KR20160084177A - 뮤턴트 루테리알에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 환자 유래 뮤턴트 루테리알 또는 상기 뮤턴트 루테리알의 파열(bursting)에 의해 수득되는 미세물질에 결합하거나, 환자 유래 뮤턴트 루테리알에 함유되어 있는 항원성 물질에 특이적으로 결합하는 환자 특이적 항체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

Description

뮤턴트 루테리알에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 제조방법{Anti-Mutant Luterial Antibody and Method for Preparing the Same}

본 발명은 루테리알 특이적 항체 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 환자 유래 뮤턴트 루테리알 또는 상기 뮤턴트 루테리알의 파열(bursting)에 의해 수득되는 미세물질에 특이적으로 결합하거나, 환자 유래 뮤턴트 루테리알에 함유되어 있는 항원성 물질에 결합하는 항체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

특정 질환을 가진 환자는 의사로부터 환자의 현재 상태, 각 치료제에 대한 임상 시험 결과, 관련 논문 및 의사의 경험에 근거하여 치료제를 처방 받는다. 다만, 환자마다 동일한 질환을 가진다 하더라도 각각 상이한 유전적 변이를 가지는 경우가 많으므로, 동일한 치료제를 투여한다고 하여도 환자 모두에게서 동일한 예후가 나타나는 것은 아니다.

예를 들어, 적어도 1개의 변이 (적어도 1개의 단일염기다형성 (SNP))를 함유하는 환자의 경우 동일한 질환을 가졌음에도 불구하고, 상이한 SNP 패턴이 나타나는 경우가 있다. 구체적으로, 도 1에 기재된 바와 같이, 정상인과 비교하여 핵산 서열의 변이(A)를 포함하는 환자 1의 치료를 위해 치료제 A'를 사용하여 치료되었다 하더라도, 동일한 질환의 다른 환자에는 치료제 A'가 적합한 치료 효과를 나타내지 못할 수 있다.

환자 2는 환자 1과 일부 동일한 핵산 서열의 변이(A)를 포함하므로 치료제(A')를 사용하여 치료 효과 기대할 수 있을 것으로 판단된다. 다만, 핵산 서열의 변이(A)와 상이한 핵산 서열의 변이(B)를 포함하고 있어, 다른 핵산 서열의 변이(B)에 대한 치료제를 사용하지 않는다면, 충분한 치료 효과를 기대할 수는 없다.

더욱이, 환자 1에서 보이는 핵산 서열의 변이(A)와 상이한 핵산 서열의 변이(B 또는 C)를 포함하는 환자 3 및 환자 4에서는 치료제(A')를 투여하더라도 충분한 치료 효과를 기대할 수 없다.

이러한 문제점을 해소하기 위하여, 최근에는 환자로부터 나타나는 특이적 지표나 마커에 대한 정보를 얻고, 특이적 지표나 마커를 활용하여 환자에게 효능을 나타낼 것으로 예상되는 환자 맞춤 치료제를 개발하려는 시도가 있다.

이와 관련하여, 본 출원의 발명자들은 한국특허출원 제10-2013-0082060호를 통해 정상인과 비교하여 환자에서 관찰되는 미토콘드리아 유사 미세물질(루테리알, Luterial)의 크기, 형태 또는 운동성이 정상인에서 관찰되는 루테리알과 상이함을 확인하고, 환자 유래 루테리알이 환자 특이적 지표나 마커가 될 수 있음을 제시한 바 있다. 정상 루테리알과 비교하여 변이를 나타내는 루테리알을 뮤턴트 루테리알로 명명한다.

한편, 질환의 치료를 위해 종래에는 다수의 저분자량 화합물이 치료제로 사용되어 왔다. 그러나, 환자 맞춤 치료제 개발 목적에 부합하기 위해 최근 보다 효율적이고 부작용이 적은 단백질 제품 개발에 주목하고 있다. 이 중, 항체는 질환 유발 타겟을 공격할 뿐 아니라 정상조직에 대한 부작용이 거의 없어 관심을 모으고 있다.

항체는 외래 단백질, 당단백질, 세포 또는 그 외 항원성 외래 물질에 의한 공격에 반응하여 척추동물 면역계에 의해 생산되는 특이적인 항체 폴리펩타이드이다. 생물이 외래 세포에 의한 침입을 극복 또는 외래 물질을 그 생물계로부터 제거할 수 있는 일련의 과정은 부분적으로 이해되고 있으나, 중요한 부분은 특정의 외래 물질에 대해 특이적으로 결합하는 항체의 제조이다. 특정 항원에 대한 폴리펩타이드의 결합 특이성은 매우 정교하고, 개개의 환자에 의해 발생할 수 있는 특이성의 정도는 복잡하고 다양하다. 다수의 항원이 반응을 유발할 수 있지만, 특정 항원에만 반응이 유발된다.

이를 기반으로, 본 발명자들은 환자 특이적 지표나 마커로 제시된 뮤턴트 루테리알 또는 뮤턴트 루테리알 유래의 미세물질에 특이적으로 결합하는 항체를 제작 및 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 환자 맞춤형 치료제 개발을 위한 연구의 결과로서, 뮤턴트 루테리알 또는 뮤턴트 루테리알의 파열에 의해 수득되는 미세물질에 결합하는 루테리알 특이적 항체를 통해, 부작용 없이 우수한 치료 효과를 나타내는 환자 맞춤형 치료제를 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (i) 환자 유래 뮤턴트 루테리알; (ii) 상기 뮤턴트 루테리알의 파열에 의해 수득되는 미세물질; 또는 (iii) 환자 유래 뮤턴트 루테리알에 함유되어 있는 항원성 물질에 특이적으로 결합하는 환자 특이적 항체를 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 환자 유래 뮤턴트 루테리알 또는 상기 뮤턴트 루테리알의 파열에 의해 수득되는 미세물질을 인간을 제외한 동물에 도입하여 환자 특이적 항체를 생성시키는 단계; 및 (b) 상기 생성된 환자 특이적 항체를 회수하는 단계를 포함하는 환자 특이적 항체의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한, (a) 환자 유래 뮤턴트 루테리알 또는 상기 뮤턴트 루테리알의 파열에 의해 수득되는 미세물질을 숙주세포에 도입하는 단계; (b) 상기 숙주세포를 배양하여, 환자 특이적 항체를 생성시키는 단계; 및 (c) 상기 생성된 환자 특이적 항체를 정제하여 회수하는 단계를 포함하는 환자 특이적 항체의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 환자 특이적 뮤턴트 루테리알 또는 상기 뮤턴트 루테리알의 파열에 의해 수득되는 미세물질에 특이적으로 결합하는 항체는 환자 각각에 가장 적합하면서도 부작용을 유발하지 않고, 우수한 치료 효과를 기대할 수 있다.

도 1은 환자에 따라 치료제의 치료 효과가 상이함을 보여주는 근거를 설명하는 모식도이다.
도 2는 루테리알의 life cycle을 개략적으로 도시하여 나타낸 것이다.
도 3은 루테리알 내부에 RNA가 함유되어 있는지 여부를 분석한 바이오 아날라이저 결과이다 (1: control; 2: 100~200nm 루테리알; 3: 200~400nm 루테리알).
도 4는 루테리알 내부에 DNA가 함유되어 있는지 여부를 분석한 바이오 아날라이저 결과이다 (왼쪽: control; 오른쪽: 루테리알).

본 발명은 일 관점에서, 환자 유래 뮤턴트 루테리알 또는 상기 뮤턴트 루테리알의 파열(bursting)에 의해 수득되는 미세물질에 결합하는 환자 특이적 항체에 관한 것이다.

본 발명은 다른 관점에서, 환자 유래 뮤턴트 루테리알에 함유되어 있는 항원성 물질에 특이적으로 결합하는 환자 특이적 항체에 관한 것이다.

"루테리알"은 내부에 RNA와 DNA를 갖춘 모든 동물에 존재하는 생명인자 (living organism)로서, 바이러스와 유사한 정도부터 약 500nm까지(정상 피션단계 50~500nm/ 비정상 퓨전단계 800nm이상)의 크기를 가지는 미세물질을 본 발명자가 명명한 것이다.

