JP2004073058A - 重症乳児ミオクロニー癲癇におけるｓｃｎ１ａの変異 - Google Patents
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Abstract
【課題】重症乳児ミオクロニー癲癇の診断に有用な、神経の電位依存性ナトリウムチャネルα−サブユニットＩ型遺伝子（ＳＣＮ１Ａ）の変異部位の解明。
【解決手段】本発明により重症乳児ミオクロニー癲癇に関与することが見出された神経の電位依存性ナトリウムチャネルα−サブユニットＩ型遺伝子（ＳＣＮ１Ａ）の変異部位は、図１に示されている。上記変異の検出のために使用するプライマー及びプローブ及びそれらを用いて重症乳児ミオクロニー癲癇を診断するためのキット及び方法も提供する。
【選択図】 図１
【解決手段】本発明により重症乳児ミオクロニー癲癇に関与することが見出された神経の電位依存性ナトリウムチャネルα−サブユニットＩ型遺伝子（ＳＣＮ１Ａ）の変異部位は、図１に示されている。上記変異の検出のために使用するプライマー及びプローブ及びそれらを用いて重症乳児ミオクロニー癲癇を診断するためのキット及び方法も提供する。
【選択図】 図１
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、重症乳児ミオクロニー癲癇（ＳＭＥＩ）における神経の電位依存性ナトリウムチャネルα−サブユニットＩ型遺伝子（ＳＣＮ１Ａ）の多頻度に生じる変異、及びその変異を利用したＳＭＥＩの診断に関する。
【０００２】
【従来の技術】
重症乳児ミオクロニー癲癇（ＳＭＥＩ）は、次のような特徴を有する、癲癇症状であり、発症前は正常に成長をつづけるが、誕生後１年迄の間に全身性または片側の熱性間代発作が生じる。ミオクロニー発作の二次的発生およびしばしば部分発作もともなう。ＳＭＥＩは難治性で運動失調および精神機能低下を伴う。家族歴および一卵性双生児での発症表現型の一致の観察から、遺伝的素因も疑われている。
【０００３】
最近、ＳＭＥＩ患者の神経系における電位依存性ナトリウムチャネルα−サブユニットＩ型蛋白質をコードする遺伝子（ＳＣＮ１Ａ）に変異が発見された（Ｃｌａｅｓ Ｌ， ｅｔ ａｌ．，Ｄｅ ｎｏｖｏ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｏｄｉｕｍ−ｃｈａｎｎｅｌ ｇｅｎｅ ＳＣＮＩＡ ｃａｕｓｅ ｓｅｖｅｒｅ ｍｙｏｃｌｏｎｉｃ ｅｐｉｌｅｐｓｙ ｏｆ ｉｎｆａｎｃｙ． Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ２００１， ６８：１３２７−１３３２）。これらの変異は異型接合性で、ｄｅ ｎｏｖｏ であった（４つのフレームシフト、一つはナンセンス、一つはスプライス−ドナー、そして一つのミスセンス）。
【０００４】
ＳＣＮ１Ａの変異は、熱性痙攣を伴う全般てんかんプラス（ＧＥＦＳ＋）の原因でもあることが知られているが、それらは全てミスセンス変異である（ＥｓｃａｙｇＡ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＳＣＮＩＡ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｓｏｄｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌ， ｉｎ ｔｗｏ ｆａｍｉｌｉｅｓ ｗｉｔｈ ＧＥＦＳ＋２． Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２０００， ２４：３４３−３４５； Ｗａｌｌａｃｅ ＲＨ， ｅｔ ａｌ， Ｆｅｂｒｉｌｅ ｓｅｉｚｕｒｅｓ ａｎｄ ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ ｅｐｉｌｅｐｓｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｎａ＋−ｃｈａｎｎｅｌ β１ ｓｕｂｕｎｉｔ ｇｅｎｅ ＳＣＮＩＢ． Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ １９９８， １９：３６６−３７０）。
【０００５】
ＳＭＥＩはＧＥＦＳ＋に比べて症状が重篤であり、的確な診断により病状の経過を予測し、早期に治療計画をたてることが重要である。しかし、両者は症状が似ていることやいずれもＳＣＮ１Ａに変異が見られることなどのため区別が難しく、ＳＭＥＩをＧＥＦＳ＋と区別して正確、迅速かつ容易に診断する方法の開発が望まれている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、日本人の重症乳児ミオクロニー癲癇（ＳＭＥＩ）患者中のＳＣＮ１Ａ遺伝子の新規変異の発見に基づき、ＳＭＥＩの診断のためにプライマーまたはプローブとして用いることができるＤＮＡ、およびそれらを用いた診断方法、さらには該方法に用いる診断用キットを提供する。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、多くのＳＭＥＩ患者中の、神経系における電位依存性ナトリウムチャネルα−サブユニットＩ型遺伝子をコードする遺伝子（ＳＣＮ１Ａ）を分析したところ、ＳＣＮ１Ａ遺伝子中の種々の部位のナンセンス変異、フレームシフト、ミスセンス変異がＳＭＥＩの原因となっていることを見いだした。その変異を後記実施例中の表１に示す。これらの変異は、今までにＧＥＦＳ＋患者のＳＣＮ１Ａ中に報告された変異とは異なるし、また、Ｃｌａｅｓ Ｌ， ｅｔ ａｌにより報告された変異とも異なっている。したがって、ＳＭＥＩであることが疑われる患者の組織、血液等から、ＤＮＡまたはＲＮＡを抽出し、ＳＣＮ１Ａ遺伝子に上記変異のいずれかが存在するかを検出することにより、ＳＭＥＩの新規な診断方法が可能になる。
【０００８】
したがって、本発明はヒトの遺伝子試料から単離及び所望により増幅されたＤＮＡまたはｍＲＮＡであって、配列番号１の塩基配列中において、下記の変異の少なくとも一つを有する塩基配列またはその相補配列からなる単離されたＤＮＡ、またはそれらのＤＮＡに相補する単離されたｍＲＮＡに関する：
（１） １２１３位のＡｒｇのナンセンス変異
（例えば、３６３７のＣ → Ｔ）；
（２） １４０８位のＴｒｐのナンセンス変異
（例えば、４２２３のＧ → Ａ）；
（３） １８０７位からのＭｅｔ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｕを削除する変異
（即ち、５４１９からの１２塩基の欠失）；
（４） エクソン４のスプライス部位の変異
（例えば、ＧＴ → ＡＴ）；
（５） ９５２位のＴｒｐのナンセンス変異
（例えば、２８５５のＧ → Ａ）；
（６） １２８４位のＴｒｐのナンセンス変異
（例えば、３８５２のＧ → Ａ）；
（７） ９４６位のＡｒｇ以後にフレームシフトをおこす変異
（例えば、２８３５のＣの欠失）；
（８） １７７位のＧｌｙ以後にフレームシフトをおこす変異
（例えば、５３０のＧの欠失）；
（９）７３２位のＧｌｎ以後にフレームシフトをおこす変異
（例えば、２１９６への８塩基挿入）；
（１０）１７６５位のＰｈｅのナンセンス変異
（例えば、５２９２へのＴの挿入）；
（１１）１０３位のＳｅｒをＧｌｙに変更する変異
（例えば、３０７のＡ → Ｇ）；
（１２）１６８５位のＡｌａをＡｓｐに変更する変異
（例えば、５０５４のＣ → Ａ）；
（１３）１１２位のＴｈｒをＩｌｅに変更する変異
（例えば３３５のＣ → Ｔ）；
（１４）１２３１位のＳｅｒをＡｒｇに変更する変異
（例えば、３６９３のＴ → Ａ）；
（１５）９８５位のＡｓｎをＩｌｅに変更する変異
（例えば、２９５４のＡ → Ｔ）；
（１６）１８３１位のＰｈｅをＳｅｒに変更する変異
（例えば、５４９２のＴ → Ｃ）；
（１７）２６５位のＧｌｙをＴｒｐに変更する変異
（例えば、７９３のＧ → Ｔ）；
（１８）９６０位のＭｅｔをＶａｌに変更する変異
（例えば、２８７８のＡ → Ｇ）；
（１９）１８１２位のＴｒｐをＧｌｙに変更する変異
（例えば、５４３４のＴ → Ｇ）
【０００９】
トリプレットコドンには縮重が知られているので、上記変異は括弧内に例示した以外の塩基の変異によって生じることもあり、そのような変異も本発明の対象である。
【００１０】
上記のヒトＳＣＮ１Ａ遺伝子の変異情報に基づいて、ＳＭＥＩの素因をもつまたは発症中の発作がＳＭＥＩであると思われる幼児および／または両親の診断を行うことができる。
【００１１】
ＳＣＮ１Ａ遺伝子
診断の一方法として、患者のＳＣＮ１Ａ遺伝子を取り出し、その塩基配列を決定し、（１）〜（１９）の変異が含まれているか調べることが可能である。ＳＣＮ１Ａ遺伝子は、例えばＮａｔ． Ｇｅｎｅｔ １９９８， １９：３６６−３７０ 又はＪ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２００１， ２１：７４８１−７４９０ に記載された方法によって、ヒトの組織または血液から単離することができる。簡単に述べると、ヘパリン処理した血液サンプルからゲノムＤＮＡを抽出する。必要であればＤＮＡをＰＣＲなどの適当な手段により増幅する。ＰＣＲプライマーは、ｃＤＮＡ （ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ． ＡＹ０４３４８４） （配列番号１）及びゲノム配列（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏｓ． ＡＣ０１０１２７及びＡＣ０２１６７３） の比較により決定されたＳＣＮ１Ａの２６のエクソンを全て増幅するよう設計すればよい。例えば、配列番号２及び５９に示すプライマーの対が使用できる。ＰＣＲ産物の塩基配列を分析して、目的の変異を含むＤＮＡであることを確認する。変異解析の方法は、例えば、Ｓｕｇａｗａｒａ Ｔ， Ｍａｚａｋｉ−Ｍｉｙａｚａｋｉ Ｅ， Ｉｔｏ Ｍ， Ｎａｇａｆｕｊｉ Ｈ， Ｆｕｋｕｍａ Ｇ， Ｍｉｔｓｕｄｏｍｅ Ａ， Ｗａｄａ Ｋ， Ｋａｎｅｋｏ Ｓ， Ｈｉｒｏｓｅ Ｓ， Ｙａｍａｋａｗａ Ｋ （２００１） Ｎａｖ１．１ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ Ｃａｕｓｅ Ｆｅｂｒｉｌｅ Ｓｅｉｚｕｒｅｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ａｆｅｂｒｉｌｅ Ｐａｒｔｉａｌ Ｓｅｉｚｕｒｅｓ． Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ５７： ７０３−７０５に記載されている。ヒト組織からのゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡの抽出、そのＰＣＲ増幅及びＰＣＲ産物の配列分析は、いずれも市販のキットおよび／または装置を用いて行うことができる。
【００１２】
ＳＣＮ１Ａ遺伝子は患者の組織または血液からｍＲＮＡを抽出し、それを基にｃＤＮＡライブラリーを作成し、これを例えばＰＣＲで増幅させることによって、ｃＤＮＡとして調製してもよい。ＳＣＮ１ＡのｃＤＮＡ配列は、配列表の配列番号１に示される。
【００１３】
変異領域を増幅させるためのプライマー
ＳＭＥＩの診断は、上記患者から例えば配列番号２ないし５９に示すプライマーの対によって増幅・単離したＳＣＮ１Ａ遺伝子の塩基配列から、あるいはより簡便には、患者から単離したゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから、変異部位を含む領域を直接増幅することができるプライマーを用いて検出することができる。本発明はそのためのプライマーも提供する。
【００１４】
