JP2003235573A - 糖尿病性腎症マーカーおよびその利用 - Google Patents

糖尿病性腎症マーカーおよびその利用

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JP2003235573A
JP2003235573A JP2002035132A JP2002035132A JP2003235573A JP 2003235573 A JP2003235573 A JP 2003235573A JP 2002035132 A JP2002035132 A JP 2002035132A JP 2002035132 A JP2002035132 A JP 2002035132A JP 2003235573 A JP2003235573 A JP 2003235573A
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protein
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acid sequence
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Hidehito Sugaru
英仁 須軽
Junji Ichihara
準二 市原
Koji Hayashi
浩司 林
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Sumitomo Pharmaceuticals Co Ltd
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Sumitomo Pharmaceuticals Co Ltd
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Abstract

(57)【要約】 (修正有) 【課題】糖尿病性腎症を反映する疾患マーカー、該疾患
マーカーを利用した糖尿病性腎症の検出方法、該疾患の
改善に有用な薬物のスクリーニング方法を提供する。 【解決手段】特定の塩基配列における連続する少なくと
も15塩基を有するポリヌクレオチドおよび/またはそれ
に相補的なポリヌクレオチドを、糖尿病性腎症の疾患マ
ーカーとして利用する。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は糖尿病性腎症の診断
に有用な疾患マーカーに関する。より詳細には、本発明
は糖尿病性腎症の遺伝子診断において、プライマーまた
は検出プローブとして有効に利用できる疾患マーカーに
関する。また本発明は、かかる疾患マーカーを利用した
糖尿病性腎症の検出方法(診断方法)に関する。
【0002】さらに本発明は、上記疾患マーカーを利用
して、糖尿病性腎症の予防薬、改善薬または治療薬とし
て有効な物質をスクリーニングする方法、並びに該方法
で調製される上記物質を有効成分とする糖尿病性腎症の
予防薬、改善薬または治療薬に関する。
【0003】
【従来の技術】近年、糖尿病性腎症から透析導入(末期
腎疾患)へ至る患者は年々増加しており透析治療に費や
す医療費は莫大なものとなりつつある。また、これまで
インスリン分泌不全の1型糖尿病から糖尿病性腎症に至
るケースが多く見られていたが、近年、食生活の西洋化
や社会的ストレスの増加などにより、2型糖尿病患者の
増加が著しく、2型糖尿病から糖尿病性腎症に至るケー
スが急増している。
【0004】糖尿病性腎症の治療には、血糖コントロー
ルに加えて、血圧調整剤などを用いた薬物療法が行われ
てきているが、これらの薬物療法では、根本的な病態の
改善は困難であり、せいぜい末期腎疾患に至るまでの時
期を遅延できる程度の効果しか得られないのが現状であ
る。また、薬物療法によって腎機能が回復できる場合と
いえども、この回復に至るまでには通常長期間を要する
ため、長期に亘る継続投与が可能な安全な薬剤が望まれ
ている。
【0005】糖尿病性腎症の発生機序としては、高血糖
状態による糖代謝異常により腎臓メサンギウム細胞など
が細胞外マトリックスを過剰産生し、これが糸球体に蓄
積することにより腎臓の機能障害が発生すると考えられ
ている。この発生機序の観点から、血糖コントロールに
加えて、機能障害を可逆的に回復させるための、より積
極的な薬物乃至治療法の確立が切望されている。
【0006】腎機能の診断は、現在、尿採取による尿中
蛋白質検査などの簡便な健診により行われている。
【0007】一方で、最近の医療現場では、糖尿病性腎
症に限らず、個々の患者の症状に合わせて治療法を的確
に選択することが望まれるようになってきている。高齢
化社会でのQOL(Quality of life)向上の必要性が認識さ
れてきた近年では、特に、万人に共通した治療ではな
く、個々の患者の症状に合わせて適切な治療が施される
ことが強く求められている。このような所謂テイラーメ
イド治療を行うためには、個々の疾患について患者の症
状やその原因(遺伝的背景)を的確に反映する疾患マーカ
ーが有用であり、その探索並びに開発を目指した研究が
精力的に行われているのが現状である。
【0008】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、糖尿病性腎
症の診断、治療などに有用な疾患マーカーを提供するこ
とを目的とする。より詳細には、本発明は糖尿病性腎症
を特異的に反映した疾患マーカーを提供することを目的
とする。さらに本発明は該疾患マーカーを利用した糖尿
病性腎症の検出方法(遺伝子診断方法)、該疾患の予防、
改善または治療に有用な薬物をスクリーニングする方
法、並びに該疾患の予防、改善または治療に有用な薬物
を提供することを目的とする。
【0009】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために糖尿病患者の腎臓組織において発現変
動する遺伝子につき鋭意検討を行っていたところ、後述
する配列表において配列番号:1、2、3、4、5、6、7、
8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、
21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、3
3、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、4
5、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、5
7、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、6
9、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、8
1、82、83、84、85および86(以下、本明細書において
「配列番号:1-86」ともいう)で示される塩基配列を有
する遺伝子の発現が、正常な腎臓組織に比して、上記疾
患患者の腎臓組織において有意に上昇することを見出し
た。
【0010】また、配列番号:87、88、89、90、91、9
2、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、10
3、104、105、106、107、108、109、110、111、112、11
3、114、115、116、117、118、119、120、121、122、12
3、124、125、126、127、128、129、130、131、132、13
3、134、135、136、137、138、139、140、141、142、14
3、144、145、146、147、148、149、150、151、152、15
3、154、155、156、157、158および159(以下、本明細書
において「配列番号:87-159」ともいう)で示される塩
基配列を有する遺伝子の発現が、正常な腎臓組織に比し
て、上記疾患患者の腎臓組織において有意に抑制される
ことを見出した。
【0011】これらのことから、本発明者らは、かかる
遺伝子が糖尿病性腎症の疾患マーカーとなり得るとの確
信を得た。本発明はかかる知見を基礎として完成された
ものである。
【0012】すなわち、本発明は、下記に掲げるもので
ある:項1. 配列番号:1、2、3、4、5、6、7、8、9、1
0、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、2
2、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、3
4、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、4
6、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、5
8、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、7
0、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、8
2、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、9
4、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、10
5、106、107、108、109、110、111、112、113、114、11
5、116、117、118、119、120、121、122、123、124、12
5、126、127、128、129、130、131、132、133、134、13
5、136、137、138、139、140、141、142、143、144、14
5、146、147、148、149、150、151、152、153、154、15
5、156、157、158および159(以下、本明細書において
「配列番号:1-159」ともいう)のいずれかに記載の塩基
配列において、連続する少なくとも15塩基を有するポリ
ヌクレオチドおよび/またはそれに相補的なポリヌクレ
オチドからなる、糖尿病性腎症疾患マーカー。
【0013】項2. 糖尿病性腎症検出においてプローブ
またはプライマーとして使用される項1に記載の疾患マ
ーカー。
【0014】項3. 配列番号:160、161、162、163、16
4、165、166、167、168、169、170、171、172および173
(以下、本明細書において「配列番号:160-173」ともい
う)のいずれかに記載のアミノ酸配列を有する蛋白質を
認識する抗体である糖尿病性腎症の疾患マーカー。
【0015】項4. 糖尿病性腎症の検出においてプロー
ブとして使用される項3に記載の疾患マーカー。
【0016】項5. 下記の工程(a)、(b)および(c)を含む
糖尿病性腎症の検出方法: (a) 被験者の生体試料から調製されたRNAまたはそれか
ら転写された相補的なポリヌクレオチドと項1または2に
記載の疾患マーカーとを結合させる工程、(b) 該疾患マ
ーカーに特異的に結合した生体試料由来のRNAまたはそ
れから転写された相補的なポリヌクレオチドを、上記疾
患マーカーを指標として測定する工程、(c) 上記(b)の
測定結果に基づいて、糖尿病性腎症の罹患を判断する工
程。
【0017】項6. 下記の工程(a)、(b)および(c)を含む
糖尿病性腎症の検出方法: (a) 被験者の生体試料から調製されたRNAまたはそれか
ら転写された相補的なポリヌクレオチドと、項1または2
に記載の疾患マーカーのうち、配列番号:1-86のいずれ
かに記載の塩基配列に基づく疾患マーカーとを結合させ
る工程、(b) 上記疾患マーカーに特異的に結合した生体
試料由来のRNAまたはそれから転写された相補的なポリ
ヌクレオチドを、上記疾患マーカーを指標として測定す
る工程、(c) 上記(b)で得られる被験者の測定結果が、
正常な生体試料について得られる結果に比して疾患マー
カーへの結合量が増大していることを指標として、糖尿
病性腎症の罹患を判断する工程。
【0018】項7. 下記の工程(a)、(b)および(c)を含む
糖尿病性腎症の検出方法: (a) 被験者の生体試料から調製されたRNAまたはそれか
ら転写された相補的なポリヌクレオチドと、項1または2
に記載の疾患マーカーのうち、配列番号:87-159のいず
れかに記載の塩基配列に基づく疾患マーカーとを結合さ
せる工程、(b) 上記疾患マーカーに特異的に結合した生
体試料由来のRNAまたはそれから転写された相補的なポ
リヌクレオチドを、上記疾患マーカーを指標として測定
する工程、(c) 上記(b)で得られる被験者の測定結果
が、正常な生体試料について得られる結果に比して疾患
マーカーへの結合量が減少していることを指標として、
糖尿病性腎症の罹患を判断する工程。
【0019】項8. 下記の工程(a)、(b)および(c)を含む
糖尿病性腎症の検出方法: (a) 被験者の生体試料から調製された蛋白質と項3また
は4に記載の疾患マーカーとを結合させる工程、(b) 該
疾患マーカーに結合した生体試料由来の蛋白質またはそ
の部分ペプチドを、上記疾患マーカーを指標として測定
する工程、(c) 上記(b)の測定結果に基づいて、糖尿病
性腎症の罹患を判断する工程。
【0020】項9. 工程(a)において用いられる疾患マー
カーが、配列番号:160、161、162、163、164、165、16
6、167、168、169、170および171(以下、本明細書にお
いて「配列番号:160-171」ともいう)のいずれかに記載
のアミノ酸配列を有する蛋白質を認識する抗体であり、
且つ工程(c)における糖尿病性腎症の罹患の判断が、被
験者について得られる測定結果を正常者について得られ
る測定結果と対比して、疾患マーカーへの結合量が増大
していることを指標としてなされるものである項8に記
載の糖尿病性腎症の検出方法。
【0021】項10. 工程(a)において用いられる疾患マ
ーカーが、配列番号:172または173で示されるアミノ酸
配列を有する蛋白質を認識する抗体であり、且つ工程
(c)における糖尿病性腎症の罹患を判断する工程が、被
験者について得られる測定結果を正常者について得られ
る測定結果と対比して、疾患マーカーへの結合量が減少
していることを指標として判断するものである項8に記
載の糖尿病性腎症の検出方法。
【0022】項11. 下記の工程(a)、(b)および(c)を含
む配列番号:1-159のいずれかに記載の塩基配列を有す
る遺伝子の発現を制御する物質のスクリーニング方法: (a) 被験物質と配列番号:1-159のいずれかに記載の塩
基配列を有する遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる
工程、(b) 被験物質を接触させた細胞の、配列番号:1-
159のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の発現
量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細
胞の上記対応する遺伝子の発現量と比較する工程、(c)
上記(b)の比較結果に基づいて、配列番号:1-159のいず
れかに記載の塩基配列を有する遺伝子の発現量を変動さ
せる被験物質を選択する工程。
【0023】項12. 下記の工程(a)、(b)および(c)を含
む配列番号:1-86のいずれかに記載の塩基配列を有する
遺伝子の発現を抑制する物質のスクリーニング方法: (a) 被験物質と配列番号:1-86のいずれかに記載の塩基
配列を有する遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工
程、(b) 被験物質を接触させた細胞の、配列番号:1-86
のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の発現量を
測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞の
上記対応する遺伝子の発現量と比較する工程、(c) 上記
(b)の比較結果に基づいて、配列番号:1-86のいずれか
に記載の塩基配列を有する遺伝子の発現量を減少させる
被験物質を選択する工程。
【0024】項13. 下記の工程(a)、(b)および(c)を含
む配列番号:87-159のいずれかに記載の塩基配列を有す
る遺伝子の発現を亢進する物質のスクリーニング方法: (a) 被験物質と配列番号:87-159のいずれかに記載の塩
基配列を有する遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる
工程、(b) 被験物質を接触させた細胞の、配列番号:87
-159のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の発現
量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細
胞の上記対応する遺伝子の発現量と比較する工程、(c)
上記(b)の比較結果に基づいて、配列番号:87-159のい
ずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の発現量を増加
させる被験物質を選択する工程。
【0025】項14. 下記の工程(a)、(b)および(c)を含
む配列番号:160-173のいずれかに記載のアミノ酸配列
を有する蛋白質の発現量を変動させる物質のスクリーニ
ング方法: (a)被験物質と配列番号:160-173のいずれかに記載のア
ミノ酸配列を有する蛋白質を発現可能な細胞または該細
胞から調製した細胞画分とを接触させる工程、(b)被験
物質を接触させた細胞または細胞画分における配列番
号:160-173のいずれかに記載のアミノ酸配列を有する
蛋白質の発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触さ
せない対照細胞もしくは細胞画分における上記配列番
号:160-173のいずれかに記載のアミノ酸配列を有する
蛋白質の発現量と比較する工程、(c)上記(b)の比較結果
に基づいて、配列番号:160-173のいずれかに記載のア
ミノ酸配列を有する蛋白質の発現量を変動させる被験物
質を選択する工程。
【0026】項15. 下記の工程(a)、(b)および(c)を含
む配列番号:160-171のいずれかに記載のアミノ酸配列
を有する蛋白質の発現量を減少させる物質のスクリーニ
ング方法: (a)被験物質と配列番号:160-171のいずれかに記載のア
ミノ酸配列を有する蛋白質を発現可能な細胞または該細
胞から調製した細胞画分とを接触させる工程、(b)被験
物質を接触させた細胞または細胞画分における配列番
号:160-171のいずれかに記載のアミノ酸配列を有する
蛋白質の発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触さ
せない対照細胞もしくは細胞画分における上記配列番
号:160-171のいずれかに記載のアミノ酸配列を有する
蛋白質の発現量と比較する工程、(c)上記(b)の比較結果
に基づいて、配列番号:160-171のいずれかに記載のア
ミノ酸配列を有する蛋白質の発現量を減少させる被験物
質を選択する工程。
【0027】項16. 下記の工程(a)、(b)および(c)を含
む配列番号:172または173で示されるアミノ酸配列を有
する蛋白質の発現量を増加させる物質のスクリーニング
方法: (a)被験物質と配列番号:172または173で示されるアミ
ノ酸配列を有する蛋白質を発現可能な細胞または該細胞
から調製した細胞画分とを接触させる工程、(b)被験物
質を接触させた細胞または細胞画分における配列番号:
172または173で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質の
発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対
照細胞もしくは細胞画分における上記配列番号:172ま
たは173で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質の発現
量と比較する工程、(c)上記(b)の比較結果に基づいて、
配列番号:172または173で示されるアミノ酸配列を有す
る蛋白質の発現量を増加させる被験物質を選択する工
程。
【0028】項17. 下記の工程(a)、(b)および(c)を含
む配列番号:160-173のいずれかに記載のアミノ酸配列
を有する蛋白質の機能または活性を制御する物質のスク
リーニング方法: (a)被験物質と配列番号:160-173のいずれかに記載のア
ミノ酸配列を有する蛋白質を含む水溶液、細胞または該
細胞から調製した細胞画分とを接触させる工程、(b)被
験物質を接触させた水溶液、細胞または細胞画分におけ
る配列番号:160-173のいずれかに記載のアミノ酸配列
を有する蛋白質の機能または活性を測定し、該機能また
は活性を被験物質を接触させない対照水溶液、対照細胞
または対照細胞画分における上記配列番号:160-173の
いずれかに記載のアミノ酸配列を有する蛋白質の機能ま
たは活性と比較する工程、(c)上記(b)の比較結果に基づ
いて、配列番号:160-173のいずれかに記載のアミノ酸
配列を有する蛋白質の機能または活性を制御する被験物
質を選択する工程。
【0029】項18. 下記の工程(a)、(b)および(c)を含
む配列番号:160-171のいずれかに記載のアミノ酸配列
を有する蛋白質の機能または活性を抑制する物質のスク
リーニング方法: (a)被験物質と配列番号:160-171のいずれかに記載のア
ミノ酸配列を有する蛋白質を含む水溶液、細胞または該
細胞から調製した細胞画分とを接触させる工程、(b)被
験物質を接触させた水溶液、細胞または細胞画分におけ
る配列番号:160-171のいずれかに記載のアミノ酸配列
を有する蛋白質の機能または活性を測定し、該機能また
は活性を被験物質を接触させない対照水溶液、対照細胞
または対照細胞画分における上記配列番号:160-171の
いずれかに記載のアミノ酸配列を有する蛋白質の機能ま
たは活性と比較する工程、(c)上記(b)の比較結果に基づ
いて、配列番号:160-171のいずれかに記載のアミノ酸
配列を有する蛋白質の機能または活性を抑制する被験物
質を選択する工程。
【0030】項19. 下記の工程(a)、(b)および(c)を含
む配列番号:172または173で示されるアミノ酸配列を有
する蛋白質の機能または活性を亢進する物質のスクリー
ニング方法: (a)被験物質と配列番号:172または173で示されるアミ
ノ酸配列を有する蛋白質を含む水溶液、細胞または該細
胞から調製した細胞画分とを接触させる工程、(b)被験
物質を接触させた水溶液、細胞または細胞画分における
配列番号:172または173で示されるアミノ酸配列を有す
る蛋白質の機能または活性を測定し、該機能または活性
を被験物質を接触させない対照水溶液、対照細胞または
対照細胞画分における上記配列番号:172または173で示
されるアミノ酸配列を有する蛋白質の機能または活性と
比較する工程、(c)上記(b)の比較結果に基づいて、配列
番号:172または173で示されるアミノ酸配列を有する蛋
白質の機能または活性を亢進する被験物質を選択する工
程。
【0031】項20. 糖尿病性腎症の予防、改善または治
療剤の有効成分を探索するための方法である、項11乃至
19のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【0032】項21. 配列番号:1-86のいずれかに記載の
塩基配列を有する遺伝子の発現を抑制する物質を有効成
分とする糖尿病性腎症の予防、改善または治療剤。
【0033】項22. 配列番号:1-86のいずれかに記載の
塩基配列を有する遺伝子の発現を抑制する物質が項12に
記載のスクリーニング法により得られるものである項21
に記載の糖尿病性腎症の予防、改善または治療剤。
【0034】項23. 配列番号:87-159のいずれかに記載
の塩基配列を有する遺伝子の発現を亢進させる物質を有
効成分とする糖尿病性腎症の予防、改善または治療剤。
【0035】項24. 配列番号:87-159のいずれかに記載
の塩基配列を有する遺伝子の発現を亢進させる物質が項
13に記載のスクリーニング法により得られるものである
項23に記載の糖尿病性腎症の予防、改善または治療剤。
【0036】項25. 配列番号:160-171のいずれかに記
載のアミノ酸配列を有する蛋白質の発現量を減少させる
物質を有効成分とする糖尿病性腎症の予防、改善または
治療剤。
【0037】項26. 配列番号:160-171のいずれかに記
載のアミノ酸配列を有する蛋白質の発現量を減少させる
物質が項15に記載のスクリーニング方法により得られる
ものである項25に記載の糖尿病性腎症の予防、改善また
は治療剤。
【0038】項27. 配列番号:172または173で示される
アミノ酸配列を有する蛋白質の発現量を増加させる物質
を有効成分とする糖尿病性腎症の予防、改善または治療
剤。
【0039】項28. 配列番号:172または173で示される
アミノ酸配列を有する蛋白質の発現量を増加させる物質
が項16に記載のスクリーニング方法により得られるもの
である項27に記載の糖尿病性腎症の予防、改善または治
療剤。
【0040】項29. 配列番号:160-171のいずれかに記
載のアミノ酸配列を有する蛋白質の機能または活性を抑
制する物質を有効成分とする糖尿病性腎症の予防、改善
または治療剤。
【0041】項30. 配列番号:160-171のいずれかに記
載のアミノ酸配列を有する蛋白質の機能または活性を抑
制する物質が項18に記載のスクリーニング方法により得
られるものである項29に記載の糖尿病性腎症の予防、改
善または治療剤。
【0042】項31. 配列番号:172または173で示される
アミノ酸配列を有する蛋白質の機能または活性を亢進す
る物質を有効成分とする糖尿病性腎症の予防、改善また
は治療剤。
【0043】項32. 配列番号:172または173で示される
アミノ酸配列を有する蛋白質の機能または活性を亢進す
る物質が項19に記載のスクリーニング方法により得られ
るものである項31に記載の糖尿病性腎症の予防、改善ま
たは治療剤。
【0044】
【発明の実施の形態】以下、本明細書において、アミノ
酸、(ポリ)ペプチド、(ポリ)ヌクレオチドなどの略号に
よる表示は、IUPAC-IUBの規定〔IUPAC-IUB Communicati
on on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 1
38: 9 (1984)〕、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明
細書等の作成のためのガイドライン」(日本国特許庁編)
および当該分野における慣用記号に従う。
【0045】本明細書において「遺伝子」または「DN
A」とは、2本鎖DNAのみならず、それを構成するセンス
鎖およびアンチセンス鎖という各1本鎖DNAを包含する趣
旨で用いられる。またその長さによって特に制限される
ものではない。従って、本明細書において遺伝子(DNA)
とは、特に言及しない限り、ヒトゲノムDNAを含む2本鎖
DNAおよびcDNAを含む1本鎖DNA(正鎖)並びに該正鎖と相
補的な配列を有する1本鎖DNA(相補鎖)、およびこれらの
断片のいずれもが含まれる。なお、遺伝子またはDNAは
機能領域の別を問うものではなく、例えば発現制御領
域、コード領域、エキソンまたはイントロンを含むこと
ができる。
【0046】本明細書において「ポリヌクレオチド」と
は、RNAおよびDNAのいずれをも包含する趣旨で用いられ
る。なお、上記DNAには、cDNA、ゲノムDNAおよび合成DN
Aのいずれもが含まれる。また上記RNAには、total RN
A、mRNA、rRNAおよび合成のRNAのいずれもが含まれる。
【0047】本明細書において「蛋白質」または「(ポ
リ)ペプチド」には、特定の塩基配列で示される「蛋白
質」または「(ポリ)ペプチド」だけでなく、これらと生
物学的機能が同等であることを限度として、その断片、
同族体(ホモログ)、誘導体および変異体が包含される。
なお、上記変異体には、天然に存在するアレル変異体、
天然に存在しない変異体および人為的に欠失、置換、付
加および挿入されることによって改変されたアミノ酸配
列を有する変異体が包含される。なお、上記変異体とし
ては、変異のない蛋白質または(ポリ)ペプチドと、少な
くとも70%、好ましくは80%、より好ましくは95%、さ
らにより好ましくは97%相同なものを挙げることができ
る。
【0048】本明細書でいう「抗体」には、ポリクロー
ナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗
体、およびFabフラグメント、Fab発現ライブラリーなど
によって生成されるフラグメントのような抗原結合性を
有する上記抗体の一部が包含される。
【0049】さらに本明細書において「疾患マーカー」
とは、糖尿病性腎症の罹患の有無もしくは罹患の程度を
診断するために、また糖尿病性腎症の予防、改善または
治療に有用な候補物質をスクリーニングするために、直
接または間接的に利用されるものをいう。これには、糖
尿病性腎症の罹患に関連して生体内での発現が変動する
遺伝子または蛋白質を特異的に認識するか、またはこれ
らと結合することのできる、(ポリ)(オリゴ)ヌクレオチ
ドまたは抗体が包含される。これらの(ポリ)(オリゴ)ヌ
クレオチドおよび抗体は、上記性質に基づいて、生体
内、組織や細胞内などで発現した上記遺伝子および蛋白
質を検出するためのプローブとして、また(オリゴ)ヌク
レオチドは生体内で発現した上記遺伝子を増幅するため
のプライマーとして有効に利用することができる。
【0050】本発明は、前述するように、配列番号:
1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、1
5、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、2
7、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、3
9、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、5
1、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、6
3、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、7
5、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85および86
(配列番号:1-86)のいずれかに記載の塩基配列を有する
遺伝子(以下、これらの遺伝子を総称して遺伝子Iともい
う。)が、糖尿病性腎症患者の腎組織で特異的にその発
現が上昇していること、並びに配列番号:87、88、89、