상기 루테리알은 DNA와 RNA를 모두 포함하며(도 3 및 도 4), 운동성을 가진다는 점에서 엑소좀(exosome)이나 미소포(microvesicle)와는 구별된다. 미토콘드리아는 야누스 그린 B (Janus green B) 및 형광염색인 로다민123(Rhodamine123), 미토트랙커(Mitotracker), 아크리딘 오렌지(Acridine Orange), 및 DAPI에 의해 발색이 확인되는데, 상기 루테리알도 미토콘드리아와 동일한 염색약에 의해 발색이 확인되며, 미토콘드리아와 유사하게 이중막을 가진 막구조로서 내부 크리스테(cristae) 구조를 완성하지 않은 상태의 구조를 가지고, 미토콘드리아와 동일한 레이저 파장 범위에서 관찰된다는 점에서 "유사 미토콘드리아", "미토콘드리아 유사체" 혹은 "미토콘드리아 전구체 (proto-mitochondria)"라고도 지칭할 수도 있다.

인간을 포함한 동물의 경우에는 혈액, 타액, 림프관, 정액·질액, 모유(특히, 초유), 제대혈, 뇌세포, 척수, 골수에 존재하며 "루테리알"로 지칭된다.

정상적인 루테리알의 크기는 50~200nm이고, 변이 루테리알은 융합하여 변이체를 형성하여 수십 마이크로미터 크기를 가진다. 루테리알은 mRNA와 miRNA를 포함하는(드물게, DNA도 포함) 미성숙 미토콘드리아 단계를 지칭하는 것일 수 있다. 루테리알은 소화액에서 녹지 않고 혈액에 유입되는 특징이 있으며, 시그널링, 세포 분화, 세포 사멸 뿐 아니라 세포 사이클 및 세포 성장의 조절과도 관련이 있을 것으로 예상된다.

본 발명자들은 그 중에서도 혈액유래 루테리알이 암의 진단에 밀접한 관련이 있음을 발견한 바 있다(대한민국 특허출원 10-2013-0082060호). 구체적으로, 정상적인 투테리알 및 루테리온은 암세포의 성장을 막고, 세포를 건강한 면역체계로 되돌리는 역할을 하는 것으로 예상되는데, 그 역할은 유전자를 정상화시키는 가능성을 지닌 RNAi(RNA interference; RNA 간섭)에 의해 수행되는 것으로 추정된다.

정상 루테리알 중 200nm 이하, 예를 들어 50-150nm의 크기를 가지는 루테리알은 암세포의 성장을 막고, 세포를 건강한 면역체계로 되돌리는 역할을 하는 것으로 예상되며, 그 역할은 유전자를 정상화시키는 가능성을 지닌 RNAi(RNA interference; RNA 간섭)에 의해 수행된다. 정상 루테리알의 RNA 내에 있는 정보체계가 정상궤도에서 벗어나 이상 질환을 유발하는 단백질을 생산하도록 지시할 경우 이를 인위적으로 간섭하여 암 등의 질병 발생을 억제하도록 작용하며, 크기가 200-500nm 이상으로 성숙하였을 때에는 에너지 대사에도 에너지 대사에도 관여하며, 특정한 파장을 조사(照射)하였을 때, 반응발현으로 빛 에너지 증폭 기능을 하며, 엽록체처럼 반응하는 것으로 확인된다. 이에, 이러한 루테리알이 정상적인 역할을 수행하지 못할 경우에는 항상성 및 ATP 생산에 결정적인 장애를 유발하여, 호흡 및 에너지 대사 모두에 질병을 야기시킬 수 있다.

이와 반대로, 정상적인 역할을 수행하지 못하는 루테리알은 크기나 형태가 다양하고, 정상 루테리알과는 상이한 생태 및 특성을 보인다. 구체적으로, 정상적인 루테리알의 경우는 이중포자 (double-spore)를 형성한 후 더 이상 증식하지는 않으나, 암 환자나 만성 질병을 가지는 환자의 기 배출된 체액에서 발견되는 돌연변이 루테리알의 경우에는 줄기세포와 유사하게 무한히 증식하는 특성을 가져 600-800nm 이상부터, 200μm(200,000nm) 이상의 크기를 가진다. 또한, 바이러스와 유사하게 적혈구, 백혈구, 혈소판 등에 침입하여 생장하거나, 다른 루테리알과 응집하는 특성을 보인다. 이러한 루테리알을 정상 루테리알과 구분하기 위하여 "돌연변이 루테리알", "뮤턴트 루테리알" "Mutant Luterial"이라고 호칭한다.

상기 뮤턴트 루테리알이 환자 내에서 지속적으로 융합 또는 응집하여 정상 루테리알과 달리 형태가 변형되거나 크기가 커질 수 있으며, 형태 또는 크기가 변화된 뮤턴트 루테리알이 지속적 팽창 후 파열하면 약 100-400nm의 크기를 가지는 미세물질이 수득될 수 있다(도 2). 이러한 미세물질로부터 암 줄기세포가 형성될 수 있으며, 이후 암 줄기세포는 암 세포로 발달될 수 있다 (도 2).

"암 줄기세포"는 암세포 내에 따로 존재하는 암을 일으키는 세포로, 비교적 무한히 자기-재생할 수 있으면서도 더욱 성장한 종양 세포로 발달될 수 있는 줄기세포의 특성을 보유하고 있고, 이러한 세포들이 암을 발생시킬 수 있다. 이러한 암 줄기세포를 제거하는 경우 암의 완전한 제거가 가능하여 전이암이나 재발암의 치료에 활용될 수 있다.

정상 루테리알과 뮤턴트 루테리알은 크기, 형태 및 나노 트랙킹 속도가 상이할 수 있다. 예를 들어, 정상 루테리알은 이중포자 (double-spore)를 형성한 후 더 이상 증식하지는 않으나, 뮤턴트 루테리알은 줄기세포와 유사하게 무한히 증식하는 특성을 가져 200 nm 이상부터, 600-800nm 이상, 200μm(200,000nm) 이상의 크기를 가진다. 또한, 바이러스와 유사하게 적혈구, 백혈구, 혈소판 등에 침입하여 생장하거나, 다른 정상 또는 뮤턴트 루테리알과 융합(fusion) 또는 응집(coagulation)하는 특성을 보인다.

더욱이, 정상 루테리알은 원형 또는 타원형의 구조를 가지나, 뮤턴트 루테리알은 편모형, 미세관형, 매스형, 로드형 또는 복합형을 나타내며, 정상 루테리알은 나노 트랙킹 속도가 12nm/sec 이상이나, 뮤턴트 루테리알은 정상 루테리알에 비해 운동성이 감소하여 나노 트랙킹 속도가 11nm/sec에서 0.5nm/sec 내지 운동성이 없는 0 nm/sec을 나타낼 수 있다.

이러한 루테리알은 다음의 특성을 가지는 것을 확인하였다:

(a) 정상의 경우, 적혈구보다 작은 크기(50~200nm)의 원형 내지 타원형으로, 운동성이 있음;

(b) 핵산 함유;

(c) 면역화학형광염색시 미토콘드리아와 유사한 반응을 나타냄;

(d) 퓨전(fusion) 및/또는 피전(fission) 생태양식을 나타냄;

(e) 퓨전이 없을 경우에는 크기가 300nm까지 성숙하고, DNA 함유 유사 미토콘드리아로 성숙하며, SEM 또는 TEM 전자현미경사진상에서 미토콘드리아와 유사한 구조를 나타냄;

(f) 퓨전이 발생할 경우에는 수천nm까지 크기가 커짐;

(g) 환자 유래의 경우, 정상 유래보다 크기(장직경 500nm 이상)가 크고, 형태가 불균일한 변이 루테리알 발생; 및

(h) 엑소좀과는 다른 빛 반응을 나타냄.

추가로, 다음의 특성 중 하나 이상을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다:

(i) 자가형광 (autofluorescence)을 나타냄;

(j) 200~400nm 크기에서 ATP를 생산함;

(k) 부착성이 있음;

(l) 이중막 구조;

(m) 특정 조건에서 변이 루테리알은 bursting되고, bursting 이후에는 stemness를 가짐; 및

(n) p53 유전자 및 텔로미어 조절기능을 가짐.

이와 관련하여, 루테리알은 예를 들어 환자에서 기 배출된 체액에서 분리될 수 있고, 본 발명에서 사용된 "환자에서 기 배출된 체액"은 혈액, 타액, 림프관, 점액, 질액, 모유 (초유), 제대혈, 뇌세포, 척수 또는 골수일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

일 실시예에서, 환자로부터 용이하게 수득 가능한 혈액으로부터 루테리알을 분리할 수 있으며, 혈액에 포함된 루테리알은 예를 들어 하기의 단계를 통해 분리될 수 있다.