本発明のプライマーは、上記（１）〜（１９）の変異の少なくとも一つの領域に対応する、ヒトＳＣＮ１Ａ遺伝子の領域を含む１０〜１００個の連続した塩基配列またはその相補配列を有するＤＮＡ断片からなる。好ましいプライマーの長さは、約２０ヌクレオチドである。プライマーは必要により標識を結合させて用いることもできる。本発明のプライマーは、市販の核酸合成装置を用いて製造可能である。通常はプライマーは、上記領域を前後に挟んだ１対のＤＮＡ断片からなる。対の一方が変異領域を含んでも含まなくてもよい。プライマー対の一方が変異領域を含む場合、患者のＳＣＮ１Ａ遺伝子に変異が存在する場合にのみ、ＤＮＡの増幅が生じるようにすることができて都合がよい（ＤＮＡ Ｒｅｓ ２００２ Ａｐｒ ３０；９（２）：５９−６２ Ａｃｃｕｒａｃｙ ｏｆ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｆｏｒ ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｂｙ ａ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ−ｂａｓｅｄ ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｔｙｐｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｈｏｒｔ ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ． Ｉｗａｓａｋｉ Ｈ， Ｅｚｕｒａ Ｙ， Ｉｓｈｉｄａ Ｒ， Ｋａｊｉｔａ Ｍ， Ｋｏｄａｉｒａ Ｍ， Ｋｎｉｇｈｔ Ｊ， Ｄａｎｉｅｌ Ｓ， Ｓｈｉ Ｍ， Ｅｍｉ Ｍ．）。
【００１５】
患者組織ＤＮＡの増幅
本発明は、上記プライマーを用いて、配列番号１の塩基配列中において、上記（１）〜（１９）の変異に対応する少なくとも一つの領域を増幅する方法も提供する。本発明の方法は、ＳＭＥＩの素因を有する、またはＳＭＥＩであると思われるヒトの血液または組織試料から、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡをライブラリーまたはＳＣＮ１Ａ遺伝子もしくはその部分領域として用意し、
用意したＤＮＡを鋳型とし、上記プライマー対の少なくとも一つを用いてＤＮＡの増幅を行ない、そして
増幅したＤＮＡの塩基配列を解析して、用いたプライマーに対応する変異が存在するかどうかを調べることからなる。
【００１６】
上記方法の具体的各工程は、よく知られた方法を用いてよい（例えば、ＮＥＵＲＯＬＯＧＹ ２００１； ５７：７０３−７０５を参照）。例えば、増幅の一般的方法はＰＣＲ反応であるが、他の増幅方法も適宜使用できる。
【００１７】
増幅したＤＮＡ中の変異の検出
上記のようにして、増幅したＤＮＡ中の変異の検出は、組織ＤＮＡのＳＮＰｓを検出する方法としてよく知られている方法で行うことができる。
【００１８】
例えば、ＤＮＡシークエンサーを用いて、変異を含むと思われる領域の配列を解読して検出することができる。
増幅したＤＮＡ断片を質量分析して、正常ＤＮＡ断片との質量が変化していることに基づいて検出してもよい。
【００１９】
変異ＤＮＡ断片に特異的にハイブリダイズするプローブのハイブリダイゼーションの有無に基づいて検出することもできる。その場合のプローブは、蛍光標識、放射性標識、酵素標識等の適当な標識により、検出を容易にすることも可能である。また、プローブはＤＮＡチップ上のマイクロアレーとして用いることもできる。
【００２０】
ＰＣＲ−ＳＳＣＰと呼ばれる方法を使用すれば、ＰＣＲ産物を変成させて一本鎖とし、その中のＳＮＰの３次元構造の相違から、変異の有無を検出することができる。
【００２１】
また、最近開発された方法では、用いたプライマーに対応する変異が試料中のＳＣＮ１Ａ遺伝子に存在する場合にのみ、該変異領域のＤＮＡを特異的に増幅することが可能になっている。例えば、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法を利用して、ＰＣＲ増幅が生じた場合に蛍光色を発生させることも可能である。この方法では、上記（１）〜（１９）の変異に対応する全ての組のプライマー対を一度に用い、ＤＮＡの増幅があったときは（１）〜（１９）のいずれかに対応する変異が試料のＳＣＮ１Ａ遺伝子に存在することを一度のテストで突き止めることができる。そのため診断が非常に迅速になる。
【００２２】
診断
本発明の方法により変異を含むＤＮＡの増幅が認められたときは、試料を提供したヒトにＳＭＥＩの素因がある、またはＳＭＥＩであると診断する。そのような診断のためには、使用するプライマー対は上記（１）〜（１９）の変異の複数に対応することが好ましく、より好ましくは（１）〜（１９）の全部の変異に対応する全部の対のプライマーを用いて、変異を有するＤＮＡのみを増幅させる。マイクロアレイ法を用いれば、反応毎に一対のプローブを用いつつ複数対のプライマーによる診断を一度に行うことも可能である。
【００２３】
診断用プローブ
本発明によれば、上記（１） 〜（１９）のいずれか１つの変異を含む１０〜１００の連続した塩基配列からなるＤＮＡまたはその混合物をプローブとして用いて、ＳＭＥＩの診断を行うことも可能である。好ましいプローブの長さは２０である。プローブは、ハイブリダイゼーションの確認を可能にする手段、例えば蛍光等の標識やレポーター遺伝子を付してもよい。さらに、プローブは、遺伝子チップの形式で適当な担体に付着させて置くこともできる。本発明のプローブは、核酸自動合成装置を用いて合成可能である。
【００２４】
プローブによるＳＮＰｓの検出法として、ＡＳＯ法など（ＤＮＡ Ｒｅｓ ２００２ Ａｐｒ ３０；９（２）：５９−６２ Ａｃｃｕｒａｃｙ ｏｆ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｆｏｒ ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｂｙａ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ−ｂａｓｅｄ ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｔｙｐｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｈｏｒｔ ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ． Ｉｗａｓａｋｉ Ｈ， Ｅｚｕｒａ Ｙ， Ｉｓｈｉｄａ Ｒ， Ｋａｊｉｔａ Ｍ， Ｋｏｄａｉｒａ Ｍ， Ｋｎｉｇｈｔ Ｊ， Ｄａｎｉｅｌ Ｓ， Ｓｈｉ Ｍ， Ｅｍｉ Ｍ．）が知られている。ＳＭＥＩの診断を行うためには、患者の組織・血液試料から、前記同様にゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡをライブラリーとしてまたはＳＣＮ１Ａ遺伝子もしくはその部分領域として調製する。必要なら、このＤＮＡを増幅させてもよい。調製したＤＮＡとプローブとが特異的にハイブリダイズするなら、患者のＳＣＮ１Ａ遺伝子は変異を有し、当該患者がＳＭＥＩの素因を有する、またはＳＭＥＩであると判断される。
【００２５】
プローブと試料ＤＮＡのハイブリダイゼーションの条件には、反応の特異性が保たれる限り特別の制限はないが、ある程度ストリンジェントな条件、より好ましくはストリンジェントな条件が好ましい。
【００２６】
ストリンジェントな条件は、塩濃度、有機溶媒（例えば、ホルムアミド）、温度、及びその他の条件によって定義される。すなわち、塩濃度を減じるか、有機溶媒濃度を増加させるか、またはハイブリダイゼーション温度を上昇させることによってストリンジェンシーは増加する。例えば、ストリンジェントな塩濃度は、通常ＮａＣｌ約７５０ｍＭ以下及びクエン酸三ナトリウム約７５ｍＭ以下、より好ましくはＮａＣｌ約５００ｍＭ以下及びクエン酸三ナトリウム約５０ｍＭ以下、最も好ましくはＮａＣｌ約２５０ｍＭ以下及びクエン酸三ナトリウム約２５ｍＭ以下である。
【００２７】
ストリンジェントな有機溶媒濃度は、ホルムアミド約３５％以上、最も好ましくは約５０％以上である。ストリンジェントな温度条件は、約３０℃以上、より好ましくは約３７℃以上、最も好ましくは約４２℃以上である。その他の条件としては、ハイブリダイゼーション時間、洗浄剤（例えば、ＳＤＳ）の濃度、及びキャリアーＤＮＡの存否等であり、これらの条件を組み合わせることによって、様々なストリンジェンシーを設定することができる。一つの好ましい態様としては、７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸三ナトリウム及び１％ＳＤＳの条件で、３０℃の温度によりハイブリダイゼーションを行う。より好ましい態様としては、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭクエン酸三ナトリウム、１％ＳＤＳ、３５％ホルムアミド、１００μｇ ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡの条件で３７℃の温度によりハイブリダイゼーションを行う。最も好ましい態様としては、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、２００μｇ ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡの条件で、４２℃の温度によりハイブリダイゼーションを行う。
【００２８】
また、ハイブリダイゼーション後の洗浄の条件もストリンジェンシーに影響する。この洗浄条件もまた、塩濃度と温度によって定義され、塩濃度の減少と温度の上昇によって洗浄のストリンジェンシーは増加する。例えば、洗浄のためのストリンジェントな塩条件は、好ましくはＮａＣｌ約３０ｍＭ以下及びクエン酸三ナトリウム約３ｍＭ以下、最も好ましくはＮａＣｌ約１５ｍＭ以下及びクエン酸三ナトリウム約１．５ｍＭ以下である。洗浄のためのストリンジェントな温度条件は、約２５℃以上、より好ましくは約４２℃以上、最も好ましくは約６８℃以上である。一つの好ましい態様としては、３０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭクエン酸三ナトリウム及び０．１％ＳＤＳの条件で、２５℃の温度により洗浄を行う。より好ましい態様としては、１５ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウム及び０．１％ＳＤＳの条件で、４２℃の温度により洗浄を行う。最も好ましい態様としては、１５ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウム及び０．１％ＳＤＳの条件で、６８℃の温度により洗浄を行う。
【００２９】
変異部位に対する特異的抗体
ＳＭＥＩの診断は、ＳＭＥＩ患者の変異したＳＣＮ１Ａ遺伝子がコードする変異蛋白質またはその断片に特異的なモノクローナル抗体を用いて行うことも可能である。そのようなモノクローナル抗体は、上記（１） 〜（１９）の変異のいずれか一つを含むヒトＳＣＮ１Ａ遺伝子ＤＮＡまたは当該変異を含むＳＣＮ１Ａ遺伝子ＤＮＡ断片がコードするペプチドを哺乳類動物に投与して、該動物の抗体産生細胞を抽出し、該細胞をミエローマ細胞と融合させ、融合細胞から（１） 〜（１９）のいずれか１つの変異を持つ蛋白質もしくはペプチドに特異的な抗体を産生するハイブリドーマをクローニングし、得られたハイブリドーマを抗体産生条件で培養することにより製造できる。モノクローナル抗体の製造方法はコーラー及びミルシュタインの方法として周知である。
【００３０】
本発明の抗体を用い、免疫化学的検査法（例えば、サンドイッチ法、蛍光標識法、ラジオイムノアッセイ等）により患者の神経組織標本と特異的に反応するか否かに基づいて、患者がＳＭＥＩの素因を有するか否かまたは熱性痙攣がＳＭＥＩの発作であるか否かを診断することが可能である。
【００３１】
診断用キット
本発明は、上記１〜２０種のプライマー対の一対ないし全部の対を含む、患者がＳＭＥＩの素因を有するか否かまたはＳＭＥＩであるか否かを診断するためのキットも提供する。このキットは、プライマー対の他に、組織ＤＮＡの抽出手段、ＤＮＡ希釈用緩衝液、反応容器、陽性対照サンプル、陰性対照サンプル、説明書、パッケージ等を適宜含んでよい。キットはさらに、組織ＤＮＡの増幅のための試薬を含んでもよい。
【００３２】
本発明は、上記（１） 〜（１９）のいずれか１つの変異を含む２０〜１００の連続した塩基配列からなるＤＮＡまたはその混合物をプローブとして含む、患者がＳＭＥＩの素因を有するか否かまたはＳＭＥＩであるか否かを診断するためのキットも提供する。好ましくはプローブは２０種のＤＮＡ断片の混合物として存在し、遺伝子チップを形成するために適当な材料のプレートに付着した状態でキットに含まれるのが好ましい。キットは、プローブの他に、組織ＤＮＡの抽出手段、ＤＮＡ希釈用緩衝液、ハイブリダイゼーションに適切なストリンジェンシーの緩衝液、ハイブリダイゼーションに適切なストリンジェンシーの洗浄液、反応容器、陽性対照サンプル、陰性対照サンプル、説明書、パッケージ等を適宜含んでよい。
【００３３】
