JP2001508311A - 脊髄小脳運動失調タイプ６の疾病の大規模遺伝子型表現及び診断テスト - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明がトリヌクレオチド反復配列の不安定性によって引き起こされる病気を発症する可能性のある個人を選別する方法を提供する。具体的には、本発明は個人のα_IAカルシウム・チャンネル遺伝子のＣＡＧオリゴヌクレオチド反復の長さを判定することによって常染色体優性脊髄小脳運動失調症タイプ６を発症する可能性のある個人を選択することを導く。さらに、大規模な遺伝子型表現によってトリヌクレオチド反復配列不安定性によって病気を引き起こす遺伝子を識別する方法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 脊髄小脳運動失調タイプ６の疾病の大規模遺伝子型表現及び診断テ スト 発明の背景 連邦政府の資金援助について 本発明は一部陸軍省からの資金援助を用いて実施されたものである。従って、 本発明に対しては連邦政府が一定の権利を有するものである。 発明の分野 本発明は一般的には分子遺伝学と遺伝子性疾患の診断の分野に関するものであ る。より具体的には、本発明は疾患の大規模遺伝子表現とそれに関する診断テス ト及びキットに関するものである。 関連技術の説明 トリヌクレオチドＣＡＧ，ＣＴＧ，ＣＣＧあるいはＧＡＡを含む反復配列の拡 張がいくつかの神経性不全の主要な原因であることが示されている。それらの中 で、ＣＡＧ反復の拡大はハンチングトン病²、脊髄延髄性筋肉萎縮、脊髄小脳運 動失調タイプｉ（ＳＡＣＩ）⁴、脊髄小脳運動失調タイプ２（ＳＣＡ２）^5-7、脊 髄小脳運動失調タイプ３／マカド−ジョセフ病（ＳＡＣ３/ＭＪＤ）⁸及びdentat orubral-pallidolusianatrophy/ハウ・リバー症候群⁹を含む一連の神経退化性不 全と関連している。これらすべての不全は中枢神経系でのニューロンの退化をも たらす進行性疾患である。それぞれの遺伝 子でのＣＡＧ反復はヒト集団において長さの多型現像を示し、その長さは通常は 40反復を越えない。発症した個体では、拡大された対立遺伝子は36〜121反復を 含んでいる¹⁰。 ＣＡＧ反復拡張はＣＧＧ，ＣＴＧ及びＧＡＡ拡張を有する疾患でしばしば見ら れるような数百あるいは数千の反復よりはずっと小さい^11-14。拡張されたＣＡ Ｇ対立遺伝子は生殖系列及び体細胞組織の両方でいろいろな程度の不安定性を示 す^15,16。ＣＡＧ反復サイズの世代間変化は特に系統的に伝達された場合、さら なる拡張を伴ない、病変を予想するための分子的基礎を提供してくれることが多 い。これらの疾患におけるＣＡＧ反復配列は関連する遺伝子のコード領域に位置 しており、蛋白質生成物内のポリグルタミントラクトに翻訳される¹⁷。ポリグル タミントラクトの拡張は各疾病での蛋白質生成物内で優性遺伝に対応する機能の 獲得をもたらすと考えられている。ＣＡＧ反復拡張によって引き起こされる疾病 の比較的均一な特徴に基づいて、同様の臨床的特徴を有する他の神経退化性疾患 もＣＡＧ反復の拡張を有していることが推測される。実際、Trottler及び同僚ら の研究によれば、ポリグルタミントラグトに対する抗体がＳＣＡ２又は脊髄小脳 運動失調タイプ７（ＳＣＡ７）を有する患者から取り出した組織内で異常に大き な蛋白質を検出するが、それはＳＣＡ２及びＳＣＡ７に関与する突然変異がポリ グルタミン反復トラクトの拡張であることを示唆している¹⁸。 先行技術は遺伝子性疾患の大規模な遺伝子表現のための有 効な手段及びそうした疾患を診断するための診断テストやキットが存在しない点 で不備である。本発明はこの技術分野で長年求められていた必要性と願望を満た すものである。 発明の要約 多型性ＣＡＧ反復はヒトα_IA電圧依存カルシウム・チャンネル・サブユニット 内で確認されている。このＣＡＧ反復の拡張が遺伝性の退化性運動失調の原因で ある可能性を実証するために、多数の無関係のコントロール及び運動失調患者間 の遺伝子型の決定が行われた。最近発症したばかりの親族でない８人の患者はよ り多くの（２〜27）数の対立遺伝子を有していたのに対して、475名の運動失調 を示していない個人では反復数は４〜16個程度であった。病気の個人の家族での 反復長さの分析はその拡張がすべての患者でその表現型をもって分離されること を示した。ヒトα_IA電圧依存カルシウム・チャンネル・サブユニットの６つアイ ソフォームが認められた。ＣＡＧ反復はこのアイソフォームのうちの３つで読み 取り枠内に存在しており、グルタミンをコードすることを表現する。従って、ヒ トα_IA電圧依存カルシウム・チャンネル・サブユニット内の小さなポリグルタミ ン拡張は新しく分類される常染色体性優性脊髄小脳運動失調、ＳＣＡ６の原因で ある可能性が非常に高い。 本発明のひとつの目的において、１つまたは複数のオリゴヌクレオチド・プラ イマーを用いるポリメラーゼ鎖反応によって患者から得たサンプル内のゲノムＤ ＮＡトリヌクレオチ ド反復配列を増幅させ；制限酵素を用いて増幅されたゲノムＤＮＡトリヌグレオ チド反復配列を制限し；電気泳動によってその制限された増幅ゲノムＤＮＡトリ ヌクレオチド反復配列を分離してサンプル電気泳動パターンを形成し；そのサン プル内でその増幅されたゲノムＤＮＡトリヌクレオチド配列を検出することがで きるプローブ内に標識し；その制限された増幅ゲノムＤＮＡトリヌクレオチド反 復配列のサンプルを交雑条件下で上記標記されたプローブの第１のアリコートと 交雑させてそのサンプル・ゲノムＤＮＡ反復配列のサンプル交雑パターンをつく りだし；病気にかかっていない供給源からの比較対象のゲノムＤＮＡトリヌクレ オチド反復配列をその１つ又は複数のオリゴヌクレオチド・プライマーによって 増幅させ；その比較対象ゲノムＤＮＡトリヌクオチド反復配列を制限酵素を用い て制限し；その制限された比較対象のゲノムＤＮＡトリヌクレオチド反復配列を 電気泳動で分離して比較対象の電気泳動パターンをつくりだし；その制限された 比較対象のゲノムＤＮＡトリヌクレオチド反復配列を交雑条件下で上記プローブ の第２のアリコートを組み合わせて上記ゲノムＤＮＡトリヌクレオチド反復配列 に対する比較対象の交雑パターンを形成し；上記サンプル・ゲノムＤＮＡトリヌ クレオチド反復配列に関するサンプル交雑パターンを上記比較対象ゲノムＤＮＡ トリヌクレオチド反復配列に対する上記比較対象交雑パターンと比較し；そして 、テストされる上記個人がトリヌグレオチド反復配列の不安定性によって引き起 こされる疾患を形成する危険性があるかどうかを判定して、上記サンプル・ゲノ ムＤＮＡトリヌクレオチド反復配列が比較対象のＤＮＡトリヌクレオチド反復配 列より大きな場合は、その個人がトリヌクレオチド反復配列によって引き起こさ れる疾患を発生する危険性があるとされる、トリヌクレオチド反復配列によって 引き起こされる疾患を発生させる危険性がある個人を判別する方法が提供される 。 本発明の別の目的においては、トリプレット塩基反復を有するオリゴヌクレオ チドでライブラリーをスクリーニングし；上記トリプレット塩基反復を有するク ローンを識別し；そのトリプレット塩基反復を側鎖しているヌクレオチドの配列 を判定するために上記識別されたクローンの配列決定を行い；上記トリプレット 塩基反復を側鎖しているヌクレオチドの上記配列に対して相補的なプライマーを 合成し；病気にかかった個人とかかっていない個人の両方を含む多数の個人から ＤＮＡを分離し；上記プライマーで分離されたＤＮＡを増幅して増幅されたトリ プレット塩基反復領域をつくりだし；上記多数サンプルの個人のそれぞれに関し て上記トリプレット塩基反復領域内のトリプレット塩基反復の数を判定して、罹 病した個人でトリプレット塩基反復拡張が比較的高い頻度で観察されるが、罹病 していない個人では存在しないかあるいは非常に低い頻度でしか発生しないかど うかを判定して、罹病している個人ではトリプレット塩基反復拡張が非常に高い 頻度で観察されるが罹病していない個人では存在しないか、あ るいは非常に低い頻度でしか発生しない場合には、その病気を引き起こす対立遺 伝子がトリヌクレオチド反復配列の不安定性によるものと判定される、病気を引 き起こす対立遺伝子がヌクレオチド反復配列の不安定性によるものである遺伝子 を識別する方法が提供される。 本発明のその他の、そしてさらなる側面、特徴及び利点は開示の目的で提供さ れる本発明の現段階での好ましい実施の形態に関する以下の説明を参照すること で明らかになるであろう。 図面の簡単な説明 本発明の上に述べた特徴、利点及び目的が達成される方法がより詳細に理解さ れるように、添付図面に示すいくつかの実施の形態を参照して、本発明をより詳 細に説明する。これらの図面は明細書の一部を構成する。しかしながら、本発明 の好ましい実施の形態を示す添付図面は、本発明の範囲を限定するものではない 。 図１はヒトα_IA電圧依存カルシウム・チャンネル・サブユニットのアイソフォ ームを示している。図１Ａはこれら異なったアイソフォームのすべてが少なくと も２つの独立ｃＤＮ 示している。ＣＧＣＡＧ挿入の部位は垂直の線で示し、グル これらの変異によって影響を受けるアミノ酸変化を図２に示す。挿入ＧＧＣＡＧ を有するアイソフォームだけが拡張された開放読み取りフレームを有している。 図１ＢはヒトＣａ²⁺チャンネル・アイソフォームＢＩ−１及びＢＩ−１（ＧＧＣ ＡＧ）のストップ・コドンを側鎖した配列を示している。上と下の文字はその配 列でコード表現された対応するアミノ酸を示している。このストップ・コドンは ＴＡＮヌクレオチドで示される。ヌクレオチド“Ｎ”はApplied Biosystem社か ら提供される色素ターミネータ配列決定剤のＦＳ Taq酵素の特徴である“Ａ” ピークの後の“Ｇ”ピークのサイズが誘導した“Ｇ”ヌクレオチドである。逆ス トランドが配列決定された際に、これが実際に“Ｇ”ヌクレオチドであることが 確認された。ＴＡＧ，ＣＴＡの相補的配列に下線を付す。 図２はウサギ（ＢＩ−１）とヒトα₁電圧依存Ｃａ²⁺チャンネル・サブユニッ トとの間の配列比較を示している。部分的なヒトｃＤＮＡ配列は最大の減少開放 読み取りフレームを示す3.6kbの２つの重複クローンの組み合わせである。同じ アミノ酸配列は“−”で示し、アリグンメントの空隙は“，”符号で示す。ヒト 及びウサギのＢＩ−１ｃＤＮＡはアイソフォームにおいて90〜94％のアミノ酸同 一性を共有している。完全な長さのヒトα_IA電圧依存Ｃａ²⁺チャンネル・サブユ ニットは決定されていないので、ウサギＢＩ−１配列のアミノ 酸ストランドを基準として数えた（GenBankのＯＣＣＣＢ−Ｉ）。