JP6078211B2 - 自閉症および自閉症の表現型に関連する遺伝子変化ならびに自閉症の診断および治療に対するその使用方法 - Google Patents

Description

本出願は、２００８年２月２０日、２００８年１０月２１日付け出願の米国仮特許出願第６１／０３０，１３６号および同第６１／１０７，１６３号に対して優先権を主張するものであり、これらはこの参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は、遺伝学の分野ならびに自閉症および自閉症スペクトラム障害の診断および治療に関する。

本発明が関連する最新技術を説明するために本明細書全体にわたっていくつかの刊行物および特許文献が参照されるが、これらはこの参照により本願明細書に完全に組み込まれる。

自閉症（ＭＩＭ［２０９８５０］）は、異常な反復運動および他の行動障害のパターンに対する傾向を伴い、社会的行動およびコミュニケーション能力における異常によって特徴づけられる、深刻で比較的よく見られる精神神経疾患である。現在の推定患者数は、自閉症については人口の０．１〜０．２％であり、ＡＳＤについては人口の０．６％である^１。世界的には、男性は女性の４倍罹りやすい^２。したがって、自閉症は、成人期まで継続し、社会に対して大きな経済的負担となり、原因不明の公衆衛生上の大きな懸念をもたらす。自閉症の最も顕著な特徴は、社会的およびコミュニケーション上の欠陥である。前者は、低い社交性（社会的交流を求めること、または注目することへの傾向が低い）、社会的ルールに対する認識の不足、社会的模倣および象徴的な遊びが困難なこと、他者に慰めを与えたり、求めたりしないことおよび他者と社会的関係を形成しないこと、言葉を使わないコミュニケーション、たとえばアイコンタクトを使用できないこと、他者の精神および情動状態に対する認識の不足、相互関係の欠如、および他者と経験を共有できないこと、として現れる。コミュニケーション障害は、言語の遅れもしくは不足、他者との会話の開始もしくは継続する能力の障害、および言語の常同的もしくは反復使用として現れる。自閉症児は、同様の知的能力を有するクラスメートよりも、自由遊びにふけることが遙かに少なく、遙かに低い発達レベルを示す。罹患児童における社会的欠陥の特徴は、１２〜１８月齢の早期に現れるため、これにより、自閉症が神経発生障害であることを示唆される。自閉症は、社会的機能および情緒的機能を支配する神経系の発育不全に由来することが示唆されている。社会性および認知発達は一般集団においては高度に相関するが、社会的障害の程度は、自閉症の個人においてＩＱとはあまり相関しない。反対のことがダウン症およびウィリアムズ症候群で見られ、この場合、社会性発達が認識機能よりも優れている。両例は、社交性の複雑な要因を指摘するものである。

自閉症の最も一般的な形態の病因はまだわかっていない。この疾患の最初の記載において、Ｋａｎｎｅｒは、罹患児童の親の類似した特質を観察して、自閉症の発現に対する育児法の影響を示唆した。いくつかの環境的仮説は、実験データによって裏付けられないが、この障害に対する強い遺伝的影響の証拠が増大している。罹患者の兄弟姉妹における自閉症の割合は２〜６％であり、一般集団におけるよりも２倍高い。双子の研究は、一卵性および二卵性双生児の一致率において有意な差を示し、前者は双生児組の６０％で一致し、非自閉症一卵性双生児のほとんどは、より軽度の関連する社会的およびコミュニケーション異常を示す。社会的、言語および認識問題は、対照の親類と比較すると、自閉症患者の親類でも見られる。自閉症の遺伝率は>９０％と推定されている。

自閉症の遺伝的基礎は、過去１０年において、３つの相補的アプローチ、すなわち細胞発生研究；リンケージ分析、および候補遺伝子分析を用いて広く研究されてきた。概説については、Ｖｏｒｓｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｍｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ １１：１８−２８；，Ｖｅｅｎｓｔｒａ−ＶａｎｄｅｒＷｅｅｌｅ ａｎｄ Ｃｏｏｋ，（２００４）Ｍｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ９：８１９−３２）を参照。自閉症における染色体異常の研究によって、端部欠失および中間部欠失、平衡転座および非平衡転座、ならびに多数の染色体上の逆位が明らかになり、染色体１５、７、およびＸ上の異常が最も多く報告されている。細胞発生研究によって示された領域の重要性は、マルチプレックス自閉症家族における全ゲノムスクリーンによって評価された（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ａｕｔｉｓｍ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，１９９８）。自閉症感受性遺伝子座の強力かつ合致した証拠が染色体７ｑについて得られ；染色体１５ｑ、１６ｐ、１９ｐ、および２ｑ上の遺伝子座については中程度の証拠が得られ；この研究の大部分は、Ｘ染色体のリンケージについて裏付けを見いだせない（Ｌａｍｂ ｅｔ ａｌ，（２００５）Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ．４２：１３２−１３７；Ｌｏｒｄ ｅｔ ａｌ，（２０００）Ａｕｔｉｓｍ Ｄｅｖ Ｄｉｓｏｒｄ．３０：２０５−２２３。ＡＧＲＥ試料は、１７ｑおよび５ｐ上の遺伝子座についての最も強力な証拠を提供した（Ｙｏｎａｎ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．７３：８８６−９７）。自閉症における多くの候補遺伝子研究は、その位置または機能に関するいくつかの有力候補に焦点を合わせてきた（Ｖｅｅｎｓｔｒａ−ＶａｎｄｅｒＷｅｅｌｅ ｅｔ ａｌ ２００４、上記において概説）。Ｊａｍａｉｎら（（２００３）Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．３４：２７−９）は、ＡＳＤと関連するリンケージ領域で、ニューロリジンをコードするＸ連鎖遺伝子、特に、ＮＬＧＮ３およびＮＬＧＮ４における希少な非同義変異を報告している。自閉症エンドフェノタイプの遺伝的基礎についての他の証拠は、脆弱性Ｘおよびレット症候群などの自閉症と重複する表現型特性を共有する疾患の研究から得られる。

自閉症の多くの新たな理論は、これらの疾患の潜在的な根本原因として、神経連結性における変化に焦点を合わせている。画像解析によって、活性依存性皮質発達の局所的および大域的連結性における変化が明らかになり、発生的研究は、自閉症が、発達中の抑制性および興奮性シナプス結合の不均衡の結果起こり得ることを示唆する。神経連結性の基本単位はシナプスであるので、自閉症が神経連結性の障害であるならば、ニューロンに関して、シナプス結合の障害として理解することができる。実際に、遺伝学研究によって、主要タンパク質における突然変異がシナプス発生および可塑性に関与することが明らかになり、たとえばニューロリジン、ＦＭＲＰおよびＭｅＣＰ２は自閉症および自閉症の兆候を伴う知能発育不全の２つの形態、特に脆弱性Ｘおよびレット症候群の個体において見いだされる（Ｊａｍａｉｎ等、２００３、上記）。したがって、遺伝子異常と（エンド）表現型との間の関連性のニューロンレベルでの探求は、当然かつ有意義であるように思われる。さらに、このような神経連結性異常は、たとえば直接白質トラクトグラフィーによるか、または特徴的な電気的活動における観察可能な遅延によって、ＡＳＤの行動的および臨床症状と直接関連し得ることが明らかになり、これらのニューロンレベルの表現型は行動の神経相関と解釈することができる。

全般的に、今日まで実施され、上述したリンケージ分析研究は、多くの理由、なかでもリンケージ分析法が、適度の効果のある一般的な遺伝的変異の同定において概してうまくいかないという一般的問題のために、自閉症の遺伝的決定基の同定にごくわずかしか成功しなかった。この問題は、多様な表現型が複数の遺伝因子と環境因子間の相互作用の最終結果によって決定され、同定される特定の遺伝的変異が疾患の全リスクにほとんど影響しない可能性が高いスペクトラム障害である自閉症において顕著である。

最近の研究では、Ｓｅｂａｔと共同研究者が、デノボコピー数多型（ＣＮＶｓ）の自閉症との関連性を報告し^８、ＣＮＶｓがこの疾患の根底にある可能性があることを示唆している。実際、彼らの結果は、４つの遺伝子座でのＣＮＶｓが、ＡＳＤのわずかな比率を占めることを示唆している^８。

しかし、これらの関連性の結果は、自主研究においてまだ再現されておらず、自閉症のわずかな割合の遺伝的リスクをまとめて説明するだけであり、従ってさらなる遺伝子座の存在を示唆するが、その頻度および効果の大きさは不明である。残りの遺伝子座について系統的に探索する目的で、本発明者らは、１２００人の白色人種の自閉症児および２０００人を超える無病のヨーロッパ系対照においてＧＷＡ研究を実施した。

Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ， Ｓ． & Ｆｏｍｂｏｎｎｅ， Ｅ． Ｐｅｒｖａｓｉｖｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｉｎ ｐｒｅｓｃｈｏｏｌ ｃｈｉｌｄｒｅｎ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ２８５，３０９３−３０９９（２００１）． Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ， Ｓ． & Ｆｏｍｂｏｎｎｅ， Ｅ． Ｐｅｒｖａｓｉｖｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｉｎ ｐｒｅｓｃｈｏｏｌ ｃｈｉｌｄｒｅｎ： ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ．Ａｍ Ｊ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ １６２，１１３３−４１（２００５）． Ｊｏｎｅｓ， Ｍ．Ｂ． & Ｓｚａｔｍａｒｉ， Ｐ． Ｓｔｏｐｐａｇｅ ｒｕｌｅｓ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ａｕｔｉｓｍ． Ｊ Ａｕｔｉｓｍ Ｄｅｖ Ｄｉｓｏｒｄ １８，３１−４０（１９８８）． Ｒｉｔｖｏ， Ｅ．Ｒ． ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ＵＣＬＡ−Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｕｔａｈ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃ ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ ａｕｔｉｓｍ： ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ．Ａｍ Ｊ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ １４６，１９４−９（１９８９）． Ｂａｉｌｅｙ， Ａ． ｅｔ ａｌ． Ａｕｔｉｓｍ ａｓ ａ ｓｔｒｏｎｇｌｙ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒ： ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｒｏｍ ａ Ｂｒｉｔｉｓｈ ｔｗｉｎ ｓｔｕｄｙ． Ｐｓｙｃｈｏｌ Ｍｅｄ ２５，６３−７７（１９９５）． Ｋｌａｕｃｋ， Ｓ．Ｍ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ａｕｔｉｓｍ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｄｉｓｏｒｄｅｒ． Ｅｕｒ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １４，７１４−２０（２００６）． Ｖｏｒｓｔｍａｎ， Ｊ．Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ａｕｔｉｓｍ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｒｅｇｉｏｎｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｐｏｒｔｅｄ ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｕｔｉｓｍ． Ｍｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ １１，１，１８−２８（２００６）． Ｓｅｂａｔ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｏｎｇ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅ ｎｏｖｏ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ａｕｔｉｓｍ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１６， ４４５−９ （２００７）． Ｇｕｎｄｅｒｓｏｎ， Ｋ．Ｌ．， Ｓｔｅｅｍｅｒｓ， Ｆ．Ｊ．， Ｌｅｅ， Ｇ．， Ｍｅｎｄｏｚａ， Ｌ．Ｇ． & Ｃｈｅｅ， Ｍ．Ｓ． Ａ ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｓｃａｌａｂｌｅ ＳＮＰ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ａｓｓａｙ ｕｓｉｎｇ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ３７，５４９−５４（２００５）． Ｓｔｅｅｍｅｒｓ， Ｆ．Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｗｈｏｌｅ−ｇｅｎｏｍｅ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓｉｎｇｌｅ−ｂａｓｅ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ａｓｓａｙ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３，３１−３（２００６）． Ｈａｋｏｎａｒｓｏｎ， Ｈ． ｅｔ ａｌ． Ａ ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｙ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ＫＩＡＡ０３５０ ａｓ ａ ｔｙｐｅ １ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｇｅｎｅ．Ｎａｔｕｒｅ ４４８，５９１−５９４（２００７）． Ａｂｒａｈａｍｓ， Ｂ．Ｓ． & Ｇｅｓｃｈｗｉｎｄ， Ｄ．Ｈ． Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ａｕｔｉｓｍ ｇｅｎｅｔｉｃｓ： ｏｎ ｔｈｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ ９，３４１−５５（２００８）． Ａｕｔｉｓｍ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｄｉｓａｂｉｌｉｔｉｅｓ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｎｅｔｗｏｒｋ． ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｍｍｗｒ／ｐｄｆ／ｓｓ／ｓｓ５６０１．ｐｄｆ．（２００７）． Ｂａｉｌｅｙ， Ａ． ｅｔ ａｌ． Ａｕｔｉｓｍ ａｓ ａ ｓｔｒｏｎｇｌｙ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒ： ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｒｏｍ ａ Ｂｒｉｔｉｓｈ ｔｗｉｎ ｓｔｕｄｙ． Ｐｓｙｃｈｏｌ Ｍｅｄ ２５，６３−７７（１９９５）． Ｌａｕｒｉｔｓｅｎ， Ｍ．Ｂ．，Ｐｅｄｅｒｓｅｎ， Ｃ．Ｂ． & Ｍｏｒｔｅｎｓｅｎ， Ｐ．Ｂ． Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｆａｍｉｌｉａｌ ｒｉｓｋ ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｐｌａｃｅ ｏｆ ｂｉｒｔｈ ｏｎ ｔｈｅ ｒｉｓｋ ｏｆ ａｕｔｉｓｍ： ａ ｎａｔｉｏｎｗｉｄｅ ｒｅｇｉｓｔｅｒ−ｂａｓｅｄ ｓｔｕｄｙ． Ｊ Ｃｈｉｌｄ Ｐｓｙｃｈｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ４６， ９６３−７１ （２００５）． Ｓｙｋｅｓ，Ｎ．Ｈ． & Ｌａｍｂ，Ｊ．Ａ．Ａｕｔｉｓｍ： ｔｈｅ ｑｕｅｓｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｅｎｅｓ． Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ９，１−１５（２００７）． Ｇｕｐｔａ， Ａ．Ｒ． & Ｓｔａｔｅ， Ｍ．Ｗ． Ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ａｕｔｉｓｍ． Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ６１，４２９−３７（２００７）． Ｆｒｅｉｔａｇ， Ｃ．Ｍ． Ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ａｕｔｉｓｔｉｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｒｅｌｅｖａｎｃｅ： ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ． Ｍｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ １２， ２−２２ （２００７）． Ｖｅｅｎｓｔｒａ−ＶａｎｄｅｒＷｅｅｌｅ， Ｊ． & Ｃｏｏｋ， Ｅ．Ｈ．， Ｊｒ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ａｕｔｉｓｍ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｄｉｓｏｒｄｅｒ．Ｍｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ９，８１９−３２ （２００４）． Ｖｏｒｓｔｍａｎ， Ｊ．Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ａｕｔｉｓｍ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｒｅｇｉｏｎｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｐｏｒｔｅｄ ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｕｔｉｓｍ． Ｍｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ １１， １， １８−２８ （２００６）． Ｓｅｂａｔ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｓｔｒｏｎｇ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅ ｎｏｖｏ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ａｕｔｉｓｍ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１６，４４５−９（２００７）． Ｗｅｉｓｓ， Ｌ．Ａ． ｅｔ ａｌ．Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｍｉｃｒｏｄｅｌｅｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｔ １６ｐ１１．２ ａｎｄ Ａｕｔｉｓｍ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ （２００８）． Ｋｕｍａｒ， Ｒ．Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ １６ｐ１１．２ ｍｉｃｒｏｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ｉｎ ａｕｔｉｓｍ． Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １７，６２８−３８（２００８）． Ｍａｒｓｈａｌｌ， Ｃ．Ｒ． ｅｔ ａｌ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ａｕｔｉｓｍ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｄｉｓｏｒｄｅｒ． Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ８２， ４７７−８８ （２００８）． ＷＴＣＣＣ． Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｙ ｏｆ １４，０００ ｃａｓｅｓ ｏｆ ｓｅｖｅｎ ｃｏｍｍｏｎ ｄｉｓｅａｓｅｓ ａｎｄ ３，０００ ｓｈａｒｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌｓ． Ｎａｔｕｒｅ ４４７，６６１−７８（２００７）． Ｓｋｌａｒ， Ｐ． ｅｔ ａｌ． Ｗｈｏｌｅ−ｇｅｎｏｍｅ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｂｉｐｏｌａｒ ｄｉｓｏｒｄｅｒ． Ｍｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ １３， ５５８−６９ （２００８）． Ａｌｋｅｌａｉ， Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ＸＶｔｈ Ｗｏｒｌｄ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ ｏｆ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｏｃｔｏｂｅｒ ７−１１， ２００７： Ｒａｐｐｏｒｔｅｕｒ ｓｕｍｍａｒｉｅｓ ｏｆ ｏｒａｌ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎｓ． Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ Ｂ Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｉａｔｒ Ｇｅｎｅｔ １７４Ｂ， ２３３−２７７ （２００８）． Ｏ'Ｄｏｎｏｖａｎ， Ｍ．Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｏｃｉ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ ｂｙ ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｏｌｌｏｗ−ｕｐ． Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ （２００８）． Ｆｅｒｒｅｉｒａ， Ｍ．Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｕｐｐｏｒｔｓ ａ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ＡＮＫ３ ａｎｄ ＣＡＣＮＡ１Ｃ ｉｎ ｂｉｐｏｌａｒ ｄｉｓｏｒｄｅｒ． Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ （２００８）． Ｍａｒｔｉｎ， Ｅ．Ｒ．， Ｍｏｎｋｓ， Ｓ．Ａ．， Ｗａｒｒｅｎ， Ｌ．Ｌ． & Ｋａｐｌａｎ， Ｎ．Ｌ． Ａ ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｌｉｎｋａｇｅ ａｎｄ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｇｅｎｅｒａｌ ｐｅｄｉｇｒｅｅｓ： ｔｈｅ ｐｅｄｉｇｒｅｅ ｄｉｓｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ｔｅｓｔ． Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ６７， １４６−５４ （２０００）． Ｃｈｕｎｇ， Ｒ．Ｈ．， Ｍｏｒｒｉｓ， Ｒ．Ｗ．， Ｚｈａｎｇ， Ｌ．， Ｌｉ， Ｙ．Ｊ． & Ｍａｒｔｉｎ， Ｅ．Ｒ． Ｘ−ＡＰＬ： ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｆａｍｉｌｙ−ｂａｓｅｄ ｔｅｓｔ ｏｆ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｌｉｎｋａｇｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｘ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ． Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ８０， ５９−６８ （２００７）． ｄｅ Ｂａｋｋｅｒ， Ｐ．Ｉ． ｅｔ ａｌ． Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｉｍｐｕｔａｔｉｏｎ−ｄｒｉｖｅｎ ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｉｅｓ． Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １７， Ｒ１２２−８ （２００８）． Ｗａｎｇ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． ＰｅｎｎＣＮＶ： ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｈｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖ ｍｏｄｅｌ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｆｏｒ ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｗｈｏｌｅ−ｇｅｎｏｍｅ ＳＮＰ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｄａｔａ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ １７， １６６５−１６７４ （２００７）． Ｓｉｅｐｅｌ， Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｉｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ， ｉｎｓｅｃｔ， ｗｏｒｍ， ａｎｄ ｙｅａｓｔ ｇｅｎｏｍｅｓ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ １５， １０３４−５０ （２００５）． Ｏｖｃｈａｒｅｎｋｏ， Ｉ． ｅｔ ａｌ． Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ｇｅｎｅ ｄｅｓｅｒｔｓ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ １５， １３７−４５ （２００５）． Ｋｏｏｌｓ， Ｐ．， Ｖａｎｈａｌｓｔ， Ｋ．， Ｖａｎ ｄｅｎ Ｅｙｎｄｅ， Ｅ． & ｖａｎ Ｒｏｙ， Ｆ． Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｃａｄｈｅｒｉｎ−１０ ｇｅｎｅ： ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ， ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ， ａｎｄ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｎ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ５ｐ１３−１４． ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ４５２， ３２８−３４ （１９９９）． Ｖｉｓｅｌ， Ａ．， Ｔｈａｌｌｅｒ， Ｃ． & Ｅｉｃｈｅｌｅ， Ｇ． ＧｅｎｅＰａｉｎｔ．ｏｒｇ： ａｎ ａｔｌａｓ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３２， Ｄ５５２−６ （２００４）． Ｈｅｉｎｚｅｎ， Ｅ．Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ｔｉｓｓｕｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｓｐｌｉｃｉｎｇ： Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｔｒａｉｔｓ． ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ ６， ｅ１０００００１ （２００８）． Ｗｉｔｔｅ， Ｊ．Ｓ． Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｒｉｓｋ ｖａｒｉａｎｔｓ ｏｎ ８ｑ２４． Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ３９， ５７９−８０ （２００７）． Ｇｈｏｕｓｓａｉｎｉ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｌｏｃｉ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃａｎｃｅｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ８ｑ２４ ｇｅｎｅ ｄｅｓｅｒｔ． Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ １００， ９６２−６ （２００８）． Ｋｉｍ， Ｈ．Ｇ． ｅｔ ａｌ． Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｒｅｘｉｎ １ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｕｔｉｓｍ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｄｉｓｏｒｄｅｒ． Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ８２， １９９−２０７ （２００８）． Ｓｚａｔｍａｒｉ， Ｐ． ｅｔ ａｌ． Ｍａｐｐｉｎｇ ａｕｔｉｓｍ ｒｉｓｋ ｌｏｃｉ ｕｓｉｎｇ ｇｅｎｅｔｉｃ ｌｉｎｋａｇｅ ａｎｄ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ． Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ３９， ３１９−２８ （２００７）． Ａｒｋｉｎｇ， Ｄ．Ｅ． ｅｔ ａｌ． Ａ ｃｏｍｍｏｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｎｅｕｒｅｘｉｎ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ ＣＮＴＮＡＰ２ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｆａｍｉｌｉａｌ ｒｉｓｋ ｏｆ ａｕｔｉｓｍ． Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ８２， １６０−４ （２００８）． Ａｌａｒｃｏｎ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｌｉｎｋａｇｅ， ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｇｅｎｅ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｅｓ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ＣＮＴＮＡＰ２ ａｓ ａｎ ａｕｔｉｓｍ−ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｇｅｎｅ． Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ８２， １５０−９ （２００８）． Ｂａｋｋａｌｏｇｌｕ， Ｂ． ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｒｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｃｏｎｔａｃｔｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｌｉｋｅ ２ ｉｎ ａｕｔｉｓｍ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ． Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ８２， １６５−７３ （２００８）． Ｍｏｒｒｏｗ， Ｅ．Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ａｕｔｉｓｍ ｌｏｃｉ ａｎｄ ｇｅｎｅｓ ｂｙ ｔｒａｃｉｎｇ ｒｅｃｅｎｔ ｓｈａｒｅｄ ａｎｃｅｓｔｒｙ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２１， ２１８−２３ （２００８）． Ｒｅｄｉｅｓ， Ｃ． Ｃａｄｈｅｒｉｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ． Ｐｒｏｇ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ ６１， ６１１−４８ （２０００）． Ｗａｎｇ， Ｋ．， Ｌｉ， Ｍ． & Ｂｕｃａｎ， Ｍ． Ｐａｔｈｗａｙ−Ｂａｓｅｄ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｆｏｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｏｍｅｗｉｄｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｓｔｕｄｉｅｓ． Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ８１（２００７）．

