JP5483141B2 - 脳症由来痙攣と発熱由来熱性痙攣の鑑別方法 - Google Patents
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Description
[1] 痙攣を起こした患者から採取した脳脊髄液中のVGF nerve growth factor inducible precursorの質量分析により得られるm/z値が4811±4.8であり、アミノ酸配列EAEAEAEE(配列番号4)を含む断片ペプチドを測定することを含む、脳症による痙攣と発熱による熱性痙攣を鑑別して検出する方法。
[2] VGF nerve growth factor inducible precursorの断片ペプチドが配列番号3に表されるアミノ酸配列又は配列番号3に表されるアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列からなる断片ペプチドである[1]の方法。
[3] 脳症がインフルエンザ脳症であり、発熱による熱性痙攣がインフルエンザの発熱による熱性痙攣である[1]又は[2]の方法。
[5] 痙攣を起こした患者から採取した脳脊髄液中のVGF nerve growth factor inducible precursorの断片ペプチドを質量分析により測定する[1]〜[3]のいずれかの方法。
[7] 配列番号3に表されるアミノ酸配列又は配列番号3に表されるアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列からなるVGF nerve growth factor inducible precursorの断片ペプチドの、脳症による痙攣と発熱による熱性痙攣の鑑別検出用マーカーとしての使用。
[9] 配列番号3に表されるアミノ酸配列又は配列番号3に表されるアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列からなるVGF nerve growth factor inducible precursorの断片ペプチドに対する抗体を含む、脳症による痙攣と発熱による熱性痙攣の鑑別検出用キット。
[10] ELISA又はウエスタンブロット法用キットである、[9]の脳症による痙攣と発熱による熱性痙攣の鑑別検出用キット。
VGF nerve growth factor inducible precursor(VGF神経誘発発達因子前駆体)は、ニューロンおよび内分泌細胞に見られる分泌ポリペプチドである。配列番号1に、ヒトVGF nerve growth factor inducible precursorをコードするDNAの塩基配列(GenBankアクセッション番号 NM_003378)を、配列番号2にヒトVGF nerve growth factor inducible precursorのアミノ酸配列を示す。
髄液試料を必要に応じ緩衝液で希釈し、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、2-メルカプトエタノール(2-ME)を含むバッファーで溶解し、SDS-PAGEにより分子量に応じて分離する。ゲル上の分離したタンパク質をニトロセルロース膜やPVDF膜に転写し、転写した膜を酵素を結合させた抗体を用いた酵素反応により呈色させ、VGF nerve growth factor inducible precursorの断片ペプチドの存在を検出する。
VGF nerve growth factor inducible precursorの断片ペプチドに対する抗体をあらかじめ特殊な化学修飾をしたマイクロタイタープレート等の担体に結合させる。結合は、物理的吸着、官能基を利用した共有結合等、公知の方法で行うことができる。髄液試料を原液または緩衝液で段階希釈後、抗体を結合させたマイクロタイタープレートにこれを適当量加え、インキュベーションする。その後洗浄し、捕捉されなかったタンパク質及び部分ペプチドを除く。次に蛍光若しくは化学発光物質または酵素を結合させた2次抗体を加えインキュベーションする。検出はそれぞれの基質を加えた後、蛍光若しくは化学発光物質または酵素反応による可視光を計測することによって評価判定を行う。
