JP5152766B2 - 癌の浸潤と転移の検査方法及び検査用試薬 - Google Patents
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。
2.チトクロムcを免疫化学的方法により測定する、1に記載の方法。
3.体液中のチトクロムcを測定するための試薬を含む、癌の浸潤と転移の検査用試薬。4.チトクロムcを免疫化学的方法により測定する、3に記載の試薬。
本発明の検査方法は、癌の浸潤と転移を検査する方法であって、癌患者の体液中のチトクロムcを測定し、測定結果を癌の浸潤と転移の指標として用いることを特徴とする。指標として用いるとは、癌患者の体液中のチトクロムcの測定値を、転移又は浸潤していない群の測定値と比較することであり、その比較結果に基づき転移又は浸潤の有無が検査される。転移又は浸潤していない群の測定値は、予め求めた転移又は浸潤していない群の測定値を使うことも許される。具体的には、転移又は浸潤していない群の測定値より高値である場合に、癌の転移又は浸潤があると判断することができる。すなわち、本発明の検査方法は、以下の工程を含む。
(1)癌患者の体液中のチトクロムcを測定し、
(2)該測定値を転移又は浸潤していない群の測定値と比較し、
(3)高値である場合に転移又は浸潤していると判断する工程。
リー電気泳動でピークとして検出する方法等がある。また、クロマトグラフィーによる方法としては、高速液体クロマトグラフィーでピークとして検出する方法等がある。場合によっては感度を上げるために、蛍光標識することも許されるが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
antibody)などが含まれる(エキスパート・オピニオン・オン・テラピューティック・パテンツ(Exp. Opin. Ther. Patents),第6巻,第5号,第441〜456頁,1996年)。
、酸性条件でチトクロムcと抗チトクロムc抗体の反応を行う旨が記載された検査用試薬が挙げられる。また、酸性に調整した反応用緩衝液を含む検査用試薬としてもよい。
ラットチトクロムc(シグマ社製)をウサギに免疫し、チトクロムcに対する抗血清を得た。その抗血清に最終濃度2 Mになるように硫酸アンモニウムを添加し、室温(20-30℃)で5時間撹拌した。撹拌した溶液を10000回転で30分遠心し上清を捨て、沈殿物に0.1 Mリン酸緩衝液pH 7.2を加え溶解後、0.1 Mリン酸緩衝液pH 7.2にて透析した。
精製した抗チトクロムcIgGを0.1 M酢酸緩衝液pH 4.2で透析し、ペプシン(シグマ社)を蛋白質濃度比で20:1の割合になるように加え、37℃で16時間反応させた。1 N NaOHを加えpHを7.5に調整し、0.15 M NaClを含む0.01 Mトリス塩酸緩衝液pH 7.5で平衡化したSephacryl S-200(GEヘルスケアバイオサイエンス社)カラムに流しゲル濾過を行った。フラクションの第一ピークを集め、濃縮し、抗チトクロムcIgG F(ab')2ポリクローナル抗体とした。
ヒトチトクロムc(R&D Systems社)110μg/100μLと65 mMリン酸緩衝液pH 7.5に溶解した2 mg/mLオブアルブミン55μLを混合して、そこへ65 mMリン酸緩衝液pH 7.5で希釈した1 mMグルタルアルデヒド42μLを加え、室温で2時間撹拌した。次に、0.15 M NaClで4℃において48時間透析し、等量のFCAとアジュバントを作製し、BALB/Cマウス腹腔に0.1
mL免疫した。2週間おきに合計3回同様に免疫した。3回目の免疫の2週間後、マウスに生理食塩水に溶解したヒトチトクロムc50μg/100μLを尾静脈より静注した。3日後マウスから脾臓を摘出して、常法に従い、脾臓リンパ球をポリエチレングリコール法によりミエローマ細胞P3X63 Ag8U.1と細胞融合した。ヒトチトクロムcを抗原としてスクリーニングを行い、ヒトチトクロムcに対するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ(clone:3G7および27G9)を樹立した。
