DE69729204T2

DE69729204T2 - Diagnose des chronischen müdigkeitssyndroms

Info

Publication number: DE69729204T2
Application number: DE69729204T
Authority: DE
Inventors: J. Robert SUHADOLNIK
Original assignee: Temple University of Commonwealth System of Higher Education
Current assignee: Temple University of Commonwealth System of Higher Education
Priority date: 1996-10-09
Filing date: 1997-09-19
Publication date: 2005-05-04
Anticipated expiration: 2017-09-20
Also published as: NZ335114A; EP0934429B1; EP0934429A1; AU4650097A; DE69729204D1; CN1232508A; US6214554B1; JP2000516818A; AU730433B2; CA2267659C; US5985565A; EP0934429A4; ES2221961T3; JP3686423B2; CA2267659A1; WO1998015646A1; ATE267266T1

Description

Technisches Gebiet
Die Erfindung bezieht sich auf die Diagnose des chronischen Müdigkeitssyndroms (CFS) durch Nachweis eines mit der Erkrankung verbundenen eindeutigen molekularen Markers.
Technischer Hintergrund
Das chronische Müdigkeitssyndrom (CFS) ist eine Erkrankung unbekannter Ätiologie, die oft mit plötzlich auftretenden grippeartigen Symptomen, schwächender Müdigkeit, leichtem Fieber, Myalgie und neurokognitiver Dysfunktion verbunden ist. CFS-Patienten zeigen typischerweise verminderte Werte der Karnofsky-Performance. Der Karnofsky-Performancetest mißt die Fähigkeit einer Person, zu funktionieren und normale Tätigkeiten auszuführen. Die Karnofsky-Indizes reichen von null für einen funktionslosen oder toten Patienten bis 100 für eine völlig normale Funktion. Die Diagnose der CFS bleibt ausgeschlossen.
Eine zunehmende Menge von Beweisen deutet darauf hin, daß CFS mit einer Regulationsstörung sowohl der humoralen als auch der zellvermittelten Immunität, einschließlich Mitogenantwort, Virusreaktivierung, abnormaler Cytokinproduktion, verminderter Funktion der natürlichen Killerzellen und Veränderung der intermediären Metaboliten, zusammenhängt. Es wurde vorgeschlagen, daß die bei CFS beobachteten klinischen und immunologischen Abnormitäten Fehler in den von doppelsträngiger RNA (dsRNA) abhängigen, durch Interferon induzierbaren Pfaden umfassen könnten, d. h. in den 2',5'- Oligoadenylat(2-5A)-Synthetase/RNase L und p68-Kinase (PKR) Antivirus-Abwehrpfaden (Suhadolnik et al., Clin. Infect. Dis. 18: 596–5104, 1994; Suhadolnik et al., In Vivo 8: 599–604 (1994). Der 2-5A-Synthetase/RNase L-Pfad ist Teil des Antivirus-Abwehrmechanismus in Säugetierzellen; dieser Pfad spielt auch eine Rolle bei der Regulation von Zellwachstum und -differenzierung (Lengyel, Ann. Review Biochem. 51: 251–282, 1982; Sen et al., Adv. Virus Res. 42: 57–102, 1993).
Nach Aktivierung durch dsRNA wandelt 2-5A-Synthetase ATP in 2'-5'-verknüpfte Oligoadenylate mit 5'-terminalen Phosphaten um. Biologisch aktives 2-5A bindet an und aktiviert eine latente Endoribonuklease, RNase L, welche einsträngige virale und zelluläre RNA, hauptsächlich hinter UpNp-Sequenzen, hydrolysiert, wodurch die Proteinsynthese inhibiert wird.
Frühere Untersuchungen des 2-5A-Synthetase/RNase L-Pfads bei CFS ergaben eine statistisch signifikante Regulationsstörung, bei der die 2-5A-Synthetase vorwiegend in ihrer aktivierten Form vorliegt, die Gehalte an bioaktiver 2-5A erhöht sind und die Aktivität der RNase L hochgeregelt ist (Suhadolnik et al., Clin. Infect. Dis., a. a. O.; Suhadolnik et al., In Vivo, a. a. O.). Bei CFS ist die Expression der Serin-Threonin-Kinase, PKR, abgeregelt (Suhadolnik et al., In Vivo, a. a. O.). PKR steuert die Initiierung der Proteintranslation durch Phosphorylierung von eIF-2.
In Analytical Biochemistry (192, 268–276, 1991) offenbart Floyd-Smith Untersuchungen an einer latenten Endoribonuklease, RNase L, welche an (2'-5')-Oligoadenylate ((2'-5')(A)_n, n = 2 bis 15) bindet und durch diese aktiviert wird. Die Charakterisierung wird durch Gelelektrophorese an Polyacrylamid und Affinitäts-Blot-Tests durchgeführt.
Im Journal of Interferon Research (Band 7, Nr. 6, 1987, Seite 676) offenbart Silverman die Isolierung von 2-5A binden den Proteinen mit 80 und 33 kDa aus Extrakten von Mäuselebern.
In Biochemistry (Band 27, Nr. 24, 1988, Seiten 8840–8846) offenbart Suhadolnik die Verwendung von Photosonden aus trimerem 2- und 8-Azidotriphosphat von 2-5A zur Untersuchung der Aktivierung und Bindung von RNase L und anderen 2-5A bindenden Proteinen.
Trotz dieser Bemühungen wurde kein eindeutiger molekularer Marker für CFS identifiziert. Benötigt wird ein biochemischer Test auf der Basis eines eindeutigen Markers für CFS, der die Grundlage für eine eindeutige CFS-Diagnose bilden kann.
Abkürzungen

Die folgenden Abkürzungen können hier verwendet werden:

AMP	Adenosin-5'-monophosphat;
2-Azido-AMP	2-Azidoadenosin-5'-monophosphat;
8-Azido-AMP	8-Azidoadenosin-5'-monophosphat;
2,8-Azido-AMP	2,8-Azidoadenosin-5'-monophosphat;
2-5A	2',5'-Oligoadenylat, das ist ein Oligomer von Adenylsäure mit (2'→5')-Phosphodiesterbindungen und 5'-Triphosphat;
CFS	chronisches Müdigkeitssyndrom;
dsRNA	doppelsträngige RNA;
ELISA	heterogener Enzym-Immunassay;
etheno-AMP	N¹N⁶-Ethenadenosin-5'-monophosphat;
GTS	Glutathion-S-transferase;
HEPES	4-(2-Hydroxyethyl)piperazinethansulfosäure;
PBMC	mononukleäre Zellen des peripheren Bluts;
PBS	phosphatgepufferte Kochsalzlösung;
p₃A₃	Trimer der Adenylsäure mit (2'→5')-Phosphodiesterbindungen und 5'-Triphosphat;

pApAp(8-azidoA)	5'-O-Phosphoryladenylyl-(2'→5')-adenylyl(2'→5')-8-azidoadenosin;
poly(U)-3'-pCp	Polyuridylsäure mit einem am 3'-Terminus gebundenen Cytosinrest;
SDS-PAGE	Polyacrylamid-Gelelektrophorese mit Natriumdodecylsulfat.

Nach einer erfindungsgemäßen Ausbildung wird ein Verfahren zur Diagnose des chronischen Ermüdungssyndroms bereitgestellt, welche die Bestimmung eines 2'-5'-Oligoadenylat bindenden Proteins in einer Patientenprobe umfaßt, wobei das Protein ein Molekulargewicht von 29 bis 31 kDa unter nativen Bedingungen hat, und wobei die Anwesenheit eines solchen Proteins in der Patientenprobe für das chronische Müdigkeitssyndrom diagnostisch ist.
Bevorzugt ist das Protein RNase L.
Geeignet umfaßt das Verfahren weiters die Untersuchung der Patientenprobe auf RNase L mit 79 bis 81 kDa, wobei (i) die Anwesenheit eines Moleküls der 29 bis 31 kDa-RNase L und die Abwesenheit eines Moleküls der 79 bis 81 kDa-RNase L ein schweres chronisches Müdigkeitssyndrom anzeigt, und (ii) die Anwesenheit von RNase L-Molekülen beider Molekulargewichte ein weniger schweres chronisches Müdigkeitssyndrom anzeigt.
Vorteilhaft umfaßt die Untersuchung der Patientenprobe:

(a) Fraktionierung der Proteine in der Patientenprobe im nativen Zustand;
(b) Bestimmung des 29 bis 31 kDa- und ggf. des 79 bis 81 kDa-Proteins mit RNase L-Aktivität in den fraktionierten Proteinen.

