MX2013006116A - Tratamiento de sintomas asociados a placa amiloide. - Google Patents

Abstract

La presente invención abarca composiciones y métodos para tratar efectivamente por lo menos un síntoma o signo de síntomas asociados a placa A o para disminuir cargas de placa amiloide. El método comprende administrar una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-ApoE al biosistema de un mamífero viviente, tal como a un humano.

Description

TRATAMIENTO DE SINTOMAS ASOCIADOS A PLACA AMILOIDE CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención es concerniente con composiciones y métodos para retardar o impedir síntomas asociados con placa ?ß, tales como aquellas asociadas con enfermedad de Alzheimer (AD) en un sujeto. En particular, la invención es concerniente con la modulación de la concentración de amiloide-ß (?ß) en el cerebro de un sujeto.

ANTECEDENTES DE LA IVENCIÓN La enfermedad de Alzheimer es la causa más común de demencia y es un problema de salud público incrementado. Se estima actualmente que aflige a 5 millones de gentes en los Estados Unidos de América con un incremento esperado de 13 millones para el año 2050. La enfermedad de Alzheimer produce la pérdida de memoria, función cognitiva y finalmente pérdida de independencia. Toma una cuota pesada personal y financiera en el sujeto y la familia. Debido a la severidad y permanencia incrementada de la enfermedad en la población, es urgente que se desarrollen mejores tratamientos.

La evidencia bioquímica, genética y de modelos de animales implica al amiloide-ß (?ß) como un péptido patógeno en AD. La marcas distintivas neuropatológicas y neuroquímicas de AD incluyen perdida sináptica y muerte neuronal selectiva, una disminución en ciertos transmisores y la presencia de depósitos proteináceos anormales en las neuronas (marañas neurofibrilares ) y en el espacio extracelular (placas cerebrovasculares, difusas y neuríticas) . El constituyente principal de estas placas es ?ß , un péptido de secuencia de 38-43 aminoácidos escindido de la proteina precursora amiloide (APP) .

En toda la vida, ?ß soluble es secretado principalmente por neuronas, pero también otros tipos de células. El depósito de ?ß excesivo puede dar como resultado síntesis de ?ß incrementado como ocurre en AD de inicio prematuro familiar o despeje de ?ß disminuido en el cerebro. La carencia de evidencia compelente de que la producción de que ?ß ocurre en las formas de inicio tardío más común de AD, sugiere que el despeje de ?ß insuficiente puede impulsar la deposición de ?ß y formación de placa amiloide también.

El gen de apolipoproteína E (ApoE) sigue siendo el factor de riesgo genético más ampliamente replicado para AD de inicio tardío, que porta el alelo E4 que tiene un riesgo 3-15 veces mayor también como una etapa prematura de inicio de la enfermedad. El cerebro ApoE es principalmente sintetizado y secretado por astrocitos y microglía que se encuentra que rodea las placas amiloides. La presente invención provee anticuerpos ApoE efectivos para reducir la carga de placa amiloide en modelos de ratón con AD.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Un aspecto de la invención abarca un método para tratar efectivamente por lo menos un síntoma asociado con placa ?ß detectable clínicamente que comprende administrar una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-ApoE a un sujeto humano viviente. En otro aspecto, la invención abarca un anticuerpo útil en tal tratamiento. Por ejemplo, un anticuerpo que atenúa terapéuticamente los efectos tóxicos del péptido ?ß en un mamífero viviente.

Otro aspecto de la invención abarca una composición que comprende por lo menos un anticuerpo anti-ApoE. En un aspecto, la invención abarca una composición que comprende por lo menos un anticuerpo anti-ApoE producido del hibridoma HJ6.1, HJ6.2, HJ6.3, HJ6.4 o una combinación de los mismos. En un aspecto, la invención abarca una composición medicinal que comprende por lo menos un anticuerpo anti-ApoE. En un aspecto, la invención abarca una composición medicinal que comprende por lo menos un anticuerpo anti-ApoE producido del hibridoma HJ6.1, HJ6.2, HJ6.3, HJ6.4 o una combinación de los mismos.

Todavía otro aspecto de la invención abarca una composición medicinal útil para tratar por lo menos un síntoma asociado con placa ?ß detectable clínicamente. La composición comprende una cantidad medicinalmente efectiva de un anticuerpo anti-ApoE apta para administración a un sujeto humano viviente. En un aspecto, un anticuerpo útil en tal tratamiento incluye un anticuerpo que atenúa terapéuticamente los efectivos tóxicos del péptido ?ß en un mamífero viviente. En un aspecto, la composición medicinal es administrada efectivamente a un sujeto viviente.

Todavía otro aspecto de la invención abarca un kit medicinal que comprende un recipiente que contiene una composición medicinal terapéutica funcional de una cantidad medicinalmente efectiva de un anticuerpo anti-ApoE apta para administración a un sujeto humano viviente y cualesquier dispositivos médicos a ser usados para dicha administración. En un aspecto, un anticuerpo útil en tal tratamiento incluye un anticuerpo que atenúa terapéuticamente los efectos tóxicos del péptido ?ß en un mamífero viviente.

Otros aspectos e iteraciones de la invención son detallados posteriormente en la presente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 ilustra gráficamente un fuerte efecto de anticuerpos anti-ApoE en la carga de placa amiloide disminuida en muestras del hipocampo de ratones PS/APP tratados intraperitonealmente una vez a la semana con 10 mg/kg comenzando a 3 meses de edad hasta los 7 meses de edad ya sea con un anticuerpo ?ß (HJ3.4) o uno de dos anticuerpos anti-ApoE (HJ6.2 o HJ6.3). El grupo testigo fue tratado con solución reguladora del pH de fosfato (PBS) . Los números de animales determinados son N=7 (PBS), N=16 (HJ3.4), N=16 (HJ6.2) , N=16) .

La figura 2 ilustra gráficamente un fuerte efecto de anticuerpos anti-ApoE en la carga de placa amiloide disminuida en muestras de la corteza cerebral de ratones PS/APP tratados intraperitonealmente una vez a la semana con 10 mg/kg ya sea con un anticuerpo ?ß (HJ3.4) o uno de los dos anticuerpos anti-ApoE (HJ6.2 o HJ6.3) . El grupo testigo fue tratado con PBS. Los números de animales determinados son N=7 (PBS), N=16 (HJ3.4), N=16 (HJ6.2), N=16) .

La figura 3 ilustra gráficamente el enlace de anticuerpos anti-ApoE HJ6.1, HJ6.2, HJ6.3 y HJ6.4 a ApoE humano utilizando un análisis de ELISA.

La figura 4 ilustra gráficamente (A) el enlace de anticuerpos anti-ApoE HJ6.1, HJ6.2, HJ6.3 y HJ6.4 a ApoE humano en plasma y (B) niveles de colesterol en los mismos ratones que recibieron los anticuerpos HJ6.1, HJ6.2, HJ6.3 y HJ6.4.

La figura 5 ilustra gráficamente la presencia de anticuerpos anti-ApoE HJ6.1, HJ6.2, HJ6.3 y HJ6.4 en el sistema nervioso central después de administración periférica .

La figura 6 ilustra gráficamente la activación microglial después de la administración a corto plazo de HJ6.2 y HJ6.3 (anticuerpos anti-ApoE) y HJ3.4 (anticuerpo anti-?ß) a ratones durante 10 dias.

