DE3743402A1 - Neue monoklonale antikoerper und deren verwendung - Google Patents
Neue monoklonale antikoerper und deren verwendungInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft neue monoklonale Antikörper
(abgekürzt MAK), die spezifisch mit Human-Fibronektin
(im folgenden Human-FN abgekürzt) reagieren, sowie ein
diagnostisches Verfahren zur Krebserkennung unter Verwendung
dieser monoklonalen Antikörper.
Human-FN ist ein adhärentes Glycoprotein, das auf den Zelloberflächen
von Fibroblasten und Endothelzellen, auf Basalmembran
oberflächen und im Blut vorkommt. Es handelt sich
dabei um eine polymere Substanz mit einem Molekulargewicht
von ca. 400 000, die aus alpha- und β -Untereinheiten besteht,
welche mit durch zwei Disulfidbrücken miteinander
verknüpft sind. Die Substanz hat Affinität zu Kollagen,
Heparin und Fibrin, fördert die Haftung und Proliferation
von Zellen und ist an der Schaffung von die Immunantwort
begünstigenden Bedingungen beteiligt (s. Molecular and
Cellular Biochemistry, 29, 103-128, 1980).
Als ein Ergebnis des raschen Fortschritts auf dem Gebiet der
Forschung über Human-Fibronectin in den letzten Jahren
konnten die funktionellen Domänen dieses Glycoproteins durch
Analyse der durch Verdauung mit verschiedenen Proteasen
erhaltenen Fragmente charakterisiert und aus der Basensequenz
der cDNA die komplette Aminosäuresequenz abgeleitet
werden. Außerdem konnte der auf der Oberfläche von Zellmembranen
vorhandene humane Fibronektin-Rezeptor identifiziert
werden, und die derzeitige Forschung gilt dem Mechanismus,
durch welchen dessen biologische Aktivität auf Zellen exprimiert
wird (J Biol Chem, 258, 3332-3340, 1983).
Monoklonale Antikörper gegen Human-Fibronectin sind für
diese Forschung von großem Nutzen. Bisher wurden jedoch nur
zwei Arten derartiger monoklonaler Antikörper beschrieben
(JA-OS Nr. 33295/84).
Yamada et al. (Proc Natl Acad Sci USA, 71, 3492, 1974)
fanden, daß, wenn Zellen zu Krebszellen transformiert
werden, das auf ihrer Oberfläche vorhandene Fibronektin
verschwindet oder mengenmäßig abnimmt. Bei einigen Arten von
Krebs (Malignomen) nimmt jedoch die Konzentration von Fibronektin
im Serum zu und gleichzeitig findet sein Abbau statt
(Cancer Res, 39, 4341, 1979).
Kürzlich wurde die Möglichkeit einer Krebsdiagnose durch
Messung von Human-Fibronektin im Urin mit einem polyklonalen
Antikörper gegen Human-Fibronektin beschrieben (JA-OS Nr.
91264/85).
Diese Befunde legen nahe, daß Human-Fibronektin in irgendeiner
Weise zur Entstehung und Proliferation von Karzinomzellen
in Beziehung steht. Ziel der vorliegenden Erfindung
ist daher ein neues Verfahren zur Messung der Anzahl von
Human-Fibronektin-Fragmenten, die die Entdeckung von Karzinomen
beim Menschen ermöglicht.
Zusammenfassend betrifft die Erfindung die monoklonalen
Antikörper FN10 und FN30, die spezifisch mit Human-
Fibronektion reagieren. Die physikochemischen Eigenschaften
dieser monoklonalen Antikörper sind nachfolgend zusammenge
stellt:
- 1) monoklonaler Antikörper FN10:
- a) Molekulargewicht: 150 000 ±5000;
- b) IgG-Subklasse: G₁;
- c) Isoelektrischer Punkt: 6,6 bis 7,1;
- d) Bindungsstelle am Antigen:
die durch Thermolysinspaltung erhaltene Human-Fibronektindomäne mit dem Molekulargewicht 10 500;
- 2) monoklonaler Antikörper FN30:
- a) Molekulargewicht: 150 000;
- b) IgG-Subklasse: G₁;
- c) Isoelektrischer Punkt: 5,3 bis 5,8;
- d) Bindungsstelle am Antigen:
die durch Thermolysinspaltung erhaltene Human-Fibronektindomäne vom Molekulargewicht 10 500; - e) biologische Aktivität:
Reaktion mit Human-Fibronektin dadurch spezifische Inhibierung der Bindung von Malignomzellen an Human-Fibronektin.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung das Hybridom FN10,
das den monoklonalen Antikörper FN10, und das Hybridom FN30,
das den monoklonalen Antikörper FN30 produzieren kann.