Bevorzugt umfaßt die Untersuchung auf RNase L-Aktivität:

(a) Nachweis der Bildung von spezifischen Spaltprodukten der Hydrolyse von 28S- und/oder 18S-RNA; oder
(b) Nachweis der Hydrolyse von poly(U)-3'-pCp.

Nach einer weiteren erfindungsgemäßen Ausbildung wird ein Verfahren zur Diagnose des chronischen Müdigkeitssyndroms bereitgestellt, welche die Untersuchung einer Patientenprobe auf ein 2'-5'-Oligoadenylat bindendes Protein mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 36 bis 38 kDa bei der Polyacrylamid-Gelelektrophorese mit Natriumdodecylsulfat umfaßt, wobei die Anwesenheit eines solchen Proteins in der Patientenprobe für das chronische Müdigkeitssyndrom diagnostisch ist.
Geeignet umfaßt das Verfahren:

(a) Kontaktieren einer Patientenprobe mit einer Sonde, die eine Verbindung nach Formel I mit einer nachweisbaren Markierung enthält, unter Bedingungen, die zur Bildung von kovalenten Konjugaten dieser markierten Verbindung mit 2'-5'-Oligoadenylat bindenden Proteinen in der Probe geeignet sind:
wobei m eine ganze Zahl von 0 bis 3 ist, n eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist, und jedes R₁ und R₂ unabhängig von den anderen R₁ und R₂ Wasserstoff oder N₃ ist, vorausgesetzt, daß mindestens ein R₁ oder R₂ N₃ ist, oder ein wasserlösliches Salz dieser Verbindung;
(b) Kontaktieren der diese kovalenten Konjugate enthaltenden Probe mit einem Antikörper, der RNase L-Spezies in der Probe bindet;
(c) Trennung der Proteine in dieser Probe durch Gelelektrophorese; und
(d) Untersuchung der aufgetrennten Proteine auf Markerproteine, die
(i) ein kovalentes Konjugat mit der markierten Sondenverbindung gebildet haben, und
(ii) an diesen Antikörper gebunden sind;

Vorteilhaft umfaßt das Verfahren weiters die Untersuchung der Patientenprobe auf ein 79 bis 81 kDa-Markerprotein, wobei die Anwesenheit eines Markerproteins mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 36 bis 38 kDa nach der Polyacrylamid-Gelelektrophorese mit Natriumdodecylsulfat und die Abwesenheit eines Markerproteins mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 79 bis 81 kDa nach der Polyacrylamid-Gelelktrophorese mit Natriumdodecylsulfat für schweres chronisches Müdigkeitssyndrom diagnostisch ist.
Bevorzugt ist in der Sondenverbindung n 1, m 1 und jedes R₂ Wasserstoff.
Die Sondenverbindung ist geeignet 5'-O-Phosphoryladenylyl(2'→5')-adenylyl-(2'→5')-8-azidoadenosin oder ein Salz davon.
Somit wird die Probe in Gegenwart von zugefügtem Proteaseinhibitor präpariert.
Bevorzugt umfaßt die Probe Blut oder eine Fraktion davon.
Geeignet enthält die Probe einen Zytoplasma-Extrakt von mononukleären Zellen des peripheren Bluts.
Es wird hier ein Verfahren zur Diagnose des chronischen Müdigkeitssyndroms offenbart, umfassend die Bestimmung von RNase L mit etwa 30 kDa in einer Patientenprobe. Das offenbarte Verfahren umfaßt:

(a) Fraktionierung der Proteine in der Patientenprobe nach dem Molekulargewicht unter nicht denaturierenden Bedingungen, und
(b) Bestimmung eines Proteins von etwa 30 kDa und RNase L-Aktivität in den fraktionierten Proteinen. Die Bestimmung der RNase L-Aktivität kann beispielsweise den Nachweis der Bildung spezifischer Spaltprodukte (SCP) aus der Hydrolyse von 28S- und/oder 18S-RNA oder den Nachweis der Hydrolyse von poly(U)-3'-pCp umfassen.

Es wird hier auch ein anderes Verfahren zur Diagnose des chronischen Müdigkeitssyndroms offenbart, umfassend:

(a) Kontaktieren einer in Gegenwart von zugesetztem Proteaseinhibitor präparierten Patientenprobe mit einer Sonde, die eine Verbindung nach Formel I mit einer nachweisbaren Markierung enthält, unter Bedingungen, die zur Bildung von kovalenten Konjugaten dieser markierten Verbindung mit 2',5'-Oligoadenylat bindenden Proteinen in der Probe geeignet sind:
wobei m eine ganze Zahl von 0 bis 3 ist, n eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist, und jedes R₁ und R₂ unabhängig von den anderen R₁ und R₂ Wasserstoff oder N₃ ist, vorausgesetzt, daß mindestens ein R₁ oder R₂ N₃ ist, oder ein wasserlösliches Salz dieser Verbindung;
(b) Kontaktieren der diese kovalenten Konjugate enthaltenden Probe mit einem Antikörper, der RNase L-Spezies in der Probe bindet;
(c) Trennung der Proteine in dieser Probe durch Gelelektrophorese; und
(d) Untersuchung der aufgetrennten Proteine auf Markerproteine, die
(i) ein kovalentes Konjugat mit der markierten Sondenverbindung gebildet haben, und
(ii) an diesen Antikörper gebunden sind;

Es wird hier auch ein weiteres Verfahren zum Nachweis des schweren chronischen Müdigkeitssyndroms offenbart, umfassend:

Es wird hier noch ein anderes Verfahren zur Beurteilung des relativen Schweregrads des chronischen Müdigkeitssyndroms bereitgestellt, umfassend die Bestimmung von RNase L-Molekülen mit Molekulargewichten von etwa 30 und etwa 80 kDa in einer Patientenprobe unter nativen Bedingungen. Die Anwesenheit eines RNase L-Moleküls mit etwa 30 kDa und die Abwesenheit eines RNase L-Moleküls mit etwa 80 kDa zeigen ein schweres chronisches Müdigkeitssyndrom an. Die Anwesenheit von RNase L-Molekülen beider Molekulargewichte zeigt ein weniger schweres chronisches Müdigkeitssyndrom an. Die Bestimmung kann ausgeführt werden durch

(a) Fraktionieren der Proteine in der Patientenprobe nach dem Molekulargewicht unter nicht denaturierenden Bedingungen und
(b) Bestimmung der etwa 30 kDa- und des etwa 80 kDa-Proteine mit RNase L-Aktivität in den fraktionierten Proteinen.

