DE69629121T2

DE69629121T2 - Verwendung eines 24 kD Proteins zur Behandlung und Diagnose einer HCV Infektion

Info

Publication number: DE69629121T2
Application number: DE69629121T
Authority: DE
Inventors: Sergio Abrignani
Original assignee: CHIRON Srl SIENA; Chiron SRL
Current assignee: GSK Vaccines SRL
Priority date: 1995-09-01
Filing date: 1996-08-30
Publication date: 2004-05-27
Anticipated expiration: 2016-08-31
Also published as: NZ316186A; PT852586E; US6737233B1; ATE245166T1; DK0852586T3; DE69635535T2; US7320875B2; US20040180053A1; DE69635535D1; IL123169A0; AU6835196A; IL123169A; EP1321476A2; US20010027565A1; DE69629121D1; US20060166193A1; EP0852586B1; US7026130B2; US6777538B2; JP4223074B2

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegenden Erfindung betrifft Proteine, die in der Lage sind, das E2-Hüllprotein des Hepatitis C-Virus (HCV) zu binden und Verfahren für die Produktion und Reinigung.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der Proteine bei der Therapie und Diagnose und pharmazeutische Zusammensetzungen und diagnostische Kits für solche Verwendungen. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren für die Durchmusterung möglicher Moleküle für die Kompetition der Bindung an den HCV-Rezeptor. Die Erfindung betrifft auch ein Tiermodell für die HCV-Infektion.
Kurze Beschreibung des Standes der Technik
HCV (zuvor bekannt als Nicht-A Nicht-B-Hepatitis – NANBV) ist ein RNA-Virus im positiven Sinn von etwa 10000 Nucleotiden mit einem einzelnen offenen Leserahmen, der ein Polyprotein von etwa 3000 Aminosäuren codiert. Obwohl die Struktur des Virus mittels rekombinanter DNA-Verfahren (1, 2) ermittelt wurde, wurde das Virus selbst nicht isoliert und die Funktionen der verschiedenen viralen Proteine, die mittels Proteolyse produziert wurden, wurde nur mittels Analogie mit anderen ähnlichen Viren ähnlicher genomischer Organisation (3) gefolgert.
Die viralen Proteine sind alle in rekombinanter Form verfügbar, in einer Vielzahl von Zellen und Zellarten exprimiert, einschließlich Hefe-, Bakterien-, Insekten- und Säugerzellen (4, 5).
Es wurde vorgeschlagen, dass zwei Proteine, E1 und E2 genannt (entsprechend den Aminosäuren 192–383 und 384–750), externe Proteine der viralen Hülle sind, die für die Bindung des Virus an die Zielzellen verantwortlich sind (3).
Die HVC-Forschung wird beträchtlich durch den beschränkten Kreis an Wirten für das Virus behindert. Das einzige verläßliche Tiermodell für die HCV-Infektion ist der Schimpanse und es ist nicht möglich, HCV in Gewebekultur zu vermehren.
In unserer anhängigen Internationalen Patentanmeldung PCT/IB95/00692 beschreiben wir ein Verfahren unter Verwendung der Durchflußcytometrie zur Identifikation von Zellen, die den HCV-Rezeptor tragen. Wir haben gezeigt, dass es durch Markierung von Zellen mit rekombinantem E2-Hüllprotein möglich ist, Zellen unter Verwendung der Durchflußcytometrie zu sortieren, wobei diejenigen Zellen isoliert werden, die in der Lage sind, spezifisch an E2 zu binden und die deshalb möglicherweise den HCV-Rezeptor tragen. Unter Verwendung dieser Technologie haben wir ein Protein identifiziert, das in der Lage ist, an das E2-Hüllprotein von HCV zu binden. Von diesem glauben wir, dass es der Rezeptor für HCV ist, was uns in die Lage versetzten würde, viel Probleme des Stands der Technik zu überwinden.
Die Internationalen Patentanmeldung WO93/04205 beschreibt die Identifikation von monoclonalen Antikörpern, die spezifisch an das E2/NS1-Antigen des Hepatitis C-Virus binden. Diese monoclonalen Antikörper ermöglichen die Identifikation von HCV-Antigen für die Diagnose und Bewertung von HCV-Infektionen.
Die Internationalen Patentanmeldung WO96/04376 beschreibt ein Verfahren für die Entdeckung und die Isolierung eines zellulären Rezeptors für das Hepatitis A-Virus. Der zelluläre Rezeptor wurde aus Säugerzellen cloniert, in denen der Rezeptor exprimiert wurde.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Protein bereitgestellt, das ein Molekulargewicht von etwa 24 kD hat und in der Lage ist, spezifisch an ein Protein des Hepatitis C-Virus zu binden, oder eine funktionell äquivalente Variante oder ein funktionell äquivalentes Fragment davon.
Es wird vom Durchschnittsfachmann verstanden werden, dass Molekulargewichte, die wie nachstehend beschrieben unter Verwendung der Elektrophorese gemessen werden, inhärent der Interpretation unterliegen, da sie in Relation zu Standardmolekulargewichtsmarkern gemessen werden. Im Kontext dieser Beschreibung ist der Ausdruck „24 kD" jedoch eindeutig, wenn er im Kontext gelesen wird, da nur ein solches Protein erhalten wird, wenn man den Verfahren folgt, die nachstehend beschrieben werden, mit der definierten Charakteristik der Bindung an das Hepatitis C-Virus.
Eine signifikante charakterisierende Eigenschaft des Proteins gemäß der vorliegenden Erfindung ist die Fähigkeit der spezifischen Bindung an ein HCV-Protein, vorzugsweise ein Hüllprotein, insbesondere das E2-Protein.
Auf der Basis dieser Spezifität und anderer, nachstehend beschriebener Eigenschaften folgern wir, dass das 24 kD-Protein der Erfindung ein zellulärer Rezeptor für HCV ist.
Wir haben gezeigt, dass das Protein im Menschen bei den Zellarten, die wir getestet haben, überall vorkommt, parallel zu der Situation, die für viele andere Viren dieser Art gefunden wird (wie Vaccinia-Virus und Influenza-Virus).
Wir haben gezeigt, dass das Protein auf eine Weise Spezies-spezifisch ist, die mit der Spezies-Spezifität von HCV selbst einhergeht.
Unsere Experimente haben gezeigt, dass das Protein von 24 kD funktionell nicht glycosiliert ist. Die Behandlung mit Glycosidasen beeinflußt nicht die Fähigkeit des Proteins von 24 kD, an das E2-Protein zu binden, und scheint das Molekulargewicht nicht wesentlich zu reduzieren. Wir folgern daher, dass, wenn das Protein überhaupt glycosiliert ist, die Glycosilierung auf eine kleine Zahl von Zuckerresten beschränkt sein muss und für die funktionelle Aktivität des Proteins nicht erforderlich ist.
Unsere Experimente haben auch gezeigt, dass das Protein ein Transmembranprotein ist, was wiederum nahelegt, dass es ein zellulärer Rezeptor ist.
Letztlich zeigen Experimente mit Zelllinien, die das Protein überexprimieren, dass solche Zellen der Aggregation unterliegen, was nahe legt, dass das Protein in gewisser Weise ein Adhäsionsmolekül sein kann.
Das Protein von 24 kD kann in seiner natürlicherweise vorkommenden Form sein, ungeachtet seiner Isolierung von seiner ursprünglichen Umgebung, oder es kann modifiziert sein, unter der Vorraussetzung, dass es seine funktionelle Charakteristik von mindestens der Bindung an das E2-Protein von HCV behält. Zum Beispiel kann das Protein von 24 kD chemisch modifiziert sein, um eine oder mehrere chemische Modifikationen bei der Aminosäurestruktur einzuführen. Es kann Modifikationen der Aminosäuresequenz einschließen, die eine oder mehrere Insertionen, Deletionen oder ersetzte Aminosäuren umfassen. Es kann zum Beispiel durch Entfernung eines funktionellen Teils der Transmembrandomäne verkürzt sein, um die einfache Produktion mittels Verfahren der rekombinanten DNA-Technik in einer geeigneten Säugerwirtszelle zu erleichtern (6).
Das Protein der vorliegenden Erfindung kann von Zellen gereinigt werden, die Bindung an ein HCV-Protein, wie das E2-Protein, zeigen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für die Herstellung eines Proteins gemäß der Erfindung oder einer funktionell äquivalenten Variante oder eines funktionell äquivalenten Fragments davon bereitgestellt, umfassend den Schritt der Züchtung von Zellen, die Bindung an ein HCV-Protein zeigen, und die Reinigung eines Proteins gemäß der Erfindung aus einer Zellzubereitung.
Die Zellen können transformierte oder nicht transformierte Säugerzellen sein und sind in geeigneter Weise menschliche Zellen.
Die Zellen können unter Verwendung der Fluoreszenz-Durchflusscytometrie oder mittels jedes anderen geeigneten Test auf ihre Bindung an ein HCV-Protein durchmustert werden. Zum Beispiel stellt die vorliegende Beschreibung die Information bereit, die notwendig ist, um das Protein von 24 kD oder eine funktionell äquivalente Variante oder ein funktionell äquivalentes Fragment davon zu produzieren, welches dann selbst verwendet werden kann, um auf andere Zellen zu testen, die das Protein tragen.
Die Zellzubereitung kann eine Zellmembranzubereitung sein, ist aber vorzugsweise eine Plasmazellmembranzubereitung.
Vorzugsweise werden die Zellen selektiert und cloniert, um die Überexpression des Proteins der vorliegenden Erfindung bereitzustellen.
Wir haben gefunden, dass das Protein durch Ammoniumsulfat bei einer Sättigung von zwischen 33 und 50% ausgefällt wird.
Deshalb wird die Zellzubereitung vorzugsweise einem Ammoniumsulfatfällung-Reinigungsschritt unterworfen, der Ammoniumsulfat zwischen 33 und 50% verwendet. In geeigneter Weise wird eine erste Fällung bei weniger als 33% durchgeführt und das ausgefällte Material wird verworfen, gefolgt von einer Fällung des erwünschten Materials bei zwischen 33 und 50%, am meisten bevorzugt 50%.
Vorzugsweise beinhaltet die Reinigung mindestens einen Schritt der hydrophoben Wechselwirkungschromatographie.
Wir haben auch gefunden, dass das Protein gegen Acetonfällung stabil ist, womit eine weitere Charakterisierung und ein nützlicher Schritt im Reinigungsverfahren bereitgestellt wird.
Am meisten bevorzugt in seiner optimierten Form umfaßt das Verfahren der Reinigung die Schritte:

i) Herstellen einer Plasmazellmembranzubereitung aus Säugerzellen, ausgewählt für die Überexpression des erfindungsgemäßen 24 kD-Proteins,
ii) Durchführen einer Ammoniumsulfatfällung bei weniger als 33% Sättigung mit der Zubereitung und Zurückbehalten des Überstands,
iii) Durchführen einer Ammoniumsulfatfällung bei einer Sättigung zwischen 33 und 50% mit dem Überstand und Zurückbehalten des Niederschlags, und
iv) Resuspendieren des Präzipitats und Durchführen einer hydrophoben Wechselwirkungschromatographie.

Als eine Alternative zur Reinigung aus Wildtyp-Zelllinien können die Proteine der Erfindung oder eine funktionell äquivalente Variante oder ein funktionell äquivalentes Fragment davon durch jedes geeignete synthetische Verfahren gemacht werden, einschließlich der chemischen Synthese. In geeigneter Weise wird das Protein oder eine funktionell äquivalente Variante oder ein funktionell äquivalentes Fragment davon durch Expression eines Gens, das das Protein codiert, in einer geeigneten Wirtszelle oder einem geeigneten Tier gemacht.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Behandlung einer HCV-Infektion bereitgestellt, welche die Verabreichung einer Menge des Proteins oder einer funktionell äquivalenten Variante oder eines funktionell äquivalenten Fragments davon an einen Patienten umfaßt, die bewirkt, die Ansteckungsfähigkeit des Virus zu reduzieren.
Da der Infektionsmechanismus von HCV zum Teil auf der Verfügbarkeit eines Zelloberflächenrezeptors abzuhängen scheint, wird die Bereitstellung einer löslichen Form des Proteins der Erfindung als Antagonist der Bindung von HCV an den zellulären Rezeptor wirken und damit den Infektionsprozeß reduzieren oder verhindern und damit die Erkrankung behandeln.
Eine geeignete lösliche Form des Proteins der Erfindung könnte zum Beispiel eine verkürzte Form des Proteins umfassen, von dem die Transmembran-Domäne entweder durch einen Proteinspaltungsschritt oder geplant bei einer chemischen oder rekombinanten DNA-Synthese entfernt wurde.
In einer anderen Ausführungsform könnte ein hybrider Partikel, der mindestens ein partikelbildendes Protein, wie das Hepatitis B-Oberflächenantigen oder ein partikelbildendes Fragment davon, in Kombination mit dem Protein der Erfindung oder einer funktionell äquivalenten Variante oder eines funktionell äquivalenten Fragments davon umfaßt, als ein Antagonist der Bindung von HCV an den zellulären Rezeptor wirken.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, die ein Protein der Erfindung oder einer funktionell äquivalenten Variante oder eines funktionell äquivalenten Fragments davon umfaßt, gegebenenfalls als ein pharmazeutisch verträgliches Salz in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.
Die pharmazeutische Zusammensetzung kann in einer geeigneten Form für die Verabreichung sein, einschließlich oraler und parenteraler Zusammensetzungen.
Es wird auch ein Verfahren zur Herstellung der pharmazeutischen Zusammensetzung bereitgestellt, bei dem das Protein der vorliegenden Erfindung oder eine funktionell äquivalente Variante oder ein funktionell äquivalentes Fragment davon in Assoziation mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger gebracht wird.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Protein der Erfindung oder eine funktionell äquivalente Variante oder ein funktionell äquivalentes Fragment davon für die Verwendung als ein Medikament bereitgestellt.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die Verwendung eines Proteins der Erfindung oder einer funktionell äquivalenten Variante oder eines funktionell äquivalenten Fragments davon bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung einer HCV-Infektion bereitgestellt.
Die Fähigkeit des Proteins der Erfindung oder einer funktionell äquivalenten Variante oder eines funktionell äquivalenten Fragments davon, an HCV zu binden, erlaubt die Verwendung des Proteins oder einer funktionell äquivalenten Variante oder eines funktionell äquivalenten Fragmentes davon als Diagnostikum für die HCV-Infektion, zum Beispiel in einem ELISA oder RIA.
Eine lösliche Form des Proteins könnte zum Beispiel in einer ELISA-Form eines Tests verwendet werden, um neutralisierende Antikörper im Serum zu messen.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Test für HCV-Antikörper in einer Serumprobe bereitgestellt, der den Schritt des Zulassens der kompetitiven Bindung zwischen Antikörpern in der Probe und einer bekannten Menge eines HCV-Proteins für die Bindung an ein Protein der Erfindung oder eine funktionell äquivalente Variante oder ein funktionell äquivalentes Fragment davon umfaßt und die Messung der Menge des bekannten gebundenen HCV-Proteins.
Vorzugsweise wird das Protein der Erfindung oder die funktionell äquivalente Variante oder das funktionell äquivalente Fragment davon an einem festen Träger immobilisiert und das HCV-Protein, das in geeigneter Weise das E2-HCV-Hüllprotein sein kann, gegebenenfalls rekombinantes E2-Protein, ist markiert, in geeigneter Weise Enzym-markiert.
Bei einem Test dieser Form resultiert die kompetitive Bindung zwischen Antikörpern und dem HCV-Protein für die Bindung an das Protein der Erfindung darin, dass das gebundenen HCV-Protein ein Maß für Antikörper in der Serumprobe ist, insbesondere neutralisierende Antikörper in der Serumprobe.
Ein signifikanter Vorteil des Test ist, dass die Messung direkt von neutralisierenden Antikörpern (d. h. diejenigen, die mit der Bindung von HCV-Hüllprotein an den zellulären Rezeptor interferieren) gemacht wird. Ein solcher Test, insbesondere in der Form eines ELISA-Tests, hat beträchtliche Anwendungen in der klinischen Umgebung und in der routinemäßigen Blutuntersuchung.
Da der Test den Titer an neutralisierenden Antikörpern mißt, bildet der Test auch eine einfaches Maß für die Wirksamkeit eines vermutlichen Impfstoffs, da der Titer an neutralisierenden Antikörpern mit dem Schutz des Wirts korreliert ist.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein diagnostischer Kit bereitgestellt, der das Protein der Erfindung oder eine funktionell äquivalente Variante oder ein funktionell äquivalentes Fragment davon umfaßt. Vorzugsweise enthält der Kit auch mindestens ein markiertes HCV-Protein, gegebenenfalls Enzym-markiert.