本発明は、上記のモノクローナル抗体を含む、患者がＳＭＥＩの素因を有するか否かまたはＳＭＥＩであるか否かを診断するためのキットも提供する。キットは抗体の他に、抗体希釈用緩衝液、反応容器、陽性対照サンプル、陰性対照サンプル、説明書、パッケージ等を適宜含んでよい。
以下に、実施例を記載して本発明をより詳細に説明する。
【００３４】
【実施例】
ＳＣＮ１Ａの変異は、熱性痙攣を伴う全般てんかんプラス（ＧＥＦＳ＋）による全身性発作の原因でもあるが、それらは全てミスセンス変異である。本実施例により、日本人の重症乳児ミオクロニー癲癇（ＳＭＥＩ）患者中のＳＣＮ１Ａの新規変異を調べ、ＳＭＥＩとＧＥＦＳ＋との遺伝子型及び表現型の比較を行った。
【００３５】
患者及び方法
ＳＭＥＩの臨床症状を有する一卵性双生児の対及び相互に無関係な多数の患者の検討を行った。
【００３６】
対象のＳＭＥＩ患者は男児１２名及び女児１１名を含み、年齢は２〜３１歳（平均１５．８歳）であった。痙攣の発症は誕生から１〜１１月目（大部分は３〜１０月目）に生じ、片側間代痙攣または全身性の間代もしくは強直・間代痙攣（ＧＴＣ）であった。患者１２は出産時の軽い窒息の病歴があった、また患者１７は低出生体重児として生まれたが窒息はなかった。全ての患者は（ 患者１２および１７も含めて） 痙攣発症までは正常に発育した。全患者において、痙攣発作は重積またはシリーズとして生じる傾向があり、このことは初期の痙攣で特に顕著であった。神経画像検査では通常は正常または軽度の萎縮が認められた。精神活動の発達は２才以後遅延し、１１名の患者で運動失調が見られた。
【００３７】
家族の病歴は、１１名の患者の親族に熱性痙攣が、２名の患者の親族に癲癇が、そして３名の患者および双子の親族には癲癇と熱性痙攣のいずれもが認められた。
【００３８】
ＥＥＧ（エレクトロ・エンセファログラム）の結果によると、症例のいくつかでは癲癇放電は最初の検査では観察されず、その後に明確になった。大部分の症例で瀰漫性の高振幅４〜７Ｈｚ徐波の背景活動が観察された。光過敏症は４名の患者に認められた。
【００３９】
癲癇症状の経過中、ミオクロニー発作は２３名の患者に、非定型欠神発作は８名の患者に、そして複雑部分発作は１６名の患者に観察された。痙攣発作（ＧＴＣ）は、いずれの抗癲癇薬による最高用量の治療に対しても、効果がなかった。現在、全患者でＧＴＣが持続している。大部分の症例で、ＧＴＣの頻度は１週間〜１月の間隔であった。
【００４０】
これら２３名の患者は、Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｅａｇｕｅ ａｇａｉｎｓｔ Ｅｐｉｌｅｐｓｙ （１９８９） の提唱するＳＭＥＩの基準（Ｅｐｉｌｅｐｓｉａ １９８９， ３０：３８９−３９９）を満たした。患者１２は誕生時の問題を除いて、ＳＭＥＩの定義に当てはまると診断された。
【００４１】
何名かの患者の両親からの血液サンプル並びに１１１名の正常人志願者からの血液サンプルを試験のコントロールに用いた。
統計分析は、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ ｔｅｓｔ および ｏｎｅ−ｗａｙ ｆａｃｔｏｒｉａｌ ＡＮＯＶＡを用いて行った。
【００４２】
試験は、両親または必要な場合は責任者である成人から書面でのインフォームドコンセントを得、さらに、Ｓｈｉｚｕｏｋａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓの倫理委員会およびＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ ｏｆ ＲＩＫＥＮ−ＢＳＩの承認も得た上で行われた。
【００４３】
変異の分析
ＳＣＮ１Ａの変異の分析は、Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ １９９８， １９：３６６−３７０ 及びＪ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００１， ２１：７４８１−７４９０ に記載された方法により行った。簡単に述べると、ゲノムＤＮＡを正常人及び患者のヘパリン処理した血液サンプルから、市販のキット（ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ， Ｑｉａｇｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ） を用いて抽出した。ゲノムＤＮＡをＰｙｒｏｂｅｓｔ （宝酒造） を用いてＰＣＲにより増幅し、配列解析して分析した。ＰＣＲプライマーは、ｃＤＮＡ （ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ． ＡＹ０４３４８４） とゲノム配列（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏｓ． ＡＣ０１０１２７及びＡＣ０２１６７３） との比較により決定された、ＳＣＮ１Ａの２６のコードエクソンを全て増幅するよう設計され、配列番号２及び５９に示す塩基配列を有する。
【００４４】
Ｅｘ １Ｆ： ＴＣＣＴＣＴＡＧＣＴＣＡＴＧＴＴＴＣＡＴ （配列番号２）
Ｅｘ １Ｒ： ＣＣＡＣＣＣＡＣＡＡＡＴＧＴＧＴＴＴＣＡ （配列番号３）
Ｅｘ ２Ｆ： ＧＴＧＡＴＴＧＴＧＣＴＧＧＴＴＴＣＴＣＡ （配列番号４）
Ｅｘ ２Ｒ： ＧＧＣＴＡＡＴＡＴＧＡＣＡＡＡＧＡＴＧＣ （配列番号５）
Ｅｘ ３Ｆ： ＴＣＣＣＴＧＡＡＴＴＴＴＧＧＣＴＡＡＧＣ （配列番号６）
Ｅｘ ３Ｒ： ＧＴＣＣＴＣＴＴＧＣＴＧＣＧＴＡＡＴＴＴ （配列番号７）
Ｅｘ ４Ｆ： ＡＧＧＧＣＴＡＣＧＴＴＴＣＡＴＴＴＧＴＡ （配列番号８）
Ｅｘ ４Ｒ： ＡＣＴＴＡＧＡＣＣＴＴＴＧＴＴＧＴＧＣＴ （配列番号９）
Ｅｘ ５Ｆ： ＣＡＧＡＧＴＣＴＴＧＡＧＡＧＣＴＴＴＧＡ （配列番号１０）
Ｅｘ ５Ｒ： ＴＣＣＡＡＧＧＣＴＧＡＴＡＡＡＧＣＴＴＡ （配列番号１１）
Ｅｘ ６Ｆ： ＡＧＣＧＴＴＧＣＡＡＡＣＡＴＴＣＴＴＧＧ （配列番号１２）
Ｅｘ ６Ｒ： ＣＣＴＧＣＡＡＴＧＴＧＴＧＣＴＡＡＴＣＡ （配列番号１３）
Ｅｘ ７Ｆ： ＴＣＣＴＧＴＣＡＴＴＣＣＴＧＴＣＴＡＴＴ （配列番号１４）
Ｅｘ ７Ｒ： ＡＧＴＴＧＧＣＴＧＴＴＡＴＣＴＴＣＡＧＴ （配列番号１５）
Ｅｘ ８Ｆ： ＴＡＴＧＣＡＧＴＣＡＡＡＡＧＴＴＧＧＧＡ （配列番号１６）
Ｅｘ ８Ｒ： ＡＧＴＣＴＣＧＴＴＴＣＡＡＧＴＴＣＴＧＣ （配列番号１７）
Ｅｘ ９Ｆ： ＧＧＧＴＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＡＣＡＴＡＡ （配列番号１８）
Ｅｘ ９Ｒ： ＡＡＴＴＣＣＴＣＡＴＡＣＡＡＣＣＡＣＣＴ （配列番号１９）
Ｅｘ １０Ｆ： ＧＴＧＡＧＡＴＧＡＴＣＴＴＣＡＧＴＣＡＧ （配列番号２０）
Ｅｘ １０Ｒ： ＣＡＣＣＧＡＧＣＴＧＴＡＧＡＣＴＴＡＣＡ （配列番号２１）
Ｅｘ １１Ｆ： ＣＣＣＡＡＧＧＧＣＴＡＧＡＡＡＣＴＴＴＣ （配列番号２２）
Ｅｘ １１Ｒ： ＣＡＡＧＡＴＧＣＡＧＧＴＧＣＡＴＴＣＡＣ （配列番号２３）
Ｅｘ １２Ｆ： ＴＡＴＣＴＧＣＣＡＴＣＡＣＣＡＡＴＴＧＡ （配列番号２４）
Ｅｘ １２Ｒ： ＡＧＣＴＣＴＴＧＡＡＴＴＡＧＡＣＴＧＴＣ （配列番号２５）
Ｅｘ １３Ｆ： ＴＧＧＧＡＧＧＴＴＴＡＧＡＧＴＡＡＡＣＴ （配列番号２６）
Ｅｘ １３Ｒ： ＴＡＡＴＴＧＣＧＡＴＴＴＴＧＣＡＧＧＧＧ （配列番号２７）
Ｅｘ １４Ｆ： ＴＧＴＧＧＧＡＡＡＡＴＡＧＣＡＴＡＡＧＣ （配列番号２８）
Ｅｘ １４Ｒ： ＧＡＣＡＡＴＧＣＡＡＡＴＧＴＴＡＣＧＧＡ （配列番号２９）
Ｅｘ １５Ｆ： ＡＡＡＡＴＴＡＧＣＣＡＴＧＡＧＣＣＴＧＡＧＡ （配列番号３０）
Ｅｘ １５Ｒ： ＧＣＡＣＴＧＣＴＡＴＡＴＴＧＣＴＧＴＧＴＴＧ （配列番号３１）
Ｅｘ １６−１ ＴＧＴＧＧＴＧＴＴＴＣＣＴＴＣＴＣＡＴＣ （配列番号３２）
Ｅｘ １６−２ ＴＴＴＧＣＴＴＴＣＴＴＣＣＡＧＡＴＣＣＧ （配列番号３３）
Ｅｘ １６−２Ｆ： ＧＧＣＡＧＣＡＧＴＧＴＴＧＡＡＡＡＡＴＡ （配列番号３４）
Ｅｘ １６−２Ｒ： ＡＣＡＧＧＣＡＡＴＡＴＡＡＴＧＣＡＴＧＴ （配列番号３５）
Ｅｘ １７Ｆ： ＴＣＣＣＣＴＴＡＴＴＣＡＡＴＣＴＣＴＣＴ （配列番号３６）
Ｅｘ １７Ｒ： ＴＣＡＡＡＧＣＡＴＧＡＣＡＣＴＡＧＡＣＴ （配列番号３７）
Ｅｘ １８Ｆ： ＴＴＡＧＡＧＡＧＣＴＡＴＧＣＴＡＧＣＡＡ （配列番号３８）
Ｅｘ １８Ｒ： ＡＴＡＧＡＡＧＡＴＡＣＡＡＧＧＴＧＧＧＡ （配列番号３９）
Ｅｘ １９Ｆ： ＴＡＡＣＴＡＣＴＧＴＴＴＣＴＣＴＧＣＣＣ （配列番号４０）
Ｅｘ １９Ｒ： ＣＣＣＴＴＧＴＣＴＴＣＣＡＧＡＡＡＴＧＡ （配列番号４１）
Ｅｘ ２０Ｆ： ＧＣＣＡＡＴＧＡＡＴＴＴＴＴＴＴＣＣＡＣＣＴＴＧ （配列番号４２）
Ｅｘ ２０Ｒ： ＡＧＡＧＧＣＣＴＡＴＴＴＣＴＣＴＴＧＣＡＴ （配列番号４３）
Ｅｘ ２１Ｆ： ＡＡＧＡＡＴＧＧＡＡＡＧＡＣＣＡＧＡＧＡ （配列番号４４）
Ｅｘ ２１Ｒ： ＴＧＧＧＣＴＣＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＡＣＴ （配列番号４５）
Ｅｘ ２２Ｆ： ＡＣＴＧＴＣＴＴＧＧＴＣＣＡＡＡＡＴＣＴＧＴ （配列番号４６）
Ｅｘ ２２Ｒ： ＡＣＣＴＧＴＣＡＣＡＣＴＴＴＴＴＣＣＣＡＡ （配列番号４７）
Ｅｘ ２３Ｆ： ＧＧＣＣＡＡＴＴＴＣＡＧＧＧＡＴＧＴＴＴＴＴ （配列番号４８）
Ｅｘ ２３Ｒ： ＧＧＡＴＡＧＴＧＡＡＴＧＡＣＡＧＡＧＧＡＡＧ （配列番号４９）
Ｅｘ ２４Ｆ： ＴＣＣＴＣＴＡＡＣＴＣＴＴＴＧＣＴＡＣＡ （配列番号５０）
Ｅｘ ２４Ｒ： ＡＧＡＴＧＡＴＧＣＴＣＴＡＣＡＡＧＴＧＡ （配列番号５１）
Ｅｘ ２５Ｒ： ＡＡＡＡＴＣＡＧＧＧＣＣＡＡＴＧＡＣＴＡ （配列番号５２）
Ｅｘ ２５Ｆ： ＧＡＴＴＡＴＣＴＣＴＧＡＴＴＧＣＴＧＧＧ （配列番号５３）
Ｅｘ ２６−１Ｆ： ＡＴＡＴＡＡＣＴＧＧＧＴＴＣＡＧＧＡＣＴ （配列番号５４）
Ｅｘ ２６−１Ｒ： ＣＡＣＡＧＴＣＴＣＣＣＴＴＡＡＣＴＧＡＧ （配列番号５５）
Ｅｘ ２６−２Ｆ： ＡＴＧＴＴＡＡＧＡＧＧＧＡＡＧＴＴＧＧＧ （配列番号５６）
Ｅｘ ２６−２Ｒ： ＴＡＧＴＧＡＴＴＧＧＣＴＧＡＴＡＧＧＡＧ （配列番号５７）
Ｅｘ ２６−３Ｆ： ＣＣＡＡＡＣＡＡＡＣＴＣＣＡＧＣＴＣＡＴ （配列番号５８）
Ｅｘ ２６−３Ｒ： ＧＣＡＣＴＧＡＣＣＴＴＡＡＧＧＡＧＡＴＴ （配列番号５９）
【００４５】
各患者からのＰＣＲ産物は、それぞれダイデオキシターミネーターキットにより直接配列解析し、自動シークエンサー（ｍｏｄｅｌ ＡＢＩ３７００， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ； ＮＪ） で分析した。分析により、大部分のＳＭＥＩ患者はＳＣＮ１Ａ遺伝子に変異が生じていた。
【００４６】
発見された変異を表１に示す。表１において、例えば「ｃ．２１０１Ｃ−＞Ｔ， Ｒ７０１Ｘ」と記載されている変異は、ｃＤＮＡの２１０１位のシトシン（Ｃ）がチミン（Ｔ）に変化した結果７０１番目のアルギニンコドンがナンセンス変異したことを示し、「ｄｅｌ」は塩基の欠失を意味し、「ｆｓ」はフレームシフトを意味し、「ｉｎｓ」は塩基の挿入を意味する。
【００４７】
結果
ＳＭＥＩの臨床症状を有する患者のＳＣＮ１Ａ遺伝子の全コードエクソンおよびスプライス部位について、変異分析を行った。ＳＣＮ１Ａ遺伝子中に合計２０の異型接合変異が検出され、つまり４名の患者の４つのフレームシフト変異、５名の患者の４つのナンセンス変異、９名の患者の９つのミスセンス変異および２名の患者の２つの他の変異であった。各変異のＳＣＮ１Ａ遺伝子中の位置は、図１に示す（図１には、本発明と平行して行った小児難治大発作てんかんＩＣＥＧＴＣの臨床症状を有する患者のＳＣＮ１Ａ遺伝子の変異も示されている）。
【００４８】
上記４つのフレームシフト変異は、１塩基挿入（患者１１のｃ．５２９２ｉｎｓＴ）、８塩基挿入（患者１０のｃ．２１９６−２２０３ｉｎｓＣＡＣＣＣＴＧＴ）および二種の１塩基欠失（患者８のｃ．２８３５ｄｅｌＣおよび患者９のｃ．５３０ｄｅｌＧ）を含み、遺伝子の途中に停止コドンを生じていた（患者１１のＦ１７６５ｆｓＸ１７９４、患者１０のＱ７３２ｆｓＸ７４９、患者８の９４６ＲｆｓＸ９５３、および患者９のＧ１７７ ｆｓＸ１８０）。
【００４９】
上記４つのナンセンス変異は、患者１および２の ｃ．３６３７Ｃ−＞Ｔ， Ｒ１２１３Ｘ 、患者３の ｃ．４２２３Ｇ−＞Ａ， Ｗ１４０８Ｘ 、患者６の ｃ．２８５５Ｇ−＞Ａ， Ｗ９５２Ｘおよび患者７の ｃ．３８５２Ｇ−＞Ａ， Ｗ１２８４Ｘ を含み、これらもまた、チャネルタンパク質の短縮を生じた。
【００５０】