Beschreibung der Figuren
1 zeigt die Fraktionierung (10% SDS-PAGE) und Autoradiographie von an Protein A-Sepharose gebundenen Proteinen, die aus Extrakten mononukleärer Zellen des peripheren Bluts (PBMC) gewonnen worden waren, die mit der 2-5A-Photosonde, [³²P]pApAp(8-AzidoA) inkubiert, mit UV bestrahlt und mit dem polyklonalen Antikörper für rekombinante menschliche RNase L inkubiert wurden. P = Patient, C = Vergleich. Lanes 1, 4–9: Personen mit CFS; Lanes 2, 3: repräsentative gesunde Vergleichspersonen. In Spaltungstests mit ribosomaler RNA bestimmte Aktivitäten der RNase L für Lanes 1–9: 79, 54, 37, 73, 59, 253, 127, > 500 und 253.
2 zeigt die Ergebnisse der analytischen Gelpermeations-HPLC-Fraktionierung von PBMC-Extrakten gesunder (Diagramm A) und CFS-Personen (Diagramme B und C) unter nativen (nicht-denaturierenden) Bedingungen. Die Extrakte wurden vor der Fraktionierung mit [³²P]pApAp(8-AzidoA) photomarkiert. Durch Szintillationsspektrometrie wurde in Aliquoten der von jedem PBMC-Extrakt gewonnenen Fraktionen die Radioaktivität bestimmt. Die Diagramme D, E und F zeigen die Ergebnisse der analytischen Gelpermeations-HPLC-Fraktionierung der PBMC-Extrakte derselben gesunden (Diagramm D) und CFS-Personen (Diagramme E und F) wie die Diagramme A, B und C, diesmal unter nativen (nicht-denaturierenden) Bedingungen, mit nachfolgender Bestimmung der RNase L-Aktivität der Fraktionen. Mit poly(U)-3'-[³²P]pCp in Gegenwart von p₃A₃ wurden Aliquote jeder Fraktion gemessen. In den Fraktionen 1–150 wurde keine 2-5A-Bindung oder 2-5A-abhängige RNase L-Enzymaktivität nachgewiesen. Die Pfeile weisen auf Molekulargewichtsmarker hin. Der gesunde Vergleichs-PBMC-Extrakt (Diagramme A und D) ist auch in 1, Lane 2, gezeigt. Der CFS-PBMC-Extrakt der Diagramme B und E in 2 ist auch in 1, lane 1, beschrieben. Der CFS-PBMC-Extrakt der Diagramme C und F in 2 ist auch in 1, Lane 8, beschrieben.
3 zeigt die Fraktionierung (10% SDS-PAGE) von Proteinen aus PBMC-Extrakten (100 μg Protein), die in Gegenwart (+) oder Abwesenheit (–) von Proteaseinhibitoren präpariert, mit der 2-5A-Photosonde [³²P]pApAp(8-AzidoA) photoaffin markiert und mit polyklonalem Antikörper für rekombinante menschliche 80 kDa-RNase L immungefällt waren. Die photoaffin markierten, immunreaktiven, 2-5A bindenden Proteine wurden durch 10% SDS-PAGE getrennt und durch Abbildung des Phosphors quantitativ bestimmt. Die Molmassen der 2-5A bindenden Proteine sind angezeigt. Lanes 1, 2: CFS-PBMC-Extrakte, Lanes 3, 4: gesunde Vergleichs-PBMC-Extrakte.
Eingehende Beschreibung der Erfindung
Biologisch aktives 2-5A bindet an und aktiviert die latente Endoribonuklease RNase L. Aktivierte RNase L wiederum hydrolysiert einsträngige virale und zelluläre RNA und inhibiert dadurch die Proteinsynthese. Es wurde festgestellt, daß Zellextrakte gesunder Personen ein 2-5A bindendes Protein von etwa 80 kDa mit 2-5A-abhängiger RNase L-Aktivität enthalten. Die Extrakte können auch ein 2-5A bindendes Protein von etwa 42 kDa mit 2-5A-abhängiger RNase L-Aktivität enthalten. Andererseits wurde gezeigt, daß CFS-Patienten ein klar abgegrenztes 2-5A bindendes Protein von 30 kDa mit 2-5A-abhängiger RNase L-Aktivität enthalten. Mit "RNase L-Aktivität" ist die enzymatische Aktivität der RNase L bei der Hydrolyse ihrer RNA-Substrate gemeint.
PBMC einer Untergruppe der untersuchten CFS-Patienten enthielt 2-5A bindende Proteine mit 2-5A-abhängiger RNase L-Aktivität bei Molekulargewichten von etwa 80 und etwa 30 kDa. War bei der Präparation der Patientenzellextrakte kein zugefügter Proteaseinhibitor anwesend, wurde auch ein 2-5A bindendes Protein mit 2-5A-abhängiger RNase L-Aktivität bei einem Molekulargewicht von etwa 42 kDa beobachtet. Die Anwe senheit der Spezies mit etwa 80 kDa fiel mit weniger aggressivem CFS zusammen. PBMC einer anderen Untergruppe der Patienten enthielt nur bei etwa 30 kDa 2-5A Bindungsaktivität und 2-5A-abhängige RNase L-Aktivität. Dieses Profil stimmte mit aggressiverem CFS überein. Ungeachtet der Schwere des Krankheitszustands können von CFS betroffene Personen an der Gegenwart der RNase L-Spezies mit etwa 30 kDa erkannt werden, die bei nicht von CFS betroffenen Personen stets fehlt. Der Nachweis der einzigartigen und bislang unbekannten RNase L-Spezies mit etwa 30 kDa unter nativen Bedingungen ermöglicht erstmalig einen genauen und eindeutigen Test auf CFS. Ebenso fällt der Nachweis einer RNase L-Sorte mit etwa 37 kDa unter nicht-nativen Bedingungen mit CFS zusammen.
Offenbarungsgemäß werden von Personen, bei denen Verdacht auf CFS besteht, Proben entnommen und auf Anwesenheit von 2-5A-abhängiger RNase L mit etwa 30 kDa untersucht. Die Probe kann von jeglichen geeigneten, RNase L enthaltenden Zellen genommen werden. Blut oder ein Teil davon, wie Serum oder Plasma, können auch verwendet werden. In mononukleären Zellen ist RNase L in beträchtlicher Konzentration vorhanden. So umfaßt eine bevorzugte Zellenquelle für Proben die PBMC. Die Probe kann durch Gewinnung der Zellen mittels Zentrifugieren, Sprengen der Zellen und Entfernen der Zellfragmente zu einem zellfreien Extrakt präpariert werden. Der Extrakt wird dann auf die Anwesenheit von etwa 30 kDa-RNase L untersucht.
Bevorzugt werden PBMC aus heparinisiertem Blut durch Zentrifugieren im Dichtegradienten mit Ficoll-Hypaque abgetrennt und Zytoplasmaextrakte nach dem Verfahren von Suhadolnik et al., Biochemistry, 22: 4153–9158 (1983) hergestellt. Um einen Verlust an RNase L-Aktivität zu vermeiden, sollte die Präparation der Zytoplasmaextrakte innerhalb von zwei Stunden nach der Gewinnung der Blutprobe beginnen. Kurz gesagt wird heparinisiertes Vollblut 1 : 1 mit PBS verdünnt. Zwei Vo lumteile des verdünnten Bluts werden über ein Volumteil Ficoll-Hypaque bei einer Dichte von 1,080 geschichtet (Boyum, Scand. J. Clin. Lab. Invest. 97: 1–109, 1968) und 30 min bei 20°C und 1000 g zentrifugiert. Die PBMC-Schicht wird entfernt und einmal mit 5 Volumteilen PBS gewaschen. Die isolierten PBMC werde in 5 ml Lysepuffer für rote Blutkörperchen suspendiert (155 mmol/l NH₄Cl, 10 mmol/l NaHCO₃, pH 7,4, 0,1 mmol/l EDTA), 5 min auf Eis gelagert und zweimal mit PBS gewaschen. Die isolierten PBMC werden in 0,1 oder 0,2 ml (etwa das Zehnfache des Zellvolumens) eines Puffers (20 mmol/l HEPES, pH 7,5, 5 mmol/l MgCl₂, 120 mmol/l KCl, 10 Glyzerin, 1 mmol/l Dithiothreit) mit 0,5% NONIDET P-40 suspendiert und zur Lyse der Zellen 10 min auf Eis gelagert. Durch 6 min Zentrifugieren bei 8000 g und 25°C erhält man die Zytoplasmaextrakte. Die zellfreien Extrakte können in 25 oder 50 μl-Aliquoten bei –70°C unbegrenzt gelagert werden.
Optional könne die Zytoplasmaextrakte mit einem Proteaseinhibitor, z. B. Mini-Complete^TM Proteaseinhibitor-Cocktail-Tabletten (Boehringer/Mannheim) nach den Anweisungen des Herstellers versetzt werden. Der Mini-Complete^TM Inhibitor enthält Aprotinin, Leupeptin, Pefabloc^® SC und EDTA. Der hier in Verbindung mit der Präparation von Zellextrakten für die diagnostische Untersuchung verwendete Ausdruck "zugefügter Proteaseinhibitor" bedeutet über den ggf. natürlich im Zellextrakt vorkommenden Proteaseinhibitor hinaus exogen zugesetzten Proteaseinhibitor. Wenn es heißt, daß ein Extrakt "in Gegenwart von zugefügtem Proteaseinhibitor präpariert" ist, bedeutet das eine Menge Proteaseinhibitor, die ausreicht, um die Aktivität der im Extrakt vorhandenen Protease im wesentlichen vollständig zu inhibieren.
