JP5468218B2 - 皮膚老化改善・進行遅延効果の評価方法、物質のスクリーニング方法、並びに、マーカーとしての使用 - Google Patents
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Description
本発明は、皮膚老化改善・進行遅延効果の評価方法、並びに、物質のスクリーニング方法、等に関し、さらに詳細には、老化による皮膚症状を発症している動物又は皮膚老化の進行が加速された動物に被験物質を投与して、該動物の体液中におけるマーカー物質の濃度を指標し、被験物質が有する皮膚老化の改善効果又は進行遅延効果を評価する皮膚老化改善・進行遅延効果の評価方法、並びに、該評価方法を用いて皮膚老化の改善効果又は進行遅延効果を有する物質をスクリーニングする物質のスクリーニング方法、等に関する。
医療技術の進歩によって平均寿命が飛躍的に延びた現在、人々の関心は疾病の治療から予防へとシフトしつつある。特に、年齢を重ねても質の高い生活を維持できるように、加齢や老化の原因に対して早めに対処することを目的とした抗加齢医学（アンチエイジング）が、予防医学の代表例として注目を集めている。
加齢や老化によってもたらされる外観上の変化として、皮膚の変化が挙げられる。すなわち、年齢を重ねるにつれて皮膚にシワ、たるみ、水分量の低下等の老化による皮膚症状が生じるようになる。当該の皮膚症状を改善するための外用剤や経口剤が多数開発されており（例えば特許文献１）、ビタミンＣやビタミンＥといった抗酸化物質の皮膚老化改善効果も知られている。
また上述した予防医学の観点から、疾病等の将来の発症リスクを検出することができるようなバイオマーカー、すなわち「予防マーカー」あるいは「リスクマーカー」と呼ばれるマーカー物質の探索が盛んに行われている。老化による皮膚症状のリスクマーカーとしての皮膚老化マーカーがあれば、例えば、皮膚老化の進行度を判定することが可能となり、事前に適切な処置を行って皮膚老化の進行を遅延させることが可能となる。また、老化による皮膚症状のリスクマーカーを用いることで、被験物質が皮膚老化の進行を遅延させるような効果を有するかを容易に調べることも可能となり、食品素材や化粧品素材の機能性評価やスクリーニングにも有用である。そして、そのような評価・スクリーニング系で選抜された食品素材を含む食品を日常的に摂取したり、選抜された化粧品素材を含む化粧品を皮膚に塗布して体内に吸収させることで、皮膚老化の改善や進行遅延を容易に行うことが可能となる。特許文献２には、皮膚老化に対応して発現量が変化する遺伝子群の開示がある。
国際公開第２００７／１２５８３２号パンフレット
特開２００７−２５９８５１号公報
しかし、体液中に存在する皮膚老化マーカーは特定されておらず、老化による皮膚症状のリスクマーカーの存在も知られていない。本発明の目的は、老化による皮膚症状のリスクマーカーとなり得るマーカー物質を新たに特定し、該マーカー物質を用いて被験物質が有する皮膚老化の改善効果又は進行遅延効果を評価する方法等を提供することにある。
上記した課題を解決するための請求項１に記載の発明は、老化による皮膚症状を発症している動物又は皮膚老化の進行が加速された動物に被験物質を投与して、該動物の体液中における下記マーカー物質（Ｍ１）〜（Ｍ９）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、被験物質が有する皮膚老化の改善効果又は進行遅延効果を評価することを特徴とする皮膚老化改善・進行遅延効果の評価方法（但し、医療行為を除く。さらに、マーカー物質（Ｍ１）、（Ｍ２）、及び（Ｍ６）の濃度の測定方法は、質量／電荷比を指標とする方法に限る）である。
（Ｍ１）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４６２０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５７４０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ３）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６０３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ４）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２１４００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ５）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５９６００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ６）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４０２０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ７）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４３９０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ８）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７０３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ９）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２８０００のイオンピークを生じるタンパク質、であり、
さらに、
マーカー物質（Ｍ３）は配列番号９又は１０で表されるアミノ酸配列を含み、
マーカー物質（Ｍ４）は配列番号１３〜２６で表される少なくとも１つのアミノ酸配列を含み、
マーカー物質（Ｍ５）は配列番号４８〜５７で表される少なくとも１つのアミノ酸配列を含み、
マーカー物質（Ｍ７）は配列番号５８で表されるアミノ酸配列を含み、
マーカー物質（Ｍ８）は配列番号５９〜６１で表される少なくとも１つのアミノ酸配列を含み、
マーカー物質（Ｍ９）は配列番号２７〜４７で表される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む。
（Ｍ１）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４６２０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５７４０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ３）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６０３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ４）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２１４００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ５）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５９６００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ６）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４０２０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ７）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４３９０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ８）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７０３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ９）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２８０００のイオンピークを生じるタンパク質、であり、
さらに、
マーカー物質（Ｍ３）は配列番号９又は１０で表されるアミノ酸配列を含み、
マーカー物質（Ｍ４）は配列番号１３〜２６で表される少なくとも１つのアミノ酸配列を含み、
マーカー物質（Ｍ５）は配列番号４８〜５７で表される少なくとも１つのアミノ酸配列を含み、
マーカー物質（Ｍ７）は配列番号５８で表されるアミノ酸配列を含み、
マーカー物質（Ｍ８）は配列番号５９〜６１で表される少なくとも１つのアミノ酸配列を含み、
マーカー物質（Ｍ９）は配列番号２７〜４７で表される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む。
本発明の皮膚老化改善・進行遅延効果の評価方法は、老化による皮膚症状を発症している動物又は皮膚老化の進行が加速された動物に被験物質を投与して、該動物の体液中における上記（Ｍ１）〜（Ｍ９）の９種のマーカー物質の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、被験物質が有する皮膚老化の改善効果又は進行遅延効果を評価するものである。上記マーカー物質（Ｍ１）〜（Ｍ９）は、いずれも老化による皮膚症状の発症直前あるいは発症初期の段階にある動物の体液中で特異的に検出されるタンパク質であり、老化による皮膚症状の予防マーカー・リスクマーカーとして有用なものである。本発明の皮膚老化改善・進行遅延効果の評価方法によれば、被験物質が有する皮膚老化の改善効果又は進行遅延効果を、容易かつ高精度に評価することができる。なお、「動物」には、マウス等の飼育可能な動物の他、ヒトも含むものとする。
ここで、各マーカー物質における質量／電荷比（以下、「ｍ／ｚ」と略記することもある。）の「約４６２０」、「約２１４００」、「約５９６００」等の値は、質量分析における測定値の誤差範囲を考慮した値であり、概ね±０．２％の幅を有する。すなわち、約４６２０は概ね４６２０±０．２％、約２１４００は概ね２１４００±０．２％、約５９６００は概ね５９６００±０．２％を表す。他の質量／電荷比についても全く同様に、概ね±０．２％の幅を有する。また、これらのマーカー物質はいずれも主に血液中に存在するタンパク質である。被験物質が皮膚老化の改善効果又は進行遅延効果を有する場合、動物の体液中のマーカー物質（Ｍ５）、（Ｍ８）、及び（Ｍ９）の濃度はより低値を示し、マーカー物質（Ｍ１）、（Ｍ２）、（Ｍ３）、（Ｍ４）、（Ｍ６）、及び（Ｍ７）の濃度はより高値を示す。
請求項２に記載の発明は、老化による皮膚症状を発症している動物又は皮膚老化の進行が加速された動物に被験物質を投与して、該動物の体液中における下記マーカー物質（Ｍ１）〜（Ｍ９）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、被験物質が有する皮膚老化の改善効果又は進行遅延効果を評価することを特徴とする皮膚老化改善・進行遅延効果の評価方法（但し、医療行為を除く。さらに、マーカー物質（Ｍ１）、（Ｍ２）、及び（Ｍ６）の濃度の測定方法は、質量／電荷比を指標とする方法に限る）である。
（Ｍ１）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４６２０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５７４０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ３）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６０３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ４）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２１４００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ５）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５９６００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ６）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４０２０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ７）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４３９０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ８）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７０３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ９）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２８０００のイオンピークを生じるタンパク質、であり、
さらに、
マーカー物質（Ｍ３）は血清アルブミン又はその修飾体であり、
マーカー物質（Ｍ４）は血漿レチノール結合タンパク質又はその修飾体であり、
マーカー物質（Ｍ５）はヘモペキシン又はその修飾体であり、
マーカー物質（Ｍ７）はα１−アンチトリプシン１−２又はその修飾体であり、
マーカー物質（Ｍ８）はアポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体であり、
マーカー物質（Ｍ９）はアポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体である。
（Ｍ１）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４６２０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５７４０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ３）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６０３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ４）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２１４００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ５）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５９６００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ６）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４０２０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ７）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４３９０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ８）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７０３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ９）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２８０００のイオンピークを生じるタンパク質、であり、
さらに、
マーカー物質（Ｍ３）は血清アルブミン又はその修飾体であり、
マーカー物質（Ｍ４）は血漿レチノール結合タンパク質又はその修飾体であり、
マーカー物質（Ｍ５）はヘモペキシン又はその修飾体であり、
マーカー物質（Ｍ７）はα１−アンチトリプシン１−２又はその修飾体であり、
マーカー物質（Ｍ８）はアポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体であり、
マーカー物質（Ｍ９）はアポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体である。
血清アルブミン（serum albumin）、血漿レチノール結合タンパク質（plasma retinol-binding protein）、ヘモペキシン（hemopexin）、α１−アンチトリプシン１−２（alpha-1 antitrypsin 1-2）、アポリポタンパク質Ｃ１（apolipoprotein C1）、及びアポリポタンパク質Ａ１（apolipoprotein A1）はいずれも物理化学的性質がよく知られているので、本発明の皮膚老化改善・進行遅延効果の評価方法によればマーカー物質（Ｍ３）、（Ｍ４）、（Ｍ５）、（Ｍ７）、（Ｍ８）、（Ｍ９）の解析が容易である。
「タンパク質の修飾体」の代表例は、当該タンパク質を構成するアミノ酸残基の少なくとも１つが修飾されたタンパク質である。「修飾」には化合物や官能基の付加（例：リン酸化）のみならず、脱離（例：脱リン酸化）も含まれる。また「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質のアイソフォームが含まれる。さらに「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質の１次構造において数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたような実質的に同一のタンパク質が含まれる。またさらに、「タンパク質又はその修飾体」には、プロテアーゼによる切断を受けた当該タンパク質由来のタンパク質断片が含まれる。なお、複合体タンパク質の場合には「タンパク質又はその修飾体」にはそのサブユニットも含まれるものとする。
同様の課題を解決するための請求項３に記載の発明は、老化による皮膚症状を発症している動物又は皮膚老化の進行が加速された動物に被験物質を投与して、該動物の体液中における下記マーカー物質（Ａ１）〜（Ａ６）のいずれかに属する少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、被験物質が有する皮膚老化の改善効果又は進行遅延効果を評価することを特徴とする皮膚老化改善・進行遅延効果の評価方法（但し、医療行為を除く）である。
