KR20000062427A

KR20000062427A - 질병의 대규모 유전자형 식별방법 및 척수소뇌성 운동실조 타입 6의 진단방법

Info

Publication number: KR20000062427A
Application number: KR1019997006177A
Authority: KR
Inventors: 리쳉치
Original assignee: 와일러 제임스 에프.; 리서치 디벨럽먼트 파운데이션
Priority date: 1997-01-07
Filing date: 1998-01-07
Publication date: 2000-10-25
Also published as: JP4164128B2; KR100575381B1; US5853995A; NZ336483A; AU6015898A; AU735756B2; EP1015628A1; US20040023277A1; US7329487B2; CA2277583A1; DE69834127T2; EP1015628B1; WO1998044155A1; IL130825A; JP2001508311A; US6303307B1; ATE322555T1; CN1293203C; RU2195497C2; IL130825A0

Abstract

본 발명은 트리뉴클레오티드 반복 서열의 불안정성에 의해 유발되는 질병이 발전될 위험에 처해 있는 자를 선별하는 방법을 제공한다. 특정적으로, 본 발명은 개인의 α_1A칼슘 채널 유전자에서 트리뉴클레오티드 CAG 반복 서열의 길이를 측정함으로써 상염색체 우성 척수소뇌 운동 실조 타입 6의 발전 위험에 있는 자를 선별하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 대규모 유전자형을 식별함으로써 트리뉴클레오티드 반복 서열의 불안정성이 원인이 되어 질병을 유발하는 유전자를 동정하는 방법을 제공한다.

Description

질병의 대규모 유전자형 식별방법 및 척수소뇌성 운동실조 타입 6의 진단방법{Large scale genotyping of diseases and a diagnostic test for spinocerebellar ataxia type 6}

트리뉴클레오티드 CAG, CTG, CGG 또는 GAA를 포함하는 반복 서열의 연장은 여러 종류의 신경 질환을 유발하는 주요 원인인 것으로 밝혀져 있다¹. 이 중에서, CAG 반복 서열의 연장은 헌팅톤병², 척수연수 근위축증³, 척수소뇌성 운동실조 타입 1(SCA1)⁴, 척수소뇌성 운동실조 타입 2(SCA2)^5-7, 척수소뇌성 운동실조 타입 3/마샤도-조세프병(SCA3/MJD)⁸및 덴타토루브럴-팔리도루이시안(dentatorubral-pallidoluysian) 근위축증/호-리버 증후군⁹을 비롯한 퇴행성 신경 질환과 관련되어 있다. 이들 모든 질환은 중추 신경계 중에 존재하는 뉴런의 퇴행을 유도하는 진행성 질병이다. 각 유전자 중에 존재하는 CAG 반복 서열은 통상 반복 서열 40개를 초과하지 않으면서 개인마다 길이의 다형성을 나타낸다. 하지만, 질환자는 연장된 대립유전자에 36개 내지 121개의 반복 서열이 포함되어 있다¹⁰.

CAG 반복 서열의 연장은 CGG, CTG 및 GAA 연장에 의한 질병^11-14에서 종종 관찰되는 수백 또는 수천개의 반복 서열보다는 훨씬 적다. 연장된 CAG 대립유전자는 배선 조직 및 체조직 모두에서 다양한 불안정성을 나타낸다^15,16. CAG 반복 서열 크기의 세대간 변화는 특히 부계에서 유전되는 경우 추가 연장되는 경향이 많아, 분자 구조를 예상할 수 있다. 질병 중에서 나타나는 CAG 반복 배열은 관련 유전자의 암호 영역에 위치하고 단백질 생성물 중 폴리글루타민 트랙으로 해독된다¹⁷. 이러한 폴리글루타민 트랙의 연장는 각 질환에 나타나는 단백질 생성물의 우성 유전을 제공하는 기능 증가를 유도하는 것으로 추정된다. CAG 반복 연장에 의해 일어나는 질환의 특성은 비교적 균일하기 때문에, 임상 특성이 유사한 기타 다른 신경변성 질환도 CAG 반복 서열의 연장부가 있을 것으로 생각되었다. 실제로, 트로티어(Trottier)와 동료들은 SCA2 또는 척수소뇌성 운동 실조 타입 7(SCA7)에 걸린 환자의 조직에서 폴리글루타민 트랙에 대한 항체를 사용하여 비정상적으로 큰 단백질을 검출하였고, 이것은 SCA2 및 SCA7의 원인이 되는 돌연변이가 폴리글루타민 반복 트랙의 연장부¹⁸임을 암시한다고 주장하였다.

이와 같은 종래 기술은 유전자 질환을 대규모로 유전자형별할 수 있는 효과적인 수단 및 유전자 질환의 진단 시험법과 진단용 키트에 대해서는 개발된 바 없다. 따라서, 본 발명은 당해 기술 분야에 오랜 염원을 실현하기 위한 것이다.

발명의 요약

인간의 α_1A전압 의존적 칼슘 채널 서브유니트에서 다형성 CAG 반복 서열을 동정하였다. 이 CAG 반복 서열의 연장가 유전 진행성 운동실조의 원인일 수 있음을 입증하기 위하여 다수의 무관련 대조군과 운동 실조 환자의 유전자형별을 실시하였다. 후발 개시성 운동 실조가 있는 8명의 무관련 환자는 운동 실조가 없는 475명의 개체에서 나타나는 반복 서열의 수(4개 내지 16개)에 비해 반복 서열의 수가 보다 많은(21개 내지 27개) 대립유전자를 갖고 있었다. 질환이 있는 개체 군에서 나타나는 반복 서열 길이를 분석한 결과, 모든 환자에서 표현형과 함께 반복부가 분리된다는 것을 발견하였다. 인간의 α_1A칼슘 채널 서브유니트는 6가지 이소형태가 동정되었다. CAG 반복 서열은 오픈 리딩 프레임내에 존재하고 3가지 이소형태에서 글루타민을 암호하는 것으로 예상된다. 따라서, 인간의 α_1A칼슘 채널에 존재하는 작은 폴리글루타민 연장부는 새로운 부류의 상염색체 우성 척수소뇌성 운동 실조, SCA6의 원인일 가능성이 가장 크다.

본 발명의 제 1 목적은 1종 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 폴리머라제 사슬 반응으로 개체 유래의 시료에 존재하는 게놈 DNA 트리뉴클레오티드 반복 서열을 증폭시키는 단계; 증폭된 게놈 DNA 트리뉴클레오티드 반복 서열을 제한 효소로 분해하는 단계; 분해 증폭된 게놈 DNA 트리뉴클레오티드 반복 서열을 전기영동으로 분리하여 시료의 전기영동 패턴을 얻는 단계; 상기 시료 중에 존재하는 상기 증폭된 게놈 DNA 트리뉴클레오티드 반복 서열을 검출할 수 있는 프로브를 표지하는 단계; 분해 증폭된 게놈 DNA 트리뉴클레오티드 반복 서열의 시료를 상기 표지된 프로브의 제1 일정량과 하이브리드화 조건하에서 하이브리드화하여 상기 시료의 게놈 DNA 트리뉴클레오티드 반복 서열에 대한 시료의 하이브리드화 패턴을 형성시키는 단계; 질환이 없는 개체 유래의 대조용 게놈 DNA 트리뉴클레오티드 반복 서열을 폴리머라제 연쇄 반응으로 1종 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 증폭시키는 단계; 상기 대조용의 게놈 DNA 트리뉴클레오티드 반복 서열을 제한 효소로 분해하는 단계; 분해된 대조용의 게놈 DNA 트리뉴클레오티드 반복 서열을 전기영동으로 분리하여 대조용의 전기영동 패턴을 형성시키는 단계; 분해된 대조용의 게놈 DNA 트리뉴클레오티드 반복 서열을 상기 프로브의 제2 일정량과 하이브리드화 조건하에서 혼합하여 상기 게놈 DNA 트리뉴클레오티드 반복 서열에 대한 대조용의 하이브리드화 패턴을 형성시키는 단계; 상기 시료 게놈 DNA 트리뉴클레오티드 반복 서열에 대한 시료의 하이브리드화 패턴을 상기 대조용의 게놈 DNA 트리뉴클레오티드 반복 서열에 대한 대조용 하이브리드화 패턴과 비교하는 단계; 및 상기 시험 개체가 트리뉴클레오티드 반복 서열의 불안정성에 의해 유발되는 질환을 진행시킬 위험에 있는지를 측정하는 단계를 포함하고, 상기 시료의 게놈 DNA 트리뉴클레오티드 반복 서열이 상기 대조용의 게놈 DNA 트리뉴클레오티드 반복 서열보다 크다면 상기 개체는 트리뉴클레오티드 반복 서열의 불안정성에 의해 유발되는 질환을 진행시킬 위험에 있는 것이 특징인, 트리뉴클레오티드 반복 서열의 불안정성에 의해 유발되는 질환을 진행시킬 위험에 있는 개체를 선별하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 제 2 목적은 3중 염기 반복 서열이 있는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 라이브러리를 선별하는 단계; 상기 3중 염기 반복 서열을 가진 클론을 동정하는 단계; 동정된 클론을 서열 분석하여 상기 3중 염기 반복 서열에 인접한 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계; 상기 3중 염기 반복 서열에 인접한 뉴클레오티드의 서열에 상보적인 프라이머를 합성하는 단계; 질환자 또는 무질환자를 포함하는 다량의 개체 시료로부터 DNA를 분리하는 단계; 분리된 DNA를 상기 프라이머로 증폭시켜 증폭된 3중 염기 반복 영역을 형성시키는 단계; 상기 다량의 시료에서 각 개체의 상기 3중 염기 반복 영역에 존재하는 3중 염기 반복 서열의 수를 결정하는 단계; 3중 염기 반복 연장부가 질환자에서는 비교적 높은 빈도로 관찰되지만 무질환자에서는 전혀 나타나지 않거나 매우 적은 빈도로 관찰되는 지를 측정하는 단계를 포함하고, 이 때 상기 3중 염기 반복 연장부가 질환자에서는 비교적 높은 빈도로 관찰되지만 무질환자에서는 전혀 나타나지 않거나 매우 적은 빈도로 관찰된다면 질환 유발 대립형질이 트리뉴클레오티드 반복 서열의 불안정성 때문일 가능성이 있음을 나타내는 것이 특징인, 질환 유발 대립형질이 트리뉴클레오티드 반복 서열의 불안정성 때문인 유전자를 동정하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 양태, 특성 및 잇점은 이하 설명을 위해 기재하는 바람직한 양태의 상세한 설명을 통해 명백히 알 수 있을 것이다.