エクソン４スプライス部位の変異（ＧＴ−＞ＡＴ）は、スプライシングの隠蔽またはエクソンのスキッピングをもたらし、チャネルを変化させたと思われる。１２塩基欠失（患者４のｃ．５４１９ｄｅｌＡＴＧＴＴＣＴＡＴＧＡＧ， １８０７ｄｅｌＭＦＹＥ）はＣ−末端領域に存在した。
【００５１】
上記ミスセンス変異のうち９つは、患者１２のｃ．３０７Ａ−＞Ｇ， Ｓ１０３Ｇ、患者１３のｃ．５０５４Ｃ−＞Ａ， Ａ１６８５Ｄ、患者１４のｃ．３３５Ｃ−＞Ｔ， Ｔ１１２Ｉ、患者１５のｃ．３６９３Ｔ−＞Ａ， Ｓ１２３１Ｒ、患者１６のｃ．２９５４Ａ−＞Ｔ， Ｎ９８５Ｉ、患者１７のｃ．５４９２Ｔ−＞Ｃ， Ｆ１８３１Ｓ、患者１８のｃ．７９３Ｇ−＞Ｔ， Ｇ２６５Ｗ、患者１９のｃ．２８７８Ａ−＞Ｇ， Ｍ９６０Ｖおよび患者２０のｃ．５４３４Ｔ−＞Ｇ， Ｗ１８１２Ｇを含み、コントロール集団（ｎ＝９３ないし１１１）には存在しないアミノ酸配列をもたらした。しかし、ミスセンス変異のうち、患者９、１１、１２、２０および２１で検出された変異（ｃ．３１９９Ａ−＞Ｇ， Ｔ１０６７Ａ）は、１０３名のコントロール集団の２０人の異型接合および２人の同型接合の個体にも存在するアミノ酸配列を生じた。このミスセンス変異では、アミノ酸はかなり保存的であった。
【００５２】
患者２２および２３では、ＳＣＮ１Ａ遺伝子のコード領域に変異は観察されなかった。
患者１、２、８、１３、１８および２０の両親は、正常対立遺伝子を有しており、これらの患者の変異がｄｅ ｎｏｖｏであることを示唆した。
【００５３】
上記結果をまとめると、２３名のＳＭＥＩ患者の５名はナンセンス変異を、２名はフレームシフト変異を、２名はフレームシフト変異とミスセンス変異を、１０名はミスセンス変異を、２名はそれ以外の変異を有し、そして２名には変異が見られなかった。本発明と平行して行ったＩＣＥＧＴＣ患者の調査では、１０名のうち、７名はミスセンス変異を有し、そして３名には変異が見られなかった。表現型および遺伝型の関連についてみると、ナンセンス変異およびフレームシフト変異は、ＳＭＥＩ患者のみに見られた。これに対して、ＩＣＥＧＴＣ患者では変異が存在してもミスセンス変異のみであった。
【００５４】
【表１】
【００５５】
考察
本発明者らは、以前、ナンセンス変異およびフレームシフト変異がＳＭＥＩの主な遺伝子型であることを報告した（Ｓｕｇａｗａｒａ ｅｔ ａｌ， Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２００２； ５８ｓ： １１２２−４ ）。本発明によれば、ＳＭＥＩは他にもミスセンス変異および他のタイプの変異遺伝子型変異として生じることが判明した。しかし、フレームシフト変異およびナンセンス変異はＳＭＥＩ患者にみられる主な異常であり、以前の報告と合わせると、３９名のＳＭＥＩ患者のうちフレームシフト変異の患者が７名およびナンセンス変異の患者が１２名であった。そのうち、コントロール集団にもみられたミスセンス変異（ｃ．３１９９Ａ−＞Ｇ， Ｔ０１６７Ａ） は、疾患に無関係の良性変異であり、以下の考察からは除外する。残りの１１名のミスセンス変異はＳＭＥＩの病因に関連すると考えられる。本発明の研究では３名、以前の研究では４名のＳＭＥＩ患者にＳＣＮ１Ａ遺伝子の変異がみられなかった。しかし、それらの患者において、プロモーターの変異またはＲＮＡ転写のスプライシングに影響するイントロン配列内の変異の可能性もあり、ＳＣＮ１Ａ遺伝子が変異している可能性は排除できない。あるいは、ＳＣＮ１Ａ以外の遺伝子の変異が原因である可能性もあり、例えば、Ｈａｒｋｉｎ ｅｔ ａｌは、ＧＡＢＡＡ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇ２サブユニット遺伝子の変異を示唆している（Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ２００２； ７０： ５３０−６）。
【００５６】
本発明では、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の異なる変異または無変異がＳＭＥＩに異なる臨床症状を生じるかも検討した。フレームシフト変異、ナンセンス変異、ミスセンス変異および無変異患者の、大発作の発症平均年齢は、それぞれ１０．７月、１６月、２５月および１７．９月であった。小発作の発症は、フレームシフト変異の場合に、ミスセンス変異より早期に生じる傾向があった（ｐ＝０．０４８９）。痙攣発作の頻度はミスセンス変異の患者ではナンセンス変異の患者に比べて若干少ない傾向があった（ｐ＝０．０６８３）。詳しくは、ＧＴＣが週１回以上生じた患者の比率は、フレームシフト変異患者では５７．１％、ナンセンス変異患者では６６．７％、ミスセンス変異患者では２７．３％、そして無変異の患者では５７．１％であった。このように、臨床症状における相違はあまりなかったが、症例が増えれば違いが明確になる可能性もある。
【００５７】
ＳＭＥＩとＩＣＥＧＴＣとの区別
本発明と平行して小児難治大発作てんかん（ＩＣＥＧＴＣ）の患者も調査した。ＩＣＥＧＴＣの患者も主な発作症状として、全身性強直間代発作（ＧＴＣ）を示す。ＳＭＥＩ患者とＩＣＥＧＴＣ患者の間に、発症年齢、性差、家族歴、神経学的異常、ＥＥＧ所見（エレクトロ・エンセファログラム）、および臨床経過についての差異はなかった。両疾患は、表現型を微妙に異にする連続症状であることも考えられる。
【００５８】
本発明および本発明者らの以前の研究にて行った分子遺伝学分析の結果では、両疾患のＳＣＮ１Ａ遺伝子に７０〜８２％の高率で変異が認められ、ＳＭＥＩではフレームシフト変異またはナンセンス変異が、そしてミスセンス変異は両疾患に認められた。したがって、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の変異が、これらの疾患における激しい癲癇発作症状に絶対的とは言えないまでも、重要な役割を担うようであり、そしてこれら二種の疾患の遺伝型上の関連を示唆している。表現型の関連を調べる前に、フレームシフト変異、ナンセンス変異、およびミスセンス変異の遺伝子型の相違が、生理学的に異なる影響を及ぼすか調べる必要がある。
【００５９】
ＳＭＥＩとＧＥＦＳ＋との関連
本発明で調べた癲癇の共通の特徴は、発熱が発作の引金になることであり、これはＧＥＦＳ＋においても特徴的である。したがって、本発明の研究は、発熱による発作の危険性増大はＳＣＮ１Ａ遺伝子の変異を示唆するのではないかとの、一般に受け入れられている仮説を確認した。ある研究者は、ＳＭＥＩがＧＥＦＳ＋の最も重症型であると仮定している（Ｓｃｈｅｆｆｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｂｒａｉｎ Ｄｅｖ ２００１； ２３： ７４９−５６； Ｖｅｇｇｉｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ， Ｅｐｉｌｅｐｔｉｃ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ２００１； ３： ２９−３２）。本発明者らによると、これまで調べたＳＭＥＩ患者の変異はｄｅ ｎｏｖｏであり、フレームシフト変異およびナンセンス変異を含んでいる。このことは、ＧＥＦＳ＋のスペクトルに関する報告とは異なっている（Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ， Ｅｐｉｌｅｐｓｙ Ｒｅｓ ２００２； ４８： １５−２３）。
【００６０】
しかしながら、本発明と平行して行った研究で、ＩＣＥＧＴＣの２名の子供の母親がその子供と同じミスセンス変異をＳＣＮ１Ａ遺伝子に有することが見いだされた。２名の母親は熱性痙攣および熱性痙攣にひきつづく無熱性発作を有し、ＧＥＦＳ＋とみなされた。このように、ＩＣＥＧＴＣをＧＥＦＳ＋家系と関連させた報告は初めてであり、ＩＣＥＧＴＣタイプの癲癇がＧＥＦＳ＋スペトクルの最も重症の形であることを示唆している。このことが、ＳＭＥＩにも当てはまるかは、さらに多くの患者およびその家族の変異を観察する必要がある。生理学的研究により、これらの重大な小児の難病およびそのＧＥＦＳ＋との関連のさらに十分な理解をもたらすことが期待される。
【００６１】
ＧＥＦＳ＋においてはＳＣＮ２Ａ中の変異が関与することが報告されているので（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００１， ９８：６３８４−６３８９） 、本発明者らはＳＣＮ２Ａのコード領域も分析した。これら４人（患者２、５、８及び９）のＳＭＥＩ患者のＳＣＮ２Ａコード領域には、変異は検出されなかった。
【００６２】
ＳＣＮ１Ａ中の変異及び患者の詳細な臨床症状は、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙのウェブサイト（ｇｏ ｔｏ ｗｗｗ．ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．ｏｒｇ） に記載した。比較の便宜のため他の文献と一致させた番号表示も含めてある。
【００６３】
【発明の効果】
本発明は、ＳＭＥＩの診断及び予後診断の直接的進歩をもたらし、この難病の新治療法の開発に多大な貢献をする。また、本発明は、ＳＭＥＩの分子病理学的な原因解明のための、短縮ＮａＶ１．１（電位依存性ナトリウムチャネルα−サブユニットＩ型）の機能及び動物モデルによる研究の突破口になると期待される。
【００６４】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、電位依存性ナトリウムチャネルα−サブユニットＩ型（ＮａＶ１．１）中の、変異部位いくつかを示す模式図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、重症乳児ミオクロニー癲癇（ＳＭＥＩ）における神経の電位依存性ナトリウムチャネルα−サブユニットＩ型遺伝子（ＳＣＮ１Ａ）の多頻度に生じる変異、及びその変異を利用したＳＭＥＩの診断に関する。
【０００２】
【従来の技術】
重症乳児ミオクロニー癲癇（ＳＭＥＩ）は、次のような特徴を有する、癲癇症状であり、発症前は正常に成長をつづけるが、誕生後１年迄の間に全身性または片側の熱性間代発作が生じる。ミオクロニー発作の二次的発生およびしばしば部分発作もともなう。ＳＭＥＩは難治性で運動失調および精神機能低下を伴う。家族歴および一卵性双生児での発症表現型の一致の観察から、遺伝的素因も疑われている。
【０００３】
最近、ＳＭＥＩ患者の神経系における電位依存性ナトリウムチャネルα−サブユニットＩ型蛋白質をコードする遺伝子（ＳＣＮ１Ａ）に変異が発見された（Ｃｌａｅｓ Ｌ， ｅｔ ａｌ．，Ｄｅ ｎｏｖｏ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｏｄｉｕｍ−ｃｈａｎｎｅｌ ｇｅｎｅ ＳＣＮＩＡ ｃａｕｓｅ ｓｅｖｅｒｅ ｍｙｏｃｌｏｎｉｃ ｅｐｉｌｅｐｓｙ ｏｆ ｉｎｆａｎｃｙ． Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ２００１， ６８：１３２７−１３３２）。これらの変異は異型接合性で、ｄｅ ｎｏｖｏ であった（４つのフレームシフト、一つはナンセンス、一つはスプライス−ドナー、そして一つのミスセンス）。
【０００４】
ＳＣＮ１Ａの変異は、熱性痙攣を伴う全般てんかんプラス（ＧＥＦＳ＋）の原因でもあることが知られているが、それらは全てミスセンス変異である（ＥｓｃａｙｇＡ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＳＣＮＩＡ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｓｏｄｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌ， ｉｎ ｔｗｏ ｆａｍｉｌｉｅｓ ｗｉｔｈ ＧＥＦＳ＋２． Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２０００， ２４：３４３−３４５； Ｗａｌｌａｃｅ ＲＨ， ｅｔ ａｌ， Ｆｅｂｒｉｌｅ ｓｅｉｚｕｒｅｓ ａｎｄ ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ ｅｐｉｌｅｐｓｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｎａ＋−ｃｈａｎｎｅｌ β１ ｓｕｂｕｎｉｔ ｇｅｎｅ ＳＣＮＩＢ． Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ １９９８， １９：３６６−３７０）。