Der zellfreie Extrakt wird dann auf Anwesenheit von etwa 30 kDa CFS-RNase L geprüft. "Etwa" mit Bezug auf das Molekulargewicht der verschiedenen RNase L-Formen bedeutet ein Molekül mit dem bezeichneten Molekulargewicht im Bereich von plus oder minus 1 kDa. Die Zellextrakte werden nach dem Molekulargewicht unter nativen, nicht-denaturierenden Bedingungen fraktioniert. Die etwa 30 kDa-Fraktion wird dann auf 2-5A-abhängige RNase L-Aktivität in Gegenwart von 2-5A oder eines seiner Analoga, das an RNase L in der Fraktion binden und diese aktivieren kann, untersucht. Mit "native Bedingungen" ist Fraktionieren durch ein Verfahren gemeint, welches die Aktivität der RNase L-Sorten in der Probe im wesentlichen konserviert. Native Bedingungen sind notwendig Bedingungen, die Proteine nicht denaturieren, insbesondere solche, die Enzyme nicht denaturieren. Nicht-denaturierende Bedingungen zur Fraktionierung von Proteinen nach dem Molekulargewicht sind dem Fachmann bekannt. Besonders vorteilhaft wird die nicht-denaturierende Fraktionierung von Proteinen nach dem Molekulargewicht durch Gelfiltrations-HPLC durchgeführt. Ein Material zur Säulenchromatographie für diesen Zweck ist SUPERDEX 200 von Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ. Dieses Material ist bei der Fraktionierung von Proteinen mit Molekulargewichten im Bereich von 15 bis 200 kDa wirksam.
Die 2-5A-abhängige RNase L-Aktivität der Fraktion mit etwa 30 kDa Molekulargewicht kann mit einer Anzahl verschiedener RNase L-Assays bestimmt werden. Der RNase L-Assay kann die Form eines Corecellulose-Assays annehmen (Silverman et al., Anal. Biochem. 144: 450–460, 1985), der die Immobilisierung und teilweise Reinigung von 2-5A bindenden Molekülen auf 2-5A-Corecellulose und die Messung der RNase L-Aktivität in der Probe durch Umwandlung von poly(U)[³²P]pCp in säurelösliche Fragmente umfaßt.
Alternativ kann die 2-5A-abhängige RNase L-Aktivität durch einen Spaltungstest mit ribosomaler RNA und Nachweis der hoch charakteristischen spezifischen Spaltprodukte (SCPs) nachgewiesen werden (Suhadolnik et al., Clin. Infect. Dis., a. a. O.). Entsprechend werden die Proben mit Zytoplas maextrakten (140 μg Protein je Test) eines RNase L-defizienten Subklons von L929-Zellen (Quelle für intakte ribosomale 28S- und 18S-RNA) bei 30°C 60 min inkubiert. Die gesamte RNA wird extrahiert, denaturiert und durch Elektrophorese auf 1,8% Agarosegel analysiert. Nach Färbung mit Ethidiumbromid werden die RNA-Banden unter UV-Licht sichtbar gemacht. Die Bildung der SCPs aufgrund der RNase L-Aktivität kann durch densitometrisches Abtasten von Gelphotographien quantifiziert und als Verhältnis der Reaktionsprodukte (SCPs) zu dem am Ende der Inkubationszeit verbleibenden Substrat (28S- und 18S-rRNA) ausgedrückt werden. Hinsichtlich einer Diskussion von SCPs siehe Wreschner et al., Nature 289: 414–417 (1981).
Nach noch einem anderen Verfahren kann die 2-5A-abhängige RNase L-Aktivität der Fraktion mit etwa 30 kDa Molekulargewicht durch Messung der Hydrolyse eines geeignet, etwa radioaktiv markierten RNase L-Substrats bestimmt werden. Beispielsweise kann die RNase L-Aktivität in einer Proteinfraktion durch Kontaktieren der Fraktion mit dem Substrat poly(U)-3'-[³²P]pCp in Gegenwart von p₃A₃ und nachfolgender Radioaktivitätsbestimmung durch Szintillationsspektrometrie bestimmt werden.
Neben dem Nachweis der etwa 30 kDa RNase L kann dieselbe Verfahrensweise zur Bestimmung der Anwesenheit der etwa 80 kDa-Spezies angewendet werden, die in den Zellen normaler Personen vorkommt. Die Anwesenheit des etwa 30 kDa-RNase L-Moleküls und die Abwesenheit des etwa 80 kDa-RNase L-Moleküls zeigt an, daß der Patient an schwerem oder fortgeschrittenem CFS leidet. Die Anwesenheit von RNase L-Molekülen beider Molekulargewichte in der Patientenprobe weist auf weniger schwere oder weniger fortgeschrittene CFS-Erkrankung hin. Die durch CFS schwer behinderten Personen, deren Zellextrakte nur die etwa 30 kDa-RNase L und nicht das 80 kDa 2-5A-Molekül enthalten, sind allgemein durch Kar nofsky-Indizes (KPS) von 60 oder weniger gekennzeichnet. Diesen Patienten fehlt auch die etwa 42 kDa RNase L-Spezies, die man bei gesunden Vergleichspersonen und CFS-Patienten mit weniger schwerer Erkrankung beobachten kann. CFS-Patienten, deren Zellextrakte sowohl die etwa 30 kDa- als auch die etwa 80 kDa-RNase L-Spezies enthalten sind allgemein durch einen KPS von 60 gekennzeichnet.
Als Alternative zur Fraktionierung nach dem Molekulargewicht können die Proteine der Patientenprobe auch durch herkömmliche Verfahren unter Verwendung von Salzen wie Ammoniumsulfat und Lösungsmitteln wie Azeton oder Butanol mit nachfolgender Chromatographie auf Diethylaminoethylcellulose teilgereinigt werden. Diese Verfahrensweise trennt die Proteine auf der Grundlage der Ladung. Die 30 kDa- und 80 kDa-Formen der RNase L können mit diesem Verfahren auf der Basis der gesamten Ladungsunterschiede getrennt werden.
Nach einem anderen Verfahren, das zur Identifizierung von Patienten mit schwerem CFS angewendet werden kann, werden Zellextrakte mit einer Photosonde photomarkiert, die ein 2-5A-Azido-Analogon umfaßt, gefolgt durch Immunfällung mit RNase L-Antikörper und Molekulargewichtsfraktionierung. Diese Verfahrensweise identifiziert spezifisch 2-5A bindende, mit RNase L immunoreaktive Proteine und eliminiert Proteine, die mit dem RNase L-Antikörper immunreagieren, aber keine 2-5A bindenden Proteine sind. Sie eliminiert auch 2-5A bindende Proteine, die nicht immunreaktiv mit dem Antikörper sind.
Photomarkierung/Immunfällung/Fraktionierung von Zellextrakten gesunder Personen, die in Abwesenheit von zugefügtem Proteaseinhibitor präpariert wurden, und Photomarkierung/Immunfällung/Fraktionierung von Zellextrakten von CFS-Patienten mit weniger schweren Symptomen weist in der SDS-PAGE 2-5A bindende Proteine mit angenäherten Molmassen von 80 und 37 kDa nach. In Abwesenheit von zugefügtem Protea seinhibitor wird auch ein 2-5A bindendes Protein mit einer angenäherten Molmasse von etwa 42 kDa nachgewiesen. Bei Patienten mit schweren CFS-Symptomen weist das Verfahren auch das 2-5A bindende Protein mit etwa 37 kDa nach. Das 2-5A bindende Protein mit etwa 80 kDa wird nicht beobachtet. Auch findet man kein 42 kDa-Protein, selbst in Abwesenheit von zugefügtem Proteaseinhibitor. Die 2-5A bindenden Proteine mit etwa 37 und etwa 42 kDa werden mit Photomarkierung/Immunfällung/Fraktionierung von Zellextrakten nicht gefunden, wenn Zellextrakte gesunder Personen in Anwesenheit von zugefügtem Proteaseinhibitor präpariert werden.
Entsprechend kann die Verfahrensweise Photomarkierung/Immunfällung/Fraktionierung zum Nachweis der Abwesenheit des 2-5A bindenden Proteins mit etwa 80 kDa angewendet werden, um damit Patienten mit schwerem CFS zu identifizieren, wenn man beachtet, daß die Bestimmung nicht zur Unterscheidung von gesunden Personen und CFS-Patienten mit minder schweren CFS-Symptomen angewendet werden kann, wenn die Zellextrakte ohne zugefügten Proteaseinhibitor präpariert werden. Wenn die Zellextrakte gesunder Personen mit zugefügtem Proteaseinhibitor präpariert werden, beobachtet man das 2-5A bindende Protein mit etwa 37 kDa nicht. Andererseits findet man das etwa 37 kDa-Molekül in Extrakten von CFS-Patienten, die in Gegenwart von Proteaseinhibitor präpariert wurden. Diese Photomarkierung/Immunfällung/Fraktionierungs-Verfahrensweise kann also angewendet werden, um normale von CFS-Zellextrakten zu unterscheiden, vorausgesetzt, daß die Extrakte in Gegenwart von zugefügtem Proteaseinhibitor präpariert werden.