（Ａ１）血清アルブミン又はその修飾体、
（Ａ２）血漿レチノール結合タンパク質又はその修飾体、
（Ａ３）ヘモペキシン又はその修飾体、
（Ａ４）α１−アンチトリプシン１−２又はその修飾体、
（Ａ５）アポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体、
（Ａ６）アポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体。
（Ａ１）血清アルブミン又はその修飾体、
（Ａ２）血漿レチノール結合タンパク質又はその修飾体、
（Ａ３）ヘモペキシン又はその修飾体、
（Ａ４）α１−アンチトリプシン１−２又はその修飾体、
（Ａ５）アポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体、
（Ａ６）アポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体。
本発明の皮膚老化改善・進行遅延効果の評価方法は、老化による皮膚症状を発症している動物又は皮膚老化の進行が加速された動物に被験物質を投与して、該動物の体液中における上記（Ａ１）〜（Ａ６）のいずれかに属する少なくとも１つのマーカー物質の濃度を基準値と比較し、被験物質が有する皮膚老化の改善効果又は進行遅延効果を評価するものである。上記（Ａ１）〜（Ａ６）に属するマーカー物質は、いずれも老化による皮膚症状の発症直前あるいは発症初期の段階にある動物の体液中で特異的に検出されるタンパク質であり、老化による皮膚症状の予防マーカー・リスクマーカーとして有用なものである。本発明の皮膚老化改善・進行遅延効果の評価方法によれば、被験物質が有する皮膚老化の改善効果又は進行遅延効果を、容易かつ高精度に評価することができる。特に、血清アルブミン、血漿レチノール結合タンパク質、ヘモペキシン、α１−アンチトリプシン１−２、アポリポタンパク質Ｃ１、及びアポリポタンパク質Ａ１はいずれも物理化学的性質がよく知られているので、解析が容易である。なお本発明においても、「動物」には、マウス等の飼育可能な動物の他、ヒトも含むものとする。
本発明においても「タンパク質の修飾体」の代表例は、当該タンパク質を構成するアミノ酸残基の少なくとも１つが修飾されたタンパク質であり、「修飾」には化合物や官能基の付加のみならず、脱離も含まれる。また「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質のアイソフォーム、当該タンパク質の１次構造において数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたような実質的に同一のタンパク質、並びに、プロテアーゼによる切断を受けた当該タンパク質由来のタンパク質断片が含まれる。さらに、複合体タンパク質の場合には「タンパク質又はその修飾体」にはそのサブユニットも含まれるものとする。
請求項４に記載の発明は、前記基準値は、老化による皮膚症状を発症している動物又は皮膚老化の進行が加速された動物に、皮膚老化の改善効果又は進行遅延効果を有さない既知物質を投与した際の、該動物の体液中における前記マーカー物質の濃度であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の皮膚老化改善・進行遅延効果の評価方法である。
かかる構成により、被験物質が有する皮膚老化の改善効果又は進行遅延効果を、より容易かつ高精度に評価することができる。
請求項５に記載の発明は、前記老化による皮膚症状を発症している動物又は皮膚老化の進行が加速された動物は、紫外線照射下で飼育された無毛動物であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の皮膚老化改善・進行遅延効果の評価方法である。
本発明の皮膚老化改善・進行遅延効果の評価方法では、老化による皮膚症状を発症している動物又は皮膚老化の進行が加速された動物として、紫外線照射下で飼育された無毛動物を用いる。かかる構成により、老化による皮膚症状を発症している動物又は皮膚老化の進行が加速された動物を容易に設定することができ、被験物質が有する皮膚老化の改善効果又は進行遅延効果をきわめて容易に評価することができる。
前記被験物質を経口的又は経皮的に投与する構成が推奨される（請求項６）。
請求項７に記載の発明は、前記体液は、血液であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の皮膚老化改善・進行遅延効果の評価方法である。
かかる構成により、測定試料となる体液を簡単に採取でき、より簡便かつ迅速に、被験物質が有する皮膚老化の改善効果又は進行遅延効果を評価することができる。
請求項８に記載の発明は、前記被験物質は、食品素材、化粧品素材、又は医薬品素材であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の皮膚老化改善・進行遅延効果の評価方法である。
かかる構成により、機能性食品、化粧品、又は医薬品の開発を目的として、皮膚老化の改善効果又は進行遅延効果を評価することができる。
請求項９に記載の発明は、前記体液又は体液成分を、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体に接触させて、体液中の前記マーカー物質を担体上に捕捉し、捕捉された前記マーカー物質の量に基づいて体液中の前記マーカー物質の濃度を算出することを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の皮膚老化改善・進行遅延効果の評価方法である。
本発明の皮膚老化改善・進行遅延効果の評価方法においては、マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を使用する。そして、該担体に体液又は体液成分を接触させて、体液又は体液成分に含まれるマーカー物質を、マーカー物質に対する親和性を有する物質を介して担体上に捕捉し、捕捉されたマーカー物質の量に基づいて体液中のマーカー物質の濃度を算出する。本発明の皮膚老化改善・進行遅延効果の評価方法によれば、担体上に捕捉されたマーカー物質を測定対象とするので、測定試料中に含まれる夾雑物質の影響を低減させることができ、より高感度かつ高精度でマーカー物質の濃度を測定することができる。なお、体液成分の例としては、体液が血液である場合の血清又は血漿が挙げられる。
請求項１０に記載の発明は、前記担体は平面部分を有し、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、該平面部分の一部に固定化されていることを特徴とする請求項９に記載の皮膚老化改善・進行遅延効果の評価方法である。
本発明の皮膚老化改善・進行遅延効果の評価方法では、平面部分を有する担体を用い、マーカー物質に対する親和性を有する物質は該平面部分の一部に固定化されている。かかる構成により、マーカー物質に対する親和性を有する物質を、担体上の複数箇所にスポット的に固定化することができる。その結果、１個の担体で複数の測定試料を同時処理することや、１個の担体で複数のマーカー物質の濃度を同時測定することが可能となり、作業効率がよい。さらに、各スポットの面積を小さくすることにより、微量の測定試料からでもマーカー物質の濃度を測定することができる。なお、平面部分を有する担体の例としては、チップ等の基板が挙げられる。
請求項１１に記載の発明は、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体又は抗体であることを特徴とする請求項９又は１０に記載の皮膚老化改善・進行遅延効果の評価方法である。
本発明の皮膚老化改善・進行遅延効果の評価方法においては、マーカー物質に対する親和性を有する物質としてイオン交換体又は抗体を用い、イオン交換体又は抗体を介して測定試料中のマーカー物質を担体上に捕捉する。当該物質がイオン交換体の場合は各種のものが入手容易であり、マーカー物質を捕捉するための担体を容易に調製することができる。また、当該物質が抗体の場合は、より特異的にマーカー物質を捕捉することができる。捕捉されたマーカー物質の量を測定する方法としては、質量分析、イムノアッセイ（抗体の場合）が挙げられる。
請求項１２に記載の発明は、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の皮膚老化改善・進行遅延効果の評価方法によって被験物質を評価し、皮膚老化の改善効果又は進行遅延効果を有する物質をスクリーニングすることを特徴とする物質のスクリーニング方法である。
本発明は物質のスクリーニング方法にかかり、動物の体液中における上記（Ｍ１）〜（Ｍ９）の各マーカー物質および上記（Ａ１）〜（Ａ６）に属する各マーカー物質の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、皮膚老化の改善効果又は進行遅延効果を有する物質をスクリーニングするものである。上記（Ｍ１）〜（Ｍ９）の各マーカー物質および上記（Ａ１）〜（Ａ６）に属する各マーカー物質は、いずれも老化による皮膚症状の発症直前あるいは発症初期の段階にある動物の体液中で特異的に検出されるタンパク質であり、老化による皮膚症状の予防マーカー・リスクマーカーとして有用なものである。本発明の物質のスクリーニング方法によれば、皮膚老化の改善効果又は進行遅延効果を有する物質を、容易かつ高精度にスクリーニングすることができる。例えば、被験物質が食品素材の場合は、皮膚老化の改善効果を有する機能性食品又は進行遅延効果を有する機能性食品の開発に有用な食品素材をスクリーニングすることができる。
関連の発明は、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の皮膚老化改善・進行遅延効果の評価方法に用いるためのキットであって、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含むことを特徴とする皮膚老化改善・進行遅延効果の評価用キットである。
この皮膚老化改善・進行遅延効果の評価用キットは、マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含む。かかる構成により、マーカー物質の濃度測定に際して当該担体を別途用意する必要がなく、きわめて簡便にマーカー物質の濃度を測定することができる。
関連の発明は、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体であることを特徴とする上記の皮膚老化改善・進行遅延効果の評価用キットである。
かかる構成により、マーカー物質をより確実に担体上に捕捉することができる。
上記のキットにおいて、皮膚老化の改善効果又は進行遅延効果を有する物質をスクリーニングするために使用される構成が推奨される。
請求項１３に記載の発明は、動物の体内に存在する下記（Ｍ１）〜（Ｍ９）の少なくとも１つのタンパク質の、皮膚老化のマーカーとしての使用である（但し、医療行為を除く。さらに、マーカー物質（Ｍ１）、（Ｍ２）、及び（Ｍ６）の検出は、質量／電荷比を指標とする方法に限る）。
（Ｍ１）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４６２０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５７４０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ３）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６０３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ４）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２１４００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ５）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５９６００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ６）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４０２０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ７）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４３９０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ８）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７０３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ９）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２８０００のイオンピークを生じるタンパク質、であり、
さらに、
マーカー物質（Ｍ３）は配列番号９又は１０で表されるアミノ酸配列を含み、
マーカー物質（Ｍ４）は配列番号１３〜２６で表される少なくとも１つのアミノ酸配列を含み、
マーカー物質（Ｍ５）は配列番号４８〜５７で表される少なくとも１つのアミノ酸配列を含み、
マーカー物質（Ｍ７）は配列番号５８で表されるアミノ酸配列を含み、
マーカー物質（Ｍ８）は配列番号５９〜６１で表される少なくとも１つのアミノ酸配列を含み、
マーカー物質（Ｍ９）は配列番号２７〜４７で表される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む。
（Ｍ１）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４６２０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５７４０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ３）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６０３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ４）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２１４００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ５）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５９６００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ６）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４０２０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ７）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４３９０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ８）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７０３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ９）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２８０００のイオンピークを生じるタンパク質、であり、
さらに、
マーカー物質（Ｍ３）は配列番号９又は１０で表されるアミノ酸配列を含み、
マーカー物質（Ｍ４）は配列番号１３〜２６で表される少なくとも１つのアミノ酸配列を含み、
マーカー物質（Ｍ５）は配列番号４８〜５７で表される少なくとも１つのアミノ酸配列を含み、
マーカー物質（Ｍ７）は配列番号５８で表されるアミノ酸配列を含み、
マーカー物質（Ｍ８）は配列番号５９〜６１で表される少なくとも１つのアミノ酸配列を含み、
マーカー物質（Ｍ９）は配列番号２７〜４７で表される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む。
請求項１４に記載の発明は、動物の体内に存在する下記（Ｍ１）〜（Ｍ９）の少なくとも１つのタンパク質の、皮膚老化のマーカーとしての使用である（但し、医療行為を除く。さらに、マーカー物質（Ｍ１）、（Ｍ２）、及び（Ｍ６）の検出は、質量／電荷比を指標とする方法に限る）。
（Ｍ１）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４６２０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５７４０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ３）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６０３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ４）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２１４００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ５）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５９６００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ６）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４０２０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ７）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４３９０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ８）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７０３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ９）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２８０００のイオンピークを生じるタンパク質、であり、
さらに、
マーカー物質（Ｍ３）は血清アルブミン又はその修飾体であり、
