JP5540343B2 - 小児てんかん患者における急性脳炎または急性脳症の罹患リスク判定データの取得方法およびその利用 - Google Patents

小児てんかん患者における急性脳炎または急性脳症の罹患リスク判定データの取得方法およびその利用 Download PDF

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本発明は、脳炎または脳症の罹患リスク判定データの取得方法およびその利用、並びに熱性けいれんのてんかんへの移行リスク判定データの取得方法およびその利用に関するものであり、特に、脳炎および脳症を発症していない者について、脳炎または脳症に罹患するリスクを判定するためのデータを取得する脳炎または脳症の罹患リスク判定データの取得方法およびその利用、並びに、熱性けいれんの既往者について、てんかんに罹患するリスクを判定するためのデータを取得する熱性けいれんのてんかんへの移行リスク判定データの取得方法およびその利用に関するものである。
小児の脳炎および脳症には処置が遅れると、難治性で予後の悪い病態に進行するものが多い。脳炎および脳症としては、短期に病状が進行する急性脳炎および急性脳症や、長期にわたって持続する慢性脳炎の「ラスムッセン脳炎」などが挙げられる。
急性脳炎および急性脳症は乳幼児期に多く、様々なウイルス感染や薬剤が引き金になって起きる。例えば、日本では、インフルエンザウイルス感染に伴って急性脳炎または急性脳症を引き起こすことが多い。このようなインフルエンザウイルスによって引き起こされる急性脳炎および急性脳症はインフルエンザ脳症とも呼ばれる。急性脳炎および急性脳症の原因には、インフルエンザのほか、種々のウイルス感染やアスピリン（解熱剤）、テオフィリン（気管支拡張剤）などの薬剤等がある。しかし、原因が同定できない場合も少なからず認められる。
急性脳炎および急性脳症は、ウイルス感染を発症してから数時間〜数日後に、意識障害、けいれん、異常行動(奇声をあげる、意味のわからない発言や行動など)、異常なおびえや怒り、幻覚などの精神症状などで発症する。
医学的には、髄液にウイルスを検出できた場合を急性脳炎、ウイルスを検出できない場合を急性脳症として区別される。しかし、髄液から原因ウイルスを検出できなくても中枢神経系への感染を否定することは現状では困難である。また、両者の臨床症状が非常に類似している。そのため、実際の医療現場では急性脳炎と急性脳症とを区別して扱うよりも「急性脳炎および急性脳症」として総括して報告することが多い（非特許文献１を参照）。
急性脳炎および急性脳症は、軽症の場合、後遺症を残すことなく回復する。しかし、重症の場合、突然のけいれんや意識障害が出現することが多い。また、後遺症としては、てんかん、知能障害、四肢麻痺などが認められる。
さらに、重症な場合には、経過中に、播種性血管内凝固、肝機能障害、腎機能障害、横紋筋融解症など、他の重篤な合併症を伴うことが多い。このような合併症を伴う最重症例では、最終的に多臓器不全の状態に陥り死亡することがある。中には、脳症発症後１〜２日で死亡に至ることもあり、死亡率は３０％、後遺症も２５％の患者に認められる重篤な疾患で、小児の死亡原因の第６位になっている。
我が国では、急性脳炎および急性脳症の発症頻度は１０万人に２〜４人程度（０．００３％）と考えられている（非特許文献２および３を参照）。具体的には、非特許文献２には、小児脳炎の発症頻度は小児１０万人あたり３．３人であることが記載されている。また、非特許文献３には、急性脳炎および急性脳症の発症頻度は、１００万人あたり１７．７人であることが記載されている。さらに、急性脳炎および急性脳症のうち、日本人で頻度の高いインフルエンザ脳症について言えば、主に６歳以下の子供がかかり、日本では毎年１００〜３００人前後の患者が発症している。
急性脳炎および急性脳症の治療法として、例えば、インフルエンザ脳症では、抗インフルエンザ剤の投与、ステロイド療法、ガンマグロブリン療法、血漿交換、低体温療法などが行われている。しかし、これら治療法の効果は、いまだ十分とはいえず、治療法が確立されたといえる状況には至っていない。
そのため、急性脳炎および急性脳症を診断する方法がいくつか開発されている。具体的には、インフルエンザ脳症は、日本を含む東アジアに多く欧米には少ないため、遺伝的要因の関連が考えられており、遺伝的要因に着目した診断方法がいくつか開発されている。
例えば、特許文献１には、小児髄液中に含まれる１４−３−３タンパク質のアイソフォームにおいて、β、θ、γ、ζ、εの順に強く検出された場合に、小児インフルエンザ脳症であると判断できることが記載されている。
また、最近、インフルエンザ脳症への罹患を左右する遺伝子多型解析が行われており、染色体１０ｑ２２に位置する特定の遺伝子の遺伝子多型がインフルエンザ脳症の発症と関連していることが報告されている。
さらに、解熱鎮痛剤及びこれに関連する薬剤を投与したときにインフルエンザ脳症を発症するリスクを判定する方法として、例えば、特許文献２の技術が知られている。
特許文献２に開示されるインフルエンザ脳症の発症リスクの判定方法では、まず、血管内皮細胞に、インビトロでウイルスを感染させる前後又は同時に、解熱鎮痛剤又はその候補薬剤を接触させ、あるいは、非ヒト動物に、ウイルスを感染させる前後又は同時に、解熱鎮痛剤又はその候補薬剤を投与する。次に、（１）血管内皮細胞内のウイルス増殖の程度、（２）血管内皮細胞における血管の透過性亢進の程度、又は、（３）血液脳関門における血管内皮細胞間のタイトジャンクションを構成するタンパク質の発現量を測定する。これらの結果を、解熱鎮痛剤又はその候補薬剤無添加の場合と比較することにより、解熱鎮痛剤又はその候補薬剤を投与したときに、インフルエンザ脳症を発症するリスクを判定する。
一方、慢性脳炎としては、ラスムッセン脳炎が挙げられる。ラスムッセン脳炎は、神経細胞に対する自己免疫疾患の一つで、しばしば部分発作の重積で発症する。年余にわたり緩徐に進行する慢性脳炎で、さまざまな脳機能障害や精神症状を起こす。子供に発病することが多く、脳炎にかかった部分の脳は萎縮し難治てんかん発作を反復する。
ラスムッセン脳炎の治療方法としては、病巣を部分的に切除しても、残された脳組織に再発するので大脳半球離断術が推奨されている。
また、小児には約８％の高い発症率で熱性けいれんが起こる。熱性けいれんは、発熱によって起こるけいれん発作である。生後６ヶ月から５歳頃までに発症し、大多数の症例では６歳までに治癒する。積極的な治療を必要としないことが多く原則として良性の疾患である。
しかし、１歳未満に発症する熱性けいれんの中には、６歳以降もけいれんが持続する難治てんかん患者が混在している。すなわち、熱性けいれんからてんかんへの移行が起こりうる。難治てんかん患者は何度もけいれんを繰り返し、てんかん重積など危険な状態を経験していることがしばしばである。難治てんかん患者は、程度に差があるものの、歩行に軽度の遅れがみられることがあり、有意語はみられるが文章を話すようになることはほとんどない。歩行の不安定性は持続、または進行することがある。
このように、熱性けいれんがてんかんへ移行すると重篤な症状を呈するため、より早期にてんかん発症を予測することが患者にとって重要である。より早期にてんかん発症を予測することが可能になれば、事前に対応することができ、患者が重篤な状態になるのを防ぐことが可能である。そのためには、熱性けいれん既往者のてんかんへの移行を予測する方法の開発が必要であり、当該方法が開発されれば、てんかんへ移行する可能性が高いと予測される者をできるだけ早い時期にてんかん専門医に紹介することが可能となる。
これまでに、てんかん患者の遺伝子を検査することによっててんかんのタイプを診断する方法についてはいくつかの技術が知られている（特許文献３，４）。
特開２００５−２９２１０８号公報（平成１７（２００５）年１０月２０日公開） 特開２００７−５３９４２号公報（平成１９（２００７）年３月８日公開） 特表２００４−５１２８１２号公報（平成１６（２００４）年４月３０日公表） 特開２００２−１３６２８９号公報（平成１４（２００２）年５月１４日公開） 小児科臨床 ５４，１９３−１９９（発行日：平成１３年（２００１）２月５日、発行所：日本小児医事出版社） 小児科臨床 ５７，２２２３−２２２８（発行日：平成１６年（２００４）１１月５日、発行所：日本小児医事出版社） 医学のあゆみ 別冊 神経疾患（ｖｅｒ．１），４３２−４３５（発行日：平成１１（１９９９）年１１月１５日、発行所：医歯薬出版株式会社）
脳炎または脳症は、患者を死に至らしめる危険性があるため、上説したように、急性脳炎および急性脳症については、予防、診断、治療にかかる技術の開発が進められている。しかし、これらの方法は、脳炎または脳症を発症していない患者における脳炎または脳症の罹患リスクを判定する技術としては不十分である。
具体的には、特許文献１の技術は、小児インフルエンザ脳症を発症していることを診断するものであり、小児インフルエンザ脳症を発症していない小児における小児インフルエンザ脳症の罹患リスクを判定することはできない。
また、特許文献２の技術は、解熱鎮痛剤の中には、血管内皮細胞でウイルス増殖を引き起こすものがあるとの知見に基づくインフルエンザ脳症の発症リスクの判定方法である。つまり、特許文献２の技術は、投与した薬剤が患者に対してインフルエンザ脳症を発症させるか否かを判定するものである。そのため、急性脳炎または急性脳症を発症していない患者における急性脳炎または急性脳症の罹患リスクを判定することはできない。
また、染色体１０ｑ２２に位置する特定の遺伝子の遺伝子多型とインフルエンザ脳症の発症との関連性が知られているが、インフルエンザ脳症の罹患リスクの判定法としての有効性は十分に立証されていない。
このように、特許文献１、および特許文献２を含め、従来技術では、急性脳炎または急性脳症を発症していない患者における急性脳炎または急性脳症の罹患リスクを判定することができない。
一方、ラスムッセン脳炎のような慢性脳炎または慢性脳症の罹患リスクを判定する方法は、これまでになく、罹患前にその罹患リスクを評価することはできない。
また、特許文献３，４に開示された技術は、てんかんを発症している患者の遺伝子を検査することによっててんかんのタイプを診断する方法に関するものであり、熱性けいれん既往者のてんかんへの移行を予測する方法については、これまでに知見は存在しない。
本発明は、上記問題点に鑑みなされたものであり、その目的は、脳炎または脳症を発症していない者について、脳炎または脳症に罹患するリスクを判定するためのデータを取得する脳炎または脳症罹患リスク判定データの取得方法およびその利用を提供することにある。
本発明者らは、急性脳炎および急性脳症、並びに慢性脳炎および慢性脳症は、上述したように、小児が発症することが多いことから、簡便に、急性脳炎および急性脳症、並びに慢性脳炎および慢性脳症の罹患リスクを併せて判定するという従来にはない技術思想に基づき、鋭意検討した結果、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１を構成するサブユニットをコードする遺伝子群における変異が、急性および慢性を問わず、脳炎または脳症の罹患に関連していることを独自に見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は、産業上有用な以下の発明を包含する。
（１）脳炎または脳症の罹患リスクを判定するためのデータを取得する脳炎または脳症の罹患リスク判定データの取得方法であって、生体から分離した試料を用いて、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１を構成するαサブユニット１型、β１サブユニット、およびβ２サブユニットをコードする遺伝子群に含まれる少なくとも１つの遺伝子について、アミノ酸変化を伴う変異の有無を検出することを含むことを特徴とする脳炎または脳症の罹患リスク判定データの取得方法。
（２）上記変異は、上記電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１の活性を変化させる変異であることを特徴とする（１）に記載の脳炎または脳症の罹患リスク判定データの取得方法。
（３）上記電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１を構成するαサブユニット１型をコードする遺伝子ついて、アミノ酸変化を伴う変異の有無を少なくとも検出することを特徴とする（１）または（２）に記載の脳炎または脳症の罹患リスク判定データの取得方法。
（４）脳炎または脳症の罹患リスクを判定するための脳炎または脳症の罹患リスク判定キットであって、（ａ）電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１を構成するαサブユニット１型、β１サブユニット、およびβ２サブユニットをコードする遺伝子群に含まれる少なくとも１つの遺伝子のエキソン領域、エキソンとイントロンとの境界領域、もしくはｍＲＮＡ、またはそれらの一部を増幅できるように設計されたプライマー、（ｂ）電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１を構成するαサブユニット１型、β１サブユニット、およびβ２サブユニットをコードする遺伝子群に含まれる少なくとも１つの遺伝子の特定の遺伝子型のエキソン、エキソンとイントロンとの境界領域、もしくはｍＲＮＡ、またはそれらの一部のみを特異的に検出できるように設計されたプローブ、並びに（ｃ）電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１を構成するαサブユニット１型、β１サブユニット、およびβ２サブユニットをコードする遺伝子群に含まれる少なくとも１つの遺伝子の特定の遺伝子型の翻訳産物であるポリペプチドまたはその一部のみに特異的に結合する抗体のうち、少なくとも１つを含むことを特徴とする脳炎または脳症の罹患リスク判定キット。
（５）脳炎または脳症の治療薬剤をスクリーニングするための細胞であって、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１を構成するαサブユニット１型、β１サブユニット、およびβ２サブユニットをコードする遺伝子群に含まれる少なくとも１つの遺伝子にアミノ酸変化を伴う変異を有することを特徴とする細胞。
（６）脳炎または脳症の治療薬剤をスクリーニングするための細胞の製造方法であって、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１を構成するαサブユニット１型、β１サブユニット、およびβ２サブユニットをコードする遺伝子群に含まれる少なくとも１つの遺伝子にアミノ酸変化を伴う変異を導入する工程を含むことを特徴とする細胞の製造方法。
（７）（５）に記載の細胞に、候補薬剤を投与し、該細胞における電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１の活性が変化したか否かを判定することを含むことを特徴とする脳炎または脳症の治療薬剤のスクリーニング方法。
（８）上記候補薬剤は、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１に対する阻害剤もしくは作動薬、または電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１を構成するαサブユニット１型、β１サブユニット、およびβ２サブユニットをコードする遺伝子群に含まれる少なくとも１つの遺伝子もしくはその核酸配列の一部からなるポリヌクレオチドを含む発現プラスミドベクターもしくはウイルスベクターであることを特徴とする（７）に記載の脳炎または脳症の治療薬剤のスクリーニング方法。
（９）熱性けいれんのてんかんへの移行リスクを判定するためのデータを取得する、熱性けいれんのてんかんへの移行リスク判定データの取得方法であって、生体から分離した試料を用いて、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１を構成するαサブユニット１型、β１サブユニット、およびβ２サブユニットをコードする遺伝子群に含まれる少なくとも１つの遺伝子について、アミノ酸変化を伴う変異の有無を検出することを含むことを特徴とする、熱性けいれんのてんかんへの移行リスク判定データの取得方法。
（１０）上記変異は、上記電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１の活性を変化させる変異であることを特徴とする（９）に記載の熱性けいれんのてんかんへの移行リスク判定データの取得方法。
（１１）上記電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１を構成するαサブユニット１型をコードする遺伝子ついて、アミノ酸変化を伴う変異の有無を少なくとも検出することを特徴とする（９）または（１０）に記載の熱性けいれんのてんかんへの移行リスク判定データの取得方法。