혈액으로부터 루테리알을 분리하는 방법은 혈액에서 혈소판 및 혈소판 이상의 크기를 가지는 혈액 유래 물질을 분리하는 제1분리단계; 상기 혈소판 및 혈소판 이상의 크기를 가지는 혈액 유래 물질을 분리시킨 혈액을 원심분리하는 제2분리단계; 상기 원심분리에 의해 수득한 상등액으로부터 루테리알을 분리하는 제3분리단계; 및 상기 분리된 루테리알을 세정하는 단계를 포함할 수 있다.

더욱 자세하게, 상기 제1분리단계는 환자에게서 혈액을 채취하고 0.8-1.2μm의 공극을 가지는 필터를 통과시켜 필터링되지 않은 물질은 분리하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 제2분리단계는, 1200~5000rpm에서 5~10분간 반복적으로 원심분리하여 엑소좀(exosome)과 같은 일반 마이크로 베지클을 제거하여 상등액을 획득하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 제3분리단계는, 원심분리를 통해 수득한 상등액에 적외선을 조사하여 운동성을 가지며 모여드는 루테리알 입자를 피펫을 이용하여 분리하는 단계를 포함할 수 있다. 루테리알은 자가형광 및 운동성의 특성을 가지므로 상기와 같이 적외선을 조사시 상등액으로부터 루테리알 입자를 확인할 수 있다. 이때, 암시야 현미경 또는 공초점 현미경으로 움직이는 루테리알 입자를 확인하면서 피펫을 사용하여 분리할 수 있다. 상기 제3단계에서 분리된 루테리알을 50nm 직경의 공극을 구비하는 필터를 통과시켜 필터링되지 않은 부분만 PBS로 세척하여 루테리알을 수득할 수 있다.

루테리알은 장직경 50nm 이상의 크기를 가지므로 상기 과정을 통하여 루테리알 이외의 혈액 유래 미세 물질은 제거할 수 있다. 상기 과정에 의해 장직경 50-800nm인 루테리알을 수득할 수 있으며, 이는 암시야 현미경 또는 공초점 현미경을 통하여 관찰이 가능하다. 상기 수득한 루테리알은 각각 200nm, 400nm, 600nm, 800nm 및 1000nm 필터를 순차적으로 이용하여 크기에 따라 50-200nm (발생기)/ 200-400nm (성숙기)/ 400-600nm (분열기)/ 600-800nm (과분열기)로 구분할 수 있다.

건강한 사람 내의 정상적인 루테리알의 경우에는 단순히 이중포자(double-spore)를 형성(fission)할 뿐이지만, 만성질병이나 암 환자 내의 루테리알(변이 루테리알)의 경우에는 루테리알끼리 융합(fussion) 또는 응집(coagulation)하거나 폭발(bursting)하여 적혈구나 암세포 등의 세포에도 부착하여 그 형태 및 크기가 정상적인 루테리알과는 달리 비정상적으로 거대해지는 특징이 있다. 변이 루테리알은 부착 성향이 높아, 상기와 같은 cycle에 의하여 융합(fusion)은 더욱 가속화되어 그 크기가 약 600nm 이상으로 커지며, 그 중에서 어떤 것들은 수백μm, 예를 들어 200μm(200,000nm) 이상의 크기를 가지기도 한다.

경우에 따라서, 환자에서 기 배출된 체액으로부터 분리된 루테리알은 생체 외에서는 빠른 시간 내에 용해되어 소멸되거나 형태가 변하는 특징이 있어 관찰 자체가 쉽지 않으므로, 특정한 크기 (500nm) 이상이 되지 않도록 배양할 수 있다.

구체적으로, 상기 루테리알에 수분을 첨가하고 IR광선 조사하에 18~30℃(바람직하게 20~25℃)에서 배양할 수 있다.

상기 배양시 첨가되는 수분은 식염수 또는 PBS 용액일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 배양 전의 혈액 유래 루테리알은 상기 분리방법에 따라 수득할 수 있으며, 그 크기가 50~200nm인 것을 사용할 수 있다. 상기 배양 방법에 따라 배양된 혈액 유래 루테리알의 배양 후 크기는 300~500nm일 수 있다. 이때, 현미경으로 관찰하면서 루테리알의 크기가 500nm을 넘지 않도록 할 수 있으며, 배양이 끝나면 크기별로 분류하여 영하 80℃로 냉각하여 보관하거나 질소로 충진하여 보관 또는 영상에서 보관할 수 있으며 보관시 보존제를 첨가할 수 있다.

상기와 같이 배양된 루테리알은 그 형태나 활성의 변화 없이 일정기간 특성에의 변화 없이 보관이 가능하여 루테리알을 이용한 질병의 진단 및 예후 예측에 효과적으로 활용될 수 있어 유용하다.

"루테리알 특성에의 변화 없이"는 루테리알의 형태(morphology)나 크기(size)가 배지 조성물에서 배양기 전의 상태와 거의 유사하게 그 형태를 유지하는 것을 의미하는 것이다. 또한, 나노트랙킹 속도와 같은 루테리알의 운동성 등의 활성이, 배양하기 전의 상태와 유사한 값을 유지하는 것을 의미하는 것이다.

루테리알은 50-200nm/200-400nm/400-600nm/600-800nm의 4종류로 분류될 수 있으며, 4종은 각각 발생기-성숙기-분열기-과분열기로 구분될 수 있다. RNAi 특성 연구에는 발생기 크기 50-200nm나 성숙기 200-400nm를 사용하는데 시험기간이 길 경우 발생기의 루테리알을 사용할 수 있으며, 미토콘드리아 특성 연구에는 400-600nm, 질병 예측 연구나 예후 판단에는 600-800nm의 과성숙 루테리알을 이용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 "항체"는 상기 뮤턴트 루테리알 또는 상기 뮤턴트 루테리알의 파열에 의해 수득되는 미세물질을 항원으로 인식하는 결합 분자이고, "환자 유래 뮤턴트 루테리알에 함유되어 있는 항원성 물질에 특이적으로 결합하는 항체"는 뮤턴트 루테리알에 함유되어 있는 단백질, 폴리펩티드, 다당류 또는 이들의 변이체와 같은 물질을 항원으로 인식하는 결합 분자를 의미한다.

상기 항체는 단클론항체 (예를 들어, 면역글로불린 Fc 구역을 갖는 전장 항체), 다중에피토프 특이성을 갖는 항체 조성물, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 디아바디 (diabody) 및 단일쇄 분자뿐만 아니라 항체 단편 (예를 들어, Fab, F(ab')2 및 Fv)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

기본 4쇄 항체 단위는 2개의 동일한 경쇄 (L) 및 2개의 동일한 중쇄 (H)로 이루어진 이종 4량체 당단백질이다. IgM 항체는 J 사슬로 불리는 추가의 폴리펩티드와 함께 5개의 기본 이종 4량체 단위로 이루어지고 10개의 항원 결합 부위를 포함하는 한편, IgA 항체는 중합화하여 J 사슬과 조합으로 다가 조립체를 형성할 수 있는 2-5개의 기본 4쇄 단위를 포함한다. IgG의 경우에, 4쇄 단위는 일반적으로 약 150kDa이다. 각각의 L 사슬은 하나의 공유 디술피드 결합에 의해 H 사슬에 연결되는 한편, 2개의 H 사슬은 H 사슬 이소형에 따라 하나 이상의 디술피드 결합에 의해 서로 연결된다. 각각의 H 및 L 사슬은 또한 규칙적으로 이격된 사슬 내 디술피드 다리를 갖는다. 각각의 H 사슬은 N-말단에서 가변 도메인 (VH)을 갖고, 이어서 각각 α 및 γ 사슬에 대해 3개의 불변 도메인 (CH) 및 μ 및 ε 이소형에 대해 4개의 CH 도메인을 갖는다. 각각의 L 사슬은 N-말단에서 가변 도메인 (VL)을 갖고, 이어서 그의 다른 단부에서 불변 도메인을 갖는다. V_L은 V_H와 정렬되고, C_L은 중쇄의 제1불변 도메인 (CH₁)과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 사이의 계면을 형성하는 것으로 생각된다. V_L은 V_H의 짝지음은 함께 단일 항원 결합 부위를 형성한다.

L 사슬은 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여 카파 및 람다로 불리는 2개의 분명하게 구분되는 종류 중 하나로 지정될 수 있다. 중쇄 (CH)의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체는 상이한 클래스 또는 이소형으로 지정될 수 있다. 5가지 클래스의 항체, 즉, 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 칭하는 중쇄를 갖는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재한다. γ 및 α 클래스는 CH 서열 및 기능에서 비교적 적은 차이에 기초하여 서브클래스로 추가로 나누어지고, 예를 들어 인간은 서브클래스: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2를 발현한다.