90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、
102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、
112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、
122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、
132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、
142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、
152、153、154、155、156、157、158および159(配列番
号:87-159)のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝
子(以下、これらの遺伝子を総称して遺伝子IIともい
う。)が、糖尿病性腎症患者の腎組織で特異的にその発
現が抑制されていることを見出したことに基づくもので
ある。
【0051】従って、これらの遺伝子およびその発現産
物〔蛋白質、(ポリ)(オリゴ)ペプチド〕は、糖尿病性腎
症の解明、診断、予防および治療に有効に利用すること
ができ、かかる利用によって医学並びに臨床学上、有用
な情報、手段などを得ることができる。また、これらの
遺伝子およびその発現産物並びにそれらからの派生物
(例えば、抗体など)は、上記糖尿病性腎症の治療並びに
該治療に有効に用いられる薬剤の開発に好適に利用する
ことができる。さらに、個体または腎組織における、上
記遺伝子の発現またはその発現産物の検出または該遺伝
子の変異またはその発現不全の検出は、糖尿病性腎症の
解明、診断などに有効に利用することができる。
【0052】以下、これらの遺伝子(ポリヌクレオチド)
並びにこれらの発現産物およびそれらの派生物につい
て、具体的な用途を説明する。
【0053】(1)糖尿病性腎症の疾患マーカーおよびそ
の応用 (1-1) ポリヌクレオチド 本発明は、前述するように、糖尿病性腎症に罹患した患
者の腎組織においては、正常な腎組織に比して、配列番
号:1-86のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子が
特異的に発現しているかその発現量が特異的に増大して
いるという知見、並びに配列番号:87-159のいずれかに
記載の塩基配列を有する遺伝子の発現が特異的に減少し
ているという知見を発端に、これらの遺伝子の発現の有
無や発現の程度を検出することによって、上記糖尿病性
腎症の罹患の有無や罹患の程度が特異的に検出でき、該
疾患の診断を正確に行うことができるという発想に基づ
くものである。
【0054】本発明ポリヌクレオチドは、従って、被験
者における上記遺伝子の発現の有無またはその程度を検
出することによって、該被験者が糖尿病性腎症に罹患し
ているか否かまたはその疾患の程度を診断することので
きるツール(疾患マーカー)として有用である。
【0055】また、本発明ポリヌクレオチドは、後述の
(3-1)項に記載するような糖尿病性腎症の予防、改善ま
たは治療に有用な候補物質のスクリーニングにおいて、
配列番号1-159のいずれかに記載の塩基配列を有する遺
伝子の発現変動を検出するためのスクリーニングツール
(疾患マーカー)としても有用である。
【0056】本発明疾患マーカーは、配列番号:1-159
のいずれかに記載の塩基配列において、連続する少なく
とも15塩基を有するポリヌクレオチドおよび/またはそ
れに相補的なポリヌクレオチドであることを特徴とす
る。
【0057】ここで相補的なポリヌクレオチド(相補
鎖、逆鎖)とは、上記各配列番号に示される塩基配列か
らなるポリヌクレオチドの全長配列、または上記各塩基
配列において少なくとも連続した15塩基長の塩基配列を
有するその部分配列(ここでは便宜上、これらを「正
鎖」ともいう)に対して、A : TおよびG : Cといった塩
基対関係に基づいて、塩基的に相補的な関係にあるポリ
ヌクレオチドを意味する。かかる相補鎖は、対象とする
正鎖の塩基配列と完全に相補配列を形成する場合に限ら
ず、対象とする正鎖とストリンジェントな条件でハイブ
リダイスすることができる程度の相補関係を有するもの
であってもよい。なお、ここでストリンジェントな条件
は、Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cl
oning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152,
Academic Press, San Diego CA) に示されるように、複
合体或いはプローブと結合する核酸の融解温度(Tm)に基
づいて決定することができる。例えば、ハイブリダイズ
後の洗浄条件として、通常「1×SSC、0.1%SDS、37℃」
程度の条件を挙げることができる。相補鎖はかかる条件
で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダイズ状態を維
持するものであることが好ましい。特に制限されない
が、より厳しいハイブリダイズ条件としては「0.5×SS
C、0.1%SDS、42℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ
条件としては「0.1×SSC、0.1%SDS、65℃」程度の洗浄
条件を挙げることができる。具体的には、このような相
補鎖として、対象の正鎖の塩基配列と完全に相補的な関
係にある塩基配列からなる鎖並びに該鎖と少なくとも90
%、好ましくは95%の相同性を有する塩基配列からなる
鎖を例示することができる。
【0058】また、正鎖側のポリヌクレオチドには、配
列番号:1-159のいずれかに記載の塩基配列またはその
部分配列を有するものだけでなく、上記相補鎖の塩基配
列に対してさらに相補的な関係にある塩基配列からなる
鎖を含めることができる。
【0059】さらに、上記正鎖のポリヌクレオチドおよ
び相補鎖(逆鎖)のポリヌクレオチドは、各々一本鎖の形
態で疾患マーカーとして使用されても、また二本鎖の形
態で疾患マーカーとして使用されてもよい。
【0060】本発明の糖尿病性腎症の疾患マーカーは、
具体的には配列番号:1-159のいずれかに記載される塩
基配列(全長配列)からなるポリヌクレオチドであっても
よいし、その相補配列からなるポリヌクレオチドであっ
てもよい。また、配列番号:1-159のいずれかで示され
る遺伝子もしくは該遺伝子に由来するポリヌクレオチド
を選択的に(特異的に)認識するものであれば、上記全長
配列もしくはその相補配列の部分配列からなるポリヌク
レオチドであってもよい。この場合、部分配列として
は、上記全長配列もしくはその相補配列の塩基配列から
任意に選択される少なくとも15個の連続した塩基長を有
するポリヌクレオチドを挙げることができる。
【0061】ここで「選択的に(特異的に)認識する」と
は、例えばノーザンブロット法においては、配列番号:
1-159のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子また
はこれらの遺伝子に由来するポリヌクレオチドが特異的
に検出できること、またRT-PCR法においては、配列番
号:1-159のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子
またはこれらの遺伝子に由来するポリヌクレオチドが特
異的に生成されることを意味するが、それに限定され
ず、当業者が上記検出物または生成物がこれらの遺伝子
に由来するものであると判断できるものであればよい。
【0062】そのような本発明疾患マーカーは、検出
(認識)対象の遺伝子(配列番号:1-159)に応じて、配列
番号:1-159のいずれかに示される塩基配列をもとにし
て、例えばprimer 3 (HYPERLINK http://www.genome.w
i.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi)あるいはベク
ターNTI(Infomax社製)を利用して設計することができ
る。具体的には配列番号:1-159のいずれかに示される
塩基配列をprimer 3またはベクターNTIのソフトウエア
にかけて得られる、プライマーまたはプローブの候補配
列もしくは少なくとも該配列を一部に含む配列をプライ
マーまたはプローブとして使用することができる。
【0063】本発明疾患マーカーは、上述するように連
続する少なくとも15塩基の長さを有するものであればよ
いが、具体的には該マーカーの用途に応じて、その長さ
を適宜選択し設定することができる。
【0064】(1-2)プローブまたはプライマーとしての
ポリヌクレオチド 本発明の疾患マーカーは、上記各遺伝子の発現によって
生じたRNAまたはそれに由来するポリヌクレオチドを特
異的に認識し増幅するためのプライマーとして、または
該RNAまたはそれに由来するポリヌクレオチドを特異的
に検出するためのプローブとして利用することができ
る。
【0065】糖尿病性腎症の検出(遺伝子診断)において
プライマーとして用いられる本発明疾患マーカーは、通
常15bp-100bp、好ましくは15bp-50bp、より好ましくは1
5bp-35bpの塩基長を有する。また検出プローブとして用
いられる本発明疾患マーカーは、通常15bp-全配列の塩
基数、好ましくは15bp-1kb、より好ましくは100bp-1kb
の塩基長を有する。
【0066】本発明疾患マーカーは、ノーザンブロット
法、RT-PCR法、in situハイブリダーゼーション法など
の、特定遺伝子を特異的に検出する公知の方法におい
て、常法に従ってプライマーまたはプローブとして利用
することができる。該利用によって糖尿病性腎症に関連
する配列番号:1-159のいずれかに記載の塩基配列を有
する遺伝子の発現の有無または発現レベル(発現量)を評
価することができる。
【0067】測定対象とする試料は、使用する検出方法
の種類に応じて適宜選択することができる。該試料は、
例えば、被験者の腎臓の一部をバイオプシなどで採取
し、そこから常法に従って調製したtotal RNAであって
もよいし、該RNAをもとにして調製される各種のポリヌ
クレオチドであってもよい。
【0068】また、配列番号:1-159のいずれかに記載
の塩基配列を有する遺伝子の生体組織における発現レベ
ルは、DNAチップを利用して検出あるいは定量すること
ができる。この場合、本発明疾患マーカーは当該DNAチ
ップのプローブとして使用することができる(例えば、A
ffymetrix社のGene Chip Human Genome U95 A,B,C,D,E
の場合、25bpの長さのポリヌクレオチドプローブとして
用いられる)。かかるDNAチップを、生体組織から採取し
たRNAをもとに調製される標識DNAまたはRNAとハイブリ
ダイズさせることにより、本発明疾患マーカー(プロー
ブ)と標識DNAまたはRNAとの複合体が形成される。該複
合体を該標識DNAまたはRNAの標識を指標として検出する
ことにより、配列番号:1-159のいずれかの塩基配列か
らなる遺伝子の生体組織中での発現の有無または発現レ
ベル(発現量)が評価できる。
【0069】なお、上記DNAチップは、配列番号:1-159
のいずれかで示される塩基配列を有する遺伝子と結合し
得る1種または2種以上の本発明疾患マーカーを含んでい
ればよい。複数の疾患マーカーを含むDNAチップの利用
によれば、ひとつの生体試料について、同時に複数の遺
伝子の発現の有無または発現レベルの評価が可能であ
る。
【0070】本発明疾患マーカーは、糖尿病性腎症の診
断、検出(罹患の有無や罹患の程度の診断)に有用であ
る。具体的には、該疾患マーカーを利用した糖尿病性腎
症の診断は、被験者の腎臓組織と正常者の腎臓組織にお
ける配列番号:1-159のいずれかに記載の塩基配列を有
する遺伝子の遺伝子発現レベルの違いを判定することに
よって行うことができる。
【0071】この場合、遺伝子発現レベルの違いには、
発現のある/なしの違いだけでなく、被験者の腎臓組織
と正常者の腎臓組織の両者ともに発現がある場合でも、
両者間の発現量の格差が2倍以上、好ましくは3倍以上の
場合が含まれる。
【0072】より具体的には、配列番号:1-86のいずれ
かに記載の塩基配列を有する遺伝子は、糖尿病性腎症患
者の腎臓において特異的に発現誘導(発現増大)を示すの
で、被験者の腎臓で特異的に発現しているか、或いは該
発現量が正常な腎臓における発現量と比べて好ましくは
2倍以上、より好ましくは3倍以上増大していれば、該被
験者について糖尿病性腎症の罹患が疑われる。この場合
の糖尿病性腎症の検出(診断)には、上記遺伝子に対応す
るいずれかの塩基配列(配列番号:1-86のいずれかに記
載の塩基配列)において、連続する少なくとも15塩基長
を有するポリヌクレオチド/またはそれに相補的なポリ
ヌクレオチドからなる本発明の疾患マーカーが有用であ
る。
【0073】中でも、配列番号1、2、53または54のいず
れかに記載の塩基配列を有する遺伝子は、正常な腎臓に
比べて糖尿病性腎症患者の腎臓において10倍以上の発現
増大を示す。従って、上記遺伝子に対応するいずれかに
記載の塩基配列(配列番号:1、2、53または54の塩基配
列)において、連続する少なくとも15塩基長を有するポ
リヌクレオチド/またはそれに相補的なポリヌクレオチ
ドからなる本発明の疾患マーカーは特に有用である。
【0074】一方、配列番号:87-159のいずれかの塩基
配列を有する遺伝子は、正常な腎臓に比して、糖尿病性
腎症患者の腎臓において特異的に発現減少を示すので、
被験者の腎臓において発現していないか、或いは該発現
量が正常な腎臓における発現量と比べて好ましくは2倍
以上、より好ましくは3倍以上減少していれば、該被験
者について糖尿病性腎症の罹患が疑われる。この場合の
糖尿病性腎症の検出(診断)には、上記遺伝子に対応する
いずれかに記載の塩基配列(配列番号:87-159のいずれ
かに記載の塩基配列)において、連続する少なくとも15
塩基長を有するポリヌクレオチド/またはそれに相補的
なポリヌクレオチドからなる本発明疾患マーカーが有用
である。
【0075】中でも、配列番号:87または129に記載の
塩基配列を有する遺伝子は、正常な腎臓に比べて糖尿病
性腎症患者の腎臓において10倍以上の発現の減少を示
す。従って、これらの遺伝子に対応する塩基配列(配列
番号:87または129に記載の塩基配列)において連続する
少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド/またはそ
れに相補的なポリヌクレオチドからなる本発明の疾患マ
ーカーが特に有用である。
【0076】本発明において糖尿病性腎症の検出(診断)
は、被験者の生体組織、特に腎臓における配列番号:1-
159のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の少な
くとも1つの発現の有無または発現レベル(発現量)を評
価することによって行われる。検出(診断)の精度や正確
性を高めるためには、上記遺伝子の2以上、好ましくは
複数個、より好ましくは上記遺伝子群の4分の1以上、さ
らにより好ましくは上記遺伝子群の半数以上について、
その発現の有無または発現レベル(発現量)を評価するこ
とが望ましい。
【0077】(1-3) 抗体 本発明は、糖尿病性腎症の疾患マーカーとして配列番
号:1-159のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子
の発現産物(蛋白質)を特異的に認識することができる抗
体を提供する。該遺伝子発現産物の具体例としては、例
えば配列番号:4、10、12、13、20、29、38、42、47、4
8、50、51、98および126のいずれかに記載の塩基配列を
有する遺伝子によってコードされる蛋白質を挙げること
ができる。これらの各塩基配列によってコードされるア
ミノ酸配列の具体例は、例えば配列番号:160-173で示
される。これらの塩基配列とアミノ酸配列との関連は、
後記実施例中、表1-表3に示すとおりである。
【0078】本発明抗体は、その形態に特に制限はな
く、上記蛋白質を免疫抗原とするポリクローナル抗体で
あっても、またモノクローナル抗体であってもよい。さ
らに当該蛋白質を構成するアミノ酸配列のうち少なくと
も連続する、通常8アミノ酸、好ましくは15アミノ酸、
更に好ましくは20アミノ酸からなるポリペプチドに対し
て抗原結合性を有する抗体も、本発明抗体に含まれる。
【0079】これらの抗体の製造方法は、すでに周知で
あり、本発明抗体もこれらの常法に従って製造すること
ができる(Current protocols in Molecular Biology ed
it.Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and S
ons. Section 11.12-11.13)。具体的には、本発明抗体
がポリクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌
などで発現し精製した上記蛋白質を用いて、あるいは常
法に従って当該蛋白質の部分アミノ酸配列を有するオリ
ゴペプチドを合成して、家兎などの非ヒト動物に免疫
し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能
である。一方、モノクローナル抗体の場合には、常法に
従って大腸菌などで発現し精製した上記蛋白質、あるい
はこれら蛋白質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプ
チドをマウスなどの非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓
細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリ
ドーマ細胞の中から得ることができる(Current protoco
ls in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (198
7) Publish. John Wiley andSons. Section 11.4-11.1
1)。
【0080】抗体の作製に免疫抗原として使用される蛋
白質は、本発明により提供される遺伝子の配列情報(配
列番号:1-159、例えば配列番号:4、10、12、13、20、
29、38、42、47、48、50、51、98および126で示される
遺伝子の配列情報)に基づいて、DNAクローニング、各プ
ラスミドの構築、宿主へのトランスフェクション、形質
転換体の培養および培養物からの蛋白質の回収の操作に
より得ることができる。これらの操作は、当業者に既知
の方法、あるいは文献記載の方法(Molecular Cloning,
T.Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Clon
ing, DM. Glover, IRL PRESS (1985))などに準じて行う
ことができる。
【0081】具体的には、配列番号:160-173のいずれ
かに記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子が所望の宿
主細胞中で発現できる組み換えDNA(発現ベクター)を作
製し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転
換体を培養して、得られる培養物から、目的蛋白質を回
収することによって、本発明抗体の製造のための免疫抗
原としての蛋白質を得ることができる。これらの蛋白質
は、また、本発明により提供される遺伝子情報(配列番
号:1-159)から常法に従って得られるアミノ酸配列情報
および/または本発明により提供されるアミノ酸配列情
報(配列番号:160-173)に従って、一般的な化学合成法
(ペプチド合成)によって製造することもできる。
【0082】なお、本発明の蛋白質には、配列番号:1-
159のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子により
コードされる蛋白質、具体的には配列番号:4、10、1
2、13、20、29、38、42、47、48、50、51、98および126
のいずれかで示される遺伝子によりコードされる蛋白質
(配列番号:160-173のいずれかで示されるアミノ酸配列
を有する蛋白質)のみならず、その相同物も包含され
る。該相同物としては、上記遺伝子によってコードされ
る蛋白質のアミノ酸配列、具体的には配列番号:160-17
3のいずれかで示されるアミノ酸配列において、1もしく
は複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ
酸配列からなり、且つ、それぞれの蛋白質の公知の機能
と同等の生物学的機能を有するか、および/または免疫
学的活性において同等の活性を有する蛋白質を挙げるこ
とができる。
【0083】ここで配列番号:1-159のいずれかに記載
の塩基配列を有する遺伝子によりコードされる蛋白質の
公知の機能と同等の生物学的機能を有する蛋白質として
は、各々対応する蛋白質(具体的には、配列番号:160-1
73のいずれかで示されるアミノ酸配列を有する蛋白質)
と生化学的または薬理学的機能において同等の機能を有
する蛋白質を挙げることができる。また、上記蛋白質と
免疫学的活性において同等の活性を有する蛋白質として
は、適当な動物あるいはその細胞において特定の免疫反
応を誘発し、かつ各対応する蛋白質に対する抗体と特異
的に結合する能力を有する蛋白質を挙げることができ
る。
【0084】なお、蛋白質におけるアミノ酸の変異数や
変異部位は、その生物学的機能および/または免疫学的
活性が保持される限り制限はない。生物学的機能や免疫
学的活性を喪失することなくアミノ酸残基が、どのよう
に、何個置換、挿入あるいは欠失されればよいかを決定
する指標は、当業者に周知のコンピュータプログラム、
例えばDNA Star softwareを用いて見出すことができ
る。例えば変異数は、典型的には、全アミノ酸の10%以
内であり、好ましくは全アミノ酸の5%以内であり、さ
らに好ましくは全アミノ酸の1%以内である。また置換
されるアミノ酸は、置換後に得られる蛋白質が、置換前
の蛋白質(配列番号:1-159のいずれかに記載の塩基配列
を有する遺伝子によりコードされる蛋白質)の生物学的
機能および/または免疫学的活性を保持している限り、
特に制限されないが、蛋白質の構造保持の観点から、残
基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性並びに両親媒
性など、置換前のアミノ酸と似た性質を有するアミノ酸
であることが好ましい。例えば、Ala、Val、Leu、Ile、
Pro、Met、PheおよびTrpは互いに非極性アミノ酸に分類
されるアミノ酸であり、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn
およびGlnは互いに非荷電性アミノ酸に分類されるアミ
ノ酸であり、AspおよびGluは互いに酸性アミノ酸に分類
されるアミノ酸であり、またLys、ArgおよびHisは互い
に塩基性アミノ酸に分類されるアミノ酸である。ゆえ
に、これらを指標として同群に属するアミノ酸を適宜選
択することができる。
【0085】また本発明抗体は、配列番号:1-159のい
ずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子によりコードさ
れる蛋白質、具体的には配列番号:4、10、12、13、2
0、29、38、42、47、48、50、51、98および126のいずれ
かで示される遺伝子によりコードされる蛋白質(配列番
号:160-173のいずれかで示されるアミノ酸配列を有す
る蛋白質)の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチド
を用いて調製されるものであってもよい。かかる抗体の
製造のために用いられるオリゴペプチドは、機能的な生
物活性を有することは要しないが、各々対応する上記の
蛋白質と同様な免疫原特性を有するものであることが望
ましい。好ましくはかかる特性を有し、配列番号:1-15
9のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子によって
コードされる蛋白質のアミノ酸配列、具体的には、配列
番号:4、10、12、13、20、29、38、42、47、48、50、5
1、98および126のいずれかに記載の遺伝子によりコード
される蛋白質のアミノ酸配列(配列番号:160-173のいず
れかで示されるアミノ酸配列)において、少なくとも連
続する、通常8アミノ酸、好ましくは15アミノ酸、より
好ましくは20アミノ酸からなるオリゴペプチドを例示す
ることができる。
【0086】かかるオリゴペプチドに対する抗体の製造
は、宿主に応じて種々のアジュバントを用いて免疫学的
反応を高めることによって行うこともできる。限定はさ
れないが、そのようなアジュバントには、フロイントア
ジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲ
ル、並びにリゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリ
アニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘ
モシアニンおよびジニトロフェノールのような表面活性
物質、BCG(カルメット−ゲラン桿菌)やコリネバクテリ
ウム-パルヴムなどのヒトアジュバントなどがある。
【0087】本発明の抗体は、配列番号:1-159のいず
れかに記載の塩基配列を有する遺伝子によってコードさ
れる蛋白質、具体的には配列番号:4、10、12、13、2
0、29、38、42、47、48、50、51、98および126のいずれ
かに記載の遺伝子によりコードされる蛋白質(配列番
号:160-173のいずれかに記載のアミノ酸配列を有する
蛋白質)に、特異的に結合する性質を有することから、
該抗体を利用することによって、被験者の組織内に発現
した上記蛋白質を特異的に検出することができる。すな
わち、当該抗体は被験者の組織内における上記蛋白質の
発現の有無およびその発現の程度を検出するためのプロ
ーブとして有用である。
【0088】具体的には、患者の腎臓の一部をバイオプ
シなどで採取し、そこから常法に従って蛋白質を調製し
て、例えばウェスタンブロット法、ELISA法など公知の
検出方法において、上記抗体を常法に従ってプローブと
して使用することによって上記蛋白質を検出することが
できる。
【0089】糖尿病性腎症の診断に際しては、被験者の
腎臓における配列番号:1-159のいずれかで示される塩
基配列を有する遺伝子によってコードされる蛋白質、具
体的には、配列番号:4、10、12、13、20、29、38、4
2、47、48、50、51、98および126のいずれかで示される
遺伝子によりコードされる蛋白質(配列番号:160-173の
いずれかで示されるアミノ酸配列を有する蛋白質)の少
なくとも1つの発現量と、正常な腎臓における対応蛋白
質の発現量とを対比して、その違いを判定すればよい。
この場合、蛋白量の違いには、蛋白質のある/なしと共
に、蛋白質の量の違いが2倍以上、好ましくは3倍以上の
場合が含まれる。
【0090】具体的には、配列番号:1-86のいずれかに
記載の塩基配列を有する遺伝子は、糖尿病性腎症患者の
腎臓で特異的に発現誘導(増大)を示し、発現産物量も増
大すので、被験者の腎臓由来の組織または細胞における
該遺伝子の発現産物(上記遺伝子によりコードされる蛋
白質、具体的には配列番号:160-171のいずれかで示さ
れるアミノ酸配列を有する蛋白質)の量が、正常な腎臓
における同遺伝子の発現産物量と比べて2倍以上、好ま
しくは3倍以上多いことが判定されれば、糖尿病性腎症
の罹患が疑われる。この場合の糖尿病性腎症の検出(診
断)には、各々の遺伝子がコードする蛋白質、具体的に
は、配列番号:4、10、12、13、20、29、38、42、47、4
8、50および51のいずれかで示される遺伝子によりコー
ドされる蛋白質(配列番号:160-171のいずれかで示され
るアミノ酸配列を有する蛋白質)を特異的に認識する抗
体である本発明疾患マーカーが有用である。
【0091】中でも、配列番号:1、2、53または54に示
される塩基配列を有する遺伝子は、糖尿病性腎症患者の
腎臓において10倍以上の発現誘導(増大)を示すので、特
に、これらの配列番号で示される塩基配列を有する遺伝
子によってコードされる蛋白質を特異的に認識する抗体
は、疾患マーカーとして糖尿病性腎症の検出(診断)に有
用であると思われる。
【0092】一方、配列番号:87-159に示される塩基配
列を有する遺伝子は、糖尿病性腎症患者の腎臓で特異的
に発現抑制(減少)を示し、その発現産物量も減少するの
で、被験者の腎臓由来の組織または細胞における該遺伝
子の発現産物(上記遺伝子によりコードされる蛋白質、
具体的には配列番号:172または173で示されるアミノ酸
配列を有する蛋白質)の量が、正常な腎臓における同遺
伝子の発現産物量と比べて2倍以上、好ましくは3倍以上
少ないことが判定されれば、糖尿病性腎症の罹患が疑わ
れる。この場合の糖尿病性腎症の検出(診断)には、各々
の遺伝子がコードする蛋白質、具体的には配列番号:98
または126で示される遺伝子によりコードされる蛋白質
(配列番号:172または173で示されるアミノ酸配列を有
する蛋白質)を特異的に認識する抗体である本発明疾患
マーカーが有用である。
【0093】中でも、配列番号:87または129で示され
る塩基配列を有する遺伝子は、糖尿病性腎症患者の腎臓
において10倍以上の発現抑制(減少)を示すので、特に、
配列番号:87または129の塩基配列を有する遺伝子によ
ってコードされる蛋白質を特異的に認識する抗体は、疾
患マーカーとして糖尿病性腎症の検出(診断)に有用であ
ると思われる。
【0094】(2)糖尿病性腎症の検出方法(診断方法) 本発明は、前述した糖尿病性腎症の疾患マーカーを利用
する糖尿病性腎症の検出方法(診断方法)を提供する。
【0095】本発明の検出方法は、具体的には、被験者
の腎臓の一部をバイオプシなどで採取し、そこに含まれ
る糖尿病性腎症に関連する配列番号:1-159のいずれか
に記載の塩基配列を有する遺伝子の遺伝子発現レベル
(発現量)、またはこれらの遺伝子に由来する蛋白質の
量を測定することにより、糖尿病性腎症の罹患の有無ま
たはその程度を検出(診断)するものである。
【0096】本発明の検出方法は、次の(a)、(b)および
(c)の工程を含む: (a) 被験者の生体試料と本発明疾患マーカーを接触させ
る工程、(b) 生体試料中の配列番号:1-159のいずれか
に記載の塩基配列を有する遺伝子の遺伝子発現レベル、