La figura 7 ilustra la secuencias de aminoácidos de (A) la región variable de cadena pesada de HJ6.1 y primera región constante (SEQ ID NO:4); (B) región variable de cadena ligera de y región constante HJ6.1 (SEQ ID NO:2); (C) región variable de cadena pesada de HJ6.2 y primera región constante (SEQ ID NO:8); (D) región variable de cadena ligera de HJ6.2 y región constante (SEQ ID NO: 6); (E) región variable de cadena pesada HJ6.3 y primera región constante (SEQ ID NO:12); (F) región variable de cadena ligera de HJ6.3 y región constante (SEQ ID NO: 10); (G) región variable de HJ6.4 y primera región constante (SEQ ID NO: 16); (H) región variable de cadena ligera de HJ6.4 y región constante (SEQ ID NO: 14). Las regiones que comprenden CDR son resaltadas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA La solicitante ha descubierto anticuerpos y métodos de uso de los mismos para tratar de manera efectiva síntomas asociados con placa ?ß el método comprende administrar efectivamente una cantidad farmacológica efectiva de un anticuerpo anti-ApoE a un sujeto viviente. La presente invención abarca el descubrimiento de que los anticuerpos anti-ApoE proveen un tratamiento para sujetos que sufren de síntomas asociados con placa ?ß. Así, la invención provee evidencia que los signos y síntomas de síntomas asociadas con placa ?ß pueden ser debidos por lo menos en parte a los efectos perjudiciales de ApoE. En un aspecto, por lo menos un síntoma o signo pre-clínico o clínico es presentado por aquel sujete. En un aspecto, un anticuerpo útil en tal tratamiento incluye un anticuerpo que atenúa terapéuticamente los efectos tóxicos del péptido ?ß en un mamífero viviente. En un aspecto, anticuerpos útiles en tal tratamiento incluyen aquellos que se enlazan a un epítope dentro de ApoE.

En un aspecto, un anticuerpo anti-ApoE es mezclado con por lo menos un excipiente o adyuvante compatible apropiado dando como resultado una composición medicinal terapéutica que es apta de ser administrada (dada) efectivamente a un sujeto humano viviente, tal como a un humano afligido con síntomas asociados a placa ?ß . Comúnmente, esta es una composición acuosa de alta pureza.

Como se usan en la presente, los términos "que trata" o "tratamiento" incluyen prevención, atenuación, inversión o mejora en por lo menos un síntoma o signos de síntomas asociados a placa ?ß.

Como se usa en la presente, el término "atenúa terapéuticamente" incluye inducir un cambio o tener un efecto positivo benéfico resultante del mismo.

Una definición de síntomas asociados a placa ?ß se refiere a cualquier síntoma provocado por la formación de placas amiloides que están compuestas de agregados fibrilares ordenados regularmente llamados fibrillas amiloides. Alteraciones ejemplares que tienen síntomas asociados a placa ?ß incluyen pero no están limitados a enfermedad de Alzheimer, demencia de cuerpo de Lewis y angiopatia amiloide cerebral .

Los síntomas asociados a placa ?ß ejemplares pueden incluir la función cognitiva deteriorada, comportamiento alterado, desregulación emocional, ataques, estructura o función del sistema nervioso deteriorada o un riesgo incrementado de desarrollo de enfermedad de Alzheimer. La función cognitiva deteriorada puede incluir pero no está limitada a dificultades con la memoria, atención, concentración, lenguaje, pensamiento abstracto, creatividad, función ejecutiva, planeación y organización. El comportamiento alterado puede incluir pero no está limitado a agresión física o verbal, impulsividad, inhibición disminuida, apatía, inicio disminuido, cambios de personalidad, abuso de alcohol, tabaco o drogas y otros comportamientos adicción-relacionados . La desregulación emocional puede incluir pero no está limitada a depresión, ansiedad, manía, irritabilidad e incontinencia emocional. Los ataques pueden incluir pero no están limitados a ataques tónicos-clónicos generalizados, ataques parciales complejos y ataques no epilépticos psicogénicos . La estructura o función del sistema nervioso deteriorado puede incluir pero no está limitado a hidrocéfalo, parkinsonismo, alteraciones del sueño, psicosis, deterioro del equilibrio y coordinación. Estos pueden incluir deterioros motrices tales como monoparesis, hemiparesis, tetraparesis, ataxia, ballismus y temblor. Este también puede incluir pérdida sensorial o disfunción sensorial incluyendo sensación olfativa, táctil, gustativa, visual y auditiva. Además, este puede incluir deterioros del sistema nervioso autónomo tales como disfunción de intestino y vejiga, disfunción sexual, desregulación de la presión sanguínea y temperatura. Finalmente, este puede incluir deterioros hormonales atribuibles a disfunción del hipotálamo y glándula pituitaria tal como deficiencias y desregulamiento de hormona de crecimiento, hormona estimulante de tiroides, hormona luteinizante, hormona estimulante de folículo, hormona de liberación de gonadotropina, prolactina y otras numerosas hormonas y moduladores. El riesgo incrementado de desarrollo de enfermedad de Alzheimer incluye aquel riesgo que es elevado con respecto al riesgo esperado dada la edad del sujeto, historia familiar, estatus genético y otros factores de riesgo conocidos.

Los péptidos ?ß son aquellos derivados de una región en el término carboxi de una proteína más grande llamada proteína precursora amiloide (APP) . El gen que codifica APP está ubicado en el cromosoma 21. Hay muchas formas de ?ß que pueden tener efectos tóxicos: los péptidos ?ß son comúnmente secuencias de 38-43 aminoácidos de largo, aunque pueden tener truncaciones y modificaciones que cambian su tamaño global. Se pueden encontrar en compartimientos solubles e insolubles, en formas monoméricas, oligoméricas y agregadas, intracelular o extracelularmente y pueden ser acomplejados con otras proteínas o moléculas. Los efectos adversos o tóxicos de ?ß pueden ser atribuibles a cualquiera o todas las formas indicadas anteriormente, también como otras no descritas específicamente .

En una modalidad, la invención provee un método para disminuir la carga de placa amiloide en el cerebro de un sujeto. El método comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo que se enlaza específicamente a ApoE al sujeto. Anticuerpos apropiados incluyen aquellos revelados en la presente. En una modalidad ejemplar, un Ab apropiado comprende un anticuerpo delineado en la tabla A posteriormente en la presente. Un método de la invención puede disminuir la carga de placa amiloide en el hipocampo de un sujeto. Un método de la invención puede también disminuir la carga de placa amiloide en la corteza cerebral de un sujeto. En cada una de las modalidades anteriores, la carga de placa amiloide puede ser disminuida por al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20% en comparación con sujetos tratados con testigo negativo o sin tratar. En algunas modalidades, la carga de placa amiloide puede ser disminuida por al menos 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 o 95% en comparación con sujetos tratados con testigo negativo o sin tratar. En otras modalidades, la carga de placa amiloide puede ser disminuida por al menos 100, 125, 150, 200, 250, 300, 350, 400 o 450% en comparación con sujetos sin tratar o sujetos tratados con testigo negativo. Métodos para medir la carga de placa amiloide son conocidos en el arte.

Anticuerpos anti-ApoE útiles en la presente incluyen todos los anticuerpos que atenúan terapéuticamente los efectos adversos o tóxicos de ?ß. Anticuerpos útiles incluyen pero no están limitados a aquellos que se enlazan específicamente a un epítope dentro de la secuencia de codificación de ApoE. Anticuerpos anti-ApoE útiles en la presente incluyen también anticuerpos que atenúan los efectos adversos o tóxicos de ?ß y se enlazan a regiones específicas de ApoE y a otras formas de ApoE. Regiones específicas de ApoE incluyen pero no están limitadas a C-terminal, N-terminal y otros dominios centrales. Otras formas de ApoE incluyen pero no están limitadas a ApoE truncado, modificado, soluble, insoluble, intracelular, extracelular, monomérico, ApoE oligomérico, ApoE fibrilar, ApoE agregado o ApoE acomplejado con otras proteínas o moléculas.

