DE69333461T2

DE69333461T2 - VERFAHREN ZUM nachweis der Alzheimer Krankheit

Info

Publication number: DE69333461T2
Application number: DE69333461T
Authority: DE
Inventors: D. Allen ROSES; J. Warren STRITTMATTER; S. Guy SALVESEN; Jan Enghild; E. Donald SCHMECHEL
Original assignee: University of Durham; Duke University
Current assignee: University of Durham; Duke University
Priority date: 1992-10-13
Filing date: 1993-09-30
Publication date: 2005-03-24
Anticipated expiration: 2013-10-01
Also published as: NZ257215A; KR100279898B1; CA2142300A1; US6027896A; US5767248A; NO951383D0; EP0625212A1; US5716828A; FI951701A0; JPH07502418A; ES2148116T1; CN1092525A; EP0625212A4; ATE262592T1; DE69333461D1; CN1525168A; CA2142300C; JP3265577B2; EP0625212B1; AU5350094A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Diagnose und Prognose der Alzheimer Krankheit.
Hintergrund der Erfindung
Bei der senilen Plaque und der kongophilen Angiopathie handelt es sich um abnormale extrazelluläre Strukturen, die im Gehirn von Patienten mit Alzheimer Krankheit im Übermaß gefunden werden. Die biochemische Zusammensetzung dieser Strukturen wurde intensiv untersucht, um deren mögliche Rolle bei der Pathogenese dieser Demenzerkrankung besser zu verstehen. Die reife senile Plaque ist eine komplexe Struktur, die aus einem Zentralstück aus Amyloidfasern, die von dystrophischen Neuriten, Axon-Enden und Dendriten, Microglia und faserartigen Astrocyten umgeben sind, besteht. Siehe D. Selkoe Neuron 6, 487-498 (1991). Das Amyloid-Kernstück der senilen Plaque, die Blutgefäße umschließt, und die kongophile Angiopathie erzeugt, ist ein Peptid mit 39 bis 43 Aminosäuren, das als β-Amyloid-Peptid bezeichnet wird. G. Glenner und C. Wong, Biochem. Biophys Res. Comm. 120, 885-890 (1984). Dieses Peptid wird im Gehirn bei der Alzheimer Krankheit, dem Down-Syndrom, der vererbbaren zerebralen Blutung vom "Dutch-Typ" und im hohen Alter gefunden. K. Kosik, Science 256, 780-783 (1992). Es wird durch eine abnormale proteolytische Spaltung eines größeren Proteins hergestellt, dem Amyloid-Vorläuferprotein (amyloid precursor protein, APP). Siehe K. Beyreuther und C. Masters, Brain Path. 1, 241-251 (1991).
Die senile Plaque und die kongophile Angiopathie enthalten zusätzlich zu dem βA-Peptid weitere Proteine. APP selbst ist neben weiteren Proteinen in der senilen Plaque mittels histochemischer Studien identifiziert worden, bei denen Antikörper eingesetzt wurden, die die Amino- und Carboxy-Termini des Vorläuferproteins erkennen. Siehe z B. F. Tagliavine et al., Neurosci. Lett, 128, 117-120 (1991); C. Joachim et al., Amer. Jour. Path. 138, 373-384 (1991). Die Mechanismen, nach denen diese Proteine im extrazellulären Raum aggregieren, um mit der senilen Plaque und der kongophilen Angiopathie zu assoziieren, sind nicht bekannt.
Während die Mechanismen, die der Alzheimer Krankheit unterliegen, relativ intensiv erforscht worden sind, besteht nach wie vor ein Bedarf an neuen Wegen zur Untersuchung und Bekämpfung dieser Krankheit.
Zusammenfassung der Erfindung
Es werden Verfahren zur Diagnose, Prognose oder Screening eines Risikos für Alzheimer Krankheit eines Subjekts offenbart. Diese Verfahren umfassen das Detektieren des Vorliegens oder der Abwesenheit von DNA, die für Apolipoprotein E Typ 4 (ApoE4)-Isoform codiert, oder das Detektieren des Vorliegens oder der Abwesenheit von ApoE4-Isoform in einer biologischen Probe des Subjekts. Das Vorliegen der ApoE4-Isoform oder der DNA, die für die ApoE4-Isoform codiert, weist darauf hin, dass das Subjekt an der Alzheimer Krankheit leidet oder das Risiko trägt, eine Alzheimer Krankheit zu entwickeln.
Die vorstehenden und weiteren Gegenstände und Aspekte der vorliegenden Erfindung werden in den beiliegenden Figuren und der folgenden Beschreibung ausführlich dargestellt.
Kurze Beschreibung der Figuren
1, oberer Teil, zeigt Proteine in der Gehirn-Rückenmark-Flüssigkeit, die an immobilisiertes βA-Peptid und an ein Kontrollpeptidd binden (dem "even-hydro peptide" oder ""E.H.") nach Inkubation und: Eluierung mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, Spalte 1; Eluierung mit 5 % Natriumdodecylsulfat, Spalte 2; Eluierung mit 4 molarem Harnstoff, Spalte 3; oder Eluierung mit 6 molarem Guanidinhydrochlorid, Spalte 4. Die Bindung von Apolipoprotein E ist mittels immunhistochemischem Anfärben im unteren Teil dargestellt.
2, oberer Teil, zeigt die Bindung von Proteinen in der Gehirn-Rückenmark-Flüssigkeit an verschiedene immobilisierte Peptide. Die Bindung von Apolipoprotein E ist wiederum mittels immunhistochemischer Anfärbung in dem unteren Teil dargestellt.
Die 3 zeigt das Alter des Ausbruchs von Subjekten mit 0,1 und 2 ApoE4-Allelen. Jede Kurve ist durch die Anzahl von ApoE4-Allelen markiert. Das Symbol "*" zeigt multiple Diagnosen innerhalb eines kurzen Zeitraums an. Die Ausbruchskurven (onset curves) wurden mit Hilfe von Kaplan-Meier-Produktverteilungen geschätzt und waren deutlich unterscheidbar (Iogrank chi-Quadrat = 53,8, 2 Freiheitsgrade, p < 0,0001).
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Wie vorstehend angegeben, stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Screnen (d. h. Diagnose oder Prognose) auf Alzheimersche Krankheit in einem Subjekt bereit. Das Verfahren umfasst die Detektion des Vorliegens oder der Abwesenheit von ApoE4-Isoform oder der DNA, die eine ApoE4-Isoform kodiert, in dem Subjekt. Das Vorliegen solch einer Isoform oder DNA zeigt an, dass das Subjekt an der Alzheimerschen Krankheit (Alzheimer's disease, AD) leidet oder das Risiko trägt, eine Alzheimersche Krankheit zu entwickeln. Geeignete Subjekte umfassen jene, die nicht zuvor als von der Alzheimerschen Krankheit betroffen diagnostiziert worden sind, jene, bei denen zuvor bestimmt worden ist, dass sie ein Risiko für die Entwicklung der Alzheimerschen Krankheit tragen, und jene, die zunächst als von der Alzheimerschen Krankheit betroffen diagnostiziert worden sind, und bei denen eine Bestätigung der Information erwünscht sind. So sind insbesondere Patienten, bei denen diagnostiziert oder bestimmt worden ist, dass sie an Demenz leiden, insbesondere Patienten, die zuvor klinisch normal waren, bei denen aber bestimmt wurde, dass sie an einer progressiven Demenz leiden, sind geeignete Kandidaten. Folglich kann die vorliegende Erfindung sowohl bei der Detektion von familiärer Alzheimer-Krankheit ("late-onset" und "early-onset", später Ausbruch und früher Ausbruch) als auch der sporadischen Alzheimerschen Krankheit eingesetzt werden.
Der Schritt der Detektion des Vorliegens oder der Abwesenheit von ApoE4 oder von DNA, die für eine solche Isoform codiert, kann entweder direkt oder indirekt mit Hilfe von beliebigen geeigneten Mitteln durchgeführt werden. Dem Fachmann sind eine Vielzahl von Techniken bekannt. Sie alle umfassen im Allgemeinen den Schritt des Sammelns einer Probe von biologischem Material, das entweder DNA oder ApoE von dem Subjekt enthält, und anschließend Detektieren in der Probe, ob das Subjekt A poE4 oder DNA, die für solch eine Isoform codiert, besitzt oder nicht. Der Detektionsschritt kann z. B. ausgeführt werden, indem eine ApoE-Probe dem Subjekt entnommen wird (z. B. Gehirn-Rückenmark-Flüssigkeit oder ein beliebiges weiteres Fluid oder Gewebe, die ApoE enthalten), und anschließend das Vorliegen oder die Abwesenheit einer ApoE4 4-Isoform in der ApoE-Probe bestimmt wird (z. B. mit Hilfe von isoelektrischer Fokussierung oder Immunassay). Alternativ dazu kann der Detektionsschritt durchgeführt werden, indem dem Subjekt eine biologische Probe abgenommen wird, die DNA enthält, und anschließend das Vorliegen oder die Abwesen heit von DNA, die für eine ApoE4-Isoform codiert, in der biologischen Probe bestimmt wird. Jede beliebige biologische Probe, die DNA dieses Subjekts enthält, kann verwendet werden, einschließlich Gewebeproben und Blutproben, wobei Blutzellen eine besonders geeignete Quelle darstellen. Die Bestimmung des Vorliegens oder der Abwesenheit von DNA, die für eine ApoE4 4-Isoform codiert, kann mit einer Oligonukleotidsonde durchgeführt werden, die mit einer geeigneten detektierbaren Gruppe markiert ist, oder mittels einer Amplifizierungsreaktion wie einer Polymerase-Kettenreaktion oder einer Ligase-Kettenreaktion (das Produkt dieser Amplifizierungsreaktion kann anschließend mit einer markierten Oligonukleotidsonde detektiert werden). Ferner kann der Detektionsschritt den Schritt umfassen, zu detektieren, ob ein Subjekt für das Gen, das für eine ApoE4-Isoform codiert, heterozygot oder homozygot ist. Es sind zahlreiche verschiedene Oligonukleotidsonden-Assayformate bekannt, die zur Ausführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Siehe z. B. US-Patent Nr. 4,302,204 von Wahl et al.; US-Patent Nr. 4,358,535 von Falkow et al.; US-Patent Nr. 4,563,419 von Ranki et al. und US-Patent Nr. 4,994,373 von Stavrianopoulos et al..
Die Amplifizierung einer ausgewählten Nukleinsäuresequenz oder Ziel-Nukleinsäuresequenz kann mittels einem beliebigen geeigneten Mittel durchgeführt werden. Siehe allgemein D. Kwoh und T. Kwoh, Am. Biotechnol. Lab. 8, 14-25 (1990). Beispiele für geeignete Amplifizierungstechniken umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Polymerase-Kettenraktion, Ligase-Kettenraktion, Strand Displacement Amplification Verfahren, (siehe allgemein G. Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 392-396 (1992); G. Walker et al., Nucleic Acids Res 20, 1691-1696 (1992)), Transkriptionsbasierte Amplifizierung (siehe D. Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173-1177 (1989)), "self-sustained" Sequenzreplikation (oder "3SR") (siehe J. Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874-1878 (1990)), dem Qβ-Replikasesystem (siehe P. Lizardi et al., Biotechnology 6, 1197-1202 (1988)), Nukleinsäuresequenzbasierte Amplifizierung (oder "NASBA") (siehe R. Lewis, Genetic Engineering News 12 (9), 1 (1992)), die Reparatur-Kettenreaktion (repair chain reaction oder "RCR") (siehe R. Lewis, supra), und Bumerang-DNA-Amplifizierung (oder "BDA") (siehe R. Lewis, supra). Zur Zeit wird die Polymerase-Kettenreaktion bevorzugt.
