JP3869722B2 - 細胞死の検出方法及び検出試薬 - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は、細胞死の検出方法及び検出試薬に関する。
背景技術
骨髄移植後に起きる多臓器を傷害する疾患である移植片対宿主反応疾患（ＧＶＨＤ）や、血球が貧食細胞に貧食される疾患である血球貧食症候群（ｈｅｍｏｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ；ＨＰＳ）そのうち特にウイルス感染後に起こるウイルス関連血球貧食症候群（Ｖｉｒｕｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｈｅｍｏｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ；ＶＡＨＳ）などは、臓器不全を生じ最後に死に到る重篤な病気である。現在これらの疾患の診断は、生検などによる細胞学診断が一般的であるが、検査における患者の苦痛、診断までの時間や操作法において欠点を持っている。
近年、ＧＶＨＤ及びＨＰＳの主な原因が、生体内の細胞のアポトーシスによることが明らかになり、アポトーシスを検出することによりＧＶＨＤ及びＨＰＳを診断することが可能ではないかと考えられるようになった。
アポトーシスを検出する方法として、従来から１）形態学的方法、２）組織化学的方法、３）生化学的方法、及び、４）免疫化学的方法が用いられている。
１）形態学的方法：アポトーシスに特異的に生じるＤＮＡ断片化を染色法で検出するクロマチン凝縮判定法やアポトーシスに特有な形態的変化を電子顕微鏡観察や細胞サイズの測定により検出する方法が用いられている。
２）組織化学的方法：ＤＮＡ断片の末端に、標識したヌクレオチドを結合させ、蛍光顕微鏡で検出する方法が用いられており、別法として、細胞内物質の量を個々の細胞について測定するフローサイトメトリー法を用いることも行われている。
３）生化学的方法：アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡラダーを検出する方法が用いられており、現在アポトーシスの最も確かな証明法とされているが、組職あるいは細胞群全体からＤＮＡを抽出するのでアポトーシス細胞の割合が多くないと感度及び定量性に問題があると言われている。
４）免疫化学的方法：ヒストン結合ＤＮＡ断片（モノヌクレオソームあるいはオリゴヌクレオソーム）を検出する固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）（セルデテクションＥＬＩＳＡ：Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，国産化学）が開発されている。
しかしこれらの方法には、手技が複雑である、感度及び定量性が悪い等の問題点があり、ＧＶＨＤ及びＨＰＳを診断する方法としては実用化に到っていないのが現状である。
発明の開示
本発明の課題は、生体内で起こっているアポトーシスを検出するための、簡便で感度及び定量性に優れた方法及び試薬を開発することにある。
チトクロムＣは、ミトコンドリアにおける電子伝達系の重要な蛋白質として知られているが、細胞がアポトーシスの引き金となる刺激に曝され、アポトーシスの状態になると、ミトコンドリアにあったチトクロムＣが急速にサイトゾルへと放出されることが報告されている（Ｄｉｎｓｄａｌｅ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５５：６０７−１８，１９９９）。そしてサイトゾルのチトクロムＣは、アポトーシスのキーファクターであるカスパーゼ（ｃａｓｐａｓｅ）−３の活性化に関与し、チトクロムＣの増加が、アポトーシス進行と関係することが報告されている（Ｍｅｄｉｎａ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５７：３６９７−７０７，１９９９）。
本発明者らは、生体内でアポトーシスが起これば、ミトコンドリアより放出されたチトクロムＣが、血中でも測定できるのではないかと考えた。そして、チトクロムＣを測定するＥＬＩＳＡを確立し、血中のチトクロムＣの量がＧＶＨＤ、ＨＰＳ、急性リンパ性白血病及びインフルエンザ脳症の進行と強く相関することを見出して、本発明を完成するに到った。
すなわち本発明は、下記のような、体液中のチトクロムＣを定量することにより、生体内で起こっている細胞死を検出する方法、並びに、その方法に使用できるチトクロムＣの測定方法及びチトクロムＣ測定試薬を提供する。
（１）体液中のチトクロムＣを定量し、定量値に基づいて細胞死を検出することを含む、細胞死を検出する方法。
（２）チトクロムＣを免疫化学的方法により定量する、（１）の細胞死を検出する方法。
（３）体液中のチトクロムＣをサンドイッチ法により定量することを含む、チトクロムＣを測定する方法。
（４）チトクロムＣに対する抗体を構成成分とする、体液中のチトクロムＣのサンドイッチ法による定量用のチトクロムＣ測定試薬。
（５）細胞死の検出用である、（４）のチトクロムＣ測定試薬。
（６）移植片対宿主反応疾患（ＧＶＨＤ）の診断用である、（４）のチトクロムＣ測定試薬。
（７）血球貧食症候群（ＨＰＳ）の診断用である、（４）のチトクロムＣ測定試薬。
（８）急性リンパ性白血病の診断用である、（４）のチトクロムＣ測定試薬。
（９）ウイルス性脳炎・脳症の診断用である、（４）に記載のチトクロムＣ測定試薬。
（１０）ウイルス性脳炎・脳症がインフルエンザ脳炎・脳症である、（１０）に記載のチトクロムＣ測定試薬。
発明を実施するための最良の形態
以下に本発明の実施の形態について詳細に説明する。
アポトーシスシグナルを受けて、ミトコンドリアから細胞質に移行したチトクロムＣは、細胞死の結果、細胞膜が崩壊することにより細胞外へ放出されると考えられる。本発明は、細胞死により細胞外へ放出されたチトクロムＣが、体液中例えば血液中のチトクロムＣの定量によって検出可能であり、体液中のチトクロムＣを定量することによって生体内で起こっている細胞死を検出できることを見出したことに基づくものである。従って、体液中のチトクロムＣを定量することにより、細胞死を検出する方法であれば、本発明に含まれるものである。
ここで細胞死とは、主にアポトーシスを指すものであるが、一般的に生体内で起こっている細胞死がアポトーシスであることを特定することは容易ではなく、体液中のチトクロムＣの増加を伴う細胞死であれば、本発明における細胞死に含まれる。
また体液とは、生体より採取された血液、血漿、血清、脳脊髄液等を意味するものである。