En un aspecto, los anticuerpos útiles en la presente incluyen aquellos anticuerpos que han sido aislados, caracterizados, purificados, son funcionales y han sido recuperados (obtenidos) para usa en una composición terapéutica funcional que es administrada a un sujeto viviente que tiene síntomas asociados con placa ?ß .

"Anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo que es derivado de una sola copia o clon, incluyendo por ejemplo cualquier clon eucarióntico, procarióntico o de fago. "Anticuerpo monoclonal" no está limitado a anticuerpos producidos por medio de tecnología de hibridoma. Los anticuerpos monoclonales pueden ser producidos utilizando por ejemplo técnicas de hibridoma bien conocidas en el arte, también como tecnologías recombinantes, tecnologías de despliegue de fago, tecnologías de síntesis o combinaciones de tales tecnologías y otras tecnologías fácilmente conocidas en el arte. Además, el anticuerpo monoclonal puede ser marcado con un marcador detectable, inmovilizado sobre una fase sólida y/o conjugado con un compuesto heterólogo (por ejemplo, una enzima o toxina) de acuerdo con métodos conocidos en el arte. Además "anticuerpo" significa un anticuerpo monoclonal funcional o un fragmento inmunológicamente efectivo del mismo, tal como un fragmento Fab, Fab1 o F(ab')2 del mismo. En algunos contextos en la presente, los fragmentos serán mencionados específicamente por énfasis; no obstante, se comprenderá que sin consideración de los fragmentos son especificados, el término "anticuerpo" incluye tales fragmentos también como formas de una sola cadena. En tanto que la proteina refrenda la habilidad específicamente para enlazarse a su objetivo propuesto, está incluida en el término "anticuerpo". También incluidos en la definición de "anticuerpo" están por ejemplo formas de una sola cadena, designadas en general como Fv, regiones de anticuerpos con esta especificidad. De preferencia aunque no necesariamente, los anticuerpos útiles en la revelación son producidos recombinantemente, como manipulación de los anticuerpos comúnmente murinos y otros anticuerpos no humanos con la especificidad apropiada es requerida con el fin de convertirlos a la forma humanizada. Los anticuerpos pueden o pueden no ser glicosilados , aunque los anticuerpos glicosilados son preferidos. Los anticuerpos son reticulados apropiadamente vía enlace de disulfuro, como es conocido.

La unidad estructural de anticuerpo básica de un anticuerpo útil en la presente comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto de dos pares idénticos de cadena de polipéptidos , cada par tiene una cadena "ligera" (alrededor de 25 KDa) y una cadena "pesada" (alrededor de 50-70 KDa) . La porción amino-terminal de cada cadena incluye una región variable de alrededor de 100 a 110 o más secuencias de aminoácido principalmente responsables para el reconocimiento de antigeno. La porción carboxi-terminal de cada cadena define una región constante principalmente responsable por la función efectora.

Los anticuerpos anti-???? útiles en la presente incluyen aquellos que son aislados, caracterizados, purificados, funcionales y han sido recuperados (obtenidos) de un proceso para su preparación y asi disponibles para uso en la presente en una forma útil en una cantidad terapéutica y medicinalmente suficiente.

Las cadenas ligeras son clasificadas como gama, mu, alfa y lambda. Las cadenas pesadas son clasificadas como gama, mu, alfa, beta o épsilon y definen el isotipo del anticuerpo como IgO, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas ligeras y pesadas, las regiones variables y constantes están unidas por una región "J" de alrededor de 12 o más secuencias de aminoácido, con la cadena pesada que también incluye una región de "D" de alrededor de 10 o más secuencias de aminoácido.

Las regiones variables de cada par de cadena ligera/pesada forman el sitio de enlace de anticuerpo. Asi, un anticuerpo intacto tiene dos sitios de enlace. Las cadenas exhiben la misma estructura general de regiones de estructura relativamente conservadas (FR) unidas por tres regiones hipervariables , también llamadas regiones que determinan la complementareidad (de aquí en adelante en la presente llamadas como "CDR") . Las CDR de las dos cadenas son alineadas con las regiones de estructura, permitiendo el enlace a un epitope especifico. De N-terminal a C-terminal, ambas cadenas ligeras y pesadas comprenden los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2 , FR3, CDR3 y FR4 , respectivamente. La asignación de secuencia de aminoácido a cada dominio es de acuerdo con convenciones conocidas (véase, Kabat "Sequences of Proteins of Immunological Interest" National Institutes of Health, Bethesda, d., 1987 and 1991; Chothia, et al, J. Mol. Bio. (1987) 196:901-917; Chothia, . et al., Nature (1989) 342: 878-883) .

En un aspecto, los anticuerpos anti-ApoE monoclonales son generados con especificidad apropiada mediante técnicas estándar de inmunización de mamíferos, formación de hibridomas de las células que producen anticuerpo de dichos mamíferos o de otra manera inmortalizarlas y cultivar los hibridomas o células inmortalizadas para determinarlas en cuanto a la especificidad apropiada. En el caso presente, tales anticuerpos podrían ser generados al inmunizar un humano, conejo, rata o ratón, por ejemplo con un péptido que representa un epitope que abarca una región de la secuencia de codificación de proteína de ApoE o una sub-región apropiada de la misma. Materiales para manipulación recombinante pueden ser obtenidos al recuperar las secuencias de nucleótidos que codifican el anticuerpo deseado del hibridoma u otra célula que lo produce. Estas secuencias pueden luego ser manipuladas y aisladas, caracterizadas, purificadas y recuperadas para proveerlas en forma humanizada para uso en la presente si se desea.

Como se usa en la presente "anticuerpo humanizado" incluye un anticuerpo anti-ApoE que está compuesto parcial o plenamente de secuencias de aminoácidos derivadas de una linea germinal de anticuerpo humana al alterar la secuencia de un anticuerpo que tiene regiones que determinan la complementareidad ("CDR") no humanas. La más simple de tal alteración puede consistir simplemente de sustituir la región constante de un anticuerpo humano por la región constante murina, dando como resultado asi una quimera humana/murina que puede tener inmunogenicidad suficientemente baja para ser aceptable para uso farmacéutico. Preferiblemente, sin embargo, la región variable del anticuerpo y aun las CDR es también humanizada por técnicas que son ahora bien conocidas en el arte. Las regiones de estructura de las regiones variables son sustituidas por las regiones de estructura humanas correspondientes dejando la CDR no humana sustancialmente intacta o aun reemplazando la CDR con secuencias derivadas de un genoma humano. Las CDR pueden también ser mutadas aleatoriamente, de tal manera que la actividad de enlace y afinidad por ApoE es mantenida o mejorada en el contexto de las regiones de estructura de la línea germinal plenamente humana o regiones de estructura gue son sustancialmente humanas. Las estructuras sustancialmente humanas tienen por lo menos 90%, 95% o 99% de identidad de secuencia con una secuencia de estructura humana conocida. Anticuerpos humanos plenamente útiles son producidos en ratones modificados genéticamente cuyos sistemas inmunes han sido alterados para corresponder a sistemas inmunes humanos. Como se menciona anteriormente, es suficiente para uso en los métodos de esta revelación emplear un fragmento inmunológicamente específico del anticuerpo, incluyendo fragmentos que representan formas de una sola cadena.