Die Erfindung betrifft außerdem ein Reagenz für einen
Immunoassay von Human-Fibronektin-Fragmenten, das als wesentliche
wirksame Bestandteile die obengenannten monoklonalen
Antikörper FN10 und FN30 gegen Human-Fibronektin
enthält.
Schließlich betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur
Malignomerkennung beim Menschen, das die immunologische
Bestimmung der Menge an Fibronektin-Fragmenten, die im
menschlichen Urin enthalten ist, mit Hilfe der genannten
monoklonalen Antikörper FN10 und FN30 gegen Human-Fibronektin
umfaßt.
Die Erfindung wird im folgenden anhand der beiliegenden
Abbildungen näher erläutert. Abb. 1 ist eine schematische
Darstellung der Struktur von Fibronektin sowie der durch
Thermolysinspaltung erhaltenen Fragmente; die in den Abb. 2,
3 und 4 gezeigten Kurven zeigen die im Urin von Gesunden und
von Malignompatienten jeweils unter Verwendung der monoklonalen
Antikörper FN10 und FN30 (Abb. 2), der monoklonalen
Antikörper FN4 und FN9 (Abb. 3), sowie mit einem polyklonalen
Antikörper (Abb. 4) gemessenen Mengen an Fibronektin;
die Abb. 5 schließlich zeigt die Rate, mit der
Fibronektin im Urin von Gesunden und von Malignompatienten
jeweils in Fragmente gespalten wird.
Unsere Untersuchungen haben ergeben, daß eine große Menge an
fragmentiertem Fibronektin (abgekürzt fFN), das im Urin von
Malignompatienten, nicht aber von Gesunden gebildet wird,
durch Verwendung von für Human-Fibronektin-Domänen spezifischen
monoklonalen Antikörpern nachgewiesen werden kann,
und daß durch Anwendung eines neuen, auf diesen Ergebnissen
beruhenden Verfahrens Malignome beim Menschen entdeckt
werden können.
Der Begriff "Domäne" soll in der vorliegenden Anmeldung eine
Erkennungsstelle des Antigens bezeichnen.
In der vorliegenden Erfindung können Hybridome, die die
erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper produzieren, nach
bekannten Verfahren, wie etwa dem in Nature, 256, 495-497
(1975) beschriebenen, hergestellt werden.
Als Human-Fibronektin-Antigen kann aus Körperflüssigkeiten,
wie etwa menschlichem Plasma oder Fruchtwasser, oder aus
Zelloberflächen isoliertes Fibronektin verwendet werden.
Fibronektin aus Human-Plasma wird dabei bevorzugt. Fibronektin
kann aus derartigen Körperflüssigkeiten oder aus
Zellkulturmedium auf übliche Weise (Int J Cancer, 20, 1-5
(1975)) isoliert und gereinigt werden.
Alternativ hierzu können vorteilhaft auch im Handel erhältliche,
nach dem oben erwähnten Verfahren gereinigte Produkte
eingesetzt werden.
Es gibt keine besonderen Einschränkungen bei der Wahl der
für die Immunisierung verwendeten Tierspezies, jedoch werden
üblicherweise Mäuse für diesen Zweck eingesetzt.
In einem typischen Beispiel wird auf obige Weise erhaltenes
Human-Fibronektin intraperitoneal einer Balb/c-Maus injiziert.