Das Protein der Erfindung oder eine funktionell äquivalente Variante oder ein funktionell äquivalentes Fragment davon können auch für das Screening nach chemischen Verbindungen verwendet werden, die die HCV-Oberflächenstruktur nachbilden, die für die Bindung an den HCV-Rezeptor verantwortlich ist.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren für das Screening nach chemischen Verbindungen gemäß ihrer Bindungsfähigkeit an die Region von HCV bereitgestellt, die für die Bindung an die Wirtszelle verantwortlich ist, umfassend die Messung der Bindung der zu prüfenden chemischen Verbindung an ein Protein der Erfindung oder eine funktionell äquivalente Variante oder ein funktionell äquivalentes Fragment davon.
Dieser Aspekt der Erfindung umfaßt die Produkte des Prüfvorgangs, entweder allein, in der Form eines pharmazeutisch verträglichen Salzes, in Kombination mit einer oder mehreren aktiven Verbindungen und/oder in Kombination mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Trägern. Es werden auch Verfahren für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung bereitgestellt, bei denen eine chemische Verbindung, die mittels des Verfahrens der Erfindung identifiziert wurde, in Assoziation mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger gebracht wird.
Die chemische Verbindung kann eine organische Chemikalie sein und kann Aminosäuren oder Aminosäureanaloga enthalten. Vorzugsweise ist die chemische Verbindung jedoch ein Polypeptid oder ein Polypeptid, das chemisch modifiziert wurde, um seine spezifischen Eigenschaften zu verändern, wie die Affinität der Bindung an das Protein der Erfindung oder eine funktionell äquivalente Variante oder ein funktionell äquivalentes Fragment davon, oder deren Stabilität in vivo.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
1 ist ein schematisches Diagramm, das einen Test beschreibt, bei dem HCV-Rezeptor bindende Liganden an die Rezeptoren auf HCV-Rezeptor-Zielzellen binden und sie werden gemessen, indem zunächst Kaninchen-anti-HCV-Antikörper gebunden wird und dann ein markiertes anti-Kaninchen IgG-FITC F(ab')-Fragment vor der Trennung mittels FACScan-Analyse gebunden wird.
2 ist ein Computer-erzeugtes Histogramm, das die Ergebnisse der FACScan-Analyse der Bindung von HCV-Protein an hämatopoetische Zellen (MOLT-4, Jurkat, K562, Daudi, EBV-B) und Epithelzellen (Hela, Adenocarcinom und Huh 7) darstellt, das von der Bindung mit HCV-Proteinen resultiert (gefüllte Kurve nicht markierte Kontrolle, offene Kurve markiert). Die Darstellung ist Zellpopulation gegen Fluoreszenzintensität.
3 ist ein Computer-erzeugtes Histogramm, das die Ergebnisse der FACScan-Analyse von gereinigtem RA, gereinigtem RO, aus Nabelschnurblut gereinigtes RA, mit pha stim. RA aus Nabelschnurblut, T-Zell-Clon KC3 (TCC) und SAG S9 TCC, die auf ihre Bindung an rekombinantes HCV-E2-Protein getestet wurden, das in CHO-Zellen exprimiert wurde (gefüllte Kurve nicht markierte Kontrolle, offene Kurve markiert). Die Darstellung ist Zellpopulation gegen Fluoreszenzintensität.
4 ist ein Satz von Computer-erzeugten Histogrammen, die die Ergebnisse der FACScan-Analyse der Bindung von E2-CHO an MOLT-4-Zellen mit und ohne Behandlung mit beta-Mercaptoethanol (BSH), einem S-S-Bindung reduzierenden Agens, darstellt (gefüllte Kurve nicht markierte Kontrolle, offene Kurve markiert). Die Darstellung ist Zellpopulation gegen Fluoreszenzintensität.
5 ist ein Satz von Computer-erzeugten Histogrammen, die die Ergebnisse der FACScan-Analyse der Bindung von E2-CHO an MOLT-4-Zellen mit und ohne Behandlung mit Endo-H, einem deglycosylierenden Enzym, darstellt (gefüllte Kurve nicht markierte Kontrolle, offene Kurve markiert). Die Darstellung ist Zellpopulation gegen Fluoreszenzintensität.
6 ist ein Western Blot von Membranen, die aus MOLT-4-Zellen gewonnen wurden und in verschiedenen Puffern gelöst wurden (vgl. Seite 22 für die Beschreibung der Spuren).
7 ist ein Western Blot der plasmatischen Membran von MOLT-4-Zellen (vgl. Seite 23 für die Beschreibung der Spuren).
8 ist ein Western Blot der Membranproteine von MOLT-4 und PBMC (vgl. Seite 23 für die Beschreibung der Spuren).
9 ist ein Western Blot der Membranproteine von MOLT-4-Zellen, die mit N-Glycosidase F behandelt worden waren (vgl. Seite 26 für die Beschreibung der Spuren).
10 ist ein Western Blot der Membranen von MOLT-4 und COS-7, die unter reduzierenden und nicht reduzierenden Bedingungen einer Elektrophorese unterzogen worden waren (vgl. Seite 27 für die Beschreibung der Spuren).
11 ist ein Western Blot eines Experiments, das die Immunpräzipitation eines E2-CHO/vermutlicher Rezeptor-Komplexes zeigt (vgl. Seite 29 für die Beschreibung der Spuren).
12 ist ein Western Blot der Ammoniumsulfat-Fraktionen der Zellmembranen von MOLT-4-Zellen (vgl. Seite 31 für die Spuren).
13 ist ein Western Blot von Proben von einem Experiment mit hydrophober Wechselwirkungschromatographie mit einem Aceton-Reinigungsschritt (vgl. Seite 32 für die Spuren).
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Der Aufbau der ausführlichen Beschreibung ist wie folgt:

1. Allgemeine Beschreibung 14
2. Zellulärer Test 15
2.1. FACS-Analyse von Zellen, die E2 binden 15
2.2. Wirkung der Modifikation von E2 auf die Bindung 17
2.2.1. Reduktion von E2 17
2.2.2. Deglycosylierung von E2 18
2.3. Produktion von monoclonalem Antikörper 18
3. Herstellung des vermutlichen Rezeptors von 24 kD 19
3.1. Herstellung des Proteins von 24 kD aus MOLT-4-Zellen 19
3.1.1. Membranreinigung 20
3.1.2. Plasmamembranreinigung 20
3.2. Überexpression von MOLT-4-Zellen 22
4. Charakterisierung des Rezeptors 22
4.1. Western Blot-Protokoll 23
4.1.1. Membranproteine 24
4.1.2. Plasmamembranproteine 25
4.1.3. Western Blot von PBMC-Zellen 26
4.2. Zelloberflächenexpression von Rezeptor 27
4.3. Wirkung von Enzymen auf die Bindung des Proteins von 24 kD 27
4.3.1. Durchflusscytometrie 28
4.3.2. Western Blot mit MOLT-4/N-Glycosidase F 29
4.4. Wirkung von reduzierenden Bedingungen auf die Bindung 30
5. Optimierung der Reinigung 31
5.1. Immunpräzipitation 31
5.2. Ammoniumsulfat-Fraktionierung 35
5.3. Hydrophobe Wechselwirkungschromatographie 37
5.4. Acetonfällung 38
6. Sequenzierung und Clonierung
6.1. Aminosäuresequenz
6.2. Clonierung und Sequenzierung der DNA-Sequenz