本発明にしたがって、自閉症および自閉症スペクトラム障害の診断および治療のための組成物および方法が提供される。例示的な方法では、標的ポリヌクレオチドにおいて少なくとも１つの欠失を含むＣＮＶの存在を検出する工程を必要としており、前記ＣＮＶが存在する場合、前記患者は自閉症および／または自閉症スペクトラム障害を発現する高いリスクを有しており、前記欠失含有ＣＮＶは、ｃｈｒ８：４３７６５５７０〜４３７７６５９５、ｃｈｒ２：５１１２０６４４〜５１１４７６００、ｃｈｒ３：１９１５１９０〜１９１５９２２、ｃｈｒ３：４１９９７３１〜４２３６３０４、ｃｈｒ１０：８７９４１６６６〜８７９４９０２９、ｃｈｒ６：１６２５８４５７６〜１６２５８７００１、ｃｈｒ２：７８２６８１９９〜７８３１１２４９およびｃｈｒ１６：４５８３４３２１〜４５８８７７４５から成るＣＮＶｓの群より選択される。前記方法は、選択的に、染色体８上のｒｓ８１８５７７１、染色体２上のｒｓ４９７１７２４、染色体３上のｒｓ１０５１０２２１、染色体３上のｒｓ１４４４０５６、染色体１０上のｒｓ１２４１１９７１、染色体６上のｒｓ１２２１４７８８、染色体２上のｒｓ２１６４８５０、および染色体１６上のｒｓ１７４６４２から成る群から選択される少なくとも１つの単一ヌクレオチド多型の検出を含むものであっても良い。

本発明のさらに別の実施形態において、自閉症または自閉症スペクトラム障害を発現する傾向を検出する方法は、標的ポリヌクレオチドにおいて少なくとも１つの重複を含むＣＮＶの存在を検出する工程を含み、前記ＣＮＶが存在する場合、前記患者は自閉症および／または自閉症スペクトラム障害を発現する高いリスクを有しており、前記重複含有ＣＮＶは、ｃｈｒ２：１３１１９６６７〜１３１６５８９８、ｃｈｒ１５：２２３９３８３３〜２２５３２３０９、ｃｈｒ１２：３１３００８４６〜３１３０２０８８、ｃｈｒ６：６９２９１８２１〜６９２９４０２８、ｃｈｒ３：２５４８１４８〜２５４８５３１、ｃｈｒ３：１７４７５４３７８〜１７４７７１９７５、ｃｈｒ４：１４４８４７４０２〜１４４８５４５７９、ｃｈｒ１：１４５６５８４６５〜１４５８０７３５８、ｃｈｒ２：２３７４８６３２８〜２３７４９７１０５；ｃｈｒ６：１６８０９１８６０〜１６８３３９１００、ｃｈｒ１９：２２４３１１８９〜２２４３１３９７、ｃｈｒ１５：２２３９３８３３〜２２５３２３０９、ｃｈｒ２２：１９３５１２６４〜１９３５８９４６、ｃｈｒ７：３２６６７０８７〜３２７７０７１３、ｃｈｒ２０：５５４２６９６１〜５５４３０８７４、ｃｈｒ１：１７４５００５５５〜１７４５４３６７５、ｃｈｒ８：５５０２１０４７〜５５０７０１３４、およびｃｈｒ３：１２２８２６１９０〜１２２８７０４７４から成るＣＮＶの群から選択される。前記方法は、選択的に、染色体２上のｒｓ４３４６３５２、染色体１５上のｒｓ７４９７２３９、染色体１２上のｒｓ６１７３７２、染色体６上のｒｓ９３４２７１７、染色体３上のｒｓ１７０１５８１６、染色体３上のｒｓ９８６０９９２、染色体４上のｒｓ７６８１９１４、染色体１上のｒｓ１２４０８１７８、染色体２上のｒｓ１１０７１９４、染色体６上のｒｓ９３４６６４９、染色体１９上のｒｓ１２３０３００、染色体１５上のｒｓ７４９７２３９、染色体２２上のｒｓ６７４４７８、染色体７上のｒｓ１３２２５１３２、染色体２０上のｒｓ６０２５５５３、染色体１上のｒｓ１０７９８４５０、染色体８上のｒｓ１０４３５６３４および染色体３上のｒｓ２０７０１８０から成る群から選択される少なくとも１つの単一ヌクレオチド多型の検出を含むものであっても良い。

本発明の別の態様において、これを必要とする患者において自閉症または自閉症スペクトラム障害を発現する傾向を検出する方法を提供する。典型的な方法は、標的ポリヌクレオチドにおいて核酸を含む少なくとも１つのＳＮＰの存在を検出する工程を必要とし、前記ＳＮＰが存在する場合、前記患者は、自閉症および／または自閉症スペクトラム障害を発現する高いリスクを有しており、前記核酸含有ＳＮＰは、染色体５上のｒｓ４３０７０５９、ｒｓ７７０４９０９、ｒｓ１２５１８１９４、ｒｓ４３２７５７２、ｒｓ１８９６７３１、およびｒｓ１００３８１１３から成るＳＮＰの群から選択されるものである。

本発明の別の実施形態において、神経シグナリングおよび／または形態を変化させる薬剤を同定する方法が提供される。当該方法は、前記ＣＮＶまたはＳＮＰの少なくとも１つを発現する細胞を提供し（工程ａ）；ＣＮＶまたはＳＮＰ含有核酸に対応する同種野生型配列を発現する細胞を提供し（工程ｂ）；各試料からの細胞を試験薬と接触させ、前記薬剤が、工程ｂ）のものと比べて工程ａ）の細胞の神経シグナリングおよび／または形態が変わるか否かを分析し、これによって神経シグナリングおよび形態を変化させる薬剤を同定することを含む。好適な実施形態において、前記試験薬は、カドヘリンを介する細胞接着を調整する。これを必要とする患者において、本明細書で記載する方法を用いて同定される試験薬の投与によって、自閉症患者を治療する方法も、本発明に含まれる。

本発明は、ｒｓ４３０７０５９、ｒｓ７７０４９０９、ｒｓ１２５１８１９４、ｒｓ４３２７５７２、ｒｓ１８９６７３１およびｒｓ１００３８１１３から成る群から選択される、少なくとも１つの単離された自閉症に関連するＳＮＰ含有核酸も提供する。このようなＳＮＰ含有核酸は、選択的に、神経細胞における発現のために適した発現ベクター中に含まれていてもよい。

本発明の別の態様において、前記ＣＮＶおよびＳＮＰを含む核酸が提供される。好適な実施形態において、核酸は固体担体に付着したものである。

本明細書に記載したＣＮＶおよび／またはＳＮＰ含有核酸分子を含むトランスジェニックマウスもまた提供される。このようなマウスは、自閉症の進行および発現を調整する薬剤を同定するための優れた生体内スクリーニング手段を提供するものである。

図１（Ａ）は、ＡＧＲＥおよびＡＣＣコホートのゲノムワイド関連メタアナリシスから得られるＳＮＰの−ｌｏｇ_１０（Ｐ）値を示すマンハッタンプロットである。 （Ｂ）最も重要なＳＮＰｓを含むゲノム領域は、ＵＣＳＣゲノムブラウザに表示され、保存されたゲノム要素はＰｈａｓｔＣｏｎｓトラックにおいてＬＯＤスコアを用いて表示されている。 （Ｃ）遺伝子型同定されたＳＮＰｓ（菱形）および帰属されたＳＮＰｓ（灰色円）はどちらもゲノム位置の関数としてそのＰ値（−ｌｏｇ１０値として）を用いてプロットする（ＮＣＢＩ Ｂｕｉｌｄ３６）。遺伝子型同定されたＳＮＰｓをｒｓ４３０７０５９との相互関係に基づいて着色した（赤：ｒ^２>０．８；橙：０．５<ｒ^２<０．８；黄：０．２<ｒ^２<０．５；白：ｒ^２<０．２）。ＨａｐＭａｐデータから推定される再結合速度をプロットして、局所的ＬＤ構造を反映する。 （Ｄ）ヒト胎児脳におけるＣＤＨ１０のインサイチュハイブリダイゼーション、上記の対応するクレシル・バイオレット染色されたマーカースライド。眼窩前頭皮質（ＯＦＣｔｘ）および前頭皮質（ＦＣｔｘ）を強調し、前頭皮質で発現が大幅に濃縮される。 （Ｅ）ｒｓ４３０７０５９のＳＮＰ遺伝子型は、９３大脳皮質組織におけるＣＤＨ９もしくはＣＤＨ１０転写産物レベルと関連しない。 図２は、表８における６のＳＮＰｓ間の連鎖不均衡。Ｄ値（Ａ）とｒ^２値（Ｂ）との両方を示す図である。図はＨａｐｌｏｖｉｅｗ（２７）によって作製する。 図３は、４つのコホートに関するこれらの合計Ｐ値（−ｌｏｇ１０値）を用いた、５ｐ１４．１領域上の全ての遺伝子型同定／帰属ＳＮＰｓについての連鎖不均衡プロットである（Ｐ<１×１０^−７を有するマーカーを赤色で強調する）。この領域における最も重要なＳＮＰｓはすべて同じＬＤブロック中にある。図はＷＧＡＶｉｅｗｅｒ（３３）によって作製する。 図４は、ＵＣＳＣゲノムブラウザによって視覚化された本発明者らの研究におけるＣＤＨ１０とＣＤＨ９との間のＣＮＶｓである。本発明者らは、定量的ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）および多重ライゲーション依存性プローブ増幅（ＭＬＰＡ）アッセイによる遺伝子間ＣＮＶｓの実験的な検証を試みた。以下の図のそれぞれは、重複するかまたはＣＤＨ１０とＣＤＨ９間の１つのＣＮＶ遺伝子座を示し、各図中の赤色バーは、ＣＮＶｓの位置および座標を表す。 図４は、ＵＣＳＣゲノムブラウザによって視覚化された本発明者らの研究におけるＣＤＨ１０とＣＤＨ９との間のＣＮＶｓである。本発明者らは、定量的ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）および多重ライゲーション依存性プローブ増幅（ＭＬＰＡ）アッセイによる遺伝子間ＣＮＶｓの実験的な検証を試みた。以下の図のそれぞれは、重複するかまたはＣＤＨ１０とＣＤＨ９間の１つのＣＮＶ遺伝子座を示し、各図中の赤色バーは、ＣＮＶｓの位置および座標を表す。 図４は、ＵＣＳＣゲノムブラウザによって視覚化された本発明者らの研究におけるＣＤＨ１０とＣＤＨ９との間のＣＮＶｓである。本発明者らは、定量的ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）および多重ライゲーション依存性プローブ増幅（ＭＬＰＡ）アッセイによる遺伝子間ＣＮＶｓの実験的な検証を試みた。以下の図のそれぞれは、重複するかまたはＣＤＨ１０とＣＤＨ９間の１つのＣＮＶ遺伝子座を示し、各図中の赤色バーは、ＣＮＶｓの位置および座標を表す。 図４は、ＵＣＳＣゲノムブラウザによって視覚化された本発明者らの研究におけるＣＤＨ１０とＣＤＨ９との間のＣＮＶｓである。本発明者らは、定量的ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）および多重ライゲーション依存性プローブ増幅（ＭＬＰＡ）アッセイによる遺伝子間ＣＮＶｓの実験的な検証を試みた。以下の図のそれぞれは、重複するかまたはＣＤＨ１０とＣＤＨ９間の１つのＣＮＶ遺伝子座を示し、各図中の赤色バーは、ＣＮＶｓの位置および座標を表す。 図４は、ＵＣＳＣゲノムブラウザによって視覚化された本発明者らの研究におけるＣＤＨ１０とＣＤＨ９との間のＣＮＶｓである。本発明者らは、定量的ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）および多重ライゲーション依存性プローブ増幅（ＭＬＰＡ）アッセイによる遺伝子間ＣＮＶｓの実験的な検証を試みた。以下の図のそれぞれは、重複するかまたはＣＤＨ１０とＣＤＨ９間の１つのＣＮＶ遺伝子座を示し、各図中の赤色バーは、ＣＮＶｓの位置および座標を表す。 図５は、ＵＣＳＣゲノム・ブラウザ・アノテーション・データベースでアノテートされる、ＣＤＨ１０とＣＤＨ９間のすでに報告されているＣＮＶｓである。ゲノム変異体のデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｊｅｃｔｓ．ｔｃａｇ．ｃａ／ｖａｒｉａｔｉｏｎ／）トラック、ならびに９のすでに公開されているものからコンパイルされた「Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ」トラックを包含する２つのトラックをブラウザで表示した。両トラックは、ＣＤＨ１０とＣＤＨ９間に共通のＣＮＶｓは同定されなかったことを示すが、ＣＤＨ９３領域を中断するＣＮＶは複数の被験者においては検出された。したがって、現在の技術基盤によって検出されない非常に小さなＣＮＶが存在しなければ、トップＳＮＰ関連性結果は、ＣＮＶとの連鎖不均衡が原因である可能性は低い。 図６は、ＣＤＨ１０とＣＤＨ９間のゲノム領域のゲノム・ブラウザ・ショットである。ＡＧＲＥコホートおよびＡＣＣコホートのＳＮＰ関連性を、−ｌｏｇ_１０（Ｐ）値を表す垂直線として表示する。ゲノム・ブラウザ・トラックで示されるように、この領域において公知のｍｉｃｒｏＲＮＡｓもしくは核内低分子ＲＮＡはない。「ヒトＥＳＴ」トラック（３４）において示されるように、ＬＤブロックと重複するスプライスされたヒト発現標識配列（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇｓ：ＥＳＴｓ）はない。ヒト組織の様々な群についての発現値（発現が減少するとともに色が赤から黒から緑へと変化する）を「ＧＮＦ発現アトラス２」トラック（２６）に表示する。予測される転写開始部位を「ＦｉｒｓｔＥＦ」トラック（３５）に表示し、このような部位はＬＤブロックと重複しない。予測されるｍｉｃｒｏＲＮＡ標的を「標的Ｓｃａｎ」トラック（３６）に表示し、そのうちのどれもＬＤブロックと重複しない。保存されたゲノム要素をＰｈａｓｔＣｏｎｓトラック（３７）においてＬＯＤスコアとともに表示する。 図７は、７９のヒト組織に関するＧＮＦ ＳｙｍＡｔｌａｓデータベースに基づいたＣＤＨ９（プローブ識別子：２０７７２９＿ａｔ）の組織特異的遺伝子発現レベルである。黒線は中央値を表す。 図８は、７９のヒト組織に関するＧＮＦ ＳｙｍＡｔｌａｓデータベースに基づいたＣＤＨ１０（プローブ識別子：２２０１１５＿ｓ＿ａｔ）の組織特異的遺伝子発現レベルである。黒線および青線は、それぞれ中央値およびその３倍値を表す。