ウサギＢＩ− １アイソフォーム（アクセス番号No.Ｘ57476）内への仮定的挿入はウサギとヒト で同じ場所にストップ・コドンを有する237アミノ酸によってその誘導ペプチド 読み取りフレームを拡張した。この推定読み取りフレームで、グルタミン反復に はヒト及びウサギｃＤＮＡ配列でアミノ酸位置2328から始まって下線を付してあ る。この挿入がないと、ウサギ及びヒトＢＩ−１アイソフォーム誘導読み取りフ レームは文献“☆”（２アリグンメントギャップの誘導のための2275としてここ に記載される）に示してあるようにアミノ酸位置2273で停止した。Ｖ１，Ｖ２， Ｖ３変異に対応するアイソフォーム内で変化するアミノ酸とＧＧＣＡＧ挿入部と を線で囲って示してある。Ｖ３アイソフォームはポリＡ⁺トラクトを有する先端 が切断された３'領域を有している。それぞれのアイソフォームの配列はGenBank に委託した（アクセス番号：Ｕ79663，Ｕ79664，Ｕ79665，Ｕ79666，Ｕ79667及 びＵ70668）。 図３はヒトα_IA電圧依存Ｃａ²⁺・チャンネル・サブユニットのノーザン分析を 示している。交雑はＳ−５ ｃＤＮＡをプローブとして用いて行われた。85kbの はっきりした帯がこのプローブに特異的な転写パターンと共に脳ｍＲＮＡ内に存 在していることが認められ、βアクチン・プローブを用いても検出されなかった 。脳から得たｍＲＮＡ内の転写は種々のスプライシング物、あるいは分解物との 交差交雑を反映して いる可能性はある。 図４は脊髄小脳運動失調患者親族でＣＡＧ反復を側鎖したＳ−５−Ｆ１及びＳ −５−Ｒ１プライマーで発生されたＰＣＲ−増幅生成物の分析を示している。図 ４ＡはＩＮＳＣＡ家族に属しているが連動失調患者の家族でない４人の冒された 個人（Ｉ．２，II．３，II．５及びII．７）からの27反復を有する拡張対立遺伝 子を示している。図４ＢはＭＳ２ＳＣＡ家族の全部で５名の冒されたメンバー（ II．１，II．２，II．３，III．１及びIII．２）で22ＣＡＧ反復の拡張対立遺伝 子が観察されることを示している。図４ＣはＭＤＳＣＡ家族内で23ＣＡＧ反復の 異常なサイズの対立遺伝子が二人の兄弟（II．１及びII．３）と一人の姉妹（II ．２）に存在しており、臨床的な運動失調は認められるがII．１の症状を発して いないII．１の娘では認められないことを示している。図４ＤはＳＩＳＣＡ家族 を示しており、５回の成熟分裂イベントで分離された２名の冒されたメンバー（ IV．１とIII．７）はその大型対立遺伝子上で同じ数の22ＣＡＧ反復を共有して いる。系譜を通じてこの対立遺伝子を追跡していくと、それらの冒された子孫（ III．５，II．２，II．４及びＩ．２）が拡張対立遺伝子を有する可能性が最も 高いことを示している。 発明の詳細な説明 本発明はトリヌクレオチド反復配列の不安定性によって引き起こされる病気を 発症する可能性がある個人を選抜する方法に向けられたもので、この方法は１つ かそれ以上のオリゴ ヌクレオチド・プライマーを用いてポリメラーゼ鎖反応によってテストされるべ き個人から得たサンプルでゲノムＤＮＡトリヌクレオチド反復配列を増幅して、 上記サンプル内で増幅されたゲノムＤＮＡトリヌクレオチド反復配列を検出する ことができるプローブで標識し、上記の増幅されたＤＮＡトリヌクレオチド反復 配列を上記標識されたプローブと交雑条件下で結合させて上記サンプル・ゲノム ＤＮＡトリヌクレオチド反復配列に関するサンプル交雑パターンをつくりだし、 病気にかかっていない個人起源の比較対象のゲノムＤＮＡトリヌグレオチド反復 配列を上記１つか複数のオリゴヌクレオチド・プライマーを用いてポリメラーゼ 鎖反応によって増幅させ、上記比較対象のゲノムＤＮＡトリヌクレオチド反復配 列を上記第２のアリコートと上記ゲノムＤＮＡトリヌクレオチド反復配列に関す る比較対象交雑パターンを形成する交雑条件下で結合させる。上記サンプルのゲ ノムＤＮＡトリヌクレオチド反復配列と上記比較対象ゲノムトリヌクレオチド反 復配列に関する上記交雑パターンと比較して、上記テスト対象の個人がトリヌク レオチド反復配列の不安定性によって引き起こされる病気を発症させる可能性が あるかどうかを判定し、上記サンプルＤＮＡトリヌクレオチド反復配列が上記比 較対象ＤＮＡトリヌクレオチド反復配列より大きな場合、その個人がトリヌクレ オチド反復配列の不安定性によって引き起こされる病気を発症する可能性がある とみなされるステップで構成されている。 本発明はさらに、病気を引き起こす対立遺伝子がトリヌクレオチド反復配列の 不安定性によるものである遺伝子を識別する方法を示し、その方法は、トリプレ ット塩基反復を有するオリゴヌクレオチドでライブラリーをスクリーニングし、 上記トリプレット塩基反復を有するクローンを同定し、そのトリプレット塩基反 復を側鎖しているヌクレオチドの配列を判定するために上記識別されたグローン の配列決定を行い、上記トリプレット塩基反復を側鎖しているヌクレオチドの上 記配列に対して相補的なプライマーを合成し、病気にかかった個人とかかってい ない個人の両方を含む多数の個人からＤＮＡを分離し、上記プライマーで分離さ れたＤＮＡを増幅して増幅されたトリプレット塩基反復領域をつくりだし、上記 多数サンプルの個人のそれぞれに関して上記トリプレット塩基反復領域内のトリ プレット塩基反復の数を判定して、罹病した個人でトリプレット塩基反復拡張が 比較的高い頻度で観察されるが、罹病していない個人では存在しないかあるいは 非常に低い頻度でしか発生しないかどうかについて判定して、罹病している個人 ではトリプレット塩基反復拡張が非常に高い頻度で観察されるが罹病していない 個人では存在しないか、あるいは非常に低い頻度でしか発生しない場合には、そ の病4気を引き起こす対立遺伝子がトリヌクレオチド反復配列の不安定性による ものと判定されるステップで構成されている。 本発明によれば、当業者に公知の従来の分子生物学、微生物学、及びＤＮＡ組 換え技術を用いることができる。そう した技術については文献で十分に説明されている。例えば、Maniatis，Fritsch 及びSambrook、“Molecular Cloning；A Laboratory Manual”（1982）；“ＤＮ Ａ Cloning A Practical Approach”、巻Ｉ及びII（D．N．Glover編集、1985） ；“Oligonucleotide Synthesis”（M．J Gait編集、1984）；“Nucleic Acid Hybridization”［B．D．Hames及びS．J．Higgins編集（1985）］；“Transcrip tion and Translation”［B．D．Hames及びS．J．Higgins編（1984）；“Animal Cell Culture”［R．I．Freshney編（1986）；“Immobilized Cells and Enzym es”［ＩＲＬ Press（1986）“；B．Perbal，“A Practical Guide To Molecula r Cloning”（1984）などを参照。 従って、ここに使われている以下の用語はそれぞれ以下のように定義されてい る。 『ベクター』とは、それに対して別のＤＮＡセグメントを取り付けてその取り 付けられたセグメントの複製が行われるようにすることができるプラスミド、フ ァージ、コスミドなどのレプリコンを意味する。ベクターはその投与が哺乳動物 受容体によって耐えられる場合には『薬学的に受け入れ可能』とされる。投与さ れた量が生理学的に有意である場合、そうした薬剤は『治療的に有効な量』で投 与されたとされる。例えば、レトロウイルス感染の治療においては、その感染の 程度あるいはその感染による生理学的損害を減少させることができる組成物は薬 学的に有効と考えられる。 『ＤＮＡ分子』とは単鎖形状あるいは二重鎖ら線形状のデオキシリボヌクレオ チド（アデニン、グアニン、チミン、あるいはシトシン）のポリマー性形態を意 味している。この用語はその分子の一次及び二次構造だけを意味しており、いず れの特有な三次形態に限定されない。従って、この用語は線形ＤＮＡ分子（例え ば、制限フラグメント）、ウイルス、プラスミド、及び染色体などに見られる二 重鎖ＤＮＡを含んでいる。ここで構造について言及する場合、従来の慣習に従っ て、ＤＮＡの非転写鎖（つまり、ｍＲＮＡとの相同性を有する鎖）に沿った５' −３'方向の配列だけを意味する。 ＤＮＡ『コード配列』は適切な調節配列の制御下で置かれた時にイン・ビボで ポリペプチドに転写、翻訳される二重鎖ＤＮＡ配列である。コード配列の境界は ５'（アミノ）末端の開始コドンと３'（カルボキシル）末端の翻訳停止コドンに よって判定される。コード配列は原核配列、真核ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、真核 性（例えば哺乳動物の）ＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、及び合成ＤＮＡ配列な どを含む。ポリアデニル化信号及び転写終末配列は通常３'からコード配列に位 置される。 本発明のプローブに関連してここで使われている『オリゴヌクレオチド』とい う用語は２つ以上、好ましくは４つ以上のリボヌクレオチドとして定義される。 その正確なサイズはオリゴヌクレオチドの最終的な機能と使用に依存する多くの 要因に依存している。 ここで用いられている『プライマー』という用語は、制限消化精製の天然性か 合成的につくられたものかを問わず、核酸鎖に相補的なプライマー拡張生成物の 合成が誘発される条件、つまり、ヌクレオチドとＤＮＡポリメラーゼの存在下、 適切な温度とpHとが満たされた状態に置かれた場合に合成の開始ポイントとして 機能することができるオリゴヌクレオチドを意味している。このプライマーは単 鎖と二重鎖のどちらであってもよく、誘発剤の存在下で望ましい拡張生成物の合 成を遂行させるのに十分な長さでなければならない。このプライマーの正確な長 さは温度やプライマーの供給源、それに、用いられた方法などを含む多数の要因 に依存する。例えば、診断目的の場合、標的配列の複雑さに応じて、オリゴヌク レオチド・プライマーは15〜25あるいはそれ以上のヌクレオチドを含んでいるが 、それ以下の場合もある。 ここで用いられている『制限エンドヌクレアーゼ』及び『制限酵素』という用 語は特定のヌクレオチド配列で、あるいはその近くで二重鎖を切断するバクテリ ア性酵素を指している。 これらの研究で最も一般的に用いられる標識は放射性元素、酵素、紫外線に当 てられた場合に蛍光を発する化学物質その他である。