（１２）熱性けいれんのてんかんへの移行リスクを判定するための、熱性けいれんのてんかんへの移行リスク判定キットであって、（ａ）電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１を構成するαサブユニット１型、β１サブユニット、およびβ２サブユニットをコードする遺伝子群に含まれる少なくとも１つの遺伝子のエキソン領域、エキソンとイントロンとの境界領域、もしくはｍＲＮＡ、またはそれらの一部を増幅できるように設計されたプライマー、（ｂ）電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１を構成するαサブユニット１型、β１サブユニット、およびβ２サブユニットをコードする遺伝子群に含まれる少なくとも１つの遺伝子の特定の遺伝子型のエキソン、エキソンとイントロンとの境界領域、もしくはｍＲＮＡ、またはそれらの一部のみを特異的に検出できるように設計されたプローブ、並びに（ｃ）電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１を構成するαサブユニット１型、β１サブユニット、およびβ２サブユニットをコードする遺伝子群に含まれる少なくとも１つの遺伝子の特定の遺伝子型の翻訳産物であるポリペプチドまたはその一部のみに特異的に結合する抗体のうち、少なくとも１つを含むことを特徴とする、熱性けいれんのてんかんへの移行リスク判定キット。
本発明にかかる脳炎または脳症の罹患リスク判定データの取得方法は、以上のように、生体から分離した試料を用いて、ナトリウムイオンチャネルのサブユニットをコードする遺伝子群に含まれる少なくとも１つの遺伝子について、アミノ酸変化を伴う変異の有無を検出することを含んでいる。
上記構成によれば、取得されたデータにおいて、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１を構成するαサブユニット１型、β１サブユニット、およびβ２サブユニットをコードする遺伝子群におけるアミノ酸変化を伴う変異の有無を検証することにより、脳炎または脳症に罹患するリスクを判定することができる。
それゆえ、脳炎または脳症を発症していない者について、急性および慢性を問わず、脳炎または脳症に罹患するリスクを判定することができるという効果を奏する。
本発明にかかる熱性けいれんのてんかんへの移行リスク判定データの取得方法は、以上のように、生体から分離した試料を用いて、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１を構成するαサブユニット１型、β１サブユニット、およびβ２サブユニットをコードする遺伝子群に含まれる少なくとも１つの遺伝子について、アミノ酸変化を伴う変異の有無を検出することを含んでいる。
上記構成によれば、取得されたデータにおいて、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１を構成するαサブユニット１型、β１サブユニット、およびβ２サブユニットをコードする遺伝子群におけるアミノ酸変化を伴う変異の有無を検証することにより、熱性けいれん既往者がてんかん患者へ移行するリスクを判定することができる。
それゆえ、熱性けいれん既往者について、より早期にてんかん発症を予測することができ、死亡率や後遺症を低下させることができるという効果を奏する。
本発明の一実施形態について説明すると以下の通りであるが、本発明はこれに限定されるものではない。
＜Ｉ．脳炎または脳症の罹患リスク判定データの取得方法＞
本発明にかかる脳炎または脳症の罹患リスク判定データの取得方法（以下、「本発明の判定データ取得方法」ともいう）は、被験者から分離した試料を用いて、該被験者が脳炎または脳症に罹患するリスクを判定するためのデータを取得するための方法である。
なお、上記被験者は特に限定されるものではなく、脳炎または脳症に罹患している者（罹患している可能性のある者）であってもよいし、脳炎または脳症に罹患していない者（罹患している可能性がない者）であってもよい。中でも、乳幼児、または小児に適用することが好ましい。
本明細書において、「脳炎」または「脳症」とは、様々なウイルス感染や薬剤が引き金になって起きる意識障害、けいれん、異常行動、異常なおびえや怒り、幻覚などの精神症状きたす急性脳炎または急性脳症、並びに長期にわたって持続する慢性脳炎または慢性脳症が意図される。具体的には、インフルエンザ脳症、ライ症候群、アスピリンやテオフィリンなどの薬剤でおきる脳症、および種々のウイルス感染に惹起された脳症などの急性脳炎または急性脳症、並びに、ラスムッセン脳炎等の慢性脳症または慢性脳炎を包含する。
これらの脳炎および脳症は、疾患を引き起こす原因はそれぞれ異なるため、すべての疾患を包括的に罹患リスクを判定することは、従来不可能であった。しかし、本発明によれば、後述する構成を備えているため、急性および慢性を問わず、あらゆる脳炎および脳症の罹患リスクを包括的に判定するためのデータを取得することができる。
本発明の判定データ取得方法は、具体的には、生体から分離した試料を用いて、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１を構成するαサブユニット１型、β１サブユニット、およびβ２サブユニットをコードする遺伝子群（以下、「ナトリウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群」ともいう）に含まれる少なくとも１つの遺伝子について、アミノ酸変化を伴う変異の有無を検出する工程を含んでいればよく、その他の具体的な構成は特に限定されない。
なお、本明細書において、「アミノ酸変化を伴う変異」とは、ミスセンス変異（アミノ酸が置換する）、ナンセンス変異（アミノ酸合成が途中で止まる）、フレームシフト（塩基の挿入、欠失により、変異位置より下流のアミノ酸配列が変化し、本来の機能を有しない）、スプライシング異常（該当エキソン領域の欠失等）、少数塩基挿入または欠失（一部のアミノ酸が新生、脱落するが下流は正常アミノ酸のまま合成）、エキソン領域微小欠失（エキソンが１つもしくは複数欠損）などが意図される。
本発明の判定データ取得方法は、具体的には、例えば、上記変異を検出するために、上記生体から分離した試料を前処理する工程等を含んでいてもよい。
上記ナトリウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群とは、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１を構成する各サブユニットをそれぞれコードする遺伝子からなる群が意図される。
電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１は、αサブユニット１型、β１サブユニット、およびβ２サブユニットから構成されている。β１サブユニットおよびβ２サブユニットは、補助的なサブユニットである。
αサブユニット１型としては、ＮＣＢＩアクセション番号ＢＡＣ２１１０１に登録されるポリペプチドを挙げることができる。また、αサブユニット１型をコードする遺伝子としては、ＳＣＮ１Ａとして、ＮＣＢＩアクセション番号ＡＢ０９３５４８に登録されている塩基配列（すなわち、配列番号２に示される塩基配列）からなるポリヌクレオチドを挙げることができる。
β１サブユニットとしては、ＮＣＢＩアクセション番号ＡＡＡ６０３９１に登録されるポリペプチドを挙げることができる。また、β１サブユニットをコードする遺伝子としては、ＳＣＮ１Ｂとして、ＮＣＢＩアクセション番号Ｌ１０３３８に登録されている塩基配列からなるポリヌクレオチドを挙げることができる。
また、β２サブユニットとしては、ＮＣＢＩアクセション番号ＡＡＣ２６０１３に登録されるポリペプチドを挙げることができる。また、β２サブユニットをコードする遺伝子としては、ＳＣＮ２Ｂとして、ＮＣＢＩアクセション番号ＡＦ００７７８３に登録されている塩基配列からなるポリヌクレオチドを挙げることができる。
本発明の判定データ取得方法では、上記例示したようなナトリウムイオンチャネルを構成する各サブユニットをコードする遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子について、アミノ酸変化を伴う変異の有無を検出すればよい。
具体的には、少なくともαサブユニット１型をコードする遺伝子について、上記変異を検出することが好ましい。
上記構成によれば、脳炎または脳症の罹患リスクを精度よく判定することを可能にするデータを取得することができる。
また、上記変異を検出する対象遺伝子は、１つであってもよいが、複数であることが好ましい。このような構成によれば、脳炎または脳症の罹患リスクをより高精度に判定することを可能にするデータを取得することができる。
上記ナトリウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群に含まれる遺伝子において検出する変異は、アミノ酸変化を伴うものであればよく、その具体的な変異は特に限定されるものではない。具体的には、変異には、ミスセンス変異（アミノ酸が置換する）、ナンセンス変異（アミノ酸合成が途中で止まる）、フレームシフト（塩基の挿入、欠失によりアミノ酸コドンのフレームがずれ、変異位置より下流のアミノ酸配列が変化し、本来の機能を有しない）、スプライシング異常（該当エキソン領域の欠失等）、少数塩基挿入または欠失（一部のアミノ酸が新生、脱落するが下流は正常アミノ酸のまま合成）、エキソン領域微小欠失（エキソンが１つもしくは複数欠損）が含まれる。また、変異は、遺伝子多型であってもよい。
上記遺伝子における変異の位置は特に限定されるものではないが、ナトリウムイオンチャネルの機能（換言すれば、活性）を変化させる位置における変異であることが好ましい。さらに、上記電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１の機能の変化は、特に限定されるものではなく、機能亢進であってもよいし、機能低下であってもよい。すなわち、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１の機能異常を示す変化であればよい。
このような変異としては、具体的には、例えば、配列番号２に示される塩基配列の第１７０２位のシトシン（Ｃ）の変異、好ましくは第１７０２位のシトシン（Ｃ）のチミン（Ｔ）への置換を挙げることができる。つまり、αサブユニット１型（ＮＣＢＩアクセション番号ＢＡＣ２１１０１）のアミノ酸配列における第５６８位のアルギニン（Ｒ）の変異、好ましくは第５６８位のアルギニン（Ｒ）のストップコドンへの変異を挙げることができる。
また、別の実施形態として、配列番号２に示される塩基配列の第３００６位のシトシン（Ｃ）の変異、好ましくは第３００６位のシトシン（Ｃ）の欠失を挙げることができる。つまり、αサブユニット１型（ＮＣＢＩアクセション番号ＢＡＣ２１１０１）のアミノ酸配列における第１００２位のアラニン（Ａ）の変異、好ましくは、フレームシフトにより第１００９位に終止コドンを生じる変異を挙げることができる。
さらに別の実施形態として、配列番号２に示される塩基配列の第４７２１位のシトシン（Ｃ）の変異、好ましくは第４７２１位のシトシン（Ｃ）のグアニン（Ｇ）への置換を挙げることができる。つまり、αサブユニット１型（ＮＣＢＩアクセション番号ＢＡＣ２１１０１）のアミノ酸配列における第１５７４位のセリン（Ｓ）の変異、好ましくは第１５７４位のセリン（Ｓ）のストップコドンへの変異を挙げることができる。
さらに別の実施形態して、配列番号２に示される塩基配列の第５０２０位のグアニン（Ｇ）の変異、好ましくは第５０２０位のグアニン（Ｇ）のシトシン（Ｃ）への置換を挙げることができる。つまり、αサブユニット１型（ＮＣＢＩアクセション番号ＢＡＣ２１１０１）のアミノ酸配列における第１６７４位のグリシン（Ｇ）の変異、好ましくは第１６７４位のグリシン（Ｇ）のアルギニン（Ｒ）への置換を挙げることができる。
また、別の実施形態として、配列番号２に示される塩基配列の第５７２６位のシトシン（Ｃ）の変異、好ましくは第５７２６位のシトシン（Ｃ）のチミン（Ｔ）への置換を挙げることができる。つまり、αサブユニット１型（ＮＣＢＩアクセション番号ＢＡＣ２１１０１）のアミノ酸配列における第１９０９位のスレオニン（Ｔ）の変異、好ましくは第１９０９位のスレオニン（Ｔ）のイソロイシン（Ｉ）への置換を挙げることができる。
電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１の機能異常にかかる変異は、上記例示的に示した変異に限定されないことはいうまでもない。
なお、本発明の判定データ取得方法において、変異の有無を検出する対象となる遺伝子は、上記のアクセション番号に登録されている塩基配列に限定されるものではない。つまり、上記例示した遺伝子がコードするタンパク質と実質的に同質の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子について、変異の有無を検出する構成も本発明に含まれる。
このような遺伝子としては、具体的には、例えば、上記のアクセション番号に登録されている塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド（遺伝子）であり、該ポリヌクレオチドの翻訳産物が電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１のサブユニットとしての機能を有する遺伝子を挙げることができる。
また、本発明にかかる判定データ取得方法においては、同じ遺伝子から生じるアイソフォームｍＲＮＡやタンパク質を変異の有無を検出する対象としてもよい。
本明細書において、「遺伝子」とは、「ポリヌクレオチド」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用されるものである。さらに、本明細書において、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ」するとは、少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、最も好ましくは少なくとも９７％の同一性が配列間に存在するときにのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」の具体的な例として、例えば、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、及び２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄する条件を挙げることができる。また、上記ハイブリダイゼーションは、J.Sambrook et al. Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2d Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory（1989）に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができ、特に限定されるものではない。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなる（ハイブリダイズし難くなる）。
「ポリヌクレオチド」はヌクレオチドの重合体を意味する。したがって、本明細書での用語「遺伝子」には、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖及びアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡやＲＮＡ（ｍＲＮＡ等）が包含される。
「ＤＮＡ」には、例えばクローニングや化学合成技術、又はそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡ等が含まれる。すなわち、ＤＮＡとは、動物のゲノム中に含まれる形態であるイントロンなどの非コード配列を含む「ゲノム」形ＤＮＡであってもよいし、また逆転写酵素やポリメラーゼを用いてｍＲＮＡを経て得られるｃＤＮＡ、すなわちイントロンなどの非コード配列を含まない「転写」形ＤＮＡであってもよい。
本発明の判定データ取得方法において、遺伝子の変異の有無を検出する方法は、特に限定されるものではなく、従来公知のあらゆる方法を用いることができる。
具体的には、例えば、ＰＣＲを利用したシークエンシング、ＳＳＣＰ（Single strand conformation polymorphism）などの変異検出法、リアルタイムＰＣＲやＤＮＡチップを用いた多型検出方法、遺伝子の各エキソンのmicro−deletionを検出する方法、ｍＲＮＡの増減を検出するNorthern blot法、ＲＴ−ＰＣＲ法, Real-time PCR法、およびｃＤＮＡアレイ法、並びに、タンパク質の増減を検出するウエスタンブロット法、免疫染色法、およびタンパクアレイ法等を挙げることができる。
ここでは、（Ａ）生体から分離された試料に含有されるゲノムＤＮＡを用いて変異を検出する実施形態、（Ｂ）生体から分離された試料に含有されるｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）を用いて変異を検出する実施形態、（Ｃ）生体から分離された試料に含有されるタンパク質を用いて変異を検出する実施形態に分けて、より具体的に説明する。
（Ａ）ゲノムＤＮＡを用いる実施形態
生体から分離された試料に含有されるゲノムＤＮＡを用いて変異を検出する実施形態では、まず、被験者から分離された試料から、従来公知の方法を用いて、ゲノムＤＮＡを抽出する。
被験者から分離された試料は、特に限定されるものではなく、ゲノムＤＮＡを抽出可能なものであればよい。具体的には、例えば、血液、骨髄液、毛髪、各臓器、末梢リンパ球、滑膜細胞を挙げることができる。また、被験者から分離した細胞を培養し、増殖したものからゲノムＤＮＡを抽出してもよい。