Im Allgemeinen umfassen DNA-Amplifizierungstechniken wie die vorstehend angegebenen die Verwendung einer Sonde, eines Paars von Sonden, oder zwei Paare von Sonden, die spezifisch an DNA bindet bzw. binden, die für ApoE4 codiert, jedoch nicht an DNA bindet bzw. binden, die für ApoE2 oder ApoE3 codieren, unter den gleichen Hybridisierungsbedingungen, und die als der Primer oder die Primer für die Amplifizierung der ApoE4-DNA oder eines Teils davon in der Amplifizierungsreaktion dienen (gleichermaßen kann eine Sonde, ein Paar von Sonden oder zwei Paare von Sonden verwendet werden, die spezifisch an DNA, die für ApoE2 codiert, bindet bzw. binden, jedoch nicht an DNA, die für ApoE3 oder ApoE4 codiert, unter den gleichen Hybridisierungsbedingungen bindet bzw. binden, und die als der Primer oder die Primer für die Amplifizierung der ApoE2-DNA oder eines Teils davon in der Amplifizierungsreaktion dienen; und ferner kann eine Sonde, ein Paar von Sonden oder zwei Paare von Sonden verwendet werden, die spezifisch an DNA, die für ApoE3 codiert, bindet bzw. binden, jedoch nicht an DNA, die für ApoE2 oder ApoE4 codiert, unter den gleichen Hybridisierungsbedingungen bindet bzw. binden, und die als der Primer oder die Primer für die Amplifizierung der ApoE3-DNA oder eines Teils davon in der Amplifizierungsreaktion dienen).
Im Allgemeinen handelt es sich bei einer Oligonukleotidsonde, die zur Detektion von DNA, die für ApoE4 codiert, eingesetzt wird, um eine Oligonukleotidsonde, die an DNA bindet, die für ApoE4 codiert, jedoch nicht an DNA, die für ApoE2 oder ApoE3 codiert, unter den gleichen Hybridisierungsbedingungen bindet. Die Oligonukleotidsonde ist mit einer geeigneten detektierbaren Gruppe markiert, wie jenen, die im Zusammenhang mit Antikörpern im Folgenden angegeben sind. Ferner handelt es sich bei einer Oligonukleotidsonde, die zur Detektion von DNA verwendet wird, die für ApoE2 codiert, um eine Oligonukleotidsonde, die an DNA bindet, die für ApoE2 codiert, jedoch nicht an DNA, die für ApoE3 oder ApoE4 codiert, unter den gleichen Hybridisierungsbedingungen bindet, und bei einer Oligonukleotidsonde, die zur Detektion von DNA, die für ApoE3 codiert, verwendet wird, handelt es sich um eine Oligonukleotidsonde, die an DNA bindet, die für ApoE3 codiert, jedoch nicht an DNA, die für ApoE2 oder ApoE4 codiert, unter den gleichen Hybridisierungsbedingungen bindet.
Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) kann in Übereinstimmung mit bekannten Techniken durchgeführt werden. Siehe z. B. US-Patente Nr. 4,683,195; 4,683,202; 4,800,159; und 4,965,188. Im Allgemeinen umfasst die PCR als erstes die Behandlung einer Nukleinsäureprobe (z. B. in Gegenwart einer wärmestabilen DNA-Polymerase) mit einem Oligonukleotidprimer für jeden Strang der spezifischen Sequenz, die unter Hybridisierungsbedingungen detektiert werden soll, so dass ein Verlängerungsprodukt jedes Primers synthetisiert wird, das komplementär zu jedem Nukleinsäurestrang ist, wobei die Primer ausreichend komplementär zu dem jeweiligen Strang der spezifischen Sequenz sein sollten, um damit zu hybridisieren, so dass das Verlängerungsprodukt, das aus jedem Primer synthetisiert wird, nach Abtrennung von dessen Komplement als ein Templat für die Synthese des Verlängerungsprodukts des anderen Primers dienen kann, und anschließend die Behandlung der Probe unter denaturierenden Bedingungen, um die Primerverlängerungsprodukte von deren Templaten zu trennen, wenn die Sequenz oder die Sequenzen, die detektiert werden sollen, vorliegen. Diese Schritte werden cyclisch wiederholt, bis ein erwünschter Grad der Ampflifizierung erhalten worden ist. Die Detektion der amplifizierten Sequenz kann durchgeführt werden, indem zum Reaktionsprodukt eine Oligonukleotidsonde zugegeben wird, die fähig ist, an das Reaktionsprodukt zu hybridisieren (z. B. eine Oligonukleotidsonde gemäß der vorliegenden Erfindung), wobei die Sonde eine detektierbare Markierung aufweist, und anschließend die Markierung gemäß bekannten Techniken detektiert wird.
Die Ligase-Kettenreaktion (LCR) wird ebenfalls in Übereinstimmung mit bekannten Techniken durchgeführt. Siehe z. B. R. Weiss, Science 254, 1292 (1991). Im Allgemeinen wird die Reaktion mit zwei Paaren von Oligonukleotidsonden durchgeführt: ein Paar bindet an einen Strang der zu detektierenden Sequenz; das andere Paar bindet an den anderen Strang der zu detektierenden Sequenz. Jedes Paar überlappt vollständig mit dem Strang, mit dem es übereinstimmt. Die Reaktion wird wie folgt durchgeführt: erstens, Denaturieren (z. B. Abtrennen) der Stränge der Sequenz, die detektiert werden soll, anschließend Umsetzen der Stränge mit den zwei Paaren von Oligonukleotidsonden in Gegenwart einer wärmebeständigen Ligase, so dass jedes Paar von Oligonukleotidproben miteinander ligiert wird, anschließend Abtrennen des Reaktionsproduktes und daraufhin cyclisches Wiederholen des Verfahrens, bis die Sequenz in dem gewünschten Ausmaß amplifiziert worden ist. Die Detektion kann auf die gleiche Art und Weise, wie vorstehend in Bezug auf PCR beschrieben wurde, durchgeführt werden.
Es ist anzumerken, dass die Detektionsschritte, die in der vorliegenden Beschreibung beschrieben worden sind, entweder direkt oder indirekt durchgeführt werden können. Wenn z. B. entweder ApoE2 oder ApoE3 ebenfalls in dem Subjekt detektiert werden, dann wird festgestellt, dass das Subjekt für ApoE4 nicht homozygot ist; und wenn sowohl ApoE2 als auch ApoE3 in dem Subjekt detektiert werden, dann wird festgestellt, dass das Subjekt weder homozygot noch heterozygot für ApoE4 ist.
Als eine Alternative zur isoelektrischen Fokussierung und den Techniken für die Allel-Detektion kann der Schritt zum Bestimmen des Vorliegens oder der Abwesenheit der ApoE4-Isoform in einer Probe mittels einem Antikörper-Assay mit einem Antikörper, der selektiv an ApoE4 bindet, durchgeführt werden (d. h. ein Antikörper, der an ApoE4 bindet, jedoch im Wesentlichen keine Bindung an ApoE2 oder ApoE3 unter den gleichen Bindungsbedinungen aufweist). Wenn man das genaue ApoE-Komplement eines Patienten bestimmen will und feststellen will, ob dieser Patient homozygot oder heterozygot für ApoE4 ist, dann können auch Antikörper verwendet werden, die selektiv an ApoE2 und ApoE3 binden (d. h. ein Antikörper, der an ApoE2 bindet, aber im Wesentlichen keine Bindung an ApoE3 oder ApoE4 unter den gleichen Bindungsbedingungen aufweist; ein Antikörper, der an ApoE3 bindet, aber im Wesentlichen keine Bindung an ApoE2 oder ApoE4 unter den gleichen Bindungsbedingungen aufweist).
Antikörper, die für die selektive Bindung an ApoE2, ApoE3 und ApoE4 verwendet werden, können mittels jeder beliebigen geeigneten Technik hergestellt werden. Z. B. können monoklonale Antikörper in einer Hybridomzelllinie gemäß den Techniken von Kohler und Milstein, Nature 265, 495-97 (1975) produziert werden. ApoE2, ApoE3 oder ApoE4 können aus einem menschlichen Patienten erhalten werden, bei dem bestimmt wurde, dass er dafür homozygot ist, anschließend mittels der Technik gereinigt werden, die in S. Rall et al., Methods in Enzymol. 128, 273 (1986) beschrieben worden ist, und als Immunogen für die Produktion von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern verwendet werden. Gereinigte ApoE-Isoformen können durch rekombinante Mittel hergestellt werden, um eine biologisch aktive Isoform zu exprimieren, oder sogar ein immunogenes Fragment davon kann als Immunogen eingesetzt werden. Monoklonale Fab-Fragmente können in Escherichia coli aus den bekannten Sequenzen nach Gentechniken hergestellt werden, die dem Fachmann bekannt sind. Siehe z. B. W. Huse, Science 246, 1275-81 (1989) (recombinant Fab techniques); P. Wenham et al., Lancet 337, 1158 (1991) (Apo PCR primers). Die DNA, die für einen Subtyp von ApoE codiert, kann erhalten und in den anderen Subtyp mittels "site-directed" Mutagenese umgewandelt werden. Siehe z. B. T. Kunkel et al., Methods in Enzymol. 154, 367-382 (1987); T. Kunkel, US-Patent Nr. 4,873,192.
Der Ausdruck "Antikörper", wie er im Rahmen der vorliegenden Beschreibung und der Ansprüche verwendet wird, bezieht sich auf alle Typen von Immunglobulinen, einschließlich IgG, IgM, IgA, IgD und IgE. Die Antikörper können monoklonal oder polyklonal sein und können von jeder beliebigen Spezies abstammen, einschließlich (z. B.) Maus, Ratte, Kaninchen, Pferd, oder vom Menschen, oder es kann sich um Chimäre Antikörper handeln, und Antikörpertragmente umfassen, wie z. B. Fab, F(ab')₂ und Fv-Fragmente, und die korrespondierenden Fragmente, die von Antikörpern erhalten werden, die von IgG verschieden sind.
Die Antikörper-Assays können im Allgemeinen homogene Assays oder heterogene Assays darstellen. In einem homogenen Assay umfasst die immunologische Reaktion im Allgemeinen den spezifischen Antikörper, einen markierten Analyten und die Probe von Interesse. Das Signal, das von der Markierung ausgeht, wird direkt oder indirekt durch die Bindung des Antikörpers an den markierten Analyten modifiziert. Sowohl die immunologische Reaktion als auch die Detektion des Grads der Reaktion werden in einer homogenen Lösung durchgeführt. Immunchemische Markierungen, die verwendet werden können, umfassen freie Radikale, Radioisotope, fluoreszierende Farbstoffe, Enzyme, Bakteriophagen, Coenzyme usw..