抗チトクロムcモノクローナル抗体(clone:2B5F8(R&D Systems社)またはclone:6H2.B4(BectonDickinson社))を、0.15M NaClを含む0.1 M酢酸緩衝液(pH 4.2)で透析し、OD 280 nmが0.56になるよう0.15M NaClを含む0.1 M酢酸緩衝液(pH 4.2)で希釈した。希釈した抗体1.67 mLを、あらかじめ磁石を用いて0.15M NaClを含む0.1 M酢酸緩衝液(pH
4.2)3 mLで3回洗浄したビーズ(DynabeadsR M-450 Epoxy, Dynal社)3.36 mL分と混合し、室温で17時間撹拌した。次にビーズをブロッキング緩衝液(50 mM Tris・HCl, 1% BSA, 0.15 M NaCl, 0.1% NaN3, pH7.5)3 mLで懸濁し、室温で7時間撹拌してビーズをブロッキングした。ブロッキングされたビーズを使用時に1検体あたり3×107個になるよう
調整して測定に用いた。
参考例3で作製した抗チトクロムcモノクローナル抗体(3G7抗体または27G9抗体)あるいは参考例2で作製した抗チトクロムcIgG F(ab')2ポリクローナル抗体をPBSで透析し、抗体濃度を0.5 mg/mLから2 mg/mLの範囲に調製する。抗体1 mLに、ジメチルスルホキシドに10mg/mL濃度で溶解したルテニウム錯体(ruthenium(II) tris(bipyridyl) - N-hydroxysuccinimide, IGEN Corp. USA)を12.2μL加え室温で30分撹拌した。次に2 M グリシンを50μL加え、室温で10分撹拌した。それを、PBS-3(10 mMリン酸カリウム, 0.15M NaCl, 0.05% NaN3, pH 6.0)であらかじめ平衡化したSephadex G-25(GEヘルスケアバイオサイエンス社)カラム(1.5 cmφ x 30 cm)にアプライしてPBS-3で溶出し、1 mLでフラクション分取した。各フラクションのOD 280 nmを測定し、第1ピークのフラクションを集めルテニウム錯体標識抗チトクロムc抗体とした。抗体濃度をMicro BCA protein Assay kit(PIERCE社)を用いて測定した。
チトクロムc標準抗原は、ヒトチトクロムc(R&D Systems社)を5% BSA、0.15 M NaCl, 0.1% NaN3を含む0.15 Mリン酸ナトリウム緩衝液pH 7.4で1000 ng/mL, 500 ng/mL, 100 ng/mL, 50 ng/mL, 10 ng/mLに希釈して調製した。
悪性腫瘍に対する外科的切除術適応患者総計100例(消化管40例 [食道癌3例、胃癌11例、結腸癌17例、肝癌7例、胆嚢癌2例]、肺17例 [小細胞癌2例、非小細胞癌15例]、泌尿器6例、生殖器19例、乳腺2例、甲状腺4例、皮膚11例、軟部組織2例、頭頚部5例)の術前1週前に採血して得た血清につき、チトクロムc値を測定した。
500μL容量のポリプロピレン製反応管に反応用溶液(0.15M NaCl, 15mM EDTA, 5% N102(日本油脂社製), 0.1% NaN3を含む0.1 Mクエン酸リン酸緩衝液pH 4.0)を200μL注入し、そこに各患者血清並びに5濃度のヒトチトクロムc標準抗原(1000 ng/mL, 500 ng/mL, 100 ng/mL, 50 ng/mL, 10 ng/mL)を20μLずつ加えた。その後の測定は、全自動電気化学発光免疫測定機ピコルミR8220(三光純薬社)を用いて行った。すなわち、反応管に1%BSA、0.3%スクロース、0.01容量%Tween20、0.1%NaN3を含む0.15M PBS(pH 7.5)でビーズ濃度1mg/mLに調整した抗チトクロムc抗体固相化ビーズ液25μLを加えて9分間反応させた。その後、ピコルミR BF洗浄液(三光純薬社)350μLでビーズを2回洗浄し、1% BSA、0.3% スクロース、 0.01 容量% Tween 20、 0.1% NaN3を含む0.15 M PBS(pH 7.5)で0.5〜1μg/mL濃度に調整したルテニウム錯体標識抗チトクロムc抗体液200μLを加えて9分間反応させた。ピコルミR BF洗浄液350μLでビーズを2回洗浄後、ピコルミR発光電解液(三光純薬社)を300μL加えて発光量を計測した。