Además, como se usa en la presente, el término "anticuerpo humanizado" se refiere a un anticuerpo anti-ApoE que comprende una estructura humana, por lo menos una CDR de un anticuerpo no humano y en la cual cualquiera región constante presente es sustancialmente idéntica a una región constante de inmunoglobulina humana, esto es, por lo menos de alrededor de 85-90%, preferiblemente por lo menos 95% idéntica. De aquí, todas las partes de un anticuerpo humanizado, excepto posiblemente las CDR, son sustancialmente idénticas a pares correspondientes de una o más secuencias de inmunoglobulina humanas naturales.

Si se desea, el diseño de inmunoglobulinas humanizadas se puede llevar a cabo como sigue. Cuando una secuencia de aminoácido cae bajo la siguiente categoría, la secuencia de aminoácidos de estructura de una inmunoglobulina humana a ser usada (inmunoglobulina aceptora) es reemplazada por una secuencias de aminoácidos de estructura de una CDR que provee inmunoglobulina no humana (inmunoglobulina donadora) : (a) la secuencia de aminoácidos en la región de estructura humana de la inmunoglobulina aceptora es inusual para la inmunoglobulina humana en aquella posición mientras que la secuencia de aminoácidos correspondiente en la inmunoglobulina donadora es típica para inmunoglobulina humana en aquella posición; (b) la posición de la secuencia de aminoácidos es inmediatamente adyacente a una de las CDR o (c) cualquier átomo de cadena lateral de una secuencia de aminoácidos de estructura está dentro de alrededor de 5-6 angstroms (de centro a centro) de cualquier átomo de una secuencia de aminoácidos de CDR en un modelo de inmunoglobulina tridimensional (Queen, et al., op. cit., and Co, ct al, Proc. Nati. Acad. Sci . USA (1991) 88:2869) . Cuando cada una de las secuencias de aminoácidos en la región de estructura humana de la inmunoglobulina aceptora y una secuencia de aminoácidos correspondiente en la inmunoglobulina donadora es inusual para inmunoglobulina humana en aquella posición, tal secuencia de aminoácidos es reemplazada por una secuencia de aminoácidos típica para inmunoglobulina en aquella posición.

En todas las instancias, el anticuerpo de la invención se enlaza específicamente a ApoE. En modalidades ejemplares, un anticuerpo de la invención se enlaza específicamente a ApoE humano. La frase "se enlaza específicamente" en la presente significa que anticuerpos se enlazan a la proteína con una constante de enlace en el intervalo de por lo menos 10"4- 10"6 M"1, con un intervalo preferido siendo de 1CT7, - 10" 9 M"1. La secuencia de ApoE de una variedad de especies es conocida en el arte y métodos para determinar si un anticuerpo se enlaza a ApoE son conocidos en el arte. Por ejemplo, véanse los ejemplos. Un anticuerpo de la invención puede reconocer ApoE2, ApoE3, ApoE4 o una variante alélica de los mismos. En una modalidad, un anticuerpo de la invención puede reconocer ApoE4 humano.

Un anticuerpo preferido es una forma humanizada de anticuerpos de ratón derivado de un hibridoma designado como HJ6.1 (designación de depósito de patente ATCC PT-11805) , HJ6.2 (designación de depósito de patente de ATCC PT-11806) , HJ6.3 (designación de depósito de patente de ATCC PT-11807) o HJ6.4 (designación de depósito de patente de ATCC PT-11808). Como se usa en la presente, el término "derivado de" significa que el anticuerpo "derivado" comprende por lo menos una región de CDR del anticuerpo producido por HJ6.1, HJ6.2, HJ6.3 o HJ6.4. En otras palabras, el "anticuerpo derivado" comprende por lo menos una región de CDR que consiste de la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 y 39.

En una modalidad, un anticuerpo de la invención puede ser derivado del hibridoma HJ6.1 y puede ser codificado por una secuencia de ácidos nucleicos que comprende 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad a la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:l o puede ser codificado por una secuencia de ácidos nucleicos que comprende 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad a la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 2. En otra modalidad, un anticuerpo de la invención puede ser derivado del hibridoma HJ6.1 y puede comprender una secuencia de aminoácidos con 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad a la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 3 o puede comprender una secuencia de aminoácidos con 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad a la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 4. En cada una de las modalidades anteriores, el anticuerpo puede ser humanizado.

En todavía otra modalidad, un anticuerpo de la invención puede ser derivado del hibridoma HJ6.2 y puede ser codificado por una secuencia de ácidos nucleicos que comprende 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad a la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 5 o puede ser codificado por una secuencia de ácidos nucleicos que comprende 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad a la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 6. En otra modalidad, un anticuerpo de la invención puede ser derivado del hibridoma HJ6.2 y puede comprender una secuencia de aminoácidos con 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad a la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 7 o puede comprender una secuencia de aminoácidos con 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad a la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 8. En cada una de las modalidades anteriores, el anticuerpo puede ser humanizado .

En una modalidad adicional, un anticuerpo de la invención puede ser derivado del hibridoma HJ6.3 y puede ser codificado por una secuencia de ácidos nucleicos que comprende 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad a la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 9 o puede ser codificado por una secuencia de ácidos nucleicos que comprende 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad a la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 10. En otra modalidad, un anticuerpo de la invención puede ser derivado del hibridoma HJ6.3 y puede comprender una secuencia de aminoácidos con 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad a la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 11 o puede comprender una secuencia de aminoácidos con 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad a la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 12. En cada una de las modalidades anteriores, el anticuerpo puede ser humanizado.

En todavía otra modalidad, un anticuerpo de la invención puede ser derivado del hibridoma HJ6.4 y puede ser codificado por una secuencia de ácido nucleicos con 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad a la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 13 y una secuencia de ácidos nucleicos con 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad a la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 14. En otra modalidad, un anticuerpo de la invención puede ser derivado del hibridoma HJ6.4 y puede comprender una secuencia de aminoácidos con 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad a la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 15 o puede comprender una secuencia de aminoácidos con 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad a la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 16. En cada una de las modalidades anteriores, el anticuerpo puede ser humanizado.

En una modalidad ejemplar del anticuerpo de la invención que se enlaza a anti-ApoE, el anticuerpo comprende la secuencia de ácidos nucleicos de cadena ligera de SEQ ID N0:1 y la secuencia de ácidos nucleicos de cadena pesada de SEQ ID NO: 2 [esto es, el anticuerpo monoclonal denominado en la presente como HJ6.1]. En otra modalidad ejemplar de un anticuerpo de la invención que se enlaza a anti-ApoE, el anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 3 y la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEQ ID NO: [esto es, el anticuerpo monoclonal denominado en la presente como HJ6.1] . En otra modalidad ejemplar de un anticuerpo de la invención que se enlaza a anti-ApoE, el anticuerpo comprende la secuencia de ácidos nucleicos de cadena ligera de SEQ ID NO: 5 y las secuencias de ácidos nucleicos de cadena pesada de SEQ ID NO: 6 [esto es, el anticuerpo monoclonal denominado en la presente como HJ6.2] . En todavía otra modalidad ejemplar de un anticuerpo de la invención que se enlaza anti-ApoE, el anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 7 y la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 8 [esto es, el anticuerpo monoclonal denominado en la presente como HJ6.2] .

