CN109789201A - 抗人vista抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供激动性抗人VISTA抗体和抗体片段。这些激动性抗体和抗体片段可用于增强或提高或模拟VISTA对T细胞免疫的抑制作用，从而抑制T细胞免疫。这些激动性抗体和抗体片段尤其可用于治疗自体免疫、变态反应、炎症性病症、GVHD、败血症和移植受体。还提供了用于鉴定这些激动剂的筛选测定法。

Description

抗人VISTA抗体及其用途
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本申请要求2016年4月15日提交的美国临时申请No.62/323,193、2016年5月31日提交的美国临时申请No.62/343,355、2016年8月9日提交的美国临时申请No.62/372,362、2016年9月9日提交的美国临时申请No.62/385,627、2016年11月22日提交的美国临时申请No.62/425,184、2016年7月19日提交的美国临时申请No.62/363,929、2016年7月21日提交的美国临时申请No.62/365,085、2016年9月9日提交的美国临时申请No.62/385,805、2016年7月19日提交的美国临时申请No.62/363,931、2016年7月21日提交的美国临时申请No.62/365,102、2016年9月9日提交的美国临时申请No.62/385,871、2016年7月19日提交的美国临时申请No.62/363,917、2016年7月21日提交的美国临时申请No.62/365,081、2016年9月9日提交的美国临时申请No.62/385,888、2016年7月19日提交的美国临时申请No.62/364,073、2016年7月21日提交的美国临时申请No.62/365,166、2016年9月9日提交的美国临时申请No.62/385,893、2016年7月19日提交的美国临时申请No.62/363,925、2016年7月21日提交的美国临时申请No.62/365,087、2016年9月9日提交的美国临时申请No.62/385,785、2016年10月11日提交的美国临时申请No.62/406,632号的优先权，将这些专利申请各自及全部均以引用方式并入本文中。本申请案涉及2017年4月___提交的PCT申请____，“ANTI-HUMAN VISTA ANTIBODIES AND USE THEREOF(抗人VISTA抗体及其用途)”(代理人案卷号43260.2213)，将其以引用的方式并入并主张其优先权。
技术领域
在一些实施方案中本发明涉及鉴定新型抗人VISTA抗体及抗体片段，即抗人VISTA(T细胞活化的含V区免疫球蛋白抑制因子(V-region Immunoglobulin-containingSuppressor of T cell Activation)(1))(“VISTA”)抗体及抗体片段。更具体地讲，本申请提供新型的人VISTA激动剂，即可激发或促进人VISTA对免疫(尤其是对T细胞免疫)的抑制作用的抗人VISTA抗体及抗体片段。另外，本发明还涉及此类激动剂用于增强或模拟VISTA对免疫的抑制作用，诸如其对CD4+或CD8+T细胞增殖、CD4+或CD8+T细胞活化的抑制作用以及其对免疫细胞因子(尤其是促炎细胞因子)产生的抑制作用的用途。另外，本发明还涉及此类激动性抗体及抗体片段作为预防剂或治疗剂的特定用途，尤其是用于治疗其中预防或抑制T细胞免疫和促炎细胞因子的表达具有治疗益处的病症(诸如自体免疫、炎症、变应性障碍、败血症、GVHD)或用于缓解某些病症诸如癌症以及更特别是IBD、银屑病、GVHD、狼疮、慢性感染和肝毒性以及类风湿性关节炎的炎性副作用。
背景技术
负向免疫检查点调节因子(NCR)路径已被证明在治疗人类免疫相关疾病中是特别优异的临床靶点。使用单克隆抗体(mAb)阻断两种NCR(CTLA-4和PD-1)以增强肿瘤免疫正在革新癌症的治疗方法，并且已将这些路径确立为人类疾病中经临床验证的靶点。触发NCR路径的可溶形式的NCR配体也已作为免疫抑制药物进入临床用来治疗自体免疫(即，用于类风湿性关节炎的AMP-110/B7-H4-Ig)。
VISTA(参见参考文献1)是一种NCR配体，其在系统分类上最接近的亲缘物是PD-L1。VISTA与PD-L1具有同源性，但表现出一种仅限于造血室的独特表达模式。具体地说，VISTA在高CD11b髓样细胞上组成型高度表达，而在CD4+及CD8+T细胞上以较低水平表达。如同PD-L1，VISTA是一种深度抑制免疫的配体(参考文献1)，并且如同PD-L1，阻断VISTA使得能在临床前肿瘤模型中发展出针对癌症的治疗性免疫(参见参考文献2)。鉴于阻断VISTA可以增强免疫，尤其是CD8+和CD4+介导的T细胞免疫，用VISTA胞外结构域的可溶性Ig融合蛋白(VISTA-Ig)处理可以抑制免疫，并且已显示可阻滞多种自体免疫疾病小鼠模型的进展。
明确的科学证据显示，VISTA是一种可诱导深度T细胞抑制的配体。包括达特茅斯学院(Dartmouth College)和詹森公司(Jannsen)在内的不同团体已报导过多种拮抗性抗人VISTA抗体。此类抗体可用于治疗其中期望抑制VISTA对T细胞免疫的免疫抑制作用的病症，诸如癌症和感染。然而，就发明人所知，此前尚未鉴定出可激发人VISTA的作用的抗人VISTA抗体或抗体片段。此类激动性抗人VISTA抗体及抗体片段将有利于治疗其中需要抑制免疫、尤其是T细胞免疫的病症和/或其中VISTA表达被异常下调的病症。
发明内容
本发明的目的之一在于提供治疗性和预防性方法，其使用特异性地结合至人VISTA及其变体的抗体及抗体片段，如能特异性地结合至人VISTA，并且能促进或模拟人VISTA对免疫的作用的嵌合型、人型、人源化型或多特异性型的抗人VISTA抗体。
本发明的具体目的之一在于提供治疗性和预防性方法，其使用包含特异性地结合至人VISTA的抗原结合区的激动性抗体或其抗体片段，其中该激动性抗体或抗体片段与具有图4中所示的CDR及可变重链多肽和可变轻链多肽的抗人VISTA抗体中的任一者结合到相同或重叠的表位。
本发明的具体目的之一在于提供治疗性和预防性方法，其使用包含特异性地结合至人VISTA的抗原结合区的激动性抗体或其抗体片段，其中该抗体或抗体片段包含的可变重链序列和可变轻链序列拥有具有图4所示序列的抗人VISTA抗体任一者的CDR多肽。
本发明的具体目的之一在于提供治疗性和预防性方法，其使用包含特异性地结合至人VISTA的抗原结合区的激动性抗体或其抗体片段，其中该抗体或抗体片段包含的可变重链序列和可变轻链序列具有选自VSTB49-VSTB116的抗人VISTA抗体的CDR多肽。
本发明的具体目的之一在于提供治疗性和预防性方法，其使用包含选自VSTB49-VSTB116的抗人VISTA抗体的CDR的激动性抗体或其抗体片段，所述抗体或其抗体片段包含的可变重链多肽和/或可变轻链多肽与VSTB49-VSTB116的可变重链多肽序列和可变轻链多肽序列具有至少90％、95％或96％-99％的序列同一性。
本发明的具体目的之一在于提供治疗性和预防性方法，其使用包含与VSTB49-VSTB116中任一者相同的CDR的激动性抗体或其抗体片段，所述抗体或其抗体片段包含的可变重链多肽和/或可变轻链多肽与VSTB49-VSTB116的可变重链多肽序列和可变轻链多肽序列相同。
本发明的具体目的之一在于提供治疗性和预防性方法，其使用激动性抗体或其抗体片段，所述激动性抗体或其抗体片段为包含特异性地结合至人VISTA的抗原结合区的嵌合型、人型、人源化型、多特异性型(如双特异性型)抗人VISTA抗体或抗体片段，其包含的可变重链序列和可变轻链序列具有与包含图4中公开的CDR及可变重链多肽和可变轻链多肽的抗人VISTA抗体中的任一者相同的CDR多肽。
本发明的具体目的之一在于提供治疗性和预防性方法，其使用新型的免疫抑制剂，即抗人VISTA抗体和抗体片段，例如含有人IgG2恒定结构域或IgG2Fc区的那些，任选其中与野生型人IgG2恒定结构域或IgG2Fc区相比所述人IgG2恒定结构域或IgG2Fc区的FcR结合能力得以维持或增强，其可激发、引发或模拟人VISTA对免疫的作用，例如其对T细胞活性、分化和增殖的抑制作用以及其对促炎细胞因子表达的抑制作用。
本发明的具体目的之一在于提供治疗性和预防性方法，其使用新型的免疫抑制性抗体和抗体片段，该免疫抑制性抗体和抗体片段可增强或模拟VISTA对T细胞免疫的抑制作用(即其抑制CD4+或CD8+T细胞增殖、CD4+或CD8+T细胞活化)和其对免疫细胞因子、特别是促炎细胞因子诸如IL-2、IL-4、IL-6、IL-17、TNF-α和/或GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)的产生的抑制，以及其对趋化因子或化学引诱物诸如KC(角化细胞化学引诱物)或MIP-2(巨噬细胞炎性蛋白2)的表达的促进作用。
本发明的具体目的之一在于提供治疗性和预防性方法，其使用新型的免疫抑制性或激动性抗人VISTA抗体和抗体片段，该抗人VISTA抗体和抗体片段具有特异性的表位特异性或者其与特异性抗人VISTA抗体竞争结合人VISTA。
本发明的具体目的之一在于提供治疗性和预防性方法，其使用新型的免疫抑制性或激动性抗人VISTA抗体和抗体片段，该抗人VISTA抗体和抗体片段具有特异性的表位特异性或者其与特异性抗人VISTA抗体竞争结合人VISTA，其可激发(增强、引发或模拟)VISTA对免疫的抑制作用，例如其对T细胞免疫(即CD4+或CD8+T细胞增殖、CD4+或CD8+T细胞活化)的抑制作用，和/或其抑制促炎性免疫细胞因子诸如IL-2、IL-4、IL-6、IL-17、TNF-α和/或GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)的产生，以及其对趋化因子或化学引诱物如KC(角化细胞化学引诱物)或MIP-2(巨噬细胞炎性蛋白2)的表达的促进作用。
本发明的具体目的之一在于提供治疗性和预防性方法，其使用激动性抗人VISTA抗体和抗体片段作为预防剂或治疗剂，特别是用于治疗其中预防或抑制或减少免疫反应在治疗上是可取的，更具体地讲其中预防或抑制或减少T细胞免疫(或更具体而言CD4+或CD8+介导的T细胞免疫)在治疗上是有益的的病症，诸如自体免疫、炎症、变应性障碍、败血症、GVHD，和/或用于治疗移植或细胞疗法受体，例如CAR-T受体，或者用于缓解某些病症诸如癌症的炎症副作用。
本发明的另一具体目的在于提供诊断或治疗组合物，其包含诊断或治疗有效量的根据本发明的激动性抗人VISTA抗体，例如含有与具有图4所示序列的抗体任一者相同的CDR的抗体，其适用于人类疗法，诸如可静脉内、皮下或肌肉内施用的组合物。
本发明的另一具体目的在于提供一种诊断或治疗方法，其联合使用根据本发明的激动性抗体和另一种免疫激动剂，例如PD-1或PD-L1激动剂，例如其中PD-1或PD-L1激动剂选自抗PD-1抗体或抗体片段、抗PD-L1抗体或抗体片段、PD-L1多肽或其片段(其可以其是单价的或多聚体)、PD-1多肽或其片段(其可以是单价的或多聚体)，或包含前述任一者的复合物或融合蛋白。
本发明的另一具体目的在于提供使体外或体内免疫细胞与根据本发明的激动性抗体接触的方法，例如人免疫细胞，例如其中将所述经接触的细胞输注进人受试者诸如患有炎症性病症、变应性病症或自体免疫病症，如GVHD、慢性或急性肝炎、RA、IBD、牛皮癣或狼疮的受试者。
本发明的另一具体目的在于提供治疗或预防自体免疫病症、变应性病症或炎症性病症的方法，包括给有需要的患者施用治疗或预防有效量的分离的抗体或其抗体片段，所述抗体或其抗体片段包含特异性地结合至人T细胞活化的V结构域Ig抑制因子(人VISTA)的抗原结合区，其中该抗体或抗体片段可激发或促进VISTA对免疫的一种或多种作用，例如人IgG2恒定区或人IgG2Fc区，任选其中所述抗体的人IgG2恒定区或Fc区结合至包括人CD32A在内的Fcγ受体，例如其中所述人IgG2恒定区或Fc区构成结合至一种或多种Fc受体，任选hFcγRI(CD64)、FcγRIIA或hFcγRIIB(CD32或CD32A)以及FcγRIIIA(CD16A)或FcγRIIIB(CD16B)中的一者或多者的天然人IgG2。
本发明的另一具体目的在于提供治疗或预防自体免疫病症、变应性病症或炎症性病症的方法，包括给有需要的患者施用治疗或预防有效量的分离的激动性抗体或抗体片段，其中所述分离的抗体或抗体片段与具有图4的序列的任何抗人VISTA抗体竞争或者结合至包括具有图4的序列的任何抗人VISTA抗体所结合的表位或与所述表位重叠的VISTA表位。
本发明的另一具体目的在于提供治疗或预防自体免疫病症、变应性病症或炎症性病症的方法，包括给有需要的患者施用治疗或预防有效量的分离的激动性抗体或抗体片段，其中所述分离的抗体或抗体片段与VISTA表位竞争或结合，与包含LLDSGLYCCLVVEIRHHHSEHRVH(SEQ ID NO:92)的残基的表位的一个或多个残基相结合或相互作用。
本发明的另一具体目的在于提供治疗或预防自体免疫病症、变应性病症或炎症性病症的方法，包括给有需要的患者施用治疗或预防有效量的分离的激动性抗体或抗体片段，其中所述分离的抗体或抗体片段与包含79EVQTCSERRPIR90(SEQ ID NO:68)、48NVTLTCRLLGPV60、153HHHSEHRVHGAM164、52LTCRLLGPV60、56LLGPVDKGHDVTFYK70、113LAQRHGLESASDHHG127、153HHHSEHRVHGAM164、93TFQDLHLHHGGHQAA107、146CLVVEIRHHHSEH158、53TCRLLGPVDKG63、123SDHHG127和/或153HHHSEHRVHGAM164的一个或多个残基的VISTA表位竞争或结合。
本发明的另一具体目的在于提供治疗或预防自体免疫病症、变应性病症或炎症性病症的方法，包括给有需要的患者施用治疗或预防有效量的分离的激动性抗体或抗体片段，其中所述分离的抗体或抗体片段与包含79EVQTCSERRPIR90(SEQ ID NO:68)的一个或多个残基的VISA表位竞争或结合。
本发明的另一具体目的在于提供治疗或预防自体免疫病症、变应性病症或炎症性病症的方法，包括给有需要的患者施用治疗或预防有效量的分离的激动性抗体或抗体片段，其中所述分离的抗体或抗体片段可促进或增强人VISTA对免疫的至少一种作用，例如其对以下中的任一者或多者的抑制作用：T细胞免疫、单核细胞活化、T细胞增殖诱导、细胞因子表达的诱导或抑制、单核细胞的存活增加、表达VISTA的细胞中抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)的诱导、以及表达VISTA的细胞中抗体依赖的细胞吞噬作用(ADCP)的诱导，例如其中所述分离的抗体或抗体片段包含特异性地结合至人VISTA的抗原结合区，其中所述抗体或抗体片段包含的可变重链序列和可变轻链序列具有与具有图4中所示的CDR多肽及可变重链多肽和可变轻链多肽的抗人VISTA抗体中任一者相同的CDR多肽，和/或包含与选自VSTB49-VSTB116的抗体相同的CDR和/或包含与选自VSTB49-VSTB116任一者的抗人VISTA抗体的可变重链多肽和/或可变轻链多肽具有至少90％序列同一性的可变重链多肽和/或可变轻链多肽，其中其可变重链多肽序列和可变轻链多肽序列示于图4中和/或包含的可变重链多肽和/或可变轻链多肽与选自VSTB49-VSTB116中任一者的抗人VISTA抗体的可变重链多肽和/或可变轻链多肽具有至少95％的序列同一性，其中其可变重链多肽序列和可变轻链多肽序列示于图4中或包含的可变重链多肽和/或可变轻链多肽与选自VSTB49-VSTB116中任一者的抗人VISTA抗体的可变重链多肽和/或可变轻链多肽具有至少96％-99％的序列同一性，和/或包含的可变重链多肽和/或可变轻链多肽与选自VSTB49-VSTB116中一者的抗人VISTA抗体的可变重链多肽和/或可变轻链多肽相同，其中其可变重链多肽序列和可变轻链多肽序列示于图4中和/或包含人恒定结构域，如选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的人恒定结构域，所述人恒定结构域任选经修饰，例如通过缺失突变、置换突变或添加突变或上述突变的任何组合进行修饰，和/或其中所述分离的抗体或抗体片段包含Fab、F(ab’)2或scFv抗体片段或者是Fab、F(ab’)2或scFv抗体片段。