In einem heterogenen Assay-Ansatz handelt es sich bei den Reagenzien im Allgemeinen um die Probe, den Antikörper und Mittel zum Produzieren eines detektierbaren Signals. Es können ähnliche Proben wie vorstehend beschrieben verwendet werden. Der Antikörper wird im Allgemeinen auf einem Träger immobilisiert, wie einem Kügelchen, einer Platte oder "slide", und mit der Probe, von der angenommen wird, dass sie das Antigen enthält, in einer flüssigen Phase in Kontakt gebracht. Der Träger wird anschließend von der flüssigen Phase abgetrennt und entweder die Trägerphase oder die flüssige Phase wird auf ein detektierbares Signal untersucht, wobei Mittel zum Produzieren solch eines Signals verwendet werden. Das Signal steht mit dem Vorliegen des Analyten in der Probe in Verbindung. Mittel zum Produzieren eines detektierbaren Signals umfassen die Verwendung von radioaktiven Markierungen, fluoreszierenden Markierungen, Enzym-Markierungen usw.. Wenn z. B. das zu detektierende Antigen eine zweite Bindungsstelle enthält, so kann ein Antikörper, der an diese Stelle bindet, an eine detektierbare Gruppe konjugiert werden und zu der Flüssigphasen-Reaktionslösung vor dem Abtrennungsschritt zugegeben werden. Das Vorliegen der detektierbaren Gruppe auf dem festen Träger weist auf das Vorliegen des Antigens in der Testprobe hin. Beispiele für geeignete Immunoassays sind Radioimmunoassay, Immunfluoreszenz-Verfahren, "enzyme-linked" Immunoassays und ähnliches.
Dem Fachmann sind die zahlreichen spezifischen Immunoassay-Formate und deren Variationen bekannt, die für die Ausführung des in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen offenbarten Verfahrens geeignet sein können. Siehe im Allgemeinen E. Maggio, Enzyme Immunoassay, (1980) (CRC Press, Inc., Boca Raton, Fl); siehe auch US-Patent Nr. 4,727,022 von Skold et al. mit dem Titel "Methods for Modulating Ligand-Receptor Interactions and their Application", US-Patent Nr. 4,659,678 von Forrest et al., US-Patent Nr. 4,376,110 von David et al., US-Patent Nr. 4,275,149 von Litman et al., US-Patent Nr. 4,233,402 von Maggio et al. und US-Patent Nr. 4,230,767 von Boguslaski et al..
Antikörper, die selektiv an eine ApoE-Isoform binden (d. h. an eines von ApoE2, ApoE3 oder ApoE4 binden, während sie im Wesentlichen keine Bindung an die anderen unter den gleichen Bindungsbedingungen aufweisen), können an einen festen Träger, der für einen diagnostischen Assay geeignet ist, konjugiert werden (z. B. Kügelchen, Platten, slides oder wells, die aus Materialien wie z. B. Latex oder Polystyrol geformt sind), in Übereinstimmung mit bekannten Techniken wie z. B. Präzipitierung. Antikörper, die an eine ApoE-Isoform binden, können ebenfalls an detektierbare Gruppen wie z. B. radioaktive Markierungen (z. B. ³⁵S, ^125sI, ¹³¹I), Enzymmarkierungen (z. B. Meerrettich-Peroxidase, alkalische Phosphatase) und fluoreszierende Markierungen (z. B. Fluorescein) in Übereinstimmung mit bekannten Techniken konjugiert werden.
Diagnostische Kits zum Durchführen von Antikörper-Assays können auf eine Vielzahl von Wegen hergestellt werden. Gemäß einer Ausführungsform umfasst das diagnostische Kit (a) einen Antikörper, der an ApoE2, ApoE3 oder ApoE4 bindet, konjugiert an einen festen Träger, und (b) einen zweiten Antikörper, der ApoE2, ApoE3 oder ApoE4 bindet, konjugiert an eine detektierbare Gruppe. Die Reagenzien können auch Hilfsmittel wie z. B. Puffermittel und Protein-stabilisierende Mittel wie z. B. Polysaccharide und Ähnliches enthalten. Der diagnostische Kit kann ferner gegebenenfalls weitere Bestandteile des Signal-produzierenden Systems, von dem die detektierbare Gruppe ein Bestandteil ist (z. B. Enzymsubstrate), Mittel zum Reduzieren der Hintergrundwechselwirkung in einem Test, Kontrollreagenzien, Apparate zum Durchführen eines Tests und Ähnliches enthalten. Eine zweite Ausführungsform eines Testkits umfasst (a) einen Antikörper wie vorstehend angegeben, und (b) einen spezifischen Bindungspartner für den Antikörper, konjugiert an eine detektierbare Gruppe. Hilfsmittel wie vorstehend angegeben können ebenfalls umfasst sein. Der Testkit kann auf jede geeignete Art und Weise verpackt sein, üblicherweise sind alle Elemente in einem einzelnen Behälter zusammen mit einem Blatt mit gedruckten Hinweisen zum Durchführen des Tests.
Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden nicht-beschränkenden Beispielen ausführlich erläutert.
BEISPIEL 1
Bindung von cerebrospinalem Apolipoprotein E an immobilisierte Beta-Amvloid-Vorläuferprotein-Fragmente
βA-Peptide (Bachem), weitere Peptide, oder Ethanolamin wurden kovalent an Immobilon AV Affinitätsmembran (Millipore) immobilisiert. Bei der Membran handelt es sich um eine chemisch aktivierte hydrophile mikroporöse Membran, die kovalent Peptide und Proteine über Amino- und Thiolgruppen immobilisiert. βA-Peptide oder Kontrollpeptide wurden in destilliertem Wasser bei 1 mg Peptid/100 μl gelöst. 10 Mikroliter (enthaltend 100 Mikrogramm Peptid) wurden auf eine Immobilonplatte mit einem Durchmesser von 13 mm aufgetragen und über Nacht bei Raumtemperatur zur Trockene inkubiert. Das Peptid lag im Vergleich zu der Anzahl von funktionellen Bindungsgruppen auf der Membran in großem Überschuss vor. Es wurden Kontrollmembranen hergestellt, indem die Membran in 2,0 M Ethanolamin in 1,0 M NaHCO₃, pH 9,5 inkubiert wurde, um die reaktiven Gruppen auf der Immobilon AV Membran zu blockieren. Die Membranen wurden bei –20°C in einem Exsikkator gelagert. Vor der Verwendung wurden die Membranen mit Phosphat-gepufferter Natriumchloridlösung gewaschen. Das 12-28 hydropathische Mimic-Peptid und das Even-Hydro-Peptid wurden unter Verwendung von Standard-f-Moc-Synthese auf einem Applied Bio-Science 430A-Peptid-Synthesizer hergestellt. Die Aminosäuren wurden mit Blockierungsgruppen geschützt und vor der manuellen Spaltung entschützt und gewaschen. Die Reinheit der Peptide wurde mittels Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigchromatographie bestätigt.
Bindung von CSF-Proteinen an immobilisierte Peptide
Die Immobilon AV Membranen, an die zuvor βA-Peptide, Ethanolamin oder das Hydromimic-Peptid oder das Even-Hydro-Peptid gebunden worden waren, wurden mit 100 μl Gehirn-Rückenmark-Flüssigkeit (zuvor durch einen 0,22 μ-Filter filtriert) mit 50 μl Phosphat-gepufferter Natriumchloridlösung, pH 7,3, für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Membranen in einen Milliporefilterhalter (Swinnex) eingeführt und mit 3,0 ml Phosphat-gepufferter Natriumchloridlösung gewaschen, anschließend mit 700 μl 5 % Natriumdodecylsulfat (SDS) gewaschen. Die Membranen wurden aus dem Filterhalter entnommen, in der Hälfte durchgeschnitten und in 150 μl Laemmli-Puffer eingeführt (2 % Natriumdodecylsulfat, 5 % Beta-Mercaptoethanol, pH 6,8) und für 5 Minuten gekocht, um zurückgehaltene Proteine zu solubilisieren. 45 μl Laemmli-Puffer mit solubilisiertem Protein wurden in jede der zehn Bahnen eines Bio-Rad-Minigel-Apparats geladen, mit einem Stacking-Gel von 4 % und einem Trenngel von 12 % Polyacrylamid mit 2 % SDS.
Immundetektion von ApoE.
Die elektrophoretisch behandelten Proteine wurden auf Immobilon P unter Verwendung von Standard-Western-Transfer-Techniken transferiert. Nach dem Transfer wurde die Membran in Blotto (5 % getrocknete Milch in Tris-gepufferter Natriumchloridlösung, pH 7,6, mit 0,5 % Tween-20 (Pierce)) bei Raumtemperatur für 1 Stunde inkubiert. Die Membran wurde als nächstes in Kaninchen-anti-Mensch-Apolipoprotein E-Antikörper bei einer 1:1000-Verdünnung (freundlicherweise von Dr. Joel Morrisett, Dept. of Medicine, Baylor College of Med., Houston, TX. zur Verfügung gestellt) in Blotto über Nacht bei 4°C inkubiert, anschließend fünfmal in Blotto gewaschen. Die Membran wurde einem Ziege-anti-Kaninchen-Sekundärantikörper, der mit Meerrettich-Peroxidase konjugiert war, bei einer Verdünnung von 1:10000 für 1 Stunde bei Raumtemperatur ausgesetzt, und anschließend siebenmal in Blotto gewaschen. Die Merrettich-Peroxidase wurde dann mit dem "Enhanced Chemiluminesce Detection kit" (Amersham) sichtbar gemacht und einem Hyperfilm ECL (Amersham) ausgesetzt.
Gehirn-Rückenmark-Flüssigkeitsproben.
Gehirn-Rückenmark-Flüssigkeit wurde aus klinischen diagnostischen Lumbalpunktionen erhalten, die nach Einwilligung an menschlichen Subjekten ausgeführt wurden, und bei –80°C gelagert.
Ergebnisse.
Die Gehirn-Rückenmark-Flüssigkeit enthält viele Proteine, die an immobilisiertes βA-Peptid, und ein Kontrollpeptid ("Even-Hydro-Peptid") nach Inkubation und Eluierung mit Phosphat-gepufferter Natriumchloridlösung binden, 1, oben, Spalte 1. Unter diesen zurückgehaltenen Proteinen ist Apolipoprotein E, wie in 1, unten, Spalte 1, dargestellt. Viele dieser Proteine werden von beiden immobilisierten Peptiden mittels 5 % Natriumdodecylsulfat, Spalte 2; mittels 4 Molar Harnstoff, Spalte 3; oder mittel 6 Molar Guanidinhydrochlorid; Spalte 4, eluiert. Das Guanidinhydrochlorid konnte jedoch nicht das Apolipoprotein E von dem βA_(1–28)-Peptid eluieren, eluierte jedoch praktisch das gesamte Apolipoprotein E, das zuvor an das Kontrollpeptid gebunden worden war, wie in der 1, unten, Spalte 4, dargestellt.