または配列番号:1-159のいずれかに記載の塩基配列を
有する遺伝子によってコードされる蛋白質の量、具体的
には、配列番号:160-173のいずれかで示されるアミノ
酸配列を有する蛋白質の量を、上記疾患マーカーを指標
として測定する工程、(c) 上記(b)の結果をもとに、糖
尿病性腎症の罹患を判断する工程。
【0097】ここで用いられる生体試料は、被験者の腎
臓由来の組織乃至細胞、これらから調製されるRNAもし
くはそれらからさらに調製されるポリヌクレオチド、ま
たは上記組織などから調製される蛋白質である。かかる
RNA、ポリヌクレオチドまたは蛋白質は、被験者の腎臓
の一部をバイオプシなどで採取し、そこから常法に従っ
て調製することができる。
【0098】本発明の診断方法は、測定対象として用い
る生体試料の種類に応じて、具体的には下記のようにし
て実施される。
【0099】(2-1) 測定対象の生体試料としてRNAを利
用する場合 生体試料としてRNAを利用する場合、本発明検出方法(診
断方法)は該RNA中の配列番号:1-159のいずれかに記載
の塩基配列を有する遺伝子の発現レベルを検出し、測定
することによって実施される。
【0100】この場合、本発明の検出方法は次の(a)、
(b)および(c)の工程を含む: (a) 被験者の生体試料と本発明疾患マーカーとを接触さ
せる工程、(b) 上記工程によって本発明の疾患マーカー
に特異的に結合した生体試料由来のRNAまたはそれから
転写された相補的なポリヌクレオチドを上記疾患マーカ
ーを指標として測定する工程、および(c) 上記(b)の結
果をもとに、糖尿病性腎症の罹患を判断する工程。
【0101】本発明の糖尿病性腎症の検出方法(診断方
法)は、特に測定対象の生体試料としてRNAを利用して、
該RNA中の配列番号:1-159のいずれかに記載の塩基配列
を有する遺伝子の発現レベルを検出し、測定することに
よって実施される。具体的には、上記検出する遺伝子の
塩基配列に応じて、前述する本発明の疾患マーカー(配
列番号:1-159のいずれかに記載の塩基配列において連
続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチドおよ
び/またはその相補的なポリヌクレオチド)をプライマ
ーまたはプローブとして用いて、ノーザンブロット法、
RT-PCR法、DNAチップ解析法、in situハイブリダイゼー
ション解析法などの公知の方法を行うことにより実施で
きる。
【0102】ノーザンブロット法を利用する場合、本発
明の上記疾患マーカーをプローブとして用いることによ
って、RNA中の配列番号:1-159のいずれかに記載の塩基
配列を有する遺伝子の発現の有無および発現レベルを検
出、測定することができる。具体的には、本発明の疾患
マーカー(相補鎖)を放射性同位元素(32P、33Pなど:R
I)、蛍光物質などで標識し、それを、常法に従ってナイ
ロンメンブレンなどにトランスファーした被験者の生体
組織由来のRNAとハイブリダイズさせた後、形成された
標識疾患マーカー(DNA)とRNAとの二重鎖を、該疾患マー
カーの標識物(RI、蛍光物質など)に由来するシグナルを
放射線検出器(BAS-1800II、富士フィルム社製)、蛍光検
出器などで検出、測定する方法を例示することができ
る。
【0103】また、AlkPhos Direct Labelling and Det
ection System (Amersham Pharamcia Biotech社製)を用
いて、該プロトコールに従って疾患マーカー(プローブD
NA)を標識し、被験者の生体組織由来のRNAとハイブリダ
イズさせた後、疾患マーカーの標識物に由来するシグナ
ルをマルチバイオイメージャーSTORM860 (AmershamPhar
macia Biotech社製)で検出、測定する方法を使用するこ
ともできる。
【0104】RT-PCR法を利用する場合、本発明疾患マー
カーをプライマーとして用いることによって、RNA中の
配列番号:1-159のいずれかに記載の塩基配列を有する
遺伝子の発現の有無および発現レベルを検出、測定する
ことができる。具体的には、被験者の生体組織由来のRN
Aから常法に従ってcDNAを調製し、これを鋳型として標
的遺伝子の領域が増幅できるように、本発明疾患マーカ
ーから調製した一対のプライマー(上記cDNA(−鎖)に結
合する正鎖、+鎖に結合する逆鎖)をこれとハイブリダ
イズさせて常法に従ってPCR法を行い、得られた増幅さ
れた二本鎖DNAを検出する。
【0105】増幅された二本鎖DNAの検出には、予めR
I、蛍光物質などで標識しておいたプライマーを用いて
上記PCRを行うことによって産生される標識二本鎖DNAを
検出する方法、産生された二本鎖DNAを常法に従ってナ
イロンメンブレンなどにトランスファーさせて、標識し
た疾患マーカーをプローブとして使用してこれとハイブ
リダイズさせて検出する方法などを用いることができ
る。なお、生成された標識二本鎖DNA産物はアジレント2
100バイオアナライザ(横河アナリティカルシステムズ社
製)などで測定することができる。また、SYBR Green RT
-PCR Reagents (Applied Biosystems社製)で該プロトコ
ールに従ってRT-PCR反応液を調製し、ABI PRIME 7700 S
equence Detection System (Applied Biosystems 社製)
で反応させて、該反応物を検出することもできる。
【0106】DNAチップ解析を利用する場合、本発明疾
患マーカーをDNAプローブ(1本鎖または2本鎖)として貼
り付けたDNAチップを用意し、これに被験者の生体組織
由来のRNAから常法によって調製されたcRNAをハイブリ
ダイズさせ、形成されたDNAとcRNAとの2本鎖を、本発明
疾患マーカーから調製される標識プローブと結合させて
検出する方法を採用することができる。また、上記DNA
チップとして、配列番号:1-159のいずれかに記載の塩
基配列を有する遺伝子の遺伝子発現レベルの検出、測定
が可能なDNAチップを用いることもできる。かかる遺伝
子の発現レベルを検出、測定することができるDNAチッ
プとしては、Affymetrix社のGene Chip Human Genome U
95 A, B, C, D, Eを挙げることができる。かかるDNAチ
ップを用いた、被験者RNA中の配列番号:1-159のいずれ
かに記載の塩基配列を有する遺伝子の遺伝子発現レベル
の検出、測定については、実施例において詳細に説明す
る。
【0107】(2-2) 測定対象の生体試料として蛋白質を
用いる場合 測定対象として蛋白質を用いる場合、糖尿病性腎症の検
出(診断)は生体試料中に存在する配列番号:1-159のい
ずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子によってコード
される蛋白質、より具体的には、配列番号:4、10、1
2、13、20、29、38、42、47、48、50、51、98および126
のいずれかで示される遺伝子によりコードされる蛋白質
(配列番号:160-173のいずれかで示されるアミノ酸配列
を有する蛋白質)を検出し、その発現蛋白量(レベル)を
測定することによって実施される。より詳しくは、配列
番号:1-159のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝
子によってコードされる蛋白質(具体的には配列番号16
0-173のいずれかに記載のアミノ酸配列を有する蛋白
質)を認識する抗体を疾患マーカーとして用いて、ウエ
スタンブロット法などの公知方法で、上記蛋白質レベル
を検出、定量する。
【0108】ウエスタンブロット法は、一次抗体として
上記抗体(本発明疾患マーカー)を用いた後、二次抗体
として125Iなどの放射性同位元素、蛍光物質などで標識
した標識抗体(一次抗体に結合する標識抗体)を用い、得
られる標識結合物の放射性同位元素、蛍光物質などに由
来するシグナルを放射線測定器(BAS-1800II:富士フィ
ルム社製など)、蛍光検出器などで検出し、測定するこ
とによって実施できる。また、一次抗体として本発明疾
患マーカーを用いた後、ECL Plus Western Blotting De
tction System (Amersham Pharmacia Biotech 社製)を
用いて、該プロトコールに従って検出し、マルチバイオ
イメージャーSTORM860 (Amersham Pharmacia Biotech
社製)で測定することもできる。
【0109】尚、上記において測定対象とする蛋白質の
うちには、既に解明されている機能または活性を有する
ものが存在する。そのような蛋白質の場合、その蛋白質
量(レベル)と機能乃至活性とは一定の相関関係を有して
いるので、蛋白質量の測定に代えて、該蛋白質の機能ま
たは活性の測定を行うことによっても、本発明の糖尿病
性腎症の検出(診断)を実施することができる。すなわ
ち、本発明は、かかる蛋白質の機能または活性を指標と
して、これを公知の方法に従って測定、評価することか
らなる、糖尿病性腎症の検出(診断)方法をも包含する。
【0110】例えば、蛋白質が既知の酵素である場合、
上記機能(活性)には当該酵素に対する基質の修飾活性や
切断活性が含まれ、これらは、例えば基質修飾量や切断
量などの測定により求めることができる。
【0111】(2-3)糖尿病性腎症の診断 糖尿病性腎症の診断は、具体的には、被験者の腎臓にお
ける配列番号:1-159のいずれかに記載の塩基配列を有
する遺伝子の遺伝子発現レベルまたはその発現産物であ
る蛋白質、具体的には配列番号:160-173のいずれかで
示されるアミノ酸配列を有する蛋白質の量(レベル)を、
正常者の腎臓における当該遺伝子発現レベルまたは当該
蛋白質の量(レベル)と比較し、両者の違いを判定するこ
とによって行うことができる。
【0112】この場合、正常な腎臓から採取、調製した
生体試料(RNAまたは蛋白質)が必要であるが、これは糖
尿病性腎症に罹患していない人の腎臓をバイオプシなど
で採取することによって取得することができる。なお、
ここでいう「糖尿病性腎症に罹患していない人」とは、
少なくとも糖尿病性腎症の自覚症状がなく、好ましくは
他の検査方法、例えば血糖検査、尿中蛋白質の測定、糸
球体濾過率の測定などの腎機能検査の結果、糖尿病性腎
症でないと診断された人をいう。なお、当該「糖尿病性
腎症に罹患していない人」を、本明細書では単に正常者
という場合もある。
【0113】被験者の腎臓と正常者の腎臓(糖尿病性腎
症に罹患していない人の腎臓)とにおける遺伝子発現レ
ベルまたは蛋白質レベルの比較は、被験者の生体試料と
正常者の生体試料を対象とした測定を並行して行うこと
で実施できる。また、並行して行わなくても、複数(少
なくとも2、好ましくは3以上、より好ましくは5以上)の
正常な腎臓試料を用いて均一な測定条件で測定して得ら
れた上記遺伝子の遺伝子発現レベルまたはこれらの遺伝
子の発現産物である蛋白質の量(レベル)の平均値または
統計的中間値を予め求めておき、これを正常レベルまた
は正常値として、これらを被験者における測定レベルま
たは測定値と比較することもできる。
【0114】被験者が、糖尿病性腎症であるかどうかの
判断は、該被験者の腎臓における配列番号:1-159のい
ずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の遺伝子発現レ
ベルまたはその発現産物である蛋白質のレベル、より具
体的には、配列番号:160-173のいずれかで示されるア
ミノ酸配列を有する蛋白質のレベルが、正常者のそれら
と比較して2倍以上、好ましくは3倍以上の変動があるか
(多いかまたは少ないか)否かを指標として行うことがで
きる。
【0115】具体的には、被験者において、上記遺伝子
のうち配列番号:1-86のいずれかに記載の塩基配列を有
する遺伝子の遺伝子発現レベルまたはその発現産物、よ
り具体的には配列番号:160-171のいずれかで示される
アミノ酸配列を有する蛋白質のレベルが、正常者の上記
に対応する遺伝子の遺伝子発現レベルまたはその発現産
物のレベルに比べて多い場合、または被験者において、
前記遺伝子のうち配列番号:87-159のいずれかに記載の
塩基配列を有する遺伝子の遺伝子発現レベルまたはその
発現産物、より具体的には配列番号:172または173で示
されるアミノ酸配列を有する蛋白質のレベルが、正常者
のそれらに対応する遺伝子の遺伝子発現レベルまたはそ
の発現産物のレベルに比べて少ない場合には、該被験者
について糖尿病性腎症が疑われる。
【0116】なお、上記方法のうち、(2-1)測定対象の
生体試料としてRNAを利用して糖尿病性腎症を検出(診
断)する場合、すなわち、遺伝子の発現の有無または遺
伝子発現レベル(発現量)から糖尿病性腎症を検出(診断)
する場合は、検出(診断)の精度や正確性を高めるため
に、配列番号:1-159に示される遺伝子のうち2以上、好
ましくは複数個、より好ましくは上記遺伝子群の4分の1
以上、さらにより好ましくは上記遺伝子群の半数以上に
ついて、発現の有無または発現のレベル(発現量)を評価
し、その結果から糖尿病性腎症を検出(診断)することが
望ましい。
【0117】また、前記(2-2)測定対象として蛋白質を
利用して糖尿病性腎症を検出(診断)する場合も、上記と
同様に、生体試料について、配列番号:1-159に示され
る遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を有する蛋白
質(具体的には配列番号:160-173で示されるアミノ酸配
列を有する蛋白質)のうちの2以上、好ましくは複数個の
レベルを評価し、その結果から糖尿病性腎症を検出(診
断)することが望ましい。
【0118】複数個の遺伝子または蛋白質について評価
を行う場合には、個々の遺伝子または蛋白質での評価を
スコア化し、総合的に糖尿病性腎症を診断することが可
能である。例えば、上記の遺伝子または蛋白質の中から
任意の10個の遺伝子または蛋白質について評価を行い、
うち9個以上の遺伝子または蛋白質について上記基準に
基づいて糖尿病性腎症の病態が疑われると評価される場
合は、該疾患である可能性が高いと診断できる。なお、
この場合、評価する遺伝子または蛋白質の数、スコアあ
るいは診断基準は限定されない。
【0119】(3)候補薬のスクリーニング方法 (3-1)遺伝子発現レベルを指標とするスクリーニング方
法 本発明は、配列番号:1-159のいずれかに記載の塩基配
列を有する遺伝子の発現を制御する物質をスクリーニン
グする方法を提供する。
【0120】本発明のスクリーニング方法は、次の工程
(a)、(b)および(c)を含む: (a) 被験物質と、配列番号:1-159のいずれかに記載の
塩基配列を有する遺伝子を発現可能な細胞とを接触させ
る工程、(b) 被験物質を接触させた細胞について配列番
号:1-159のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子
の遺伝子発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触さ
せない対照細胞の上記対応する遺伝子の発現量と比較す
る工程、(c) 上記の比較結果に基づいて、配列番号:1-
159のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の遺伝
子発現量を変動させる被験物質を選択する工程。
【0121】かかるスクリーニングに用いられる細胞と
しては、内来性および外来性を問わず、配列番号:1-15
9のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子を発現し
得る細胞であって、かつ腎臓由来の細胞を挙げることが
できる。腎臓由来の細胞としては、具体的には、2型糖
尿病性腎症モデルマウスであるC57BL/ksj-db-db Jclマ
ウス(日本クレア)、1型糖尿病性腎症モデルであるスト
レプトゾトシン投与Wistarラット(チャールズリバー)か
ら単離、調製された初代腎臓培養細胞などを挙げること
ができる。また、NRK-49F細胞(ラット腎臓細胞、ATCC寄
託株)のような株化した細胞も上記腎臓由来細胞に包含
される。尚、当該NRK-49F細胞のような株化細胞を用い
る場合、高グルコース培地(例えばグルコース濃度25mM
程度)で培養するかもしくは腎炎などの組織線維化の原
因因子として知られている例えばTGF-β、PDGFなどの存
在下で培養することにより、よりヒト疾患に近い状態と
した細胞とすることができ、かかる細胞を用いるのが好
ましい。
【0122】さらに本発明のスクリーニングに用いられ
る細胞の範疇には、細胞の集合体である組織も含まれ
る。
【0123】候補物質となり得るものとしては、制限さ
れないが、核酸、ペプチド、蛋白質、有機化合物、無機
化合物などであり、スクリーニングは、具体的にはこれ
らの候補物質となり得る被験物質またはこれらを含む試
料(被験試料)を上記組織/または細胞と接触させて行う
ことができる。かかる被験試料としては、被験物質を含
む、細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成
低分子化合物、合成ペプチド、天然化合物などが挙げら
れるが、これに制限されない。
【0124】本発明スクリーニングに際して、被験物質
と細胞とを接触させる条件は、特に制限されないが、該
細胞が死滅せず且つ所望遺伝子を発現できる培養条件
(温度、pH、培地組成など)を選択するのが好ましい。
【0125】実施例に示すように、糖尿病性腎症に罹患
した患者の腎臓では、正常な腎臓に比して、配列番号:
1-86のいずれかで示される塩基配列を有する遺伝子(遺
伝子I)の発現レベルの上昇が認められる。この知見か
ら、配列番号:1-86のいずれかで示される塩基配列を有
する遺伝子の発現レベルの上昇が、糖尿病性腎症と関連
していると考えられる。本発明スクリーニング方法に
は、これら遺伝子の発現レベルを指標として、その発現
を抑制する物質(発現レベルを正常レベルに戻す物質)を
探索する方法が包含される。このスクリーニング方法に
よって、糖尿病性腎症の予防、改善乃至治療薬の有効成
分となる候補物質が提供できる。
【0126】かかる配列番号:1-86のいずれかで示され
る塩基配列を有する遺伝子の発現レベルを指標とする本
発明スクリーニング方法は、具体的には以下の工程(a)-
(c)を含んでいる。 (a) 被験物質と、配列番号:1-86のいずれかで示される
塩基配列を有する遺伝子を発現可能な細胞とを接触させ
る工程、(b) 被験物質を接触させた細胞について、配列
番号:1-86のいずれかで示される塩基配列を有する遺伝
子の遺伝子発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触
させない対照細胞の上記対応する遺伝子の発現量と比較
する工程、および(c) 上記の比較結果に基づいて、配列
番号:1-86のいずれかで示される塩基配列を有する遺伝
子の発現を抑制する(遺伝子発現レベルを低下させる)被
験物質を選択する工程。
【0127】また、実施例に示すように、糖尿病性腎症
に罹患した患者の腎臓では、正常な腎臓に比して、配列
番号:87-159のいずれかで示される塩基配列を有する遺
伝子(遺伝子II)の発現レベルの低下が認められる。この
知見から、配列番号:87-159のいずれかで示される塩基
配列を有する遺伝子の発現レベルの低下が、糖尿病性腎
症と関連していると考えられる。本発明のスクリーニン
グ方法には、これら遺伝子の発現レベルを指標として、
その発現を亢進させる物質(発現量を増加させる物質、
発現レベルを正常レベルに戻す物質)を探索する方法が
包含される。このスクリーニング方法によっても、糖尿
病性腎症の予防、改善乃至治療薬の有効成分となる候補
物質が提供できる。
【0128】この本発明スクリーニング方法は、具体的
には、以下の(a)-(c)工程を含んでいる。 (a) 被験物質と、配列番号:87-159のいずれかで示され
る塩基配列を有する遺伝子を発現可能な細胞とを接触さ
せる工程、(b) 被験物質を接触させた細胞について、配
列番号:87-159のいずれかで示される塩基配列を有する
遺伝子の遺伝子発現量を測定し、該発現量を被験物質を
接触させない対照細胞の上記対応する遺伝子の発現量と
比較する工程、および(c) 上記の比較結果に基づいて、
配列番号:87-159のいずれかで示される塩基配列を有す
る遺伝子の発現量を増加させる被験物質を選択する工
程。
【0129】すなわち、本発明のスクリーニング方法
は、配列番号:1-86のいずれかで示される塩基配列を有
する遺伝子(遺伝子I)の発現誘導・増大および/または
配列番号:87-159のいずれかで示される塩基配列を有す
る遺伝子(遺伝子II)の発現抑制・減少が、糖尿病性腎症
と関連していることを利用したものである。よって、糖
尿病性腎症の緩和/抑制作用を有する(糖尿病性腎症に
対して改善/治療効果を発揮する)物質の探索には、配
列番号:1-86のいずれかで示される塩基配列を有する遺
伝子(遺伝子I)の発現レベルの減少もしくは発現抑制が
指標とされ、また配列番号:87-159のいずれかで示され
る塩基配列を有する遺伝子(遺伝子II)の発現レベルの増
大もしくは発現誘導が指標とされる。
【0130】以上のように、本発明のスクリーニング方
法は、配列番号:1-86のいずれかで示される塩基配列を
有する遺伝子(遺伝子I)の発現を抑制乃至減少させる物
質を探索するか、或いは配列番号:87-159のいずれかで
示される塩基配列を有する遺伝子(遺伝子II)の発現を誘
導乃至増大させる物質を探索することによって、糖尿病
性腎症の予防、改善または治療薬の有効成分となる候補
化合物を提供するものである。
【0131】本発明スクリーニング方法に従う候補物質
の選別は、具体的には配列番号:1-86のいずれかで示さ
れる塩基配列を有する遺伝子(遺伝子I)が発現している
細胞を用いる場合は、被験物質(候補物質)を添加した細
胞における上記各遺伝子の発現レベルが被験物質(候補
物質)を添加しない細胞における同遺伝子の発現レベル
に比して低くなることをもって、行うことができる。ま
た、該遺伝子Iの発現に発現誘導物質を必要とする細胞
を用いる場合は、発現誘導物質(例えば、NRK-49F細胞の
場合は高グルコース処理やTGF-β、PDGFなど)によって
誘導される発現が、候補物質の存在によって抑制される
こと、すなわち発現誘導物質の存在下で、候補物質を接
触させた細胞の遺伝子発現が、発現誘導物質存在下で、
候補物質を接触させなかった対照細胞(正のコントロー
ル)に比して低くなることをもって、行うことができ
る。
【0132】一方、配列番号:87-159のいずれかで示さ
れる塩基配列を有する遺伝子(遺伝子II)が発現している
細胞を用いる場合は、被験物質(候補物質)を添加した細
胞における上記各遺伝子の発現レベルが被験物質(候補
物質)を添加しない細胞における同遺伝子の発現レベル
に比して高くなることをもって、候補物質を選別するこ
とができる。また、該遺伝子IIの発現が発現抑制物質に
よって抑制されている場合は、発現抑制物質(例えば、N
RK-49F細胞の場合は高グルコース処理やTGF-β、PDGFな
ど)によって抑制される発現が、候補物質の存在によっ
て誘導されること、すなわち発現抑制物質の存在下で、
候補物質を接触させた細胞の遺伝子発現が、該発現抑制
物質の存在下で、候補物質を接触させなかった対照細胞
(正のコントロール)に比して高くなることをもって、候
補物質の選別を行うことができる。
【0133】より具体的には、例えばC57BL/Ksj-db/db
Jclマウス、ストレプトゾトシン投与Wistarラットなど
から単離、調製した初代腎臓培養細胞、高グルコース処
理、TGF-β処理などを施したNRK-49F細胞などを用い
て、溶媒のみを加えた当該細胞(対照細胞)と被験物質を
加えた当該細胞とについて、遺伝子Iまたは遺伝子IIの
発現レベルを比較し、それぞれその発現レベルの減少ま
たは増大を指標として、候補物質を選別することができ
る。
【0134】本発明スクリーニング法にかかる所定遺伝
子の発現レベルの検出および定量は、前述した細胞から
調製したRNAまたはそれから転写された相補的なポリヌ
クレオチドと本発明疾患マーカーとを用いて、前記(2-
1)項に記述したように、ノーザンブロット法、RT-PCR法
など公知の方法、DNAチップなどを利用する方法などに
従って実施することができる。指標とする遺伝子発現レ
ベルの変動(抑制・減少または誘導・増大)の程度として
は、被験物質(候補物質)を添加した細胞における遺伝子
Iまたは遺伝子IIの発現が被験物質(候補物質)を添加し
ない対照細胞での発現量と比較して10%、好ましくは30
%、特に好ましくは50%以上の減少または増加を例示する
ことができる。
【0135】また遺伝子Iまたは遺伝子IIの発現レベル
の検出および定量は、それぞれ遺伝子Iまたは遺伝子II
の発現を制御する遺伝子領域(発現制御領域)に、例えば
ルシフェラーゼ遺伝子などのマーカー遺伝子をつないだ
融合遺伝子を導入した細胞株を用いて、マーカー遺伝子
由来の蛋白質の活性を測定することによっても実施でき
る。本発明の遺伝子Iまたは遺伝子IIの発現制御物質の
スクリーニング方法には、かかるマーカー遺伝子の発現
量を指標として標的物質を探索する方法も包含される。
この意味において、本発明でいう配列番号:1-159のい
ずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の概念には、該
遺伝子の発現制御領域とマーカー遺伝子との融合遺伝子
が含まれる。
【0136】上記マーカー遺伝子としては、発光反応や
呈色反応を触媒する酵素の構造遺伝子が好ましい。具体
的には、上記ルシフェラーゼ遺伝子のほか、クロラムフ
ェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、βグ
ルクロニダーゼ遺伝子、βガラクトシダーゼ遺伝子、エ
クオリン遺伝子などのレポーター遺伝子を例示できる。
ここで遺伝子の発現制御領域としては、例えば該遺伝子
の転写開始部位上流約1kb、好ましくは約2kbを用いるこ
とができる。融合遺伝子の作成およびマーカー遺伝子由
来の活性測定は、公知の方法で行うことができる。
【0137】本発明スクリーニング方法において、スク
リーニングの精度や正確性を高めるためには、被験物質
による遺伝子発現レベルを前記遺伝子の2以上、好まし
くは複数個、より好ましくは上記遺伝子群の4分の1以
上、さらにより好ましくは上記遺伝子群の半数以上につ
いて評価し、候補物質を選別することが望ましい。複数
個の遺伝子について評価する場合には、個々の遺伝子で
の評価をスコア化し、総合的に糖尿病性腎症を診断する
ことが可能である。例えば、一つの被験物質を用いて、
上記の遺伝子の中から任意の10個の遺伝子について評価
を行い、該被験物質がそのうちの9個以上の遺伝子に関
して上記基準から糖尿病性腎症の予防、改善または治療
薬の有効成分となる候補化合物であると評価される場
合、該被験物質は候補化合物である可能性が高いと判断
できる。この場合、評価する遺伝子数、スコアあるいは
判断基準は限定されない。
【0138】以上のスクリーニング方法により、被験物
質から選別される物質は、配列番号:1-86のいずれかで
示される塩基配列を有する遺伝子の遺伝子発現抑制剤ま
たは配列番号87-159のいずれかで示される塩基配列を有
する遺伝子の遺伝子発現増強剤(誘導剤)として位置づけ
ることができる。これらの物質は、生体内において配列
番号:1-86のいずれかで示される塩基配列を有する遺伝
子の発現を抑制・減少するか、或いは配列番号:87-159
のいずれかで示される塩基配列を有する遺伝子の発現を
誘導・増大することによって、糖尿病性腎症を緩和、抑
制(改善、治療)する薬物の有力な候補物質となる。
【0139】(3-2) 蛋白質の発現量を指標とするスクリ
ーニング方法 本発明は、配列番号:1-159のいずれかで示される塩基
配列を有する遺伝子によりコードされる蛋白質、例えば
配列番号:160-173のいずれかで示されるアミノ酸配列
を有する蛋白質の発現量を制御する物質のスクリーニン
グする方法を提供する。
【0140】本発明スクリーニング方法は、次の工程
(a)、(b)および(c)を含む: (a) 被験物質と配列番号:1-159のいずれかに記載の塩
基配列を有する遺伝子によりコードされる蛋白質、例え
ば配列番号:160-173のいずれかに記載のアミノ酸配列
を有する蛋白質を発現可能な細胞または該細胞から調製
した細胞画分とを接触させる工程、(b) 被験物質を接触
させた細胞または細胞画分における配列番号:1-159の
いずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子によりコード
される蛋白質、例えば配列番号:160-173のいずれかに
記載のアミノ酸配列を有する蛋白質の量を測定し、該量
を被験物質を接触させない対照細胞もしくは細胞画分に
おける同一蛋白質の発現量と比較する工程、(c) 上記
(b)の比較結果に基づいて、当該蛋白質の発現量を変動
させる被験物質を選択する工程。
【0141】本発明スクリーニングに用いられる細胞
は、内来性および外来性を問わず、配列番号:1-159の
いずれかで示される塩基配列を有する遺伝子によりコー
ドされる蛋白質、例えば配列番号:160-173のいずれか
で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質を発現し得る細
胞を挙げることができる。配列番号:1-159のいずれか
で示される塩基配列を有する遺伝子によりコードされる
蛋白質、例えば配列番号:160-173のいずれかで示され
るアミノ酸配列を有する蛋白質を発現し得る細胞として
は、具体的には、前記(3-1)項に記載したような腎臓由
来の細胞などを用いることができる。細胞画分とは、上
記細胞に由来する各種の画分を意味し、これには、例え
ば、細胞膜画分、細胞質画分、細胞核画分などが含まれ
る。
【0142】実施例に示すように、糖尿病性腎症に罹患
した患者の腎臓では、正常な腎臓に比して、配列番号:
1-86のいずれかで示される塩基配列を有する遺伝子の発
現レベルの上昇が観察され、該遺伝子の発現産物である
蛋白質量の増加がみられる。この知見から、当該遺伝子
の発現産物である蛋白質の量は、糖尿病性腎症に関連す
ると考えられる。本発明スクリーニング方法は、当該遺
伝子の発現産物である蛋白質の量を指標として、該蛋白
質量を低下させる物質(正常レベルに戻す物質)を探索
する方法が包含される。
【0143】かかる配列番号:1-86のいずれかで示され
る塩基配列を有する遺伝子の発現産物である蛋白質量を
指標とする本発明スクリーニング方法は、具体的には、
以下の(a)-(c)工程を含んでいる。(a) 被験物質と配列
番号:1-86のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子
によりコードされる蛋白質、例えば配列番号:160-171
のいずれかに記載のアミノ酸配列を有する蛋白質を発現
