JPWO2005042779A1 - 糖尿病又は糖尿病性腎症の治療又は予防薬のスクリーニング方法 - Google Patents
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Abstract
Description
ティナ(Tina L.Gumienny)ら,Cell,107,27−41,2001年10月5日発行 エンリコ(Enrico Brugnera)ら、Nature Cell Biology,4,574−582,2002年7月15日オンライン公開,ウェブページアドレス:http://cellbio.nature.com
〔1〕 被験物質の存在下に、ELMO1の発現量若しくはELMO1を発現させることにより引き起こされる事象を評価し、該発現量の減少若しくは該事象の阻害をもたらす被験物質を選別することを特徴とする、糖尿病性腎症の治療又は予防薬のスクリーニング方法、
〔2〕 被験物質の存在下に、ELMO1及び/又はELMO2の発現量若しくはELMO1及び/又はELMO2を発現させることにより引き起こされる事象を評価し、該発現量の減少若しくは該事象の阻害をもたらす被験物質を選別することを特徴とする、糖尿病の治療又は予防薬のスクリーニング方法、
〔3〕 被験物質存在下に、ELMO1及び/又はELMO2の発現量を評価し、該発現量の減少をもたらす被験物質を選別することを特徴とする、細胞外基質産生抑制剤のスクリーニング方法、
〔4〕 被験物質存在下に、ELMO1及び/又はELMO2の発現量を評価し、該発現量の増加をもたらす被験物質を選別することを特徴とする、マトリックスメタロプロテイナーゼ産生促進剤のスクリーニング方法、
〔5〕 被験物質存在下に、ELMO1及び/又はELMO2の発現量を評価し、該発現量の減少をもたらす被験物質を選別することを特徴とする、サイトカイン産生抑制剤のスクリーニング方法、
〔6〕 被験物質存在下に、ELMO1及び/又はELMO2の発現量を評価し、該発現量の減少をもたらす被験物質を選別することを特徴とする、糖取込み促進剤のスクリーニング方法、
〔7〕 ELMO1遺伝子の第16イントロン、第17イントロン及び第18イントロンからなる群より選ばれた少なくとも1種のヌクレオチドにおける多型を検出することを特徴とする、糖尿病性腎症の診断方法、
〔8〕 ELMO1遺伝子の第16イントロン、第17イントロン及び第18イントロンからなる群より選ばれた少なくとも1種のヌクレオチドにおける多型を検出することを特徴とする、糖尿病性腎症の発症に寄与する核酸の検出方法、並びに
〔9〕 (I)ELMO1遺伝子の第16イントロン、第17イントロン及び第18イントロンからなる群より選ばれた少なくとも1種のイントロンにおいて糖尿病性腎症に罹患する可能性に関連する多型を検出するために用いられるプローブ、及び/又は
(II)ELMO1遺伝子の第16イントロン、第17イントロン及び第18イントロンからなる群より選ばれた少なくとも1種のイントロンにおいて糖尿病性腎症に罹患する可能性に関連する多型を検出するために用いられるプライマー対、
を含む、糖尿病性腎症の診断キット、
に関する。
− 被験物質の存在下に、ELMO1の発現若しくはELMO1を発現させることにより引き起こされる事象〔すなわち、発現(例えば、発現量)の抑制(例えば、減少)若しくは該事象の阻害等〕を評価し、該発現量の抑制(例えば、減少)若しくは該事象の阻害をもたらす被験物質を選別することを特徴とする、糖尿病性腎症の治療又は予防薬のスクリーニング方法(実施態様1);
− 被験物質の存在下に、ELMO1及び/又はELMO2の発現〔すなわち、発現(例えば、発現量)の抑制(例えば、減少)若しくは事象の阻害等〕を評価し、該発現量の抑制(例えば、減少)若しくは該事象の阻害をもたらす被験物質を選別することを特徴とする、糖尿病の治療又は予防薬のスクリーニング方法(実施態様2);
− 被験物質の存在下に、ELMO1及び/又はELMO2の発現〔すなわち、発現(例えば、発現量)の抑制(例えば、減少)等〕を評価し、該発現(例えば、発現量)の抑制(例えば、減少)をもたらす被験物質を選別することを特徴とする、細胞外基質産生抑制剤のスクリーニング方法(実施態様3);
− 被験物質の存在下に、ELMO1及び/又はELMO2の発現〔すなわち、発現(例えば、発現量)の促進(例えば、増加)等〕を評価し、該発現(例えば、発現量)の促進をもたらす被験物質を選別することを特徴とする、マトリックスメタロプロテイナーゼの発現促進剤のスクリーニング方法(実施態様4);
− 被験物質の存在下に、ELMO1及び/又はELMO2の発現〔すなわち、発現(例えば、発現量)の抑制(例えば、減少)等〕を評価し、該発現(例えば、発現量)の抑制(例えば、減少)をもたらす被験物質を選別することを特徴とする、サイトカイン産生抑制剤のスクリーニング方法(実施態様5);
− 被験物質の存在下に、ELMO1及び/又はELMO2の発現〔すなわち、発現(例えば、発現量)の抑制(例えば、減少)等〕を評価し、該発現(例えば、発現量)の抑制(例えば、減少)をもたらす被験物質を選別することを特徴とする、糖取込み促進剤のスクリーニング方法(実施態様6);
が提供される。なお、これらのスクリーニング方法は、薬理評価においても利用されうる。
1)配列番号:1に示されるアミノ酸配列において、少なくとも1残基、具体的には、1個若しくは複数個、好ましくは、1個若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、付加又は挿入を有するアミノ酸配列をコードする核酸、
2)野生型ELMO1をコードする核酸のアンチセンス鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズしうる核酸、
3)配列番号:1に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列に対し、Lipman−pearson法〔Science、227、p1435(1985)〕により、最適な状態にアラインメントされ、算出された値であり、少なくとも50%、好ましくは、80%以上、より好ましくは、90%以上である塩基配列からなる核酸、
等が挙げられる。
前記実施態様1のスクリーニング方法によれば、ELMO1の発現の抑制(例えば、発現量の減少)若しくはELMO1を発現させることにより引き起こされる事象の阻害を評価するため、糖尿病性腎症の進行を遅延させるための治療に一般的に用いられているACE阻害薬、アンジオテンシンII受容体拮抗薬等とは異なる作用機序を示す物質を簡便に、効率よくスクリーニングすることができるという優れた効果を発揮する。
(1) 被験物質の存在下に、ELMO1をコードする核酸をコードする核酸を導入した哺乳動物細胞におけるELMO1の発現量を測定し、ELMO1の発現量を減少させる被検物質を、糖尿病性腎症の治療又は予防薬の候補物質としてスクリーニングする方法(方法1という);
(2) 被験物質の存在下に、ELMO1をコードする核酸を導入した哺乳動物細胞における細胞外基質の量を測定し、ELMO1の発現により引き起こされる該細胞外基質量の上昇を抑制する被験物質を、糖尿病性腎症の治療又は予防薬の候補物質としてスクリーニングする方法(方法2という);
(3) 被験物質の存在下に、ELMO1をコードする核酸を導入した哺乳動物細胞におけるマトリックスメタロプロテイナーゼの量を測定し、ELMO1の発現により引き起こされる該マトリックスメタロプロテイナーゼの減少を抑制する被験物質を、糖尿病性腎症の治療又は予防薬の被験物質としてスクリーニングする方法(方法3という);
(4) 被験物質の存在下に、ELMO1をコードする核酸を導入した哺乳動物細胞におけるサイトカインの量を測定し、ELMO1の発現により引き起こされる該サイトカイン量の上昇を抑制する被験物質を、糖尿病性腎症の治療又は予防薬の被験物質としてスクリーニングする方法(方法4という);
により行なわれうる。
(I) 被験物質を含有した培地又は被験物質を含まない培地で、細胞を培養し、得られた細胞から全RNAを抽出し、得られた全RNAを鋳型とし、適切なプライマー(対)を用いてRT−PCRを行なう方法;
(II) 被験物質を含有した培地又は被験物質を含まない培地で、細胞を培養し、得られた細胞から全RNAを抽出し、適切なプローブを用いて、ノーザンブロット解析を行なう方法;