본 발명은 부분적으로 국방부의 승인을 통해 얻은 기금을 사용하여 이루어졌다. 따라서, 연방 정부는 본 발명의 권리를 일부 소유한다.

본 발명은 일반적으로 분자유전학 분야 및 유전자 질환의 진단 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 질병의 대규모 유전자형 식별방법 및 진단 시험방법과 이를 위한 키트에 관한 것이다.

전술한 본 발명의 특징, 잇점 및 목적을 달성하는 기술 구성이 상세하게 이해될 수 있도록 이하 첨부되는 도면에 예시한 특정 양태를 참조로 하여 보다 구체적으로 설명하겠다. 이 도면은 본 명세서의 일부를 구성한다. 하지만, 첨부 도면은 본 발명의 바람직한 양태를 설명한 것이지 권리 범위를 제한하기 위한 것이 아님을 주지하기 바란다.

도 1은 인간 α_1A전압 의존적 Ca²⁺채널의 이소형태를 도시한 것이다. 도 1A는 여러 이소형태 모두가 2종 이상의 각 cDNA 클론에서 관찰됨을 도시한 것이다. "빗금친 굵은 막대"는 94개 염기쌍 뉴클레오티드 변화를 나타낸 것이고, "빗금친 가는 막대"는 36 bp 결실부를 도시한 것이다. GGCAG 삽입 부위는 수직 막대로 나타내었고, 글루타민 트랙(폴리 Q)의 위치는 "중간 굵기의 빗금친 막대"로 도시하였다. 이와 같이 변화시 나타나는 아미노산 변화는 도 2에 도시하였다. GGCAG 삽입부를 가진 이소형태만이 연장된 오픈 리딩 프레임을 보유한다. 도 1B는 인간의 CA²⁺채널 이소형태 BI-1 및 BI-1(GGCAG)의 종결 코돈에 인접한 서열을 도시한 것이다. 상부 및 하부의 문자는 상기 서열에 의해 암호된 각 아미노산을 나타낸 것이다. 종결 코돈은 TAN 뉴클레오티드로 표시하였다. 뉴클레오티드 "N"은 어플라이드 바이오시스템의 염료 종결인자 서열분석 화학에 사용된 FS Taq 효소의 특징인, "A"피크 이후에 감소된 크기의 "G"피크를 나타내는 "G"뉴클레오티드이다. 이것은 역방향 가닥의 서열 분석을 통해 "G"뉴클레오티드가 확실함을 확인하였다. TAG의 상보 서열인 CTA에 밑줄을 그어 표시하였다.

도 2는 래빗(BI-1)과 인간의 a₁전압 의존적 Ca²⁺채널 간의 서열 비교를 도시한 것이다. 부분 인간 cDNA 서열은 가장 큰 추론 오픈 리딩 프레임을 나타내는 3.6 kb인 2개의 중복 클론의 조합체이다. 동일 아미노산은 "-"기호로 나타내고 정렬시의 갭은 "."으로 나타내었다. 인간과 래빗의 BI-1 cDNA는 이소형태에 따라 90 내지 94%의 아미노산 동일성을 공유하였다. 총길이 인간 α_1A전압 의존적 Ca²⁺채널은 결정되지 않았으나, 래빗 BI-1 서열내 아미노산 가닥은 참조군(GenBank의 OCCCBI-1)과 같이 넘버링하였다. 가정적으로 래빗 BI-1 이소형태(수탁번호 X57476)로 GGCAG 뉴클레오티드를 삽입하면 추론되는 펩티드 리딩 프레임은 237개의 아미노산으로 연장되면서 종결 코돈이 래빗과 인간에서 동일 위치에 나타났다. 이와 같이 추론된 리딩 프레임에서 인간과 래빗 cDNA 서열중 아미노산 2328 위치에서 개시되는 글루타민 반복 서열에 밑줄을 그어 표시하였다. 이러한 삽입부가 없는 경우, 래빗과 인간의 BI-1 이소형태 상의 리딩 프레임 종결부는 "*"로 표시된 아미노산 위치 2273에 존재하는 것으로 추론된다(이 도면에서는 2개의 정렬 갭으로 인해 2275에 기재됨). V1, V2 및 V3 변형체의 대응 이소형태마다 상이한 아미노산과 GGCAG 삽입부는 박스로 표시하였다. V3 이소형태는 폴리 A⁺트랙을 가진 절두형 3' 영역을 보유한다. 각 이소형태의 서열은 GenBank에 기탁하였다(수탁 번호 U79663, U79664, U79665, U79666, U79667 및 U79668).

도 3은 인간 α_1A전압 의존적 Ca²⁺채널 발현을 노던 분석한 것이다. 하이브리드화는 프로브로서 S-5 cDNA를 사용하여 실시하였다. 뇌 mRNA에는 이 프로브에 특이적인 스미어(smear) 패턴과 함께 독특한 8.5 kb 밴드가 존재하였다. 뇌의 mRNA에서 나타나는 스미어링은 각종 접목 형태 또는 일부 분해물과의 교차 하이브리드화를 반영하는 것이다.

도 4는 소뇌 운동 실조 군에 존재하는 CAG 반복 서열에 인접한 프라이머 S-5-F1 및 S-5-R1을 사용하여 만든 PCR 증폭된 생성물의 분석 결과를 도시한 것이다. 도 4A는 무증후성 군에는 존재하지 않으나 INSCA 동족 유래의 4명의 질환자(I.2, II.3, II.5 및 II.7)에 존재하는 27개 반복부를 가진 연장된 대립형질을 도시한 것이다. 도 4B는 MS2SCA 동족에 속하는 총 5명의 질환자(II.1, II.2, II.3, III.1 및 III.2) 중에서 22개 CAG 반복 서열이 존재한다는 것을 도시한 것이다. 도 4C는 MDSCA 동족 중에서 변이성 크기의 23 CAG 반복 서열의 대립형질이 임상적으로 운동 실조를 보유한 2명의 형제(II.1 및 II.3)와 여자 형제(II.2)에는 존재하지만 무증후성인 딸(II.1)에는 존재하지 않는다는 것을 도시한 것이다. 도 4D는 5회의 감수분열 과정에 의해 분리된 2명의 질환자(IV.1 및 III.7)가 자신의 큰 대립형질 상에 동일한 수의 22개 CAG 반복 서열을 공유하고 있는 SISCA군을 도시한 것이다. 이 대립형질을 계보를 통해 추적해보면 질환이 있는 후대(III.5, II.2, II.4 및 I.2)가 그 대립형질의 연장부를 보유할 가능성이 가장 크다는 것을 알 수 있다.

본 발명은 1종 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 폴리머라제 사슬 반응으로 시험될 개체 유래의 시료에 존재하는 게놈 DNA 트리뉴클레오티드 반복 서열을 증폭시키는 단계; 상기 시료 중에 존재하는 증폭된 게놈 DNA 트리뉴클레오티드 반복 서열을 검출할 수 있는 프로브를 표지화하는 단계; 증폭된 게놈 DNA 트리뉴클레오티드 반복 서열의 시료를 상기 표지된 프로브의 제1 일정량과 하이브리드화 조건하에서 혼합하여 상기 시료의 게놈 DNA 트리뉴클레오티드 반복 서열에 대한 시료의 하이브리드화 패턴을 형성시키는 단계; 질환이 없는 개체 유래의 대조용 게놈 DNA 트리뉴클레오티드 반복 서열을 폴리머라제 연쇄 반응으로 1종 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 증폭시키는 단계; 대조용의 게놈 DNA 트리뉴클레오티드 반복 서열을 상기 프로브의 제2 일정량과 하이브리드화 조건하에서 혼합하여 상기 게놈 DNA 트리뉴클레오티드 반복 서열에 대한 대조용의 하이브리드화 패턴을 형성시키는 단계; 상기 시료 게놈 DNA 트리뉴클레오티드 반복 서열에 대한 시료의 하이브리드화 패턴을 상기 대조용의 게놈 DNA 트리뉴클레오티드 반복 서열에 대한 대조용 하이브리드화 패턴과 비교하는 단계; 및 상기 시험 개체가 트리뉴클레오티드 반복 서열의 불안정성에 의해 유발되는 질환을 진행시킬 위험에 있는지를 측정하는 단계를 포함하고, 상기 시료의 게놈 DNA 트리뉴클레오티드 반복 서열이 상기 대조용의 게놈 DNA 트리뉴클레오티드 반복 서열보다 크다면 상기 개체는 트리뉴클레오티드 반복 서열의 불안정성에 의해 유발되는 질환을 진행시킬 위험에 있는 것이 특징인, 트리뉴클레오티드 반복 서열의 불안정성에 의해 유발되는 질환을 진행시킬 위험에 있는 개체를 선별하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 3중 염기 반복 서열이 있는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 라이브러리를 선별하는 단계; 상기 3중 염기 반복 서열을 가진 클론을 동정하는 단계; 동정된 클론을 서열 분석하여 상기 3중 염기 반복 서열에 인접한 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계; 상기 3중 염기 반복 서열에 인접한 뉴클레오티드의 서열에 상보적인 프라이머를 합성하는 단계; 질환자 또는 무질환자를 포함하는 다량의 개체 시료로부터 DNA를 분리하는 단계; 분리된 DNA를 상기 프라이머로 증폭시켜 증폭된 3중 염기 반복 영역을 형성시키는 단계; 상기 다량의 시료에서 각 개체의 상기 3중 염기 반복 영역에 존재하는 3중 염기 반복 서열의 수를 결정하는 단계; 3중 염기 반복 연장부가 질환자에서는 비교적 높은 빈도로 관찰되지만 무질환자에서는 전혀 나타나지 않거나 매우 적은 빈도로 관찰되는 지를 측정하는 단계를 포함하고, 이 때 상기 3중 염기 반복 연장부가 질환자에서는 비교적 높은 빈도로 관찰되지만 무질환자에서는 전혀 나타나지 않거나 매우 적은 빈도로 관찰된다면 질환 유발 대립형질이 트리뉴클레오티드 반복 서열의 불안정성 때문일 가능성이 있음을 나타내는 것이 특징인, 질환 유발 대립형질이 트리뉴클레오티드 반복 서열의 불안정성 때문인 유전자를 동정하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명에는 당해 기술 분야에 통상적인 분자 생물학, 미생물학 및 재조합 DNA 기법을 이용할 수 있다. 이 기법은 다음과 같은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예컨대, 문헌 Maniatis, Fritsch ＆ Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual(1982); "DNA Cloning: A Practical Approach", Volumes I and II(D.N.Glover ed. 1985); "Oligonucleotide Synthesis"(M.J.Gait ed: 1984); "Nucleic Acid Hybridization"[B.D.Hamas ＆ S.J.Higgins eds.(1985)]; "Transcription and Translation"[B.D. Hames ＆ S.J.Higgins eds(1984); "Animal Cell Culture"[R.I. Freshney, ed(1986)]; "Immobilized Cells and Enzymes"[IRL Press(1986)]; B.Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning"(1984).