また、抽出したゲノムＤＮＡは、例えば、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic acid sequence based amplification）法、ＴＭＡ（Transcription-mediated amplification）法、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification）法、ＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法、およびＩＣＡＮ（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）法などの通常行われる遺伝子増幅法により増幅して用いてもよい。
こうして調製されたゲノムＤＮＡを含有する試料を用いて、変異を検出する対象となる遺伝子における変異の有無を検出する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、アリル特異的オリゴヌクレオチドプローブ法、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（Oligonucleotide Ligation Assay）法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、ＰＣＲ−ＣＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＰＨＦＡ法、インベーダー法、ＲＣＡ（Rolling Circle Amplification）法、プライマーオリゴベースエクステンション（Primer Oligo Base Extension）法等を挙げることができる。
より具体的には、例えば、ゲノムＤＮＡから、変異の有無を検出する対象となる遺伝子のエキソンを含む領域、好ましくは変異位置を含むエキソン領域、または、エキソンとイントロンとの境界領域、好ましくは変異位置を含むエキソンとイントロンとの境界領域を増幅後、得られたＰＣＲ産物をダイレクトシークエンスすることによって該遺伝子における変異の有無を検出することができる。
また、ゲノムＤＮＡを適当な制限酵素で消化し、切断されたゲノムＤＮＡ断片のサイズの違いをサザンブロッティングなどで検出することによっても、遺伝子における変異の有無を検出することができる。
また、ナトリウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群に含まれる複数の遺伝子について、変異の有無を検出する場合、マルチプレートを用いるなど、従来公知の多サンプルの処理方法を上記方法と組み合わせて用いてもよい。
また、蛍光標識したプライマーを用いて各エキソンを増幅後、ゲル電気泳動やキャピラリー電気泳動法にて各シグナルの強さを検討する方法により、エキソンの欠失を検出することも可能である。
このように、生体から分離された試料に含有されるゲノムＤＮＡを用いて、ナトリウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群における変異を検出することにより、被験者が脳炎または脳症に罹患するリスクを判定するためのデータを取得することができる。具体的には、取得されたデータにおいて、ナトリウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群に変異が見出された場合には、該被験者は脳炎または脳症に罹患する可能性が高いと判定することができる。
なお、変異の検出方法において使用されるプライマーおよびプローブは、常法により、ＤＮＡシンセサイザーなどにより作製することができる。
（Ｂ）ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）を用いる場合
生体から分離された試料に含有されるｍＲＮＡを用いて変異を検出する実施形態では、まず、被験者から分離された試料から、従来公知の方法を用いて、ｍＲＮＡを抽出する。
上記被験者から分離された試料は、特に限定されるものではなく、ｍＲＮＡを抽出可能であり、変異を検出する対象となる遺伝子を発現している、または発現している可能性があるものであればよい。
具体的には、例えば、患者の末梢血白血球細胞や皮膚線維芽細胞、口腔粘膜細胞、筋細胞が好ましい。
続いて、その抽出したｍＲＮＡから逆転写反応によってｃＤＮＡを作製する。さらに、得られたｃＤＮＡを必要に応じて、例えば、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic acid sequence based amplification）法、ＴＭＡ（Transcription-mediated amplification）法ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification）法、ＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法、およびＩＣＡＮ（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）法などの通常行われる遺伝子増幅法により増幅してもよい。
こうして調製されたｃＤＮＡを含有する試料を用いて、変異を検出する対象となる遺伝子における変異の有無を検出する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、上記ゲノムＤＮＡを用いて遺伝子の変異を検出する場合と同様の方法を用いて、変異を検出する対象となる遺伝子の変異の有無を検出することができる。
このように、生体から分離された試料に含有されるｍＲＮＡを用いて、ナトリウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群における変異を検出することにより、被験者が脳炎または脳症に罹患するリスクを判定するためのデータを取得することができる。具体的には、取得されたデータにおいて、ナトリウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群に変異が見出された場合には、該被験者は脳炎または脳症に罹患する可能性が高いと判定することができる。
（Ｃ）タンパク質を用いる場合
生体から分離された試料に含有されるタンパク質を用いて変異を検出する実施形態では、まず、被験者から分離された試料から、従来公知の方法を用いて、タンパク質を抽出する。
上記被験者から分離された試料は、特に限定されるものではなく、タンパク質を抽出可能であり、変異を検出する対象となる遺伝子の翻訳産物（換言すれば、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１）を発現している、または発現している可能性があるものであればよい。
こうして調製されたタンパク質を含有する試料を用いて、変異を検出する対象となる遺伝子における変異の有無を検出する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、変異を検出する対象となる遺伝子の翻訳産物（タンパク質）について、特定の変異をもつポリペプチドのみを特異的に認識する抗体を作製し、該抗体を用いたＥＬＩＳＡ法やウエスタンブロット法により変異を検出することができる。なお、本明細書において、用語「タンパク質」は、「ポリペプチド」又は「ペプチド」と交換可能に使用される。
また、上記タンパク質を含有する試料から、変異を検出する対象となる遺伝子の翻訳産物（タンパク質）を単離し、直接または必要に応じ、酵素等で切断し、プロテインシークエンサーや、質量分析装置を利用して変異を検出することができる。
さらに、上記タンパク質を含有する試料から、変異を検出する対象となる遺伝子の翻訳産物（タンパク質）を単離し、該ポリペプチドの等電点に基づいて、変異を検出することもできる。
このように、生体から分離された試料に含有されるタンパク質を用いて、ナトリウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群における変異を検出することにより、被験者が脳炎または脳症に罹患するリスクを判定するためのデータを取得することができる。具体的には、取得されたデータにおいて、変異を検出する対象となる遺伝子の翻訳産物（タンパク質）に変異が見出された場合には、該被験者は脳炎または脳症に罹患する可能性が高いと判定することができる。
本発明の判定データ取得方法は、上説した構成を備えているため、該判定データ取得方法により取得したデータによれば、被験者が脳炎または脳症に罹患するリスクの可能性を事前に診断することができる。
そのため、本発明の判定データ取得方法によれば、脳炎または脳症による死亡率や後遺症の成績を向上させることができる。また、家族の精神的負担や経済的負担を軽減し、さらには適切な治療を施すことによって医療費を削減することができる。
＜ＩＩ．脳炎または脳症の罹患リスク判定キット＞
本発明には、本発明の判定データ取得方法を用いて、脳炎または脳症の罹患リスクを判定するためのデータを取得するために用いる脳炎または脳症の罹患リスク判定キット（以下、単に「本発明の判定キット」ともいう）も含まれる。
本発明の判定キットは、具体的には、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１を構成するサブユニットをコードする遺伝子群（すなわち、ナトリウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群）のうち、少なくとも１つの遺伝子における変異の有無を検出するための試薬を少なくとも含んでいればよく、その他の具体的な構成は特に限定されるものではない。
ナトリウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群における変異の有無を検出するための試薬としては、例えば、プライマー、プローブ、および抗体などを挙げることができる。これらの試薬は、単独で含まれてもよく、また、複数の組み合わせで含まれていてもよい。さらに、上記判定キットは、上記例示する試薬以外のその他の試薬を含んでいてもよい。
具体的には、ゲノムＤＮＡを用いて、ナトリウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群における変異の有無を検出するキットとしては、ナトリウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群のうち、少なくとも１つの遺伝子のエキソン領域もしくはエキソンとイントロンとの境界領域、またはそれらの一部を増幅できるように設計されたプライマーや、変異型または野生型の一方のエキソン領域もしくはエキソンとイントロンとの境界領域、またはそれらの一部（換言すれば、特定の遺伝子型のエキソンもしくはエキソンとイントロンとの境界領域、またはそれらの一部）のみを特異的に検出できるように設計されたプローブを含む構成を挙げることができる。
上記プライマーおよびプローブの配列は特に限定されるものではないが、例えば、プライマーとしては、後述の実施例で用いたプライマーを挙げることができる。ただし、本発明は、後述の実施例に限定されないことはいうまでもない。
さらに、このような判定キットでは、上記プライマーやプローブに加えて、ＰＣＲ法やサザンブロット法、核酸シークエンシングに用いられる試薬など、上記遺伝子における変異の有無を検出するために必要な試薬を１つ以上組み合わせて含む構成とすることもできる。
なお、上記試薬は、本発明の検出方法に応じて適宜選択採用されるが、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ＤＮＡ合成酵素等を挙げることができる。さらに、ＰＣＲ法やサザンブロット法、核酸シークエンシングに用いることが可能な適当な緩衝液および洗浄液等が含まれていてもよい。
また、ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）または全ＲＮＡを用いて、ナトリウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群における変異の有無を検出するキットとしては、上記遺伝子群のうち、少なくとも１つの遺伝子のｃＤＮＡまたはその一部の領域を増幅できるように設計されたプライマーや、変異型または野生型の一方のｍＲＮＡもしくはその一部（換言すれば、特定の遺伝子型のｍＲＮＡまたはその一部）のみを特異的に検出できるように設計されたプローブを含む構成を挙げることができる。
さらに、このような判定キットでは、上記プライマーやプローブに加えて、ＲＴ−ＰＣＲ法やノザンブロット法、核酸シークエンシングに用いられる試薬など、上記遺伝子における変異の有無を検出するために必要な試薬を１つ以上組み合わせて含む構成とすることもできる。
なお、上記試薬は、本発明の検出方法に応じて適宜選択採用されるが、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ＤＮＡ合成酵素等を挙げることができる。さらに、ＲＴ−ＰＣＲ法やノザンブロット法、核酸シークエンシングに用いることが可能な適当な緩衝液および洗浄液等が含まれていてもよい。
また、タンパク質レベルでナトリウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群における変異の有無を検出するキットとしては、例えば、該遺伝子群の翻訳産物であるポリペプチド（タンパク質）のうち、野生型または変異型のポリペプチドもしくはその一部の一方のみに特異的に結合する抗体（換言すれば、特定の遺伝子型の翻訳産物であるポリペプチドまたはその一部のみに特異的に結合する抗体）を含むキット等が挙げられる。
さらに、このような判定キットでは、上記抗体に加えて、ＥＬＩＳＡ法や、ウエスタンブロット法、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１の活性測定に用いられる試薬など、上記遺伝子における変異（換言すれば、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１における変異）の有無を検出するために必要な試薬を１つ以上組み合わせて含む構成とすることもできる。
また、本発明の判定キットは、上記例示した構成物をどのように組み合わせて含んでいてもよい。
上説したような本発明の判定キットを用いることにより、被験者が脳炎または脳症に罹患するリスクを、脳炎または脳症の罹患前に判定するためのデータを取得することができる。
本発明の判定キットが適用される被験者は、特に限定されるものではないが、乳幼児、または小児に適用することが好ましい。
＜ＩＩＩ．脳炎または脳症の治療薬剤のスクリーニング細胞およびその製造方法＞
本発明によれば、培養細胞において、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１を構成するサブユニットをコードする遺伝子群に含まれる少なくとも１つの遺伝子にアミノ酸変化を伴う変異を導入することにより、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１の活性が変化した細胞を製造することができる。
換言すれば、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１のサブユニットをコードする遺伝子群の少なくとも１つの遺伝子にアミノ酸変化を伴う変異が導入された形で、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１を構成するサブユニットをコードする遺伝子群が発現する培養細胞を製造することができる。
このような細胞は、脳炎または脳症の治療薬剤のスクリーニングに好適に用いることができる。つまり、このような細胞は、治療薬剤のスクリーニング細胞ということができる。
したがって、本発明には、このような脳炎または脳症の治療薬剤のスクリーニング細胞（以下、単に「スクリーニング細胞」ともいう）およびその製造方法も含まれる。
本発明にかかるスクリーニング細胞は、具体的には、ナトリウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群の少なくとも１つの遺伝子にアミノ酸変化を伴う変異を有する細胞である。
例えば、変異型の電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１を発現するように、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１を構成するサブユニットをコードする遺伝子群の少なくとも１つの遺伝子にアミノ酸変化を伴う変異が導入されている細胞が挙げられる。
このような細胞では、変異型の電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１が発現しており、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１の機能が変化している。この機能変化は特に限定されるものではない。
上記遺伝子群におけるこのような変異および変異を導入する遺伝子については、＜Ｉ．脳炎または脳症の罹患リスク判定データの取得方法＞で説明した通りであるので、ここでは、詳細な説明は省略する。
本明細書において、「治療薬剤のスクリーニング細胞」とは、ヒトの疾患に対する予防法または治療法を開発するために用いられる実験用培養細胞をいい、具体的には、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、サルなどの哺乳動物、およびその他の脊椎動物が挙げられる。