Man sollte beachten, daß, obwohl das vorstehende Photomarkierung/Immunfällung/Fraktionierungs-Verfahren ein etwa 37 kDa, 2-5A bindendes Protein in solchen Zellextrakten gesunder Personen nachweisen kann, die in Abwesenheit zugefügten Proteaseinhibitors präpariert wurden, das nachgewiesene Mo lekül keine 2-5A abhängige RNase L-Aktivität in gesunden Personen zeigt.
Die bei der Bestimmung mit dem Photomarkierung/Immunfällung/Fraktionierungs-Verfahren verwendete Photosonde umfaßt ein 2-5A-Analogon nach obiger Formel I, wobei entweder eines oder beide der Wasserstoffatome in 2- oder 8-Stellung bei einem oder mehreren der Adeninreste des 2-5A-Moleküls durch eine Azidgruppe ersetzt sind. Die Photomarkierung der 2-5A bindenden Proteine in Zellextrakten umfaßt das Kontaktieren des Extrakts mit der (z. B. radioaktiv) markierten Photosonde unter Bedingungen, die zur Bildung eines kovalenten Konjugats zwischen Photosonde und 2-5A bindendem Protein ausreichen. Im allgemeinen wird dies durch Inkubieren einer Mischung des Extrakts mit der Photosonde unter UV-Licht geringer Intensität erreicht. Die Herstellung von 2-5A-Azidanaloga zur Verwendung als Photosonde ist im US-Patent 4,990,498 (enzymatische Synthese) und bei Charubala et al., Helv. Chim. Acta 72: 1354–1361 (1989; chemische Synthese) beschrieben. Die 2-5A-Azidanaloga binden wirksam an RNase L und aktivieren diese. Bei Belichtung mit UV-Licht geringer Intensität bilden die 2-5A-Azidanaloga durch die lichtempfindliche Azidgruppe leicht reaktive Nitrenradikalzwischenprodukte (C-N). Das Nitrenradikalzwischenprodukt reagiert mit biologischen Molekülen und photomarkiert diese. Diese in situ-Photoaktivierung der 2-5A-Azidanaolga nach Bindung an RNase L stört die Aktivität der RNase L nicht (Siehe US-Patent 4,990,498, 2).
Das 2-5A-Analogon nach Formel I kann ein Oligomer einer einzigen Azido-AMP-Spezies (z. B. 2-Azido-AMP) umfassen, wie beim 2-Azidoadenylyl-(2'→5')-2-azidoadenylyl-(2'→5')-2-azidoadenosin; ein Oligomer von sowohl 2-Azido-AMP als auch 8-Azido-AMP, wie beim 2-Azidoadenylyl-(2'→5')-8-azidoadenylyl-(2'→5')-2-azidoadenosin; ein Oligomer von AMP und 2-Azido-AMP oder 8-Azido-AMP, wie beim 2-Azidoadenylyl- (2'→5')-2-azidoadenylyl-(2'→5')-2-azidoadenosin; oder ein Oligomer aus irgendeiner Kombination eines der Monomere AMP, 2-Azido-AMP, 8-Azido-AMP oder 2,8-Azido-AMP, vorausgesetzt, aß mindestens eines der Monomere eine Azido-AMP-Spezies ist.
Das 2-5A-Azidanalogon der Formel I ist für die erfindungsgemäße Verwendung bevorzugt ein Trimer (n = 1). Der bevorzugte 5'-Phosphorylierungsgrad ist Monophosphorylierung (m = 1). Besonders bevorzugt sind Oligomere mit einem oder mehreren 8-Azidoadenylylresten, z. B. 5'-O-Phosphoryladenylyl-(2'→5')-adenylyl-(2'→5')-8-azidoadenosin.
Das 2-5A-Azidoanalogon trägt bevorzugt eine nachweisbare Markierung, die seine Identifizierung ermöglicht. Die Markierung kann beispielsweise eine radioaktive Markierung wie ³²P, ³H, ¹⁴C, oder ¹⁵N umfassen. ³²P ist der stärkste β-Strahler und daher bevorzugt. Alternativ kann die Markierung eine oder mehrere inkorporierte Ethengruppen umfassen, welche stark fluoreszieren. Die Aminogruppe am Kohlenstoff-6 eines oder mehrerer Adeninkerne kann unter Bildung von N¹N⁶-Ethenadenin in Ethengruppen umgewandelt werden, oder das fluoreszierende Oligomer kann de novo aus Ethen-AMP oder einer Kombination von Ethen-AMP-, Azido-AMP- und AMP-Monomeren synthetisiert werden. Siehe Suhadolnik et al., J. Biol. Chem. 252: 4125–4133 (1977). Der Fachmann kennt weitere Markierungen zum Nachweis biologischer Moleküle.
Nach der Photomarkierung mit dem 2-5A-Analogon wird dann der Zellextrakt mit dem polyklonalen Antikörper der RNase L kombiniert. Der Antikörper für den Schritt der Immunfällung kann gegen rekombinante menschliche 80 kDa gezüchtete polyklonale Antisera umfassen, die auch die etwa 30 kDa-CFS-RNase L erkennen. Rekombinante menschliche 80 kDa-RNase L kann durch Standardrekombinationstechniken aus der bekannten cDNA voller Länge exprimiert werden (Zhou et al., Cell 72: 753–765, 1993; GenBank-Sequenz, Zugangsnummer L10381).
Polyklonale Antisera gegen rekombinante menschliche 80 kDa-RNase L erhält man durch Impfung von Tieren mit dem rekombinanten Protein und Gewinnung der Antisera nach bekannten Methoden.
Der RNase L-Antikörper kann einen intakten Antikörper oder dessen Fragmente, die Antigen binden können, einschließlich der Fragmente Fab und F(ab')₂ ohne Beschränkung auf diese umfassen. Daher umfaßt der Begriff "Antikörper", wie er hier gebraucht wird, intakte Antikörper und deren Fragmente, die ihre Antigenbindungsfähigkeit behalten haben. Optional kann ein markierter sekundärer Antikörper eingesetzt werden, um die Identifizierung der vom RNase L-Antikörper gebildeten Antigen-Antikörper-Komplexe zu unterstützen. Der sekundäre Antikörper kann an RNase L oder an den primären RNase L-Antikörper binden. Der markierte sekundäre Antikörper kann beispielsweise Anti-Kaninchen-IgG von Schaf, Ziege oder Maus umfassen, wenn der primäre RNase L-Antikörper ein Kaninchen-Antikörper ist.
Die Markierung auf dem sekundären Antikörper wird durch physikalische oder chemische Mittel nachgewiesen. Solche Markierungen umfassen radioaktive Markierungen, chromophore, wie fluoreszierende, UV oder Licht absorbierende Markierungen und Enzymmarkierungen. Jedes geeignete Radioisotop kann als Markierung verwendet werden, beispielsweise ¹²⁵I, ¹³¹I, ³H und ¹⁴C. In einem ELISA ist die Markierung ein Enzym, z. B. alkalische Phosphatase, die ein chromogenes Substrat unter Freisetzung eines chromophoren Spaltprodukts spaltet. Im Fall der alkalischen Phosphatase kann das Substrat beispielsweise Phenolphthaleinmonophosphat oder p-Nitrophenylphosphat umfassen.
Nach der Immunfällung werden die im Extrakt gebildeten Komplexe, die Antikörper, Photosonde und 2-5A bindendes Protein enthalten, dann durch Adsorption an Protein A-Harz (z. B. Protein A-Agarose) und nachfolgendes Waschen und Elution der Proteine vom Harz gereinigt. Das eluierte Proteingemisch wird durch Gelelektrophorese fraktioniert und die photomarkierten/immungefällten 2-5A bindenden Proteine werden durch Nachweis der Markierung auf der Photosonde oder dem Antikörper sichtbar gemacht. Die Molekulargewichte der markierten Banden werden durch Bezugnahme auf bekannte Molekulargewichtsnormale bestimmt.
Die Ausführung der Erfindung wird durch die folgenden nicht beschränkenden Beispiele veranschaulicht. Alle unter nicht-denaturierenden Bedingungen geprüften PBMC-Extrakte von CFS-Patienten waren durch die Anwesenheit der etwa 30 kDa-RNase L gekennzeichnet, und allen Vergleichen von Gesunden fehlte diese niedrigmolekulare RNase L. Daher ist die etwa 30 kDa-RNase L ein molekularer Marker für die CFS-Erkrankung. Die hier vorgestellten Daten zeigen auch, daß die schwersten Fälle von CFS außer durch die Anwesenheit des Markers etwa 30 kDa-RNase L durch die Abwesenheit der etwa 80 kDa-RNase L-Spezies gekennzeichnet sind. Bei den CFS-Patienten mit weniger schweren Symptomen waren sowohl die etwa 80 kDa-RNas L-Spezies als auch die 30 kDa-Spezies erhalten. Daher korreliert auf der Basis der erhaltenen Daten das Muster des Auftretens der 80 und der 30 kDa RNase L-Moleküle mit der Schwere der klinischen CFS-Ausprägung.
