KR100701580B1

KR100701580B1 - 항-아밀로이드 항체를 이용한 아밀로이드 제거 방법들

Info

Publication number: KR100701580B1
Application number: KR1020007013040A
Authority: KR
Inventors: 솔로몬아란; 하른시씨루디; 월조나단에스.
Original assignee: 유니버시티 오브 테네시 리서치 파운데이션
Priority date: 1998-05-21
Filing date: 1999-05-21
Publication date: 2007-03-30
Also published as: KR20010052374A; DK1078005T3; CA2325600A1; EP1078005B1; HK1035542A1; WO1999060024A1; ES2345746T3; CN1589903A; WO1999060024A9; RU2004107695A; DE69942274D1; ZA200007811B; MXPA00011348A; AU4007599A; EP1078005A1; JP2010159284A; JP2002515235A; IL139095A0; NZ507727A; CN1344275A

Abstract

아밀로이드 원섬유의 침전에 대한 환자의 세포성 매개 면역 응답을 증강시키는 방법 및 관련 면역글로블린 펩티드와 그의 단편들이 개시되어 있다. 상기 방법들은 아밀로이드 물질 또는 그의 구성 부분들에 대한 항체의 옵손화 효과를 이용한다.

아밀로이드

Description

항-아밀로이드 항체를 이용한 아밀로이드 제거 방법들{METHODS FOR AMYLOID REMOVAL USING ANTI-AMYLOID ANTIBODIES}

본 발명은 미국 국립 보건원(NIH)으로부터 허여번호 2R01CA20056의 정부 지원하에 의해 만들어졌다. 따라서, 미국 정부는 본 발명의 일정 권리를 소유할 수 있다.

본 발명은 전반적으로 아밀로이드-관련 질병들을 치유하기 위한 방법과 연관된다. 특히, 본 발명은 환자의 자체 면역식세포 체계에 의해 아밀로이드 원섬유를 제거하는 항체-관련 치료방법을 제공한다.

아밀로이드증은 콩고레드 친화성(congophilic), 녹색 복굴절 원섬유, 콩고레드(congo red)로 염색되면 분산되거나 편재된 아밀로이드종(amyloidomas) 형태의 단백질의 병적인 침전물을 의미한다. 이러한 침전은 여러 가지 질병의 징후를 나타내는데, 예를 들면 알쯔하이머병(Alzheimer's Disease), 염증-관련 아밀로이드, 타입 Ⅱ 당뇨병, 소해면형 뇌장애(bovine spongiform encephalopathy: BSE), 크로이펠트 야콥병(Creutzfeld-Jakob disease: CJD), 스크라피(scrapie) 및 제 1 아밀로이드증이 있다.

아밀로이드증은 일반적으로 주요 전신성 아밀로이드증, 주요 국소 아밀로이드증 및 기타 아밀로이드증의 세 그룹으로 분류된다. 주요 전신성 아밀로이드증은 만성 염증 질환(즉, 결핵, 골수염 등); 유년기 류마티스성 관절염, 강직성 척추염 및 크론병(Crohn's disease) 등과 같은 비전염성 질환들; 그리고 가족성 지중해 열병, 혈청 세포 이혼화증(제 1 아밀로이드증) 및 다양한 가족성 다발성 신경장애들과 심근증을 포함한다. 주요 국소 아밀로이드증은 일반적으로 8세 이상에서의 만성적인 투석과, 중년 이후의 비외상성 뇌출혈, 알쯔하이머병, 다운증후군(Down syndrome) 및 유전성 뇌출혈(네덜란드)을 포함한다.

기타 아밀로이드증은 가족성 다발성 신경장애들(아이오와), 가족성 아밀로이드증(핀란드), 유전성 뇌출혈(아일랜드), 크로이펠트 야콥병, 갑상선 골수암, 심방 아밀로이드 및 당뇨병(인슐린종)을 포함한다. 다른 아밀로이드증들은 세실의 의학 교재(Cecil's Textbook of Medicine) 1504-6 (W.B. Saunders & Co., Philadelphia, PA;1996)에 있는 루이스(Louis W. Heck)의 "아밀로이드병"(The Amyloid Diseases)에 인용된 것들을 포함한다. 크로이펠트야콥병(CJD)과 거츠만-스트라슬러-스케인커병(Gerstmann-Strassler-Scheinker: GSS)을 야기시키는 전염성 해면형 뇌장애는 필드 비롤로지(FIELDS VIROLOGY)(1996)2845-49 (제3판;라빈출판사 (RavenPublishers), 필라델피아, PA;1996)안에 있는 B. 체세브로등(B. Chesebro etal.)의 "전염성해면형뇌장애: 간략한 입문서"(Transmissible Spongiform Encepphalopathies: A Brief Introduction)와 필드 비롤로지(1996) 2851-2900 안의 가듀섹(D.C.Gajdusek)의 "전염성 아밀로이드: 전염성 대뇌 아밀로이드로서의 아급성 해면형 뇌장애"(Infectious amyloids: Subacute Spongiform Encepphalopathies as Transmissible Cerebral Amyloidoses)에 기술되어 있다. 상기한 여러 질병들은 대개 전염성 단백질인 프리온(prions)에 의해 매개되어지는 듯하다. 필드 비롤로지 2901-50(1996) 안에 있는 S.B.프루시너(S.B.Prusiner)의 "프리온" 및 그 안에 포함된 참고문헌들 참조. 아밀로이드증의 유전형들은 온라인 멘델리안 인헤리턴스 인 맨(OnlineMendelianInheritanceinMan: OMIM) "www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Omim/dispmim?" 에 기재되어 있다. 앞서 상술된 각각은 참고로 본 명세서에 포함된다.

임상학적으로 증명된 아밀로이드증을 갖는 환자들이 자발적으로 완전히 회복되는 것은 매우 드물며, 이는 아마도 아밀로이드 원섬유 자체가 면역성이 없기 때문일 것이다. 대량(high-dose) 화학요법, 스테로이드, 요오드화된 독소루비신 및 줄기 세포(stem cell) 대체 치료와 같은 아밀로이드증에 관한 다양한 치료법이 연구되고 있다. 그러나, 아밀로이드증의 한 형태인 가족성 지중해 아밀로이드증만이 약물치료(콜히친)에 효과를 나타내었다.

다르게는 인식되지 않을 물체의 면역학적 제거를 야기시키거나 조정하는 모노클로날 항체(monoclonal antibodies: mAbs)가 알려져 있다. mAbs는, 예를 들면, 비-호지킨 림프종(non-Hodgkins lymphoma) 및 유방암을 치료하는 데에 성공적으로 사용된다.

종래 아밀로이드 단백질이나 아밀로이드 원섬유와 결합하는 항체에 대한 다양한 연구가 이루어져 왔다. 예로, 미국 특허 번호. 제 5,714,471호; 제5,693,478호 제 5,688,651호; 제 5,652,092호 ; 제 5,593,846호 ; 제 5,536,640호 ;제 5,385,915호 ; 제 5,348,963호 ; 제 5,270,165호 ; 제 5,262,332호 ; 제 5,262,303호 ; 제 5,164,295호 및 제 4,782,014호 참조. 또한, 몇몇 간행물에서는 항-아밀로이드 항체가 β-아밀로이드증의 진행의 연구와 다양한 치료적 선택에 유용할 것이라고 제안하였다. 예로, 베로티 등(Bellotti et al.)의 Scand. J. Immunol.(1992) 36(4):607 ~ 625; 베로티 등(Bellotti et al.)의 Ren.Fail.(1993) 15(3):365-371;워커 등(Walker et al.)의 J. Neuropathol.Exp.Neurol.(1994) 53(4):377-383과 및 빅켈 등(Bickel et al.)의 Bioconjug. Chem.(1994) 5(2):119-125 참조. 그러나, 어떠한 치료학적 항체도 환자의 아밀로이드 원섬유 침전을 멈추거나 역행시키는 것이 증명되지 않았다. 그러므로, 아밀로이드 원섬유에 결합된 항체를 함유하는 항체 제제제를 사용하는, 아밀로이드증의 치료방법에 대한 요구가 존재하는 것이다.

본 발명자는 아밀로이드-관련 질병들과 상태들을 치료하는 새로운 방법들을 알아내었다. 상기 방법들은 아밀로이드의 단백질 성분들에 대한 옵손화 효과(opsonizing effect)를 이용하는 것이다.