항체의 "가변 구역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노-말단 도메인을 나타낸다. 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 "VH" 및 "VL"로서 칭할 수 있다. 이들 도메인은 일반적으로 항체의 최대 가변 부분이고 (동일한 클래스의 다른 항체에 비해), 항원 결합 부위를 함유한다.

"가변"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체들 사이에서 서열이 크게 상이함을 나타낸다. V 도메인은 항원 결합을 매개하고, 그의 특정 항원에 대한 특정 항체의 특이성을 규정한다. 그러나, 가변성은 가변 도메인의 전체 범위에 걸쳐 균등하게 분포되지 않는다. 대신에, 가변성은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 모두에서 초가변 구역 (HVR)으로 불리는 3개의 세그먼트에 집중된다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분은 프레임워크 구역 (FR)으로 불린다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 루프 연결부를 형성하고, 일부 경우에 베타-시트 구조의 일부를 형성하는 3개의 HVR에 의해 연결된, 주로 베타-시트 형태를 취하는 4개의 FR 구역을 각각 포함한다. 각 사슬 내의 HVR은 FR 구역에 의해 매우 근접하게 함께 유지되고, 다른 사슬의 HVR과 함께 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다. 불변 도메인은 항원에 대한 항체의 결합에 직접 관여하지 않지만, 다양한 효과기 (effector) 기능, 예를 들어 항체 의존성 세포독성에서 항체의 참여를 나타낸다.

"초가변 구역," "HVR," 또는 "HV"는 서열에서 초가변이고/이거나 구조상 규정된 루프를 형성하는 항체 가변 도메인의 구역을 나타낸다. 일반적으로, 항체는 6개의 HVR; 즉 VH 내에 3개 (H1, H2, H3), 및 VL 내에 3개 (L1, L2, L3)를 포함한다. 천연 항체에서, H3 및 L3이 6개의 HVR의 대부분의 다양성을 보이고, 특히 H3이 항체에 우수한 특이성을 부여할 때 특유한 역할을 수행하는 것으로 생각된다. 실제로, 중쇄만으로 구성된 천연 발생 카멜리드 (camelid) 항체가 경쇄의 부재 하에 기능을 보이고 안정하다.

"프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 HVR 잔기 이외의 다른 가변 도메인 잔기이다. "카바트에서와 같은 가변 도메인 잔기 넘버링" 또는 "카바트에서와 같은 아미노산 위치 넘버링" 및 그의 변형은 카바트 등의 상기 문헌에서 항체 편집 (compilation)의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 사용된 넘버링 시스템을 나타낸다. 잔기의 카바트 넘버링은 항체 서열의 상동성 구역을 표준 카바트 넘버링된 서열과 정렬시킴으로써 주어진 항체에 대해 결정될 수 있다.

"단클론항체"는 실질적으로 동질의 항체군으로부터 수득된 항체를 의미하고, 적은 양으로 존재할 수 있는 자연 발생 가능한 변이를 제외하고 개개의 항체가 동일한 것을 의미한다. 단클론항체는 매우 특이적이고, 단일 항원 사이트에 결합한다. 더욱이 상이한 에피토프에 대한 다른 항체를 포함하는 다클론항체와 달리, 단클론항체는 항원의 단일 에피토프에 결합한다. 특이성 이외에도, 단클론항체는 기타 다른 항체의 의한 오염 없이 하이브리도마 배양에 의해 합성될 수 있다는 점에서 이점이 있다. 단클론항체는 예를 들어, 융합세포법(Kohler et al., Nature, 256:495, 1975)에 의해 제조되거나, 재조합 DNA법에 의해 제조될 수 있으며, 기타 단클론항체를 제조할 수 있는 방법이라면 모두 포함될 수 있다.

"전장 항체", "무손상 항체" 또는 "전체 항체"는 항체 단편에 반대되는, 그의 실질적으로 무손상 형태의 항체를 나타내도록 상호 교환 가능하도록 사용된다. 구체적으로, 전체 항체는 Fc 구역을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 갖는 것을 포함한다. 불변 도메인은 천연 서열 불변 도메인 (예를 들어, 인간 천연 서열 불변 도메인) 또는 그의 아미노산 서열 변이체일 수 있다.

"항체 단편"은 무손상 항체의 일부, 바람직하게는 무손상 항체의 항원 결합 및/또는 가변 구역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')₂ 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 단일쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 이중특이적 이상의 다중특이적 항체를 포함한다.

항체를 파파인 소화시키면 "Fab" 단편으로 불리는 2개의 동일한 항원 결합 단편, 및 나머지 "Fc" 단편 (이 명칭은 쉽게 결정화하는 그의 능력을 반영한다)을 생성시킨다. Fab 단편은 H 사슬의 가변 구역 도메인 (V_H), 및 하나의 중쇄의 제1불변 도메인 (CH₁)과 함께 전체 L 사슬로 이루어진다. 각각의 Fab 단편은 항원 결합에 관하여 1가이고, 단일 항원 결합 부위를 갖는다. 항체를 펩신 처리하면 상이한 항원 결합 활성을 갖는 2개의 디술피드 연결된 Fab 단편에 대략 상응하는 단일의 큰 F(ab')₂ 단편을 생성시키고, 여전히 항원에 가교결합할 수 있다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 CH₁ 도메인의 카르복시 말단에서 몇 개의 잔기가 추가된 점에서 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 본원에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리 티올기를 보유하는 Fab'의 명칭이다. F(ab')₂ 항체 단편은 본래 그들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 한쌍의 Fab' 단편으로서 생산되었다. 항체 단편의 다른 화학 커플링도 당업계에 공지되어 있다.

"Fc 단편"은 디술피드에 의해 유지되는 두 H 사슬의 카르복시-말단 부분을 포함한다. 항체의 효과기 기능은 Fc 구역 내의 서열에 의해 결정되고, 이 구역은 또한 특정 종류의 세포 상에서 발견되는 Fc 수용체 (FcR)에 의해 인식된다.

"Fv"는 완전한 항원-인식 및 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 상기 단편은 강한 비공유 회합 현상에서 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 구역 도메인의 이량체로 이루어진다. 이들 2개 도메인의 접힘은 항원 결합을 위한 아미노산 잔기에 기여하고 항체에 항원 결합 특이성을 부여하는 6개의 초가변 루프 (각각 H 및 L 사슬로부터 3개의 루프)를 생성시킨다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3개의 HVR만 포함하는 Fv의 절반)이라도 전체 결합 부위보다 더 낮은 친화도이지만 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.

"단일쇄 Fv" (또한 "sFv" 또는 "scFv"로 약칭함)는 VH 및 VL 항체 도메인을 포함하는 항체 단편이다. 바람직하게는, sFv는 sFv가 항원 결합을 위한 목적하는 구조를 형성할 수 있도록 하는, V_H 및 V_L 도메인 사이의 링커 (linker)를 추가로 포함한다.

항체의 "기능적 단편"은 무손상 항체의 일부, 예를 들어 일반적으로 무손상 항체의 항원 결합 또는 가변 구역, 또는 변경된 FcR 결합 능력을 보유하거나 갖는 항체의 F 구역을 포함한다. 항체 단편의 예는 선형 항체, 단일쇄 항체 분자 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.

"디아바디(diabody)"는 V 도메인의 사슬간이 아니라 사슬내 짝지음이 달성되어 2가 단편, 즉, 2개의 항원 결합 부위를 갖는 단편을 생성하도록, V_H 및 V_L 도메인 사이에 짧은 링커 (약 5-10개 잔기)를 사용하여 sFv 단편을 구성함으로써 제조된 작은 항체 단편을 나타낸다. 이중특이적 디아바디는 2개의 교차(crossover) sFv 단편의 이종 2량체이고, 여기서 2개의 항체의 V_H 및 V_L 도메인은 상이한 폴리펩티드 사슬 상에 존재한다.

단클론항체는 구체적으로 중쇄 및/또는 경쇄의 일부는 특정 종에서 유래하거나 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 한편, 사슬의 나머지는 다른 종으로부터 유래하거나 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체 뿐 아니라 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 그러한 항체의 단편을 포함한다. "인간화 항체"는 "키메라 항체"의 하위세트로 사용된다.