髄液中のVGF nerve growth factor inducible precursorの断片ペプチドを質量分析計を用いた質量分析法により解析することもできる。質量分析計は、試料導入部、イオン化室、分析部、検出部、記録部等を含む。イオン化法としては電子衝撃イオン化(EI)法、化学イオン化(CI)法、フィールドデソープション(FD)法、二次イオン化(SIMS)法、高速原子衝突(FAB)法、matrix-assisted laser desorption ionization(MALDI)法、エレクトロスプレーイオン化(ESI)法等を用いればよい。また、分析部は、二重収束質量分析計、四重極型質量分析計、飛行時間型質量分析計、フーリエ変換質量分析計、イオンサイクロトロン質量分析計等が用いられる。
臨床上、インフルエンザ脳症患児、インフルエンザ以外の原因で発症したと考えられた脳症患児及び熱性痙攣患児(単純型、複雑型)を対象とし、病院の倫理委員会で承認を得たプロトコールに沿い、患児の両親よりインフォームドコンセントを得たのち、入院時に一般検査に用いた脳脊髄液を用いて質量分析計による検討を行った。測定した症例は、熱性痙攣30例、インフルエンザ脳炎5例、脳炎6例の計11例であった。
(1)イオン交換チップを用いたマイクロスケールでの精製方法の確立
脳脊髄液及びバッファーを体積比1:9で混合し、陽イオン交換チップ(CM10、バイオ・ラッドラボラトリーズ株式会社)又は陰イオン交換チップ(Q10、バイオ・ラッドラボラトリーズ株式会社)のスポットに1スポット当たり50μl添加した。バッファーとしては、100mM酢酸バッファーpH4.5、リン酸ナトリウムバッファーpH6.7又はTris-HClバッファーpH8.9を用いた60分間室温でインキュベーションした後、1スポット当り150μlの上記バッファーで5分間の洗浄を2回行い、MIlliQ水でリンスし脱塩した後、風乾し、エネルギー吸収分子(SPA(シナピン酸)を添加した。イオン交換チップにより捕捉されたペプチドにパルスレーザを照射し、チップ表面から脱離させ、イオン化し、イオン化したタンパク質をProteinChip SELDI System(バイオ・ラッドラボラトリーズ株式会社)を用いて解析した。
(1)の検討結果を踏まえ、陰イオン交換カラムにより分子量4811のペプチドの精製方法を検討した。陰イオン交換カラムとしては、Q Sepharose Fast Flow (GE Healthcare社)を用いた。陰イオン交換カラムを5倍量の50mM酢酸バッファーpH4で3回洗浄して平衡化した。試料として、熱性痙攣児の髄液を用いた。髄液試料500μlを14000rpmで10分間遠心分離し、上清に50mM酢酸バッファーpH4を加え2倍希釈し、OG(0.1% オクチルグルコシド)を添加し、500μlとし、平衡化した陰イオン交換カラムに添加した。以下のバッファーを用いてステップワイズにイオン強度を上げ溶出し、フラクションを回収した。
1.非吸着画分 1000μl
2.50mM 酢酸バッファーpH4+OG(洗浄) 100μl×3
3.100mM NaCl含有50mM 酢酸バッファーpH4+OG(洗浄) 100μl×3
4.200mM NaCl含有50mM 酢酸バッファーpH4+OG(洗浄) 100μl×3
5.300mM NaCl含有50mM 酢酸バッファーpH4+OG(洗浄) 100μl×3
6.500mM NaCl含有50mM 酢酸バッファーpH4+OG(洗浄) 100μl×3
7.1000mM NaCl含有50mM 酢酸バッファーpH4+OG(洗浄) 100μl×3
分子量4811のペプチドのピークは、0.1M〜0.2MのNaCl画分に溶出された(図4)。
(2)で得られた0.2M NaClの溶出画分について逆相HPLCを用いてグラジエント溶出によりさらに精製した。逆相HPLCの条件は以下のとおりであった。
カラム:TSK-GEL Super ODS 1×50mm(東ソー)
流速:54μl/min.
溶媒A:0.1% TFA
溶媒B:90%アセトニトリル/0.1%TFA
グラジエント:0→10%B/2min.→50%B/40min.