マーカー物質（Ｍ４）は血漿レチノール結合タンパク質又はその修飾体であり、
マーカー物質（Ｍ５）はヘモペキシン又はその修飾体であり、
マーカー物質（Ｍ７）はα１−アンチトリプシン１−２又はその修飾体であり、
マーカー物質（Ｍ８）はアポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体であり、
マーカー物質（Ｍ９）はアポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体である。
（Ｍ１）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４６２０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５７４０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ３）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６０３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ４）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２１４００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ５）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５９６００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ６）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４０２０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ７）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４３９０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ８）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７０３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ９）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２８０００のイオンピークを生じるタンパク質、であり、
さらに、
マーカー物質（Ｍ３）は血清アルブミン又はその修飾体であり、
マーカー物質（Ｍ４）は血漿レチノール結合タンパク質又はその修飾体であり、
マーカー物質（Ｍ５）はヘモペキシン又はその修飾体であり、
マーカー物質（Ｍ７）はα１−アンチトリプシン１−２又はその修飾体であり、
マーカー物質（Ｍ８）はアポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体であり、
マーカー物質（Ｍ９）はアポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体である。
請求項１５に記載の発明は、動物の体内に存在する下記（Ａ１）〜（Ａ６）の少なくとも１つのタンパク質の、皮膚老化のマーカーとしての使用である（但し、医療行為を除く）。
（Ａ１）血清アルブミン又はその修飾体、
（Ａ２）血漿レチノール結合タンパク質又はその修飾体、
（Ａ３）ヘモペキシン又はその修飾体、
（Ａ４）α１−アンチトリプシン１−２又はその修飾体、
（Ａ５）アポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体、
（Ａ６）アポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体。
（Ａ１）血清アルブミン又はその修飾体、
（Ａ２）血漿レチノール結合タンパク質又はその修飾体、
（Ａ３）ヘモペキシン又はその修飾体、
（Ａ４）α１−アンチトリプシン１−２又はその修飾体、
（Ａ５）アポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体、
（Ａ６）アポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体。
本発明の皮膚老化改善・進行遅延効果の評価方法によれば、被験物質が有する皮膚老化の改善効果又は進行遅延効果を、容易かつ高精度に評価することができる。
本発明の物質のスクリーニング方法によれば、皮膚老化の改善効果又は進行遅延効果を有する物質を、容易かつ高精度にスクリーニングすることができる。
上記の皮膚老化改善・進行遅延効果の評価用キットによれば、マーカー物質の濃度測定に際して当該担体を別途用意する必要がなく、きわめて簡便にマーカー物質の濃度を測定することができる。
以下、本発明を実施するための最良の形態について詳細に説明する。
本発明の皮膚老化改善・進行遅延効果の評価方法は２つの様相を含む。１つの様相では、老化による皮膚症状を発症している動物又は皮膚老化の進行が加速された動物に被験物質を投与して、該動物の体液中における下記マーカー物質（Ｍ１）〜（Ｍ９）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、被験物質が有する皮膚老化の改善効果又は進行遅延効果を評価する。
（Ｍ１）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４６２０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５７４０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ３）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６０３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ４）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２１４００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ５）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５９６００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ６）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４０２０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ７）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４３９０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ８）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７０３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ９）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２８０００のイオンピークを生じるタンパク質。
（Ｍ１）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４６２０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５７４０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ３）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６０３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ４）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２１４００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ５）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５９６００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ６）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４０２０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ７）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４３９０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ８）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７０３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ９）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２８０００のイオンピークを生じるタンパク質。
これらのマーカー物質はいずれも主に血液中に存在するタンパク質であり、老化による皮膚症状の発症直前あるいは発症初期の段階にある動物体内で特異的に検出されるものである。なお、（Ｍ５）、（Ｍ８）、及び（Ｍ９）の各マーカー物質（以下、これらのマーカー物質からなるグループを「グループ１」と称することがある。）は、老化による皮膚症状を発症している状態又は皮膚老化の進行が加速された状態（皮膚老化が急速に進行している状態）でより高値を示すものであるので、被験物質が皮膚老化の改善効果又は進行遅延効果を有する場合には、当該被験物質を投与した動物においてより低値を示す。一方、（Ｍ１）、（Ｍ２）、（Ｍ３）、（Ｍ４）、（Ｍ６）、及び（Ｍ７）の各マーカー物質（以下、これらのマーカー物質からなるグループを「グループ２」と称することがある。）は、老化による皮膚症状を発症している状態又は皮膚老化の進行が加速された状態でより低値を示すものであるので、被験物質が皮膚老化の改善効果又は進行遅延効果を有する場合には、当該被験物質を投与した動物においてより高値を示す。
ある条件のペプチドマッピング並びにＮ末端アミノ酸解析の結果によれば、マーカー物質（Ｍ３）は血清アルブミンの断片と同定され得る。また、ある条件のペプチドマッピングによれば、マーカー物質（Ｍ４）は血漿レチノール結合タンパク質、マーカー物質（Ｍ５）はヘモペキシン（hemopexin）、マーカー物質（Ｍ７）はα１−アンチトリプシン１−２の修飾体、マーカー物質（Ｍ８）はアポリポタンパク質Ｃ１、マーカー物質（Ｍ９）はアポリポタンパク質Ａ１と同定され得る。すなわち、ある実施形態では、下記（１）〜（６）の少なくとも１つを満たす。
（１）マーカー物質（Ｍ３）は血清アルブミン又はその修飾体である、
（２）マーカー物質（Ｍ４）は血漿レチノール結合タンパク質又はその修飾体である、
（３）マーカー物質（Ｍ５）はヘモペキシン又はその修飾体である、
（４）マーカー物質（Ｍ７）はα１−アンチトリプシン１−２又はその修飾体である、
（５）マーカー物質（Ｍ８）はアポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体である、
（６）マーカー物質（Ｍ９）はアポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体である。
（１）マーカー物質（Ｍ３）は血清アルブミン又はその修飾体である、
（２）マーカー物質（Ｍ４）は血漿レチノール結合タンパク質又はその修飾体である、
（３）マーカー物質（Ｍ５）はヘモペキシン又はその修飾体である、
（４）マーカー物質（Ｍ７）はα１−アンチトリプシン１−２又はその修飾体である、
（５）マーカー物質（Ｍ８）はアポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体である、
（６）マーカー物質（Ｍ９）はアポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体である。
本発明の皮膚老化改善・進行遅延効果の評価方法の他の様相では、老化による皮膚症状を発症している動物又は皮膚老化の進行が加速された動物に被験物質を投与して、該動物の体液中における下記（Ａ１）〜（Ａ６）のいずれかに属する少なくとも１つのマーカー物質の濃度を基準値と比較し、被験物質が有する皮膚老化の改善効果又は進行遅延効果を評価する。
（Ａ１）血清アルブミン又はその修飾体、
（Ａ２）血漿レチノール結合タンパク質又はその修飾体、
（Ａ３）ヘモペキシン又はその修飾体、
（Ａ４）α１−アンチトリプシン１−２又はその修飾体、
（Ａ５）アポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体、
（Ａ６）アポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体。
（Ａ１）血清アルブミン又はその修飾体、
（Ａ２）血漿レチノール結合タンパク質又はその修飾体、
（Ａ３）ヘモペキシン又はその修飾体、
（Ａ４）α１−アンチトリプシン１−２又はその修飾体、
（Ａ５）アポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体、
（Ａ６）アポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体。
なお、マウス由来の血清アルブミン、血漿レチノール結合タンパク質、ヘモペキシン、α１−アンチトリプシン１−２、アポリポタンパク質Ｃ１、及びアポリポタンパク質Ａ１のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１〜６に示すとおりである。
タンパク質の修飾の例としては、Ｎ末端αアミノ基やリジンεアミノ基のメチル化、アセチル化、アデニリル化、ミリスチル化等；セリン・スレオニン・アスパラギンへの糖又は糖鎖の付加；セリン・スレオニン・チロシン・アルギニン・ヒスチジンのリン酸化；システインのシステイニル化、ホモシステイニル化、スルホニル化等；グルタミン酸のγ−カルボキシル化；Ｎ末端グルタミン酸のピログルタミン酸への変換、等が挙げられる。また、これらの修飾の脱離（脱メチル化、糖又は糖鎖の脱離、脱リン酸化等）も「修飾」に含まれる。
「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質のアイソフォームが含まれる。アイソフォームとしては、前記した各種の修飾の他、選択的スプライシングによって生じたタンパク質が挙げられる。さらに、「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質の１次構造において数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたような実質的に同一のタンパク質が含まれる。またさらに、「タンパク質又はその修飾体」には、プロテアーゼによる切断を受けた当該タンパク質由来のタンパク質断片が含まれる。例えば、当該タンパク質由来と認められうる長さのタンパク質断片、例えば２０個以上のアミノ酸残基からなるタンパク質断片、分子量が２千以上のタンパク質断片、等が挙げられる。また、複合体タンパク質の場合には「タンパク質又はその修飾体」にはそのサブユニットも含まれるものとする。
例えば、血清アルブミン（配列番号１）のＣ末端側５５アミノ酸からなるタンパク質断片（配列番号７）は「血清アルブミンの修飾体」に含まれる。
また、α１−アンチトリプシン１−２（配列番号４）の３５３番目のＭｅｔと３５４番目のＳｅｒとの間が切断され得ることが知られている。その結果生じるＣ末端側３６アミノ酸からなるタンパク質断片（配列番号８）は「α１−アンチトリプシン１−２の修飾体」に含まれる。さらに、配列番号８のタンパク質断片のＮ末端のＳｅｒがチロシン化された修飾体や、配列番号４において３５３番目のＭｅｔの酸化によって切断位置がシフトし、３５２番目のＰｒｏと３５３番目のＭｅｔとの間が切断されて生じるタンパク質断片（Ｃ末端側３７アミノ酸）も、「α１−アンチトリプシン１−２の修飾体」に含まれる。
また、シグナル配列が切断された後のアポリポタンパク質Ｃ１(配列番号５）のＮ末端アミノ酸配列は「Ａｌａ−Ｐｒｏ」から始まるが、これら２つのアミノ酸は切断され得ることが報告されている（Oleg Chertov et al., Proteomics, Vol. 4, No. 4, 2004）。このようなＮ末端の２アミノ酸が欠損したアポリポタンパク質Ｃ１の断片は「アポリポタンパク質Ｃ１の修飾体」に含まれる。
本発明の皮膚老化改善・進行遅延効果の評価方法では、（Ｍ１）〜（Ｍ９）の各マーカー物質並びに（Ａ１）〜（Ａ６）に属する各マーカー物質の１つだけを用いてもよいし、複数を組み合わせて用いてもよい。複数を用いる場合の組み合わせ方については特に限定はないが、例えば、グループ１から選択したマーカー物質（１つ又は複数）とグループ２から選択したマーカー物質（１つ又は複数）とを組み合わせることができる。
本発明の皮膚老化改善・進行遅延効果の評価方法の好ましい実施形態では、上記基準値として、老化による皮膚症状を発症している動物又は皮膚老化の進行が加速された動物に、皮膚老化の改善効果又は進行遅延効果を有さない既知物質を投与した際の、該動物の体液中における前記マーカー物質の濃度を用いる。すなわち、老化による皮膚症状を発症している動物又は皮膚老化の進行が加速された動物に、皮膚老化の改善効果又は進行遅延効果を有さない既知物質を投与した場合、その体液中の上記マーカー物質の濃度は「異常値」となる。そして、被験物質を投与した上記動物における値（測定値）と当該基準値（異常値）とを比較し、測定値が基準値と有意に差がありかつ正常側である場合（正常側に維持された場合）に、当該被験物質が皮膚老化の改善効果又は進行遅延効果を有すると評価することができる。具体的には、グループ１に属するマーカー物質を指標とする場合は、測定値が当該基準値に比べて有意に低いときに、一方、グループ２に属するマーカー物質を指標とする場合は、測定値が基準値に比べて有意に高いときに、当該被験物質が皮膚老化の改善効果又は進行遅延効果を有すると評価することができる。