チトクロムＣを測定する方法としては、免疫化学的方法、電気泳動による方法、クロマトグラフィーによる方法等が考えられる。電気泳動による方法としては、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ってチトクロムＣをバンドとして検出する方法、キャピラリー電気泳動でピークとして検出する方法等がある。また、クロマトグラフィーによる方法としては、高速液体クロマトグラフィーでピークとして検出する方法等がある。場合によっては感度を上げるために、蛍光標識することも許されるが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
チトクロムＣを測定する方法としては、感度及び簡便性から免疫化学的方法が好ましい。ここで免疫化学的方法とは、チトクロムＣに対する抗体を用いて、チトクロムＣを定量する方法である。免疫化学的方法としては、チトクロムＣを標識する競合法、抗体を標識するサンドイッチ法、抗体コートしたビーズの凝集を観察するラテックスビーズ法等、様々な方法があるが、チトクロムＣに対する抗体を用いた方法であれば、本発明の好ましい態様に含まれる。抗体はモノクローナル抗体でも、ポリクローナル抗体でも良い。また標識する方法にも、放射性同位元素による標識、電気化学発光する化合物による標識、蛍光標識、酵素標識、ビオチン標識等、様々な方法があるが、本発明はこれらの例に限られるものではない。
チトクロムＣを測定する免疫化学的方法の例として、以下にサンドイッチ法についてステップを追って説明する。
１）チトクロムＣに対する抗体をビーズ又はカップ上に固相化する。ビーズはマイクロビーズでもよく、その場合は磁性体のマイクロビーズが好ましい。固相化は、共有結合により結合させても非共有結合により結合させても構わない。通常、ビーズ又はカップ上の非特異的な結合部位をふさぐため、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン等の蛋白質、又は、Ｔｗｅｅｎ ２０等の界面活性剤でブロッキング操作を行う。
２）検体を、必要であればＢＳＡ、カゼイン等の蛋白質、又は、Ｔｗｅｅｎ ２０等の界面活性剤を含むバッファーで希釈し、ビーズ又はカップに加える。また、既知の量のチトクロムＣも同様に希釈して加える。
３）ビーズ又はカップを、できればＴｗｅｅｎ ２０等の界面活性剤を含むバッファーで洗浄後、できればＢＳＡ、カゼイン等の蛋白質、又は、Ｔｗｅｅｎ ２０等の界面活性剤を含むバッファーで希釈された標識抗体を加える。
４）ビーズ又はカップを、できればＴｗｅｅｎ ２０等の界面活性剤を含むバッファーで洗浄後、標識に応じた方法で測定する。例えば、放射性標識であれば放射活性を、酵素標識であれば酵素活性を測定する。また、ビオチン化標識であれば更に標識アビジンを加えて、標識に応じた方法で測定する。
５）既知量のチトクロムＣから検量線を作成し、検体中に含まれるチトクロムＣ量を計算する。
以上のステップにより、検体中のチトクロムＣが定量される。
チトクロムＣの定量値が正常値よりも高い場合に、細胞死が検出されたとすることができる。
また本発明は、体液中のチトクロムＣをサンドイッチ法により定量することを含むチトクロムＣを測定する方法に関する。サンドイッチ法は、固定化抗体と標識抗体により抗原がサンドイッチされた状態を利用する、ＥＬＩＳＡなどの免疫化学的方法である。
チトクロムＣを免疫化学的方法により測定する方法としては、ドットブロット法が多く用いられている（Ｓｏｕｉｃｈｉ Ａ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍ．２７３：１９８９２−４，１９９８）。しかしながら、この方法はチトクロムＣの含有量が高く蛋白質濃度の低い細胞ホモジェネート中のチトクロムＣは測定できても、チトクロムＣの含有量が低く蛋白質濃度の高い体液中のチトクロムＣを高感度に定量するには不向きであった。本発明は、蛋白質濃度の高い体液中のチトクロムＣを高感度で定量するために、サンドイッチ法のＥＬＩＳＡを適用し、生体内で起こった細胞死で放出される程度に微量の、体液中のチトクロムＣをも検出できることを見出したものである。
更に本発明は、チトクロムＣに対する抗体を構成成分とする、体液中のチトクロムＣをサンドイッチ法により定量するチトクロムＣ測定試薬にも関する。測定試薬は、抗体として抗チトクロムＣ抗体を用いる以外は、通常のサンドイッチ法に用いられる試薬（キット）と同様の構成でよい。その一例としてサンドイッチ法によりチトクロムＣを測定する測定試薬は、例えば１）抗チトクロムＣ抗体コートカップ、抗チトクロムＣ抗体コートビーズなどの抗チトクロムＣ抗体コート固相、２）標識抗チトクロムＣ抗体、３）既知濃度のチトクロムＣ標準溶液、４）希釈液、５）洗浄液、を含有する試薬である。更に、酵素標識であれば、６）発色基質、７）反応停止液が含まれてもよい。
本発明で開示されるチトクロムＣの測定方法及び測定試薬により、細胞死の検出が可能になる。従って、アポトーシスを伴う様々な疾患の、鑑別や経過観察などの診断のための指標を提供することが可能となる。従って、細胞死の検出やアポトーシスを伴う疾患の診断を目的とするチトクロムＣの測定方法及び測定試薬が提供される。
ここでアポトーシスを伴う疾患とは、例えば以下の例があげられる。
１）生体防御を担う免疫系の細胞が発するシグナルにより、アポトーシスが引き起こされる疾患、例えばＧＶＨＤ、自己免疫性疾患（全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ（ＲＡ）、強皮症、シェーグレン症候群、多発性硬化症、インシュリン依存性糖尿病、潰瘍性大腸炎）。
２）ウイルス感染による細胞死、あるいはウイルスに感染した細胞に対して免疫系細胞が反応してアポトーシスが引き起こされる疾患、例えばウイルス関連血球貧食症候群（ＶＡＨＳ）、その他のウイルス感染（ＨＣＶ、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス）。
３）異常なアポトーシスシグナルによる細胞死が引き起こされる疾患、例えば神経変性疾患（アルツハイマー病、パーキンソン病）。
４）白血病、例えば急性リンパ性白血病。
５）人為的にアポトーシスが引き起こされる疾患、例えば放射線照射、薬剤（抗ガン剤など）投与などに対するもの。
６）全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）：生体に対する侵襲に反応して非特異的に免疫系が活性化し、サイトカイン産生が制御不能になり臓器障害が発生する疾患（ＨＰＳ、重症膵炎）。
ウイルス感染により引き起こされる疾患で、重篤でかつ後遺症として残りやすいのは、脳炎・脳症である。特にインフルエンザウイルスにより起こされる脳炎・脳症は、インフルエンザによる死亡原因の大きな割合を占めるにもかかわらず、熱性けいれんとの鑑別が難しく、的確な治療を行うための的確な早期診断の方法が求められている。本発明の測定方法及び測定試薬によれば的確な早期診断が可能になる。