Eine zweite Immunisierung wird vier Wochen später
durchgeführt, und die Milz wird drei Tage nach der zweiten
Immunisierung entfernt. Die so erhaltenen Milzzellen werden
durch die Wirkung von Polyethylenglycol mit Maus-Myelomzellen
(P3-X63-Ag8-U1) fusioniert und das erhaltene Gemisch
wird in einer 96-Loch-Mikrotiterplatte inkubiert. Am Ende
der Inkubation werden die Kulturüberstände gesammelt, die
Zellen werden durch ELISA auf die Produktion spezifischer
Antikörper gescreent und schließlich durch die limiting
dilution-Methode kloniert, wobei man Hybridome erhält, die
monoklonale Antikörper gegen Human-Fibronektin produzieren
können.
Diese Hybridome sezernieren monoklonale Antikörper in das
Kulturmedium. Man kann daher jedes Hybridom in einem käuflichen
serumfreien Medium kultivieren und durch Aufarbeiten
des Kulturüberstandes auf übliche Weise, beispielsweise
durch Aussalzen mit Ammonsulfat oder andere Verfahren, eine
Antikörperfraktion erhalten. Man kann die Hybridome auch in
einer syngenen Maus züchten und die Antikörperfraktion in
gleicher Weise aus der Körperflüssigkeit der Maus erhalten.
Die jeweilige besondere Domäne des Human-Fibronektins, mit
welcher ein auf die obige Weise erhaltener monoklonaler
Antikörper spezifisch reagiert, kann durch bekannte Methoden
identifiziert werden (J Biol Chem, 260, 5105-5114 (1985)).
Die Domäne, die ein monoklonaler Antikörper spezifisch
erkennt, kann nachgewiesen werden, indem man Human-Fibronektin
mit Thermolysin, einer von Sigma Chemical Co.,
vertriebenen Protease, spaltet, das so erhaltene Reaktionsgemisch
durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (Nature,
227, 680-685 (1970)) auftrennt, durch Western Blotting auf
Nitrocellulosefolie überträgt (Proc Natl Acad Sci USA, 76,
4350-4354 (1979)) und die Nitrocellulose mit dem monoklonalen
Antikörper reagieren läßt (s. "Useful Immunological
Experiments", Kodansha Scientific, 1984).
Die biologische Aktivität und Funktion jeder einzelnen
Domäne von Human-Fibronektin sind bekannt. Insbesondere
konnten die biologischen Aktivitäten aller durch Thermolysinspaltung
von Human-Fibronektion gebildeten Domänen aufgeklärt
werden (Biochem Biophys Res Commun, 116, 534-540
(1983)).
Die Abb. 1 zeigt schematisch die durch Spaltung von
Human-Fibronektin mit Thermolysin gebildeten Fragmente,
deren Funktion in Tabelle 1 aufgeführt ist.
Die monoklonalen Antikörper gegen Human-Fibronektion FN4,
FN9, FN10 und FN30 wurden jeweils aus den Hybridomen FN4,
FN9, FN10, bzw. FN30 erhalten. Die Bindungseigenschaften
dieser monoklonalen Antikörper an Fibronektin-Domänen sind
in der Tabelle 2 zusammengestellt.
Die weitere Untersuchung der monoklonalen Antikörper FN10
und FN30 zeigte, daß die Bindungsstelle des MAK FN30 auf dem
Fibronektinmolekül in der Gegend von Aminosäuren Nr. 1235
bis1407 (gezählt vom N-Terminus her), die des MAK FN10
dagegen in der Gegend von Aminosäure Nr.1408 bis 1517 liegt
(EMBO J, 4, 1755-1759 (1985)).
Für die quantitative Untersuchung von Human-Fibronektin
unter Verwendung von für seine Domänen spezifischen Antikörpern
können verschiedene Arten von dem Fachmann bekannten
Immunoassays angewandt werden, wie etwa Enzymimmunoassays,
Radioimmunassays, turbidimetrische immunologische Assays,
Latexagglutinationstests, Hämagglutinationstests und Immuno
diffusionsverfahren, wie die radiale Immundiffusion. Von den
genannten Methoden ist der Enzymimmunoassay, was Empfindlichkeit
und einfache Durchführung betrifft, am besten
geeignet. Bei diesem Verfahren wird ein für eine Human-
Fibronektin-Domäne spezifischer Antikörper an einen
unlöslichen Träger, wie etwa Polystyrolkügelchen oder eine
Polystyrol-Mikrotiterplatte, kovalent gebunden oder physikalisch
adsorbiert, wobei man einen unlöslichen antikörper
beschichteten Träger erhält. Getrennt davon wird der für
eine Human-Fibronektin-Domäne spezifische MAK enzymmarkiert.