疫学研究によって、成人期にまで及ぶ可変型表現型発現を提示する、児童においてよく見られる精神神経疾患である自閉症の病因に遺伝因子が関与することがわかる。自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）の小サブセットから成るデノボコピー数変動（ＣＮＶｓ）をはじめとするいくつかの遺伝的決定基はすでに報告されている。関係するゲノム領域は、ＮＲＸＮ１、ＮＬＧＮ３、ＳＨＡＮＫ３およびＡＵＴＳ２をはじめとするいくつかの遺伝子において報告される変動を有し、非常に不均一であると思われる。自閉症の病因に寄与する新規遺伝因子を同定するために、本発明者らは、シンプレックスおよびマルチプレックス家系の混合ならびに２０００人のヨーロッパ系の無病対照児童からの１２００人の自閉症患者（ＡＤＩ−Ｒおよび／またはＡＤＯＳ陽性）のコホートにおいてゲノムワイド関連性（ＧＷＡ）研究を実施する。本発明者らの関連分析によって、ゲノムワイドで有意なシグナルはないことが明らかになった（Ｐ>Ｘ×１０−７）。しかし、本発明者らは、自閉症と関連するいくつかの新規ＣＮＶｓを同定し、あらかじめ特定された有意性閾値（Ｐ<１×１０^−５）を満たす合計１２の欠失遺伝子座および９の複製遺伝子座を同定した。これらのＣＮＶｓのサブセットは、ＴＲＰＳ１およびＨＣＮ１をはじめとする自閉症遺伝情報源交換局（Ａｕｔｉｓｍ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｅｘｃｈａｎｇｅ：ＡＧＲＥ）コンソーシアムからの独立した自閉症コホートにおいて複製され、単一のＳＮＰを用いて標識することができた。あわせると、これらの結果は、自閉症における遺伝的景観が、自閉症の表現型と関連する一般的ＣＮＶｓと希少ＣＮＶｓの両方を包含することを示唆する。これらのＣＮＶｓは高度に不均一であり、ほとんどの場合、個々の家族および神経シグナリングおよび発生の種類において濃縮される遺伝子の周りのクラスタに特有である。

自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤｓ）の根底にあるさらなる遺伝的リスク因子も、これらのゲノムワイド関連性研究において同定された。膜細胞接着分子をコードする２つの遺伝子、つまりカドヘリン１０（ＣＤＨ１０）とカドヘリン９（ＣＤＨ９）間にある６のＳＮＰｓは強力な関連性シグナルを示し、最も重要なＳＮＰはｒｓ４３０７０５９である（Ｐ＝３．４×１０^−８；ＯＲ＝１．１９）。これらの関連性シグナルを４８７の自閉症家族（１，５３７人の被験者）、ならびに１０８人のＡＳＤ患者および５４０人の対照のコホートを含む２つの独立したコホートにおいて複製し、合計Ｐ値は１０，０００人を超える対象の全データ組について７．９×１０^−８〜２．１×１０^−１０の範囲であった。本発明者らの結果は、ＡＳＤｓの病因において神経細胞接着分子が関与するとし、ＡＳＤに関する感受性を有する共通の変異体のゲノムワイドに重要な関連性をはじめて示すものである。

定義：
「コピー数多型（ＣＮＶ）」とは、個体の遺伝子型における特定の遺伝子のコピー数を意味する。ＣＮＶは、ヒト表現型多様性の主な遺伝子成分である。遺伝性疾患に対する感受性は、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）だけでなく、ＣＮＶｓをはじめとする構造および他の遺伝子変化とも関連することが知られている。ＣＮＶは、約１キロベース（ｋｂ）またはそれ以上であるＤＮＡ断片を含むコピー数変化を表す（Ｆｅｕｋ ｅｔ ａｌ．２００６ａ）。本明細書において記載するＣＮＶは、後のＣＮＶ分析の複雑さを最小限に抑えるために、転移要素（たとえば、約６ｋｂのＫｐｎＩ繰り返し）の挿入／欠失から生じる変異体を含まない。ＣＮＶという用語は、したがって、大規模なコピー数変異体（ＬＣＶｓ；Ｉａｆｒａｔｅ ｅｔ ａｌ．２００４）、コピー数多型（ＣＮＰｓ；Ｓｅｂａｔ ｅｔ ａｌ．２００４）、および中間サイズの変異体（ＩＳＶｓ；Ｔｕｚｕｎ ｅｔ ａｌ．２００５）などのあらかじめ導入された項目を含むが、レトロポゾン挿入を含まない。

「単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）」とは、ＤＮＡ中の単一塩基が、その位置での通常の塩基と異なる変化を意味する。これらの単一塩基の変化を、ＳＮＰもしくは「スニップス（ｓｎｉｐｓ）」と呼ぶ。数百万のＳＮＰｓがヒトゲノムにおいて分類されている。いくつかのＳＮＰｓ、たとえば鎌状細胞の原因となるものが、疾患に関与する。他のＳＮＰｓはゲノムにおける通常の変化である。

「遺伝子変化」という用語は、本明細書で用いられる場合、１つもしくはそれ以上の核酸分子の野生型もしくは参照配列からの変化を意味する。遺伝子変化としては、制限なく、塩基対置換、公知の配列の核酸分子からの少なくとも１つのヌクレオチドの付加および欠失が挙げられる。

「固体マトリックス」という用語は、本明細書において用いられる場合、任意の構成のもの、たとえばビーズ、微小粒子、マイクロアレイ、マイクロタイトレーションウェルもしくは試験管の表面、尿試験紙またはフィルターを意味する。マトリックスの材料は、ポリスチレン、セルロース、ラテックス、ニトロセルロース、ナイロン、ポリアクリルアミド、デキストランまたはアガロースであってよい。

「〜から本質的に成る」という語句は、特定のヌクレオチドまたはアミノ酸について言及する場合、所与の配列ＩＤ番号の特性を有する配列を意味する。たとえば、アミノ酸配列に関連して用いられる場合、この語句は、配列自体ならびに配列の機能および新規特性に影響を及ぼさない分子修飾を包含する。

「標的核酸」とは、本明細書において用いられる場合、複合核酸混合物中の存在する核酸のあらかじめ規定された領域を意味し、前記規定された野生型領域は、自閉症と関連するか、または関連しない少なくとも１つの公知のヌクレオチド変化を含む。核酸分子は、ｃＤＮＡクローニングもしくはサブトラクティブハイブリダイゼーションによって天然源から単離することができるか、または手作業で合成することができる。核酸分子は、トリエステル合成法によって手作業で合成することができるか、または自動化ＤＮＡ合成機を用いることによって合成することができる。

本発明において用いられる核酸に関して、「単離された核酸」という用語が時折用いられる。この用語は、ＤＮＡに対して適用される場合、これが由来する生物の天然に存在するゲノムにおいて、（５'および３'方向において）これのすぐ隣の配列によって隔てられたＤＮＡ分子を意味する。たとえば、「単離された核酸」は、プラスミドもしくはウイルスベクターなどのベクター中に挿入されるか、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡ中に組み入れられたＤＮＡ分子を含んでもよい。「単離された核酸分子」は、ｃＤＮＡ分子も含んでよい。ベクター中に挿入された、単離された核酸分子も、本明細書において組換え核酸分子と称する場合もある。

ＲＮＡ分子に関して、「単離された核酸」という用語は、主に、上記定義の単離されたＤＮＡ分子によってコードされるＲＮＡ分子を意味する。あるいは、前記用語は、その自然状態において（すなわち、細胞もしくは組織において）関連するＲＮＡ分子から十分に分離され、したがって「実質的に純粋な」形態で存在するＲＮＡ分子を意味する。

核酸に関連して「濃縮された」という用語を使用することによって、特異的ＤＮＡもしくはＲＮＡ配列が、正常細胞もしくは配列を採取した細胞におけるよりも、対象の細胞もしくは溶液中に存在する全ＤＮＡもしくはＲＮＡの有意に高い割合（２〜５倍）を構成することを意味する。これは、存在する他のＤＮＡもしくはＲＮＡの量の優先的減少によるか、または特異的ＤＮＡもしくはＲＮＡ配列の量の優先的増加によるか、またはこれら２つの組み合わせによって、人為的に引き起こすことができる。しかし、「濃縮された」とは、他のＤＮＡもしくはＲＮＡ配列が存在しないという意味ではなく、単に対象の配列の相対量が有意に増加したことを意味する。

ある目的に関しては、ヌクレオチド配列が精製された形態であることも有利である。核酸に関連して「精製された」という用語は、絶対的な純度（たとえば、均一調製物）を要求するわけではなく、当該配列が、自然環境におけるよりも相対的に純粋であることを示す（自然のレベルと比較して、このレベルは、たとえばｍｇ／ｍｌで表して少なくとも２〜５倍高い）。ｃＤＮＡライブラリから単離された個々のクローンを精製して、電気泳動均質性にすることができる。これらのクローンから得られる、クレームされるＤＮＡ分子は、全ＤＮＡもしくは全ＲＮＡから直接得ることができる。ｃＤＮＡクローンは天然には存在せず、むしろ好ましくは部分的に精製された天然に存在する物質（メッセンジャーＲＮＡ）の操作によって得られる。ｍＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリの構築は、合成物質（ｃＤＮＡ）の作製を含み、純粋な個々のｃＤＮＡクローンの作製は、ｃＤＮＡライブラリを担う細胞のクローン選択によって合成ライブラリから単離することもできる。ｍＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリの構築および別個のｃＤＮＡクローンの単離を含むプロセスによって、本来のメッセージの約１０^−６倍の精製が得られる。したがって、少なくとも１倍、好ましくは２倍もしくは３倍、さらに好ましくは４倍もしくは５倍の精製が特に想定される。

「実質的に純粋な」という用語は、少なくとも５０〜６０重量％の対象の化合物（たとえば、核酸、オリゴヌクレオチド等）（たとえば、核酸、オリゴヌクレオチド等）を含む調製物を意味する。さらに好ましくは、前記調製物は、少なくとも７５重量％、最も好ましくは９０〜９９重量％の対象の化合物を含む。純度は、対象の化合物について適切な方法によって測定する。

「相補的」という用語は、多数の有益な互いとの相互作用を形成し得る２つのヌクレオチドを表す。たとえば、アデニンはチミンに対して相補的である。その理由は、これらが２つの水素結合を形成できるためである。同様に、グアニンとシトシンとは、これらが３つの水素結合を形成できるため、相補的である。したがって、核酸配列が次の塩基配列、チミン、アデニン、グアニンおよびシトシンを含むならば、この核酸分子の「補体」は、チミンの代わりにアデニン、アデニンの代わりにチミン、グアニンの代わりにシトシン、そしてシトシンの代わりにグアニンを含む分子である。補体は、親核酸分子と最適の相互作用を形成する核酸配列を含み得るので、このような補体はその親分子と高い親和性で結合することができる。

一本鎖核酸、特にオリゴヌクレオチドに関して、「特異的にハイブリダイズする」という用語は、当分野において一般的に用いられる、あらかじめ決められた条件下でこのようなハイブリダイゼーションを可能にするために十分相補的な配列の２つの一本鎖ヌクレオチド分子間の関連性を意味する（「実質的に相補的」と称する場合もある）。特に、この用語は、本発明の一本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ分子内に含まれる実質的に相補的な配列を用いたオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを意味し、非相補的配列の一本鎖核酸を用いたオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを実質的に排除する。たとえば、特異的ハイブリダイゼーションは、任意の自閉症特異的マーカー遺伝子もしくは核酸とハイブリダイズするが、他のヌクレオチドとはハイブリダイズしない配列を意味し得る。また、「特異的にハイブリダイズする」ポリヌクレオチドは、神経特異的マーカー、たとえば本明細書に含まれる表中に示される自閉症特異的マーカーのみとハイブリダイズし得る。様々な相補性を有する一本鎖核酸分子の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする適切な条件は、当分野で周知である。

たとえば、特定の配列相同性を有する核酸分子間のハイブリダイゼーションを達成するために必要なストリンジェントな条件を計算するための１つの一般式を以下に記載する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）：

上記式に示すように、［Ｎａ＋］＝［０．３６８］および５０％ホルムアミド（ＧＣ含有量４２％、平均プローブサイズ２００塩基）を用いて、Ｔ_ｍは５７℃である。ＤＮＡ二本鎖のＴ_ｍは、相同性が１％減少するごとに１〜１．５℃減少する。したがって、約７５％を超える配列同一性を有する標的が、４２℃のハイブリダイゼーション温度を用いて観察される。

ハイブリダイゼーションおよび洗浄のストリンジェンシーは、主に溶液の塩濃度および温度に依存する。一般的に、プローブをその標的を用いてアニーリングする速度を最大にするために、ハイブリダイゼーションは、通常、ハイブリッドの計算されたＴ_ｍより２０〜２５℃低い塩および温度条件で実施する。洗浄条件は、標的のプローブに関する同一性の程度について可能な限りストリンジェントであるべきである。一般的に、洗浄条件はハイブリッドのＴ_ｍよりも約１２〜２０℃低くなるように選択される。本発明の核酸に関して、中程度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＣ、５×デンハート液、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ中４２℃中でのハイブリダイゼーションと、２×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ中５５℃で１５分間洗浄と定義される。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＣ、５×デンハート液、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ中４２℃でのハイブリダイゼーションと、１×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ中６５℃で１５分間洗浄として定義される。極高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＣ、５×デンハート液、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ中４２℃でのハイブリダイゼーションと、０．１×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ中６５℃で１５分間の洗浄として定義される。

「オリゴヌクレオチド」という用語は、本明細書において用いられる場合、２もしくはそれ以上、好ましくは３より多いリボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドから構成される核酸分子として定義される。オリゴヌクレオチドの正確なサイズは、様々な因子およびオリゴヌクレオチドの具体的な用途および使用に依存するであろう。プローブおよびプライマーを含むオリゴヌクレオチドは、３ヌクレオチドから核酸分子の完全長までの任意の長さであり得、明確には、３から完全長のポリヌクレオチドまでの連続した核酸のあらゆる可能な数を包含する。好ましくは、オリゴヌクレオチドは少なくとも約１０ヌクレオチドの長さであり、さらに好ましくは少なくとも１５ヌクレオチドの長さであり、さらに好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチドの長さである。

「プローブ」という用語は、本明細書において用いられる場合、精製された制限酵素消化物におけるなど天然に存在するか、または合成によって産生されるかにかかわらず、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸、ＲＮＡもしくはＤＮＡのいずれかを意味し、これはプローブに対して相補的な配列を有する核酸とアニーリングできるか、または核酸に対して特異的にハイブリダイズすることができる。プローブは、一本鎖もしくは二本鎖のいずれかであってよい。プローブの正確な長さは、温度、プローブ源および前記方法の使用をはじめとする多くの因子に依存するであろう。たとえば、診断用途に関して、前記標的配列の複雑さに応じて、前記オリゴヌクレオチドプローブは典型的には１５〜２５もしくはそれ以上のヌクレオチドを含むが、これより少ないヌクレオチドを含む場合もある。本明細書におけるプローブは、特定の標的核酸配列の異なるストランドに対して相補的であるように選択される。このことは、前記プローブが、これらのそれぞれの標的ストランドとあらかじめ決められた条件下で、「特異的にハイブリダイズする」ことができるかまたはアニールすることができるために十分相補的でなければならないことを意味する。したがって、前記プローブ配列は前記標的の正確な相補的配列を反映する必要はない。たとえば、非相補的ヌクレオチド断片を前記プローブの５'もしくは３'と結合させてもよく、前記プローブ配列の残りは前記標的ストランドに対して相補的である。あるいは、非相補的塩基またはさらに長い配列をプローブ中に組み入れることができる。ただし、前記プローブ配列は前記標的核酸の配列と、特異的にアニールするために十分な相補性を有するものとする。

「プライマー」という用語は、本明細書において用いられる場合、ＲＮＡもしくはＤＮＡのいずれか、一本鎖もしくは二本鎖のいずれか、生物系由来であるか、制限酵素消化によって生じるか、もしくは合成によって産生されるかのいずれかであるオリゴヌクレオチドであって、適切な環境中に置かれると、テンプレート依存性核酸合成の開始剤として機能的に作用できるオリゴヌクレオチドを意味する。適切な核酸テンプレート、核酸の適切なヌクレオシド三リン酸前駆体、ポリメラーゼ酵素、好適な補助因子ならびに好適な温度およびｐＨなどの条件が提供されると、前記プライマーを、ポリメラーゼの作用によるヌクレオチドの付加もしくは類似の作用によって３'末端で伸長して、プライマー伸長産物を得ることができる。前記プライマーは特定の適用条件および要件に応じて長さが変わり得る。たとえば、診断的適用において、前記オリゴヌクレオチドプライマーは典型的には１５〜２５もしくはそれ以上のヌクレオチドの長さである。前記プライマーは、所望の伸長産物の合成を準備するために十分な、所望のテンプレートに対する相補性を有するものでなければならない。すなわち、ポリメラーゼもしくは類似の酵素による合成の開始で使用される適切な並置においてプライマーの３'ヒドロキシル部分を提供するために十分な方法で所望のテンプレートストランドとアニールすることができる。前記プライマー配列が所望のテンプレートの正確な補体である必要はない。たとえば、非相補的ヌクレオチド配列を、それ以外は相補的であるプライマーの５'末端と結合させてもよい。あるいは、非相補的塩基をオリゴヌクレオチドプライマー配列内に組み入れてもよい。ただし、前記プライマー配列は、前記伸長産物の合成用テンプレート・プライマー複合体を機能的に提供するために十分な、所望のテンプレートストランド配列との相補性を有する。