비인간 (예를 들어, 쥐) 항체의 "인간화" 형태는 비인간 항체 유래 최소의 서열을 포함하는 키메라 항체, 쇄 또는 이의 단편(예를 들어, Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ 또는 항체의 기타 항원 결합 서열)로, 대부분이 인간 항체인 인간화 항체로, 공여자의 CDR (complementarity determining region) 잔기가 목적하는 특이성, 친화성 또는 성능을 가진 마우스, 랫 또는 토끼와 같은 비인간 종(공여자 항체)의 CDR 잔기에 의해 교체된다. 예를 들어, 인간 항체의 Fv FR(framework region)의 잔기가 상응하는 비인간 잔기에 의해 교체된다. 또한, 인간화 항체는 수여자 항체 또는 도입된 CDR/FR 서열 중 어느 것에서도 발견되지 않는 서열을 포함할 수 있다. 항체 성능을 더욱 정제하고 최적화하기 위해 이러한 변형이 적용될 수 있다. 일반적으로 인간화 항체는 실질적으로 적어도 하나 통상 2 이상의 가변 영역 전부를 포함할 것이고, 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 부위는 비인간 항체에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 부위는 인간 항체 서열이다. 인간화 항체는 선택적으로 인간 항체 유래 불변영역 (Fc)의 적어도 일부를 포함한다.

인간화 항체를 제작하는 방법은 공지되어 있으며, 비인간 소스로부터 도입된 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 가진다. 비인간 아미노산 잔기는 가변 도메인으로부터 유래하고 있다. 인간화는 인간 항체의 배열이 뮤린 CDR 또는 CDR 배열에 의해 치환됨으로써 이루어진다. 상기 인간화는 인간 항체의 FR에 동물로부터 생산된 항체의 CDR 서열을 이식(grafting)하는 CDR-이식(CDR grafting) 단계 및 추가적으로 친화도(affinity)를 높이거나 면역원성(immunogenecity)을 저하시키기 위해, 하나 이상의 아미노산 서열을 치환, 삽입, 결실하는 CDR-워킹(CDR-walking)을 통해 이루어질 수 있다.

경우에 따라서, 인간화 항체는 CDR 잔기 뿐 아니라, 몇몇 FR 잔기가 뮤린 항체의 상응하는 부위 유래의 잔기로 치환된 항체이다. 인간화 항체를 제작하는 경우 이용되는 L사슬과 H사슬의 양쪽 모두에서 인간 가변영역의 선택은 항원성을 감소하는데 있어서 매우 중요하다. 인간화 항체는 적어도 하나의, 일반적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비인간 항체의 것에 대응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 구역은 인간 항체 서열의 것이지만, FR 구역은 항체 성능, 예를 들어 결합 친화도, 이성질체화, 면역원성 등을 개선시키는 하나 이상의 개별적인 FR 잔기 치환을 포함할 수 있다. FR에서 상기 아미노산 치환의 수는 일반적으로 H쇄에서 6개 이하, L쇄에서 3개 이하이다. 또한, 인간화 항체는 임의로 적어도 일부의 항체 불변 영역 (Fc), 일반적으로 인간 항체의 불변 영역을 포함할 것이다.

인간화에 대한 대안으로서, 인간 항체가 생성될 수 있다. "인간 항체"는 인간에 의해 생산되거나, 임의의 인간 항체 제조 기술을 사용하여 제조된 항체에 대응하는 아미노산 서열을 가지는 항체이다. 상기 인간 항체의 정의는 비인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 특히 배제한다. 인간 항체는 파지 디스플레이 라이브러리를 포함하여 당업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 인간 항체는 항원 시험 접종에 반응하여 항체를 생산하도록 변형되었지만, 그의 내인성 로커스가 기능하지 않는 트랜스제닉 동물, 예를 들어 면역처리된 제노마우스 (xenomouse)에 항원을 투여하여 만들어질 수 있다.

뮤턴트 루테리알/미세물질 또는 이의 특정 에피토프에 "특이적으로 결합하는" 또는 "특이적인" 항체는 임의의 다른 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프에 실질적으로 결합하지 않으면서 뮤턴트 루테리알/미세물질 또는 이의 특정 에피토프에만 결합하는 항체이다.

본 발명에 따른 항체는 (a) 환자 유래 뮤턴트 루테리알 또는 상기 뮤턴트 루테리알의 파열에 의해 수득되는 미세물질을 인간을 제외한 동물에 도입하여 환자 특이적 항체를 생성시키는 단계; 및 (b) 상기 생성된 환자 특이적 항체를 회수하는 단계를 거쳐 환자 맞춤형 항체를 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 방법에 따른 항체는 항원, 예를 들어 환자 유래 뮤턴트 루테리알 또는 상기 뮤턴트 루테리알의 파열에 의해 수득되는 미세물질을 항원보강제 (adjuvant)와 함께 복수의 피하 또는 복강내 투여하여 생성될 수 있다. 면역화될 종, 예를 들어 마우스, 랫 또는 토끼에 면역성이 있는 단백질, 예를 들어 키홀-림펫 헤모사이아닌 (keyhole limpet hemocyanin), 세럼 알부민(serum albumin), 보빈 티로글로불린(bovine thyroglobulin), 이관능 또는 유도체화 시약 예를 들어 말레이미도벤조일 설포숙신이미드 에스테르(시스테인 잔기를 통해 컨쥬게이션), N-하이드록시숙신이미드 (라이신 잔기로 컨쥬게이션), 글루타르알데히드, 숙신산 무수물, SOCl_2, 또는 R¹N=C=NR, 여기서 R 및 R¹은 서로 다른 알킬기를 사용한 소이빈 트립신 저해제를 상기 항원에 컨쥬게이션하는 것도 항체 제조에 유용할 수 있다.

동물은 1 mg 또는 1 μg의 펩타이드 또는 컨쥬게이트(각각 토끼 또는 마우스용)를 3 부피의 프로인트 완전 항원보강제(Freund`s complete adjuvant, FCA)와 함께 혼합하여 항원, 면역성의 컨쥬게이트 또는 유도체에 대하여 면역화될 수 있다. 1달 후 동물은 여러 사이트에서 피하 주사에 의해 프로인트 완전 항원보강제 중 원래 양의 1/5~1/10에 해당하는 펩타이드 또는 컨쥬게이트로 부스팅 된다. 7-14일 후 동물의 혈액을 채취하고, 항체 타이터를 위해 세럼을 어세이한다. 동물들은 타이터 평형(plateaus)까지 부스팅된다. 바람직하게, 동물들은 동일한 항원이나 상이한 단백질 및/또는 상이한 크로스 링크 제제를 통해서 컨쥬게이션된 컨쥬게이트로 부스팅된다. 컨쥬게이트는 또한, 단백질 융합과 같은 재조합 세포 배양에 의해 제조될 수 있다. 또한, 알룸(alum)과 같은 응집제도 면역 반응 향상에 적합하게 사용된다.

또한, 본 발명에 따른 항체는 (a) 환자 유래 뮤턴트 루테리알 또는 상기 뮤턴트 루테리알의 파열에 의해 수득되는 미세물질을 숙주세포에 도입하는 단계; (b) 상기 숙주세포를 배양하여, 환자 특이적 항체를 생성시키는 단계; 및 (c) 상기 생성된 환자 특이적 항체를 회수하는 단계를 거쳐 환자 맞춤형 항체를 제조할 수도 있다.

이러한 방법을 통해 생성된 항체, 예를 들어 단클론항체는 실질적으로 균질인 항체의 집단으로 별개의 항체의 혼합물은 아닌 항체의 특성을 나타낸다. 단클론항체는 융합세포법을 이용하여 제작되거나 재조합 DNA법에 따라 제작될 수 있다.

융합세포법에서는 마우스나 햄스터와 같은 다른 적절한 호스트 동물이 면역화되어 면역화에 이용된 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 또는 생산 가능한 림프구를 유도해낸다. 경우에 따라서, 림프구는 in vitro에서 면역화될 수 있다. 림프구는 이후 폴리에틸렌글리콜(PEG)과 같은 적합한 융합제를 사용하여 골수종 세포와 융합됨으로써, 하이브리도마 세포가 형성될 수 있다. 이렇게 제조된 하이브리도마 세포는 비융합 원 골수종 세포의 성장 또는 생존을 저해하는 하나 이상의 물질을 포함한 배양 배지에 접종되어 자랄 수 있다. 예를 들어, 원 골수종 세포가 HGPRT(hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase) 효소가 결핍된 경우, 하이브리도마를 위한 배양 배지는 전형적으로 HGPRT 결실 세포의 성장을 방해하는 물질인 히폭산틴, 아미노프테린 및 티미딘(HAT 배양)을 포함할 것이다.