(III) 被験物質を含有した培地又は被験物質を含まない培地で、細胞を培養し、得られた細胞から無細胞抽出液を調製し、得られた無細胞抽出液と、適切な抗体とを用いて、イムノアッセイを行なう方法;
(IV) 被験物質を含有した培地又は被験物質を含まない培地で、細胞を培養し、得られた培養上清と、適切な抗体とを用いて、イムノアッセイを行なう方法;
等により、測定されうる。
前記方法1と同様に培養された各細胞の全RNAを鋳型とし、マトリックスメタロプロテイナーゼに応じたプライマー(対)を用いてRT−PCRを行なう方法;
前記方法1と同様に培養された各細胞の全RNAとマトリックスメタロプロテイナーゼに応じたプローブとを用いて、ノーザンブロット解析を行なう方法;
前記方法1と同様に培養された無細胞抽出液とマトリックスメタロプロテイナーゼに対する抗体とを用いて、イムノアッセイを行なう方法;
前記無細胞抽出液について、マトリックスメタロプロテイナーゼの活性を測定する方法;
前記無細胞抽出液について、天然基質であるコラーゲンの分解活性を測定する方法;
前記無細胞抽出液について、蛍光ラベルされた合成ペプチド基質の分解活性を測定する方法;
等により、測定されうる。
前記方法1と同様に培養された各細胞の全RNAを鋳型とし、サイトカインに応じたプライマー(対)を用いてRT−PCRを行なう方法、
前記方法1と同様に培養された各細胞の全RNAとサイトカインに応じたプローブとを用いて、ノーザンブロット解析を行なう方法、
前記方法1と同様に培養された無細胞抽出液とサイトカインに対する抗体とを用いて、イムノアッセイを行なう方法
等により、測定されうる。
前記実施態様2のスクリーニング方法は、より具体的には、例えば、被験物質の存在下に、ELMO1をコードする核酸及び/又はELMO2をコードする核酸を導入した哺乳動物細胞におけるELMO1及び/又はELMO2の発現量を測定するステップを行ない、該被験物質の存在した場合に該発現量が減少することを、該被験物質が糖尿病の治療又は予防薬であることの指標として、目的の被験物質をスクリーニングすることができる。
前記実施態様3のスクリーニング方法においては、より具体的には、例えば、被験物質の存在下に、ELMO1をコードする核酸及び/又はELMO2をコードする核酸を導入した哺乳動物細胞におけるELMO1及び/又はELMO2の発現量を測定するステップを行ない、該被験物質の存在した場合に該発現量が減少することを、該被験物質が細胞外基質産生抑制剤であることの指標として、目的の被験物質をスクリーニングすることができる。
前記実施態様4のスクリーニング方法においては、より具体的には、例えば、被験物質の存在下に、ELMO1をコードする核酸及び/又はELMO2をコードする核酸を導入した哺乳動物細胞におけるELMO1及び/又はELMO2の発現量を測定するステップを行ない、該被験物質の存在した場合にELMO1及び/又はELMO2の発現量が減少することを、該被験物質が、マトリックスメタロプロテイナーゼの発現促進剤であることの指標として、被験物質をスクリーニングすることができる。
前記実施態様5のスクリーニング方法においては、より具体的には、例えば、被験物質の存在下に、ELMO1をコードする核酸及び/又はELMO2をコードする核酸を導入した哺乳動物細胞におけるELMO1及び/又はELMO2の発現量を測定するステップを含み、ここで、被験物質の存在した場合にELMO1及び/又はELMO2の発現量が減少することを、該被験物質が、サイトカイン産生抑制剤であることの指標として、被験物質をスクリーニングすることができる。
前記実施態様6のスクリーニング方法においては、より具体的には、例えば、被験物質の存在下に、ELMO1をコードする核酸及び/又はELMO2をコードする核酸を導入した哺乳動物細胞におけるELMO1及び/又はELMO2の発現量を測定するステップを行ない、被験物質の存在した場合にELMO1及び/又はELMO2の発現量が減少することを、該被験物質が、糖取込み促進剤であることの指標として、被験物質をスクリーニングすることができる。
(II)ELMO1遺伝子の第16イントロン、ELMO1遺伝子の第17イントロン及びELMO1遺伝子の第18イントロンからなる群より選ばれた少なくとも1種のイントロンにおいて糖尿病性腎症に罹患する可能性に関連する多型を検出するために用いられるプライマー対、
を用いて、PCR、ASO(Allele Specific Oligonucleotide hybridization法)、ALBUM(Aldehyde−Linker−Based Ultrasensitive Mismatch Scanning法)、マイクロアレイによる解析、clevageを用いた解析、インベーダー法、TaqManPCR、RFLP等を行なうことにより塩基配列の決定することにより検出されうる。
a) 第16イントロンの65015位のヌクレオチドを含む連続した10〜100ヌクレオチドの塩基配列又はそのアンチセンス鎖を有するプローブ、
b) 第16イントロンの65287位のヌクレオチドを含む連続した10〜100ヌクレオチドの塩基配列又はそのアンチセンス鎖を有するプローブ、
c) 第16イントロンの67363位のヌクレオチドを含む連続した10〜100ヌクレオチドの塩基配列又はそのアンチセンス鎖を有するプローブ、
d) 第16イントロンの79410位のヌクレオチドを含む連続した10〜100ヌクレオチドの塩基配列又はそのアンチセンス鎖を有するプローブ、
e) 第16イントロンの80716位のヌクレオチドを含む連続した10〜100ヌクレオチドの塩基配列又はそのアンチセンス鎖を有するプローブ、
f) 第16イントロンの101326位のヌクレオチドを含む連続した10〜100ヌクレオチドの塩基配列又はそのアンチセンス鎖を有するプローブ、
g) 第16イントロンの105612位のヌクレオチドを含む連続した10〜100ヌクレオチドの塩基配列又はそのアンチセンス鎖を有するプローブ、
h) 第16イントロンの114458位のヌクレオチドを含む連続した10〜100ヌクレオチドの塩基配列又はそのアンチセンス鎖を有するプローブ、
i) 第17イントロンの5495位のヌクレオチドを含む連続した10〜100ヌクレオチドの塩基配列又はそのアンチセンス鎖を有するプローブ、
j) 第17イントロンの6958位のヌクレオチドを含む連続した10〜100ヌクレオチドの塩基配列又はそのアンチセンス鎖を有するプローブ、及び
k) 第18イントロンの9170位のヌクレオチドを含む連続した10〜100ヌクレオチドの塩基配列又はそのアンチセンス鎖を有するプローブ、
等が挙げられる。
A) 第16イントロンの65015位から5’又は3’末端方向に0〜20ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを一端とする連続した15〜40ヌクレオチドの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、それに対応する方向に、該65015位に対応するアンチセンス鎖上のヌクレオチドから0〜20ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを一端とする連続した15〜40ヌクレオチドの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対、
B) 第16イントロンの65287位から5’又は3’末端方向に0〜20ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを一端とする連続した15〜40ヌクレオチドの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、それに対応する方向に、該65287位に対応するアンチセンス鎖上のヌクレオチドから0〜20ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを一端とする連続した15〜40ヌクレオチドの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対、