Ähnliche Ergebnisse erhielt man mit Azid-Photomarkierung, Immunfällung und SDS-PAGE-Fraktionierung der 2-5A bindenden Proteine unter denaturierenden Bedingungen. Der Nachweis eines 2-5A bindenden Proteins mit scheinbarem Molekulargewicht von etwa 37 kDa, aber nicht 80 kDa, fiel mit schwerem CFS zusammen, während die Anwesenheit beider Band weniger schweren CFS-Symptomen entsprach.
Beispiel 1
Identifizierung des CFS-Markermoleküls durch Azid-Photoaffinitätsmarkierung und Immunfällung unter denaturierenden Bedingungen
A. Untersuchungssubjekte und Vergleiche
Die Untersuchungssubjekte waren Personen, bei denen zuvor die diagnostischen Kriterien für CFS nach den Richtlinien des Center for Disease Control and Prevention (CDC) von 1988 als erfüllt diagnostiziert worden waren, sowie gesunde Vergleichspersonen. Patienten und Vergleichspersonen waren aus Arztpraxen in Nevada und North Carolina ausgewählt worden. Die Auswahlkriterien für Patienten und Vergleichspersonen und die klinischen Variablen bei Beginn der Untersuchung waren wie bei Suhadolnik et al., Clin. Infect. Dis. 18: S 96–5104 (1994) beschrieben. Bei der Entnahme der Blutproben wurden ausgewählte Symptome nach einer selbst aufgestellten Prüfliste beurteilt. Der Ermüdungsgrad wurde unter Verwendung des Karnofski-Index (KPS) beurteilt (mittlerer KPS = 56). Es wurden zehn nach Alter und Geschlecht passende Vergleichspersonen rekrutiert. Bei jedem CFS-Patienten und jeder Vergleichsperson wurde die Anamnese erhoben und eine körperliche Untersuchung durchgeführt. Die Altersverteilung der Vergleichspersonen war von der der Personen mit CFS nicht wesentlich verschieden (mittleres Alter CFS = 46 Jahre; Vergleiche = 41,7 Jahre). Alle Vergleichspersonen wurden befragt und bestritten insbesondere, an chronischer Müdigkeit oder anderen signifikanten Symptomen zu leiden; die Ergebnisse der körperlichen Untersuchung waren normal. Die Untersuchung wurde vom örtlichen Institutional Review Board genehmigt. Jeder Patient und jede Vergleichsperson wurde informiert und stimmte zu. Mononukleäre Zellen des peripheren Bluts (PBMC) wurden aus heparinisiertem Blut (50 ml) durch Zentrifugieren im Dichtegradienten mit Ficoll-Hypaque abge trennt und Zytoplasmaextrakte wurden präpariert wie früher von Suhadolnik et al., Biochemistry 22: 4153–4158 (1983) beschrieben. Die Zytoplasmaextrakte wurden ohne Zufügen von Proteaseinhibitor präpariert.
B. Herstellung von polyklonalem rekombinantem menschlichem RNase L
Menschliche RNase L-cDNA mit voller Länge ist bei Zhou et al., Cell 72: 753–765 (1993) beschrieben. und als GenBank Zugangsnummer (accession number) L10381 enthalten. Durch die Fusionsproteinstrategie mit Glutathion-S-transferase erhielt man gereinigte rekombinante menschliche 80 kDa-RNase L, die für die Herstellung des polyklonalen RNase L-Antikörpers benötigt wurde. Das GST-RNase L-Fusionsprotein wurde durch Expression in E. coli nach dem von Sobol et al., J. Biol. Chem. 270: 5963–5978 (1995) beschriebenen Verfahren erhalten. Ein polyklonaler Antikörper gegen rekombinante menschliche 80 kDa-RNase L wurde in weißen Neuseeland-Kaninchen durch Impfung mit dem hochgereinigten rekombinanten menschlichen GST-RNase L-Fusionsprotein hervorgebracht. Vor der Impfung wurde Serum gewonnen und zum Vergleich zurückbehalten (präimmunes Serum). Die erste Inokulation erfolgte am Tag 1 mit 100 μg GST-RNase L, vermischt mit dem gleichen Volumen an vollständigem Freundschem Adjuvans. An den Tagen 14, 21, 49 und 84 wurden Auffrischungen mit 50 μg GST-RNase L (50% natives und 50% hitzedenaturiertes Protein), vermischt mit unvollständigem Freundschem Adjuvans, gegeben. An den Tage 120, 150 und 180 wurden Blutproben für die Antikörper-Herstellung gezogen, nachdem weitere Auffrischungen vorausgegangen waren. Nach Hydrolyse des GST-RNase L-Fusionsproteins mit humanem Thrombin wurde die RNase L kovalent an die mit Glutaraldehyd aktivierte Patrone (Whatman) nach Spezifikation des Hersteller gekuppelt. Um den nicht an RNase L gekuppelten Glutaraldehyd zu reduzieren ließ man Natriumborhydrid durch die Säule zirkulieren. Das Kaninchen- Antiserum mit dem polyklonalen Antikörper für RNase L ließ man 1 h bei Raumtemperatur durch die Glutaraldehyd-Säule zirkulieren und eluierte nach der Spezifikation des Herstellers. Der polyklonale RNase L-Antikörper wurde durch Western Blotting unter Verwendung von Extrakten von menschlichen 293-Zellen (ATCC CRL 1573) und eines von E. coli exprimierten rekombinaten GST-RNase L-Fusionsproteins charakterisiert, wie von Sobol et al. a. a. O., beschrieben.
C. Azid-Photoaffinitäts-Markierung und Immunfällung von 2-5A bindenden Proteinen in PBMC-Extrakten unter denaturierenden Bedingungen
Die chemische Synthese der 2-5A-Azid-Photosonde, ApAp(8-azidoA), die 5'-Monophosphorylierung mit [γ-³²P]ATP und Polynukleotidkinase zur Gewinnung von [³²P]pApAp(8-azidoA) und die Photomarkierung der 2-5A bindenden Proteine in PBMC-Extrakten war wie von Charubala et al., Helv. Chim. Acta 72: 1354–1361 (1989) beschrieben. Die Photomarkierung der 2-5A bindenden Proteine wurde also durch Inkubieren von PBMC-Extrakten (100 μg Protein), die in Abwesenheit von zugefügtem Proteaseinhibitor präpariert wurden, mit der Photosonde [³²P]pApAp(8-azidoA) (60 μCi/nmol, 5 μCi) (30 min, 4°C) und nachfolgender UV-Bestrahlung (8000 W/cm², 30 s, 0°C) vollzogen. Die Mischung der Photomarkierung wurde mit affintätsgereinigtem polyklonalem RNase L-Antikörper (24 μg Protein), Protein A-Sepharose (30 μl) und 100 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) vereinigt und die Mischung wurde 1 h bei 4°C rotiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurde das Harz mit 40 μl Proteinsolubilisierungslösung vermischt, 5 min gekocht und zentrifugiert (10600 g, 5 min, Raumtemperatur). Der Überstand wurde durch 10% SDS-PAGE fraktioniert. Die azidphotomarkierten/immungefällten 2-5A bindenden Proteine wurden durch Autoradiographie des getrockneten Gels sichtbar gemacht. Die kombinierte Verfahrensweise der Azidphotomarkierung/Immunfällung eliminiert Proteine, die mit dem polyklonalen Antikörper für RNase L immunreagieren, aber keine 2-5A bindenden Proteine sind, und sie eliminiert auch 2-5A bindende Proteine, die nicht immunreaktiv für den polyklonalen Antikörper für RNase L sind.
D. Ergebnisse
Unter den denaturierenden Bedingungen dieses Versuchs wurden drei 2-5A bindende Proteine in PBMC der gesunden Vergleichspersonen (1, Lanes 2, 3) und in einer Untergruppe der CFS-PBMC (1, Lanes 1, 4, 5) beobachtet. Jedoch brachte die Photoaffinitätsmarkierung/Immunfällung eine zweite Untergruppe von CFS-PBMC hervor, in der nur ein 2-5A bindendes Protein mit einer geschätzten Molmasse von 37 kDa beobachtet wurde; es wurden keine 80 oder 42 kDa 2-5A bindenden Proteine gefunden (1, Lanes 6, 7, 8, 9). Die durch Lanes 1, 4 und 5 repräsentierten Patienten waren durch weniger schwere CFS-Symptome gekennzeichnet. Die durch Lanes 6, 7, 8 und 9 repräsentierten Patienten waren durch schwerere CFS-Symptome gekennzeichnet. Daher korrelieren die Testergebnisse mit der Schwere der CFS-Ausprägung bei den Patienten der Untersuchung.