可能な細胞または該細胞から調製した細胞画分とを接触
させる工程、(b) 被験物質を接触させた細胞または細胞
画分における配列番号:1-86のいずれかに記載の塩基配
列を有する遺伝子によりコードされる蛋白質、例えば配
列番号:160-171のいずれかに記載のアミノ酸配列を有
する蛋白質の量を測定し、該発現量を被験物質を接触さ
せない対照細胞もしくは細胞画分における同一蛋白質の
量と比較する工程、(c) 上記(b)の比較結果に基づい
て、当該蛋白質の発現量を減少させる被験物質を選択す
る工程。
【0144】また、実施例に示すように、糖尿病性腎症
に罹患した患者の腎臓では、正常な腎臓に比して、配列
番号:87-159のいずれかで示される塩基配列を有する遺
伝子の発現レベルの低下が観察され、該遺伝子の発現産
物である蛋白質量の低下がみられる。この知見から、当
該遺伝子の発現産物である蛋白質の量は、糖尿病性腎症
に関連すると考えられる。本発明スクリーニング方法
は、当該遺伝子の発現産物である蛋白質の量を指標とし
て、該蛋白質量を増加させる物質(正常レベルに戻す物
質)を探索する方法が包含される。
【0145】かかる配列番号:87-159のいずれかで示さ
れる塩基配列を有する遺伝子の発現産物である蛋白質量
を指標とする本発明スクリーニング方法は、具体的に
は、以下の(a)-(c)工程を含んでいる。 (a) 被験物質と配列番号:87-159のいずれかに記載の塩
基配列を有する遺伝子によりコードされる蛋白質、例え
ば配列番号:172または173に記載のアミノ酸配列を有す
る蛋白質を発現可能な細胞または該細胞から調製した細
胞画分とを接触させる工程、(b) 被験物質を接触させた
細胞または細胞画分における配列番号:87-159のいずれ
かに記載の塩基配列を有する遺伝子によりコードされる
蛋白質、例えば配列番号:172または173に記載のアミノ
酸配列を有する蛋白質の発量を測定し、該発現量を被験
物質を接触させない対照細胞もしくは細胞画分における
同一蛋白質の発現量と比較する工程、(c) 上記(b)の比
較結果に基づいて、当該蛋白質の発現量を増加させる被
験物質を選択する工程。
【0146】すなわち、本発明のスクリーニング方法
は、配列番号:1-86のいずれかに記載の塩基配列を有す
る遺伝子(遺伝子I)によりコードされる蛋白質、具体的
には配列番号:160-171のいずれかに記載のアミノ酸配
列を有する蛋白質の量(レベル)の上昇・増加および/ま
たは配列番号:87-159のいずれかに記載の塩基配列を有
する遺伝子(遺伝子II)によりコードされる蛋白質、具体
的には配列番号:172または173に記載のアミノ酸配列を
有する蛋白質の量(レベル)の低下・減少が、糖尿病性腎
症と関連していることを利用したものである。よって、
該糖尿病性腎症の緩和/抑制作用を有する(糖尿病性腎
症に対して改善/治療効果を発揮する)物質の探索に
は、配列番号:1-86のいずれかに記載の塩基配列を有す
る遺伝子(遺伝子I)によりコードされる蛋白質、具体的
には配列番号:160-171のいずれかに記載のアミノ酸配
列を有する蛋白質のレベルの減少もしくは低下が指標と
され、また配列番号:87-159のいずれかに記載の塩基配
列を有する遺伝子(遺伝子II)によりコードされる蛋白
質、具体的には配列番号:172または173に記載のアミノ
酸配列を有する蛋白質のレベルの増大もしくは発現誘導
が指標とされる。
【0147】上記のことから、本発明のスクリーニング
方法は、配列番号:1-86のいずれかで示される塩基配列
を有する遺伝子(遺伝子I)によりコードされる蛋白質、
具体的には配列番号:160-171のいずれかで示されるア
ミノ酸配列を有する蛋白質のレベルを抑制・減少させる
物質を探索することおよび/または配列番号:87-159の
いずれかで示される塩基配列を有する遺伝子(遺伝子II)
によりコードされる蛋白質、具体的には配列番号:172
または173で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質のレ
ベルを誘導・増大させる物質を探索することによって、
糖尿病性腎症の予防薬、改善薬または治療薬の有効成分
となる候補物質を提供するものである。
【0148】候補物質の選別は、具体的には配列番号:
1-86のいずれかで示される塩基配列を有する遺伝子(遺
伝子I)によりコードされる蛋白質を発現産生している細
胞を用いる場合は、被験物質(候補物質)を添加した細胞
における上記各遺伝子産物としての蛋白質のレベルが被
験物質(候補物質)を添加しない細胞における同遺伝子産
物のレベルに比して低くなることをもって、行うことが
できる。また、該遺伝子Iの発現産物の産生に発現誘導
物質を必要とする細胞を用いる場合は、発現誘導物質
(例えば、NRK-49F細胞の場合は高グルコース処理やTGF-
β、PDGFなど)によって誘導される遺伝子産物の産生
が、候補物質の存在によって抑制されること、すなわち
発現誘導物質の存在下で、候補物質を接触させた細胞の
遺伝子発現産物のレベルが、発現誘導物質存在下で、候
補物質を接触させなかった対照細胞(正のコントロール)
の遺伝子発現産物レベルに比して低くなることをもっ
て、行うことができる。
【0149】一方、配列番号:87-159のいずれかで示さ
れる塩基配列を有する遺伝子(遺伝子II)によりコードさ
れる蛋白質を発現産生している細胞を用いる場合は、被
験物質(候補物質)を添加した細胞における上記各遺伝子
産物のレベルが被験物質(候補物質)を添加しない細胞に
おける同遺伝子産物のレベルに比して高くなることをも
って、候補物質を選別することができる。また、該遺伝
子IIの発現が発現抑制物質によって抑制されている場合
は、発現抑制物質(例えば、NRK-49F細胞の場合は高グル
コース処理やTGF-β、PDGFなど)によって抑制される発
現産物レベルが、候補物質の存在によって上昇するこ
と、すなわち発現抑制物質の存在下で、候補物質を接触
させた細胞の遺伝子産物の産生レベルが、該発現抑制物
質の存在下で、候補物質を接触させなかった対照細胞
(正のコントロール)の遺伝子産物産生レベルに比して高
くなることをもって、候補物質の選別を行うことができ
る。
【0150】より具体的には、例えばC57BL/Ksj-db/db
Jclマウス、ストレプトゾトシン投与Wistarラットなど
から単離、調製した初代腎臓培養細胞、高グルコース処
理、TGF-β処理などを施したNRK-49F細胞などを用い
て、溶媒のみを加えた当該細胞(対照細胞)と被験物質を
加えた当該細胞とについて、遺伝子Iまたは遺伝子IIの
発現産物レベルを比較し、それぞれその発現産物レベル
の減少または増大を指標として、候補物質を選別するこ
とができる。
【0151】本発明スクリーニング方法に係る蛋白質の
発現量は、前述したように、例えば、本発明疾患マーカ
ーとして抗体(例えば、配列番号:160-173のいずれかで
示されるアミノ酸配列からなる蛋白質を認識する抗体)
を用いたウエスタンブロット法などの公知方法に従って
定量できる。ウエスタンブロット法は、一次抗体として
本発明疾患マーカーを用いた後、二次抗体として125Iな
どの放射性同位元素、蛍光物質などで標識した一次抗体
に結合する抗体を用いて標識し、これら標識物質由来の
シグナルを放射線測定器(BAS-1800II:富士フィルム社
製など)、蛍光検出器などで測定することによって実施
できる。また、一次抗体として本発明疾患マーカーを用
いた後、ECL Plus Western Blotting Detction System
(AmershamPharmacia Biotech 社製)を利用して、該プロ
トコールに従って検出し、マルチバイオイメージャーST
ORM860(Amersham Pharmacia Biotech 社製)で測定する
こともできる。
【0152】本発明スクリーニング方法によってスクリ
ーニングされる被験物質(候補物質)は、制限されない
が、核酸、ペプチド、蛋白質、有機化合物、無機化合物
などであり、本発明スクリーニングは、具体的にはこれ
らの被験物質またはこれらを含む試料(被験試料)を上記
細胞または細胞画分と接触させることにより行われる。
被験試料としては、被験物質を含む、細胞抽出液、遺伝
子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物、合成ペ
プチド、天然化合物などが挙げられるが、これらに制限
されない。
【0153】本発明スクリーニング方法において、スク
リーニングの精度や正確性を高めるためには、被験物質
による遺伝子発現産物量(レベル)を前記蛋白質の2以
上、好ましくは複数個、より好ましくは上記蛋白質群の
4分の1以上、さらにより好ましくは上記蛋白質群の半数
以上について評価し、候補物質を選別することが望まし
い。複数個の蛋白質について評価する場合には、個々の
蛋白質での評価をスコア化し、総合的に糖尿病性腎症を
診断することが可能である。
【0154】(3-3) 蛋白質の機能(活性)を指標とするス
クリーニング方法 本発明は、また配列番号:1-159のいずれかで示される
塩基配列を有する遺伝子によりコードされる蛋白質、例
えば配列番号:160-173のいずれかで示されるアミノ酸
配列を有する蛋白質の機能(活性)を制御する物質をスク
リーニングする方法を提供する。
【0155】本発明スクリーニング方法は、次の工程
(a)、(b)および(c)を含む: (a) 被験物質と配列番号:1-159のいずれかで示される
塩基配列を有する遺伝子によりコードされる蛋白質、例
えば配列番号:160-173のいずれかで示されるアミノ酸
配列を有する蛋白質を含む水溶液、細胞または該細胞か
ら調製した細胞画分とを接触させる工程、(b) 被験物質
を接触させた水溶液、細胞または細胞画分の、配列番
号:1-159のいずれかで示される塩基配列を有する遺伝
子によりコードされる蛋白質、例えば配列番号:160-17
3のいずれかで示されるアミノ酸配列を有する蛋白質に
由来する機能(活性)を測定し、該機能(活性)を被験物質
を接触させない対照水溶液または対照細胞もしくは細胞
画分における同一蛋白質に由来する機能(活性)と比較す
る工程、(c) 上記(b)の比較結果に基づいて、配列番
号:1-159のいずれかで示される塩基配列を有する遺伝
子によりコードされる蛋白質、例えば配列番号:160-17
3のいずれかで示されるアミノ酸配列を有する蛋白質に
由来する機能(活性)を変動させる被験物質を選択する工
程。
【0156】本発明スクリーニングに用いられる特定蛋
白質を含む水溶液は、配列番号:1-159のいずれかで示
される塩基配列を有する遺伝子によりコードされる蛋白
質、例えば配列番号:160-173のいずれかで示されるア
ミノ酸配列を有する蛋白質を含むものであればよく、特
に制限されない。その具体例としては、例えば所定の蛋
白質の水溶液の他、所定の蛋白質を含む細胞溶解液、核
抽出液あるいは細胞の培養上清などを例示することがで
きる。
【0157】また、本発明スクリーニングに用いられる
細胞は、内来性および外来性を問わず、配列番号:1-15
9のいずれかで示される塩基配列を有する遺伝子により
コードされる蛋白質、例えば配列番号:160-173のいず
れかで示されるアミノ酸配列を有する蛋白質、を発現し
得る細胞を挙げることができる。該細胞としては、具体
的には、前記(3-1)項に示されるような腎臓由来の細胞
などを用いることができる。また、配列番号:1-159の
いずれかで示される塩基配列を有する遺伝子(発現ベク
ター)で形質転換された形質転換細胞も、上記細胞に包
含される。該形質転換に用いられる宿主細胞としては、
例えばNRK-49F、COS、CHO、L、Sf9などの周知の細胞を
挙げることができる。細胞画分とは、上記細胞に由来す
る各種の画分を意味し、これには、例えば、細胞膜画
分、細胞質画分、細胞核画分などが含まれる。
【0158】実施例に示すように、糖尿病性腎症に罹患
した患者の腎臓では、正常な腎臓に比して、配列番号:
1-86のいずれかで示される塩基配列を有する遺伝子の発
現レベルの上昇が観察され、該遺伝子の発現産物である
蛋白質量の増加がみられ、それに伴って該蛋白質の機能
(活性)の亢進が認められる。この知見から、当該遺伝子
の発現産物である蛋白質の機能(活性)は、糖尿病性腎症
に関連すると考えられる。本発明スクリーニング方法
は、当該遺伝子の発現産物である蛋白質の機能(活性)を
指標として、該蛋白質の機能(活性)を抑制する物質(正
常レベルに戻す物質)を探索する方法が包含される。
【0159】かかる配列番号:1-86のいずれかで示され
る塩基配列を有する遺伝子の発現産物である蛋白質の機
能(活性)を指標とする本発明スクリーニング方法は、具
体的には、以下の(a)-(c)工程を含んでいる。 (a) 被験物質と配列番号:1-86のいずれかに記載の塩基
配列を有する遺伝子によりコードされる蛋白質、例えば
配列番号:160-171のいずれかに記載のアミノ酸配列を
有する蛋白質を含む水溶液、細胞または該細胞から調製
した細胞画分とを接触させる工程、(b) 被験物質を接触
させた水溶液、細胞または細胞画分における配列番号:
1-86のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子により
コードされる蛋白質、例えば配列番号:160-171のいず
れかに記載のアミノ酸配列を有する蛋白質の機能または
活性を測定し、該機能または活性を被験物質を接触させ
ない対照水溶液、対照細胞または対照細胞画分における
同一蛋白質の機能または活性と比較する工程、(c) 上記
(b)の比較結果に基づいて、当該蛋白質の機能または活
性を抑制する被験物質を選択する工程。
【0160】また、実施例に示すように、糖尿病性腎症
に罹患した患者の腎臓では、正常な腎臓に比して、配列
番号:87-159のいずれかで示される塩基配列を有する遺
伝子の発現レベルの低下が観察され、該遺伝子の発現産
物である蛋白質量の低下がみられ、これに伴って該蛋白
質の機能(活性)の低下が認められる。この知見から、当
該遺伝子の発現産物である蛋白質の機能(活性)は、糖尿
病性腎症に関連すると考えられる。本発明スクリーニン
グ方法は、当該遺伝子の発現産物である蛋白質の機能
(活性)を指標として、該蛋白質の機能(活性)を亢進させ
る物質(正常レベルに戻す物質)を探索する方法が包含
される。
【0161】かかる配列番号:87-159のいずれかで示さ
れる塩基配列を有する遺伝子の発現産物である蛋白質の
機能(活性)を指標とする本発明スクリーニング方法は、
具体的には、以下の(a)-(c)工程を含んでいる。 (a) 被験物質と配列番号:87-159のいずれかに記載の塩
基配列を有する遺伝子によりコードされる蛋白質、例え
ば配列番号:172または173に記載のアミノ酸配列を有す
る蛋白質を含む水溶液、細胞または該細胞から調製した
細胞画分とを接触させる工程、(b) 被験物質を接触させ
た水溶液、細胞または細胞画分における配列番号:87-1
59のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子によりコ
ードされる蛋白質、例えば配列番号:172または173に記
載のアミノ酸配列を有する蛋白質の機能または活性を測
定し、該機能または活性を被験物質を接触させない対照
水溶液、対照細胞または対照細胞画分における同一蛋白
質の機能または活性と比較する工程、(c) 上記(b)の比
較結果に基づいて、当該蛋白質の機能または活性を亢進
させる被験物質を選択する工程。
【0162】すなわち、本発明のスクリーニング方法
は、配列番号:1-86のいずれかに記載の塩基配列を有す
る遺伝子(遺伝子I)によりコードされる蛋白質、具体的
には配列番号:160-171のいずれかに記載のアミノ酸配
列を有する蛋白質の機能(活性)の亢進・上昇および/ま
たは配列番号:87-159のいずれかに記載の塩基配列を有
する遺伝子(遺伝子II)によりコードされる蛋白質、具体
的には配列番号:172または173に記載のアミノ酸配列を
有する蛋白質の機能(活性)の低下・減少が、糖尿病性腎
症と関連していることを利用したものである。よって、
該糖尿病性腎症の緩和/抑制作用を有する(糖尿病性腎
症に対して改善/治療効果を発揮する)物質の探索に
は、配列番号:1-86のいずれかに記載の塩基配列を有す
る遺伝子(遺伝子I)によりコードされる蛋白質、具体的
には配列番号:160-171のいずれかに記載のアミノ酸配
列を有する蛋白質の機能(活性)の抑制もしくは低下が指
標とされ、また配列番号:87-159のいずれかに記載の塩
基配列を有する遺伝子(遺伝子II)によりコードされる蛋
白質、具体的には配列番号:172または173に記載のアミ
ノ酸配列を有する蛋白質の機能(活性)の亢進もしくは上
昇が指標とされる。
【0163】上記のことから、本発明のスクリーニング
方法は、配列番号:1-86のいずれかで示される塩基配列
を有する遺伝子(遺伝子I)によりコードされる蛋白質、
具体的には配列番号:160-171のいずれかで示されるア
ミノ酸配列を有する蛋白質の機能(活性)を抑制・減少さ
せる物質を探索することおよび/または配列番号:87-1
59のいずれかで示される塩基配列を有する遺伝子(遺伝
子II)によりコードされる蛋白質、具体的には配列番
号:172または173で示されるアミノ酸配列を有する蛋白
質の機能(活性)を亢進・増大させる物質を探索すること
によって、糖尿病性腎症の予防薬、改善薬または治療薬
の有効成分となる候補物質を提供するものである。
【0164】上記蛋白質の機能または活性は、当該蛋白
質の公知の機能または活性に基づく適当なスクリーニン
グ系を構築することによって測定することができる。な
お、特定塩基配列によってコードされる蛋白質ならびに
当該蛋白質が有する機能、活性などは、例えばGenBank
などの公知のデータベースや文献検索用のデータベース
を用いて容易に調べることができる。
【0165】候補物質の選別は、例えば配列番号:1-86
のいずれかで示される塩基配列を有する遺伝子(遺伝子
I)によりコードされる蛋白質を発現産生している細胞を
用いる場合は、被験物質(候補物質)を添加した細胞にお
ける上記各遺伝子産物としての蛋白質の機能(活性)が被
験物質(候補物質)を添加しない細胞における同遺伝子産
物の機能(活性)に比して低下していることをもって、行
うことができる。また、該遺伝子Iの発現産物の産生に
発現誘導物質を必要とする細胞を用いる場合は、発現誘
導物質(例えば、NRK-49F細胞の場合は高グルコース処理
やTGF-β、PDGFなど)によって誘導される遺伝子産物の
機能(活性)が、候補物質の存在によって抑制されるこ
と、すなわち発現誘導物質の存在下で、候補物質を接触
させた細胞の遺伝子発現産物の機能(活性)が、発現誘導
物質存在下で、候補物質を接触させなかった対照細胞
(正のコントロール)の遺伝子発現産物の機能(活性)に比
して低下していることをもって、行うことができる。
【0166】一方、配列番号:87-159のいずれかで示さ
れる塩基配列を有する遺伝子(遺伝子II)によりコードさ
れる蛋白質を発現産生している細胞を用いる場合は、被
験物質(候補物質)を添加した細胞における上記各遺伝子
産物の機能(活性)が被験物質(候補物質)を添加しない細
胞における同遺伝子産物の機能(活性)に比して高くなる
ことをもって、候補物質を選別することができる。ま
た、該遺伝子IIの発現が発現抑制物質によって抑制され
ている場合は、発現抑制物質(例えば、NRK-49F細胞の場
合は高グルコース処理やTGF-β、PDGFなど)によって抑
制される発現産物の機能(活性)が、候補物質の存在によ
って亢進すること、すなわち発現抑制物質の存在下で、
候補物質を接触させた細胞の遺伝子産物の機能(活性)
が、該発現抑制物質の存在下で、候補物質を接触させな
かった対照細胞(正のコントロール)の遺伝子産物の機能
(活性)に比して高くなることをもって、候補物質の選別
を行うことができる。
【0167】より具体的には、例えばC57BL/Ksj-db/db
Jclマウス、ストレプトゾトシン投与Wistarラットなど
から単離、調製した初代腎臓培養細胞;高グルコース処
理、TGF-β処理などを施したNRK-49F細胞;本発明遺伝
子Iまたは遺伝子IIを有する発現ベクターで形質転換さ
れたNRK-49F細胞、COS細胞、CHO細胞などの適当な細胞
を用いて、溶媒のみを加えた当該細胞(対照細胞)と被験
物質を加えた当該細胞とについて、遺伝子Iまたは遺伝
子IIの発現産物の機能(活性)を比較し、それぞれその発
現産物の機能(活性)の抑制または亢進を指標として、候
補物質を選別することができる。
【0168】本発明スクリーニング方法によってスクリ
ーニングされる被験物質(候補物質)は、制限されない
が、核酸、ペプチド、蛋白質、有機化合物、無機化合物
などであり、本発明スクリーニングは、具体的にはこれ
らの被験物質またはこれらを含む試料(被験試料)を上記
水溶液、細胞または細胞画分と接触させることにより行
われる。被験試料としては、被験物質を含む、細胞抽出
液、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合
物、合成ペプチド、天然化合物などが挙げられるが、こ
れらに制限されない。
【0169】前記(3-1)項乃至(3-3)項に示した本発明ス
クリーニング方法において、配列番号:1-86のいずれか
で示される塩基配列を有する遺伝子や該遺伝子によりコ
ードされる蛋白質に関して、該遺伝子の発現を抑制、減
少させる物質や該遺伝子によりコードされる蛋白質の発
現量、機能または活性を抑制、低下させる物質が、糖尿
病性腎症の予防、改善乃至治療薬の有効成分として有用
であること、および配列番号:87-159のいずれかで示さ
れる塩基配列を有する遺伝子や該遺伝子によりコードさ
れる蛋白質に関して、該遺伝子の発現を誘導、増大させ
る物質や該遺伝子によりコードされる蛋白質の発現量、
機能または活性を増大、亢進させる物質が、糖尿病性腎
症の予防、改善乃至治療薬の有効成分として有用である
ことを確認する手段としては、例えば下記に示す実験な
どを挙げることができる。
【0170】例えば、前述のNRK-49F細胞に病態となる
刺激(例えば高グルコース刺激、TGF-β刺激、PDGF刺激
など)を与え、配列番号:1-86のいずれかで示される塩
基配列を有する遺伝子のアンチセンスオリゴDNAを導入
し、細胞外基質(例えばコラーゲン、プロテオグリカン
など)の合成能を測定する方法を挙げることができる。
本実験において、配列番号:1-86のいずれかで示される
塩基配列を有する遺伝子のアンチセンスオリゴDNAを導
入することによって、当該遺伝子やその発現産物の発現
・機能を低下させた際に、細胞外基質合成能が低下する
ことにより、当該遺伝子の発現抑制物質や機能抑制物質
の有用性が確認される。
【0171】また、例えば前記のように病態刺激を与え
たNRK-49F細胞において配列番号:87-159のいずれかで
示される塩基配列を有する遺伝子を強制発現させて、細
胞外基質合成能を測定する方法も挙げることができる。
この場合、配列番号:87-159のいずれかで示される塩基
配列を有する遺伝子の強制発現によって当該遺伝子やそ
の発現産物の発現・機能を上昇させた際に、細胞外基質
合成能が低下することにより、当該遺伝子の発現上昇物
質や機能亢進物質の有用性が確認される。
【0172】更に、前記(3-1)乃至(3-3)項に記載の本発
明スクリーニング方法によって選別された候補物質は、
例えば、高グルコース、TGF-β、PDGFなどで処理したNR
K-49F細胞における細胞外基質(例えばコラーゲン、プロ
テオグリカンなど)の合成能を測定する試験(in vitro)
や、糖尿病性腎症モデル動物(例えばC57BL/Ksj-db-db
Jclマウス、ストレプトゾトシン投与ラットなど)を用
いた薬効試験、安全性試験などを行うことによって、さ
らに糖尿病性腎症患者への臨床試験を行うことによっ
て、より実用的な糖尿病性腎症の予防、改善または治療
薬の取得に供することができる。このようにして選別さ
れた物質は、さらにその構造解析結果に基づいて、化学
的合成、生物学的合成(発酵)または遺伝子学的操作によ
って、工業的に製造することができる。
【0173】(4)糖尿病性腎症の改善・治療剤 本発明は、高血糖状態に由来する糖尿病性腎症の予防、
改善および治療剤を提供する。
【0174】本発明は配列番号:1-159のいずれかに記
載の塩基配列を有する遺伝子および該遺伝子によりコー
ドされる蛋白質、具体的には配列番号:160-173のいず
れかに記載のアミノ酸配列を有する蛋白質が糖尿病性腎
症と関連しているという新たな知見から、(1)配列番
号:1-86のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の
発現を抑制もしくは減少させる物質、(2)配列番号:1-8
6のいずれかに記載の塩基配列によりコードされる蛋白
質、具体的には配列番号:160-171のいずれかに記載の
アミノ酸配列を有する蛋白質の量もしくは機能(活性)を
低下もしくは減少させる物質、(3)配列番号:87-159の
いずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の発現を誘導
もしくは増大させる物質、および(4)配列番号:87-159
のいずれかに記載の塩基配列によりコードされる蛋白
質、具体的には配列番号:172または173に記載のアミノ
酸配列を有する蛋白質の量もしくは機能(活性)を亢進も
しくは増大させる物質が、上記疾患の改善または治療に
有効であるという考えに基づくものである。すなわち、
本発明の糖尿病性腎症の予防、改善および治療剤は、上
記(1)-(4)に示される物質を有効成分とする。
【0175】当該有効成分とする物質は、前述した本発
明スクリーニング方法を利用して選別されたもののみな
らず、選別された物質に関する情報に基づいて常法に従
って化学・生化学的手法によりもしくは工業的に製造さ
れたものであってもよい。
【0176】かかる有効成分は、そのままもしくは自体
公知の薬学的に許容される担体(賦形剤、増量剤、結合
剤、滑沢剤などが含まれる)や慣用の添加剤などと混合
して医薬組成物として調製することができる。当該医薬
組成物は、調製する形態(錠剤、丸剤、カプセル剤、散
剤、顆粒剤、シロップ剤などの経口投与剤;注射剤、点
滴剤、外用剤、坐剤などの非経口投与剤)などに応じて
経口投与または非経口投与することができる。また投与
量は、有効成分の種類、投与経路、投与対象または患者
の年齢、体重、症状などによって異なり一概に規定でき
ないが、1日投与用量として、数mg-2g、好ましくは数十
mg程度を、1日1回または数回に分けて投与することがで
きる。
【0177】上記有効成分とする物質がDNAによりコー
ドされるものの場合、該DNAを遺伝子治療用ベクターに
組み込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。この場
合も、投与量、投与方法は患者の体重や年齢、症状など
により変動するが、当業者であれば適宜選択することが
可能である。
【0178】
【実施例】次に、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。しかし、本発明はこれらの実施例になんら限
定されるものではない。実施例1 DNAチップ解析 ヒト糖尿病患者の腎臓組織6サンプルと、ヒトの正常な
腎臓組織55サンプルからそれぞれ調製したtotal RNAを
用いて、DNAチップ解析を行った。DNAチップ解析はAffy
metrix社Gene Chip Human Genome U95A,B,C,D,Eを用い
て行った。具体的には、解析は、(1) total RNAからのc
DNAの調製、(2) 該cDNAからラベル化cRNAの調製、(3)
ラベル化cRNAのフラグメント化、(4)フラグメント化cRN
Aとプローブアレイとのハイブリダイズ、(5) プローブ
アレイの染色、(6) プローブアレイのスキャンおよび
(7) 遺伝子発現解析の手順で行った。
【0179】(1)total RNAからのcDNAの調製 ヒト糖尿病患者の腎臓組織6サンプルおよび正常な腎臓
組織55サンプルから調製した各total RNA 10μgおよびT
7-(dT)24プライマー (Amersham社製) 100pmolを含む11
μLの混合液に、70℃、10分間加熱後、氷上で冷却し
た。冷却後、SuperScript Choice System for cDNA Syn
thesis (Gibco-BRL社製)に含まれる5×First Strand cD
NA Buffer 4μL、該キットに含まれる0.1M DTT 2μLお
よび該キットに含まれる10mM dNTP Mix 1μLを添加し、
42℃で2分間加熱した。更に、該キットに含まれるSuper
ScriptII RT 2μL(400U)を添加し、42℃で1時間加熱し
た後、氷上で冷却した。冷却後、DEPC処理水(ナカライ
テスク社製)91μL、該キットに含まれる5×Second Stra
nd Reaction Buffer 30μL、10mM dNTP Mix 3μL、該キ
ットに含まれるE. coli DNA Ligase 1μL(10U)、該キッ
トに含まれるE. coliDNA Polymerase I 4μL(40U)およ
び該キットに含まれるE. coli RNaseH 1μL (2U)を添加
し、16℃で5分間反応させた。次いで、該キットに含ま
れるT4 DNA Polymerase 2μL(10U)を加え、16℃で5分間
反応させた後、0.5M EDTA 10μLを添加した。次いで、
フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール溶液
(ニッポンジーン社製)162μLを添加し、混合した。該混
合液を、予め室温、14,000rpm、30秒間遠心分離してお
いたPhase Lock Gel Light (エッペンドルフ社製) に移
し、室温、14,000rpm、2分間遠心分離した後、145μLの
水層をエッペンドルフチューブに移した。得られた溶液
に、7.5M酢酸アンモニウム溶液72.5μLおよびエタノー
ル362.5μLを加え混合した後、4℃、14,000rpm、20分間
遠心分離した。遠心分離後、上清を捨て、作製したcDNA
を含むDNAペレットを得た。
【0180】その後、該ペレットに80%エタノール0.5mL
を添加し、4℃、14,000rpm、5分間遠心分離した後、上
清を捨てた。再度同様の操作を行った後、該ペレットを
乾燥して、DEPC処理水12μLに溶解した。
【0181】以上の操作によって、ヒト糖尿病患者の腎
臓組織6サンプルとヒトの正常な腎臓組織55サンプルか
らそれぞれ調製したtotal RNAからcDNAを取得した。
【0182】(2) cDNAからラベル化cRNAの調製 各cDNA溶液5μLに、DEPC処理水17μL、BioArray High Y
ield RNA TranscriptLabeling Kit (ENZO社製) に含ま
れる10×HY Reaction Buffer 4μL、該キットに含まれ