C) 第16イントロンの67363位から5’又は3’末端方向に0〜20ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを一端とする連続した15〜40ヌクレオチドの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、それに対応する方向に、該67363位に対応するアンチセンス鎖上のヌクレオチドから0〜20ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを一端とする連続した15〜40ヌクレオチドの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対、
D) 第16イントロンの79410位から5’又は3’末端方向に0〜20ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを一端とする連続した15〜40ヌクレオチドの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、それに対応する方向に、該79410位に対応するアンチセンス鎖上のヌクレオチドから0〜20ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを一端とする連続した15〜40ヌクレオチドの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対、
E) 第16イントロンの80716位から5’又は3’末端方向に0〜20ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを一端とする連続した15〜40ヌクレオチドの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、それに対応する方向に、該80716位に対応するアンチセンス鎖上のヌクレオチドから0〜20ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを一端とする連続した15〜40ヌクレオチドの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対、
F) 第16イントロンの101326位から5’又は3’末端方向に0〜20ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを一端とする連続した15〜40ヌクレオチドの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、それに対応する方向に、該101326位に対応するアンチセンス鎖上のヌクレオチドから0〜20ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを一端とする連続した15〜40ヌクレオチドの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対、
G) 第16イントロンの105612位から5’又は3’末端方向に0〜20ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを一端とする連続した15〜40ヌクレオチドの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、それに対応する方向に、該105612位に対応するアンチセンス鎖上のヌクレオチドから0〜20ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを一端とする連続した15〜40ヌクレオチドの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対、
H) 第16イントロンの114458位から5’又は3’末端方向に0〜20ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを一端とする連続した15〜40ヌクレオチドの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、それに対応する方向に、該114458位に対応するアンチセンス鎖上のヌクレオチドから0〜20ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを一端とする連続した15〜40ヌクレオチドの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対、
I) 第17イントロンにおける5495位から5’又は3’末端方向に0〜20ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを一端とする連続した15〜40ヌクレオチドの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、それに対応する方向に、該5495位に対応するアンチセンス鎖上のヌクレオチドから0〜20ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを一端とする連続した15〜40ヌクレオチドの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対、
J) 第17イントロンにおける6958位から5’又は3’末端方向に0〜20ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを一端とする連続した15〜40ヌクレオチドの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、それに対応する方向に、該6958位に対応するアンチセンス鎖上のヌクレオチドから0〜20ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを一端とする連続した15〜40ヌクレオチドの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対、及び
K) 第18イントロンにおける9170位から5’又は3’末端方向に0〜20ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを一端とする連続した15〜40ヌクレオチドの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、それに対応する方向に、該9170位に対応するアンチセンス鎖上のヌクレオチドから0〜20ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを一端とする連続した15〜40ヌクレオチドの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対、
等が挙げられる。
ELMO1イントロン16 +65015のCがTに置換したプローブ(121ヌクレオチド)(配列番号:17):
5'-AAGGAGTCTGGTGTCTTTTGCACATGATGATGTCAACTTGGGTCCCTCACATTGCCTTAGTGTCCTTCACCCAACCCACCAGTGCAGGACATAGTGGTCCTCCCCACCCCGCCCATTGTCT-3';
ELMO1イントロン16 +65015の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマー(配列番号:18):
5'-GCACATGATGAT GTCAACTTGG-3';
ELMO1イントロン16 +65015の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマー(配列番号:19):
5'-ATCTAGTTCATCCACTGAGCTC-3';
ELMO1イントロン16 +65015の塩基がCであるものを検出するプローブ(配列番号:20):
5'-TTGCCTTAGCGTCCTT-3';
ELMO1イントロン16 +65015の塩基がTであるものを検出するプローブ(配列番号:21):
5'-ATTGCCTTAGTGTCCTT-3';
ELMO1イントロン16 +65015の塩基がTであるかCであるかを検出するためのTaqman PCRプライマー(配列番号:22):