【０００５】
ＳＭＥＩはＧＥＦＳ＋に比べて症状が重篤であり、的確な診断により病状の経過を予測し、早期に治療計画をたてることが重要である。しかし、両者は症状が似ていることやいずれもＳＣＮ１Ａに変異が見られることなどのため区別が難しく、ＳＭＥＩをＧＥＦＳ＋と区別して正確、迅速かつ容易に診断する方法の開発が望まれている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、日本人の重症乳児ミオクロニー癲癇（ＳＭＥＩ）患者中のＳＣＮ１Ａ遺伝子の新規変異の発見に基づき、ＳＭＥＩの診断のためにプライマーまたはプローブとして用いることができるＤＮＡ、およびそれらを用いた診断方法、さらには該方法に用いる診断用キットを提供する。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、多くのＳＭＥＩ患者中の、神経系における電位依存性ナトリウムチャネルα−サブユニットＩ型遺伝子をコードする遺伝子（ＳＣＮ１Ａ）を分析したところ、ＳＣＮ１Ａ遺伝子中の種々の部位のナンセンス変異、フレームシフト、ミスセンス変異がＳＭＥＩの原因となっていることを見いだした。その変異を後記実施例中の表１に示す。これらの変異は、今までにＧＥＦＳ＋患者のＳＣＮ１Ａ中に報告された変異とは異なるし、また、Ｃｌａｅｓ Ｌ， ｅｔ ａｌにより報告された変異とも異なっている。したがって、ＳＭＥＩであることが疑われる患者の組織、血液等から、ＤＮＡまたはＲＮＡを抽出し、ＳＣＮ１Ａ遺伝子に上記変異のいずれかが存在するかを検出することにより、ＳＭＥＩの新規な診断方法が可能になる。
【０００８】
したがって、本発明はヒトの遺伝子試料から単離及び所望により増幅されたＤＮＡまたはｍＲＮＡであって、配列番号１の塩基配列中において、下記の変異の少なくとも一つを有する塩基配列またはその相補配列からなる単離されたＤＮＡ、またはそれらのＤＮＡに相補する単離されたｍＲＮＡに関する：
（１） １２１３位のＡｒｇのナンセンス変異
（例えば、３６３７のＣ → Ｔ）；
（２） １４０８位のＴｒｐのナンセンス変異
（例えば、４２２３のＧ → Ａ）；
（３） １８０７位からのＭｅｔ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｕを削除する変異
（即ち、５４１９からの１２塩基の欠失）；
（４） エクソン４のスプライス部位の変異
（例えば、ＧＴ → ＡＴ）；
（５） ９５２位のＴｒｐのナンセンス変異
（例えば、２８５５のＧ → Ａ）；
（６） １２８４位のＴｒｐのナンセンス変異
（例えば、３８５２のＧ → Ａ）；
（７） ９４６位のＡｒｇ以後にフレームシフトをおこす変異
（例えば、２８３５のＣの欠失）；
（８） １７７位のＧｌｙ以後にフレームシフトをおこす変異
（例えば、５３０のＧの欠失）；
（９）７３２位のＧｌｎ以後にフレームシフトをおこす変異
（例えば、２１９６への８塩基挿入）；
（１０）１７６５位のＰｈｅのナンセンス変異
（例えば、５２９２へのＴの挿入）；
（１１）１０３位のＳｅｒをＧｌｙに変更する変異
（例えば、３０７のＡ → Ｇ）；
（１２）１６８５位のＡｌａをＡｓｐに変更する変異
（例えば、５０５４のＣ → Ａ）；
（１３）１１２位のＴｈｒをＩｌｅに変更する変異
（例えば３３５のＣ → Ｔ）；
（１４）１２３１位のＳｅｒをＡｒｇに変更する変異
（例えば、３６９３のＴ → Ａ）；
（１５）９８５位のＡｓｎをＩｌｅに変更する変異
（例えば、２９５４のＡ → Ｔ）；
（１６）１８３１位のＰｈｅをＳｅｒに変更する変異
（例えば、５４９２のＴ → Ｃ）；
（１７）２６５位のＧｌｙをＴｒｐに変更する変異
（例えば、７９３のＧ → Ｔ）；
（１８）９６０位のＭｅｔをＶａｌに変更する変異
（例えば、２８７８のＡ → Ｇ）；
（１９）１８１２位のＴｒｐをＧｌｙに変更する変異
（例えば、５４３４のＴ → Ｇ）
【０００９】
トリプレットコドンには縮重が知られているので、上記変異は括弧内に例示した以外の塩基の変異によって生じることもあり、そのような変異も本発明の対象である。
【００１０】
上記のヒトＳＣＮ１Ａ遺伝子の変異情報に基づいて、ＳＭＥＩの素因をもつまたは発症中の発作がＳＭＥＩであると思われる幼児および／または両親の診断を行うことができる。
【００１１】
ＳＣＮ１Ａ遺伝子
診断の一方法として、患者のＳＣＮ１Ａ遺伝子を取り出し、その塩基配列を決定し、（１）〜（１９）の変異が含まれているか調べることが可能である。ＳＣＮ１Ａ遺伝子は、例えばＮａｔ． Ｇｅｎｅｔ １９９８， １９：３６６−３７０ 又はＪ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２００１， ２１：７４８１−７４９０ に記載された方法によって、ヒトの組織または血液から単離することができる。簡単に述べると、ヘパリン処理した血液サンプルからゲノムＤＮＡを抽出する。必要であればＤＮＡをＰＣＲなどの適当な手段により増幅する。ＰＣＲプライマーは、ｃＤＮＡ （ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ． ＡＹ０４３４８４） （配列番号１）及びゲノム配列（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏｓ． ＡＣ０１０１２７及びＡＣ０２１６７３） の比較により決定されたＳＣＮ１Ａの２６のエクソンを全て増幅するよう設計すればよい。例えば、配列番号２及び５９に示すプライマーの対が使用できる。ＰＣＲ産物の塩基配列を分析して、目的の変異を含むＤＮＡであることを確認する。変異解析の方法は、例えば、Ｓｕｇａｗａｒａ Ｔ， Ｍａｚａｋｉ−Ｍｉｙａｚａｋｉ Ｅ， Ｉｔｏ Ｍ， Ｎａｇａｆｕｊｉ Ｈ， Ｆｕｋｕｍａ Ｇ， Ｍｉｔｓｕｄｏｍｅ Ａ， Ｗａｄａ Ｋ， Ｋａｎｅｋｏ Ｓ， Ｈｉｒｏｓｅ Ｓ， Ｙａｍａｋａｗａ Ｋ （２００１） Ｎａｖ１．１ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ Ｃａｕｓｅ Ｆｅｂｒｉｌｅ Ｓｅｉｚｕｒｅｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ａｆｅｂｒｉｌｅ Ｐａｒｔｉａｌ Ｓｅｉｚｕｒｅｓ． Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ５７： ７０３−７０５に記載されている。ヒト組織からのゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡの抽出、そのＰＣＲ増幅及びＰＣＲ産物の配列分析は、いずれも市販のキットおよび／または装置を用いて行うことができる。
【００１２】
ＳＣＮ１Ａ遺伝子は患者の組織または血液からｍＲＮＡを抽出し、それを基にｃＤＮＡライブラリーを作成し、これを例えばＰＣＲで増幅させることによって、ｃＤＮＡとして調製してもよい。ＳＣＮ１ＡのｃＤＮＡ配列は、配列表の配列番号１に示される。
【００１３】
変異領域を増幅させるためのプライマー
ＳＭＥＩの診断は、上記患者から例えば配列番号２ないし５９に示すプライマーの対によって増幅・単離したＳＣＮ１Ａ遺伝子の塩基配列から、あるいはより簡便には、患者から単離したゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから、変異部位を含む領域を直接増幅することができるプライマーを用いて検出することができる。本発明はそのためのプライマーも提供する。
【００１４】
本発明のプライマーは、上記（１）〜（１９）の変異の少なくとも一つの領域に対応する、ヒトＳＣＮ１Ａ遺伝子の領域を含む１０〜１００個の連続した塩基配列またはその相補配列を有するＤＮＡ断片からなる。好ましいプライマーの長さは、約２０ヌクレオチドである。プライマーは必要により標識を結合させて用いることもできる。本発明のプライマーは、市販の核酸合成装置を用いて製造可能である。通常はプライマーは、上記領域を前後に挟んだ１対のＤＮＡ断片からなる。対の一方が変異領域を含んでも含まなくてもよい。プライマー対の一方が変異領域を含む場合、患者のＳＣＮ１Ａ遺伝子に変異が存在する場合にのみ、ＤＮＡの増幅が生じるようにすることができて都合がよい（ＤＮＡ Ｒｅｓ ２００２ Ａｐｒ ３０；９（２）：５９−６２ Ａｃｃｕｒａｃｙ ｏｆ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｆｏｒ ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｂｙ ａ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ−ｂａｓｅｄ ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｔｙｐｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｈｏｒｔ ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ． Ｉｗａｓａｋｉ Ｈ， Ｅｚｕｒａ Ｙ， Ｉｓｈｉｄａ Ｒ， Ｋａｊｉｔａ Ｍ， Ｋｏｄａｉｒａ Ｍ， Ｋｎｉｇｈｔ Ｊ， Ｄａｎｉｅｌ Ｓ， Ｓｈｉ Ｍ， Ｅｍｉ Ｍ．）。
【００１５】
患者組織ＤＮＡの増幅
本発明は、上記プライマーを用いて、配列番号１の塩基配列中において、上記（１）〜（１９）の変異に対応する少なくとも一つの領域を増幅する方法も提供する。本発明の方法は、ＳＭＥＩの素因を有する、またはＳＭＥＩであると思われるヒトの血液または組織試料から、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡをライブラリーまたはＳＣＮ１Ａ遺伝子もしくはその部分領域として用意し、
用意したＤＮＡを鋳型とし、上記プライマー対の少なくとも一つを用いてＤＮＡの増幅を行ない、そして
増幅したＤＮＡの塩基配列を解析して、用いたプライマーに対応する変異が存在するかどうかを調べることからなる。
【００１６】
上記方法の具体的各工程は、よく知られた方法を用いてよい（例えば、ＮＥＵＲＯＬＯＧＹ ２００１； ５７：７０３−７０５を参照）。例えば、増幅の一般的方法はＰＣＲ反応であるが、他の増幅方法も適宜使用できる。
【００１７】
増幅したＤＮＡ中の変異の検出
上記のようにして、増幅したＤＮＡ中の変異の検出は、組織ＤＮＡのＳＮＰｓを検出する方法としてよく知られている方法で行うことができる。
【００１８】
例えば、ＤＮＡシークエンサーを用いて、変異を含むと思われる領域の配列を解読して検出することができる。
増幅したＤＮＡ断片を質量分析して、正常ＤＮＡ断片との質量が変化していることに基づいて検出してもよい。
【００１９】
変異ＤＮＡ断片に特異的にハイブリダイズするプローブのハイブリダイゼーションの有無に基づいて検出することもできる。その場合のプローブは、蛍光標識、放射性標識、酵素標識等の適当な標識により、検出を容易にすることも可能である。また、プローブはＤＮＡチップ上のマイクロアレーとして用いることもできる。
【００２０】
ＰＣＲ−ＳＳＣＰと呼ばれる方法を使用すれば、ＰＣＲ産物を変成させて一本鎖とし、その中のＳＮＰの３次元構造の相違から、変異の有無を検出することができる。
【００２１】
また、最近開発された方法では、用いたプライマーに対応する変異が試料中のＳＣＮ１Ａ遺伝子に存在する場合にのみ、該変異領域のＤＮＡを特異的に増幅することが可能になっている。例えば、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法を利用して、ＰＣＲ増幅が生じた場合に蛍光色を発生させることも可能である。この方法では、上記（１）〜（１９）の変異に対応する全ての組のプライマー対を一度に用い、ＤＮＡの増幅があったときは（１）〜（１９）のいずれかに対応する変異が試料のＳＣＮ１Ａ遺伝子に存在することを一度のテストで突き止めることができる。そのため診断が非常に迅速になる。
【００２２】
診断
本発明の方法により変異を含むＤＮＡの増幅が認められたときは、試料を提供したヒトにＳＭＥＩの素因がある、またはＳＭＥＩであると診断する。そのような診断のためには、使用するプライマー対は上記（１）〜（１９）の変異の複数に対応することが好ましく、より好ましくは（１）〜（１９）の全部の変異に対応する全部の対のプライマーを用いて、変異を有するＤＮＡのみを増幅させる。マイクロアレイ法を用いれば、反応毎に一対のプローブを用いつつ複数対のプライマーによる診断を一度に行うことも可能である。