本发明的另一具体目的在于提供治疗或预防自体免疫病症、变应性病症或炎症性病症的方法，包括给有需要的患者施用治疗或预防有效量的分离的激动性抗人VISTA抗体或抗体片段，其中所述分离的抗体或抗体片段可促进或增强人VISTA对免疫的至少一种作用，例如选自其对T细胞免疫、单核细胞活化的抑制作用、T细胞增殖的抑制、细胞因子表达的诱导或抑制、单核细胞的存活增加、表达VISTA的细胞中抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)的抑制、以及表达VISTA的细胞中抗体依赖的细胞吞噬作用(ADCP)的抑制，例如包含人IgG2恒定区或Fc区的抗体，例如其中所述分离的抗体或抗体片段可促进或增强人VISTA对免疫的抑制作用，例如其对以下任一者或多者的作用：T细胞免疫、单核细胞活化、T细胞增殖；细胞因子表达、单核细胞存活、表达VISTA的细胞中抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)；以及表达VISTA的细胞中抗体依赖的细胞吞噬作用(ADCP)。
本发明的另一具体目的在于提供治疗或预防自体免疫病症、变应性病症或炎症性病症的方法，包括给有需要的患者施用治疗或预防有效量的分离的激动性抗人VISTA抗体或抗体片段，其中所述分离的抗体或抗体片段可抑制T细胞免疫和/或促炎细胞因子表达。
本发明的另一具体目的在于提供治疗或预防自体免疫病症、变应性病症或炎症性病症的方法，包括给有需要的患者施用治疗或预防有效量的分离的激动性抗人VISTA抗体或抗体片段，其中所述分离的抗体或抗体片段包含人Fc区，例如人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4或者前述任一者的嵌合体，和/或所述分离的抗体或抗体片段包含嵌合型、人型、多特异型或人源化型抗体或抗体片段，和/或所述分离的抗体或抗体片段包含突变的人IgG2恒定结构域或Fc区，和/或所述分离的抗体或抗体片段包含人IgG2恒定结构域或其片段或者hIgG1、hIgG3、hIgG4、IgA、IgD、IgE或IgM，其中所述抗体的整个或基本上整个铰链结构域和CH1结构域以及任选整个或基本上整个轻链恒定区已用hIgG2的相应的整个或基本上整个轻链以及铰链结构域和CH1结构域(“H2区”或“H2结构域”)置换，和/或所述分离的抗体或抗体片段(i)包含IgG2Fc区，其中第127位的重链半胱氨酸残基和第214位的轻链半胱氨酸残基(其中编号方式是根据Kabat)中的一者或二者缺失或改变成不同的氨基酸残基，从而导致所得的经修饰的抗体的激动特性相对于其中这些残基未改变的抗体增加，(ii)所述抗体的H2区中第214位的半胱氨酸残基被突变或用另一个氨基酸置换和/或重链的第127、232或233位的半胱氨酸残基中的一者或多者缺失或用另一个氨基酸置换，(iii)其包含人IgG2恒定结构域，其中至少一个半胱氨酸残基缺失或改变成另一个氨基酸，(iv)其与VSTB95(可变重链序列和可变轻链序列在图4中所示)竞争或与VSTB95结合至人VISTA上的相同表位。
本发明的另一具体目的在于提供治疗或预防自体免疫病症、变应性病症或炎症性病症的方法，包括给有需要的患者施用治疗或预防有效量的分离的激动性抗人VISTA抗体或抗体片段，其中所述分离的抗体或抗体片段：
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本发明的另一具体目的在于提供治疗或预防自体免疫病症、变应性病症或炎症性病症的方法，包括给有需要的患者施用治疗或预防有效量的分离的激动性抗人VISTA抗体或抗体片段，其中所述分离的抗体或抗体片段：
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本发明的另一具体目的在于提供治疗或预防自体免疫病症、变应性病症或炎症性病症的方法，包括给有需要的患者施用治疗或预防有效量的根据前述任一项的分离的激动性抗人VISTA抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包含其中任选至少一个半胱氨酸残基缺失或改变成另一氨基酸的人IgG2恒定结构域。
本发明的另一具体目的在于提供治疗或预防自体免疫病症、变应性病症或炎症性病症的方法，包括给有需要的患者施用治疗或预防有效量的根据前述任一项的分离的激动性抗人VISTA抗体或抗体片段，其中所述分离的抗体或抗体片段包含介导以下免疫抑制作用中的任一种或至少一种的组合的激动性抗人VISTA抗体或抗体片段：(i)降低免疫应答、(ii)降低T细胞活化、(iii)降低细胞毒性T细胞活性、(iv)降低天然杀伤(NK)细胞活性、(v)降低T细胞活性、(vi)降低促炎细胞因子分泌、(vii)降低IL-2分泌；(viii)降低γ干扰素产生、(ix)降低Th1应答、(x)降低Th2应答、(xi)增加调节T细胞的细胞数目和/或活性、(xii)增加调节细胞活性和/或髓源性抑制细胞(MDSC)、iMC、间充质基质细胞、表达TIE2的单核细胞中的一者或多者、(xiii)增加调节细胞活性和/或髓源性抑制细胞(MDSC)、iMC、间充质基质细胞、表达TIE2的单核细胞中的一者或多者的活性、(xiii)增加M2巨噬细胞、(xiv)增加M2巨噬细胞活性、(xv)增加N2中性粒细胞、(xvi)增加N2中性粒细胞活性、(xvii)增加T细胞活化的抑制、(xviii)增加CTL活化的抑制、(xix)增加NK细胞活化的抑制、(xx)增加T细胞耗竭、(xxi)降低T细胞应答、(xxii)降低细胞毒性细胞的活性、(xxiii)减少抗原特异性记忆应答、(xxiv)抑制细胞的凋亡或溶解、(xxv)降低对细胞的细胞毒性作用或细胞抑制作用、(xxvi)减少细胞的直接杀死、(xxvii)降低Thl7活性和/或(xxviii)减少补体依赖的细胞毒性和/或抗体依赖细胞介导的细胞毒性，前提条件是所述抗VISTA抗体或抗原结合片段可引发与(i)-(xxviii)中的一者或多者相反的作用并且任选用于治疗自体免疫、变态反应、炎症、移植或败血症。
本发明的另一具体目的在于提供治疗或预防自体免疫病症、变应性病症或炎症性病症的方法，包括给有需要的患者施用治疗或预防有效量的根据前述任一项的分离的激动性抗人VISTA抗体或抗体片段以便治疗或预防类风湿性关节炎。
本发明的另一具体目的在于提供治疗或预防自体免疫病症、变应性病症或炎症性病症的方法，包括给有需要的患者施用治疗或预防有效量的根据前述任一项的分离的激动性抗人VISTA抗体或抗体片段以便治疗或预防GVHD。
本发明的另一具体目的在于提供治疗或预防自体免疫病症、变应性病症或炎症性病症的方法，包括给有需要的患者施用治疗或预防有效量的根据前述任一项的分离的激动性抗人VISTA抗体或抗体片段以便治疗或预防牛皮癣。
本发明的另一具体目的在于提供治疗或预防自体免疫病症、变应性病症或炎症性病症的方法，包括给有需要的患者施用治疗或预防有效量的根据前述任一项的分离的激动性抗人VISTA抗体或抗体片段以便治疗或预防IBD或结肠炎或者另一炎性或自体免疫性肠障碍。
本发明的另一具体目的在于提供治疗或预防自体免疫病症、变应性病症或炎症性病症的方法，包括给有需要的患者施用治疗或预防有效量的根据前述任一项的分离的激动性抗人VISTA抗体或抗体片段以便治疗或预防狼疮。
本发明的另一具体目的在于提供治疗或预防自体免疫病症、变应性病症或炎症性病症的方法，包括给有需要的患者施用治疗或预防有效量的根据前述任一项的分离的激动性抗人VISTA抗体或抗体片段以便治疗或预防慢性或急性感染或者与之相关的炎症或肝毒性，例如甲型、乙型、丙型、丁型、戊型或庚型肝炎。
本发明的另一具体目的在于提供治疗或预防自体免疫病症、变应性病症或炎症性病症的方法，包括给有需要的患者施用治疗或预防有效量的根据前述任一项的分离的激动性抗人VISTA抗体或抗体片段，该方法包括给有需要的受试者施用可在体外和/或体内实现以下免疫抑制作用中的任一种或至少一种的组合的激动性抗体或抗体片段：(i)降低免疫应答、(ii)降低T细胞活化、(iii)降低细胞毒性T细胞活性、(iv)降低天然杀伤(NK)细胞活性、(v)降低T细胞活性、(vi)降低促炎细胞因子分泌、(vii)降低IL-2分泌；(viii)降低γ干扰素产生、(ix)降低Th1应答、(x)降低Th2应答、(xi)增加调节T细胞的细胞数目和/或活性、(xii)增加调节细胞活性和/或髓源性抑制细胞(MDSC)、iMC、间充质基质细胞、表达TIE2的单核细胞中的一者或多者、(xiii)增加调节细胞活性和/或髓源性抑制细胞(MDSC)、iMC、间充质基质细胞、表达TIE2的单核细胞中的一者或多者的活性、(xiii)增加M2巨噬细胞、(xiv)增加M2巨噬细胞活性、(xv)增加N2中性粒细胞、(xvi)增加N2中性粒细胞活性、(xvii)增加T细胞活化的抑制、(xviii)增加CTL活化的抑制、(xix)增加NK细胞活化的抑制、(xx)增加T细胞耗竭、(xxi)降低T细胞应答、(xxii)降低细胞毒性细胞的活性、(xxiii)减少抗原特异性记忆应答、(xxiv)抑制细胞的凋亡或溶解、(xxv)降低对细胞的细胞毒性作用或细胞抑制作用、(xxvi)减少细胞的直接杀死、(xxvii)降低Thl7活性和/或(xxviii)减少补体依赖的细胞毒性和/或抗体依赖细胞介导的细胞毒性，前提条件是所述抗VISTA抗体或抗原结合片段可引发与(i)-(xxviii)中的一者或多者相反的作用并且任选用于治疗自体免疫、变态反应、炎症、移植或败血症。
本发明的另一具体目的在于提供治疗或预防自体免疫病症、变应性病症或炎症性病症的方法，包括给有需要的患者施用治疗或预防有效量的根据前述任一项的分离的激动性抗人VISTA抗体或抗体片段以在人受试者中治疗或预防变态反应、自体免疫、移植、基因疗法、炎症、癌症、GVHD或败血症，或用于治疗或预防与任一前述病症相关的炎性副作用、自体免疫副作用或变应性副作用。
本发明的另一具体目的在于提供治疗或预防自体免疫病症、变应性病症或炎症性病症的方法，包括给有需要的患者施用治疗或预防有效量的根据前述任一项的分离的激动性抗人VISTA抗体或抗体片段，还包括施用另一免疫调节抗体或融合蛋白，其选自靶向CTLA4、PD-1、PDL-1、LAG-3、TIM-3、BTLA、B7-H4、B7-H3、VISTA中的一者或多者的免疫抑制性抗体或融合蛋白和/或靶向CD40、CD137、OX40、GITR、CD27、CD28或ICOS中的一者或多者的激动性抗体或融合蛋白。
本发明的另一具体目的在于提供治疗或预防自体免疫病症、变应性病症或炎症性病症的方法，包括给有需要的患者施用治疗或预防有效量的根据前述任一项的分离的激动性抗人VISTA抗体或抗体片段，该方法包括在治疗之前、治疗同时和/或治疗之后测定个体的细胞中或体液中的VISTA蛋白，例如测定选自髓系细胞和/或淋巴细胞、单核细胞或中性粒细胞、T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞或自然杀伤T(NKT)细胞中的任何一种或多种的造血细胞上和/或造血细胞上的VISTA蛋白。
本发明的另一具体目的在于提供治疗或预防自体免疫病症、变应性病症或炎症性病症的方法，包括给有需要的患者施用治疗或预防有效量的根据前述任一项的分离的激动性抗人VISTA抗体或抗体片段，其中所述激动性抗人VISTA抗体或片段包含与选自VSTB49-VSTB116的抗体相同的CDR和可任选进行突变的人IgG2Fc区，任选其中所述IgG2恒定区或Fc区保留天然FcR结合和/或结合CD32A的能力，和/或所述激动性抗人VISTA抗体或片段具有对人VISTA的亲和力或KD，所述KD在37℃下通过表面等离振子共振测定为50M或更低，或者所述激动性抗人VISTA抗体或片段具有对人VISTA的亲和力或KD，所述KD在37℃下通过表面等离振子共振测定为1nM或更低。
本发明的另一具体目的在于提供使用根据前述任一项的分离的激动性抗人VISTA抗体或抗体片段来在体外或体内引发免疫抑制的方法。
本发明的另一具体目的在于提供治疗或预防自体免疫病症、变应性病症或炎症性病症的方法，包括给有需要的患者施用治疗或预防有效量的根据前述任一项的分离的激动性抗人VISTA抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段选自具有图4的可变序列的任何抗体。
本发明的目的之一在于进一步提供通过施用免疫抑制性或激动性抗人VISTA抗体或抗体片段来在有需要的受试者(如患有急性或慢性人自体免疫病症、变应性病症和炎症性病症的个体)中治疗或预防自体免疫、变态反应和炎症的方法，其中所述免疫抑制性或激动性抗人VISTA抗体或抗体片段，例如其中所述免疫抑制性或激动性抗人VISTA抗体或抗体片段可激发人VISTA对免疫的至少一种作用，例如其对T细胞活化、分化和增殖、细胞因子水平和B细胞免疫的抑制作用。
本发明的另一具体目的在于提供治疗或预防自体免疫病症、变应性病症或炎症性病症的方法，包括给有需要的患者施用治疗或预防有效量的根据前述任一项的分离的激动性抗人VISTA抗体或抗体片段，该方法用于治疗或预防狼疮或狼疮样病症或狼疮样症状，或者提供通过施用免疫抑制性或激动性抗人VISTA抗体或抗体片段来逆转、稳定和减少与狼疮或狼疮样病症相关的病理症状的方法，如“全身性红斑狼疮”或(“SLE”)、皮肤型狼疮或皮肤狼疮、药物诱导的狼疮和新生儿狼疮。
本发明的另一具体目的在于提供治疗或预防自体免疫病症、变应性病症或炎症性病症的方法，包括给有需要的患者施用治疗或预防有效量的根据前述任一项的分离的激动性抗人VISTA抗体或抗体片段，该方法通过施用免疫抑制性或激动性抗人VISTA抗体或抗体片段用于在有需要的受试者中治疗或预防与自体免疫或炎症性病症相关的肾炎、炎性肾损害或蛋白尿。
本发明的另一具体目的在于提供治疗或预防自体免疫病症、变应性病症或炎症性病症的方法，包括给有需要的患者施用治疗或预防有效量的根据前述任一项的分离的激动性抗人VISTA抗体或抗体片段，该方法通过施用免疫抑制性或激动性抗人VISTA抗体或抗体片段用于在有需要的受试者中治疗或预防涉及炎症诱导的脾肿大或淋巴组织增生的炎症性病症。
本发明的另一具体目的在于提供通过施用根据本发明的免疫抑制性或激动性抗人VISTA抗体或抗体片段来在有需要的受试者中促进IL-9表达和/或减少LIX/CXCL5表达的方法。
本发明的另一具体目的在于提供治疗、抑制或预防狼疮或狼疮样病症的至少一种病理性副作用的方法，其中所述症状包括蛋白尿、自身抗体、细胞因子及与炎症相关的其他因子的表达增加、肾脏炎症(即狼疮性肾炎)、肾脏损伤、肺部血压增加(即肺动脉高压)、呼吸困难、神经系统和脑的炎症、颅内血管炎症、动脉硬化或冠状动脉疾病、皮疹、皮肤损害、脱发或前述症状的任何组合，所述方法通过以下来实现：通过施用根据本发明的免疫抑制性或激动性抗人VISTA抗体或抗体片段，任选还包括施用用于治疗狼疮的另一种药物，所述另一种药物任选选自皮质类固醇、其他抗炎药剂、抗疟疾药物、抗凝血剂、ACTH、其他免疫抑制剂诸如甲氨蝶呤、环磷酰胺和其他免疫调节抗体诸如贝利木单抗(belimumab)。
本发明的另一具体目的在于提供在人类患者中预防GVHD并发症如急性或慢性GVHD的发展的方法，该方法包括给所述人类患者施用根据本发明的免疫抑制性或激动性抗人VISTA抗体或抗体片段。
本发明的另一具体目的在于提供在人类患者中治疗GVHD并发症如急性或慢性GVHD的发展的方法，该方法包括给所述人类患者施用免疫抑制性或激动性抗人VISTA抗体或抗体片段。
本发明的另一具体目的在于提供通过使待移植进受体中的器官、组织或免疫细胞与免疫抑制性或激动性抗人VISTA抗体或抗体片段接触来处理所述待移植进受体中的器官、组织或免疫细胞以预防急性或慢性GVHD应答的方法，例如，其中所述移植的细胞、组织或器官是同种异体的或异种的，例如同种异体骨髓或造血细胞或骨髓谱系细胞的同种异体前体，和/或其中所述免疫抑制性或激动性抗人VISTA抗体或所述抗体片段在移植之前、同时或之后或它们的组合施用，和/或其中所述移植物包含同种异体细胞，将所述同种异体细胞施用给患者以治疗血液的恶性或遗传性疾病或其他疾病，例如再生障碍性贫血、骨髓纤维化或化疗和放疗后的骨髓衰竭。
本发明的另一具体目的在于提供在作为骨髓移植受体的受试者中降低机会性感染的易感性的方法，该方法包括选择已具有同种异体骨髓或造血干细胞移植物的受试者；并给所述受试者施用治疗有效量的包含VISTA激动性抗体的药物组合物和有效量的机会性感染的抗原；其中所述药物组合物和所述抗原可在所述受试者中降低所述机会性感染的易感性，任选还包括将所述移植细胞、组织或器官与免疫抑制性药物一起施用或相接触，以及/或者该方法还包括施用或使用另一种药物，所述另一种药物任选选自TNF-α拮抗剂、IL-6拮抗剂、羟氯喹、皮质类固醇、其他抗炎剂、抗凝剂、ACTH和其他免疫抑制剂诸如甲氨蝶呤、环磷酰胺、柳氮磺胺吡啶、来氟米特(leflunomide)、金硫基苹果酸钠、环孢菌素、B细胞耗竭性和抑制性抗体以及其他免疫调节抗体。