5'-CTGGTGTCTTTTGCACATGATGATG-3';
ELMO1イントロン16 +65015の塩基がTであるかCであるかを検出するためのTaqman PCRプライマー(配列番号:23):
5'-GCACTGGTGGGTTGGGT-3';
ELMO1イントロン16 +65287のCがGに置換したポリヌクレオチド(121ヌクレオチド)(配列番号:24):
5'-TTCTGCATGCTAGGAACCGACATAGGAGTTGGGGATAATAAGTCAAAGAACGCACAATAAGTCACTTGACTGTGTCTATGATAGACAAGTGTTTGCCTAGCTTATGTCACTTGAACTCGAC-3';
ELMO1イントロン16 +65287の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマー(配列番号:25):
5'-GCACATGATGATGTCAACTTGG-3';
ELMO1イントロン16 +65287の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマー(配列番号:26):
5'-ATCTAGTTCATCCACTGAGCTC-3';
ELMO1イントロン16 +65287の塩基がCであるものを検出するプローブ(配列番号:27):
5'-CAGTCAAGTGAGTTATT-3';
ELMO1イントロン16 +65287の塩基がGであるものを検出するプローブ(配列番号:28):
5'-CAGTCAAGTGACTTATT-3';
ELMO1イントロン16 +65287の塩基がTであるかCであるかを検出するためのTaqman PCRプライマー(配列番号:29):
5'-GCTAGGAACCGACATAGGAGTTG-3';
ELMO1イントロン16 +65287の塩基がTであるかCであるかを検出するためのTaqman PCRプライマー(配列番号:30):
5'-ACATAAGCTAGGCAAACACTTGTCT-3';
ELMO1イントロン16 +67363のAがGに置換したポリヌクレオチド(121ヌクレオチド)(配列番号:31):
5'-GTGGAGATCAGTCATTTCAATAACCTACCTCCGATGCCTTTCATTCCAGGATTCCAAAGGGGTTTCTTAAAAATGTCACTTCCTTGGGTTCTACAGTCCAAAGTGGGAATCTGTCTGATCT-3';
ELMO1イントロン16 +67363の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマー(配列番号:32):
5'-TGTCTTCATAGCATA GCATGAG-3';
ELMO1イントロン16 +67363の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマー:
5'-AGAATGTCATTACCTCAATCAGC-3'(配列番号:33);
ELMO1イントロン16 +67363の塩基がAであるものを検出するプローブ(配列番号:34):
5'-ACATTTTTAAGAAACTCCTTTG-3';
ELMO1イントロン16 +67363の塩基がGであるものを検出するプローブ(配列番号:35):
5'-ACATTTTTAAGAAACCCCTTTG-3';
ELMO1イントロン16 +67363の塩基がAであるかGであるかを検出するためのTaqman PCRプライマー(配列番号:36):
5'-CGATGCCTTTCATTCCAGGATTC-3';
ELMO1イントロン16 +67363の塩基がAであるかGであるかを検出するためのTaqman PCRプライマー(配列番号:37):
5'-GGACTGTAGAACCCAAGGAAGTG-3';
ELMO1イントロン16 +79410のCがGに置換したポリヌクレオチド(121ヌクレオチド)(配列番号:38):
5'-GCTTAGCGGAAACTCAGTAAATAATTGCTGTACAGCAGAGCTGTTGTCATTCAGATGGGAGGGGCAACTTGAAGTCCTGCCCCTTGATACTCCGAGGTGAGCCCTGCCTCTTTTGAACATT-3';
ELMO1イントロン16 +79410の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマー(配列番号:39):
5'-TAGAGTGTGGATGCTGCGAAGC-3';
ELMO1イントロン16 +79410の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマー(配列番号:40):
5'-CTAAGGTGAGAAGTGAGCTGTG-3';
ELMO1イントロン16 +79410の塩基がCであるものを検出するプローブ(配列番号:41):
5'-AAGTTGCCCGTCCCAT-3';
ELMO1イントロン16 +79410の塩基がCであるものを検出するプローブ(配列番号:42):
5'-CAAGTTGCCCCTCCCAT-3';
ELMO1イントロン16 +79410の塩基がCであるかGであるかを検出するためのTaqman PCRプライマー(配列番号:43):
5'-AAGGCTTAGCGGAAACTCAGTAAAT-3';
ELMO1イントロン16 +79410の塩基がCであるかGであるかを検出するためのTaqman PCRプライマー(配列番号:44):
5'-GGCTCACCTCGGAGTATCAAG-3';
ELMO1イントロン16 +80716のCがTに置換したポリヌクレオチド(121ヌクレオチド)(配列番号:45):
5'-GCTTTTTCTTCAGTTACAGAAGCATAAGACTCCATAGAACCTTCCAGCTTTGTTTCACTTTGTTCACTTAGTTTGTTTCACTTACTTTGCACTGTATTCTCACTGTTGCCCTTGCCCCCAC-3';
ELMO1イントロン16 +80716の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマー(配列番号:46):
5'-ACGTGCTCTGAGCTGCTTTG-3';
ELMO1イントロン16 +80716の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマー(配列番号:47):
5'-ACAGAACACTTAGTATAGCTGTG-3';
ELMO1イントロン16 +80716の塩基がCであるものを検出するプローブ(配列番号:48):
5'-AAACTAAGTGAACGAAGTGA-3';
ELMO1イントロン16 +80716の塩基がTであるものを検出するプローブ(配列番号:49):
5'-AAACTAAGTGAACAAAGTGA-3';
ELMO1イントロン16 +80716の塩基がCであるかTであるかを検出するためのTaqman PCRプライマー(配列番号:50):
5'-CTCCATAGAACCTTCCAGCTTTGTT-3';
ELMO1イントロン16 +80716の塩基がCであるかTであるかを検出するためのTaqman PCRプライマー(配列番号:51):
5'-CAACAGTGAGAATACAGTGCAAAGT-3';
ELMO1イントロン16 +101326のGがCに置換したポリヌクレオチド(121ヌクレオチド)(配列番号:52):
5'-TAGCTGACGTACATTCTCTGCATGGTGTTTACCCAACAGTCATCACTCATGTTTGCTCATCAGGTGTTGGGGTGATGAGCCGAGCTGCTGTATTCTCAGCTGGGCCTGGAGCCTGCTTAGT-3';
ELMO1イントロン16 +101326の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマー(配列番号:53):
5'-TCTACTACAGGTAAGTAGATACC-3';
ELMO1イントロン16 +101326の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマー(配列番号:54):
5'-AGCATTGTCTACTGCAGAATCTG-3';
