DE60035286T2

DE60035286T2 - Verfahren zum Nachweis von Zelltod mittels Cytochrom C.

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Publication number: DE60035286T2
Application number: DE60035286T
Authority: DE
Inventors: Fumio Kumamoto-shi ENDO; Naoto Kumamoto-shi ADACHI; Hiroyuki Miyazaki-shi NUNOI; Keisuke Tsukuba-shi WATANABE
Original assignee: Eisai R&D Management Co Ltd
Current assignee: Eisai R&D Management Co Ltd
Priority date: 1999-11-08
Filing date: 2000-11-08
Publication date: 2008-02-21
Anticipated expiration: 2020-11-09
Also published as: ATE365327T1; EP1229328A1; US20060183176A1; EP1229328B1; WO2001035093A1; US7070924B1; DE60035286D1; ES2288877T3; JP3869722B2; EP1229328A4

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und ein Reagens zum Nachweis von Zelltod.
Die Graft-versus-Rost-Reaktion (GvHD, Transplantat-gegen-Empfänger-Reaktion), eine Erkrankung, die nach Knochenmarkstransplantationen auftritt und zahlreiche Organe schädigt; das hämophagozytische Syndrom (HPS), eine Erkrankung, bei der Blutzellen durch Phagozyten phagozytiert werden, insbesondere das Virus bezogene hämophagozytische Syndrom (VAHS), das nach Virusinfektionen auftritt, usw. sind schwere Erkrankungen, die Organversagen verursachen und letztendlich zum Tode führen. Gegenwärtig wird zur Diagnose dieser Erkrankungen im Allgemeinen eine zytologische Diagnose wie eine Biopsie verwendet. Jedoch hat eine solche Diagnose Nachteile in Hinblick auf Schmerzen der Patienten während des Tests, der für die Diagnose nötigen Zeit und die Arbeitsabläufe.
Weil in den letzten Jahren gefunden wurde, dass eine Hauptursache von GvHD und HPS Zellapoptose in lebenden Körpern ist, wird angenommen, dass GvHD und HPS durch Nachweis von Apoptose diagnostiziert werden können.
Als Verfahren zum Nachweis von Apoptose wurden gewöhnlich eingesetzt
1) morphologische Verfahren, 2) histochemische Verfahren, 3) biochemische Verfahren und 4) immunochemische Verfahren.
1) Morphologische Verfahren
Es wird das Chromatin-Kondensationsverfahren, bei dem spezifisch während der Apoptose erfolgende DNS-Fragmentierung mittels Anfärbung nachgewiesen wird, und ein Verfahren zum Nachweis morphologischer Veränderungen, die spezifisch für die Apoptose sind, durch Betrachtung unter einem Elektronenmikroskop, oder Messung der Zellgröße verwendet.
2) Histochemische Verfahren
Hier werden ein Ligierungsverfahren eines markierten Nukleotids an das Ende eines DNS-Fragments und sein Nachweis mittels eines Fluoreszenzmikroskops verwendet. Als anderes Verfahren wird auch Durchflusszytometrie verwendet, bei der für einzelne Zellen Mengen intrazellulärer Substanzen gemessen werden.
3) Biochemische Verfahren
Hier wird ein Verfahren zum Nachweis einer DNS-Leiter mittels Agarose-Gelelektrophorese verwendet. Dies wird gegenwärtig als das zuverlässigste Verfahren zum Nachweis von Apoptose betrachtet. Weil DNS aus einem Gewebe oder einer Zellpopulation als Ganzes extrahiert wird, heißt es jedoch, dass dieses Verfahren hinsichtlich der Sensitivität und Quanitfizierbarkeit problematisch ist, falls der Anteil apoptotischer Zellen nicht hoch ist.
4) Immunochemische Verfahren
Es ist ein Festphasen-Enzymimmunoassay (Enzymgebundenes Immunoabsorbensassay, ELISA) zum Nachweis Histon bindender DNS-Fragmente (Mono- oder Oligonukleosome) entwickelt worden (Zellennachweis-ELISA: Boehringer Mannheim, Kokusan Chemical).
Jedoch sind diese Verfahren problematisch im Hinblick auf komplizierte Arbeitsabläufe und geringe Empfindlichkeit und Quantifizierbarkeit, und sie werden gegenwärtig in der Praxis nicht als Verfahren zur Diagnose von GvDH und HPS verwendet.
Offenbarung der Erfindung
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren und ein Reagens zum Nachweis von in einem lebenden Körper stattfindender Apoptose zu entwickeln, die einfach sind und verbesserte Empfindlichkeit und Quantifizierbarkeit aufweisen.
Cytochrom C ist als wichtiges Protein im Transportsystem der Mitochondrien bekannt. Es wurde berichtet, dass Cytochrom C in den Mitochondrien schnell in das Zytosol freigesetzt wird, wenn eine Zelle einem Reiz ausgesetzt wird, der Apoptose auslöst und sie in ein Apoptosestadium eintritt (Dinsdale, D. et al., American J. Patol. 155: 607-17, 1999). Es wurde auch berichtet, dass Cytochrom C im Zytosol mit der Aktivierung von Caspase-3 verknüpft ist, die ein Schlüsselfaktor von Apoptose ist, und dass ein Anstieg von Cytochrom C beim Fortgang der Apoptose beteiligt ist (Medina V. et al., Cancer Research, 57: 3697-707, 1997).
DE 4107334 offenbart die Verwendung von Cytochrom C oder Histon in einem Serodiagnoseverfahren zum Nachweis von Krebs.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben sich überlegt, dass dann, wenn Apoptose in einem lebenden Körper stattfindet, von den Mitochondrien freigesetztes Cytochrom C auch im Blut nachgewiesen werden könnte. Dann führten sie ein ELISA-Verfahren zum Messen von Cytochrom C ein und fanden, dass der Cytochrom C-Spiegel mit dem Fortschritt von GvHD, HPS, akuter lymphatischer Leukämie und grippaler Enzephalopathie stark korreliert. So vollendeten die die vorliegende Erfindung.