【００２３】
診断用プローブ
本発明によれば、上記（１） 〜（１９）のいずれか１つの変異を含む１０〜１００の連続した塩基配列からなるＤＮＡまたはその混合物をプローブとして用いて、ＳＭＥＩの診断を行うことも可能である。好ましいプローブの長さは２０である。プローブは、ハイブリダイゼーションの確認を可能にする手段、例えば蛍光等の標識やレポーター遺伝子を付してもよい。さらに、プローブは、遺伝子チップの形式で適当な担体に付着させて置くこともできる。本発明のプローブは、核酸自動合成装置を用いて合成可能である。
【００２４】
プローブによるＳＮＰｓの検出法として、ＡＳＯ法など（ＤＮＡ Ｒｅｓ ２００２ Ａｐｒ ３０；９（２）：５９−６２ Ａｃｃｕｒａｃｙ ｏｆ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｆｏｒ ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｂｙａ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ−ｂａｓｅｄ ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｔｙｐｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｈｏｒｔ ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ． Ｉｗａｓａｋｉ Ｈ， Ｅｚｕｒａ Ｙ， Ｉｓｈｉｄａ Ｒ， Ｋａｊｉｔａ Ｍ， Ｋｏｄａｉｒａ Ｍ， Ｋｎｉｇｈｔ Ｊ， Ｄａｎｉｅｌ Ｓ， Ｓｈｉ Ｍ， Ｅｍｉ Ｍ．）が知られている。ＳＭＥＩの診断を行うためには、患者の組織・血液試料から、前記同様にゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡをライブラリーとしてまたはＳＣＮ１Ａ遺伝子もしくはその部分領域として調製する。必要なら、このＤＮＡを増幅させてもよい。調製したＤＮＡとプローブとが特異的にハイブリダイズするなら、患者のＳＣＮ１Ａ遺伝子は変異を有し、当該患者がＳＭＥＩの素因を有する、またはＳＭＥＩであると判断される。
【００２５】
プローブと試料ＤＮＡのハイブリダイゼーションの条件には、反応の特異性が保たれる限り特別の制限はないが、ある程度ストリンジェントな条件、より好ましくはストリンジェントな条件が好ましい。
【００２６】
ストリンジェントな条件は、塩濃度、有機溶媒（例えば、ホルムアミド）、温度、及びその他の条件によって定義される。すなわち、塩濃度を減じるか、有機溶媒濃度を増加させるか、またはハイブリダイゼーション温度を上昇させることによってストリンジェンシーは増加する。例えば、ストリンジェントな塩濃度は、通常ＮａＣｌ約７５０ｍＭ以下及びクエン酸三ナトリウム約７５ｍＭ以下、より好ましくはＮａＣｌ約５００ｍＭ以下及びクエン酸三ナトリウム約５０ｍＭ以下、最も好ましくはＮａＣｌ約２５０ｍＭ以下及びクエン酸三ナトリウム約２５ｍＭ以下である。
【００２７】
ストリンジェントな有機溶媒濃度は、ホルムアミド約３５％以上、最も好ましくは約５０％以上である。ストリンジェントな温度条件は、約３０℃以上、より好ましくは約３７℃以上、最も好ましくは約４２℃以上である。その他の条件としては、ハイブリダイゼーション時間、洗浄剤（例えば、ＳＤＳ）の濃度、及びキャリアーＤＮＡの存否等であり、これらの条件を組み合わせることによって、様々なストリンジェンシーを設定することができる。一つの好ましい態様としては、７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸三ナトリウム及び１％ＳＤＳの条件で、３０℃の温度によりハイブリダイゼーションを行う。より好ましい態様としては、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭクエン酸三ナトリウム、１％ＳＤＳ、３５％ホルムアミド、１００μｇ ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡの条件で３７℃の温度によりハイブリダイゼーションを行う。最も好ましい態様としては、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、２００μｇ ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡの条件で、４２℃の温度によりハイブリダイゼーションを行う。
【００２８】
また、ハイブリダイゼーション後の洗浄の条件もストリンジェンシーに影響する。この洗浄条件もまた、塩濃度と温度によって定義され、塩濃度の減少と温度の上昇によって洗浄のストリンジェンシーは増加する。例えば、洗浄のためのストリンジェントな塩条件は、好ましくはＮａＣｌ約３０ｍＭ以下及びクエン酸三ナトリウム約３ｍＭ以下、最も好ましくはＮａＣｌ約１５ｍＭ以下及びクエン酸三ナトリウム約１．５ｍＭ以下である。洗浄のためのストリンジェントな温度条件は、約２５℃以上、より好ましくは約４２℃以上、最も好ましくは約６８℃以上である。一つの好ましい態様としては、３０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭクエン酸三ナトリウム及び０．１％ＳＤＳの条件で、２５℃の温度により洗浄を行う。より好ましい態様としては、１５ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウム及び０．１％ＳＤＳの条件で、４２℃の温度により洗浄を行う。最も好ましい態様としては、１５ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウム及び０．１％ＳＤＳの条件で、６８℃の温度により洗浄を行う。
【００２９】
変異部位に対する特異的抗体
ＳＭＥＩの診断は、ＳＭＥＩ患者の変異したＳＣＮ１Ａ遺伝子がコードする変異蛋白質またはその断片に特異的なモノクローナル抗体を用いて行うことも可能である。そのようなモノクローナル抗体は、上記（１） 〜（１９）の変異のいずれか一つを含むヒトＳＣＮ１Ａ遺伝子ＤＮＡまたは当該変異を含むＳＣＮ１Ａ遺伝子ＤＮＡ断片がコードするペプチドを哺乳類動物に投与して、該動物の抗体産生細胞を抽出し、該細胞をミエローマ細胞と融合させ、融合細胞から（１） 〜（１９）のいずれか１つの変異を持つ蛋白質もしくはペプチドに特異的な抗体を産生するハイブリドーマをクローニングし、得られたハイブリドーマを抗体産生条件で培養することにより製造できる。モノクローナル抗体の製造方法はコーラー及びミルシュタインの方法として周知である。
【００３０】
本発明の抗体を用い、免疫化学的検査法（例えば、サンドイッチ法、蛍光標識法、ラジオイムノアッセイ等）により患者の神経組織標本と特異的に反応するか否かに基づいて、患者がＳＭＥＩの素因を有するか否かまたは熱性痙攣がＳＭＥＩの発作であるか否かを診断することが可能である。
【００３１】
診断用キット
本発明は、上記１〜２０種のプライマー対の一対ないし全部の対を含む、患者がＳＭＥＩの素因を有するか否かまたはＳＭＥＩであるか否かを診断するためのキットも提供する。このキットは、プライマー対の他に、組織ＤＮＡの抽出手段、ＤＮＡ希釈用緩衝液、反応容器、陽性対照サンプル、陰性対照サンプル、説明書、パッケージ等を適宜含んでよい。キットはさらに、組織ＤＮＡの増幅のための試薬を含んでもよい。
【００３２】
本発明は、上記（１） 〜（１９）のいずれか１つの変異を含む２０〜１００の連続した塩基配列からなるＤＮＡまたはその混合物をプローブとして含む、患者がＳＭＥＩの素因を有するか否かまたはＳＭＥＩであるか否かを診断するためのキットも提供する。好ましくはプローブは２０種のＤＮＡ断片の混合物として存在し、遺伝子チップを形成するために適当な材料のプレートに付着した状態でキットに含まれるのが好ましい。キットは、プローブの他に、組織ＤＮＡの抽出手段、ＤＮＡ希釈用緩衝液、ハイブリダイゼーションに適切なストリンジェンシーの緩衝液、ハイブリダイゼーションに適切なストリンジェンシーの洗浄液、反応容器、陽性対照サンプル、陰性対照サンプル、説明書、パッケージ等を適宜含んでよい。
【００３３】
本発明は、上記のモノクローナル抗体を含む、患者がＳＭＥＩの素因を有するか否かまたはＳＭＥＩであるか否かを診断するためのキットも提供する。キットは抗体の他に、抗体希釈用緩衝液、反応容器、陽性対照サンプル、陰性対照サンプル、説明書、パッケージ等を適宜含んでよい。
以下に、実施例を記載して本発明をより詳細に説明する。
【００３４】
【実施例】
ＳＣＮ１Ａの変異は、熱性痙攣を伴う全般てんかんプラス（ＧＥＦＳ＋）による全身性発作の原因でもあるが、それらは全てミスセンス変異である。本実施例により、日本人の重症乳児ミオクロニー癲癇（ＳＭＥＩ）患者中のＳＣＮ１Ａの新規変異を調べ、ＳＭＥＩとＧＥＦＳ＋との遺伝子型及び表現型の比較を行った。
【００３５】
患者及び方法
ＳＭＥＩの臨床症状を有する一卵性双生児の対及び相互に無関係な多数の患者の検討を行った。
【００３６】
対象のＳＭＥＩ患者は男児１２名及び女児１１名を含み、年齢は２〜３１歳（平均１５．８歳）であった。痙攣の発症は誕生から１〜１１月目（大部分は３〜１０月目）に生じ、片側間代痙攣または全身性の間代もしくは強直・間代痙攣（ＧＴＣ）であった。患者１２は出産時の軽い窒息の病歴があった、また患者１７は低出生体重児として生まれたが窒息はなかった。全ての患者は（ 患者１２および１７も含めて） 痙攣発症までは正常に発育した。全患者において、痙攣発作は重積またはシリーズとして生じる傾向があり、このことは初期の痙攣で特に顕著であった。神経画像検査では通常は正常または軽度の萎縮が認められた。精神活動の発達は２才以後遅延し、１１名の患者で運動失調が見られた。
【００３７】
家族の病歴は、１１名の患者の親族に熱性痙攣が、２名の患者の親族に癲癇が、そして３名の患者および双子の親族には癲癇と熱性痙攣のいずれもが認められた。
【００３８】
ＥＥＧ（エレクトロ・エンセファログラム）の結果によると、症例のいくつかでは癲癇放電は最初の検査では観察されず、その後に明確になった。大部分の症例で瀰漫性の高振幅４〜７Ｈｚ徐波の背景活動が観察された。光過敏症は４名の患者に認められた。
【００３９】
癲癇症状の経過中、ミオクロニー発作は２３名の患者に、非定型欠神発作は８名の患者に、そして複雑部分発作は１６名の患者に観察された。痙攣発作（ＧＴＣ）は、いずれの抗癲癇薬による最高用量の治療に対しても、効果がなかった。現在、全患者でＧＴＣが持続している。大部分の症例で、ＧＴＣの頻度は１週間〜１月の間隔であった。
【００４０】
これら２３名の患者は、Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｅａｇｕｅ ａｇａｉｎｓｔ Ｅｐｉｌｅｐｓｙ （１９８９） の提唱するＳＭＥＩの基準（Ｅｐｉｌｅｐｓｉａ １９８９， ３０：３８９−３９９）を満たした。患者１２は誕生時の問題を除いて、ＳＭＥＩの定義に当てはまると診断された。
【００４１】
何名かの患者の両親からの血液サンプル並びに１１１名の正常人志願者からの血液サンプルを試験のコントロールに用いた。
統計分析は、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ ｔｅｓｔ および ｏｎｅ−ｗａｙ ｆａｃｔｏｒｉａｌ ＡＮＯＶＡを用いて行った。
【００４２】
試験は、両親または必要な場合は責任者である成人から書面でのインフォームドコンセントを得、さらに、Ｓｈｉｚｕｏｋａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓの倫理委員会およびＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ ｏｆ ＲＩＫＥＮ−ＢＳＩの承認も得た上で行われた。
【００４３】
変異の分析