多数の蛍光物質が知られて おり、標識として用いることができる。これらには例えばフルオレスセイン、ロ ーダミン、オウラミン、テキサス・レッド、ＡＭＣＡブルー及びルシフェール・ イエローなどである。特定の検出物質はヤ ギで作成されイソチオシアネートを通じてフルオレスセインに接合される抗ウサ ギ抗体である。 以下の実施例は発明の種々の実施の形態を示すためであって、いかなる意味で も本発明の範囲の限定を意図するものではない。実施例１ Ｓ−５ ｃＤＮＡの単離 Ｓ−５ ｃＤＮＡの単離は放射標識・オリゴヌクレオチド・プローブ（ＧＣＴ ）７によって一次ヒト脳ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによっ て実行される。ヒト脳ｃＤＮＡはGuber及びHoffman法⁴⁴とClontech［Palo Alto ，Ca］から購入したｍＲＮＡを用いて誘導されたオリゴ−ｄ（Ｔ）である。ｃＤ ＮＡライブラリはＺＡＰ IIベクターにクローンするためのNot Ｉ制限リンカ ーによって構成される。このライブラリーは150mm Luriaブロス寒天プレートあ たり1000プラークの密度で植え付けされた。150,000一次クローンの全体をスク リーニングした。放射標識・オリゴヌクレオチド・プローブ（ＧＣＴ）７との交 雑は標準水性交雑溶液⁴⁵を用いて55℃の温度で実行された。フィルターは30分毎 に55℃の温度下で２×ＳＳＣと0.1％ＳＤＳによって３回洗浄した。交雑クロー ンはプラスミド・解放のために精製した。AutoGen740計を用いて、プラスミドＤ ＮＡを単離し、ＡＢＩキット及びＡＢＩ−373Ａシーケンサーに関する手順を用 いて配列決定を行った。ｃＤＮＡの配列決定をトリプレット反 復配列の存在を確認するために行った。Ｓ−５ ｃＤＮＡはこの方法を用いて得 られた387の独特な遺伝子組換えＤＮＡからの１つである。α_IAカルシウムチャ ンネルの追加クローンをＳ−５ｃ ＤＮＡをプローブとして用いることで単離し た。上のヒト脳ｃＤＮＡライブラリーに加えて、Strategene（LaJolla，Ca）か らのEcoクローニング・サイトを有する市販のヒト胎児脳ｃＤＮＡをスクリーニ ングし、ライブラリーから確認されたクローンを用いて、Not Ｉサイトからポ リ（Ａ）トラクトまでの３'領域を再構成した。実施例２ ＰＣＲ分析 α_IAカルシウム・チャンネル内のＣＡＧ長さ多型性の程度について以下のプラ イマー：Ｓ−５−Ｆ１（５'−ＣＡＣＧＴＧＴＣＣＴＡＴＴＣＣＣＣＴＧＴＧＡ ＴＣＣ−３'）（配列識別番号NO：１）及びＳ−５−Ｒ１（５'−ＴＧＧＧＴＡＣ ＣＴＣＣＧＡＧＧＧＣＣＧＣＴＧＧＴＧ−３'）（配列識別番号NO：２）を用い て判定を行ったが、α_IAカルシウム・チャンネル遺伝子の配列に基づくいずれの 適切なプライマーでもこの目的のために用いることができる。各反応を調べるた めに各プライマーの５pmolを0.05単位のポリヌクレオチド・キナーゼを用いて１ mCiの［γ−³²Ｐ］ＡＴＰで30分間エンド・標識した。各ＰＣＲ分析は、0.25単 位のTaqポリメラーゼ、125μMのｄＮＴＰ，10mMのトリス pH8.9，2.5mMのＭｇ Ｃｌ₂，30mMのＫＣｌ、及び3.5％（Ｖ/Ｖ）のグリセロール を含む総体積25ml内に放射標識したＳ−５−Ｒ１とＳ−５−Ｆ１プライマーをそ れぞれ5pmolずつ溶かしたものにゲノムＤＮＡを混ぜ合わしたものを20ng含んで いた。これらのサンプルを95℃で３分間変性させてから、変性（94℃で25秒間） 、アリーリング（68℃で30秒間）、そして増幅（72℃で２分間）のサイクルを28 回繰り返した。15mlのホルムアルデヒド負荷染料をその反応に加えて、混合物を 95℃で20分間変性させた。７mlは６％ポリアクリルアミド／８Ｍ尿素ゲルを通じ て電気泳動させた。対立遺伝子はＭ13配列決定ラッダーに対する移動を比較する ことによって判定した。用いられた比較対象のＤＮＡはＣＥＰＦ家系からの65サ ンプル、Molecular and Human Genetics社の種々の研究者によって提供された12 5の無関係な比較対象、糖尿病兄弟姉妹ペアからの160サンプル、41の散発的乳癌 症例、パーキンソン氏病症例からの42サンプル、発声障害症例からの24サンプル 及び突発性アルツハイマーの18サンプルを含んでいた。実施例３ ノーザン分析 複数のヒトの組織から得たポリＡ⁺ＲＮＡを含むノーザン・ブロットをClontec h社から購入した。200ngのＳ−５ ｃＤＮＡ挿入物をPharmacia社からのランダ ム・標識・キットを用いて［α−³²Ｐ］ｃＣＴＰで放射標識した。このプローブ をClontech社が推奨するプロトコールに従って65℃で一昼夜交雑させた。フィル ターは0.1ＸＳＳＣ、0.1％ＳＤＳで30分 毎に68℃の温度で３回洗浄してから、その後Ｘフィルムに露出させた。0.5ＸＳ ＳＣと0.1％ＳＤＳで68℃で軽く洗浄を繰り返したところ、異なった組織に多数 の帯が見られ、他のカルシウム・チャンネル遺伝子との反応が起きたことが示唆 された。実施例４ 結合分析 遺伝子型・データを検査したところ、ＣＡＧ反復の数の増大と運動失調表現型 との間に明らかな関連性が認められた。133人の運動失調患者のうち、８人では 反復長が20以上で、比較対象の方はいずれも反復長が16以下であった。この関連 性を運動失調症例における拡張の存在と比較対象を比較する２×２テーブルを用 いて統計的に評価を加えた。有意のレベルはFisherの正確さテストを用いて判定 した。 拡張と疾患が一緒に現れることを示すために、ハプロタイプ分析を行った。ひ とつの表現型（運動失調）と多型性（拡張）の両方を有するひとつの座の構造を モデル化するために、一方は病気の座で他方は多型性の座である２つの座を完全 に結合させ、完全な結合不均衡状態においた。ハプロタイプ頻度を何らかの種類 の優性遺伝性運動失調にかかっている全部で133件の症例を想定して計算した。 従って、各症例で突然変異を引き起こす１つの病気があるはずである。これらの 突然変異（約６％）のうちの８件はＣＡＧ反復拡張で起こされたもので、他の94 ％はこの遺伝子における非拡張性突然変異 か他の遺伝子における突然変異など、他の突然変異によって起こされたものであ った。ハプロタイプ頻度を計算するのに必要な追加的情報は未知の座での優性運 動失調症のポピュレーション頻度である。この頻度の推定値が高ければ高い程、 ロッド・スコアは低くなる。遺伝子頻度を1000で１とするこの分析で500を１と する控え目な数を用いた。その場合、４つの単一タイプ頻度を設け、0.999（運 動失調も拡張も認められない）、0.0（運動失調は認められないが、拡張は認め られる）、0.00094（運動失調は認められるが、拡張はない）、そして0.00006（ 運動失調と拡張の両方が認められる）とした。これらの多型性頻度を用いてＦＡ ＳＴＬＩＮＫバージョン3.0Ｐソフトウエア・プログラムを用いて４つの運動失 調症の遺伝を有する家族のロッド・スコアを計算した。すべての患者に対して病 状と遺伝子型を設定し、病気がなく遺伝子型も調べられていない個人は未知疾病 状態及び未知遺伝子型に分類した。 ひとつのＣＡＧ反復の拡張によって引き起こされる病気を確認するために、多 型性ＣＡＧ反復と比較的遅く神経退化性疾患を発症させたＤＮＡサンプルを用い て大規模な遺伝子型調査を行った。この調査はウサギα_IA電圧依存カルシウム・ チャンネルＢＩ−１遺伝子のヒト相同体が常染色体性優性脊髄小脳運動失調と診 断された患者の一部で拡張された多型性ＣＡＧ反復配列を含んでいることを報告 している。これらの結果はヒトα_IA電圧依存Ｃａ²⁺チャンネル遺伝子内でポリグ ルタミンをコード表現する性質を有するＣＡＧ反復の拡張が脊髄小脳運動失調症 の１つの形態の明らかな原因であることを示している。実施例５ ヒトα_IAカルシウム・チャンネル・サブユニット内でのＣＡＧ反復 トリヌグレオチド反復配列を含む遺伝子を確認するために、増幅されていない ヒトの脳ｃＤＮＡライブラリーを(ＧＣＴ)₇反復オリゴヌクレオチドをプローブ として用いることでスクリーニングした。これらのクローンの反復サイズは４〜 21個の範囲であった。dentatorubral-pallidoluysian atrophy／ハウ−リバー³ 及びマカド−ジョセフ病⁸遺伝子に対応する部分的ｃＤＮＡクローンがこのスク リーンで分離された。ＳＣＡ１，ＣＡＳ２，及びハンチングトン病遺伝子に対応 するｃＤＮＡクローンはこのスクリーニングでは分離されなかったが、その理由 は、それがオリゴ−ｄ（Ｔ）プライミングを用いて発生されたことを考えると、 これらの遺伝子のそれぞれにおけるＣＡＧ反復が大きな転写の５'領域に存在し ており、スクリーンされたｃＤＮＡライブラリーが３'ｃＤＮＡ末端に変移され ているからである可能性が最も高い。 十分に調べられた第１のクローンはＳ−５を設計するｃＤＮＡで13のＣＡＧ反 復を含んでいた。この1.2kbのｃＤＮＡの推定ペプチド配列はウサギα_IA電圧依 存Ｃａ²⁺チャンネル（Ｐ/Ｑ−タイブＣａ²⁺チャンネルとも言われる）のＢＩ− １アイソフォームに対して90％のアミノ酸同一性を有しており、Ｓ−５クローン がヒト相同体の部分的ｃＤＮＡであることを示唆している¹⁹。推定されたヒト・ ペプチド配列はラット脳α_IAＣａ²⁺チャンネル・サブユニットに対しても90％の 同一性を有している。ウサギＢＩ−１アミノ酸位置722−1036に対応する部分的 ヒトｃＤＮＡ配列はこれまでに、カルシウム・チャンネルのウサギ及びラットα_IA サブユニットに対してそれぞれ92％及び82％の同一性を有していることが報告 されている²¹。本発明によるｃＤＮＡはアミノ酸位置1325で始まるウサギ蛋白質 のカルボキシ末端領域に対応するコード配列を含んでいる。これらの配列データ は単離されたｃＤＮＡがカルシウム・チャンネルのヒトα_IAサブユニットをコー ドすることを示唆している。 Corriel社製の体細胞ハイブリッドマッピング・パネル＃２を用いて、α_IAＣ ａ²⁺チャンネルを配列タグ・サイト（ＳＴＳ）マッピングによってヒト・染色体 19に局所化した。Dirionnら²²はα_IAＣａ²⁺チャンネル・サブユニットの部分的 ｃＤＮＡクローンを用いてのヒト・染色体19p13へのマッピングについて報告し ている。この座の遺伝子記号はＣＡＣＮＬ１Ａ４を設計していた²²。ＣＡＣＮＬ １Ａ４遺伝子の部分ヒトｃＤＮＡ（ウサギＢＩ−１ヌクレオチド位置6487−7165 ）はMargolisら²³によって報告されており、染色体19に対してマップイングする ことが示されている。