検出:280nmにおける吸光度
画分サイズ:54μ/チューブ
(1)MS/MS解析による同定
実施例2で精製したペプチドを還元カルボキサミドメチル化及びトリプシン処理後にMALDI-Q-STARTを用いてMS/MS解析により同定した。
MS/MS解析の結果を図6に示す。
m/z1907.8のペプチドの質量(分子量)は、内部補正法により補正しm/z4808.35であった。
実施例2で精製したペプチドを2μl/スポットでプロテインチップ(NP20)に添加し、固定し、MilliQ水5μl/スポットで2回洗浄し乾燥させた。次いで、10mM NH4HCO3(pH8)に溶解した5mM DTT(ジチオスレイトール)をスポットに添加し、70℃に設定したヒートブロックに静置し乾燥させ、MilliQ水5μl/スポットで2回洗浄し乾燥させた。次いで、2μg/mlトリプシン/10mM NH4HCO3(pH8)溶液4μl/スポットを添加し、湿度チャンバー中で2時間、37℃で保温した。その後、SELDI(Surface Enhanced Laser Desorpotion/Ionization)によりペプチドの解析を行い、データベース検索によりMS/MSでヒットしたデータベース配列との一致度を確認した。
1.抗体の作製
実施例3で特定したVGF nerve growth factor inducible precursorのアミノ酸配列に対するポリクローナル抗体を作成するために、配列番号3のアミノ酸配列を抗原ポリペプチドとして選択した。抗体の作製は、株式会社スクラムに外注した。
上記1において作製した抗体を用いて、ウエスタンブロッティングによる脳症検体の解析を行った。
(1)試料の調製
脳症及び熱性痙攣の患児の両親に対して、研究目的の使用について十分な説明を行い、同意を得られた脳脊髄液サンプルを検体として用いた。
抗体検出用として、16.5%レディージェルJ peptide(バイオラド社製)に上記検体とサイズマーカーをアプライし、電気泳動装置(バイオラド社製)に装着して、トリシンサンプルバッファー(バイオラド社製)を使用して泳動を行った。泳動は90分、100ボルトで行った。
上記(2)において電気泳動を行ったゲルを、トリス/グリシン/SDSバッファー(バイオラド社製)を使用して、100Vで60分間、PVDF膜(バイオラド社製)にそれぞれ転写した。転写装置としてはウェット式ブロッター(バイオラド社製)を用いた。
Claims (9)
- 痙攣を起こした患者から採取した脳脊髄液中のVGF nerve growth factor inducible precursorの質量分析により得られるm/z値が4811±4.8であり、アミノ酸配列EAEAEAEE(配列番号4)を含む断片ペプチドを測定することを含む、脳症による痙攣と発熱による熱性痙攣を鑑別して検出する方法。
- VGF nerve growth factor inducible precursorの断片ペプチドが配列番号3に表されるアミノ酸配列又は配列番号3に表されるアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列からなる断片ペプチドである請求項1記載の方法。
- 脳症がインフルエンザ脳症であり、発熱による熱性痙攣がインフルエンザの発熱による熱性痙攣である請求項1又は2記載の方法。
- 痙攣を起こした患者から採取した脳脊髄液中のVGF nerve growth factor inducible precursorの断片ペプチドをELISA又はウエスタンブロット法により測定する請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 痙攣を起こした患者から採取した脳脊髄液中のVGF nerve growth factor inducible precursorの断片ペプチドを質量分析により測定する請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 配列番号3に表されるアミノ酸配列又は配列番号3に表されるアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列からなるVGF nerve growth factor inducible precursorの断片ペプチドからなる、脳症による痙攣と発熱による熱性痙攣の鑑別検出用マーカー。
- 配列番号3に表されるアミノ酸配列又は配列番号3に表されるアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列からなるVGF nerve growth factor inducible precursorの断片ペプチドの、脳症による痙攣と発熱による熱性痙攣の鑑別検出用マーカーとしての使用。
- 配列番号3に表されるアミノ酸配列又は配列番号3に表されるアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列からなるVGF nerve growth factor inducible precursorの断片ペプチドに対する抗体を含む、脳症による痙攣と発熱による熱性痙攣の鑑別検出用キット。
- ELISA又はウエスタンブロット法用キットである、請求項8記載の脳症による痙攣と発熱による熱性痙攣の鑑別検出用キット。
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