本発明にかかる脳炎または脳症の治療薬剤のスクリーニング細胞の製造方法は、上記の特性を有する細胞を製造する方法であり、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１を構成するサブユニットをコードする遺伝子群に含まれる少なくとも１つの遺伝子にアミノ酸変化を伴う変異を導入する工程を含んでいればよい。
より具体的には、以下の３つの実施形態を挙げることができる。ここでは、以下の３つの実施形態について具体的に説明するが、本発明はこれに限定されない。
（１）発現ベクター等を用いる方法
この方法では、まず、ナトリウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群（αサブユニット１型、β１サブユニット、およびβ２サブユニット）のうち、少なくとも１つの遺伝子にはアミノ酸変化を伴う変異を含んでいる遺伝子群を、発現ベクター等を用いて、宿主となる培養細胞内において発現させる。これにより、本発明にかかるスクリーニング細胞を製造することができる。
このとき、宿主となる培養細胞は電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１が発現していない細胞であることが好ましい。このような細胞によれば、内在の電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１の影響を受けることがない。
なお、本方法において、その他の具体的な工程、材料、条件、使用装置、および使用機器等については、特に限定されるものではない。
（２）人為的な変異導入を用いる方法
この方法では、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１を発現している培養細胞に、ナトリウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群のうち、少なくとも１つの遺伝子にアミノ酸変化を伴う変異を導入する。これにより、本発明にかかるスクリーニング細胞を製造することができる。
上記培養細胞に変異を導入する方法は、特に限定されるものではなく、従来公知の遺伝子操作技術を適宜組み合わせて用いればよい。
（３）モデル動物を用いる方法
この方法では、まず、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１を構成するサブユニットをコードする遺伝子群に含まれる少なくとも１つの遺伝子にアミノ酸変化を伴う変異を有するモデル動物を作製する。次に、該モデル動物から組織を摘出し、その組織から培養細胞を作製する。これにより、本発明にかかるスクリーニング細胞を製造することができる。
上記モデル動物は、ナトリウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群のうち、少なくとも１つの遺伝子に変異が導入されているため、脳炎または脳症を発症する。すなわち、上記モデル動物は、脳炎または脳症を人為的に発症させた脳炎または脳症の発症モデル動物ということができる。
本発明には、このようなモデル動物、すなわち、脳炎または脳症の発症モデル動物、およびその製造方法も含まれる。
本発明にかかる脳炎または脳症の発症モデル動物は、具体的には、ナトリウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群の少なくとも１つの遺伝子にアミノ酸変化を伴う変異を有する。該脳炎または脳症の発症モデル動物は、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１の機能に異常があることが好ましい。
上記遺伝子群におけるこのような変異および変異を導入する遺伝子については、＜Ｉ．脳炎または脳症の罹患リスク判定データの取得方法＞で説明した通りであるので、ここでは、詳細な説明は省略する。
本明細書において、「モデル動物」とは、ヒトの疾患に対する予防法または治療法を開発するために用いられる実験動物をいい、具体的には、マウス、ラット、ウサギ、サル、ヤギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、イヌなどの非ヒト哺乳動物、およびその他の脊椎動物が挙げられる。
本発明にかかる脳炎または脳症の発症モデル動物の製造方法は、ナトリウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群の少なくとも１つの遺伝子にアミノ酸変化を伴う変異が導入されるように、モデル動物の上記遺伝子群を操作する工程を含んでいればよく、その他の具体的な工程、材料、条件、使用装置、および使用機器等については、特に限定されるものではない。
本明細書において、「モデル動物の遺伝子を操作する」とは、従来公知の遺伝子操作技術を用いて、モデル動物の遺伝子を操作することが意図される。具体的には、モデル動物の遺伝子を破壊したり、当該遺伝子に変異を導入したり、当該遺伝子を変異型遺伝子で置換したり、さらには、当該モデル動物に外来遺伝子を導入したり、モデル動物を交雑したりすることをすべて包含する意味である。
本発明にかかる脳炎または脳症の発症モデル動物の製造方法によれば、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１を構成するサブユニットをコードする遺伝子群の少なくとも１つの遺伝子にアミノ酸変化を伴う変異が導入されるように、モデル動物の上記遺伝子群を操作することにより、脳炎または脳症を発症したモデル動物を製造することができる。
＜ＩＶ．脳炎または脳症の治療薬剤のスクリーニング方法＞
本発明にかかるスクリーニング細胞、および脳炎または脳症の発症モデル動物は、新たな脳炎または脳症の治療方法や治療薬剤の開発に用いることができる。したがって、本発明には、脳炎または脳症の治療薬の治療薬剤をスクリーニングする脳炎または脳症の治療薬剤のスクリーニング方法（以下、単に「スクリーニング方法」ともいう）が含まれる。
ここでは、本発明にかかるスクリーニング方法の一実施形態として、本発明にかかるスクリーニング細胞を用いる実施形態と、本発明にかかる脳炎または脳症の発症モデル動物を用いる実施形態について説明するが、本発明はこれに限定されない。
すなわち、例えば、本発明にかかる脳炎または脳症の発症モデル動物に代えて、他の脳炎または脳症の発症モデル動物を用いる実施形態とすることもできる。
（１）本発明にかかるスクリーング細胞を用いる場合
本発明にかかるスクリーニング細胞に候補薬剤を投与する工程と、該候補薬剤が投与された脳炎または脳症の治療薬剤のスクリーニング細胞において、ナトリウムイオンチャネルの活性が変化したかを判定する工程とを少なくとも含む。
つまり、本実施形態にかかるスクリーニング方法によれば、本発明にかかるスクリーニング細胞に候補薬剤を投与し、当該候補薬剤を投与されたスクリーニング細胞におけるナトリウムイオンチャネルの活性が変化していることを指標として、上記候補薬剤が脳炎または脳症の治療薬剤となりうるかを判定することができる。
上記候補薬剤は、特に限定されるものではないが、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１の発現に影響を及ぼすことが期待される化合物、または電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１の活性に影響を及ぼすことが期待される化合物（例えば、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１に対する阻害剤や阻害剤の候補物質、または作動薬や作動薬の候補物質）であることが好ましい。
また、上記候補薬剤は、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１を構成するサブユニットをコードする遺伝子群から選択される少なくとも１つの遺伝子もしくはその核酸配列の一部からなるポリヌクレオチドを含む発現プラスミドベクターもしくはウイルスベクターであってもよい。
このような候補薬剤を本発明にかかるスクリーニング細胞に投与する方法は、特に限定されるものではなく、その候補薬剤の物性等に応じて、それに適した方法を従来公知のものから選択して用いればよい。
また、該候補薬剤が投与されたスクリーニング細胞における電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１の活性が変化したか否かを判定する方法は特に限定されるものではなく、電気生理学的測定機器や蛍光色素観察機器などを用いて判定すればよい。
（２）本発明にかかる脳炎または脳症の発症モデル動物を用いる場合
本発明にかかる脳炎または脳症の発症モデル動物に候補薬剤を投与する工程と、該候補薬剤が投与された脳炎または脳症の発症モデル動物の脳炎または脳症が治癒または改善されたか否かを判定する工程とを含んでいればよい。つまり、本発明にかかる脳炎または脳症の治療薬剤のスクリーニング方法によれば、脳炎または脳症の発症モデル動物に候補薬剤を投与し、当該候補薬剤を投与された脳炎または脳症の発症モデル動物において、脳炎または脳症が治癒または改善していることを指標として、上記候補薬剤が脳炎または脳症の治療薬剤となりうるかを判定することができる。
上記候補薬剤は、特に限定されるものではなく、（１）本発明にかかるスクリーング細胞を用いる場合と同様の物質を挙げることができる。
このような候補薬剤を本発明にかかる脳炎または脳症発症モデル動物に投与する方法は、特に限定されるものではなく、その候補薬剤の物性等に応じて、それに適した方法を従来公知のものから選択して用いればよい。
また、該候補薬剤が投与された脳炎または脳症の発症モデル動物の脳炎または脳症が治癒または改善されたか否かを判定する方法は特に限定されるものではなく、脳炎または脳症に特徴的症状を指標に判定すればよい。
＜Ｖ．熱性けいれんのてんかんへの移行リスク判定データの取得方法＞
本発明にかかる熱性けいれんのてんかんへの移行リスク判定データの取得方法は、熱性けいれん既往者である被験者から分離した試料を用いて、該被験者がてんかん患者へ移行するリスクを判定するためのデータを取得するための方法である。
上記被験者は、熱性けいれんの既往者であれば特に限定されるものではないが、小児には約８％の高い確率で熱性けいれんが発症し、大多数は６歳までに治癒することに鑑み、生後６歳未満の小児であることが好ましく、１歳未満に熱性けいれんを発症した者の中に、６歳以降もてんかんが持続する難治性てんかん患者が含まれることが多いため、１歳未満の小児であることが好ましい。
本明細書において、「熱性けいれん」とは、発熱によって起こるけいれん発作が意図される。例えば、感冒などのウイルス感染や細菌感染などによる３８℃以上の発熱に伴って１−５分持続する全身のけいれんを挙げることができる。また、本明細書において、「てんかん」とは、発熱とは無関係に生じうる慢性的なけいれん発作が意図される。
本発明の判定データ取得方法は、具体的には、生体から分離した試料を用いて、ナトリウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群に含まれる少なくとも１つの遺伝子について、アミノ酸変化を伴う変異の有無を検出する工程を含んでいればよく、その他の具体的な構成は特に限定されない。
本発明の判定データ取得方法は、具体的には、例えば、上記変異を検出するために、上記生体から分離した試料を前処理する工程等を含んでいてもよい。
本発明の判定データ取得方法では、上記例示したようなナトリウムイオンチャネルを構成する各サブユニットをコードする遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子について、アミノ酸変化を伴う変異の有無を検出すればよい。
具体的には、少なくともαサブユニット１型をコードする遺伝子について、上記変異を検出することが好ましい。
上記構成によれば、熱性けいれんのてんかんへの移行リスクを精度よく判定することを可能にするデータを取得することができる。
また、上記変異を検出する対象遺伝子は、１つであってもよいが、複数であることが好ましい。このような構成によれば、熱性けいれんのてんかんへの移行リスクをより高精度に判定することを可能にするデータを取得することができる。
上記ナトリウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群に含まれる遺伝子において検出する変異は、アミノ酸変化を伴うものであればよく、その具体的な変異は特に限定されるものではない。具体的には、変異には、ミスセンス変異（アミノ酸が置換する）、ナンセンス変異（アミノ酸合成が途中で止まる）、フレームシフト（塩基の挿入、欠失によりアミノ酸コドンのフレームがずれ、変異位置より下流のアミノ酸配列が変化し、本来の機能を有しない）、スプライシング異常（該当エキソン領域の欠失等）、少数塩基挿入または欠失（一部のアミノ酸が新生、脱落するが下流は正常アミノ酸のまま合成）、エキソン領域微小欠失（エキソンが１つもしくは複数欠損）が含まれる。また、変異は、遺伝子多型であってもよい。
上記遺伝子における変異の位置は特に限定されるものではないが、ナトリウムイオンチャネルの機能（換言すれば、活性）を変化させる位置における変異であることが好ましい。さらに、上記電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１の機能の変化は、特に限定されるものではなく、機能亢進であってもよいし、機能低下であってもよい。すなわち、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１の機能異常を示す変化であればよい。
このような変異としては、具体的には、例えば、配列番号２に示される塩基配列の第４７２３位のシトシン（Ｃ）の変異、好ましくは第４７２３位のシトシン（Ｃ）がチミン（Ｔ）に置換された変異（Ｃ４７２３Ｔ）を挙げることができる。つまり、αサブユニット１型（ＮＣＢＩアクセション番号ＢＡＣ２１１０１）のアミノ酸配列における第１５７５位のアルギニン（Ｒ）の変異、好ましくは第１５７５位のアルギニン（Ｒ）のシステイン（Ｃ）への変異（Ｒ１５７５Ｃ）を挙げることができる。
また、別の実施形態として、配列番号２に示される塩基配列の第４８４７位のチミン（Ｔ）の変異、好ましくは第４８４７位のチミン（Ｔ）がシトシン（Ｃ）に置換された変異（Ｔ４８４７Ｃ）を挙げることができる。つまり、αサブユニット１型（ＮＣＢＩアクセション番号ＢＡＣ２１１０１）のアミノ酸配列における第１６１６位のイソロイシン（Ｉ）の変異、好ましくは第１６１６位のイソロイシン（Ｉ）のスレオニン（Ｔ）への変異（Ｉ１６１６Ｔ）を挙げることができる。
さらに別の実施形態として、配列番号２に示される塩基配列の第５３０５位のチミン（Ｔ）の変異、好ましくは第５３０５位のチミン（Ｔ）がシトシン（Ｃ）に置換された変異（Ｔ５３０５Ｃ）を挙げることができる。つまり、αサブユニット１型（ＮＣＢＩアクセション番号ＢＡＣ２１１０１）のアミノ酸配列における第１７６９位のチロシン（Ｙ）の変異、好ましくは第１７６９位のチロシン（Ｙ）のヒスチジン（Ｈ）への変異（Ｙ１７６９Ｈ）を挙げることができる。
さらに別の実施形態として、配列番号２に示される塩基配列の第５５６７位のチミン（Ｔ）の変異、好ましくは第５５６７位のチミン（Ｔ）がシトシン（Ｃ）に置換された変異（Ｔ５５６７Ｃ）を挙げることができる。つまり、αサブユニット１型（ＮＣＢＩアクセション番号ＢＡＣ２１１０１）のアミノ酸配列における第１８５６位のメチオニン（Ｍ）の変異、好ましくは第１８５６位のメチオニン（Ｍ）のスレオニン（Ｔ）への変異（Ｍ１８５６Ｔ）を挙げることができる。
さらに別の実施形態として、配列番号２に示される塩基配列の第４８８位のグアニン（Ｇ）の変異、好ましくは第４８８位のグアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）に置換された変異（Ｇ４８８Ａ）を挙げることができる。つまり、αサブユニット１型（ＮＣＢＩアクセション番号ＢＡＣ２１１０１）のアミノ酸配列における第１６３位のグリシン（Ｇ）の変異、好ましくは第１６３位のグリシン（Ｇ）のグルタミン酸（Ｅ）への変異（Ｇ１６３Ｅ）を挙げることができる。
さらに別の実施形態として、配列番号２に示される塩基配列の第４６１５位のアデニン（Ａ）の変異、好ましくは第４６１５位のアデニン（Ａ）がシトシン（Ｃ）に置換された変異（Ａ４６１５Ｃ）を挙げることができる。つまり、αサブユニット１型（ＮＣＢＩアクセション番号ＢＡＣ２１１０１）のアミノ酸配列における第１５３９位のスレオニン（Ｔ）の変異、好ましくは第１５３９位のスレオニン（Ｔ）のプロリン（Ｐ）への変異（Ｔ１５３９Ｐ）を挙げることができる。
さらに別の実施形態として、配列番号２に示される塩基配列の第４２８４位と４２８５位との間のゲノムＤＮＡに存在するイントロン２１のうち、最後から２つ目の位置（-２位）のアデニン（Ａ）の変異、好ましくはイントロン２１の最後から２つ目の位置（-２位）のアデニン（Ａ）がグアニン（Ｇ）に置換された変異（イントロン２１ ａｇ（−２）ｇｇ）を挙げることができる。つまり、αサブユニット１型（ＮＣＢＩアクセション番号ＢＡＣ２１１０１）のアミノ酸配列における第１４２９位以降のスプライシング異常、好ましくは第１４２９位以降の欠失を挙げることができる。