Dazu wird das verwendete Enzym zuerst mit einer für das
jeweilige Enzym am besten geeigneten Substanz,
beispielsweise N-Maleinimidester für β-Galaktosidase, oder
Periodsäure für Peroxidase, und dann mit dem MAK zur
Reaktion gebracht, wobei ein für eine
Human-Fibronektin-Domäne spezifischer, enzymmarkierter
monoklonaler Antikörper erhalten wird.
Die Bestimmung von Human-Fibronektin im Urin unter Verwendung
eines für eine Human-Fibronektin-Domäne spezifischen,
enzymmarkierten monoklonale Antikörpers und eines einem
Antikörper-beschichteten, unlöslichen Träger (unlöslicher
Antikörper) zeigte, daß im Urin von Malignompatienten mehr
fragmentiertes Fibronektin (fFN) vorkommt als im Urin von
Gesunden, und daß die Menge an fFN mit einem Immunoassay
unter Verwendung der MAK FN10 und FN30 spezifisch bestimmt
werden kann.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Als Antigen wurde in diesem Versuch Human-Fibronektin aus
Plasma (vertrieben von Collaborative Research,) verwendet.
0,100 mg Antigen wurden in 0,1 ml physiologischer Kochsalzlösung
gelöst und die gleiche Menge komplettes Freund′s
Adjuvans zugesetzt. Die so erhaltene Emulsion wurde einer
Balb/c-Maus i. p. injiziert. Nach vier Wochen wurden nochmals
0,100 mg Antigen ohne Adjuvans i. p. injiziert. Nach drei Tagen
wurde die Milz entfernt und die Milzzellen wurden im Verhältnis
10 : 1 mit Maus-Myelomzellen (P3-X63-Ag8-U1) gemischt.
Das Gemisch wurde eine Minute in Gegenwart von 50% Polyethylenglycol
(PEG) und 20% Dimethylsulfoxid (DMSO) inkubiert,
um die Zellfusion zu ermöglichen. Die so behandelten
Zellen wurden dann in DMEM-Medium mit 10% fötalem Kälberserum
(FCS) suspendiert und die Suspension wurde in einer
Konzentration von 2 × 10⁴ Zellen pro Loch in eine 96-Loch-
Mikrotiterplatte ausgesät. Alle ein bis drei Tage wurde die
Hälfte des Mediums durch HAT-Medium ersetzt. Die Kulturüberstände
der Lochs, in denen Hybriddomwachstum festgestellt
wurde, wurden 10 bis 20 Tage danach abgenommen und auf das
Vorhandensein von Antikörpern durch ELISA oder eine andere
geeignete Methode untersucht. Antikörper produzierende
Hybridome wurden aus 39 Kulturen isoliert. Jede Gruppe dieser
Hybridome wurde zweimal durch limiting dilution (Verdünnung
zur Herstellung von Einzelzell-Kulturen) kloniert, und bei
den vier Hybridom-Klonen FN4, FN9, FN10 und FN30 wurden die
höchsten Titer an produzierten MAK gefunden. Um große Mengen
dieser MAK zu erhalten, wurden die Hybridome FN4, FN9, FN10
und FN30 jeweils i. p. einer Balb/c-Maus zur Induktion von
Aszitestumoren injiziert. Durch Abnehmen des Aszites von der
betroffenen Maus erhielt man eine Lösung des monoklonalen
Antikörpers gegen Human-Fibronektin.
Die Hybridome FN10 und FN30 wurden unter der Bezeichnung
FERM BP-1532 bzw. FERM BP-1533 beim Fermentation Research
Institute, Agency of Industrial Science and Technology,
Japan, am 22. Oktober 1987 hinterlegt.