바람직한 골수종 세포는 효율적으로 융합하여, 선택된 항체 생산 세포에 의한 항체의 안정적 고레벨의 생산을 유지하고, HAT 배양지와 같은 배양지에 감수성인 물건이다. 이들 중에서 바람직한 골수종 세포계는 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양 유래와 같은 뮤린 골수종주 및 SP-2세포이다. 사람 골수종 및 마우스-사람 헤테로 골수종 세포계 또한 인간 단일 클론 항체의 생산을 위해서 사용될 수 있다.

항원에 대한 단클론항체의 생산을 위해 하이브리도마 세포가 자라는 배양 배지를 어세이할 수 있다. 바람직하게, 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 단클론항체의 결합 특이성은 면역침강법, 방사성면역검정법(RIA) 또는 ELISA와 같은 in vitro 결합 어세이에 의해 측정될 수 있다. 또한, 단클론항체의 친화도는 Scatchard 분석에 의해 측정될 수 있으며, Scatchard 분석에 의해 affinity의 종류에 따른 binding site 개수에 대한 정보를 확인할 수 있다.

하이브리도마 세포가 바람직한 특이성, 어피니티 및/또는 활성의 항체를 생산하는지 여부를 동정한 후, 클론을 한계 희석법에 의해 서브 클론화하고, 표준적인 방법(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103(Academic Press, 1986))에 의해 성장시킨다. 이를 위해 적당한 예를 들면 D-MEM 또는 RPMI-1640 배양 배지를 사용할 수 있다. 경우에 따라서, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수의 종양과 같이 in vivo로 성장할 수 있다.

일 실시예에서, 상기 뮤턴트 루테리알 또는 상기 뮤턴트 루테리알의 파열에 의해 수득되는 미세물질에 대한 단클론항체를 코드하는 DNA가 시퀀싱된 경우 예를 들면, 뮤린 항체의 중쇄와 경쇄를 코드하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 이용하여 서열이 확인된 경우, DNA를 발현 벡터에 도입하고, 재조합 숙주세포에 트랜스펙션하여 단클론항체를 수득할 수 있다.

다른 실시예에서, 환자 유래 뮤턴트 루테리알 또는 상기 뮤턴트 루테리알의 파열에 의해 수득되는 미세물질을 숙주세포와 공배양할 수 있다. 공배양은 본 발명에서 분리된 환자 유래 뮤턴트 루테리알 또는 상기 뮤턴트 루테리알의 파열에 의해 수득되는 미세물질을 무혈청 배지(serum-free media)에서 사이토카인(cytokine) 또는 성장인자(growth factor) 등 기타 배양에 필요한 조성을 가진 배지에서 혼합 배양하는 형태일 수 있다.

상기 숙주세포는 인체형의 항체에 부착된 당사슬의 성분과 구조가 동일/유사한 항체를 생산할 수 있어야 하며, 이러한 조건을 만족할 수 있는 숙주세포는 T세포, HEK293, CHO, BHK, Sp2/0, 및 NS로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 바람직하게, 항체 생산에서 유효성 및 안정성이 입증된 CHO 세포일 수 있다. CHO 세포에서 생산된 항체의 당 구조는 마우스 유래의 세포들 NS0, SP2/0과 달리, 인체에서 면역반응을 일으키는 galactose-α(1,3)-galactose (α-gal) 항원이 부가되지 않기 때문이다. α-gal 항원은 무균돼지의 장기를 인간에게 이식하는 이종 이식에서 발생하는 초급성 면역 거부반응의 주요 원인으로 알려져 있으며, 마우스 유래 세포에서 생산된 당단백질들에 미량 부가될 수 있다.

경우에 따라서, 파지 디스플레이 기술을 사용하여 비면역처리된 공여자로부터 면역글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 인간 항체 및 항체 단편을 시험관 내에서 생성시킬 수 있다. 이 기술에 따라, 항체 V 도메인 유전자는 필라멘트성 박테리오파지, 예를 들어 M13의 주요 또는 마이너 코트 단백질 유전자 내로 클로닝되어 파지 입자의 표면 상에 기능적 항체 단편으로 디스플레이된다. 필라멘트성 입자는 파지 게놈의 단일가닥 DNA 카피를 포함하기 때문에, 항체의 기능성 특성에 기초하여 선택함으로써 목적하는 특성을 보이는 항체를 코딩하는 유전자의 선택이 가능하다. 따라서, 파지는 B 세포의 특성 일부를 모방한다. 파지 디스플레이는 다양한 포맷으로 수행할 수 있다. 파지 디스플레이에 V-유전자 세그먼트의 복수의 공급원이 사용될 수 있다.

"분리하여 회수된" 항체는 생산 환경 (예를 들어, 천연에서 또는 재조합 방식으로)의 성분으로부터 확인된 후, 독립된 형태로 분리 및/또는 회수된 항체이다. 바람직하게는, 분리하여 회수된 항체는 그의 생산 환경의 다른 모든 성분과의 회합이 존재하지 않는다. 생산 환경의 오염 성분, 예를 들어 재조합 형질감염된 세포로부터 생성되는 것은 대개 항체에 대한 연구, 진단 또는 치료 용도를 저해할 물질이고, 오염 성분으로 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비-단백질성 용질을 포함할 수 있다. 항체의 천연 환경의 적어도 하나의 성분도 존재하지 않을 것이기 때문에, 분리하여 회수된 항체는 재조합 세포 내의 계내 항체를 포함한다. 통상적으로, 분리하여 회수된 항체는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 수 있다.

상기 정제 단계에서는 예를 들면, 어피니티 크로마토그래피 (프로틴 A-세파로스, 히드록실 어퍼타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 이와 동등한 공지의 항체 정제법에 의해서 회수할 수 있다.

항체의 효과기 기능은 항체의 Fc 구역 (원 서열 Fc 구역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 구역)에 기인한 생물학적 활성을 의미하고, 항체의 이소형에 따라 상이할 수 있다. 항체 효과기 기능의 예는 보체 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체 의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC); 포식작용 및 B 세포 활성화 등을 포함할 수 있다.

"보체 의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재하에 뮤턴트 루테리알 또는 이로부터 유래되는 미세물질의 용해를 의미한다. 전통적인 보체 경로의 활성화는 보체 시스템의 제1성분 (C1q)이 동족 (cognate) 항원에 결합된 항체에 결합함으로써 개시된다.

"Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 구역에 결합하는 수용체를 설명한다. 바람직한 FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 또한, 바람직한 FcR은 IgG 항체 (감마 수용체)에 결합하는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 서브클래스의 수용체를 포함한다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제 수용체")를 포함하고, 이들은 유사한 아미노산 서열을 가진다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신계 활성화 모티프 (ITAM)를 포함한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신계 억제 모티프 (ITIM)를 포함한다.

예를 들어, Fc 구역의 특정 위치에서 "아미노산 변형"은 특정 잔기의 치환 또는 결실 또는 특정 잔기에 인접한 적어도 하나의 아미노산 잔기의 삽입을 의미한다. 특정 잔기에 "인접한" 삽입은 그의 1 또는 2개의 잔기 내의 삽입을 의미한다. 삽입은 특정 잔기의 N-말단 또는 C-말단에서 이루어질 수 있다. 본원에서 바람직한 아미노산 변형은 치환이다.

특정 항원에 "친화도"를 가지는 항체는 변경되지 않은 천연 항체에 비해 항원에 대한 항체의 친화도를 개선시키는, 그의 하나 이상의 HVR에 하나 이상의 변경을 갖는 항체이다. 한 실시태양에서, 친화도 성숙 항체는 표적 항원에 대한 나노몰 또는 심지어 피코몰의 친화도를 갖는다.

"B 세포"는 골수 내에서 성숙된 림프구이고, 나이브 B 세포, 기억 B 세포, 또는 효과기 B 세포 (혈장 세포)가 포함된다.

"항체 의존성 세포 매개 세포독성" 또는 ADCC는 특정 세포독성 세포 (예를 들어 천연 킬러 (NK) 세포, 호중구 및 대식세포)에 존재하는 Fc 수용체 (FcR)에 결합되어 분비된 Ig에 의해 상기 세포독성 세포가 루테리알 또는 이로부터 유래되는 미세물질에 특이적으로 결합한 후, 이를 세포독소로 사멸시키는 세포독성의 한 형태를 의미한다. 세포독성 세포를 무장시키고, 상기 메카니즘으로 표적을 치사시키는데 항체가 필요하다. 예를 들어, ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하고, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다.