Die Bindung von Apolipoprotein E an verschiedene immobilisierte Peptide ist in der 2 dargestellt. Das Apolipoprotein E in Gehirn-Rückenmark-Flüssigkeit bindet mit hoher Affinität an immobilisiertes βA(_1–40) und βA(_1–28), nach der Inkubation und dem Waschen mit PBS und 5 % Natriumdodecylsulfat. Das "12-28 even hydro-Peptid" enthält die gleichen Aminosäuren wie βA_(12–28), hat jedoch ein anderes hydropathisches Profil. Wie in der 2 unten dargestellt, fand zwischen dem Apolipoprotein E und diesem immobilisierten Peptid keine Bindung statt. Das 12-28-hydrophatische Mimic-Peptid enthält andere Aminosäuren als βA_(12–28), hat jedoch ein hydropathisches Profil, das sehr ähnlich ist zu dem von βA_(12–28), und bindet ebenfalls an Apolipoprotein E.
BEISPIEL 2
Immundetektion von ApoE in CSF von Alzheimer-Patienten und Kontrollpatienten
Die Gehirn-Rückenmark-Flüssigkeit (cerebrospinal fluid, CSF) von sowohl Patienten mit Alzheimerscher Krankheit als auch Kontrollpatienten enthält immunreaktives Apolipoprotein E. Das Apolipoprotein E in jeder Kontroll-CSF band an das immobilisierte βA₍₁_₂₈₎. Das Apolipoprotein E in den Gehirn-Rückenmark-Flüssigkeitsproben von Patienten mit der Alzheimerschen Krankheit zeigte jedoch eine deutliche Variabilität im Hinblick auf die Bindung an das βA-Peptid.
BEISPIEL 3
Identifizierung von ApoE-Isoformen in Alzheimerscher CSF durch isoelektrische Fokussierung
Um zu bestimmen, ob die Variation der Bindung an das βA-Peptid, auf das vorstehend hingewiesen worden ist, durch eine Heterogenizität des Apolipoproteins E selbst erklärt werden kann, wurden CSF-Proteine mittels isoelektrischer Fokussierung aufgelöst und das immunreaktive Apolipoprotein E wurde sichtbar gemacht. Die Proteine der Gehirn-Rückenmark-Flüssigkeit (Cerebrospinal fluid, CSF) wurden mittels Schütteln von 30 μl CSF mit einem gleichen Volumen an Chloroform:Methanol :: 2:1 (V/V) delipidiert. Delipidierte CSF wurde anschließend unter Verwendung von Standardtechniken auf einem Harnstoff, Polyacrylamidgel mit Biorad-Ampholyten Ph 3-10 in einem vertikalen Slab-Gel-Apparat (Biorad Minigel) isoelektrisch fokussiert. Nach der Elektrophorese wurden die Proteine auf Immobilon P unter Verwendung der Western-Technik transferiert und wie vorstehend beschrieben detektiert. Es konnten mehrere Apolipoproteine E-Isoformen mittels isoelektrischer Fokussierung detektiert werden.
BEISPIEL 4
Detektion von DNA, die für die Apo Typ 4-Isoform codiert, in Blutzellen von Patienten mit Alzheimerscher Krankheit
Populationsassoziationsstudien von Apolipoprotein E wurden mit über 85 Blutproben von Subjekten durchgeführt, die an familiärer Alzheimerscher Krankheit litten, wobei die Diagnose der Alzheimerschen Krankheit durch Autopsie bestätigt worden war.
Genomische DNA aus den Blutproben wurde in Übereinstimmung mit Standardtechniken extrahiert und durch die Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert, entweder in einem Stratagene SCS-96 oder einem Techne MW-2-Thermocycler, unter Verwendung von Techne HI-TEMP 96 Well-Platten und den von P. Wenham et al., Lancet 337, 1158 (1991) beschriebenen Primern. Das Protokoll für die Polymerase-Kettenreaktion war im Wesentlichen wie das von Wenham et al., supra, und J. Hixson und D. Vernier, J. Lipid Res 31, 545 (1990) beschriebene. Jede Amplifizierungsreaktion enthielt 20 ng genomische DNA, 1,0 pmol/μl jedes Primers, 10 % Dimethylsulfoxid (Sigma), 200 μM jedes dNTP (Pharmacia), 2,0 μCi (alpha-³²P) dCTP (800 Ci/Mol in 10 mM Tricin, NEN Research Products), 0,05 Einheiten/μl Taq DNA-Polymerase und versetztem 1X Inkubationspuffer (Boehringer Mannheim) in einem Endvolumen von 15 μl. Eine anfängliche Denaturierung bei 94°C für 5 Minuten wurde gefolgt von 35 Cyclen Annealing bei 65°C für 0,5 Minuten, Verlängerung bei 70°C für 1,5 Minuten, Denaturierung bei 94°C für 0,5 Minuten und eine finale Verlängerung bei 70°C für 10 Minuten. Nach der Amplifizierung wurden 5 Einheiten Hhal(Pharmacia) direkt zu jedem Well gegeben, und die Platten wurden für wenigstens 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Drei μl jeder Reaktion wurden auf ein 6 % nichtdenaturierendes Gel (0,4 mm dick × 43 cm lang) geladen und für 1 Stunde unter konstantem Strom (45 mA) elektrophoretisch behandelt. Nach der Elektrophorese wurde das Gel auf Whatman 3M-Chromatographiepapier tranferiert, getrocknet und für 1 Stunde unter Verwendung eines Kodak XAR-5-Films autoradiographiert.
Die Daten sind in der folgenden Tabelle 1 dargestellt. Die Ergebnisse zeigten, dass die ansonsten unübliche Typ4-Isoform mit der Alzheimerschen Krankheit hoch assoziiert war, verglichen mit der normalen Population. Die Genhäufigkeit dieser Typ 4-Isoform von Apolipoprotein E in der allgemeinen Population liegt bei 16 %, während bei den untersuchten Patienten mit Alzheimerscher Krankheit die Genhäufigkeit bei 51 % lag.
Tabelle 1: ApoE-Isotyp in normalen Patienten und Patienten mit Alzheimerscher Krankheit.
Diese Daten zeigen, dass die Detektion von DNA, die für die Typ 4-Isoform von Apolipoprotein E codiert, als prognostischer und diagnostischer Test für familiäre Alzheimersche Krankheit geeignet ist.
BEISPIEL 5
Assoziation von ApoE4 mit "late-onset" familiärer und sporadischer Alzheimerscher Krankheit
Diese Daten liefern eine weitere Unterstützung für die Beteiligung des ApoE4-Allels (ApoE-e4) an der Pathogenese von "late-onset" (später Ausbruch) familiärer und sporadischer AD.
Familien.
Die Blutproben für die genomischen DNA-Studien wurden von Familien erhalten, die zuvor beschrieben worden waren (J. Murrell et al., Science 254, 97-99 (1991); H. Karlinsky et al., Neurology 42, 1445-1453 (1992); P. St. George-Hyslop et al., Nature Genet. 2, 330-334 (1992); M. Pericak-Vance et al., Am.J. Hum. Genet. 48, 1034-1050 (1991); und P. St. George-Hyslop et al., Nature 347, 194-197 (1990)). Alle untersuchten Individuen, die als mögliche Patienten mit Alzheimerscher Krankheit (AD) diagnostiziert worden waren, wurden von einem Neurologen und angegliedertem diagnostischem Personal der Joseph and Kathleen Bryan Alheimer's Disease Research Center (ADRC) Memory Disorders Clinic an der Duke University, dem Centre for Neurodegenerative Diseases an der University of Toronto, oder den Departments of Neurology am Massachusetts General Hospital and der Harvard Medical School untersucht. Die klinische Diagnose wurde nach den NINCDS-ADRDA-Kriterien vorgenommen (C. McKhann et al., Neurology 34, 939-944 (1984)). Die Duke-Stammbäume (pedigrees) waren primär "late-onset" AD-Familien mit einem Durchschnittsalter von 66,1 ± 10,3 Jahren in den 35 Familien. Drei der Familien konnten als "earlyonset" AD-Familien (M < 60 Jahren) klassifiziert werden. Eine Familie segretiert mit der APP717val-ile Mutation (A. Goate et al., Nature 349, 704-706 (1991)), eine zweite Familie segregiert mit der APP717val-phe-Mutation (J. Murrell et al., Science 254, 97-99 (1991)) und die andere ist mit Chromosom 14-Markern mit einem maximalen LOD-Score von 3,5 verbunden (G. Schellenberg et al., Science 258, 668-671 (1992) und P. St. George-Hyslop et al., Nature Genet 2, 330-334 (1992)). Die Toronto-Stammbäume wurden primär als "early-onset" Familien klassifiziert (13 der 17 Familien). Fünf der Familien waren mit Chromosom 14 mit LOD-Scores von mehr als 3,0 in jeder Familie verknüpft (P. H. St. George-Hyslop et al., Nature Genet 2, 330-334 (1992)), während ein sechster Stammbaum die APP17-vaI-ile-Mutation aufwies (N. Karlinsky et al., Neurology 42, 1445-1453 (1992)). Die familiären und genotypischen Daten wurden mit dem PEDIGENE^TM-System prozessiert (C. Haynes et al., Genet. Epidemiol. 3, 235-239 (1986)).
Die genomische DNA von einigen Patienten, die als sporadische Fälle von möglicher AD in Duke, Toronto und Boston diagnostiziert worden waren, wurde über die letzten 6 Jahre aufbewahrt. Als sporadische AD-Patienten wurden jene definiert, die keine bekannte Familiengeschichte von AD oder Demenz aufwiesen. Die sporadischen, möglichen AD-Patienten stellten die gesamten aufbewahrten DNAs in den Toronto- und Duke-Banken im November 1992 dar, außer für eine laufende prospektive Serie, die im August 1992 an der Bryan ADRC Memory Disorders Clinic gestartet worden war. Die DNA aus diesen Individuen war vor jeglichem Interesse am ApoE-Isotypisieren gesammelt worden. Nicht alle sporadischen AD-Patienten, die in diesen Kliniken untersucht worden waren, wurden routinemäßig in Banken aufbewahrt. Es kann angenommen werden, dass die Diagnose für mögliche AD in dieser Gruppe im Bereich von 80 bis 90 % Genauigkeit liegt, was in den meisten spezialisierten AD-Kliniken eingehalten wird. Hirn-DNA wurde von Autopsie-bestätigten (autopsyconfirmed) kaukasischen Fällen von AD erhalten, die in der Kathleen Bryan Brain Bank von Duke, der Universität von Toronto und der Harvard Medical School in Banken aufbewahrt wurden. Aus den Serien von sporadischen AD-Autopsien wurden sechs Autopsien von Schwarzen oder amerikanischen Indianern entfernt, da die Assoziationsanalysen gegenüber der Kontrollgruppe sensitiv sind. In der Studie wurden zwei Sets von Kontrollen verwendet. Bei dem ersten Set handelte es sich um 91 nicht verwandte Großeltern aus den Referenzfamilien vom Centre d'Etude du Polymorphisme Humain (CEPH) (J. Dausett et al., Genomics 6, 575-577 (1990)). Diese Familien wurden für humanes Gen-Mapping gesammelt und sind dadurch gekennzeichnet, dass Großeltern, Eltern und viele Enkelkinder für das DNA-Mapping zur Verfügung stehen. Die Großeltern stellen eine statistische Gruppe von kaukasischen älteren Kontrollen europäischen und amerikanischen Ursprungs dar, ähnlich zu den "late-onset" FAD-Familien und der Autopsie-bestätigten sporadischen AD-Population. 21 kaukasische Eheleute von Patienten, die an einer laufenden prospektiven Analyse von möglichen AD-Patienten und Eheleuten teilnehmen, wurden ebenfalls als Kontrollgruppe verwendet.