Die in Abschnitt 1 erhaltene Lösung von monoklonalen Antikörpern
gegen Human-Fibronektin wurde mit Ammonsulfat behandelt,
gefolgt von einer Säulenchromatografie auf DEAE-Zellulose,
und man erhielt einen gereinigten monoklonalen Antikörper
gegen Human-Fibronektin. Das Molkulargewicht des
Antikörpers wurde durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
abgeschätzt, sein isoelektrischer Punkt durch Elektrofokussierung
bestimmt, und die IgG-Subklasse durch ELISA unter
Verwendung von Antiseren gegen Maus-IgG-Subklassen (vertrieben
von Seikagaku, Kogyo, Ltd., Japan) geprüft. Die
Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengestellt.
Fibronektin aus menschlichem Plasma (Collaborative Research)
wurde auf einer Gelatine-beschichteten Mikroschale (Corning)
in einer Konzentration von 0,100 mg/ml ausgestrichen und die
Platte wurde mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen,
um überschüssiges Human-Plasma-Fibronektin zu entfernen.
Man ließ dann jeweils einen monoklonalen Antikörper (FN4,
FN9, FN10 bzw. FN30) auf die Platte einwirken, inkubierte
sechs Stunden und wusch mit physiologischer Kochsalzlösung
überschüssigen MAK ab. Unabhängig davon wurden HeLa-Zellen
oder normale menschliche Fibroblasten in Serum-freiem
DMEM-Medium (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) dispergiert,
so daß eine Einzelzell-Suspension entstand. Diese wurde auf
die oben beschriebene Kulturschale aufgebracht und dann
inkubiert. Die Zellen wurden nach einem festgelegten Zeitraum
unter dem Mikroskop daraufhin untersucht, ob ihre
Fähigkeit, sich auszubreiten und adhärent zu werden durch
den MAK beeinträchtigt wurde. Keiner der untersuchten MAK
inhibierte Ausbreitung und Adhäsion normaler menschlicher
Fibroblasten. Nur der MAK FN30 hemmte Ausbreitung und Adhäsion
von HeLa-Zellen.
1. Zu 20 ml 0,1 M Phosphatpuffer, pH 8,0, mit 1 mg MAK gegen
Human-Fibronektin (FN4 oder FN30) aus Beispiel 1, wurden 100
Polystyrolkügelchen einer Teilchengröße von 6,35 mm (Sekisui
Chemical Co., Ltd.) gegeben. Das Gemisch wurde 16 h bei 5°C
stehen gelassen und dann eine Stunde auf 37°C erwärmt, um
den Antikörper an die Polystyrolkugeln zu fixieren. Nach
sorgfältigem Waschen mit physiologischer Kochsalzlösung
wurden die Kugeln über Nacht in 10 mM Phosphatpuffer, pH 7,4
mit 1% Rinderserumalbumin, 0,05% Natriumazid und 0,9%
Natriumchlorid eingetaucht. Auf diese Weise wurden mit MAK
gegen Human-Fibronektin beschichtete Kügelchen erhalten.
2. Durch Bindung von Peroxidase (Boehringer, Mannheim) an die
in Beispiel 1 erhaltenen monoklonalen Antikörper FN9 und
FN10 gegen Human-Fibronektin nach dem Verfahren von Nakane
et al., J Histochem Cytochem 22: 1084 (1974), wurden markierte
Antikörper hergestellt. Zu einer Lösung von 10 mg
Peroxidase in 2 ml reinem Wasser wurden 0,2 ml einer
0,1 M Kaliumperiodatlösung zugegeben. Das Gemisch wurde
20 min bei Raumtemperatur stehengelassen und dann über Nacht
gegen 1 mM Acetatpuffer, pH 4,0, dialysiert. Das Dialysat
wurde durch Zugabe von 0,2 M Carbonatpuffer, pH 9,5, auf
pH 9 bis 9,5 eingestellt. Getrennt davon wurden jeweils 2 mg
der monoklonalen Antikörper gegen Human-Fibronektin in je
1,5 ml phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung,
pH 7,4, (PBS) gelöst und die erhaltenen Lösungen wurden über
Nacht bei 4°C gegen 10 mM Carbonatpuffer, pH 9,5,
dialysiert. Das jeweils erhaltene Dialysat wurde mit der
Periodat-behandelten Peroxidase gemischt und das Gemisch
wurde 2 h bei Raumtemperatur stehengelassen. Nach Zugabe von
0,1 ml einer wäßrigen Natriumborhydridlösung, 4 mg/ml, wurde
die Reaktion bei 4°C zwei Stunden weitergeführt, dann wurde
das Reaktionsgemisch durch Gelfiltration auf mit PBS äquilibriertem
Ultrogel AcA22Wz (LKB) fraktioniert. Die
Fraktionen, in denen sowohl Peroxidaseaktivität als auch
Antikörper nachweisbar war, wurden gesammelt und unter
Zusatz von Natriummethylthiolat in einer Endkonzentration
von 0,01% bei 4°C gelagert.