따라서, 본 명세서에 사용된 용어의 정의는 다음과 같다.

"벡터"는 플라스미드, 파지 또는 코스미드와 같은 레플리콘으로, 부착되는 분절의 복제가 일어날 수 있도록 다른 DNA 분절이 부착될 수 있다. 이 벡터는 수용체 포유 동물에 대해 투여가 허용된다면 "약리학적 허용성"이라고 한다. 이와 같은 제제는 투여되는 양이 생리적으로 유의적이라면 "치료적 유효량"으로 투여된다고 한다. 이 제제이 존재가 수용체 포유 동물의 생리학을 변화시킨다면 생리적으로 유의적인 것이다. 예컨대, 레트로바이러스 감염 치료시, 감염 정도 또는 감염에 의한 생리적 손상을 감소시키는 화합물은 치료적으로 효과적이라고 간주한다.

"DNA 분자"는 1본쇄 또는 2본쇄 나선 형태인 데옥시리보뉴클레오티드(아데닌, 구아닌, 티민 또는 시토신)의 중합체 형태를 의미한다. 이 용어는 분자의 1차 및 2차 구조를 의미하는 것이며, 특정 3차 형태를 의미하는 것이 아니다. 따라서, 이 용어는 특히 선형 DNA 분자(예, 제한 단편), 바이러스, 플라스미드 및 염색체에서 발견되는 2본쇄 DNA를 포함한다. 본 명세서에서 구조를 논하는 경우, 통상의 관례를 따라서 DNA의 비전사 가닥(즉, mRNA에 상동성인 서열을 가진 가닥)을 따라 5'에서 3' 방향으로의 서열을 단지 제시하였다.

DNA "암호 서열"은 적당한 조절 서열의 조절하에 배치되었을 때 전사되고 생체내에서 폴리펩티드로 해독되는 2본쇄 DNA 서열이다. 암호 서열이 경계는 5' 말단(아미노 말단) 쪽에 있는 개시 코돈과 3' 말단(카르복실 말단) 쪽에 있는 해독 종결 코돈에 의해 결정된다. 암호 서열로는 원핵 서열, 진핵 mRNA 유래의 cDNA, 진핵(예, 포유 동물) DNA 유래의 게놈 DNA 서열 및 합성 DNA 서열을 포함할 수 있으나, 이것에 국한되는 것은 아니다. 폴리아데닐화 시그널과 전사 종결 서열은 보통 암호 서열의 3' 쪽에 위치한다.

본 명세서에서 사용된 본 발명의 프로브를 의미하는 "올리고뉴클레오티드"라는 용어는 2종 이상의 리보뉴클레오티드, 바람직하게는 3종 이상의 리보뉴클레오티드로 구성된 분자를 의미한다. 정확한 크기는 최종 기능 및 올리고뉴클레오티드의 용도에 따라 변화하는 많은 인자에 따라 달라진다.

본 명세서에 사용된 "프라이머"라는 용어는 정제된 제한 분해물과 같은 자연 발생적이거나 합성적으로 제조된 올리고뉴클레오티드를 의미하는 것으로서, 핵산 가닥에 상보적인 프라이머 연장 생성물의 합성이 유도되는 조건, 즉 DNA 폴리머라제와 같은 유도제와 뉴클레오티드 존재하에 적합한 온도와 pH에 배치하였을 때 합성 개시점으로서 작용할 수 있다. 프라이머는 1본쇄 또는 2본쇄일 수 있고, 유도제 존재하에 목적하는 연장 생성물의 합성을 개시하기에 충분히 길어야 한다. 프라이머의 정확한 길이는 온도, 프라이머원 및 사용된 방법을 비롯하여 많은 인자에 따라 달라진다. 예컨대, 진단 용도시에, 표적 서열의 복잡성에 따라 올리고뉴클레오티드 프라이머는 보통 15개 내지 25개 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 것이 일반적이고, 물론 이보다 적은 수의 뉴클레오티드도 포함할 수도 있다.

본 명세서에 사용된 "제한 엔도뉴클레아제"및 "제한 효소"는 특정 뉴클레오티드 서열이나 그 부근에서 2본쇄 DNA를 절단하는 박테리아 효소를 의미한다.

이와 같은 연구에 가장 일반적으로 사용되는 표지는 방사능활성 원소, 효소, 자외선에 노출시 형광성을 나타내는 화학물질 등이다. 형광성 물질은 다양한 종류가 알려져 있어, 표지로서 사용될 수 있다. 그 예로는, 플루오레세인, 로다민, 아우라민, 텍사스 레드, AMCA 블루 및 루시퍼 옐로우를 포함한다. 특히 검출 물질로는 염소 중에서 제조되고 이소티오시아네이트를 통해 플루오레세인에 접합된 항래빗 항체가 있다.

하기 실시예로 본 발명의 양태를 예시한다. 그러나, 이들 실시예가 본 발명을 한정하는 것으로 이해되어서는 아니된다.

실시예 1

S-5 cDNA의 분리

S-5 cDNA는, 방사능표지된 올리고뉴클레오티드 탐침 (GCT)₇으로 일차 인간뇌 cDNA 유전자군을 선별하여, 분리하였다. 인간뇌 cDNA는 클론텍(캐나다 팔로 알토 소재)에서 구입한 mRNA로 구버(Guber)와 호프만(Hoffman) 방법을 사용하여 올리고-d(T) 프라임화하였다. cDNA 유전자군은 NotⅠ 제한 효소를 사용하여 IZAPⅡ 벡터내로 클론시켜 제조하였다. 유전자군은 150 밀리미터의 루리아 브로스(Luria broth) 한천 평판 당 1000개의 균군락이 형성되도록 도말하였다. 전체 150,000개의 일차 클론을 스크린하였다. 방사능표지된 올리고뉴클레오티드 탐침 (GCT)₇과의 하이브리드화는 55℃에서 표준 하이브리드화 수용액을 사용하여 수행하였다⁴⁵. 필터를 55℃ 온도, 2 X SSC 및 0.1% SDS에서 매회 30분씩 3회 세척하였다. 하이브리드된 클론을 플라스미드 추출을 위하여 정제하였다. 플라스미드 DNA를 오토겐 740 기기를 사용하여 분리하고, ABI-373A 시퀀서의 ABI 키트 프로토콜을 사용하여 염기서열을 정하였다. cDNA의 염기서열 분석은 삼중 반복 서열의 존재 유무를 확인하는 것으로 실시되었다. S-5 cDNA는 이와같은 방법을 통하여 수득된 387개의 서로다른 재조합 cDNA들중 하나이다. α_1A칼슘 채널의 부가적인 클론을 탐침으로서 S-5 cDNA를 사용하여 분리하였다. 언급한 인간 뇌 cDNA 유전자군 이외에도, EcoRⅠ 클로닝 부위를 함유한 태아의 뇌 cDNA 유전자군(캐나다 라 졸라 소재의 스트라진)을 스크린하고, 유전자군으로부터 동정된 클론을 사용하여 NotⅠ 부위에서 폴리(A)부위까지의 3＇영역을 작제하였다.