En ciertas modalidades, un anticuerpo de la invención es codificado por las secuencias de ácido nucleico de cadena ligera de SEQ ID NO: 9 y la secuencia de ácido nucleico de cadena pesada de SEQ ID NO: 10 [esto es, el anticuerpo monoclonal denominado en la presente como HJ6.3] . En otras modalidades, un anticuerpo de la invención es codificado por la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 11 y la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 12 [esto es, el anticuerpo monoclonal denominado en la presente como HJ6.3] . En otra modalidad, un anticuerpo de la invención es codificado por la secuencia de ácidos nucleicos de cadena ligera de SEQ ID NO: 13 y la secuencia de ácidos nucleicos de cadena pesada de SEQ ID NO: 14 [esto es, el anticuerpo monoclonal denominado en la presente como HJ6.4 ] . en todavía otra modalidad, un anticuerpo de la invención es codificado por la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 15 y la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 16 [esto es, el anticuerpo monoclonal denominado en la presente como HJ6.4] .

En una modalidad, un anticuerpo de la invención puede comprender una CDR1 de cadena ligera, tales como los anticuerpos 1, 49, 97 y 145 de la Tabla A. En otra modalidad, un anticuerpo de la invención puede comprender una CDR2 de cadena ligera, tales como los anticuerpos 4, 52, 100 y 148 de la tabla A. En todavía otra modalidad, un anticuerpo de la invención puede comprender una CDR3 de cadena ligera, tales como los anticuerpos 6, 54, 102 y 150 de la tabla A. En una modalidad alternativa, un anticuerpo de la invención puede comprender una combinación de dos o tres CDR de cadena ligera, tales como los anticuerpos 2, 3, 5, 50, 51, 53, 98, 99, 101, 146, 147 y 149 de la tabla A.

Similarmente, en una modalidad, un anticuerpo de la invención puede comprender una CDR1 de cadena pesada, tales como los anticuerpos 7, 55, 103 y 151 de la tabla A. En otra modalidad, un anticuerpo de la invención puede comprender una CDR2 de cadena pesada, tales como los anticuerpos 10, 58, 106 y 154 de la tabla A. En todavía otra modalidad, un anticuerpo de la invención puede comprender un CDR3 de cadena pesada, tales como los anticuerpos 12, 60, 108 y 156 de la tabla A. En una modalidad alternativa, un anticuerpo de la invención puede comprender una combinación de dos o tres CDR de cadena pesada, tales como los anticuerpos 8, 9, 11, 56, 57, 59, 104, 105, 107, 152, 153 y 155 de la tabla A.

Alternativamente, un anticuerpo de la invención puede comprender una o más CDR de cadena ligera y una o más CDR de cadena pesada, tales como los anticuerpos 13-48, 61-96, 109-144 y 157-192 de la tabla A.

TABLA A 10 20 25 5 10 25 En varias modalidades, un anticuerpo de la invención es humanizado. Por ejemplo, en una modalidad, un anticuerpo humanizado de la invención puede comprender una región variable de cadena ligera que comprende una CDRl de secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 con cero a dos sustituciones de aminoácido, una CDR2 de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 18 con cero a dos sustituciones de aminoácido y una CDR3 de secuencia de aminoácidos LSP o puede comprender una región variable de cadena pesada que comprende una CDRl de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 19 con cero a dos sustituciones de aminoácido, una CDR2 de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 20 con cero a dos sustituciones de aminoácidos y una CDR3 de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 21 con cero a dos sustituciones de aminoácidos. En una modalidad preferida, un anticuerpo humanizado de la invención puede comprender una región variable de cadena ligera que comprende una CDRl de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 17 con cero a dos sustituciones de aminoácido, una CDR2 de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 18 con cero a dos sustituciones de aminoácido, una CDR3 de secuencia de aminoácidos LSP, una región variable de cadena pesada que comprende una CDRl de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 19 con cero a dos sustituciones de aminoácidos, una CDR2 de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 20 con cero a dos sustituciones de aminoácidos y una CDR3 de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 21 con cero a dos sustituciones de aminoácido. En una modalidad ejemplar, un anticuerpo humanizado de la invención puede comprender una región variable de cadena ligera que comprende una CDRl de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 17, una CDR2 de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 18, una CDR3 de secuencia de aminoácidos LSP, una región variable de cadena pesada que comprende una CDRl de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 19, una CDR2 de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 20 y una CDR3 de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 21. La invención también abarca las correspondientes secuencias de ácidos nucleicos SEQ ID NO: 17, 18, 19, 20 y 21, que pueden ser determinada fácilmente por aquel de habilidad en el arte y pueden ser incorporadas a un vector o a otra molécula de ADN grande, tal como un cromosoma con el fin de expresar un anticuerpo de la invención.

En otra modalidad, un anticuerpo humanizado de la invención puede comprender una región variable de cadena ligera que comprende una CDRl de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 22 con cero a dos sustituciones de aminoácido, una CDR2 de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 23 con cero a dos sustituciones de aminoácidos y una CDR3 de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 24 con cero a dos sustituciones de aminoácido o puede comprender una región variable de cadena pesada que comprende una CDRl de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 25 con cero a dos sustituciones de aminoácido, una CDR2 de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 26 con cero a dos sustituciones de aminoácidos y una CDR3 de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 27 con cero a dos sustituciones de aminoácido. En una modalidad preferida, un anticuerpo humanizado de la invención puede comprender una región variable de cadena ligera que comprende una CDRl de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 22 con cero a dos sustituciones de aminoácidos, una CDR2 de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 23 con cero a dos sustituciones de aminoácidos, una CDR3 de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 24 con cero a dos sustituciones de aminoácidos y una región variable de cadena pesada que comprende una CDRl de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 25 con cero a dos sustituciones de aminoácidos, una CDR2 de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 26 con cero a dos sustituciones de aminoácidos y una CDR3 de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 27 con cero a dos sustituciones de aminoácidos. En una modalidad ejemplar, un anticuerpo humanizado de la invención puede comprender una región variable de cadena ligera que comprende una CDRl de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 22, una CDR2 de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 23, una CDR3 de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 24, una región variable de cadena pesada que comprende una CDRl de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 25, una CDR2 de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 26 y una CDR3 de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 27. La invención también abarca las correspondientes secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NO: 22, 23, 24, 25, 26 y 27, que pueden ser determinadas fácilmente por aquel de habilidad en el arte y pueden ser incorporadas a un vector u otro molécula de ADN grande, tal como un cromosoma, con el fin de expresar un anticuerpo de la invención.

En todavía otra modalidad, un anticuerpo humanizado de la invención puede comprender una región variable de cadena ligera que comprende una CDRl de secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 con cero a dos sustituciones de aminoácidos, una CDR2 de secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 con cero a dos sustituciones de aminoácidos, una CDR3 de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 30 con cero a dos sustituciones de aminoácidos o puede comprender una región variable de cadena pesada que comprende una CDRl de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 31 con cero a dos sustituciones de aminoácidos, una CDR2 de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 32 con cero a dos sustituciones de aminoácidos y una CDR3 de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 33 con cero a dos sustituciones de aminoácidos. En una modalidad preferida, un anticuerpo humanizado de la invención puede comprender una región variable de cadena ligera que comprende una CDRl de secuencia de aminoácidos de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 28 con cero a dos sustituciones de aminoácidos, una CDR2 de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 29 con cero a dos sustituciones de aminoácidos, una CDR3 de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 30 con cero a dos sustituciones de aminoácidos y una región variable de cadena pesada que comprende una CDRl de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 31 con cero a dos sustituciones de aminoácidos, una CDR2 de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 32 con cero a dos sustituciones de aminoácidos y una CDR3 de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 32 con cero a dos sustituciones de aminoácidos. En una modalidad ejemplar, un anticuerpo humanizado de la invención puede comprender una región variable de cadena ligera que comprende una CDRl de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 28, una CDR2 de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 29, una CDR3 de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 30, una región variable de cadena pesada que comprende una CDRl de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 31, una de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 32 y una CDR3 de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 33. La invención también abarca las correspondientes secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NO:34, 35, 36, 37, 38 y 39, que pueden ser determinadas fácilmente por aquel de habilidad en el arte y pueden ser incorporadas a un vector u otra molécula de ADN grande, tal como un cromosoma con el fin de expresar un anticuerpo de la invención.