本发明的另一具体目的在于提供治疗或预预防疗或预防牛皮癣或另一种炎性皮肤病症例如涉及免疫细胞(如T细胞)浸润的炎性皮肤病症的方法，或者逆转、稳定和减少与牛皮癣或另一种炎性皮肤病症例如涉及免疫细胞浸润的炎性皮肤病症相关的病理症状的方法，所述方法通过施用根据本发明的免疫抑制性或激动性抗人VISTA抗体或抗体片段来实现，任选其中所述牛皮癣或另一种炎性皮肤病症例如涉及免疫细胞浸润的炎性皮肤病症选自斑块状牛皮癣、脓疱性牛皮癣、皮褶性牛皮癣、滴状牛皮癣、红皮病性牛皮癣、药物诱导的牛皮癣，或者包含斑块状银屑病。
本发明的另一具体目的在于提供通过施用免疫抑制性或激动性抗人VISTA抗体或抗体片段在有需要的受试者中治疗或预防、抑制、逆转或防止CD3+T细胞浸润进组织中的方法，其中所述浸润与自体免疫病症或炎症性病症的病理学相关。
本发明的另一具体目的在于提供通过施用免疫抑制性或激动性抗人VISTA抗体或抗体片段来治疗、抑制或预防牛皮癣或另一种炎性皮肤病症的至少一种病理性副作用的方法，其中所述症状包括严重瘙痒、皮肤斑块、发红、其他皮肤变色或斑片、皮疹、皮肤脓疱、皮肤鳞屑、指甲凹陷或变色或者前述症状的任何组合，任选包括施用用于治疗牛皮癣或另一种炎性皮肤病症的另一种药物，所述另一种药物任选选自IL-12拮抗剂、IL-17拮抗剂、IL-23拮抗剂、TNF-α拮抗剂、IL-6拮抗剂、羟氯喹、皮质类固醇、其他抗炎剂、ACTH和其他免疫抑制剂诸如甲氨蝶呤、环磷酰胺、柳氮磺胺吡啶、来氟米特、金硫基苹果酸钠、环孢菌素、类视黄醇类、维生素D类似物、环孢菌素、氨甲酰羟基脲(hydroxycarbamide)、富马酸酯诸如富马酸二甲酯，以及其他免疫调节抗体。
本发明的另一具体目的在于提供治疗或预预防疗或预防关节炎或关节炎样病症或者关节炎和关节炎样症状的方法，或者逆转、稳定和减轻与关节炎和关节炎样病症相关的病理症状的方法，所述方法通过施用免疫抑制性或激动性抗人VISTA抗体或抗体片段来实现，例如其中关节炎和关节炎样病症选自类风湿性关节炎(“RA”)、牛皮癣关节炎(“PA”)和骨关节炎(“OA”)。
本发明的另一具体目的在于提供通过施用免疫抑制性或激动性抗人VISTA抗体或抗体片段来在有需要的受试者中治疗或预预防疗或预防与自体免疫或炎症性病症相关的关节炎症或关节疼痛的方法。
本发明的另一具体目的在于提供通过施用免疫抑制性或激动性抗人VISTA抗体或抗体片段来治疗、抑制或预防关节炎或关节炎样病症的至少一种病理副性作用的方法，其中所述症状包括关节损伤、关节疼痛、肺或心脏炎症、低红血细胞计数、发热、急性或慢性疲劳、血管炎、纤维化诸如肺纤维化、肾淀粉样变性、动脉粥样硬化、心肌梗塞、中风或前述症状的任何组合。
本发明的另一具体目的在于提供在人类患者中预防或治疗急性或慢性感染以及与急性或慢性感染相关的炎性应答和/或细胞因子应答的方法，该方法包括给所述人类患者施用免疫抑制性或激动性抗人VISTA抗体或抗体片段。
本发明的另一具体目的在于提供在人类患者中预防或治疗急性或慢性肝炎感染以及与急性或慢性肝炎感染相关的炎性应答和/或细胞因子应答的方法，该方法包括给所述人类患者施用免疫抑制性或激动性抗人VISTA抗体或抗体片段。
本发明的另一具体目的在于提供在人类患者中预防或治疗肝毒性或肝损伤(例如与急性或慢性感染相关的肝毒性或肝损伤)以及与急性或慢性感染或肝硬化或者酒精或药物滥用相关的炎性应答和/或细胞因子应答的方法，该方法包括给所述人类患者施用激动性抗人VISTA抗体或抗体片段，例如，其中所治疗的患者患有甲型、乙型、丙型、丁型、戊型或庚型肝炎。
本发明的另一具体目的在于提供根据前述任一项的治疗或预防方法，其中所述激动性抗VISTA抗体通过全身性或非全身性施用途径模式施用，例如在前面主张的内容中，激动性抗VISTA抗体通过注射、局部、吸入或口服来施用，和/或激动性抗VISTA抗体通过静脉内施用、皮下施用、动脉内施用、肌肉内施用、肠胃外施用、脊柱施用或表皮施用(例如通过注射或输注)来施用，和/或激动性抗VISTA抗体通过全身性或非全身性施用途径模式施用，和/或激动性抗VISTA抗体通过静脉内施用、皮下施用、动脉内施用、肌肉内施用、肠胃外施用、脊柱施用或表皮施用(例如通过注射或输注)来施用。
本发明的另一具体目的在于提供根据前述任一项的治疗或预防方法、组合物或者抗体或抗体片段，其中所述激动性抗VISTA抗体与另一种免疫激动剂联合施用，所述另一种免疫激动剂是例如激动性抗PD-1抗体或抗体片段、激动性抗PD-L1抗体或抗体片段、激动性PD-L1多肽或其片段(其可以是单价的或多聚体的)、激动性PD-1多肽或其片段(其可以是单价的或多聚体的)或包含前述任一者的复合物或融合蛋白，其中这些激动剂可以单独施用或者以组合的方式并且以任一次序施用。
本发明的另一具体目的在于提供根据前述任一项的治疗或预防方法或者抗体或抗体片段，其中所述激动性抗VISTA抗体是人型、人源化型、多特异性型或嵌合型的。
本发明的另一具体目的在于提供根据前述任一项的治疗或预防方法、组合物或者抗体或抗体片段，其中所述激动性抗VISTA包含可任选进行突变的人IgG2恒定区或Fc区。
本发明的另一具体目的在于提供根据前述任一项的治疗或预防方法或者抗体或抗体片段，其中所述激动性抗VISTA抗体包含人IgG2恒定结构域或其片段或者hIgG1、hIgG3、hIgG4、IgA、IgD、IgE或IgM，其中所述抗体的整个或基本上整个铰链结构域和CH1结构域以及任选整个或基本上整个轻链恒定区已用hIgG2的相应的整个或基本上整个轻链以及铰链结构域和CH1结构域(“H2区”或“H2结构域”)替换。
本发明的另一具体目的在于提供根据前述任一项的治疗或预防方法或者抗体或抗体片段，其中所述激动性抗VISTA抗体包含人IgG2恒定结构域或其片段，其中第127位的重链半胱氨酸残基和第214位的轻链半胱氨酸残基(其中编号方式是根据Kabat)中的一者或二者缺失或改变成不同的氨基酸残基，从而导致所得的经修饰的抗体的激动特性相对于其中这些残基未改变的抗体增加，和/或其中所述VISTA激动性抗体包含人IgG2恒定结构域或其片段，其中所述抗体的H2区中第214位的半胱氨酸残基被突变或用另一个氨基酸置换和/或重链的第127、232或233位的半胱氨酸残基中的一者或多者缺失或用另一个氨基酸置换，和/或所述VISTA激动性抗体包含人IgG2恒定结构域或其片段，其中至少一个半胱氨酸残基缺失或改变成另一个氨基酸，和/或所述激动剂包含具有与图4中的任何抗体相同的CDR的抗体。
本发明的另一具体目的在于提供根据前述任一项的治疗或预防方法或根据前述任一项的抗体或抗体片段，其中所述激动性抗VISTA抗体与1E8、GA1、GG8中的任一者或具有图4中所示序列的任何其他抗体竞争或与1E8、GA1、GG8中的任一者或具有图4中所示序列的任何其他抗体结合至人VISTA上的相同表位。
本发明的另一具体目的在于提供根据前述任一项的治疗或预防方法或根据前述任一项的抗体或抗体片段，其中所述激动性抗VISTA抗体结合至人VISTA上的表位，该表位包含人VISTA上由1E8、GA1、GG8、INX800、INX01、INX802、INX900-919中的任一者或具有图4中所示序列的任何其他抗体所结合的表位的一个或多个残基。
附图说明
图1A-D.该图示出了可用于鉴定抑制性VISTA单克隆抗体(mAb)的体外和体内筛选测定法。A)在存在指定mAb的情况下将纯化的T细胞涂铺在抗CD3的上面72小时。通过H3掺入测量增殖。B)在存在指定抗体的情况下通过ISQ脉冲的APC刺激纯化的DO11.10T细胞6天。通过使用CTV稀释染料测量增殖。C)通过将C57BL/6细胞转移到经照射的BALB/c受体中来诱导GVHD。转移后第0、2和4天给小鼠腹膜内注射200μg抗体并分析存活情况。D)在施用ConA(15毫克/千克)之前3小时以10毫克/千克的指定抗体处理小鼠并通过Luminex在6下分析血浆中的IL-2。
图2A-F.该图显示激动性VISTA抗体在多种自体免疫疾病模型中是免疫抑制性的。A)从25周开始直至实验结束用8G8或仓鼠Ig(200μg)处理NZB/W F1小鼠3次/周。“X”表示对照处理组全部被处死的时间点。B)在施用15mg/kg(mpk)ConA前3小时用200μg抗体处理小鼠3小时并跟踪存活情况80小时。C)先用胶原II mAb、然后用LPS依次处理小鼠，通过测量足肿胀来测量关节炎。每隔一天施用8G8和仓鼠Ig(200μg)3次。D)每天将咪喹莫特(Imiquimod)施至小鼠的耳朵。在第14天，每隔一天施用8G8或仓鼠Ig(200μg)，并用卡尺测量耳厚度。E、F)每天将咪喹莫特施至小鼠背部。在第9天，对小鼠实施安乐死，并将皮肤做成切片并染色以通过IHC进行CD3表达分析。
图3.该图示出了野生型(WT)和hV-KI小鼠中VISTA的表达。从WT和VISTA KI小鼠的淋巴结中分离CD4+T细胞、CD8+T细胞、Tregs(CD4+FoxP3+)和单核细胞CD11b+,Ly6C+,Ly6G-并分别用针对小鼠或人蛋白的αVISTA抗体染色。
图4含有不同抗人VISTA抗体的序列，包括INX800、INX801和INX900-INX919的序列。
图5示出了示例性抗人VISTA抗体(即INX800和INX801)在ConA肝炎模型中的作用，该模型评估了其对不同细胞因子、趋化因子和化学引诱物的表达的影响。
图6示出了示例性抗人VISTA抗体(即INX800和INX801)在体内移植物抗宿主病(GVHD)动物模型中的作用。
图7示出了示例性激动性抗人VISTA抗体(即INX800或INX801)对CD3驱动的T细胞免疫应答的作用。
图8示出了示例性激动性抗人VISTA抗体(即INX800或INX801)对特定T细胞群体数目或对总T细胞数目的作用。
图9比较了示例性抗人VISTA抗体在ConA测定法中的作用以及对选定促炎细胞因子和炎症标志物(即IL-2、γ干扰素和IL-12p70)的表达的作用。
图10A-C：示出了不同的IgG2亚型。(A)二硫键改组导致亚型A和B，以及A/B的过渡状态(图来自Zhang,A.等，2015)。(B)可通过RP-HPLC区分各亚型。(C)所观察到的INX901的RP-HPLC色谱图。
图11：示出了IgG2A亚型或B亚型的化学富集。(黑线，顶部)色谱图示出了定义B型的明显的最左边的峰。(红线，底部)色谱图示出了定义A型的明显的右边的峰。
图12：就二硫键改组对INX901Fc沉默变体进行比较。(顶部)IgG2骨架上的INX901表现出预期的A亚型、A/B亚型和B亚型的混合物。(中间)沉默的IgG1骨架上的INX901Si作为单一亚型存在。(底部)INX901HSi具有IgG1沉默Fc区，其中CH1/铰链来自IgG2，其使得二硫键改组等同于天然IgG2。
图13.经生化偏斜的INX901形式仍然可以减少MLR中细胞因子的产生。通过Luminex分析法在72小时时间点分析来自两个独立MLR的上清液的细胞因子产生。INX901亲本、A偏斜形式和B偏斜形式都以剂量依赖的方式减少了TNFα和IL-2的产生。
图14.经基因锁定的INX901形式仍然可以减少MLR中的细胞因子产生，但Fc沉默变体不可。通过Luminex分析法在72小时时间点分析来自每个MLR的上清液的细胞因子产生。INX901亲本、A锁定形式和B锁定形式都以剂量依赖的方式减少了TNFα和IL-2的产生。含有使Fc结构域沉默的突变的Si和HSi变体不能一致地抑制细胞因子的产生。
图15.经基因锁定的INX908形式仍然可以减少MLR中的细胞因子产生，但Fc沉默变体不能。通过Luminex分析法在72小时时间点分析来自每个MLR的上清液的细胞因子产生。INX908亲本、A锁定形式和B锁定形式都以剂量依赖的方式减少了TNFα和IL-2的产生。含有使Fc结构域沉默的突变的Si和HSi变体不能一致地抑制细胞因子的产生。
图16.该图示意性地描述了用于鉴定激动性抗人VISTA抗体所结合的线性表位和非连续表位的技术。
图17：该图示出了激动性抗人VISTA抗体结合至相同的核心序列。
图18：该图汇总了根据本发明的不同抗人VISTA抗体的表位分析。
图19：该图示出了激动性抗人VISTA抗体所结合的表位，并进一步鉴定了与结合有关的重要残基。
图20：外周血中CD4T细胞的变化。100μl血中的绝对数量(左图)；CD45+细胞的频率(中图)；CD45+细胞的频率(右图)(每组n＝8，SEM，统计非配对T检验，无相等SD)。
图21：外周血中CD4T细胞活化状态的变化。(每组n＝8，SEM，统计非配对T检验，无相等SD)(MFI：中值荧光强度)。
图22：INX901处理可阻止与结肠炎进展相关的体重减轻。(每组n＝8，SEM)。
图23：INX901处理阻止了结肠缩短。(每组n＝8或4，SEM，统计非配对T检验，无相等SD)。
图24：INX901处理阻止了结肠炎发展。每个小鼠组的结肠的H-E染色切片的代表性图片。放大倍数：顶部的图片为4倍，底部的图片为20倍。箭头指示具有丰富炎性浸润的区域。注意，它们在INX901处理的结肠样品中完全不存在。
图25显示INX901处理阻止了CD3+T细胞募集至结肠。每个小鼠组的结肠的CD3染色切片的代表性图片。放大倍数：顶部的图片为4倍，底部的图片为20倍。
图26：INX901处理阻止了髓样(CD11b+)细胞募集至结肠。每个小鼠组的结肠的CD11b染色切片的代表性图片。放大倍数：顶部的图片为4倍，底部的图片为20倍。
图27示出了脾CD4T细胞的变化。在第46天(最后的抗体剂量后40天)收集脾脏并通过流式细胞术进行分析(每组n＝8或4，SEM，统计非配对T检验，无相等SD)。
图28示出了来自经IMQD处理的小鼠的皮肤切片的H-E分析。仓鼠Ig图像位于左边，8G8处理组位于右边。
图29示出了来自经IMQD处理的小鼠的皮肤切片的IHC分析。仓鼠Ig图像位于左边，8G8处理组位于右边。
图30示出了对来自IMQD处理的小鼠的皮肤切片针对视场中的CD3+细胞进行的定量分析。
图31示出了仓鼠Ig和8G8处理的小鼠的脾脏中免疫群体的定量分析。在第8天提取并分析脾脏。
图32示出了用对照Ig、INX800或INX801处理的小鼠在6小时时间点时的一组32种细胞因子中IL-2的Luminex分析。在-3小时时用每种指定的抗体预处理小鼠。在时间0时，给予小鼠15mg/kg的ConA，然后在6小时时间点时处死并放血。
图33示出了用对照Ig、INX800或INX801处理的小鼠在6小时时间点时的32种细胞因子的Luminex分析。在-3小时时用每种指定的抗体预处理小鼠。在时间0时，给予小鼠15mg/kg的ConA，然后在6小时时间点时处死并放血。
图34示出了来自实验14的经ConA处理的小鼠和未处理小鼠(mice)的ALC计数。在-3小时时用每种指定的抗体以10mpk预处理小鼠。在时间0，给予小鼠15mg/kgConA(实验14)或根本不给药(未处理)，然后在6小时时放血以用于通过流式细胞术进行ALC计数。
图35示出了用仓鼠Ig、8G8或13F3处理的小鼠在6小时时间点时的一组32种细胞因子中血清IL-2的Luminex分析。在-3小时时用每种指定的抗体预处理小鼠。在时间0时，给予小鼠15mg/kg的ConA，然后在6小时时间点时处死并放血。
图36示出了30mg/kg ConA处理的小鼠的Kaplan Meier曲线。在-3小时时用每种指定的抗体预处理小鼠。在时间0时，给予小鼠30mg/kg的ConA，然后进行存活情况分析。
图37示出了用对照Ig、INX800或INX903处理的小鼠在6小时时间点时的血浆中的IL-2表达。在-3小时时用每种指定的抗体预处理小鼠。在时间0时，给予小鼠15mg/kg的ConA，然后在6小时时间点时处死并放血。
图38A-B示出了用对照Ig、INX800、INX903或拮抗剂处理的小鼠在6小时时间点时的血浆中的IL-2和MIP-1β表达。在-3小时时用每种指定的抗体预处理小鼠。在时间0时，给予小鼠15mg/kg的ConA，然后在6小时时间点时处死并放血。
图39含有CIA关节炎模型的实验方案。
图40示出了激动性抗小鼠VISTA抗体8G8在胶原诱导的关节炎模型中的作用。如所示的，在第-2天开始处理，随后每隔一天对小鼠进行给药。(每组n＝10)。8G8处理显著降低了疾病严重程度(交互作用项P<0.000005)。
图41含有实施例9中的CIA关节炎模型实验的实验方案。
图42示出了实施例8的实验的CAIA疾病进展评分。如所示的，在第-2天开始处理，随后每隔一天对小鼠进行给药。(每组n＝10)。8G8处理显著降低了疾病严重程度(交互作用项P<0.000005)。
图43示出了CAIA疾病进展评分。在第-2天开始处理，随后每隔一天对小鼠进行给药。(对照组中n＝9，INX903处理组中n＝8；从对照组中移除了1只小鼠，因为它从未显示任何疾病迹象)。INX903处理显著降低了疾病严重程度(交互作用项P＝0.01)。