실시예 2

PCR 분석

α_1A칼슘 채널에서 CAG 길이 다형성의 정도는 하기의 프라이머로 결정하였다:

S-5-F1 (5＇-CACGTGTCCTATTCCCCTGTGATCC-3＇)(서열번호 1) 및 S-5-R1 (5＇-TGGGTACCTCCGAGGGCCGCTGGTG-3＇)(서열번호 2). 그러나 이 목적을 위해 α_1A칼슘 채널 유전자의 염기서열이 기초가된 어떠한 적절한 프라이머도 사용할 수 있다. 각 반응에서 각각의 프라이머 5 피코몰을, 0.05 유니트의 폴리뉴클레오티드 키나아제를 사용하여, 1 mCi의 [γ-³²P]ATP로 30분 동안 말단표지시켰다. 각 PCR 분석에는 0.25 유니트의 Taq 폴리머아제, 125 마이크로몰의 dNTP, pH 8.9인 10 밀리몰의 Tris, 2.5 밀리몰의 염화마그네슘, 30 밀리몰의 염화칼륨 및 3.5%(v/v)의 글리세롤이 포함된 25 ml 전체 용적에 5 피코몰의 방사능표지된 S-5-R1 및 S-5-F1 프라이머와 혼합된 20 나노그램의 게놈 DNA가 포함되었다. 시료를 95℃에서 3분 동안 변성시킨 후, 94℃에서 25초 동안의 변성과정, 68℃에서 30초 동안 어닐링 및 72℃에서 2분 동안의 연장을 1 주기로 하여 28회 반복하였다. 15 ml의 포름아마이드 로딩 염료를 반응물에 첨가시킨 후, 혼합물을 95℃에서 20분 동안 변성시켰다. 혼합물 7 ml를 6% 폴리아크릴아마이드/8몰 우레아겔을 통해 전기영동시켰다. M13 시퀀싱 레더와의 상대적인 이동거리를 비교하여 대립유전자의 크기를 결정하였다. 사용된 대조군 DNA는 CEPH류에 속하는 65개 시료를 포함하고; 분자 및 인간 유전학과에서 125개의 서로다른 대조군을 제공하였으며; 160개의 시료는 당뇨병 환자에게서 수득하였고; 41개는 산발성 유방암 환자에게서 수득하였고; 42개는 파킨슨 환자에게서 수득하였고; 24개의 디스토니아 환자시료 및 18개의 산발성 알츠하이머 환자 시료를 추가로 수득하였다.

실시예 3

노던 (Northern) 분석

클론텍으로부터 다중인간조직의 폴리A⁺RNA를 함유하고 있는 노던 블럿을 구입하였다. 200 나노그램의 S-5 cDNA 삽입서열은 파마시아에서 구입한 무작위 표지키트를 사용하여 [α-³²P]dCTP로 방사능표지시켰다. 탐침은 클론텍의 지침에 따라 65℃ 온도에서 하루밤 동안 하이브리드화시켰다. 필터는 0.1 X SSC 및 0.1% SDS에서 각각 68℃에서 30분 동안 3회 세척한 후, X-선 필름에 노출시켰다. 0.5 X SSC 및 0.1% SDS에서 68℃ 온도로 약하게 세척을하면 다른 조직 보다 많은 밴드가 검출되며, 이는 기타 칼슘 채널 유전자와의 교차 반응이 있음을 제시한다.

실시예 4

가교 분석

유전형질 데이타에 대한 검사결과는 CAG 반복 횟수의 증가와 운동실조 형질간의 상관성이 분명히 있음을 나타낸다. 133명의 운동실조 환자중 8명은 20보다 긴 길이의 반복구간을 갖고 있으며, 반면 대조군의 경우 16이상의 반복 길이를 갖는다. 이와 같은 상관성은 2×2 표를 사용하여 운동실조 시료 대 대조군내의 연장 유무를 비교하여 통계적으로 측정하였다. 결과의 경중은 피셔의 이그젝트 시험법을 사용하여 결정하였다.

연장과 질병이 동시에 전이된다는 것을 증명하기 위하여 반수체형 분석을 사용하였다. 표현형질(운동실조) 및 다형성(연장)을 모두 갖고 있는 단일 유전자위 상황을 모델링화하기 위하여, 완전하게 결합되고 완전한 가교 비평형 상태인 하나의 질병 유전자위 및 하나의 다형성으로 이루어진 두개의 유전자위를 사용하였다. 반수체형의 발생빈도를 몇종류의 우성유전성 운동실조병을 앓고 있는 133명의 환자 시료를 조사를 통하여 계산하였다. 그러므로 각 경우에 대하여 돌연변이를 유발하는 하나의 질병이 있어야 한다. 이들 돌연변이중 8개(약 6%)는 CAG 반복 연장에 의해 유발되고; 기타 94%는 이 유전자의 비연장 돌연변이 또는 이외의 유전자 돌연변이에 의하여 유발된다. 반수체형의 발생빈도를 계산하는데 필요한 추가적인 정보로는 미지의 유전자위에 존재하는 우성 운동실조 군집의 빈도이다. 이 발생빈도의 평가가 높을수록 로드 스코어가 낮아진다. 500개중 1개의 보존수는 1000개중 1개의 유전자 발생빈도를 분석하는 본 분석에 사용된다. 4개의 반수체형 발생빈도는 다음과 같다: 0.999(운동실조 및 연장이 모두 없음), 0.0(운동실조는 없고 연장만 발생됨), 0.00094(운동실조는 발생되고 연장은 없음) 및 (운동실조와 연장이 모두 발생됨). 이와같은 반수체형 발생빈도는 패스트링크 3.0p 버전 프로그램을 사용하여 4개의 운동실조류의 로드 스코어를 계산하는데 사용한다. 모든 환자들에 대한 질병 상태 및 유전형질을 검사하였고, 건강하고 유전형질이 밝혀지지 않은 개인들은 미지의 질병 상태 및 미지의 유전형질로 분류되었다.

CAG 반복 연장에 의해 유발되는 질병을 동정하기 위하여 다형성 CAG 반복과 만개시신경변성병을 갖고 있는 환자의 DNA 시료를 사용하여 대규모의 유전형질 조사를 수행하였다. 본 발명은 인간의 것과 유사한 토끼의 α_1A전압의존 칼슘 채널 BI-A 유전자가 상염색체 우성 소뇌 운동실조병으로 진단된 환자의 분획에 존재하는 연장된 다형성 CAG 반복 서열을 포함하고 있다는 것을 보고한다. 이 결과는 CAG 반복 연장이 인간의 α_1A전압의존 칼슘 채널 유전자가 하나의 소뇌 운동실조병을 유발한다는 것을 명백히 나타낸다.

실시예 5

인간 α_1A칼슘 채널 서브유니트에서의 CAG 반복

삼중뉴클레오티드 반복서열을 포함하는 유전자를 동정하기 위하여 비증폭된 인간뇌 cDNA 유전자군을 (GCT)₇반복 올리고뉴클레오티드를 탐침으로 사용하여 선별하였다. 387개의 cDNA로 동정된 스크린은 염기서열 분석을 기초로 각각 독립적인 것으로 결정되었다. 이 클론내의 반복 크기는 4에서 21까지의 범위이며, 이 스크린에서 덴타토루브럴-팔리돌루이시안 위축증/호-리버 및 마차도-조세프병 유전자에 해당하는 부분 cDNA 클론을 분리하였다. 이 스크린에서 SCA1, SCA2에 해당하는 cDNA 클론 및 헌팅턴병 유전자가 분리되지 않았으며, 이는 이들 각 유전자내의 CAG 반복이 대전사물의 5＇영역에 위치하고, 스크린된 cDNA 유전자군이 올리고-d(T) 프라이밍을 사용하여 발생된 주어진 3＇cDNA 말단에 치우쳐 있기 때문인 것같다.

세밀하게 조사된 첫번째 클론은 13개의 CAG 반복을 함유한 S-5로 명명된 cDNA이다. 1.2 kb cDNA의 추정 펩타이드 서열은 토끼의 α_1A전압의존 칼슘 채널(또한 P/Q형 칼슘 채널로 알려짐)의 BI-1 이소형과 약 90%의 아미노산 유사성을 갖고 있으며, 이는 S-5 클론이 인간의 것과 유사한 부분 cDNA라는 것을 제시한다. 또한 추정 인간 펩타이드 서열은 쥐의 뇌 α_1A칼슘 채널 서브유니트와 90% 유사성을 보인다. 토끼 BI-1 아미노산의 722-1036 위치에 해당하는 부분 인간 cDNA 서열은 토끼와 쥐의 α_1A칼슘 채널과 각각 92% 및 82%를 공유하고 있다는 보고가 이전에 발표되었다. 본 발명의 cDNA는 아미노산 위치에서 개시하는 토끼 단백질의 카르복시 말단 영역에 해당하는 코딩 서열을 포함한다. 아미노산서열의 데이타는 분리된 cDNA가 인간 α_1A칼슘 채널 서브유니트를 코딩하고 있다는 것을 의미한다.

코리엘에서 구입한 체세포 하이브리드 매핑패널 2번을 사용하여 인간 α_1A칼슘 채널을 서열 태그 위치(STS) 매핑을 통하여 인간 염색체 19번에 위치시켰다. 디리옹(Diriong)²²등은 부분 cDNA 클론을 사용하여 α_1A칼슘 채널 서브유니트를 인간 염색체 19p13에 매핑시키는 방법을 보고하였다. 이 유전자군의 유전자 심볼은 CACNL1A4²²로 명명하였다. CACNL1A4 유전자의 부분 cDNA(토끼 BI-I 뉴클레오티드 위치 6487-7165에 해당함)는 마골리스(Margolis)등²³에 의해 보고되었으며, 19번 염색체에 매핑한 것을 도시하였다. 인간 CACNL1A4 유전자의 전체 서열을 기술한 보고가 최근에 오포프(Ophoff)²⁴등에 의해 발표되었다.

토끼의 경우 두개의 α_1A칼슘 채널 서브유니트 이소형(BI-1 alc BI-2)이 밝혀졌다. 이들 이소형은 서로다른 카르복시 말단 서열을 갖고 있으며, BI-2의 경우 151개의 부가적인 아미노산이 존재한다. 이들 이소형은 423개 뉴클레오티드의 삽입-결실의 결과인 것으로 믿어진다. BI-1내에 423개의 뉴클레오티드가 존재하는 것은 보다 짧은길이의 2273개 아미노산 이소형을 유도시키는 중지 코돈을 도입시킨다. 쥐 뇌의 경우, 4개 이상의 스플라이스된 α_1A칼슘 채널 유전자 이소형이 관찰되었으나 하나의 이소형 염기서열만이 보고되었다.