ELMO1イントロン16 +101326の塩基がGであるものを検出するプローブ(配列番号:55):
5'-CAACACCTCATGAGCA-3';
ELMO1イントロン16 +101326の塩基がCであるものを検出するプローブ(配列番号:56):
5'-CAACACCTGATGAGCA-3';
ELMO1イントロン16 +101326の塩基がGであるかCであるかを検出するためのTaqman PCRプライマー(配列番号:57):
5'-TTTACCCAACAGTCATCACTCATGT-3';
ELMO1イントロン16 +101326の塩基がGであるかCであるかを検出するためのTaqman PCRプライマー(配列番号:58):
5'-AGCAGCTCGGCTCATCAC-3';
ELMO1イントロン16 +105612のCがTに置換したポリヌクレオチド(121ヌクレオチド)(配列番号:59):
5'-ATAATTGTTGTTTATTCTGTGTCCTCCAAAGGACTCATCAGTAAGGAAAGGGACTGCATTTGGGTGAGAGAATGGGAGACCCAGCAGATTTCTGGAAACCATTGCAATAACTGGCTTCACA-3';
ELMO1イントロン16 +105612の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマー(配列番号:60):
5'-ATTGACTTCAGCAGCCAAGATG-3';
ELMO1イントロン16 +105612の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマー(配列番号:61):
5'-CTGGCAAGTCTTCATGAAGGC-3';
ELMO1イントロン16 +105612の塩基がCであるものを検出するプローブ(配列番号:62):
5'-TCACCCGAATGCAG-3';
ELMO1イントロン16 +105612の塩基がTであるものを検出するプローブ(配列番号:63):
5'-TCACCCAAATGCAG-3';
ELMO1イントロン16 +105612の塩基がCであるかTであるかを検出するためのTaqman PCRプライマー(配列番号:64):
5'-CTCCAAAGGACTCATCAGTAAGGAA-3';
ELMO1イントロン16 +105612の塩基がCであるかTであるかを検出するためのTaqman PCRプライマー(配列番号:65):
5'-GCCAGTTATTGCAATGGTTTCCA-3';
ELMO1イントロン16 +114458のCがTに置換したポリヌクレオチド(121ヌクレオチド)(配列番号:66):
5'-GCTCCCCTGTGACATCGCGTCTTCCCTTGGGTGAGGCAAGTATGTGTCTTTCCACTGTCCTAGGCTGAGAGCTCATCCGGCACAGGGCCTCCAGTGTCGCGTCATTCCTTGCACTGAGTAG-3';
ELMO1イントロン16 +114458の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマー(配列番号:67):
5'-TCAGCCTGTCTGCATGTGGC-3';
ELMO1イントロン16 +114458の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマー(配列番号:68):
5'-TCTATGGTCACTCTGCATGTC-3';
ELMO1イントロン16 +114458の塩基がCであるものを検出するプローブ(配列番号:69):
5'-TCTCAGCCTGGGACAG-3';
ELMO1イントロン16 +114458の塩基がTであるものを検出するプローブ(配列番号:70):
5'-CTCTCAGCCTAGGACAG-3';
ELMO1イントロン16 +114458の塩基がCであるかTであるかを検出するためのTaqman PCRプライマー(配列番号:71):
5'-GTGAGGCAAGTATGTGTCTTTCCA-3';
ELMO1イントロン16 +114458の塩基がCであるかTであるかを検出するためのTaqman PCRプライマー(配列番号:72):
5'-GCCCTGTGCCGGATGAG-3';
ELMO1イントロン17 +5495のGがAに置換したポリヌクレオチド(121ヌクレオチド)(配列番号:73):
5'-ACTTTCTTTTCCACTCAGTGCAGGGTTCTTCAAAGCTGCAATTTACTGAGTCCATTTTAGATAGAGCTAAGTGCTGATAATAAATAGTTTAGTGATCTGAAAGCCTGAAATGAGACCCTAA-3';
ELMO1イントロン17 +5495の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマー(配列番号:74):
5'-ATAACTCAACCCTGGCCTAGTG-3';
ELMO1イントロン17 +5495の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマー(配列番号:75):
5'-TAAGCACTGAGCAGGAATGTAAG-3';
ELMO1イントロン17 +5495の塩基がGであるものを検出するプローブ(配列番号:76):
5'-ACTTAGCTCTACCTAAAAT-3';
ELMO1イントロン17 +5495の塩基がAであるものを検出するプローブ(配列番号:77):
5'-CACTTAGCTCTATCTAAAAT-3';
ELMO1イントロン17 +5495の塩基がGであるかAであるかを検出するためのTaqman PCRプライマー(配列番号:78):
5'- GGGTTCTTCAAAGCTGCAATTTACT-3';
ELMO1イントロン17 +5495の塩基がGであるかAであるかを検出するためのTaqman PCRプライマー(配列番号:79):
5'-GTCTCATTTCAGGCTTTCAGATCAC-3';
ELMO1イントロン17 +6958のTがCに置換したポリヌクレオチド(121ヌクレオチド)(配列番号:80):
5'-ATAAAAGAAGAAAATTTTCAGGACACTTTGCTCTGGAAAAACATCACTGAAGTAGCTGGTCCTTTTGTGGAATTCTGTAAATGTCACAGAATCTATTGTGGTGTTGTACTTATGCCCCTGG-3';
ELMO1イントロン17 +6958の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマー(配列番号:81):
5'-TGATTGTCTTAGCAGTGCTGAATG-3';
ELMO1イントロン17 +6958の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマー(配列番号:82):
5'-AACAGTGAGTGCCAGCTCTC-3';
ELMO1イントロン17 +6958の塩基がTであるものを検出するプローブ
5'-CCACAAAAGAACCAGC-3'(配列番号:83);
ELMO1イントロン17 +6958の塩基がCであるものを検出するプローブ(配列番号:84):
5'-TCCACAAAAGGACCAGC-3';
ELMO1イントロン17 +6958の塩基がTであるかCであるかを検出するためのTaqman PCRプライマー(配列番号:85):
5'-CATAACTTTGTATCCGTGGCTTTGT-3';
ELMO1イントロン17 +6958の塩基がTであるかCであるかを検出するためのTaqman PCRプライマー(配列番号:86):
5'-GGGCATAAGTACAACACCACAATAGA-3';
ELMO1イントロン18 +9170のGがAに置換したポリヌクレオチド(121ヌクレオチド)(配列番号:87):
5'-TAAATGAATAAGGAGCAGTTCCCATGGTGGTTATCATTAGTGATAACATAACCTCTGGAAACCACCACCTCATAAAATCTATTGCTATTGAGCTTGAAGAGTTCAATGACTTTACTAATGG-3';
ELMO1イントロン18 +9170の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマー(配列番号:88):
