JP5846372B2 - Dravet症候群の発症可能性の判定方法およびその利用 - Google Patents
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Description
被験体から分離された試料を用いて、電位依存性ナトリウムイオンチャネルNaV1.1のαサブユニット1型における変異の有無を検出する工程と、
電位依存性カルシウムイオンチャネルCaV2.1のαサブユニット1型における変異の有無を検出する工程とを含むことを特徴としている。好ましくは、本発明に係る判定方法は、Dravet症候群の発症の可能性を判定するためのデータを取得する方法である。
電位依存性ナトリウムイオンチャネルNaV1.1のαサブユニット1型における変異を検出するための、ポリヌクレオチドと、
電位依存性カルシウムイオンチャネルCaV2.1のαサブユニット1型における変異を検出するための、ポリヌクレオチドとを備えていることを特徴としている。本発明に係るキットは、Dravet症候群の発症の可能性を判定するためのデータを取得するためのキットであってもよい。
電位依存性カルシウムイオンチャネルCaV2.1を構成するαサブユニット1型をコードする遺伝子に、アミノ酸変化を伴う変異を導入する工程と、を含むことを特徴としている。
電位依存性ナトリウムイオンチャネルNaV1.1のαサブユニット1型に変異を導入する工程と、
電位依存性カルシウムイオンチャネルCaV2.1のαサブユニット1型に変異を導入する工程とを含むことを特徴としている。
当該候補薬剤の投与によって、上記Dravet症候群の発症モデル動物における、Dravet症候群が改善または治癒されたか否かを判定する工程とを含むことを特徴としている。
当該候補薬剤の投与によって、上記細胞における、電位依存性ナトリウムイオンチャネルNaV1.1の活性および/または電位依存性カルシウムイオンチャネルCaV2.1の活性が変化したか否かを判定する工程とを含むことを特徴としている。
本発明に係るDravet症候群の発症の可能性を判定する方法(「本発明に係る判定方法」ともいう。)は、被験体から分離した試料を用いて、当該被験体がDravet症候群の発症の可能性を判定する方法である。尚、本明細書において、上記「Dravet症候群の発症の可能性」とは、Dravet症候群をすでに発症している可能性と、Dravet症候群を将来的に発症する可能性との両方の意味を包含するものである。
本明細書において、上記「変異の有無を検出する工程」とは、電位依存性ナトリウムイオンチャネルNaV1.1のαサブユニット1型における変異の有無を検出する工程と、電位依存性カルシウムイオンチャネルCaV2.1のαサブユニット1型における変異の有無を検出する工程とを指している。
被験体から分離された試料に含有されるゲノムDNAを用いて遺伝子の変異を検出する実施形態では、まず、被験体から分離された試料から、従来公知の方法を用いて、ゲノムDNAを抽出する。
被験体から分離された試料に含有されるmRNAを用いて変異を検出する実施形態では、まず、被験体から分離された試料から、従来公知の方法を用いて、mRNAを抽出する。
被験体から分離された試料に含有されるタンパク質を用いて変異を検出する実施形態では、まず、被験体から分離された試料から、従来公知の方法を用いて、タンパク質を抽出する。
本明細書において、上記「活性の変化を確認する工程」とは、上記電位依存性ナトリウムイオンチャネルNaV1.1の活性が変化していることを確認する工程と、上記電位依存性カルシウムイオンチャネルCaV2.1の活性が変化していることを確認する工程とを指している。
本発明には、本発明に係る判定方法を用いて、Dravet症候群の発症の可能性を判定するためのキット(以下、単に「本発明に係るキット」ともいう)も含まれる。
例えば、ナトリウムイオンチャネルα1サブユニットおよびカルシウムイオンチャネルα1サブユニットについて、それぞれの遺伝子のゲノムDNAまたはその一部の領域を増幅できるように設計されたプライマー対や、変異型または野生型の一方のゲノムDNAのみを特異的に検出できるように設計されたプローブを含む構成を挙げることができる。これらのポリヌクレオチドは、上記「1.本発明に係る判定方法」の「(A)ゲノムDNAを用いる実施形態」の項で説明したとおりであるので、ここでは説明は省略する。