配列番号２に示される塩基配列の第４２８４（エキソン２１）と４２８５位（エキソン２２）の間のゲノムＤＮＡに存在するイントロン２１の最後から２つの塩基配列はａｇであり、エキソン２２の始めにつながる。一般的に、イントロン２１の上記ａｇはスプライシングを受ける認識配列であるため、ここに異常があると、イントロンがまだ続いているとみなされ、その直後のエキソン（もしくはその下流）は異常なスプライシングを生じてしまい、全長蛋白ができなくなってしまう。
さらに、別の実施形態として、配列番号２に示される塩基配列の第３００６位のシトシン（Ｃ）の変異、好ましくは第３００６位のシトシン（Ｃ）の欠失（Ｃ３００６ｄｅｌ）を挙げることができる。つまり、αサブユニット１型（ＮＣＢＩアクセション番号ＢＡＣ２１１０１）のアミノ酸配列における第１００２位のアラニン（Ａ）の変異、好ましくは、フレームシフトにより第１００９位に終止コドンを生じる変異（A1002fsX1009）を挙げることができる。
さらに別の実施形態として、配列番号２に示される塩基配列の第４１６８位のグアニン（Ｇ）の変異、好ましくは第４１６８位のグアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）に置換された変異（Ｇ４１６８Ａ）を挙げることができる。つまり、αサブユニット１型（ＮＣＢＩアクセション番号ＢＡＣ２１１０１）のアミノ酸配列における第１３９０位のバリン（Ｖ）の変異、好ましくは第１３９０位のバリン（Ｖ）のメチオニン（Ｍ）への変異（Ｖ１３９０Ｍ）を挙げることができる。
さらに、別の実施形態として、配列番号２に示される塩基配列の第４２８６位から第４２９０位間の５塩基ＣＣＡＣＡの変異、好ましくは第４２８６位から第４２９０位間のＣＣＡＣＡのＡＴＧＴＣＣへの置換を挙げることができる。つまり、αサブユニット１型（ＮＣＢＩアクセション番号ＢＡＣ２１１０１）のアミノ酸配列における第１４２９位のアラニン（Ａ）の変異、好ましくは、フレームシフトにより第１４４３位に終止コドンを生じる変異（A1429fsX1443）を挙げることができる。
さらに別の実施形態として、配列番号２に示される塩基配列の第２７０５位のチミン（Ｔ）の変異、好ましくは第２７０５位のチミン（Ｔ）がグアニン（Ｇ）に置換された変異（Ｔ２７０５Ｇ）を挙げることができる。つまり、αサブユニット１型（ＮＣＢＩアクセション番号ＢＡＣ２１１０１）のアミノ酸配列における第９０２位のフェニルアラニン（Ｆ）の変異、好ましくは第９０２位のフェニルアラニン（Ｆ）のシステイン（Ｃ）への変異（Ｆ９０２Ｃ）を挙げることができる。
さらに別の実施形態として、配列番号２に示される塩基配列の第４７２１位のシトシン（Ｃ）の変異、好ましくは第４７２１位のシトシン（Ｃ）のグアニン（Ｇ）への置換（Ｃ４７２１Ｇ）を挙げることができる。つまり、αサブユニット１型（ＮＣＢＩアクセション番号ＢＡＣ２１１０１）のアミノ酸配列における第１５７４位のセリン（Ｓ）の変異、好ましくは第１５７４位のセリン（Ｓ）のストップコドンへの変異（Ｓ１５７４Ｘ）を挙げることができる。
さらに別の実施形態として、配列番号２に示される塩基配列の第３８２９位のシトシン（Ｃ）の変異、好ましくは第３８２９位のシトシン（Ｃ）のチミン（Ｔ）への置換（Ｃ３８２９Ｔ）を挙げることができる。つまり、αサブユニット１型（ＮＣＢＩアクセション番号ＢＡＣ２１１０１）のアミノ酸配列における第１２７７位のグルタミン（Ｑ）の変異、好ましくは第１２７７位のグルタミン（Ｑ）のストップコドンへの変異（Ｑ１２７７Ｘ）を挙げることができる。
さらに別の実施形態として、配列番号２に示される塩基配列の第３８６７位のシトシン（Ｃ）、第３８６８位のチミン（Ｔ）および第３８６９位のチミン（Ｔ）の変異、好ましくは第３８６７位のシトシン（Ｃ）、第３８６８位のチミン（Ｔ）および第３８６９位のチミン（Ｔ）の欠失を挙げることができる。つまり、αサブユニット１型（ＮＣＢＩアクセション番号ＢＡＣ２１１０１）のアミノ酸配列における第１２８９位のフェニルアラニン（Ｆ）の変異、好ましくは第１２８９位のフェニルアラニン（Ｆ）欠失（Ｆ１２８９ｄｅｌ）を挙げることができる。
さらに別の実施形態として、配列番号２に示される塩基配列の第５２９位のグアニン（Ｇ）の変異、好ましくは５２９位のグアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）に置換された変異（Ｇ５２９Ａ）を挙げることができる。つまり、αサブユニット１型（ＮＣＢＩアクセション番号ＢＡＣ２１１０１）のアミノ酸配列における第１７７位のグリシン（Ｇ）の変異、好ましくは第１７７位のグリシン（Ｇ）のアルギニン（Ｒ）への変異（Ｇ１７７Ｒ）を挙げることができる。
さらに別の実施形態として、配列番号２に示される塩基配列の第３７９４位のチミン（Ｔ）の変異、好ましくは第３７９４位のチミン（Ｔ）がシトシン（Ｃ）に置換された変異（Ｔ３７９４Ｃ）を挙げることができる。つまり、αサブユニット１型（ＮＣＢＩアクセション番号ＢＡＣ２１１０１）のアミノ酸配列における第１２６５位のロイシン（Ｌ）の変異、好ましくは第１２６５位のロイシン（Ｌ）のプロリン（Ｐ）への変異（Ｌ１２６５Ｐ）を挙げることができる。
さらに別の実施形態として、配列番号２に示される塩基配列の第２９７０位のグアニン（Ｇ）の変異、好ましくは第２９７０位のグアニン（Ｇ）がチミン（Ｔ）に置換された変異（Ｇ２９７０Ｔ）を挙げることができる。つまり、αサブユニット１型（ＮＣＢＩアクセション番号ＢＡＣ２１１０１）のアミノ酸配列における第９９０位のロイシン（Ｌ）の変異、好ましくは第９９０位のロイシン（Ｌ）のフェニルアラニン（Ｆ）への変異（Ｌ９９０Ｆ）を挙げることができる。
さらに別の実施形態として、配列番号２に示される塩基配列の第４３４９位のアデニン（Ａ）の変異、好ましくは第４３４９位のアデニン（Ａ）がグアニン（Ｇ）に置換された変異（Ａ４３４９Ｇ）を挙げることができる。つまり、αサブユニット１型（ＮＣＢＩアクセション番号ＢＡＣ２１１０１）のアミノ酸配列における第１４５０位のグルタミン（Ｑ）の変異、好ましくは第１４５０位のグルタミン（Ｑ）のアルギニン（Ｒ）への変異（Ｑ１４５０Ｒ）を挙げることができる。
また、別の実施形態として、配列番号２に示される塩基配列の第３２４５位のシトシン（Ｃ）の変異、好ましくは第３２４５位のシトシン（Ｃ）の欠失（Ｃ３２４５ｄｅｌ）を挙げることができる。つまり、αサブユニット１型（ＮＣＢＩアクセション番号ＢＡＣ２１１０１）のアミノ酸配列における第１０８２位のスレオニン（Ｔ）の変異、好ましくは、フレームシフトにより第１０８６位に終止コドンを生じる変異を挙げることができる。
また、別の実施形態として、配列番号２に示される塩基配列の第５７２６位のシトシン（Ｃ）の変異、好ましくは第５７２６位のシトシン（Ｃ）のチミン（Ｔ）への置換（Ｃ５７２６Ｔ）を挙げることができる。つまり、αサブユニット１型（ＮＣＢＩアクセション番号ＢＡＣ２１１０１）のアミノ酸配列における第１９０９位のスレオニン（Ｔ）の変異、好ましくは第１９０９位のスレオニン（Ｔ）のイソロイシン（Ｉ）への置換（Ｔ１９０９Ｉ）を挙げることができる。
また、別の実施形態として、配列番号２に示される塩基配列の第２７９１位のシトシン（Ｃ）の変異、好ましくは第２７９１位のシトシン（Ｃ）のチミン（Ｔ）への置換（Ｃ２７９１Ｔ）を挙げることができる。つまり、αサブユニット１型（ＮＣＢＩアクセション番号ＢＡＣ２１１０１）のアミノ酸配列における第９３１位のアルギニン（Ｒ）の変異、好ましくは第９３１位のアルギニン（Ｒ）のシステイン（Ｃ）への置換（Ｒ９３１Ｃ）を挙げることができる。
また、別の実施形態として、配列番号２に示される塩基配列の第２２１３位のグアニン（Ｇ）の変異、好ましくは第２２１３位のグアニン（Ｇ）の欠失（Ｇ２２１３ｄｅｌ）を挙げることができる。つまり、αサブユニット１型（ＮＣＢＩアクセション番号ＢＡＣ２１１０１）のアミノ酸配列における第７３８位のトリプトファン（Ｗ）の変異、好ましくは、フレームシフトにより第７４６位に終止コドンを生じる変異（W738fsX746）を挙げることができる。
また、別の実施形態として、配列番号２に示される塩基配列の第５６４０位から第
５６４５位間の６塩基ＡＧＡＧＡＴの変異、好ましくは第５６４０位から第５６４５位間の６塩基ＡＧＡＧＡＴのＣＴＡＧＡＧＴＡへの置換を挙げることができる。つまり、αサブユニット１型（ＮＣＢＩアクセション番号ＢＡＣ２１１０１）のアミノ酸配列における第１８８０位のグリシン（Ｇ）の変異、好ましくは、フレームシフトにより第１８８１位に終止コドンを生じる変異（G1880fsX1881）を挙げることができる。
さらに別の実施形態として、配列番号２に示される塩基配列の第２１３４位のシトシン（Ｃ）の変異、好ましくは第２１３４位のシトシン（Ｃ）のチミン（Ｔ）への置換（Ｃ２１３４Ｔ）を挙げることができる。つまり、αサブユニット１型（ＮＣＢＩアクセション番号ＢＡＣ２１１０１）のアミノ酸配列における第７１２位のアルギニン（Ｒ）の変異、好ましくは第７１２位のアルギニン（Ｒ）のストップコドンへの変異（Ｒ７１２Ｘ）を挙げることができる。
さらに別の実施形態として、配列番号２に示される塩基配列の第４７２１位のシトシン（Ｃ）の変異、好ましくは第４７２１位のシトシン（Ｃ）のグアニン（Ｇ）への置換（Ｃ４７２１Ｇ）を挙げることができる。つまり、αサブユニット１型（ＮＣＢＩアクセション番号ＢＡＣ２１１０１）のアミノ酸配列における第１５７４位のセリン（Ｓ）の変異、好ましくは第１５７４位のセリン（Ｓ）のストップコドンへの変異（Ｓ１５７４Ｘ）を挙げることができる。
さらに別の実施形態として、配列番号２に示される塩基配列の第５０２０位のグアニン（Ｇ）の変異、好ましくは第５０２０位のグアニン（Ｇ）のシトシン（Ｃ）への置換（Ｇ５０２０Ｃ）を挙げることができる。つまり、αサブユニット１型（ＮＣＢＩアクセション番号ＢＡＣ２１１０１）のアミノ酸配列における第１６７４位のグリシン（Ｇ）の変異、好ましくは第１６７４位のグリシン（Ｇ）のアルギニン（Ｒ）への置換（Ｇ１６７４Ｒ）を挙げることができる。
さらに別の実施形態として、配列番号２に示される塩基配列の第５０５４位のシトシン（Ｃ）の変異、好ましくは第５０５４位のシトシン（Ｃ）のアデニン（Ａ）への置換（Ｃ５０５４Ａ）を挙げることができる。つまり、αサブユニット１型（ＮＣＢＩアクセション番号ＢＡＣ２１１０１）のアミノ酸配列における第１６８５位のアラニン（Ａ）の変異、好ましくは第１６８５位のアラニン（Ａ）のアスパラギン酸（Ｄ）への置換（Ａ１６８５Ｄ）を挙げることができる。
さらに別の実施形態として、配列番号２に示される塩基配列の第３０７９位のアデニン（Ａ）の変異、好ましくは第３０７９位のアデニン（Ａ）のチミン（Ｔ）への置換（Ａ３０７９Ｔ）を挙げることができる。つまり、αサブユニット１型（ＮＣＢＩアクセション番号ＢＡＣ２１１０１）のアミノ酸配列における第１０２７位のリシン（Ｋ）の変異、好ましくは第１０２７位のリシン（Ｋ）のストップコドンへの変異（Ｋ１０２７Ｘ）を挙げることができる。
また、別の実施形態として、配列番号２に示される塩基配列の第１６４１位の変異、好ましくは第１６４１位へのアデニン（Ａ）の挿入（１６４１ｉｎｓＡ）を挙げることができる。つまり、αサブユニット１型（ＮＣＢＩアクセション番号ＢＡＣ２１１０１）のアミノ酸配列における第５４７位のリシン（Ｋ）の変異、好ましくは、フレームシフトにより第５７０位に終止コドンを生じる変異（K547fsX570）を挙げることができる。
さらに、別の実施形態として、配列番号２に示される塩基配列の第２１２０位のシトシン（Ｃ）の変異、好ましくは第２１２０位のシトシン（Ｃ）の欠失（Ｃ２１２０ｄｅｌ）を挙げることができる。つまり、αサブユニット１型（ＮＣＢＩアクセション番号ＢＡＣ２１１０１）のアミノ酸配列における第７０７位のプロリン（Ｐ）の変異、好ましくは、フレームシフトにより第７１４位に終止コドンを生じる変異（P707fsX714）を挙げることができる。
さらに別の実施形態として、配列番号２に示される塩基配列の第４９４２位のシトシン（Ｃ）の変異、好ましくは第４９４２位のシトシン（Ｃ）のチミン（Ｔ）への置換（Ｃ４９４２Ｔ）を挙げることができる。つまり、αサブユニット１型（ＮＣＢＩアクセション番号ＢＡＣ２１１０１）のアミノ酸配列における第１６４８位のアルギニン（Ｒ）の変異、好ましくは第１６４８位のアルギニン（Ｒ）のシステイン（Ｃ）への置換（Ｒ１６４８Ｃ）を挙げることができる。
さらに別の実施形態として、配列番号２に示される塩基配列の第１１３０位のグアニン（Ｇ）の変異、好ましくは第１１３０位のグアニン（Ｇ）のチミン（Ｔ）への置換（Ｇ１１３０Ｔ）を挙げることができる。つまり、αサブユニット１型（ＮＣＢＩアクセション番号ＢＡＣ２１１０１）のアミノ酸配列における第３７７位のアルギニン（Ｒ）の変異、好ましくは第３７７位のアルギニン（Ｒ）のロイシン（Ｌ）への置換（Ｒ３７７Ｌ）を挙げることができる。
また、別の実施形態として、配列番号２に示される塩基配列の第１５０２位のグアニン（Ｇ）の変異、好ましくは第１５０２位のグアニン（Ｇ）の欠失（Ｇ１５０２ｄｅｌ）を挙げることができる。つまり、αサブユニット１型（ＮＣＢＩアクセション番号ＢＡＣ２１１０１）のアミノ酸配列における第５０１位のアルギニン（Ｒ）の変異、好ましくは、フレームシフトにより第５４３位に終止コドンを生じる変異（R501fsX543）を挙げることができる。
さらに別の実施形態として、配列番号２に示される塩基配列の第２５９３位のシトシン（Ｃ）の変異、好ましくは第２５９３位のシトシン（Ｃ）のチミン（Ｔ）への置換（Ｃ２５９３Ｔ）を挙げることができる。つまり、αサブユニット１型（ＮＣＢＩアクセション番号ＢＡＣ２１１０１）のアミノ酸配列における第８６５位のアルギニン（Ｒ）の変異、好ましくは第８６５位のアルギニン（Ｒ）のストップコドンへの変異（Ｒ８６５Ｘ）を挙げることができる。
また、別の実施形態として、配列番号２に示される塩基配列の第１８２０位のシトシン（Ｃ）の変異、好ましくは第１８２０位のシトシン（Ｃ）の欠失（Ｃ１８２０ｄｅｌ）を挙げることができる。つまり、αサブユニット１型（ＮＣＢＩアクセション番号ＢＡＣ２１１０１）のアミノ酸配列における第６０７位のセリン（Ｓ）の変異、好ましくは、フレームシフトにより第６２２位に終止コドンを生じる変異（S607fsX622）を挙げることができる。
さらに別の実施形態として、配列番号２に示される塩基配列の第６３５位のチミン（Ｔ）の変異、好ましくは第６３５位のチミン（Ｔ）のシトシン（Ｃ）への置換（Ｔ６３５Ｃ）を挙げることができる。つまり、αサブユニット１型（ＮＣＢＩアクセション番号ＢＡＣ２１１０１）のアミノ酸配列における第２１２位のバリン（Ｖ）の変異、好ましくは第２１２位のバリン（Ｖ）のアラニン（Ａ）への置換（Ｖ２１２Ａ）を挙げることができる。
さらに別の実施形態として、配列番号２に示される塩基配列の第３８１２位のグアニン（Ｇ）の変異、好ましくは第３８１２位のグアニン（Ｇ）のアデニン（Ａ）への置換（Ｇ３８１２Ａ）を挙げることができる。つまり、αサブユニット１型（ＮＣＢＩアクセション番号ＢＡＣ２１１０１）のアミノ酸配列における第１２７１位のトリプトファン（Ｗ）の変異、好ましくは第１２７１位のトリプトファン（Ｗ）のストップコドンへの変異（Ｗ１２７１Ｘ）を挙げることができる。
さらに別の実施形態として、配列番号２に示される塩基配列の第４３００位のチミン（Ｔ）の変異、好ましくは第４３００位のチミン（Ｔ）のシトシン（Ｃ）への置換（Ｔ４３００Ｃ）を挙げることができる。つまり、αサブユニット１型（ＮＣＢＩアクセション番号ＢＡＣ２１１０１）のアミノ酸配列における第１４３４位のトリプトファン（Ｗ）の変異、好ましくは第１４３４位のトリプトファン（Ｗ）のアルギニン（Ｒ）への置換（Ｗ１４３４Ｒ）を挙げることができる。
さらに別の実施形態として、配列番号２に示される塩基配列の第２３６２位のグアニン（Ｇ）の変異、好ましくは第２３６２位のグアニン（Ｇ）のアデニン（Ａ）への置換（Ｇ２３６２Ａ）を挙げることができる。つまり、αサブユニット１型（ＮＣＢＩアクセション番号ＢＡＣ２１１０１）のアミノ酸配列における第７８８位のグルタミン酸（Ｅ）の変異、好ましくは第７８８位のグルタミン酸（Ｅ）のリシン（Ｋ）への置換（Ｅ７８８Ｋ）を挙げることができる。
さらに別の実施形態として、配列番号２に示される塩基配列の第４７８６位のシトシン（Ｃ）の変異、好ましくは第４７８６位のシトシン（Ｃ）のチミン（Ｔ）への置換（Ｃ４７８６Ｔ）を挙げることができる。つまり、αサブユニット１型（ＮＣＢＩアクセション番号ＢＡＣ２１１０１）のアミノ酸配列における第１５９６位のアルギニン（Ｒ）の変異、好ましくは第１５９６位のアルギニン（Ｒ）のシステイン（Ｃ）への置換（Ｒ１５９６Ｃ）を挙げることができる。
電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１の機能異常にかかる変異は、上記例示的に示した変異に限定されないことはいうまでもない。
なお、本発明の判定データ取得方法において、変異の有無を検出する対象となる遺伝子は、上記のアクセション番号に登録されている塩基配列に限定されるものではない。つまり、上記例示した遺伝子がコードするタンパク質と実質的に同質の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子について、変異の有無を検出する構成も本発明に含まれる。
このような遺伝子としては、具体的には、例えば、上記のアクセション番号に登録されている塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド（遺伝子）であり、該ポリヌクレオチドの翻訳産物が電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１のサブユニットとしての機能を有する遺伝子を挙げることができる。