(1) Ein Verfahren zum Nachweis von Apoptose, das die Bestimmung von Cytochrom C in Körperflüssigkeit und den Nachweis von Apoptose umfasst.
(2) Verfahren nach (1), worin das Cytochrom C durch ein immunochemisches Verfahren bestimmt wird.
(3) Verfahren nach (1), worin das immunochemische Verfahren ein Sandwich-Verfahren ist.
(4) Verwendung eines Antikörpers, der auf Cytochrom C bezogen ist, bei der Bestimmung des Cytochrom C in der Körperflüssigkeit zum Nachweis der Apoptose.
(5) Verwendung nach (4), wobei die Körperflüssigkeit von einem lebenden Körper gewonnen wird der eine aus der aus Graft-versus-Rost-Reaktion (Transplantat-gegen-Empfänger-Reaktion), Systemischen Lupus erythematosus, Gelenkrheumatismus, Sklerodermie, Sjögren-Syndrom, Multiple Sklerose, Insulin abhängigen Diabetes mellitus, Colitis ulcerosa, virale Infektionen, neurodegenerative Erkrankungen, Leukämie, Strahlenbelastung, Antikrebs-Arzneimittel-Medikamentation und systemisches inflammatorisches Reaktionssyndrom bestehenden Gruppe ausgewählte Krankheit hat.
(6) Verwendung nach (5) wobei die Erkrankung die Transplantat-gegen-Empfänger-Reaktion ist.
(7) Verwendung nach (5), wobei die Erkrankung hämophagozytisches Syndrom (HPS) ist.
(8) Verwendung nach (5), wobei die Erkrankung akute lymphatische Leukämie ist
(9) Verwendung nach (5), wobei die Erkrankung virale Enzephalitis oder Enzephalopathie ist.
(10) Verwendung nach (9), wobei die virale Enzephalitis oder Enzephalopathie eine grippale