Das 2-5A bindende etwa 37 kDa-Protein geht nicht aus dem von Protease vermittelten Abbau des etwa 80 kDa-Proteins bei der Präparation und Verarbeitung der PBMC-Extrakte hervor. Die Quantisierung durch Analyse mit dem Phosphorimager bewies, daß die in CFS-PMBC bei 37 kDa beobachteten Proteinbanden bei Anwesenheit und Abwesenheit des Proteaseinhibitors gleiche Intensität hatten, was auf Stabilität des etwa 37 kDa-Proteins hinweist.
Beispiel 2
Identifizierung des CFS-Markermoleküls durch Azid-Photoaffinitätsmarkierung und Aktivitätsbestimmung der 2-5A-abhängigen RNase L unter nativen (nicht-denaturierenden) Be dingungen
A. Schätzung der Molmasse von 2-5A bindenden Proteinen in PBMC-Extrakten durch analytische Gelpermeations-HPLC unter nativen Bedingungen
PBMC-Extrakte (200 μg Protein) von Personen mit CFS oder gesunden Vergleichspersonen wurden 30 min bei 4°C in Gegenwart von [³²P]pApAp(8-azidoA) (109 μCi/nmol, 10 μCi) inkubiert, mit UV bestrahlt (8000 W/cm², 30 s, 0°C), auf eine Superdex 200 (Hiload 16/60) Gelfiltrationssäule (Pharmacia Biotech Inc.) aufgetragen und bei Raumtemperatur mit 25 mmol/l Tris-Cl (pH 7,4), 80 mmol/l KCl, 1 mmol/l EDTA, 5 mmol/l MgCl₂, 0,1 mmol/l ATP und 14 mmol/l β-Mercaptoethanol bei einer Flußgeschwindigkeit von 0,5 ml/min eluiert; es wurden Fraktionen von 0,5 ml aufgefangen. Die an das (die) 2-5A bindenden Protein(e) in jeder Fraktion kovalent gebundene [³²P]Azido-2-5A-Photosonde wurde durch Szintillationsspektrometrie der Cerenkov-Strahlung (50% Wirkungsgrad) in einem Szintillationsspektrometer Tm Analytics, Modell 6895, quantitativ gemessen. Die Superdex 200-Säule wurde mit Myosin, β-Galaktosidase, Phosphorylase b, Rinderserumalbumin, Eialbumin, Kohlensäuredehydrase und Sojabohnen-Trypsininhibitor (220, 116, 97,4, 68, 44, 31 bzw. 21,5 kDa) geeicht.
B. Enzymaktivität der 2-5A-abhängigen RNase L in PBMC-Extrakten mit nachfolgender analytischer Gelpermeations-HPLC unter nativen Bedingungen
PBMC-Extrakte (200 μg Protein) von gesunden Vergleichspersonen und Personen mit CFS wurden unter nativen Bedingungen auf einer Superdex 200-Gelfiltrationssäule wie im vorangehenden Absatz beschrieben fraktioniert. Durch Hydrolyse von poly(U)-3'-[³²P]pCp (20000 dpm) in Reaktionsgemischen (15–30 μl) mit p₃A₃ (1*10^–8 bis 1*10^–7 mol/l) wurde die RNase L-Aktivität eines Aliquots (5–20 μl) jeder Fraktion bestimmt (Sobol et al., a. a. O.). Die unspezifische RNase L-Aktivität wurde durch Hydrolyse von poly(C)-3'-[³²P]pCp (14000 dpm) in Reaktionsgemischen (15–30 μl) ohne p₃A₃ gemessen. Die radioaktiven Messungen wurden mit einem Scintiverse I (Fisher) (> 99% Wirkungsgrad) ausgeführt.
C. Ergebnisse
In PBMC-Extrakten gesunder Vergleichspersonen wurde bei Analyse unter nativen Bedingungen 2-5A-Bindung und 2-5A-abhängige RNase L-Enzymaktivität bei 80 und 42 kDa beobachtet (2, Diagramme A und D). In einer Untergruppe von CFS-PBMC-Extrakten wurden drei 2-5A bindende Proteine mit 2-5A-abhängiger RNase L-Enzymaktivität beobachtet. In dieser Untergruppe wurden 2-5A bindende Proteine mit 2-5A-abhängiger RNase L-Enzymaktivität entweder bei 80, 42 und 30 kDa (2, Diagramme B und E) oder bei 80, 42 und 30 kDa beobachtet. In einer zweiten Untergruppe von CFS-PBMC-Extrakten (wie in 1, Lanes 6, 7, 8, 9 gezeigt) wurde bei 80 oder 42 kDa keine 2-5A-Bindung oder 2-5A-abhängige RNase L-Enzymaktivität beobachtet; man fand jedoch 2-5A-Bindung und 2-5A-abhängige RNase L-Enzymaktivität bei 30 kDa (2, Diagramme C und F). In Vergleichsbestimmungen wurde poly(C)-3'-[³²P]pCp verwendet, um zu zeigen, daß die in den PBMC-Extrakten beobachtete 2-5A-abhängige RNase L-Enzymaktivität nicht auf unspezifische RNase-Aktivität zurückging. In keiner Fraktion wurde Hydrolyse des poly(C)-3'-[³²P]pCp beobachtet, was als weiterer Beweis für die Anwesenheit von 2-5A-abhängiger RNase L angesehen wird. Die Spezifität der [³²P]pApAp(8-azidoA)-Photosonde wurde durch Konkurrenzversuche mit authentischem p₃A₃ bestätigt (Daten nicht gezeigt). Weiterhin wurde in Abwesenheit von 2-5A, dem allosterischen Aktivator von RNase L, keine Hydrolyse von poly(U)-3'-[³²P]pCp beobachtet.
Das unter denaturierenden Bedingungen nach SDS-PAGE bei 37 kDa beobachtete 2-5A bindende Protein ist in vernünftiger Übereinstimmung mit dem unter nativen Bedingungen beobachteten 30 kDa-Protein; dies auf der Basis von Präzedenzfällen in der Literatur, die Unterschiede der unter nativen und denaturierenden Bedingungen beobachteten Molmasse berücksichtigen (Somerville et al., J. Bacteriol. 117: 3837–3842, 1995).
Beispiel 3
Stabilität der immunreaktiven 2-5A bindenden Proteine gegenüber der Proteolyse
In Gegenwart und Abwesenheit von Proteaseinhibitoren wurden PBMC-Extrakte präpariert, um den möglichen Einfluß des proteolytischen Abbaus während Präparation und Verarbeitung der Extrakte zu beurteilen. Die Präparation der Zytoplasmaextrakte in Gegenwart von Proteaseinhibitor erfolgte nach den Herstelleranweisungen (Mini-Complete^TM Proteaseinhibitor-Cocktailtabletten, Boehringer/Mannheim, enthaltend Aprotinin, Leupeptin, Pefabloc^® SC und EDTA). Suhadolnik et al., Clin. Infect. Dis., a. a. O. Die Azid-Photosonde [³²P]pApAp(8-azidoA) wurde an ihre 2-5A bindenden Proteinen kovalent gebunden und durch Immunfällung mit polyklonalem rekombinantem menschlichem 80 kDa RNase L-Antikörper weiter gereinigt. Die photaffinitätsmarkierten immunreaktiven 2-5A bindenden Proteine wurden durch Analyse mit Phosphorimager nach SDS-PAGE quantitativ bestimmt. In Gegenwart von Proteaseinhibitoren präparierter CFS-PBMC-Extrakt enthielt ein niedermolekulares immunreaktives 2-5A bindendes Protein bei 37 kDa zusätzlich zur 2-5A-abhängigem 80 kDa-RNase L (3, Lane 1). Die Photoaffinitätsmarkierung und Immunfällung desselben CFS-PBMC-Extrakts, präpariert in Abwesenheit von Proteaseinhibitoren, ergab immunoreaktive 2-5A bindende Proteine bei 37 und 42 kDa zusätzlich zur 80 kDa RNase L (3, Lane 2). Die quantitative Bestimmung durch Photoimager-Analyse zeigte, daß die bei 37 kDa in Extrakten von CFS-PBMC in Gegenwart und in Abwesenheit von Proteaseinhibitoren beobachteten Proteinbanden gleiche Intensität hatten, was auf Stabilität des 37 kDa-Proteins hinweist (3, Lanes 1 und 2). In solchen PBMC-Extrakten von gesunden Vergleichspersonen, die in Gegenwart von Proteaseinhibitoren präpariert waren, wurde nur die 80 kDa-RNase L nachgewiesen (3, Lane 3). Wurde derselbe Extrakt in Abwesenheit von Proteaseinhibitor präpariert, gab es 70% Verminderung der 80 kDa-RNase L (3, vgl. Lanes 3 und 4) In diesen PBMC-Extrakten von gesunden Vergleichspersonen, in Gegenwart oder Abwesenheit von Proteaseinhibitoren präpariert, wurde jedoch kein 37 kDa immunreaktives 2-5A bindendes Protein nachgewiesen (3, Lanes 3 und 4). In einigen der geprüften PBMC-Extrakte von gesunden Vergleichspersonen wurde ein immunreaktives 2-5A bindendes Protein bei 50 kDa beobachtet, aber nicht bei 37 kDa (3, Lane 4). Nach der Messung der Hydrolyse von poly(U)-3'-[³²P]pCp zeigte das 50 kDa 2-5A bindende Protein keine 2-5A-abhängige RNase L-Aktivität