体液中のチトクロムＣを測定することにより、生体内で進行している細胞死を測定することが可能となり、これら疾患の進行をモニターすることができる。特にＧＶＨＤ、血球貧食症候群（ＨＰＳ）、中でもウイルス関連血球貧食症候群（ＶＡＨＳ）、急性リンパ性白血病、及びインフルエンザ脳炎・脳症では、病状を把握するためにチトクロムＣを定量することは有用である。
発明者らによる更なる研究の結果、ＨＰＳ及びインフルエンザ脳症において、血中チトクロムＣの量が細胞死の指標とされるＬＤＨと良く相関することが確かめられ、更にチトクロムＣが、ＬＤＨに先行して増加及び減少することが明らかにされた。
体液中のチトクロムＣは、生体内で起こっている細胞死の良い指標であり、病態を早く的確に知るための有用な指標となり得る。
実施例
以下に、具体的な例をもって本発明を示すが、本発明はこれに限られるものではない。％は、特記しない限り質量％である。
［実施例１］チトクロムＣのＥＬＩＳＡによる測定
チトクロムＣの測定法は、以下の手順で実施する。
１）抗チトクロムＣ抗体の精製
ラットのチトクロムＣ（シグマ社）をウサギに免疫し、チトクロムＣに対する抗血清を得る。その抗血清に最終濃度２Ｍになるように硫安を添加し、室温（２０〜３０℃）で５時間撹拌する。撹拌した溶液を１００００回転で３０分遠心し上清を捨て、沈殿物を０．１Ｍリン緩衝液ｐＨ７．２で溶解後、同一緩衝液に対して透析する。透析した溶液は、ＣＮＢｒ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（ファルマシア社）にウシのチトクロムＣを結合させて得た担体のカラムに流す。０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む０．０１Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．５でカラムを洗浄後、０．１Ｍ塩酸グアニジンで抗チトクロムＣ抗体を溶出し、溶出液を、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む０．０１Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．５に対して透析し抗体（ＩｇＧ）精製物とする。
２）抗チトクロムＣ抗体Ｆ（ａｂ’）２の調製
精製したＩｇＧを０．１Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ４．２に対して透析する。透析したＩｇＧ溶液にペプシン（シグマ社）を質量濃度比で２０：１の割合になるように加え、３７℃で１６時間反応させる。反応後の溶液のｐＨを１Ｎ ＮａＯＨで７．５に調整した後、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む０．０１Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．５で平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００（ファルマシア社）カラムでゲル濾過を行う。ゲル濾過したフラクションの第一ピークを集め、濃縮し抗チトクロムＣ抗体Ｆ（ａｂ’）２液とする。
３）西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗チトクロムＣ抗体Ｆ（ａｂ’）２抗体の作製
４ｍｇ／ｍｌに調整したＨＲＰ（東洋紡）溶液の１ｍｌに０．１Ｍメタ過ヨウ素酸ナトリウムを６０μｌ加え、室温（２０〜３０℃）で２０分撹拌後、０．００１Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ４．４に対して透析する。透析後、０．２Ｍ炭酸ナトリウム液でｐＨ９．０〜９．５に調整する。この溶液に０．１Ｍ炭酸緩衝液ｐＨ９．５に対して透析した抗チトクロムＣ抗体Ｆ（ａｂ’）２溶液（４ｍｇ／ｍｌ）を１ｍｌ加え、室温（２０〜３０℃）で２時間撹拌する。４ｍｇ／ｍｌに調整した水素化ホウ素ナトリウム液を５０μｌ加え、４℃で２時間撹拌後、１６時間静置保存する。この溶液を０．１５Ｍ ＮａＣｌを含むリン酸緩衝液ｐＨ７．２に対して透析後、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００（ファルマシア社）カラムでゲル濾過を行う。ゲル濾過したフラクションの第一ピークを集め、２５％ウサギ血清（日本生物材料）を含む０．２Ｍリン酸二ナトリウム緩衝液ｐＨ５．４で希釈し、ＨＲＰ標識抗チトクロムＣ抗体Ｆ（ａｂ’）２液（標識抗体液）とする。
４）抗チトクロムＣ抗体固相化カップの作製
１）で得られたＩｇＧ精製物を、０．０１Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．５で吸光度０．１に調整する。この抗体溶液を、ポリスチレンカップに１００μｌ注入し４℃で１６時間反応させた後、ＥＩＡ法専用洗浄機によって０．１５Ｍ ＮａＣｌ及び０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含む０．０１Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．５で３回（各４秒間）洗浄する。洗浄したカップに、０．５％ウシアルブミンを含む０．０１Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．５を２００μｌ加え、再度４℃で１６時間反応させ固相化カップとする。
５）標準抗原の調製
ラットのチトクロムＣ（シグマ社）を、２％ ＢＳＡ、０．０１Ｍ ＥＤＴＡ ２Ｎａ、０．１％ ＮａＮ３、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０及び０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む０．０５Ｍトリス緩衝液ｐＨ７．５で希釈し、５０ｎｇ／ｍｌ〜０．０５ｎｇ／ｍｌの希釈液を作製する。
６）測定