また、本発明にかかる判定データ取得方法においては、同じ遺伝子から生じるアイソフォームｍＲＮＡやタンパク質を変異の有無を検出する対象としてもよい。
本発明の判定データ取得方法において、遺伝子の変異の有無を検出する方法は、特に限定されるものではなく、従来公知のあらゆる方法を用いることができる。
具体的には、例えば、ＰＣＲを利用したシークエンシング、ＳＳＣＰ（Single strand conformation polymorphism）などの変異検出法、リアルタイムＰＣＲやＤＮＡチップを用いた多型検出方法、遺伝子の各エキソンのmicro−deletionを検出する方法、ｍＲＮＡの増減を検出するNorthern blot法、ＲＴ−ＰＣＲ法, Real-time PCR法、およびｃＤＮＡアレイ法、並びに、タンパク質の増減を検出するウエスタンブロット法、免疫染色法、およびタンパクアレイ法等を挙げることができる。
遺伝子の変異の有無を検出する方法の実施形態としては、例えば、（Ａ）生体から分離された試料に含有されるゲノムＤＮＡを用いて変異を検出する実施形態、（Ｂ）生体から分離された試料に含有されるｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）を用いて変異を検出する実施形態、（Ｃ）生体から分離された試料に含有されるタンパク質を用いて変異を検出する実施形態を挙げることができる。上記（Ａ）〜（Ｃ）の具体的内容については、＜Ｉ．脳炎または脳症の罹患リスク判定データの取得方法＞と同じである。
生体から分離された試料に含有されるゲノムＤＮＡを用いてナトリウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群における変異を検出することにより、熱性けいれんがてんかんに移行するリスクを判定するためのデータを取得することができる。具体的には、取得されたデータにおいて、ナトリウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群に変異が見出された場合には、熱性けいれんの既往者はてんかん患者に移行する可能性が高いと判定することができる。
また、生体から分離された試料に含有されるｍＲＮＡを用いて、ナトリウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群における変異を検出することにより、熱性けいれんがてんかんに移行するリスクを判定するためのデータを取得することができる。具体的には、取得されたデータにおいて、ナトリウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群に変異が見出された場合には、熱性けいれんの既往者はてんかん患者に移行する可能性が高いと判定することができる。
さらに、生体から分離された試料に含有されるタンパク質を用いて、ナトリウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群における変異を検出することにより、熱性けいれんがてんかんに移行するリスクを判定するためのデータを取得することができる。具体的には、取得されたデータにおいて、変異を検出する対象となる遺伝子の翻訳産物（タンパク質）に変異が見出された場合には、熱性けいれんの既往者はてんかん患者に移行する可能性が高いと判定することができる。
本発明にかかる、熱性けいれんのてんかんへの移行リスク判定データの取得方法は上説した構成を備えているため、該判定データ取得方法により取得したデータによれば、熱性けいれんがてんかんへ移行するリスクの可能性を事前に診断することができる。
そのため、本発明の判定データ取得方法によれば、てんかんへ移行する可能性のある患者に対して早期に適切な処置を施すことが可能となり、死亡率や後遺症の低減のみならず、家族の精神的負担や経済的負担の軽減、さらには適切な治療を施すことによる医療費の削減に貢献することができる。
（ＶＩ．熱性けいれんのてんかんへの移行リスク判定キット）
本発明には、本発明の判定データ取得方法を用いて、熱性けいれんのてんかんへの移行リスクを判定するためのデータを取得するために用いる、熱性けいれんのてんかんへの移行リスク判定キット（以下、単に「てんかんへの移行リスク判定キット」ともいう）も含まれる。
てんかんへの移行リスク判定キットは、具体的には、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１を構成するサブユニットをコードする遺伝子群（すなわち、ナトリウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群）のうち、少なくとも１つの遺伝子における変異の有無を検出するための試薬を少なくとも含んでいればよく、その他の具体的な構成は特に限定されるものではない。
ナトリウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群における変異の有無を検出するための試薬としては、例えば、プライマー、プローブ、および抗体などを挙げることができる。これらの試薬は、単独で含まれてもよく、また、複数の組み合わせで含まれていてもよい。さらに、上記判定キットは、上記例示する試薬以外のその他の試薬を含んでいてもよい。
具体的には、ゲノムＤＮＡを用いて、ナトリウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群における変異の有無を検出するキットとしては、ナトリウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群のうち、少なくとも１つの遺伝子のエキソン領域もしくはエキソンとイントロンとの境界領域、またはそれらの一部を増幅できるように設計されたプライマーや、変異型または野生型の一方のエキソン領域もしくはエキソンとイントロンとの境界領域、またはそれらの一部（換言すれば、特定の遺伝子型のエキソンもしくはエキソンとイントロンとの境界領域、またはそれらの一部）のみを特異的に検出できるように設計されたプローブを含む構成を挙げることができる。
上記プライマーおよびプローブの配列は特に限定されるものではないが、例えば、プライマーとしては、後述の実施例で用いたプライマーを挙げることができる。ただし、本発明は、後述の実施例に限定されないことはいうまでもない。
さらに、このような判定キットでは、上記プライマーやプローブに加えて、ＰＣＲ法やサザンブロット法、核酸シークエンシングに用いられる試薬など、上記遺伝子における変異の有無を検出するために必要な試薬を１つ以上組み合わせて含む構成とすることもできる。
なお、上記試薬は、本発明の検出方法に応じて適宜選択採用されるが、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ＤＮＡ合成酵素等を挙げることができる。さらに、ＰＣＲ法やサザンブロット法、核酸シークエンシングに用いることが可能な適当な緩衝液および洗浄液等が含まれていてもよい。
また、ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）または全ＲＮＡを用いて、ナトリウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群における変異の有無を検出するキットとしては、上記遺伝子群のうち、少なくとも１つの遺伝子のｃＤＮＡまたはその一部の領域を増幅できるように設計されたプライマーや、変異型または野生型の一方のｍＲＮＡもしくはその一部（換言すれば、特定の遺伝子型のｍＲＮＡまたはその一部）のみを特異的に検出できるように設計されたプローブを含む構成を挙げることができる。
さらに、このような判定キットでは、上記プライマーやプローブに加えて、ＲＴ−ＰＣＲ法やノザンブロット法、核酸シークエンシングに用いられる試薬など、上記遺伝子における変異の有無を検出するために必要な試薬を１つ以上組み合わせて含む構成とすることもできる。
なお、上記試薬は、本発明の検出方法に応じて適宜選択採用されるが、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ＤＮＡ合成酵素等を挙げることができる。さらに、ＲＴ−ＰＣＲ法やノザンブロット法、核酸シークエンシングに用いることが可能な適当な緩衝液および洗浄液等が含まれていてもよい。
また、タンパク質レベルでナトリウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群における変異の有無を検出するキットとしては、例えば、該遺伝子群の翻訳産物であるポリペプチド（タンパク質）のうち、野生型または変異型のポリペプチドもしくはその一部の一方のみに特異的に結合する抗体（換言すれば、特定の遺伝子型の翻訳産物であるポリペプチドまたはその一部のみに特異的に結合する抗体）を含むキット等が挙げられる。
さらに、このような判定キットでは、上記抗体に加えて、ＥＬＩＳＡ法や、ウエスタンブロット法、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１の活性測定に用いられる試薬など、上記遺伝子における変異（換言すれば、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１における変異）の有無を検出するために必要な試薬を１つ以上組み合わせて含む構成とすることもできる。
また、てんかんへの移行リスク判定キットは、上記例示した構成物をどのように組み合わせて含んでいてもよい。
上説したようなてんかんへの移行リスク判定キットを用いることにより、熱性けいれん既往者がてんかんに移行するリスクを、てんかんへの移行前に判定するためのデータを取得することができる。
本発明のてんかんへの移行リスク判定キットが適用される被験者は、特に限定されるものではないが、生後６歳未満の熱性けいれん既往者に適用することが好ましく、生後１歳未満の熱性けいれん既往者に適用することがより好ましい。
なお本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
本発明について、実施例および図１〜図９に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。当業者は本発明の範囲を逸脱することなく、種々の変更、修正、および改変を行うことができる。
〔実施例１：インフルエンザ脳症に罹患した患者における電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１の変異〕
小児てんかん患者について、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１のαサブユニット１型をコードするＳＣＮ１Ａ遺伝子の解析を行った。具体的には、まず、遺伝子解析の同意を得た後に末梢血を採取した。ＤＮＡ抽出キット(WB kit；Nippon gene, Tokyo, Japan)を用いて患者の末梢血からゲノムＤＮＡを抽出し、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の全エキソン（エキソン１〜２６）をＰＣＲで増幅した。
ＰＣＲは５０ｎｇ ヒトゲノムＤＮＡ、２０ｐｍｏｌ 各プライマー、０．８ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１×reaction buffer、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．７ユニットのAmpliTaq Gold DNA polymerase (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)を含む２５μｌの反応液中で行った。
なお、各エキソンを増幅させるためのプライマーセットとしては、それぞれ、以下のプライマーセットを用いた。また、ＳＣＮ１Ａ遺伝子のゲノム配列は、配列番号１に示す。
エキソン１増幅
Sense primer：5'- tcatggcacagttcctgtatc -3' （配列番号３）
Antisense primer：5'- gcagtaggcaattagcagcaa -3' （配列番号３０）
エキソン２増幅
Sense primer：5'- tggggcactttagaaattgtg -3' （配列番号４）
Antisense primer：5'- tgacaaagatgcaaaatgagag -3' （配列番号３１）
エキソン３増幅
Sense primer：5'- gcagtttgggcttttcaatg -3' （配列番号５）
Antisense primer：5'- tgagcattgtcctcttgctg -3' （配列番号３２）
エキソン４増幅
Sense primer：5'- agggctacgtttcatttgtatg -3' （配列番号６）
Antisense primer：5'- tgtgctaaattgaaatccagag -3' （配列番号３３）
エキソン５増幅
Sense primer：5'- cagctcttcgcactttcaga -3' （配列番号７）
Antisense primer：5'- tcaagcagagaaggatgctga -3' （配列番号３４）
エキソン６増幅
Sense primer：5'- agcgttgcaaacattcttgg -3' （配列番号８）
Antisense primer：5'- gggatatccagcccctcaag -3' （配列番号３５）
エキソン７増幅
Sense primer：5'- gacaaatacttgtgcctttgaatg -3' （配列番号９）
Antisense primer：5'- acataatctcatactttatcaaaaacc -3' （配列番号３６）
エキソン８増幅
Sense primer：5'- gaaatggaggtgttgaaaatgc -3' （配列番号１０）
Antisense primer：5'- aatccttggcatcactctgc -3' （配列番号３７）
エキソン９増幅
Sense primer：5'- agtacagggtgctatgaccaac -3' （配列番号１１）
Antisense primer：5'- tcctcatacaaccacctgctc -3' （配列番号３８）
エキソン１０増幅
Sense primer：5'- tctccaaaagccttcattagg -3' （配列番号１２）
Antisense primer：5'- ttctaattctccccctctctcc -3' （配列番号３９）
エキソン１１増幅
Sense primer：5'- tcctcattctttaatcccaagg -3' （配列番号１３）
Antisense primer：5'- gccgttctgtagaaacactgg -3' （配列番号４０）
エキソン１２増幅
Sense primer：5'- gtcagaaatatctgccatcacc -3' （配列番号１４）
Antisense primer：5'- gaatgcactattcccaactcac -3' （配列番号４１）
エキソン１３増幅
Sense primer：5'- tgggctctatgtgtgtgtctg -3' （配列番号１５）
Antisense primer：5'- ggaagcatgaaggatggttg -3' （配列番号４２）
エキソン１４増幅
Sense primer：5'- tacttcgcgtttccacaagg -3' （配列番号１６）
Antisense primer：5'- gctatgcaagaaccctgattg -3' （配列番号４３）
エキソン１５増幅
Sense primer：5'- atgagcctgagacggttagg -3' （配列番号１７）
Antisense primer：5'- atacatgtgccatgctggtg -3' （配列番号４４）
エキソン１６増幅
Sense primer：5'- tgctgtggtgtttccttctc -3' （配列番号１８）
Antisense primer：5'- tgtattcataccttcccacacc -3' （配列番号４５）
エキソン１７増幅
Sense primer：5'- aaaagggttagcacagacaatg -3' （配列番号１９）
Antisense primer：5'- attgggcagatataatcaaagc -3' （配列番号４６）
エキソン１８増幅
Sense primer：5'- cacacagctgatgaatgtgc -3' （配列番号２０）
Antisense primer：5'- tgaagggctacactttctgg -3' （配列番号４７）
エキソン１９増幅
Sense primer：5'- tctgccctcctattccaatg -3' （配列番号２１）
Antisense primer：5'- gcccttgtcttccagaaatg -3' （配列番号４８）
エキソン２０増幅
Sense primer：5'- aaaaattacatcctttacatcaaactg -3' （配列番号２２）
Antisense primer：5'- ttttgcatgcatagattttcc -3' （配列番号４９）
エキソン２１増幅
Sense primer：5'- tgaaccttgcttttacatatcc -3' （配列番号２３）
Antisense primer：5'- acccatctgggctcataaac -3' （配列番号５０）
エキソン２２増幅