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、その開示全体がこの参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，６８３，１９５号明細書、同第４，８００，１９５号明細書、および同第４，９６５，１８８号明細書に記載されている。

「ベクター」という用語は、細胞中に感染、トランスフェクトもしくは形質転換することができ、独立的もしくは宿主細胞ゲノム内で複製できる、一本鎖もしくは二本鎖環状核酸分子に関する。環状二本鎖核酸分子は、切断することができ、それによって制限酵素で処理して直線化することができる。各種ベクター、制限酵素、および制限酵素によって標的とされるヌクレオチド配列の情報は、当業者には容易に利用可能であり、レプリコン、たとえばプラスミド、コスミド、バクミド、ファージもしくはウイルスを包含し、これに対して別の遺伝子配列もしくは要素（ＤＮＡもしくはＲＮＡのいずれか）を結合させて、結合配列もしくは要素を複製することができる。ベクターを制限酵素で切断し、２断片を合わせてライゲートすることによって、本発明の核酸分子をベクター中に挿入することができる。

原核生物もしくは真核生物中への発現構築物の形質転換、トランスフェクション、または形質導入を促進するために、当業者には多くの技術が利用可能である。「形質転換」、「トランスフェクション」、および「形質導入」という用語は、細胞もしくは宿主生物中へ核酸および／または発現構築物を挿入する方法を意味する。これらの方法は、前記細胞を高濃度の塩、電場、もしくは界面活性剤で処理して前記宿主細胞外膜もしくは壁を対象の核酸分子に対して透過性にすること、微量注入法、ＰＥＧ融合法など、様々な技術を包含する。

「プロモータ要素」という用語は、一旦は適切な細胞の内部で、転写因子および／またはポリメラーゼ結合ならびにその後のベクターＤＮＡの一部のｍＲＮＡ中への転写を促進できるベクター中に組み入れられるヌクレオチド配列を表す。一実施形態において、本発明のプロモータ要素は、自閉症特異的マーカー核酸分子の５'末端の前にあるので、後者がｍＲＮＡ中に転写される。宿主細胞機構は次にｍＲＮＡをポリペプチドに翻訳する。

当業者は、核酸ベクターが、プロモータ要素および自閉症特異的マーカー遺伝子核酸分子以外の核酸要素を含み得ることを認識するであろう。これらの他の核酸要素は、これに限定されるものではないが、複製起点、リボソーム結合部位、薬剤耐性酵素またはアミノ酸代謝酵素をコードする核酸配列、および分泌シグナル、局在化シグナル、もしくはポリペプチド精製に有用なシグナルをコードする核酸配列を包含する。

「レプリコン」は、任意の遺伝要素、たとえば、プラスミド、コスミド、バクミド、プラスチド、ファージもしくはウイルスであり、主にそれ自体の制御下で複製できるものである。レプリコンは、ＲＮＡもしくはＤＮＡのいずれかであってよく、一本鎖であっても、二本鎖であってもよい。

「発現オペロン」は、転写および翻訳制御配列、たとえばプロモータ、エンハンサ、翻訳開始シグナル（たとえば、ＡＴＧもしくはＡＵＧコドン）、ポリアデニル化シグナル、ターミネータ等を有してもよく、宿主細胞もしくは生物におけるポリペプチドコーディング配列の発現を促進する核酸断片を意味する。

本明細書で用いられる場合、「レポーター」、「レポーター系」、「レポーター遺伝子」、もしくは「レポーター遺伝子産物」という用語は、核酸が、発現された場合に、たとえば、生物学的検定法、免疫測定、放射免疫測定、または比色法、蛍光法、化学発光法もしくは他の方法によって容易に測定可能であるレポーターシグナルを産生する産物をコードする遺伝子を含む、機能的遺伝系を意味する。前記核酸は、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、線状もしくは環状、一本鎖もしくは二本鎖、アンチセンスもしくはセンス極性のいずれかであり、レポーター遺伝子産物の発現に必要な制御要素と機能的に連結される。必要な制御要素は、レポーター系の性質、およびレポーター遺伝子がＤＮＡもしくはＲＮＡの形態であるかどうかによって変化するが、これらに限定されるものではないが、プロモータ、エンハンサ、翻訳制御配列、ポリＡ付加シグナル、転写終結シグナル等の要素を挙げることができる。

導入された核酸は、受容細胞もしくは生物の核酸中に組み入れられる（共有結合する）可能性もあるし、そうでない可能性もある。細菌、酵母、植物および哺乳動物細胞において、たとえば、導入された核酸をエピソーム要素もしくは独立レプリコン、たとえばプラスミドとして維持することができる。あるいは、導入された核酸は、受容細胞もしくは生物の核酸中に組み入れられるようになる可能性があり、当該細胞もしくは生物中で安定して維持され、前記受容細胞もしくは生物の子孫細胞もしくは生物にさらに伝えられるかもしくは受け継がれる可能性がある。最後に、導入された核酸は、一時的にのみ受容細胞もしくは宿主生物において存在できる。

「選択可能なマーカー遺伝子」という用語は、発現された場合に、形質転換細胞に選択可能な表現型、たとえば抗生物質耐性を付与する遺伝子を意味する。

「機能的に連結された」という用語は、コーディング配列の発現に必要な調節配列が、コーディング配列の発現を行うためにコーティング配列に対して適切な位置にＤＮＡ分子が位置していることを意味する。この同じ定義は、発現ベクター中の転写単位および他の転写制御要素（たとえば、エンハンサ）の配置に対しても適用される場合がある。

「組換え生物」もしくは「トランスジェニック生物」という用語は、遺伝子もしくは核酸分子の新規組み合わせを有する生物を意味する。遺伝子もしくは核酸分子の新規組み合わせを、当業者に利用可能な多様な核酸操作手法を用いて生物中に導入することができる。「生物」という用語は、少なくとも１つの細胞から成る任意の生き物に関連する。生物は、１つの真核細胞のような簡単なものであってもよく、または哺乳動物のような複雑なものであってもよい。したがって、「組換え生物」という語句は、組換え細胞、ならびに真核生物および原核生物を包含する。

「単離されたタンパク質」もしくは「単離され、かつ精製されたタンパク質」という語句を本明細書において用いる場合がある。この用語は、本発明の単離された核酸分子の発現によって産生されるタンパク質を主に意味する。あるいは、この用語は、これが自然に関連する他のタンパク質から十分に分離されているので、「実質的に純粋な」形態で存在するタンパク質を意味する場合もある。「単離された」という用語は、他の化合物もしくは物質との人工もしくは合成混合物、または基本的な活性を妨害せず、たとえば、不完全な精製、安定剤の添加、またはたとえば免疫原性製剤もしくは薬剤的に許容される製剤中への配合によって、存在する可能性がある不純物の存在を排除することを意味しない。

「特異的結合対」は、正常な状態では他の分子に対してよりも互いに優先的に結合する、互いについて特別な特異性を有する特異的結合要素（ｓｂｍ）および結合パートナー（ｂｐ）を含む。特異的結合対の例は、抗原および抗体、リガンドおよび受容体ならびに相補的ヌクレオチド配列である。当業者は、多くの他の例を認識する。さらに、「特異的結合対」という用語は、特異的結合要素および結合パートナーのいずれかもしくは両方が大分子の一部を含む場合にも適用可能である。特異的結合対が核酸配列を含む実施形態において、これらは、アッセイ条件下で、互いにハイブリダイズする長さ、好ましくは１０ヌクレオチドを超える長さ、さらに好ましくは１５もしくは２０ヌクレオチドを超える長さを有するものであろう。

「試料」もしくは「患者試料」もしくは「生体試料」とは、概して、特定の分子、好ましくは自閉症特異的マーカー分子、たとえば下記の表中に示すマーカーについて試験することができる試料を意味する。試料は、これに限定されるものではないが、細胞、血液、血清、血漿、尿、唾液、脳脊髄液、涙液、胸膜液をはじめとする体液等を含んでもよい。

「薬剤」および「試験化合物」という用語は、本明細書において交換可能に用いられ、化合物、化合物の混合物、生体高分子、または細菌、植物、真菌もしくは動物（特に哺乳動物）細胞もしくは組織などの生体材料から作製される抽出物を意味する。生体高分子としては、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド、ペプチド／ＤＮＡ複合体、および本明細書に記載されるＳＮＰおよび／またはＣＮＶ含有核酸またはこれらのコードされたタンパク質の活性を調節する能力を示す任意の核酸に基づく分子が挙げられる。薬剤は、本明細書で以下に記載するスクリーニングアッセイを組み入れることによって、潜在的な生物活性について評価される。

自閉症および自閉症スペクトラム障害の発現の傾向を診断するために自閉症関連ＣＮＶＳおよび／またはＳＮＰＳを使用する方法
これに限定されるものではないが、下記表中に記載されたものを含む自閉症関連ＣＮＶおよび／またはＳＮＰ含有核酸を、本発明の様々な目的に関して使用することができる。自閉症関連ＣＮＶ／ＳＮＰ含有ＤＮＡ、ＲＮＡ、もしくはその断片を、自閉症特異的マーカーの存在および／または発現を検出するためのプローブとして使用できる。自閉症特異的マーカー核酸をこのようなアッセイのプローブとして利用できる方法としては、これらに限定されるものではないが：（１）インサイチュハイブリダイゼーション；（２）サザンハイブリダイゼーション（３）ノーザンハイブリダイゼーション；および（４）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの各種増幅反応が挙げられる。

さらに、自閉症関連ＣＮＶｓ／ＳＮＰｓを検出するためのアッセイを、これに限定されるものではないが、体液（血液、尿、血清、脳脊髄液、胃洗浄を包含する）、任意の種類の細胞（たとえば、脳細胞、白血球、単核細胞）または生体組織を含む任意の種類の生体試料に関して実施することができる。

先の考察から、本発明の、自閉症関連ＣＮＶ／ＳＮＰ含有核酸、これを発現するベクター、自閉症ＣＮＶ／ＳＮＰ含有マーカータンパク質および抗自閉症特異的マーカー抗体を用いて、生体組織、細胞、もしくは流体において自閉症関連ＣＮＶｓ／ＳＮＰｓを検出し、自閉症の発現に関与する遺伝子およびタンパク質相互作用を評価する目的で、自閉症ＳＮＰ含有マーカータンパク質発現を変えることができることがわかる。

自閉症関連ＣＮＶｓ／ＳＮＰｓについてスクリーニングするためのほとんどの実施形態において、試料中の自閉症関連ＣＮＶ／ＳＮＰ含有核酸を、たとえばＰＣＲを用いてまず増幅させて、試料中に存在する他の配列と比較してテンプレートの量を増加させる。これによって、標的配列が、もし試料中に存在するならば、高い感度で検出されることを可能になる。この初期工程は、当分野でますます重要になってきている高感度アレイ技術を用いることによって回避できる。あるいは、新規検出技術で、この制限を克服することができ、全ＲＮＡで１μｇもの少量しか含有しない小試料の分析を可能にできる。伝統的な蛍光技術に対して、共鳴光散乱（ＲＬＳ）技術を用いて、ビオチンで標識されたハイブリッド標的および抗ビオチン抗体を使用して、複数の読み出しで少量のｍＲＮＡを検出することができる。ＰＣＲ増幅の別の代替法は、シグナル対ノイズ比を増加させ、バックグラウンド干渉を減少させるために、プラナー型導波技術（ＰＷＧ）を含む。両技術は、Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．（米国）から市販されている。

したがって、前記技術のいずれかを用いて、自閉症関連ＣＮＶ／ＳＮＰマーカー発現を検出もしくは定量化することができ、ひいては自閉症を診断することができる。

キットおよび製品
任意の前記製品を、自閉症関連ＣＮＶ／ＳＮＰ特異的マーカーポリヌクレオチドまたは遺伝子チップ上に固定化された１もしくはそれ以上のかかるマーカー、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド、抗体、標識、マーカー、またはレポーター、薬剤的に許容される担体、生理学的に許容される担体、使用説明書、容器、投与用容器、アッセイ用基質、またはこれらの任意の組み合わせを含んでよいキット中に組み入れることができる。

治療薬開発のために自閉症関連ＣＮＶｓ／ＳＮＰｓを使用する方法
本明細書で同定されるＣＮＶｓおよびＳＮＰｓは自閉症の病因と関連するので、前記遺伝子およびかかるＣＮＶｓ／ＳＮＰｓを含有するこれらのコードされた産物の活性を調節する薬剤を同定するための方法によって、この状態と関連する様々な障害を治療するための有効な治療薬が得られるはずである。

表に示すデータからわかるように、いくつかの染色体は、それらの活性を調節する治療薬の合理的設計に適した標的を提供する領域を含む。これらの領域に対応する小ペプチド分子を用いて、コードされたタンパク質の活性を有効に調節する治療薬の設計を促進することができる。

分子モデリングは、機能に必要な立体構造もしくは重要なアミノ酸残基に基づいたＣＮＶ／ＳＮＰ含有核酸によりコードされるタンパク質の活性部位と結合する能力を有する特異的有機分子の同定を促進するはずである。コンビナトリアルケミストリー法を用いて、最高の活性を有する分子を同定し、次いで、さらなるスクリーニングサイクルのためにこれらの分子の相互作用を発展させる。

薬剤スクリーニングアッセイにおいて用いられるポリペプチドもしくは断片は、溶液中束縛されないか、固体担体に付着しているか、または細胞内にあるかのいずれかである。薬剤スクリーニングの一方法は、ポリペプチドもしくは断片を、好ましくは競合的結合アッセイにおいて発現する組換えポリヌクレオチドで適切に形質転換された真核生物もしくは原核生物宿主細胞を利用する。このような細胞は、生存可能な形態であっても、もしくは固定形態のいずれであっても、標準的結合アッセイに使用できる。前記ポリペプチドもしくは断片と試験される前記薬剤間の複合体の形成を決定できるか、または前記ポリペプチドもしくは断片と公知の基質間の複合体形成が試験される薬剤で干渉される程度を調べることができる。

薬剤スクリーニングのための別の技術は、コードされたポリペプチドに適した結合親和性を有する化合物についての高スループットスクリーニングを提供し、Ｇｅｙｓｅｎ、ＰＣＴ公開出願、国際公開第８４／０３５６４号パンフレット（１９８４年９月１３日付けで公開）で詳細に記載されている。簡単に言うと、多数の異なる小ペプチド試験化合物、たとえば前述のものを、プラスチックピンもしくはある他の表面などの固体基体上で合成する。ペプチド試験化合物を標的ポリペプチドと反応させ、洗浄する。結合したポリペプチドを次いで、当分野において周知の方法によって検出する。

薬剤スクリーニングのためのさらなる技術は、非機能的もしくは変更された自閉症関連遺伝子を有する宿主真核細胞系または細胞（たとえば、前述のもの）の使用を包含する。これらの宿主細胞系または細胞は、ペプチドレベルが不良である。前記宿主細胞系もしくは細胞を薬剤化合物の存在下で成長させる。前記宿主細胞の細胞代謝速度を測定して、前記化合物が前記欠損細胞における細胞代謝を調節できるかどうかを決定する。本発明における使用が想定される宿主細胞としては、これらに限定されるものではないが、細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、および植物細胞が挙げられる。自閉症関連ＣＮＶ／ＳＮＰをコードするＤＮＡ分子を、このような宿主細胞中に単独または組み合わせて導入して、このような発現によって付与される細胞の表現型を評価することができる。ＤＮＡ分子を導入する方法も、当業者に周知である。このような方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ & Ｓｏｎｓ，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．１９９５に記載され、その開示は、この参照により本明細書に組み込まれる。

本発明の新規ＤＮＡ配列を発現するように修飾することができる、様々な発現ベクターが利用可能である。本明細書で例示する特異的ベクターは単なる例であって、本発明の範囲を制限することを意図しない。発現方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ｏｒ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １６．３−１７．４４（１９８９）によって記載されている。サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）における発現方法もＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８９）で記載されている。

本発明の実施において使用するのに適したベクターとしては、原核生物ベクター、たとえばｐＮＨベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｉｎｃ．，１１０９９ Ｎ．Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉｎｅｓ Ｒｄ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，カリフォルニア州９２０３７）、ｐＥＴベクター（Ｎｏｖｏｇｅｎ Ｉｎｃ．，５６５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ， ウィスコンシン州５３７１１）およびｐＧＥＸベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ニュージャージー州０８８５４）が挙げられる。本発明の実施において有用な真核生物ベクターの例としては、ベクターｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、およびｐＲＥＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，１１５８８ Ｓｏｒｒｅｎｔｏ Ｖａｌｌｅｙ Ｒｄ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ．カリフォルニア州９２１２１）；ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５&Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；バクロウイルスベクター、たとえばｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、もしくはｐＡＣ３６０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；ならびに酵母ベクター、たとえばＹＲＰ１７、ＹＩＰ５、およびＹＥＰ２４（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，マサチューセッツ州）、ならびにｐＲＳ４０３およびｐＲＳ４１３ Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｉｎｃ．）；ピチアベクター、たとえばｐＨＩＬ−Ｄ１（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ Ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ Ｃｏ．，Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ，オクラホマ州７４００４）；レトロウイルスベクター、たとえばＰＬＮＣＸおよびｐＬＰＣＸ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）；ならびにアデノウイルスおよびアデノ関連ウイルスベクターが挙げられる。

本発明の発現ベクターにおいて用いられるプロモータとしては、原核細胞もしくは真核細胞において機能できるプロモータが挙げられる。原核細胞において機能できるプロモータとしては、ラクトース（ｌａｃ）制御要素、バクテリオファージラムダ（ｐＬ）制御要素、アラビノース制御要素、トリプトファン（ｔｒｐ）制御要素、バクテリオファージＴ７制御要素、およびこれらのハイブリッドが挙げられる。真核細胞において機能できるプロモータとしては、エプスタイン・バー・ウイルス・プロモータ、アデノウイルスプロモータ、ＳＶ４０プロモータ、ラウス肉腫ウイルスプロモータ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ、バクロウイルスプロモータ、たとえばＡｃＭＮＰＶポリへドリンプロモータ、ピチアプロモータ、たとえばアルコール・オキシダーゼ・プロモータ、およびサッカロマイセスプロモータ、たとえばｇａｌ４誘導プロモータおよびＰＧＫ構成的プロモータ、ならびに神経細胞特異的血小板由来成長因子プロモータ（ＰＤＧＦ）、Ｔｈｙ−１プロモータ、ハムスターおよびマウス・プリオン・プロモータ（ＭｏＰｒＰ）、およびグリア細胞におけるトランス遺伝子の発現のためのグリア細胞繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）が挙げられる。