Kurze Beschreibung der Abbildungen:
1 zeigt Änderungen der Werte von LDH, AST, ALT, Ferritin und Cytochrom C (Cyto-C) in Seren von HPS-Patienten.
2 zeigt Cytochrom C-Spiegel in Seren von Patienten, die an Influenza begleitet von hohem Fieber, Fieberkrämpfen oder Enzephalitis oder Enzephalopathie leiden.
3 zeigt Änderungen der Werte von GOT, LDH und Cytochrom C im Blut von Patienten, die eine grippale Enzephalopathie ausgebildet haben.
4 zeigt die Spiegel verschiedener Zytokine in Seren von Patienten, die an Influenza begleitet von hohem Fieber, Fieberkrämpfen oder Enzephalitis oder Enzephalopathie leiden.
Bevorzugte Ausführungsform der Erfindung
Im Folgenden werden bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung im Detail beschrieben.
Es wird in Betracht gezogen, dass aus den Mitochondrien in Zytoplasma als Antwort auf ein Apoptosesignal überführtes Cytochrom C wegen der Zerstörung der Zellmembran als Folge des Zelltodes außerhalb der Zelle freigesetzt wird. Die vorliegende Erfindung basiert auf der Erkenntnis, dass Cytochrom C, das als Folge von Zelltod außerhalb der Zelle freigesetzt wird, durch Bestimmung von Cytochrom C in Körperflüssigkeiten wie Blut nachgewiesen werden kann, und das in einem lebenden Körper erfolgender Zelltod durch Bestimmung von Cytochrom C in Körperflüssigkeit nachgewiesen werden kann. Daher fallen Verfahren zum Nachweis von Zelltod durch Bestimmung von Cytochrom C in Körperflüssigkeiten in den Bereich der Erfindung.
Der hier verwendete Begriff „Zelltod" bezieht sich hauptsächlich auf Apoptose. Es ist jedoch nicht einfach, Allgemein in einem lebenden Körper stattfindenden Zelltod als Apoptose zu identifizieren, und jede Art von Zelltod, die von einem Anstieg von Cytochrom C in Körperflüssigkeiten begleitet wird, ist im Zelltod, auf den in der vorliegenden Erfindung Bezug genommen wird, eingeschlossen.
Darüber hinaus bezieht sich Körperflüssigkeit auf Blut, Plasma, Serum, Rückenmarksflüssigkeit oder Ähnliches, die von einem lebenden Körper gewonnen werden.
Als Verfahren zur Messung von Cytochrom C kann ein immunochemisches Verfahren genannt werden, ein Verfahren unter Verwendung von Elektrophorese, ein Verfahren unter Verwendung von Chromatographie usw. Beispiele für Verfahren unter Verwendung von Elektrophorese schließen ein Verfahren ein, bei dem Polyacrylamidgel-Elektrophorese zum Nachweis von Cytochrom C in Form einer Bande durchgeführt wird, ein Verfahren, bei dem Kapillarelektrophorese zum Nachweis von Cytochrom C als Peak durchgeführt wird, usw. Weiterhin kann als Verfahren unter Verwendung von Chromatographie ein Verfahren genannt werden, bei dem High Performance Flüssigchromatographie zum Nachweis von Cytochrom C als Peak verwendet wird, usw. Um die Empfindlichkeit zu erhöhen, kann in manchen Fällen eine Fluoreszenzmarkierung verwendet werden, aber die vorliegende Erfindung ist nicht auf solche Fälle beschränkt.