삭제

본 발명은 치료학적으로 유효한 양의 적어도 하나의 면역글로블린 폴리펩티드 또는 그의 단편들을 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 환자에게 복용시키는 단계를 포함한다. 이때, 면역글로블린 폴리펩티드 또는 그것의 단편은 인간 아밀로이드 원섬유에 결합하는 실질적으로 정제된 면역글로블린 폴리펩티드일 수 있으며, 상기 폴리펩티드의 결합은 아밀로이드 원섬유를 옵손화시킨다.

특히, 본 발명은 후술하는 세 가지 mAbs들의 어느 하나 혹은 이들의 조합의 용도에 관한 것이다. 상기 항체들은 일반적인 항-아밀로이드 결합 성질을 가지며, 환자 자신의 세포 면역성 제거 메카니즘을 활성화시키는 외부 옵손화 시약을 제공한다.

도 1a와 도 1b. 도 1a와 도 1b는 아밀로이드를 주사한 직후(도 1a)와 주사후 14일이 지난후(도 1b)의 Balb/c 30 쥐의 재생 사진이다. 주사 부위는 면도되어 아밀로이드 물질의 주사로 야기된 "혹"(hump)이 더 잘 보여진다.

도 2a-2b. 도 2a와 도 2b는 시험관에서 옵손화된 인간 아밀로이드에 부착된 인간 호중구(다엽성 핵)의 재생 사진이다.

도 3a-3d. 도 3a-3d는 면역 조직 화학적으로 염색된 아밀로이드를 적재한 조직 샘플(20배 확대)의 재생 사진이다. 도 3a는 콩고 레드(Congo red)로 염색된, κⅠ 아밀로이드증을 가진 환자로부터의 조직 샘플이다; 편광하에 관찰된 아밀로이드 침전이 청록색 입자로 보인다. 도 3b는 항-κⅠ(57-18-H12) mAb로 표지된 후에 알칼리성 인산 가수분해 효소로 염색된 조직 샘플이다. 도 3c는 도 3b에서와 같이 염색되었으나 항-κⅣ(11-1F4) mAb로 표지된 조직샘플이다. 도 3d는 도 3b에서와 같이 염색되었으나 항-λⅧ(31-8c7)에서 mAb로 표지된 조직샘플이다.

도 4. 도 4는 Balb/c 쥐에 이식된 인간 아밀로이드에 결합된 형광표시된(FITC) κ4 mAb를 나타내는 재생 사진이다. 상기 mAb는 쥐의 대퇴부에 주사되었다. 아밀로이드종은 주사 72시간 후에 절개되었고 외형광 현미경(20배 확대)을 사용하여 관찰되었다.

일반적 기술

본 발명은 숙주 또는 환자내에서 바람직하지 않은 아밀로이드 원섬유의 침전을 저하시키거나 제거하는 것을 향상 또는 조절하기 위하여 면역글로블린 폴리펩티드를 이용한다. 본 발명은, 예를 들면, 바람직하지 않은 아밀로이드 원섬유 침전에 의해 특징화되는 상태 또는 질병을 겪고 있는 인간을 치료하는데 이용될 것으로 생각된다.

어떤 특별한 작용 메카니즘에 구애됨이 없이 본 발명에 따른 면역글로블린 펩티드의 투여는 아밀로이드증을 겪고 있는 환자의 침전된 아밀로이드 원섬유를 옵손화하여, 환자 자신의 면역 시스템이 환자의 침전된 아밀로이드 원섬유를 제거하도록 돕는다고 생각된다. 환자의 면역 시스템 단독으로는 이러한 치료적인 중재 없이 아밀로이드 원섬유에 의해 조절되는 상태에서 아밀로이드 원섬유를 제거할 수 없는 데, 이는 아마도 아밀로이드 원섬유 자체가 상대적으로 면역성이 없기 때문일 것이다.

아밀로이드증 환자의 치료를 위해, 본 발명에 따른 치료학적 유효량의 면역글로블린 폴리펩티드나 그의 단편을 약학적으로 적합한 담체나 부형제와 함께 투여한다. 바람직하지 않은 아밀로이드 원섬유의 침전에 이러한 면역글로블린 폴리펩티드가 결합하거나 부착되면, 아밀로이드 원섬유 침전은 옵손화된다고 생각된다.

본 발명의 조성물들의 일회 또는 복수회의 투여는 다른 치료적 항체 제품들의 투약에 대한 당업자에게 알려진 투여 방법이나 투여량에 의해 수행되어질 수 있다. 상기 변수들은 특정 환자를 치료하는 의사에 의해 선택 및/또는 최적화 되어질 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 약학적 제제의 치료적으로 유효한 투여량이 바람직하지 않은 아밀로이드 원섬유 침전을 실질적으로 억제하거나, 아밀로이드 원섬유의 바람직하지 않은 침전율을 실질적으로 억제하기에 충분한 양을 운반해야 한다. 보다 바람직하게는, 상기 제제가 환자내의 침전된 아밀로이드 원섬유의 총 적재량을 경감시켜야 한다. 나아가, 상기 제제의 투여는 아밀로이드증 진단 후 빨리 시작하여 증상이 실질적으로 완화될 때까지 계속되며, 그 후 일정기간 계속되어야 한다. 질병이 상당히 진행된 경우, 부하용량 후 유지용량이 필요할 수 있다.

정의

본 명세서에서 "펩티드", "폴리펩티드"나 "단백질"과 같은 용어는 상호 교체 가능하게 사용된다. 폴리펩티드를 언급할 때, "실질적인 동일성"이란 대상 폴리펩티드 또는 단백질이 천연으로 존재하는 단백질 또는 이의 부분과 약 30% 동일하며, 일반적으로는 적어도 약 70% 동일하며, 바람직하게는 적어도 약 95% 동일하다.

본 명세서에서 사용된, "분리된", "실질적으로 순수한" 그리고 "실질적으로 균질한"이란 용어는 상호 교체 가능하게 쓰이고, 자연적으로 단백질을 동반하는 요소들로부터 분리되어진 단백질을 의미한다. 실질적으로 정제된 단백질은 보통은 약 85% 내지 90% 이상, 보다 일반적으로는 약 95%, 및 바람직하게는 약 99% 이상의 순도의 단백질 샘플을 포함할 것이다. 단백질의 순도나 균일성은 당업계에 널리 알려진 많은 방법들에 의해 나타내어질 수 있는 바, 예를 들어 단백질 샘플의 폴리아크릴아미드겔 전기영동 후, 염색 후에 폴리아크릴아미드겔 상의 단일 폴리펩티드 띠를 나타내는 방법이 있다. 어떤 목적에 대해서는 고분해능이 요구되며, HPLC 또는 유사한 정제 방법들이 사용될 것이다.

단백질은 황산 암모늄 같은 물질에 의한 선택적 침전, 칼럼 크로마토그래피, 면역 정제 방법 및 기타 방법들을 포함하는 당업계에 잘 알려진 표준 기술에 의해서 실질적으로 균일하게 정제될 수 있다. 그 예로, 스코프, 단백질 정제; 이론과 실제, 스프린저-버래그: 뉴욕(Scope, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag: New York)(1982)이 있으며, 이는 본 명세서에 참고로 삽입된다.

항체 정제 기술은 당업계에 잘 알려져 있다. 할로우 등(Harlow et al.), 항체: 실험실 매뉴얼, 콜드 스프링 하버 실험실 출판, 콜드 스프링 하버(1988), 288-318이 있으며, 이는 본 명세서에 참고로 삽입된다. 상기 문헌에는 예를 들어, 황산 암모늄 침전, 카프릴산, DEAE, 수산화인회석 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 단백질 A 비드 및 면역 친화성을 서술하였다.

본 명세서에서 사용된 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다. 핵산을 언급할 때, "실질적 동일성" 이란 용어는 두 핵산의 서열 또는 이들의 지정된 부분들이 적절히 배열되어 비교되어졌을 때 서로 동일하고, 적어도 약 80%의 뉴클레오티드, 주로 적어도 약 90% 내지 95%의 뉴클레오티드 및 보다 바람직하게는 적어도 약 98% 내지 99.5%의 뉴클레오티드가 적합한 뉴클레오티드 삽입 또는 결실을 갖는다는 것을 나타낸다.