抗チトクロムＣ抗体を固相化したカップ中のウシアルブミン液を吸い取り、全カップに、２％ ＢＳＡ、０．０１Ｍ ＥＤＴＡ ２Ｎａ、０．１％ ＮａＮ３、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０及び０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む０．０５Ｍトリス緩衝液ｐＨ７．５を５０μｌ注入する。そのカップに標準抗原希釈液及び検体を５０μｌ加え、室温（２０〜３０℃）で１時間反応させる。反応後、ＥＩＡ専用洗浄機を用い、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０、０．００１５Ｍ ＮａＣｌ、０．００１５％ パラオキシ安息香酸メチル及び０．００５％ ２−クロロアセトアミドを含む０．００５Ｍトリス緩衝液ｐＨ７．５で３回（各４秒間）洗浄する。洗浄後、標識抗体液を１００μｌ加え室温（２０〜３０℃）で１時間反応させる。反応後、ＥＩＡ専用洗浄機を用い０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．００１５％パラオキシ安息香酸メチル及び０．００５％ ２−クロロアセトアミドを含む０．００５Ｍトリス緩衝液ｐＨ７．５で３回（各４秒間）洗浄する。洗浄後、１．５ｍｇ／ｍｌのＡＢＴＳ（２，２−アジノ−ビス−（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）を含む０．１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ４．２を１００μｌ加え室温（２０〜３０℃）で１時間反応させ、次いで０．０１３％ ＮａＮ３液を１００μｌ加え反応を停止する。発色した溶液の４０５ｎｍの吸光度を分光光度計で測定する。
７）標準抗原曲線の特性
各濃度のチトクロムＣ及び検体の吸光度値からブランクの吸光度値を引く。横軸に標準抗原濃度、縦軸は標準抗原の吸光度をプロットし、標準曲線を描く。その標準抗原曲線を基に、検体中に含まれるチトクロムＣ量を計算する。
［実施例２］ＧＶＨＤ、ＨＰＳ及び急性リンパ性白血病患者血清中のチトクロムＣの定量
実施例１に記載したチトクロムＣのＥＬＩＳＡ系を用いて、ＧＶＨＤ、ＨＰＳ及び急性リンパ性白血病患者並びに健常人の血清中のチトクロムＣ量を測定した。
その結果、表１に示すように、健常人１５人では全て陰性（＜０．０５ｎｇ／ｍｌ）であったが、ＧＶＨＤでは６例中４例（６７％）、ＨＰＳでは４例中４例（１００％）、急性リンパ性白血病では２例中２例（１００％）が陽性であった。またＨＰＳでは、血中チトクロムＣ濃度の高い患者で、予後が悪い傾向が見られた。
アポトーシスが起こっていると考えられる患者の血清中では、明らかなチトクロムＣ定量値の高値が認められた。
また図１にはＨＰＳ患者血清中の、ＬＤＨ、ＡＳＴ、ＡＬＴ、フェリチン及びチトクロムＣの値の推移を示した。チトクロムＣはＬＤＨの値とほぼ相関し、更にＬＤＨに先行して推移して、病態の変化を鋭敏に捉える指標として有用であると考えられる。
［実施例３］インフルエンザ脳炎・脳症患者血清中のチトクロムＣの定量
実施例１に記載したＥＬＩＳＡ系を用いて、インフルエンザ患者のうち、高熱、熱性けいれん及び脳炎・脳症を伴った患者の血清中のチトクロムＣ量を測定した。
図２に、１症例で複数回測定した場合も含めて結果を示す。脳炎・脳症を伴った例では、全２７検体（８例）が５ｎｇ／ｍｌ以上の高値を示し、その中でも１７検体が３０ｎｇ／ｍｌ以上の高値を示していた。また、血中チトクロムＣの濃度が高い患者で、予後が悪い傾向が見られた。
熱性けいれんを繰り返していた患者の中にやや高値を示す患者がおり、これらの患者については、十分な注意が必要であろうと考えられた。高熱を伴う患者では、高値のチトクロムＣ定量値を示した患者がいなかった。
また図３には、インフルエンザ脳症を発症した患者の、血中ＧＯＴ、ＬＤＨ及びチトクロムＣの値の推移を示す。チトクロムＣはＬＤＨに先行して上昇及び下降し、チトクロムＣが脳症のインフルエンザ脳症の病態を反映する、先行指標として有用であることが示された。
［実施例４］インフルエンザ脳炎・脳症患者血清中の各種サイトカイン濃度
高熱、熱性けいれん及び脳炎・脳症を伴ったインフルエンザ患者の血清中の、Ｅ−セレクチン（ｓｅｌｅｃｔｉｎ）、可溶性トロンボモジュリン（ｓｏｌｕｂｌｅ ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ）（ｓＴＭ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、Ｆａｓ、ＦａｓＬ及びチトクロムＣの濃度を定量した。Ｅ−セレクチンはｓＥ−セレクチンＥＬＩＳＡキット（ｖｅｒｓｉｏｎ ２、Ｂｅｎｄｅｒ ｍｅｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ｓＴＭはＴＭテスト（Ｔｅｉｊｉｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）、ＴＮＦはヒトＴＮＦ−αサイトスクリーンイムノアッセイキット（Ｂｉｏｓｃｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）、ＦａｓはｓＦａｓ ＥＬＩＳＡキット、ＦａｓＬはｓＦａｓリガンドＥＬＩＳＡキット（共にＭｅｄｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）にて測定し、チトクロムＣは実施例１に記載したＥＬＩＳＡ系を用いて測定した。
図４に示すように、どのサイトカインも脳炎・脳症患者血清中で高値を示す例が増加したが、チトクロムＣが脳炎・脳症で最も顕著に増加し、脳炎・脳症の鑑別にはチトクロムＣが最も適していることが示された。
産業上の利用の可能性
本発明により、体液中のチトクロムＣを定量するのに適した免疫化学的方法が提供される。また、チトクロムＣは生体内で起こっている細胞死の良い指標であり、病態を早く的確に知るための有用な指標であることが明らかにされ、従って、チトクロムＣの測定は、アポトーシスが病態の進行に関わる疾患、特にＧＶＨＤ、ＨＰＳ、急性リンパ性白血病及びインフルエンザ脳炎・脳症の、鑑別及び経過観察などの診断に有用である。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＨＰＳ患者血清中のＬＤＨ、ＡＳＴ、ＡＬＴ、フェリチン及びチトクロムＣ（Ｃｙｔｏ−Ｃ）の値の推移を示す。
図２は、高熱、熱性けいれん及び脳炎・脳症を伴うインフルエンザ患者血清中のチトクロムＣ量を示す。
図３は、インフルエンザ脳症を発症した患者血中のＧＯＴ、ＬＤＨ及びチトクロムＣの値の椎移を示す。
図４は、高熱、熱性けいれん及び脳炎・脳症を伴うインフルエンザ患者血清中の各種サイトカイン量を示す。
本発明は、細胞死の検出方法及び検出試薬に関する。
背景技術