転移(+)群と転移(−)群における血清チトクロムc値の分布を図1に示し、各群における血清チトクロムc値の中央値と陽性率を表1に示した。マンホイットニーU検定において、転移(+)群の血清チトクロムc値は、転移(−)群に比べて有意(P=0.000051)に高値を示した。転移、浸潤ともに(−)群16例における血清チトクロムc値の平均値+3SD値をカットオフ値(25.5ng/mL)とした場合、転移(−)群の陽性率は23.8%であったのに対し、転移(+)群の陽性率は56.1%と高値を示した。
(1)測定症例と測定方法
実施例1に用いた症例の中から、手術時摘出組織の病理検査結果に基づいて、腫瘍細胞の原発臓器外(被膜・漿膜外)への浸潤を認めない症例を浸潤(−)群(19症例)、脈管侵襲のみを認める症例を浸潤A群(28症例)、原発臓器外(被膜・漿膜外)への浸潤を認める症例を浸潤B群(28症例)として分類し、それぞれの群について血清チトクロムc値を比較した。血清チトクロムc値の測定は、実施例1に示した電気化学発光免疫測定法にて行った。
浸潤(−)群、浸潤A群、浸潤B群のチトクロムc値の分布と各群における陽性率を図2に示した。なお、陽性率を求めるためのカットオフ値は、実施例1に示した値(25.5ng/mL)を用いた。マンホイットニーU検定において、浸潤B群の血清チトクロムc値は、浸潤(−)群比べて有意(P = 0.003)に高値を示し、また、浸潤A群に比べても有意(P = 0.03
02)に高値を示した。陽性率は浸潤(−)群0%、浸潤A群29.4%、浸潤B群66.7%であった。
この結果は、癌の浸潤度が高いほど血清チトクロムc値が高くなることを示すものであった。
(1)測定症例と測定方法
実施例1で用いた症例の中から、術前化学療法を施行した症例を除く転移例(リンパ節転移を除く72症例)と浸潤例(76症例)につき、血清チトクロムc値と細胞障害マーカーであるLDH(乳酸デヒドロゲナーゼ)値を測定した。血清チトクロムc値の測定は、実施例1に示した電気化学発光免疫測定法にて行った。また、LDHは日本臨床化学学会(JSCC)勧告法に準拠したJSCC標準化対応法に従って測定した。
ROC分析により転移に対する診断能を比較した結果を図3に、浸潤に対する診断能を比較した結果を図4に示した。曲線下面積は、図3、図4ともにチトクロムcの方がLDHに比べて広く、転移と浸潤に対する診断能は、チトクロムcの方がLDHに比べて優れていた。
Claims (6)
- 転移性の癌の転移を検査する方法であって、以下の工程、
(1)癌患者から採取された体液中のチトクロムcを測定し、
(2)該測定値を転移していない群の測定値と比較し、
(3)高値である場合に転移していると判断する工程、
を含む方法。 - チトクロムcを免疫化学的方法により測定する、請求項1に記載の方法。
- 体液が血清である請求項1に記載の方法。
- 浸潤性の癌の浸潤を検査する方法であって、以下の工程、
(1)癌患者から採取された体液中のチトクロムcを測定し、
(2)該測定値を浸潤していない群の測定値と比較し、
(3)高値である場合に浸潤していると判断する工程、
を含む方法。 - チトクロムcを免疫化学的方法により測定する、請求項4に記載の方法。
- 体液が血清である請求項4に記載の方法。
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