토끼와 인간의 유전자 서열을 비교한 결과 CAG 반복이 보전적이며, 토끼 α_1A칼슘 채널 BI-1의 추정 3＇미번역 영역 및 S-5 cDNA에 존재한다는 것이 밝혀졌다. 토끼 BI-1 이소형의 3＇미번역 영역과 본 발명의 인간 S-5 클론 사이에 높은 유사성(700개 뉴클레오티드 상의 84% 유사성)이 있음을 발견한 것은 부가적인 스플라이스 변이체가 발생할 수 있으며, 몇몇은 CAG 반복이 유전자의 번역부위인 오픈 리딩 프레임을 포함할 가능성이 높아졌다. 이를 조사하기 위하여, 일차 인간 cDNA 유전자군 및 태아뇌 cDNA 유전자군을 S-5 cDNA를 탐침으로 사용하여 재선별을 실시하였다. 전체적으로 17개의 부가적인 클론이 분리되었으며, 이들 클론의 염기서열을 분석함으로써 여러 인간 α_1A칼슘 채널의 카르복실 영역내에 선택적으로 스플라이스된 이소형을 동정할 수 있었다(도 1A). 특히 이들 cDNA중 5개는 S-5 cDNA의 TAG 중지 코돈에 앞서 5개의 염기쌍(GGCAG) 삽입체를 포함한다. 이들 5개의 염기쌍 삽입체를 보유하고 있는 클론은 인간 유전자내에서 239개의 부가적인 아미노산의 추정 오픈 리딩 프레임을 연장한다. 이와 같이 이론적으로 5개의 염기쌍 서열이 토끼의 BI-1 칼슘 채널의 2273 아미노산 위치로 삽입되면 237개의 아미노산에 의해 추정 리딩 프레임을 연장하고, 인간 유전자 서열에 대한 아미노산 호몰로그는 매우 높은 보존성(80% 유사성)이 남아 있어 토끼의 이소형 존재가 논쟁대상이 된다(도 2). BI-1 (GGCAG) 이소형에서, CAG 반복서열은 인간 및 토끼의 α_1A칼슘 채널 유전자내의 2328 아미노산 위치에서 개시되는 폴리글루타민을 코딩한다.

또한, 인간 α_1A칼슘 채널 유전자의 부가적인 이소형을 이외의 클론에서도 관찰하였다. 클론된 인공물로부터 유발된 결과물이 없다는 것을 증명하기 위하여, 각 이소형에 대한 두개 이상의 독립적인 클론을 분리하였으며, 이들의 염기서열을 밝혔다. 전체적으로, 인간에게는 BI-1으로 명명된 토끼의 BI-1 이소형과 동일한 변형체를 포함하여 6개의 변형체가 관찰되었다. BI-1(V1)으로 명명된 변형체는 BI-1과 뉴클레오티드 수준에서는 다르지만, 아미노산 수준에서는 동질성을 갖는 94개의 염기쌍 서열을 갖고 있다. 또한, 이러한 변형체는 토끼에서도 기술되어 있다¹⁹. 본 연구에서 분리한 BI-1(V1) 이소형은 오포프(Ophoff)²⁴등에 의해 기술된대로 추정 펩티드 서열과 99.8%가 동일하다. 1460(알라닌에서 글리신), 1605(알라닌에서 발린), 및 1618(알라닌에서 발린) 위치의 아미노산을 포함하여 세개의 서로다른 변형체가 존재한다. 추정 염기서열내 이들 위치의 아미노산은 분석한 여러 클론과 일치하며 토끼와 쥐의 α_1A칼슘 채널 서브유니트의 추정 아미노산과 동일하다. BI-1 및 BI-1(V1) 이소형은 GGCAG 삽입체와 결합한 형태인것을 관찰하였다(각각 서열번호 3 및 서열번호 4). 부가적인 스플라이스 변형체는 36개의 뉴클레오티드 결실을 갖는 BI-1(V2)-GGCAG (서열번호 5) 및 절단된 3＇영역 BI-1-(V2, V3)를 갖는 변형체를 포함한다(도 1A). 동정된 클론은 비변형 시그먼트내의 동일한 양측면 서열을 갖고 이로인하여 클론된 인공물을 통제할 수 있는 이들 변형체들의 여러 조합들을 갖고 있다.

다중 이소형의 존재와 일치하여, S-5 cDNA를 이용하여 고하이브리드화 노던 분석을 수행한 결과 뇌에서 가장 큰 크기 mRNA 얼룩의 위와 아래를 겹치는 하나의 8.5 kb 밴드가 검출된다(도 3). 약한 하이브리드화 과정에서는 모든 조직에서 많은 수의 부가적인 밴드를 관찰하였으며, 이는 기타 칼슘 채널과 교차 하이브리드화한다는 것을 제시한다(데이타는 제시하지 않음). 이와 같은 크기가 1.2에서 3.1 kb까지인 인간 뇌 유전자군으로부터의 모든 클론들은 인간 α_1A칼슘 채널 서브유니트의 카르복실 영역만을 나타낸다. 하나의 인간 mRNA에서 추출된 성인뇌 cDNA내의 CAG 반복서열은 11개 또는 13개의 반복을 포함하며 이는 유사한 염색체 쌍으로부터 전사된 폴리몰픽 CAG 유전자를 나타냄을 제시한다.

실시예 6

연장된 CAG 반복에 대한 대규모의 유전형질 관찰

인간의 M13 시퀀싱 레더와의 상대적인 이동거리를 비교하여 서브유니트내 정상 길이의 다형성과 구별되는 특이한 길이의 CAG 반복 서열의 동정 가능성이 운동실조 환자에 대한 대규모 유전형질 관찰을 통하여 조사되었다. 이 기술은 만일 삼중뉴클레오티드 연장이 SCA6에 책임이 있을 경우, 질병을 가진 개인에 있어서는 연장이 상대적으로 높은 빈도로 관찰되지만 비병원성 유전자에게는 매우 낮은 빈도로 발생하거나 전혀 발생하지 않을 것이다라는 전제에 기초하고 있다.

일반적인 군락에서 475개의 서로다른 비운동실조 개인으로부터의 DNA 시료와 급진적인 소뇌 운동실조를 가진 알려진 서로다른 경우로부터의 133개 DNA 시료를 분석하였다. 인간의 α_1A칼슘 채널 서브유니트의 CAG 반복 서열을 양옆에 위치한 한쌍의 방사능 표지된 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 각 시료의 CAG 반복 영역을 확대하였으며, CAG 반복 영역의 크기는 겔전기영동을 통하여 결정하였다. 운동실조 그룹 시료 반복서열의 크기는 일반 군락 시료의 DNA로부터 수득된 그룹의 크기와 비교하였다.

표 1에서는 475개의 비운동실조 시료의 α_1A칼슘 채널 서브유니트 유전자에서 CAG 반복서열의 크기 분포 뿐만아니라 소뇌 운동실조를 갖고 있는 133명 환자의 α_1A칼슘 채널 서브유니트 유전자에서 CAG 반복 크기의 분포가 나타내고 있다. 대조군과 환자 군집의 인종적 배경은 코카시안, 아프리카 미국인, 히스페닉 및 아시안등을 포함한다. 일반적인 군집에 속하는 개인은 4에서 16 CAG 반복 유니트 범위의 10개 유전자와 71%의 이형접합성을 보인다. 소뇌 운동실조 환자의 경우, CAG 반복수는 74%의 이형접합성을 갖는 크기가 7에서 27까지의 범위를 갖는다. 유전자 크기 분포에서 나타난대로, 133개 운동실조 경우중 8명의 서로다른 환자(6%)들은 적아도 21 CAG 반복 유니트의 보다 큰 유전자를 갖는다. 비록 연장이 상대적으로 작을지라도 정상길이의 다형성과 궁극적으로 상이하게 만드는 비운동실조 대조군의 475명에서 관찰되지 않았다(피셔 이그젝트 시험을 사용하여 P〈10^-5를 관찰).

운동실조와 비-운동실조 염색체상의 CAG 반복 유니트 수의 비교

CAG 반복 유니트 수	염색체의 비-운동실조 대조군수	염색체의 운동실조 대조군 수
4	21	0
5	0	0
6	4	0
7	65	27
8	2	2
9	0	0
10	0	0
11	398	91
12	150	57
13	264	73
14	39	7
15	6	1
16	1	0
17	0	0
18	0	0
19	0	0
20	0	0
21	0	1
22	0	5
23	0	1
...	...	...
27	0	1

이 8개 경우로부터의 게놈 DNA를 S-5 프라이머로 증폭시키고, 서브클론시켜 염기서열을 밝힌다. 염기서열 분석을 통하여 수득된 CAG 반복 유니트 수는 α_1A칼슘 채널 서브유니트내 순수한 CAG 반복 유니트 수의 증가와 일치한다. 이렇게 연장된 유전자내의 CAG 반복 유니트의 서로다른 수는 희귀발견되는 유전자들에 대한 논쟁을 불러온다. 운동실조 군집에서 연장된 크기의 이상 유전자 및 일반 군집에서의 이 유전자의 부재에 대한 관찰은 이들 연장된 유전자가 분석한 운동실조 환자의 분획에서 돌연변이 기초를 나타내는 가능성과 일치한다.