例えば、ナトリウムイオンチャネルα1サブユニットおよびカルシウムイオンチャネルα1サブユニットについて、それぞれの遺伝子のcDNAまたはその一部の領域を増幅できるように設計されたプライマー対や、変異型または野生型の一方のmRNAのみを特異的に検出できるように設計されたプローブを含む構成を挙げることができる。このようなポリヌクレオチドは、上記「1.本発明に係る判定方法」の「((B)mRNA(cDNA)を用いる実施形態」の項で説明したとおりであるので、ここでは説明は省略する。
本発明には、Dravet症候群の発症モデル動物、およびその作製方法も含まれる。
本発明に係るDravet症候群の発症モデル動物は、ナトリウムイオンチャネルα1サブユニット、およびカルシウムイオンチャネルα1サブユニットの両方において変異を有する。ナトリウムイオンチャネルα1サブユニットにおける変異、およびカルシウムイオンチャネルα1サブユニットにおける変異については、上記「1.本発明に係る判定方法」の項で説明したとおりであるので、ここでは、詳細な説明は省略する。
本発明に係るDravet症候群の発症モデル動物の作製方法としては、ナトリウムイオンチャネルα1サブユニットに変異を導入する工程と、カルシウムイオンチャネルα1サブユニットに変異を導入する工程とを含んでいる。
本発明には、ナトリウムイオンチャネルα1サブユニット、およびカルシウムイオンチャネルα1サブユニットの両方において変異を有する細胞、およびその製造方法も含まれる。
本発明に係る細胞は、ナトリウムイオンチャネルα1サブユニット、およびカルシウムイオンチャネルα1サブユニットの両方において変異を有する細胞である。ナトリウムイオンチャネルα1サブユニットにおける変異、およびカルシウムイオンチャネルα1サブユニットにおける変異については、上記「1.本発明に係る判定方法」の項で説明したとおりであるので、ここでは、詳細な説明は省略する。
本発明に係る細胞の製造方法は、上記の特性を有する細胞を製造する方法であり、ナトリウムイオンチャネルα1サブユニットに変異を導入する工程と、カルシウムイオンチャネルα1サブユニットに変異を導入する工程とを含んでいる。より具体的には、以下の3つの実施形態を挙げることができる。ここでは、以下の3つの実施形態について具体的に説明するが、本発明はこれに限定されない。
この方法では、変異型の電位依存性ナトリウムイオンチャネルNaV1.1および変異型の電位依存性カルシウムイオンチャネルCaV2.1を発現する細胞を、発現ベクター等を用いて作製する。具体的に説明すると、変異型の電位依存性ナトリウムイオンチャネルNaV1.1を細胞に発現させるために、例えば、アミノ酸変化を伴う変異を有するナトリウムイオンチャネルα1サブユニット遺伝子と、電位依存性ナトリウムイオンチャネルNaV1.1を構成する、上記α1サブユニット以外のサブユニット(β1サブユニットおよびβ2サブユニット)をコードする遺伝子(β1サブユニット遺伝子およびβ2サブユニット遺伝子)の野生型とを、発現ベクター等を用いて、宿主となる培養細胞内において共発現させる。これにより、変異型のナトリウムイオンチャネルα1サブユニットを含む変異型の電位依存性ナトリウムイオンチャネルNaV1.1を、細胞に発現させることができる。
この方法では、電位依存性ナトリウムイオンチャネルNaV1.1、および電位依存性カルシウムイオンチャネルCaV2.1の両方を発現している培養細胞において、ナトリウムイオンチャネルα1サブユニット、およびカルシウムイオンチャネルα1サブユニットの両方に変異を導入する。これにより、本発明に係る細胞を製造することができる。