Genomische DNA.
DNA mit hohem Molekulargewicht wurde aus transformierten Lymphoblasten gemäß bekannten Techniken erhalten (M. Pericak-Vance et al., Neurology 36, 1418-1423 (1986) und M. Pericak-Vance et al., Exp Neurol 102, 271-279 (1988)), oder nach dem GENEPURE 341^TM Nukleinsäureextraktor geliefertem Protokoll (Applied Biosystems). Die genomische DNA aus Hirngewebe wurde durch Pulverisieren von ungefähr 300 mg gefrorenem Hirngewebe unter flüssigem Stickstoff, Zugabe von 4 ml Lysepuffer (Applied Biosystems) und 1 mg Proteinase K (Applied Biosystems), und leichtes Schaukeln über Nacht bei 37°C, vor der Extraktion auf dem GENEPURE 341^TM, isoliert.
Amplifizierung und Restriktions-Isotypisierung von ApoE.
Die genomische DNA wurde mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) in einem Techne MW-2-Thermocycler unter Verwendung von HI-TEMP 96-Wellplatten (Techne) und den von P. Wenham et al., Lancet337, 1158-1159 (1991) beschriebenen Primern amplifiziert. Das PCR-Protokoll basierte auf jenen, die von Wenham et al. und J. Hixson et al., J. Lipid Res 31, 545-548 (1990) beschrieben worden sind. Jede Amplifizierungsreaktion enthielt 20 ng genomische DNA, 1,0 pmol/μl jedes Primers, 10 % Dimethylsulfoxid (Sigma), 200 μM jedes dNTP (Pharmacia), 1,0 μCi (alpha-₃₂P)dCTP (800 Ci/Mol in 10 mM Tricin, NEN Research Products), 0,05 Einheiten/μl Tq DNA-Polymerase und versetztem 1X Puffer (Boehringer Mannheim) in einem Endvolumen von 15 μl. Eine anfängliche Denaturierung bei 94°C für 5 Minuten wurde gefolgt von 35 Cyclen Annealing bei 65°C für 0,5 Minuten, Verlängerung bei 70°C für 1,5 Minuten, Denaturierung bei 94°C für 0,5 Minuten und eine finale Verlängerung bei 70°C für 10 Minuten. Nach der Amplifizierung wurden 5 Einheiten HhaI (Gibco) direkt zu jedem Well gegeben, und die Platten wurden für wenigstens 3 Stunden bei 37°C inkubiert. 15 μl von 2X Typ III Stop Farbstoff (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press B.24 (1989)) wurden zu jedem Well gegeben, und 3 μl jeder Reaktion wurde auf ein 6 % nicht-denaturierendes Polyacrylamid-Gel gegeben (0,4 mm dick × 43 cm lang) und für 1 Stunde unter konstantem Strom (45 mA) elektrophoretisch behandelt. Nach der Elektrophorese wurde das Gel auf ein Whatman 3M-Chromatographiepapier transferiert, getrocknet und für 1 Stunde unter Verwendung eines Kodak XAR-5-Films autoradiographiert. Jeder Autoradiograph wurde unabhängig voneinander von zwei verschiedenen Beobachtern gelesen.
Statistische Analyse.
Die Allel-Häufigkeiten für die Kontrollgruppe und die AD-Gruppe wurden durch Zählen von Allelen und Berechnen der Probenverhältnisse geschätzt. Die Allel-Häufigkeitsschätrungen für die "early-onset" und "late-onset" FAD-Familien wurden berechnet, indem ein zufällig ausgewählter betroffener Patient aus jeder Familie verwendet wurde. Die Z-Statistik für den Vergleich von zwei Proportionen wurde berechnet (R. Elston und W. Johnson, Essentials of Biostatistics, (1987) und G. Schellenberg et al., J. Neurogenet. 4, 97-108 (1987)). Ein extremer Wert von Z im Vergleich zu den Wahrscheinlichkeiten für die normale Standardverteilung würde auf eine Verwerfung der Nullhypothese, dass die Allel-Häufigkeiten in den zwei Gruppen gleich sind, hindeuten. Um die ApoE-Allel-Häufigkeiten in den unterschiedlichen Populationen zu vergleichen, d. h. AD versus Kontrolle, und zwischen den Kontrollgruppen, wurden die folgenden Vergleiche vorgenommen: 1) CEPH-Kontrollen versus Eheleute-Kontrollen; 2) CEPH-Kontrollen versus Literaturkontrollen; 3) CEPH-Kontrollen versus "late-onset"; 4) CEPH-Kontrollen versus "early-onset"; 5) CEPH-Kontrollen versus klinischen (möglichen) sporadischen AD-Patienten; und 6) CEPH-Kontrollen versus Autopsie-bestätigten sporadischen AD-Patienten. Die Verknüpfungsanalyse vom Betroffenem-Stammbaum-Mitglied (Affected-pedigree-member (APM) linkage analysis) für ApoE wurde in Übereinstimmung mit bekannten Techniken analysiert (M. Pericak-Vance et al., Am. J. Hum. Genet. 48, 1034-1050 (1991) und D. Weeks et al., Am. J. Hum. Genet. 42, 315-326 (1988)). Zwei Punkte-LOD-scores wurden unter Verwendung des Computerprogramms LINKAGE^TM Program Package (Version 5.0) berechnet (G. Lanthrop et al., Am. J. Hum. Genet. 36, 460-465 (1984) und G. Lanthrop et al., Proc. Nat/. Acad. Sci. USA 81, 3443-3446 (1984)). Das Alter des Ausbruchs und die Krankheits-Parameter, die in den LOD-score-Berechnungen eingesetzt wurden, waren wie vorstehend angegeben (M. Pericak-Vance et al., supra).
Resultate.
Die Tabelle 2 stellt die ApoE e4-Allel-Häufigkeitsschätzungen in drei Kontrollpopulationen dar: 1) 91 Großeltern aus den CEPH-Referenzfamilien; 2) 21 Eheleute aus einer laufenden prospektiven Studie, die konsekutive sporadische mögliche AD-Patienten untersucht, und 3) eine repräsentative Kontrollserie aus einer ähnlichen Population wie in der Literatur (G. Lanthrop et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 3443-3446 (1984)). Ferner sind die ApoE e4-Allel-Häufigkeitsschätzungen für mehrere unterschiedliche Gruppen mit Alzheimerscher Krankheit dargestellt: 1) ein zufällig ausgewähltes betroffenes Individuum in den kombinierten Duke- und Toronto/Boston-"late-onset"-FAD-Serien; 2) ein zufällig ausgewähltes betroffenes Individuum in den kombinierten Toronto/Boston- und Duke-"early-onset"-FAD-Familien; 3) gesammelte DNA-Proben von sporadischen Patienten, die die Diagnose einer möglichen AD tragen, aus den Duke- und Toronto/Boston-Kliniken; und 4) DNA aus 176 Autopsiebestätigten sporadischen AD-Patienten aus Duke und Toronto/Boston.
In Übereinstimmung mit den vorstehenden Beispielen 1 bis 4 war die ApoE e4-Allel-Häufigkeit der zufällig ausgewählten betroffenen Patienten in den vorwiegend "lateonset"-FAD-Familien signifikant von jener der CEPH-Kontrollen verschieden; 0,50 ± 0,06 versus 0,16 ± 0,027 (Allel-Häufigkeit-Schätrung ± Standardabweichung, Z = 2,44, P = 0,014). Ähnlich waren die kombinierten Duke- und Toronto/Boston-"lateonset"-FAD-Serien, die in der vorliegenden Beschreibung vorgestellt werden, signifikant verschieden von den CEPH-Kontrollen (P = 0,000017). Die ApoE-e4-Häufigkeit der kombinierten "early-onset"-FAD-Serie aus Toronto/Boston und Duke (0,19 ± 0,069) unterschied sich nicht signifikant (P = 0,069) von der Häufigkeit in den CEPH-Kontrollen. Statistische Analysen zeigen hochsignifikante Unterschiede in den ApoE-e4-Allel-Häufigkeiten sowohl bei sporadischer (möglicher) AD (P = 0,00031) als auch bei Autopsie-bestätigter sporadischer AD (P < 0,00001), verglichen mit den CEPH-Kontrollen.
Tabelle 2. ApoE-e4-Allel-Häufigkeitsschätzungen
BEISPIEL 6
Beziehung zwischen der Amyloid Beta-Peptid-Ablagerung und dem Aaolipoprotein E-Typ in Post-Mortem-Geweben
In diesem Beispiel wurden eine Reihe von Gehirnen von Patienten mit sporadischer "late-onset" AD mit bekanntem ApoE-Genotyp untersucht, um festrustellen, ob AD-Gehirne mit einem ApoE-e4-Allel ein bestimmtes Muster der Amyloid-Ablagerung aufweisen. Es wurde gefunden, dass Gehirne von Patienten, die für ApoE-e4 homozygot waren, vermehrte vaskuläre Amyloid-Ablagerungen und eine erhöhte Anzahl und Dichte von Amyloid-Plaques und neuritischen Plaques im Vergleich zu ApoE e3 Homozygoten aufwiesen. In immuncytochemischen Studen war das β-Peptid in jenen Patienten mit einem oder zwei ApoE-e4-Allelen signifikant erhöht. Die drei untersuchten ApoE-Hauptgenotypen (e3/3, e3/4 und e4/4) zeigten keinen statistisch signifikanten Unterschied im Hinblick auf das Geschlecht, das Alter des Ausbruchs oder die Dauer der Krankheit. "Late-onset" AD-Fälle, die mit einem oder zwei ApoE-e4-Allelen assoziiert sind, weisen daher einen besonderen neuropathologischen Genotyp im Vergleich zu Fällen auf, die für das ApoE-e3-Allel homozygot sind.
Auswahl der Fälle.
143 Autopsie-bestätigte Fälle von "late-onset" Alzheimerscher Krankheit (AD), die die NIH- und CERAD-Kriterien erfüllten (C. McKhann et a., Neurology 34, 939-944 (1984) und S. Mirra et al., Neurology 41, 479-486 (1991)), und die keine betroffene Familienangehörige oder weitere neurologische Erkrankungen aufwiesen, wurden über die Kathleen Bryan Brain Bank an der Duke University erhalten und auf den ApoE-Genotyp analysiert. Diese Fälle wurden zwischen 1985 und 1992 aufbewahrt. Das Durchschnittsalter beim Tod für die 143 Fälle lag bei 77,2 ± 8,9 Jahren mit einer durchschnittlichen Dauer der Erkrankung von 8,6 ± 4,2 Jahren, und bei 63 % der Patienten handelte es sich um Frauen.