さらに、基準値は複数あってもよい。例えば、上記の異常値に加え、老化による皮膚症状を発症していない動物又は皮膚老化の進行が遅い動物における値（正常値。陰性対照。）を基準値に加えることができる。具体的には、（１）老化による皮膚症状を発症していない動物又は皮膚老化の進行が遅い動物に、普通食又は被験物質を投与する群（正常値を示す群）、（２）老化による皮膚症状を発症している動物又は皮膚老化の進行が加速された動物（皮膚老化の進行が速い動物）に、皮膚老化の改善効果又は進行遅延効果を有さない既知物質を投与する群（異常値を示す群）、及び、（３）老化による皮膚症状を発症している動物又は皮膚老化の進行が加速された動物に被験物質を投与する群、の計３群を設定し、動物を飼育する。そして、各動物の体液中の上記マーカー物質を測定し、各測定値を比較する。このとき、（１）と（２）とで有意差があり、（３）と（２）とで有意差があり、かつ（３）が（２）に比べて正常側（（１）に近い側）である場合（正常側に維持された場合）に、当該被験物質が皮膚老化の改善効果又は進行遅延効果を有すると評価することができる。
さらに、基準値として、（４）老化による皮膚症状を発症している動物又は皮膚老化の進行が加速された動物に、皮膚老化の改善効果又は進行遅延効果を有する既知物質を投与する群、の動物における値（陽性対照）を加えることもできる。具体的には、上記（１）〜（３）に加えて、上記（４）の群を設定し、動物を飼育する。このとき、（１）と（２）とで有意差があり、（３）と（２）とで有意差があり、かつ（３）が（２）に比べて正常側（（１）及び（４）に近い側）である場合に、当該被験物質が皮膚老化の改善効果又は進行遅延効果を有すると評価することができる。すなわち、このような被験物質は、（４）で採用した上記既知物質と同様の挙動を示し、同様の作用を有する物質といえる。「皮膚老化の改善効果又は進行遅延効果を有する既知物質」の例としては、ヘリピロンＡ（helipyrone A；例えば国際公開第２００７／１２５８３２号パンフレットに記載）が挙げられる。
好ましい実施形態では、「老化による皮膚症状を発症している動物又は皮膚老化の進行が加速された動物」として紫外線照射下で飼育した無毛動物を用いる。例えば、ヘアレスマウス、ヘアレスラットといった各種の無毛動物がすでに作出されており、これらを入手して使用することができる。この際、皮膚老化の程度は、例えば、しわの形態や皮膚表面の乾燥度を指標として評価することができる。なお、紫外線照射以外に、薬剤塗布によって皮膚老化を誘発させることも可能である。
後述の実施例で示すとおり、Ｈｏｓ：ＨＲ１ヘアレスマウスを紫外線照射下で飼育すると、紫外線照射４〜５週で軽微なシワ形成が認められる。この段階のマウスは、老化による皮膚症状の発症直前あるいは発症初期の状態にあるといえる。本発明の皮膚老化改善・進行遅延効果の評価方法で用いるマーカー物質（Ｍ１）〜（Ｍ９）及び（Ａ１）〜（Ａ６）のいずれかに属するマーカー物質は、紫外線照射４〜５週の当該マウスの体液中に存在し、老化による皮膚症状の発症直前や発症初期の状態ではないマウス（例えば、正常マウス）と比較してその体液中の濃度に有意差を示す。したがって、本発明において紫外線照射下でヘアレスマウスを飼育する系を採用する場合には、例えば、紫外線照射４〜５週ごろの体液を測定試料として各マーカー物質の濃度を測定すればよい。
被験物質を投与する経路としては特に限定はないが、好ましくは、経口的又は経皮的に投与する。経口的に投与する場合には、例えば、被験物質を含有させた食餌を摂取させればよい。経皮的に投与する場合には、例えば、被験物質を含有する軟膏、クリーム、ローション、溶液、パウダー、ゲル等を皮膚に塗布すればよい。パップ剤として皮膚に貼付し、体内に吸収させてもよい。
「老化による皮膚症状を発症している動物又は皮膚老化の進行が加速された動物」における動物の種類には特に限定はなく、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ等を採用することができる。さらに、動物としてヒトを採用することもできる。この場合には、臨床試験の結果によって物質を評価することになる。
本発明の皮膚老化改善・進行遅延効果の評価方法において使用する動物の体液としては、血液が好ましく用いられる。特に、血液から調製した血清又は血漿（体液成分）を測定試料とすることが好ましい。血清又は血漿は遠心分離等の公知の方法で血液から調製することができる。
本発明の皮膚老化改善・進行遅延効果の評価方法における被験物質としては、食品素材、化粧品素材、医薬品素材などが挙げられる。例えば、食品素材を評価対象とする場合は、機能性食品の開発に役立てることができる。
本発明の皮膚老化改善・進行遅延効果の評価方法において、マーカー物質の濃度を測定する方法は、そのマーカー物質の濃度を特異的に測定できる方法であれば、タンパク質の定量に一般に用いられている方法をそのまま用いることができる。例えば、各種のイムノアッセイ、質量分析（ＭＳ）、クロマトグラフィー、電気泳動等を用いることができる。
イムノアッセイによれば、夾雑物質の多い試料のままでも正確にマーカー物質の濃度を測定することができる。イムノアッセイの例としては、抗原抗体結合物を直接的又は間接的に測定する沈降反応、凝集反応、溶血反応などの古典的な方法や、標識法と組み合わせて検出感度を高めたエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）等の方法が挙げられる。なお、これらのイムノアッセイに用いるマーカー物質に特異的な抗体は、モノクローナルでもよいし、ポリクローナルでもよい。
質量分析によれば、各マーカー物質由来のイオンピークを特定し、そのイオンピーク強度をもって各マーカー物質の量（濃度）を測定することができる。質量分析によってマーカー物質の濃度を測定する場合のイオン化の方法としては、マトリクス支援レーザーイオン化（matrix-assisted laser desorption/ionization、ＭＡＬＤＩ）、エレクトロスプレーイオン化（electrospray ionization、ＥＳＩ）のいずれも適用可能であるが、多価イオンの生成が少ないＭＡＬＤＩが好ましい。特に、飛行時間質量分析計（time-of-flight mass spectrometer、ＴＯＦ）と組み合わせたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによれば、より正確にマーカー物質由来のイオンピークを特定することができる。
電気泳動によりマーカー物質の濃度を測定する場合は、例えば、検査材料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供して目的のマーカー物質を分離し、適宜の色素や蛍光物質でゲルを染色し、目的のマーカー物質に相当するバンドの濃さや蛍光強度を測定すればよい。ＳＤＳ−ＰＡＧＥだけではマーカー物質の分離が不十分な場合は、等電点電気泳動（ＩＥＦ）と組み合わせた２次元電気泳動を用いることもできる。さらに、ゲルから直接検出するのではなく、ウエスタンブロッティングを行って膜上のマーカー物質の量を測定することもできる。
クロマトグラフィーによってマーカー物質の濃度を測定する場合は、例えば、液体高速クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による方法を用いることができる。すなわち、試料をＨＰＬＣに供して目的のマーカー物質を分離し、そのクロマトグラムのピーク面積を測定することにより試料中のマーカー物質の濃度を測定することができる。
好ましい実施形態では、マーカー物質を担体上に捕捉し、その捕捉されたマーカー物質を測定対象とする。すなわち、マーカー物質に対する親和性を有する物質を担体に固定化し、その親和性を有する物質を介してマーカー物質を担体上に捕捉する。そして、捕捉された前記マーカー物質の量に基づいて体液中の前記マーカー物質の濃度を算出する。本実施形態によれば、試料中に含まれる夾雑物質の影響を低減させることができ、より高感度かつ高精度でマーカー物質の濃度を測定することができる。本実施形態において用いることができる担体の例としては、ビーズ、金属、ガラス、樹脂等のような一般的なものの他、基板のような、平面部分を有する担体を用いることができる。基板を用いる場合は、その平面部分の一部にマーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化することが好ましい。例としては、基板としてチップを用い、その表面の複数箇所にスポット的にマーカー物質に親和性を有する物質を固定化した担体が挙げられる。なお「親和性」の例としては、イオン結合、金属キレート体とタンパク質中のヒスチジン残基等とのアフィニティ、抗原と抗体、酵素と基質、若しくはホルモンとレセプターのようなバイオアフィニティ、及び、疎水性相互作用のような化学的な相互作用、が挙げられる。
イオン結合によってマーカー物質を担体に捕捉する場合は、イオン交換体を担体に固定化する。この場合、イオン交換体には陽イオン交換体、陰イオン交換体のいずれも用いることができ、さらに、強陽イオン交換体、弱陽イオン交換体、強陰イオン交換体、弱陰イオン交換体のいずれも用いることができるが、強陰イオン交換体と弱陽イオン交換体が好ましく用いられる。強陰イオン交換体の例としては、４級アンモニウム（トリメチルアミノメチル）（ＱＡ）、４級アミノエチル（ジエチル，モノ・２−ヒドロキシブチルアミノエチル）（ＱＡＥ）、４級アンモニウム（トリメチルアンモニウム）（ＱＭＡ）等の強陰イオン交換基を有するものが挙げられる。また、弱陽イオン交換体の例としては、カルボキシメチル（ＣＭ）等の弱陽イオン交換基を有するものが挙げられる。また、強陽イオン交換体の例としては、スルホプロピル（ＳＰ）等の強陽イオン交換基を有するものが挙げられる。さらに、弱陰イオン交換体の例としては、ジメチルアミノエチル（ＤＥ）、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）等の弱陰イオン交換基を有するものが挙げられる。
金属キレート体を介してマーカー物質を捕捉する場合は、例えば、Ｃｕ2+、Ｚｎ2+、Ｎｉ2+、Ｃｏ2+、Ａｌ3+、Ｆｅ3+、Ｇａ3+等の金属キレート体を固定化した担体を用いることができる。
抗体によってマーカー物質を担体に捕捉する場合は、マーカー物質に特異的な抗体を担体に固定化すればよい。
疎水性相互作用によってマーカー物質を担体に捕捉する場合は、担体に疎水基をもつ物質を固定化する。疎水基の例としては、Ｃ４〜Ｃ２０のアルキル基、フェニル基等が挙げられる。
本実施形態においてマーカー物質の測定方法にイムノアッセイを用いる場合は、抗体を固定化した担体を用いることが好ましい。このようにすれば、担体に固定化された抗体を１次抗体としたイムノアッセイの系を簡単に構築することができる。例えば、マーカー物質に特異的でエピトープの異なる２種類の抗体を用意し、一方を１次抗体として担体に固定化し、他方を２次抗体として酵素標識し、サンドイッチＥＩＡの系を構築することができる。その他、結合阻止法や競合法によるイムノアッセイの系も構築可能である。さらに、担体として基板を用いる場合は、抗体チップによるイムノアッセイが可能である。抗体チップによれば、複数のマーカー物質の濃度を同時に測定でき、迅速な測定が可能である。
一方、本実施形態において質量分析を用いる場合は、例えば、抗体の他、イオン交換体、金属キレート体又は疎水基を固定化した担体を用いることができる。なお、これらの物質による結合は抗原と抗体等のバイオアフィニティほどの特異性がないので、これらの物質を固定化した担体を用いる場合はマーカー物質以外の物質も担体上に捕捉されうるが、質量分析によれば分子量を反映した質量分析計スペクトルによって定量するので、問題はない。特に、担体として基板を用い、表面エンハンス型レーザー脱離イオン化（surface-enhanced laser desorption/ionization）−飛行時間質量分析（time-of-flight mass spectrometry）（以下、「ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ」と称する）を行うことにより、マーカー物質の濃度をより正確に測定することができる。使用できる基板の種類としては、陽イオン交換基板、陰イオン交換基板、順相基板、逆相基板、金属イオン基板、抗体基板等を用いることができるが、陽イオン交換基板、特に弱陽イオン交換基板と、陰イオン交換基板、特に強陰イオン交換基板が好ましく用いられる。
本発明の物質のスクリーニング方法は、本発明の皮膚老化改善・進行遅延効果の評価方法によって被験物質を評価し、皮膚老化の改善効果又は進行遅延効果を有する物質をスクリーニングするものである。本発明の物質のスクリーニング方法においても、上記した本発明の皮膚老化改善・進行遅延効果の評価方法の実施形態と全く同様の実施形態をとることができる。
本発明の皮膚老化改善・進行遅延効果の評価方法を簡便に行なうために、必要な試薬類をまとめて評価用キットを構築することができる。当該評価用キットとしては、例えば、マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含むものが挙げられる。特に、担体として、ＣＭ等の弱陽イオン交換体、あるいはＱＡやＱＡＥ等の強陰イオン交換体を固定化した基板を含めた評価用キットによれば、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ等を簡便に行なうことができる。本キット中には他の試薬類、例えば、標準物質、前処理用の各種緩衝液等を含めてもよい。なお本キットは、皮膚老化の改善効果又は進行遅延効果を有する物質をスクリーニングするためのキットとしても使用できる。当該キットの構成例を以下に挙げる。
〔キットの構成例〕
（１）弱陽イオン交換基板：１枚
（２）強陰イオン交換基板：１枚
（３）基板洗浄用バッファーＡ（ｐＨ３．０）：適量
（４）基板洗浄用バッファーＢ（ｐＨ９．０）：適量
（５）各マーカー物質の標準品：各適量
（１）弱陽イオン交換基板：１枚
（２）強陰イオン交換基板：１枚
（３）基板洗浄用バッファーＡ（ｐＨ３．０）：適量
（４）基板洗浄用バッファーＢ（ｐＨ９．０）：適量
（５）各マーカー物質の標準品：各適量
以下に、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
１．紫外線照射皮膚障害モデル動物を使った動物実験
皮膚老化モデルとして、紫外線照射下でヘアレスマウスを飼育する系を採用した。まず、紫外線照射の有無と飼料の組み合わせが異なる以下の４つの群を設定した。各群の個体数は５匹以上とした。
第１群：紫外線照射なし＋通常飼料
第２群：紫外線照射あり＋通常飼料
第３群：紫外線照射あり＋ヘリピロンＡ含有飼料
第４群：紫外線照射なし＋ヘリピロンＡ含有飼料
すなわち、第１群は皮膚老化の進行が遅い群、第２群は皮膚老化が急速に進行する群、第３群は老化による皮膚症状の発症が抑制される群、に相当する。第４群はヘリピロンＡの作用検証用の群である。飼育条件等の詳細は以下のとおりとした。
皮膚老化モデルとして、紫外線照射下でヘアレスマウスを飼育する系を採用した。まず、紫外線照射の有無と飼料の組み合わせが異なる以下の４つの群を設定した。各群の個体数は５匹以上とした。
第１群：紫外線照射なし＋通常飼料
第２群：紫外線照射あり＋通常飼料
第３群：紫外線照射あり＋ヘリピロンＡ含有飼料
第４群：紫外線照射なし＋ヘリピロンＡ含有飼料
すなわち、第１群は皮膚老化の進行が遅い群、第２群は皮膚老化が急速に進行する群、第３群は老化による皮膚症状の発症が抑制される群、に相当する。第４群はヘリピロンＡの作用検証用の群である。飼育条件等の詳細は以下のとおりとした。
〔動物種〕
・Ｈｏｓ：ＨＲ１ヘアレスマウス（雌、５週齢）
・５週齢より飼育開始（混餌投与を開始）、６週齢より紫外線照射開始
〔飼料〕
・通常飼料：ＭＦ（オリエンタル酵母工業社）
・ヘリピロンＡ含有飼料：ヘリピロンＡ（ファンケル社）を０．１％（５０ｍｇ／ｋｇ体重に相当）含有するＭＦ
〔紫外線照射条件〕
・隔日×１０週間（１６週齢まで）
・Ｂ波：２０ｍＪ／ｃｍ2／日（０．３３〜０．３６ＭＥＤ）
・Ａ波：１４Ｊ／ｃｍ2／日（強度：４０〜４５ｍＷ／ｍ2）
〔各種試験と採血のタイミング〕
・紫外線照射０週（６週齢）、２週（８週齢）、４週（１０週齢）、１０週（１６週齢）の計４回
〔試験項目〕
・シワの形態観察：３Ｄ皮膚解析システム（ＡＳＡ−０３ＲＸ）によるレプリカ解析（キメ体積率）
・皮表面部乾燥度：簡易水分計（モイスチャーチェッカー）ＭＹ７０７Ｓによる測定
〔採血方法〕
・道具：２６〜２７Ｇ注射針を１ｍＬシリンジに装着、ヘパリン処理
・採血箇所：心臓（右心室辺り）
・血漿分離：遠心分離まで氷冷、１２，０００Ｇ，４℃で１０分間遠心分離、凍結保存
・Ｈｏｓ：ＨＲ１ヘアレスマウス（雌、５週齢）
・５週齢より飼育開始（混餌投与を開始）、６週齢より紫外線照射開始
〔飼料〕
・通常飼料：ＭＦ（オリエンタル酵母工業社）
・ヘリピロンＡ含有飼料：ヘリピロンＡ（ファンケル社）を０．１％（５０ｍｇ／ｋｇ体重に相当）含有するＭＦ
〔紫外線照射条件〕
・隔日×１０週間（１６週齢まで）
・Ｂ波：２０ｍＪ／ｃｍ2／日（０．３３〜０．３６ＭＥＤ）
・Ａ波：１４Ｊ／ｃｍ2／日（強度：４０〜４５ｍＷ／ｍ2）
〔各種試験と採血のタイミング〕
・紫外線照射０週（６週齢）、２週（８週齢）、４週（１０週齢）、１０週（１６週齢）の計４回
〔試験項目〕
・シワの形態観察：３Ｄ皮膚解析システム（ＡＳＡ−０３ＲＸ）によるレプリカ解析（キメ体積率）
・皮表面部乾燥度：簡易水分計（モイスチャーチェッカー）ＭＹ７０７Ｓによる測定
〔採血方法〕
・道具：２６〜２７Ｇ注射針を１ｍＬシリンジに装着、ヘパリン処理
・採血箇所：心臓（右心室辺り）
・血漿分離：遠心分離まで氷冷、１２，０００Ｇ，４℃で１０分間遠心分離、凍結保存
〔シワの形態観察の結果〕
第１群と第２群とを比較すると、紫外線照射４週以降においてキメ体積率に有意差が認められ、第２群の方がシワが多かった。第２群と第３群とを比較すると、第４週においてキメ体積率に有意差が認められ、第３群の方がシワが少なかった。
〔皮表面部乾燥度の結果〕
第１群と第２群とを比較すると、紫外線照射１０週において水分量に有意差が認められ、第２群の方が水分量が少なかった。第２群と第３群とを比較すると、第１０週において水分量に有意差が認められ、第３群の方が水分量が多かった。
第１群と第２群とを比較すると、紫外線照射４週以降においてキメ体積率に有意差が認められ、第２群の方がシワが多かった。第２群と第３群とを比較すると、第４週においてキメ体積率に有意差が認められ、第３群の方がシワが少なかった。
〔皮表面部乾燥度の結果〕
第１群と第２群とを比較すると、紫外線照射１０週において水分量に有意差が認められ、第２群の方が水分量が少なかった。第２群と第３群とを比較すると、第１０週において水分量に有意差が認められ、第３群の方が水分量が多かった。
以上の結果から、紫外線照射４週の時点が老化による皮膚症状の発症直前か発症初期の段階であると判断し、紫外線照射４週の血漿サンプルを以下のプロテオーム解析に供した。
２．プロテインチップによる解析とイオンピークの選抜