또는, 실질적인 핵산 서열 동일성은 핵산 단편이 선택적 혼성화 조건하에 다른 핵산가닥의 보체와 혼성화될 때 존재한다. "실질적 상보성"은 마찬가지로 하나의 핵산이 다른 핵산에 선택적으로 혼성화 되거나, 동일한 것을 의미한다. 보통 선택적 혼성화는 적어도 14-25개 뉴클레오티드 범위 이상에서 적어도 약 55% 동일성이 존재할 때, 바람직하게는 적어도 65% 동일성이 존재할 때, 보다 바람직하게는 적어도 약 75%, 그리고 가장 바람직하게는 적어도 약 90% 동일할 때 일어난다. 본 명세서에 삽입되는, 엠. 가네히사(M. Kanehisa)의 핵산 연구(Nucleic Acids Res.) 12:203(1984) 참조.

엄격한 혼성화 조건은 일반적으로 약 1M 미만의 염농도를 포함하며, 보다 일반적으로는 약 500 mM 미만, 바람직하게는 약 200 mM 미만의 염농도를 포함한 것이다. 온도 조건은 일반적으로 22℃ 보다 높게 보다 일반적으로는 약 30℃ 보다 높게, 바람직하게 약 37℃를 초과하게 한다. 다른 인자들이 염기 조성물과 상보성 가닥들의 크기, 유기용매의 존재 및 염기 불일치의 정도를 포함하는 혼성화의 엄밀도(stringency)에 극적인 영향을 미칠 수 있는 것처럼, 매개변수의 조합은 어느 한 가지만의 절대 치수보다 중요하다.

핵산을 언급할 때, "분리된" 또는 "실질적으로 순수한"이란 당업계에 공지된 알칼라인/SDS 처리, 염화 세슘 띠 분리, 칼럼 크로마토그래피 등을 포함하는 표준 기술들에 의해 다른 세포 핵산 또는 단백질과 같은 다른 세포 구성성분 또는 다른 오염물로부터 정제되어진 것을 의미한다. 본 명세서에 참조로 삽입되는 그린 출판사와 윌리-인터사이언스, 뉴욕(1987)의 F. 아우슈벨 등(F. Ausubel), 분자 생물학의 현재 프로토콜(Current Protocols in Molecular Biology) 참조.

핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계를 가지고 위치되었을 때 "기능적으로 연결"된다. 예를 들어, 프로모터와 인핸서가 서열의 전사에 영향을 준다면 이들은 코딩 서열에 기능적으로 연결된 것이다. 일반적으로, 기능적으로 연결된다는 것의 의미는 연결된 핵산 서열들이 인접해 있고, 두 개의 단백질 코딩 영역의 결합이 필요한 경우, 인접해 있고 해독 프레임 내에 있음을 의미한다.

폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 발현벡터에 서브클로닝하는 것과 같은 핵산 조작, 탐침의 라벨링, DNA 혼성화 등의 기술은 일반적으로 샘 브룩 등(1989) 분자 클로닝: 실험실 매뉴얼(2nd ed.) Vol. 1~3, 콜드 스프링 하버 실험실(Sambrook et al.,(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2nd ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Habor Laboratory), 또는 위에서 인용한 아우슈벨(Ausubel et al.) 등 ed.(1987)에 기술되어 있으며, 상기 두 문헌도 모두 본 명세서에 참고로 삽입된다.

"발현 벡터", "클로닝 벡터" 또는 "벡터"는 많은 경우 선택된 숙주 세포에서 복제 가능한 플라스미드 또는 다른 핵산 분자들이다. 발현 벡터는 자율적으로 복제할 수 있거나 또는 당업계에 잘 알려진 기술에 의해 숙주 세포의 유전체(genome) 안으로 삽입됨으로써 복제할 수 있다. 자율적으로 복제하는 벡터는 복제 시작점(an origin of replication)을 가지거나 선택된 숙주 세포내에서 기능을 가지는 자율 복제 서열(autonomous replicating sequence, "ARS")을 갖는다. 주로 벡터는 예를 들어 클로닝과 구축(construction)을 위한 E. Coli, 발현을 위한 포유동물세포와 같은 하나 이상의 숙주 세포에서 사용 가능한 것이 바람직하다.

포유 동물의 세포주는 진핵생물로부터 유래하는 폴리펩티드의 발현을 위한 숙주 세포로 자주 이용된다. 배양시 포유동물 세포의 증식은 자체가 공지되어 있다. 본 명세서에 참고로 삽입되는 조직 배양(Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Patterson, ed.)(1973)을 참조. 또한 숙주 세포주는 특히 박테리아(즉, 대장균 또는 바실러스 서브틸리스), 효모, 사상균, 식물 세포 또는 곤충 세포와 같은 유기체를 포함할 수 있다.

"형질전환"은 공지된 방법에 의해 대상 핵산을 포함하는 벡터를 숙주 세포 안으로 직접 도입하는 것을 의미한다. 형질전환 방법은 숙주 세포 형태에 따라 다양하며, 일렉트로포레이션(electroporation); 염화 칼슘(calcium chloride), 염화 루비듐 인산 칼슘(rubidium chloride calcium phosphate), DEAE-덱스트란 또는 다른 물질들을 사용하는 트랜스펙션(transfection); 마이크로 발사체 충격; 리포펙션(lipofection);전염(벡터가 전염성인 경우); 및 다른 방법들을 포함한다. 일반적인 것은 앞서 인용한 샘부룩 등(Sambrook et al.)(1989)에 저술되어 있다. 앞서 상술한 핵산이 도입되는 세포는 상기 세포의 자손 역시 포함하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 "면역글로블린 폴리펩티드"는 특정 대상, 예를 들어 아밀로이드 원섬유에 대해 특이한 면역 반응 활성을 갖는 천연 면역글로블린(예를 들어, 항체)으로부터 유래되는 분자를 의미한다. 항체는 전형적으로 면역글로블린 폴리펩티드의 사합체(tetramer)이다. 본 명세서에서 사용된 "항체"란 용어는 또한 면역글로블린 유전자에 의해 실질적으로 암호화된 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드로 구성된 단백질을 의미한다. 면역글로블린 유전자는 카파(kappa) 또는 람다(lambda) 형태일 수 있는 경쇄(light chain)를 코딩하는 것 및 중쇄(heavy chain)를 코딩하는 것을 포함한다. 중쇄형에는 알파, 감마, 델타, 입실론 및 뮤가 있다. 면역글루블린 경쇄 및 중쇄의 카르복시 말단 부분은 불변영역(constant region)인데 비하여, 아미노 말단 부분은 무수한 면역글로블린 가변영역(variable region) 유전자에 의해 암호화된다. 면역글루블린의 가변 영역은 항원 인식 특이성을 제공하는 영역이다. 특히, 상기 특이성은 면역글로블린의 과가변성 영역으로도 알려져 있는, 상보성 결정 영역(complementarity determining resions, CDRs)에 존재한다.

면역글로블린은 단일 사슬들 뿐만 아니라, 예를 들어 Fv, Fab, F(ab''), F(ab')₂, SvFv와 다른 단편들을 포함하는 다양한 단편 형태들로 존재할 수 있다.(본 명세서에 참고로 삽입되는 것으로, 휴스턴 등(Huston, et al.)의 Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 85:5879-5883(1988) 및 버드 등(Bird, etal.)의 사이언스지(Science) 242:4223-426 (1988)을 참조.) (일반적으로, 본 명세서에 참조고 삽입된 후드 등(Hood, et al.), "면역학(Immunology)", 벤자민(Benjamin), N.Y., 2nd ed.(1984) 및 훈카필러(Hunkapiller)와 후드, 네이쳐지(Nature), 323:15-16(1986)을 참조.) 경쇄 및 중쇄의 유전자들이 단일 코딩 서열 안에 결합되어 있는 단일-사슬 항체가 또한 사용될 수 있다. 면역글로블린 폴리펩티드는 또한 절단된 면역글로블린 사슬, 예를 들어 천연 폴리펩티드보다 불변 영역을 덜 포함하고 있는 사슬을 포함한다. 상기 절단된 폴리펩티드들은 잘려진 영역 서열의 5' 안으로 정지코돈을 도입하는 등의 표준 방법에 의해서 생산될 수 있다. 상기 절단된 폴리펩티드는 이후 절단된 항체에 결합되어질 수 있다. 본 명세서에 사용된 항체들은 또한 다음의 참조문헌들에 기술된 방법 등에 의해 생산될 수 있는 양쪽 특이성(bispecific) 항체들을 포함할 수 있다: 글레니 등(Glennie et al.)의 J. Immunol., 139:2367-2375 (1987); 시갈 등(Segal et al.)의 암치료법의 생물학적 치료 최신정보(Biologic Therapy of Cancer therapy of Cancer Updates) 2(4):1-12(1992);와 쉘라비 등(Shalaby et al.)의 J. Exp. Med. 175:217-225(1992).