ＳＣＮ１Ａの変異の分析は、Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ １９９８， １９：３６６−３７０ 及びＪ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００１， ２１：７４８１−７４９０ に記載された方法により行った。簡単に述べると、ゲノムＤＮＡを正常人及び患者のヘパリン処理した血液サンプルから、市販のキット（ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ， Ｑｉａｇｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ） を用いて抽出した。ゲノムＤＮＡをＰｙｒｏｂｅｓｔ （宝酒造） を用いてＰＣＲにより増幅し、配列解析して分析した。ＰＣＲプライマーは、ｃＤＮＡ （ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ． ＡＹ０４３４８４） とゲノム配列（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏｓ． ＡＣ０１０１２７及びＡＣ０２１６７３） との比較により決定された、ＳＣＮ１Ａの２６のコードエクソンを全て増幅するよう設計され、配列番号２及び５９に示す塩基配列を有する。
【００４４】
Ｅｘ １Ｆ： ＴＣＣＴＣＴＡＧＣＴＣＡＴＧＴＴＴＣＡＴ （配列番号２）
Ｅｘ １Ｒ： ＣＣＡＣＣＣＡＣＡＡＡＴＧＴＧＴＴＴＣＡ （配列番号３）
Ｅｘ ２Ｆ： ＧＴＧＡＴＴＧＴＧＣＴＧＧＴＴＴＣＴＣＡ （配列番号４）
Ｅｘ ２Ｒ： ＧＧＣＴＡＡＴＡＴＧＡＣＡＡＡＧＡＴＧＣ （配列番号５）
Ｅｘ ３Ｆ： ＴＣＣＣＴＧＡＡＴＴＴＴＧＧＣＴＡＡＧＣ （配列番号６）
Ｅｘ ３Ｒ： ＧＴＣＣＴＣＴＴＧＣＴＧＣＧＴＡＡＴＴＴ （配列番号７）
Ｅｘ ４Ｆ： ＡＧＧＧＣＴＡＣＧＴＴＴＣＡＴＴＴＧＴＡ （配列番号８）
Ｅｘ ４Ｒ： ＡＣＴＴＡＧＡＣＣＴＴＴＧＴＴＧＴＧＣＴ （配列番号９）
Ｅｘ ５Ｆ： ＣＡＧＡＧＴＣＴＴＧＡＧＡＧＣＴＴＴＧＡ （配列番号１０）
Ｅｘ ５Ｒ： ＴＣＣＡＡＧＧＣＴＧＡＴＡＡＡＧＣＴＴＡ （配列番号１１）
Ｅｘ ６Ｆ： ＡＧＣＧＴＴＧＣＡＡＡＣＡＴＴＣＴＴＧＧ （配列番号１２）
Ｅｘ ６Ｒ： ＣＣＴＧＣＡＡＴＧＴＧＴＧＣＴＡＡＴＣＡ （配列番号１３）
Ｅｘ ７Ｆ： ＴＣＣＴＧＴＣＡＴＴＣＣＴＧＴＣＴＡＴＴ （配列番号１４）
Ｅｘ ７Ｒ： ＡＧＴＴＧＧＣＴＧＴＴＡＴＣＴＴＣＡＧＴ （配列番号１５）
Ｅｘ ８Ｆ： ＴＡＴＧＣＡＧＴＣＡＡＡＡＧＴＴＧＧＧＡ （配列番号１６）
Ｅｘ ８Ｒ： ＡＧＴＣＴＣＧＴＴＴＣＡＡＧＴＴＣＴＧＣ （配列番号１７）
Ｅｘ ９Ｆ： ＧＧＧＴＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＡＣＡＴＡＡ （配列番号１８）
Ｅｘ ９Ｒ： ＡＡＴＴＣＣＴＣＡＴＡＣＡＡＣＣＡＣＣＴ （配列番号１９）
Ｅｘ １０Ｆ： ＧＴＧＡＧＡＴＧＡＴＣＴＴＣＡＧＴＣＡＧ （配列番号２０）
Ｅｘ １０Ｒ： ＣＡＣＣＧＡＧＣＴＧＴＡＧＡＣＴＴＡＣＡ （配列番号２１）
Ｅｘ １１Ｆ： ＣＣＣＡＡＧＧＧＣＴＡＧＡＡＡＣＴＴＴＣ （配列番号２２）
Ｅｘ １１Ｒ： ＣＡＡＧＡＴＧＣＡＧＧＴＧＣＡＴＴＣＡＣ （配列番号２３）
Ｅｘ １２Ｆ： ＴＡＴＣＴＧＣＣＡＴＣＡＣＣＡＡＴＴＧＡ （配列番号２４）
Ｅｘ １２Ｒ： ＡＧＣＴＣＴＴＧＡＡＴＴＡＧＡＣＴＧＴＣ （配列番号２５）
Ｅｘ １３Ｆ： ＴＧＧＧＡＧＧＴＴＴＡＧＡＧＴＡＡＡＣＴ （配列番号２６）
Ｅｘ １３Ｒ： ＴＡＡＴＴＧＣＧＡＴＴＴＴＧＣＡＧＧＧＧ （配列番号２７）
Ｅｘ １４Ｆ： ＴＧＴＧＧＧＡＡＡＡＴＡＧＣＡＴＡＡＧＣ （配列番号２８）
Ｅｘ １４Ｒ： ＧＡＣＡＡＴＧＣＡＡＡＴＧＴＴＡＣＧＧＡ （配列番号２９）
Ｅｘ １５Ｆ： ＡＡＡＡＴＴＡＧＣＣＡＴＧＡＧＣＣＴＧＡＧＡ （配列番号３０）
Ｅｘ １５Ｒ： ＧＣＡＣＴＧＣＴＡＴＡＴＴＧＣＴＧＴＧＴＴＧ （配列番号３１）
Ｅｘ １６−１ ＴＧＴＧＧＴＧＴＴＴＣＣＴＴＣＴＣＡＴＣ （配列番号３２）
Ｅｘ １６−２ ＴＴＴＧＣＴＴＴＣＴＴＣＣＡＧＡＴＣＣＧ （配列番号３３）
Ｅｘ １６−２Ｆ： ＧＧＣＡＧＣＡＧＴＧＴＴＧＡＡＡＡＡＴＡ （配列番号３４）
Ｅｘ １６−２Ｒ： ＡＣＡＧＧＣＡＡＴＡＴＡＡＴＧＣＡＴＧＴ （配列番号３５）
Ｅｘ １７Ｆ： ＴＣＣＣＣＴＴＡＴＴＣＡＡＴＣＴＣＴＣＴ （配列番号３６）
Ｅｘ １７Ｒ： ＴＣＡＡＡＧＣＡＴＧＡＣＡＣＴＡＧＡＣＴ （配列番号３７）
Ｅｘ １８Ｆ： ＴＴＡＧＡＧＡＧＣＴＡＴＧＣＴＡＧＣＡＡ （配列番号３８）
Ｅｘ １８Ｒ： ＡＴＡＧＡＡＧＡＴＡＣＡＡＧＧＴＧＧＧＡ （配列番号３９）
Ｅｘ １９Ｆ： ＴＡＡＣＴＡＣＴＧＴＴＴＣＴＣＴＧＣＣＣ （配列番号４０）
Ｅｘ １９Ｒ： ＣＣＣＴＴＧＴＣＴＴＣＣＡＧＡＡＡＴＧＡ （配列番号４１）
Ｅｘ ２０Ｆ： ＧＣＣＡＡＴＧＡＡＴＴＴＴＴＴＴＣＣＡＣＣＴＴＧ （配列番号４２）
Ｅｘ ２０Ｒ： ＡＧＡＧＧＣＣＴＡＴＴＴＣＴＣＴＴＧＣＡＴ （配列番号４３）
Ｅｘ ２１Ｆ： ＡＡＧＡＡＴＧＧＡＡＡＧＡＣＣＡＧＡＧＡ （配列番号４４）
Ｅｘ ２１Ｒ： ＴＧＧＧＣＴＣＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＡＣＴ （配列番号４５）
Ｅｘ ２２Ｆ： ＡＣＴＧＴＣＴＴＧＧＴＣＣＡＡＡＡＴＣＴＧＴ （配列番号４６）
Ｅｘ ２２Ｒ： ＡＣＣＴＧＴＣＡＣＡＣＴＴＴＴＴＣＣＣＡＡ （配列番号４７）
Ｅｘ ２３Ｆ： ＧＧＣＣＡＡＴＴＴＣＡＧＧＧＡＴＧＴＴＴＴＴ （配列番号４８）
Ｅｘ ２３Ｒ： ＧＧＡＴＡＧＴＧＡＡＴＧＡＣＡＧＡＧＧＡＡＧ （配列番号４９）
Ｅｘ ２４Ｆ： ＴＣＣＴＣＴＡＡＣＴＣＴＴＴＧＣＴＡＣＡ （配列番号５０）
Ｅｘ ２４Ｒ： ＡＧＡＴＧＡＴＧＣＴＣＴＡＣＡＡＧＴＧＡ （配列番号５１）
Ｅｘ ２５Ｒ： ＡＡＡＡＴＣＡＧＧＧＣＣＡＡＴＧＡＣＴＡ （配列番号５２）
Ｅｘ ２５Ｆ： ＧＡＴＴＡＴＣＴＣＴＧＡＴＴＧＣＴＧＧＧ （配列番号５３）
Ｅｘ ２６−１Ｆ： ＡＴＡＴＡＡＣＴＧＧＧＴＴＣＡＧＧＡＣＴ （配列番号５４）
Ｅｘ ２６−１Ｒ： ＣＡＣＡＧＴＣＴＣＣＣＴＴＡＡＣＴＧＡＧ （配列番号５５）
Ｅｘ ２６−２Ｆ： ＡＴＧＴＴＡＡＧＡＧＧＧＡＡＧＴＴＧＧＧ （配列番号５６）
Ｅｘ ２６−２Ｒ： ＴＡＧＴＧＡＴＴＧＧＣＴＧＡＴＡＧＧＡＧ （配列番号５７）
Ｅｘ ２６−３Ｆ： ＣＣＡＡＡＣＡＡＡＣＴＣＣＡＧＣＴＣＡＴ （配列番号５８）
Ｅｘ ２６−３Ｒ： ＧＣＡＣＴＧＡＣＣＴＴＡＡＧＧＡＧＡＴＴ （配列番号５９）
【００４５】
各患者からのＰＣＲ産物は、それぞれダイデオキシターミネーターキットにより直接配列解析し、自動シークエンサー（ｍｏｄｅｌ ＡＢＩ３７００， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ； ＮＪ） で分析した。分析により、大部分のＳＭＥＩ患者はＳＣＮ１Ａ遺伝子に変異が生じていた。
【００４６】
発見された変異を表１に示す。表１において、例えば「ｃ．２１０１Ｃ−＞Ｔ， Ｒ７０１Ｘ」と記載されている変異は、ｃＤＮＡの２１０１位のシトシン（Ｃ）がチミン（Ｔ）に変化した結果７０１番目のアルギニンコドンがナンセンス変異したことを示し、「ｄｅｌ」は塩基の欠失を意味し、「ｆｓ」はフレームシフトを意味し、「ｉｎｓ」は塩基の挿入を意味する。
【００４７】
結果
ＳＭＥＩの臨床症状を有する患者のＳＣＮ１Ａ遺伝子の全コードエクソンおよびスプライス部位について、変異分析を行った。ＳＣＮ１Ａ遺伝子中に合計２０の異型接合変異が検出され、つまり４名の患者の４つのフレームシフト変異、５名の患者の４つのナンセンス変異、９名の患者の９つのミスセンス変異および２名の患者の２つの他の変異であった。各変異のＳＣＮ１Ａ遺伝子中の位置は、図１に示す（図１には、本発明と平行して行った小児難治大発作てんかんＩＣＥＧＴＣの臨床症状を有する患者のＳＣＮ１Ａ遺伝子の変異も示されている）。
【００４８】
上記４つのフレームシフト変異は、１塩基挿入（患者１１のｃ．５２９２ｉｎｓＴ）、８塩基挿入（患者１０のｃ．２１９６−２２０３ｉｎｓＣＡＣＣＣＴＧＴ）および二種の１塩基欠失（患者８のｃ．２８３５ｄｅｌＣおよび患者９のｃ．５３０ｄｅｌＧ）を含み、遺伝子の途中に停止コドンを生じていた（患者１１のＦ１７６５ｆｓＸ１７９４、患者１０のＱ７３２ｆｓＸ７４９、患者８の９４６ＲｆｓＸ９５３、および患者９のＧ１７７ ｆｓＸ１８０）。
【００４９】
上記４つのナンセンス変異は、患者１および２の ｃ．３６３７Ｃ−＞Ｔ， Ｒ１２１３Ｘ 、患者３の ｃ．４２２３Ｇ−＞Ａ， Ｗ１４０８Ｘ 、患者６の ｃ．２８５５Ｇ−＞Ａ， Ｗ９５２Ｘおよび患者７の ｃ．３８５２Ｇ−＞Ａ， Ｗ１２８４Ｘ を含み、これらもまた、チャネルタンパク質の短縮を生じた。
【００５０】
エクソン４スプライス部位の変異（ＧＴ−＞ＡＴ）は、スプライシングの隠蔽またはエクソンのスキッピングをもたらし、チャネルを変化させたと思われる。１２塩基欠失（患者４のｃ．５４１９ｄｅｌＡＴＧＴＴＣＴＡＴＧＡＧ， １８０７ｄｅｌＭＦＹＥ）はＣ−末端領域に存在した。
【００５１】
上記ミスセンス変異のうち９つは、患者１２のｃ．３０７Ａ−＞Ｇ， Ｓ１０３Ｇ、患者１３のｃ．５０５４Ｃ−＞Ａ， Ａ１６８５Ｄ、患者１４のｃ．３３５Ｃ−＞Ｔ， Ｔ１１２Ｉ、患者１５のｃ．３６９３Ｔ−＞Ａ， Ｓ１２３１Ｒ、患者１６のｃ．２９５４Ａ−＞Ｔ， Ｎ９８５Ｉ、患者１７のｃ．５４９２Ｔ−＞Ｃ， Ｆ１８３１Ｓ、患者１８のｃ．７９３Ｇ−＞Ｔ， Ｇ２６５Ｗ、患者１９のｃ．２８７８Ａ−＞Ｇ， Ｍ９６０Ｖおよび患者２０のｃ．５４３４Ｔ−＞Ｇ， Ｗ１８１２Ｇを含み、コントロール集団（ｎ＝９３ないし１１１）には存在しないアミノ酸配列をもたらした。しかし、ミスセンス変異のうち、患者９、１１、１２、２０および２１で検出された変異（ｃ．３１９９Ａ−＞Ｇ， Ｔ１０６７Ａ）は、１０３名のコントロール集団の２０人の異型接合および２人の同型接合の個体にも存在するアミノ酸配列を生じた。このミスセンス変異では、アミノ酸はかなり保存的であった。
【００５２】
患者２２および２３では、ＳＣＮ１Ａ遺伝子のコード領域に変異は観察されなかった。
患者１、２、８、１３、１８および２０の両親は、正常対立遺伝子を有しており、これらの患者の変異がｄｅ ｎｏｖｏであることを示唆した。
【００５３】
上記結果をまとめると、２３名のＳＭＥＩ患者の５名はナンセンス変異を、２名はフレームシフト変異を、２名はフレームシフト変異とミスセンス変異を、１０名はミスセンス変異を、２名はそれ以外の変異を有し、そして２名には変異が見られなかった。本発明と平行して行ったＩＣＥＧＴＣ患者の調査では、１０名のうち、７名はミスセンス変異を有し、そして３名には変異が見られなかった。表現型および遺伝型の関連についてみると、ナンセンス変異およびフレームシフト変異は、ＳＭＥＩ患者のみに見られた。これに対して、ＩＣＥＧＴＣ患者では変異が存在してもミスセンス変異のみであった。
【００５４】
【表１】
考察
本発明者らは、以前、ナンセンス変異およびフレームシフト変異がＳＭＥＩの主な遺伝子型であることを報告した（Ｓｕｇａｗａｒａ ｅｔ ａｌ， Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２００２； ５８ｓ： １１２２−４ ）。本発明によれば、ＳＭＥＩは他にもミスセンス変異および他のタイプの変異遺伝子型変異として生じることが判明した。しかし、フレームシフト変異およびナンセンス変異はＳＭＥＩ患者にみられる主な異常であり、以前の報告と合わせると、３９名のＳＭＥＩ患者のうちフレームシフト変異の患者が７名およびナンセンス変異の患者が１２名であった。そのうち、コントロール集団にもみられたミスセンス変異（ｃ．３１９９Ａ−＞Ｇ， Ｔ０１６７Ａ） は、疾患に無関係の良性変異であり、以下の考察からは除外する。残りの１１名のミスセンス変異はＳＭＥＩの病因に関連すると考えられる。本発明の研究では３名、以前の研究では４名のＳＭＥＩ患者にＳＣＮ１Ａ遺伝子の変異がみられなかった。しかし、それらの患者において、プロモーターの変異またはＲＮＡ転写のスプライシングに影響するイントロン配列内の変異の可能性もあり、ＳＣＮ１Ａ遺伝子が変異している可能性は排除できない。あるいは、ＳＣＮ１Ａ以外の遺伝子の変異が原因である可能性もあり、例えば、Ｈａｒｋｉｎ ｅｔ ａｌは、ＧＡＢＡＡ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇ２サブユニット遺伝子の変異を示唆している（Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ２００２； ７０： ５３０−６）。
【００５６】