ヒトＣＡＣＮＬ１Ａ４の完全な配列について述べた報告は 最近Ophoffらによ って公表されている²⁴。 ウサギの場合、α_IAカルシウム・チャンネル・サブユニットの２つのアイソフ ォーム（ＢＩ−１及びＢＩ−２）が確認されている¹³。これらのアイソフォーム はカルボキシ末端配列が相互に異なっており、ＢＩ−２ではさらに151個のアミ ノ酸が加わっている。これらのアイソフォームは423個のヌクレオチドの挿入− 欠消の結果であると考えられる。ＢＩ−１内の423のヌクレオチドの存在は停止 コドンを誘導し、より短い2273アミノ酸アイソフォームをもたらす。ラットの脳 においては、少なくとも４つのα_IAＣａ²⁺チャンネル遺伝子が選択的にスプライ スされたアイソフォームが観察されたが、唯１つのアイソフォームの配列につい てだけ報告されている²⁰。 ウサギとヒトの配列を比較したところ、ＣＡＧ反復が保存され、ウサギα_IAＣ ａ²⁺チャンネルＢＩ−１とＳ−５ｃＤＮＡの未翻訳領域に位置していることが分 かった。ウサギＢＩ−１アイソフォームの３'未翻訳領域と本発明によるヒトＳ −５クローンとの間に高度の同一性（700個のヌクレオチドで84％同一）が認め られたことはさらに追加的なスプライス変異が起きる可能性と、その一部がＣＡ Ｇ反復が翻訳されている開放読み取りフレームを含んでいる可能性とを示唆して いる。このことを検証するために、一次ヒトｃＤＮＡライブラリーと市販の胎仔 脳ｃＤＮＡライブラリーとをＳ−５ ｃＤＮＡをプローブとして用いて再スクリ ーニングした。17の 追加クローンを分離し、これらのクローンを注意深く配列分析したところ、ヒト α_IAＣａ²⁺チャンネル（図１Ａ）のカルボキシ末端のいくつかの選択的にスプラ イスされたアイソフォームが確認できた。特に、これらのｃＤＮＡのうちの５つ はＳ−Ｒ ｃＤＮＡのＴＡＧ停止コドンの前に５つの塩基対ＧＧＣＡＧ）挿入を 含んでいる（図１Ｂ）。この５塩基対挿入を有するクローンはヒト遺伝子にさら に239のアミノ酸による拡張誘導開放読み取りフレームを有している。この５塩 基対配列をウサギＢＩ−１カルシウム・チャンネルのアミノ酸位置2273に試しに 挿入してみると、その推定読み取りフレームが237アミノ酸だけ拡張し、このヒ ト配列に対するペプチド相同物は高い割り合いで保存されたので（80％の同一性 ）、ウサギの脳でのそうしたアイソフォームの存在が強く示唆される（図２）。 このＢＩ−１（ＧＧＣＡＧ）アイソフォームでは、ＣＡＧ反復はヒト及びウサギ α_IAカルシウム・チャンネル遺伝子でアミノ酸2328から始まるポリグルタミンを コード表現する。 ヒトα_IAＣａ²⁺チャンネル遺伝子の別のアイフォソームも他のクローンで観察 された。これらのいずれもクローニングによる人工産物からもたらされたもので ないことを確かめるために、各アイソフォームに対して少なくとも２つの独立の クローンを単離して配列決定した。全体で、ヒトの場合にもＢＩ−１と呼ばれる ウサギＢＩ−１アイソフォームと同じ変種を含む６つの変種が観察された。ＢＩ −１（Ｖ１）を設計 する変異は94塩基対配列を有しており、これはヌクレチド・レベルでＢＩ−１と は異なっているが、アミノ酸レベルでは相同であった。この変種はウサギでも発 見されている¹⁹。この研究で単離されたＢＩ−１（Ｖ１）アイソフォームはOphn offらが述べた推定ペプチド配列と99.8％の同一性を有していた²⁴。位置1460（A la−Gly）、1605（Ala−Val）、そして1618（Ala−Val）でのアミノ酸レベルで の３つの違いがある。推定配列内のこれらの位置のアミノ酸は分析されたいくつ かのクローンで一貫性があり、ウサギ及びラットα_IAＣａ²⁺チャンネル・サブユ ニット推定アミノ酸と同じであった。ＢＩ−１及びＢＩ−１（Ｖ１）アイソフォ ームはＧＧＣＡＧ挿入との組み合わせで観察される（それぞれ配列識別番号NO： ３及び配列識別番号NO：４）。さらに別のスプライス変異は36ヌクレオチド欠失 を有するＢＩ−１（Ｖ２）−ＧＧＣＡＧ（配列識別番号NO：５）と先端が切断さ れた３'ＢＩ−１−（Ｖ２，Ｖ３）を有する変異などを含んでいる（図１Ａ）。 確認されたクローンはこれらの変異の異なった組み合わせと非変異セグメントで の同じ側鎖配列を有しているのでクローニングによって人工的につくりだされた ものではない。 複数のアイソフォームの存在と一貫しているが、Ｓ−５ｃＤＮＡによる高交雑 度でのノーザン分析では脳の優勢サイズｍＲＮＡの上と下の汚点に重なった8.5k bの単一帯が得ら４れた（図３）。低交雑度では、すべての組織で多くの追加的 な帯が観察され、これは他のタイプのカルシウム・チャンネルへの交差交雑が起 きた可能性を示唆している（データは示さず）。サイズが1.2〜3.1kbの範囲のヒ ト脳ライブラリーからのこれらグローンのすべてはヒトα_IAＣａ²⁺チャンネル・ サブユニットのカルボキシル領域だけを示している。単一のヒトｍＲＮＡ供給源 から誘導されたそれぞれの成人脳ｃＤＮＡ内のＣＡＧ反復は11か13のいずれかの 反復を含んでおり、相同性染色体対から転写された多型性ＣＡＧ対立遺伝子の表 示を示している。実施例６ 拡張ＣＡＧ反復に関する大規模遺伝子型調査 ヒトのα_IAＣａ²⁺チャンネル・サブユニットの通常の長さ多様性からは区別が つけられる異常な長さのＣＡＧ反復配列を識別する可能性について運動失調患者 の大規模遺伝子型調査を行って調べた。この技術は、トリヌクレチド拡張がＳＣ Ａ６に関与しているのであれば、冒された個人で比較的高い頻度で拡張が観察さ れるが、非疾患対立形質ではまったく存在しないか、あるいは低い頻度で起きる であろうという推測に基づいている。 一般的な集団からの無関係な、そして運動失調症を有してぃない個人475人か ら集めたＤＮＡサンプルと進行性脊髄小脳運動失調を有することが知られている 無関係なインデックスケースからの133のＤＮＡサンプルの分析を行った。ヒト のα_IAＣａ²⁺チャンネル・サブユニットのＣＡＧ反復配列を 側鎖した放射標識合成オリゴヌクレオチド・プライマーの対を用いて、各サンプ ルのＣＡＧ反復領域を増幅させ、ＣＡＧ反復領域のサイズをゲル電気泳動法で判 定した。運動失調グループ・サンプルの反復サイズを一般集団・サンプルのＤＮ Ａからのものと比較した。 表１は脊髄小脳運動失調を有する133名のインデックス患者のα_IAＣａ²⁺チャ ンネル・サブユニット遺伝子におけるＣＡＧ反復サイズの分布と、475の運動失 調非発症サンプルのα_IAＣａ²⁺チャンネル・サブユニット遺伝子におけるＣＡＧ 反復サイズの分布を示している。一般ポピュレーションのコーカシア、アフリカ ン・アメリカン、ヒスパニック及びアジア系を含む比較対象及び患者集団の人種 的背景は４〜16のＣＡＧ反復単位範囲の対立形質と71％の異型接合性を示した。 脊髄小脳運動失調症患者においては、ＣＡＧ反復の数は７〜27の範囲で、異型接 合性は74％であった。対立形質サイズ分布から分かるように、133の運動失調症 インデックスケースのうちの８つの非血縁の患者（６％）は少なくとも21ＣＡＧ 反復単位の大規模対立形質を有していた。拡張は比較的小さいが、運動失調症を 発症していない比較対象からの475名の個人ではそれが観察されなかったので、 正常な長さの多様性である可能性は非常に低い（Fisherの正確度検定ではＰ＜10^-5 ）。 これら８つのインデックスケースからのゲノムＤＮＡをＳ−５プライマーで増 幅して、サブクローン化してから、配列 決定を行った。配列分析から得られたＣＧＡ反復単位の数はα_IAＣａ²⁺チャンネ ル・サブユニットの純粋なＣＡＧ反復単位の数の増大と一貫した傾向を示した。 これらの拡張された対立形質におけるＣＡＧ反復の数の違いは稀にあるファウン ダー対立遺伝子とははっきり対称を示している。運動失調症集団で拡張サイズの 異常な対立遺伝子が観察されることと一般ポピレーションでそれが見られないこ とはこれらの拡張された対立遺伝子が分析された運動失調症患者の一部の突然変 異を示している可能性との一貫した傾向性を示す。 大規模遺伝子型表現の方法はα_IAＣａ²⁺チャンネル・サブユニット遺伝子での ＣＡＧ拡張を確認するのに有効であった。従って、こうした考え方はトリプレッ ト反復疾患現象に伴う他の突然変異タイプの研究にも適用できる可能性がある。 基本的に、トリヌクレオチド反復拡張は疾病表現系においては高い頻度で現れる が非疾患表現系では存在しないか、低い頻度でしか表現されない対立遺伝子に関 連していると人は仮定する。従って、大規模遺伝子型表現は位置クローニング法 を含め、他のヒトの疾患遺伝子を確認するために用いられる方法とは異なってい る。位置クローニング法では、候補となる疾患遺伝子を単離する前に特定の染色 体領域に遺伝子結合を行っておくことが求められる。位置クローニングはハンチ ングトン病、脊髄延髄運動失調症、脊髄小脳運動失調症タイプ１、脊髄小脳運動 失調症タイプ２、脊髄小脳運動失調症タイプ３／マカドージョセフ病の遺伝子や フラジャイルＸ及び萎 縮性筋ジストロフィーに関連した遺伝子の識別に用いられている。 本発明の方式はまた、遺伝子の識別で非系統的戦略が用いられるヒトの疾患に 対するランダム候補方式とも異なっている。ランダム候補遺伝子方式はdentator obural-pallidoluysian運動失調症／ハウ−リバー症候群遺伝子の識別に用いら れた。本発明の戦略は疾患遺伝子のトリプレット反復配列が長さにおいて多型性 を持っており、それがそれらの遺伝子を大規模遺伝子型表現のために用いやすく しているという観察に基づいている。この大規模遺伝子型表現方式は非疾患集団 と比較しての病気をもった個人での異常な対立遺伝子サイズを識別する。こうし た考え方に基づく戦略は位置クローニングでの最初のステップで用いられるよう な家系における特定の遺伝子関係（結合）の特定というこれまでの必要性をなく すものである。本発明による大規模遺伝子型表現戦略は直接的遺伝子対疾病状態 表現方式である。 