1. Allgemeine Beschreibung
Bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung wird, außer anders angedeutet, herkömmliche Verfahren der Immunologie, Cytofluorometrie und Molekularbiologie verwenden, die vom Stand der Technik umfaßt sind. Solche Verfahren sind in der Literatur ausführlich erklärt (7).
Der Durchschnittsfachmann wird die allgemeinen Verfahren und Techniken der Testplanung und -durchführung verstehen und mit ihnen vertraut sein. Die Erfindung wird hier für den Durchschnittsfachmann ausreichend detailliert beschrieben, damit er die offenbarten Experimente verstehen und wiederholen kann.
Für Viren und Proteine werden in dieser Beschreibung Standardabkürzungen verwendet. Alle hier zitierten Veröffentlichungen, Patente und Patenanmeldungen sind durch Bezugnahme eingeschlossen. Envelope 1 (E1) und Envelope 2 (E2) von HCV betreffen die Proteine und Fragmente davon, deren Nucleotidsequenz veröffentlicht ist (EP-A-0318261 und EP-A-0388232, vorstehend zitiert). Die Nucleotide der E1- und E2-Gene und der codierten Proteine variieren in verschiedenen HCV-Isolaten. Deshalb werden E1 und E2 für alle HCV- Isolate identifiziert, weil sie in den Aminosäuresequenzen 192–383 und 384–750 enthalten sind.
E1 und E2 sind unter Verwendung verschiedener Expressionssysteme mittels rekombinanter DNA-Verfahren produziert worden (Spaete et al und Chien et al, vorstehend zitiert).
2. Zellulärer Test
2.1. FACS-Analyse von Zellen, die an E2 binden
Es wurde ein Experiment mit dem Ziel durchgeführt, die Fähigkeit von HCV-Protein zu messen, an verschiedene Zelltypen zu binden, die den mutmaßlichen HCV-Rezeptor haben sollten.
Zellen (10⁵/Mulde) von dem menschlichen T-Zell-Lymphom Molt-4 (kommerziell verfügbar und erhältlich von der American Type Culture Collection) werden in Mikrotiterplatten mit 96 U-förmigen Mulden (Costar) durch 5 Minuten Zentrifugation bei 4°C und 200 × g pelletiert. Zwanzig Mikroliter an HCV-Proteinen (CHO-exprimiertes rekombinantes E2-Protein), die zu verschiedenen Konzentrationen (von 10 μg/ml bis 0,001 μg/ml) in PBS verdünnt waren, wurden mit dem Pellet an Molt-4-Zellen gemischt und 60 Minuten bei 4°C inkubiert. Nicht gebundene HCV-Proteine wurden durch zwei Zentrifugationen von 5 Minuten in PBS bei 4°C und 200 × g entfernt.
Die Zellen wurden anschließend 30 Minuten bei 4°C mit verschiedenen Verdünnungen (von 1/10 bis 1/300000) von Seren von Menschen, Schimpansen, Kaninchen oder Mäusen inkubiert, die entweder mit HCV infiziert waren oder mit rekombinanten HCV-Proteinen immunisiert worden waren, oder mir den entsprechenden Seren vor der Immunisierung als Kontrolle.
Die Zellen wurden zweimal in PBS gewaschen und 30 Minuten mit den geeigneten Verdünnungen an mit Fluoreszein-isothiocyanat konjugierten Antiseren inkubiert (entweder menschliches IgG oder Kaninchen-IgG oder Mäuse-IgG).
Die Zellen wurden anschließend bei 4°C in PBS gewaschen, in 100 μl PBS resuspendiert und die zellgebundene Fluoreszenz wurde mit einem FCScan Durchflusscytometer (Becton & Dickinson) analysiert. Unter Verwendung einer Dot Blot-Darstellung der Vorwärts- und seitlichen Streuung wird die Maschine so eingestellt, dass sie lebende einzelne Zellen einschließt und Zelltrümmer und Klumpen von Zellen ausschließt. Es wurden insgesamt 5000 Ereignisse gesammelt und die Analyse der Daten wurde unter Verwendung des Lysis II-Softwareprogramms von Becton & Dickinson vorgenommen. Dieses Programm produziert Histogramme von jeder Zellprobe und berechnet die mittlere Kanalfluoreszenz der Zellpopulation, die sich direkt auf die Oberflächendichte der fluoreszierend markierten HCV-Proteine bezieht, die an die Zellen gebunden sind. Die mittleren Fluoreszenzwerte (mittlere Kanalzahl) der mit oder ohne HCV-Proteine und mit Immunserum oder Serum vor der Immunisierung inkubierten Zellen wurden verglichen. Die Schwelle für positive Ergebnisse wird für jedes Experiment mittels durchflusscytometrischer Analyse von Zellen ohne gebundene HCV-Proteine festgesetzt, die mit Antiseren gegen HCV-Proteine und dem FITC-markierten zweiten Antikörper inkubiert wurden. Ein repräsentatives Bindungsexperiment ist in 1 gezeigt, das die mittels durchflusscytometrischer Analyse erreichte Trennung zeigt.
Das Experiment wurde auch mit einer Vielzahl von Zelllinien durchgeführt (zum Beispiel andere hämatopoetische Zellen als MOLT-4 wie Jurkat, K562, Daudi, EBV-B (mit Epstein-Barr-Virus transformierte B-Zelllinie) und Epithelzellen wie Hela, Adenocarcinom und Huh 7), um Zellen zu identifizieren, die in der Lage sind, HCV-Proteine zu binden, und damit Zellen, die den/die vermutlichen Rezeptoren) für HCV haben, gemäß dem vorstehend beschriebenen Protokoll. Es ist ersichtlich, dass die Wiederholung dieses Experiments für die Durchführung der vorliegenden Erfindung nicht erforderlich ist, sondern zum Nachweis der allgemeinen Natur des vermutlichen Rezeptors dient (die meisten der Zellen sind in jedem Fall allgemein verfügbar und wurden tatsächlich bei der ATCC erhalten). Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt, zusammen mit denen für MOLT-4, und zeigen, dass die spezifische Bindung von E2 an Zellen weitverbreitet ist, was nahe legt, dass der HCV-Rezeptor überall zu finden ist.
In einer ähnlichen Serie von Experimenten wurden gereinigtes RA, gereinigtes RO, aus Nabelschnurblut gereinigtes RA, mit pha stim. RA aus Nabelschnurblut, KC3 TCC und SAG S9 TCC auf ihre Bindung an rekombinantes HCV E2-Protein getestet, das in CHO-Zellen exprimiert wurde (E2-CHO), und bestätigten, dass die Bindung bei nicht transformierten Zellen auftritt. Die Resultate sind in 3 gezeigt.
2.2. Wirkung der Modifikation von E2 auf die Bindung
Die Wirkungen der Modifikation des rekombinanten HCV-Proteins E2, das in CHO-Zellen exprimiert wurde (E2-CHO), auf die Bindung an MOLT-4-Zellen wurden unter Verwendung eines reduzierenden Mittels und eines deglycosylierenden Enzyms untersucht.
2.2.1. Reduktion von E2