本発明では、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の異なる変異または無変異がＳＭＥＩに異なる臨床症状を生じるかも検討した。フレームシフト変異、ナンセンス変異、ミスセンス変異および無変異患者の、大発作の発症平均年齢は、それぞれ１０．７月、１６月、２５月および１７．９月であった。小発作の発症は、フレームシフト変異の場合に、ミスセンス変異より早期に生じる傾向があった（ｐ＝０．０４８９）。痙攣発作の頻度はミスセンス変異の患者ではナンセンス変異の患者に比べて若干少ない傾向があった（ｐ＝０．０６８３）。詳しくは、ＧＴＣが週１回以上生じた患者の比率は、フレームシフト変異患者では５７．１％、ナンセンス変異患者では６６．７％、ミスセンス変異患者では２７．３％、そして無変異の患者では５７．１％であった。このように、臨床症状における相違はあまりなかったが、症例が増えれば違いが明確になる可能性もある。
【００５７】
ＳＭＥＩとＩＣＥＧＴＣとの区別
本発明と平行して小児難治大発作てんかん（ＩＣＥＧＴＣ）の患者も調査した。ＩＣＥＧＴＣの患者も主な発作症状として、全身性強直間代発作（ＧＴＣ）を示す。ＳＭＥＩ患者とＩＣＥＧＴＣ患者の間に、発症年齢、性差、家族歴、神経学的異常、ＥＥＧ所見（エレクトロ・エンセファログラム）、および臨床経過についての差異はなかった。両疾患は、表現型を微妙に異にする連続症状であることも考えられる。
【００５８】
本発明および本発明者らの以前の研究にて行った分子遺伝学分析の結果では、両疾患のＳＣＮ１Ａ遺伝子に７０〜８２％の高率で変異が認められ、ＳＭＥＩではフレームシフト変異またはナンセンス変異が、そしてミスセンス変異は両疾患に認められた。したがって、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の変異が、これらの疾患における激しい癲癇発作症状に絶対的とは言えないまでも、重要な役割を担うようであり、そしてこれら二種の疾患の遺伝型上の関連を示唆している。表現型の関連を調べる前に、フレームシフト変異、ナンセンス変異、およびミスセンス変異の遺伝子型の相違が、生理学的に異なる影響を及ぼすか調べる必要がある。
【００５９】
ＳＭＥＩとＧＥＦＳ＋との関連
本発明で調べた癲癇の共通の特徴は、発熱が発作の引金になることであり、これはＧＥＦＳ＋においても特徴的である。したがって、本発明の研究は、発熱による発作の危険性増大はＳＣＮ１Ａ遺伝子の変異を示唆するのではないかとの、一般に受け入れられている仮説を確認した。ある研究者は、ＳＭＥＩがＧＥＦＳ＋の最も重症型であると仮定している（Ｓｃｈｅｆｆｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｂｒａｉｎ Ｄｅｖ ２００１； ２３： ７４９−５６； Ｖｅｇｇｉｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ， Ｅｐｉｌｅｐｔｉｃ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ２００１； ３： ２９−３２）。本発明者らによると、これまで調べたＳＭＥＩ患者の変異はｄｅ ｎｏｖｏであり、フレームシフト変異およびナンセンス変異を含んでいる。このことは、ＧＥＦＳ＋のスペクトルに関する報告とは異なっている（Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ， Ｅｐｉｌｅｐｓｙ Ｒｅｓ ２００２； ４８： １５−２３）。
【００６０】
しかしながら、本発明と平行して行った研究で、ＩＣＥＧＴＣの２名の子供の母親がその子供と同じミスセンス変異をＳＣＮ１Ａ遺伝子に有することが見いだされた。２名の母親は熱性痙攣および熱性痙攣にひきつづく無熱性発作を有し、ＧＥＦＳ＋とみなされた。このように、ＩＣＥＧＴＣをＧＥＦＳ＋家系と関連させた報告は初めてであり、ＩＣＥＧＴＣタイプの癲癇がＧＥＦＳ＋スペトクルの最も重症の形であることを示唆している。このことが、ＳＭＥＩにも当てはまるかは、さらに多くの患者およびその家族の変異を観察する必要がある。生理学的研究により、これらの重大な小児の難病およびそのＧＥＦＳ＋との関連のさらに十分な理解をもたらすことが期待される。
【００６１】
ＧＥＦＳ＋においてはＳＣＮ２Ａ中の変異が関与することが報告されているので（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００１， ９８：６３８４−６３８９） 、本発明者らはＳＣＮ２Ａのコード領域も分析した。これら４人（患者２、５、８及び９）のＳＭＥＩ患者のＳＣＮ２Ａコード領域には、変異は検出されなかった。
【００６２】
ＳＣＮ１Ａ中の変異及び患者の詳細な臨床症状は、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙのウェブサイト（ｇｏ ｔｏ ｗｗｗ．ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．ｏｒｇ） に記載した。比較の便宜のため他の文献と一致させた番号表示も含めてある。
【００６３】
【発明の効果】
本発明は、ＳＭＥＩの診断及び予後診断の直接的進歩をもたらし、この難病の新治療法の開発に多大な貢献をする。また、本発明は、ＳＭＥＩの分子病理学的な原因解明のための、短縮ＮａＶ１．１（電位依存性ナトリウムチャネルα−サブユニットＩ型）の機能及び動物モデルによる研究の突破口になると期待される。
【００６４】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、電位依存性ナトリウムチャネルα−サブユニットＩ型（ＮａＶ１．１）中の、変異部位いくつかを示す模式図である。
Claims (14)
- 配列番号１のｃＤＮＡ塩基配列中における、下記（１） ないし（１９）に対応する領域の変異の少なくとも一つを有する塩基配列またはその相補配列からなる単離されたヒトＳＣＮ１Ａ遺伝子ＤＮＡ、またはそれらのＤＮＡに相補する単離されたｍＲＮＡ：
（１） １２１３位のＡｒｇのナンセンス変異
（例えば、３６３７のＣ → Ｔ）；
（２） １４０８位のＴｒｐのナンセンス変異
（例えば、４２２３のＧ → Ａ）；
（３） １８０７位からのＭｅｔ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｕを削除する変異
（即ち、５４１９からの１２塩基の欠失）；
（４） エクソン４のスプライス部位の変異
（例えば、ＧＴ → ＡＴ）；
（５） ９５２位のＴｒｐのナンセンス変異
（例えば、２８５５のＧ → Ａ）；
（６） １２８４位のＴｒｐのナンセンス変異
（例えば、３８５２のＧ → Ａ）；
（７） ９４６位のＡｒｇ以後にフレームシフトをおこす変異
（例えば、２８３５のＣの欠失）；
（８） １７７位のＧｌｙ以後にフレームシフトをおこす変異
（例えば、５３０のＧの欠失）；
（１９）７３２位のＧｌｎ以後にフレームシフトをおこす変異
（例えば、２１９６への８塩基挿入）；
（１０）１７６５位のＰｈｅのナンセンス変異
（例えば、５２９２へのＴの挿入）；
（１１）１０３位のＳｅｒをＧｌｙに変更する変異
（例えば、３０７のＡ → Ｇ）；
（１２）１６８５位のＡｌａをＡｓｐに変更する変異
（例えば、５０５４のＣ → Ａ）；
（１３）１１２位のＴｈｒをＩｌｅに変更する変異
（例えば３３５のＣ → Ｔ）；
（１４）１２３１位のＳｅｒをＡｒｇに変更する変異
（例えば、３６９３のＴ → Ａ）；
（１５）９８５位のＡｓｎをＩｌｅに変更する変異
（例えば、２９５４のＡ → Ｔ）；
（１６）１８３１位のＰｈｅをＳｅｒに変更する変異
（例えば、５４９２のＴ → Ｃ）；
（１７）２６５位のＧｌｙをＴｒｐに変更する変異
（例えば、７９３のＧ → Ｔ）；
（１８）９６０位のＭｅｔをＶａｌに変更する変異
（例えば、２８７８のＡ → Ｇ）；
（１９）１８１２位のＴｒｐをＧｌｙに変更する変異
（例えば、５４３４のＴ → Ｇ） - 請求項１に記載したＤＮＡまたはＲＮＡの一部であって、（１） 〜（１９）のいずれか１つの変異を含む１０〜１００個の連続した塩基配列からなるＤＮＡ、ＲＮＡまたはその混合物。
- 請求項１に記載した（１） 〜（１９）のいずれか１つの変異の前後に対応するヒトＳＣＮ１Ａ遺伝子の領域を含む１０〜１００個の連続した塩基配列またはその相補配列からなるＤＮＡ断片。
- 請求項１に記載した（１）〜（１９）のいずれか１つの変異の前後に対応するヒトＳＣＮ１Ａ遺伝子の領域をそれぞれ含む、連続した塩基配列またはその相補配列を有する一対のＤＮＡ断片からなるプライマー対。
- 各々が、１０〜１００個の連続した塩基配列を有する一対のＤＮＡ断片からなる請求項４のプライマー対。
- 各々が、２０〜１００個の連続した塩基配列を有する一対のＤＮＡ断片からなる請求項５のプライマー対。
- ＳＭＥＩの素因を有する、またはＳＭＥＩであると思われるヒトの血液または組織試料から調製したゲノムＤＮＡ抽出物またはｃＤＮＡを用意し、
請求項４、５または６のプライマー対の一対ないし全部の対を用い、上記ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡの増幅を行ない、
増幅したＤＮＡの塩基配列を解析して、増幅したＤＮＡが請求項１の（１） 〜（１９）のいずれか１つの変異を含むか否かを調べ、そして
変異が存在する場合は、当該ヒトの血液または組織試料に含まれるＳＣＮ１Ａ遺伝子にＳＭＥＩに関連する変異が存在すると判断する方法。 - ＳＭＥＩの素因を有する、またはＳＭＥＩであると思われるヒトの血液または組織試料から調製したゲノムＤＮＡ抽出物またはｃＤＮＡを用意し、
請求項４、５または６のプライマー対の一対ないし全部の対を用い、上記ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡの増幅を行ない、そして
当該ヒトの血液または組織試料に含まれるＳＣＮ１Ａ遺伝子にＳＭＥＩに関連する変異が存在する場合に特異的に、前記試料中のＤＮＡを増幅させる方法。 - ＳＭＥＩの素因を有するまたはＳＭＥＩであると思われるヒトの血液または組織試料から調製したゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを用意し、
必要なら該ＤＮＡを増幅させ、
該ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡに、請求項２のＤＮＡまたはその混合物をプローブとして接触させ、
該ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡがＳＭＥＩに関連する変異を含む場合に特異的に、プローブとのハイブリダイゼーションを生じさせる方法。 - 請求項４、５または６に記載したプライマー対の一対ないし全部の対を含む、ＳＭＥＩの素因を有するか否かまたは熱性痙攣がＳＭＥＩの発作であるか否かを診断するためのキット。
- 請求項８の方法で増幅させた、（１） 〜（１９）の少なくとも１つの変異を含むヒトＳＣＮ１Ａ遺伝子断片。
- 請求項１の変異を含むヒトＳＣＮ１Ａ遺伝子ＤＮＡまたは請求項１１の変異を含むヒトＳＣＮ１Ａ遺伝子断片がコードするペプチドを、哺乳類動物に投与して、該動物の抗体産生細胞を採取し、該細胞をミエローマ細胞と融合させ、融合細胞から目的の抗体を産生するハイブリドーマをクローニングすることからなる、（１） 〜（１９）のいずれか１つの変異に特異的な抗体を産生するハイブリドーマの製造方法。
- 請求項１２のハイブリドーマが産生する、（１） 〜（１９）のいずれか１つの変異を含むヒトＳＣＮ１Ａ遺伝子がコードする蛋白質に特異的なモノクローナル抗体。
- 請求項１３に記載したモノクローナル抗体を含む、ＳＭＥＩの素因を有するか否かまたは熱性痙攣がＳＭＥＩの発作であるか否かを診断するためのキット。
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|---|---|---|---|---|
| US8916743B2 (en) | 2010-01-29 | 2014-12-23 | National University Corporation Okayama University | Method for assessment of potential for development of dravet syndrome and use thereof |
-
2002
- 2002-08-15 JP JP2002236838A patent/JP2004073058A/ja active Pending
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