加えて、本発明のベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を促進する多様なマーカーのうちのいずれか１つを含んでもよい。このようなマーカーとしては、温度感受性、薬剤耐性、もしくは前記宿主生物の表現型の特徴と関連する酵素と関連する遺伝子が挙げられる。

本発明の自閉症関連ＣＮＶｓ／ＳＮＰｓもしくはその機能的断片を発現する宿主細胞は、その中で潜在的な化合物もしくは薬剤を自閉症の発現を調節する能力についてスクリーンするシステムを提供する。したがって、一実施形態において、本発明の核酸分子を、神経シグナリングならびに神経細胞伝達および構造と関連する細胞代謝の態様を調節する薬剤を同定するためのアッセイにおいて使用される組換え細胞系を作製するために使用することができる。本明細書では、ＣＮＶ／ＳＮＰ含有核酸によってコードされるタンパク質の機能を調節できる化合物についてのスクリーン法も提供する。

別の方法は、ファージ表面上のＣＮＶ／ＳＮＰ含有核酸によってコードされるポリペプチドの断片を発現するように操作された、ファージ・ディスプレー・ライブラリの使用を必要とする。このようなライブラリを次いで、発現されたペプチドとケミカルライブラリの成分との間の結合親和性を検出できる条件下で、コンビナトリアル・ケミカル・ライブラリと接触させる。米国特許第６，０５７，０９８号および同第５，９６５，４５６号明細書は、このようなアッセイを実施するための方法および装置を提供する。このような化合物ライブラリは、これに限定されるものではないが、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，（英国コーンウォール州Ｔｒｅｖｉｌｌｅｔ）、Ｃｏｍｇｅｎｅｘ（ニュージャージー州Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ）、Ｍｉｃｒｏｓｏｕｒ（コネチカット州Ｎｅｗ Ｍｉｌｆｏｒｄ）、Ａｌｄｒｉｃｈ（ウィスコンシン州Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ）、Ａｋｏｓ Ｃｏｎｓｕｌｔｉｎｇ ａｎｄ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ＧｍｂＨ（スイス国Ｂａｓｅｌ）、Ａｍｂｉｎｔｅｒ（仏国Ｐａｒｉｓ）、Ａｓｉｎｅｘ（露国Ｍｏｓｃｏｗ）、Ａｕｒｏｒａ（オーストリア国Ｇｒａｚ）、ＢｉｏＦｏｃｕｓ ＤＰＩ（スイス国）、Ｂｉｏｎｅｔ（英国Ｃａｍｅｌｆｏｒｄ）、Ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅ（カリフォルニア州Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）、Ｃｈｅｍ Ｄｉｖ（カリフォルニア州Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）を含む多くの企業から市販されている。当業者は、他の供給源を認識し、これを容易に購入することができる。治療上有効な化合物は、本明細書において記載するスクリーニングアッセイで同定されると、医薬組成物に処方することができ、自閉症の治療に利用することができる。

合理的薬物設計の目標は、ポリペプチドのさらに活性もしくは安定な形態であるか、またはたとえば、ポリペプチドの生体内機能を向上もしくは妨害する薬剤を調製するために、対象の生物活性ポリペプチド、またはこれらと相互作用する小分子（たとえば、作用物質、拮抗物質、阻害物質）の構造的類似体を産生することである。たとえば、Ｈｏｄｇｓｏｎ，（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１９−２１を参照。前述の一方法において、対象のタンパク質の三次元構造、またはたとえば、タンパク質・基質複合体の三次元構造を、Ｘ線結晶学によるか、核磁気共鳴によるか、コンピュータモデリングによるか、または最も典型的には方法の組み合わせによって解明する。それほど頻繁ではないが、ポリペプチドの構造に関する有用な情報が、相同タンパク質の構造に基づくモデリングによって得られる。合理的薬物設計の一例は、ＨＩＶプロテアーゼ阻害物質の開発である（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：５２７−５３３）。加えて、ペプチドをアラニン・スキャンによって分析することができる（Ｗｅｌｌｓ，（１９９１）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ． ２０２：３９０−４１１）。この技術では、アミノ酸残基をＡｌａと置換し、ペプチドの活性に対するその影響を決定する。ペプチドのアミノ酸残基のそれぞれを、ペプチドの重要な領域を決定するためのこのような方法で分析する。

機能分析によって選択される、標的特異的抗体を単離することも可能であり、次いでその結晶構造を解明することができる。原則として、この方法は、その後の薬剤設計の基礎とすることができるファーマコア（ｐｈａｒｍａｃｏｒｅ）を産生する。

抗イディオタイプ抗体（ａｎｔｉ−ｉｄｓ）を生成させて、機能的な薬理活性抗体にすることによって、タンパク質結晶学を完全に回避することができる。鏡像の鏡像として、ａｎｔｉ−ｉｄｓの結合部位は、オリジナルの分子の類似体であることが予想される。ａｎｔｉ−ｉｄｓを次いで、化学的もしくは生物学的に産生されたペプチドバンクのバンクからペプチドを同定し、単離するために使用できる。選択されたペプチドはファーマコアとしての働きをする。

このように、たとえば、改善されたポリペプチド活性もしくは安定性を有するか、またはポリペプチド活性の阻害物質、作用物質、拮抗物質等としての働きをする薬剤を設計することができる。本明細書において記載するＣＮＶ／ＳＮＰ含有核酸配列の利用可能性に基づいて、十分な量のコードされたポリペプチドを、Ｘ線結晶学などの分析的研究を実施するために利用可能にすることができる。加えて、本明細書で提供するタンパク質配列の情報は、Ｘ線結晶学の代わりに、またはＸ線結晶学に加えて、コンピュータモデリング技術を採用する者の指針となるであろう。

別の実施形態において、自閉症関連ＣＮＶ／ＳＮＰ含有核酸の利用可能性によって、本発明の自閉症関連ＣＮＶｓ／ＳＮＰｓを保有する実験用マウスの系統の生産が可能になる。本発明の自閉症関連ＣＮＶ／ＳＮＰを発現するトランスジェニックマウスは、その中で自閉症の発生および進行において、ＳＮＰ含有核酸によりコードされるタンパク質の役割を調べるためのモデル系を提供する。実験用マウス中にトランス遺伝子を導入する方法は、当業者に公知である。３つの一般的な方法はとしては次のものが挙げられる：１．対象の外来遺伝子をコードするレトロウイルスベクターを初期胚中に組み入れる；２．新たに受精した卵の前胚中にＤＮＡを注入する；および３．遺伝子操作された胚幹細胞を初期胚中に組み入れる。前述のトランスジェニックマウスの生産は、様々な細胞代謝プロセスおよび神経プロセスにおける標的タンパク質の役割の分子的説明を容易にする。このようなマウスは、全動物モデルにおける推定治療薬剤を研究するための生体内スクリーニング手段を提供し、本発明に含まれる。

「動物」という用語は、本明細書においては、ヒトを除く全ての脊椎動物を包含するために用いられる。胚形成および胎児期を包含する、発生のあらゆる段階における各動物も包含する。「トランスジェニック動物」は、標的組換えもしくは微量注入法もしくは組換えウイルスでの感染によるなど、細胞以下のレベルでの意図的な遺伝子操作によって、直接的もしくは間接的に、変更もしくは受容された遺伝子情報を有する１もしくはそれ以上の細胞を含む任意の動物である。「トランスジェニック動物」という用語は、古典的な交雑育種または体外受精を包含することを意味するのではなく、むしろ１もしくはそれ以上細胞が組換えＤＮＡ分子によって変更されているか、または組換えＤＮＡ分子を受容した動物を包含することを意味する。この分子は、規定された遺伝子座を特異的に標的とするか、染色体内にランダムに組み入れられるか、またはＤＮＡを染色体外複製することができる。「生殖細胞系トランスジェニック動物」という用語は、その中で遺伝子変化もしくは遺伝情報が生殖細胞系中に導入され、これによって前記遺伝情報を子孫に移す能力が付与されたトランスジェニック動物を意味する。このような子孫が、実際に、この変化もしくは遺伝情報の一部または全てを有するならば、これらもまたトランスジェニック動物である。

遺伝情報の変化は、受容者が属する動物種に対して異質であってもよく、または特定の各受容者のみに対して異質であってもよく、または受容者がすでに保有している遺伝情報であってもよい。最後の場合、変更もしくは導入された遺伝子は、生来の遺伝子とは異なって発現される可能性がある。このような変更もしくは異質遺伝情報は、自閉症関連ＣＮＶ／ＳＮＰ含有ヌクレオチド配列の導入を包含する。

標的遺伝子を変えるために用いられるＤＮＡは、これらに限定されるものではないが、ゲノム源からの単離、単離されたｍＲＮＡテンプレートからのｃＤＮＡの調製、直接合成、またはこれらの組み合わせを包含する様々な技術によって得ることができる。

トランス遺伝子導入に好適な種類の標的細胞は、胚性幹細胞（ＥＳ）である。ＥＳ細胞は、体外で培養された着床前の胚から得ることができる（Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１５４−１５６；Ｂｒａｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３０９：２５５−２５８；Ｇｏｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８３：９０６５−９０６９）。トランス遺伝子は、ＤＮＡトランスフェクションなどの標準的技術によるか、またはレトロウイルス媒介性形質導入によって、ＥＳ細胞中に有効に導入することができる。結果として得られる形質転換されたＥＳ細胞を、その後、ヒト以外の動物から得られる未分化胚芽細胞と組み合わせることができる。導入されたＥＳ細胞は、その後、胚でコロニーを形成し、結果として得られるキメラ動物の生殖細胞系に寄与する。

個々の遺伝子およびこれらの発現産物の寄与を決定する問題に対する一つの取り組みは、単離された自閉症関連ＣＮＶ／ＳＮＰ遺伝子を挿入カセットとして使用して、分化全能性のＥＳ細胞（たとえば、前述のもの）における野生型遺伝子を選択的に不活性化し、次いでトランスジェニックマウスを生成させることである。遺伝子標的トランスジェニックマウスの生成における遺伝子標的ＥＳ細胞の使用は記載され、他の場所で概説されている（Ｆｒｏｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｃｅｌｌ ５６：１４５−１４７；Ｂｒａｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：５３４−５３９）。

任意の遺伝領域を不活性化もしくは変更して、染色体対立遺伝子中に特異的変化を導入するための標的相同組換えを用いることによって所望の突然変異にするための技術が利用可能である。しかし、１００％に近い頻度で起こる相同染色体外組換えと比較して、相同プラスミド−染色体組換えは、当初、１０^−６〜１０^−３間の頻度で検出されるだけであると報告された。非相同プラスミド−染色体相互作用は、匹敵する相同挿入よりも１０^５倍〜１０^２倍高いレベルでより頻繁に起こる。

ネズミＥＳ細胞における標的組換えのこのような低い割合を克服するために、希少な相同組換え体を検出もしくは選択するための様々な方法が開発された。相同変化事象を検出するための一つの取り組みは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて形質転換細胞のプールを相同挿入についてスクリーンし、続いて個々のクローンのスクリーンを行う。あるいは、相同挿入が起こる場合にのみ活性になり、これらの組換え体が直接的に選択されることが可能になるマーカー遺伝子が構築される、正の遺伝子選択法が開発されている。相同組換え体を選択するために開発された最も有力な方法のうちの１つは、変化の直接選択が存在しない遺伝子について開発された正負選択（ＰＮＳ）法である。前記マーカー遺伝子はそれ自身のプロモータを有するので、前記ＰＮＳ法は、高レベルで発現されない遺伝子を標的とするのにより有効である。非相同組換え体は、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）遺伝子を使用し、ガンシクロビル（ＧＡＮＣ）もしくは（１−（２−デオキシ−２−フルオロ−Ｂ−Ｄアラビノフルラノシル）−５−ヨードウラシル（ＦＩＡＵ）などの有効なヘルペス薬を用いたその非相同挿入に対して選択することによって、選択される。この対抗選択によって、生存している形質転換体における多くの相同組換え体の数を増大させることができる。自閉症関連ＳＮＰ含有核酸を標的挿入カセットとして使用することによって、たとえば、自閉症関連ＳＮＰ核酸によってコードされるポリペプチドについて免疫特異的な抗体に対する免疫反応性を獲得することにより可視化されるような挿入の成功を検出するための手段が得られ、かくして所望の遺伝子型を有するＥＳ細胞のスクリーニング／選択が促進される。

本明細書で用いられる場合、ノックイン動物は、内因的ネズミ遺伝子が、たとえば、本発明のヒト自閉症関連ＣＮＶ／ＳＮＰ含有遺伝子と置換されたものである。このようなノックイン動物は、自閉症の発現を研究するための理想的なモデル系を提供する。

本明細書で用いられる場合、自閉症関連ＣＮＶ／ＳＮＰ含有核酸、その断片、または自閉症関連ＣＮＶ／ＳＮＰ融合タンパク質の発現は、自閉症関連ＣＮＶ／ＳＮＰの全部もしくは一部をコードする核酸配列が、特定の組織もしくは細胞型においてコードされたタンパク質の発現を行う調節配列（たとえば、プロモータおよび／またはエンハンサ）に機能的に連結されているベクターを用いる、「組織特異的方法」または「細胞型特異的方法」で標的とすることができる。このような調節要素を、体外および生体内用途の両方について有利に使用することができる。組織特異的タンパク質を管理するプロモータは当分野で周知であり、本明細書で記載する。

本発明の自閉症関連ＣＮＶ／ＳＮＰをコードする核酸配列を、トランスジェニック動物における発現のために様々なプロモータ配列と機能的に連結することができる。このようなプロモータとしては、これに限定されるものではないが、米国特許第５，８７７，３９９号明細書およびＢｏｒｃｈｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔ． Ａｎａｌ．１３（６）（１９９６）ｐａｇｅｓ １５９−１６３に記載されているハムスターおよびマウス・プリオン・プロモータ（ＭｏＰｒＰ）などのプリオン遺伝子プロモータ；米国特許第５，６１２，４８６号明細書、および同第５，３８７，７４２号明細書に記載されるラット神経細胞特異的エノラーゼプロモータ；米国特許第５，８１１，６３３号明細書に記載される血小板由来成長因子Ｂ遺伝子プロモータ；米国特許第５，８４９，９９９号明細書に記載される脳特異的ジストロフィンプロモータ；Ｔｈｙ−１プロモータ；ＰＧＫプロモータ；ＣＭＶプロモータ；神経細胞特異的血小板由来成長因子Ｂ遺伝子プロモータ；およびグリア細胞におけるトランス遺伝子発現のためのグリア細胞繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモータが挙げられる。

本発明のトランスジェニックマウスの使用法も本明細書で記載する。自閉症関連ＣＮＶ／ＳＮＰを含有する核酸もしくはそのコードされたタンパク質が導入されているトランスジェニックマウスは、たとえば、自閉症の発現を調節できる治療薬を特定するために治療薬をスクリーンするためのスクリーニング法を開発するために有用である。

調合薬およびペプチド療法
本明細書で記載する自閉症関連ＣＮＶｓ／ＳＮＰｓによる神経シグナリングおよび脳構造における役割を解明することによって、自閉症の治療および診断に有用な医薬組成物の開発が促進される。これらの組成物は、上記物質のうちの１つのほかに、薬剤的に許容される賦形剤、担体、緩衝液、安定剤または当業者に周知の他の物質を含んでもよい。このような物質は、無毒であり、かつ前記活性成分の有効性を妨害しないものでなければならない。前記担体または他の物質の正確な性質は、たとえば、経口、静脈内、皮膚もしくは皮下、鼻、筋肉内、腹腔内経路などの投与経路に依存する可能性がある。

ポリペプチド、抗体、ペプチド、核酸分子、小分子または個体に投与される本発明の他の薬剤的に有用な化合物であるかどうかによらず、投与は好ましくは、個体に対して効果を示すのに十分な、「予防上有効な量」もしくは「治療上有効な量」である（場合によっては、予防が想定される治療である可能性があるが）。

以下の実施例は、本発明のある実施形態を説明するために記載する。これらは本発明を限定することを意図しない。

以下の材料および方法は、本発明の実施を容易にするために記載する。

自閉症コホートは、３人の核家族（罹患児童１人と両親）もしくはマルチプレックス家族のいずれかに属する１２００人の自閉症患者から構成され、遺伝子型同定のために罹患者１人だけをランダムに選択した。全患者は１２才未満であり、標準的ＡＤＩ−Ｒおよび／またはＡＤＯＳ基準を満たしていると診断された。民族的背景は、最大１つのヨーロッパ系サブセットと混合した（ｎ＝９００）。ヨーロッパ系の被験者のみを分析で使用した。各病院および他の関連施設の倫理研究委員会は研究を承認し、全ての被験者から書面でのインフォームド・コンセントを得た。

研究複製コホートについての詳細な情報は、ＡＧＲＥウェブサイトで入手可能である。ＡＧＲＥ試料も米国で集め、ほとんどの被験者はヨーロッパ系であり；ヨーロッパ系の被験者のみを複製分析において使用した。

対照群は、自己申告で白色人種、平均年齢９．４２才；５３．０５％の男性および４６．９５％の女性で自閉症もしくはＡＳＤでない児童を含んでいた。これら個人は、ＣＨＯＰの臨床医および４カ所のプライマリー・ケア診療所ならびにいくつかのグループ診療および健康児童診察も含む外来患者診療所を含むチョップス・ヘルス・ケア・ネットワーク（ＣＨＯＰ'ｓ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ Ｎｅｔｗｏｒｋ）内の看護職員が集めた。ＣＨＯＰの倫理研究委員会は、研究を承認し、全ての被験者から書面でのインフォームド・コンセントを得た。

本発明者らは、すでに記載されているようにして^１１、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｆｉｎｉｕｍ（商標）ＩＩ ＨｕｍａｎＨａｐ５５０ ＢｅａｄＣｈｉｐ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ^９、１０（Ｉｌｌｕｍｉｎａ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）を、ＣＨＯＰの（センター・フォア・アプライド・ゲノミクス（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）で使用して、高スループットゲノムワイドＳＮＰ遺伝子型同定を実施した。