25 μl E2-CHO SMC-PC (130 μg/ml) in 20 mM Kaliumphosphat, 0.1 M NaCl, pH 6,0 wurden bei pH 8,0 mit 1 M Tris-Base (insgesamt 1 μl) gepuffert und dann BSH (beta-Mercaptoethanol) mit einer Endkonzentration vom 500 mM zugegeben; die Röhrchen wurden mit Stickstoff gespült und die Reaktion wurde 100 Minuten bei 37°C laufen gelassen.
Proben von zuvor wurden mit RPMI-Medium 1 : 20 verdünnt und für einen FACS-Bindungstest mit MOLT-4-Zellen verwendet, wie vorstehend beschrieben. Die Endkonzentration an BSH in dem FACS-Test war 12,5 mM und unter diesen Bedingungen wurde in vorhergehenden vorläufigen Experimenten verifiziert, daß die Zellen lebendig sind (bei 50 mM BSH noch über 90% der Zellen lebendig).
Die Ergebnisse in 4 zeigen, daß die Bindung von MOLT-4-Zellen an rekombinantes E2 bei Reduktion mit beta-Mercaptoethanol substantiell reduziert ist, was das Notwendigkeit einer korrekten E2-Konformation anzeigt, die durch S-S-Brücken aufrechterhalten wird.
2.2.2. Deglycosylierung von E2
Zu 25 μl E2-CHO SMC-PC (130 μg/ml) in 20 mM Kaliumphosphat, 0,1 M NaCl, pH 6,0 wurden 30 μl 0,2 M NaHP₂O₄ mit einem endgültigen pH von 5,5 zugegeben plus SDS mit einer Endkonzentration von 0,01%. Dann wurden 10 μl einer Endo-H-Stammlösung mit einer Endkonzentration von 200 mU/ml unter Einhaltung eines konstanten pH zugegeben und die resultierende Probe wurde 20 Stunden bei 37°C gehalten. Die Probe wurde dann mit RPMI 1 : 20 verdünnt und für einen FACS-Bindungstest verwendet, wie vorstehend beschrieben.
Die Resultate in 5 zeigen, daß die Bindung von MOLT-4-Zellen an rekombinantes E2 bei Deglycosylierung mit Endo-H substantiell reduziert ist, was das Notwendigkeit der Glycosylierung von E2 für die Bindung anzeigt.
2.3. Produktion von monoclonalem Antikörper
Monoclonale Antikörper wurden unter Verwendung von Standardverfahren und durch Immunisierung von Mäusen mit rekombinantem, in CHO-Zellen produziertem HCV-E2 (E2-CHO) hergestellt. Es wurden mehrere Zelllinien etabliert, die in der Lage waren, an E2-CHO zu binden, ebenso wie Zelllinien, die in der Lage waren, an E2 zu binden, das an MOLT-4-Zellen gebunden war, und Zelllinien, die in der Lage waren, die Bindung von E2-CHO an MOLT-4-Zellen zu neutralisieren.
3. Gewinnung des vermutlichen 24 kD-Rezeptors
3.1. Gewinnung des 24-kD-Proteins aus MOLT-4-Zellen
Das 24-kD-Protein wurde aus MOLT-4-Zellen durch Membranreinigung und durch Plasmamembranreinigung gereinigt, wobei das letztere die besserer Ausbeute an Protein ergab.
3.1.1. Membranreinigung
MOLT-4-Zellen wurden bei 37°C, 5% CO₂ in RPMI gezüchtet, das mit 25 mM Hepes gepuffert war in einem Wachstumsmedium, das Fötales Kälberserum (FCS – Endkonzentration 5%), 1 mM Glutamin, 100 μg/ml Kanamycin, MEM Vitamine (Gibco), 1 mM Natriumpyruvat, MEM nicht essentielle Aminosäuren (Gibco) und 5 × 10^–5 M (β-Mercaptoethanol enthielt.
Die Zellen wurden nach dem Erreichen einer Dichte von 750.000 bis 1.000.000 Zellen pro ml geerntet.
Das Zellen enthaltende Wachstumsmedium wurde bei 300 g 10 Minuten zentrifugiert, um die Zellen als Pellet zu erhalten. Die Zellen im Pellet wurden dreimal mit PBS-Puffer gewaschen (resuspendiert und erneut zentrifugiert).
Das Zellpellet wurde in hypotonischer Lösung mit 1 ml hypotonischer Lösung pro 100 × 10⁶ Zellen resuspendiert.
Die hypotonische Lösung enthielt Tris (10 mM), NaCl (10 mM), CaCl₂ (0,2 mM), MgCl₂ (1,5 mM), PMSF (1,0 mM), Aprotinin (2,0 μg/ml), Pepstatin (0,7 μg/ml) und Leupeptin (0,5 μg/ml).
Die Zellen wurden 20 Minuten unter vorsichtigem Schütteln bei 4°C gelassen und dann mit 25 Schlägen mit einem Potter manuellen Homogenisator zerstört.
Die Membranen wurden nach sequentieller Zentrifugation des Überstands bei 100 g für 7 Minuten, bei 3500 g für 10 Minuten und bei 40.000 g für 60 Minuten gewonnen. Das wie obenstehend erhaltene Pellet wurde in geeignetem Puffer aufgelöst.
Der für die Auflösung des Membranpellets bei 40.000 g verwendete Puffer enthielt 1 % Triton X-100 in PBS-Puffer, pH 7,4, 8 mM Chaps in PBS-Puffer, pH 7,4 und 4 M Harnstoff in Natriumphosphatpuffer, pH 7,4.
Alle für die Auflösung der Membran verwendeten Puffer enthielten Protease-Inhibitoren mit den vorstehend berichteten Konzentrationen für die hypotonische Lösung und wurden in einem Verhältnis von 200 μl Puffer pro 5 × 10⁸ Zellen verwendet.
Gelöstes Material wurde bei 100.000 g 60 Minuten zentrifugiert und der Überstand nach der Abschätzung des Proteingehalts mittels des BCA-Verfahrens für die weitere Verwendung aufbewahrt.
Das erhaltene Material wurde wie nachstehend beschrieben Analysen unterworfen.
3.1.2. Plasmamembranreinigung
Das Verfahren für die Plasmamembranreinigung basierte auf Morre' D. J. et al (8).
MOLT-4-Zellen wurden bei 37°C, 5% CO₂ in RPMI gezüchtet, das mit 25 mM Hepes gepuffert war in einem Wachstumsmedium, das Fötales Kälberserum (FCS – Endkonzentration 5%), 1 mM Glutamin, 100 μl/ml Kanamycin, MEM Vitamine (Gibco), 1 mM Natriumpyruvat, MEM nicht essentielle Aminosäuren (Gibco) und 5 × 10^–5 M (β-Mercaptoethanol enthielt.
Die Zellen wurden aus dem Kulturmedium pelletiert und dreimal mit PBS gewaschen.
Die pelletieren Zellen wurden in 0,2 mM EDTA, 1 mM HaHCO₃ resuspendiert, das die folgenden Protease-Inhibitoren enthielt: PMSF (1,0 mM), Aprotinin (2,0 μg/ml), Pepstatin (0,7 μg/ml), Leupeptin (0,5 μg/ml) mit einem Verhältnis von Puffer zu Zellen von 2 ml pro jeweils 10⁸ Zellen.
Die resuspendierten Zellen wurden mit einem Polytron Homogenisator unter Verwendung einer S25 N10 G-Sonde 40 Sekunden bei 9500 rpm aufgebrochen. Der Zellaufbruch wurde mit einem optischen Mikroskop verifiziert. Das Homogenat wurde bei 300 g zentrifugiert und der resultierende Überstand weiterhin bei 23.500 g 60 Minuten resuspendiert. Das resultierende Pellet wurde in 0,2 M Kaliumphosphat, pH 7,2, resuspendiert, das Proteaseinhibitoren in den vorstehend beschriebenen Verhältnissen enthielt. Das Puffervolumen war 1 ml pro jeweils 5 × 10⁸ Zellen.
Die Membransuspension wurde über das folgende Zweiphasensystem aufgetrennt:

20% (Gew./Gew.) T500 Dextran 13,2 g

40% (Gew./Gew.) PEG 3350 6,6 g

0,2 KP, pH 7,2 0,8 ml

Membransusp. 5,0 g

destilliertes Wasser bis zu 35 g
Die Probe wurde auf 4°C gekühlt und die Röhrchen wurden 30 bis 40 mal gewendet, wobei die Temperatur konstant gehalten wurde. Die Probe wurde dann in einem Schwingrotor bei 150–200 g 5 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Die obere Phase wurde entfernt und mit 1 mM Natriumbicarbonat fünffach verdünnt, das Proteaseinhibitoren enthielt. Die Membranen wurden durch 30 Minuten Zentrifugation bei 30.000 g gewonnen.
Das Pellet wurde in einem geeigneten Puffer gelöst und 60 Minuten bei 100.000 g zentrifugiert, um nicht gelöstes Material zu entfernen.
Das erhaltene Material wurde wie nachstehend beschrieben Analysen unterworfen.
3.2. Überexprimierende MOLT-4-Zellen
Eine weitere Zelllinie, die in der Lage ist, die charakteristischer Bindungsfähigkeit für E2 zu überexprimieren, wurde durch Selektion und Reclonierung von MOLT-4-Zellen hergestellt, die E2 stark binden. Die resultierende Zelllinie zeigte eine deutlich größere Bindungsaffinität für E2 als der Wildtypstamm.
4. Charakterisierung des Rezeptors
4.1. Western Blot-Protokoll
Die folgenden Experimente zeigen die Bindung von E2 an gereinigtes 24 kD-Protein in einem Western Blot von Proteinen von MOLT-4-Zellen, die aus Membranen und aus Plasmamembranen und aus peripheren mononukleären Zellen des Bluts (PBMC) gereinigt waren.
Außer anders angezeigt wurden alle SDS-PAGE-Experimente gemäß Laemmli et al (9) durchgeführt, Proben von gelösten Membranen wurde unter nicht reduzierenden Bedingungen und ohne Kochen vor jedem Elektrophoreselauf laufen gelassen.
Nach dem elektrophoretischen Transfer (Western Blot) in Puffer, der 25 mM Tris, 192 mM Glycin, 20% Methanol enthielt, bei einem konstanten elektrischen Feld von 10 Volt/cm, wurden die geblotteten Transferträger bei Raumtemperatur 2 Stunden in PBS-Puffer, pH 7,4 gesättigt, der 0,05% Tween 20 und 10% Trockenmagermilch enthielt. Nach 1 × 15 Minuten und 2 × 5 Minuten Waschen in PBS, 0,05% Tween 20, das 1% Trockenmagermilch enthielt, wurden die Transferträger übernacht mit rekombinantem E2-CHO-Protein bei einer Konzentration von 1–2 μg/ml inkubiert, das in PBS-Puffer gelöst war, der 0,05% Tween 20, 1 % Milch und 0,02% Natriumazid enthielt. Negative Kontrolltransferträger (die mit denselben Proben geblottet wurden) wurden dieselbe Zeit in demselben Puffer ohne E2-CHO-Protein inkubiert.
Um das rekombinante E2-CHO-Protein nachzuweisen, das an die Transferträger gebunden war, wurden diese mit dem Kulturüberstand eines Hybridoms mit der Bezeichnung 291 A2 (einem monoclonalen Antikörper, der Epitope erkennt, die auf E2 angeboten werden, wenn es an den vermutlichen Rezeptor gebunden ist) bei einer Verdünnung von 1 : 500 in PBS, 0,05% Tween, 1% Milch, 2 Stunden inkubiert.
Nach diesem Schritt wurden die Transferträger 1 × 15 Minuten und 2 × 5 Minuten mit einer Lösung aus PBS, 0,05% Tween, 1% Milch gewaschen. Die Transferträger wurden dann eine Stunde mit einem mit Biotin konjugiertem Ziege-anti-Maus-Immunglobulin-spezifischen polyclonalen Antikörper von kommerzieller Quelle (PharMingen, San Diego, CA, USA) bei einer 1 : 2000-Verdünnung in der vorstehend erwähnten PBS/Tween/Milch-Lösung inkubiert. Nach diesem Schritt wurden die Transferträger 1 × 15 Minuten und 2 × 5 Minuten mit PBS/Tween/Milch gewaschen. Letztlich wurden die Transferträger eine Stunde mit Extravidin^®-Peroxidase (Sigma Immunochemicals Co., St Louis, MO, USA) bei einer 1 : 2500-Verdünnung in PBS/Tween/Milch-Lösung inkubiert. Die Transferträger wurden dann 1 × 15 Minuten und 4 × 5 Minuten mit PBS-Puffer, pH 7,4, gewaschen, der 0,05% Tween 20 enthielt. Die Chemilumineszenz-Färbung wurde unter Verwendung des ECL-Western Blotting-Nachweisreagens (Amersham, UK) durchgeführt.
4.1.1. Membranproteine
Eine Membranherstellung wurde wie vorstehend beschrieben hergestellt. Die Membranpellets als Resultat der Zentrifugation bei 40.000 g wurden in Puffern gelöst, die nachstehend beschrieben werden und bei 100.000 g zentrifigiert, um nicht gelöstes Material zu entfernen. Die Pellets wurden noch einmal mit 1% Triton in PBS bei pH 7,4 extrahiert.
Nach einer SDS-PAGE (15 μg/Spur) und Blotting wurden die Transferträger mit rekombinantem E2-CHO-Protein inkubiert, wie vorstehend beschrieben.

Die Resultate sind in 6 gezeigt.

Spur	Beschreibung
1A	4 M Harnstoff in 50 mM Natriumphosphat, pH 7,2
2A	Pellet von der Probe von Spur 1A, gelöst in 1% Triton X-100 in PBS, pH 7,4
3A	1% Triton X-100 in PBS, pH 7,4
4A	Pellet von der Probe von Spur 3A, gelöst in 1% Triton X-100 in PBS, pH 7,4
5A	0,01% Triton X-100 in PBS, pH 7,4
6A	Pellet von der Probe von Spur 5A, gelöst in 1% Triton X-100 in PBS, pH 7,4

1B bis 6B sind die negativen Kontrollen für die entsprechenden Proben in den Spuren 1A bis 6A.
Die Proteinbande bei 24 kD ist klar sichtbar.
4.1.2. Plasmamembranproteine
Eine Plasmamembranherstellung wurde wie vorstehend beschrieben hergestellt.
Die Plasmamembranen wurden in in PBS, pH 7,4 gelöst, das 1% Triton X-100 enthielt, und einer Laemmli SDS-PAGE unterworfen. Der Transferträger wurde mit dem rekombinanten E2-CHO-Protein inkubiert.
Die Resultate sind in 7 gezeigt.

Spur Beschreibung 1A Plasmamembranen, 10 μg Gesamtproteingehalt

2A Plasmamembranen, 5 μg Gesamtproteingehalt
Die Spuren 1B und 2B sind die negativen Kontrollen für die entsprechenden Proben in den Spuren 1A und 2A.
Die Proteinbande bei 24 kD ist klar sichtbar.
4.1.3. Western Blot von PBMC-Zellen
Um festzustellen, ob das 24 kD-Protein in normalen Zellen identifiziert werden konnte, wurde eine Probe an peripheren mononukleären Zellen des Bluts unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Verfahren und wie vorstehend beschrieben einem Western Blot unterworfen.
Die Resultate sind in 8 beschrieben.

Spur Beschreibung 1/2 Molt-4-Membranproteine

3 PBMC Membranproteine (22 μg/ml) 4 PBMC Membranproteine (44 μg/ml)
Die negativen Kontrollspuren werden als "-E2 CHO" bezeichnet
4.2. Zelloberflächenexpression von Rezeptor
Unter Verwendung der vorstehen beschriebenen Protokolle wurden unter Verwendung von FACscan und Western Blot verschiedene Zelltypen auf die Anwesenheit des 24 kD-Proteins als vermutlichen HCV-Rezeptor analysiert.
Die Ergebnisse sind nachstehend gezeigt:
Diese Resultate zeigen, dass die Artenverteilung des 24 kD-Proteins übereinstimmt mit der Empfänglichkeit für die HCV-Infektion.
4.3. Wirkung von Enzymen auf die Bindung des 24 kD-Proteins
4.3.1. Durchflusscytometrie
Die biochemische Natur der Zelloberflächenkomponente (Rezeptor), der die Anheftung des E2-CHO-Hüllproteins an Molt-4-Zellen vermittelt, wurde untersucht. Die Vorbehandlung von Molt-4-Zellen mit V. cholerae-Neuraminidase, die eine α-2,3-Spezifität hat, reduziert die Bindung von E2-CHO nicht.
Die Proteinnatur des Rezeptors wurde gezeigt, weil Zellen, die mit Proteasen vorbehandelt waren, die Bindungsfähigkeit für E2-CHO völlig verloren, während die Behandlung von Zellen mit Phospholipase die Bindung nicht beeinflußte, was nahelegt, dass die zellulären Anheftungsproteine nicht über einen Glycosylphophatilylinositol-Anker verknüpft waren. Die E2-Bindungsstelle auf Molt-4-Zellen waren empfindlich gegenüber allen verwendeten Proteasen, was Serinproteasen wie Trypsin einschließt und eine Thioprotease wie Papain.
Die Resultate der proteolytischen Behandlung zeigte die Einbindung von Membranproteinen bei der Bindung von Hüllprotein und waren wie folgt:
Zellen (10⁶ ml^–1) wurden bei 37°C 60 Min. in RPMI 1640/Hepes-Medium plus der oben angezeigten Enzyme inkubiert. Die Zellen wurden zentrifugiert, in frischem Medium resuspendiert und mit E2-CHO-Protein (3 μg/ml) inkubiert. Gereinigter monoclonaler Antikörper gegen E2-CHO (1,5 μg/ml) wurde als ein zweiter Schritt verwendet. Gereinigter und mit Phycoerythrin markierter Kaninchen-anti-Maus-Antikörper (5 μg/ml) wurde als drittes Reagens verwendet. Insgesamt 5000 Zellen wurden mit einem FACScan Durchflusscytometer bewertet.
Es wurden Enzyme mit einer Konzentration verwendet, die die Lebensfähigkeit der Zelle nicht beeinträchtigte, gemessen mittels Propidium-Jodid-Ausschluß während der FACS-Analyse.
Die Fluoreszenz wurde in willkürlichen Einheiten (Kanalzahlen) im logarithmischen Maßstab aufgezeichnet und die mittleren Intensitäten bestimmt. Die Daten von den einzelnen Experimenten wurden in Bezug auf die Fluoreszenz der nicht gefärbten Kontrollproben normalisiert und die Werte sind als Prozent der Fluoreszenzintensitäten in den gefärbten Kontrollproben angegeben.
4.3.2. Western Blot von MOLT-4/N-Glycosidase F
Peptid-N-Glycosidase F-Behandlung wurde durch Inkubation von Membranproteinen (50 μg) übernacht bei 37°C in Phosphatpuffer, pH 7,4, 25 mM EDTA plus Enzym (50 U/ml) durchgeführt und aufeinanderfolgend auf 12% SDS-PAGE geladen.
Um die Aktivität des Glycosidase F-Enzyms (PNGase F) zu zeigen, wurde als Kontrolle das Polypeptid gp 12o in demselben Experiment verwendet (Daten nicht gezeigt).
Die Resultate sind in 9 gezeigt.