本発明の別の目的においては、トリプレット塩基反復を有するオリゴヌクレオ チドでライブラリーをスクリーニングし；上記トリプレット塩基反復を有するク ローンを識別し；そのトリプレット塩基反復を側鎖しているヌクレオチドの配列 を判定するために上記識別されたクローンの配列決定を行い；上記トリプレット 塩基反復を側鎖しているヌクレオチドの上記配列に対して相補的なプライマーを 合成し；病気にかかった個人とかかっていない個人の両方を含む多数の個人から Ｄ ＮＡを分離し；上記プライマーで分離されたＤＮＡを増幅して増幅されたトリプ レット塩基反復領域をつくりだし；上記多数サンプルの個人のそれぞれに関して 上記トリプレット塩基反復領域内のトリプレット塩基反復の数を判定して、罹病 した個人でトリプレット塩基反復拡張が比較的高い頻度で観察されるが、罹病し ていない個人では存在しないかあるいは非常に低い頻度でしか発生しないかどう かを判定して、罹病している個人ではトリプレット塩基反復拡張が非常に高い頻 度で観察されるが罹病していない個人では存在しないか、あるいは非常に低い頻 度でしか発生しない場合には、その病気を引き起こす対立遺伝子がトリヌクレオ チド反復配列の不安定性によるものと判定される、病気を引き起こす対立遺伝子 がヌクレオチド反復配列の不安定性によるものである遺伝子を識別する方法が提 供される。実施例７ 運動失調症患者における拡張対立遺伝子の遺伝 インデックスケースのうちの４つはさらに別の冒されたメンバーについて臨床 的に評価を行い、遺伝子型分析のためにＤＮＡを得ることができた家系である。 目的を知らされた後で、21名の家系構成員によるこの研究への参加が得られた。 21名のうち14名は運動失調症の臨床的な証拠を有していた。これらの家族のそれ ぞれで、常染色体優性状態で遺伝されており、発病の年齢は28才から50才の範囲 であった。 Ｓ−５プライマーを用いてのこれら家族メンバーの遺伝子型に関する分析を行 ったところ、各家族で疾患表現型で分離された拡張対立遺伝子が認められた。例 えば、図４ＡはＩＮＳＣＡ家系の４人の罹病個人に27の反復を有する拡張対立遺 伝子が存在しているが遠い関係にあるメンバーを含めて非病態状態の家族メンバ ーのいずれにおいてもそれは認められなかったことを示している（データ示さず ）。この族で、発病の年齢は28才から31才で、非病態状態の個人のうちの３人は 41才以上であった。図４Ｂは22反復の拡張対立遺伝子がＭＳ２ＳＣＡ家のすべて の罹病メンバーで観察されたことを示している。ＭＤＳＣＡ家においては（図４ Ｃ）、23ＣＡＧ反復の異常なサイズの対立遺伝子は臨床的な運動失調症を有する ２名の兄弟（II．１とII．３）と１名の姉妹（II．２）に存在していたが、II． ３の非病態状態の娘には存在していなかった。図４Ｄに示すＳＩＳＣＡ家では、 ５回の成熟分裂で分離される２名の罹病メンバー（IV．１とIII．７）が彼らの 大型の対立遺伝子上に22のＣＡＧ反復を有していた。系譜を通じてこの対立遺伝 子を追跡すると、彼らの祖先で発病した者（III．５，II．２，II．４及びＩ． ２）はこの拡張対立遺伝子を有していた可能性が非常に高いことが分かった。こ れらの家族でこの病気を有する拡張対立遺伝子が存在していることは、罹病個人 からの遺伝子型データをＦＡＳＴＬＩＮＫコンピュータ・プログラム（上記参照 ）のバージョン3.0Ｐを用いて分析したところ、遺伝子組換え頻度が０で累積ハ プロタイプ・ ロッド・スコアが5.08で示されるように高度に有意である^26'27。各族のロッド ・スコアを表２に要約して示す。まとめて言うと、拡張対立遺伝子が脊髄小脳運 動失調症と診断された患者だけに観察されて475名の運動失調症にかかっていな い個人においては観察されなかったという統計学的に有意な知見とこれらの拡張 遺伝子のはっきりした関係とはα_IA電圧依存Ｃａ²⁺チャンネル・サブユニットに おけるポリグルタミン拡張が優性遺伝運動失調症の後期発症の原因であることを 示している。 実施例８ ＣＡＧ反復拡張を有する患者での臨床的及び病理学的知見 上に述べた家系での患者の臨床的な特徴は手足及び歩行における軽くはあるが ゆっくりと進行する脊髄小脳運動失調症、 遺伝性自立神経不全、眼球振盪症、及び軽度の振動及び刺激感覚喪失という点で 非常に類似しており、一貫して優性である。これらの病気は非常に潜行性であり 、ほとんどの患者は最初は罹病していることに気づいていないが、急に回転した り激しく動いたりすると瞬間的にバランスを喪失する感覚があったり「頭がぼん やりしたり」する感じがすると述べている。一般的に、これらの患者が彼らが恒 常的なバランス及び運動調整上の困難さを自覚するのは、こうした最初の感覚が あってから何年も経った後である。この病気は通常20〜30年かけて進行し、歩行 が困難になり、それらの患者は車椅子の使用を余儀なくされる。何人かの老齢の 患者では、呼吸困難が認められ、脳幹が関与していることが示唆され、また、こ の病気はＭＤＳＡ及びＭＳ２ＳＣＡ家の数名のメンバーでは死因であった。この 症状は通常拡張対立遺伝子反復数が22〜23のＭＤＳＣＡ，ＳＩＳＣＡ及びＭＳ２ ＳＣＡ家ではそれらの患者が40代に達した時に発生するが、ＩＮＳＣＡ家の場合 は、拡張対立遺伝子が27の反復を含んでおり、発病は罹病個人が28〜31才の年齢 範囲に達した場合である。罹病した個人の脳を磁気共鳴画像形成したところ、孤 立した脳麻痺が明らかになった。ＳＩＳＣＡ家の２人の罹病メンバーについて詳 細な神経学的調査を行ったところ、はっきりした脳性麻痺と非常に軽度の脳幹麻 痺が示された²⁸。顕微鏡検査では脳のプルキニエ細胞のかなりの喪失、顆粒細胞 の軽度の喪失及び変性核ニューロン、及び劣性軽度から中程度のニューロン喪失 が明らかになった。 遺伝性脳性運動失調症は小脳およびその求心性及び遠心性接続部の機能不全に 関連した神経性不全の雑多なグループである。今日までのところ、それぞれＳＣ Ａ１，ＳＣＡ２，ＳＣＡ３，ＳＣＡ４，ＳＣＡ５及びＳＣＡ７と呼ばれる座を有 するヒト常染色体６，12，14，16，11及び３に対して６つの常染色体優性脊髄小 脳運動失調（ＳＣＡ）がマップされている¹⁰。優性遺伝性及び進行性運動失調症 を有する多くの家系でのこの遺伝子のマップ位置はまだ分かっていない。α_IAＣ ａ²⁺チャンネル・サブユニットのヒト・染色体19ｐ13に対するマッピングと４つ の家系における突然変異メカニズムとしてのこのチャンネルにおけるＣＡＧ反復 拡張の識別によってＳＣＡ６と呼ばれるヒトのクロモソーム19ｐ13上の新しいＳ ＣＡ座が明らかになる。 過去においては、ＳＣＡ６という用語は公知の座のいずれにもマップされない 優性遺伝性ＳＣＡについて述べる際に用いられていた^29'30。このマッピング命 名法は染色体19ｐ13にマッピングする優性遺伝性運動失調症マッピングに対して ＳＣＡ６座を割り当てるように改訂された（ＨＧＭ命名委員会）。遺伝性激発性 脊髄小脳運動失調症（ＨＰＣＡ）あるいは一過性運動失調症（ＥＡ）も19ｐ13領 域にマップされている^31-32。別の一過性疾患である家族性半身不随性偏頭痛（ ＦＨＭ）₃₃もＨＰＣＡ/ＥＡに関与する遺伝子があるとされている領域内の19ｐ1 3に局所化されている。ＨＰＣＡある いはＥＡを有する患者は通常周期的な運動失調症に襲われ、発作と発作の間は見 かけ上正常な状態を維持する。これは運動失調症が恒常的になる何年も前に、そ の患者が示した一過性感覚不安定の後遺症である。ＨＰＣＡ/ＥＡの神経学的検 査で認められる唯一の持続的な異常性は振盪の存在で、これはすべての患者で認 められる。脳画像形成研究によれば一部のＨＰＣＡ/ＥＡ患者は脳性麻痺を有し ていることが明らかにされた³¹。興味深いことに、ＦＨＭを有するいくつかの家 族では、罹病メンバーは、ＨＰＣＡ/ＥＡにみられたものと同様に運動失調症、 振盪及びその他の脳全庭視覚以上に関係している退化性脳性麻痺を示している³⁴ 。これら２つの不全の表現型が重なっていることは、ＨＰＣＡ/ＥＡとＦＨＭが 恐らくその症状の周期的性格の故にイオン・チャンネル遺伝子における突然変異 によって起こされる対立遺伝子性不全であるという仮説を導いた^32'34。 最近、OphoffらはＦＨＭを有する家族のヒトα_IAＣａ²⁺チャンネル・サブユニ ット遺伝子における４つのミスセンス突然変異とＥＡを有する家族の同じ遺伝子 の読み取りフレームを破断する２つの突然変異の例を報告した²⁴。これらの結果 と本発明とは、ＦＨＭ，ＨＰＣＡ/ＥＡ及び進行性ＳＣＡ６が対立遺伝子性不全 であることを示している。この突然変異の性質（ＨＰＣＡ/ＥＡでの蛋白質先端 切断に対してＳＣＡ６ではＣＡＧ反復）はこの病気の臨床経過にも影響を及ぼす 。恒常的で進行性の小脳及び脳幹機能不全がＳＣＡ６で観察さ れるのに対して、ＨＰＣＡ/ＥＡでは軽度及び中程度の脳性機能不全が観察され る。このことはグルタミン拡張が進行性神経喪失をもたらすような形態でそのチ ャンネルの機能に影響を及ぼすことを示唆している。これは神経伝達子放出の変 化か、あるいは細胞の死をもたらす異常なレベルの細胞内Ｃａ²⁺の発生によって 行われる可能性が強い^21'35。現段階では、これらの突然変異のぞれぞれが周期 的な神経機能不全及び恒常的／進行性疾患にどのような病理的影響を及ぼすのか は判断できず、形質導入マウス・モデル及び神経生理学的研究の成果を待つ必要 があるであろう。ＳＣＡ６家系のＣＡＣＮＬ１Ａ４遺伝子における他の突然変異 の可能性も排除できないが、８つのそれぞれ無関係な運動失調症遺伝家系での拡 張と疾患表現型との間の高度の有意関連性（Ｐ＜10^-5）及び４つの家系（世代間 不安定性がない）における拡張対立遺伝子の反復数の違いはこれが病気を発生さ せる突然変異であることを強く示唆している。また、Ophoffらが²⁴彼らが遺伝子 型表現を行った50人の正常な個人では拡張対立遺伝子をまったく観察しなかった ことも重要である。 ＳＣＡ６内の突然変異メカニズムは他の優性遺伝性進行性運動失調症の場合と 同様に翻訳されたＣＡＧ反復の拡張を含んでいることは明らかにされたが、その 病原性メカニズムが同じであるかどうかは分からない。ＳＣＡ６における突然変 異とＳＣＡ１，ＳＣＡ２，ＳＣＡ３，ＨＤ，ＤＲＰＬＡ及びＳＭＢＡを起こすも のとの間には２つの重要な違いがある。 その第１はＳＣＡ６の拡張された突然変異対立遺伝子（21〜27反復）は他の神経 退化性疾患のいずれでみられる拡張対立遺伝子（36〜121反復）よりはるかに小 さく、多くの非罹病個人の他の座で見られるポリグルタミントラクトの通常の範 囲に十分に入るものであることである。第２に、ＣＡＧ反復拡張は正常なプルキ ニエ機能及び生存において重要な役割を果たす遺伝子のコード表現領域に起きる ことである^19'25。このことはＣＡＧ拡張がα_IAカルシウム・チャンネルの正常 の機能に直接干渉して病原的作用を及ぼしている可能性を示唆する。 電圧依存カルシウム・チャンネルはカルシウムのニューロン及びその他の励起 可能細胞への侵入を媒介し、膜励起性、神経伝達子放出、及び遺伝子発現などを 含む種々の神経機能において重要な役割を果たす³⁶。カルシウム・チャンネルは そのチャンネル活性が主として孔形成ａ₁サブユニットによって媒介される多重 サブユニット複合体であるが、ｂ，ａ₂/ｄ及びｇなどの他のサブユニットもチャ ンネル活性を調節する必須蛋白質として機能する^36-38。