採取した各血漿サンプル２０μＬに、変性バッファー（９Ｍ 尿素、２％ ＣＨＡＰＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０））３０μＬを加えて前処理を行い、タンパク質を変性させた。次に、前処理した各体液試料を強陰イオン交換樹脂カラム（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＧＥヘルスケア社）にアプライした。次いで、ｐＨ９．０の緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、０．１％（ｗ／ｖ）１−ｏ−Ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（以下、「ＯＧＰ」と称する。））、ｐＨ５．０の緩衝液（１００ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）、０．１％（ｗ／ｖ）ＯＧＰ）、ｐＨ３．０の緩衝液（５０ｍＭ クエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）、０．１％（ｗ／ｖ）ＯＧＰ）、及び有機溶媒（０．１％トリフルオロ酢酸、５０．０％アセトニトリルからなる混合液）各２００μＬで順に溶出させ、画分１（ｐＨ９．０で溶出、素通り）、画分２（ｐＨ５．０で溶出）、画分３（ｐＨ３．０で溶出）、画分４（有機溶媒で溶出）の４つの粗分画画分を得た。
採取した各血漿サンプル２０μＬに、変性バッファー（９Ｍ 尿素、２％ ＣＨＡＰＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０））３０μＬを加えて前処理を行い、タンパク質を変性させた。次に、前処理した各体液試料を強陰イオン交換樹脂カラム（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＧＥヘルスケア社）にアプライした。次いで、ｐＨ９．０の緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、０．１％（ｗ／ｖ）１−ｏ−Ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（以下、「ＯＧＰ」と称する。））、ｐＨ５．０の緩衝液（１００ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）、０．１％（ｗ／ｖ）ＯＧＰ）、ｐＨ３．０の緩衝液（５０ｍＭ クエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）、０．１％（ｗ／ｖ）ＯＧＰ）、及び有機溶媒（０．１％トリフルオロ酢酸、５０．０％アセトニトリルからなる混合液）各２００μＬで順に溶出させ、画分１（ｐＨ９．０で溶出、素通り）、画分２（ｐＨ５．０で溶出）、画分３（ｐＨ３．０で溶出）、画分４（有機溶媒で溶出）の４つの粗分画画分を得た。
得られた各画分１０μＬをｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファー（５０ｍＭ クエン酸ナトリウム）で１０倍希釈した後、弱陽イオン交換チップＣＭ１０（バイオラッド社）に添加した。同様に、得られた各画分１０μＬをｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０））で１０倍希釈した後、強陰イオン交換チップＱ１０（バイオラッド社）に添加した。各チップを各結合バッファーで３回洗浄した後に脱イオン水で１回洗浄し、乾燥させた。次に、エネルギー吸収分子であるシナピン酸（ＳＰＡ−Ｈ、ＳＰＡ−Ｌ）又はα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）を添加し、プロテインチップリーダーＭｏｄｅｌ ＰＢＳ ＩＩｃ（バイオラッド社）を用いて、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった。なお、測定分子量範囲（ｍ／ｚ）は、３０００〜２０００００の範囲で行なった。また、測定は２連で行い、ｍ／ｚの平均値を算出した。データ解析は、Protein Chip Software、CiphergenExpress Data Manager、及びBiomarker Patterns Software（いずれもバイオラッド社）を用いて行なった。具体的には、ベースライン補正、分子量校正、スペクトルの正規化処理を行なった後、シングルマーカー解析及び数本のマーカーを組み合わせたマルチフロー解析を行なった。その結果、粗分画画分の種類、プロテインチップの種類、チップの洗浄条件等の組み合わせによって多数のピークが検出された。各ピークについて、ｐ値（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定法）、ＲＯＣ面積、及びイオンピーク強度を算出し、さらに、以下の（１）〜（３）の条件を指標として９個の候補ピークを選抜した。
（１）候補ピーク探索（基本）
第１群と第２群との間でイオン強度に有意差がある（ｐ＜０．０５）。
（２）ヘリピロンＡ効果検証
第２群と第３群との間でイオン強度に有意差があり（ｐ＜０．０５）、かつ第３群の値の方が第２群の値よりも第１群の値に近い（第３群の値が第１群側に復帰している）。
（３）増減パターン解析
第２群のみが高値または低値を示し、第１群、第３群および第４群の間ではあまり差がない。なお、第３群と第４群との間に差があっても、第４群の値の方が第３群の値よりも第２群から離れている場合には本条件を満たすものとして取り扱う。
第１群と第２群との間でイオン強度に有意差がある（ｐ＜０．０５）。
（２）ヘリピロンＡ効果検証
第２群と第３群との間でイオン強度に有意差があり（ｐ＜０．０５）、かつ第３群の値の方が第２群の値よりも第１群の値に近い（第３群の値が第１群側に復帰している）。
（３）増減パターン解析
第２群のみが高値または低値を示し、第１群、第３群および第４群の間ではあまり差がない。なお、第３群と第４群との間に差があっても、第４群の値の方が第３群の値よりも第２群から離れている場合には本条件を満たすものとして取り扱う。
３．マーカー物質（Ｍ１）の特定
画分３（ｐＨ３．０）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｌ）を行なった場合に、質量／電荷比が４６１６（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図１に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。図中、髭の上端と下端はそれぞれ最大値と最小値、箱の上辺と下辺はそれぞれ第３四分位（７５パーセンタイル）と第１四分位（２５パーセンタイル）、箱の中の線は中央値である（図２以降も同じ）。各ＲＯＣ面積と各ｐ値は以下のとおりとなった。
画分３（ｐＨ３．０）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｌ）を行なった場合に、質量／電荷比が４６１６（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図１に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。図中、髭の上端と下端はそれぞれ最大値と最小値、箱の上辺と下辺はそれぞれ第３四分位（７５パーセンタイル）と第１四分位（２５パーセンタイル）、箱の中の線は中央値である（図２以降も同じ）。各ＲＯＣ面積と各ｐ値は以下のとおりとなった。
ＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）：０．８６
ｐ値（第１群ｖｓ第２群）：０．００３
ＲＯＣ面積（第２群ｖｓ第３群）：０．８６
ｐ値（第２群ｖｓ第３群）：０．００７
ｐ値（第１群ｖｓ第２群）：０．００３
ＲＯＣ面積（第２群ｖｓ第３群）：０．８６
ｐ値（第２群ｖｓ第３群）：０．００７
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約４６２０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ１））が、老化による皮膚症状を発症しているマウス、又は皮膚老化の進行が加速されたマウスに特異的な物質であり、皮膚老化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被験物質を投与した「老化による皮膚症状を発症している動物又は皮膚老化の進行が加速された動物」の体液中におけるマーカー物質（Ｍ１）の濃度を指標として、被験物質が有する皮膚老化の改善効果又は進行遅延効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約４６２０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、皮膚老化の改善効果、又は進行遅延効果を有すると評価することができる。
４．マーカー物質（Ｍ２）の特定
画分４（有機溶媒）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＣＨＣＡ）を行なった場合に、質量／電荷比が５７４３（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図２に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。各ＲＯＣ面積と各ｐ値は以下のとおりとなった。
画分４（有機溶媒）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＣＨＣＡ）を行なった場合に、質量／電荷比が５７４３（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図２に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。各ＲＯＣ面積と各ｐ値は以下のとおりとなった。
ＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）：０．７８
ｐ値（第１群ｖｓ第２群）：０．０１６
ＲＯＣ面積（第２群ｖｓ第３群）：０．７４
ｐ値（第２群ｖｓ第３群）：０．０４１
ｐ値（第１群ｖｓ第２群）：０．０１６
ＲＯＣ面積（第２群ｖｓ第３群）：０．７４
ｐ値（第２群ｖｓ第３群）：０．０４１
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約５７４０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ２））が、老化による皮膚症状を発症しているマウス、又は皮膚老化の進行が加速されたマウスに特異的な物質であり、皮膚老化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被験物質を投与した「老化による皮膚症状を発症している動物又は皮膚老化の進行が加速された動物」の体液中におけるマーカー物質（Ｍ２）の濃度を指標として、被験物質が有する皮膚老化の改善効果又は進行遅延効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約５７４０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、皮膚老化の改善効果、又は進行遅延効果を有すると評価することができる。
５．マーカー物質（Ｍ３）の特定
画分３（ｐＨ３．０）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｌ）を行なった場合に、質量／電荷比が６０２９（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図３に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。各ＲＯＣ面積と各ｐ値は以下のとおりとなった。
画分３（ｐＨ３．０）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｌ）を行なった場合に、質量／電荷比が６０２９（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図３に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。各ＲＯＣ面積と各ｐ値は以下のとおりとなった。
ＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）：０．７８
ｐ値（第１群ｖｓ第２群）：０．０４１
ＲＯＣ面積（第２群ｖｓ第３群）：０．７８
ｐ値（第２群ｖｓ第３群）：０．０２３
ｐ値（第１群ｖｓ第２群）：０．０４１
ＲＯＣ面積（第２群ｖｓ第３群）：０．７８
ｐ値（第２群ｖｓ第３群）：０．０２３
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約６０３０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ３））が、老化による皮膚症状を発症しているマウス、又は皮膚老化の進行が加速されたマウスに特異的な物質であり、皮膚老化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被験物質を投与した「老化による皮膚症状を発症している動物又は皮膚老化の進行が加速された動物」の体液中におけるマーカー物質（Ｍ３）の濃度を指標として、被験物質が有する皮膚老化の改善効果又は進行遅延効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約６０３０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、皮膚老化の改善効果、又は進行遅延効果を有すると評価することができる。
６．マーカー物質（Ｍ４）の特定
画分２（ｐＨ５．０）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｈ）を行なった場合に、質量／電荷比が２１３９８（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図４に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。各ＲＯＣ面積と各ｐ値は以下のとおりとなった。
画分２（ｐＨ５．０）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｈ）を行なった場合に、質量／電荷比が２１３９８（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図４に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。各ＲＯＣ面積と各ｐ値は以下のとおりとなった。
ＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）：０．９０
ｐ値（第１群ｖｓ第２群）：０．００３
ＲＯＣ面積（第２群ｖｓ第３群）：０．８２
ｐ値（第２群ｖｓ第３群）：０．０２８
ｐ値（第１群ｖｓ第２群）：０．００３
ＲＯＣ面積（第２群ｖｓ第３群）：０．８２
ｐ値（第２群ｖｓ第３群）：０．０２８
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約２１４００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ４））が、老化による皮膚症状を発症しているマウス、又は皮膚老化の進行が加速されたマウスに特異的な物質であり、皮膚老化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被験物質を投与した「老化による皮膚症状を発症している動物又は皮膚老化の進行が加速された動物」の体液中におけるマーカー物質（Ｍ４）の濃度を指標として、被験物質が有する皮膚老化の改善効果又は進行遅延効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約２１４００のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、皮膚老化の改善効果、又は進行遅延効果を有すると評価することができる。
７．マーカー物質（Ｍ５）の特定
画分２（ｐＨ５．０）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＣＨＣＡ）を行なった場合に、質量／電荷比が５９５８６（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で低値を示し、第２群で高値を示した。図５に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。各ＲＯＣ面積と各ｐ値は以下のとおりとなった。
画分２（ｐＨ５．０）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＣＨＣＡ）を行なった場合に、質量／電荷比が５９５８６（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で低値を示し、第２群で高値を示した。図５に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。各ＲＯＣ面積と各ｐ値は以下のとおりとなった。
ＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）：０．９０
ｐ値（第１群ｖｓ第２群）：０．００２
ＲＯＣ面積（第２群ｖｓ第３群）：０．９０
ｐ値（第２群ｖｓ第３群）：０．００２
ｐ値（第１群ｖｓ第２群）：０．００２
ＲＯＣ面積（第２群ｖｓ第３群）：０．９０
ｐ値（第２群ｖｓ第３群）：０．００２
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約５９６００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ５））が、老化による皮膚症状を発症しているマウス、又は皮膚老化の進行が加速されたマウスに特異的な物質であり、皮膚老化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被験物質を投与した「老化による皮膚症状を発症している動物又は皮膚老化の進行が加速された動物」の体液中におけるマーカー物質（Ｍ５）の濃度を指標として、被験物質が有する皮膚老化の改善効果又は進行遅延効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約５９６００のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、皮膚老化の改善効果、又は進行遅延効果を有すると評価することができる。
８．マーカー物質（Ｍ６）の特定