Als Verfahren zur Messung von Cytochrom C ist im Hinblick auf Empfindlichkeit und Einfachheit ein immunochemisches Verfahren bevorzugt. Der hier verwendete Ausdruck immunochemisches Verfahren" bezieht sich auf ein Verfahren zur Bestimmung von Cytochrom C unter Verwendung eines auf Cytochrom C zielenden Antikörpers. Als immunochemisches Verfahren können verschiedene Verfahren genannt werden wie ein Konkurrenzverfahren, bei dem Cytochrom C markiert ist, ein Sandwich-Verfahren, bei dem ein Antikörper markiert ist, ein Verfahren mit Latex-Kugeln, bei dem Zusammenkleben von mit Antikörper beschichteten Kugeln beobachtet wird, usw., und sie sind in den bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung eingeschlossen, so lange ein auf Cytochrom C zielender Antikörper verwendet wird. Der Antikörper kann ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper sein. Als Markierungsverfahren können verschiedene Verfahren genannt werden wie Markierung mit einem radioaktiven Isotop, Markierung mit einer Elektrolumineszenz zeigenden Verbindung, Fluoreszenzmarkierung, Markierung mit einem Enzym, Markierung mit Biotin, usw., aber die vorliegende Erfindung ist nicht auf diese Beispiele beschränkt.
Als Beispiel für das immunochemische Verfahren zur Messung von Cytochrom C wird im Folgenden ein Sandwich-Verfahren Schritt für Schritt erklärt.

1) Ein auf Cytochrom C zielender Antikörper wird auf Kugeln oder einem Tiegel immobilisiert. Die Kugeln können Mikrokugeln sein. In diesem Fall sind Mikroperlen aus einer magnetischen Substanz bevorzugt. Die Immobilisierung kann mittels kovalenter oder nicht kovalenter Bindung erzielt werden. Gewöhnlich werden nichtspezifische Bindungsstellen auf den Kugeln oder dem Tiegel unter Verwendung eines Proteins wie Rinderserumalbumin (BSA) oder Casein oder einem oberflächenaktiven Stoff wie Tween 20 blockiert.
2) Eine Probe wird mit einem Puffer verdünnt, der ein Protein wie BSA oder Casein oder einen oberflächenaktiven Stoff wie Tween 20, falls nötig, enthält, und zu den Kugeln oder dem Tiegel gegeben. Weiterhin wird eine bekannte Menge Cytochrom C ähnlich verdünnt und zugegeben.
3) Die Kugeln oder der Tiegel werden/wird mit einem Puffer, der, falls nötig, einen oberflächenaktiven Stoff wie Tween 20 enthält, gewaschen und ein mit einem Puffer, der, falls nötig, ein Protein wie BSA oder Casein oder einen oberflächenaktiven Stoff wie Tween 20 enthält, verdünnter markierter Antikörper wird zugegeben.
4) Die Kugeln oder der Tiegel werden/wird mit einem Puffer, der, falls nötig, einen oberflächenaktiven Stoff wie Tween 20 enthält, gewaschen und die Messung wird mittels eines dem Marker entsprechenden Verfahren durchgeführt. Z.B. wird die Radioaktivität gemessen, wenn radioaktiv markiert wurde, oder es wird die enzymatische Aktivität gemessen, wenn mit einem Enzym markiert wurde. Weiterhin wird dann, wenn mit Biotin markiert wurde, markiertes Avidin zugegeben und die Messung wird mit einem dem Marker entsprechenden Verfahren durchgeführt.
5) Eine Kalibrierkurve wird unter Verwendung bekannter Mengen Cytochrom C hergestellt und die in der Probe enthaltene Menge Cytochrom C wird berechnet.