대규모 유전형질 방법은 α_1A칼슘 채널 서브유니트 유전자에서 CAG 연장을 동정하는데 효과적이다. 그러므로, 이 개념을 삼중 반복 질병현상과 관련된 이외의 돌연변이형을 탐색하는데 사용할 수 있다. 기본적으로, 삼중뉴클레오티드 반복 연장이 질병 표현형질에서 높은 빈도를 나타내는 유전자와 관련되어 있지만, 비질병 표현형질에서의 낮은 빈도의 유전자 또는 이의 부재와는 관련이 없다. 그러므로 대규모 표현형질방법은 위치적 클로닝을 포함하여 이외의 인간 질병 유전자의 동정하는데 사용되는 방법과는 다르다. 위치적 클로닝 방법에서, 특정 염색체 영역에 대한 유전적 가교는 고려대상의 질병 유전의 분리에 앞서 설립하여야 한다. 위치적 클로닝은 헌팅톤병, 척수연수 근육 위축증, 척수소뇌 운동실조형 1, 척수소뇌 운동실조형 2, 척수소뇌 운동실조형 3/마차도-조셉병, 및 프레질 X 및 마이토닉 근육 위축병과 관련된 유전자의 동정에 사용하였다.

또한, 본 발명의 접근은 체계적인 유전자 동정 전략이 세워지지 않은 인간 질병에 대한 무작위적인 후보 유전자 접근과는 다르다. 무작위적 후보 유전자의 접근 방법은 덴타토루브럴-팔리돌루이시안 위축증/호-리버 증후군 유전자의 동정에 사용하였다. 본 발명의 전략은 질병 유전자내 삼중 반복 서열이 대규모 유전형질 조사에 적합한 길이의 다형성이라는 관찰에 기초하고 있다. 대규모 유전형질 접근은 비질병 군집과 비교하여 질병이 있는 개인에서 이상 크기를 갖는 유전자를 동정한다. 위의 전략에서 유도된 이 개념은 위치적 클로닝에서 첫번째 단계로 사용하고 있는 가계혈통내의 특정유전자연관(가교)의 앞선 설립을 위해 요구되는 것들을 부정한다. 본 발명의 대규모 유전형질 전략은 직접적인 유전자 대 질병상태의 접근방법이다.

본 발명의 또 다른 목적으로는, 하기와 같은 여러 단계를 포함하는 삼중뉴클레오티드 반복 서열의 불안정성에 기인하여 질병을 유발시키는 유전자가 함유된 유전자를 동정하는 방법을 제공하는 것이다: 삼중 염기 반복을 보유한 올리고뉴클레오티드를 이용한 유전자군의 선별; 전술한 삼중 염기 반복을 보유한 클론의 동정; 삼중 염기 반복을 양쪽에 위치한 뉴클레오티드 서열을 결정하기 위한 동정된 클론의 시퀀싱; 삼중 염기 반복을 양쪽에 위치한 뉴틀레오타이드와 상보적인 프라이머 합성; 질병 및 비질병 개인들을 포함한 개인들의 대규모 샘플링으로부터의 DNA 분리; 대규모 샘플링중 각 개인에 대한 삼중 염기 반복 영역에서의 삼중 염기 반복수 결정; 삼중 염기 반복 연장이 질병을 갖는 개인에서는 비교적 높은 빈도로 관찰되고, 질병이 없는 개인에서는 낮은 빈도로 또는 관찰되지 않는지에 대한 결정 등이다. 만일 삼중 염기 반복 연장이 질병을 가진 개인에게서 비교적 높은 빈도로 관찰되고 질병이 없는 개인에서는 낮은 빈도로 또는 관찰되지 않는다면, 질병 유발 유전자는 삼중뉴클레오티드 반복 서열의 불안정성에 기인할 것이다.

실시예 7

운동실조 환자에서 나타나는 연장된 대립형질의 유전

임상적으로 평가된 다른 질환 군에서 지표 4가지를 취하여, 유전자형별 분석을 위해 DNA를 얻었다. 동의하에 연구에 참여한 구성원 21명을 확보하였다. 21명 중 14명은 운동 실조인 것이 임상적으로 입증되었다. 이 군들에서 운동 실조는 각각 28세 내지 50세에 개시되면서 상염색체 우성 방식으로 유전되었다.

S-5 프라이머를 사용하여 상기 군의 유전자형별 분석을 실시한 결과, 연장된 대립 형질이 각 군에서 질환의 표현형에 따라 분리되는 것으로 확인되었다. 예컨대, 도 4A는 근연성이 먼 군(데이터는 도시하지 않음)을 비롯하여 무증후성 군에서는 관찰되지 않으나 INSCA 동족 유래의 4명의 질환자에서 관찰되는 27개 반복 서열을 가진 연장된 대립 형질을 도시한 것이다. 이 동족 중에서 관찰되는 개시 연령은 28세 내지 31세이었고, 무증후성 개체 중 3명의 개시 연령은 41세 이상이었다. 도 4B는 22개 반복 서열의 연장 대립 형질이 MS2SCA 동족에 속하는 5명의 감염자 모두에서 관찰된다는 것을 도시한 것이다. MDSCA 동족(도 4C) 중에서 임상적 운동 실조가 있는 2명의 형제(II.1 및 II.3)와 여자 형제(II.2)에서는 변이 크기의 23 CAG 반복 서열의 대립 형질이 관찰되었지만, 무증후성 딸인 II.1에서는 관찰되지 않았다. 도 4D에 도시된 SISCA 군에서는, 5회의 감수분열 과정에 의해 분리된 2명의 감염체(.1 및 III.7)가 보다 큰 대립 형질 상에 동수의 22개 CAG 반복 서열을 공유하는 것으로 나타났다. 계보를 통해 이 대립 형질을 추적해 본 결과, 감염된 후대(III.5, II.2, II.4 및 I.2)가 상기 연장된 대립 형질을 보유할 가능성이 가장 크다는 것을 알 수 있었다. 이 군 중에서 질환이 있는 연장된 대립 형질의 분리율은, FASTLINK 컴퓨터 프로그램(전술함)^{26, 27}버젼 3.0P를 사용하여 감염체의 유전자형 데이터를 분석하였을 때 재조합 빈도 0에서 5.08의 누적 반수체형 로드(lod) 값으로 알 수 있듯이 매우 유의적이었다. 각 동족의 로드 값은 표 2에 요약하였다. 종합해보면, 연장된 대립 형질이 475명의 비운동 실조 대조군에서는 관찰되지 않고 소뇌 운동 실조로 진단된 환자에서만 관찰된다는 통계적으로 유의적인 관찰과 이 연장 대립 형질과 질환의 명백한 연관성은 α_1A전압 의존적 Ca²⁺채널 서브유니트 중의 폴리글루타민 연장부가 후발 개시성이며 우성적으로 유전되는 운동 실조의 원인임을 입증하는 것이다.

반수체형 분석에 의한 로드(lod) 값

군	θ= 0 에서의 로드 값
INSCA	1.20
MDSCA	0.90
MS2SCA	1.49
SISCA	1.49
총	5.08

실시예 8

CAG 반복 서열 연장부를 보유한 환자에서 나타나는 임상 및 병리적 특징

전술한 군에 속하는 환자의 임상적 특징은 서로 매우 유사하며, 주로 진행 속도가 중간 내지 느린 사지 및 보행의 소뇌 운동 실조, 눌어증, 안진 및 중간 진동성 감각 상실과 고유수용 감각 상실으로 구성된다. 이 질환은 매우 잠행성이며, 대부분의 환자들은 초기에 느끼지 못하고, 갑작스럽게 회전하거나 신속하게 움직였을 때 순간 불균형과 "머리가 띵함"을 느낀다. 일반적으로, 이와 같은 초기 증상 후 환자가 영구적인 균형과 조정의 어려움을 느끼는 것은 수년이 지난 후이다. 이 질환은 보통 20년 내지 30년간 진행되어 보행 장애를 유도하고 환자가 휠체어에 의존하게 만든다. 몇몇 노인 중에서는 뇌간의 관련성을 암시하는 질식이 관찰되었고, MDSCA 및 MS2SCA 동족의 몇몇 구성원에서는 이 질환이 사망의 원인이었다. 일반적으로 증후는 반복 서열의 수가 22개 내지 23개인 MDSCA, SISCA 및 MS2SCA군에 속하는 환자가 40대가 되면 진행하지만, 연장 대립 형질이 27개의 반복 서열을 포함하는 INSCA 동족인 경우에는 질병 개시가 모든 질환자에서 28세 내지 31세에 이루어졌다. 질환자의 뇌를 자기공명영상화 기법으로 조사한 결과 분리된 소뇌 근위축이 관찰되었다. SISCA 동족 중 2명의 사망자에 대하여 세밀한 신경병리적 연구를 실시한 결과 소뇌 근수축은 현저하고 뇌간 근수축은 보통 정도인 것을 관찰하였다. 현미경 조사 결과 소뇌 푸르키니에 세포의 손실은 심각하였고 과립 세포 및 치상 핵 뉴런의 손실은 중간 정도이었으며, 하올리브에서의 신경 손실은 중간 내지 중간 이하이었다.

유전성 소뇌 운동 실조는 소뇌 및 이것의 구심성 및 원심성 연결체의 기능부전과 연관된 신경 질환의 임상적, 유전적 이종 군이다. 지금까지, 인간 염색체 6, 12, 14, 16, 11 및 3에 대해 6개의 상염색체 우성 척수소뇌 운동 실조(SCA)가 지도 작성되었고, 그 좌는 각각 SCA1, SCA2, SCA3, SCA4, SCA5 및 SCA7로 표시하였다. 우성 유전성이고 진행성인 운동 실조가 있는 다수의 군 중에서 이 유전자들의 위치는 알려져 있지 않다. 인간 염색체 19p13에 대한 α_1ACa²⁺채널 서브유니트의 지도화 및 4군 중의 돌연변이 기작에 의한 상기 채널내 CAG 반복 서열 연장부의 동정 결과, 인간 염색체 19p13에 SCA6으로 표시될 수 있는 새로운 SCA 좌를 발견하였다.