画分３（ｐＨ３．０）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｌ）を行なった場合に、質量／電荷比が４０２０（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図６に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。各ＲＯＣ面積と各ｐ値は以下のとおりとなった。
画分３（ｐＨ３．０）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｌ）を行なった場合に、質量／電荷比が４０２０（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図６に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。各ＲＯＣ面積と各ｐ値は以下のとおりとなった。
ＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）：０．７４
ｐ値（第１群ｖｓ第２群）：０．０４１
ＲＯＣ面積（第２群ｖｓ第３群）：０．８２
ｐ値（第２群ｖｓ第３群）：０．００８
ｐ値（第１群ｖｓ第２群）：０．０４１
ＲＯＣ面積（第２群ｖｓ第３群）：０．８２
ｐ値（第２群ｖｓ第３群）：０．００８
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約４０２０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ６））が、老化による皮膚症状を発症しているマウス、又は皮膚老化の進行が加速されたマウスに特異的な物質であり、皮膚老化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被験物質を投与した「老化による皮膚症状を発症している動物又は皮膚老化の進行が加速された動物」の体液中におけるマーカー物質（Ｍ６）の濃度を指標として、被験物質が有する皮膚老化の改善効果又は進行遅延効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約４０２０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、皮膚老化の改善効果、又は進行遅延効果を有すると評価することができる。
９．マーカー物質（Ｍ７）の特定
画分２（ｐＨ５．０）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｌ）を行なった場合に、質量／電荷比が４３９１（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図７に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。各ＲＯＣ面積と各ｐ値は以下のとおりとなった。
画分２（ｐＨ５．０）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｌ）を行なった場合に、質量／電荷比が４３９１（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図７に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。各ＲＯＣ面積と各ｐ値は以下のとおりとなった。
ＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）：０．８６
ｐ値（第１群ｖｓ第２群）：０．００７
ＲＯＣ面積（第２群ｖｓ第３群）：０．７４
ｐ値（第２群ｖｓ第３群）：０．０４９
ｐ値（第１群ｖｓ第２群）：０．００７
ＲＯＣ面積（第２群ｖｓ第３群）：０．７４
ｐ値（第２群ｖｓ第３群）：０．０４９
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約４３９０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ７））が、老化による皮膚症状を発症しているマウス、又は皮膚老化の進行が加速されたマウスに特異的な物質であり、皮膚老化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被験物質を投与した「老化による皮膚症状を発症している動物又は皮膚老化の進行が加速された動物」の体液中におけるマーカー物質（Ｍ７）の濃度を指標として、被験物質が有する皮膚老化の改善効果又は進行遅延効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約４３９０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、皮膚老化の改善効果、又は進行遅延効果を有すると評価することができる。
１０．マーカー物質（Ｍ８）の特定
画分１（ｐＨ９．０）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＣＨＣＡ）を行なった場合に、質量／電荷比が７０３４（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で低値を示し、第２群で高値を示した。図８に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。各ＲＯＣ面積と各ｐ値は以下のとおりとなった。
画分１（ｐＨ９．０）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＣＨＣＡ）を行なった場合に、質量／電荷比が７０３４（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で低値を示し、第２群で高値を示した。図８に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。各ＲＯＣ面積と各ｐ値は以下のとおりとなった。
ＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）：０．７４
ｐ値（第１群ｖｓ第２群）：０．０２８
ＲＯＣ面積（第２群ｖｓ第３群）：０．７８
ｐ値（第２群ｖｓ第３群）：０．０３４
ｐ値（第１群ｖｓ第２群）：０．０２８
ＲＯＣ面積（第２群ｖｓ第３群）：０．７８
ｐ値（第２群ｖｓ第３群）：０．０３４
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約７０３０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ８））が、老化による皮膚症状を発症しているマウス、又は皮膚老化の進行が加速されたマウスに特異的な物質であり、皮膚老化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被験物質を投与した「老化による皮膚症状を発症している動物又は皮膚老化の進行が加速された動物」の体液中におけるマーカー物質（Ｍ８）の濃度を指標として、被験物質が有する皮膚老化の改善効果又は進行遅延効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約７０３０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、皮膚老化の改善効果、又は進行遅延効果を有すると評価することができる。
１１．マーカー物質（Ｍ９）の特定
画分２（ｐＨ５．０）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＣＨＣＡ）を行なった場合に、質量／電荷比が２７９７３（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で低値を示し、第２群で高値を示した。図９に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。各ＲＯＣ面積と各ｐ値は以下のとおりとなった。
画分２（ｐＨ５．０）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＣＨＣＡ）を行なった場合に、質量／電荷比が２７９７３（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で低値を示し、第２群で高値を示した。図９に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。各ＲＯＣ面積と各ｐ値は以下のとおりとなった。
ＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）：０．９０
ｐ値（第１群ｖｓ第２群）：０．００１
ＲＯＣ面積（第２群ｖｓ第３群）：０．８６
ｐ値（第２群ｖｓ第３群）：０．００３
ｐ値（第１群ｖｓ第２群）：０．００１
ＲＯＣ面積（第２群ｖｓ第３群）：０．８６
ｐ値（第２群ｖｓ第３群）：０．００３
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約２８０００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ９））が、老化による皮膚症状を発症しているマウス、又は皮膚老化の進行が加速されたマウスに特異的な物質であり、皮膚老化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被験物質を投与した「老化による皮膚症状を発症している動物又は皮膚老化の進行が加速された動物」の体液中におけるマーカー物質（Ｍ９）の濃度を指標として、被験物質が有する皮膚老化の改善効果又は進行遅延効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約２８０００のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、皮膚老化の改善効果、又は進行遅延効果を有すると評価することができる。
なお、ヒトの体液中にもマーカー物質（Ｍ１）〜（Ｍ９）と同等のタンパク質が存在する場合には、ヒトの体液中における当該タンパク質の濃度を指標として、皮膚老化の発症の有無、又は将来の発症リスクを診断できる可能性も示唆された。
１．マーカー物質（Ｍ３）の精製と同定
強陰イオン交換樹脂Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ（ＧＥヘルスケア社）を充填したカラム（１ｍＬ)を平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，１Ｍ 尿素，０．２２％ ＣＨＡＰＳ）にて平衡化した。ＩＣＲマウスヘパリン血漿（清水実験材料社）５００μＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）を７５０μＬ加えて４℃で２０分間変性処理した。変性処理したサンプルを、平衡化した前記カラムに添加した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、１００ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）、及び５０ｍＭ クエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．０）で順に洗浄した後、３３．３％ イソプロパノール，１６．７ アセトニトリル，０．１％ ＴＦＡで溶出し、ピーク画分を分取した。分取した画分に対してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ｍ３）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した。
強陰イオン交換樹脂Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ（ＧＥヘルスケア社）を充填したカラム（１ｍＬ)を平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，１Ｍ 尿素，０．２２％ ＣＨＡＰＳ）にて平衡化した。ＩＣＲマウスヘパリン血漿（清水実験材料社）５００μＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）を７５０μＬ加えて４℃で２０分間変性処理した。変性処理したサンプルを、平衡化した前記カラムに添加した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、１００ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）、及び５０ｍＭ クエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．０）で順に洗浄した後、３３．３％ イソプロパノール，１６．７ アセトニトリル，０．１％ ＴＦＡで溶出し、ピーク画分を分取した。分取した画分に対してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ｍ３）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した。
弱陽イオン交換樹脂ＨｉＴｒａｐ ＣＭ ＦＦ（ＧＥヘルスケア社）を充填したカラム（１ｍＬ）を５０ｍＭ クエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）にて平衡化した。分取した前記ピーク画分を、平衡化した前記カラムに添加した。５０ｍＭ クエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）でカラムを洗浄した後、１００ｍＭ ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ クエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）で溶出し、ピーク画分を分取した。分取した画分に対してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ｍ３）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した。
分取した画分の一部をアセトン沈殿処理した後、ポリペプチド分離用ゲル（１５−２０％）ＮＴＨ−５Ａ０Ｔゲル（ＤＲＣ社）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（図１０）。図１０中、レーン１，２はいずれも回収画分、Ｍは分子量マーカーである。分離された約６．０ｋＤａのバンド（図１０の矢印）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ｍ３）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図１１の矢印）。
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って約６．０ｋＤａのバンドを切り出し、還元アルキル化処理した後、０．０１μｇ／μＬのトリプシン溶液（５０ｍＭ 炭酸水素アンモニウム（ｐＨ８．０）に溶解）を作用させてゲル内で消化した。消化したサンプル１μＬを金属プレート上に滴下し、飽和ＣＨＣＡ溶液０．４μＬをさらに滴下して乾燥させた後、質量分析計Proteomics Analyzer 4700（アプライドバイオシステムズ社)で測定したところ、少なくとも２個のピークが検出され、それらの精密質量は、「１８５０．８４」及び「１９８１．９９」と算出された。これらのデータを元にＭａｓｃｏｔデータベース（マトリックスサイエンス社）によって既知タンパク質を検索し、ペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、これらのペプチドはそれぞれ配列番号９、１０で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「血清アルブミン」と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第１表に示す。既報の血清アルブミンのアミノ酸配列を配列番号１に示す。
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ってＰＶＤＦ膜に転写し、約６．０ｋＤａのバンド部分をＮ末端アミノ酸解析に供した。その結果、配列番号１１及び１２で表される各１０アミノ酸が決定された。これらのアミノ酸配列はマウス血清アルブミン（配列番号１）のＣ末端側の一部と完全一致していた。さらに、配列番号１のアミノ酸番号５５４（Ａｌａ）からＣ末端であるアミノ酸番号６０８（Ａｌａ）の部分に相当するタンパク質断片の予想される等電点が５．６５、分子量が６０１９であり、これらの値がＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果とよく一致した。このことから、マーカー物質（Ｍ３）は「血清アルブミンのＣ末端側の断片」と同定された。当該タンパク質断片に相当する、配列番号１のアミノ酸番号５５４（Ａｌａ）〜６０８（Ａｌａ）の部分のアミノ酸配列を配列番号７に示す。
２．マーカー物質（Ｍ４）と（Ｍ９）の精製と同定
弱陰イオン交換樹脂Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ ＤＥＡＥ（バイオラッド社）を充填したスピンカラム（５ｍＬ）を平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，１Ｍ 尿素，０．２２％ ＣＨＡＰＳ）にて平衡化した。３．０ｍＬのＩＣＲマウスヘパリン血漿（清水実験材料社）を２０，０００Ｇ、４℃で１０分間遠心し、上清を回収した。回収した上清２．５ｍＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）を３．７５ｍＬ加えて変性処理し、平衡化した前記カラムに添加した。非吸着画分を溶出させた後、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）で溶出し、ピーク画分を分取した。分取した画分に対してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ｍ４）又は（Ｍ９）と同等の質量／電荷比を示す各ピークを確認した。
弱陰イオン交換樹脂Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ ＤＥＡＥ（バイオラッド社）を充填したスピンカラム（５ｍＬ）を平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，１Ｍ 尿素，０．２２％ ＣＨＡＰＳ）にて平衡化した。３．０ｍＬのＩＣＲマウスヘパリン血漿（清水実験材料社）を２０，０００Ｇ、４℃で１０分間遠心し、上清を回収した。回収した上清２．５ｍＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）を３．７５ｍＬ加えて変性処理し、平衡化した前記カラムに添加した。非吸着画分を溶出させた後、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）で溶出し、ピーク画分を分取した。分取した画分に対してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ｍ４）又は（Ｍ９）と同等の質量／電荷比を示す各ピークを確認した。