６つのａ₁遺伝子をコー ドするｃＤＮＡをクローン化して、α_1A,B,C,D,E及び_Sと命名した³⁹。本発明に おいて特徴づけられているヒトの遺伝子はウサギ及びラットα_IAアイソフォーム と非常に相同である^19'20。ヒト・染色体19へのマッピング・アサインメントは α_IAアイソフォームをコード表現するヒトの配列の染色体19ｐ13への従来のマッ ピングと一貫性を持つ^22-24。電気生 理学及び薬学的特性の組み合わせが哺乳動物の抹消及び中枢ニューロンの高域値 カルシウム・チャンネルの４つの主要型を特徴づける⁴⁰。これらはＬ，Ｎ，Ｐ及 びＱと呼ばれ、Ｐ−タイプ・チャンネルがブルキニエ細胞では優性カルシウム・ チャンネルであり、Ｑタイプが脳顆粒細胞において優性なカルシウム・チャンネ ルである^25'38。クローン化されたα_IAアイソフォームはＰ及び／又はＱタイプ のカルシウムの流れをつくりだすことが示されている^38'40。確認されている別 のアイソフォームもＰ/Ｑタイプのカルシウムの流れで観察される機能的な相違 の一部を解明するのに役立つ可能性がある。α_IAチャンネルの薬学的及び電気生 理学的性質はそのラットの小脳での豊富な表現と合わせて、カルシウムの侵入及 びプルキニエ細胞におけるホメオスタシスにおけるその重要性を示している。 最近、α_IA電圧依存サブユニット遺伝子のマウス相同体が突然の発作や脳の運 動失調症を示すふらつき（ｔｇ）及び体の痩せた（ｔｇ^la）マウスでの突然変異 した遺伝子の識別することを目的とした位置クローニング戦略を用いて識別され た⁴²。この座はヒト19ｐ13と同様の領域のマウス・クロモソーム８にマップされ る。ｔｇ突然変異、つまり位置1802でのＣからＴへの変化は第２の膜横断領域の 細胞外セグメントの保持されている孔被覆領域に非常に近い位置でのプロリンか らロイシンへの保存されない置換を引き起こす。この突然変異は運動失調症、運 動筋肉及び不在タイプの発作を伴う退行 性神経不全につながる。 ｔｇ^laはＣ末端細胞内領域内に配置されるイントロンの5’末端でのスプライ ス・ドナー・コンセンサス配列におけるＧからＡへの単一の変化である。この突 然変異はＲＴ−ＰＣＲで検出される２つの異常にスプライスされたｍＲＮＡ、イ ントロンをスプライスすることができなかったことで発生するより大型のフラグ メントと１つのエクソンのスキッピングから発生する小さ目のフラグメントとを 発生させる。両方の転写体とも読み取りフレームを変移させて異常な蛋白質を発 生させる性向を有する。スプライス突然変異を有するホモ接合のｔｇ^laマウスは ｔｇマウスと比較するとより深刻な運動失調症及び脳性退化を有している。 α_IAＣａ²⁺チャンネルの突然変異がマウスにおける脳性運動失調症及びプルキ ニエ及び顆粒細胞の退化と関連しているという知見は、このチャンネルが小脳に おける正常なプルキニエ及び顆粒細胞機能にとって重要であるという仮説を裏づ けるものである。マウスにおけるこれら２つの退行的性質とｔｇ^la突然変異が異 常な蛋白質を発生させるという事実はこれらの突然変異が機能メカニズムの喪失 を通じて運動失調表現型を引き起こすことを示唆している。ｔｇ^laマウスの突然 変異はヒト遺伝子において、推定されるグルタミントラクトの位置からすぐ上流 のチャンネルのカルボキシ末端位置を変化させる。これらのデータはヒトα_IAＣ ａ²⁺チャンネル・アイソフォームにおける軽度のグルタミン拡張が脳の退化と運 動失調症をもたらすメカニズムに関しての興味深い問題を提起する。この病気の 優性的性格は以下の３つの可能性、つまり、（１）単一不全による機能の喪失、 （２）その拡張による優性的否定的作用、あるいは（３）ＣＡＧ反復拡張によっ て引き起こされる他の病気によって示唆されているような機能の新たな獲得、の ３つの可能性を示唆している。突然変異によってヘテロ接合性を示すｔｇ及びｔ ｇ^laマウスにおける運動失調症表現型の欠如は機能の喪失という仮説を強く否定 するものであろう。しかしながら、マウスにおけるいずれかの突然変異が本当に α_IAチャンネル機能の喪失につながること、そしてヘテロ接合性を示すマウスが 運動失調症やプルキニエ細胞退行を示さないということを十分な定量的測定で確 認するまでは、このモデルを排除することはできない。一部の患者における見え にくく軽度の性質を考えれば、マウスで軽度で潜行性の運動失調症表現型を確認 することは非常に難しいであろう。優性否定的メカニズムを発生させるモデルは ヒトの家族における遺伝パターン及びこれまでｔｇマウスに関して得られている データとの一貫性を有している。このモデルでは、グルタミントラグトの小さな 拡張がその対合蛋白質に結合するか、あるいはその活性を調節することが知られ ているその他の付属チャンネル蛋白質との関係を妨害するかのいずれかによって 、そのチャンネルの正常な機能に干渉する可能性がある。α_IAＣａ²⁺チャンネル が電気生理学的なデータ⁴³及びｔｇマウスでのデータに基づいて正常なプルキニ エ細胞機能に対して重要な役割を果たしていることが知られていることを考えれ ば、グルタミン拡張がその蛋白質に機能を新しく獲得させると主張することは困 難である。グルタミン拡張は構成的活性化の可能性を含めて異常なチャンネル機 能をもたらす可能性が非常に高い。種々のモデルの最終的な検証は、α_IAＣａ²⁺ チャンネル遺伝子を欠いているマウス及びＳＣＡ６疾患範囲でのＣＡＧ拡張を有 する対立遺伝子を表現するマウスを何世代分かつくりだすことによって可能にな るであろう。 ＳＣＡ６の遺伝子型／表現型相関は、27反復を有する家族のすべてのメンバー において発病の年齢（28〜31才）が反復サイズが22〜23の範囲の場合の他の家族 （40〜50才）と比較して非常に異なっていることを考えれば、拡張が非常に望ま しくない影響を及ぼすことを示唆している。現在の段階で、遺伝子型／表現型相 関性についてしっかりした結論を導き出すにはサンプルのサイズが小さ過ぎるが 、ＳＣＡ６よりは軽度のＨＰＣＡ/ＥＡを有する一部の患者の場合は拡張がもっ とずっと小さいという事実は興味深い。さらに、α_IAＣａ²⁺チャンネルにおける 異なった突然変異がＳＣＡ６につながるのかどうかを調べることは重要であろう 。ＳＣＡ６におけるＣＡＧ反復は検出可能なあるいは世代間での対立遺伝子の変 化を示さないまま安定している。これは、他の多くの座での同様のサイズのＣＡ Ｇ反復が安定した状態で伝達されることを考えれば驚くべきことでもない。しか しながら、一般的な 集団における反復のサイズと異なったＳＣＡ６家族における拡張対立遺伝子のサ イズの違いはある程度の不安定性がこの座で起こること、そしてそうした不安定 性が突然変異的な拡張をもたらし、疾病を引き起こす対立遺伝子範囲に変化した ことを示唆している。 結論として、本発明はプルキエニ細胞タイプのＣａ²⁺チャンネルのヒトα_IAサ ブユニットがプルキエニ細胞の退化及び脳性運動失調症につながることを示した 。この知見の中間的な示唆は臨床的でもあり、生物学的でもある。比較的小さな ＣＡＧ反復が異常な蛋白質機能につながる場合があるという観察はそうした反復 の作用についての新しい考え方と病原的作用についてそれぞれを慎重に調べる必 要性を示している。最後に、ヒト・カルシウム・チャンネルにおけるグルタミン トラグトの拡張は、それらがカルシウム・ホメオスタシスと他のグルタミン媒介 神経退化プロセスにおけるそうしたメカニズムにおいて果たしている可能性のあ る役割についての洞察を与えてくれる。 ここでは以下の文献が引用された。 1. Warren，S．T．：The expanding World of trinucleotiderepeats．Science 271，1374−1375（1996） 2. ハンチングトン病共同研究グループ。A novelgene containing a trinucleo tide repeat that is expended and unstable on Huntington's disease ChrAom osomes．Cell 72，971−983（1993） 3. La Spada，A．R．Wilson．E．M.，Lubahn，D．B.，Harding，A．E．& Fishb eck，H．Androgen receptor gene mutations in X-linked spinal and bulbar m uscular atrophy．Nature 352，77−79（1991） 4. Orr．Hら、Expansion of an unstablet rinucleotide（ＣＡＧ）repeat in spinocerebellarataxia type Ｉ．Nature Genet ４，221−226（1993） 5. Pulst，S，ら。Moderate expansion of a normally biallelic trinucleoti de repeat in spinocerebellar ataxia type2．Nature Genet．14，269−276（1 996） 6. Sanpei，Kら。Identification of the gene for spinocerebellar ataxia t ype 2 using a direct identification of repeat expansion and cloning tech nique，ＤＩＲＥＣＴ．Nature Genet．14，277−284（1996） 7. Imbert，G．ら。Cloning of the gene for spinocerebellar ataxia 2 reve als a locus with high sensitivity to expanded ＣＡＧ/glutamine repeats．Nature Genet．14，285−291（1996）． 8. Kawaguchi，Yら。CAG expansions in a novel gene for Machado-Joseph di sease at chromosome 14q32．1．Nature Genet ８，221−233（1994） 9. Koide．Rら。Unstable expansion of CAG repeat in hereditary dentatoru bral-pallidolusyan atrophy（ＤＲＰＬＡ）．Nature Genet ６，９−13（1994 ） 10． Zoghbi，H.Y．& Caskey，C.T.