Mit den oben genannten Schritten wird Cytochrom C in der Probe bestimmt. Wenn der bestimmte Cytochrom C-Wert größer ist als der normale Wert, kann davon ausgegangen werden, dass Zelltod nachgewiesen wurde.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zur Messung von Cytochrom C, das die Bestimmung von Cytochrom C in Körperflüssigkeit mit einem Sandwich-Verfahren umfasst. Das Sandwich-Verfahren ist ein immunochemisches Verfahren wie ELISA unter Verwendung eines Antigens, das zwischen einem immobilisierten Antikörper und einem markierten Antikörper eingeschlossen ist.
Als Verfahren zur Messung von Cytochrom C mittels eines immunochemischen Verfahrens wird ein Dot-Blot-Verfahren breit angewandt (Souichi A. et al., J. Biological Chem. 273:19892-4, 1998). Dieses Verfahren kann zwar in einem Zellhomogenat mit einem hohen Gehalt an Cytochrom C und einem geringen Proteingehalt messen, es ist aber zur Bestimmung mit hoher Empfindlichkeit von Cytochrom C in Körperflüssigkeit mit einem geringen Cytochrom C-Gehalt und hoher Proteinkonzentration nicht geeignet. Die vorliegende Erfindung basiert auf der Erkenntnis, dass selbst eine Spur von Cytochrom C in Körperflüssigkeit, wie sie auf Grund von Zelltod, der in einem lebenden Körper stattfindet, freigesetzt wird, unter Verwendung von auf dem Sandwich-Verfahren basierender ELISA zum Nachweis von Cytochrom C in einer Körperflüssigkeit mit großer Empfindlichkeit nachgewiesen werden kann, die eine hohe Proteinkonzentration enthält.
Das in der vorliegenden Erfindung offenbarte Verfahren zur Messung von Cytochrom C ermöglicht den Nachweis von Zelltod. Daher wird es möglich einen Diagnoseindikator zur Diagnose verschiedener, von Apoptose begleiteter Erkrankungen wie unterschiedliche Diagnosen oder Verfolgen der Krankheiten, zur Verfügung zu stellen. So wird ein Verfahren zur Messung von Cytochrom C zum Zwecke des Nachweises von Zelltod oder zur Diagnose einer von Apoptose begleiteter Erkrankung zur Verfügung gestellt.
Als Beispiele für von Apoptose begleitete Erkrankungen können die folgenden genannt werden:

1) Erkrankung, bei der Apoptose als Antwort auf ein Signal erzeugt wird, das von einer Zelle eines für Biophylaxe verantwortlichen Immunsystems erzeugt wird, z.B. GVDH und Autoimmunerkrankungen (Systemischer Lupus erythematosus (SLE), rheumatische Arthritis (RA), Sklerodermie, Sjoergren-Syndrom, Multiple Sklerose, insulinabhängiger Diabetes mellitus, Colitis ulcerosa).
2) Erkrankungen, bei denen der Zelltod durch virale Infektion induziert wird oder Apoptose durch die Reaktion einer Zelle eines Immunsystems mit einer von einem Virus infizierten Zelle induziert wird, z.B. Virus-assoziiertes hämophagocytisches Syndrom (VAHS) und andere Vireninfektionen (HCV, HIV, Influenzavirus).
3) Erkrankungen, bei denen der Zelltod durch ein unnormales Apoptosesignal induziert wird, z.B. Neurodegenerative Erkrankungen (Alzheimer, Parkinson).
4) Leukämie, z.B. akute lymphatische Leukämie.
5) Erkrankungen, bei denen Apoptose künstlich induziert wird, z.B. durch Strahlenbelastung oder Arzneimitteleinnahme (z.B. Antikrebsmittel).
6) Systemisches inflammatorisches Reaktions-Syndrom (SIRS), Erkrankungen, bei denen Organfunktionsstörungen auftreten, weil das Immunsystem als Reaktion auf einen Angriff auf einen lebenden Körper unspezifisch aktiviert wird und damit die Steuerung der Cytokin-Produktion unmöglich wird (HPS, schwere Bauchspeicheldrüsenentzündung).