과거에 SCA6이라는 용어는 공지 유전자좌로 지도작성되지 않은^29,30우성 유전성 SCA를 나타내는 것이었다. 이 지도 명명법이 SCA6 유전자 좌를 염색체 19p13(HGM 명명 위원회)의 우성 유전성 운동 실조 지도에 지정하기 위해 개정하였다. 유전성 발작 소뇌 운동 실조(HPCA) 또는 우연적 운동 실조(EA) 역시 19p13 영역^31-32에 지도 작성되었다. 다른 우연적 질환인 가족성 편마비성 편두통(FHM)³³의 유전자좌도 HPCA/EA의 유전자가 지정된 영역에서 19p13에 위치하였다. HPCA 또는 EA가 있는 환자는 일반적으로 발작 사이 정상적인 공조가 뚜렷한 주기적 운동 실조를 나타낸다. 이것은 운동 실조가 영구적으로 관찰되기 수년 전에 환자가 느끼는 우연적 감각의 불규칙성이 기억된 것이다. HPCA/EA에 대한 신경학적 검사시 관찰되는 유일한 영구적 이상은 모든 환자에서 관찰되는 안진이다. 뇌 영상화 연구를 통해 일부 HPCA/EA 환자는 소뇌 근수축을 보유한 것으로 관찰되었다³¹. 흥미로운 사실은 여러 FHM 환자 부류 중에서, 질환자들은 HPCA/EA에서 관찰되는 것과 유사한 운동 실조, 안진 및 기타 전정 소뇌 안구 이상과 관련이 있는 변성 소뇌 근위축을 나타내었다. 이 두 질환의 표현형이 중복되는 것으로부터 HPCA/EA 및 FHM이 증후의 주기성 때문에 이온 채널 유전자의 돌연변이에 의해 유발될 가능성이 있는 대립 형질 질환이라는 가설을 얻을 수 있다.

최근, 오포프 등(Ophoff et al.)은 FHM 환자에서는 인간 α_1ACa²⁺채널 서브유니트 유전자에 4개의 미스센스 돌연변이가 존재하고, 2명의 EA 환자에서는 동일 유전자의 리딩 프레임을 붕괴시키는 2개의 돌연변이가 존재한다고 보고하였다²⁴. 이 결과와 본 발명은 FHM, HPCA/EA 및 진행성 SCA6이 대립형질 질환임을 증명한다. 돌연변이의 특성(SCA6에서 관찰되는 CAG 반복 서열 연장 대 HPCA/EA에서 관찰되는 단백질 절두)은 이 질환의 임상적 과정에 영향을 미친다. SCA6에서는 영구적이고 진행성인 소뇌 및 뇌간 이상이 관찰되는 반면 HPCA/EA에서는 약하거나 간헐적인 소뇌 이상이 관찰되었다. 이와 같은 사실은 글루타민 연장부가 진행성 신경 손상을 자극하는 방식으로 채널의 기능에 영향을 미친다는 것을 암시한다. 이것은 신경전달물질 방출의 변화를 통해 일어나거나, 세포 사멸을 유도하는 세포내 Ca²⁺의 농도를 변화시켜 일어날 수 있다^{21, 35}. 이 시점에서 주기적 신경 이상 대 영구적이며 진행성인 질환과 관련된 각 돌연변이의 병인성 효과를 측정할 수는 없으며, 돌연변이 마우스 모델과 신경생리학적 연구를 실시해야만 할 것이다. SCA6군에서 나타나는 CACNL1A4 유전자 중의 기타 다른 돌연변이는 배제하더라도, 8명의 각 운동 실조 군에서 나타나는 연장부와 질환 표현형(P〈10^-5)과 4군 중에 존재하는 연장 대립 형질 상의 여러 가지 반복체 수(세대간 불안정성 부재하에) 간의 고도로 유의적인 관련성은, 이것이 돌연변이 유발 질환이라는 것을 강력하게 지지하는 것이다. 또한, 오포프와 동료²⁴는 유전자형별된 50명의 정상 개체에서 어떤 연장 대립형질도 관찰하지 못하였다는 것은 중요한 점이다.

SCA6 중의 돌연변이 기작이 다른 우성적으로 유전되고 진행성인 운동 실조와 같이 해독된 CAG 반복체의 연장부를 포함하는 것으로 증명될지라도 병원성 기작이 유사한지는 명확하지 않다. SCA6 중의 돌연변이와 SCA1, SCA2, SCA3, HD, DRPLA 및 SBMA를 유발하는 돌연변이간에는 2가지 주요 차이가 있다. 첫번째는 SCA6 중의 연장된 돌연변이 대립 형질(21개 내지 27개 반복체)이 기타 다른 신경변성 질환에서 관찰되는 연장 대립 형질(36개 내지 121개 반복체) 보다 현저히 작고 많은 무질환자 중의 다른 유전자좌에서 관찰되는 폴리글루타민 트랙의 충분한 정상 범위 이내라는 점이다. 두 번째는 정상 푸르키니에 세포 기능과 생존에 중요한 것으로 알려진 유전자의 암호 영역에서 CAG 반복체 연장부가 나타난다는 점이다^19,25. 이것은 CAG 연장부가 α_1A칼슘 채널의 정상 기능을 직접 방해하여 병원성 효과를 발휘할 것이라는 가능성을 제기하는 것이다.

전압 의존적 칼슘 채널은 신경원 및 기타 자극성 세포 중으로 칼슘의 유입을 매개하고, 막 흥분성, 신경전달물질 방출 및 유전자 발현을 비롯한 다양한 신경원 기능에 중요한 역할을 한다³⁵. 칼슘 채널은 주로 기공 형성 a₁서브유닛에 의해 매개되는 채널 활성이 있는 다중서브유닛 복합체이지만, b, a₂/d 및 g를 비롯한 부가 서브유니트도 채널 활성을 조절하는 부속 단백질로서 작용한다^36-38. 6개의 a₁유전자를 암호하는 cDNA는 클로닝하여 α_1A,B,C,D,E및 S³⁹라고 표시하였다. 본 발명의 특징인 인간 유전자는 래빗과 래트의 α_1A이소형태와 상동성이 가장 크다^19,20. 인간 염색체 19의 지도상 위치는 염색체 19p13에 대한 α_1A이소형태를 암호하는 인간 서열의 종래 지도와 일치한다^22-24. 전기생리적 성질과 약리적 성질을 조합하면 포유 동물의 말초 및 중추 신경원에 존재하는 4가지 주요 형태의 고한계치 칼슘 채널이 얻어진다⁴⁰. 이것을 L, N, P 및 Q로 표시하였고, P형 채널은 푸르키니에 세포에 존재하는 주요 칼슘 채널이고, Q형 채널은 소뇌 과립 세포에 존재하는 주요 칼슘 채널이다^25,38. 클로닝된 α_1A이소형태는 P형 및/또는 Q형 칼슘 채널을 유도한다는 것이 밝혀진 바 있다^38,40. 동정된 또 다른 이소형태는 P/Q형 칼슘 채널에서 관찰되는 기능적 차이의 일부를 해명해준다. α_1A채널의 약리적 성질 뿐만 아니라 전기생리적 성질은 래트 소뇌에서 나타나는 풍부한 발현율과 함께 푸르키니에 세포 중의 항상성 및 칼슘 도입에 있어 중요성을 역설하는 것이다^25,41.

최근, α_1A전압 의존적 서브유니트 유전자의 마우스 동족체가 급발작과 소뇌 운동 실조를 보이는 불안정(tg) 마우스와 여윈(tg^la) 마우스 중에 존재하는 돌연변이된 유전자를 동정하는 것을 목적으로 하는 위치 클로닝 전략을 사용하여 동정하였다. 이 유전자좌는 인간 19p13과 신테닉한 영역내 마우스 염색체 8에 위치하였다. 위치 1802에서 C가 T로 변화한 tg 돌연변이는 제2 경막 도메인의 세포외 분절에 존재하는 보존적 기공 내부 도메인과 매우 근접한 위치에서 비보존적 프롤린을 로이신으로 치환시킨다. 이 돌연변이는 운동 실조, 운동형 발작 및 결여형 발작을 나타내는 열성 신경 질환을 유도한다.

tg^la돌연변이는 C 말단 세포내 도메인에 위치한 인트론의 5' 말단에 있는 접목 공여체의 콘센서스 서열 중의 단독 G가 A로 변화한 것이다. 이 돌연변이는 RT PCR에 의해 검출되는 2가지 이상 접목된 mRNA, 즉 인트론의 제거 접목시 실패로 얻어지는 보다 큰 단편과 1개의 엑손을 간과하여 생기는 보다 작은 단편을 생성한다. 이 두 전사체는 리딩 프레임을 이동시켜 이상 단백질을 생성하는 것으로 추정된다. 접목 돌연변이가 있는 동형접합성 tg^la마우스는 tg 마우스에 비해 보다 분명한 운동 실조와 소뇌 변성을 나타낸다.