En todavía otra modalidad, un anticuerpo humanizado de la invención puede comprender una región variable de cadena ligera que comprende una CDRl de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 34 con cero a dos sustituciones de aminoácidos, una CDR2 de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 35 con cero a dos sustituciones de aminoácidos, una CDR3 de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 36 con cero a dos sustituciones de aminoácidos o puede comprender una región variable de cadena pesada que comprende una CDRl de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 37 con cero a dos sustituciones de aminoácidos, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 38 con cero a dos sustituciones de aminoácidos y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 39 con cero a dos sustituciones de aminoácidos. En una modalidad preferida, un anticuerpo humanizado de la invención puede comprender una región variable de cadena ligera que comprende una CDRl que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 34 con cero a dos sustituciones de aminoácidos, a CDR2 de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 35 con cero a dos sustituciones de aminoácidos, una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 36 con cero a dos sustituciones de aminoácidos, una región variable de cadena pesada que comprende una CDRl que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 37 con cero a dos sustituciones de aminoácidos, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 38 con cero a dos sustituciones de aminoácidos y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 39 con cero a dos sustituciones de aminoácidos. En una modalidad ejemplar, un anticuerpo humanizado de la invención puede comprender una región variable de cadena ligera que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 34, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 35, una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 36, una región variable de cadena pesada que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 38 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 39. La invención también abarca las correspondientes secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NO: 34, 35, 36, 37, 38 y 39, que pueden ser determinadas por aquel de habilidad ordinaria en el arte y pueden ser incorporadas a un vector u otra molécula de ADN grande, tal como un cromosoma, con el fin de expresar un anticuerpo de la invención.

En un aspecto, los anticuerpos en una cantidad farmacológicamente efectiva preferida en grado farmacéutico, incluyendo fragmentos farmacológicamente efectiva, son administrados a un sujeto, tal como a un sujeto viviente a ser tratado por síntomas asociados a placa ?ß . La administración es efectuada utilizando técnicas efectivas estándar, incluyendo periféricamente (esto es, no por administración al sistema nervioso central) o localmente al sistema nervioso central. La administración periférica incluye pero no está limitada a administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, pulmonar, transdérmica , intramuscular, intranasal, bucal, sublingual o de supositorio. La administración local, incluyendo directamente al sistema nervioso central (CNS) incluye pero no está limitada a via un catéter lumbar, intraventricular o intraparenquimal o utilizando una formulación de liberación controlada implantada quirúrgicamente.

Composiciones farmacéuticas para administración efectiva son diseñadas deliberadamente para ser apropiadas para el modo de administración seleccionado y excipientes aceptables farmacéuticamente tales como agentes dispersantes compatibles, soluciones reguladoras del pH, surfactantes , conservadores, agentes solubilizantes, agentes de isotonicidad, agentes estabilizantes y los semejantes son usados como sea apropiado. Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton Pa., 16Ed ISBN: 0-912734-04-3, última edición, incorporada en la presente por referencia en su totalidad, provee un compendio de técnicas de formulación como son en general conocidas por los practicantes. Puede ser particularmente útil alterar las características de solubilidad de los anticuerpos útiles en esta revelación, haciéndolos más lipofílicos, por ejemplo al encapsularlos en liposomas o al bloquear grupos polares.

La administración sistémica periférica efectiva mediante inyección intravenosa, intraperitoneal o subcutánea es un método de administración preferido a un sujeto viviente. Los vehículos apropiados para tales inyecciones son directos. Además, sin embargo, la administración puede también ser efectuada a través de las membranas mucosales por medio de aerosoles nasales o supositorios. Formulaciones apropiadas para tales modos de administración son bien conocidas e incluyen comúnmente surfactantes que facilitan la transferencia a través de la membrana. Tales surfactantes son frecuentemente derivados de esteroides o son lípidos catiónicos, tales como cloruro de N--[l-(2,3-dioleoil) propil] -N, ,?-trimetil amonio (DOTMA) o varios compuestos tales como hemisuccinato de colesterol, fosfatidil gliceroles y los semejantes.

La concentración del anticuerpo humanizado en formulaciones a ser administradas en una cantidad efectiva y varia de tan bajo como de alrededor de 0.1% en peso a tanto como alrededor de 15 o alrededor de 20% en peso y será seleccionada principalmente en base a los volúmenes de fluido, viscosidades y así sucesivamente, de acuerdo con el modo de administración particular seleccionado si se desea. Una composición típica para inyección a un sujeto viviente podría estar compuesta para contener 1 mi de pH regulado estéril de solución salina de pH regulado de fosfato y alrededor de 1-1000 mg de cualquiera o una combinación del anticuerpo humanizado de la presente revelación. La formulación podría ser filtrada estéril después de elaborar la formulación o de otra manera hacerse microbiológicamente aceptable. Una composición típica para infusión intravenosa podría tener volúmenes de entre 1-250 mi de fluido, tal como solución de Ringer estéril y 1-100 mg por mi o más de concentración de anticuerpo anti-ApoE. Agentes terapéuticos de la invención pueden ser congelados o liofilizados para almacenamiento y reconstituidos en un portador estéril apropiado antes del uso. La liofilización y reconstitución puede conducir a grados variables de perdida de actividad de anticuerpo (por ejemplo, con globulinas inmunes convencionales, anticuerpos IgM tienden tener mayor pérdida de actividad que los anticuerpos de IgG) . Las dosificaciones administradas son dosificaciones efectivas y pueden tener que ser ajustadas para compensar. El pH de las formulaciones en general calidad grado farmacéutico será seleccionado para equilibrar la estabilidad del anticuerpo (química y física) y confort al sujeto cuando es administrada. En general, un pH de entre 4 y 8 es tolerado. Las dosis variaran de individuo a individuo en base al tamaño, peso y otras características fisiobiológicas del individuo que recibe la administración exitosa .

Como se usa en la presente, el término "cantidad efectiva" significa una cantidad de una sustancia tal como un compuesto que conduce a efectos mensurables y benéficos para el sujeto administrado con la sustancia, esto es, eficacia significativa. La cantidad o dosis efectiva del compuesto administrado de acuerdo con esta revelación será determinada por las circunstancias que rodean el caso, incluyendo el compuesto administrado, la ruta de administración, el estatus de los síntomas que son tratados y sujeto similar y consideraciones de situación de administración de otras consideraciones. En un aspecto, una dosis típica contiene de alrededor de 0.01 mg/kg a alrededor de 100 mg/kg de un anticuerpo anti-ApoE descrito en la presente. Las dosis pueden variar de alrededor de 0.05 mg/kg a alrededor de 50 mg/kg, mas preferiblemente de alrededor de 0.1 mg/kg a alrededor de 25 mg/kg. La frecuencia de dosificación puede ser diaria o una vez, dos veces, tres veces o más por semana o por mes como sea necesario para tratar efectivamente los síntomas.