5'-TGGTCATACCTATCCAGAGAAG-3';
ELMO1イントロン18 +9170の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマー(配列番号:89):
5'-CCTGGAGGAAACAAGCAGTTC-3';
ELMO1イントロン18 +9170の塩基がGであるものを検出するプローブ(配列番号:90):
5'-ATGACGTGGCAGACCTTCCAGAGGTTATGTTATCA-3';
ELMO1イントロン18 +9170の塩基がAであるものを検出するプローブ(配列番号:91):
5'-CGCGCCGAGGTTTCCAGAGGTTATGTTATCA-3';
ELMO1イントロン18 +9170の塩基がGであるかAであるかを検出するためのインベーダープローブ(配列番号:92):
5'-TAGATTTTATGAGGTGGTGGN-3'
等が挙げられる。
インフォームドコンセントの下、滋賀医科大学、東京女子医科大学、順天堂大学、川崎医科大学、岩手医科大学、又は千葉徳洲会病院に定期的に来診する2型糖尿病患者を対象として実験を行なった。
1)糖尿病性腎症症例:糖尿病網膜症と、明らかな糖尿病性腎症(200μg/分を超える尿中アルブミン排泄率若しくは300mg/gCrを超える尿中アルブミン/クレアチニン比)とを伴う患者、又は慢性透析療法を受けている患者、及び
2)対照群:腎機能障害の兆候を示していないが糖尿病網膜症を伴う患者〔20μg/分未満の尿中アルブミン排泄率若しくは30mg/gCr未満の尿中アルブミン/クレアチニン比〕
により2つのグループに分類した。
糖尿病性腎症の病因におけるELMO1遺伝子の考えうる役割を調べるため、インサイチュハイブリダイゼーションにより、正常マウス腎臓における本遺伝子の発現パターンを調べた。
正常グルコース濃度(5.5mM)又は高グルコース濃度(25mM)で培養されたCOS細胞において、ELMO1遺伝子の発現に対するグルコースの影響を調べた。
ELMO1について、
センスプライマー:5'-ccggattgtgcttgagaaca-3'(配列番号:3)、
アンチセンスプライマー:5'-ctcactaggcaactcgccca-3'(配列番号:4)、
フィブロネクチンについて、
センスプライマー:5'-gctcagaatccaagcggaga-3'(配列番号:5)、
アンチセンスプライマー:5'-ctttcccaagcaattttgatgg-3'(配列番号:6)、
I型コラーゲン(アルファ1)について、
センスプライマー:5'-caccaatcacctgcgtacaga-3'(配列番号:7)、
アンチセンスプライマー:5'-caccaatcacctgcgtacaga-3'(配列番号:8)、
TGF−β1について、
センスプライマー:5'-aggtcacccgcgtgctaat-3'(配列番号:9)、
アンチセンスプライマー:5'-ggttcaggtaccgcttctcg-3'(配列番号:10)、
マトリックスメタロプロテイナーゼ−2(MMP−2)について、
センスプライマー:5'-gatgccgcctttaactggag-3'(配列番号:11)、
アンチセンスプライマー:5'-catctgcgatgagcttggg-3'(配列番号:12)、
マトリックスメタロプロテイナーゼ−3(MMP−3)について、
センスプライマー:5'-tttctcgttgctgctcatgaa-3'(配列番号:13)、
アンチセンスプライマー:5'-gagacaggcggaaccgagt-3'(配列番号:14)、
GAPDHについて
センスプライマー:5'-gctcagaatccaagcggaga-3'(配列番号:15)、
アンチセンスプライマー:5'-ctttcccaagcaattttgatgg-3'(配列番号:16)
を用いて行なった。
ついで、ELMO1遺伝子を発現させた細胞を用い、細胞外マトリックス遺伝子、TGF−β1遺伝子及びマトリックスメタロプロテアーゼ遺伝子の発現に対する過剰のELMO1遺伝子影響を調べた。
被験個体の末梢血より、慣用の核酸抽出法で核酸含有試料を調製する。ELMO1の第18イントロンの領域の核酸を基に作製されたSNP検出用マイクロアレイに、前記核酸含有試料を供して、ハイブリダイズさせ、生じるDNAハイブリッドの一方のDNA鎖について、4種の蛍光標識ジデオキシヌクレオチドとDNAポリメラーゼとを用いて、プライマー伸長させる。SNPが、存在する部分の塩基に取り込まれた蛍光を指標として検出されることに基づき、核酸含有試料が、糖尿病性腎症の発症に寄与する核酸を含むことが示され、被験個体が、糖尿病性腎症を発症しているか、あるいは、将来発症する可能性があると判断される。
pCDNA3.1−ELMO1を、エレクトロポレーション法により、哺乳動物腎臓由来細胞(COS7細胞、HEK293細胞等)に導入する。得られた形質転換細胞を、化合物ライブラリーの化合物を含有したDMEM培地において、5% CO2、37℃で4〜24時間培養する。また、対照として、前記化合物ライブラリーの化合物を含まないDMEM培地において、同様に培養する。培養後の細胞から、全RNAを抽出する。ついで、全RNAを鋳型とし、前記実施例2と同様に、フィブロネクチン、I型コラーゲン(アルファ1)、TGF−β1、マトリックスメタロプロテイナーゼ−2(MMP−2)、マトリックスメタロプロテイナーゼ−3(MMP−3)及びGAPDHのそれぞれに対するプライマーを用いて、定量的RT−PCRを行なう。GAPDHの結果により、数値を正規化し、化合物存在下及び非存在下におけるフィブロネクチン、I型コラーゲン(アルファ1)、TGF−β1、マトリックスメタロプロテイナーゼ−2(MMP−2)及びマトリックスメタロプロテイナーゼ−3(MMP−3)それぞれの発現量を評価する。
インスリン抵抗性モデル動物について、1) インスリン抵抗性改善剤であるピオグリタゾンの投与〔ピオグリタゾン投与群〕、2) 食餌制限〔食餌制限群〕、又は3) 食餌制限と運動負荷との組み合わせ〔食餌制限+運動負荷群〕による処理を行なった。
センスプライマー:5'-TCAACAAGGTAATGCAGGTGGT-3'(配列番号:93)、
アンチセンスプライマー:5'-TGGCGGATTTTCAGGATCTC-3'(配列番号:94)、
ELMO2について、
センスプライマー:5'- GCCGGCAAGAAAGGTTCTG-3'(配列番号:95)、
アンチセンスプライマー:5'- TCACCATAATGCAAAACCTTGTG-3'(配列番号:96)、
GAPDHについて
センスプライマー:5'- TGCACCACCAACTGCTTAGC-3'(配列番号:97)、
アンチセンスプライマー:5'- GGATGCAGGGATGATGTTCTG-3'(配列番号:98)
を用いた。
ヒトELMO1及びELMO2(GenBankアクセッション番号:NM_014800、NM_133171)の塩基配列に基づき、Human Skeletal Muscle Marathon−Ready cDNA(商品名、クローンテック社製)より、ヒトELMO1及びELMO2 cDNA全長をPCRにより増幅し、PCR−BluntII−TOPOベクター(商品名、インビトロジェン社)へクローニングした。
前記実施例7で得られたヒトELMO発現細胞株を用いて、グルコース取りこみ活性の測定を行なった。CytoStar−T plate(商品名、アマシャムバイオサイエンシーズ社製)に、細胞を2×104細胞/ウェルとなるように播種し、CO2インキュベーターで37℃、一晩培養した。
Claims (22)
- 被検験物質の存在下に、ELMO1の発現量若しくはELMO1を発現させることにより引き起こされる事象を評価し、該発現量の減少若しくは該事象の阻害をもたらす被験物質を選別することを特徴とする、糖尿病性腎症の治療又は予防薬のスクリーニング方法。
- 被験物質の存在下に、ELMO1をコードする核酸を導入した哺乳動物細胞におけるELMO1の発現量を測定するステップを含み、ここで、被験物質の存在した場合にELMO1の発現量が減少することを、該被験物質が糖尿病性腎症の治療又は予防薬であることの指標とする、請求項1記載の方法。