この方法では、上述した本発明に係るDravet症候群の発症モデル動物から組織を摘出し、その組織から培養細胞を作製する。本発明に係るDravet症候群の発症モデル動物については、上記「3.本発明に係るDravet症候群の発症モデル動物およびその作製方法」の項で説明したとおりであるので、ここでは、詳細な説明は省略する。当然のことながら、摘出される上記「組織」とは、変異が導入されたナトリウムイオンチャネルα1サブユニット、および変異が導入されたカルシウムイオンチャネルα1サブユニットの両方が発現している組織を意図している。
本発明に係るDravet症候群の発症モデル動物および本発明に係る細胞は、新たなDravet症候群の治療方法や治療薬剤の開発に用いることができる。したがって、本発明には、Dravet症候群の治療薬の治療薬剤をスクリーニングするDravet症候群の治療薬剤のスクリーニング方法(以下、「本発明に係るスクリーニング方法」ともいう)が含まれる。
本発明に係るDravet症候群の発症モデル動物に候補薬剤を投与する工程と、当該候補薬剤が投与されたDravet症候群の発症モデル動物における、Dravet症候群が改善または治癒されたか否かを判定する工程とを含んでいればよい。
本発明に係るスクリーニング細胞に候補薬剤を投与する工程と、当該候補薬剤が投与されたDravet症候群の治療薬剤のスクリーニング細胞において、電位依存性ナトリウムイオンチャネルNaV1.1の活性および/または電位依存性カルシウムイオンチャネルCaV2.1の活性が変化したかを判定する工程とを少なくとも含む。
上記電位依存性カルシウムイオンチャネルCaV2.1のαサブユニット1型における変異は、表2に記載の変異の1つ以上であることが好ましい。
上記電位依存性カルシウムイオンチャネルCaV2.1の活性が変化していることを確認する工程とをさらに含むことが好ましい。
岡山大学医学部・歯学部附属病院および関連病院に来院したDravet症候群患者の47例の末梢血よりDNAを抽出し、各種遺伝子の変異について解析した。本研究は岡山大学「ヒトゲノム・遺伝子解析研究倫理審査委員会」の承認を得て行われた。
CACNA1A:電位依存性カルシウムイオンチャネルCaV2.1のα1サブユニット
CACNB4:電位依存性カルシウムイオンチャネルのβ4サブユニット
SCN1B:電位依存性ナトリウムイオンチャネルのβ1サブユニット
SCN3A:電位依存性ナトリウムイオンチャネルNaV1.3のα3サブユニット
CACNA1A遺伝子の遺伝子解析に用いたプライマー対の塩基配列(配列番号63〜143)については、後述する「プライマーの配列」の項に示した。
(1)ミスセンス変異
G266S 1例
K472R 1例
E921D 11例
A924G 1例
E996V 11例
G1108S 3例
R1126H 4例
R2201Q 4例
(2)アミノ酸の欠失
4アミノ酸の欠失(deletion 2202−2205) 1例。
(3)エキソン中のアミノ酸変化を伴わない遺伝子変異
E292E(rs16006)、E394E(rs2248069)、I525I(rs16010)、T698T(rs16016)、R1023R(rs16025)、F1291F(rs16030)、T1458T(新規SNPまたは突然変異)、S1472S(新規SNPまたは突然変異)、V1890V(rs17846921)、H2225H(rs16051)
(4)イントロン中の遺伝子変異
エキソン1上流(rs16000)、イントロン1(rs16003)、イントロン3(rs17846942)、イントロン8(rs2306348)、イントロン11(rs10407951)、イントロン17(rs16018)、イントロン39(rs3816027)、イントロン40(rs17846925)、イントロン42(新規SNPまたは突然変異)。
SCN1Aのみに変異を有している患者;20例
CACNA1Aのみに変異を有している患者;2例
SCN1AおよびCACNA1Aの両方に変異を有していない患者;6例
これまでDravet症候群の患者におけるCACNA1A遺伝子の異常については全く報告されていない。本研究結果は、Dravet症候群患者は、電位依存性ナトリウムイオンチャネルNaV1.1のα1サブユニット遺伝子であるSCN1Aおよび電位依存性カルシウムイオンチャネルCaV2.1のα1サブユニット遺伝子であるCACNA1Aにおいて、高頻度の変異を有することを示している。