Ein insolubilisierter Antikörper und ein markierter Antikörper
wurden aus polyklonalem Antikörper gegen Human-Fibronektin
(Igaku Seibutsugaku Kenkyusho) auf die gleiche Weise,
wie in Abschn. 1 und 2 beschrieben, hergestellt.
FN aus menschlichem Blutplasma (Funakoshi Co., Ltd.) wurde
als Human-nFN verwendet. Human-fFN wurde nach dem Verfahren
von Borsi et al., Anal Biochem 155:, 335 (1986), wie folgt
hergestellt: Zu einer Lösung von 500 mg Fibronektin aus
menschlichem Blutplasma in 500 ml 35 mM Tris-HCl-Puffer mit
0,5 mM EDTA und 25 mM CaCl₂, ph 7,6, wurde Thermolysin
(Sigma) in einer Endkonzentration von 0,005 mg/ml zugegeben.
Das Gemisch wurde für 4 Stunden zur Verdauung auf
22°C gehalten, danach wurde die Reaktion durch Zugabe von
EDTA in einer Endkonzentration von 5 mM gestoppt. Die
SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese des Reaktionsgemisches
zeigte, daß Fibronektin in sechs Fragmente gespalten worden
war, wobei kein nicht-gespaltenes nFN verblieben war. Durch
Elektrophorese konnte auch gezeigt werden, das das als
Ausgangsmaterial verwendete nFN kein fFN enthalten hatte.
Der Proteingehalt der Lösung wurde durch Messung der Extinktion
bei 280 nm unter Zugrundelegung eines Extinktionskoeffizienten
E = 12,8 nach Mosesson et al., J Biol Chem 245:
5728 (1970), bestimmt.
Die Menge an nFN und fFN wurde jeweils durch Enzymimmunoassay
(EIA) wie folgt bestimmt. Eine zu untersuchende Probe
von 0,200 ml und ein Kügelchen mit insolubilisiertem Antikörper
wurden in ein Röhrchen gegeben und eine Stunde bei
37°C inkubiert (erste Inkubation). Das Kügelchen wurde dann
dreimal mit 3 ml physiologischer Kochsalzlösung gewaschen,
in ein anderes Röhrchen mit 0,200 ml einer Lösung von markiertem
Antikörper in einer Verdünnung von 1 : 300 überführt und
eine weitere Stunde inkubiert (zweite Inkubation). Das
Kügelchen wurde dann erneut dreimal mit 3 ml physiologischer
Kochsalzlösung gewaschen und in ein neues Röhrchen gegeben.
0,300 ml Farbreagenz, eine Lösung von 1 mg/ml o-Phenylendiamin
und 0,01% Wasserstoffperoxid in 0,1 M Citratpuffer,
pH 5,0, wurden zugegeben und das Gemisch 30 Minuten bei
37°C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 1 ml
0,5 M Schwefelsäure gestoppt und die Extinktion bei
492 nm abgelesen. Die Tabelle 4 zeigt die für das im obigen
Abschnitt 4 hergestellte nFN und fFN erhaltenen Ergebnisse.