る10×Biotin Labeled Ribonucleotides 4μL、該キッ
トに含まれる10×DTT 4μL、該キットに含まれる10×RN
ase Inhibitor Mix 4μLおよび該キットに含まれる20×
T7 RNA Polymerase 2μLを混合し、37℃で5時間反応さ
せた。反応後、反応液にDEPC処理水60μLを加えた後、R
Neasy Mini Kitを用いて添付プロトコールに従い、調製
したラベル化cRNAを精製した。
【0183】(3) ラベル化cRNAのフラグメント化 各ラベル化cRNA 20μgを含む溶液に、5×Fragmentation
Buffer(200mMトリス−酢酸 pH8.1 (Sigma社製)、500mM
酢酸カリウム (Sigma社製)、150mM酢酸マグネシウム (S
igma社製))8μLを加えた反応液40μLを、94℃で35分間
加熱した後、氷中に置いた。これによって、ラベル化RN
Aをフラグメント化した。
【0184】(4) フラグメント化cRNAとプローブアレイ
とのハイブリダイズ 各フラグメント化cRNA 40μLに、5nM Control Oligo B2
(Amersham社製)4μL、100×Control cRNA Cocktail 4μ
L、Herring sperm DNA(Promega社製)40μg、Acetylated
BSA(Gibco-BRL社製)200μg、2×MES Hybridization Bu
ffer(200mM MES、2M [Na+], 40mM EDTA、0.02% Tween20
(Pierce社製)、pH6.5-6.7) 200μLおよびDEPC処理水14
4μLを混合し、400μLのハイブリカクテルを得た。得ら
れた各ハイブリカクテルを99℃で5分間加熱し、更に45
℃で5分間加熱した。加熱後、室温、14,000rpm、5分間
遠心分離し、ハイブリカクテル上清を得た。
【0185】一方、1×MESハイブリダイゼーションバッ
ファーで満たしたHuman genome U95プローブアレイ(Aff
ymetrix社製)を、ハイブリオーブン内で、45℃、60rp
m、10分間回転させた後、1×MESハイブリダイゼーショ
ンバッファーを除去してプローブアレイを調製した。上
記で得られたハイブリカクテル上清200μLを該プローブ
アレイにそれぞれ添加し、ハイブリオーブン内で45℃、
60rpm、16時間回転させ、フラグメント化cRNAとハイブ
リダイズしたプローブアレイを得た。
【0186】(5) プローブアレイの染色 上記で得られたハイブリダイズ済みプローブアレイのそ
れぞれからハイブリカクテルを回収除去した後、Non-St
ringent Wash Buffer (6×SSPE (20×SSPE (ナカライテ
スク社製)を希釈)、0.01%Tween20、0.005% Antifoam0-3
0 (Sigma社製))で満たした。次に、Non-Stringent Wash
BufferおよびStringent Wash Buffer (100mM MES、0.1
M NaCl、0.01%Tween20)をセットしたGeneChip Fluidics
Station400 (Affymetrix社製) の所定の位置にフラグ
メント化cRNAとハイブリダイズしたプローブアレイを装
着した。その後、染色プロトコールEuKGE-WS2に従っ
て、一次染色液(10μg/mL Streptavidin Phycoerythrin
(SAPE) (MolecμLar Probe社製)、2mg/mL Acetylated
BSA、100mM MES、1M NaCl (Ambion社製)、0.05%Tween20
および0.005%Antifoam0-30)および二次染色液(100μg/m
L Goat IgG (Sigma社製)、3μg/mL Biotinylated Anti-
Streptavidin antibody (Vector Laboratories社製)、2
mg/mL Acetylated BSA、100mM MES、1M NaCl、0.05%Twe
en20および0.005% Antifoam0-30)により染色した。
【0187】(6) プローブアレイのスキャン、および
(7) 遺伝子発現解析 染色した各プローブアレイをHP GeneArray Scanner (Af
fymetrix社製)に供し、染色パターンを読み取った。染
色パターンをもとにGene Chip Workstation System (Af
fymetrix社製)によってプローブアレイ上の遺伝子の発
現を解析した。次に、解析プロトコールに従ってNormal
izationおよび遺伝子発現の比較解析を行った。
【0188】実施例2 ヒト糖尿病患者の腎臓組織とヒ
ト正常腎臓組織での遺伝子発現の変動解析 実施例1で行ったDNAチップ解析による遺伝子発現の比較
解析結果から、ヒト正常腎臓組織に比べて糖尿病患者の
腎臓組織で3倍以上の発現増を示したプローブ、並びに
ヒト正常腎臓組織に比べて糖尿病患者の腎臓組織で3倍
以上の発現減少を示したプローブを選抜した。
【0189】選抜したプローブの中から、さらにヒト糖
尿病患者の腎臓組織で高頻度に発現が上昇もしくは低下
しているプローブを選抜した。具体的には、発現が上昇
しているプローブの場合は、DNAチップ解析結果から得
られるAbs Callを指標にして、糖尿病患者の腎臓組織で
のAbs CallがPresentである例数が3例以上のプローブを
選抜した。また、発現が低下しているプローブの場合
は、正常腎臓組織でのAbs CallがPresentである例数が1
0例以上のプローブを選抜した。
【0190】各選抜したプローブについて発現変動の増
減および発現変動倍率を表1に示す。なお、表中、発現
変動倍率は、Human Genome U95 Chipで解析したヒト正
常腎臓組織の遺伝子発現量を1とした場合における糖尿
病患者の腎臓組織での該遺伝子の発現量の増減を比で示
すもので、減少の場合はマイナス(−)をつけて示す。ま
た、表1には各選抜されたプローブ(Human U95のプロー
ブ名)に対応する遺伝子の塩基配列の配列番号および該
遺伝子がコードするアミノ酸配列の配列番号を合わせて
示す。
【0191】
【表1】
【0192】
【表2】
【0193】
【表3】
【0194】表1-表3の結果から判るように、配列番号:
1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、1
5、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、2
7、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、3
9、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、5
1、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、6
3、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、7
5、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85または86
の塩基配列を有する遺伝子は、ヒト正常な腎臓組織に比
べて糖尿病患者腎臓組織で発現増大を示した。特に、配
列番号: 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、1
5、16、17、18、55、56、57、58、59、60、61、62また
は63の塩基配列を有する遺伝子は、ヒト正常な腎臓組織
に比べて糖尿病患者腎臓組織で4倍以上10倍未満の発現
増大を示した。また、配列番号1、2、53または54の塩基
配列を有する遺伝子はヒトの正常腎臓組織に比べて糖尿
病患者腎臓組織で10倍以上の発現増大を示した。
【0195】一方、配列番号:87、88、89、90、91、9
2、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、10
3、104、105、106、107、108、109、110、111、112、11
3、114、115、116、117、118、119、120、121、122、12
3、124、125、126、127、128、129、130、131、132、13
3、134、135、136、137、138、139、140、141、142、14
3、144、145、146、147、148、149、150、151、152、15
3、154、155、156、157、158または159の塩基配列を有
する遺伝子は、ヒト正常な腎臓組織に比べて糖尿病患者
腎臓組織で発現が減少していた。特に、配列番号:88、
89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、129、1
30、131、132、133、134、135、136または137の塩基配
列を有する遺伝子は、正常なヒト腎臓組織に比べて糖尿
病患者の腎臓組織で4倍以上10倍未満の発現減少を示し
た。また、配列番号:87または129の塩基配列を有する
遺伝子は同様に糖尿病患者の腎臓組織で10倍以上の発現
減少を示した。
【0196】以上に示すように、配列番号:1-86で示さ
れる塩基配列を有する遺伝子は、正常な腎臓組織に比し
て、糖尿病性腎症患者の腎臓組織で特異的に発現が増大
し、また配列番号:87-159で示される塩基配列を有する
遺伝子は、正常な腎臓組織に比して、糖尿病性腎症患者
の腎臓組織で発現が特異的に減少していることから、こ
れらは糖尿病性腎症に関するマーカー遺伝子として応用
可能な遺伝子であると考えられ、また、これらの遺伝子
を用いることによって糖尿病性腎症を緩和、抑制する治
療薬の候補薬をスクリーニングすることが可能である。
【0197】実施例3 配列番号:1-86の塩基配列を有
する遺伝子の発現を抑制する剤のスクリーニング C57BL/Ksj-db/db Jclマウスもしくはストレプトゾトシ
ン投与Wistarラットから初代腎臓培養細胞を単離、調製
し、その本培養液に、それぞれ100μM、10μM、および1
μMの濃度になるように被験物質を添加し、37℃、CO2
度5%で2日間培養する。ここで、対照実験として、被験
物質無添加の細胞についても同様に培養する(コントロ
ール)。これらの各培養細胞より抽出したRNAを用いて実
施例1に記載された方法で、配列番号:1-86の塩基配列
を有する遺伝子の発現量を調べる。コントロールと比べ
て、配列番号:1-86の塩基配列を有する遺伝子の発現量
が10%、好ましくは30%、特に好ましくは50%以上減少し
ている系について、添加した被験物質を糖尿病性腎症の
緩和、抑制(改善、治療)する候補化合物として選択す
る。
【0198】実施例4 配列番号:87-159の塩基配列を
有する遺伝子の発現を誘導(増大)する剤のスクリーニン
グ C57BL/Ksj-db/db Jclマウスもしくはストレプトゾトシ
ン投与Wistarラットから初代腎臓培養細胞を単離、調製
し、その本培養液に、それぞれ100μM、10μM、および1
μMの濃度になるように被験物質を添加し、37℃、CO2
度5%で2日間培養する。ここで、対照実験として、被験
物質無添加の細胞についても同様に培養する(コントロ
ール)。これらの各培養細胞より抽出したRNAを用いて実
施例1に記載された方法で、配列番号:87-159の塩基配
列を有する遺伝子の発現量を調べる。コントロールと比
べて、配列番号:87-159の塩基配列を有する遺伝子の発
現量が10%、好ましくは30%、特に好ましくは50%以上増
加している系について、添加した被験物質を糖尿病性腎
症の緩和、抑制(改善、治療)する候補化合物として選択
する。
【0199】
【発明の効果】本発明によって、糖尿病性腎症患者の腎
臓において、発現が特異的に増大している遺伝子(配列
番号:1-86の塩基配列を有する遺伝子)と発現が特異的
に減少している遺伝子(配列番号:87-159の塩基配列を
有する遺伝子)が明らかになった。これらの遺伝子は糖
尿病性腎症の遺伝子診断に用いられるマーカー遺伝子
(プローブ、プライマー)として有用である。これらのマ
ーカー遺伝子によれば糖尿病性腎症の原因を明らかにす
ることができ(診断精度の向上)、これによってより適切
な治療を施すことが可能となる。すなわち、本発明のマ
ーカー遺伝子は糖尿病性腎症の適切な治療のためのツー
ルとして利用することができる。
【0200】また、上記遺伝子の発現と糖尿病性腎症と
の関連性から、該遺伝子の発現を制御する物質は、糖尿
病性腎症の治療薬として有用であると考えられる。従っ
て、この遺伝子の発現の変動を指標とすることによっ
て、糖尿病性腎症の予防、改善乃至治療薬となり得る候
補薬をスクリーニングし選別することが可能である。本
発明は、このような糖尿病性腎症の治療薬などの開発技
術をも提供する。
【0201】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Sumitomo Pharmaceuticals <120> A marker for diabetic nephropathy <130> 47901JP <140> <141> <160> 173 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 474 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 tccattgctg tatctttctt tattggtttg gggaaaactg gagggggctg gaaggccatg 60 accatgacac aagcaggacc acccacactc agcgaagcac acaacagccg tgcaggaaag 120 acagcccctg aggcccgcct gccagcaccc cctcggcttt tggcggggcg gggggggcag 180 gggcgggaga ggcaacaggg gaggggagcc actgccccca ggcagggcag agcctgggga 240 cagacttggg ggtgccccat tccaacccca gcgccatgcg ccacaccctc aaatctcaaa 300 atccagcaga ggccagcccc agggggaagg tttggggagg ggaccgaaag catccaaggg 360 aaggaaatct gggggtcagt ccacttggcc tcggcatctg cctgggcatc accacttggg 420 gggctggcca gcacggaggc ctgagtggct gtggcgggcc atgccctgct caga 474 <210> 2 <211> 593 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 agaaatatat attccacttt attagttaga aaaaatcatt taagccacat ggtggccaca 60 atgtccataa cttgagcagg ctttggcatc ccaccacccc cttcagacca atacacacta 120 tgttggagga acgactttaa aatgtaaaat gagaaatggg cactgaacac tccatcctca 180 ctcccaacag cccacccaca cacctcttca actgctatcc aaacatggag gagctcttgt 240 ggaagagagg ctcaacacca aataattgag ctaagacatt caagactaaa ggaaccccag 300 acagatgttt aggaagtagg gttgaaaata tcaccatctc ccaacagctg aagttgggac 360 atctaagaga tgtcagagcc atactgctga ggaaagcata gcatacacca gaccccgggg 420 taagggcgag atcaacctat ctcatagcca taagcaatcc actcacacct gtgcattaaa 480 caggctnttt cttttctttt tttttgagat gagtcttgca ctgggccang ctggtacaga 540 gtgcatctcg ctcactgcac ctcgtccccg gttcagcaat ctcccgctca gct 593 <210> 3 <211> 483 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 tttttttttt tttttttttc agtggtataa atcgtcttta attgaaaaag ctggagggga 60 aacccgatcc cctgggagca gtgccaggag ttgggtggaa actgagtggg gtttgtgtgg 120 gtgagggggc atttactcct tttgcaacaa gccaaaagta gaacagccta aggaaaagtg 180 acctgccttg gagccttagt ccctccttta gggccccctc agcctaccct atccaagtct 240 gaggctatgg aagtctccct cctagttcac tagcaggttc cccatttttt ccaggctgcc 300 cctagcactc cacgtttttc tgaaaaaatc taaacaggcc ctttttgggt acctaaaacc 360 cagctgaggt tgtgagctgt aaggtaaagc aggttctatc caattaaaac ctgttggggc 420 gtatgaggtc tggagtgcaa gaggccttca cccttcttgg cctgacctgt aggggagaag 480 ggt 483 <210> 4 <211> 900 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 agcctgagga ggagacagga cagagcgtct ggagaggcag gaggacaccg agttccccgt 60 gttggcctcc aggtcctgtg cttgcggagc cgtccggcgg ctgggatcga gccccgacaa 120 tgggcaacgc gcaggagcgg ccgtcagaga ctatcgaccg cgagcggaaa cgcctggtcg 180 agacgctgca ggcggactcg ggactgctgt tggacgcgct gctggcgcgg ggcgtgctca 240 ccgggccaga gtacgaggca ttggatgcac tgcctgatgc cgagcgcagg gtgcgccgcc 300 tactgctgct ggtgcagggc aagggcgagg ccgcctgcca ggagctgcta cgctgtgccc 360 agcgtaccgc gggcgcgccg gaccccgctt gggactggca gcacgtgggt ccgggctacc 420 gggaccgcag ctatgaccct ccatgcccag gccactggac gccggaggca cccggctcgg 480 ggaccacatg ccccgggttg cccagagctt cagaccctga cgaggccggg ggccctgagg 540 gctccgaggc ggtgcaatcc gggaccccgg aggagccaga gccagagctg gaagctgagg 600 cctctaaaga ggctgaaccg gagccggagc cagagccaga gctggaaccc gaggctgaag 660 cagaaccaga gccggaactg gagccagaac cggacccaga gcccgagccc gacttcgagg 720 aaagggacga gtccgaagat tcctgaaggc cagagctctt gacaggcggt gccccgccca 780 tgctggatag gacctgggat gctgctggag ctgaatcgga tgccaccaag gctcggtcca 840 gcccagtacc gctggaagtg aataaactcc ggagggtcgg acgggacctg ggctctctcc 900 <210> 5 <211> 542 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 ttagcaactc acttctttaa tttcagaatc cacagaggta agtccagctt agaccagggg 60 gctgagttct ctcaaatgaa atctgtgcca atatttactc caggaaggca agagcccagc 120 ccttcaaggc tcctgagatc aggaacggct ggtggttagg aggcgctctc ctggccgctc 180 tagctgtgtg gggcaccccc tgcatatgtg gggcacacgt ggcctatgca caccacccac 240 ctacaagctt gggcggctcc agtgggaaag acaggagagg gaagcaacat ttgattgaat 300 ctgagccaag agggccagag gctgaggaag gcacccccac agcagcctcc tgagcaaaca 360 gcacctgggg gctctaccca gttgggacaa agggcgaggc tcccagcaac agtaagggag 420 atggcgtcct ctgggagagg gtggcctggg gtggggtgac agggcttcca cgccaccact 480 gcaccctcgg caagaacgag cagatgtgga gaagaggaat gccatcaatg cgcccnccat 540 ct 542 <210> 6 <211> 423 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 ttttaaccaa aatgcaatta actaatagta agagcaccac cgttgatatt agcaggtata 60 tgaactccat atttaataca tattcaaaaa tagagcaact attgttaaaa ttcttgtagt 120 gttaaataac ttttacattt cctgcaaaag gcagatgtta acaaagatgc tatagactga 180 aaatcatata catgtctatt attaataaaa accttgcagt gattttacaa ctgtttgctt 240 cagaagggct ctttccagtg aattcagata tgtgaattct gatgaaccct ttcctcatcc 300 cagcctccat cctcactatc cttagtgtct gcacctattt agacagacac aaataggaga 360 aacttttaag atgtgaagct aacacattca ttcttccttt tctctttttt tataatgagt 420 atg 423 <210> 7 <211> 239 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 ctgcacaaag ccaaaaatcc gtgtggcctt ccaagatgaa gcccaatttt ggagtctgtc 60 ctgtgacaat taggccatga gggtgcagtg aatgattaat gttgttatcg ctagagtggg 120 tttgttataa aagggcgagt tcagccctct tttactttct caccctccct cctttttttt 180 tttttgagat ggggtcacac tctgttgccc aggctggagt gcagtggtgc aatgttgac 239 <210> 8 <211> 622 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 ggtggtttgg cacctgcagc cattccaacc tcaacggcca gtacttccgc tccatcccac 60 agcagcggca gaagcttaag aagggaatct tctggaagac ctggcggggc cgctactacc 120 cgctgcaggc caccaccatg ttgatccagc ccatgnagca gaggcagcct cctagcgtcc 180 tggctgggcc tggtcccagg ccacggaaag acggtgactc ttggctctgc cgaggatgtg 240 gccgttccct gcctgggcag ggnctccaag gaggggccat ctggaaactt gtggacagag 300 aagaagacca cgactggaga agcccccttt ctgagtgcag gggggctgca tgcgttgcct 360 cctgagatcg aggctgcagg atatgctcag actctagagg cgtggaccaa ggggcatgga 420 gcttcactcc ttgctggcca gggagttggg gactcagagg gaccacttgg ggccagccag 480 actggccttc aatggcggac tcagtcatat tgactgangg ggancagggc ttgtttgggt 540 ccaanagcgc cctcatngtt cttgttcctg tttgtgtgta ggtcccctgg gaacaaagca 600 gccnccaatt ggattttggn cg 622 <210> 9 <211> 581 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 gcggccgcaa acgttttttt tttttttttt ttttttttta ttttggaaaa tgttaaaatt 60 tattaatagg ggttaacatc acatagttaa ttaaactagt tatgtattgt acataatgac 120 aacatcttca ctagactgag tgctcaagga tttgagatga ttcgctattc atcacacccc 180 gaagattgag atccactgta tttacacaaa gcaaagccat gtcagcaagg gactgtcaac 240 ctgattctga gaacataaac attcaaaatt tattttccag tgttcctttt tggaaaccaa 300 caacacatct ttaataccta cacacacaca catctctacc tttaaaaaaa aaagtgtaac 360 ttcacagata gtacctaatc ttcaagctta aaatttaagt taaaattaat ctctattttg 420 tgggcaccct ttagtgaact aaaatctaca tgaaaccttt tggcttttgt gtagcaggaa 480 atacccacgt tttgggtcaa ttagtgcaga tgggagcagc agaggagcta caccagacag 540 caaagcaaga ctagagcaaa cgagaaggac cagcccctag c 581 <210> 10 <211> 2689 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 ggctggggcc tgaggcctgg ggctcaccca cgcccccgcc gacgcctgcc gcgccgccgc 60 cacccccgcc acccggagcc ccgggtggct cgcaggacac ctgtacgtcg tgcggcggct 120 tccggcggcc agaggagctc ggccgagtgg acggcgactt cctggaggcg gtgaagcggc 180 acatcttgag ccgcctgcag atgcggggcc ggcccaacat cacgcacgcc gtgcctaagg 240 ccgccatggt cacggccctg cgcaagctgc acgcgggcaa ggtgcgcgag gacggccgcg 300 tggagatccc gcacctcgac ggccacgcca gcccgggcgc cgacggccag gagcgcgttt 360 ccgaaatcat cagcttcgcc gagacagatg gcctcgcctc ctcccgggtc cgcctatact 420 tcttcatctc caacgaaggc aaccagaacc tgtttgtggt ccaggccagc ctgtggcttt 480 acctgaaact cctgccctac gtcctggaga agggcagccg gcggaaggtg cgggtcaaag 540 tgtacttcca ggagcagggc cacggtgaca ggtggaacat ggtggagaag agggtggacc 600 tcaagcgcag cggctggcat accttcccac tcacggaggc catccaggcc ttgtttgagc 660 ggggcgagcg gcgactcaac ctagacgtgc agtgtgacag ctgccaggag ctggccgtgg 720 tgccggtgtt cgtggaccca ggcgaagagt cgcaccgacc ctttgtggtg gtgcaggctc 780 ggctgggcga cagcaggcac cgcattcgca agcgaggcct ggagtgcgat ggccggacca 840 acctctgttg caggcaacag ttcttcattg acttccgcct catcggctgg aacgactgga 900 tcatagcacc caccggctac tacggcaact actgtgaggg cagctgccca gcctacctgg 960 caggggtccc cggctctgcc tcctccttcc acacggctgt ggtgaaccag taccgcatgc 1020 ggggtctgaa ccccggcacg gtgaactcct gctgcattcc caccaagctg agcaccatgt 1080 ccatgctgta cttcgatgat gagtacaaca tcgtcaagcg ggacgtgccc aacatgattg 1140 tggaggagtg cggctgcgcc tgacagtgca aggcaggggc acggtggtgg ggcacggagg 1200 gcagtcccgg gtgggcttct tccagccccc cgcgggaacg gggtacacgg