"모노클로날 항체"는 당업자에 익숙한 다양한 방법들에 의해 얻어질 수 있다. 간단하게는, 소정의 항원으로 면역화된 동물의 비장 세포는 일반적으로 골수종 세포와의 융합에 의해 불멸화된다. (콜러(Kohler)와 밀스테인(Milstein)의 Eur.J.Immunol. 6:511-519(1976)을 참조) 불멸화의 다른 방법은 엡스테인 바 바이러스(Epstein Barr Virus), 발암 유전자 또는 레트로바이러스에 의한 형질 변환, 또는 당업계에 잘 알려진 다른 방법들을 포함한다. 단일 불멸화 세포들로부터 발생하는 군체는 항원에 대한 소정의 특이성과 친화성을 갖는 항체의 생성을 위하여 스크리닝되고 상기 세포에 의해 생성된 모노클로날 항체의 수율은 척추 동물 숙주의 복막강 안으로의 주입을 포함하는 다양한 방법에 의해 향상될 수 있다.

또한, 단일 특이성(monospecific)과 양쪽 특이성(bispecific) 면역글로블린은 원핵 또는 진핵 숙주 세포의 재조합 기술에 의해 생산될 수 있다. "키메릭"(chimeric) 항체는 경쇄와 중쇄의 유전자가 상이한 종(species)에 속하는 면역글로블린 유전자 조각들로 구성되게 하기 위해 유전적으로 조작된 면역글로블린 유전자들에 의해 암호화된다. 예를 들면, 쥐의 모노클로날 항체로부터의 유전자의 가변성(Ⅴ) 조각들이 인간의 불변(C) 조각들에 결합될 수 있다. 이러한 키메릭 항체는 쥐의 가변 영역 및 불변 영역을 갖는 항체보다는 인간에 덜 항원성인 듯 하다.

본 명세서에서 사용된 키메릭 항체라는 용어는, 인간-유사 프레임워크(human-like framework)를 갖는 면역글로블린을 가지며, 적어도 약 85% - 90% 의 불변 영역, 바람직하게는 인간 면역글로블린 불변 영역과 약 95% 폴리펩티드 서열 동일성이 존재하여 소위 "인간화된" 면역글로블린이라 불리는 면역글로블린을 포함하는 항체를 말한다. (예로, 참조문헌으로 들어있는 PCT 공개 WO 90/07861 참조.) 그러므로 가능한 상보성 결정 영역(CDRs resions)을 제외한, 상기 "인간화된" 면역글로블린의 모든 부분은 하나 또는 그 이상의 천연 인간 면역글로블린 서열에 상응하는 부분과 실질적으로 같다. 필요하다면, 특히 특정 구조 잔기가 CDR의 구조에 영향을 미치는 것으로 발견될 경우 구조 잔기가 종(species)내 또는 종간에 치환될 수 있다. 키메릭 항체는 또한 절단된 가변 또는 불변 영역을 포함할 수 있다.

본 명세서에 사용된 "프레임워크(framework) 영역" 이라는 용어는 단일 종 의 다른 면역글로블린 사이에서 비교적 보존되어 있는(즉, CDRs 이외) 면역글로블린 경쇄 및 중쇄의 가변 영역 부분들을 말한다. 이는 참조문헌으로 들어 있는 카벳 등(Kabat et al.)(1987);면역학적 관점에서의 단백질 서열(Sequences of Proteins of Immunologic Interest, 4th Ed., U.S. Dept. Health and Human Services) 에 의해 정의되어 있다. 본 명세서에서 사용된, "인간-유사 프레임워크 영역"은 각 존재하는 사슬의 프레임워크 영역이 인간 면역글로블린과 동일한 적어도 약 70 또는 그 이상의 아미노산 잔기, 전형적으로는 75 내지 85 또는 그 이상의 잔기를 포함하는 프레임워크 영역이다.

인간의 불변 영역 DNA 서열은 잘 알려진 방법에 의해 다양한 인간 세포로부터, 바람직하게는 불멸화된 B-세포로부터 분리될 수 있다. 본 발명의 키메릭 면역글로블린을 생산하기 위한 가변 영역이나 CDRs는 인간형 아밀로이드에 결합할 수 있는 모노클로날 항체로부터 유사하게 유래될 수 있고, 마우스(mice), 랫(rat), 토끼, 인간 세포주 또는 잘 알려진 방법에 의해 항체를 생산할 수 있는 기타 척추동물을 포함하는 어느 편리한 포유류 체계에서 생산된다. 가변 영역이나 CDRs는 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, "PCR")이나 파아지-디스플레이 라이브러리(phage-display libraries)를 포함하는 표준 재조합 방법에 의해 합성적으로 생산될 수 있다. 파아지-디스플레이 방법에 대해, 예로 맥카펄티 등(McCafferty et al.)의 네이쳐지 352:624-628과 막스 등(Marks et al.)의 바이오테크놀러지 11:1145-1149(1993)를 참조. 박테리아, 효모 및 파아지와 같은 적합한 원핵 세포체계가 이용될 수 있다.

DNA 서열에 적합한 공급원 세포들과 면역글로블린 발현과 분비에 적합한 숙주 세포들은 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection) ("세포주 및 하이브리도마의 카탈로그" 5번째 판(1985) 락빌(Rockville), 매릴랜드(Maryland), U.S.A., 이 문헌은 본 명세서에 참고로 삽입된다.)등의 많은 공급원으로부터 얻을 수 있다.

앞서 특히 상술된 키메릭 그리고 "인간화된" 면역글로블린 이외에 실질적으로 동일한 다른 변형 면역글로블린들이 당업계에 잘 알려진 다양한 재조합 DNA 기술을 사용하여 용이하게 고안되고 제작될 수 있다. 일반적으로, 유전자의 변형은 PCR과 위치특이적 변이법과 같은 잘 알려진 다양한 방법들에 의해 용이하게 얻어질 수 있다.(본 명세서에 참고로 삽입되는, 길만(Gillman)과 스미스(Smith)의 Gene 8:81-97(1979)과 S.로버트 등(S. Roberts et al.)의 네이쳐지 328:731-734(1987)을를 참조.)

선택적으로, 일차 면역글로블린 구조 부분만을 포함하는 폴리펩티드 단편들이 생산될 수 있다. 예를 들면, 그것은 항원 인식(즉, 상보적 고정)외에 하나 또는 그 이상의 면역글로블린 활성 또는 항원 인식과 하나 또는 그 이상의 면역글로불린 활성을 갖는 면역글로블린 폴리펩티드 단편을 생성하는 것이 바람직하다.

면역글로블린 유전자의 전체 또는 일부는 또한 새로운 성질을 가지는 융합 단백질(예를 들어, "면역독소")을 생산하기 위하여 다른 유전자들(효소)로부터의 기능성 영역 또는 독소, 표지 및 표적기(targeting moiety)와 같은 다른 분자들과 결합될 수 있다. 유전자 융합의 경우, 두 구성요소는 동일한 폴리펩티드 사슬안에 존재한다. 한편, 면역글로블린이나 그의 단편은 잘 알려진 다양한 화학처리에 의해 독소 또는 표지에 화학적으로 결합될 수 있다. 예를 들어, 표지 또는 세포 독성제가 단백질이고, 두번째 구성 요소는 온전한 면역글로블린 일 때, 그 결합은 헤테로 이작용성 크로스-링커(heterobifunctional cross-linkers), 예를들어,SPDP, 카보다이이미드(carbodiimide),글루타르알데히드(glutaraldehyde) 등을 통해 이루어진다.