图44示出了CAIA疾病进展评分。在第-2天开始处理，随后每隔一天对小鼠进行给药。(每组n＝10)。8G8处理显著降低了疾病严重程度(交互作用项P<0.0001)。
图45示出了用INX800处理时的CAIA疾病进展评分。在第-2天开始处理，随后每隔一天对小鼠进行给药。(对照组n＝9，INX800处理组n＝8)。
图46示出了用INX901处理时的CAIA疾病进展评分。在第-2天开始处理，随后每隔一天对小鼠进行给药。(对照组n＝9，INX901处理组n＝10)。
图47示出了用INX902处理时的CAIA疾病进展评分。在第-2天开始处理，随后每隔一天对小鼠进行给药。(对照组n＝9，INX902处理组n＝7)。
图48A-B示出了急性GvHD疾病模型中用8G8、13F3或对照仓鼠IgG抗体处理的受体小鼠的重量和存活情况。
图49示出了急性GvHD疾病模型中用INX抗VISTA抗体或对照Ig处理的受体小鼠的重量。A：疾病高峰期时的每组平均体重减轻(每组n＝5-8只小鼠)；B：每组平均体重减轻(每组n＝5-8只小鼠)；C：存活情况。
图50A-C示出了急性GvHD疾病模型中用INX901、INX902、INX903和INX904或对照Ig处理的存活小鼠中的嵌合状态和供体T细胞数目。A)α-人VISTA处理的小鼠(左边分图)或Balb/c对照小鼠(右边小图)中的血液CD11b细胞中供体(H2Kb，竖直)或受体(H2Kd，水平)表达的代表性图。B)α-人VISTA处理的小鼠的血液中供体来源的CD11b的百分比。C)嵌合型α-人VISTA处理的小鼠或DDE1对照小鼠的25μl血液中的供体来源的T细胞数目。
图51A-B示出了异种GvHD疾病模型中用INX901或对照抗体处理的NSG小鼠的重量。51A：每组平均值(n＝6)；51B：个体小鼠的重量。骷髅图指示小鼠在指定日期被发现死亡或被执行安乐死。
图52示出了异种GvHD疾病模型中用INX901或对照抗体处理的NSG小鼠中的T细胞扩增。该图示出了人CD3+T细胞占小鼠外周循环中总CD45+细胞的百分比值。
图53A-C示出了急性GvHD疾病模型中用8G8抗体或对照仓鼠IgG处理的受体小鼠的重量和存活情况；53A：每组平均体重减轻(每组n＝8只小鼠)；53B：每组个体体重减轻(每组n＝8只小鼠)；53C：存活情况。
图54A-B示出了急性GvHD疾病模型中用多种剂量的INX902或对照Ig处理的受体小鼠的体重和存活情况；图54A示出了INX902处理的小鼠的每组平均体重减轻(每组n＝8只小鼠)，图54B示出了INX902处理的小鼠的存活情况。
图55A-B示出了急性GvHD疾病模型中用多种剂量的INX902或对照Ig处理的存活小鼠中的嵌合状态；图55A示出了INX902处理的小鼠的血液中供体来源的CD11b的百分比，图55B示出了INX902处理的小鼠或DDE1对照小鼠的25μl血液中的供体来源的细胞数目。
图56A-D示出了急性GvHD疾病模型中用多种剂量的INX903和INX901抗体或对照Ig处理的受体小鼠的体重和存活情况；图56A示出了每组平均体重减轻(每组n＝8只小鼠)，图56B示出了INX903处理的小鼠的存活情况；图56C示出了INX901处理的小鼠的每组平均体重减轻(每组n＝8只小鼠)；图56D示出了INX901处理的小鼠的存活情况。
图57A-B示出了急性GvHD疾病模型中用多种剂量的INX901和INX901或对照Ig处理的存活小鼠中的嵌合状态；图57A：INX903处理的小鼠的血液中供体来源的CD11b的百分比；图57B：INX901处理的小鼠的血液中供体来源的CD11b的百分比。
图58A-C示出了急性GvHD疾病模型中用INX抗体或对照Ig处理的受体小鼠的重量；图58A示出了每组平均体重减轻(每组n＝8只小鼠)；图58B：每组个体体重减轻(每组n＝8只小鼠)，16C为存活情况。
图59显示通过将T细胞和BM从hV-KI小鼠转移到经照射的Balb/c受体中诱导急性GvHD。通过体重减轻跟踪小鼠的疾病，如果体重减轻超过初始起始体重的20％则处死小鼠。
图60显示激动性抗VISTA抗体8G8延迟NZBWF-1小鼠的蛋白尿发作。在实验中，每周监测16周龄雌性NZBWF-1小鼠的蛋白尿。使用化学测试条记录蛋白尿值并定量为mg/dL。在第32周，通过腹膜内注射每周三次用300ug对照IgG(黑色线条，n＝5)或300ug8G8(红色线条，n＝5)处理小鼠。在第33周，用对照IgG处理的小鼠由于健康状况不佳而被处死。
图61显示检测了对照Ig和8G8处理的NZBWF-1小鼠的血清中的LIX/CXCL5和IL-9水平。在第33周从对照IgG(n＝5)和8G8小鼠(n＝5)收集血清，并使用Bio-plex 200系统运行32重测定法(32plex)评估趋化因子和细胞因子，并通过Bio Plex manager 6.0软件分析。数据显示为平均值+/-SEM，统计显著性由未配对Student t检验测定。在图7中，**表示组之间的显著性(p<0.01)。
图62显示8G8可减少NZBWF-1小鼠中的蛋白尿发展。在实验中，每周监测22周龄雌性NZBWF-1小鼠的蛋白尿。使用化学测试条记录蛋白尿值并定量为mg/dL。在第28周，通过腹膜内注射每周三次用300ug对照IgG(黑色线条，n＝6)或300ug 8G8(红色线条，n＝6)处理小鼠。
图63显示在实验中VISTA激动剂8G8减少了MRL/lpr小鼠中的蛋白尿发展，其中每周监测15周龄雌性MRL/lpr小鼠的蛋白尿。使用化学测试条记录蛋白尿值并定量为mg/dL。在第16周，通过腹膜内注射每周三次用300ug仓鼠IgG(黑色线条，n＝8)或300ug8G8(红色线条，n＝8)处理小鼠。由于化学测试条的技术问题，第21周的数据被丢弃。(A)示出了带标准误差条的蛋白尿平均值。(B)每个时间点的疾病发生率计算为每组中表现出等于或大于100mg/dL的蛋白尿的小鼠的百分比。
图64显示在实验中VISTA激动剂8G8(抗小鼠VISTA激动性抗体)在MRL/lpr小鼠中减少了脾肿大，其中在第23周从每周三次经腹膜内注射用300ug对照Ig/仓鼠Ig或300ug8G8处理的小鼠收获脾脏。与8G8处理的小鼠相比，在对照Ig处理的小鼠中观察到脾肿大。这里显示的是代表性的脾脏。
图65显示在实验中VISTA激动剂8G8(抗小鼠VISTA激动性抗体)在MRL/lpr小鼠中减少了颈部淋巴结的淋巴组织增生，其中在第23周从每周三次经腹膜内注射用300ug对照Ig/仓鼠Ig或300ug 8G8处理的小鼠收获颈部淋巴结。与8G8处理的小鼠相比，在对照Ig处理的小鼠中观察到淋巴组织增生。这里显示的是代表性的颈部淋巴结。
图66A-B显示在实验中8G8(抗小鼠VISTA激动性抗体)减少了MRL/lpr小鼠中的蛋白尿发展，其中每周监测9周龄雌性MRL/lpr小鼠的蛋白尿。使用化学测试条记录蛋白尿值并定量为mg/dL。在第11周，通过腹膜内注射每周三次用200μl PBS(黑色虚线，n＝8)或10mg/kg仓鼠Ig(实心黑线，n＝8)或10mg/kg 8G8(红色线条，n＝2)处理小鼠。(A)示出了带标准误差条的蛋白尿平均值。(B)每个时间点的疾病发生率计算为每组中表现出等于或大于100mg/dL的蛋白尿的小鼠的百分比。
图67示出了实施例中提及的DDE1转移实验的实验设计。INX903(含有VSTB95抗体可变区(参见图4)和野生型人IgG2恒定区的抗人VISTA激动性抗体)。在实验中，在DDE1转移后第0、2和6天施加处理。在每个时间点，分析每组4只小鼠加1只未处理小鼠。处理脾脏用于流式细胞术，并从心脏血液回收血清用于通过ELISA检测抗dsDNA IgG。
图68含有DDE1转移实验的结果。结果表明供体和宿主细胞群体可通过其I类MHC等位基因区分。宿主B6D2F1细胞表达H-2Kb和H-2Kd二者，而供体DDE1细胞仅表达H-2Kb。
图69A-C含有DDE1转移实验的进一步结果。该图显示通过INX903处理阻止了SLE进展期间的B细胞活化。图A含有受体B细胞上MHCII IAd表达的直方图。图B示出了实验过程中受体B细胞和脾细胞的总数以及实验过程中受体B细胞上的II类MHC IAd的MFI(n＝4,SEM)。图C示出了第14天的脾脏大小。
图70含有DDE1转移实验的进一步结果。具体而言，图中的结果显示通过INX903处理防止了SLE中的抗dsDNA自身抗体产生。在第7天和第14天在未处理小鼠(n＝2)和人IgG2或INX903处理的小鼠(n＝4,SEM)中通过ELISA测量血清中的抗dsDNA IgG滴度。
图71含有DDE1转移实验的进一步结果。图中的数据显示，INX903处理的CD4T细胞在第1天CD69表达降低(n＝4)。
图72含有DDE1转移实验的进一步结果。图中的数据显示INX903处理的小鼠中CD4T细胞的数目降低，尽管细胞周期没有变化(n＝4)。
图73还显示响应于INX903处理，总供体CD4T细胞数目随时间推移而降低。
图74A-B：显示8G8减少了MRL/lpr小鼠的蛋白尿发展。如图所示，每周监测15周龄雌性MRL/lpr小鼠的蛋白尿。使用化学测试条记录蛋白尿值并定量为mg/dL。在第16周，通过腹膜内注射每周三次用300ug仓鼠IgG(黑色线条，n＝8)或300ug 8G8(红色线条，n＝8)处理小鼠。由于化学测试条的技术问题，第21周的数据被丢弃。(A)示出了带标准误差条的蛋白尿平均值。(B)每个时间点的疾病发生率计算为每组中表现出等于或大于100mg/dL的蛋白尿的小鼠的百分比。
图75显示8G8施用减少了MRL/lpr小鼠的脾肿大。在第23周从每周三次通过腹膜内注射用300ug对照Ig/仓鼠Ig或300ug 8G8处理的小鼠收获脾脏。与8G8处理的小鼠相比，在对照Ig处理的小鼠中观察到脾肿大。这里显示的是代表性的脾脏。
图76显示8G8施用减少了MRL/lpr小鼠中颈部淋巴结的淋巴组织增生。在第23周从每周三次通过腹膜内注射用300ug对照Ig/仓鼠Ig或300ug 8G8处理的小鼠收获颈部淋巴结。与8G8处理的小鼠相比，在对照Ig处理的小鼠中观察到淋巴组织增生。这里显示的是代表性的颈部淋巴结。
图77含有实验结果，其表明8G8施用减少了NZBWF-1小鼠的蛋白尿发展。
图78含有实验结果，其表明8G8施用不影响免疫复合体NZBWF-1小鼠。
具体实施方式
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。虽然与本文所述的那些类似或等效的方法和材料均可用于本发明中或本发明的测试，但是本文描述合适的方法和材料。材料、方法和实例仅为说明性的，并且无意进行限制。与本文所述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学相结合使用的命名法以及这些化学的实验室程序和技术在本领域众所周知且常用。标准技术可用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及患者治疗。
如本文描述和随附权利要求书通篇所用，除非上下文另外明确规定，否则“一个(种)(a,an)”和“该(所述)(the)”的含义包括多个指代物。
如本文所用，“活化受体”泛指结合抗原、复合抗原(例如，在MHC分子的背景下)、Ig-融合蛋白、配体或抗体的免疫细胞受体。活化受体但不限于T细胞受体(TCR)、B细胞受体(BCR)、细胞因子受体、LPS受体、补体受体和Fc受体。例如，T细胞受体存在于T细胞上并与CD3分子缔合。T细胞受体受MHC分子背景下的抗原(以及受多克隆T细胞活化试剂)刺激。经由TCR进行的T细胞活化可导致许多变化，例如蛋白质磷酸化、膜脂质改变、离子通量、环核苷酸改变、RNA转录改变、蛋白质合成改变和细胞体积改变。例如，T细胞受体存在于T细胞上并与CD3分子缔合。T细胞受体受MHC分子背景下的抗原(以及受多克隆T细胞活化试剂)刺激。经由TCR进行的T细胞活化可导致许多变化，例如蛋白质磷酸化、膜脂质改变、离子通量、环核苷酸改变、RNA转录改变、蛋白质合成改变和细胞体积改变。
如本文所用，“佐剂”指用于刺激免疫系统和增加对疫苗的应答的试剂，其本身没有任何特异性抗原作用。
如本文所用，“激动剂”指可增强或模拟特定分子对免疫的作用的分子，通常是抗体或融合蛋白。一般而言，在本申请中，这将指可增强或模拟人VISTA对免疫的作用，特别是VISTA对T细胞免疫(CD4+和/或CD8+T细胞免疫)、促炎细胞因子的表达的抑制作用以及其对特定趋化因子和化学引诱物表达的作用的抗人VISTA激动性抗体和抗体片段。
本文中的“有助于诊断”或“有助于检测”疾病意指特定的标志多肽或表达的RNA的表达水平被单独地或与一种或多种其他标志物相结合检测以评估个体是否具有特定疾病病症的细胞特征或特定疾病病症的发作或者具有免疫功能失调，诸如表征为VISTA表达的免疫抑制或表征为细胞具有降低的VISTA水平的异常免疫上调，例如在自体免疫、炎症或变应性应答期间，如在患有慢性和非慢性疾病的个体中。
如本文所用，“变应性疾病”泛指涉及变态反应的疾病。更具体而言，“变应性疾病”被定义为鉴别到其变应原的疾病，其中暴露于该变应原与发生病理变化之间存在强相关性，并且其中该病理变化已证明具有免疫学机制。在本文中，免疫学机制意指白细胞显示出对变应原刺激的免疫应答。
如本文所用，“氨基酸”泛指天然存在的和合成的氨基酸，以及以于天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及后来经修饰的那些氨基酸(如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸)。氨基酸类似物是指基本化学结构与天然存在的氨基酸相同(即，碳结合至氢、羧基、氨基)并且具有R基团(如高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍)的化合物。类似物可具有经修饰的R基团(例如正亮氨酸)或经修饰的肽主链，但仍保留了与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指不同于氨基酸的一般化学结构，但以以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的化合物。
如本文所用，“无反应性”或“耐受性”或“延长的抗原特异性T细胞抑制”或“延长的免疫抑制”泛指对活化受体介导的刺激的抵抗性(Reflectivity)。抵抗性通常是抗原特异性的，并且在停止暴露于耐受性抗原后持续存在。例如，T细胞中的无反应性(与无应答性相对)表征为缺乏细胞因子产生，例如IL-2。当T细胞暴露于抗原并在不存在第二信号(共刺激信号)时接收第一信号(T细胞受体或CD-3介导的信号)时，发生T细胞无反应性。在这些条件下，细胞再次暴露于相同的抗原(即使是在存在共刺激分子的情况下发生再暴露)会导致不能产生细胞因子，并因此不能增殖。然而，无反应性T细胞可对无关抗原发生应答，并且可在用细胞因子(如IL-2)培养时增殖。例如，T细胞无反应性也可通过T淋巴细胞缺乏IL-2产生而观测到，如通过ELISA或通过使用指示细胞系的增殖测定法来测量。作为另一种选择，可使用报告基因构建体。例如，无反应性T细胞不能引发由异源启动子在5'IL-2基因增强子控制下诱导的或由可见于增强子内的API序列的多聚体诱导的IL-2基因转录(Kang等(1992)Science 257:1134)。共刺激信号的调节可导致免疫细胞的效应功能的调节。
“拮抗剂”在本文中是指可阻断或降低具体分子对免疫的作用的分子，通常是抗体或融合蛋白。一般而言，在本申请中，这将指可阻断或降低人VISTA对免疫的作用，特别是VISTA对T细胞免疫(CD4+和/或CD8+T细胞免疫)、促炎细胞因子的表达的抑制作用以及VISTA对特定趋化因子和化学引诱物表达的作用的抗人VISTA拮抗性抗体和抗体片段。
