoppt. Die SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese des Reaktionsgemisches zeigte, daß Fibronektin in sechs Fragmente gespalten worden war, wobei kein nicht-gespaltenes nFN verblieben war. Durch Elektrophorese konnte auch gezeigt werden, das das als Ausgangsmaterial verwendete nFN kein fFN enthalten hatte.

Der Proteingehalt der Lösung wurde durch Messung der Extinktion bei 280 nm unter Zugrundelegung eines Extinktionskoeffizienten E = 12,8 nach Mosesson et al., J Biol Chem 245: 5728 (1970), bestimmt.

5. Bestimmung von nFN und fFN

Die Menge an nFN und fFN wurde jeweils durch Enzymimmunoassay (EIA) wie folgt bestimmt. Eine zu untersuchende Probe von 0,200 ml und ein Kügelchen mit insolubilisiertem Antikörper wurden in ein Röhrchen gegeben und eine Stunde bei 37°C inkubiert (erste Inkubation). Das Kügelchen wurde dann dreimal mit 3 ml physiologischer Kochsalzlösung gewaschen, in ein anderes Röhrchen mit 0,200 ml einer Lösung von markiertem Antikörper in einer Verdünnung von 1 : 300 überführt und eine weitere Stunde inkubiert (zweite Inkubation). Das Kügelchen wurde dann erneut dreimal mit 3 ml physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und in ein neues Röhrchen gegeben. 0,300 ml Farbreagenz, eine Lösung von 1 mg/ml o-Phenylendiamin und 0,01% Wasserstoffperoxid in 0,1 M Citratpuffer, pH 5,0, wurden zugegeben und das Gemisch 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 1 ml 0,5 M Schwefelsäure gestoppt und die Extinktion bei 492 nm abgelesen. Die Tabelle 4 zeigt die für das im obigen Abschnitt 4 hergestellte nFN und fFN erhaltenen Ergebnisse. Die Kombination der monoklonalen Antikörper FN4 und FN9 (einer Kombination, welche die Domänen 1 und 6 erkennt) kann zur Bestimmung von nFN, nicht jedoch von fFN verwendet werden. Die Empfindlichkeit des Nachweises war mit der Kombination der polyklonalen Antikörper sehr gering.

Tabelle 4

Es wurden Musterproben, die nFN und fFN in verschiedenen Mischungsverhältnissen enthielten, hergestellt. Die Menge an nFN und fFN wurde jeweils separat bestimmt, und es wurde die Fragmentierungsrate in einer Probe berechnet. Die verwendete Eichkurve beruhte auf den in Tabelle 5 angegebenen Daten. Die Gesamtmenge an nFN und fFN konnte durch Verwendung einer Kombination der monoklonalen Antikörper FN30 und FN10, die Menge an nFN allein durch die Kombination der MAK FN4 und FN9 bestimmt werden. Die Fragmentierungsrate konnte nach der folgenden Gleichung berechnet werden:

Tabelle 5

Beispiel 3 Bestimmung von Fibronektin im Urin von Malignom- Patienten 1. Nachweis durch Immunoblot-Assay

Von zehn gesunden Probanden und zehn Malignom-Patienten wurde Morgenurin gesammelt. 10 ml jeder Probe wurden dann jeweils über Nacht bei 4°C gegen reines Wasser dialysiert und das Dialysat wurde lyophilisiert. Das getrocknete Produkt wurde in 0,1 ml eines 10 mM Phosphatpuffers, pH 7,2, gelöst. Die Lösung wurde dann durch SDS-Polyacrylamid gelelektrophorese aufgetrennt und die fraktionierten Proteine wurden elektrophoretisch auf eine Nitrocellulosefolie übertragen. Die so an die Nitrocellulosefolie adsorbierten Proteine wurden durch einen farbgebenden EIA unter Verwendung verschiedener monoklonaler und polyklonaler Antikörper gegen Human-Fibronektin als erstem Antikörper, Peroxidase-markiertem Antikörper gegen Maus-Immunglobuline bzw. Peroxidase-markiertem Antikörper gegen Kaninchen-Immunglobuline (beide Amersham) als zweitem Antikörper, sowie 0,1 M Phosphatpuffer, pH 6,5, mit 1 mg/ml 4-Chlor-1-naphthol und 0,01% Wasserstoffperoxid als Farbentwickler nachgewiesen. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 6 gezeigt. Im Urin von Gesunden konnte mit jedem der verwendeten ersten Antikörper nur die nFN-Bande (MG 220 000), jedoch keine fFN-Banden (MG 5000 bis 200 000) nachgewiesen werden. Bei den Patienten mit Malignomen waren sowohl die nFN-Bande (MG 220 000), als auch fFN-Banden (MG 5000 bis 200 000) nachweisbar. In diesem Fall war der Nachweis wirksamer bei Verwendung der Domänen-spezifischen monoklonalen Antikörper FN4, FN9, FN10 und FN30, als bei Verwendung des polyklonalen Antikörpers gegen Human-Fibronektin. Die oben erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß im Urin von Malignompatienten, nicht aber von Gesunden fFN vorhanden ist und unter Verwendung der Domänen-spezifischen, monoklonalen Antikörper gegen Human-Fibronektin nachgewiesen werden kann.