La sincronización de administración del tratamiento en relación con la enfermedad de la misma y duración del tratamiento serán determinados por las circunstancias que rodean el caso. El tratamiento podría comenzar inmediatamente, tal como en el sitio de la lesión como es administrada por personal médico de emergencia. El tratamiento podría comenzar en un hospital o clínica misma o a un tiempo más tarde después de la descarga del hospital o después de ser observado en un clínico de sujeto externo. La duración del tratamiento podría variar de una sola dosis administrada en una base de una vez a un curso de toda la vida de tratamientos terapéuticos.

Aunque los métodos anteriores parecen ser los más convenientes y más apropiados y efectivos para administración de proteínas tales como anticuerpos humanizados, mediante adaptación apropiada, otras técnicas efectivas para administración, tal como administración intraventricular, administración transdérmica y administración oral pueden ser empleadas a condición que dé se utilice la formulación apropiada en las mismas.

Además, puede ser deseable emplear formulaciones de liberación controlada utilizando películas y matrices biodegradables o mini bombas osmóticas o sistemas de administración basados en leche de dextrana, arginato o colágeno.

Los niveles de dosificación típicos pueden ser determinados y optimizados utilizando técnicas clínicas estándar y serán dependientes del modo de administración.

Los siguientes ejemplos son incluidos para demostrar modalidades preferidas de la invención. Se debe apreciar por aquellos de habilidad en el arte que las técnicas reveladas en los ejemplos que siguen representan técnicas descubierta por los inventores que funcionan bien en la práctica de la invención. Aquellos de habilidad en el arte deben, sin embargo, a la luz de la presente revelación, apreciar que muchos cambios se pueden hacer en las modalidades especificas que son reveladas y todavía obtener un resultado semejante o similar sin desviarse del espíritu y alcance de la invención, por consiguiente, toda la materia resumida o mostrada en los ejemplos adjuntos y figuras será interpretada como ilustrativa y no en un sentido limitante.

EJEMPLOS : Los siguientes ejemplos ilustran varias iteraciones de la invención.

Anticuerpos específicos para la proteína ApoE fueron generados utilizando técnicas de hibridoma, como se describe posteriormente en la presente en los ejemplos 1 y 2. Específicamente, cuatro hibridomas fueron generados y los anticuerpos ApoE fueron obtenidos de los hibridomas. Los hibridomas HJ6.1, HJ6.2, HJ6.3, and HJ6.4 han sido asignados a las designaciones de depósito de patente ATCC PTA-11805, PTA-11806, PTA-11807, and PTA-11808 respectivamente.

Ejemplo 1: Preparación de hibridomas En primer lugar, 100 µ? del péptido de antígeno (ApoE, 1 mg/ml) en solución salina fueron mezclados con un volumen igual de adyuvante completo de Freund, emulsificado e inoculado a la espalda de un ratón (Balb/c, 6 semanas de edad) . Después de 2 semanas, el ratón fue re-inmunizado con una mezcla de 50 µ? de la solución salina de péptido de antigeno (ApoE, 1 mg/ml) y adyuvante incompleto de Freund, emulsificado mediante tratamiento ultrasónico y después de esto, se llevaron a cabo inmunizaciones adicionales cada semana. En los 40 dias después de la inmunización, el vaso fue removido, los linfocitos fueron cosechados en medio PR 1640 (complementado con penicilina y estreptomicina) y tratados con cloruro de amonio 17 M para remover los glóbulos rojos sanguíneos. Los linfocitos aislados fueron fusionados con células de mieloma cepa P3U1 derivados de un tumor de medula ósea de ratón mediante el método de polietilenglicol (PEG4000) para obtener células de hibridoma. Las células de hibridoma así obtenidas fueron suspendidos en medio HAT con células alimentadoras y luego distribuidas a placas de 96 cavidades y cultivadas por 15 días.

Ejemplo 2 : Selección del anticuerpo monoclonal Los sobrenadantes del medio de cultivo fueron recuperados de las cavidades en las cuales las células de hibridoma obtenidas del ejemplo 1 fueron cultivadas y anticuerpos monoclonales que reaccionan con el péptido de antígeno mediante el método de análisis inmunoabsorbente enzima-enlazado (ELISA) fueron seleccionados.

En primer lugar, 100 µ? de 10 yg/ml de péptido de antígeno fueron agregados a cada cavidad de placa de 96 cavidades, inmovilizados a la fase solida después de mantenerlos a 4°C de la noche a la mañana y bloqueados con 200 µ? de suero de becerro al 10% a 37 °C de la noche a la mañana. Luego , 100 µ? del sobrenadante del medio de cultivo de las células de hibridoma fueron agregados a cada cavidad, se hicieron reaccionar a 37 °C por 2 horas y luego el anticuerpo anti-ratón peroxidasa de rábano (HRP) -conjugado que fue diluido 1000 veces, fue agregado 7 se hizo reaccionar a 37 °C por una hora. El color fue revelado utilizando sustrato de peroxidasa de micro cavidad de tetrametilbencidina (T B) como sustrato.

, Después de terminar la reacción al agregar 100 µ? de ácido sulfúrico 4 N, la absorbancia a 450 a 540 nm fue medida y los anticuerpos monoclonales, que mostraron la absorbancia de alrededor de 3 fueron seleccionados y clonados mediante el método de dilución limitante.

Ratones (Balb/c) fueron inyectados con 0.5 mi de prístina intraperitonealmente 7 días y 3 días antes, fueron inoculados intraperitonealmente con células de hibridoma que producen el anticuerpo monoclonal seleccionados y los ascites fueron recolectados alrededor de 10 días más tarde. Los ascites recolectados fueron mantenidos a temperatura ambiente por 30 minutos, a 4°C de la noche a la mañana y centrifugados a 15000 por rpm por 10 minutos y luego el sobrenadante fue recuperado.

Los títulos de los anticuerpos monoclonales seleccionados fueron medidos mediante el método de ELISA. El ApoE fue inmovilizado sobre una placa de micro cavidad, los anticuerpos monoclonales fueron agregados y después de la reacción, el color fue revelado utilizando el anticuerpo anti-ratón peroxidasa de rábano (HRP) -conjugado y T B. Los resultados indican que los anticuerpos monoclonales seleccionados reaccionaron de manera dependiente de la concentración .

Ejemplo 3: Los anticuerpos anti-ApoE provocan reducción en la carga de placa Ratones PS/APP, que exhiben formación de placa amiloide relacionada con la edad similar a aquella observada en sujetos con enfermedad de Alzheimer, son usados como modelo de ratón para la enfermedad de Alzheimer. Los ratones PS/APP fueron tratados intraperitonealmente una vez a la semana con 10 mg/kg ya sea con un anticuerpo ?ß (HJ3.4) o uno de dos anticuerpos anti-ApoE (HJ6.2 o HJ6.3). Otro grupo fue tratado con PBS como testigo. El tratamiento fue de 3-7 meses de edad. Hubo un fuerte efecto de los anticuerpos anti-ApoE asociados con una disminución en carga de placa ?ß como se demuestra tanto en el hipocampo (figura 1) como en la corteza (figura 2) .

Ejemplo 4: Enlace de anticuerpos anti-ApoE a ApoE humano Un análisis de emparedado de ELISA fue usado para medir el enlace de los anticuerpos HJ6.1, HJ6.2, HJ6.3 y HJ6.4 de anti-ApoE a anti-ApoE humano. El anticuerpo monoclonal WUEA4 que se enlaza a ApoE humano fue recubierto primero sobre una placa de ELISA. Luego, concentraciones diferentes de ApoE4 humano fueron aplicadas. Los anticuerpos anti-ApoE biotinilados HJ6.1, HJ6.2, HJ6.3 y HJ6. fueron aplicados por último y la densidad óptica (OD) fue leida de un lector de placas (figura 3) .