如本文所用，“抗体”泛指抗体的“抗原结合部分”(也可与“抗体部分”、“抗原结合片段”、“抗体片段”互换使用)，以及完整的抗体分子。如本文所用，术语“抗原结合部分”是指抗体保留特异性结合抗原的能力的一个或多个片段(例如，VISTA或其特定部分))。本文所提及的术语“抗体”包括完整的多克隆和单克隆抗体及其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链以及双特异性和多特异性抗体，例如结合多种抗原或多种抗原表位的抗体。“抗体”是指包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，或其抗原结合部分。每条重链由至少一个重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域(CH1、Cm和Cm-)组成。每条轻链由至少一个轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域(CL-)组成。VH和VL区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，散布有更保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端到羧基末端按照以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白结合至宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)。更通常而言，术语“抗体”旨在包括具有匹配并识别表位的特定形状的任何含多肽链的分子结构，其中一个或多个非共价结合相互作用可稳定该分子结构与表位之间的复合物。原型抗体分子是免疫球蛋白，并且来自所有来源(人类、啮齿动物、兔、牛、绵羊、猪、狗、其他哺乳动物、鸡、其他禽类等)的所有类型的免疫球蛋白(IgG、IgM、IgA、IgE、IgD等)均视为“抗体”。
抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段执行。涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”内的抗原结合片段的非限制性实例包括(a)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(b)F(ab’)2片段，其为包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(c)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(d)由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(e)dAb片段(Ward等(1989)Nature 341:544-546)，其由VH结构域组成；以及(f)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域(VL和VH)由单独的基因编码，但它们可以利用重组方法通过合成接头连接，使得它们能够作为单个蛋白质链制备，其中VL和VH区配对而形成单价分子(称为单链Fv(scFv))。参见例如Bird等(1988)Science242:423-426；Huston等(1988)Proc Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；以及Osbourn等(1998)Nat.Biotechnol.16:778。单链抗体也旨在涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”内。也可以将任何特异性scFv的VH和VL序列与人免疫球蛋白恒定区cDNA或基因组序列连接以产生编码完整IgG分子或其他同种型的表达载体。VH和VL也可以利用蛋白质化学或重组DNA技术用于产生免疫球蛋白的Fab、Fv或其他片段。还涵盖其他形式的单链抗体，诸如双体。双体是二价的双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单条多肽链上表达，但使用的接头太短而不允许同一链上的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对从而产生两个抗原结合位点。参见例如Holliger等(1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448；Poljak等(1994)Structure 2:1121-1123。更进一步地，抗体或其抗原结合部分(抗原结合片段、抗体片段、抗体部分)可以是较大免疫粘附分子的一部分，免疫粘附分子通过抗体或抗体部分与一种或多种其他蛋白质或肽的共价或非共价缔合而形成。免疫粘附分子的实例包括使用链霉亲和素核心区来制备四聚体scFv分子(Kipriyanov等(1995)Hum.AntibodiesHybridomas 6:93-101)以及使用半胱氨酸残基、标记肽和C端多组氨酸标签来制备二价和生物素化的scFv分子。Kipriyanov等(1994)Mol.Immunol.31:1047-1058。抗体部分，诸如Fab和F(ab’)2片段，可以使用常规技术(诸如分别对完整的抗体进行木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化)从完整抗体制备。此外，如本文所述，可以使用标准的重组DNA技术获得抗体、抗体部分和免疫粘附分子。抗体可以是多克隆抗体、单克隆抗体、异种抗体、同种异体抗体、同基因抗体或它们经修饰的形式，例如人源化抗体、嵌合型抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。
如本文所用，“识别抗原的抗体”和“抗原特异的抗体”可与术语“特异性地结合至抗原的抗体”互换使用，并且是指特异性地结合抗原的免疫球蛋白或其片段。
如本文所用，“抗原”泛指能够被抗体结合的分子或分子的一部分，其另外能够诱导动物产生能够结合至该抗原的表位的抗体。抗原可具有一个表位或者具有一个以上的表位。本文提及的特异性反应表示抗原将以高度选择性的方式与其相应抗体而非与众多可能由其他抗原激发的其他抗体反应。在对所关注的特定抗原有所需增强的免疫应答的情况下，抗原包括但不限于示例性的感染性疾病抗原，针对其可引发保护性免疫应答。
如本文所用，“抗原递呈细胞”泛指专职性抗原递呈细胞(例如B淋巴细胞、单核细胞、树突细胞和朗格汉斯细胞(Langerhans cell))以及其他抗原递呈细胞(例如角质细胞、内皮细胞、星形胶质细胞、成纤维细胞和少突胶质细胞)。
如本文所用，“反义核酸分子”泛指与编码蛋白质的“有义”核酸互补(例如与双链cDNA分子的编码链互补)、与mRNA序列互补或与基因的编码链互补的核苷酸序列。因此，反义核酸分子可以通过氢键结合至有义核酸分子。
如本文所用，“细胞凋亡”泛指程序性细胞死亡，其可使用本领域已知的技术表征。凋亡性细胞死亡可表征为在细胞分裂中以细胞收缩、膜起泡和染色质凝聚告终。正经历凋亡的细胞还显示核小体间DNA裂解的特征模式。
如本文所用，“自体免疫”或“自体免疫疾病或病症”泛指由个体自身组织引起或针对个体自身组织而产生的疾病或病症，或其共分离或表现、或由其产生的病症。本文中的自体免疫病症包括炎性或变应性病症，例如表征为针对潜在与组织破坏相关的自身抗原的宿主免疫反应的慢性疾病，诸如类风湿性关节炎。
如本文所用，“B细胞受体(BCR)”泛指见于B细胞上的在膜Ig(mIg)与其他跨膜多肽(如IgA和Ig)之间的复合物。mIg的信号转导功能由受体分子通过低聚抗原或多聚抗原交联触发。B细胞也可通过抗免疫球蛋白抗体活化。在BCR活化时，在B细胞中发生许多变化，包括酪氨酸磷酸化。
如本文所用，“癌症”泛指表征为细胞分裂异常且不受控制从而导致恶性生长或肿瘤(例如细胞生长不受调节)的任何肿瘤疾病(无论是浸润性的还是转移性的)。本文所用的术语“癌症”或“癌性”应理解为涵盖表征为引起恶性生长或肿瘤的异常且不受控制的细胞分裂的任何肿瘤性疾病(无论是浸润性的、非浸润性的还是转移性的)，本文描述了其非限制性实例。这包括哺乳动物中通常表征为不受调节的细胞生长的任何生理状况。在工作实施例中举例说明了癌症的实例。另外的癌症包括但不限于：癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。这类癌症的更具体的实例包括：鳞状细胞癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(包括胃肠癌)、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾脏癌或肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌和各种类型的头颈癌，以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞性(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥漫性NHL；高级免疫母细胞NHL；高级淋巴细胞性NHL；高级小无核裂细胞NHL；肿块性NHL；套细胞淋巴瘤；艾滋病相关淋巴瘤；和瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症)；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；急性成淋巴细胞性白血病(ALL)；毛细胞白血病；慢性成髓细胞性白血病；多发性骨髓瘤和移植后淋巴增生性障碍(PTLD)。适合于通过本发明治疗的其他癌症包括但不限于：癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴性恶性肿瘤。此类癌症的更具体的例子包括：结肠直肠癌、膀胱癌、卵巢癌、黑素瘤、鳞状细胞癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(包括胃肠癌)、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾脏癌或肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌和各种类型的头颈癌，以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞性(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥漫性NHL；高级免疫母细胞NHL；高级淋巴细胞性NHL；高级小无核裂细胞NHL；肿块性NHL；套细胞淋巴瘤；艾滋病相关淋巴瘤；和瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症)；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；急性成淋巴细胞性白血病(ALL)；毛细胞白血病；慢性成髓细胞性白血病；和移植后淋巴增生性障碍(PTLD)，以及瘢痣病相关的异常血管增生、水肿(诸如与脑肿瘤相关的脑水肿)和梅格斯综合征(Meigs’syndrome)。优选地，癌症选自：结肠直肠癌、乳腺癌、结肠直肠癌、直肠癌、非小细胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、肾细胞癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、软组织肉瘤、卡波西氏肉瘤、类癌癌、头颈癌、黑素瘤、卵巢癌、间皮瘤和多发性骨髓瘤。在一个示例性实施方案中，癌症是早期或晚期(包括转移性)膀胱癌、卵巢或黑素瘤。在另一个实施方案中，癌症是结肠直肠癌。适合于本发明治疗的癌性病症包括表达或不表达VISTA的癌症，并且还包括其中免疫细胞、基质细胞或患病细胞的VISTA表达抑制抗肿瘤应答和抗浸润免疫应答的非转移性或非浸润性以及浸润性或转移性癌症。本发明的方法特别适用于血管化肿瘤的治疗。根据本发明的癌症包括表达或不表达VISTA的癌症，并且还包括其中免疫细胞、基质细胞或患病细胞的VISTA表达抑制抗肿瘤应答和抗浸润免疫应答的非转移性或非浸润性以及浸润性或转移性癌症，以及表征为血管化肿瘤的那些癌症。
如本文所用，“嵌合抗体”泛指这样一种抗体分子，其中恒定区或其部分被改变、置换或交换以使得抗原结合位点(可变区)连接至不同或改变类别、效应功能和/或物种的恒定区，或赋予该嵌合抗体以新的性质的完全不同的分子，例如酶、毒素、激素、生长因子、药物，可变区或其部分用具有不同或改变的抗原特异性的可变区改变、置换或交换。
如本文所用，“编码区”泛指包含翻译成氨基酸残基的密码子的核苷酸序列区，而术语“非编码区”是指不翻译成氨基酸的核苷酸序列区域(例如，5’和3’非翻译区)。
如本文所用，“保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列两者，并且对于特定核酸序列，泛指保守修饰的变体：其是指编码相同或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸，或其中核酸不编码基本上相同的序列的氨基酸序列。因为遗传密码的简并性，大量在功能上相同的核酸编码任何给定的蛋白质。“沉默变异”是一种保守修饰的核酸变异。在本文中编码多肽的每一核酸序列也描述该核酸的每一种可能的沉默变异。技术人员将认识到，可以修饰核酸中的每个密码子(除通常作为甲硫氨酸的唯一密码子的AUG)以及通常作为色氨酸的唯一密码子的TGG以外)以得到在功能上相同的分子。
如本文所用，“互补决定区”、“高变区”或“CDR”泛指见于抗体轻链或重链可变区中的高变区或互补决定区(CDR)中的一者或多者。参见Kabat等(1987)Sequences ofProteins of Immunological Interest National Institutes of Health,Bethesda,Md。这些表述包括如Kabat等(1983)在Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S.Dept.of Health and Human Services中定义的的高变区，或抗体3维结构中的高变环。Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917。各链中的CDR都保持在框架区的邻近处，并且与来自另一条链的CDR一起促成形成抗原结合位点。在CDR内，存在已被称为选择性决定区(SDR)的选择氨基酸，其表示在抗体-抗原相互作用中被CDR使用的关键接触残基。(Kashmiri(2005)Methods 36:25-34)。
如本文所用，“对照量”泛指标志物可为待相对于标志物的测试量加以比较的任何量或一定范围的量。例如，标志物的对照量可为患有特定疾病或病症的患者或不患有这种疾病或病症的人的体内标志物的量。对照量可为绝对量(如微克/毫升)或相对量(如相对信号强度)。
如本文所用，“共刺激受体”泛指将共刺激信号传递至免疫细胞的受体，如CD28或ICOS。如本文所用，术语“抑制性受体”包括将负信号传送至免疫细胞(如T细胞或NK细胞)的受体。
如本文所用，“共刺激”泛指共刺激分子能够提供诱导增殖或效应功能的第二非活化受体介导的信号(“共刺激信号”)的能力。例如，共刺激信号可导致细胞因子分泌(例如在已接收T细胞受体介导的信号的T细胞的情况下)。已接收细胞受体介导的信号(例如经由活化受体)的免疫细胞可在本文中称为“活化的免疫细胞”。关于T细胞，将共刺激信号传递至T细胞涉及不受环孢菌素A(cyclosporin Α)抑制的信号传导路径。此外，共刺激信号可诱导T细胞中的细胞因子分泌(如IL-2和/或IL-10)和/或可防止在T细胞中诱导抗原无应答性、诱导无反应性、或诱导细胞死亡。
如本文所用，“共刺激多肽”或“共刺激分子”指在与T细胞上的细胞表面分子相互作用后调节T细胞应答的多肽。
如本文所用，“共刺激信号传导”是由在抗原特异性T细胞应答期间抗原递呈细胞上的共刺激多肽与它们在T细胞上的受体之间的相互作用所致的信号传导活性。在不希望受单一假设的限制下，抗原特异性T细胞应答据信由以下两种信号介导：1)T细胞受体(TCR)与在MHC的情形下递呈的抗原肽接合(信号1)，和2)通过不同共刺激受体/配体对之间的接触来递送的第二抗原非依赖性信号(信号2)。在不希望受单一假设限制下，这个“第二信号”在决定T细胞应答的类型(活化还是抑制)以及该应答的强度和持续时间方面至关重要，并且由来自共刺激分子诸如B7家族的蛋白质的正信号与负信号两者调节。
如本文所用，“B7”多肽意指B7蛋白质家族的成员，所述蛋白质共刺激T细胞，包括但不限于B7-1、B7-2、B7-DC、B7-H5、B7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-S3及它们的生物活性片段和/或变体。代表性生物活性片段包括共刺激T细胞的细胞外结构域或细胞外结构域的片段。
如本文所用，“细胞质结构域”泛指蛋白质的延伸至细胞的细胞质中的部分。