，Inherited disorderscaused by trinucle otide repeat expansions.Advances in Human Genetics. Vol（印刷中）（編集 ：Harris，H．& Hirschorn，K．H．）（Plenum，New York，1996） 11. Verkek，A．J．M．Hら。Identification of a gene（ＦＭＲ−１）contain ing a CGG repeat coincident with a breakpoint cluster region exhibiting length variation in fragile X syndrome．Cell 65，905−914（1991） 12. Gu，Y.，Shen Y.，Gibbs，R．A．及びNeilsen，D．L．Identification of ＦＭＲ２,a novel gene associated with the ＦＲＡＸＥＣＣＧ repeat and Cp G island．Nature Genet 13，109−113（1996） 13. Fu，Y−Hら。An unstable triplet repeat in gene relatedto myotonic m uscular dystrophy．Science 255，1256−1259（1992）． 14. Campuzano，Vら。Friedreich's ataxia;autosomal recessive disease cau sed by an intronic ＧＡＡ triplet repeat expansion．Science 271，1423− 1427（1996）． 15. Chong，S．S.，McCall，A．E.，Cota，J.，Subramony，S．H.，Orr，H．T. ，Hughes，M．R.，& Zoghbi，H．Y Cametic and somatic tissue-specific hete rogeneity of the expanded ＳＣＡｌ ＣＡＧ repeat in spinocerebellar atax ia type 1．Nature Genet. 10，344−353(1995)。 16. Telenius，Hら。Molecular analysis of juvenile Huntington disease：t he major influence on（ＣＡＧ）in repeat is the sex of the affected pare nt．Hum. Mol. Genet ２，1535−1540（1993） 17. Housman，D，Gain of glutamines，gain of function．Nature Genet 10 ，３−４（1995）． 18. Troitter，Yら。Polyglutamine expansion as a pathological epitope in Huntington'sdisease and four dominant cerebellar ataxias．Nature 378， 403−406（1995） 19. Mori，Yら。Primary structure and functional expression from complem entrary ＤＮＡ of a brain Calcium channel．Nature 350，398−402（1991） 20. Starr，T．V．B.，Prystay，W．& Snutch，T．P，Primary structure of a Calcium channel that is highly expressed inthe rat cerebellum．Proc ．Nat．Acad．Sci．USA 88，56 21−5625（1991）。 21. Rettig．J.，Sheng，Z−H.，Kim．D．K.，Hodson，C．D.，Snutch，T．P. ，& Catterall，W．A.，Isoform-specific interaction of the α_IA subunits of brain Ｃａ²⁺channels with the presynaptic proteins syntaxin and ＳＮ ＡＰ−25．Proc ．Natl．Acad．Scie．USA 93，7363−7368（1996） 22. Diriong，S．Willialns，M．E.，Ellis，S．B.，Harpold，M．M．& Taviau x，S.，Chromosomal localization of the human genes for α_IA，α_IB and α_IE voltage-dependent Ｃa²⁺ channel subunits．Genomics 30，605−609（1995 ）。 23. Margolisら。Characterization of ｃＤＮＡ clones containing ＣＣＡ t rinucleotide repeats derived from human brain Somat. Cell Mol. Genet 21 ．271−284（1995） 24. Ophoff，R．A．ら。Familial hemiplegic migraine and episodic ataxia type 2 are caused by mutations in the Ｃａ²⁺ channel gene ＣＡＣＮＬ１Ａ ４．Cell，87，543−552（1996）。 25. Llinas，R．Sugimori，M.，Hillman，D．E．& Chrkey，B．Distribution a nd functional significance of the P-type voltagedependent Ｃａ²⁺ channel s in the mammalian central nervous system．Trends in Neurosci 15，351−355（1992 ）。 26. Cottingham，R．W．Idury，R．M.，& Schaffer，A．A．Faster sequential genetic linkage computations．Am ．J．Hum．Genet 53，252−263（1993） 27. Lathrop，G．M.，Lalouel，J．M.，Julier，C．& Ott，J．Strategies for multilocus linkage analysis in humans．Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 81， 3443−3446（1984）。 28. Subramony，S．H.，Fratkin，J．D.，Manyan，B．V．& Currier，R．D．Do minantly inherited cerebello-olivary atrophy isnot due to mutation at th e spinocerebellar ataxia-1，Machado-Joseph disease，or Dentato-Rubro-Pal lido-Luysian Atrophylocus．Movement Disorders 11：２，174−180（1996） 。 29. Stevanin，Gら。A third locus for autosomal dominant cerebellar atax ia type 1 maps to chromosome 14ｑ24 ３-qter evidence for the existence of a fourth locus．Am ．J．Hum．Genet．54，11−20（1994）。 30. Twells．R．ら。Autosomal dominant cerebellar ataxia with delnentia ：evidence of a fourth disease locus．Hum ．Mol．Genet．１，177−190（199 4） 31. Vahedi，Kら。A gene for hereditary Paroxysmal cerebellar ataxia map s to chromosome 19p．Annals of Neurology 37，289−293（1995）。 32. Kralller，P．L．ら。A locus for the nystagmus-associated form of ep isodic ataxia maps to an 11-cM region on chromosome 19ｐ Am ．J．Hum．Gen et 57，182−185（1995） 33. Joutel，Aら。A gene for familial hemiplegic migrainemaps to chromos ome 19．Nature Genet ５，41−45（1993） 34. Elliott，M.，Peroutka，S．J.，Welch．S．& May，E．F．Familial hemip legic migraine，nystagmus，and cerebellar atrophy．Annals of Neurology 39，１，１．100−106（1996）。 35. Koh，J．Y.，& Cotman．C.W．Programmed cell death：its possible cont ribution to neurotoxicity mediated by calcium channel antagonist．Brain Res ． 587，233−240（1996） 36. Catterall．W.A．Structureand function of voltage-gated ion channels ．Annu ．Rev．Biochem．64，493−531（1995） 37. Perez-Reyes．E.，Yuan，W.，Wei，X．& Bers，M．Regulationof the clon ed L-type cardiac calcium channel by cyclic-ＡＭＰ-dependent protein kin ase ＦＥＢＳ Lett 342，119−123（1994） 38. Stea，Aら。Localization and functional properties of a rat brain α_IAcalcium channel reflect similarities to neuronal Q−and P−type channels．Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 91，10576−10580（1994） 39. Birnbaumer，Lら。The namingof voltage-gated calcium channels．Neuro n 13，505−506（1994）。 40. Zhang，J．F．ら。Distinctive pharmacology and kinetics of cloned ne uronal Ｃａ²⁺ channels and their possible counterparts in mammalian ＣＮ Ｓ neurons．Neuropharmacology 32，1075−1088（1993）。 41. Mintz，I．M.，Adams，M．E.，& Bean，B．P．P-type calcium channels i n rat and peripheral neurons．Neuron ９，85−95（1992）。 42. Fletcher，C．F．ら。Absencee pilesy in Tottering mutant mice isasso ciated with calcium channel defects．Cell 87，607−617（1996）。 43. Mintz，I.M.，Block of Cachannels in rat central neurons by the spid er toxin omega-Aga-IIIA．J ．Neurosci．14．2844−2853（1994） 44. Gubler，U.，& Hoffman.，B．J.，A simple and very efficient method f or generating ｃＤＮＡ libraries．Gene 25，253−269（1983） 45. Sambrook，J.，Fritsch，E．F & Maniatis，T．(1989)Molecular Cloning ．A Laboratory Manual．（Colg Spring Harbor，N．Y.，1989） 本明細書内で触れられているずべての特許及び刊行物は本発明が関係する技術 分野の当業者のレベルを示している。これらの特許及び刊行物は、個々の刊行物 がそれに言及されることで具体的、個別的に組み入れられるのと同様に全体とし て本明細書に組み入れられる。 当業者であれば、本発明がここに述べられている目的を実行し、その課題と利 点、及びそれらに本質的に課題や利点を達成するのによく適合していることは容 易に理解できるであろう。本実施例はここで述べられている方法、手順、処理、 分子、及び具体的な化合物は現段階での好ましい実施の形態を示すものであり、 例示のためのものであって、本発明の範囲の限定を意図するものではない。特許 請求の範囲に定義されている本発明の精神内に含まれる変更や他の使用法は当業 者なら容易に想起できるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，Ｍ Ｗ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，Ｅ Ｓ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ， ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 1. トリヌクレオチドＣＡＧ反復配列不安定性によって引き起こされる常染色体 優性脊髄小脳運動失調症タイプ６を発症する可能性のある個人を識別する方法に おいて、 ゲノムＤＮＡサンプル内のＣＡＧ反復配列を増幅することができるプライマ ーを標識し、 上記標識されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いた、ポリメラーゼ鎖反 応により上記サンプル内の上記ゲノムＤＮＡ ＣＡＧ反復配列を増幅して増幅さ れたサンプル・ゲノムＤＮＡフラグメントをつくしだし、 増幅された上記ＤＮＡフラグメントを電気泳動にかけてサンプル電気泳動パ ターンをつくりだし、 上記標識されたオリゴヌクレオチド・プライマーを用いてポリメラーゼ鎖反 応によって比較対象のゲノムＤＮＡ ＣＡＧ反復配列を増幅させて増幅された比 較対象ゲノムＤＮＡフラグメントをつくりだし、 上記増幅された比較対象ゲノムＤＮＡフラグメントを電気泳動にかけて比較 対象の電気泳動パターンをつくりだし、 上記サンプルの電気泳動パターンを比較対象の電気泳動パターンと比較し、 上記テストされるべき個人がＣＧＡ反復配列不安定性によって引き起こされ る疾患を発症する可能性があるかどうかを判定し、上記サンプルのゲノムＤＮＡ 電気泳動パターンが上記比較対象のゲノムＤＮＡ電気泳動パターンからの 標識されたフラグメントより大きな標識されたフラグメントを含んでいる場合に は、上記個人がトリヌグレオチド反復配列不安定性によって引き起こされる疾患 を発症させる可能性があるとされるステップで構成された方法。 2. 上記プライマーがα_IAカルシウム・チャンネル遺伝子の配列から誘導される 請求項１の方法。 3. 上記１つまたは複数のオリゴヌクレオチド・プライマーが５'−ＣＡＣＧＴ ＧＴＣＣＴＡＴＴＣＣＣＣＴＧＴＧＡＴＣＣ−３'（配列識別番号NO：１）及び ５'−ＴＧＧＧＴＡＣＣＴＣＣＧＡＧＧＧＣＣＧＣＴＧＧＴＧ−３'（配列識別番 号NO：２） 4. 病気を引き起こす対立遺伝子がトリヌクレオチド反復配列不安定性によるも のである遺伝子を識別する方法において、 トリプレット塩基反復を有するオリゴヌクレオチドを有するライブラリーを スクリーニングし、 上記トリプレット塩基反復を有するクローンを識別し、 上記トリプレット塩基反復を側鎖しているヌクレオチドの配列を判定するた めに上記識別されたクローンを配列決定し、 上記トリプレット塩基反復を側鎖しているヌクレオチドの上記配列に相補的 なプライマーを合成し、 罹病した個人と罹病していない個人を含む多数の個人サンプルからＤＮＡを 単離して、 上記単離したＤＮＡを上記プライマーで増幅して上記トリプレット塩基反復 領域をつくりだし、 上記多数のサンプルの個人のそれぞれからの上記トリプレット塩基反復領域 内のトリプレット塩基反復の数を判定して、 トリプレット塩基反復拡張が罹病した個人では比較的高い頻度で観察される が、罹病していない個人では存在しないか、あるいは非常に低い頻度でしか観察 されないかどうかを判定して、トリプレット塩基反復拡張が罹病した個人では比 較的高い頻度で観察されるが罹病していない個人では存在しないかあるいは非常 に低い頻度でしか観察されない場合に、病気を引き起こす対立遺伝子がトリヌク レオチド反復配列不安定性によるものとされるステップで構成された方法。 5. 上記トリプレット塩基反復のトリプレットがＣＡＧである請求項４の方法。 6. 上記ライブラリーがｃＤＮＡライブラリーである請求項４の方法。 補正請求項 1. トリヌクレオチドＣＡＧ反復配列不安定性によって引き起こされる常染色体 優性脊髄小脳運動失調症タイプ６を発症する可能性のある個人を識別する方法に おいて、 ゲノムＤＮＡサンプル内のＣＡＧ反復配列を増幅することができるすくなく とも１つのオリゴヌクレオチド・プライマーを標識し、 上記標識されたオリゴヌクレオチド・プライマーを用いるポリメラーゼ鎖反 応によって比較対象のゲノムＤＮＡ ＣＡＧ反復配列を増幅して、増幅された比 較対象のゲノムＤＮＡフラグメントをつくりだし、 上記の増幅された上サンブルのＤＮＡフラグメントを電気泳動にかけてサン プル電気泳動パターンをつくりだし、 上記標識されたオリゴヌクレオチド・プライマーを用いてポリメラーゼ鎖反 応によって比較対象のゲノムＤＮＡ ＣＡＧ反復配列を増幅させて増幅された比 較対象ゲノムＤＮＡフラグメントをつくりだし、 上記増幅された比較対象ゲノムＤＮＡフラグメントを電気泳動にかけて比較 対象の電気泳動パターンをつくりだし、 上記サンプルの電気泳動パターンを比較対象の電気泳動パターンと比較し、 そして 上記テストされるべき個人がＣＧＡ反復配列不安定性によって引き起こされ る常染色体優性脊髄小脳運動失調症タ イプ６を発症する可能性があるかどうかを判定し、上記サンプルのゲノムＤＮＡ 電気泳動パターンが上記比較対象のゲノムＤＮＡ電気泳動パターンからの標識さ れたフラグメントより大きな標識されたフラグメントを含んでいる場合には、上 記個人がトリヌクレオチド反復配列不安定性によって引き起こされる常染色体脊 髄小脳運動失調症タイプ６を発症させる可能性があるとされるステップで構成さ れた方法。 2. 上記プライマーがα_IAカルシウム・チャンネル遺伝子の配列に基づいている 請求項１の方法。 3. 上記オリゴヌクレオチド・プライマーが５'−ＣＡＣＧＴＧＴＣＣＴＡＴＴ ＣＣＣＣＴＧＴＧＡＴＣＣ−３'（配列識別番号NO：１）及び５'−ＴＧＧＧＴＡ ＣＣＴＣＣＧＡＧＧＧＣＣＧＣＴＧＧＴＧ−３'（配列識別番号NO：２）によっ て構成されるグループから選択される請求項２の方法。 4. 病気を引き起こす対立遺伝子がトリヌクレオチド反復配列不安定性によるも のである遺伝子を識別する方法において、 トリプレット塩基反復を有する放射又は蛍光標識・オリゴヌクレオチド・プ ローブで遺伝子ライブラリーをスクリーニングし、 オリゴヌクレオチド・プローブに交雑するクローンを識別し、 上記トリプレット塩基反復を側鎖しているヌクレオチドの配列を判定するた めに上記識別されたクローンを配列決定し、 上記トリプレット塩基反復を側鎖しているヌクレオチドの上記配列に相補的 なプライマーを合成し、 罹病した個人と罹病していない個人を含む多数の個人サンプルからＤＮＡを 単離して、 上記単離したＤＮＡを上記プライマーで増幅して上記トリプレット塩基反復 領域をつくりだし、 上記多数のサンプルの個人のそれぞれからの上記トリプレット塩基反復領域 内のトリプレット塩基反復の数を判定して、 トリプレット塩基反復拡張が罹病した個人では比較的高い頻度で観察される が、罹病していない個人では存在しないか、あるいは非常に低い頻度でしか観察 されないかどうかを判定して、トリプレット塩基反復拡張が罹病した個人では比 較的高い頻度で観察されるが罹病していない個人では存在しないかあるいは非常 に低い頻度でしか観察されない場合に、病気を引き起こす対立遺伝子がトリヌク レオチド反復配列不安定性によるものとされるステッブで構成された方法。 5. 上記トリプレット塩基反復のトリプレットがＣＡＧである請求項４の方法。 6. 上記ライブラリーがｃＤＮＡライブラリーである請求項 ４の方法。