回収した画分の一部をアセトン沈殿処理した後、ポリペプチド分離用ゲル（１５−２０％）ＮＴＨ−５Ａ０Ｔゲル（ＤＲＣ社）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（図１２）。図１２中、レーン１，２はいずれも回収画分、Ｍは分子量マーカーである。分離された約２８．０ｋＤａのバンド（図１２の矢印ａ）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ｍ９）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図１３の矢印）。
同様に、分離された約２１．４ｋＤａのバンド（図１２の矢印ｂ）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ｍ４）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図１４の矢印）。
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って約２１．４ｋＤａのバンドを切り出し、上記１と同様にしてゲル内消化及び質量分析を行ったところ、少なくとも１４個のピークが検出され、それらの精密質量は「１１５５．６２」、「１４８５．７７」、「１２２６．６４」、「２７０５．１４」、「２０７９．９４」、「３１４６．４５」、「１０８５．５２」、「１２４１．６２」、「１３６０．６６」、「１０７６．５１」、「１５２３．７３」、「２２３７．０４」、「１７８９．８２」、及び「２１０４．９７」と算出された。これらのデータを元に上記１と同様にしてペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、これらのペプチドはそれぞれ配列番号１３〜２６で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「血漿レチノール結合タンパク質」と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第２表に示す。既報の血漿レチノール結合タンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に示す。
同様に、約２８．０ｋＤａのバンドを切り出し、ゲル内消化及び質量分析を行ったところ、少なくとも２１個のピークが検出され、それらの精密質量は「１８５２．５３」、「１２６５．８８」、「１３９４．０６」、「１２３６．８６」、「１５９６．３５」、「１３４０．０１」、「１５９６．３５」、「１０９８．７７」、「８４２．５１」、「１０４６．６８」、「１３１７．９６」、「１１２９．７３」、「８２６．４７」、「１２９６．９０」、「１９９７．８０」、「１８８５．６８」、「１３３０．９３」、「１０３９．７１」、「１３００．４９」、「１５６１．２６」、及び「９８９．６０」と算出された。これらのデータを元に上記１と同様にしてペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、これらのペプチドはそれぞれ配列番号２７〜４７で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「アポリポタンパク質Ａ１」と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第３表に示す。既報のアポリポタンパク質Ａ１のアミノ酸配列を配列番号６に示す。
３．マーカー物質（Ｍ５）の精製と同定
強陰イオン交換樹脂Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ（ＧＥヘルスケア社）を充填したスピンカラム（５ｍＬ)を平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，１Ｍ 尿素，０．２２％ ＣＨＡＰＳ）にて平衡化した。１．５ｍＬのマウスヘパリン血漿（Ｐｅｌｆｒｅｅｚ社）を２０，０００Ｇ、４℃で１０分間遠心し、上清を回収した回収した上清１．０ｍＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）を１．５ｍＬ加えて変性処理し、平衡化した前記カラムに添加した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）でカラムを洗浄した後、５０ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）で溶出し（２段階）、各画分を分取した。分取した画分（２種）に対してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ｍ５）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した。
強陰イオン交換樹脂Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ（ＧＥヘルスケア社）を充填したスピンカラム（５ｍＬ)を平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，１Ｍ 尿素，０．２２％ ＣＨＡＰＳ）にて平衡化した。１．５ｍＬのマウスヘパリン血漿（Ｐｅｌｆｒｅｅｚ社）を２０，０００Ｇ、４℃で１０分間遠心し、上清を回収した回収した上清１．０ｍＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）を１．５ｍＬ加えて変性処理し、平衡化した前記カラムに添加した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）でカラムを洗浄した後、５０ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）で溶出し（２段階）、各画分を分取した。分取した画分（２種）に対してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ｍ５）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した。
弱陽イオン交換樹脂ＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＨＰ（ＧＥヘルスケア社）を充填したカラム（１ｍＬ）を５０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．０）にて平衡化した。分取した前半の画分２．０ｍＬに対して８ｍＬの５０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．０）を加えて希釈した後（５倍希釈）、平衡化した前記カラムに添加した。５０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭのＮａＣｌを含有する５０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．０）でカラムを順次洗浄した後、１Ｍ ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．０）で溶出し、ピーク画分を回収した。分取した画分に対してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ｍ５）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した。
回収した画分をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（５ｋＤａカット、ミリポア社）で脱塩及び濃縮した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（７．５％ゲル）を行った（図１５）。図１５中、レーン１，２はいずれも回収画分、Ｍは分子量マーカーである。分離された約６０ｋＤａのバンド（図１５の矢印）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ｍ５）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図１６の矢印）。
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って約６０ｋＤａのバンドを切り出し、上記１と同様にしてゲル内消化及び質量分析を行ったところ、少なくとも１０個のピークが検出され、それらの精密質量は、「７９３．４６」、「１１００．５７」、「１１２８．６２」、「１２１２．７３」、「１５０４．９１」、「１５１６．８２」、「１７２７．９２」、「１８５６．０２」、「２４４８．３８」、及び「２４７２．３７」と算出された。これらのデータを元に上記１と同様にしてペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、これらのペプチドはそれぞれ配列番号４８〜５７で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「ヘモペキシン」と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第３表に示す。既報のヘモペキシンのアミノ酸配列を配列番号３に示す。
４．マーカー物質（Ｍ７）の精製と同定
弱陰イオン交換樹脂Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ ＤＥＡＥ（バイオラッド社）を充填したスピンカラム（１ｍＬ）を平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，１Ｍ 尿素，０．２２％ ＣＨＡＰＳ）にて平衡化した。マウスヘパリン血漿（Ｐｅｌｆｒｅｅｚ社）１ｍＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）１．５ｍＬを加えて変性処理し、平衡化した前記カラムに添加した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で順次洗浄した後、１００ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）で溶出し、ピーク画分を分取した。分取した画分に対してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ｍ７）と同等の質量／電荷比を示す約４．４ｋのピーク、並びに、約４．２ｋのピークを確認した。
弱陰イオン交換樹脂Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ ＤＥＡＥ（バイオラッド社）を充填したスピンカラム（１ｍＬ）を平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，１Ｍ 尿素，０．２２％ ＣＨＡＰＳ）にて平衡化した。マウスヘパリン血漿（Ｐｅｌｆｒｅｅｚ社）１ｍＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）１．５ｍＬを加えて変性処理し、平衡化した前記カラムに添加した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で順次洗浄した後、１００ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）で溶出し、ピーク画分を分取した。分取した画分に対してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ｍ７）と同等の質量／電荷比を示す約４．４ｋのピーク、並びに、約４．２ｋのピークを確認した。
弱陽イオン交換樹脂ＨｉＴｒａｐ ＣＭ ＦＦ（ＧＥヘルスケア社）を充填したカラム（１ｍＬ）を１００ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．０）で平衡化した。分取した画分を１００ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．０）で１０倍希釈した後、ステリフリップＨＶ０．４５μｍ（ミリポア社）でろ過した。ろ過したサンプルを、平衡化した前記カラムに添加した。１００ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．０）、及び５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する同バッファーで順次カラムを洗浄した後、１００ｍＭ ＮａＣｌを含有する同バッファーで溶出（画分Ｉ）、さらに１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する同バッファーで溶出（画分ＩＩ）した。各画分に対してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行った。その結果、画分Ｉではマーカー物質（Ｍ７）と同等の質量／電荷比を示す約４．４ｋＤａのピークに加えて約４．２ｋＤａのピークが検出された。一方、画分ＩＩでは約４．２ｋＤａのピークが検出されたが、約４．４ｋＤａの明確なピークは検出されなかった。これら２種の物質は物理化学的性質が互いに似ており、約４．４ｋＤａの物質を単離精製することが困難であった。そのため、画分ＩとＩＩとの差分の解析を行うことを試みた。
回収した各画分（Ｉ、ＩＩ）の一部をＴＣＡ沈殿処理した後、ポリペプチド分離用ゲル（１５−２０％）ＮＴＨ−５Ａ０Ｔゲル（ＤＲＣ社）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（図１６）。図１６中、レーン１は画分Ｉ、レーン２は画分ＩＩ、Ｍは分子量マーカーである。レーン１で分離された約４．２〜４．４ｋＤａのバンド（図１７のバンドＡ）、レーン２で分離された同様のバンド（図１７のバンドＢ）をそれぞれ切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行った。その結果、バンドＡ（画分Ｉ）からは、マーカー物質（Ｍ７）と同等の質量／電荷比を示す約４．４ｋＤａのピークに加えて約４．２ｋＤａのピークが検出された（図１８（ａ））。一方、バンドＢ（画分ＩＩ）からは、約４．２ｋＤａのピークが主に検出されたが、約４．４ｋＤａのピークも微量ながら検出された（図１８（ｂ））。
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ってバンドＢ（画分ＩＩ、約４．２ｋＤａ）を切り出し、上記１と同様にしてゲル内消化及び質量分析を行ったところ、少なくとも１個のピークが検出され、その精密質量は「２６４８．３５」と算出された。このデータを元に上記１と同様にしてペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、このペプチドはそれぞれ配列番号５８で表わされるアミノ酸配列（ＦＤＨＰＦＬＦＩＩＦＥＥＨＴＱＳＰＩＦＶＧＫ）のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「α１−アンチトリプシン１−２」と同定され、さらに、予想される分子量（４０２１）から「α１−アンチトリプシン１−２のＣ末端側３６アミノ酸からなる断片」（配列番号８）と同定された。既報のα１−アンチトリプシン１−２のアミノ酸配列を配列番号３に示す。
さらに、バンドＡ（画分Ｉ、約４．４ｋＤａ＋約４．２ｋＤａ）についてペプチドマスフィンガープリンティングを行っても全く同じペプチドが検出され、差分に相当するペプチドは検出されなかった。このことから、約４．４ｋＤａのタンパク質は約４．２ｋＤａのタンパク質の修飾体と考えられた。これらの分子量の差は１６３であり、修飾の可能性として、Ｎ末端のＳｅｒのチロシン化や、酸化されたＭｅｔのＮ末端への付加が考えられた。
５．マーカー物質（Ｍ８）の精製と同定
強陰イオン交換樹脂Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ（ＧＥヘルスケア社）を充填したスピンカラム（１ｍＬ)を平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０），１Ｍ 尿素，０．２２％ ＣＨＡＰＳ）にて平衡化した。Ｃ５７ＢＬマウス血漿（清水実験材料社）５００μＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０），９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）を７５０μＬ加えて変性処理し、平衡化した前記カラムに添加した。非吸着画分を回収し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにて精製度を確認した。
強陰イオン交換樹脂Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ（ＧＥヘルスケア社）を充填したスピンカラム（１ｍＬ)を平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０），１Ｍ 尿素，０．２２％ ＣＨＡＰＳ）にて平衡化した。Ｃ５７ＢＬマウス血漿（清水実験材料社）５００μＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０），９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）を７５０μＬ加えて変性処理し、平衡化した前記カラムに添加した。非吸着画分を回収し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにて精製度を確認した。
回収した画分の一部をアセトン沈殿処理した後、ポリペプチド分離用ゲル（１５−２０％）ＮＴＨ−５Ａ０Ｔ（ＤＲＣ社）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。図１９に結果を示す。図１９中、レーン１〜６はいずれも回収画分、Ｍは分子量マーカーである。分離された約７．０ｋＤａのバンド（図１９の矢印）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ｍ８）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図２０のａ）。