如本文所用，“诊断”泛指鉴定病理状况的存在或性质。诊断方法的灵敏性和特异性存在差异。诊断测定法的“灵敏性”是测试阳性的患病个体的百分比(“真阳性”的百分比)。测定法未检测出的患病个体是“假阴性”。未患病以及在测定法中测试阴性的受试者被称为“真阴性”。诊断测定法的“特异性”是1减去假阳性率，其中“假阳性”率定义为测试阳性的无疾病者的比例。虽然特定的诊断方法可能不提供对病症的明确诊断，但若所述方法提供有助于诊断的阳性指示，那么则足够。
如本文所用，“诊断”或“有助于诊断”泛指将疾病或症状分类和/或确定个体具有疾病病症的可能性(例如基于不存在或存在VISTA表达，和/或由免疫细胞、基质细胞和/或推定患病细胞达成的表达增加或降低)；确定疾病的严重性、监测疾病进展、预测疾病的结果和/或恢复前景。术语“检测”也可任选涵盖任何前述事项。在一些实施方案中，根据本发明来诊断疾病可通过测定从受试者获得的生物样品中本发明的多核苷酸或多肽的水平来实现，其中可使测定的水平与疾病易感性或疾病的存在与否相关联。应注意，“从受试者获得的生物样品”也可任选包括尚未从受试者身体上取出的样品。
如本文所用，“有效量”泛指化合物、抗体、抗原或细胞的当向患者施用以治疗疾病时足以实现对所述疾病的治疗的量。有效量可为有效用于预防的量和/或有效用于预防的量。有效量可为有效减轻体征/症状的量、有效预防体征/症状的出现、降低体征/症状出现的严重性、消除体征/症状出现、减缓体征/症状出现的发展、防止体征/症状出现的进展和/或实现对体征/症状出现的预防的量。“有效量”可视待治疗患者的疾病及其严重性以及年龄、体重、病史、易感性和预先存在的病症而变化。为了本发明的目的，术语“有效量”与“治疗有效量”同义。
如本文所用，“细胞外结构域”或“ECD”泛指蛋白质的延生出细胞的表面的部分。
如本文所用，“表达载体”泛指用于在任何细胞(包括原核、酵母、真菌、植物、昆虫或哺乳动物细胞)中在体外或体内组成型或诱导型表达本发明的核酸序列的目的的任何重组表达系统。该术语包括线性或环状表达系统。该术语包括保持游离或整合至宿主细胞基因组中的表达系统。表达系统可具有自我复制的能力或不具有该能力，即仅驱动在细胞中的瞬时表达。该术语包括仅含有为重组核酸的转录所需的最少元件的重组表达盒。
如本文所用，“家族”泛指本发明的多肽和核酸分子，意指具有共同结构域或基序并且具有足够氨基酸或核苷酸序列同源性(如本文所定义)的两个或更多个多肽或核酸分子。家族成员可为天然或非天然存在的并且可来自相同或不同物种。例如，家族可含有第一来源以及其他来源的第一多肽、人来源的不同多肽，或者可含有非人源同系物(如猴多肽)。家族的成员也可具有共同功能特征。
如本文所用，“Fc受体”(FcR)泛指免疫球蛋白分子(Ig)的Fc部分的细胞表面受体。Fc受体见于参与免疫应答的许多细胞上。在迄今为止已鉴定的人FcR之中，有识别IgG(命名为FcγR)、IgE(FceRl)、IgA(FcaR)和聚合IgM/A(FcεμR)的那些。FcR见于以下细胞类型中：FceRI(肥大细胞)、FceRII(许多白细胞)、FcaR(嗜中性粒细胞)和FcμR(腺上皮、肝细胞)。(Hogg(1988)Immunol.Today 9:185-86)。广泛研究的FcγR为细胞免疫防御中的核心，并且负责刺激自体免疫性疾病的发病机理中涉及的炎症和水解酶的介体的释放。(Unkeless(1988),Annu.Rev.Immunol.6:251-87)。FcγR在效应细胞与分泌Ig的淋巴细胞之间的提供重要联系，因为巨噬细胞/单核细胞、多形核白细胞和天然杀伤(NK)细胞FcγR赋予由IgG介导的特异性识别的元件。人白细胞具有IgG的至少三种不同类型的FcγR受体：hFcγRI(CD64)(见于单核细胞/巨噬细胞上)、hFcγRIIA或hFcγRIIB(CD32或CD32A)(见于单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、血小板、可能还有B细胞、以及K562细胞系上)和FcγRIIIA(CD16A)或FcγRIIIB(CD16B)(见于NK细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和巨噬细胞上)。
如本文所用，“框架区”或“FR”泛指抗体的轻链和重链的可变区内的框架区的一个或多个。参见Kabat等(1987)Sequences of Proteins of Immunological InterestNational Institutes of Health,Bethesda,Md。这些表述包括插入抗体轻链和重链的可变区内的CDR之间的那些氨基酸序列区。
“移植物抗宿主病”(GVHD)：如本文所用，是指同种异体骨髓移植或造血干细胞移植的常见并发症，其中移植骨髓中的功能性免疫细胞将受体识别为“外来的”并产生针对宿主组织d免疫应答。根据1959年的Billingham标准，发生GVHD必须满足三个标准：1)施用免疫活性移植物，其含有有活力且有功能的免疫细胞；2)受体在免疫学上是组织不相容的；3)受体免疫功能低下，因此不能破坏所移植的细胞或使之失活。临床上，移植物抗宿主病分为急性和慢性两种形式。该疾病的急性或暴发性形式(aGVHD)通常在移植后的前100天内观察到，并且由于相关的发病率和死亡率，其为移植有效性的主要挑战。移植物抗宿主病的慢性形式(cGVHD)通常在100天后发生。中度至重度cGVHD病例的出现对长期存活产生不利影响。在骨髓移植后，存在于作为污染物或有意引入宿主中的移植物中的T细胞在将宿主组织视为抗原外来物后攻击移植受体的组织。T细胞产生过量的细胞因子，包括TNFα和干扰素γ(IFNγ)。多种宿主抗原可引发移植物抗宿主病，其中包括人白细胞抗原(HLA)。然而，即使当HLA相同的兄弟姐妹是供体时，也可能发生移植物抗宿主病。典型的是，急性移植物抗宿主病的特征在于对肝脏、皮肤和粘膜以及胃肠道的选择性损害。其他研究表明，移植物抗宿主病的靶向包括免疫系统(诸如骨髓和胸腺)本身以及肺部(以特发性肺炎的形式)在内的器官。慢性移植物抗宿主病也会攻击上述器官，但在其长期过程中也会对结缔组织和外分泌腺造成损害。
如本文所用，“异源”泛指核酸的多个部分，其表明该核酸包含两条或更多条在自然界中不以相同关系存在的子序列。例如，通常经重组而产生具有两个或更多个来自不相关基因、被布置成产生新功能性核酸的序列(例如来自一个来源的启动子和来自另一来源的编码区)的核酸。类似地，异源蛋白质指示蛋白质包含两条或更多条在自然界中不以相同关系存在的子序列(例如融合蛋白)。
如本文所用，“高亲和力”泛指抗体或融合蛋白对靶标抗原或受体具有的KD为至少10-6M、更优选10-7M、甚至更优选至少10-8M、甚至更优选至少10-9M、10-10M、10-11M或10-12M。IgG抗体或融合蛋白的“高亲和力”在本文中是指抗体对靶标抗原或受体具有的KD为至少10-6M、更优选至少10-7M或、优选地至少10-8M、更优选至少10-9M，并且甚至更优选至少10-10M、10-11M或10-12M。具体关于抗体而言，“高亲和力”结合可针对其他抗体同种型而变化。例如，对IgM同种型的“高亲和力”结合是指抗体具有的KD为至少10-7M、更优选至少10-8M。
如本文所用，“同源性”泛指核酸序列与参照核酸序列之间或多肽序列与参照多肽序列之间的类似性程度。同源性可为部分的或完全的。完全同源性指核酸或氨基酸序列是相同的。部分同源的核酸或氨基酸序列是与参照核酸或氨基酸序列不相同的核酸或氨基酸序列。可通过例如美国国家生物技术信息中心(National Center of BiotechnologyInformation，NCBI)的BlastP软件，利用默认参数进行序列比较来确定同源性程度。术语“序列同一性”可与“同源性”互换使用。
如本文所用，“宿主细胞”泛指已引入了本发明的核酸分子诸如本发明的重组表达载体的细胞。宿主细胞可为原核细胞(如大肠杆菌)，或真核细胞诸如酵母、昆虫(如SF9)、两栖动物或哺乳动物细胞诸如CHO、HeLa、HEK-293，例如培养的细胞、外植体和体内细胞。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在本文中可互换使用。应了解，这些术语不仅指特定的受试者细胞，而且还指这种细胞的子代或潜在子代。因为后代中可能因突变或环境影响而出现某些改变，所以子代实际上可能不与亲本细胞相同，但仍然被包括在如本文所用的该术语的范围内。
“人单克隆抗体”是指显示单一结合特异性的抗体，其具有其中框架区与CDR区两者均源于人种系免疫球蛋白序列的可变区。在一个实施方案中，由杂交瘤产生人单克隆抗体，所述杂交瘤包括与永生化细胞融合的B细胞，所述B细胞从转基因非人动物例如转基因小鼠获得，具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组。这包括完全人单克隆抗体及其缀合物和变体，例如其结合于诸如治疗剂或诊断剂之类的效应子。
如本文所用，“人源化抗体”泛指包括通过具有可变区和恒定区的非人细胞产生的抗体，所述可变区和恒定区已发生改变从而与将通过人细胞产生的抗体更加密切相似。例如，通过改变非人抗体氨基酸序列以并入见于人种系免疫球蛋白序列中的氨基酸。本发明的人源化抗体可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)，例如在CDR中。如本文所用，术语“人源化抗体”也包括这样的的抗体，其中已将来源于另一种哺乳动物物种诸如小鼠的种系的CDR序列移植于人框架序列上。
如本文所用，“杂交”泛指互补(包括部分互补)的多核苷酸链通过在所述链彼此反平行布置时在互补核苷酸之间形成氢键而产生的物理相互作用。
如本文所用，“IgV结构域”和“IgC结构域”泛指Ig超家族成员结构域。这些结构域对应于具有称为Ig折叠的不同折叠样式的结构单元。Ig折叠包含两个β片层的夹心结构，各β片层由5-10个氨基酸的反平行β链组成与大多数但非全部结构域中的两个片层之间的保守二硫键组成。Ig、TCR和MHC分子的IgC结构域共有相同类型的序列模式，并且被称为Ig超家族内的CI组。其他IgC结构域属于其他组。IgV结构域也共有序列模式，并且被称为V组结构域。IgV结构域长于C结构域，并且形成另外一对β链。
如本文所用，“免疫细胞”泛指具有造血来源，且在免疫应答中起作用的细胞。免疫细胞包括但不限于：淋巴细胞诸如B细胞和T细胞；自然杀伤细胞；树突细胞，以及髓样细胞，诸如单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和粒细胞。
如本文所用，“免疫测定法”泛指使用抗体来特异性结合抗原的测定法。免疫测定法可表征为使用特定抗体的特异性结合性质来分离、靶向和/或定量抗原。
如本文所用，“免疫相关疾病(或障碍或病症)”应理解为涵盖选自包括但不限于以下的组的任何疾病、障碍或病症：自体免疫性疾病、炎性障碍和与移植物移植排斥相关的免疫障碍，诸如急性和慢性器官移植排斥、同种异体干细胞移植排斥、自体干细胞移植排斥、骨髓移植排斥和移植物抗宿主疾病。
如本文所用，“免疫应答”泛指受调节T细胞共刺激影响的T细胞介导和/或B细胞介导的免疫应答。示例性的免疫应答包括B细胞应答(例如抗体产生)、T细胞应答(例如细胞因子产生和细胞细胞毒性)以及细胞因子应答性细胞(例如巨噬细胞)的活化。如本文所用，关于免疫应答的术语“下调”包括任何一种或多种免疫应答的减弱，而关于免疫应答的术语“上调”包括任何一种或多种免疫应答的增加。应当理解，一种类型的免疫应答的上调可导致另一类型的免疫应答的相应下调。例如，某些细胞因子(例如IL-10)的产生的上调可导致细胞免疫应答的下调。
如本文所用，“免疫的”、“免疫学的”、“免疫”应答指在受体患者中产生针对肽的体液应答(抗体介导)和/或细胞应答(由抗原特异性T细胞或它们的分泌产物介导)。这种应答可为通过施用免疫原来诱导的主动应答或通过施用抗体或致敏T细胞来诱导的被动应答。在不希望受单一假设限制下，细胞免疫应答通过递呈与II类或I类MHC分子缔合的多肽表位以分别活化抗原特异性CD4+T辅助细胞和/或CD8+细胞毒性T细胞来引发。应答也可涉及单核细胞、巨噬细胞、NK细胞、嗜碱性粒细胞、树突细胞、星形细胞、小神经胶质细胞、嗜酸性粒细胞的活化、嗜中性粒细胞或先天免疫的其他组分的活化或募集。可通过增殖测定法(CD4+T细胞)或CTL(细胞毒性T淋巴细胞)测定法来确定存在细胞介导的免疫应答。可通过从经免疫同基因动物分别分离抗体和T细胞，并在第二受试者中测量保护性或治疗性作用来区分体液应答和细胞应答对针对免疫原的保护性或治疗性作用的相对贡献。
“免疫原性试剂”或“免疫原”是在任选与佐剂联合向哺乳动物施用时能够诱导针对它自身的免疫应答的部分。
如本文所用，可互换使用的“炎性障碍”、“炎症性病症”和/或“炎症”泛指慢性或急性的炎性疾病，并且明确包括炎性自体免疫性疾病和炎性变应性病症。这些病症例如包括表征为对有害刺激诸如病原体、受损细胞或刺激物的免疫应答调节异常的炎性异常。炎性障碍是种类繁多的人疾病的根本。病因起源于炎性过程中的非免疫疾病包括癌症、动脉粥样硬化和缺血性心脏病。与炎症相关的障碍的实例包括：慢性前列腺炎、肾小球性肾炎、超敏反应、骨盆炎性疾病、再灌注损伤、类肉瘤病、血管炎、间质性膀胱炎、正常补体血症性荨麻疹性血管炎、心包炎、肌炎、抗合成酶综合征、巩膜炎、巨噬细胞活化综合征、贝塞特氏综合征、PAPA综合征、布劳氏综合征(Blau’s Syndrome)、痛风、成人和青少年斯蒂尔氏病(Still’s disease)、冷吡啉病(cryropyrinopathy)、马克尔-韦尔斯综合征(Muckle-Wellssyndrome)、家族性寒冷诱发的自体炎性综合征、新生儿发作型多系统炎性疾病、家族性地中海热、慢性婴儿神经、皮肤和关节综合征、全身性青少年特发性关节炎、高IgD综合征、史尼兹勒氏综合征(Schnitzler’s syndrome)、TNF受体相关的周期综合征(TRAPSP)、齿龈炎、牙周炎、肝炎、肝硬化、胰腺炎、心肌炎、血管炎、胃炎、痛风、痛风性关节炎以及选自由牛皮癣、特应性皮炎、湿疹、红斑痤疮、荨麻疹和粉刺的炎性皮肤障碍。
如本文所用，“抑制性信号”泛指通过免疫细胞上的抑制性受体分子传送的信号。信号经由活化受体(例如经由TCR、CD3、BCR或Fc分子)拮抗信号并可导致例如以下方面的抑制：第二信使产生；增殖；或免疫细胞中的效应功能，例如减少吞噬作用、减少抗体产生或降低细胞毒性，或免疫细胞无法产生介体(例如细胞因子(例如IL-2)和/或变应性应答的介体)；或发生无反应性。
如本文所用，“分离的”泛指物质从其天然存在的原始环境移除，从而从其天然环境人为地改变，并且包括“重组”多肽。分离的物质可为例如包括载体系统包括的外源性核酸、宿主细胞内所含的外源性核酸、或已从其原始环境移出从而被人为地改变的任何物质(例如“分离的抗体”)。例如，如本文所用，“分离的”或“纯化的”泛指蛋白质、DNA、抗体、RNA或其生物活性部分，它们基本上不含来自生物物质所源于的细胞或组织来源的细胞物质或其他污染性蛋白，或当通过化学方法合成时基本上不含化学前体或其他化学物质。如本文所用，术语“分离的”是指所关注的化合物(例如多核苷酸或多肽)处于与所述化合物天然存在的环境不同的环境中，例如诸如通过将肽浓缩至其不在自然界中被发现的浓度而从其天然环境分离。“分离的”包括化合物处于基本上富集所关注的化合物和/或其中所关注的化合物被部分或基本上纯化的样品内。
如本文所用，“分离的抗体”意指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合VISTA的分离的抗体基本上不含特异性结合除VISTA以外的抗原的抗体)。此外，分离的抗体可基本上不含其他细胞物质和/或化学物质。
如本文所用，“同种型”指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如IgM或IgGl)。
如本文所用，“K缔合”或“Ka”泛指特定抗体-抗原相互作用的缔合速率，而如本文所用，术语“K解离”或“Kd”是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。
如本文所用的术语“KD”意指解离常数，其从Kd与Ka的比率(即Kd/KA)获得，并且表示为摩尔浓度(M)。可使用本领域中良好确立的方法诸如等离子体共振ELISA和KINEXA来确定抗体的KD值。一种优选用于确定抗体的KD的方法是通过使用表面等离子体共振、优选利用生物传感器系统诸如系统或通过ELISA来进行。通常，这些方法在25°或37℃下进行。用于治疗用途的抗体在25℃或37℃下通过表面等离子体共振测定时通常具有50nM或更低、或更通常1nM或更低的KD。
如本文所用，“标记”或“可检测部分”泛指可通过光度法、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其他物理手段检测的组合物。