骨髄移植後に起きる多臓器を傷害する疾患である移植片対宿主反応疾患（ＧＶＨＤ）や、血球が貧食細胞に貧食される疾患である血球貧食症候群（ｈｅｍｏｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ；ＨＰＳ）そのうち特にウイルス感染後に起こるウイルス関連血球貧食症候群（Ｖｉｒｕｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｈｅｍｏｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ；ＶＡＨＳ）などは、臓器不全を生じ最後に死に到る重篤な病気である。現在これらの疾患の診断は、生検などによる細胞学診断が一般的であるが、検査における患者の苦痛、診断までの時間や操作法において欠点を持っている。
近年、ＧＶＨＤ及びＨＰＳの主な原因が、生体内の細胞のアポトーシスによることが明らかになり、アポトーシスを検出することによりＧＶＨＤ及びＨＰＳを診断することが可能ではないかと考えられるようになった。
アポトーシスを検出する方法として、従来から１）形態学的方法、２）組織化学的方法、３）生化学的方法、及び、４）免疫化学的方法が用いられている。
１）形態学的方法：アポトーシスに特異的に生じるＤＮＡ断片化を染色法で検出するクロマチン凝縮判定法やアポトーシスに特有な形態的変化を電子顕微鏡観察や細胞サイズの測定により検出する方法が用いられている。
２）組織化学的方法：ＤＮＡ断片の末端に、標識したヌクレオチドを結合させ、蛍光顕微鏡で検出する方法が用いられており、別法として、細胞内物質の量を個々の細胞について測定するフローサイトメトリー法を用いることも行われている。
３）生化学的方法：アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡラダーを検出する方法が用いられており、現在アポトーシスの最も確かな証明法とされているが、組職あるいは細胞群全体からＤＮＡを抽出するのでアポトーシス細胞の割合が多くないと感度及び定量性に問題があると言われている。
４）免疫化学的方法：ヒストン結合ＤＮＡ断片（モノヌクレオソームあるいはオリゴヌクレオソーム）を検出する固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）（セルデテクションＥＬＩＳＡ：Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，国産化学）が開発されている。
しかしこれらの方法には、手技が複雑である、感度及び定量性が悪い等の問題点があり、ＧＶＨＤ及びＨＰＳを診断する方法としては実用化に到っていないのが現状である。
発明の開示
本発明の課題は、生体内で起こっているアポトーシスを検出するための、簡便で感度及び定量性に優れた方法及び試薬を開発することにある。
チトクロムＣは、ミトコンドリアにおける電子伝達系の重要な蛋白質として知られているが、細胞がアポトーシスの引き金となる刺激に曝され、アポトーシスの状態になると、ミトコンドリアにあったチトクロムＣが急速にサイトゾルへと放出されることが報告されている（Ｄｉｎｓｄａｌｅ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５５：６０７−１８，１９９９）。そしてサイトゾルのチトクロムＣは、アポトーシスのキーファクターであるカスパーゼ（ｃａｓｐａｓｅ）−３の活性化に関与し、チトクロムＣの増加が、アポトーシス進行と関係することが報告されている（Ｍｅｄｉｎａ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５７：３６９７−７０７，１９９９）。
本発明者らは、生体内でアポトーシスが起これば、ミトコンドリアより放出されたチトクロムＣが、血中でも測定できるのではないかと考えた。そして、チトクロムＣを測定するＥＬＩＳＡを確立し、血中のチトクロムＣの量がＧＶＨＤ、ＨＰＳ、急性リンパ性白血病及びインフルエンザ脳症の進行と強く相関することを見出して、本発明を完成するに到った。
すなわち本発明は、下記のような、体液中のチトクロムＣを定量することにより、生体内で起こっている細胞死を検出する方法、並びに、その方法に使用できるチトクロムＣの測定方法及びチトクロムＣ測定試薬を提供する。
（１）体液中のチトクロムＣを定量し、定量値に基づいて細胞死を検出することを含む、細胞死を検出する方法。
（２）チトクロムＣを免疫化学的方法により定量する、（１）の細胞死を検出する方法。
（３）体液中のチトクロムＣをサンドイッチ法により定量することを含む、チトクロムＣを測定する方法。
（４）チトクロムＣに対する抗体を構成成分とする、体液中のチトクロムＣのサンドイッチ法による定量用のチトクロムＣ測定試薬。
（５）細胞死の検出用である、（４）のチトクロムＣ測定試薬。
（６）移植片対宿主反応疾患（ＧＶＨＤ）の診断用である、（４）のチトクロムＣ測定試薬。
（７）血球貧食症候群（ＨＰＳ）の診断用である、（４）のチトクロムＣ測定試薬。
（８）急性リンパ性白血病の診断用である、（４）のチトクロムＣ測定試薬。
（９）ウイルス性脳炎・脳症の診断用である、（４）に記載のチトクロムＣ測定試薬。
（１０）ウイルス性脳炎・脳症がインフルエンザ脳炎・脳症である、（１０）に記載のチトクロムＣ測定試薬。
発明を実施するための最良の形態
以下に本発明の実施の形態について詳細に説明する。
アポトーシスシグナルを受けて、ミトコンドリアから細胞質に移行したチトクロムＣは、細胞死の結果、細胞膜が崩壊することにより細胞外へ放出されると考えられる。本発明は、細胞死により細胞外へ放出されたチトクロムＣが、体液中例えば血液中のチトクロムＣの定量によって検出可能であり、体液中のチトクロムＣを定量することによって生体内で起こっている細胞死を検出できることを見出したことに基づくものである。従って、体液中のチトクロムＣを定量することにより、細胞死を検出する方法であれば、本発明に含まれるものである。
ここで細胞死とは、主にアポトーシスを指すものであるが、一般的に生体内で起こっている細胞死がアポトーシスであることを特定することは容易ではなく、体液中のチトクロムＣの増加を伴う細胞死であれば、本発明における細胞死に含まれる。
また体液とは、生体より採取された血液、血漿、血清、脳脊髄液等を意味するものである。
チトクロムＣを測定する方法としては、免疫化学的方法、電気泳動による方法、クロマトグラフィーによる方法等が考えられる。電気泳動による方法としては、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ってチトクロムＣをバンドとして検出する方法、キャピラリー電気泳動でピークとして検出する方法等がある。また、クロマトグラフィーによる方法としては、高速液体クロマトグラフィーでピークとして検出する方法等がある。場合によっては感度を上げるために、蛍光標識することも許されるが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