Spur Beschreibung

1 +/ve Kontrolle

2 behandelte und gekochte Membran

3 unbehandelte und gekochte Membran

4 behandelte Membran

5 unbehandelte Membran
Diese Resultate zeigen, dass die Behandlung einer MOLT-4-Membranzubereitung mit Peptid-N-Glycosidase F, die alle N-verknüpften Glycane hydrolysiert, die E2-CHO-Bindung nicht unterbindet.
4.4. Wirkung von reduzierenden Bedingungen auf die Bindung
Ein Western Blot von MOLT-4- und COS-7-Membranen, wie vorstehend beschrieben hergestellt, wurde unter reduzierenden und nicht reduzierenden Bedingungen einer Elektrophorese unterzogen, um die Erfordernis oder anders von Disulphidbrücken in dem 24 kD-Protein festzustellen, indem die Bindung von E2-CHO an den Transferträger gemessen wurde.
Die Transferträger wurde wie vorstehend beschrieben mit rekombinantem E2-CHO-Protein inkubiert.

Die Resultate sind in 10 gezeigt.

Spur	Beschreibung
1A	COS-7-Membranen in nicht reduzierenden SDS-Laemmli-Puffer
2A	MOLT-4-Membranen in nicht reduzierenden SDS-Laemmli-Puffer
3A	COS-7-Membranen in SDS-Laemmli-Puffer, der 5% β-SH enthält
4A	MOLT-4-Membranen in SDS-Laemmli-Puffer, der 5% β-SH enthält

1B bis 4B sind negative Kontrollen für die entsprechenden Spuren 1A bis 4A.5
5. Optimierung der Reinigung
5.1. Immunpräzipitation
Lösung der Membranproteine
Eine Membranzubereitung von 400 Millionen MOLT-4-Zellen (Subclon A2A6) wurde mit 200 μl PBS-Puffer, pH 7,4, behandelt, der 7,5 mM CHAPS und die folgenden Proteaseinhibitoren in μl/ml enthielt: PMSF 35, Aprotinin 2, Pepstatin 0,7, Leupeptin 0,5. Nach der Behandlung mit den vorstehenden Puffern wurde die resultierende Suspension bei 100.000 g eine Stunde zentrifugiert und mit dem klaren Überstand wurden Immunpräzipitationsexperimente vorgenommen. Die endgültige Proteinkonzentration, basierend auf dem BCA-Proteintest (Pierce, USA), war 2,7 ng/ml.
Inkubation mit dem rekombinanten E2-Hüllprotein
200 μl der Membranproteinlösung (2,7 mg/ml) in PBS-CHAPS wurden zu 15 μl zu CHO-produzierter E2-Lösung (Ansatz P4) zugegeben. Die Konzentration der Stammlösung von E2-P4-Protein war 130 μl/ml und die Endkonzentration in der Membranproteinlösung war 9,75 μg/ml.
Das Gemisch wurde übernacht unter Rühren bei 4°C gehalten.
Inkubation mit Kaninchen-anti-E2-Antiseren
Die resultierende Lösung wurde in zwei Teilmengen von 100 μl aufgeteilt und jede mit 5 μl Antiserum von einem Kaninchen (R#1) vor und nach der Immunisierung gemischt, das zuvor mit dem E2-Protein immunisiert worden war. Die Endverdünnung der Antiseren war 1 : 20. Die Inkubation wurde 1 Stunde bei 4°C durchgeführt.
Zugabe von Protein-A-Sepharose CL-4B
Protein-A-Sepharose CL-4B-Harz (Pharmacia, Schweden) wurde intensiv mit PBS gewaschen, das 7,5 mM CHAPS bei pH 7,4 enthielt und 30 μl an kompaktem Schlamm (die Kapazität der Matrix ist 20 μg von menschlichem IgG pro ml Schlamm) wurden zu je 100 μl Probe zugegeben, die vom vorstehenden Schritt resultierte. Die Inkubation wurde unter Rühren 1 Stunde bei 4°C durchgeführt.
Die Proben wurden zentrifugiert, um aus dem Harz ein Pellet zu bilden und der Überstand wurde entfernt, mit Laemmli-Puffer gemischt (ohne reduzierendes Mittel) und für die SDS-PAGE aufbewahrt. Das Harzpellet wurde zweimal mit 500 μl PBS-CHAPS gewaschen (jede Waschung 10 Min. bei 4°C) und dann wurde das Pellet mit 50 μl Laemmli-Puffer behandelt, der 5 M Harnstoff enthielt. Der resultierende Überstand wurde der SDS-PAGE unterworfen.
SDS-PAGE und Immunblot
Die Proben von den vorstehenden Schritten, das heißt Überstand, der Material enthielt, das nicht an Protein-A-Matrix (SN) absorbiert worden war, und Material, das von der Protein-A-Matrix (ProtA) desorbiert worden war, von den Antiseren vor und nach der Immunisierung, wurden auf ein SDS-PAGE-Gel in einem nicht reduzierenden Puffer und ohne Aufheizen geladen. Nach dem Lauf wurden die Gele mittels Elektroblotting auf Nitrocellulosepapier in 20%-igem Methanol-Tris-Glycin-Puffer gebracht und wie vorstehend beschrieben der Immunfärbung unterworfen. Die Inkubation mit E2-Protein wurde übernacht unter Verwendung von E2 SMC-PC mit 1,73 μg/ml in PBS, 0,05% Tween, 20,1% Milch durchgeführt.
Die auf SDS-PAGE geladenen Proben waren:

A) Überstand (nicht von Prot-A zurückgehaltenes Material) von Antiserum vor der Immunisierung
B) Von Prot-A desorbiertes Material von Antiserum vor der Immunisierung
C) Überstand von Antiserum nach der Immunisierung, und
D) Von Prot-A desorbiertes Material von Antiserum nach der Immunisierung

Drei Ansätze dieser Proben wurden auf ein Gel geladen, eine wurde direkt im Gel gefärbt, die beiden andern wurden der Immunfärbung unterworfen, eine mit E2 inkubiert, die andere als negative Kontrolle.
Der auf Nitrocellulose übertragene Träger wurde mir dem rekombinanten Protein E2-CHO SMP-PC mit 1,73 μg/ml inkubiert, gefolgt von Kulturüberstand des Hybridoms 291A2 (der einen monoclonalen Antikörper enthält, der Epitope erkennt, die von E2 gezeigt werden, wenn es an seinen vermutlichen Rezeptor gebunden ist), biotinylierte polyclonale anti-Maus-Ig-Antikörper und mit Peroxidase markiertes Extravidin^TM (Sigma Immunochemicals, USA) Die Chemilumineszenz-Färbung wurde ECL-Luminol (Amersham, GB) erhalten, 1 Minute Einwirken.

Die Ergebnisse sind in 11 gezeigt.