또한, 대식세포와 함께, "T 세포" 역시 세포-매개성 면역에 관여하는 주요 세포 종류이다. T-림프구는 먼저 작은 펩티드로 절단된 후, 항원-제시 세포 (APC)로 불리는 제2 숙주세포의 표면 상에 나타나는 경우에만 외부 단백질을 인식한다. 항원 제시는 제시 세포의 표면 상의 주요 조직적합 복합체 (MHC) 단백질로 불리는 특이적 단백질에 부분적으로 의존한다. 이에, 세포-매개성 면역을 자극하기 위해, 외부 펩티드는 MHC 펩티드와 조합으로 T-세포에 제시되어야 하고, 상기 조합은 T-세포 수용체에 의해 인식된다. 2가지 중요한 T-세포 하위세트, 세포독성 T 림프구 (T_c 세포 또는 CTL) 및 헬퍼 T 세포 (T_H) 세포가 존재하는데, Tc 세포는 바이러스 방어에 중요하고, 특정 세포 표면 발현된 바이러스 펩티드를 인식함으로써 바이러스를 직접 치사시킬 수 있으며, T_H 세포는 다른 세포 종류의 증식, 성숙 및 면역 기능을 촉진하고, 예를 들어 B 세포, 대식세포 및 세포독성 T 세포의 활성을 제어하도록 림포카인 분비를 촉진한다.

일 실시예에서, 본 발명에 따른 항체는 뮤턴트 루테리알 또는 미세물질의 활성을 억제할 수 있다.

뮤턴트 루테리알 또는 미세물질의 "활성 억제"는 본 발명에 따른 항체가 뮤턴트 루테리알에 특이적으로 결합하여 뮤턴트 루테리알의 성숙, 융합(fusion) 또는 파열을 억제함으로써 뮤턴트 루테리알의 형태 변형 또는 크기 증가를 저해하거나, 뮤턴트 루테리알의 파열에 의해 수득되는 미세물질에 특이적으로 결합하여 상기 미세물질이 암 줄기세포화되는 것을 방지할 수 있음을 의미한다. 또한, 본 발명에 따른 항체는 뮤턴트 루테리알에 함유되어 있는 항원성 물질에 특이적으로 결합하여 치료 효과를 나타낼 수 있다.

치료를 위해서 in vivo로 항체를 사용하는 경우, 뮤턴트 루테리알 또는 뮤턴트 루테리알의 파열에 의해 수득되는 미세물질의 활성을 저해할 수 있을 정도의 치료 유효량을 환자에게 투여할 수 있다.

치료용 항체 제제는 목적하는 정도의 순도를 갖는 활성 성분을 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합함으로써 제조될 수 있다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용된 용량 및 농도에서 수여자에게 무독성이고, 버퍼, 보존제, 등장화제, 안정화제, 금속 착물 (예를 들어 Zn-단백질 착물); 킬레이팅제, 예를 들어 EDTA 및/또는 비-이온성 계면활성제를 포함할 수 있다.

버퍼를 이용하여, 특히 안정성이 pH 의존적인 경우 치료 유효성을 최적화하는 범위로 pH를 조절한다. 버퍼는 바람직하게는 약 50 mM 내지 약 250 mM 범위의 농도로 존재한다. 적당한 완충제는 유기산 및 무기산 모두 및 그의 염을 포함한다. 예를 들어, 시트레이트, 포스페이트, 숙시네이트, 타르트레이트, 푸마레이트, 글루코네이트, 옥살레이트, 락테이트, 아세테이트가 있다. 추가로, 버퍼는 히스티딘 및 트리메틸아민염, 예를 들어 트리스를 포함할 수 있다.

보존제는 미생물 성장을 지연시키기 위하여 첨가되고, 통상적으로 0.2％-1.0％ (w/v) 범위로 존재한다. 본 발명에 사용하기 위한 적당한 보존제는 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 할라이드(예를 들어 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드), 벤제토늄 클로라이드; 티메로살, 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥사놀, 3-펜타놀 및 m-크레졸을 포함할 수 있다.

경우에 따라서, 액체 조성물의 등장성을 조정하거나 유지하기 위해 안정화제로 알려진 등장화제를 첨가할 수 있다. 항체와 같은 크고 대전된 생체분자를 이용하는 경우, 이들은 아미노산 측쇄의 대전된 기와 상호작용하여 분자간 및 분자내 상호작용 가능성을 줄일 수 있기 때문에 종종 안정화제로 지칭된다. 등장화제는 다른 성분의 상대적 함량을 고려하여, 0.1~25 중량％, 바람직하게는 1~5 중량％의 양으로 존재할 수 있다. 등장화제는 다가 당 알콜, 바람직하게는 삼가 이상의 당 알콜, 예를 들어 글리세린, 에리트리톨, 아라비톨, 자일리톨, 소르비톨 및 만니톨을 포함할 수 있다.

추가의 부형제로 벌크화제, 용해도 증강제, 안정화제 및 변성 또는 용기 벽에 대한 부착을 방지하는 물질을 더 포함할 수 있으며, 예를 들어 다가 당 알콜 (위에서 열거한 다가 당 알코올 동일하게 적용); 아미노산, 예를 들어 알라닌, 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 라이신, 오르니틴, 류신, 2-페닐알라닌, 글루탐산, 트레오닌 등; 유기 당 또는 당 알콜, 예를 들어 수크로스, 락토스, 락티톨, 트레할로스, 스타키오스, 만노스, 소르보스, 자일로스, 리보스, 리비톨, 미오이니시토스, 미오이니시톨, 갈락토스, 갈락티톨, 글리세롤, 시클리톨 (예: 이노시톨), 폴리에틸렌 글리콜; 황 함유 환원제, 예를 들어 우레아, 글루타티온, 티옥틱산, 나트륨 티오글리콜레이트, 티오글리세롤, α-모노티오글리세롤 및 나트륨 티오 술페이트; 저분자량 단백질, 예를 들어 인간 혈청 알부민, 소 혈청 알부민, 젤라틴 또는 다른 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 단당류 (예를 들어, 자일로스, 만노스, 프럭토스, 글루코스); 이당류 (예를 들어, 락토스, 말토스, 수크로스); 삼당류, 예를 들어 라피노스; 및 다당류, 예를 들어 덱스트린 또는 덱스트란을 더 포함할 수 있다.

비이온성 계면활성제 또는 세제 (또한 "습윤제"로 공지됨)는 치료제의 가용화를 돕고, 치료 단백질을 교반에 의해 유도되는 응집에 대해 보호하기 위해 존재한다 (이는 또한 활성 치료 단백질 또는 항체의 변성을 유발하지 않으면서 제제가 전단 표면 스트레스에 노출되는 것을 허용한다). 비이온성 계면활성제는 약 0.05~1.0mg/ml, 바람직하게는 0.07~0.2mg/ml의 범위로 존재한다.

적합한 비이온성 계면활성제는 폴리소르베이트 (20, 40, 60, 65, 80 등), 폴리옥사머 (184, 188 등), PLURONIC^® 폴리올, Triton^®, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노에테르 (Tween^®20, Tween^®80 등), 라우로마크로골 400, 폴리옥실 40 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 수소화 피마자유 10, 50 및 60, 글리세롤 모노스테아레이트, 수크로스 지방산 에스테르, 메틸 셀룰로스 및 카르복시메틸 셀룰로스를 포함한다. 사용될 수 있는 음이온성 세제는 나트륨 라우릴 술페이트, 디옥틸 나트륨 술포숙시네이트 및 디옥틸 나트륨 술포네이트를 포함한다. 양이온성 세제는 벤즈알코늄 클로라이드 또는 벤제토늄 클로라이드를 포함한다.

제제를 생체 내 투여용으로 사용하기 위하여서는, 제제는 멸균 상태이어야 한다. 제제는 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 멸균될 수 있다. 본원의 치료 조성물은 일반적으로 멸균 접근 포트를 갖는 용기, 예를 들어 피하 주사 바늘에 의해 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알에 둔다.

이들은 표적 세포 부위에 비경구적으로 투여될 수 있으며, 예를 들어 단일 또는 다회 볼러스 (bolus) 또는 장시간에 걸친 주입으로 적당한 방식, 예를 들어 피하, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 병변내 또는 관절내 경로에 의한 주사 또는 주입, 국소 투여, 흡입에 의해서 또는 지속방출 또는 연장방출 방식에 의해 투여될 수 있다.