적합한 표지로 예를 들면 방사성 핵종, 효소, 기질, 보조인자, 저해제, 형광제, 화학 발광제, 자성 조각들이 있다. 참조문헌으로 들어있는 다음 모든 특허는 이러한 표지의 사용을 가르쳐준다. 본 명세서에 참고로 삽입되는,미국특허 제 3,817,817호; 제 3,850,752호; 제 3,939,350호; 제 3,996,345호; 제 4,277,437호; 제 4,275,149호 및 제 4,366,241호를 참조.

단일 사슬 분자를 포함하는 면역독소는 또한 재조합 방법에 의해 생산되어 질 수 있다. 다양한 면역독소의 생성은 당업계에 잘 알려져 있으며, 방법들은 예를 들어, 본 명세서에 참고로 삽입되는 "모노클로날 항체-독소 접합: 마술탄환을 위하여("Monoclonal Antibody-Toxin conjugates: Aiming the Magic Bullet)," 트로프 등(Thrope et al.), 임상 의학에서의 단일 세포성 항체(Monoclonal Antibodies in Clinical Medicine), Academic Press, pp. 168-190(1982); E.비테타(E. Vitetta), 사이언스지(Science)(1987) 238:1098-1104; 및 G.윈터(G. Winter)와 C.밀스테인(C. Milstein)의 네이쳐지(1991) 349:293-299 에 있다.

면역글로블린 및 면역글로블린 단편을 제조하는 다른 기술들은 V.S.마릭 등(V.S.Malik et al.)의 항체 기술(Antibody Techniques)(Academic Press, 1994);C.A.K.보어백(C.A.K. Borrebaeck)의 항체 공학(Antibody Engineering): 분자 생물학의 통찰(Breakthroughs in Molecular Biology) (옥스퍼드 대학 출판사, 1995); 그리고 P.J.델브 등(P.J.Delves et al.)의 항체 생산(Antibody Production) : 필수적 기술(Essential Techniques)(존 윌리 앤 손즈(John Wiley & Sons), 1997)에 기술되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참고로 삽입된다.

본 명세서에 사용된, "옵손화"는 면역글로블린 폴리펩티드가 특정 대상, 특히 아밀로이드 원섬유 침전상의 발견되는 에피토프와 결합하여, 상기 항체와 대상이 함께 숙주 세포 면역체계에 의해 "이질"(foreign)로 인식되는 것을 말한다. 다시 말해, 본 발명의 면역글로블린의 결합은 아밀로이드 원섬유의 식균작용을 증가시킨다.

본 명세서에서 사용된 "아밀로이드종"은 아밀로이드 물질의 존재에 의해서 특징 지워지는 모든 상태를 의미하도록 의도되어졌다. 상기 물질은 아밀로이드종 또는 보다 분산되어 있는 아밀로이드 침전이나 원섬유의 형태일 수 있다.

약학적 조성물

본 발명에 따른 치료법적 처치를 위한 약학적 조성물은 비경구적, 경구적 또는 국부 투여하도록 의도된다. 바람직하게는, 상기 약학적 조성물은 비경구적으로 투여되는데, 예를 들어 정맥내, 피하내, 내피 또는 근육내로 투여된다. 혈액뇌관문(blood brain barrier)은 IgG에 침투할 수 없으므로(U.빅켈 등(U.Bickel et al.)의 1994 Bioconj. Chem. 5:119-25를 참조.) 혈관뇌관문을 극복하기 위한 항체의 수송은 원하는 부위에 항체의 리포좀과 미셀을 통한 수송으로 이루어질 수 있다. 또한, 본 발명의 약제들은 뇌척수액으로 직접 운반될 수 있다 (예로, L.C.워커 등(L.C.Walker et al.)의 1994 J.Neuropathol. Exp. Neurol. 53:377-83을 참조). 다른 수송 작용들에 대해서는 P.M.프리덴(P.M.Friden)의 1996년 미국 특허 제 5,527,527호와 W.M.파드리지(W.M.Pardridge)의 1991년 미국 특허 제 5,004,697호에 언급되어 있다. 상기 모든 문헌들은 참고로 본 명세서에 삽입된다.

그러므로, 본 발명은 약학적으로 허용 가능한 담체, 바람직하게는 수성의 담체 안에 용해되어 있거나 현탁된 항-아밀로이드 면역글로블린 폴리펩티드 용액을 포함하는 비경구적 투여용 조성물들을 제공한다. 다양한 수성 담체가 이용될 수 있으며, 예를 들어 물, 완충용액이 처리된 물, 0.4% 함염물(saline), 0.3% 글리신(glycine), 히알루론산(hyaluronic acid) 등이 그것이다. 상기 조성물들은 관습적이고, 잘 알려진 멸균 기술로 멸균되어질 수 있으며, 또한 멸균 여과될 수 있다. 결과적으로 생성된 수용액은 그대로 또는 동결 건조되어 사용을 위해 포장될 수 있으며, 동결 건조된 제제는 투여전에 멸균 용액과 결합된다. 상기 조성물은 예를 들면, pH 적정 및 완충 시약들(pH adjusting and buffering agents), 탄력성 조정시약(tonicity adjusting agents), 습윤제와 같은 예를 들어 아세트산 나트륨(sodiumacetate),락트산나트륨(sodiumlactate),염화나트륨(sodium chloride) ,염화 칼륨(potassium chloride), 염화 칼슘(calcium chloride), 모노라우르산소르비탄(sorbitanmonolaurate), 트리에탄올아민올레이트(triethanolamineoleate)등의, 생리 조건과 유사하게 만드는 데 필요한 약학적으로 허용 가능한 보조 물질들을 포함할 수 있다.

약학적 제제에서 본 발명의 항-아밀로이드 면역글로블린 폴리펩티드의 농도는 넓게 변화할 수 있다. 즉, 중량 단위로 1% 도 안되는 것으로부터, 일반적으로는 적어도 약 10-15% 또는 그 정도, 많게는 50% 또는 그 이상으로까지 변화할 수 있고, 선택된 특정한 투여 방법에 따라 용액 부피, 점도 등에 의해 주로 선택될 것이다.

불필요한 실험 없이, 당업자는 아밀로이드종을 적절히 옵손화시키는데 유효한 면역글로블린 폴리펩티드의 양을 결정할 수 있다. 이런 용도를 위한 유효량은 항-아밀로이드 면역글로블린 폴리펩티드 조성물의 특성, 투여 방법, 치료될 질병의 단계와 심각성, 환자의 몸무게와 전반적인 건강상태 및 처방하는 의사의 판단에 따라 다르다. 1회 투여량은 보통 0.5mg/kg이 된다. 유념할 것은, 항-아밀로이드 면역글로블린 폴리펩티드 및 그로부터 유래된 펩티드 조성물은 심각한 질병상태, 즉 생명을 위협하거나 위협할 가능성이 있는 상황에서 사용된다는 점이다. 이러한 경우에, 치료하는 의사는 상기 조성물들의 상당한 과량을 투여하는 것이 바람직하게 여겨질 수 있다. 따라서, 이런 상황하에서는 본 발명의 인간 항-아밀로이드 모노클로날 항체 또는 실질적으로 인간 항-아밀로이드 수용체 모노클로날 항체가 가장 바람직하다.

본 발명에 따른 아밀로이드증 환자의 치료는 또한 소나 닭과 같은 아밀로이드증에 걸리기 쉬운 동물들에게 적용될 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 인간 환자에 대한 언급들은 또한 비-인간 환자에게도 적용될 수 있다.