Sense primer：5'- tgtcttggtccaaaatctgtg -3' （配列番号２４）
Antisense primer：5'- ttggtcgtttatgctttattcg -3' （配列番号５１）
エキソン２３増幅
Sense primer：5'- ccctaaaggccaatttcagg -3' （配列番号２５）
Antisense primer：5'- atttggcagagaaaacactcc -3' （配列番号５２）
エキソン２４増幅
Sense primer：5'- gagatttgggggtgtttgtc -3' （配列番号２６）
Antisense primer：5'- ggattgtaatggggtgcttc -3' （配列番号５３）
エキソン２５増幅
Sense primer：5'- caaaaatcagggccaatgac -3' （配列番号２７）
Antisense primer：5'- tgattgctgggatgatcttg -3' （配列番号５４）
エキソン２６（１）増幅
Sense primer：5'- aggactctgaaccttaccttgg -3' （配列番号２８）
Antisense primer：5'- ccatgaatcgctcttccatc -3' （配列番号５５）
エキソン２６（２）増幅
Sense primer：5'- tgtgggaacccatctgttg -3' （配列番号２９）
Antisense primer：5'- gtttgctgacaaggggtcac -3' （配列番号５６）。
得られたＰＣＲ産物を、PCR products pre-sequencing kit (Amersham Biosciences, Little Chalfont, Buckinghamshire, England)を用いて精製した。続いて、Big Dye Terminator FS ready-reaction kit (Applied Biosystems)を用いて、シークエンス反応を行い、蛍光シークエンサー（ABI PRISM3100 sequencer ；Applied Biosystems）により塩基配列を決定した。
その結果、表１に示すように、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１のαサブユニット１型をコードするＳＣＮ１Ａ遺伝子にアミノ酸変化をもたらす変異を有する患者４３人を見いだした。
これら４３人の患者のうち、図１に変異の詳細を示す５人は、その後、急性脳炎または急性脳症を発症した。つまり、ＳＣＮ１Ａ遺伝子に変異を有する者の急性脳炎または急性脳症の罹患率は、１１．６３％であった。一方、一般的な急性脳炎または急性脳症の発症頻度は、０．００３％である。
したがって、上記の結果は、ＳＣＮ１Ａ遺伝子に変異を有する者では、急性脳炎または急性脳症の罹患率が、３８７７倍も高いことを示している。
なお、急性脳炎または急性脳症を発症した５人の臨床的特徴を表２に示す。
また、上記５人の患者のうち、表２に示す患者番号１３の患者の脳波の測定結果を図２（ａ）〜（ｄ）に示す。なお、脳波は１０−２０法という電極配置法で記録した。電極配置記号は頭部の部位を示すもので、一般にＦｐ１，Ｆｐ２は前部極、Ｆ３，Ｆ４は前頭部、Ｃ３，Ｃ４は中心部、Ｐ３，Ｐ４は頭頂部、Ｏ１，Ｏ２は後頭部、Ｆ７，Ｆ８は前側頭部、Ｔ３，Ｔ４は中側頭部、Ｔ５，Ｔ６は後側頭部、Ｆｚは正中前頭部、Ｃｚは正中中心部、Ｐｚは正中頭頂部を意味する。
図２（ａ）は、インフルエンザ脳症を発症して１３時間後のけいれん重積時の脳波を示す図である。全ての電極配置記号から、棘徐波複合が連続的に認められ、脳全体の広汎な領域からけいれん発射が出現していることを示している。
その後、図２（ｂ）に示すように、インフルエンザ発症３８時間後には、けいれんは収まっているが、すでに、脳波の低電位化が始まっていた。さらに、図２（ｃ）に示すように、インフルエンザ発症６２時間後の脳波では、さらに、低電位化が進行した。そして、図２（ｄ）に示すように、７日目には、脳波が平坦になって、急速な病状の進行で脳の全般的な活動停止に近い状態に至った。
また、上記患者について、インフルエンザ脳症を発症して８日目の聴性脳幹反応を調べた。図３（ａ）〜（ｃ）は、それぞれ、右側を刺激したときの聴性脳幹反応の結果、左側を刺激したときの聴性脳幹反応の結果、および左右両側を刺激したときの聴性脳幹反応の結果を示す。
図３（ａ）〜（ｃ）に示すように、いずれの刺激に対しても無反応であった。脳波所見、聴性脳幹反応所見、そして自発呼吸の消失や臨床的脳幹反応の消失など総合的に判断して、脳死状態になったと診断された。患者は、多臓器不全も合併し、インフルエンザ脳症を発症して２７日目に死亡した。
〔実施例２：変異型ナトリウムイオンチャネルの機能解析〕
変異型ＳＣＮ１Ａ遺伝子（Ｃ１７０２Ｔ）を発現させることによって、実施例１で見出された電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１のαサブユニット１型における変異のうち、変異型ナトリウムイオンチャネル（Ｒ５６８Ｘ）を作製した。コントロールとして、野生型（正常型）ＳＣＮ１Ａ遺伝子を発現させることによって、野生型（正常型）ナトリウムイオンチャネルを作製した。
そして、該変異型ナトリウムイオンチャネルおよび野生型ナトリウムイオンチャネルについて、機能解析を行った。ＳＣＮ１Ａ遺伝子産物である電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１のαサブユニット１型は、β１サブユニットおよびβ２サブユニットによる機能調節を受けているため、変異型プラスミドとβサブユニットのＳＣＮ１Ｂ、ＳＣＮ２Ｂ発現ベクターとを、トランスフェクション試薬を用いてヒト腎細胞ＨＥＫ２９３に共発現させた。全細胞記録によるパッチクランプ法で電気生理学的特性を検討した。
ナトリウムチャネル電流の記録は、２２℃〜２４℃の室温で、トランスフェクション２４時間〜４８時間に行った。パッチ電極はborosilicate glassを用い、multistage P-97 Flaming-Brown micropipette pullerで作成した。
細胞内液の組成は、１１０ｍＭ ＣｓＦ、１０ｍＭ ＮａＦ、２０ｍＭ ＣｓＣｌ、２ｍＭ ＥＧＴＡ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳとした。一方、細胞外液の組成は、１４５ｍＭ ＮａＣｌ、４ｍＭ ＫＣｌ、１．８ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳとした。アンプはAxopatch200B (Axon Instruments)を用いた。電気生理学的特性は、電位依存性チャネル活性化を調べ、正常型と比較検討した。データ解析にはClampfit 8.2ソフトウエアを使用した。
その結果、図４（ａ）に示すように、野生型ナトリウムイオンチャネルは、チャネルとしての機能を有していた。一方、変異型ナトリウムイオンチャネルは、正常型と比較して、電位の変化に伴うナトリウム電流がほとんどなく、チャネルとしての活性を有しなかった。
さらに、上記変異型ナトリウムチャネルおよび野生型ナトリウムチャネルについて、細胞内局在性を調べるために、蛍光タンパク質を野生型ナトリウムイオンチャネルおよび変異型ナトリウムイオンチャネルに融合させ解析した。その結果、図４（ｂ）に示すように、野生型ナトリウムチャネルは細胞膜に局在したのに対して、変異型ナトリウムチャネルは、細胞膜に局在することなく、細胞質に留まっていた。
〔実施例３：ラスムッセン脳炎に罹患した患者における電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１の変異〕
進行性の右半身麻痺と難治な部分発作を主訴に来院したラスムッセン脳炎患者について、まず、脳波を測定した。脳波電極は１０−２０法に従って配置した。その結果、図５（ａ）に示すように、左半球に徐波が増強し、左前頭部、左前側頭部からてんかん発射が出現していた。これは、左半球の機能が低下し、同部がてんかん焦点になっていることを意味している。
次に、上記患者について、頭部ＭＲＩ画像を撮影した。その結果、図５（ｂ）に示すように、左半球の軽度萎縮と左脳室拡大とが認められた。なお、図５（ｂ）に示す３つの画像は、左から順に、Ｔ１強調画像（Ｂ１）、Ｔ２強調画像（Ｂ２）、ＦＬＡＲ画像（Ｂ３）で、図５（ｃ）は脳血流シンチグラフィーで、Ｃ１は初発時、Ｃ２は病状が進行したときの所見である。Ｃ１では異常所見は認められないが、Ｃ２では左半球の血流低下が新たに出現しており、機能が低下したことを示す所見である。これらの脳波および神経画像検査から、左半球の機能が低下して萎縮が進行し、てんかん焦点になっていることが明らかになった。
当該ラスムッセン脳炎患者の抹消血を採取後、ＤＮＡを抽出し、ＳＣＮ１Ａ遺伝子について解析した。なお、本実験は、岡山大学「ヒトゲノム・遺伝子解析研究倫理審査委員会」の承認を得て行われた。
ＤＮＡ抽出キット(WB kit；Nippon gene, Tokyo, Japan)を用いて患者の末梢血からゲノムＤＮＡを抽出し、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の全エキソンをＰＣＲで増幅した。ＰＣＲは５０ｎｇ ヒトゲノムＤＮＡ、２０ｐｍｏｌ 各プライマー、０．８ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１×reaction buffer、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．７ユニットのAmpliTaq Gold DNA polymerase (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)を含む２５μｌの反応液中で行った。なお、プライマーセットには、実施例１に記載したプライマーセットを用いた。
得られたＰＣＲ産物を、PCR products pre-sequencing kit (Amersham Biosciences, Little Chalfont, Buckinghamshire, England)を用いて精製した。続いて、Big Dye Terminator FS ready-reaction kit (Applied Biosystems)を用いて、シークエンス反応を行い、蛍光シークエンサー（ABI PRISM3100 sequencer ；Applied Biosystems）により塩基配列を決定した。
その結果、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１のαサブユニット１型をコードするＳＣＮ１Ａ遺伝子において、アミノ酸変異をもたらす遺伝子変異が検出された。そのＳＣＮ１Ａ遺伝子変異の配列を図５（ｄ）に示す。この変異は、配列番号２に示される塩基配列の第４７２３位のヌクレオチドであるシトシン（Ｃ）がチミン（Ｔ）に置換された変異（Ｃ４７２３Ｔ）であった。
この変異により、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１のαサブユニット１型は、第１５７５位のアミノ酸残基であるアルギニン（Ｒ）がシステイン（Ｃ）に置換（Ｒ１５７５Ｃ）されることになる。
以上の結果、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１のαサブユニット１型をコードするＳＣＮ１Ａ遺伝子における変異が、ラスムッセン脳炎の発症に関連することが分かった。
〔実施例４：変異型ナトリウムイオンチャネルの機能解析〕
実施例３で見出された変異型ＳＣＮ１Ａ遺伝子（Ｃ４７２３Ｔ）を発現させることによって、変異型ナトリウムイオンチャネル（Ｒ１５７５Ｃ）を作製した。コントロールとして、野生型（正常型）ＳＣＮ１Ａ遺伝子を発現させることによって、野生型（正常型）ナトリウムイオンチャネルを作製した。
そして、該変異型ナトリウムイオンチャネルおよび野生型ナトリウムイオンチャネルについて、機能解析を行った。ＳＣＮ１Ａ遺伝子産物である電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１のαサブユニット１型は、β１サブユニットおよびβ２サブユニットによる機能調節を受けているため、変異型プラスミドと、β１サブユニットをコードするＳＣＮ１Ｂ遺伝子およびβ２サブユニットをコードするＳＣＮ２Ｂ遺伝子を含む発現ベクターとを、トランスフェクション試薬を用いてヒト腎細胞ＨＥＫ２９３に共発現させた。全細胞記録によるパッチクランプ法で電気生理学的特性を検討した。
ナトリウムチャネル電流の記録は、２２℃〜２４℃の室温で、トランスフェクション２４時間〜４８時間に行った。パッチ電極はborosilicate glassを用い、multistage P-97 Flaming-Brown micropipette pullerで作成した。
細胞内液の組成は、１１０ｍＭ ＣｓＦ、１０ｍＭ ＮａＦ、２０ｍＭ ＣｓＣｌ、２ｍＭ ＥＧＴＡ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳとした。一方、細胞外液の組成は、１４５ｍＭ ＮａＣｌ、４ｍＭ ＫＣｌ、１．８ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳとした。アンプはAxopatch200B（Axon Instruments）を用いた。電気生理学的特性は、電位依存性チャネル活性化を調べ、正常型と比較検討した。データ解析にはClampfit 8.2ソフトウエアを使用した。
その結果、図６（ａ）および（ｂ）に示すように、野生型ナトリウムイオンチャネルおよび変異型ナトリウムイオンチャネルともに、チャネルとしての機能を有しており、両者に有意差はなかった。なお、図６（ａ）は、野生型ナトリウムチャネルおよび変異型ナトリウムチャネル（Ｒ１５７５Ｃ）の電位の変化に伴うナトリウム電流の代表例を示す。図６（ｂ）は、不活性化の時定数を検討した結果を示す。
一方、−１０ｍＶの脱分極刺激を与えたとき、図６（ｃ）に示すように、変異型ナトリウムチャネル（Ｒ１５７５Ｃ）では、野生型よりも持続性ナトリウム電流が増大していた。なお、図６（ｃ）は、−１０ｍＶの脱分極刺激を与えたときの代表的なナトリウム電流曲線を示す。
さらに、持続性ナトリウム電流の大きさを野生型ナトリウムチャネルおよび変異型ナトリウムチャネル（Ｒ１５７５Ｃ）について、それぞれ７つの細胞で測定したところ、図６（ｄ）に示すように、変異型ナトリウムチャネル（Ｒ１５７５Ｃ）では、有意に持続性ナトリウム電流が大きかった。なお、図６（ｄ）は、持続性ナトリウム電流の大きさを野生型ナトリウムチャネルおよび変異型ナトリウムチャネル（Ｒ１５７５Ｃ）について、それぞれ７つの細胞で測定し、統計学処理をした結果を示す図である。
次に、チャネルの電気生理学的特性を詳細に検討するため、電流−電圧関連（図７（ａ））、チャネルの活性化（図７（ｂ））、チャネルの不活性化（図７（ｃ））、およびチャネルの不活性化からの回復（図７（ｄ））を測定した。
その結果、図７（ａ）、（ｂ）、および（ｄ）に示すように、電流−電圧関連、チャネルの活性化、およびチャネルの不活性化からの回復には、両者で有意差は認められなかった。
これに対して、チャネルの不活性化については、図７（ｃ）に示すように、変異型ナトリウムイオンチャネル（Ｒ１５７５Ｃ）では脱分極側に有意にシフトしていた。
以上の機能解析の結果、変異型ナトリウムイオンチャネル（Ｒ１５７５Ｃ）は持続性ナトリウム電流が増大し、チャネルの不活性化が遅いという特性を持つことが明らかになった。これらのデータは、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１の機能が亢進していることを示している。つまり、上記変異を有すると、神経細胞が過剰に興奮しやすい、すなわち、けいれんを起こしやすいことを意味している。
〔実施例５：急性脳炎または急性脳症に罹患した非てんかん患者における電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１の変異〕
実施例１では小児てんかん患者を対象として、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１のαサブユニット１型をコードするＳＣＮ１Ａ遺伝子の解析を行った。本実施例では、てんかんやけいれんの既往がない人でも、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１の変異を調べることによって脳炎または脳症の罹患リスクを判定することができるか否かについて検討した。
急性脳炎または急性脳症に罹患した患者で、発症前にけいれんの既往がない１３人について、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１のαサブユニット１型をコードするＳＣＮ１Ａ遺伝子の解析を行った。具体的には、まず、遺伝子解析の同意を得た後に末梢血を採取した。ＤＮＡ抽出キット(WB kit；Nippon gene, Tokyo, Japan)を用いて患者の末梢血からゲノムＤＮＡを抽出し、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の全エキソン（エキソン１〜２６）をＰＣＲで増幅した。