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って約７．０ｋＤａのバンドを切り出し、上記１と同様にしてゲル内消化及び質量分析を行ったところ、少なくとも３個のピークが検出され、それらの精密質量は、「１２７９．７０」、「１２９９．７１」、及び「１０４２．５３」と算出された。これらのデータを元にＭａｓｃｏｔデータベース（マトリックスサイエンス社）によって既知タンパク質を検索し、ペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、精密質量「１２７９．７０」、「１２９９．７１」、及び「１０４２．５３」のペプチドはそれぞれ配列番号５９〜６１で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「アポリポタンパク質Ｃ１」と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第５表に示す。既報のアポリポタンパク質Ｃ１のアミノ酸配列は配列番号５に示すとおりである。
なお、図２０に示すように、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析においてマーカー物質（Ｍ８）よりも小さい質量（約６．８ｋＤａ）を示すピークも検出された（図２０のｂ）。これら２種のタンパク質は性質が非常に似ていること、並びに、質量の値の比較から、ピークｂのタンパク質はアポリポタンパク質Ｃ１（配列番号５）のＮ末端の２アミノ酸（Ａｌａ−Ｐｒｏ）が欠損した「アポリポタンパク質Ｃ１の修飾体」であると考えられた。アミノ酸配列から計算される質量は、ピークａが６９９３Ｄａ、ピークｂが６８２５Ｄａであった。
Claims (15)
- 老化による皮膚症状を発症している動物又は皮膚老化の進行が加速された動物に被験物質を投与して、該動物の体液中における下記マーカー物質（Ｍ１）〜（Ｍ９）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、被験物質が有する皮膚老化の改善効果又は進行遅延効果を評価することを特徴とする皮膚老化改善・進行遅延効果の評価方法（但し、医療行為を除く。さらに、マーカー物質（Ｍ１）、（Ｍ２）、及び（Ｍ６）の濃度の測定方法は、質量／電荷比を指標とする方法に限る）。
（Ｍ１）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４６２０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５７４０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ３）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６０３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ４）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２１４００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ５）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５９６００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ６）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４０２０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ７）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４３９０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ８）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７０３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ９）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２８０００のイオンピークを生じるタンパク質、であり、
さらに、
マーカー物質（Ｍ３）は配列番号９又は１０で表されるアミノ酸配列を含み、
マーカー物質（Ｍ４）は配列番号１３〜２６で表される少なくとも１つのアミノ酸配列を含み、
マーカー物質（Ｍ５）は配列番号４８〜５７で表される少なくとも１つのアミノ酸配列を含み、
マーカー物質（Ｍ７）は配列番号５８で表されるアミノ酸配列を含み、
マーカー物質（Ｍ８）は配列番号５９〜６１で表される少なくとも１つのアミノ酸配列を含み、
マーカー物質（Ｍ９）は配列番号２７〜４７で表される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む。 - 老化による皮膚症状を発症している動物又は皮膚老化の進行が加速された動物に被験物質を投与して、該動物の体液中における下記マーカー物質（Ｍ１）〜（Ｍ９）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、被験物質が有する皮膚老化の改善効果又は進行遅延効果を評価することを特徴とする皮膚老化改善・進行遅延効果の評価方法（但し、医療行為を除く。さらに、マーカー物質（Ｍ１）、（Ｍ２）、及び（Ｍ６）の濃度の測定方法は、質量／電荷比を指標とする方法に限る）。
（Ｍ１）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４６２０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５７４０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ３）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６０３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ４）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２１４００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ５）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５９６００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ６）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４０２０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ７）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４３９０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ８）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７０３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ９）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２８０００のイオンピークを生じるタンパク質、であり、
さらに、
マーカー物質（Ｍ３）は血清アルブミン又はその修飾体であり、
マーカー物質（Ｍ４）は血漿レチノール結合タンパク質又はその修飾体であり、
マーカー物質（Ｍ５）はヘモペキシン又はその修飾体であり、
マーカー物質（Ｍ７）はα１−アンチトリプシン１−２又はその修飾体であり、
マーカー物質（Ｍ８）はアポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体であり、
マーカー物質（Ｍ９）はアポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体である。 - 老化による皮膚症状を発症している動物又は皮膚老化の進行が加速された動物に被験物質を投与して、該動物の体液中における下記マーカー物質（Ａ１）〜（Ａ６）のいずれかに属する少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、被験物質が有する皮膚老化の改善効果又は進行遅延効果を評価することを特徴とする皮膚老化改善・進行遅延効果の評価方法（但し、医療行為を除く）。
（Ａ１）血清アルブミン又はその修飾体、
（Ａ２）血漿レチノール結合タンパク質又はその修飾体、
（Ａ３）ヘモペキシン又はその修飾体、
（Ａ４）α１−アンチトリプシン１−２又はその修飾体、
（Ａ５）アポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体、
（Ａ６）アポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体。 - 前記基準値は、老化による皮膚症状を発症している動物又は皮膚老化の進行が加速された動物に、皮膚老化の改善効果又は進行遅延効果を有さない既知物質を投与した際の、該動物の体液中における前記マーカー物質の濃度であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の皮膚老化改善・進行遅延効果の評価方法。
- 前記老化による皮膚症状を発症している動物又は皮膚老化の進行が加速された動物は、紫外線照射下で飼育された無毛動物であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の皮膚老化改善・進行遅延効果の評価方法。
- 前記被験物質を経口的又は経皮的に投与することを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の皮膚老化改善・進行遅延効果の評価方法。
- 前記体液は、血液であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の皮膚老化改善・進行遅延効果の評価方法。
- 前記被験物質は、食品素材、化粧品素材、又は医薬品素材であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の皮膚老化改善・進行遅延効果の評価方法。
- 前記体液又は体液成分を、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体に接触させて、体液中の前記マーカー物質を担体上に捕捉し、捕捉された前記マーカー物質の量に基づいて体液中の前記マーカー物質の濃度を算出することを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の皮膚老化改善・進行遅延効果の評価方法。
- 前記担体は平面部分を有し、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、該平面部分の一部に固定化されていることを特徴とする請求項９に記載の皮膚老化改善・進行遅延効果の評価方法。
- 前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体又は抗体であることを特徴とする請求項９又は１０に記載の皮膚老化改善・進行遅延効果の評価方法。
- 請求項１〜１１のいずれか１項に記載の皮膚老化改善・進行遅延効果の評価方法によって被験物質を評価し、皮膚老化の改善効果又は進行遅延効果を有する物質をスクリーニングすることを特徴とする物質のスクリーニング方法。
- 動物の体内に存在する下記（Ｍ１）〜（Ｍ９）の少なくとも１つのタンパク質の、皮膚老化のマーカーとしての使用（但し、医療行為を除く。さらに、マーカー物質（Ｍ１）、（Ｍ２）、及び（Ｍ６）の検出は、質量／電荷比を指標とする方法に限る）。
（Ｍ１）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４６２０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５７４０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ３）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６０３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ４）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２１４００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ５）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５９６００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ６）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４０２０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ７）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４３９０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ８）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７０３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ９）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２８０００のイオンピークを生じるタンパク質、であり、
さらに、
マーカー物質（Ｍ３）は配列番号９又は１０で表されるアミノ酸配列を含み、
マーカー物質（Ｍ４）は配列番号１３〜２６で表される少なくとも１つのアミノ酸配列を含み、
マーカー物質（Ｍ５）は配列番号４８〜５７で表される少なくとも１つのアミノ酸配列を含み、
マーカー物質（Ｍ７）は配列番号５８で表されるアミノ酸配列を含み、
マーカー物質（Ｍ８）は配列番号５９〜６１で表される少なくとも１つのアミノ酸配列を含み、
マーカー物質（Ｍ９）は配列番号２７〜４７で表される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む。 - 動物の体内に存在する下記（Ｍ１）〜（Ｍ９）の少なくとも１つのタンパク質の、皮膚老化のマーカーとしての使用（但し、医療行為を除く。さらに、マーカー物質（Ｍ１）、（Ｍ２）、及び（Ｍ６）の検出は、質量／電荷比を指標とする方法に限る）。
（Ｍ１）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４６２０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５７４０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ３）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６０３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ４）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２１４００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ５）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５９６００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ６）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４０２０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ７）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４３９０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ８）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７０３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ９）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２８０００のイオンピークを生じるタンパク質、であり、
さらに、
マーカー物質（Ｍ３）は血清アルブミン又はその修飾体であり、
マーカー物質（Ｍ４）は血漿レチノール結合タンパク質又はその修飾体であり、
マーカー物質（Ｍ５）はヘモペキシン又はその修飾体であり、
マーカー物質（Ｍ７）はα１−アンチトリプシン１−２又はその修飾体であり、
マーカー物質（Ｍ８）はアポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体であり、
マーカー物質（Ｍ９）はアポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体である。 - 動物の体内に存在する下記（Ａ１）〜（Ａ６）の少なくとも１つのタンパク質の、皮膚老化のマーカーとしての使用（但し、医療行為を除く）。
（Ａ１）血清アルブミン又はその修飾体、
（Ａ２）血漿レチノール結合タンパク質又はその修飾体、
（Ａ３）ヘモペキシン又はその修飾体、
（Ａ４）α１−アンチトリプシン１−２又はその修飾体、
（Ａ５）アポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体、
（Ａ６）アポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体。
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| JP2008180348A JP5468218B2 (ja) | 2008-07-10 | 2008-07-10 | 皮膚老化改善・進行遅延効果の評価方法、物質のスクリーニング方法、並びに、マーカーとしての使用 |
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