본 명세서에서 정의된 면역글로블린 폴리펩티드는 아밀로이드종 또는 그것의 전구체에 대한 항-아밀로이드 mAbs인 것이 바람직하다. mAbs는 IgLC의 다양한 영역에 대해서나 또는 바람직하게는 IgLC의 서브세트(subsets)들 κ1, κ4, λ8, 또는 그들의 조합에 대하여 야기될 수 있다. 실질적으로 비-인간의 것인 면역글로블린 폴리펩티드의 인간에 대한 투여는 항-항체 응답을 이끌어낼 것이다. 그러므로, 실질적으로 인간의 것인 본 발명의 항-IgLC 면역글로블린 폴리폡티드를 제조하는 것이 바람직할 것이다. "실질적으로 인간의 것"이라 함은 특히 아밀로이드증이 확립된 경우들을 치료하는데 필요한 만큼 장기간에 걸친 반복적 투여를 위해서, 적어도 약 50%가 인간 유래인, 바람직하게는 적어도 약 70-80%, 그리고 가장 바람직하게는 약 95 % 내지 99%나 그 이상이 인간 유래인 아미노산 서열들로 구성된 항체나 그것의 결합 단편(binding fragment)을 의미한다. 본 명세서에 따르면, 인간의 항체는 만약 문맥이 다른 것을 나타내고 있지 않다면, 실질적으로 인간의 것 뿐 아니라 전적으로 인간 유래의 항체를 포함한 것을 의미한다. 모노클로날 항체들은 또한 합성 아밀로이드 원섬유들에 대하여 야기될 수 있다. 경쇄이고 가변영역인 재조합펩티드는 표준 기술들을 사용하여 시험관에서 분리되고 정제된다. 합성 원섬유들은 그리고 나서 월 등(Wall et al.)의 "시험관에서의 면역글로블린 경쇄의 원섬유 발생"(In vitro Immunogloblin Light Chain Fibrillogenesis), 효소학에서의 방법, Vol. 309 (In Press)에 의해 기술된 것과 같은 방법을 사용하여 펩티드로부터 제조된다. 그러한 후 항체는 보통 쥐나 토끼를 사용하는 표준 면역 기술을 사용하여 합성 원섬유에 대하여 야기된다. 항-원섬유 항체를 분비하는 모노클로날 세포주는 표준 하이브리도마 기술을 사용하여 생산된다. 본 발명의 항-아밀로이드 면역글로블린 폴리펩티드들은 다수의 공지기술 중 어느 것에서도 제조될 수 있을 것이다. 예를 들면, 그것들은 정제되거나 또는 부분적으로 정제된 인간의 아밀로이드로 동물을 면역화 시키는 것에 의해 제조된다. 면역화된 동물들은 뮤린(murine), 라고모르프(lagomorph), 말(equine) 등과 같은 인간 형태 아밀로이드 세포외 영역에 독특한 에피토프를 면역학적으로 인식할 수 있는 다양한 종들 중 어느 하나일 수 있다. 본 발명의 모노클로날 항체들은 인간 형태 아밀로이드의 세포외 영역에 독특한 에피토프에 특이적으로 결합한 면역글로블린 폴리펩티드 또는 그의 일부분을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 세포를 불멸화함으로써 제조된다. 불멸화 과정(immortalization process)은 하이브리도마 융합 기술에 의해, 항체-생산 임파구의 바이러스성 형질전환에 의해, 재조합 DNA 기술에 의해 또는 세포 융합, 바이러스성 형질전환 및/또는 재조합 DNA 방법론을 결합한 기술에 의해서 수행될 수 있다. 모노클로날 항체를 야기시키는 면역원은 예로, 참조문헌으로 들어 있는 A.로마킨 등(A.Lomakin et al.), 1997 Proc. Nat'l Acad. Sci. 미국 94:7942-7 에 기술된 합성 아밀로이드 원섬유를 포함한다. 인간의 항-아밀로이드 모노클로날 항체들을 발생시키는 것은 종래 불멸화 기술로는 어렵기 때문에, 먼저 비-인간의 항체들을 만들고 재조합 DNA 기술을 통해 예를 들어, Fab, CDRs 또는 과가변성 영역인 비-인간 항체의 항원 결합 영역을 실질적으로 인간 분자를 생산하기에 적합한 인간불변영역(Fc) 또는 프레임워크영역(framework regions)내로 이동시키는 것이 바람직할 것이다. 이런 방법들은 일반적으로 당해 기술분야에서 잘 알려져 있고, 참조문헌으로 수록된 다음 예에 기술되어 있다. 미국 특허 제 4,816,397호, PCT 공개 제 WO 90/07816호 와 EP 공개 제 173494호 및 제 239400호. 그러나, 완전한 인간의 항체들은 형질전환 동물에서 생산될 수 있다. 바람직한 인간 면역글로블린 유전자나 유전자 조각들은 예를 들면, PCR에 의해 인간의 B 세포로부터 분리될 수 있으며, 상기 DNA는 진핵 세포에서의 형질 발현을 위해 적합한 벡터 안으로 클로닝될 수 있으며, 상기 클로닝된 DNA는 동물에 도입되어 형질변환 동물(transgenics)을 생산할 수 있다. 인간 면역글로블린을 발현하는 형질변환 동물의 생산에 적합한 동물은 생쥐, 쥐, 토끼 및 돼지를 포함하고 인간 면역글로블린을 발현하는 형질변환된 설치류 동물은 바람직하게는 인간 항체의 동정 및 분리를 용이하게 하기 위해 불활성화 되거나 녹-아웃된(knocked-out) 하나 또는 그 이상의 그들의 내인성(endogenous) 면역글로블린 위치를 가져야 한다. (론버그 등(Lonberg et al.)의 네이쳐지 368:856-859(1994)를 참조.)

인간의 아밀로이드에 결합하는 생성된 키메릭 항체들 또는 키메릭 면역글로블린 폴리펩티드들이 또한 본 발명의 범위 안에 있다. 전형적인 치료적 키메릭 항체는 인간 아밀로이드 항원결정자(determinant)에 대해 특이적인 마우스 면역글로블린으로부터의 가변(V) 또는 항원-결합 영역, 및 인간 면역글로블린으로부터의 불변(C) 또는 이펙터(effector) 영역으로 이루어진 하이브리드 단백질이지만, 다른 포유류종으로부터의 영역들도 가변 및 불변 영역 모두에서 사용될 수 있다. 본 명세서에 사용된, "키메릭 항체"라는 말은 또한 단지 CDRs만이 항원 결정기들을 특이적으로 인식하는 면역글로블린으로부터 이동된 것이고, 면역글로블린 유전자의 나머지는 인간(또는 소정의 다른 포유류) 면역글로블린 유전자로부터 유도된 면역글로블린 유전자들에 의해 암호화된 항체를 말한다. 상술된 바와 같이, 이러한 형태의 키메릭 항체는 "인간화된"(humanized)(인간 면역글로블린 유전자가 사용된 경우) 항체로 불린다. 또한 다른 종의 서열을 포함하지 않는 재조합 인간 항체들이 고려되기도 한다.

항-아밀로이드 면역글로블린 폴리펩티드들의 가변 영역들의 과가변성 영역들은 본 발명의 관련 특징을 포함한다. 과가변성 영역들, 또는 CDRs는 프레임워크 영역(단일종의 상이한 면역글로블린들 중에서 비교적 보존되어 있는 면역글로블린의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 일부)과 함께, 항-아밀로이드 면역글로블린 폴리펩티드가 인간 아밀로이드를 인식하여 인간의 아밀로이드에 결합될 수 있도록 한다. 과가변성 영역들은 클로닝되어 시퀀싱될 수 있다. 일단 동정되면, 인간 아밀로이드의 특이적 인식에 기여하는 상기 영역들은 이후 다른 면역글로블린 분자의 일부분 또는 융합 단백질, 예를 들어 클로닝된 이디오타입(idiotype)의 면역원성을 증가시키는 기능을 하는 담체 분자(carrier molecule)로서 숙주내 발현을 위한 벡터내로 클로닝될 수 있다.

본 발명의 항-아밀로이드 면역글로블린 폴리펩티드들은 일반적으로 온전한 상태 또는 Fv, Fab, F(ab')₂단편과 같은 면역원의 단편들로서 사용될 것이다. 상기 단편들은 예를 들어, 펩신(pepsin), 파파인(papain) 또는 다른 단백질 분해효소(proteolytic enzymes)를 사용하는 항체의 단백질분해 소화에 의한 것, 또 는 소정의 단편을 암호화하는 유전자 또는 그것의 일부가 클로닝되거나 또는 합성되는 재조합 DNA 기술에 의한 것과 같은 종래의 기술에 의해서 항체들로부터 얻어질 수 있고, 다양한 숙주에서 발현될 수도 있다.