如本文所用，“低严格度”、“中等严格度”、“高严格度”或“极高严格度条件”泛指用于核酸杂交和洗涤的条件。用于进行杂交反应的指导可见于Ausubel等(2002)，ShortProtocols in Molecular Biology(第5版)John Wiley&Sons,NY中。示例性的特异性杂交条件包括但不限于：(1)低严格度杂交条件，在约45℃下于6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中进行，随后至少在50℃下在0.2×SSC、0.1％SDS中洗涤两次(对于低严格度条件，洗涤温度可增加至55℃)；(2)中等严格度杂交条件，在约45℃下于6×SSC中进行，随后在60℃下在0.2×SSC、0.1％SDS中洗涤一次或多次；(3)高严格度杂交条件，在约45℃下于6×SSC中进行，随后在65℃下在0.2×SSC、0.1％SDS中洗涤一次或多次；以及(4)极高严格度杂交条件是在65℃下0.5M磷酸钠、7％SDS，随后在65℃下以0.2×SSC和1％SDS洗涤一次或多次。
如本文所用，“狼疮”旨在包括所有类型的狼疮。狼疮有4种类型，将在下面讨论。如本文所用，“狼疮样病症”旨在包括具有与狼疮类似的症状的炎症性病症，诸如肾炎、蛋白尿增加和脾肿大。“全身性红斑狼疮”或(“SLE”)是最常见的狼疮形式，其可以是轻度或严重的并且可以影响主要器官系统。这是大多数人与“狼疮”相关的病症。其为一种原因不明的自体免疫病症，可能会导致肾脏炎症(称为狼疮性肾炎)，该炎症可影响身体从血液中过滤废物的能力，或者如果严重的话可能会导致肾脏损害从而需要透析或肾移植。SLE也可能会导致肺部血压升高(称为肺动脉高压)，可导致呼吸困难。另外SLE可能会导致神经系统和大脑的炎症，这可导致记忆问题、混乱、头痛和中风。另外SLE可能会导致大脑血管的炎症，这可导致高烧、癫痫和行为改变。SLE也可能导致动脉硬化或冠状动脉疾病-冠状动脉壁上沉积物的积聚-可导致心脏病发作。“皮肤狼疮”在本文中是指仅影响皮肤的狼疮病症。有三种类型的狼疮影响皮肤：慢性皮肤型红斑狼疮(CCLE)(也称为盘状红斑狼疮[DLE])、亚急性皮肤型红斑狼疮(SCLE)和肿胀性狼疮。皮肤型红斑狼疮或盘状红斑狼疮可引起多种类型的皮疹和病变(疮)，最常见的称为盘状皮疹，其凸起、呈鳞状和红色，但不发痒。皮疹区域显示为圆盘或圆圈。皮肤型狼疮的另一个常见实例是面颊和鼻梁上的皮疹，称为蝶形皮疹。其他皮疹或疮可能出现在面部、颈部或头皮(皮肤暴露在阳光或荧光灯下的区域)，或出现在口腔、鼻或阴道中。脱发和皮肤色素或颜色的变化也是皮肤型狼疮的症状。大约10％患有皮肤型狼疮的人会发展全身性红斑狼疮。然而，这些人很可能已患有全身性红斑狼疮，以皮疹为其主要症状。“药物诱导的红斑狼疮”是由某些药物引起的病症，这些药物可以在未患有SLE的人中引起狼疮样症状。通常，这种形式的狼疮是暂时的，并且通常在药物停止的几个月内消退。已知可诱导狼疮样症状的药物包括降压药物肼苯哒嗪和甲基多巴、称为普鲁卡因酰胺的心脏药物以及用于金属中毒称为D-青霉胺的药物。药物诱导的狼疮的其他诱因包括米诺环素(用于治疗痤疮)、异烟肼(治疗结核病)和抗TNF(用于治疗类风湿性关节炎)。药物诱导的狼疮的症状与全身性红斑狼疮相似，然而与SLE不同，其很少影响主要器官。新生儿狼疮不是真正的狼疮形式。这是一种罕见的疾病，其影响患有狼疮的女性的婴儿，并且是由母亲的抗体作用于子宫内的婴儿引起。在出生时，婴儿可能具有皮疹、肝脏问题或低血细胞计数，但这些症状通常在几个月后完全消失，没有持久影响。一些患有新生儿狼疮的婴儿也可能有严重的心脏缺陷。
如本文所用，“哺乳动物”泛指哺乳纲的表征为在皮肤上覆有毛发以及雌性有用于养育幼仔的产乳乳腺的任何及所有温血脊椎动物(包括人)。哺乳动物的实例包括但不限于羊驼、犰狳、水豚、猫、骆驼、黑猩猩、灰鼠、牛、狗、山羊、大猩猩、仓鼠、马、人、狐猴、美洲驼、小鼠、非人灵长类动物、猪、大鼠、绵羊、鼩鼱、松鼠、貘和田鼠。哺乳动物包括但不限于牛科动物、犬科动物、马科动物、猫科动物、鼠科动物、羊科动物、猪科动物、灵长类动物和啮齿动物物种。哺乳动物还包括任何及所有由华盛顿哥伦比亚特区美国国家自然历史博物馆史密森尼学会(National Museum of Natural History,Smithsonian Institution inWashington D.C.)列在世界哺乳动物物种(Mammal Species of the World)上的那些哺乳动物。
“多特异性抗体”是指具有2个或更多个抗原结合区的抗体。这包括双特异性抗体。这些抗原结合区可结合至不同抗原或结合至同一抗原的不同表位。
如本文所用，“天然存在的核酸分子”泛指具有在自然界中存在的核苷酸序列的RNA或DNA分子(例如编码天然蛋白)。
如本文所用，“核酸”或“核酸序列”泛指呈单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸寡核苷酸。该术语涵盖核酸，即寡核苷酸，其含有天然核苷酸的已知类似物。该术语也涵盖具有合成主链的核酸样结构。除非另外指明，否则特定核酸序列也暗中涵盖其保守修饰的变体(例如简并密码子置换)和互补序列以及明确指明的序列。术语核酸可与基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸互换使用。
如本文所用，“有效连接”泛指当使两个DNA片段接合时，使由所述两个DNA片段编码的氨基酸序列保持同框。
如本文所用，“互补位”泛指抗体的识别抗原的部分(例如抗体的抗原结合位点)。互补位可为抗体的Fv区的小区域(例如15-22个氨基酸)并且可含有抗体重链和轻链的部分。参见Goldsby等的Antigens(第3章)Immunology(第5版)New York:W.H.Freeman andCompany，第57-75页。
如本文所用，“患者”或“受试者”或“受体”、“个体”或“所治疗的个体”可互换使用，并且泛指需要治疗以缓解疾病状态或预防疾病状态的发生或复发的任何动物。另外，如本文所用的“患者”泛指具有风险因素、疾病史、易感性、症状和体征、先前被诊断、处于疾病风险中或是疾病患者群体的成员的任何动物。患者可为临床患者诸如人，或兽医学患者诸如伴侣动物、驯化动物、家畜动物、外来动物或动物园动物。
“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用并且泛指任何长度的氨基酸残基的聚合物，而与修饰(例如磷酸化或糖基化)无关。该术语适用于以下氨基酸聚合物：其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的类似物或模拟物；以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。该术语适用于以下氨基酸聚合物：其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物；以及适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的的氨基酸聚合物。可例如通过添加碳水化合物残基以形成糖蛋白来修饰多肽。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”明确包括糖蛋白以及非糖蛋白。
如本文所用，“启动子”泛指引导核酸转录的一系列核酸序列。如本文所用，启动子包括在起始转录位点附近的必要的核酸序列，诸如在聚合酶Π型启动子的情况下是TATA元件。启动子也任选地包括远端增强子或阻遏子元件，其可位于距离转录起始位点多达数千个碱基对之处。“组成型”启动子是在大多数环境和发育条件下具有活性的启动子。“诱导型”启动子是在环境或发育调节下具有活性的启动子。
如本文所用，“预防有效量”泛指化合物当向患者施用以预防疾病或防止疾病复发时足以对疾病或复发实现这种预防的量。预防有效量可为有效预防体征和/或症状的发生的量。“预防有效量”可视待治疗患者的疾病及其严重性以及年龄、体重、病史、病症倾向性和先前存在的病症而变化。
“预防性疫苗”和/或“预防性疫苗接种”是指用于预防疾病或与疾病相关的症状诸如癌症或感染性病症的疫苗。
如本文所用，“预防”泛指其中体征和/或症状不存在于患者中、处于缓解的情况下、或先前存在于患者中的疗程。预防包括防止在治疗患者的疾病之后出现疾病。此外，防止包括治疗可能会发生疾病的患者，尤其是易患疾病的患者(例如患者群体的成员、具有风险因素或处于发生疾病的风险下的那些患者)。
如本文所用，“重组”泛指产物，例如指细胞或核酸、蛋白质或载体，指示所述细胞、核酸、蛋白质或载体已通过引入异源核酸或蛋白质或者改变天然核酸或蛋白质得到修饰，或所述细胞源于经如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达该细胞的初始(非重组)形式中未见的基因，或表达以别的方式异常表达、表达不足或完全不表达的天然基因。
如本文所用，“重组人抗体”包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的所有人抗体，诸如(a)从人免疫球蛋白基因转基因性或转染色体性动物(例如小鼠)或由其制备的杂交瘤分离的抗体(以下进一步描述)，(b)从被转化以表达人抗体的宿主细胞，例如从转染瘤分离的抗体，(c)从重组组合人抗体文库分离的抗体，和(d)通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接成其他DNA序列的任何其他手段制备、表达、产生或分离的抗体。所述重组人抗体具有其中框架区和CDR区源于人种系免疫球蛋白序列的可变区。然而，在某些实施方案中，可使所述重组人抗体经受体外诱变(或当使用人Ig序列转基因性动物时，经受体内体细胞诱变)，并且因此，重组抗体的VH区和VL区的氨基酸序列是这样的序列：尽管源于人种系VH和VL序列以及与人种系VH和VL序列相关，但可不天然存在于体内人抗体种系谱系内。
如本文所用，“信号序列”或“信号肽”泛指含有约15个或更多个氨基酸的肽，其存在于分泌性多肽和膜结合多肽的N末端，并且含有大量疏水性氨基酸残基。例如，信号序列含有至少约10-30个氨基酸残基，优选约15-25个氨基酸残基，更优选约18-20个氨基酸残基，并且甚至更优选约19个氨基酸残基，并且具有至少约35％-65％，优选约38％-50％，并且更优选约40％-45％疏水性氨基酸残基(例如缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或苯丙氨酸)。“信号序列”在本领域中也称为“信号肽”，用于将含有这种序列的多肽引导至脂质双层，并且在分泌性和膜结合多肽中裂解。
如本文所用，“特异性(或选择性)结合”至抗体或“对…具有特异性(或选择性)免疫活性”或“与…特异性相互作用或结合”泛指蛋白质或肽(或其他表位)，在一些实施方案中，指可确定所述蛋白质在蛋白质和其他生物物质的异质群体中存在的结合反应。例如，在指定免疫测定法条件下，指定的抗体结合至特定蛋白质，结合量比背景(非特异性信号)大至少两倍，并且基本上不会与样品中存在的其他蛋白质大量结合。通常，特异性或选择性反应将为背景信号或噪声的至少两倍，并且更通常为背景的约10至100倍以上。
如本文所用，“可特异性杂交的”和“互补的”泛指核酸可通过传统沃森-克里克(Watson-Crick)类型或其他非传统类型来与另一核酸序列形成氢键。核酸分子与其互补序列的结合自由能足以使得核酸的相关功能得到发挥，例如RNAi活性。本领域熟知核酸分子的结合自由能的测定。(参见例如Turner等(1987)的CSH Symp.Quant.Biol.LII:123-33；Frier等(1987)PNAS 83:9373-77 1986)；Turner等的J.Am.Chem.Soc.109:3783-85)。互补性百分比表示核酸分子中可与第二核酸序列形成氢键(例如沃森-克里克碱基配对)的连续残基的百分比(例如在10个中有约至少5、6、7、8、9、10个，即有约至少50％、60％、70％、80％、90％和100％的互补性(包括所述值))。“完全互补”或100％互补性泛指核酸序列的所有连续残基都与第二核酸序列中相同数目的连续残基氢键合。
“基本互补性”是指排除被选择为具有非互补性的多核苷酸链区域，诸如突出，多核苷酸链表现出约至少90％的互补性。特异性结合需要足够程度的互补性以避免寡聚化合物与非目标序列在需要特异性结合所处的条件下，即在体内测定法或治疗性治疗的情况下的生理条件下，或在体外测定法的情况下在进行测定法所处的条件下，发生非特异性结合。非目标序列通常可相差至少5个核苷酸。
如本文所用，疾病的“征象”泛指指示疾病、在检查患者时发现的任何异常；与症状相反的客观的疾病指示，而症状是主观的疾病指示。
如本文所用，“固体载体”、“载体”和“基材”泛指提供固体或半固体结构，另一材料可与其附接的任何材料，包括但不限于平滑载体(例如金属、玻璃、塑料、硅和陶瓷表面)以及纹理化和多孔的材料。
如本文所用的VISTA的“可溶性胞外域(ECD)”或“胞外域”或“可溶性VISTA蛋白/分子”意指非细胞表面结合的VISTA分子或其任何部分，包括但不限于：VISTA融合蛋白或VISTA ECD-Ig融合蛋白(其中使VISTA的细胞外结构域或其片段融合于免疫球蛋白(Ig)部分，从而致使融合分子可溶)或其片段和衍生物；其中VISTA的细胞外结构域与生物活性或化学活性蛋白质(诸如乳头状瘤病毒E7基因产物、黑素瘤相关的抗原p97或HIV包膜蛋白)的一部分融合或接合的蛋白质或其片段和衍生物；杂合(嵌合)融合蛋白(诸如VISTA-Ig)或其片段和衍生物。以下更详细描述所述融合蛋白。
如本文所用，“可溶性VISTA蛋白/分子”也包括跨膜结构域被移除以致使蛋白质可溶的VISTA分子或其片段和衍生物；其片段、部分或衍生物以及可溶性VISTA突变分子。用于根据本发明至少一些实施方案的方法中的可溶性VISTA分子可以或可不包括信号(前导)肽序列。
如本文所用，在疗法或诊断的情形下的“受试者”或“患者”或“个体”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，诸如非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、马、母牛、鸡、两栖动物、爬行动物等，即适于根据本发明进行治疗的任一个，包括但不限于禽类和哺乳动物受试者，并且优选地为哺乳动物。需要根据本发明进行治疗的任何哺乳动物受试者都是适合的。两种性别以及处于任何发育阶段(即新生儿、婴儿、青少年、青年和成人)的人受试者都可根据本发明进行治疗。本发明也可对动物受试者，特别是哺乳动物受试者诸如小鼠、大鼠、狗、猫、牛、山羊、绵羊和马进行以用于兽医学目的，以及用于药物筛选和药物开发目的。“受试者”可与“个体”和“患者”互换使用。
如本文所用，“基本上不含化学前体或其他化学物质”泛指VISTA蛋白的制剂，其中蛋白质与蛋白质的合成中涉及的化学前体或其他化学物质分离。在一个实施方案中，用语“基本上不含化学前体或其他化学物质”包括具有少于约30％(以干重计)的化学前体或非VISTA化学物质、更优选少于约20％化学前体或非VISTA化学物质、还更优选少于约10％化学前体或非VISTA化学物质以及最优选少于约5％化学前体或非VISTA化学物质的VISTA蛋白制剂。
如本文所用，疾病的“症状”泛指由患者所感受并且指示疾病的在结构、功能或感觉方面的任何病态现象或与正常情况的偏离。
如本文所用，“T细胞”泛指CD4+T细胞和CD8+T细胞。术语T细胞也包括T辅助1型T细胞和T辅助2型T细胞两者。
如本文所用，“疗法”、“治疗性”或“治疗”泛指治疗疾病，停滞或减轻疾病或其临床症状的发展、和/或缓解疾病，使疾病或其临床症状消退。疗法涵盖预防、治疗、补救、减少、减轻和/或使得疾病、疾病的征象和/或症状缓解。疗法涵盖减轻具有进行中疾病征象和/或症状(例如炎症、疼痛)的患者的征象和/或症状。疗法还涵盖“预防”。出于疗法的目的，术语“减轻”泛指征象和/或症状的临床显著的减轻。疗法包括治疗复发或复发性征象和/或症状(例如炎症、疼痛)。疗法涵盖但不限于阻止任何时候出现征象和/或症状以及减轻现有征象和/或症状以及消除现有征象和/或症状。疗法包括治疗慢性疾病(“维持”)和急性疾病。例如，治疗包括治疗或预防征象和/或症状(例如炎症、疼痛)的复发。
如本文所用，“Treg细胞”(有时也被称为抑制T细胞或诱导型Treg细胞或iTreg)指T细胞亚群，其调节免疫系统并维持对自身抗原的耐受性并且可消除自体免疫疾病。Foxp3+CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)在正常生理条件下维持外周耐受性方面是关键性的。