- 被験物質の存在下に、ELMO1及び/又はELMO2の発現量若しくはELMO1及び/又はELMO2を発現させることにより引き起こされる事象を評価し、該発現量の減少若しくは該事象の阻害をもたらす被験物質を選別することを特徴とする、糖尿病の治療又は予防薬のスクリーニング方法。
- 被験物質の存在下に、ELMO1をコードする核酸及び/又はELMO2をコードする核酸を導入した哺乳動物細胞におけるELMO1及び/又はELMO2の発現量を測定するステップを含み、ここで、被験物質の存在した場合にELMO1及び/又はELMO2の発現量が減少することを、該被験物質が糖尿病の治療又は予防薬であることの指標とする、請求項3記載の方法。
- 被験物質存在下に、ELMO1をコードする核酸を導入した哺乳動物細胞における細胞外基質の量を測定するステップを含み、ここで、被験物質の存在した場合に細胞外基質の産生が抑制されることを、該被験物質が糖尿病性腎症の治療又は予防薬であることの指標とする、請求項1記載の方法。
- 被験物質存在下に、ELMO1及び/又はELMO2の発現量を評価し、該発現量の減少をもたらす被験物質を選別することを特徴とする、細胞外基質産生抑制剤のスクリーニング方法。
- 細胞外基質がI型コラーゲン又はフィブロネクチンである、請求項5又は6記載の方
法。 - 被験物質存在下に、ELMO1をコードする核酸を導入した哺乳動物細胞におけるマトリックスメタロプロテイナーゼの量をするステップを含み、ここで、被験物質の存在した場合にマトリックスメタロプロテイナーゼ産生が促進されることを、該被験物質が糖尿病性腎症の治療又は予防薬であることの指標とする、請求項1記載の方法。
- 被験物質存在下に、ELMO1及び/又はELMO2の発現量を評価し、該発現量の増加をもたらす被験物質を選別することを特徴とする、マトリックスメタロプロテイナーゼ産生促進剤のスクリーニング方法。
- マトリックスメタロプロテイナーゼがマトリックスメタロプロテイナーゼ−2又はマトリックスメタロプロテイナーゼ−3である、請求項8又は9記載の方法。
- 被験物質存在下に、ELMO1をコードする核酸を導入した哺乳動物細胞におけるサイトカインの量をするステップを含み、ここで、被験物質の存在した場合にサイトカイン産生が抑制されることを、該被験物質が糖尿病性腎症の治療又は予防薬であることの指標とする、請求項1記載の方法。
- 被験物質存在下に、ELMO1及び/又はELMO2の発現量を評価し、該発現量の減少をもたらす被験物質を選別することを特徴とする、サイトカイン産生抑制剤のスクリーニング方法。
- サイトカインがTGF−βである請求項11又は12記載の方法。
- 被験物質存在下に、ELMO1をコードする核酸及び/又はELMO2をコードする核酸を導入した哺乳動物細胞における糖の取込み量をするステップを含み、ここで、被験物質の存在した場合に糖の取込み量が増加することを、該被験物質が糖尿病の治療又は予防薬であることの指標とする、請求項3記載の方法。
- 被験物質存在下に、ELMO1及び/又はELMO2の発現量を評価し、該発現量の減少をもたらす被験物質を選別することを特徴とする、糖取込み促進剤のスクリーニング方法。
- ELMO1遺伝子の第16イントロン、第17イントロン及び第18イントロンからなる群より選ばれた少なくとも1種のヌクレオチドにおける多型を検出することを特徴とする、糖尿病性腎症の診断方法。
- 該多型が、第16イントロンにおける65015位、65287位、67363位、79410位、80716位、101326位、105612位、114458位、第17イントロンにおける5495位、6958位及び第18イントロンにおける9170位のヌクレオチドからなる群より選ばれた少なくとも1種のヌクレオチドにおける多型である、請求項16記載の診断方法。
- ELMO1遺伝子の第16イントロン、第17イントロン及び第18イントロンからなる群より選ばれた少なくとも1種のヌクレオチドにおける多型を検出することを特徴とする、糖尿病性腎症の発症に寄与する核酸の検出方法。
- 該多型が、第16イントロンにおける65015位、65287位、67363位、79410位、80716位、101326位、105612位、114458位、第17イントロンにおける5495位、6958位及び第18イントロンにおける9170位のヌクレオチドからなる群より選ばれた少なくとも1種のヌクレオチドにおける多型である、請求項18記載の検出方法。
- (I)ELMO1遺伝子の第16イントロン、第17イントロン及び第18イントロンからなる群より選ばれた少なくとも1種のイントロンにおいて糖尿病性腎症に罹患する可能性に関連する多型を検出するために用いられるプローブ、及び/又は
(II)ELMO1遺伝子の第16イントロン、第17イントロン及び第18イントロンからなる群より選ばれた少なくとも1種のイントロンにおいて糖尿病性腎症に罹患する可能性に関連する多型を検出するために用いられるプライマー対、
を含む、糖尿病性腎症の診断キット。 - (I’)ELMO1遺伝子の第16イントロンにおける65015位、65287位、67363位、79410位、80716位、101326位、105612位、114458位、第17イントロンにおける5495位、6958位及び第18イントロンにおける9170位のヌクレオチドからなる群より選ばれた少なくとも1種のヌクレオチドにおける多型を検出するために用いられるプローブ、及び/又は
(II’)ELMO1遺伝子の第16イントロンにおける65015位、65287位、67363位、79410位、80716位、101326位、105612位、114458位、第17イントロンにおける5495位、6958位及び第18イントロンにおける9170位のヌクレオチドからなる群より選ばれた少なくとも1種のヌクレオチドにおける多型を検出するために用いられるプライマー対、
を含む、請求項20記載の糖尿病性腎症の診断キット。 - (I’’)ELMO1遺伝子の塩基配列において、
a) 第16イントロンの65015位のヌクレオチドを含む連続した10〜100ヌクレオチドの塩基配列又はそのアンチセンス鎖を有するプローブ、
b) 第16イントロンの65287位のヌクレオチドを含む連続した10〜100ヌクレオチドの塩基配列又はそのアンチセンス鎖を有するプローブ、
c) 第16イントロンの67363位のヌクレオチドを含む連続した10〜100ヌクレオチドの塩基配列又はそのアンチセンス鎖を有するプローブ、
d) 第16イントロンの79410位のヌクレオチドを含む連続した10〜100ヌクレオチドの塩基配列又はそのアンチセンス鎖を有するプローブ、
e) 第16イントロンの80716位のヌクレオチドを含む連続した10〜100ヌクレオチドの塩基配列又はそのアンチセンス鎖を有するプローブ、
f) 第16イントロンの101326位のヌクレオチドを含む連続した10〜100ヌクレオチドの塩基配列又はそのアンチセンス鎖を有するプローブ、
g) 第16イントロンの105612位のヌクレオチドを含む連続した10〜100ヌクレオチドの塩基配列又はそのアンチセンス鎖を有するプローブ、
h) 第16イントロンの114458位のヌクレオチドを含む連続した10〜100ヌクレオチドの塩基配列又はそのアンチセンス鎖を有するプローブ、
i) 第17イントロンの5495位のヌクレオチドを含む連続した10〜100ヌクレオチドの塩基配列又はそのアンチセンス鎖を有するプローブ、
j) 第17イントロンの6958位のヌクレオチドを含む連続した10〜100ヌクレオチドの塩基配列又はそのアンチセンス鎖を有するプローブ、及び
k) 第18イントロンの9170位のヌクレオチドを含む連続した10〜100ヌクレオチドの塩基配列又はそのアンチセンス鎖を有するプローブ、
からなる群より選ばれた少なくとも1種のプローブ、及び/又は
(II’’)ELMO1遺伝子の塩基配列において、
A) 第16イントロンの65015位から5’又は3’末端方向に0〜20ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを一端とする連続した15〜40ヌクレオチドの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、それに対応する方向に、該65015位に対応するアンチセンス鎖上のヌクレオチドから0〜20ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを一端とする連続した15〜40ヌクレオチドの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対、