당업자는 "항-이디오타입" 항체들이 표준 방법들에 따라 특이적 면역글로블린을 면역원으로 사용함으로써 생산될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 예를 들면, 아밀로이드 원섬유 또는 그것의 단편들에 의한 감염 또는 면역화는 중화 면역글로블린(a neutralizing immunogloblin)을 유발하는데, 이것은 이의 Fab 가변 영역 결합 부위 상에 특정 면역글로블린 즉, 유전자형에 독특한 아밀로이드 상(image)을 갖는다. 그러한 항-아밀로이드 면역글로블린으로의 면역화는 항-이디오타입 항체를 유발하며, 이것은 그것의 결합 부위에 본래의 아밀로이드 항원 구조를 모방한 형상을 가진다. 따라서, 이러한 항-이디오타입 항체들은 아밀로이드 항원 대신에 쓰일 수 있다. 예로, 참조문헌으로 삽입되어 있는 니소노프(Nisonoff)(1991) J.Immunol.147:2429- 2438 를 참조.

다음의 실시예는 본 발명의 바람직한 실시예를 상세하게 지적하였고, 결코 명세서에 기재된 내용의 나머지 부분을 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 다른 포괄적 구성들(generic configurations)은 당업자에게는 명백할 것이다.

실시예 1

뮤린 숙주에서의 인간 IgLC 아밀로이드의 조력받지 않는 분해

인간 IgLC 아밀로이드를 해부과정에서 얻은 감염조직으로부터 추출하여 정제하였다. 첫번째 실험은 50 내지 200 mg의 상기 아밀로이드 물질을 Balb/c 마우스 내로 이식하는 과정을 포함하였다. 생체내에서 발견된 부속 분자들(the accessory molecules)을 갖춘 아밀로이드 원섬유의 미세한 부유물을 만들기 위해 아밀로이드 덩어리, 또는 "아밀로이드종"을 일련의 초음파 처리(sonication) 및 그라인딩(grinding) 단계에 의해 멸균된 PBS 에서 제조하였다. 아밀로이드를 마우스에게 광-게이지 피하주사 바늘(hypodermic needle)을 통하여 주사할 수 있도록 이 과정을 행하였다. 동물 몸무게의 10% 와 동량의 아밀로이드 물질은 마우스(마취하에서) 견갑골 사이에 주사되고, 이것은 눈에 보이는 커다란 덩어리가 된다.(도 1a 참조.) 마우스에서 아밀로이드종이 완전하게 제거되려면 15-18일이 소요되고(도 1b 참조.), 그 후에 그 동물은 건강하게 보였고 정상적인 수명을 살았다. 아밀로이드종의 제거는 주사 부위, 피부 아래로 쉽게 느껴질 수 있는 딱딱한 완두콩 같은 아밀로이드종을 단순히 만져봄으로써 실험자에 의해 주관적으로 결정되었다.

실시예 2

아밀로이드종의 제거에 있어서의 항체-중개면역 및 세포내 면역의 연관성

아밀로이드종의 제거에 있어서 항-아밀로이드 항체의 연관성을 아밀로이드 물질로 먼저 주사된 마우스로부터의 혈청을 상기 주사된 물질의 시료에 대해서 스크리닝함으로써 나타내었다. 이는 1차 항체로서 마우스의 혈청을 적당히 희석한 것을 이용한 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)을 통해 행해졌다. 그것은 아밀로이드 매트릭스의 모든 구성 성분마다 항체가 있다는 것을 보여주었는데 즉, 겔(gel)상의 모든 밴드(band)는 마우스 혈청에 의해서 염색되었는데, 심지어 10,000배 희석된 혈청에 의해서도 염색되었다. (데이터는 도시되지 않음.)

세포 구성성분의 연관을 시험관에서의 호중구 결합 분석(in vitro neutrophil binding assays)에 의해(도 2a와 2b를 참조.), 또한 녹아웃-돌연변이 마우스 변형주(knockout-mutant mouse strains)를 사용함으로써 (데이터는 도시되지 않음.) 나타내었다. 도 2a와 2b는 마우스 항-인간 IgLC mAbs로 아밀로이드를 처리한 후 인간 아밀로이드에 부착하는 인간 호중구를 보여준다. 이것은 마우스 mAb가 인간의 호중구에 이끌릴 뿐만 아니라 인간의 아밀로이드에도 결합할 수 있다는 것을 보여준다.

녹아웃-돌연변이 마우스 변형주(knockout-mutant mouse strains)의 연구는 아밀로이드 제거에서의 항체 연관의 발견을 더욱 뒷받침한다. 첫째로, B와 T 임파구가 결여된 중복 면역 결핍증 마우스(scid/scid mice)에서는 심지어 세 달이 지난 후에도 주사된 아밀로이드종을 제거할 수 없었다. (데이터는 도시되지 않음.) 두번째로, CD18 녹아웃 동물들에서는 정상의 동물들만큼 빠르게 아밀로이드종을 제거할 수 없었다. CD18 녹아웃 동물들은 과립성/대식세포 계통에서 발견되는 세포 표면 인테그린(integrin)인 CD18이 97% 부족하다. 비록 이런 세포들은 서큘레이션(the circulation)을 떠날 수는 없지만, 상기 동물들은 B 및 T 세포 컴피턴트(competent)이고, 따라서 항체 반응을 취할 수 있다. 세번째로, 백혈구 세포를 가지고 있지 않은 누드 마우스(nude mice)에서는 아밀로이드종을 제거할 수 없었다. 더 나아가서, 다른 마우스로부터의 아밀로이드-반응성 혈청으로 배양된 아밀로이드는, 두번째 마우스로 이식되었을 경우, 4일 이내에 제거된다. 이 실험에서 Balb/c 마우스에는 50 mg의 HIG 아밀로이드를 주사하였고, 말단-정맥 베어내기(tail-vein clipping)에 의해 혈액을 뽑아낸 후, 1주일 동안 놓아두었다. 혈액을 1,500 rpm에서 회전시켰고 흡입에 의해 상기 세포를 제거하였다. 사용되는 동안 혈장을 4℃ 에서 보관하였다. 또 다른 HIG 아밀로이드(100 mg)의 제조물은 이전의 마우스로부터의 1 ml 혈장을 넣은 멸균 PBS에서 부유시킴으로써 제조되었다. 이어서, 제조물을 두번째 마우스(Balb/c)내에 주사하고 아밀로이드를 4일 후에 제거하였다. 따라서, 주사하기 전에 물질을 옵손화시킴으로써 과정을 빠르게 할 수 있었다고 결론 내렸다.

실시예 3

IgLC 서브세트(subsets)의 ELISA 스크리닝

IgLC 부분들(λ1, λ2, λ3, λ4, λ5, λ6, κ1, κ2, κ3, κ4, 자유 κ와 λ및 전체 κ와 λ)에 대항하여 생긴 mAbs를 이용하여 인간에서 추출된 다수의 아밀로이드 시료를 스크리닝하기 위해서 엘리사(ELISA) 기술을 이용하여 체계적인 연구를 하였다. 흥미롭게도, 매우 번번히 아밀로이드가 그들 자신의 아형(subtype)에 대해 특이적인 mAbs, 전체 κ또는 λ항체와, κ1(57-18H12), κ4(11-1F4)와 λ8(31-8C7) mAb에 양성으로 반응한다는 것을 알아냈다. 이들 후자의 세 가지 시약은 비-서브세트 특이적 방법으로 반응하는 것으로 발견되었다. 즉, κ1은 κ1 이외의IgLC로 구성된 아밀로이드와 반응하였고; 그리고 다른 두 개의 mAbs는 동일한 성질을 나타낸다. 이는 이러한 항체들에 의해 인식된 항원요소들이 아밀로이드 원섬유의 일반적인 특징일 수 있음을 보여주고, 표적화될 수 있는 공유 아밀로이드 항원요소의 가능성을 나타낸다.

실시예 4

면역화학적 염색

아밀로이드 환자들로부터의 조직 시료들은 표준 면역화학적 기술을 이용하여 염색하였고 비슷한 결합 현상이 관찰되었다. 도 3a 내지 3d는 항-κ1이 κ1 아밀로이드에 결합하는 것과, 놀랍게도 항-κ4가 κ1 아밀로이드와 반응하는 것을 나타내고 있는 바, 이는 상기 항체들이 인식할 수 있는 아밀로이드 에피토프를 제시하고 있는 것이다. 부가적으로, 항-κ4는 λ-함유 아밀로이드(도시되지 않음)와 반응하였다. 이것은 교차-이소타입 반응성(cross-isotype reactivity)의 예이다. 그러나, 엘리사(ELISA)와 면역조직화학의 결과들이 항상 일치하지는 않는다. 이것은 검사하는 방법에서의 근본적인 차이에 기인하는 것 같다. 즉, 엘리사(ELISA)는 추출된 정제 아밀로이드를 사용하는 액체상 결합 분석법이고 반면, 면역조직화학은 슬라이드 위에고정된 조직 조각 위에서 수행되는 것이다.