α_1ACa²⁺채널 중의 돌연변이가 마우스 중 푸르키니에 세포 및 과립 세포 변성과 소뇌 운동 실조에 관련이 있다는 발견은 이 채널이 소뇌에서의 정상 푸르키니에 세포 및 과립 세포 기능에 중요하다는 가설을 지지하는 것이다. 이 돌연변이의 마우스 중 열성 성질과 tg^la돌연변이가 이상 단백질을 생성하는 것으로 예상된다는 사실은 이와 같은 돌연변이가 기능 기작의 상실을 통해 운동 실조 표현형을 나타낸다는 것을 암시하는 것이다. tg^la마우스 중의 돌연변이는 인간 유전자에 존재하는 추정상의 글루타민 트랙의 위치로부터 인접 상류에 있는 채널이 카르복시 말단부를 변화시킨다. 이 데이터는 인간 α_1ACa²⁺채널 이소형태 중의 적당한 글루타민 연장부가 소뇌 변성 및 운동 실조를 유도하는 기작에 대한 관심을 불러일으킨다. 이 질병의 우성 성질은 3가지 가능성을 제시한다. (1) 반수체부족에 의한 기능 상실, (2) 연장부에 의한 주요 음성 효과, 또는 (3) CAG 반복 연장부에 의해 유발되는 기타 질환에서 제시된 바와 같은 신규 기능 획득. 돌연변이가 이종접합된 tg 및 tg^la마우스에서는 운동 실조 표현형이 결실된다는 것은 기능 상실 가설에 반대되는 주장이다. 하지만, 마우스내 어떤 돌연변이가 α_1ACa²⁺채널 기능의 상실을 유도하고 이종접합성 마우스가 운동실조를 나타내지 않거나 푸르키니에 세포 변성을 나타내지 않는다는 것을 세밀한 정량적 방법으로 확인할 때까지는 상기 모델을 배제할 수는 없다. 일부 환자 중에서 일시적이며 약한 운동 실조의 성질이 관찰된다면 마우스에서 약한 간헐적 운동 실조 표현형을 확인하기는 매우 어렵다. 주요 음성 기작을 자극하는 모델은 인간 군 중의 유전성 패턴 및 tg 마우스에 대해 지금까지 입수용이한 데이터와 융화가능하다. 이 모델에서 글루타민 트랙의 작은 연장부는 시냅스 단백질에 대한 결과에 영향을 미치거나 활성을 조절하는 것으로 알려진 다른 부속 채널 단백질에 대한 결합을 방해하여 채널의 정상 기능을 저해할 수 있다. tg 마우스 중의 데이터와 전기생리적 데이터⁴³에 근거해 볼 때 α_1ACa²⁺채널이 정상 푸르키니에 세포 기능에 중요한 것으로 알려져 있는 바, 글루타민 연장부가 단백질에 신규 기능을 부여한다고 주장하기는 어렵다. 글루타민 연장부는 구성적 활성화의 가능성을 비롯하여 이상 채널 기능을 유도할 가능성이 가장 크다. 각종 모델의 최종 시험을 위해서는 α_1ACa²⁺채널 유전자가 결실된 마우스와 SCA6 질환 범위에서 CAG 연장부를 가진 대립형질을 발현하는 마우스를 기다려야 할 것이다.

SCA6에 있어 유전자형/표현형 상관성은 반복 크기가 22개 내지 23개 범위인 군(40세 내지 50세)에 비해 27개 반복부를 보유하는 군의 모든 군에서 개시 연령(28세 내지 31세)에 큰 차이를 제공하는 바 연장부가 매우 유해하다는 것을 암시한다. 이 때 시료 크기가 유전자형/표현형 상관관계에 대한 확고한 결론을 유도하기에 지나치게 작더라도, SCA6보다는 훨씬 약한 HPCA/EA에 걸린 일부 환자의 연장부가 훨씬 작은지를 관찰하기에는 바람직할 것이다. 또한, α_1ACa²⁺채널에 여러 돌연변이가 SCA6을 유도하는지를 측정하는 것도 중요한 것이다. SCA6 중의 CAG 반복 서열은 세대간 대립 형질 크기의 변화 또는 검출가능한 모자이크화 없이 안정적이다. 이것은 기타 다른 많은 유전자좌에서 유사한 크기의 CAG 반복 서열이 안정적인 방식으로 전달되는 것으로 관찰된다면 놀라운 것이 아니다. 하지만, 일반 군에서 반복 서열의 크기와 여러 SCA6 군에서 관찰되는 연장 대립 형질의 여러 크기는 이 유전자 좌에서 약간의 불안정성이 일어나고 이와 같은 불안정성이 질환 대립 형질 범위내의 돌연변이 연장부를 만든다는 것을 시사한다.

결론적으로, 본 발명은 푸르키니에 세포형 Ca²⁺채널의 인간 α_1A서브유니트에 존재하는 비교적 작은 폴리글루타민 연장부가 푸르키니에 세포 변성과 소뇌 운동 실조를 유도한다는 것을 입증한다. 이와 같은 발견의 직접적인 영향은 임상적이고 생물학적인 것이다. 비교적 작은 CAG 반복 연장부가 이상 단백질 기능을 유도할 수 있다는 관찰은 상기 반복체의 효과에 대한 새로운 개념과 가능한 병원성 효과에 대해 각각 주의깊은 평가 필요성을 불러일으킨다. 마지막으로, 인체 칼슘 채널에 존재하는 폴리글루타민 트랙의 연장부는 칼슘 항상성에 관련된 신경변성 기작과 다른 글루타민 매개의 신경 변성 과정에 대한 상기 기작의 가능한 역할에 관한 통찰력을 제공할 것이다.

다음과 같은 참조 문헌을 본 발명에 참고 인용하였다.

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45. Sambrook,J., Fritsch,E.F. ＆ Maniatis,T.(1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual.(Cold Spring Harbor, N.Y., 1989).

본 명세서에 기재된 모든 특허 또는 공보는 본 발명이 속하는 당해 기술 분야의 통상의 기술 수준을 나타내는 것이다. 이들 특허와 공보는 개개의 전체 내용이 본 명세서에 참고 인용된다.

당업자는 본 발명이 본 명세서에 기재된 고유의 것은 물론 기재된 목적을 실시하고 최종 결과와 잇점을 얻기 위하여 적절히 변형될 수 있음을 이해할 것이다. 본 명세서에 기재된 방법, 절차, 처리, 분자 및 특정 화합물과 함께 본 발명의 실시예는 예시적인 것이지 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해해서는 안된다. 다른 변형과 용도는 첨부되는 청구의 범위에 의해 제한되는 바와 같은 본 발명의 취지내에 포함되는 한 당업자에 의해 실시가능하다.

Claims

게놈 DNA 시료 중의 CAG 반복 서열을 증폭시키기 위하여 1종 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 표지화하는 단계;

표지된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응으로 대조용 게놈 DNA CAG 반복 서열을 증폭시켜, 증폭된 대조용 게놈 DNA 단편을 생성시키는 단계;

증폭된 시료 게놈 DNA 단편을 전기영동하여, 시료 전기영동 패턴을 형성시키는 단계;

대조용 게놈 DNA CAG 반복 서열을 상기 표지된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응으로 증폭시켜, 증폭된 대조용 게놈 DNA 단편을 형성시키는 단계;

증폭된 대조용 게놈 DNA 단편을 전기영동하여, 대조군의 전기영동 패턴을 형성시키는 단계;

상기 시료의 전기영동 패턴과 대조용의 전기영동 패턴을 비교하는 단계; 및

피검자가 CAG 반복 서열의 불안정성에 의해 유발되는 상염색체 우성 척수소뇌 운동 실조 타입 6을 진행시킬 위험에 있는지를 측정하는 단계를 포함하여, 트리뉴클레오티드 CAG 반복 서열의 불안정성에 의해 유발되는 상염색체 우성 척수소뇌 운동 실조 타입 6이 진행될 수 있는 위험에 있는 자를 선별하는 방법 {이 때, 상기 시료의 게놈 DNA 전기영동 패턴이 상기 대조군의 게놈 DNA 전기영동 패턴의 표지된 단편보다 더 큰 표지된 단편을 포함하는 경우, 상기 피검체는 트리뉴클레오티드 반복 서열의 불안정성에 의해 유발되는 상염색체 우성 척수소뇌 운동 실조 타입 6이 진행될 수 있는 위험성이 있을 수 있다}.
제1항에 있어서, 프라이머가 α_1A칼슘 채널 유전자의 서열을 기본으로 한 방법.
제2항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 프라이머가 5'-CACGTGTCCTATTCCCCTGTGATCC-3'(서열 번호 1) 및 5'-TGGGTACCTCCGAGGGCCGCTGGTG-3'(서열 번호 2)로 이루어진 그룹중에서 선택되는 방법.
3중 염기 반복 서열을 가진 방사능 또는 형광성 표지된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 유전자 라이브러리를 선별하는 단계;

올리고뉴클레오티드 프로브에 하이브리드화하는 클론을 동정하는 단계;

동정된 클론을 서열 분석하여 상기 3중 염기 반복 서열에 인접한 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계;

상기 3중 염기 반복 서열에 인접한 뉴클레오티드 서열에 상보적인 프라이머를 합성하는 단계;

질환자 및 비-질환자를 비롯한 대규모의 개체 시료로부터 DNA를 분리하는 단계;

분리된 DNA를 상기 프라이머로 증폭시켜, 증폭된 3중 염기 반복 서열 영역을 생성시키는 단계;

상기 대규모 시료 중의 각 개체의 3중 염기 반복 서열 영역에 존재하는 3중 염기 반복 서열의 수를 측정하는 단계; 및

3중 염기 반복 서열 연장부가 질환자에서는 상대적으로 높은 빈도로 관찰되지만 비-질환자에서는 전혀 나타나지 않거나 매우 적은 빈도로 관찰되는 지를 측정하는 단계를 포함하여, 트리뉴클레오티드 반복 서열의 불안정성에 기인하는 질환 유발 대립 형질을 동정하는 방법 {이 때, 상기 3중 염기 반복 연장부가 질환자에서는 비교적 높은 빈도로 관찰되나 비-질환자에서는 전혀 나타나지 않거나 매우 적은 빈도로 관찰되는 경우, 질환자는 트리뉴클레오티드 반복 서열의 불안정성에 기인하는 질환 유발 대립 형질을 가지고 있을 가능성이 크다}.
제4항에 있어서, 3중 염기 반복 서열이 CAG인 방법.
제4항에 있어서, 라이브러리가 cDNA 라이브러리인 방법.