B) 第16イントロンの65287位から5’又は3’末端方向に0〜20ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを一端とする連続した15〜40ヌクレオチドの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、それに対応する方向に、該65287位に対応するアンチセンス鎖上のヌクレオチドから0〜20ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを一端とする連続した15〜40ヌクレオチドの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対、
C) 第16イントロンの67363位から5’又は3’末端方向に0〜20ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを一端とする連続した15〜40ヌクレオチドの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、それに対応する方向に、該67363位に対応するアンチセンス鎖上のヌクレオチドから0〜20ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを一端とする連続した15〜40ヌクレオチドの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対、
D) 第16イントロンの79410位から5’又は3’末端方向に0〜20ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを一端とする連続した15〜40ヌクレオチドの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、それに対応する方向に、該79410位に対応するアンチセンス鎖上のヌクレオチドから0〜20ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを一端とする連続した15〜40ヌクレオチドの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対、
E) 第16イントロンの80716位から5’又は3’末端方向に0〜20ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを一端とする連続した15〜40ヌクレオチドの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、それに対応する方向に、該80716位に対応するアンチセンス鎖上のヌクレオチドから0〜20ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを一端とする連続した15〜40ヌクレオチドの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対、
F) 第16イントロンの101326位から5’又は3’末端方向に0〜20ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを一端とする連続した15〜40ヌクレオチドの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、それに対応する方向に、該101326位に対応するアンチセンス鎖上のヌクレオチドから0〜20ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを一端とする連続した15〜40ヌクレオチドの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対、
G) 第16イントロンの105612位から5’又は3’末端方向に0〜20ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを一端とする連続した15〜40ヌクレオチドの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、それに対応する方向に、該105612位に対応するアンチセンス鎖上のヌクレオチドから0〜20ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを一端とする連続した15〜40ヌクレオチドの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対、
H) 第16イントロンの114458位から5’又は3’末端方向に0〜20ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを一端とする連続した15〜40ヌクレオチドの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、それに対応する方向に、該114458位に対応するアンチセンス鎖上のヌクレオチドから0〜20ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを一端とする連続した15〜40ヌクレオチドの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対、
I) 第17イントロンにおける5495位から5’又は3’末端方向に0〜20ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを一端とする連続した15〜40ヌクレオチドの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、それに対応する方向に、該5495位に対応するアンチセンス鎖上のヌクレオチドから0〜20ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを一端とする連続した15〜40ヌクレオチドの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対、
J) 第17イントロンにおける6958位から5’又は3’末端方向に0〜20ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを一端とする連続した15〜40ヌクレオチドの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、それに対応する方向に、該6958位に対応するアンチセンス鎖上のヌクレオチドから0〜20ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを一端とする連続した15〜40ヌクレオチドの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対、及び
K) 第18イントロンにおける9170位から5’又は3’末端方向に0〜20ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを一端とする連続した15〜40ヌクレオチドの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、それに対応する方向に、該9170位に対応するアンチセンス鎖上のヌクレオチドから0〜20ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを一端とする連続した15〜40ヌクレオチドの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対、
からなる群より選ばれた少なくとも1種のプライマー対、
を含有してなる、請求項20又は21記載の糖尿病性腎症の診断キット。
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