Unter den durch Vireninfektionen ausgelösten Erkrankungen sind diejenigen, die ernst sind und bei denen 7die Wahrscheinlichkeit von Spätfolgen hoch ist, Enzephalitis und Enzephalopathie. Insbesondere von Influenzaviren verursachte Enzephalitis und Enzephalopathie sind für einen großen Teil von Todesfällen durch Influenza verantwortlich, aber es ist schwierig, diese Erkrankungen von Fieberkrämpfen zu unterscheiden und ein Verfahren zur präzisen frühzeitigen Diagnose zum Bereitstellen einer geeigneten Behandlung ist daher nötig. Das erfindungsgemäße Messverfahren erlaubt eine präzise und frühzeitige Diagnose.
Mittels des Messens von Cytochrom C in Körperflüssigkeit kann in einem lebenden Körper fortschreitender Zelltod bestimmt werden und somit kann der Fortschritt dieser Erkrankungen verfolgt werden. Insbesondere bei GVHD, hämophagocytischem Syndrom (HPS), insbesondere Virus assoziiertem hämophagocytischem Syndrom (VAHS), akuter lymphatischer Leukämie und grippaler Enzephalitis und Enzephalopathie ist die Bestimmung von Cytochrom C nützlich, um den Zustand der Krankheit zu verstehen.
Als Ergebnis weiterer Untersuchungen der Erfinder der vorliegenden Erfindung wurde bestätigt, dass der Cytochrom C-Spiegel in Blut gut mit LDH korreliert, das als Indikator von Zelltod bei HPS und grippaler Enzephalopathie betrachtet wurde, und es wurde weiterhin aufgezeigt, dass ein Ansteigen und Absinken von Cytochrom C demjenigen von LDH voranging.
Cytochrom C in Körperflüssigkeit ist ein günstiger Indikator für im Körper stattfindenden Zelltod und kann ein nützlicher Indikator sein, um einen pathologischen Zustand frühzeitig und präzise ausfindig zu machen.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird genauer in Bezug auf die folgenden Beispiele beschrieben.
Beispiel 1: Messung von Cytochrom C mit ELISA.
Cytochrom C wird mittels des folgenden Verfahrens gemessen.
1) Reinigung von Anti-Cytochrom C-Antikörper
Ein Kaninchen wird mit Ratten-Cytochrom C (Sigma) immunisiert, um gegen Cytochrom C gerichtetes Antiserum zu erhalten. Zum Antiserum wird Ammoniumsulfat zu einer Endkonzentration von 2 M gegeben und es wird bei Raumtemperatur (20-30 °C) 5 Stunden lang gerührt. Die gerührte Lösung wird 30 Minuten lang mit 1000 Upm zentrifugiert und der Überstand wird verworfen. Der Niederschlag wird in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,2) gelöst und gegen denselben Puffer dialysiert. Die dialysierte Lösung wird auf eine Säule mit einem Träger aufgegeben, der durch Binden von Rinder-Cytochrom C an CNBr-Sepharose 4B (Pharmacia) erhalten wurde. Die Säule wird mit 0,01 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,5), der 0,15 M NaCl enthält, gewaschen und dann werden Anti-Cytochrom C-Antikörper mit 0,1 M Guanidinhydrochlorid eluiert. Die eluierte Lösung wird gegen 0,01 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,5), der 0,15 M NaCl enthält, dialysiert, um aufgereinigte Antikörper zu erhalten (IgG).
2. Herstellung von Anti-Cytochrom C-Antikörper F(ab')₂
Das aufgereinigte IgG wird gegen 0,1 M Acetatpuffer (pH 4,2) dialysiert. Zur dialysierten IgG-Lösung wird Pepsin (Sigma) in einem Massenkonzentrationsverhältnis von 20:1 gegeben und man lässt bei 37 °C 16 Stunden lang reagieren. Die Lösung nach der Reaktion wird mit 1 N NaOH auf pH 7,5 eingestellt und unter Verwendung einer mit 0,15 M NaCl enthaltenden 0,01 Tris-HCL-Puffer (pH 7,5) äquilibrierten Sephacryl S-200-Säule (Pharmacia) einer Gelfiltration unterzogen. Ein erster Peak der bei der Gelfiltration erhaltenen Fraktionen wird gewonnen und aufkonzentriert und es wird eine Anti-Cytochrom C-Antikörper F(ab')₂-Lösung erhalten.
3. Herstellung von mit Meerrettichperoxidase (HRP) markiertem Anti-Cytochrom C-Antikörper F(ab')₂
Zu 1 mL auf 4 mg/mL eingestellter HRP-Lösung (Toyobo), werden 60 μL 0,1 M Natriummetaperiodat zugegeben und es wird 20 Minuten lang bei Raumtemperatur (20-30 °C) gerührt und gegen 0,001 M Acetatpuffer (pH 4,4) dialysiert. Die dialysierte Lösung wird mit 0,2 M Natriumcarbonatlösung auf pH 9,0-9,5 eingestellt. Zu dieser Lösung wird 1 mL gegen 0,1 M Carobonatpuffer dialysierte Anti-Cytochrom C-Antikörper F(ab')₂-Lösung zugegeben und es wird 2 Stunden lang bei Raumtemperatur (20-30 °C) gerührt. Dann werden 50 μL auf 4 mg/mL eingestellte Borhydridlösung zugegeben und man rührt bei 4 °C 2 Stunden lang und lässt 16 Stunden stehen. Diese Lösung wird gegen 0,15 M NaCl enthaltenden Phosphatpuffer (pH 7,2) dialyisert und dann unter Verwendung einer Sephacryl S-200-Säule (Pharmacia) einer Gelfiltration unterzogen. Ein erster Peak der bei der Gelfiltration erhaltenen Fraktionen wird gewonnen und mit 25 % Kaninchenserum (Nippon Seibutsu Zairyo) enthaltenden 0,2 M Dinatriumphosphatpuffer (pH 5,4) verdünnt, und es wird eine HRP-markierte Anti-Cytochrom C-Antikörper F(ab')₂-Lösung (markierte Antikörperlösung) erhalten.