tgggctgagt 1260 acagtcattc tgttgggctg tggagatagt gccagggtgc ggcctgagat atttttctac 1320 agcttcatag agcaaccagt caaaaccaga gcgagaaccc tcaactgaca tgaaatactt 1380 taaaatgcac acgtagccac gcacagccag acgcatcctg ccacccacac agcagcctcc 1440 aggataccag caaatggatg cggtgacaaa tggcagctta gctacaaatg cctgtcagtc 1500 ggagagaatg gggtgagcag ccaccattcc accagctggc ccggccacgt ctcgaagttg 1560 cgccttcccg agcacacata aaagcacaaa gacagagacg cagagagaga gagagagcca 1620 cggagaggaa aagcagatgc aggggtgggg agcgcagctc ggcggaggct gcgtgtgccc 1680 cgtggctttt accaggcctg ctctgcctgg ctcgatgtct gcttcttccc agcctgggat 1740 ccttcgtgct tcaaggcctg gggagcctgt ccttccatgc ccttgtcgag ggaaagagac 1800 ccagaaagga cacaacccgt cagagacctg ggagcagggg caatgaccgt ttgactgttt 1860 gtggcttggg cctctgacat gacttatgtg tgtgtgtgtt tttggggtgg ggagggaggg 1920 agagaagagg gggctaaatt tgatgcttta actgatctcc aacagttgac aggtcatcct 1980 tgccagttgt ataactgaaa aaggactttt ctaccaggta tgacctttta agtgaaaatc 2040 tgaattgttc taaatggaaa gaaaaaaagt tgcaatctgt gcccttcatt ggggacattc 2100 ctctaggact ggtttgggga cgggtgggaa tgacccctag gcaaggggat gagaccgcag 2160 gaggaaatgg cggggaggtg gcattcttga actgctgagg atggggggtg tcccctcagc 2220 ggaggccaag ggaggggagc agcctagttg gtcttggaga gatggggaag gctttcagct 2280 gatttgcaga agttgcccat gtgggcccaa ccatcagggc tggccgtgga cgtggcccct 2340 gcccactcac ctgcccgcct gcccgcccgc ccgcatagca cttgcagacc tgcctgaacg 2400 cacatgacat agcacttgcc gatctgcgtg tgcccagaag tggcccttgg ccgagcgccg 2460 aactcgctcg ccctctagat gtccaagtgc cacgtgaact atgcaattta aagggttgac 2520 ccacactaga cgaaactgga ctcgtacgac tctttttata ttttttatac ttgaaatgaa 2580 atcctttgct tcttttttaa gcgaatgatt gcttttaatg tttgcactga tttagttgca 2640 tgattagtca gaaactgcca tttgaaaaaa aagttatttt tatagcagc 2689 <210> 11 <211> 771 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 tccctttnaa gtcnnanntg anttgtcggg gttagtgttg cttctganga gagtaggtgg 60 tcaggnggnt tctcgtgagc gagttcgtgg ggtagctcct cttatagtca accccgtagg 120 aagaggagtg gtgcatttcc agccgcttgc ttagaccggt ctgagacagg gaggctcccg 180 ggggacccag ggaggnctcc cgctgtggaa ctttgggggg naggctgtcc aggttctcca 240 caaggttcac cccatggttg ggactcttgc tgctgagatg ttccttgatg gtcttatact 300 ccagtgtggc ggcctggtcc tccagngcca tctgggccac ctcgctcatt ttgggctggt 360 ccacgtactc atgctggtag ccctgctgcg tgatgggnag gaccaccacg ctggggattn 420 tggctggggg aggcccgcag gggcaggtcc cgtgggaatc acagggggag cccatggggg 480 ggatttcctt tggtgcaggc attgatgagg ttcttggttc ctctcccact cgnggntgcc 540 gcggttggnt tcccncttct tnctgnagag ttggggttga ttcttggggt ngggagggcc 600 cgncaantcc agggtgggtg ctggtcttgt tttnattgag aanctttggc cgnntttggc 660 cggaagtngc ganttgccgt ngnngattaa cnggcgtnca gntttgccnc ccggtttggg 720 gcntttgggt tgganttntc cccaanagag gnccttgagt ttgntgannc c 771 <210> 12 <211> 1468 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 gacaccgtgg ggggtaggtt tgatgccact caggcatttg tcggggagct cagccagttc 60 aacatatggg accgcgtcct tcgcgcacaa gaaattgtca acatcgccaa ctgctccaca 120 aacatgccgg gcaacatcat cccgtgggtg gacaataacg tcgatgtgtt cggaggggcc 180 tccaagtggc ccgtggagac gtgtgaggag gctctccttg acttgtagcc gccttctcct 240 ctgtccagga ggccgggatc aggctgttgc catggaagtt cagggccata gactgcccca 300 cttaaactct tgtcagtctg ggctcagggt tcccagagct cattccccag gaatctctaa 360 gaccagggct ggggcagtgt ctgtcactgg cttgtttgtt ccctaccaat attctgttgc 420 tgtttgaagt agtgccaggg tcccctggga agatgccccc aagacacctg ccccaagtgg 480 gtggatatct gccttcctgc tgcaagtgga ggcaggtcca gcagcccctc ttcagagccc 540 ctgtaaatgc tatcgcagcc tgagtcctgc cgccttccag ttccttggtg tcccgtgcac 600 cccttctgtc tgtccccttt catgctgtgc agccgtcccg ctggagtggc catgtccctt 660 gtgcattgag tgcatccccg ctggtgacta agctcgcagc aagcgctacc cccgatctgc 720 aaaagggcct ctccctttgt gttctataca ttgtgaatct tcccgtctga agaacgccca 780 gcctgcccag acaaagcccc gccttcccca aagcagaggg gctgtctgtg tctccagaaa 840 ggggacatcg gggggggagg ggggctcaga aaggagaagg gctgtgatct ccggtccctt 900 cccccatcat ccttccttag actgatgctt tgactgaatc atcactagct atggcattaa 960 aaggcctctc ttctcatctg gtgccaaagg ttccgttgca gctttttaca accatccggt 1020 gtggtttgga ggatttgttt tttttttttc ccaacagaaa agaacagcca ttagaagaag 1080 gctcccattt tctgatgttc cgccccactg tgaagagtgt gctcgtttta aattcatgtt 1140 gattcttgta agcactggac tgtcttcatc aagtatttcc cctacagaac tcctcaagaa 1200 aaacagagat catttggcta gagattgtct gagtgactcc aagctactca ctgtattgga 1260 cgggagtagt aatttatttt aaagataaag tgactaagtg gggaaattta taaagctaaa 1320 tattatatat tttatttttc atacatgttt gaagtgcaaa tctgtggata ttccatttgt 1380 aggaccaagt cgacatgccc atcctgacat tgtatgctac gagaactctt ctgatgatgg 1440 aatttcgatt aaagtgcact gaaagatg 1468 <210> 13 <211> 2269 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 tgggttggtg tttatctcct cccagccttg agggagggaa caacactgta ggatctgggg 60 agagaggaac aaaggaccgt gaaagctgct ctgtaaaagc tgacacagcc ctcccaagtg 120 agcaggactg ttcttcccac tgcaatctga cagtttactg catgcctgga gagaacacag 180 cagtaaaaac caggtttgct actggaaaaa gaggaaagag aagactttca ttgacggacc 240 cagccatggc agcgtagcag ccctgcgttt cagacggcag cagctcggga ctctggacgt 300 gtgtttgccc tcaagtttgc taagctgctg gtttattact gaagaaagaa tgtggcagat 360 tgttttcttt actctgagct gtgatcttgt cttggccgca gcctataaca actttcggaa 420 gagcatggac agcataggaa agaagcaata tcaggtccag catgggtcct gcagctacac 480 tttcctcctg ccagagatgg acaactgccg ctcttcctcc agcccctacg tgtccaatgc 540 tgtgcagagg gacgcgccgc tcgaatacga tgactcggtg cagaggctgc aagtgctgga 600 gaacatcatg gaaaacaaca ctcagtggct aatgaagctt gagaattata tccaggacaa 660 catgaagaaa gaaatggtag agatacagca gaatgcagta cagaaccaga cggctgtgat 720 gatagaaata gggacaaacc tgttgaacca aacagctgag caaacgcgga agttaactga 780 tgtggaagcc caagtattaa atcagaccac gagacttgaa cttcagctct tggaacactc 840 cctctcgaca aacaaattgg aaaaacagat tttggaccag accagtgaaa taaacaaatt 900 gcaagataag aacagtttcc tagaaaagaa ggtgctagct atggaagaca agcacatcat 960 ccaactacag tcaataaaag aagagaaaga tcagctacag gtgttagtat ccaagcaaaa 1020 ttccatcatt gaagaactag aaaaaaaaat agtgactgcc acggtgaata attcagttct 1080 tcaaaagcag caacatgatc tcatggagac agttaataac ttactgacta tgatgtccac 1140 atcaaactca gctaaggacc ccactgttgc taaagaagaa caaatcagct tcagagactg 1200 tgctgaagta ttcaaatcag gacacaccac aaatggcatc tacacgttaa cattccctaa 1260 ttctacagaa gagatcaagg cctactgtga catggaagct ggaggaggcg ggtggacaat 1320 tattcagcga cgtgaggatg gcagcgttga ttttcagagg acttggaaag aatataaagt 1380 gggatttggt aacccttcag gagaatattg gctgggaaat gagtttgttt cgcaactgac 1440 taatcagcaa cgctatgtgc ttaaaataca ccttaaagac tgggaaggga atgaggctta 1500 ctcattgtat gaacatttct atctctcaag tgaagaactc aattatagga ttcaccttaa 1560 aggacttaca gggacagccg gcaaaataag cagcatcagc caaccaggaa atgattttag 1620 cacaaaggat ggagacaacg acaaatgtat ttgcaaatgt tcacaaatgc taacaggagg 1680 ctggtggttt gatgcatgtg gtccttccaa cttgaacgga atgtactatc cacagaggca 1740 gaacacaaat aagttcaacg gcattaaatg gtactactgg aaaggctcag gctattcgct 1800 caaggccaca accatgatga tccgaccagc agatttctaa acatcccagt ccacctgagg 1860 aactgtctcg aactattttc aaagacttaa gcccagtgca ctgaaagtca cggctgcgca 1920 ctgtgtcctc ttccaccaca gagggcgtgt gctcggtgct gacgggaccc acatgctcca 1980 gattagagcc tgtaaacttt atcacttaaa cttgcatcac ttaacggacc aaagcaagac 2040 cctaaacatc cataattgtg attagacaga acacctatgc aaagatgaac ccgaggctga 2100 gaatcagact gacagtttac agacgctgct gtcacaacca agaatgttat gtgcaagttt 2160 atcagtaaat aactggaaaa cagaacactt atgttataca 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Thr 1940 1945 1950 Gly Cys Pro Pro Phe Asp Glu His Lys Cys Leu Ala Glu Gly Gly Lys 1955 1960 1965 Ile Met Lys Ile Pro Gly Thr Cys Cys Asp Thr Cys Glu Glu Pro Glu 1970 1975 1980 Cys Asn Asp Ile Thr Ala Arg Leu Gln Tyr Val Lys Val Gly Ser Cys 1985 1990 1995 2000 Lys Ser Glu Val Glu Val Asp Ile His Tyr Cys Gln Gly Lys Cys Ala 2005 2010 2015 Ser Lys Ala Met Tyr Ser Ile Asp Ile Asn Asp Val Gln Asp Gln Cys 2020 2025 2030 Ser Cys Cys Ser Pro Thr Arg Thr Glu Pro Met Gln Val Ala Leu His 2035 2040 2045 Cys Thr Asn Gly Ser Val Val Tyr His Glu Val Leu Asn Ala Met Glu 2050 2055 2060 Cys Lys Cys Ser Pro Arg Lys Cys Ser Lys 2065 2070 <210> 166 <211> 434 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 166 Met Ser Ile Glu Lys Ile Trp Ala Arg Glu Ile Leu Asp Ser Arg Gly 1 5 10 15 Asn Pro Thr Val Glu Val Asp Leu Tyr Thr Ala Lys Gly Leu Phe Arg 20 25 30 Ala Ala Val Pro Ser Gly Ala Ser Thr Gly Ile Tyr Glu Ala Leu Glu 35 40 45 Leu Arg Asp Gly Asp Lys Gln Arg Tyr Leu Gly Lys Gly Val Leu Lys 50 55 60 Ala Val Asp His Ile Asn Ser Thr Ile Ala Pro Ala Leu Ile Ser Ser 65 70 75 80 Gly Leu Ser Val Val Glu Gln Glu Lys Leu Asp Asn Leu Met Leu Glu 85 90 95 Leu Asp Gly Thr Glu Asn Lys Ser Lys Phe Gly Ala Asn Ala Ile Leu 100 105 110 Gly Val Ser Leu Ala Val Cys Lys Ala Gly Ala Ala Glu Arg Glu Leu 115 120 125 Pro Leu Tyr Arg His Ile Ala Gln Leu Ala Gly Asn Ser Asp Leu Ile 130 135 140 Leu Pro Val Pro Ala Phe Asn Val Ile Asn Gly Gly Ser His Ala Gly 145 150 155 160 Asn Lys Leu Ala Met Gln Glu Phe Met Ile Leu Pro Val Gly Ala Glu 165 170 175 Ser Phe Arg Asp Ala Met Arg Leu Gly Ala Glu Val Tyr His Thr Leu 180 185 190 Lys Gly Val Ile Lys Asp Lys Tyr Gly Lys Asp Ala Thr Asn Val Gly 195 200 205 Asp Glu Gly Gly Phe Ala Pro Asn Ile Leu Glu Asn Ser Glu Ala Leu 210 215 220 Glu Leu Val Lys Glu Ala Ile Asp Lys Ala Gly Tyr Thr Glu Lys Ile 225 230 235 240 Val Ile Gly Met Asp Val Ala Ala Ser Glu Phe Tyr Arg Asp Gly Lys 245 250 255 Tyr Asp Leu Asp Phe Lys Ser Pro Thr Asp Pro Ser Arg Tyr Ile Thr 260 265 270 Gly Asp Gln Leu Gly Ala Leu Tyr Gln Asp Phe Val Arg Asp Tyr Pro 275 280 285 Val Val Ser Ile Glu Asp Pro Phe Asp Gln Asp Asp Trp Ala Ala Trp 290 295 300 Ser Lys Phe Thr Ala Asn Val Gly Ile Gln Ile Val Gly Asp Asp Leu 305 310 315 320 Thr Val Thr Asn Pro Lys Arg Ile Glu Arg Ala Val Glu Glu Lys Ala 325 330 335 Cys Asn Cys Leu Leu Leu Lys Val Asn Gln Ile Gly Ser Val Thr Glu 340 345 350 Ala Ile Gln Ala Cys Lys Leu Ala Gln Glu Asn Gly Trp Gly Val Met 355 360 365 Val Ser His Arg Ser Gly Glu Thr Glu Asp Thr Phe Ile Ala Asp Leu 370 375 380 Val Val Gly Leu Cys Thr Gly Gln Ile Lys Thr Gly Ala Pro Cys Arg 385 390 395 400 Ser Glu Arg Leu Ala Lys Tyr Asn Gln Leu Met Arg Ile Glu Glu Glu 405 410 415 Leu Gly Asp Glu Ala Arg Phe Ala Gly His Asn Phe Arg Asn Pro Ser 420 425 430 Val Leu <210> 167 <211> 380 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 167 Lys Arg Leu Ser Leu Pro Met Asp Ile Arg Leu Pro Gln Glu Phe Leu 1 5 10 15 Gln Lys Leu Gln Met Glu Ser Pro Asp Leu Pro Lys Pro Leu Ser Arg 20 25 30 Met Ser Arg Arg Ala Ser Leu Ser Asp Ile Gly Phe Gly Lys Leu Glu 35 40 45 Thr Tyr Val Lys Leu Asp Lys Leu Gly Glu Gly Thr Tyr Ala Thr Val 50 55 60 Phe Lys Gly Arg Ser Lys Leu Thr Glu Asn Leu Val Ala Leu Lys Glu 65 70 75 80 Ile Arg Leu Glu His Glu Glu Gly Ala Pro Cys Thr Ala Ile Arg Glu 85 90 95 Val Ser Leu Leu Lys Asn Leu Lys His Ala Asn Ile Val Thr Leu His 100 105 110 Asp Leu Ile His Thr Asp Arg Ser Leu Thr Leu Val Phe Glu Tyr Leu 115 120 125 Asp Ser Asp Leu Lys Gln Tyr Leu Asp His Cys Gly Asn Leu Met Ser 130 135 140 Met His Asn Val Lys Ile Phe Met Phe Gln Leu Leu Arg Gly Leu Ala 145 150 155 160 Tyr Cys His Thr Arg Lys Ile Leu His Arg Asp Leu Lys Pro Gln Asn 165 170 175 Leu Leu Ile Asn Glu Arg Gly Glu Leu Lys Leu Ala Asp Phe Gly Leu 180 185 190 Ala Arg Ala Lys Ser Val Pro Thr Lys Thr Tyr Ser Asn Glu Val Val 195 200 205 Thr Leu Trp Tyr Arg Pro Pro Asp Val Leu Leu Gly Ser Thr Glu Tyr 210 215 220 Ser Thr Pro Ile Ala Met Trp Gly Val Gly Cys Ile His Tyr Glu Met 225 230 235 240 Ala Thr Gly Arg Pro Leu Phe Pro Gly Ser Thr Val Lys Glu Glu Leu 245 250 255 His Leu Ile Phe Arg Leu Leu Gly Thr Pro Thr Glu Glu Thr Trp Pro 260 265 270 Gly Val Thr Ala Phe Ser Glu Phe Arg Thr Tyr Ser Phe Pro Cys Tyr 275 280 285 Leu Pro Gln Pro Leu Ile Asn His Ala Pro Arg Leu Asp Thr Asp Gly 290 295 300 Ile His Leu Leu Ser Ser Leu Leu Val Tyr Glu Ser Lys Ser Arg Met 305 310 315 320 Ser Ala Glu Ala Ala Leu Ser His Ser Tyr Phe Arg Ser Leu Gly Glu 325 330 335 Arg Val His Gln Leu Glu Asp Thr Ala Ser Ile Phe Ser Leu Lys Glu 340 345 350 Ile Gln Leu Gln Lys Asp Pro Gly Tyr Arg Gly Leu Ala Phe Gln Gln 355 360 365 Pro Gly Arg Gly Lys Asn Arg Arg Gln Ser Ile Phe 370 375 380 <210> 168 <211> 339 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 168 Met Ala Glu Ala Ser Ser Asp Pro Gly Ala Glu Glu Arg Glu Glu Leu 1 5 10 15 Leu Gly Pro Thr Ala Gln Trp Ser Val Glu Asp Glu Glu Glu Ala Val 20 25 30 His Glu Gln Cys Gln His Glu Arg Asp Arg Gln Leu Gln Ala Gln Asp 35 40 45 Glu Glu Gly Gly Gly His Val Pro Glu Arg Pro Lys Gln Glu Met Leu 50 55 60 Leu Ser Leu Lys Pro Ser Glu Ala Pro Glu Leu Asp Glu Asp Glu Gly 65 70 75 80 Phe Gly Asp Trp Ser Gln Arg Pro Glu Gln Arg Gln Gln His Glu Gly 85 90 95 Ala Gln Gly Ala Leu Asp Ser Gly Glu Pro Pro Gln Cys Arg Ser Pro 100 105 110 Glu Gly Glu Gln Glu Asp Arg Pro Gly Leu His Ala Tyr Glu Lys Glu 115 120 125 Asp Ser Asp Glu Val His Leu Glu Glu Leu Ser Leu Ser Lys Glu Gly 130 135 140 Pro Gly Pro Glu Asp Thr Val Gln Asp Asn Leu Gly Ala Ala Gly Ala 145 150 155 160 Glu Glu Glu Gln Glu Glu His Gln Lys Cys Gln Gln Pro Arg Thr Pro 165 170 175 Ser Pro Leu Val Leu Glu Gly Thr Ile Glu Gln Ser Ser Pro Pro Leu 180 185 190 Ser Pro Thr Thr Lys Leu Ile Asp Arg Thr Glu Ser Leu Asn Arg Ser 195 200 205 Ile Glu Lys Ser Asn Ser Val Lys Lys Ser Gln Pro Asp Leu Pro Ile 210 215 220 Ser Lys Ile Asp Gln Trp Leu Glu Gln Tyr Thr Gln Ala Ile Glu Thr 225 230 235 240 Ala Gly Arg Thr Pro Lys Leu Ala Arg Gln Ala Ser Ile Glu Leu Pro 245 250 255 Ser Met Ala Val Ala Ser Thr Lys Ser Arg Trp Glu Thr Gly Glu Val 260 265 270 Gln Ala Gln Ser Ala Ala Lys Thr Pro Ser Cys Lys Asp Ile Val Ala 275 280 285 Gly Asp Met Ser Lys Lys Ser Leu Trp Glu Gln Lys Gly Gly Ser Lys 290 295 300 Thr Ser Ser Thr Ile Lys Ser Thr Pro Ser Gly Lys Arg Tyr Lys Phe 305 310 315 320 Val Ala Thr Gly His Gly Lys Tyr Glu Lys Val Leu Val Glu Gly Gly 325 330 335 Pro Ala Pro <210> 169 <211> 242 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 169 Pro Pro Pro Pro Ala Cys Ser Cys Pro Arg Gly Pro Arg Glu Arg His 1 5 10 15 Gly Pro Arg Thr Pro Gly Gly Gln Leu Pro Gly Ala Arg Arg Gly Pro 20 25 30 Gly Pro Arg Arg Pro Ala Pro Leu Pro Ala Arg Pro