항-κ1(57-18-H12(ATCC Acc. No.PTA-104)), 항-κ4(11-1F4(ATCC Acc.No.PTA-105))와 항 λ8(31-8c7(ATCC Acc. No.PTA-103)) mAbs를 분비하는 하이브리도마 세포의 시료를 1999년 5월 21일 부다페스트 조약에 따라 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection, ATCC)에 기탁하였다.

실시예 5

항-IgLC 부분군의 생체내( In vivo ) 연구

위에서 확인된 κ1, κ4, 또는 λ8의 세 항체들 중 하나의 0.1 mg을 위에 서술된 것처럼 아밀로이드가 아밀로이드종 형태로 도입되어 있는 마우스의 대퇴부에 주사하였다. κ1과 κ4 시약은 7일(아밀로이드의 어떠한 종류는 4일의 단기간내) 이내에 시험된 대부분의 아밀로이드 원섬유 종들의 숙주에 의해 완전한 제거 결과를 나타내었다. 도 4는 인간 아밀로이드에 결합하는 형광화된 κ4 mAb를 보여 준다.

두개 시험관 연구들(상기 언급)의 일정 실험예에서 반응을 보인 λ8 시약의 경우, 생체내 실험에서 약 10% 까지 아밀로이드종의 분해를 증가시켰다.

실시예 6

항-IgLC 부분군의 생체내 연구

인간 아밀로이드를 염증-관련, AA-아밀로이드를 가진 환자로부터 분리하고, Balb/c 마우스내로 주사하기 위해 초음파 처리 및 그라인딩을 반복함으로써 제조하여 상기 마우스내로 그 주사를 가능하게 하였다.(실시예 1을 참고.) 100mg의 인간 AA-아밀로이드 추출물 주사 후 즉시 마우스들을 100 ㎍의 4 mAb, 항-AA mAb, mAb 없는 것 및 비-특이성 컨트롤 mAb(항-자유 카이)로 처리하였다. 물질의 완전한 분해를 48 시간 동안 κ4와 항-AA mAbs로 처리되었던 동물에서 관찰하였다. 반대로, 컨트롤 동물들은 주사 부위에 큰 덩어리의 아밀로이드가 남아 있었다.

실시예 7

특이성 항-아밀로이드 원섬유 mAbs 생산

합성 아밀로이드 원섬유를 시험관에서 제조하고 마우스 항-아밀로이드 원섬유 mAbs의 첫 세대를 생산하기 위해 마우스에서 면역원으로써 사용하였다. 간단하게 말하면, 재조합 λ6-경쇄의 가변 영역 펩티드를 박테리아 발현 시스템 및 표준 단백질 정제 기술을 사용하여 생산, 분리 및 정제하였다. 합성 원섬유들을 서술된 대로 용액에서 장기간의 교반에 의해 이러한 펩티드들로부터 제조하였다. 예로 월 등(Wall et al.)의 "시험관에서의 면역글로블린 경쇄 원섬유 유전자"(In vitro Immunogloblin Light Chain Fibrillogenesis), 효소학에 있어서의 방법들, vol. 309 (In Press)이 있다. 원섬유들을 실온에서 17,000×g 에서 20분 동안 원심 분리에 의해 모았다.

모아진 원섬유들을 그 후에 수주일 동안 Balb/c 마우스들을 면역화 시키는데 사용하였다. 항-원섬유 항체를 분비하는 모노클로날 세포주를 표준 하이브리도마 기술을 사용하여 생산하였다. 그 결과로 만들어진 항체들은 실시예 3에 기술된 엘리사(ELISA) 분석을 기초로 하여 입증될 수 있는 항-원섬유 활성을 가진다. 이들 항체는 엘리사(ELISA)에 의해 시험될 때 전구체 단백질의 이소타입(isotype)이나 소군체(subgroup)의 본성을 고려하지 않은 시점에 시험된 모든 인간 IgLC 아밀로이드 추출물의 99%와 반응하였다. 비슷하게, 항체는 ELISA형식(format)으로 분리된 뮤린 AA-아밀로이드 및 알쯔하이머(Alzheimer's) 단백질 Aβ[Aβ(25-35)] 로부터 유도된 펩티드로 구성된 합성 원섬유와 반응한다.

상기 해설 및 실시예는 단지 바람직한 실시예의 상세한 설명을 나타내는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 당해 기술 분야에 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명의 정신 및 범위로부터 일탈하는 것이 아니라면 다양한 변형예 및 균등예가 가능하다는 것은 명백하다. 상기 관련된 모든 인용예, 문헌 및 특허는 전체가 참조문헌으로 여기에 수록된다.

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아밀로이드 원섬유에 결합하고, 동물에서 질병-관련 아밀로이드 원섬유 침전을 제거하기에 효과적인 면역글로블린 폴리펩티드 또는 그의 단편.
제10항에 있어서, 상기 면역글로블린 폴리펩티드 또는 그의 단편은 모노클로날 항체 또는 그의 단편인 면역글로블린 폴리펩티드 또는 그의 단편.
제11항에 있어서, 상기 모노클로날 항체는 인간화된 항체인 면역글로블린 폴리펩티드 또는 그의 단편.
제11항에 있어서, 상기 모노클로날 항체는 키메릭 항체인 면역글로블린 폴리펩티드 또는 그의 단편.
제13항에 있어서, 상기 키메릭 항체는 인간화된 항체인 면역글로블린 폴리펩티드 또는 그의 단편.
제11항에 있어서, 상기 모노클로날 항체는 표지된 항체인 면역글로블린 폴리펩티드 또는 그의 단편.
제11항에 있어서, 상기 모노클로날 항체는 κ1(57-18H12)(ATCC 승인번호 PTA-104), κ4(11-1F4)(ATCC 승인번호 PTA-105), λ8(31-8C7)(ATCC 승인번호 PTA-103) 및 그것의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역글로블린 폴리펩티드 또는 그의 단편.
제16항에 있어서, 상기 모노클로날 항체는 인간화된 항체인 면역글로블린 폴리펩티드 또는 그의 단편.
제10항에 있어서, 상기 면역글로블린 폴리펩티드 또는 그의 단편은 합성 아밀로이드 원섬유에 대해 유도된 것인 면역글로블린 폴리펩티드 또는 그의 단편.
제10항 내지 제17항 중 어느 한 항의 면역글로블린 폴리펩티드 또는 그의 단편을 포함하는 약학적 조성물.
제10항 내지 제 17항 중 어느 한 항의 면역글로블린 폴리펩티드의 적어도 하나의 과가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자.
제20항의 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포.
제21항의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 면역글로블린 폴리펩티드의 제조 방법.
적어도 하나의 면역글로블린 폴리펩티드 또는 그의 단편을 포함하는 약학적 조성물로서, 상기 면역글로블린 폴리펩티드 또는 그의 단편은 동물에서 아밀로이드 원섬유 침전 제거를 증진시키는 약학적 조성물.
제23항에 있어서, 상기 면역글로블린 폴리펩티드 또는 그의 단편은 면역글로블린 경쇄에 대해 유도된 것인 약학적 조성물.
제23항에 있어서, 상기 면역글로블린 폴리펩티드 또는 그의 단편의 결합은 아밀로이드 원섬유를 옵손화하는 약학적 조성물.
제23항에 있어서, 상기 면역글로블린 폴리펩티드 또는 그의 단편은 모노클로날 항체인 약학적 조성물.
제26항에 있어서, 상기 모노클로날 항체는 인간화된 항체인 약학적 조성물.
제26항에 있어서, 상기 모노클로날 항체는 키메릭 항체인 약학적 조성물.
제28항에 있어서, 상기 키메릭 항체는 인간화된 항체인 약학적 조성물.
제26항에 있어서, 상기 모노클로날 항체는 표지된 항체인 약학적 조성물.
제26항에 있어서, 상기 모노클로날 항체는 κ1(57-18H12)(ATCC 승인번호 PTA-104), κ4(11-1F4)(ATCC 승인번호 PTA-105), λ8(31-8C7)(ATCC 승인번호 PTA-103) 및 그것의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 약학적 조성물.