良性の熱性けいれん患者におけるSCN1A遺伝子およびCACNA1A遺伝子の異常の検討を行った。岡山大学病院および関連病院に来院した良性の全般てんかん熱性けいれんプラス(generalized epilepsy with febrile seizure plus: GEFS+)患者の50例の末梢血よりDNAを抽出し、各種遺伝子の変異について解析した。DNA抽出、遺伝子のPCR増幅、シークエンス反応は上記記載の方法で行った。
CACNA1A遺伝子のコーディング領域で検出されたミスセンス変異、欠失変異の9種類のうち、登録済みの3種類を除く、残りの6種類の遺伝子変異が遺伝子多型(SNP)かどうかを調べるために、健常人190例の血液から採取したDNAについて、同様にCACNA1A遺伝子の遺伝子変異の解析を行った。CACNA1A遺伝子のコーディング領域で検出されたミスセンス変異、欠失変異の9種類についての結果を表6に示す。その結果、1種類のCACNA1A遺伝子の変異(G266S)は健常人からは検出されなかった。この結果より、G266SのCACNA1A遺伝子の変異は、SNPではなく、健常人190例、およびNCBIのSNPデータベースにも無い、新規遺伝子変異(遺伝子異常)であることが判明した。
CACNA1A遺伝子のコーディング領域で検出されたミスセンス変異、欠失変異の9種類が、疾患の症状悪化にどのように影響を与えているか検討を行った。発作症状データが詳細に整っているDravet症候群患者において、SCN1A遺伝子変異のみを有している患者20例と、SCN1A遺伝子およびCACNA1A遺伝子の両方に変異を有している19例の患者に関して、1歳未満での発作症状を比較検討した。その結果を表7に示す。尚、表7に記載の「GTC」は、全身性強直・間代発作(generalized tonic-clonc seizure)の略語であり、「CPS」は、複雑部分発作(complex partial seizure)の略語である。
変異型カルシウムイオンチャネルおよび正常型(野生型)カルシウムイオンチャネルについて、培養細胞を用いた機能解析を行った。まず、ヒトのCACNA1A遺伝子(配列番号4)のcDNAを用いて、変異型CACNA1A(G266S;R1126H;R2201Q;deletion 2202−2205;R1126HおよびR2201Qの2重変異)遺伝子を有する発現ベクターを作製した。各変異箇所を含むDNA断片をPCRにて作製した後、その断片を正常型cDNAの対応する断片と置換することにより変異型cDNAを作製した。コントロールとして、正常型(野生型)のCACNA1A遺伝子を有する発現ベクター(pMO14X2-CACNA1A)を使用した。
上記知見より、SCN1AおよびCACNA1Aの両方に何らかの変異を有していることが、Dravet症候群の発症に重要であると考えられた。そこで、電位依存性ナトリウムイオンチャネルNaV1.1のα1サブユニット遺伝子Scn1aの変異と、電位依存性カルシウムイオンチャネルCaV2.1のα1サブユニット遺伝子Cacna1aの変異の両方を有するラットを作製し、症状の悪性化について検討を行った(ヒトの遺伝子はSCN1AおよびCACNA1Aと表記し、ラットの遺伝子はScn1aおよびCacna1aと表記した)。
ENUミュータジェネシスにより作製された、電位依存性ナトリウムチャンネルNaV1.1のα1サブユニット遺伝子(Scn1a)にミスセンス変異を有するラット。第1417位のアミノ酸であるアスパラギン(N)がヒスチジン(H)に変異している(「N1417H」と表す)。ヒト全般性てんかん熱性けいれんプラス(GEFS+)のモデル動物。背景系統はF344/NSlcラット。京都大学医学研究科附属動物実験施設より分与された。
Scl:Wistarにメチルニトロソウレアを投与して作製された、運動失調および欠神様発作を主症状とするミュータントラット。常染色体劣性遺伝様式をとり、電位依存性カルシウムイオンチャネルCaV2.1のα1サブユニットにミスセンス変異を有する。第251位のアミノ酸であるメチオニン(M)がリジン(K)に変異している(M251K)。京都大学医学研究科附属動物実験施設より分与された。