Pro Gly Ala Leu 35 40 45 Gly Ser Val Leu Arg Pro Leu Arg Ala Arg Pro Gly Cys Arg Pro Arg 50 55 60 Arg Pro His Pro Ala Ala Arg Cys Leu Pro Leu Arg Pro His Arg Pro 65 70 75 80 Thr Arg Arg His Arg Arg Pro Gly Gly Phe Pro Leu Ala Trp Gly Ser 85 90 95 Pro Gln Pro Ala Pro Arg Pro Ala Pro Gly Arg Ser Ser Ala Leu Ala 100 105 110 Leu Ala Gly Gly Ala Ala Pro Gly Val Ala Arg Ala Gln Arg Pro Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Arg Ser His Pro Gly Gly Pro Gly Ser Pro Arg Gly 130 135 140 Gly Gly Thr Val Gly Pro Gly Asp Arg Gly Pro Ala Ala Ala Asp Gly 145 150 155 160 Gly Arg Pro Gln Arg Thr Val Arg Ala Ala Glu Thr Arg Gly Ala Ala 165 170 175 Ala Ala Pro Pro Leu Thr Leu Glu Gly Pro Val Gln Ser His His Gly 180 185 190 Thr Pro Ala Leu Thr Gln Gly Pro Gln Ser Pro Arg Asp Gly Ala Gln 195 200 205 Leu Gly Ala Cys Thr Arg Pro Val Asp Val Arg Asp Ser Gly Gly Arg 210 215 220 Pro Leu Pro Pro Pro Asp Thr Leu Ala Ser Ala Gly Asp Phe Leu Cys 225 230 235 240 Thr Met <210> 170 <211> 215 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 170 Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly 20 25 30 Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln 35 40 45 Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu 50 55 60 Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu 65 70 75 80 Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro 85 90 95 Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His 100 105 110 Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys 115 120 125 Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Lys Ser Val 130 135 140 Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg Tyr 145 150 155 160 Lys Ser Trp Ser Val Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His 165 170 175 Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr 180 185 190 Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys 195 200 205 Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg 210 215 <210> 171 <211> 149 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 171 Met Pro Val Met Arg Leu Phe Pro Cys Phe Leu Gln Leu Leu Ala Gly 1 5 10 15 Leu Ala Leu Pro Ala Val Pro Pro Gln Gln Trp Ala Leu Ser Ala Gly 20 25 30 Asn Gly Ser Ser Glu Val Glu Val Val Pro Phe Gln Glu Val Trp Gly 35 40 45 Arg Ser Tyr Cys Arg Ala Leu Glu Arg Leu Val Asp Val Val Ser Glu 50 55 60 Tyr Pro Ser Glu Val Glu His Met Phe Ser Pro Ser Cys Val Ser Leu 65 70 75 80 Leu Arg Cys Thr Gly Cys Cys Gly Asp Glu Asn Leu His Cys Val Pro 85 90 95 Val Glu Thr Ala Asn Val Thr Met Gln Leu Leu Lys Ile Arg Ser Gly 100 105 110 Asp Arg Pro Ser Tyr Val Glu Leu Thr Phe Ser Gln His Val Arg Cys 115 120 125 Glu Cys Arg Pro Leu Arg Glu Lys Met Lys Pro Glu Arg Cys Gly Asp 130 135 140 Ala Val Pro Arg Arg 145 <210> 172 <211> 483 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 172 Phe His Lys Leu Lys Thr Met Lys His Leu Leu Leu Leu Leu Leu Cys 1 5 10 15 Val Phe Leu Val Lys Ser Gln Gly Val Asn Asp Asn Glu Glu Gly Phe 20 25 30 Phe Ser Ala Arg Gly His Arg Pro Leu Asp Lys Lys Arg Glu Glu Ala 35 40 45 Pro Ser Leu Arg Pro Ala Pro Pro Pro Ile Ser Gly Gly Gly Tyr Arg 50 55 60 Ala Arg Pro Ala Lys Ala Ala Ala Thr Gln Lys Lys Val Glu Arg Lys 65 70 75 80 Ala Pro Asp Ala Gly Gly Cys Leu His Ala Asp Pro Asp Leu Gly Val 85 90 95 Leu Cys Pro Thr Gly Cys Gln Leu Gln Glu Ala Leu Leu Gln Gln Glu 100 105 110 Arg Pro Ile Arg Asn Ser Val Asp Glu Leu Asn Asn Asn Val Glu Ala 115 120 125 Val Ser Gln Thr Ser Ser Ser Ser Phe Gln Tyr Met Tyr Leu Leu Lys 130 135 140 Asp Leu Trp Gln Lys Arg Gln Lys Gln Val Lys Asp Asn Glu Asn Val 145 150 155 160 Val Asn Glu Tyr Ser Ser Glu Leu Glu Lys His Gln Leu Tyr Ile Asp 165 170 175 Glu Thr Val Asn Ser Asn Ile Ala Thr Asn Leu Arg Val Leu Arg Ser 180 185 190 Ile Leu Glu Asn Leu Arg Ser Lys Ile Gln Lys Leu Glu Ser Asp Val 195 200 205 Ser Ala Gln Met Glu Tyr Cys Arg Thr Pro Cys Thr Val Ser Cys Asn 210 215 220 Ile Pro Val Val Ser Gly Lys Glu Cys Glu Glu Ile Ile Arg Lys Gly 225 230 235 240 Gly Glu Thr Ser Glu Met Tyr Leu Ile Gln Pro Asp Ser Ser Val Lys 245 250 255 Pro Tyr Arg Val Tyr Cys Asp Met Asn Thr Glu Asn Gly Gly Trp Thr 260 265 270 Val Ile Gln Asn Arg Gln Asp Gly Ser Val Asp Phe Gly Arg Lys Trp 275 280 285 Asp Pro Tyr Lys Gln Gly Phe Gly Asn Val Ala Thr Asn Thr Asp Gly 290 295 300 Lys Asn Tyr Cys Gly Leu Pro Gly Glu Tyr Trp Leu Gly Asn Asp Lys 305 310 315 320 Ile Ser Gln Leu Thr Arg Met Gly Pro Thr Glu Leu Leu Ile Glu Met 325 330 335 Glu Asp Trp Lys Gly Asp Lys Val Lys Ala His Tyr Gly Gly Phe Thr 340 345 350 Val Gln Asn Glu Ala Asn Lys Tyr Gln Ile Ser Val Asn Lys Tyr Arg 355 360 365 Gly Thr Ala Gly Asn Ala Leu Met Asp Gly Ala Ser Gln Leu Met Gly 370 375 380 Glu Asn Arg Thr Met Thr Ile His Asn Gly Met Phe Phe Ser Thr Tyr 385 390 395 400 Asp Arg Asp Asn Asp Gly Trp Leu Thr Ser Asp Pro Arg Lys Gln Cys 405 410 415 Ser Lys Glu Asp Gly Gly Gly Trp Trp Tyr Asn Arg Cys His Ala Ala 420 425 430 Asn Pro Asn Gly Arg Tyr Tyr Trp Gly Gly Gln Tyr Thr Trp Asp Met 435 440 445 Ala Lys His Gly Thr Asp Asp Gly Val Val Trp Met Asn Trp Lys Gly 450 455 460 Ser Trp Tyr Ser Met Arg Lys Met Ser Met Lys Ile Arg Pro Phe Phe 465 470 475 480 Pro Gln Gln <210> 173 <211> 679 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 173 Met Cys Arg Gly Cys Gly Cys Leu Pro Pro Asp Ala Pro Cys Pro Thr 1 5 10 15 Leu Cys Ser Arg Asn Pro Ala Met Val Asn Glu Ala Arg Gly Asn Ser 20 25 30 Ser Leu Asn Pro Cys Leu Glu Gly Ser Ala Ser Ser Gly Ser Glu Ser 35 40 45 Ser Lys Asp Ser Ser Arg Cys Ser Thr Pro Gly Leu Asp Pro Glu Arg 50 55 60 His Glu Arg Leu Arg Glu Lys Met Arg Arg Arg Leu Glu Ser Gly Asp 65 70 75 80 Lys Trp Phe Ser Leu Glu Phe Phe Pro Pro Arg Thr Ala Glu Gly Ala 85 90 95 Val Asn Leu Ile Ser Arg Phe Asp Arg Met Ala Ala Gly Gly Pro Leu 100 105 110 Tyr Ile Asp Val Thr Trp His Pro Ala Gly Asp Pro Gly Ser Asp Lys 115 120 125 Glu Thr Ser Ser Met Met Ile Ala Ser Thr Ala Val Asn Tyr Cys Gly 130 135 140 Leu Glu Thr Ile Leu His Met Thr Cys Cys Arg Gln Arg Leu Glu Glu 145 150 155 160 Ile Thr Gly His Leu His Lys Ala Lys Gln Leu Gly Leu Lys Asn Ile 165 170 175 Met Ala Leu Arg Gly Asp Pro Ile Gly Asp Gln Trp Glu Glu Glu Glu 180 185 190 Gly Gly Phe Asn Tyr Ala Val Asp Leu Val Lys His Ile Arg Ser Glu 195 200 205 Phe Gly Asp Tyr Phe Asp Ile Cys Val Ala Gly Tyr Pro Lys Gly His 210 215 220 Pro Glu Ala Gly Ser Phe Glu Ala Asp Leu Lys His Leu Lys Glu Lys 225 230 235 240 Val Ser Ala Gly Ala Asp Phe Ile Ile Thr Gln Leu Phe Phe Glu Ala 245 250 255 Asp Thr Phe Phe Arg Phe Val Lys Ala Cys Thr Asp Met Gly Ile Thr 260 265 270 Cys Pro Ile Val Pro Gly Ile Phe Pro Ile Gln Gly Tyr His Ser Leu 275 280 285 Arg Gln Leu Val Lys Leu Ser Lys Leu Glu Val Pro Gln Glu Ile Lys 290 295 300 Asp Val Ile Glu Pro Ile Lys Asp Asn Asp Ala Ala Ile Arg Asn Tyr 305 310 315 320 Gly Ile Glu Leu Ala Val Ser Leu Cys Gln Glu Leu Leu Ala Ser Gly 325 330 335 Leu Val Pro Gly Leu His Phe Tyr Thr Leu Asn Arg Glu Met Ala Thr 340 345 350 Thr Glu Val Leu Lys Arg Leu Gly Met Trp Thr Glu Asp Pro Arg Arg 355 360 365 Pro Leu Pro Trp Ala Leu Ser Ala His Pro Lys Arg Arg Glu Glu Asp 370 375 380 Val Arg Pro Ile Phe Trp Ala Ser Arg Pro Lys Ser Tyr Ile Tyr Arg 385 390 395 400 Thr Gln Glu Trp Asp Glu Phe Pro Asn Gly Arg Trp Gly Asn Ser Ser 405 410 415 Ser Pro Ala Phe Gly Glu Leu Lys Asp Tyr Tyr Leu Phe Tyr Leu Lys 420 425 430 Ser Lys Ser Pro Lys Glu Glu Leu Leu Lys Met Trp Gly Glu Glu Leu 435 440 445 Thr Ser Glu Ala Ser Val Phe Glu Val Phe Val Leu Tyr Leu Ser Gly 450 455 460 Glu Pro Asn Arg Asn Gly His Lys Val Thr Cys Leu Pro Trp Asn Asp 465 470 475 480 Glu Pro Leu Ala Ala Glu Thr Ser Leu Leu Lys Glu Glu Leu Leu Arg 485 490 495 Val Asn Arg Gln Gly Ile Leu Thr Ile Asn Ser Gln Pro Asn Ile Asn 500 505 510 Gly Lys Pro Ser Ser Asp Pro Ile Val Gly Trp Gly Pro Ser Gly Gly 515 520 525 Tyr Val Phe Gln Lys Ala Tyr Leu Glu Phe Phe Thr Ser Arg Glu Thr 530 535 540 Ala Glu Ala Leu Leu Gln Val Leu Lys Lys Tyr Glu Leu Arg Val Asn 545 550 555 560 Tyr His Leu Val Asn Val Lys Gly Glu Asn Ile Thr Asn Ala Pro Glu 565 570 575 Leu Gln Pro Asn Ala Val Thr Trp Gly Ile Phe Pro Gly Arg Glu Ile 580 585 590 Ile Gln Pro Thr Val Val Asp Pro Val Ser Phe Met Phe Trp Lys Asp 595 600 605 Glu Ala Phe Ala Leu Trp Ile Glu Arg Trp Gly Lys Leu Tyr Glu Glu 610 615 620 Glu Ser Pro Ser Arg Thr Ile Ile Gln Tyr Ile His Asp Asn Tyr Phe 625 630 635 640 Leu Val Asn Leu Val Asp Asn Asp Phe Pro Leu Asp Asn Cys Leu Trp 645 650 655 Gln Val Val Glu Asp Thr Leu Glu Leu Leu Asn Arg Pro Thr Gln Asn 660 665 670 Ala Arg Glu Thr Glu Ala Pro 675
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) C12Q 1/02 C12Q 1/68 A 1/68 G01N 33/15 Z G01N 33/15 33/50 Z 33/50 33/53 D 33/53 M 33/566 33/566 C12N 15/00 ZNAA (72)発明者 林 浩司 大阪府大阪市此花区春日出中3丁目1番98 号 住友製薬株式会社内 Fターム(参考) 2G045 AA34 AA35 BB01 BB10 BB24 BB46 CB01 DA13 DA36 FB02 FB03 4B024 AA11 BA61 CA04 CA11 DA06 EA04 HA12 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ02 QQ08 QQ53 QQ79 QQ96 QR08 QR14 QR20 QR32 QR36 QR42 QR50 QR55 QR56 QR62 QR77 QS25 QS34 QS36 QX02 4C084 AA17 NA14 ZA811 ZB212 ZC351 4H045 AA10 AA11 AA30 BA09 CA40 DA75 EA20 EA27 EA50 FA74

Claims (32)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】配列番号:1、2、3、4、5、6、7、8、9、1
    0、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、2
    2、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、3
    4、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、4
    6、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、5
    8、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、7
    0、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、8
    2、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、9
    4、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、10
    5、106、107、108、109、110、111、112、113、114、11
    5、116、117、118、119、120、121、122、123、124、12
    5、126、127、128、129、130、131、132、133、134、13
    5、136、137、138、139、140、141、142、143、144、14
    5、146、147、148、149、150、151、152、153、154、15
    5、156、157、158および159のいずれかに記載の塩基配
    列において、連続する少なくとも15塩基を有するポリヌ
    クレオチドおよび/またはそれに相補的なポリヌクレオ
    チドからなる、糖尿病性腎症疾患マーカー。
  2. 【請求項2】糖尿病性腎症検出においてプローブまたは
    プライマーとして使用される請求項1に記載の疾患マー
    カー。
  3. 【請求項3】配列番号:160、161、162、163、164、16
    5、166、167、168、169、170、171、172および173のい
    ずれかに記載のアミノ酸配列を有する蛋白質を認識する
    抗体である糖尿病性腎症の疾患マーカー。
  4. 【請求項4】糖尿病性腎症の検出においてプローブとし
    て使用される請求項3に記載の疾患マーカー。
  5. 【請求項5】下記の工程(a)、(b)および(c)を含む糖尿病
    性腎症の検出方法: (a) 被験者の生体試料から調製されたRNAまたはそれか
    ら転写された相補的なポリヌクレオチドと請求項1また
    は2に記載の疾患マーカーとを結合させる工程、(b) 該
    疾患マーカーに特異的に結合した生体試料由来のRNAま
    たはそれから転写された相補的なポリヌクレオチドを、
    上記疾患マーカーを指標として測定する工程、(c) 上記
    (b)の測定結果に基づいて、糖尿病性腎症の罹患を判断
    する工程。
  6. 【請求項6】下記の工程(a)、(b)および(c)を含む糖尿病
    性腎症の検出方法: (a) 被験者の生体試料から調製されたRNAまたはそれか
    ら転写された相補的なポリヌクレオチドと、請求項1ま
    たは2に記載の疾患マーカーのうち、配列番号:1、2、
    3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、1
    7、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、2
    9、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、4
    1、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、5
    3、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、6
    5、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、7
    7、78、79、80、81、82、83、84、85および86のいずれ
    かに記載の塩基配列に基づく疾患マーカーとを結合させ
    る工程、(b) 上記疾患マーカーに特異的に結合した生体
    試料由来のRNAまたはそれから転写された相補的なポリ
    ヌクレオチドを、上記疾患マーカーを指標として測定す
    る工程、(c) 上記(b)で得られる被験者の測定結果が、
    正常な生体試料について得られる結果に比して疾患マー
    カーへの結合量が増大していることを指標として、糖尿
    病性腎症の罹患を判断する工程。
  7. 【請求項7】下記の工程(a)、(b)および(c)を含む糖尿病
    性腎症の検出方法: (a) 被験者の生体試料から調製されたRNAまたはそれか
    ら転写された相補的なポリヌクレオチドと、請求項1ま
    たは2に記載の疾患マーカーのうち、配列番号:87、8
    8、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、10
    0、101、102、103、104、105、106、107、108、109、11
    0、111、112、113、114、115、116、117、118、119、12
    0、121、122、123、124、125、126、127、128、129、13
    0、131、132、133、134、135、136、137、138、139、14
    0、141、142、143、144、145、146、147、148、149、15
    0、151、152、153、154、155、156、157、158および159
    のいずれかに記載の塩基配列に基づく疾患マーカーとを
    結合させる工程、(b) 上記疾患マーカーに特異的に結合
    した生体試料由来のRNAまたはそれから転写された相補
    的なポリヌクレオチドを、上記疾患マーカーを指標とし
    て測定する工程、(c) 上記(b)で得られる被験者の測定
    結果が、正常な生体試料について得られる結果に比して
    疾患マーカーへの結合量が減少していることを指標とし
    て、糖尿病性腎症の罹患を判断する工程。
  8. 【請求項8】下記の工程(a)、(b)および(c)を含む糖尿病
    性腎症の検出方法:(a) 被験者の生体試料から調製され
    た蛋白質と請求項3または4に記載の疾患マーカーとを結
    合させる工程、(b) 該疾患マーカーに結合した生体試料
    由来の蛋白質またはその部分ペプチドを、上記疾患マー
    カーを指標として測定する工程、(c) 上記(b)の測定結
    果に基づいて、糖尿病性腎症の罹患を判断する工程。
  9. 【請求項9】工程(a)において用いられる疾患マーカー
    が、配列番号:160、161、162、163、164、165、166、1
    67、168、169、170および171のいずれかに記載のアミノ
    酸配列を有する蛋白質を認識する抗体であり、且つ工程
    (c)における糖尿病性腎症の罹患の判断が、被験者につ
    いて得られる測定結果を正常者について得られる測定結
    果と対比して、疾患マーカーへの結合量が増大している
    ことを指標としてなされるものである請求項8に記載の
    糖尿病性腎症の検出方法。
  10. 【請求項10】工程(a)において用いられる疾患マーカー
    が、配列番号:172または173で示されるアミノ酸配列を
    有する蛋白質を認識する抗体であり、且つ工程(c)にお
    ける糖尿病性腎症の罹患を判断する工程が、被験者につ
    いて得られる測定結果を正常者について得られる測定結
    果と対比して、疾患マーカーへの結合量が減少している
    ことを指標として判断するものである請求項8に記載の
    糖尿病性腎症の検出方法。
  11. 【請求項11】下記の工程(a)、(b)および(c)を含む配列
    番号:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、1
    4、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、2
    6、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、3
    8、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、5
    0、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、6
    2、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、7
    4、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、8
    6、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、9
    8、99、100、101、102、103、104、105、106、107、10
    8、109、110、111、112、113、114、115、116、117、11
    8、119、120、121、122、123、124、125、126、127、12
    8、129、130、131、132、133、134、135、136、137、13
    8、139、140、141、142、143、144、145、146、147、14
    8、149、150、151、152、153、154、155、156、157、15
    8および159のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子
    の発現を制御する物質のスクリーニング方法: (a) 被験物質と配列番号:1、2、3、4、5、6、7、8、
    9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、2
    1、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、3
    3、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、4