Claims

Verfahren zur Diagnose des chronischen Müdigkeitssyndroms umfassend das Untersuchen einer Patientenprobe auf ein 2',5'-Oligoadenylat-bindendes Protein, wobei das Protein ein Molekulargewicht von 29 bis 31 kDa unter nativen Bedingungen aufweist, und wobei die Anwesenheit eines derartigen Proteins in der Patientenprobe für das chronische Müdigkeitssyndrom diagnostisch ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Protein RNase L ist.
Verfahren gemäß Anspruch 2, ferner umfassend das Untersuchen der Patientenprobe auf eine 79 bis 81 kDa RNase L, wobei (i) die Anwesenheit eines 29 bis 31 kDa RNase L Moleküls und die Abwesenheit eines 79 bis 81 kDa RNase L Moleküls das schwer chronische Müdigkeitssyndrom anzeigt, und (ii) die Anwesenheit von RNase L Molekülen beider Molekulargewichte das weniger schwer chronische Müdigkeitssyndrom anzeigt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1, 2 und 3, wobei das Untersuchen der Patientenprobe umfasst: (a) Fraktionieren des Proteins in der Patientenprobe hinsichtlich des Molekulargewichts unter nativen Bedingungen; (b) Untersuchen des fraktionierten Proteins auf ein 29 bis 31 kDa und wahlweise ein 79 bis 81 kDa Protein mit RNase L-Aktivität.
Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei die Untersuchung auf RNase L-Aktivität umfasst: (a) Detektieren der Bildung eines spezifischen Spaltungsproduktes aus der Hydrolyse von 28S und/oder 18S RNA; oder (b) Detektieren der Hydrolyse von poly(U)-3'-pCp.
Verfahren zur Diagnose des chronischen Müdigkeitssyndroms, umfassend das Untersuchen einer Patientenprobe auf ein 2',5'-Oligoadenylat-bindendes Protein mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 36 bis 38 kDa in einer Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid Gel-Elektrophorese, wobei die Anwesenheit eines derartigen Proteins in der Patientenprobe für das chronische Müdigkeitssyndrom diagnostisch ist.
Verfahren gemäß Anspruch 6 umfassend: (a) Kontaktieren einer Patientenprobe mit einer Sonde enthaltend eine Verbindung gemäß der Formel I, welche eine detektierbare Kennzeichnung trägt, unter Bedingungen, die zur Ausbildung kovalenter Konjugate der gekennzeichneten Probenverbindung und 2',5'-Oligoadenylat-bindenden Proteine in der Probe ausreichend ist:
wobei m eine ganze Zahl von 0 bis 3 ist, n eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist, und jedes R₁ und jedes R₂, unabhängig von jedem anderen R₁ und R₂, ist Wasserstoff oder N₃, wobei zumindest ein R₁ oder R₂ N₃ ist, oder ein wasserlösliches Salz der Verbindung; (b) Kontaktieren der die kovalenten Konjugate enthaltenden Probe mit einem Antikörper, welcher die RNase L Spezies in der Probe bindet; (c) Separieren der Proteine in der Probe durch Gel-Elektrophorese; und (d) Untersuchen der separierten Proteine auf Markerproteine, welche (i) ein kovalentes Konjugat mit der gekennzeichneten Sondenverbindung ausgebildet haben, und (ii) durch den Antikörper gebunden sind; wobei die Anwesenheit eines Markerproteins mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 36 bis 38 kDa gemäß der Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid Gel-Elektrophorese für das chronische Müdigkeitssyndrom diagnostisch ist.
Verfahren gemäß Anspruch 7 zur Detektion des schwer chronischen Müdigkeitssyndroms, ferner umfassend das Untersuchen der Patientenprobe auf ein 79 bis 81 kDa Markerprotein, wobei die Anwesenheit eines Markerproteins mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 36 bis 38 kDa gemäß der Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid Gel-Elektrophorese und die Abwesenheit eines Markerproteins mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 79 bis 81 kDa gemäß der Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid Gel-Elektrophorese für das schwer chronische Müdigkeitssyndrom diagnostisch ist.
Verfahren gemäß Anspruch 7 oder 8, wobei n ist 1, m ist 1 und jedes R₂ Wasserstoff in der Probenverbindung ist.
Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei die Sondenverbindung 5'-Q-Phosphoryladenylyl-(2'-5')-Adenylyl-(2'-5')-8-Azidoadenosin oder ein Salz davon ist.
Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Probe in Anwesenheit von einem hinzugefügten Proteaseinhibitor angefertigt ist.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Probe Blut oder eine Fraktion davon umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei die Probe ein cytoplasmisches Extrakt von peripheren Blutmononuclearzellen umfasst.