Tabelle 6

2. Bestimmung durch Sandwich-EIA

Von zehn Gesunden und zehn Patienten mit Malignomen wurde Morgenurin gesammelt und die Menge an Human-Fibronektin in jeder Probe wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 2 bestimmt. Außerdem wurde die Kreatininkonzentration in jeder Probe mit einer handelsüblichen Test-Packung (Kreatinin-Test Wako, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) bestimmt, und die tatsächliche Menge an FN wurde als Verhältnis von gemessener FN-Menge zu Kreatinin (ug FN/g Krea) ausgedrückt, wobei auf das Urinvolumen korrigiert wurde.

Die Abb. 2 zeigt die Ergebnisse bei Verwendung der monoklonalen Antikörper FN30 und FN10 als insolubilisierter Antikörper bzw. markierter Antikörper; die Abb. 3 bei Verwendung der monoklonalen Antikörper FN4 und FN9; und Abb. 4 bei Verwendung von polyklonalen Antikörpern. Die Abb. 5 schließlich vergleicht die Fragmentierungsraten in diesen Kombinationen. In den Abbildungen ist auf der Ordinate die FN-Menge in µg/g Kreatinin oder die Frag mentierungsrate in % aufgetragen. Die Abbildungen zeigen, daß mit der Kombination der monoklonalen Antikörper FN30 und FN10 die im Urin von Malignompatienten nachgewiesene Fibronektinmenge größer als die im Urin von Gesunden ist, und daß besonders bei Patienten mit Metastasen (mit offenen Kreisen eingetragen) abnorm hohe Werte erhalten werden. Andererseits wurden mit der Kombination der monoklonalen Antikörper FN4 und FN9 keine signifikanten Unterschiede in der Menge an nFN zwischen Gesunden und Malignompatienten gesehen. Bei Verwendung von polyklonalen Antikörpern wurden für Malignompatienten höhere Werte als bei Gesunden bestimmt, der Unterschied war jedoch geringer als mit der Kombination der monoklonalen Antikörper FN30 und FN10. Die Fragmentierungsraten von Human-Fibronektin in den untersuchten Proben schwankten bei Gesunden in einem weiten Bereich zwischen 15 und 85%, und lag bei den Malignompatienten in der Regel über 90%. Diese Ergebnisse zeigen, daß im Urin von Malignompatienten große Mengen an fragmentiertem Fibronektin vorkommen und daß eine effektive Diagnostik von Malignomen, insbesondere metastasierenden Malignomen durch spezifische Bestimmung der Menge an so gebildetem fragmentiertem Fibronektin möglich ist.

Wie aus dem oben Gesagten ersichtlich wird, liefert die vorliegende Erfindung ein neues Verfahren für die Krebserkennung beim Menschen aus menschlichen Urinproben, die leicht in großen Mengen erhältlich sind und einfach getestet werden können.

Claims

Verfahren zur Krebsdiagnose beim Menschen, gekennzeichnet durch die immunologische Bestimmung der Menge an Fibronektinfragmenten im menschlichen Urin unter Verwendung von als FN10 und FN30 bezeichneten, monoklonalen, gegen Human-Fibronektin gerichteten und die folgenden physikochemischen Eigenschaften aufweisenden Antikörpern:
- 1) monoklonaler Antikörper FN10:
  - a) Molekulargewicht: 150 000 ± 5000;
  - b) IgG-Subklasse: G₁;
  - c) Isoelektrischer Punkt: 6,6 bis 7,1;
  - d) Bindungsstelle am Antigen:
    im Bereich der Aminosäuren 1408 bis 1517 der durch Thermolysinspaltung erhaltenen Human- Fibronektindomäne vom Molekulargewicht 105 000;
- 2) monoklonaler Antikörper FN30:
  - a) Molekulargewicht: 150 000 ± 5000;
  - b) IgG-Subklasse: G₁;
  - c) Isoelektrischer Punkt: 5,3 bis 5,8;
  - d) Bindungsstelle am Antigen:
    im Bereich der Aminosäuren 1235 bis 1407 der durch Thermolysinspaltung erhaltenen Human- Fibronektindomäne 4 vom Molekulargewicht 105 000;
  - e) biologische Aktivität:
    Reaktion mit Human-Fibronektin dadurch spezifische Inhibierung der Bindung von Malignomzellen an Human-Fibronektin.