ApoE-Genotypisierung
Genomische DNA wurde durch Isolieren von DNA aus ungefähr 300 mg gefrorenem Hirngewebe von jedem Patienten erhalten. Die ApoE-Genotypisierung für jeden Patienten wurde wie vorstehend beschrieben ausgeführt, unter Verwendung einer Amplifizierung mittels Polymerase-Kettenreaktion mit ApoE-Primern und HhaI-Restriktions-isotypisierung mit autoradiographischer Detektion. Die ApoE-Genotypisierung zeigte: 47 Fälle ApoE e3/3, 64 Fälle ApoE e3/4, 23 Fälle ApoE e4/4, 3 Fälle ApoE e2/3 und 6 Fälle ApoE e2/4.
Neuropathologische Analyse.
Die Informationen über das Todesalter, die Dauer der Krankheit, das Geschlecht, das Hirngewicht, das Vorliegen von Amyloidablagerungen in Hirngefäßen (unter Verwendung von Kongorot-Anfärbung) und die Beschreibung der Dichte von neuritischen Plaques und der Menge an Neurofibrillen-Veränderungen (neurofibrillary tangles, modifizierte King-Silberfärbung [B. Lloyd et al., J. Histotech 8, 155-156 (1985)]) wurden aus den ursprünglichen neuropathologischen Berichten entnommen. Die Auszählungen von neuritischen Plaques wurden in 100 Fällen beschrieben und Auszählungen von Neurofibrillen-Veränderungen in 95 Fällen. Jede Auszählung entsprach einem einzelnen mikroskopischen Feld, das als die am meisten betroffene Fläche im Bereich dieser Region angesehen wurde. Die Plaques wurden mit einem 10x-Objektiv (Feld von 2,92 mm²) gezählt, während die Veränderungen mit einem 20x-Objekt gezählt wurden (Feld von 0,72 mm²). Die Plaque-Auszählungen wurden nach 100 pro 10x-Feld abgebrochen. Alle diese Daten wurden ein bis 5 Jahre vor der ApoE-Genotyp-Analyse in die medizinischen Patientenberichte aufgenommen.
Analyse von Kongorot-angefärbtem Material für vaskuläres Amyloid.
Eine Untergruppe von 53 Patienten wurde ausgewählt, indem in chronologischer Reihenfolge jene Fälle mit bereits existierenden Kongorot-angefärbten Schnitten gewählt wurden. Die Auswahl endete, als 17 Patienten mit dem ApoE-Genotyp e4/4 (aus den insgesamt 23 Patienten); 20 Patienten mit dem ApoE-Genotyp e3/3 (aus den insgesamt 49 Patienten); und 16 Patienten mit dem ApoE-Genotyp e3/4 (aus den insgesamt 65 Patienten) ausgewählt worden waren. 40 der 53 Autopsiereporte wiesen ausdrücklich auf vaskuläre Amyloide hin und bildeten einen Set von Blind-Beobachtungen, bevor die Genotypisierung abgeschlossen war. Das Vorliegen von vaskulären Amyloiden wurde in drei Stufen eingeteilt: keine offensichtlichen Amyloid-Ablagerungen (Stufe 0), Spuren von Amyloid-Ablagerungen einschließlich einem positivem Gefäß (Stufe 1), und leicht identifizierbare vaskuläre Amyloide (Stufe 2). Zusätzlich wurden Kongorot-angefärbte Schnitte vom frontalen Cortex und dem Hippocampus einschließlich dem entorhinalen Cortex von allen 53 Fällen von drei Beobachtern auf vaskuläre Amyloide unter Verwendung des gleichen Stufensystems untersucht. Diese Beobachtungen wurden unabhängig voneinander und doppelblind mit einer durchschnittlichen Inter-Bewerter-Übereinstimmung von 8,5 % analysiert.
Immuncytochemische Methoden.
Paraffinblöcke der Hippocampusregion, dem Frontallappen und dem Parietallappen wurden für 7 Fälle mit ApoE e4/4, 8 Fälle mit ApoE e3/3 und 4 Fälle mit ApoE e3/4 erhalten. Die Auswahl dieser Fälle war zufällig ohne Kenntnis des neuropathologischen Berichts. 6-8 Mikrometer Paraffinschnitte wurden geschnitten und auf beschichtete Objektträger für die Immuncytochemie befestigt. Die Schnitte wurden deparaffinisiert, mit 90 % Ameisensäure für 3 Minuten behandelt, gewaschen und anschließend mit monoklonalem Antikörper für die Immunlokalisierung von Amyloid β-Peptid inkubiert (Antikörper beschrieben in S. Ikeda et al., Prog. Clin. Biol. Res 317, 313-323 (1989), Schenkung von Drs. George Glenner und David Allsop). Die Schnitte wurden parallel mit identischer Antikörperverdünnung und enzymatischen Detektionsschritten unter Verwendung der ABC-Methode umgesetzt (Vectorstain, Burlingame, CA), und eine Hülle wurde nach der Dehydratation über Permount angebracht. Halb-benachbarte Schnitte (nicht mit Ameisensäure behandelt) wurden verwendet, um neuritische Plaques mit einem monoklonalem Antikörper (Verdünnung 1:1000) gegen das 164kd-Neurofilamentprotein (SMI-34, Sternberger-Meyer Immunocytochemicals, Inc) nachzuweisen, und für ApoE wurde ein polyklonaler Antikörper (Verdünnung 1:20000) gegen humanes ApoE verwendet, der ApoE2-, ApoE3- und ApoE4-Isoformen auf Western-Blots erkennt (Schenkung von Dr. Joel Morrisett, Baylor College of Medicine). Die parallelen Kontrollen wurden in diesen Experimenten nicht angefärbt.
Analyse des immuncytochemischen Materials
Die Regionen der maximalen Plaquedichte in jedem Schnitt wurden ausgewählt und eine graphische Analyse wurde durchgeführt, indem die Plaque-Konturen unter Verwendung einer Lucida-Kamera auf einem definierten Rechteck von 0,25 mm², das in 160 gleiche Raster eingeteilt war, gezeichnet wurden. Alle Rasterboxen, die eine ganze oder einen Teil einer immunreaktiven Plaque enthielten, wurden gezählt, und die Gesamtrahl wurde durch den tatsächlichen Genotyp dividiert. Mit diesen Methoden liegt die Inter-Bewerter-Verlässlichkeit bei 85 %, und die Variation zwischen verschiedenen Feldern vom gleichen Schnitt bei 15 %. Repräsentative Fälle wurden mit einem Zeiss-Photomikroskop photographiert.
Statistische Analyse.
Die Daten wurden in ein Statgraphic-Packet eingegeben und eine Analyse der Varianz wurde verwendet, um die Beziehungen zwischen den Variablen zu beschreiben. Es bestanden keine signifikanten Unterschiede zwischen der Hauptgruppe von 143 Fällen, der Subgruppe von 53 Fällen, oder den kleineren Untergruppen, wie vorstehend angegeben, von ApoE e3/3, e3/4 und e4/4 Genotypen, die für eine Kongorot-Analyse oder immuncytochemische Analyse ausgesucht worden waren, im Hinblick auf das Todesalter, das Geschlechterverhältnis oder das Gehirngewicht. Zum Vergleich der Plaqueanzahl und der Anzahl von Neurofibrillen-Veränderungen wurde eine Kruskal-Wallis-One-Way-Analyse durchgeführt, da die Beobachtungen an keine normale Verteilung angepasst werden konnten.
Immunlokalisierung von β-Peptid Amyloid-Ablagerungen im Gehirn von sporadischen AD-Patienten, die für ApoE e3 oder e4 homozygot sind
Die Immuncytochemie für β-Peptid in Hirnen von Patienten mit sporadischer "lateonset" AD zeigte konsistente Unterschiede zwischen immungefärbten Schnitten vom cerebralen Cortex von ApoE e3/3- und ApoE e4/4-Fällen (Daten nicht gezeigt). Die β-Peptid-Immunreaktivität in den Schnitten von ApoE e3/3-Fällen lassen eine minimale bis nicht vorhandene vaskuläre Anfärbung und schwach immunreaktive Plaques erkennen, während Schnitte von ApoE e4/4-Fällen stark angefärbt werden, mit zahl reichen immunreaktiven Gefäßen auf der cerebralen Oberfläche und stark immunreaktiven Plaques und Gefäßen im Parenchym. Der Unterschied ist im Allgemeinen von einer solchen Größenordnung, dass β-Peptid-immungefärbte Schnitte von ApoE e4/4-Gehirnen ohne ein Mikroskop von Schnitten von ApoE e3/3-Gehirnen unterschieden werden können.
Immunlokalisierung von ApoE in Gehirnen von AD-Patienten, die für ApoE e3 oder e4 homozygot sind.
Eine ApoE-Immunreaktivität wurde in Gehirngefäßen, Neuronen, Glialzellen, senilen Plaques und Neurofibrillen-Veränderungen beobachtet, wie in früheren Berichten beschrieben (J. Diedrich et al., J. Virol. 65, 4759-4768 (1991); und Y. Namba et al., Brain Res 541, 163-166 (1991)). Ähnlich wie die β-Peptid-Immunreaktivität ist die ApoE-Immunreaktivität nach einer Behandlung mit Ameisensäure verstärkt. Es traten keine großen Unterschiede bei der Lokalisierung oder der Intensität der ApoE-Immunreaktivität in ApoE e3/3-Fällen im Vergleich zu ApoE e4/4-Fällen auf (man bemerke, dass dieses polyklonale Antiserum gegen ApoE sowohl die ApoE 3-Isoform als auch die ApoE 4-Isoform detektiert). Insbesondere waren die meisten größeren Gehirngefäße ApoE-immunreaktiv sowohl in den ApoE e4/4-Fällen als auch in den ApoE e3/3-Fällen.
Ausmaß von vaskulärem Amyloid in e3/3, e4/4 und e3/4 ApoE-Genotypen - retrospektive Analyse von Autopsieberichten.
In 40 der 53 Fälle wurde auf das Vorliegen oder die Abwesenheit von vaskulärem Amyloid, das durch Kongorot-Färbung detektiert wurde, eindeutig in den Autopsieberichten hingewiesen. Eine retrospektive Wertung dieser Autopsieberichte im Hinblick auf die Menge an vaskulären Amyloid-Ablagerungen zeigte eine signifikante Assoziation von vaskulärem Amyloid mit der Anzahl von ApoE e4-Allelen (p < 0,0001). Üblicherweise wurde bei ApoE e3/3-Fällen nicht auf vaskuläres Amyloid hingewiesen, Spuren von vaskulärem Amyloid lagen bei e3/4-Fällen vor, und bei den meisten e4/4-Fällen wurden große Mengen beobachtet (Tabelle 3.A.1, im Folgenden).
Prospektive Analyse von Kongorot-angefärbtem Material.