チトクロムＣを測定する方法としては、感度及び簡便性から免疫化学的方法が好ましい。ここで免疫化学的方法とは、チトクロムＣに対する抗体を用いて、チトクロムＣを定量する方法である。免疫化学的方法としては、チトクロムＣを標識する競合法、抗体を標識するサンドイッチ法、抗体コートしたビーズの凝集を観察するラテックスビーズ法等、様々な方法があるが、チトクロムＣに対する抗体を用いた方法であれば、本発明の好ましい態様に含まれる。抗体はモノクローナル抗体でも、ポリクローナル抗体でも良い。また標識する方法にも、放射性同位元素による標識、電気化学発光する化合物による標識、蛍光標識、酵素標識、ビオチン標識等、様々な方法があるが、本発明はこれらの例に限られるものではない。
チトクロムＣを測定する免疫化学的方法の例として、以下にサンドイッチ法についてステップを追って説明する。
１）チトクロムＣに対する抗体をビーズ又はカップ上に固相化する。ビーズはマイクロビーズでもよく、その場合は磁性体のマイクロビーズが好ましい。固相化は、共有結合により結合させても非共有結合により結合させても構わない。通常、ビーズ又はカップ上の非特異的な結合部位をふさぐため、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン等の蛋白質、又は、Ｔｗｅｅｎ ２０等の界面活性剤でブロッキング操作を行う。
２）検体を、必要であればＢＳＡ、カゼイン等の蛋白質、又は、Ｔｗｅｅｎ ２０等の界面活性剤を含むバッファーで希釈し、ビーズ又はカップに加える。また、既知の量のチトクロムＣも同様に希釈して加える。
３）ビーズ又はカップを、できればＴｗｅｅｎ ２０等の界面活性剤を含むバッファーで洗浄後、できればＢＳＡ、カゼイン等の蛋白質、又は、Ｔｗｅｅｎ ２０等の界面活性剤を含むバッファーで希釈された標識抗体を加える。
４）ビーズ又はカップを、できればＴｗｅｅｎ ２０等の界面活性剤を含むバッファーで洗浄後、標識に応じた方法で測定する。例えば、放射性標識であれば放射活性を、酵素標識であれば酵素活性を測定する。また、ビオチン化標識であれば更に標識アビジンを加えて、標識に応じた方法で測定する。
５）既知量のチトクロムＣから検量線を作成し、検体中に含まれるチトクロムＣ量を計算する。
以上のステップにより、検体中のチトクロムＣが定量される。
チトクロムＣの定量値が正常値よりも高い場合に、細胞死が検出されたとすることができる。
また本発明は、体液中のチトクロムＣをサンドイッチ法により定量することを含むチトクロムＣを測定する方法に関する。サンドイッチ法は、固定化抗体と標識抗体により抗原がサンドイッチされた状態を利用する、ＥＬＩＳＡなどの免疫化学的方法である。
チトクロムＣを免疫化学的方法により測定する方法としては、ドットブロット法が多く用いられている（Ｓｏｕｉｃｈｉ Ａ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍ．２７３：１９８９２−４，１９９８）。しかしながら、この方法はチトクロムＣの含有量が高く蛋白質濃度の低い細胞ホモジェネート中のチトクロムＣは測定できても、チトクロムＣの含有量が低く蛋白質濃度の高い体液中のチトクロムＣを高感度に定量するには不向きであった。本発明は、蛋白質濃度の高い体液中のチトクロムＣを高感度で定量するために、サンドイッチ法のＥＬＩＳＡを適用し、生体内で起こった細胞死で放出される程度に微量の、体液中のチトクロムＣをも検出できることを見出したものである。
更に本発明は、チトクロムＣに対する抗体を構成成分とする、体液中のチトクロムＣをサンドイッチ法により定量するチトクロムＣ測定試薬にも関する。測定試薬は、抗体として抗チトクロムＣ抗体を用いる以外は、通常のサンドイッチ法に用いられる試薬（キット）と同様の構成でよい。その一例としてサンドイッチ法によりチトクロムＣを測定する測定試薬は、例えば１）抗チトクロムＣ抗体コートカップ、抗チトクロムＣ抗体コートビーズなどの抗チトクロムＣ抗体コート固相、２）標識抗チトクロムＣ抗体、３）既知濃度のチトクロムＣ標準溶液、４）希釈液、５）洗浄液、を含有する試薬である。更に、酵素標識であれば、６）発色基質、７）反応停止液が含まれてもよい。
本発明で開示されるチトクロムＣの測定方法及び測定試薬により、細胞死の検出が可能になる。従って、アポトーシスを伴う様々な疾患の、鑑別や経過観察などの診断のための指標を提供することが可能となる。従って、細胞死の検出やアポトーシスを伴う疾患の診断を目的とするチトクロムＣの測定方法及び測定試薬が提供される。
ここでアポトーシスを伴う疾患とは、例えば以下の例があげられる。
１）生体防御を担う免疫系の細胞が発するシグナルにより、アポトーシスが引き起こされる疾患、例えばＧＶＨＤ、自己免疫性疾患（全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ（ＲＡ）、強皮症、シェーグレン症候群、多発性硬化症、インシュリン依存性糖尿病、潰瘍性大腸炎）。
２）ウイルス感染による細胞死、あるいはウイルスに感染した細胞に対して免疫系細胞が反応してアポトーシスが引き起こされる疾患、例えばウイルス関連血球貧食症候群（ＶＡＨＳ）、その他のウイルス感染（ＨＣＶ、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス）。
３）異常なアポトーシスシグナルによる細胞死が引き起こされる疾患、例えば神経変性疾患（アルツハイマー病、パーキンソン病）。
４）白血病、例えば急性リンパ性白血病。
５）人為的にアポトーシスが引き起こされる疾患、例えば放射線照射、薬剤（抗ガン剤など）投与などに対するもの。
６）全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）：生体に対する侵襲に反応して非特異的に免疫系が活性化し、サイトカイン産生が制御不能になり臓器障害が発生する疾患（ＨＰＳ、重症膵炎）。
ウイルス感染により引き起こされる疾患で、重篤でかつ後遺症として残りやすいのは、脳炎・脳症である。特にインフルエンザウイルスにより起こされる脳炎・脳症は、インフルエンザによる死亡原因の大きな割合を占めるにもかかわらず、熱性けいれんとの鑑別が難しく、的確な治療を行うための的確な早期診断の方法が求められている。本発明の測定方法及び測定試薬によれば的確な早期診断が可能になる。
体液中のチトクロムＣを測定することにより、生体内で進行している細胞死を測定することが可能となり、これら疾患の進行をモニターすることができる。特にＧＶＨＤ、血球貧食症候群（ＨＰＳ）、中でもウイルス関連血球貧食症候群（ＶＡＨＳ）、急性リンパ性白血病、及びインフルエンザ脳炎・脳症では、病状を把握するためにチトクロムＣを定量することは有用である。