ラットを用いた検証を行う前に、変異型ナトリウムイオンチャネルおよび正常型ナトリウムイオンチャネルについての、培養細胞を用いた機能解析を行った。Scn1a遺伝子に変異を有するラット(F344-Scn1aKyo811)では、Scn1a遺伝子がコードするタンパク質の第1417位のアミノ酸であるアスパラギン(AAT)がヒスチジン(CAT)に変化している(N1417H)。第1417位のアスパラギンはナトリウムイオンチャネル第3ドメインのイオン透過に関わるポア形成領域に位置する。そこで、まず、F344-Scn1aKyo811が有する変異型電位依存的ナトリウムイオンチャネルの機能解析を行った。
上述した親ラット(P)としてのF344-Scn1aKyo811と、GRY(groggy rat, Cacna1agryとの掛け合わせを行い、F1(雑種第一世代)ラットを作製し、F1ラット同士を掛け合わせてF2(雑種第二世代)ラットを作製した。図5は、親ラット(P)、F1ラットおよびF2ラットの遺伝子型を表す図である。図5の(a)に示すように、F1ラットは、Scn1a遺伝子の変異およびCacna1a遺伝子の変異のいずれもヘテロ接合型に有している(「Scn1a変異型ヘテロ+Cacna1a変異型ヘテロ」と表記する)。また、図5の(b)に示すように、F2ラットには9種類の遺伝子型を示すラットが生まれる。各種ラットの遺伝子型は、ラットの尾の先端組織を採取し、DNAを抽出した後に、抽出したDNAを用いて、DNAシークエンス法による遺伝子変異を確認するか、または制限酵素による切断パターンを確認することによって特定した。
DNAシークエンス法による遺伝子変異確認は、以下のようにして行った。まず、変異点を挟むプライマー対(Scn1a増幅用プライマー対の塩基配列は配列番号5および配列番号6に示し、Cacna1a増幅用プライマー対の塩基配列は配列番号7および配列番号8に示す)を用いてゲノムDNAを増幅した後、得られたPCR産物を、PCR products pre-sequencing kit(Amersham Biosciences, Little Chalfont, Buckinghamshire, England)を用いて精製した。用いたプライマー対の塩基配列は、後述する「プライマーの配列」の項を参照のこと。
制限酵素消化による遺伝子変異確認は、以下のようにして行った。Scn1a遺伝子における変異を検出する場合は、Scn1a遺伝子における変異点を挟むプライマー対(配列番号5および6)を用いてゲノムDNAを増幅した後、得られたPCR産物を、制限酵素BclIを用いて50℃、3時間反応させた。その後、4%アガロースゲルを用いて制限酵素反応液を電気泳動し、バンドのサイズを確認した。図7は、F2ラットにおけるScn1a遺伝子の遺伝子型を、制限酵素消化によって特定する方法を示す図である。
Dravet症候群の発症モデルラットを用いて、Scn1a遺伝子の変異にCacna1a遺伝子の変異が加わると、発作にどのような影響(悪性化)を及ぼすかについて検討した。具体的には、温熱負荷によってけいれん発作を誘発したときの症状について、Scn1a遺伝子の変異のみをホモ接合型に有するラット(「Scn1a変異ホモ+Cacna1a野生型ホモ」と表記する)と、Scn1a遺伝子の変異はホモ接合型で且つCacna1a遺伝子の変異をヘテロ接合型に有するラット(「Scn1a変異ホモ+Cacna1a変異ヘテロ」と表記する)とを比較した。
(1)Scn1awt/wtCacna1awt/wt(Scn1a野生型ホモ+Cacna1a野生型ホモ) 雄14匹
(2)Scn1amut/mutCacna1awt/wt(Scn1a変異型ホモ+Cacna1a野生型ホモ) 雄7匹
(3)Scn1amut/mutCacna1awt/mut(Scn1a変異型ホモ+Cacna1a変異型ヘテロ) 雄17匹
(4)Scn1a wt/wtCacna1awt/mut(Scn1a野生型ホモ+Cacna1a変異型ヘテロ) 雄12匹。