Um das Ausmaß von vaskulärer Amyloidose in den Gesamtserien von 53 Fällen prospektiv zu untersuchen, wurde eine doppelblinde Untersuchung von Kongorotgefärbten Schnitten von Hippocampus und frontalem Cortex durchgeführt. Diese Analyse bestätigte eine hochsignifikante Assoziation zwischen dem Vorliegen von Kongorot-positiver Amyloid-Angiopathie und der Dosis von ApoE e4-Allel in den 53 Fällen (Tabelle 3.A.1). Solche amyloiden Gefäße waren nicht zwingend im gesam ten Bereich einer bestimmten cortikalen Region bei ApoE e4/4-Homozygoten vorhanden, jedoch herrschten sie oft in den Tiefen von Sulci wie der hippocampalen Fissur vor.
Analyse von β-Peptid-immunreaktiven Gefäßen
Wenn Schnitte von einer Untergruppe der Serien von 53 Patienten auf β-Peptid immun reagiert und ähnlich bewertet wurden, wurde die gleiche statistisch signifikante Beziehung zwischen der Menge an vaskulärem Amyloid und der Dosis von ApoE e4-Allel gefunden (Tabelle 3.C.1). Die amyloidischen Gefäße in ApoE e4-Homozygoten umfassten leptomeningeale Gefäße und große und kleine Gefäße in der corticalen Platte mit umgebenden Plaque-ähnlicher Anlagerung von Amyloid (Plaque-ähnliche Angiopathie von Scholze [W. Scholze, Z. Gesamte Neurol. Psych. 162, 694-715 (1938)]).
Die Anzahl an neuritischen Plaques ist in ApoE e4-Homozygoten erhöht im Vergleich zu ApoE e3-Homozygoten.
In vier von fünf corticalen Regionen war die durchschnittliche Anzahl von neuritischen Plaques in silber-angefärbtem Material größer bei ApoE e4-Homozygoten als bei ApoE-e3-Homozygoten (Tabelle 1.A.2). Eine Kruskal-Wallis-One-Way-Analyse zeigte, dass eine erhöhte durchschnittliche Anzahl von neuritischen Plaques signifikant mit der ApoE-e4-Alleldosis in drei Regionen verbunden war: frontaler, temporaler und parietaler Cortex, und dass die Assoziation in dem CA1-Unterteld vom Hippocampus nahezu signifikant war. Die Anzahl neuritischer Plaques korrelierte nicht mit der Dauer der Erkrankung.
Die Anzahl von Neurofibrillen-Veränderungen sind bei ApoE e4-Homozygoten im Ver-gleich zu ApoE e3-Homozygoten schwach erhöht
In allen fünf vorstehend angegebenen corticalen Regionen war die durchschnittliche Anzahl von Neurofibrillen-Veränderungen größer bei ApoE-e4-Homozygotes im Vergleich zu ApoE-e3-Homozygoten (Tabelle 3.A.3). Die Wahrscheinlichkeit, dass alle fünf Regionen eine erhöhte durchschnittliche Anzahl von Neurofibrillen-Veränderungen in ApoE e4/4-Fällen im Vergleich zu ApoE e3/3-Fällen aufweisen, liegt bei 3 % (nicht parametrischer Paarprobentest). Die Unterschiede an durchschnittlichen Zählungen für jedes Areal sind gering und nicht signifikant nach dem Kruskal-Wallis-Test. Jedoch variiert die mittlere Anzahl von Neurofibrillen-Veränderungen in jeder corticalen Region signifikant (p < 0,01) mit der Dauer der Erkrankung in der Gesamtgruppe von Patienten und in den ApoE-Genotyp-Untergruppen. Die Steigerung der mittleren Anzahl von Neurofibrillen-Veränderungen in ApoE-e4-Homozygoten ist anscheinend für den Aufwärtstrend bei der Dauer der Erkrankung, die mit ApoE-e4 in Beziehung steht, verantwortlich.
Immuncytochemische Analyse von Amyloid-Ablagerungen in sporadischen AD-Fällen
Die starke Zunahme der Amyloid-Ablagerung, die bei ApoE-e4-Homozygoten im Vergleich zu ApoE-e3-Homozygoten mit sporadischer AD festgestellt worden ist, umfasst sowohl vaskuläre Amyloid-Ablagerung als auch Ablagerung in senilen Plaques. Um diese Unterschiede qualitativ und quantitativ zu bestätigen, wurde ein Set von 7 Patienten, die für ApoE-e4 homozygot sind, mit einem Set von 8 Patienten, die für ApoE-e3 homozygot sind, verglichen. Vier Heterozygote (ApoE-e3/4) wurden ebenfalls untersucht, um mögliche ApoE-Dosiseffekte zu bestimmen. "Low-Power"-Ansichten vom cerebralem Cortex zeigten den üblichen Unterschied bei der β-Peptid-Gesamtimmunreaktivität, die in β-Peptid-immunreagierten corticalen Schnitten von ApoE e3-Homozygoten im Vergleich zu ApoE e4-Homozygoten beobachtet wird (Daten nicht dargestellt). Diese Unterschiede werden konsistent gefunden, selbst wenn die β-Peptidimmungefärbten Schnitte einer bestimmten corticalen Region auf mikroskopische Felder mit maximaler Dichte von immunreaktiven Plaques untersucht werden. Die Plaques in ApoE e4/4-Fällen waren zahlreicher, etwas größer und oft ein Gefäß enthaltend, und dunkler als jene, die in ApoE e3/3-Fällen festgestellt wurden.
Quantitative Analyse der β-Peptid-Immunreaktivität von Plaques
Schnitte von frontalem Cortex von 15 Fällen sporadischer AD wurden für eine β-Peptid-Lokalisierung immunreagiert und eine quantitative Analyse der mikroskopischen Felder, die eine Maximaldichte von β-Peptid-immunreaktiven Plaques für jeden Fall enthielten (Tabelle 3.B.2), wurde vorgenommen. Es trat eine hochsignifikante, 7-mal größere durchschnittliche Fläche, die von stark β-Peptid-immunreaktiven Plaques bedeckt war, in ApoE e4/4-Homozygoten im Vergleich zu ApoE e3/3-Homozygoten auf (p < 0,002). Die ApoE e3/4-Fälle liegen dazwischen.
In mehreren ApoE e3/3-Fällen waren auch schwach immunreaktive Plaques vorhanden und deren Anzahl war signifikant höher als in den ApoE e4/4-Fällen (p = 0,04). Nichtsdestotrotz war die Gesamtfläche, die von allen β-Peptid-immunreaktiven Plaques bedeckt war, zweifach größer (p < 0,008) in ApoE e4/4-Homozygoten im Vergleich zu ApoE e3/3-Homozygoten (Tabelle 3.B.2).
Ausmaß von neuritischen Plaques
Zusätzliche halbbenachbarte (semi-adjacent) Schnitte von dem frontalen Cortex von 8 der vorstehend genannten Fälle wurden mit einem Antikörper gegen das Neurofilamentprotein (SMI-34) immungefärbt, um zu untersuchen, ob die neuritische Plaque-Dichte sich zwischen den ApoE-e3- und den ApoE-e4-Homozygoten unterschied. Die SMI-34-Immunreaktivität deutet auf neuritische Prozesse und Neuronen mit Neurofibrillen-Veränderungen hin. Neuritische Plaques können durch ihren Gehalt an neuritischen Prozessen identifiziert werden.
Auch wenn die Anzahl und Gesamtfläche, die von neuritischen Plaques (wie durch die SMI-34-Immunreaktivität definiert) bedeckt ist, weniger als jene für Amyloid-Plaques ist (wie durch die β-Peptid-Immunreaktivität definiert) (Ergebnisse nicht dargestellt), zeigte der Vergleich der Plaqueflächen-Messungen in halbbenachbarten Schnitten eine signifikante und lineare Korrelation für die zwei Methoden der Plaquedetektion in diesen 8 Fällen (p < 0,006, r = 0,73). Die Fläche, die von neuritischen Plaques bedeckt ist, ist ferner signifikant größer bei ApoE-e4-Homozygoten als bei ApoE-e3-Homozygoten (p < 0,02).
BEISPIEL 7
Beziehung zwischen der ApoE4-Gendosis und dem Risiko für Alzheimersche Krankheit
Dieses Beispiel quantifiziert sowohl das erhöhte Risiko für AD als auch das frühere Alter beim Ausbruch, das durch ApoE4-Allele in "late-onset" AD-Familien verliehen wird. Das Risiko stieg von 20 % auf 90 % an und das mittlere Alter beim Ausbruch sank von 84 auf 68 Jahre mit steigender Zahl von ApoE4-Allelen. Diese Daten deuten darauf hin, dass die ApoE4-Gendosis ein Hauptrisikofaktor für "late-onset" AD ist, und dass die Homozygose für ApoE4 im Prinzip ausreicht, um AD im Alter von 80 Jahren zu verursachen.
Vier der 46 bis jetzt untersuchten Familien sind "early-onset" Familien; zwei haben Chromosom 21 APP-Mutationen, und zwei stehen mit dem Chromosom 14 in Zusammenhang. Die Häufigkeit von ApoE4 war in diesen Familien nicht erhöht. Mitglieder von 42 "late-onset" Familien, die für AD diagnostiziert worden waren oder untersucht worden waren und dabei nach dem Alter von 60 Jahren als nicht betroffen eingestuft wurden, mit bekanntem ApoE-Genotyp, wurden untersucht. Vor der Teilnahme in unserer Studie wurde von allen Subjekten nach Aufklärung eine Einwilligung erhalten, gegebenenfalls durch ihren rechtlichen Beistand. Alle Studienprotokolle wurden von dem Duke University Medical Center Institutional Review Board bewilligt. Deskriptive Statistiken für betroffene und nicht betroffene Subjekte sind in der Tabelle 4 angegeben. Im Durchschnitt überlebten Frauen länger als Männer, unabhängig davon, ob sie betroffen (p = 0,02) oder nicht betroffen (p = 0,13) waren.
Im Hinblick auf Tabelle 4 ist darauf hinzuweisen, dass mehr als 90 % der klinisch diagnostizierten Fälle durch eine Autopsie bestätigt worden waren. Der Vorhersagewert von einer klinischen Untersuchung liegt bei nahezu 100 %, wenn ein Familienmitglied eine Autopsie-bestätigte Diagnose von AD aufweist. Vier Subjekte mit einer Diagnose von AD und 30 Subjekte, die vor dem Alter von 60 untersucht worden waren, wurden von der Analyse ausgeschlossen. Bei den "late-onset" Familien lag kein Zusammenhang mit dem Chromosom 21 oder dem Chromosom 14 innerhalb von 19 % Rekombination der Region vor, die zuvor mit "early-onset" AD in Zusammenhang gebracht worden war. Der geschätzte maximale Zweipunkte-LOD-Score für AD und APOE lag bei 2,61 bei 6 % Rekombination.