Spur	Beschreibung
1A	Molekulargewichtsstandard
2A	Leer
3A	Mit Kaninchenserum vor der Immunisierung inkubierte Probe – Überstand
4A	Mit Kaninchenserum vor der Immunisierung inkubierte Probe – an Protein-A gebunden
5A	Mit Kaninchenserum nach der Immunisierung inkubierte Probe – Überstand
6A	Mit Kaninchenserum nach der Immunisierung inkubierte Probe – an Protein-A gebunden

Die negativen Kontrollen verwendeten die Nitrocellulosemembran, die mit dem Kulturüberstand des Hybridoms 291A2 inkubiert worden war, gefolgt von biotinylierten polyclonalen anti-Maus-Ig-Antikörpern und mit Peroxidase markiertem Streptavidin. 1B bis 4B entsprechen 3A bis 6A.
5.2. Ammoniumsulphatfraktionierung
Aus MOLT-4-Zellen wurden, wie in dem Membranzubereitungsprotokoll beschrieben, Membranen gewonnen und in PBS-Puffer, pH 7,4, gelöst, der 8 mM CHAPS enthielt. Die Proteinkonzentration, geschätzt auf der Basis des BCA-Tests, reicht von 1,8 bis 2,5 mg/ml.
Die gelösten Membranen wurden mit einer gesättigten Ammoniumsulphatlösung (AS) in einem Volumen gemischt, das ausreichte, um eine 25%-ige Sättigung an Ammoniumsulphat zu erhalten (d. h. die Endkonzentration an AS ist 25% der gesättigten Ausgangslösung). Die Probe durfte 2 Stunden in schmelzendem Eis stehen und wurde dann 30 Minuten bei 15800 g zentrifugiert.
Der Überstand wurde mit der gesättigten AS-Lösung zu einer Endkonzentration von 50% gemischt. Die Probe durfte 2 Stunden in schmelzendem Eis stehen und wurde dann 15 Minuten bei 4°C in einer Spin-X-Zentrifugenfiltereinheit (Costar, Cambridge, MA, USA) filtriert.
Die vorstehend erhaltenen Niederschläge wurden in geeigneten Puffern gelöst und weiter behandelt.
Die Pellets wurden erneut in PBS, pH 7,4, gelöst, das 10 M Harnstoff enthielt und einer Laemmli SDS-PAGE unterworfen. Die Volumen der AS-Fraktionen wurde so aufgebracht, dass die Mengen an vermutlichem Rezeptor in den verschiedenen Proben vergleichbar sein sollten.
Der Transferträger wurde wie vorstehend beschrieben mit rekombinantem E2-CHO-Protein inkubiert.
Die Resultate sind in der 12 gezeigt und zeigen, dass die Ausfällung von p24 im Bereich von 33 bis 50% Sättigung erfolgt.

Spur Beschreibung

1A Ausgangsmembranen

2A 20% AS-Fraktion

3A 33% AS-Fraktion

4A 43% AS-Fraktion

5A 50% AS-Fraktion

6A 60% AS-Fraktion
5.3. Hydrophobe Wechselwirkungschromatogrraphie
1,5 ml gelöste Membranen von MOLT-4-Zellen (Proteinkonzentration 2,5 mg/ml) wurde bei 25% Sättigung an Ammoniumsulphat vorfraktioniert und der Überstand von diesem Schritt wurde auf 50% Sättigung an AS gebracht. Der erhaltene Niederschlag wurde in 200 μl PBS resuspendiert, das Ammoniumsulphat mit 25% Sättigung enthielt. Das nicht gelöste Material wurde durch 30 Minuten Zentrifugation bei 15800 g pelletiert. Der erhaltene Überstand wurde mit 200 μl Phenyl-Sepharose-Matrix (Pharmacia, Uppsala, Schweden) inkubiert, die zuvor 2 Stunden bei Raumtemperatur in PBS, pH 7,2, das AS mit 25% Sättigung enthielt, äquilibriert worden war.
Das nicht erhaltene Material wurde durch Filtern in einer Spin-X-Zentrifugenfiltereinheit (Costar, USA) gewonnen.
Die Matrix an Phenyl-Sepharose wurde dann zweimal mit 100 μl PBS, 25% AS-Sättigung und einmal mit 300 ml desselben Puffers gewaschen. Die Matrix wurde dann mit PBS, pH 7,4, (200 μl) eluiert und dann mit PBS, pH 7,4, das 20 McOH enthielt. Letztlich wurde die Matrix mit 40 μl nicht reduzierendem Laemmli-Puffer behandelt.
Ammoniumsulphat enthaltende Proben (d. h. nicht zurückgehaltenes und Waschmaterial) wurden gegen 8 M Harnstoff in PBS, pH 7,4, dialysiert.
Alle Proben wurden der SDS-PAGE-Analyse und dem Western Blot unterworfen.
5.4. Acetonfällung
50 μl in 8 mM CHAPS in PBS, pH 7,4, gelöste Membranen von MOLT-4-Zellen wurden mit 200 μl Aceton gemischt.
Die Probe wurde 15 Minuten bei 15800 g zentrifugiert und der Überstand verworfen. Der erhaltene Niederschlag wurde in nicht reduzierendem Laemmli-Probenpuffer gelöst und SDS-PAGE und Western Blot unterworfen. Die Transferträger wurden wie vorstehend beschrieben mit rekombinantem E2-CHO-Protein inkubiert.

Die Resultate der kombinierten HIC- und Acetonfällungsexperimente sind in 13 gezeigt.

Spur	Beschreibung
1A	Ausgangsmembranen (16 μl Gesamtproteingehalt)
2A	Nicht von der Matrix zurückgehaltenes Material
3A	Waschlösung
4A	Mit PBS, pH 7,4, eluiertes Material
5A	Mit PBS, pH 7,4, das 20% Methanol enthält, eluiertes Material
6A	Mit Laemmli-Puffer eluiertes Material
7A	In Triton, 1% PBS, pH 7,4, gelöste Membranen (26 μg Gesamtprotein)
8A	Acetonfällung von Probe 7A

Die Proben 1B bis 8B entsprechen Proben 1A bis 8A.
Diese Experimente zeigen, dass Ammoniumsulphat Matertal ausfällte, das unter geeigneten Bedingungen wiederaufgelöst werden kann und der hydrophoben Wechselwirkungschromatographie unterzogen werden kann. Das vermutliche HCV-Rezeptorprotein von 24 kD bindet an Phenyl-Sepharose und kann von der Matrix gewonnen werden.
Der Membranextrakt kann ohne Verlust der Bindungskapazität des vermutlichen HCV-Rezeptors mit Aceton ausgefällt werden.
Es ist zu verstehen, das die Erfindung vorstehend beispielhaft beschrieben ist und dass im Umfang und Geist der Erfindung ohne unangemessene Experimente und ohne erfinderische Tätigkeit Modifikationen gemacht werden können.
Referenzen

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2. Europäische Patentanmeldung EP-A-0388232
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8. Morre' D. J. et al., Methods Enzymol. (1994) 228, 448-450
9. Laemmli et al Nature (1970) 27 680

Claims

Verwendung eines Transmembran-Proteins mit einem Molekulargewicht von etwa 24 kD, wie bestimmt durch eine Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese auf einem 12%igen Acrylamidgel, das in der Lage ist, spezifisch an das E2-Protein des Hepatitis-C-Virus zu binden, oder eine Variante oder ein Fragment des Proteins, das in der Lage ist, spezifisch an das E2 Protein des Hepatitis-C-Virus zu binden, wobei das Protein durch ein Verfahren erhältlich ist, das die Schritte umfasst: a) Herstellen einer Plasmazellzubereitung aus Säugerzellen, ausgewählt für die Überexpression des erfindungsgemäßen 24 kD-Proteins; b) Durchführen einer Ammoniumsulfatfällung bei weniger als 33% Sättigung mit der Zubereitung und Zurückbehalten des Überstands; c) Durchführen einer Ammoniumsulfatfällung bei einer Sättigung zwischen 33 und 50% mit dem Überstand und Zurückbehalten des Proteins; und d) Resuspendieren des Präzipitats und Durchführen einer hydrophoben Wechselwirkungschromatographie; für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Diagnose einer HCV-Infektion.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Protein funktionell unglycosyliert ist.