Estos resultados muestran que los anticuerpos anti-ApoE HJ6.1, HJ6.2 y HJ6.3 se enlazan a ApoE humano en un formato de ELISA con potencia decreciente. Sin embargo, el anticuerpo anti-ApoE HJ6.4 no se enlaza a ApoE humano en este análisis.

Ejemplo 5: Los anticuerpos anti-ApoE se enlazan a ApoE humano en el plasma pero no afectan el colesterol en el plasma Para estos experimentos ratones de nocaut de ApoE4 humanos fueron usados para medir los complejos de ApoE/anticuerpo en el plasma. Los ratones de nocaut ApoE4 recibieron 500 mg de mAb HJ6 biotinilado intraperitonealmente . Veinticuatro horas más tarde, el plasma fue diluido (1:1000) y cargado a una placa de ELISA recubierta con 5 g/ml WUE4 que se enlaza a ApoE humano. El complejo de ApoE/anticuerpo fue detectado por una dilución 1:5000 de HRP40. La densidad óptica (OD) fue leída sobre un lector de placas. Estos resultados muestran que los anticuerpos HJ6.1, HJ6.2 y HJ6.3 se enlazan a ApoE humano en plasma, mientras que HJ6.4 no se enlaza a ApoE humano en plasma. Ninguna señal fue obtenida cuando este experimento fue efectuado en ratones ApoE-/-.

El colesterol en el plasma total fue también medido en los mismos ratones ApoE4+/+ que recibieron inyecciones intraperitoneales de 500 mg de anticuerpos monoclonales de la serie HJ6, HJ6.1, HJ6.2, HJ6.3, y HJ6.4. El colesterol en el plasma no cambio en relación con los animales que recibieron solución salina de pH reguladora de fosfato (figura 4B) .

Ejemplo 6: Los anticuerpos de la serie HJ6 a ApoE humano encontrados en el sistema nervioso central (CNS) después de la administración periférica El fluido cerebroespinal (CSF) de ratones ApoE4+/+ o ApoE4-/- que recibieron mAb de la serie HJ6 o PBS (véase figura 4) fue diluido (1:23) y el complejo de ApoE4 /anticuerpo biotinilado en el CFS fue capturado mediante WUE4 y luego detectado mediante HRP40. Los resultados demuestran que el CSF hay complejos de ApoE4 con los anticuerpos ApoE HJ6.1B, HJ6.2B o HJ6.3B (figura 5), sugiriendo que una fracción de los mAb de ApoE fueron aptos de entrar al compartimiento de CNS y enlazarse a ApoE. La OD650 siguió el orden de HJ6.1B>HJ6.2B=HJ6.3B>»HJ6.4B, que es consistente con el patrón observado por la habilidad de estos anticuerpos para enlazarse a ApoE sobre una placa de ELISA (figura 3) en el plasma (figura 4).

Ejemplo 7: Activación microglial en ratones administrados con anticuerpos de la serie HJ6 10 mg/kg de anticuerpos DE HJ6.2, HJ6.3 y HJ3.4 diluidos en PBS PSAPP o el mismo volumen de PBS fue inyectado a ratones PSAPP intraperitonealmente en el punto en el tiempo 0, día 3, día 6 y día 9. En el día 10, los cerebros fueron removidos más fijados y teñidos con anticuerpo CD45 que marca microglía activados. Hubo un incremento en la cantidad de corteza cubierta por microglía activados en los ratones inyectados con HJ6.3 y HJ6.4. Los ratones PSAPP en este experimento expresan ApoE de ratón. Estos resultados muestran que la administración a corto plazo de HJ6.3 (anticuerpo anti-ApoE) y HJ3.4 (anticuerpo anti-?ß) a ratones PSAPP de 6 meses de edad que ya tienen placas amiloides de más de 10 días, da como resultado activación microglial, mientras que un anticuerpo ApoE (HJ6.2) parece no tener este efecto (figura 6) .

Claims (19)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo aislado, caracterizado porque el anticuerpo se enlaza específicamente a ApoE y es derivado de un hibridoma seleccionado del grupo que consiste de HJ6.1 (designación de depósito de patente ATCC PT-11805), HJ6.2 (designación de depósito de patente PT-11806) , HJ6.3 (designación de depósito de patente PT-11807) y HJ6.4 (designación de depósito de patente PT-11808).

2. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 16.

3. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID N0:1, SEQ ID N0:3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID N0:13 y SEQ ID N0:15.

4. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo es seleccionado del grupo que consiste de un anticuerpo de una sola cadena, un fragmento de anticuerpo, un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado.

5. Un anticuerpo aislado, caracterizado porque el anticuerpo se enlaza específicamente a ApoE y comprende una CDR3 de cadena pesada que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 con cero a dos sustituciones de aminoácidos .

6. Un anticuerpo aislado, caracterizado porque el anticuerpo se enlaza específicamente a ApoE y comprende una CDR3 de cadena pesada que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 con cero a dos sustituciones de aminoácidos.

7. Un anticuerpo aislado, caracterizado porque el anticuerpo se enlaza específicamente a ApoE y comprende una CDR3 de cadena pesada que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 con cero a dos sustituciones de aminoácidos .

8. Un método para el tratamiento de por lo menos un síntoma o signo de síntomas asociadas a placa ?ß en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar una cantidad efectiva de por lo menos un anticuerpo anti-ApoE a aquel sujeto.

9. El método de la reivindicación 8, caracterizado porque el tratamiento incluye prevenir, atenuar, invertir o mejorar por lo menos un síntoma o signo de síntomas asociados a placa ?ß en un sujeto.

10. El método de la reivindicación 8, caracterizado porque el síntoma o signos asociados a placa ?ß incluye función cognitiva deteriorada, comportamiento alterado, función del lenguaje anormal, desregulación emocional, ataques, estructura o función del sistema nervioso deteriorado y un riesgo incrementado de desarrollo de enfermedad de Alzheimer o angiopatia amiloide cerebral.

11. El método de la reivindicación 8, caracterizado porque anticuerpo anti-ApoE se enlaza a un epitope dentro de la secuencia de codificación de ApoE.

12. El método de la reivindicación 8, caracterizado porque la administración comprende una ruta de administración sistémica efectiva.

13. El método de la reivindicación 8, caracterizado porque la administración comprende una ruta de administración local efectiva incluyendo directamente dentro del sistema nervioso central.

14. Un método para disminuir la carga de placa amiloide en el cerebro de un sujeto, el método está caracterizado porque comprende administrar una cantidad efectiva de por lo menos un anticuerpo anti-ApoE a aquel sujeto.

15. El método de la reivindicación 14, caracterizado porque el anticuerpo anti-ApoE se enlaza a un epitope dentro de la secuencia de codificación de ApoE.

16. El método de la reivindicación 14, caracterizado porque la administración comprende una ruta de administración sistémica efectiva.

17. El método de la reivindicación 14, caracterizado porque la administración comprende una ruta de administración local efectiva incluye directamente dentro del sistema nervioso central.

18. El método de la reivindicación 14, caracterizado porque las cargas de placa amiloide son disminuidas en el hipocampo

19. El método de la reivindicación 14, caracterizado porque las placas de placa amiloide son disminuidas en la corteza .