発明者らによる更なる研究の結果、ＨＰＳ及びインフルエンザ脳症において、血中チトクロムＣの量が細胞死の指標とされるＬＤＨと良く相関することが確かめられ、更にチトクロムＣが、ＬＤＨに先行して増加及び減少することが明らかにされた。
体液中のチトクロムＣは、生体内で起こっている細胞死の良い指標であり、病態を早く的確に知るための有用な指標となり得る。
実施例
以下に、具体的な例をもって本発明を示すが、本発明はこれに限られるものではない。％は、特記しない限り質量％である。
［実施例１］チトクロムＣのＥＬＩＳＡによる測定
チトクロムＣの測定法は、以下の手順で実施する。
１）抗チトクロムＣ抗体の精製
ラットのチトクロムＣ（シグマ社）をウサギに免疫し、チトクロムＣに対する抗血清を得る。その抗血清に最終濃度２Ｍになるように硫安を添加し、室温（２０〜３０℃）で５時間撹拌する。撹拌した溶液を１００００回転で３０分遠心し上清を捨て、沈殿物を０．１Ｍリン緩衝液ｐＨ７．２で溶解後、同一緩衝液に対して透析する。透析した溶液は、ＣＮＢｒ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（ファルマシア社）にウシのチトクロムＣを結合させて得た担体のカラムに流す。０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む０．０１Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．５でカラムを洗浄後、０．１Ｍ塩酸グアニジンで抗チトクロムＣ抗体を溶出し、溶出液を、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む０．０１Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．５に対して透析し抗体（ＩｇＧ）精製物とする。
２）抗チトクロムＣ抗体Ｆ（ａｂ’）２の調製
精製したＩｇＧを０．１Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ４．２に対して透析する。透析したＩｇＧ溶液にペプシン（シグマ社）を質量濃度比で２０：１の割合になるように加え、３７℃で１６時間反応させる。反応後の溶液のｐＨを１Ｎ ＮａＯＨで７．５に調整した後、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む０．０１Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．５で平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００（ファルマシア社）カラムでゲル濾過を行う。ゲル濾過したフラクションの第一ピークを集め、濃縮し抗チトクロムＣ抗体Ｆ（ａｂ’）２液とする。
３）西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗チトクロムＣ抗体Ｆ（ａｂ’）２抗体の作製
４ｍｇ／ｍｌに調整したＨＲＰ（東洋紡）溶液の１ｍｌに０．１Ｍメタ過ヨウ素酸ナトリウムを６０μｌ加え、室温（２０〜３０℃）で２０分撹拌後、０．００１Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ４．４に対して透析する。透析後、０．２Ｍ炭酸ナトリウム液でｐＨ９．０〜９．５に調整する。この溶液に０．１Ｍ炭酸緩衝液ｐＨ９．５に対して透析した抗チトクロムＣ抗体Ｆ（ａｂ’）２溶液（４ｍｇ／ｍｌ）を１ｍｌ加え、室温（２０〜３０℃）で２時間撹拌する。４ｍｇ／ｍｌに調整した水素化ホウ素ナトリウム液を５０μｌ加え、４℃で２時間撹拌後、１６時間静置保存する。この溶液を０．１５Ｍ ＮａＣｌを含むリン酸緩衝液ｐＨ７．２に対して透析後、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００（ファルマシア社）カラムでゲル濾過を行う。ゲル濾過したフラクションの第一ピークを集め、２５％ウサギ血清（日本生物材料）を含む０．２Ｍリン酸二ナトリウム緩衝液ｐＨ５．４で希釈し、ＨＲＰ標識抗チトクロムＣ抗体Ｆ（ａｂ’）２液（標識抗体液）とする。
４）抗チトクロムＣ抗体固相化カップの作製
１）で得られたＩｇＧ精製物を、０．０１Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．５で吸光度０．１に調整する。この抗体溶液を、ポリスチレンカップに１００μｌ注入し４℃で１６時間反応させた後、ＥＩＡ法専用洗浄機によって０．１５Ｍ ＮａＣｌ及び０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含む０．０１Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．５で３回（各４秒間）洗浄する。洗浄したカップに、０．５％ウシアルブミンを含む０．０１Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．５を２００μｌ加え、再度４℃で１６時間反応させ固相化カップとする。
５）標準抗原の調製
ラットのチトクロムＣ（シグマ社）を、２％ ＢＳＡ、０．０１Ｍ ＥＤＴＡ ２Ｎａ、０．１％ ＮａＮ３、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０及び０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む０．０５Ｍトリス緩衝液ｐＨ７．５で希釈し、５０ｎｇ／ｍｌ〜０．０５ｎｇ／ｍｌの希釈液を作製する。
６）測定
抗チトクロムＣ抗体を固相化したカップ中のウシアルブミン液を吸い取り、全カップに、２％ ＢＳＡ、０．０１Ｍ ＥＤＴＡ ２Ｎａ、０．１％ ＮａＮ３、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０及び０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む０．０５Ｍトリス緩衝液ｐＨ７．５を５０μｌ注入する。そのカップに標準抗原希釈液及び検体を５０μｌ加え、室温（２０〜３０℃）で１時間反応させる。反応後、ＥＩＡ専用洗浄機を用い、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０、０．００１５Ｍ ＮａＣｌ、０．００１５％ パラオキシ安息香酸メチル及び０．００５％ ２−クロロアセトアミドを含む０．００５Ｍトリス緩衝液ｐＨ７．５で３回（各４秒間）洗浄する。洗浄後、標識抗体液を１００μｌ加え室温（２０〜３０℃）で１時間反応させる。反応後、ＥＩＡ専用洗浄機を用い０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．００１５％パラオキシ安息香酸メチル及び０．００５％ ２−クロロアセトアミドを含む０．００５Ｍトリス緩衝液ｐＨ７．５で３回（各４秒間）洗浄する。洗浄後、１．５ｍｇ／ｍｌのＡＢＴＳ（２，２−アジノ−ビス−（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）を含む０．１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ４．２を１００μｌ加え室温（２０〜３０℃）で１時間反応させ、次いで０．０１３％ ＮａＮ３液を１００μｌ加え反応を停止する。発色した溶液の４０５ｎｍの吸光度を分光光度計で測定する。