4. Herstellung eines Tiegels, auf dem Anti-Cytochrom C-Antikörper immobilisiert ist
Das in 1) erhaltene aufgereinigte IgG wird mit 0,01 Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) auf ein Absorptionsvermögen von 0,1 eingestellt. 100 μL dieser Antikörperlösung werden in einen Polystyroltiegel gegeben, man lässt bei 4 °C 16 Stunden lang reagieren und dann wird der Tiegel drei Mal mit 0,15 M NaCl und 0,01 %Tween 20 enthaltenden 0,01 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) unter Verwendung eines zur Verwendung bei EIA entwickelten Wäschers gewaschen (jedes Mal vier Sekunden lang). 200 μL 0,5 % Rinderalbumin enthaltender 0,01 M Tris-Puffer (pH 7,5) wird in den gewaschenen Tiegel gegeben und man läßt bei 4 °C erneut 16 Stunden lang reagieren, um einen Tiegel mit einem auf der festen Phase immobilisierten Antikörper zu erhalten.
5. Herstellung des Standardantigens
Rattencytochrom C (Sigma) wird mit 2 % BSA, 0,01 M EDTA 2Na, 0,1 % NaN₃, 0,01 % Tween 20 und 0,15 M NaCl enthaltendem 0.05 M Tris-Puffer (pH 7,5) verdünnt, um 50-0,05 ng/mL Verdünnungen herzustellen.
6. Messung
Die Rinderalbuminlösung im Tiegel mit immobilisiertem Anti-Cytochrom C Antikörper wird herausgesaugt und 50 μL 2 % BSA, 0,01 M EDTA 2Na, 0,1 % NaN₃, 0,01 % Tween 20 und 0,15 M NaCl enthaltender 0.05 M Tris-Puffer (pH 7,5) wird in den vorgenannten Tiegel gegeben. 50 μL jeder der verdünnten Standard-Antigenlösungen und eine Probe werden in den Tiegel gegeben und man lässt eine Stunde lang bei Raumtemperatur (20-30 °C) reagieren. Nach der Reaktion wird der Tiegel drei Mal mit 0,01 % Tween 20, 0,0015 M NaCl, 0,0015 % Methylparaoxibenzoat und 0,005 % 2-Chloracetamin enthaltenden 0,005 M Tris-Puffer (pH 7,5) unter Verwendung eines zur Verwendung bei EIA entwickelten Wäschers gewaschen (jedes Mal vier Sekunden lang). Nach dem Waschen werden 100 μL der markierten Antikörperlösung zugegeben und man lässt bei Raumtemperatur (20-30 °C) eine Stunde lang reagieren. Nach der Reaktion wird der Tiegel drei Mal mit 0,01 % Tween 20, 0,15 M NaCl, 0,0015 % Methylparaoxibenzoat und 0,005 % 2-Chloracetamin enthaltendem 0,005 M Tris-Puffer (pH 7,5) unter Verwendung eines zur Verwendung bei EIA entwickelten Wäschers gewaschen (jedes Mal vier Sekunden lang). Nach dem Waschen werden 100 μL 0,1 M Citratpuffer (pH 4,2), der 1,5 mg/mL ABTS (2,2-Azino-bis-(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure) enthält, zugegeben und man lässt bei Raumtemperatur (20-30 °C) eine Stunde lang reagieren und dann werden 100 μL 0,013 % NaN₃-Lösung zum Beenden der Reaktion zugegeben. Das Absorptionsvermögen der Lösung, die eine Färbung entwickelt hat, wird unter Verwendung eines Spektrophotometers bei 405 nm gemessen.
7. Kennzeichen der Standard-Antigenkurve
Der Absorptionswert einer Blindprobe wird jeweils von den Absorptionswerten von Cytochrom C bei unterschiedlichen Konzentrationen und der Probe abgezogen. Die Standard-Antigenkonzentration und der Absorptionswert des Standard-Antigens werden auf die horizontale und die vertikale Achse, respektive, aufgetragen, um eine Standardkurve zu zeichnen. Auf der Grundlage der Standard-Antigenkurve wird die Menge an in der Probe enthaltenem Cytochrom C berechnet.
Beispiel 2: Quantifizierung von Cytochrom C in Seren von an GVDH, HPS und akuter lymphatischer Leukämie leidenden Patienten
Die Cytochrom C-Spiegel in Seren von an GVDH, HPS und akuter lymphatischer Leukämie leidenden Patienten wurden unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen ELISA-Systems zur Messung von Cytochrom C gemessen.
Das Ergebnis zeigt, dass, wie in Tabelle 1 dargestellt, 15 normale Probanden alle negativ waren (< 0,05 ng/mL), während 4 von 6 GVDH-Patienten positiv waren (67 %), 4 von 4 HPS-Patienten waren positiv (100 %) und 2 von 2 unter akuter lymphatischer Leukämie leidenden Patienten waren positiv (100 %). Weiterhin neigten die HPS-Patienten mit einer hohen Konzentration an Cytochrom C im Blut dazu, dass die Krankheit einen schlechten Verlauf nahm.