ケースコントロール比較のために、本発明者らは、１２００人の自閉症発端者（そのほとんどは、散発性／シンプレックス自閉症家族の出である）および２０００人のヨーロッパ系の非血縁対照（自己申告に基づき、約５６１，４６６単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰｓ）を有する）を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｈｕｍａｎ Ｈａｐ５５０ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ＢｅａｄＣｈｉｐプラットフォーム^９を使用して遺伝子型を同定した。全ての患者は、標準的ＡＤＩ−Ｒおよび／またはＡＤＯＳ基準に基づいて臨床的に証明された自閉症であった。５６１，４６６のＳＮＰｓのうち、５２５４は９０％のコール頻度（ｃａｌｌ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）を満たさず、１６，３９１のＳＮＰｓは１％ＭＡＦ未満であり、１５，２６４のＳＮＰｓはハーディーワインバーグ平衡（Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ：ＨＷＥ）に達せず、廃棄した。この結果、５２４，５５７組のＳＮＰｓをＧＷＡ分析に使用する。本発明者らは、自閉症児、罹患していない兄弟姉妹、および親から得られた５，９７５試料を遺伝子型同定した。これらのうち、３１６は９８．０％のコール率閾値（ｃａｌｌ ｒａｔｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）より低くなり、除外した。したがって、５，６５９試料は遺伝子型同定コール率（ｃａｌｌ ｒａｔｅ）が９７．５％より高かった。自閉症患者および対照被験者は、２つの独立した試料セット由来であった。Ｉ：ＣＨＯＰ／Ｓｅａｔｔｌｅから来たシンプレックスおよびマルチプレックス家族の混合であり、１，０５７人の自閉症患者、５８２人の親および２５１８人の罹患していない対照を含んでいた。ＩＩ：ＡＧＲＥ由来のマルチプレックス家族であり、１６９７人の自閉症患者および９３２の固有家族からの２３２３人の罹患していない兄弟姉妹もしくは親を含んでいた。ケースコントロール分析において、単一マーカー対立遺伝子頻度を、全てのマーカーについてχ^２統計を用いて比較した。表１に示すように、本発明者らは、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ相関後に０．０５レベルのゲノムワイド有意性を満たす１つのＳＮＰ（ｒｓ２３８１５９５）を同定した。さらなる試験によると、前記希少対立遺伝子の前記対立遺伝子頻度は希少で、患者集団では２％であり、対照では０．６％であり、ＳＮＰはケースコントロール分析においてのみシグナルを示し（ＰＤＴ分析において陰性）、これはシグナルを示すこの領域での唯一のＳＮＰであり、このことは、誤りである可能性を示唆する。表１は、示唆的Ｐ値を有するＳＮＰｓを記載する（名目Ｐ<１×１０^−５）。

本発明者らは、自閉症表現型に対するＣＮＶ関連性についてのゲノムワイド調査も実施した。データの品質は、９８％を超えるコール率、家系情報マーカー（ＡＩＭｓ）クラスタ化に基づいて綿密に分類された患者および対照の母集団、０．３５未満の正規化強度の標準偏差、ＧＣ含有量に一致する強度の低波形、および個人あたり４０ＣＮＶｓの最大数に基づいて厳密にフィルターにかけた。この結果、２０７２の自閉症例および２５１８人の対照が得られた。隠れマルコフモデル（Ｈｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖ Ｍｏｄｅｌ：ＨＭＭ）法を利用して、最も可能性が高いＣＮＶ状態を各試料のＳＮＰの連続配列について報告する。本発明者らは、まず、これに限定されるものではないが、ＮＲＸＮ１、ＳＨＡＮＫ３、ＡＵＴＳ２およびＮＬＧＮ３を含む自閉症もしくはＡＳＤ表現型に関連するとすでに報告されているＣＮＶの複製について調査した。表２に示すように、ＮＲＸＮ１は、ＣＮＶ関連性（Ｐ＝０．０１７）によって本発明者らが確認できた唯一すでに報告されている遺伝子であった。残りの遺伝子に対する関連性についての証拠はなかった。ＳＮＰに基づく全ゲノムＣＮＶ関連性をあらかじめ形成して、患者集団と対照集団間の複合ＣＮＶ重複において最も有意な点を記録した。カイ二乗統計量を、各ＳＮＰについて欠失および重複のＣＮＶ観察に対して適用した。結果を非重複的方法で提示するために、統計的極小値を、１ＭＢ内にあるＳＮＰｓを含む名目有意性の領域に関連して報告する。本発明者らは、この方法を用いて、自閉症における新規（表３）および過剰（表４）のＣＮＶｓの領域を同定した。ＣＮＶｓの大部分は、Ｓｅａｔｔｌｅ／ＣＨＯＰコンソーシアムからの血液由来試料と自閉症遺伝情報源交換局（ＡＧＲＥ）からの細胞系試料との間に複製を有する。最も重要な関連性は、ＰＯＴＥ８（前立腺、卵巣、および精巣において発現されるタンパク質）である（ｐ＝１．３６^−１１）。

自閉症に関連する直接機能確認のために遺伝子含量に集中するために、遺伝子含量に直接影響を及ぼすＣＮＶｓのみについて分析を実施した。遺伝子に基づく方法は、異なる位置で同じ遺伝子に影響を及ぼし得るＣＮＶｓの不完全な重複を取り込むためにより柔軟性が高い。各ＣＮＶコールは、自閉症のトップ候補遺伝子を確立するために遺伝子含量でアノテートした。本発明者らは、この方法を用いて、自閉症における新規（表５）および過剰（表６）のＣＮＶｓの領域を同定した。表７は他の名目上有意なＣＮＶｓを記載する。この方法から得られる非常に有意な結果のうちの１つ（ｐ＝４．５^−１５）は、ＭＧＡＭ（マルターゼ・グルコアミラーゼ）遺伝子の欠失をもたらすＣＮＶ、デンプン消化の最終工程に関与する刷子縁膜酵素を含む。この遺伝子は、腸の微絨毛ライニングにおいて主に発現され、デンプンの消化に関与し；デンプンが消化されない場合、腸は、Ｄ−乳酸およびこれらの産物としてデルモフィンを産生する細菌の温床となる。これらの代謝物は、中枢神経系（ＣＮＳ）の血液脳関門を通って脳へと伝播し、奇矯な行動と関連する。４１％のＡＧＲＥ患者は、胃腸障害および消化不良が報告されており、これは対照が１０％であるのに対して、４４％の自閉症児が胃腸症状を有することを示す他の報告と一致する。

自閉症と関連するか、または自閉症において過剰であるかのいずれかであるＣＮＶｓを含む、本発明者らが同定した他の遺伝子の一部の潜在的な生物学的役割に取り組むために、デイビッド・バイオインフォーマティクス・データベース（ＤＡＶＩＤ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｄａｔａｂａｓｅ）を用いて列挙した全遺伝子の機能注解クラスタリング（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ：ＦＡＣ）を実施した。本発明者らは、シナプス伝達機能を有するとして分類された遺伝子が、これらの自閉症候補遺伝子のうち最高に濃縮され（ｐ＝７．１^−３）、したがって自閉症に対して著しい生物学的関連性を有することを観察した。これらの遺伝子は、発達中の神経系における軸索結合の形成に関与する、ＣＮＴＮ４（コンタクチン４）；中枢神経系シナプスの形成および再形成に関与する、ＮＬＧＮ１（ニューロリジン１）；ＧＲＩＤ１（グルタミン酸受容体、イオンチャンネル型）、Ｌ−グルタメートは、興奮性神経伝達物質としての働きをする；節後交感神経細胞のシナプス小胞において発現され、ドーパミンをノルエピネフリンに変換し、ＡＤＨＤと関連する、ＤＢＨ（ドーパミン・ベータ・ヒドロキシラーゼ）；アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣＨＥ）を神経筋接合部の基底膜および脳におけるニューロンのシナプスの膜に固定するために必要な、ＰＲＩＭＡ１（プロリンリッチな膜アンカー）；神経細胞におけるシナプス後骨格の一部であり、ＤＬＧ１〜４およびＳＨＡＮＫ１〜３と相互作用する、ＤＬＧＡＰ１（ディスク・ラージ・ホモログ（ｄｉｓｃｓ ｌａｒｇｅ ｈｏｍｏｌｏｇ）関連タンパク質）を含む。これらの遺伝子は、ＮＬＧＮ１を除いては、自閉症に関して新規である。自閉症発現に対するこれらの遺伝子におけるＣＮＶｓとの直接機能的関連性は、説得力がある。いくつかの他の遺伝子は、本発明者らが観察したＣＮＶｓによって影響を受け、一方、その自閉症における役割は、この時点では明らかではなくてもよく、関連性シグナルの強度は、これらの遺伝子およびこれらの隣接する領域が自閉症表現型になりやすくすることを示唆する。

あわせると、これらの結果は、自閉症の病因における遺伝的展望は、一般的および希少ＣＮＶｓの両方を含み、これらは自閉症表現型と関連し、この場合、前記希少ＣＮＶｓは非常に異質であり、個々の家族および神経シグナリングおよび発生に関与する遺伝子上のクラスタに特有である。

実施例ＩＩ
ＣＤＨ１０とＣＤＨ９間の遺伝子間領域における共通の遺伝子多様性は、自閉症スペクトラム障害に対する感受性と関連する。

疫学研究によって、児童においてよく見られる精神神経疾患であり、成人期にまで及ぶ可変的表現型発現を提示する自閉症の病因において、遺伝因子が関与するとされる。自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）の小サブセットを構成し得るデノボコピー数多型（ＣＮＶｓ）をはじめとするいくつかの遺伝的決定基がすでに報告されている。関与するゲノム領域は、ＮＲＸＮ１、ＮＬＧＮ３、ＳＨＡＮＫ３およびＡＵＴＳ２をはじめとするいくつかの遺伝子において報告されている変化を有し、非常に異質であるように見える。実施例Ｉを参照。

以下の材料および方法は、実施例ＩＩの実施を容易にするために記載する。

自閉症遺伝情報源交換局（ＡＧＲＥ）
自閉症遺伝情報源交換局（ＡＧＲＥ；ワールド・ワイド・ウェブ上ａｇｒｅ．ｏｒｇ）は、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤｓ）を有する家族からのＤＮＡ試料および臨床情報を所有している（１）。本発明者らは、ＡＧＲＥコレクション（２００７年８月現在）からの９４３家族（４，４４４人）から得られたＤＮＡ試料の遺伝子型を同定した。これらのＡＧＲＥ家族は、９１７マルチプレックス家族、２４シンプレックス家族およびＡＳＤと診断されない２家族（分析では使用しない）を含んでいた。

ＡＧＲＥアノテーション・データベースは、自閉症診断面接改訂版（Ａｕｔｉｓｍ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｔｅｒｖｉｅｗ−Ｒｅｖｉｓｅｄ：ＡＤＩ−Ｒ）（２）に基づいて３つの診断区分：自閉症、広域（ＰＤＤ−ＮＯＳおよびアスペルガー症候群を含む広汎性発達障害の範囲に従った障害のパターン）または不完全（Ｎｏｔ Ｑｕｉｔｅ）自閉症（社会的、コミュニケーション、および／または行動領域のいずれかもしくは全てに関する自閉症基準を１点だけ満たさず、「発症年齢」の基準を満たす個体；または、全ての領域に関して基準を満たすが、「発症年齢」の基準を満たさない個体）に分類される。本発明者らの分析において、「自閉症」を有するＡＧＲＥ患者（ｎ＝１，６８４）、「広域」（ｎ＝１７１）または「不完全自閉症」（ｎ＝７９）表現型アノテーションを、単一のＡＳＤ群として処理した。これらのうち、１１人の被験者は、自閉症診断観察スケジュール（Ａｕｔｉｓｍ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ｓｃｈｅｄｕｌｅ：ＡＤＯＳ）（３）により、ＡＤＩ−Ｒ（自閉症診断面接改訂版）を用いないで自閉症と診断された。

異なる診断区分のＡＳＤ被験者についての発症年齢および評価年齢を下記表に記載した。Ｒａｖｅｎｓ推定非言語ＩＱスコアは、ＡＧＲＥ個体のサブセットについて入手可能であり：中央値は、マルチプレックス家族（７０８人のＡＳＤ被験者）においては１００、シンプレックス家族（４９人のＡＳＤ被験者）においては９８である。マルチプレックス家族中３８７人のＡＳＤ被験者およびシンプレックス家族中２８人のＡＤＳ被験者は、低機能もしくは行動のいずれかのためにＲａｖｅｎｓに関して試験できない（ＡＧＲＥアノテーション・データベースにおいて「Ｒａｖｅｎｓ試験不可」としてアノテートする）。

これらのＡＧＲＥ個体についての自己申告の人種／民族情報を以下に記載する。しかし、本発明者らの関連分析において、本発明者らは、遺伝子型データに関して多次元スケーリングを使用し、ヨーロッパ系の全被験者を同定するために厳密な基準を適用し、本発明者らは、関連性試験から他の家系の被験者を除外した（下記の詳細なＱＣ手順を参照）。

自閉症ケースコントロール（Ａｕｔｉｓｍ Ｃａｓｅ−Ｃｏｎｔｒｏｌ：ＡＣＣ）コホートにおけるＡＳＤおよび対照被験者
ＡＣＣコホート内のＡＳＤ被験者は、全米、ならびにＣＨＯＰの複数の共同プロジェクトからの研究者によってもたらされ、この場合、全ての試料は遺伝子型が同定されていた。ケースコントロール分析に用いた全てのＡＳＤ被験者は、ＡＤＯＳ（自閉症診断観察スケジュール）、ＡＤＩ（自閉症診断面接）またはＡＤＩ−Ｒ（自閉症診断面接改訂版）診断ツールを用いて診断した。共同研究者によって提供された「最良の診断」を用いて、遺伝子型同定のためにＡＳＤ被験者を選択し、これはＡＤＩとＡＤＯＳとの両方に基づく複合基準である。遺伝子型同定されなかった被験者、データベースにおいて遺伝子型データがない被験者（チップ不良のため）、表現型アノテーションのない被験者、および診断データを紛失した被験者（「最良の診断」を「ＭＩＳＳＩＮＧ」として設定する）を除外した後、本発明者らには、陽性ＡＤＩ／ＡＤＩ−Ｒ、ＡＤＯＳのいずれかまたは両者の研究基準を満たす１，４５３試料が残った。

研究被験者の平均年齢は、１０．３±６．６才であり、ＡＤＩ診断の平均年齢は、８．４±４．７才であり、ＡＤＯＳ診断の平均年齢は９．９±７．２才であり、ＩＱテストの平均年齢は１０．９±６．７才である。１，２４１人のヨーロッパ系被験者のみを研究で使用した（下記ＱＣの項を参照）。被験者の大部分（８３．１％）は男性であった。ほとんど全て（９４．５％）のＤＮＡ試料は全血から抽出し、他は細胞系由来であった。

ＩＱ分布は、公知である場合、以下に記載する。

ディスカバリー期で用いる対照群は、７，０７７人の自己申告で白色人種家系の児童を含んでいた（平均年齢は８．８±５．４ＳＤ才；５２．０８％の男性、４７．６５％の女性、そして０．２７％不明であった）。全対照被験者はＡＳＤｓの病歴がなく、診断検査に付されるべき症状を示さなかった。ＣＨＯＰ対照は、４カ所のプライマリー・ケア診療所ならびにいくつかのグループ診療および健康児童診察も含む外来患者診療所を含むＣＨＯＰヘルス・ケア・ネットワーク内のＣＨＯＰ臨床医の指揮下で、ＣＨＯＰ看護および医療助手職員によって集められた。全ＤＮＡ試料を全血から抽出した。これらの対照被験者は全て自己申告で白色人種であったが、本発明者らは、これらの被験者を患者と併せて組み合わせ、多次元スケーリングを使用して、本発明者らの品質管理的手順の間、ヨーロッパ系の被験者の同種集団と見なした（下記ＱＣの項を参照）。

ディスカバリーコホート用遺伝子型同定プラットフォーム
ＡＧＲＥコホートおよびＡＣＣコホートにおける個体を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｕｍａｎＨａｐ５５０ＳＮＰ遺伝子型同定アレイを利用して、遺伝子型を同定し、このアレイは、ヒトゲノム全体にわたるハプロタイプ多様性をとらえるために、ＨａｐＭａｐ Ｐｈａｓｅ ＩおよびＰｈａｓｅ ＩＩデータに基づいて選択される、５５０，０００片より多いＳＮＰｓを含む。本発明者らの研究において使用したいくつかのコホートのうち、ＡＧＲＥからの試料を、エプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）で形質転換されたリンパ芽球様細胞系から抽出したＤＮＡを用いて遺伝子型を同定し、一方、他のコホート中のほぼ全ての被験者（ＡＳＤ患者と対照被験者との両方）は、全血から抽出したＤＮＡを用いて遺伝子型を同定した。

ＡＧＲＥ家族およびＡＣＣ被験者の遺伝子型同定実験をＣｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｃｈｉｌｄｒｅｎ'ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａで実施した。ほとんどのＡＧＲＥ試料（ｎ＝４，１６３）は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｕｍａｎＨａｐ５５０バージョン３アレイで遺伝子型を同定したが、小サブセットのＡＧＲＥ試料（ｎ＝２９１）は、バージョン１アレイによって遺伝子型を同定した。バージョン１アレイとバージョン３アレイとの間の唯一の違いは、アレイの新バージョン中の約１０ＫのＳＮＰマーカーがＩｌｌｕｍｉｎａで置換されていることである。

ＡＧＲＥデータセットについての品質管理（ＱＣ）概要
ＡＧＲＥデータセット（常染色体マーカー）の品質管理（ＱＣ）手順の概要を以下の図で示す。さらに詳細なＱＣ手順を以下で記載する。

ＰＤＴソフトウェアを性染色体に関して使用できないので、本発明者らは、別の分析で染色体Ｘマーカーに関してＸ−ＡＰＬを適用し、ＱＣ手順を項で記載する。エラー！参照元が見つかりません。

ＡＧＲＥコホートにおける関連分析での被験者選択についての品質管理
その後の関連分析のために、厳しい品質管理（ＱＣ）基準を遺伝子型が同定されたＡＧＲＥ被験者に対して適用した。ＱＣの様々な態様を以下で詳細に記載する。

低遺伝子型コール率
コール率は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＢｅａｄＳｔｕｄｉｏソフトウェアに実装されたデフォルト遺伝子型同定呼び出しアルゴリズムを用いて、「ノーコール（Ｎｏ Ｃａｌｌ）」遺伝子型数に基づいて計算する。個体あたりのコール率を、ＰＬＩＮＫソフトウェアによって評価した（４）。合計２４試料は、遺伝子型同定の最初のバッチでは低コール率のために２回遺伝子型を同定した。あわせると、ＡＧＲＥデータセット中４７の独自の個体は、低コール率のために分析から除外した。

メンデルエラー
ファミリーデータの利用可能性のために、本発明者らは、家系情報が公知のＡＧＲＥ試料間の家族関係をチェックできた。過剰のメンデルエラーを有する試料は、潜在的な父系問題、試料の誤標識、または遺伝子型同定実験中の試料取り扱いの問題を示す可能性があり、下流の関連分析から除外しなければならない。