Tabelle 4. Deskriptive Statistiken für betroffene und nicht betroffene Subjekte
Der Anteil von betroffenen Individuen stieg mit der Zahl von ApoE4-Allelen von 20 % Subjekte mit den Genotypen 2/3 oder 3/3, auf 47 % Subjekte mit den Genotypen 2/4 oder 3/4 und auf 91 % Subjekte mit dem 4/4-Genotyp (Tabelle 5). Dieser additive Trend war hochsignifinkant (Chi-Quadrat = 33,4 mit 1 df, p < 0,00001) (G. Koch et al., Analysis of Categorical Data (Les Presses de L'Universite de Montreal, Montreal, 1985) und SAS Institute, Inc., SAS/STAT Users Guide, Release 6,03 Edition (SAS Institute, Cary NC, 1988)). Es waren mehr Frauen als Männer betroffen (p = 0,04). Dies weist darauf hin, dass Frauen möglicherweise ein größeres Risiko für AD aufweisen.
Tabelle 5. Prozentsatz Betroffene für jeden ApoE-Genotyp
Wie in der Tabelle 6 dargestellt, stieg das Risiko für AD um einen Faktor von 2,84 (95 % Konfidenzintervall (CI) 2,03 bis 3,96) für jedes zusätzliche ApoE4-Allel (D. R. Cox et al., Analysis of Survival Data (Chapman and Hall, Londen, 1984) und L. Wei et al., JASA 84, 1065 (1989)). Somit war bei Subjekten mit dem 4/4-Genotyp die Wahrscheinlichkeit, betroffen zu sein, 8-mal so hoch wie bei Subjekten mit den 2/3- oder 3/3-Genotypen. Wenn separate Schätzungen für Subjekte mit 0, 1 und 2 ApoE4-Allelen durchgeführt wurden, lag ein konsistenter Nachweis vor (der keine statistische Signifikanz erreichte), dass Frauen ein höheres Risiko tragen als Männer. Das Risiko für Frauen im Vergleich zu Männern war 1,33 (95 % CI 0,42 bis 4,26), 1,39 (95 % CI 0,76 bis 2,55) und 1,30 (95 % CI 0,50 bis 3,38) bei jeweils 0, 1 und 2 ApoE4-Gendosen.
Tabelle 6. Prozentsatz von betroffenen Subjekten und relative Gefahr gemäß der Anzahl von ApoE4-Allelen
Die Schätzungen des Risikos in Tabelle 6 wurden mittels einer Exponentierung von Parameter-Schätzungen abgeleitet, die aus einem Cox-proportionalen Gefahrenmo dell erhalten wurden, was es ermöglichte, das Risiko bei Männern und Frauen zu unterscheiden (SAS Institute Inc., Analysis of Survival Data (Chapman and Hall, London, 1984), und SAS Institute Inc., SAS Technical Report P-217, SAS/STAT Software: The PHREG Procedure, Version 6 (SAS Institute Inc., Cary NC, 1991)). Das Symbol '+' zeigt an, dass sich das Risiko signifikant vom Referenzwert 1 unterschied. Informationen über jedes Subjekt im Alter zwischen 60 und 75 Jahren wurden verwendet, da die Annahme von proportionalen Risiken nach der Diagnose im Alter von 75 Jahren von praktisch allen Personen mit 2 ApoE-e4-Allelen nicht aufrecht erhalten werden konnte. Die Schätzungen von relativen Risiken ergeben sich statistisch konsistent, wenn nicht sogar völlig effizient, aus proportionalen Risikomodellen, selbst wenn miteinander verwandte Individuen untersucht werden (L. Wei et al., JASA 84, 1065 (1989)). Somit nähern sich Schätzungen des Risikos stark an Schätzungen an, die durch Untersuchung von nur einer Person aus jeder sehr viel größeren Gruppe von Familien gefunden worden wären.
Die Mantel-Haenszel-Korrelationsstatistik (SAS Institute, Inc., SAS/STAT User's Guide, Release 6,03 Edition (SAS Institute, Cary NC, 1988) und D. R. Cox et al., Analysis of Survival Data (Chapman and Hall, London, 1984)) getrennt nach Familie, wurde verwendet, um den additiven Trend für ein Risiko mit steigender ApoE4-Gendosis zu bewerten. Der Anteil von betroffenen Subjekten stieg mit der ApoE4-Gendosis signifikant an (Chi-Quadrat = 33,4 mit 1 d.f., p < 0,00001).
Als nächstes wurde das Alter des Ausbruchs untersucht, um zu bestimmen, ob es mit der ApoE4-Gendosis in Zusammenhang steht. Die Ausbruchsverteilungen wurden aus Informationen über das Alter des Ausbruchs bei betroffenen Subjekten und über das Alter, in dem nicht betroffene Subjekte das letzte Mal untersucht worden waren, erhalten, und waren für jede Gendosis verschieden (Chi-Quadrat = 53,84 mit 2 d.f., p < 0,00001) (R. G. Miller Jr., Survival Analysis (Whiley, New York, 1981), und SAS Institute Inc., SAS Users Guide: Statistics, Version 5 Edition (SAS Institute, Cary NC, 1984)) (3). Jedes zusätzliche ApoE4-Allel verschob den Ausbruch zu einem jüngeren Alter, der durchschnittliche Ausbruch lag bei 84,3 (SE 1,3) Jahren in Subjekten mit einem ApoE4-Allel, und 68,4 (1,2) Jahren in Subjekten mit 2 ApoE4-Allelen. Es zeigte sich eine Tendenz, dass der Ausbruch bei Frauen früher als bei Männern stattfand (p = 0,04).
Ähnlich wurden Überlebensverteilungen aus Informationen über das Todesalter von Subjekten, die bekannterweise verstorben sind, und über das Alter, in dem andere Subjekte das letzte Mal untersucht worden waren, erhalten, unabhängig von dem Status im Hinblick auf betroffen oder nicht-betroffen. Die ApoE4-Gendosis wurde mit dem Überlebensalter in Zusammenhang gesetzt (p = 0,004); das durchschnittliche Überlebensalter lag bei 84,9 (SE 1,3) Jahren in Subjekten mit 0 ApoE4-Allelen, 78,8 (SE 0,8) Jahren in Subjekten mit 1 ApoE4-Allel und 78,1 (SE 1,4) Jahren in Subjekten mit 2 ApoE4-Allelen. Der frühere Todeszeitpunkt bei Individuen mit 1 oder 2 ApoeE4-Allelen ist im Wesentlichen auf den häufigeren und früheren Ausbruch von AD bei diesen Subjekten zurückzuführen (p = 0,001).
Trotz kürzerer Überlebenszeiten in Subjekten mit 1 oder 2 ApoE4-Allelen führte uns der "early-onset" (frühere Ausbruch), der durch jedes ApoE4-Allel verliehen wird, zu dem Verdacht, dass die meisten Diagnosen für AD und die vorherrschenden Fälle in Subjekten mit 1 oder 2 ApoE4-Allelen auftreten. Der Unterschied zwischen durchschnittlichem Ausbruch und durchschnittlichem Überleben lag bei 9,7 Jahren in Subjekten mit 2 ApoE4-Allelen, 3,1 Jahre in Subjekten mit 1 ApoE4-Allel und 0,6 Jahre in Subjekten mit 0 ApoE4-Allelen.
Die früheren Berichte über eine Verbindung von AD mit Markern in der Nähe des ApoE-Locus könnten aus der allelischen Assoziation von AD mit ApoE4 resultieren. Auch wenn diese Marker nicht in einem Ungleichgewicht mit ApoE4 zu sein scheinen, könnte deren Segregation die Verbindung in Familien nachahmen, die wenigstens 1 ApoE4-Allel segretieren (D. A. Greenberg, Am. J. Hum. Genet. 52, 135-143 (1993)). Der starke, jedoch nicht endgültige Nachweis für eine Verbindung von AD mit dem ApoE-Locus (2 = 2,61, 0 = 0,06) unterstützt ebenfalls diese Erklärung.
Es ist wichtig zu erkennen, dass 19 von 95 betroffenen Subjekten in unserer Gruppe von Stammbäumen und 64 von 176 Autopsie-bestätigten sporadischen AD-Fällen, die von Saunders et al. (R. G. Miller Jr., Survival Analysis (Wiley, New York, 1981)) beschrieben worden sind, keine ApoE4-Allele aufwiesen. 12 von 42 "late-onset" Familien hatten betroffene Mitglieder mit 0 ApoE4-Allelen. Die Tatsache, dass diese dazu neigten, die größten, und auf der Basis von Simulationsstudien, die potentiell aussagekräftigsten Familien für einen Zusammenhang (linkage) darzustellen, deutet stark darauf hin, dass weitere genetische Risikoquellen bestehen. Diese weiteren Gene können nur identifiziert werden, wenn die Effekte des ApoE4-Allels in spätere Analysen einbezogen werden.

Claims

Ein Verfahren zur Diagnose, Prognose oder zum Screening eines Risikos für Alzheimersche Krankheit eines Subjekts, worin das Vorliegen von Apolipoprotein E Typ 4 (ApoE4) Isoform darauf hinweist, dass das Subjekt an der Alzheimerschen Krankheit leidet oder das Risiko trägt, eine Alzheimersche Krankheit zu entwickeln, wobei das Verfahren umfasst: Detektieren des Vorliegens oder der Abwesenheit von ApoE4 oder von DNA, die dieses codiert, in einer biologischen Probe dieses Subjekts, z. B. in einer Blutprobe.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, worin zuvor nicht diagnostiziert worden war, dass das Subjekt an Alzheimerscher Krankheit leidet.
Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei der Detektionsschritt das Detektieren, ob das Subjekt für das Gen, das die ApoE Typ 4 Isoform codiert, homozygot ist, umfasst.
Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, worin zuvor bestimmt worden war, dass das Subjekt ein Risiko zur Entwicklung von Alzheimerscher Krankheit trägt.
Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das Subjekt an Demenz leidet.
Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, worin der Schritt der Detektion von DNA, die ApoE4 codiert, durchgeführt wird, indem die DNA, die ApoE4 codiert, amplifiziert wird.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 6, worin der Amplifizierungsschritt mittels Polymerase-Kettenreaktion oder mittels Ligase-Kettenreaktion durchgeführt wird.
Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, worin der Schritt der Detektion von ApoE4 mittels isoelektrischer Fokussierung oder mittels Immunassay durchgeführt wird, gegebenenfalls einem Immunassay mit einem Antikörper, der selektiv an die ApoE4 Isoform bindet.
Die Verwendung eines Mittels zur Detektion von Apolipoprotein E Typ 4 Isoform (ApoE4) oder von DNA, die dieses codiert, in einer biologischen Probe eines Subjekts zur Bestimmung, ob das Subjekt an Alzheimerscher Krankheit leidet oder ein Risiko zur Entwicklung von Alzheimerscher Krankheit trägt.
Eine Verwendung gemäß Anspruch 9, die auf die Diagnose oder die Bestimmung der Prognose der Alzheimerschen Krankheit in einem Subjekt angewendet wird.
Eine Verwendung gemäß Anspruch 9 oder 10, die durch Detektion der DNA, die ApoE4 codiert, ausgeführt wird.
Eine Verwendung gemäß Anspruch 9 oder 10, die durch direkte Detektion von ApoE4 ausgeführt wird.
Eine Verwendung gemäß einem der Ansprüche 9 bis 12, die die Detektion, ob das Subjekt für das Gen, das ApoE4 codiert, homozygot ist, einschließt.