Deutlich hohe bestimmte Cytochrom C-Werte wurden in Seren von Patienten bestimmt, bei denen angenommen wurde, dass Apoptose erfolgte. Tabelle 1 Bestimmte Werte von Cytochrom C in Seren von an GVDH, HPS und akuter lymphatischer Leukämie leidenden Patienten

Erkrankung	Im Serum bestimmter Cytochrom C-Wert (ng/mL)
GVHD	1,1 < 0,05 0,4 0,3 < 0,05 0,3
HPS (einschließlich VAHS)	3,1 22,0 38,0 2,9
akute lymphatische Leukämie	0,4 0,4
normale Probanden*	< 0,05

* Alle 15 normalen Probanden hatten werte unterhalb der Nachweisgrenze (< 0,05 ng/mL)

Weiterhin sind die Änderungen der Werte von LDH, AST, ALT, Ferritin und Cytochrom C in Seren von HPS-Patienten in 1 dargestellt. Der Cytochrom C-Wert korrelierte im Wesentlichen mit dem LDH und seine Veränderung ging derjenigen von LDH voraus. Daher wird angenommen, dass Cytochrom C als Indikator nützlich ist, um Veränderungen pathologischer Zustände mit großer Empfindlichkeit anzuzeigen.
Beispiel 3: Bestimmung von Cytochrom C in Seren von unter grippaler Enzephalitis oder Enzephalopathie leidenden Patienten
Die Mengen an Cytochrom C in Seren von unter von hohem Fieber begleiteter Influenza leidenden Patienten wurde unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen ELISA-Systems gemessen.
Die Ergebnisse einschließlich derer mehrmaliger Messungen bei einem Patienten sind in 2 dargestellt. Unter den von Enzephalitis oder Enzephalopathie begleiteten Fällen zeigten alle 27 Proben (8 Fälle) hohe Werte nicht unter 5 ng/mL, und unter diesen zeigten 17 Proben hohe Werte nicht unter 30 mg/mL. Weiterhin neigten die Patienten mit einer hohen Konzentration an Cytochrom C im Blut dazu, dass die Krankheit einen schlechten Verlauf nahm.
Einige Patienten, die unter wiederholten Fieberkrämpfen litten, zeigten leicht erhöhte Werte und es wurde gefolgert, dass für diese Patienten eine ausreichende Pflege notwendig ist. Unter den Patienten mit hohem Fieber zeigte kein Patient einen hohen bestimmten Cytochrom C Wert.
Weiterhin sind die Veränderungen der GOT, LDH und Cytochrom C-Werte im Blut von Patienten mit grippaler Enzephalopathie in 3 dargestellt. Anstieg und Abnahme des Cytochrom C-Niveaus traten vor demjenigen von LDH auf und es wurde gezeigt, dass Cytochrom C als Indikator zur Vorhersage eines pathologischen Zustands grippaler Enzephalopathie nützlich ist.
Beispiel 4: Konzentrationen verschiedener Zytokine in Seren von unter grippaler Enzephalitis oder Enzephalopathie leidenden Patienten
Konzentrationen von E-Selectin, löslichem Throbomodulin (sTM), Tumornecrosefaktor (TNF), Fas, FasL und Cytochrom C in Seren von unter von starkem Fieber, Fieberkrämpfen begleiteter grippaler Influenza leidenden Patienten oder unter grippaler Enzephalitis oder Enzephalopathie leidenden Patienten wurden bestimmt. E-Selectin wurde unter Verwendung eines sE-Selectin-ELISA-Sets (Version 2, Bender Med. Systems) gemessen. sTM wurde unter Verwendung eines TM-Tests (Teijin Diagnostics) gemessen. TNF wurde unter Verwendung eines humanen TNF-α-Cytoscreen-Immunoassay-Sets (Biosource International) gemessen. Fas wurde unter Verwendung eines sFas-ELISA-Sets gemessen und FasL wurde unter Verwendung eines sFas-Liganden-ELISA-Sets (beide hergestellt von Medical and Biological Laborstories) gemessen. Cytochrom C wurde unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen ELISA-Systems gemessen.
Wie in 4 gezeigt wird, stieg die Anzahl von Fällen, bei denen hohe Werte bestimmt wurden, bei Patienten, die unter Enzephalitis oder Enzephalopathie litten, an. Jedoch stieg Cytochrom C am deutlichsten bei unter Enzephalitis oder Enzephalopathie leidenden Patienten an. Damit wurde gezeigt, dass Cytochrom C am besten für die differentielle Diagnose von Enzephalitis oder Enzephalopathie geeignet ist.
Gewerbliche Anwendbarkeit
Die vorliegende Erfindung stellt ein immunochemisches Verfahren zur Bestimmung von Cytochrom C in Körperflüssigkeit zur Verfügung. Weiterhin wurde dargelegt, dass Cytochrom C ein bevorzugter Indikator für in einem lebenden Körper stattfindenden Zelltod ist und ein nützlicher Indikator zum frühzeitigen und genauen Auffinden eines pathologischen Zustandes. Daher ist die Messung von Cytochrom C zur Diagnose wie differenzieller Diagnose oder Verfolgung von Krankheiten, bei denen Apoptose am Fortschreiten ihres pathologischen Zustands beteiligt ist, insbesondere GVHD, HPS, akute lymphatische Leukämien und grippale Enzephalitis oder Enzephalopathie nützlich.

Claims

Verfahren zum Nachweis von Apoptose, das die Bestimmung des Cytochroms C in Körperflüssigkeit und den Nachweis von Apoptose umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Cytochrom C durch ein immunochemisches Verfahren bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 2, worin das immunochemische Verfahren ein Sandwich-Verfahren ist.
Verwendung eines Antikörpers, der auf das Cytochrom C bezogen ist, bei der Bestimmung des Cytochroms C in Körperflüssigkeit zum Nachweis der Apoptose.
Verwendung nach Anspruch 4 zur Diagnose einer Krankheit, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus der Transplantat-gegen-Empfänger-Reaktion, Systemischer Lupus erythematodes, rheumatoide Arthritis, Sklerodermie, Sjoegren-Syndrom, Multiple Sklerose, insulinabhängiger Diabetes mellitus, Colitis ulcerosa, virale Infektionen, neurodegenerative Erkrankungen, Leukämie, Strahlenbelastung, Antikrebs-Arzneimittel-Medikation -und systemisches inflammatorisches Reaktions-Syndrom (SIRS) besteht.
Verwendung nach Anspruch 5, worin die Krankheit die Transplantat-gegen-Empfänger-Reaktion ist.
Verwendung nach Anspruch 5, worin die Krankheit das hemophagocytische Syndrom (HPS) ist.
Verwendung nach Anspruch 5, worin die Krankheit die akute lymphatische Leukämie ist.
Verwendung nach Anspruch 5, worin die Krankheit die virale Enzephalitis oder Enzephalopathie ist.
Verwendung nach Anspruch 9, worin die virale Enzephalitis oder Enzephalopathie eine grippale Enzephalitis oder Enzephalophatie ist.