この分析は、子孫に関して実施した。すなわち、メンデルエラーが存在する場合はいつでも、子孫はメンデルエラーのカウントを獲得し、一方、親はそのようなカウントを獲得しない。大核家族中の１人の子孫が（たとえば、この個体についての試料誤標識が原因の）メンデル問題を有する場合、この手順は、この子孫だけを確実に排除し、一方、他の子孫および親は依然として分析に含まれる。個体あたりのメンデルエラー率をＰＬＩＮＫソフトウェア（４）によって評価した。合計７９試料（子孫として）は、親遺伝子型データに関してメンデル不一致を有する>２％のマーカーを有していた人と同定され、本発明者らの関連性試験から除外した。

一卵性双生児
ＡＧＲＥコレクション中、７０家族が一卵性（ＭＺ）双生児を含む（三つ子および四つ子兄弟姉妹がいる家族を含む）。本発明者らは、分析から７４人を除去して、各家族中、１組だけのＭＺ双生児兄弟姉妹を分析に含める。

遺伝子型が一卵性双生児とアノテートされなかった人を複製する。

本発明者らは次に、遺伝子型重複（すなわち、ほぼ同じ遺伝子型を有する２人の被験者で、ＡＧＲＥアノテーションで一卵性双生児としてアノテートされなかった人であり、その一部は２つの異なる家族中に存在する場合もある）をチェックした。予想されるように、２つの異なる家族で２つの重複が存在する場合、彼らはメンデル不一致によって容易に検出することができ、通常、本発明者らはどの試料が間違った家族に誤表示されたかを推測できる。ＭＺ双生児と注記されなかった、重複個体の完全なリストを以下に記載し、これらの問題は手作業で調査し、解決した。

染色体２１トリソミー
ＰｅｎｎＣＮＶアルゴリズム（５）を用いて、本発明者らは、ＡＵ０７５３０７、ＡＵ１２２７３０３およびＡＵ０１５８０４を含む染色体２１トリソミーを有する３人の被験者を同定した。個体ＡＵ０１５８０４をＡＧＲＥ表現型データベースにおいて「非突発性自閉症」としてアノテートし、本発明者らの関連分析から除外した。

ヨーロッパ系の個体の推定
家族基準の研究設計は集団の階層化から保護するが、対立遺伝子の不均一性につながる可能性があり、真に関連するシグナルを隠す可能性がある。本発明者らは、本発明者らの全てのディスカバリーコホートおよび重複コホートにおける関連性シグナルについてヨーロッパ系の個体のみを調べることにした。

本発明者らは、ＰＬＩＮＫソフトウェア（Ｐｕｒｅｌｌら、上記）に実装されているマルチ・ディメンジョナル・スケーリング（Ｍｕｌｔｉ−Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｓｃａｌｉｎｇ：ＭＤＳ）を、ＡＧＲＥデータセットにおける集団構造を推定するために使用した。自己申告の家系をＭＤＳで推測される家系と比較することによって、ヨーロッパ系の遺伝的に推測される個体を同定することのＭＤＳの信頼性を確認した。主成分１が−１０より大きいこと、および主成分２が−２〜２の間であることによって定義されるように、これらの個体は、三角形の右側に集められる（データは不掲載）。前述の手順を用いて、合計３２３２人がヨーロッパ系であると推定される。

ＱＣに合格した被験者の最終人数
先の項のすべてで記載されたＱＣ基準を適用して、本発明者らは関連分析のために３１０１人を残した。

関連分析におけるＳＮＰｓ選択のための品質管理
ＨｕｍａｎＨａｐ５５０ｖ１およびｖ３アレイの重複
ＡＧＲＥコホートにおける小部分は、ＨｕｍａｎＨａｐ５５０ｖ１アレイによって遺伝子型が同定され（ｎ＝２９１）、他の者はｖ３アレイによって遺伝子型が同定されるので、本発明者らの分析は、ｖ１およびｖ３アレイによって共有されるマーカーのみを配慮する：ＨｕｍａｎＨａｐ５５０ｖ１アレイは５５５３５２マーカーを含み、一方、ｖ３アレイは、２つのアレイによって共有される５４５０８０マーカーを含む５６１４６６マーカーを含む。

ミトコンドリアおよび性染色体マーカー
本発明者らは、Ｘ、Ｙ、ＸＹおよびミトコンドリア染色体からマーカーを除外して、本発明者らの関連分析を常染色体マーカーに限定した。これによって、上記工程から５３１６８９マーカーが残った。

マーカーごとのノーコール率
９５％未満のコール率を有するマーカーを分析から除外した。コール率は、ＰＬＩＮＫソフトウェアによって計算した。合計６７２７のマーカーをこの工程において関連分析から除外した。

メンデルエラー
過剰のメンデルエラーを有するマーカー（>５％家族において）を分析から除外した。その理由は、これらが遺伝子型同定障害、ＳＮＰクラスタ化障害もしくは共通のコピー数多型領域内にＳＮＰｓの存在を示素可能性があるからである。ＰＬＩＮＫソフトウェアによって計算された個体ごとのメンデルエラー率に基づいて、合計４９２のマーカーはこの閾値を満たさず、除外しなければならない。

マイナー対立遺伝子頻度（Ｍｉｎｏｒ Ａｌｌｅｌｅ Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）（ヨーロッパ系の個体）
５％未満のマイナー対立遺伝子頻度（ＭＡＦ）を有するマーカーを本発明者らの分析から除外した。この手順は、ＱＣに合格し、本発明者らの関連分析で用いられるＡＧＲＥ個体に限定され、ＭＡＦは、ＡＧＲＥコレクションの創始者（親）に関してＰＬＩＮＫソフトウェアによって計算する。合計４９０７８マーカーをこの工程で関連分析から除外した。

ハーディーワインバーグ平衡（ヨーロッパ系の個体）
０．００１未満のハーディーワインバーグ平衡Ｐ値を有するマーカーを分析から除外した。その理由は、これらのマーカーが遺伝子型同定障害を有する可能性があるか、または共通のＣＮＶ領域中に位置するからである。この手順は、ＱＣに合格し、本発明者らの関連分析で用いられるＡＧＲＥ個体に限定され、ＭＡＦは、ＡＧＲＥコレクションの創始者（親）に関してＰＬＩＮＫソフトウェアによって計算する。合計３２５１マーカーをこの工程で関連分析から除外した。

ＱＣに合格したＳＮＰｓの最終数
ＳＮＰｓ選択のための上記ＱＣ手順の後、合計４７４０１９ＳＮＰｓを続く関連分析で使用した。ゲノムワイドで有意なＰ閾値（ボンフェローニ補正に基づく）は１．１×１０^−７と計算された。

ＡＣＣコホートの品質管理
ＡＣＣコホートについての品質管理手順は、ＡＧＲＥコホートに関して実施されたものとだいたい類似している。ここでは、ＡＣＣコホートに適用されたＱＣのいくつかの異なる態様を記載する。

集団階層化
本発明者らは、全被験者（患者と対照との両方を含む）間のゲノムワイドなＩＢＳ推定値を得るためにＰＬＩＮＫソフトウェアを適用し、次に集団異常値の目視検査のために多次元スケーリング（ＭＤＳ）プロットを作製した。集団遺伝分析のシグナル「増強」を促進するために、本発明者らは、１１２ＨａｐＭａｐ個体（以下でＣＥＵ、ＣＨＢ、ＪＰＴ、ＹＲＩと表示）をＭＤＳ分析に含めた。ヨーロッパ系の個体を、−０．０１を超える主成分１および０．０３未満の主成分２によって選択する（データは不掲載）。

ＡＣＣコホートについてのデータの質を一連のルーチン分析によってスクリーンした。各ＳＮＰｓが０．００１未満のＰ値、各ＳＮＰ遺伝子型収率９５％未満、またはマイナー対立遺伝子頻度５％未満でハーディーワンバーグ平衡から偏っているならば、さらなる分析から除外した。加えて、被験者は、彼らの遺伝子型収率が９５％未満である場合も除外した（２６人の被験者を除外）。これらの手順は、ＡＧＲＥデータセットにおいて適用したものと同じであった。

集団階層化に関する問題にさらに取り組むために、本発明者らはＥｉｇｅｎＳｔｒａｔソフトウェア（Ａ．Ｌ．Ｐｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ３８，９０４（２００６）も適用して、前記ＱＣ閾値に合格した患者および対照被験者に関する全関連性試験を再実施した。表９に記載したＳＮＰｓのＰ値は、全て１０倍以内の差であり、集団異常値の除去におけるＭＤＳ法の有効性にさらに関連する。したがって、本発明者らは、先に公開されたＧＷＡＳ研究にしたがい、未補正のＰ値を記載する。

曖昧な関連性および重複遺伝子型同定の検出および削除
本発明者らは、全患者および対照被験者間の全てのペアごとの比較についてゲノムワイドＩＢＳ推定値を計算した。本発明者らのデータセット中で曖昧な関連性および潜在的な重複遺伝子型同定を検出するために、本発明者らは、２工程手順を適用して、全個体間のペアごとのＩＢＤ推定値を計算した。まず、ＭＤＳを調査し、９５％を超えるコール率のヨーロッパ系と推定される個体を本発明者らのデータセット中にただ保管し；第２に、本発明者らは、ゲノムワイドＩＢＳ推定値を再計算し、ＰＬＩＮＫソフトウェアを用いてＩＢＤ推定値を再計算した。この２工程手順によって、集団間の対立遺伝子頻度の差がＩＢＤ推定における偏りに至らないことを確実にする。本発明者らは、曖昧な関連性を検出するために厳しい閾値を適用し、すなわち、ＩＢＤ>０．１５の被験者の任意の対を処理して、１人だけの被験者が最終関連性試験に残るようにした。

ＱＣに合格した被験者の最終人数
これらのＱＣ手順の結果、１，２０４の患者、６，４９１の対照、および４８０，５３０ＳＮＰｓをその後の関連分析で使用した。

関連性試験
家系不均衡試験（ＰＤＴ）
ＡＧＲＥコホートについての関連分析を、家系不均衡試験に関連するＰＤＴソフトウェアバージョン６によって実施する（Ｅ．Ｒ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｓ．Ａ．Ｍｏｎｋｓ，Ｌ．Ｌ．Ｗａｒｒｅｎ，Ｎ．Ｌ．Ｋａｐｌａｎ，Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ６７， １４６（２０００）；Ｅ．Ｒ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｍ．Ｐ．Ｂａｓｓ，Ｎ．Ｌ．Ｋａｐｌａｎ，Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ６８，１０６５（２００１）。カスタムスクリプトを使用して、標準的な遺伝子型データをＰＤＴソフトウェアによって読み取ることができるフォーマットに変換し、メンデルエラーを消去し（ＰＤＴはメンデルエラーを正しく取り扱うために使用可能でなかったため）、そして親の遺伝子型データをその遺伝子型情報が入手可能でない親の欠測データとして水増しした。すべてのデフォルトパラメータを関連分析で使用した。ＰＤＴは：（１）親遺伝子型と１もしくはそれ以上の罹患子孫との両方、または（２）不一致（一方が罹患し、一方は罹患していない）同胞対のいずれかを必要とする。他の家族は当該分析で使用しなかった。試験統計量は、Ｚスコアとして与えられ、Ｐ値はＺスコアに基づいて計算する。

家族に基づく関連性試験（ＦＢＡＴ）
ＰＤＴソフトウェアによって計算された関連性結果を照合するために、本発明者らはＦＢＡＴ（ファミリーに基づく関連性試験）ソフトウェアに関与する異なるアルゴリズムも適用した（Ｓ． Ｈｏｒｖａｔｈ，Ｘ．Ｘｕ，Ｎ．Ｍ．Ｌａｉｒｄ，Ｅｕｒ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ９，３０１（２００１）。ＰＤＴと同様に、ＦＢＡＴソフトウェアは、核家族情報と不一致同胞対情報とのどちらも関連性試験において使用できる。本発明者らは、ＦＢＡＴソフトウェアにおいて全てのデフォルトパラメータを（ＦＢＡＴは家族において検出されたメンデルエラーを自動的に消去する）、追加のモデル、２対立遺伝子試験とともに採用した。

ＦＢＡＴ仮定関連性
本発明者らは、関連性について試験する場合に、潜在的な連鎖を考慮することによって、異なるＦＢＡＴモデルも試験した。これらの結果は、デフォルトパラメータによって得られたものとおおむね一致する。

結果
本発明者らは、ＡＧＲＥコホートにおいてＡＳＤに対してゲノムワイドで有意な関連性（Ｐ<５×１０^−８）を観察しなかったが、最低のＰ値内に重要な関連性が含まれると仮定した。これらの関連性を同定するための能力を強化するために、米国の複数の箇所由来の１，４５３人のＡＳＤを有する被験者およびＣｈｉｌｄｒｅｎ'ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ由来のＡＳＤのない７，０７０人の対照被験者であって、同じプラットフォーム上で遺伝子型が同定された者を含む第２コホート（自閉症ケースコントロールコホート、またはＡＣＣコホート）を調べた。このコホート中のＡＳＤｓを有する被験者を、ＡＤＩおよびＡＤＯＳツールを使用して診断した。遺伝子型に対して完全な品質管理を行った後、関連性分析を、１，２４１人のＡＳＤを有する被験者およびヨーロッパ系と推定される６，４９１人の対照被験者に関して実施した（補充法）。本発明者らは、ＡＣＣコホートにおいてもＡＳＤに対するゲノムワイドで有意な関連性（Ｐ<５×１０^−８）を検出しなかった。したがって、本発明者らは、その後、推奨されるメタアナリシス法^２１を用いて、これら２つの独立したデータセットの複合解析を実施した。常染色体およびＸ染色体を調査すると、５ｐ１４．１に位置する１つのＳＮＰがゲノムワイドな有意性に達し（ｒｓ４３０７０５９、Ｐ＝３．４×１０^−８）、同じ座位での５つのさらなるＳＮＰｓは１×１０^−４より低いＰ値を有していた（表８および図１Ａ）。本発明者らは、ＡＣＣコホートにおいてＹ染色体上の１０マーカーについてさらに分析し、最も重要なＳＮＰは、ＵＳＰ９Ｙ（ユビキチン特異的プロテアーゼ９、Ｙ−結合）内に位置するｒｓ２０３２５９７である（Ｐ＝１．１×１０^−４）。表９を参照。さらに、本発明者らは、２つのディスカバリーコホートにおいて性染色体の擬似常染色体領域中の１５マーカーを分析したが、どのマーカーも関連性の証拠を示さなかった。表１０を参照。

ＡＳＤｓと関連するが、ＳＮＰ遺伝子型同定アレイによって取り込まれなかったさらなる変異体を同定するために、本発明者らは、常染色体上の全ゲノム帰属遺伝子型を用いてディスカバリーコホートを分析した（補充法を参照）。最も重要な関連性シグナルは依然として５ｐ１４．１領域中にあった（表１１および図１Ｂ、１Ｃ）；しかし、いくつかのさらなるゲノム遺伝子座、たとえば６ｐ１１．２（ＬＲＲＣ１内）、１３ｑ３３．３（ＭＹＯ１６付近）および１４ｑ２１．１（ＦＢＸＯ３３付近）は、示唆的関連性シグナルを有するＳＮＰｓを有する（表１２）。

５ｐ１４．１座位で本発明者らのゲノムワイド関連性結果を再現するために、本発明者らはＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｕｍａｎＨａｐ１Ｍ ＢｅａｄＣｈｉｐ上約１００万のマーカーを用いて遺伝子型が同定された４８７の自閉症家族からの被験者１，５３７人を含む、第３の独立して生成され、分析されるコホートにおいてこれらのマーカーについての関連性統計量を調べた（ＣＡＰコホート、表８）。前記ＳＮＰｓの全てについての前記関連性シグナルをこのコホートにおいて複製した（Ｐ値は０．０１〜２．８×１０^−５の範囲）。複製のさらなる証拠を求めて、本発明者らは、１０８人のＡＳＤ患者および５４０人の、ＨｕｍａｎＣＮＶ３７０アレイ、つまりコピー数分析のために非多型マーカーを追加されたＳＮＰ遺伝子型同定アレイ上で遺伝子型が同定された、遺伝的に一致した対照被験者の第４の独立したコホート（ＣＡＲＴコホート、表８）からの関連性統計量を調べた。ｒｓ７７０４９０９およびｒｓ１００３８１１３はこのアレイプラットフォーム中に存在しなかったので、本発明者らは帰属遺伝子型に関する関連性を分析した。遺伝子型が同定されたＳＮＰと帰属されたＳＮＰとの両方を、ＣＡＲＴコホートにおいて予想される方向で複製した（表８）。４つのデータセット全てに関するメタアナリシスは、６つのＳＮＰｓ全てがＡＳＤｓと関連し、合計Ｐ値は７．９×１０^−８〜２．１×１０^−１０の範囲であることを示す。合わせると、収束する証拠のスコアは、５ｐ１４．１上の共通の遺伝子変異体がＡＳＤに関する感受性を付与することを確証した。

遺伝子型が同定されたマーカーに加えて、全ゲノムインピューテーションは、ディスカバリーコホートの複合解析でＡＳＤｓとの示唆的関連性を有する複数の遺伝子座を同定した。下記表は、Ｐ値<１×１０^−５を有する遺伝子型が同定されたマーカーおよび帰属されたマーカーを記載する（５ｐ１４．１領域を除外する）。Ａ１およびＡ２は、それぞれ対立遺伝子１および対立遺伝子２を意味し、下記対立遺伝子頻度は、ＡＧＲＥ親もしくはＡＣＣ対照被験者における対立遺伝子１に基づいて計算する。