本発明は、難治性のDravet症候群の発症の分子基盤に基づいて開発されたものであり、本発明に係る判定方法は、Dravet症候群患者の早期発見方法として有用であるといえる。本発明に係る判定方法を用いることによって、予後不良のDravet症候群を、高精度に、且つ早期に発見することが可能となり、Dravet症候群の患者に対して、早期から、てんかん専門医による治療管理体制を整えることができる。この結果、患者の治療成績の向上、家族の精神的負担の軽減、および経済的負担の軽減が可能となる。また、Dravet症候群の患者に対して適切な治療を施すことができるので、医療費の削減に貢献し得ると考える。
Scn1a遺伝子の増幅、およびCacna1a遺伝子の増幅に用いたプライマー対の塩基配列を表10に示す。
Claims (10)
- Dravet症候群の発症の可能性を判定するためのデータを取得する方法であって、
被験体から分離された試料を用いて、電位依存性ナトリウムイオンチャネルNaV1.1のαサブユニット1型における変異の有無を検出する工程と、
電位依存性カルシウムイオンチャネルCaV2.1のαサブユニット1型における変異の有無を検出する工程と
を含むことを特徴とする方法。 - 上記電位依存性ナトリウムイオンチャネルNaV1.1のαサブユニット1型における変異は、表1に記載の変異の1つ以上であり、
上記電位依存性カルシウムイオンチャネルCaV2.1のαサブユニット1型における変異は、表2に記載の変異の1つ以上である
ことを特徴とする請求項1に記載の方法。 - 上記電位依存性ナトリウムイオンチャネルNaV1.1の活性が変化していることを確認する工程と、
上記電位依存性カルシウムイオンチャネルCaV2.1の活性が変化していることを確認する工程と
をさらに含むことを特徴とする請求項1または2に記載の方法。 - Dravet症候群の発症の可能性を判定するためのキットであって、
電位依存性ナトリウムイオンチャネルNaV1.1のαサブユニット1型における変異を検出するための、ポリヌクレオチドと、
電位依存性カルシウムイオンチャネルCaV2.1のαサブユニット1型における変異を検出するための、ポリヌクレオチドと
を備えていることを特徴とするキット。 - 電位依存性ナトリウムイオンチャネルNaV1.1のαサブユニット1型、および電位依存性カルシウムイオンチャネルCaV2.1のαサブユニット1型の両方において、変異を有することを特徴とするDravet症候群の発症モデル非ヒト動物。
- 請求項5に記載のDravet症候群の発症モデル非ヒト動物の作製方法であって、
電位依存性ナトリウムイオンチャネルNaV1.1のαサブユニット1型に変異を導入する工程と、
電位依存性カルシウムイオンチャネルCaV2.1のαサブユニット1型に変異を導入する工程と
を含むことを特徴とする作製方法。 - 電位依存性ナトリウムイオンチャネルNaV1.1のαサブユニット1型、および電位依存性カルシウムイオンチャネルCaV2.1のαサブユニット1型の両方において変異を有することを特徴とする細胞。
- 請求項7に記載の細胞の製造方法であって、
電位依存性ナトリウムイオンチャネルNaV1.1のαサブユニット1型に変異を導入する工程と、
電位依存性カルシウムイオンチャネルCaV2.1のαサブユニット1型に変異を導入する工程と
を含むことを特徴とする製造方法。 - 請求項5に記載のDravet症候群の発症モデル非ヒト動物に、候補薬剤を投与する工程と、
当該候補薬剤の投与によって、上記Dravet症候群の発症モデル非ヒト動物における、Dravet症候群が改善または治癒されたか否かを判定する工程と
を含むことを特徴とするDravet症候群の治療薬剤のスクリーニング方法。 - 請求項7に記載の細胞に、候補薬剤を投与する工程と、
当該候補薬剤の投与によって、上記細胞における、電位依存性ナトリウムイオンチャネルNaV1.1の活性および/または電位依存性カルシウムイオンチャネルCaV2.1の活性が変化したか否かを判定する工程と
を含むことを特徴とするDravet症候群の治療薬剤のスクリーニング方法。
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