    5、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、5
    7、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、6
    9、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、8
    1、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、9
    3、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、10
    4、105、106、107、108、109、110、111、112、113、11
    4、115、116、117、118、119、120、121、122、123、12
    4、125、126、127、128、129、130、131、132、133、13
    4、135、136、137、138、139、140、141、142、143、14
    4、145、146、147、148、149、150、151、152、153、15
    4、155、156、157、158および159のいずれかに記載の塩
    基配列を有する遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる
    工程、(b) 被験物質を接触させた細胞の、配列番号:
    1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、1
    5、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、2
    7、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、3
    9、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、5
    1、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、6
    3、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、7
    5、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、8
    7、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、9
    9、100、101、102、103、104、105、106、107、108、10
    9、110、111、112、113、114、115、116、117、118、11
    9、120、121、122、123、124、125、126、127、128、12
    9、130、131、132、133、134、135、136、137、138、13
    9、140、141、142、143、144、145、146、147、148、14
    9、150、151、152、153、154、155、156、157、158およ
    び159のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の発
    現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照
    細胞の上記対応する遺伝子の発現量と比較する工程、
    (c) 上記(b)の比較結果に基づいて、配列番号:1、2、
    3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、1
    7、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、2
    9、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、4
    1、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、5
    3、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、6
    5、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、7
    7、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、8
    9、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、10
    1、102、103、104、105、106、107、108、109、110、11
    1、112、113、114、115、116、117、118、119、120、12
    1、122、123、124、125、126、127、128、129、130、13
    1、132、133、134、135、136、137、138、139、140、14
    1、142、143、144、145、146、147、148、149、150、15
    1、152、153、154、155、156、157、158および159のい
    ずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の発現量を変動
    させる被験物質を選択する工程。
  12. 【請求項12】下記の工程(a)、(b)および(c)を含む配列
    番号:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、1
    4、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、2
    6、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、3
    8、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、5
    0、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、6
    2、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、7
    4、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85およ
    び86のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の発現
    を抑制する物質のスクリーニング方法: (a) 被験物質と配列番号:1、2、3、4、5、6、7、8、
    9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、2
    1、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、3
    3、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、4
    5、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、5
    7、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、6
    9、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、8
    1、82、83、84、85および86のいずれかに記載の塩基配
    列を有する遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工
    程、(b) 被験物質を接触させた細胞の、配列番号:1、
    2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、1
    6、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、2
    8、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、4
    0、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、5
    2、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、6
    4、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、7
    6、77、78、79、80、81、82、83、84、85および86のい
    ずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の発現量を測定
    し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞の上記
    対応する遺伝子の発現量と比較する工程、(c) 上記(b)
    の比較結果に基づいて、配列番号:1、2、3、4、5、6、
    7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、2
    0、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、3
    2、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、4
    4、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、5
    6、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、6
    8、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、8
    0、81、82、83、84、85および86のいずれかに記載の塩
    基配列を有する遺伝子の発現量を減少させる被験物質を
    選択する工程。
  13. 【請求項13】下記の工程(a)、(b)および(c)を含む配列
    番号:87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、
    98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、10
    8、109、110、111、112、113、114、115、116、117、11
    8、119、120、121、122、123、124、125、126、127、12
    8、129、130、131、132、133、134、135、136、137、13
    8、139、140、141、142、143、144、145、146、147、14
    8、149、150、151、152、153、154、155、156、157、15
    8および159のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子
    の発現を亢進する物質のスクリーニング方法: (a) 被験物質と配列番号:87、88、89、90、91、92、9
    3、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、10
    4、105、106、107、108、109、110、111、112、113、11
    4、115、116、117、118、119、120、121、122、123、12
    4、125、126、127、128、129、130、131、132、133、13
    4、135、136、137、138、139、140、141、142、143、14
    4、145、146、147、148、149、150、151、152、153、15
    4、155、156、157、158および159のいずれかに記載の塩
    基配列を有する遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる
    工程、(b) 被験物質を接触させた細胞の、配列番号:8
    7、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、9
    9、100、101、102、103、104、105、106、107、108、10
    9、110、111、112、113、114、115、116、117、118、11
    9、120、121、122、123、124、125、126、127、128、12
    9、130、131、132、133、134、135、136、137、138、13
    9、140、141、142、143、144、145、146、147、148、14
    9、150、151、152、153、154、155、156、157、158およ
    び159のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の発
    現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照
    細胞の上記対応する遺伝子の発現量と比較する工程、
    (c) 上記(b)の比較結果に基づいて、配列番号:87、8
    8、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、10
    0、101、102、103、104、105、106、107、108、109、11
    0、111、112、113、114、115、116、117、118、119、12
    0、121、122、123、124、125、126、127、128、129、13
    0、131、132、133、134、135、136、137、138、139、14
    0、141、142、143、144、145、146、147、148、149、15
    0、151、152、153、154、155、156、157、158および159
    のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の発現量を
    増加させる被験物質を選択する工程。
  14. 【請求項14】下記の工程(a)、(b)および(c)を含む配列
    番号:160、161、162、163、164、165、166、167、16
    8、169、170、171、172および173のいずれかに記載のア
    ミノ酸配列を有する蛋白質の発現量を変動させる物質の
    スクリーニング方法: (a)被験物質と配列番号:160、161、162、163、164、16
    5、166、167、168、169、170、171、172および173のい
    ずれかに記載のアミノ酸配列を有する蛋白質を発現可能
    な細胞または該細胞から調製した細胞画分とを接触させ
    る工程、(b)被験物質を接触させた細胞または細胞画分
    における配列番号:160、161、162、163、164、165、16
    6、167、168、169、170、171、172および173のいずれか
    に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質の発現量を測定
    し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞もしく
    は細胞画分における上記配列番号:160、161、162、16
    3、164、165、166、167、168、169、170、171、172およ
    び173のいずれかに記載のアミノ酸配列を有する蛋白質
    の発現量と比較する工程、(c)上記(b)の比較結果に基づ
    いて、配列番号:160、161、162、163、164、165、16
    6、167、168、169、170、171、172および173のいずれか
    に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質の発現量を変動さ
    せる被験物質を選択する工程。
  15. 【請求項15】下記の工程(a)、(b)および(c)を含む配列
    番号:160、161、162、163、164、165、166、167、16
    8、169、170および171のいずれかに記載のアミノ酸配列
    を有する蛋白質の発現量を減少させる物質のスクリーニ
    ング方法: (a)被験物質と配列番号:160、161、162、163、164、16
    5、166、167、168、169、170および171のいずれかに記
    載のアミノ酸配列を有する蛋白質を発現可能な細胞また
    は該細胞から調製した細胞画分とを接触させる工程、
    (b)被験物質を接触させた細胞または細胞画分における
    配列番号:160、161、162、163、164、165、166、167、
    168、169、170および171のいずれかに記載のアミノ酸配
    列を有する蛋白質の発現量を測定し、該発現量を被験物
    質を接触させない対照細胞もしくは細胞画分における上
    記配列番号:160、161、162、163、164、165、166、16
    7、168、169、170および171のいずれかに記載のアミノ
    酸配列を有する蛋白質の発現量と比較する工程、(c)上
    記(b)の比較結果に基づいて、配列番号:160、161、16
    2、163、164、165、166、167、168、169、170および171
    のいずれかに記載のアミノ酸配列を有する蛋白質の発現
    量を減少させる被験物質を選択する工程。
  16. 【請求項16】下記の工程(a)、(b)および(c)を含む配列
    番号:172または173で示されるアミノ酸配列を有する蛋
    白質の発現量を増加させる物質のスクリーニング方法: (a)被験物質と配列番号:172または173で示されるアミ
    ノ酸配列を有する蛋白質を発現可能な細胞または該細胞
    から調製した細胞画分とを接触させる工程、(b)被験物
    質を接触させた細胞または細胞画分における配列番号:
    172または173で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質の
    発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対
    照細胞もしくは細胞画分における上記配列番号:172ま
    たは173で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質の発現
    量と比較する工程、(c)上記(b)の比較結果に基づいて、
    配列番号:172または173で示されるアミノ酸配列を有す
    る蛋白質の発現量を増加させる被験物質を選択する工
    程。
  17. 【請求項17】 下記の工程(a)、(b)および(c)を含む配
    列番号:160、161、162、163、164、165、166、167、16
    8、169、170、171、172および173のいずれかに記載のア
    ミノ酸配列を有する蛋白質の機能または活性を制御する
    物質のスクリーニング方法: (a)被験物質と配列番号:160、161、162、163、164、16
    5、166、167、168、169、170、171、172および173のい
    ずれかに記載のアミノ酸配列を有する蛋白質を含む水溶
    液、細胞または該細胞から調製した細胞画分とを接触さ
    せる工程、(b)被験物質を接触させた水溶液、細胞また
    は細胞画分における配列番号:160、161、162、163、16
    4、165、166、167、168、169、170、171、172および173
    のいずれかに記載のアミノ酸配列を有する蛋白質の機能
    または活性を測定し、該機能または活性を被験物質を接
    触させない対照水溶液、対照細胞または対照細胞画分に
    おける上記配列番号:160、161、162、163、164、165、
    166、167、168、169、170、171、172および173のいずれ
    かに記載のアミノ酸配列を有する蛋白質の機能または活
    性と比較する工程、(c)上記(b)の比較結果に基づいて、
    配列番号:160、161、162、163、164、165、166、167、
    168、169、170、171、172および173のいずれかに記載の
    アミノ酸配列を有する蛋白質の機能または活性を制御す
    る被験物質を選択する工程。
  18. 【請求項18】 下記の工程(a)、(b)および(c)を含む配
    列番号:160、161、162、163、164、165、166、167、16
    8、169、170および171のいずれかに記載のアミノ酸配列
    を有する蛋白質の機能または活性を抑制する物質のスク
    リーニング方法: (a)被験物質と配列番号:160、161、162、163、164、16
    5、166、167、168、169、170および171のいずれかに記
    載のアミノ酸配列を有する蛋白質を含む水溶液、細胞ま
    たは該細胞から調製した細胞画分とを接触させる工程、
    (b)被験物質を接触させた水溶液、細胞または細胞画分
    における配列番号:160、161、162、163、164、165、16
    6、167、168、169、170および171のいずれかに記載のア
    ミノ酸配列を有する蛋白質の機能または活性を測定し、
    該機能または活性を被験物質を接触させない対照水溶
    液、対照細胞または対照細胞画分における上記配列番
    号:160、161、162、163、164、165、166、167、168、1
    69、170および171のいずれかに記載のアミノ酸配列を有
    する蛋白質の機能または活性と比較する工程、(c)上記
    (b)の比較結果に基づいて、配列番号:160、161、162、
    163、164、165、166、167、168、169、170および171の
    いずれかに記載のアミノ酸配列を有する蛋白質の機能ま
    たは活性を抑制する被験物質を選択する工程。
  19. 【請求項19】 下記の工程(a)、(b)および(c)を含む配
    列番号:172または173で示されるアミノ酸配列を有する
    蛋白質の機能または活性を亢進する物質のスクリーニン
    グ方法: (a)被験物質と配列番号:172または173で示されるアミ
    ノ酸配列を有する蛋白質を含む水溶液、細胞または該細
    胞から調製した細胞画分とを接触させる工程、(b)被験
    物質を接触させた水溶液、細胞または細胞画分における
    配列番号:172または173で示されるアミノ酸配列を有す
    る蛋白質の機能または活性を測定し、該機能または活性
    を被験物質を接触させない対照水溶液、対照細胞または
    対照細胞画分における上記配列番号:172または173で示
    されるアミノ酸配列を有する蛋白質の機能または活性と
    比較する工程、(c)上記(b)の比較結果に基づいて、配列
    番号:172または173で示されるアミノ酸配列を有する蛋
    白質の機能または活性を亢進する被験物質を選択する工
    程。
  20. 【請求項20】 糖尿病性腎症の予防、改善または治療剤
    の有効成分を探索するための方法である、請求項11乃至
    19のいずれかに記載のスクリーニング方法。
  21. 【請求項21】 配列番号:1、2、3、4、5、6、7、8、
    9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、2
    1、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、3
    3、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、4
    5、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、5
    7、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、6
    9、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、8
    1、82、83、84、85および86のいずれかに記載の塩基配
    列を有する遺伝子の発現を抑制する物質を有効成分とす
    る糖尿病性腎症の予防、改善または治療剤。
  22. 【請求項22】 配列番号:1、2、3、4、5、6、7、8、
    9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、2
    1、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、3
    3、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、4
    5、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、5
    7、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、6
    9、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、8
    1、82、83、84、85および86のいずれかに記載の塩基配
    列を有する遺伝子の発現を抑制する物質が請求項12に記
    載のスクリーニング法により得られるものである請求項
    21に記載の糖尿病性腎症の予防、改善または治療剤。
  23. 【請求項23】 配列番号:87、88、89、90、91、92、9
    3、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、10
    4、105、106、107、108、109、110、111、112、113、11
    4、115、116、117、118、119、120、121、122、123、12
    4、125、126、127、128、129、130、131、132、133、13
    4、135、136、137、138、139、140、141、142、143、14
    4、145、146、147、148、149、150、151、152、153、15
    4、155、156、157、158および159のいずれかに記載の塩
    基配列を有する遺伝子の発現を亢進させる物質を有効成
    分とする糖尿病性腎症の予防、改善または治療剤。
  24. 【請求項24】配列番号:87、88、89、90、91、92、93、
    94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、1
    05、106、107、108、109、110、111、112、113、114、1
    15、116、117、118、119、120、121、122、123、124、1
    25、126、127、128、129、130、131、132、133、134、1
    35、136、137、138、139、140、141、142、143、144、1
    45、146、147、148、149、150、151、152、153、154、1
    55、156、157、158および159のいずれかに記載の塩基配
    列を有する遺伝子の発現を亢進させる物質が請求項13に
    記載のスクリーニング法により得られるものである請求
    項23に記載の糖尿病性腎症の予防、改善または治療剤。
  25. 【請求項25】配列番号:160、161、162、163、164、16
    5、166、167、168、169、170および171のいずれかに記
    載のアミノ酸配列を有する蛋白質の発現量を減少させる
    物質を有効成分とする糖尿病性腎症の予防、改善または
    治療剤。
  26. 【請求項26】配列番号:160、161、162、163、164、16
    5、166、167、168、169、170および171のいずれかに記
    載のアミノ酸配列を有する蛋白質の発現量を減少させる
    物質が請求項15に記載のスクリーニング方法により得ら
    れるものである請求項25に記載の糖尿病性腎症の予防、
    改善または治療剤。
  27. 【請求項27】配列番号:172または173で示されるアミノ
    酸配列を有する蛋白質の発現量を増加させる物質を有効
    成分とする糖尿病性腎症の予防、改善または治療剤。
  28. 【請求項28】配列番号:172または173で示されるアミノ
    酸配列を有する蛋白質の発現量を増加させる物質が請求
    項16に記載のスクリーニング方法により得られるもので
    ある請求項27に記載の糖尿病性腎症の予防、改善または
    治療剤。
  29. 【請求項29】配列番号:160、161、162、163、164、16
    5、166、167、168、169、170および171のいずれかに記
    載のアミノ酸配列を有する蛋白質の機能または活性を抑
    制する物質を有効成分とする糖尿病性腎症の予防、改善
    または治療剤。
  30. 【請求項30】配列番号:160、161、162、163、164、16
    5、166、167、168、169、170および171のいずれかに記
    載のアミノ酸配列を有する蛋白質の機能または活性を抑
    制する物質が請求項18に記載のスクリーニング方法によ
    り得られるものである請求項29に記載の糖尿病性腎症の
    予防、改善または治療剤。
  31. 【請求項31】配列番号:172または173で示されるアミノ
    酸配列を有する蛋白質の機能または活性を亢進する物質
    を有効成分とする糖尿病性腎症の予防、改善または治療
    剤。
  32. 【請求項32】配列番号:172または173で示されるアミノ
    酸配列を有する蛋白質の機能または活性を亢進する物質
    が請求項19に記載のスクリーニング方法により得られる
    ものである請求項31に記載の糖尿病性腎症の予防、改善
    または治療剤。
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