５ｐ１４．１領域のさらに綿密な調査によって、１×１０^−７より低いＰ値を有する、遺伝子型が同定されたＳＮＰｓおよび帰属ＳＮＰｓはすべて、約１００ｋｂ連鎖不均衡（ＬＤ）ブロック内にあることがわかり、このことは、これらのＳＮＰｓが同じ変異体を標識することを示唆する。図２および３を参照。ＬＤブロックは、ＣＤＨ１０（カドヘリン１０）とＣＤＨ９（カドヘリン９）との間の２．２Ｍｂ遺伝子間領域内に位置する（図１Ｂ、１Ｃ）。ＣＤＨ１０とＣＤＨ９とはどちらも、カドヘリンスーパーファミリー由来のタイプＩＩの古典的なカドヘリンをコードし、これらはカルシウム依存性細胞−細胞接着に関与する貫膜タンパク質である。２．２Ｍｂ遺伝子間領域内で、構造変異体を含む他の種類の変異体を探索するために、本発明者らは、シグナル強度データに関してＰｅｎｎＣＮＶソフトウェア^２２を使用し、前記領域内の５つのＣＮＶ座位を同定した（図４）。これらのＣＮＶｓはすべて本発明者らの研究において対照被験者中に存在し、５つのＣＮＶｓのうちの３つは、健常な個体をアノテートするゲノム変異体についてのデータベースにおいても報告され（図５）、このことは、前記領域における希少ＣＮＶｓは、ＡＳＤｓの原因変異体である可能性が低いことを示唆する。本発明者らは、次に、最も重要なＳＮＰｓを有する約１００ｋｂのＬＤブロックに焦点を置き、他の転写産物または機能的要素が前記ブロック内に位置するかどうかを決定した。ＵＣＳＣゲノム・ブラウザ・アノテーションを調べることによって、本発明者らは、ＬＤブロックと重複する、予測される遺伝子、予測される転写開始部位、スプライスされたヒトＥＳＴ配列、公知のミクロＲＮＡ遺伝子もしくは予測されるミクロＲＮＡ標的を同定しなかった（図６）。しかし、本発明者らは、ＬＤブロックが、全ヒトゲノム中、上位０．０２６％の最も保存された要素としてランク付けされる８４９ｂｐ要素を含む、複数の高度に保存されたゲノム要素を含むことに留意する（ＬＯＤスコア＝３，４８０、ＰｈａｓｔＣｏｎｓ^２３による、図１Ｂ）。大きな安定遺伝子デザートが典型的には、発現もしくは転写に関与する遺伝子の調節要素を含むという先の報告と一致して^２４、本発明者らは、これらの標識ＳＮＰｓが、ＣＤＨ１０もしくはＣＤＨ９のいずれかの発現および作用を調節する機能的変異体の関連性をとらえると仮定した。

ＣＤＨ１０およびＣＤＨ９は非神経組織において低レベルで発現されるので（図７および８）、本発明者らは、インサイチュハイブリダイゼーションによってヒト胎児脳におけるこれらのｍＲＮＡ分布を評価した（補充法）。ＣＤＨ９は均一に低レベルの発現を示したが、前頭皮質において濃縮の著しいパターンがＣＤＨ１０について観察された（図１Ｄ）。これらの結果は、ヒト胎児脳^２５において高レベルのＣＤＨ１０、および発生中のマウス脳^２６の前皮質板におけるＣＤＨ１０ｍＲＮＡの顕著な濃縮と一致した。本発明者らは、次に、遺伝子型が同定された被験者からの９３のヒト大脳皮質組織における遺伝子発現をプロファイルするＳＮＰＥｘｐｒｅｓｓデータベース^２７を調べたが、表８中のＳＮＰｓはどれも、ＣＤＨ９（ｒｓ４３０７０５９についてＰ＝０．９２）またはＣＤＨ１０（ｒｓ４３０７０５９についてＰ＝０．８６）のいずれかについての発現レベルと関連しなかった（図１Ｅ）。小さな試料サイズは微細な効果のサイズを検出するために十分な能力を有さない可能性があるが、前記原因変異体は、発生中の脳においてのみ遺伝子発現を調節するか、または前記原因変異体は、８ｑ２４上の遺伝子間領域において報告される変異体と同様に、様々な癌に関与する^{２８、２９}未同定の機能的要素を標的とすることも可能である。

最近の遺伝学研究は、希少ＡＳＤ患者で潜在的に破壊される、ＮＲＸＮ１（ニューレキシン １）^{３０、３１}、ＣＮＴＮＡＰ２（コンタクチン関連タンパク質様２）^{３２〜３４}およびＰＣＤＨ１０（プロトカドヘリン１０）^３５を含むいくつかの神経細胞接着遺伝子を同定した。カドヘリンは、発生中の脳における細胞接着およびシナプス複合性の生成に関与する貫膜タンパク質の大きな群である^３６。上記情報を考慮して、本発明者らは、いくつかの他のカドヘリン遺伝子が、合したディスカバリーコホートの上位１，０００の最も重要なＳＮＰｓによっても標識されたことに留意する（表１３）。加えて、ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＣＮＴＮＡＰ２、ＧＲＩＫ２、ＮＲＸＮ１およびＮＬＧＮ４Ｘを含むいくつかの顕著なＡＳＤ候補遺伝子座^１の周囲のＳＮＰｓも、関連性の示唆的証拠を示す（表１４）。細胞接着分子が、遺伝子ファミリーとして、ＡＳＤｓと関連するかどうかを調べるために、本発明者らは、２経路に基づく関連法を適用した（補充法）。まず、本発明者らは、ディスカバリーコホートにおける各遺伝子について、Ｓｉｍｅｓ補正されたＰ値の分布を調べ、２５の関連するカドヘリン遺伝子が、他の全ての遺伝子よりもＡＳＤｓとより有意な関連性を示し（Ｐ＝０．０２）、一方、２５のカドヘリン遺伝子を８のニューレキシンファミリー遺伝子（ＮＲＸＮ１〜ＮＲＸＮ３、ＣＮＴＮＡＰ１〜ＣＮＴＮＡＰ５）と組み合わせた場合に、より強力な濃縮シグナル（Ｐ＝０．００４）が得られたことを見いだした。第２に、本発明者らは、ケースコントロールデータセットに関してホルマール経路関連性方法を用いてＡＣＣコホートを分析した^３７。本発明者らは、カドヘリン遺伝子のセットがＡＳＤｓと関連し（置換Ｐ＝０．０２）、一方、複合カドヘリン／ニューレキシン遺伝子はさらに有意な関連性を示す（置換Ｐ＝０．００２）ことを確認した。したがって、本発明者らの経路分析は、神経細胞接着分子がまとめてＡＳＤｓの病因に関与する可能性があることを示唆する。

表１３
ディスカバリーコホートの複合解析で上位１０００の最も重要なＳＮＰのうち、カドヘリンおよびプロトカドヘリン内／付近の遺伝子型が同定されたＳＮＰｓ（ＣＤＨ９／ＣＤＨ１０以外）についての関連性結果。Ａ１およびＡ２は、それぞれ対立遺伝子１および対立遺伝子２を意味し、下記対立遺伝子頻度は、ＡＧＲＥ親もしくはＡＣＣ対象被験者における対立遺伝子１に基づいて計算する。

表１４
連鎖研究、細胞発生研究および候補遺伝子関連性研究ですでに関連づけられている顕著なＡＤＳ遺伝子座内もしくはその周囲の遺伝子型が同定されたＳＮＰｓについてのトップ関連性結果（Ｐ<０．０１）。８の「有望な」遺伝子および１８の「起こり得る」遺伝子を含む、潜在的なＡＳＤ遺伝子座のこのリストは、最近の総説からコンパイルした（１６）。

（ａ）常染色体上のＡＳＤ候補遺伝子座内もしくはその周りの重要なＳＮＰｓを以下にまとめる：

（ｂ）染色体Ｘ上のＡＳＤ候補遺伝子座内もしくはその周りの重要なＳＮＰｓを以下にまとめる：

結論として、ヨーロッパ系の１０，０００人を超える対象の合した試料において、本発明者らは、ＡＳＤに対する感受性と関連するＣＤＨ１０〜ＣＤＨ９の間の遺伝子間領域において、共通の遺伝的変異を特定した。ＣＤＨ１０およびＣＤＨ９の潜在的な役割に加えて、経路に基づく関連分析は、ＡＳＤに関する感受性の付与における他の神経細胞接着分子を支持する。ＡＳＤの遺伝的複雑性および拡大研究には非常に大きな患者コホートが必要であることを強調することとは別に、本発明者らの研究は、ＡＳＤの複雑な遺伝的構造を究明する多大な努力の一部として、共通の感受性対立遺伝子を同定するゲノムワイド関連法の適用に成功する。

実施例ＩＩＩ
自閉症およびＡＳＤの治療のために有効な治療薬を同定するためのスクリーニングアッセイ
本明細書の前記情報を、自閉症もしくは自閉症スペクトラム障害の発現に関して増大した感受性を診断するため、および治療的介入のために、患者に対して臨床的に適用することができる。本発明の好適な実施形態は、本明細書で記載する情報を患者に適用することを含む。マイクロアレイを含む診断用組成物、および方法は、自閉症もしくはＡＳＤの発現についての感受性を評価するために患者から得られた核酸において本明細書に記載する遺伝子発現を同定するために設計することができる。これは、患者が診療所に到着した後に行うことができ、患者から採血し、そして本明細書に記載した診断法を用いて、医師は実施例Ｉに記載するようにＣＮＶを検出することができるか、または実施例ＩＩに記載するように染色体５のＣＤＨ１０およびＣＤＨ９領域におけるＳＮＰを検出することができる。患者試料から得られる情報は、選択的に評価前に増幅することができ、自閉症またはＡＳＤを発現する感受性が増加もしくは低下した患者を診断するために用いられる。本発明の診断法を実施するためのキットも本発明で提供する。このようなキットは、本発明で提供される少なくとも１つのＳＮＰおよび前記患者試料を評価するために必要な試薬を含むマイクロアレイを含む。

自閉症／ＡＳＤに関与する遺伝子の同一性および患者結果は、どの変異体が存在するかを示し、ＡＳＤ発現の危険性が変わったものを同定する。本明細書において提供する情報によって、従来可能であったよりも疾患進行の早い時期に治療的介入が可能になる。本明細書において前述のように、ＣＨＤ１０およびＣＨＤ９は、この神経疾患の治療のために有効な新規治療薬開発の新規標的を提供する。

本発明のある好適な実施形態を記載し、具体例を示したが、本発明はかかる実施形態に限定されることを意図しない。以下の実施例に記載される本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく、様々な変更を加えることができる。

Claims (15)

1. 自閉症または自閉症スペクトラム障害を発現する傾向を検出する方法であって、前記方法は、標的ポリヌクレオチドにおいて欠失含有ＣＮＶを有する少なくとも１つの遺伝子変 化を検出する工程を含み、前記欠失含有ＣＮＶは、ｃｈｒ８：４３７６５５７０〜４３７ ７６５９５であり、前記遺伝子変化が存在する場合、前記患者は自閉症および／または自閉症スペクトラム障害を発現するリスクが高いものであり、前記少なくとも１つの遺伝子 変化は、ＮＣＢＩ Ｂｕｉｌｄ ３６に準拠したゲノム位置によって規定されるものである、方法。
2. 請求項１記載の方法において、この方法は、さらに、染色体８上のｒｓ８１８５７７１、染色体２上のｒｓ４９７１７２４、染色体３上のｒｓ１０５１０２２１、染色体３上のｒｓ１４４４０５６、染色体１０上のｒｓ１２４１１９７１、染色体６上のｒｓ１２２１４７８８、染色体２上のｒｓ２１６４８５０、および染色体１６上のｒｓ１７４６４２から成る群から選択される少なくとも１つの単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を検出する工程を含むものである、方法。
3. 請求項１または２記載の方法において、前記標的ポリヌクレオチドは検出前に増幅されるものである、方法。
4. 請求項１または２記載の方法において、前記ＣＮＶまたはＳＮＰの存在を検出する工程は、特異的ハイブリダイゼーションの検出、対立遺伝子サイズの測定、制限断片長多型解析、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション分析、単一塩基プライマー伸長反応、および増幅ポリヌクレオチドのシークエンシングから成る群から選択される工程を行うことにより、ポリヌクレオチド試料を分析し、前記ＣＮＶまたはＳＮＰの存在を決定する工程をさらに含むものである、方法。
5. 請求項１または２記載の方法において、前記標的ポリヌクレオチドはＤＮＡである、方法。
6. 請求項１または２記載の方法において、前記標的ポリヌクレオチドはリボ核酸（ＲＮＡ）である、方法。
7. 請求項１または２記載の方法において、前記少なくとも１つの遺伝子変化を有するポリ ヌクレオチドは、ヒト対象の単離された細胞から得られるものである、方法。
8. 請求項１記載の方法であって、さらに、ｃｈｒ２：５１１２０６４４〜５１１４７６０ ０、ｃｈｒ３：１９１５１９０〜１９１５９２２、ｃｈｒ３：４１９９７３１〜４２３６ ３０４、ｃｈｒ１０：８７９４１６６６〜８７９４９０２９、ｃｈｒ６：１６２５８４５ ７６〜１６２５８７００１、ｃｈｒ２：７８２６８１９９〜７８３１１２４９、およびｃ ｈｒ１６：４５８３４３２１〜４５８８７７４５から成る群から選択される欠失含有ＣＮ Ｖから選択される少なくとも１つの遺伝子変化を検出する工程を有する、方法。
9. 請求項１記載の方法であって、さらに、ｃｈｒ２：１３１１９６６７〜１３１６５８９ ８、ｃｈｒ１５：２２３９３８３３〜２２５３２３０９、ｃｈｒ１２：３１３００８４６ 〜３１３０２０８８、ｃｈｒ６：６９２９１８２１〜６９２９４０２８、ｃｈｒ３：２５ ４８１４８〜２５４８５３１、ｃｈｒ３：１７４７５４３７８〜１７４７７１９７５、ｃ ｈｒ４：１４４８４７４０２〜１４４８５４５７９、ｃｈｒ１：１４５６５８４６５〜１ ４５８０７３５８、ｃｈｒ２：２３７４８６３２８〜２３７４９７１０５、ｃｈｒ６：１ ６８０９１８６０〜１６８３３９１００、ｃｈｒ１９：２２４３１１８９〜２２４３１３ ９７、ｃｈｒ２２：１９３５１２６４〜１９３５８９４６、ｃｈｒ７：３２６６７０８７ 〜３２７７０７１３、ｃｈｒ２０：５５４２６９６１〜５５４３０８７４、ｃｈｒ１：１ ７４５００５５５〜１７４５４３６７５、ｃｈｒ８：５５０２１０４７〜５５０７０１３ ４、およびｃｈｒ３：１２２８２６１９０〜１２２８７０４７４から成る群から選択され る重複含有ＣＮＶから選択される少なくとも１つの遺伝子変化を検出する工程を有する、 方法。
10. 請求項１記載の方法であって、さらに、ＳＮＰ含有核酸を検出する工程を有し、前記Ｓ ＮＰ含有核酸は、染色体５上のｒｓ４３０７０５９、ｒｓ７７０４９０９、ｒｓ１２５１ ８１９４、ｒｓ４３２７５７２、ｒｓ１８９６７３１、およびｒｓ１００３８１１３から 選択される、方法。
11. 請求項１記載の方法であって、さらに、ＳＮＰ含有核酸を検出する工程を有し、前記Ｓ ＮＰ含有核酸は、染色体２上のｒｓ４３４６３５２、染色体１５上のｒｓ７４９７２３９ 、染色体１２上のｒｓ６１７３７２、染色体６上のｒｓ９３４２７１７、染色体３上のｒ ｓ１７０１５８１６、染色体３上のｒｓ９８６０９９２、染色体４上のｒｓ７６８１９１ ４、染色体１上のｒｓ１２４０８１７８、染色体２上のｒｓ１１０７１９４、染色体６上 のｒｓ９３４６６４９、染色体１９上のｒｓ１２３０３００、染色体１５上のｒｓ７４９ ７２３９、染色体２２上のｒｓ６７４４７８、染色体７上のｒｓ１３２２５１３２、染色 体２０上のｒｓ６０２５５５３、染色体１上のｒｓ１０７９８４５０、染色体８上のｒｓ １０４３５６３４、および染色体３上のｒｓ２０７０１８０から選択される、方法。
12. 請求項１〜７のいずれか１つに記載の方法における少なくとも１つの遺伝子変化の存在 を検出するためのプローブとしての、単離された自閉症関連ＣＮＶ含有核酸の使用であって、前記ＣＮＶは、ｃｈｒ８：４３７６５５７０〜４３７７６５９５の欠失を有し、前記 ＣＮＶは、ＮＣＢＩ Ｂｕｉｌｄ ３６に準拠したゲノム位置によって規定されるものである、使用。
13. 請求項１２記載の、単離された自閉症関連ＣＮＶ含有核酸の使用であって、さらに、ｃ ｈｒ２：５１１２０６４４〜５１１４７６００、ｃｈｒ３：１９１５１９０〜１９１５９ ２２、ｃｈｒ３：４１９９７３１〜４２３６３０４、ｃｈｒ１０：８７９４１６６６〜８ ７９４９０２９、ｃｈｒ６：１６２５８４５７６〜１６２５８７００１、ｃｈｒ２：７８ ２６８１９９〜７８３１１２４９、およびｃｈｒ１６：４５８３４３２１〜４５８８７７ ４５からなる群から選択される欠失、および／またはｃｈｒ２：１３１１９６６７〜１３１６５８９８、ｃｈｒ１５：２２３９３８３３〜２２５３２３０９、ｃｈｒ１２：３１３００８４６〜３１３０２０８８、ｃｈｒ６：６９２９１８２１〜６９２９４０２８、ｃｈｒ３：２５４８１４８〜２５４８５３１、ｃｈｒ３：１７４７５４３７８〜１７４７７１９７５、ｃｈｒ４：１４４８４７４０２〜１４４８５４５７９、ｃｈｒ１：１４５６５８４６５〜１４５８０７３５８、ｃｈｒ２：２３７４８６３２８〜２３７４９７１０５、ｃｈｒ６：１６８０９１８６０〜１６８３３９１００、ｃｈｒ１９：２２４３１１８９〜２２４３１３９７、ｃｈｒ２２：１９３５１２６４〜１９３５８９４６、ｃｈｒ７：３２６６７０８７〜３２７７０７１３、ｃｈｒ２０：５５４２６９６１〜５５４３０８７４、ｃｈｒ１：１７４５００５５５〜１７４５４３６７５、ｃｈｒ８：５５０２１０４７〜５５０７０１３４、およびｃｈｒ３：１２２８２６１９０〜１２２８７０４７４から成る群から選択される重複を有する、少なくとも１つの自閉症関連ＣＮＶ含有核酸を有する、使用。
14. 請求項１２記載の、単離された自閉症関連ＣＮＶ含有核酸の使用であって、さらに、少 なくとも１つの自閉症関連ＳＮＰ含有核酸を有し、前記ＳＮＰは、ｒｓ４３０７０５９、 ｒｓ７７０４９０９、ｒｓ１２５１８１９４、ｒｓ４３２７５７２、ｒｓ１８９６７３１ 、およびｒｓ１００３８１１３から選択される、使用。
15. 請求項１２〜１４のいずれか１つに記載の、単離された自閉症関連ＣＮＶ含有核酸の使 用において、前記自閉症関連ＣＮＶ含有核酸は、固体担体に固定されている、使用。

Images