ＰＣＲは５０ｎｇ ヒトゲノムＤＮＡ、２０ｐｍｏｌ 各プライマー、０．８ｍＭｄＮＴＰｓ、１×reaction buffer、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．７ユニットのAmpliTaq Gold DNA polymerase (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)を含む２５μｌの反応液中で行った。なお、各エキソンを増幅させるためのプライマーセットは、実施例１で用いたものと同じである。
得られたＰＣＲ産物を、PCR products pre-sequencing kit (Amersham Biosciences, Little Chalfont, Buckinghamshire, England)を用いて精製した。続いて、Big Dye Terminator FS ready-reaction kit (Applied Biosystems)を用いて、シークエンス反応を行い、蛍光シークエンサー（ABI PRISM3100 sequencer ；Applied Biosystems）により塩基配列を決定した。
その結果、表３に示すように、一般の急性脳炎または急性脳症に罹患した患者１３人中1名（７.６９%）に、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１のαサブユニット１型をコードするＳＣＮ１Ａ遺伝子にアミノ酸変化をもたらすミスセンス変異を見いだした。
図８の（ａ）は正常な患者のＳＣＮ１Ａ遺伝子解析結果を示す図であり、図８の（ｂ）は、表３に示す番号８の患者におけるＳＣＮ１Ａ遺伝子解析結果を示す図である。図８の（ｂ）におけるＳＣＮ１Ａ遺伝子変異は、配列番号２に示される塩基配列の第４７２３位のヌクレオチドであるシトシン（Ｃ）がチミン（Ｔ）に置換された変異（Ｃ４７２３Ｔ）であった。
この変異により、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１のαサブユニット１型は、第１５７５位のアミノ酸残基であるアルギニン（Ｒ）がシステイン（Ｃ）に置換（Ｒ１５７５Ｃ）された。この患者はＣＧＣ（Ｒをコード）とＴＧＣ（Ｃをコード）とのヘテロ接合型であった。
以上より、てんかんやけいれんの既往がない一般の人でも、ＳＣＮ１Ａ遺伝子に変異を有する場合、急性脳炎または急性脳症に罹患する危険性が高いことが分かった。よって、本発明にかかる脳炎または脳症の罹患リスク判定データの取得方法は、てんかん患者に限らず、広く一般に、当該遺伝子の変異の検査は脳炎または脳症に罹患するリスクを判定する方法となることが明らかになった。
〔実施例６：熱性けいれん既往者における電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１の変異〕
熱性けいれん既往者について、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１のαサブユニット１型をコードするＳＣＮ１Ａ遺伝子の解析を行った。具体的には、まず、遺伝子解析の同意を得た後に抹消血を採取した。ＤＮＡ抽出キット(WB kit；Nippon gene, Tokyo, Japan)を用いて患者の末梢血からゲノムＤＮＡを抽出し、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の全エキソン（エキソン１〜２６）をＰＣＲで増幅した。
ＰＣＲは５０ｎｇ ヒトゲノムＤＮＡ、２０ｐｍｏｌ 各プライマー、０．８ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１×reaction buffer、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．７ユニットのAmpliTaq Gold DNA polymerase (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)を含む２５μｌの反応液中で行った。各エキソンを増幅させるためのプライマーセットは、実施例１で用いたものと同じものを用いた。
得られたＰＣＲ産物を、PCR products pre-sequencing kit (Amersham Biosciences, Little Chalfont, Buckinghamshire, England)を用いて精製した。続いて、Big Dye Terminator FS ready-reaction kit (Applied Biosystems)を用いて、シークエンス反応を行い、蛍光シークエンサー（ABI PRISM3100 sequencer ；Applied Biosystems）により塩基配列を決定した。
熱性けいれん既往者１１０人について、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１のαサブユニット１型をコードするＳＣＮ１Ａの遺伝子変異解析を行ったところ、表４〜６に示すように、そのうち４６人にアミノ酸変異をもたらす遺伝子変異を検出した。一方、患者の発作の追跡調査を進めたところ、１１０人のうち追跡調査を行えたのは９８人であった。生後９６ヵ月を区切りとして、予後とＳＣＮ１Ａ遺伝子変異の相関をKaplan Meier法にて統計解析を行った。
表４〜６は、追跡できた患者の最終時の年齢（追跡最終年齢）と、発作が起きた最終年齢（発作最終年齢）をまとめたものである。発作持続は６歳、すなわち９６カ月を区切りとして、それ以上続く患者は発作最終年齢＝continue、発作持続期間＝９６カ月、として記載している。９６カ月以上発作が続くことはてんかんへ移行していることを意味している。また、表４〜６には、遺伝子変異の種類として、アミノ酸に変化を生じるミスセンス変異か、アミノ酸が途中で合成停止するナンセンス変異か、該当するものに＋を記した。表４の番号１の患者はＳＣＮ１Ａの変異を持たず、発作は４７カ月で止まったことを示している。
図９は、ミスセンス変異またはナンセンス変異のどちらか一方でも持つこと（つまり、遺伝子に変異があること）と発作持続期間との関係をKaplan Meier法（ＳＰＳＳ ｖｅｒ１２Ｊ）で解析した結果を示す図である。図９において、横軸は発作持続期間（月）を表し、縦軸は表４〜６に示す９８人の患者のうち、けいれん発作が持続している患者の割合を示している。また、実線はＳＣＮ１Ａ遺伝子に変異がある患者における、発作持続期間（月）とけいれん発作が持続している患者の割合との関係を示し、点線はＳＣＮ１Ａ遺伝子に変異がない患者における、上記関係を示している。
Log Rank Testで、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の変異と、けいれん発作の持続との相関の有意差検定を行ったところ、ＳＣＮ１Ａ遺伝子に変異がある患者は９６カ月まで発作が持続すること（すなわち、てんかんへの移行）と非常に強い相関を示した(p=0.0001)。このように、本発明にかかる方法により、熱性けいれん患者のてんかんへの移行を高精度に予測できることが明らかとなった。
なお本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。
以上のように、本発明では、ナトリウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群のうち少なくとも１つの遺伝子におけるアミノ酸変化を伴う変異の有無を検出することにより、脳炎または脳症に罹患していない被験者についても、該被験者が脳炎または脳症の罹患リスクを判定するためのデータを取得することができる。
また、本発明では、ナトリウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群のうち少なくとも１つの遺伝子におけるアミノ酸変化を伴う変異の有無を検出することにより、熱性けいれん既往者について、てんかん患者へ移行するリスクを判定するためのデータを取得することができる。
そのため、本発明は、脳炎または脳症の罹患リスク、または熱性けいれんのてんかんへの移行リスクを判定するために用いる判定キットに代表される診断医療の分野だけでなく、保健医学分野に広く利用することができる。
また、本発明では、ナトリウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群のうち少なくとも１つの遺伝子にアミノ酸変化を伴う変異を導入することにより、脳炎または脳症の発症モデル動物を製造することができる。このような脳炎または脳症の発症モデル動物は、脳炎または脳症の治療薬剤や治療方法の開発に用いることができる。それゆえ、本発明は、製薬分野をはじめ、生命科学分野の産業に広く利用することができる。
図１は急性脳炎または急性脳症を発症した患者におけるＳＣＮ１Ａ遺伝子解析結果を示す図である。 図２（ａ）〜（ｄ）は、インフルエンザ脳症を発症した患者における脳症発症後の脳波の経過を示す図であり、（ａ）〜（ｄ）はそれぞれ、インフルエンザ脳症によるけいれん重積時の脳波、インフルエンザ発症３８時間後でけいれんが収まっている状態の脳波、インフルエンザ発症６２時間後の脳波、およびインフルエンザ発症７日目の脳波を示す図である。 図３（ａ）〜（ｃ）は、それぞれ、インフルエンザ脳症を発症した患者において、右側を刺激したときの聴性脳幹反応の結果、左側を刺激したときの聴性脳幹反応の結果、および左右両側を刺激したときの聴性脳幹反応の結果を示す。 図４は、変異型ＳＣＮ１Ａ遺伝子および野生型ＳＣＮ１Ａ遺伝子の機能解析の結果を示す図であり、（ａ）は変異型ナトリウムイオンチャネルおよび野生型ナトリウムイオンチャネルの電位変化に伴うナトリウム電流を測定した結果を示す図であり、（ｂ）は変異型ナトリウムイオンチャネルおよび野生型ナトリウムイオンチャネルの細胞内局在を解析した結果を示す図である。 図５（ａ）は、ラスムッセン脳炎患者における脳波を示す図であり、図５（ｂ）は、ラスムッセン脳炎患者の頭部ＭＲＩ画像を示す図であり、図５（ｃ）は、ラスムッセン脳炎患者の脳血流シンチグラフィーを示す図であり、図５（ｄ）は、ラスムッセン脳炎患者におけるＳＣＮ１Ａ遺伝子における変異配列を示す図である。 図６は、変異型ＳＣＮ１Ａ遺伝子および野生型ＳＣＮ１Ａ遺伝子の機能解析の結果を示す図であり、（ａ）は野生型ナトリウムイオンチャネルおよび変異型ナトリウムイオンチャネル（Ｒ１５７５Ｃ）の電位の変化に伴うナトリウム電流曲線を、（ｂ）は変異型ナトリウムイオンチャネルおよび野生型ナトリウムイオンチャネルの不活性化の時定数タウを、（ｃ）は変異型ナトリウムイオンチャネルおよび野生型ナトリウムイオンチャネルに−１０ｍＶの脱分極刺激を与えたときのナトリウム電流曲線を、（ｄ）は変異型ナトリウムイオンチャネルおよび野生型ナトリウムイオンチャネルの持続性ナトリウム電流量をそれぞれ示す図である。 図７（ａ）は変異型ナトリウムイオンチャネルおよび野生型ナトリウムイオンチャネルの電流−電圧曲線を、図７（ｂ）は変異型ナトリウムイオンチャネルおよび野生型ナトリウムイオンチャネルの活性化曲線を、図７（ｃ）は変異型ナトリウムイオンチャネルおよび野生型ナトリウムイオンチャネルの不活性化曲線を、図７（ｄ）は変異型ナトリウムイオンチャネルおよび野生型ナトリウムイオンチャネルの不活性化からの回復曲線をそれぞれ示す図である。 図８の（ａ）は正常な患者のＳＣＮ１Ａ遺伝子解析結果を示す図であり、図８の（ｂ）は、表３に示す番号８の患者におけるＳＣＮ１Ａ遺伝子解析結果を示す図である。 ミスセンス変異またはナンセンス変異のどちらか一方でも持つことと発作持続期間との関係をKaplan Meier法（ＳＰＳＳ ｖｅｒ１２Ｊ）で解析した結果を示す図である。

Claims (7)

  1. 小児てんかん患者における急性脳炎または急性脳症の罹患リスクを判定するためのデータを取得する小児てんかん患者における急性脳炎または急性脳症の罹患リスク判定データの取得方法であって、
    小児てんかん患者から分離した試料を用いて、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１を構成するαサブユニット１型をコードする遺伝子について、以下の（１）〜（４）の何れか１つ以上のアミノ酸変化を伴う変異の有無を検出することを含むことを特徴とする小児てんかん患者における急性脳炎または急性脳症の罹患リスク判定データの取得方法：
    （１）配列番号２に示される塩基配列の第３００６位のシトシンの欠失；
    （２）配列番号２に示される塩基配列の第４７２１位のシトシンのグアニンへの置換；
    （３）配列番号２に示される塩基配列の第５０２０位のグアニンのシトシンへの置換；
    （４）配列番号２に示される塩基配列の第５７２６位のシトシンのチミンへの置換。
  2. 上記変異は、上記電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１の活性を変化させる変異であることを特徴とする請求項１に記載の小児てんかん患者における急性脳炎または急性脳症の罹患リスク判定データの取得方法。
  3. 小児てんかん患者における急性脳炎または急性脳症の罹患リスクを判定するための小児てんかん患者における急性脳炎または急性脳症の罹患リスク判定キットであって、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１を構成するαサブユニット１型をコードする遺伝子について、以下の（１）〜（４）の何れか１つ以上のアミノ酸変化を伴う変異の有無を検出するために、
    （ａ）電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１を構成するαサブユニット１型をコードする遺伝子のエキソン領域、エキソンとイントロンとの境界領域、もしくはｍＲＮＡ、またはそれらの一部を増幅できるように設計されたプライマー、
    （ｂ）電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１を構成するαサブユニット１型をコードする遺伝子の特定の遺伝子型のエキソン、エキソンとイントロンとの境界領域、もしくはｍＲＮＡ、またはそれらの一部のみを特異的に検出できるように設計されたプローブ、並びに
    （ｃ）電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１を構成するαサブユニット１型をコードする遺伝子の特定の遺伝子型の翻訳産物であるポリペプチドまたはその一部のみに特異的に結合する抗体のうち、少なくとも１つを含むことを特徴とする小児てんかん患者における急性脳炎または急性脳症の罹患リスク判定キット：
    （１）配列番号２に示される塩基配列の第３００６位のシトシンの欠失；
    （２）配列番号２に示される塩基配列の第４７２１位のシトシンのグアニンへの置換；
    （３）配列番号２に示される塩基配列の第５０２０位のグアニンのシトシンへの置換；
    （４）配列番号２に示される塩基配列の第５７２６位のシトシンのチミンへの置換。
  4. 小児てんかん患者における急性脳炎または急性脳症の治療薬剤をスクリーニングするための細胞であって、
    電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１を構成するαサブユニット１型をコードする遺伝子に、以下の（１）〜（４）の何れか１つ以上のアミノ酸変化を伴う変異を有することを特徴とする細胞：
    （１）配列番号２に示される塩基配列の第３００６位のシトシンの欠失；
    （２）配列番号２に示される塩基配列の第４７２１位のシトシンのグアニンへの置換；
    （３）配列番号２に示される塩基配列の第５０２０位のグアニンのシトシンへの置換；
    （４）配列番号２に示される塩基配列の第５７２６位のシトシンのチミンへの置換。
  5. 小児てんかん患者における急性脳炎または急性脳症の治療薬剤をスクリーニングするための細胞の製造方法であって、
    電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１を構成するαサブユニット１型をコードする遺伝子に、以下の（１）〜（４）の何れか１つ以上のアミノ酸変化を伴う変異を導入する工程を含むことを特徴とする細胞の製造方法：
    （１）配列番号２に示される塩基配列の第３００６位のシトシンの欠失；
    （２）配列番号２に示される塩基配列の第４７２１位のシトシンのグアニンへの置換；
    （３）配列番号２に示される塩基配列の第５０２０位のグアニンのシトシンへの置換；
    （４）配列番号２に示される塩基配列の第５７２６位のシトシンのチミンへの置換。
  6. 請求項４に記載の細胞に、候補薬剤を投与し、
    該細胞における電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１の活性が変化したか否かを判定することを含むことを特徴とする小児てんかん患者における急性脳炎または急性脳症の治療薬剤のスクリーニング方法。
  7. 上記候補薬剤は、電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１に対する阻害剤もしくは作動薬、または電位依存性ナトリウムイオンチャネルＮａＶ１．１を構成するαサブユニット１型をコードする遺伝子もしくはその核酸配列の一部からなるポリヌクレオチドを含む発現プラスミドベクターもしくはウイルスベクターであることを特徴とする請求項６に記載の小児てんかん患者における急性脳炎または急性脳症の治療薬剤のスクリーニング方法。
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