Die Kombination der monoklonalen Antikörper FN4 und FN9
(einer Kombination, welche die Domänen 1 und 4 erkennt) kann
zur Bestimmung von nFN, nicht jedoch von fFN verwendet
werden. Die Empfindlichkeit des Nachweises war mit der
Kombination der polyklonalen Antikörper sehr gering.
Es wurden Musterproben, die nFN und fFN in verschiedenen
Mischungsverhältnissen enthielten, hergestellt. Die Menge an
nFN und fFN wurde jeweils separat bestimmt, und es wurde die
Fragmentierungsrate in einer Probe berechnet. Die verwendete
Eichkurve beruhte auf den in Tabelle 5 angegebenen Daten.
Die Gesamtmenge an nFN und fFN konnte durch Verwendung einer
Kombination der monoklonalen Antikörper FN30 und FN10, die
Menge an nFN allein durch die Kombination der MAK FN4 und
FN9 bestimmt werden. Die Fragmentierungsrate konnte nach der
folgenden Gleichung berechnet werden:
Von zehn gesunden Probanden und zehn Malignom-Patienten
wurde Morgenurin gesammelt. 10 ml jeder Probe wurden dann
jeweils über Nacht bei 4°C gegen reines Wasser dialysiert
und das Dialysat wurde lyophilisiert. Das getrocknete Produkt
wurde in 0,1 ml eines 10 mM Phosphatpuffers,
pH 7,2, gelöst. Die Lösung wurde dann durch SDS-Polyacrylamid
gelelektrophorese aufgetrennt und die fraktionierten Proteine
wurden elektrophoretisch auf eine Nitrocellulosefolie
übertragen. Die so an die Nitrocellulosefolie adsorbierten
Proteine wurden durch einen farbgebenden EIA unter Verwendung
verschiedener monoklonaler und polyklonaler Antikörper gegen
Human-Fibronektin als erstem Antikörper, Peroxidase-markiertem
Antikörper gegen Maus-Immunglobuline bzw. Peroxidase-markiertem
Antikörper gegen Kaninchen-Immunglobuline (beide
Amersham) als zweitem Antikörper, sowie 0,1 M Phosphatpuffer,
pH 6,5, mit 1 mg/ml 4-Chlor-1-naphthol und 0,01%
Wasserstoffperoxid als Farbentwickler nachgewiesen. Die
Ergebnisse sind in der Tabelle 6 gezeigt. Im Urin von
Gesunden konnte mit jedem der verwendete ersten Antikörper
nur die nFN-Bande (MG 220 000), jedoch keine fFN-Banden
(MG 5000 bis 200 000) werden. Bei den
Patienten mit Malignomen waren sowohl die nFN-Bande (MG
220 000), als auch fFN-Banden (MG 5000 bis 200 000)
nachweisbar. In diesem Fall war der Nachweis wirksamer
bei Verwendung der Domänen-spezifischen monoklonalen
Antikörper FN4, FN9, FN10 und FN30, als bei Verwendung des
polyklonalen Antikörpers gegen Human-Fibronektin. Die oben
erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß im Urin von Malignompatienten,
nicht aber von Gesunden fFN vorhanden ist und unter
Verwendung der der erfindungsgemäßen Domänen-spezifischen,
monoklonalen Antikörper gegen Human-Fibronektin nachgewiesen
werden kann.
Von zehn Gesunden und zehn Patienten mit Malignomen wurde
Morgenurin gesammelt und die Menge an Human-Fibronektin in
jeder Probe wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 2
bestimmt. Außerdem wurde die Kreatininkonzentration in jeder
Probe mit einer handelsüblichen Test-Packung (Kreatinin-Test
Wako, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) bestimmt, und die
tatsächliche Menge an FN wurde als Verhältnis von gemessener
FN-Menge zu Kreatinin (ug FN/g Krea) ausgedrückt, wobei auf
das Urinvolumen korrigiert wurde.
Die Abb. 2 zeigt die Ergebnisse bei Verwendung der
monoklonalen Antikörper FN30 und FN10 als insolubilisierter
Antikörper bzw. markierter Antikörper; die Abb. 3 bei
Verwendung der monoklonalen Antikörper FN4 und FN9; und
Abb. 4 bei Verwendung von polyklonalen Antikörpern.