"치료 유효량"과 관련된 항체의 용량은 질환의 성질, 항체의 공격부위, 치료 지침, 환자 및 환자의 병력에 의해 결정될 수 있으며, 예를 들어 투여되는 항체의 양은 약 0.1~10mg/체중kg의 범위일 수 있다. 상이한 제제가 상이한 치료법 및 상이한 질환에 효과적일 수 있으며, 특정 기관 또는 조직을 치료하기 위한 투여가 다른 기관 또는 조직에 대한 것과 상이한 양식으로의 전달을 필요로 할 수 있다는 것은 본 발명의 범위 내에 있다. 나아가, 용량은 1회 이상의 별개 투여에 의해서, 또는 연속 주입에 의해 투여될 수 있다. 병태에 따라서, 수일 또는 그 이상에 걸친 반복 투여에 대하여, 치료는 목적하는 질병 증상의 억제가 발생할 때까지 지속될 수 있다. 그러나, 다른 투여 계획이 유용할 수 있다. 치료 요법은 통상적인 기술 및 분석에 의해 용이하게 모니터링 될 수 있다.

[실시예}

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 뮤턴트 루테리알에 특이적으로 결합하는 항체

1-1: 환자 유래 루테리알의 분리

다양한 환자유래의 정상 및 뮤턴트 루테리알을 분리하였다. 비소세포성 폐암 말기 환자에게서 혈액을 50cc 채취하여 0.8μm 이상의 직경의 공극을 구비하는 필터를 통과시켜 필터링되지 않은 물질은 분리하였다. 필터링된 혈액을 1200~5000rpm에서 5~10분간 반복적으로 원심분리를 수행하여 엑소좀(exosome)과 같은 일반 마이크로 베지클을 제거하여 상등액을 획득하였다. 상기 상등액에 가시광선을 조사하여 운동성을 가지며 모여드는 루테리알 입자를 피펫을 이용하여 분리하였다.

루테리알은 자가형광 및 운동성의 특성을 가지므로 상기와 같이 가시광선을 조사시 루테리알 입자를 확인할 수 있다. 이때, 암시야 현미경 또는 공초점 현미경으로 움직이는 루테리알 입자를 확인하면서 피펫을 사용하여 분리하였다. 분리된 루테리알을 50nm 직경의 공극을 구비하는 필터를 통과시켜 필터링되지 않은 부분만 PBS로 세척하여 루테리알을 수득하였다. 상기 과정에 의해 장직경 50-800nm인 루테리알을 수득할 수 있으며, 이는 암시야 현미경 또는 공초점 현미경을 통하여 관찰 확인이 가능하였다. 상기 수득한 루테리알은 크기에 따라 50-200nm (발생기)/ 200-400nm (성숙기)/ 400-600nm (분열기)/ 600-800nm (과분열기)로 구분하였다.

1-2: 마우스 유래 항체의 제작

약 16주된 암컷 마우스에 완전 프로인트 아주반트 (Complete Freund's adjuvant) 50㎍ 및 실시예 1-1에서 분리된 약 600~800nm 뮤턴트 루테리알를 피하 주사한 다음, 2주 후에 불완전 프로인트 아주반트 50㎍ 및 실시예 1-1에서 분리된 600~800nm 뮤턴트 루테리알를 피하 주사함으로써, 상기 마우스를 면역시켰다. 10일 후 상기 마우스의 꼬리로부터 혈액 샘플 (약 100㎕)을 수집하였다. 혈청을 대상으로 하여, 포획물로서 뮤턴트 루테리알로 피복시킨 미세역가 판을 사용하여 ELISA함으로써 항-뮤턴트 루테리알 항체에 대해 시험하였고, 희석된 혈청 (1/500~1/8000)을 적용하며, HRP-접합된 염소-항-마우스 IgG를 태그화하였다.

6주 이상의 간격 후, 세포 융합하기 4일 및 2일 전에 식염수 중의 50 ㎍ 뮤턴트 루테리알를 상기 마우스 (고 양성 반응을 나타냄)에게 복강내 투여함으로써 추가 면역시켰다.

비장 세포를 분리하고, 이를 Sp2/0-Agl4 골수종 세포와 융합하였다. 히포크산틴, 아미노프테린, 티미딘 배지에서 선별한 후, 배양 상등액을 상기 언급된 바와 같은 ELISA 내로 적용함으로써 양성 클론을 선별하였다. 생성된 항체의 특성은 별도의 실험을 통해 규명 중이다.

1-3: CHO 세포와 공배양을 통한 항체의 제작

실시예 1-1에서 분리된 600~800nm 뮤턴트 루테리알과 CHO 세포를 1:1의 비율로 접종한 다음, 10% FBS가 포함된 DMEM 배지를 첨가하였다. 배지는 배양기간 동안 3일 간격으로 교체해 주었고, 배양 2주에 배양 지지체를 취하여 뮤턴트 루테리알의 CHO 세포 도입 여부 및 이로부터 항체 생성 여부를 관찰하였다.

항체 생성 여부에 대한 확인은 위 실시예와 마찬가지로, CHO 세포 생성물을 위 실시예에서와 마찬가지로 ELISA함으로써 항-뮤턴트 루테리알 항체에 대해 시험하였다. 생성된 항체의 특성은 별도의 실험을 통해 규명 중이다.

실시예 2: 미세물질에 특이적으로 결합하는 항체

2-1: 미세물질의 분리

실시예 1에서 분리된 뮤턴트 루테리알의 배양 중 파열에 의해 관찰되는 미세물질을 암시야 현미경 또는 공초점 현미경으로 확인하면서 피펫을 사용하여 분리하였으며, 이 때 미세물질의 크기는 300nm이었다.

2-2: 마우스 유래 항체의 제작

뮤턴트 루테리알의 파열에 의해 수득되는 300nm 크기의 미세물질을 항원으로 사용하였다는 것 이외에는 실시예 1과 동일한 방법으로 항체를 생산하였으며, 생성된 항체의 특성은 별도의 실험을 통해 규명 중이다.

2-3: CHO 세포와 공배양을 통한 항체의 제작

뮤턴트 루테리알의 파열에 의해 수득되는 300nm 크기의 미세물질을 사용하였다는 것 이외에는 실시예 1과 동일한 방법으로 항체를 생산하였으며, 생성된 항체의 특성은 별도의 실험을 통해 규명 중이다.

이상으로 본 발명의 내용을 상세히 기술하였는바, 당 업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (10)

1. (i) 환자 유래 뮤턴트 루테리알; (ii) 상기 뮤턴트 루테리알의 파열(bursting)에 의해 수득되는 미세물질; 또는 (iii) 환자 유래 뮤턴트 루테리알에 함유되어 있는 항원성 물질에 특이적으로 결합하는 환자 특이적 항체.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 뮤턴트 루테리알 또는 미세물질은 혈액에서 분리되는 것을 특징으로 하는 환자 특이적 항체.
   
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 뮤턴트 루테리알은 400nm~수백㎛인 것을 특징으로 하는 환자 특이적 항체.
   
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 뮤턴트 루테리알의 파열에 의해 수득되는 미세물질은 100~400nm의 크기를 가지는 것을 특징으로 하는 환자 특이적 항체.
   
5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체는 뮤턴트 루테리알의 융합(fusion) 또는 파열을 저해하는 것을 특징으로 하는 환자 특이적 항체.
   
6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체는 뮤턴트 루테리알의 파열에 의해 수득되는 미세물질의 암 줄기세포화를 저해하는 것을 특징으로 하는 환자 특이적 항체.
   
7. 다음 단계를 포함하는 환자 특이적 항체의 제조방법:
   (a) 환자 유래 뮤턴트 루테리알 또는 상기 뮤턴트 루테리알의 파열에 의해 수득되는 미세물질을 인간을 제외한 동물에 도입하여 환자 특이적 항체를 생성시키는 단계; 및
   (b) 상기 생성된 환자 특이적 항체를 회수하는 단계.
   
8. 다음 단계를 포함하는 환자 특이적 항체의 제조방법:
   (a) 환자 유래 뮤턴트 루테리알 또는 상기 뮤턴트 루테리알의 파열에 의해 수득되는 미세물질을 숙주세포에 도입하는 단계;
   (b) 상기 숙주세포를 배양하여, 환자 특이적 항체를 생성시키는 단계; 및
   (c) 상기 생성된 환자 특이적 항체를 회수하는 단계.
   
9. 제8항에 있어서, 상기 (a) 단계의 숙주세포는 T세포, HEK293, CHO, BHK, Sp2/0, 및 NS로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 환자 특이적 항체의 제조방법.
   
10. 제8항에 있어서, 상기 (a) 단계의 도입은 공배양에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 환자 특이적 항체의 제조방법.

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