７）標準抗原曲線の特性
各濃度のチトクロムＣ及び検体の吸光度値からブランクの吸光度値を引く。横軸に標準抗原濃度、縦軸は標準抗原の吸光度をプロットし、標準曲線を描く。その標準抗原曲線を基に、検体中に含まれるチトクロムＣ量を計算する。
［実施例２］ＧＶＨＤ、ＨＰＳ及び急性リンパ性白血病患者血清中のチトクロムＣの定量
実施例１に記載したチトクロムＣのＥＬＩＳＡ系を用いて、ＧＶＨＤ、ＨＰＳ及び急性リンパ性白血病患者並びに健常人の血清中のチトクロムＣ量を測定した。
その結果、表１に示すように、健常人１５人では全て陰性（＜０．０５ｎｇ／ｍｌ）であったが、ＧＶＨＤでは６例中４例（６７％）、ＨＰＳでは４例中４例（１００％）、急性リンパ性白血病では２例中２例（１００％）が陽性であった。またＨＰＳでは、血中チトクロムＣ濃度の高い患者で、予後が悪い傾向が見られた。
アポトーシスが起こっていると考えられる患者の血清中では、明らかなチトクロムＣ定量値の高値が認められた。
［実施例３］インフルエンザ脳炎・脳症患者血清中のチトクロムＣの定量
実施例１に記載したＥＬＩＳＡ系を用いて、インフルエンザ患者のうち、高熱、熱性けいれん及び脳炎・脳症を伴った患者の血清中のチトクロムＣ量を測定した。
図２に、１症例で複数回測定した場合も含めて結果を示す。脳炎・脳症を伴った例では、全２７検体（８例）が５ｎｇ／ｍｌ以上の高値を示し、その中でも１７検体が３０ｎｇ／ｍｌ以上の高値を示していた。また、血中チトクロムＣの濃度が高い患者で、予後が悪い傾向が見られた。
熱性けいれんを繰り返していた患者の中にやや高値を示す患者がおり、これらの患者については、十分な注意が必要であろうと考えられた。高熱を伴う患者では、高値のチトクロムＣ定量値を示した患者がいなかった。
また図３には、インフルエンザ脳症を発症した患者の、血中ＧＯＴ、ＬＤＨ及びチトクロムＣの値の推移を示す。チトクロムＣはＬＤＨに先行して上昇及び下降し、チトクロムＣが脳症のインフルエンザ脳症の病態を反映する、先行指標として有用であることが示された。
［実施例４］インフルエンザ脳炎・脳症患者血清中の各種サイトカイン濃度
高熱、熱性けいれん及び脳炎・脳症を伴ったインフルエンザ患者の血清中の、Ｅ−セレクチン（ｓｅｌｅｃｔｉｎ）、可溶性トロンボモジュリン（ｓｏｌｕｂｌｅ ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ）（ｓＴＭ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、Ｆａｓ、ＦａｓＬ及びチトクロムＣの濃度を定量した。Ｅ−セレクチンはｓＥ−セレクチンＥＬＩＳＡキット（ｖｅｒｓｉｏｎ ２、Ｂｅｎｄｅｒ ｍｅｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ｓＴＭはＴＭテスト（Ｔｅｉｊｉｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）、ＴＮＦはヒトＴＮＦ−αサイトスクリーンイムノアッセイキット（Ｂｉｏｓｃｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）、ＦａｓはｓＦａｓ ＥＬＩＳＡキット、ＦａｓＬはｓＦａｓリガンドＥＬＩＳＡキット（共にＭｅｄｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）にて測定し、チトクロムＣは実施例１に記載したＥＬＩＳＡ系を用いて測定した。
図４に示すように、どのサイトカインも脳炎・脳症患者血清中で高値を示す例が増加したが、チトクロムＣが脳炎・脳症で最も顕著に増加し、脳炎・脳症の鑑別にはチトクロムＣが最も適していることが示された。
産業上の利用の可能性
本発明により、体液中のチトクロムＣを定量するのに適した免疫化学的方法が提供される。また、チトクロムＣは生体内で起こっている細胞死の良い指標であり、病態を早く的確に知るための有用な指標であることが明らかにされ、従って、チトクロムＣの測定は、アポトーシスが病態の進行に関わる疾患、特にＧＶＨＤ、ＨＰＳ、急性リンパ性白血病及びインフルエンザ脳炎・脳症の、鑑別及び経過観察などの診断に有用である。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＨＰＳ患者血清中のＬＤＨ、ＡＳＴ、ＡＬＴ、フェリチン及びチトクロムＣ（Ｃｙｔｏ−Ｃ）の値の推移を示す。
図２は、高熱、熱性けいれん及び脳炎・脳症を伴うインフルエンザ患者血清中のチトクロムＣ量を示す。
図３は、インフルエンザ脳症を発症した患者血中のＧＯＴ、ＬＤＨ及びチトクロムＣの値の椎移を示す。
図４は、高熱、熱性けいれん及び脳炎・脳症を伴うインフルエンザ患者血清中の各種サイトカイン量を示す。
Claims (8)
- 体液中のチトクロムＣを定量し、定量値に基づいてアポトーシスを検出することを含む、細胞死を検出する方法。
- チトクロムＣを免疫化学的方法により定量する、請求項１に記載のアポトーシスを検出する方法。
- チトクロムＣに対する抗体を構成成分とする、体液中のチトクロムＣをサンドイッチ法により定量するための、アポトーシスの検出用チトクロムＣ測定試薬。
- 移植片対宿主反応疾患の診断用である、請求項３に記載のチトクロムＣ測定試薬。
- 血球貪食症候群の診断用である、請求項３に記載のチトクロムＣ測定試薬。
- 急性リンパ性白血病の診断用である、請求項３に記載のチトクロムＣ測定試薬。
- ウイルス性脳炎・脳症の診断用である、請求項３に記載のチトクロムＣ測定試薬。
- ウイルス性脳炎・脳症がインフルエンザ脳炎・脳症である、請求項７に記載のチトクロムＣ測定試薬。
Applications Claiming Priority (3)
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