Die Abb. 5 schließlich vergleicht die Fragmentierungsraten
in diesen Kombinationen. In den Abbildungen ist auf
der Ordinate die FN-Menge in µg/g Kreatinin oder die Frag
mentierungsrate in % aufgetragen. Die Abbildungen zeigen,
daß mit der Kombination der monoklonalen Antikörper FN30 und
FN10 die im Urin von Malignompatienten nachgewiesene Fibronetkinmenge
größer als die im Urin von Gesunden ist, und daß
besonders bei Patienten mit Metastasen (mit offenen Kreisen
eingetragen) abnorm hohe Werte erhalten werden. Andererseits
wurden mit der Kombination der monoklonalen Antikörper FN4
und FN9 keine signifikanten Unterschiede in der Menge an nFN
zwischen Gesunden und Malignompatienten gesehen. Bei Verwendung
von polyklonalen Antikörpern wurden für Malignompatienten
höhere Werte als bei Gesunden bestimmt, der Unterschied
war jedoch geringer als mit der Kombination der monoklonalen
Antikörper FN30 und FN10. Die Fragmentierungsraten von
Human-Fibronektin in den untersuchten Proben schwankten bei
Gesunden in einem weiten Bereich zwischen 15 und 85%, und
lag bei den Malignompatienten in der Regel über 90%. Diese
Ergebnisse zeigen, daß im Urin von Malignompatienten große
Mengen an fragmentiertem Fibronektin vorkommen und daß eine
effektive Diagnostik von Malignomen, insbesondere metastasierenden
Malignomen durch spezifische Bestimmung der Menge
an so gebildetem fragmentiertem Fibronektin möglich ist.
Wie aus dem oben Gesagten ersichtlich wird, liefert die
vorliegende Erfindung ein neues Verfahren für die Krebserkennung
beim Menschen aus menschlichen Urinproben, die
leicht in großen Mengen erhältlich sind und einfach getestet
werden können.
Claims (4)
1. Die monoklonalen Antikörper FN10 und FN30, dadurch gekennzeichnet,
daß sie spezifisch mit Human-Fibronektin
reagieren und die folgenden physikochemischen Eigenschaften
besitzen:
- 1) monoklonaler Antikörper FN10:
- a) Molekulargewicht: 150 000 ±5000;
- b) IgG-Subklasse: G₁;
- c) Isoelektrischer Punkt: 6,6 bis 7,1;
- d) Bindungsstelle am Antigen:
die durch Thermolysinspaltung erhaltene Human-Fibronektindomäne mit dem Molekulargewicht 10 500;
- 2) monoklonaler Antikörper FN30:
- a) Molekulargewicht: 150 000;
- b) IgG-Subklasse: G₁;
- c) Isoelektrischer Punkt: 5,3 bis 5,8;
- d) Bindungsstelle am Antigen:
die durch Thermolysinspaltung erhaltene Human-Fibronektindomäne vom Molekulargewicht 10 500; - e) biologische Aktivität:
Reaktion mit Human-Fibronektin dadurch spezifische Inhibierung der Bindung von Malignomzellen an Human-Fibronektin.
2. Die Hybridome FN10 und FN30, dadurch gekennzeichnet,
daß sie die monoklonalen Antikörper gegen Human-Fibronektin
nach Anspruch 1 produzieren.
3. Reagenz zur immunologischen Bestimmung der Menge an Fibronektin
fragmenten, dadurch gekennzeichnet, daß es als
wesentlich wirksame Bestandteile die monoklonalen Antikörper FN10
und FN30 nach Anspruch 1 gegen Human-Fibronektin enthält.
4. Verfahren zur Krebserkennung beim Menschen, dadurch gekennzeichnet,
daß es den immunologischen Nachweis der
Menge an Fibronektinfragmenten in menschlichem Urin unter Verwendung
der monoklonalen Antikörper gegen Human-Fibronektin FN10
und/oder FN30 nach den Ansprüchen 1 und 3 umfaßt.
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