如本文所用，“跨膜结构域”泛指长度是约15个氨基酸残基的跨越质膜的氨基酸序列。更优选地，跨膜结构域包括约至少20个、25个、30个、35个、40个或45个氨基酸残基，并且跨越质膜。跨膜结构域富含疏水性残基，并且通常具有a螺旋结构。在一个实施方案中，跨膜结构域的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多的氨基酸具有疏水性，例如亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸或色氨酸。跨膜结构域例如描述于Zagotta等(1996)Annu.Rev.Neurosci.19:235-263中。
如本文所用，“转基因动物”泛指非人动物，优选哺乳动物，更优选小鼠，其中所述动物的一个或多个细胞包括“转基因”。术语“转基因”是指以下外源性DNA：其被整合至转基因动物从其发育的细胞的基因组中，以及保持在成熟动物的基因组中，例如引导在所述转基因动物的一种或多种细胞类型或组织中表达所编码基因产物。
如本文所用，“无应答性”泛指免疫细胞对刺激例如以及经由活化受体或细胞因子达成的刺激的抵抗性。无应答性可例如由于暴露于免疫抑制剂或高剂量的抗原而发生。
如本文所用，“可变区”或“VR”泛指抗体中各对轻链和重链内直接涉及所述抗体结合抗原的结构域。各重链在一端具有可变结构域(VH)，继之以许多恒定结构域。各轻链具有在一端的可变结构域(VL)和在其另一端的恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对准，并且轻链可变结构域与重链的可变结构域对准。
如本文所用，“载体”泛指能够转运其已与之连接的另一核酸分子的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指可向其中连接另外的DNA片段的环状双链DNA环。另一类型的载体为病毒载体，其中可将另外的DNA片段连接至病毒基因组中。某些载体能够在它们所引入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其他载体(例如非游离型哺乳动物载体)在引入宿主细胞中时整合至宿主细胞的基因组，并因而随宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够引导其所有效连接的基因的表达。载体在本文中被称为“重组表达载体”或简称为“表达载体”。一般来说，在重组DNA技术中有用的表达载体通常呈质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明旨在包括这些发挥等效功能的其他形式的表达载体，诸如病毒载体(例如复制缺陷性逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。所述技术和程序通常根据本领域熟知的常规方法并且如本说明书通篇所引用和讨论的多个一般且较特定的的参考文献中所述来进行。参见例如Sambrook等(2001)Molec.Cloning:Lab.Manual[第3版]Cold SpringHarbor Laboratory Press。标准技术可用于重组DNA、寡核苷酸合成，以及组织培养和转化(例如电穿孔、脂质体转染)。可根据制造商说明书，或如本领域中通常所实现，或如本文所述来进行酶促反应和纯化技术。
已定义了本申请中所用的某些术语和短语，下面进一步描述本发明所包括的抗VISTA多肽和抗原结合抗体片段及其产生和使用方法。
本发明涉及包含结合至T细胞活化的V结构域Ig抑制因子(VISTA)的抗原结合区的抗体和抗体片段。VISTA是负面抑制免疫应答的检查点调节物。参见Wang等(2011)，"VISTA,a novel mouse Ig superfamily ligand that negatively regulates T cellresponses,"J.Exp.Med.,208(3)577-92。该蛋白质在正常人嗜中性粒细胞、单核细胞和T细胞亚群上表达。此外，食蟹猴细胞以与正常人细胞相似的模式表达VISTA。VISTA也在(例如癌症患者)的外周血细胞中表达。
根据本发明的激动性抗VISTA抗体或抗体片段的结合将会激发、引发或模拟VISTA对免疫的至少一种作用，从而促进VISTA对免疫的至少一种抑制作用，例如，抑制T细胞免疫或抑制特定促炎细胞因子的表达或其对某些化学引诱物和趋化因子的表达的促进作用。
此类抗体片段包括例如Fab、F(ab’)2和scFv抗体片段。这些抗体或抗体片段可包含抗体恒定区或其片段或变体。此类抗体和抗体片段包括与在造血细胞和其他细胞，例如髓样细胞和/或淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、T细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、肿瘤细胞上和/或肿瘤微环境(TME)中表达的VISTA蛋白结合的那些。肿瘤微环境是肿瘤的细胞环境。它可以包括周围的免疫细胞、成纤维细胞、血管、其他细胞、信号分子和细胞外基质。
本申请提供了新型的激动性抗人VISTA抗体，包括包含与具图4所示序列的抗人VISTA抗体任一者相同的CDR的抗体。虽然在本发明之前许多拮抗性抗人VISTA抗体已在文献中有所报道，但是激动性抗人VISTA抗体或抗体片段尚未被报道。
如在随后的实验实施例中所公开的，最初产生了两种嵌合型抗人VISTA抗体，其源自鼠抗人VISTA抗体(具有图4中的序列的1E8)，它们分别含有未经修饰的IgG2人恒定区或者其中κ链第127位的半胱氨酸残基变为丝氨酸残基的IgG2恒定区。如实施例及其中所引用的附图所示，发现两种抗体可激发或模拟VISTA对免疫的抑制作用，至少基于(i)它们降低某些促炎细胞因子诸如IL-2、IL-4、IL-6、IL-17、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达以及减少某些趋化因子或化学引诱物诸如KC(角质化细胞衍生的趋化因子)或MIP-2(巨噬细胞炎性蛋白-2)的表达的能力；(ii)在GVHD模型中抑制T细胞活性；以及(iii)抑制CD3驱动的T细胞应答。
此外，在分离这两种激动性抗体后，已获得了另外10种含有人IgG2恒定区或Fc区的嵌合型激动性抗人VISTA抗体。这些抗体衍生自在本文中称为GG8、VSTB95(INX903)、VSTB103(INX904)、VSTB53(INX905)、VSTB92(INX908)、VSTB50(INX900)、VSTB56(INX901)、VSTB63(INX902)、VSTB54(INX906)和VSTB66(INX907)(具有图4中的序列)的抗体。
特别地，这些嵌合型抗人VISTA抗体具有图4中所示的可变序列和人IgG2恒定区。如下文表1和2中所报道的，当通过使用抗体表位鉴定(antibody binning)进行评估时，发现这些抗人VISTA抗体结合至指定为第1组和第2组的2个不同表位组。如图4所示，对应于第2组的表位包括存在于人VISTA中的2种不同肽(即NLTLLDSGL和VQTGKDAPSNC)中的残基。而且，如下文实施例中所述，已通过分析确定了根据本发明的其他激动性抗体的表位特异性。
如下表1和表2所示，发现这12种不同的抗人VISTA抗体在至少一种免疫抑制模型中具有免疫抑制作用，并且许多在数种免疫抑制模型中具有免疫抑制作用。特别是INX905、INX908、INX901、INX902和INX906在2种不同的测定法形式中显示出免疫抑制。虽然所有这些抗体都具有免疫抑制作用，并且似乎可引发、促进或激发VISTA的免疫抑制作用，但INX901、INX902和INX906以及INX908似乎是最具免疫抑制性。
此外，将针对它们的免疫抑制特性以及它们激发或模拟人VISTA的免疫抑制作用及其他作用的能力筛选包含人IgG2恒定域的其他嵌合型抗人VISTA抗体，该恒定域含有图4中所示的其他抗VISTA抗体的可变序列。基于迄今为止获得的结果，该筛选应可鉴定其他激动性抗人VISTA抗体。另外，根据本发明的激动性抗人VISTA抗体已显示在许多自体免疫和炎性动物疾病模型，包括关节炎、狼疮或SLE、GVHD、炎性肠病(IBD)或结肠炎、慢性和急性感染性疾病或肝毒性和牛皮癣动物模型中是有效的(免疫抑制)。基于此，本主题抗人VISTA激动性抗体应该非常适合用于治疗和预防自体免疫病症、变应性病症和炎症性病症。
如上所述，具有图4中所示序列的嵌合型IgG2抗人VISTA抗体显示在至少一种免疫抑制模型中具有免疫抑制性。此外，这些抗体以特异性的免疫调节方式引发这些免疫抑制作用，而不是通过实现特定类型T细胞的耗竭或通过耗竭一般的T细胞。
如实施例中进一步显示的，出乎意料的是，在铰链区含有突变的嵌合型IgG2激动性抗人VISTA抗体引发了基本上相同的免疫抑制作用，即IgG2恒定区内的突变在测试实验条件下似乎没有引起抑制的增强。相反，IgG2A形式和IgG2B形式二者以及它们混合物都引发相同的免疫抑制作用。此外且也出乎意料的是，基于实施例中公开的实验，似乎FcγR结合可能有助于主题抗人VISTA抗体的激动剂特性。特别地，据发现包含沉默IgG2恒定区消除了主题激动性抗体的免疫抑制性质。基于这些结果，假设一种或多种FcγR可能会影响这些抗体的激动性质，并且特别是假设FcγRIIA(CD32或CD32A)或FcγRIIB(CD32B)结合可能涉及主题激动性抗体的激动剂性质。
使用这些相同的方法，预期可以获得其他激动性抗人VISTA IgG2抗体，例如，源自具有图4中所示序列的抗人VISTA抗体的其他抗体。如上所述，迄今已获得12种激动性抗人VISTA抗体，包括具有图4中所含序列的抗体。基于这些结果，预计可以产生其他激动性抗人VISTA抗体并显示其具有免疫抑制性。还预期可以产生这样的其他激动性抗人VISTA抗体：该抗体与含有图4中所示序列的任何抗体结合相同或重叠的表位和/或与之竞争。在示例性实施方案中，这些抗体将结合对应于第1组或第2组抗体的表位，或将与这些抗体竞争结合至人VISTA。
鉴别与抗体结合的特定表位的方法是本领域已知的。在工作实施例中，申请人公开了对许多根据本发明的抗VISTA抗体所结合的表位的阐明。因此，在示例性实施方案中，根据本发明的激动性抗人VISTA抗体将包含A型、B型或前述类型的混合物的IgG2恒定区或其片段。在示例性实施方案中，这些抗体将结合一种或多种FcγR，例如它们将与完整的或野生型的人IgG2Fc区结合相同的FcγR。在其他示例性实施方案中，该抗体将结合CD32(CD32A和/或CD32B)。这可以通过使用可结合CD32(CD32A和/或CD32B)的野生型的或经修饰的IgG2恒定区来实现。此外，可以修饰该激动性抗体以掺入另一多肽，诸如结合FcγR如CD32A和/或CD32B的另一Fc多肽或抗原结合区。
本发明的激动性抗人VISTA抗体中所含的IgG2Fc或恒定区任选可以被修饰，例如，以便改变效应功能，例如改变FcR结合、FcN结合、补体结合、糖基化等等。特别地，本发明的激动性抗人VISTA抗体中所含的IgG2Fc或恒定区任选可以通过27位半胱氨酸的转换或者进一步任选通过例如铰链区中的另一半胱氨酸残基或其他残基转换成另一氨基酸如丝氨酸来修饰。下文公开了其他潜在的Fc修饰。
这些VISTA激动性抗体可用于治疗或预防疾病病症或用于治疗或减轻、缓解与其相关的病理学作用，例如炎症，用于治疗或预防其中抑制T细胞免疫或促炎细胞因子的表达和或趋化因子和化学引诱物的表达增加在治疗上或预防上是有益的的病症。这些病症特别包括自体免疫、变态反应、炎性障碍、败血症、GVHD和用于抑制针对移植细胞、组织或器官诸如CAR-T细胞或基因疗法构建体或含有细胞的不需要的T细胞免疫应答。
如上所述，可以使用根据本发明的激动性抗人VISTA抗体治疗性或预防性治疗的示例性病症包括自体免疫病症、变态反应病症、炎症性病症、GVHD、移植和败血症。如上所述，根据本发明的激动性抗人VISTA抗体已显示出治疗有效性并且在许多动物疾病模型，包括关节炎、炎性肠病(IBD)、狼疮、GVHD、慢性急性感染/肝毒性和牛皮癣疾病模型中具有免疫抑制性。因此，本发明的抗体应该非常适合用于治疗其中在治疗上期望抑制免疫、尤其是T细胞免疫的病症。
A.激动性抗人VISTA抗体及片段在疗法和诊断中的用途
含有根据本发明的激动剂的组合物可用于抑制T细胞免疫以及用于治疗其中在治疗上期望抑制T细胞免疫的病症，诸如自体免疫病症、变态反应病症或炎症性病症。这些组合物将包含一定量的本发明的激动性抗体或抗体片段，其在有需要的受试者中有效抑制T细胞活化或增殖或细胞因子表达或VISTA的其他作用。此类自体免疫病症、炎症性病症和变应性病症包括例如关节炎病症，诸如RA、牛皮癣性关节炎、牛皮癣、硬皮病、多发性硬化、狼疮、IBD、ITP、糖尿病、GVHD、肉样瘤病、变应性哮喘、肝炎相关的肝毒性，以及用于抑制不需要的针对移植细胞、组织或器官的T细胞免疫应答诸如CAR-T细胞或基因疗法，构建体或含有的细胞等。
其中可单独使用本发明抗体或与其他治疗剂、尤其是其他免疫抑制剂分子联合使用本发明抗体的具体病症包括：获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、获得性脾萎缩、急性前葡萄膜炎、急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、急性痛风性关节炎、急性坏死性出血性脑白质炎、急性或慢性窦炎、急性化脓性脑膜炎(或其他中枢神经系统炎性障碍)、急性严重炎症、阿狄森氏病(Addison’s disease)、肾上腺炎、成人发作型糖尿病(II型糖尿病)、成人发作型特发性甲状旁腺机能减退(AOIH)、无γ球蛋白血症、粒性白细胞缺乏症、血管病(包括血管炎，任选大血管血管炎，任选风湿性多肌痛和巨细胞(高安氏(Takayasu’s))关节炎)、变应性病症、变应性接触性皮炎、变应性皮炎、变应性肉芽肿性血管炎、变应性超敏感性障碍、变应性神经炎、变应性反应、弥漫性脱发、全部脱发、阿尔波特氏综合征(Alport’s syndrome)、肺泡炎(任选变应性肺泡炎或纤维性肺泡炎)、阿尔茨海默氏病、淀粉样变性、肌萎缩性侧索硬化(ALS；路格里克氏病(Lou Gehrig’s disease))、嗜酸性粒细胞相关障碍(任选嗜酸性粒细胞增多)、过敏症、僵直性脊椎炎、血管扩张、抗体介导的肾炎、抗GBM/抗TBM肾炎、抗原-抗体复合物介导的疾病、抗肾小球基底膜疾病、抗磷脂抗体综合征、抗磷脂综合征(APS)、口疮、口疮性口炎、再生障碍性贫血、心律不齐、动脉硬化、动脉硬化性病症、关节炎(任选类风湿性关节炎诸如急性关节炎或慢性类风湿性关节炎、慢性进行性关节炎、变形性关节炎)、蛔虫病、曲霉肿、含有嗜酸性粒细胞的肉芽肿、曲霉病、无精子发生、哮喘(任选支气管哮喘(asthma bronchiale)、支气管哮喘(bronchial asthma)或自体免疫哮喘)、共济失调性毛细血管扩张症、运动失调性硬化、动脉粥样硬化、自闭症、自体免疫性血管性水肿、自体免疫再生障碍性贫血、自体免疫性萎缩性胃炎、自体免疫性糖尿病、睾丸和卵巢的自体免疫性疾病(包括自体免疫睾丸炎和卵巢炎)、与胶原性疾病相关的自体免疫障碍、自体免疫性自主神经异常、自体免疫性耳病(任选自体免疫性内耳病(AGED))、自体免疫性内分泌疾病(包括甲状腺炎诸如自体免疫性甲状腺炎)、自体免疫性肠病综合征、自体免疫性腺衰竭、自体免疫性听觉损失、自体免疫性溶血、自体免疫性肝炎、自体免疫性血液学障碍、自体免疫性高脂质血症、自体免疫性免疫缺陷、自体免疫性内耳病性(AIED)、自体免疫心肌炎、自体免疫嗜中性白细胞减少症、自体免疫胰腺炎、自体免疫多内分泌病变、I型自体免疫多腺性综合征、自体免疫视网膜病变、自体免疫血小板减少性紫癜(ATP)、自体免疫甲状腺疾病、自体免疫性荨麻疹、自体免疫介导的胃肠疾病、轴突和神经元神经病变、巴洛病(Balo disease)、贝塞特氏病(s disease)、良性家族性和缺血再灌注损伤、良性淋巴细胞性血管炎、伯杰氏病(Berger’s disease)(IgA肾病变)、养鸟人肺(bird-fancier’s lung)、失明、伯克氏病(Boeck’s disease)、闭塞性细支气管炎(非移植)相对于NSIP、支气管炎、支气管肺炎曲霉病、布鲁顿氏综合征(Bruton’s syndrome)、大疱性类天疱疮、卡普兰氏综合征(Caplan’s syndrome)、心肌病变、心血管性缺血、卡斯尔曼氏综合征(Castleman’ssyndrome)、乳糜泻、乳糜泻口炎性腹泻(麸质肠病)、小脑变性、脑缺血和伴随血管化的疾病、查加斯病(Chagas disease)、通道病变(任选癫痫、CNS的通道病变)、脉络膜视网膜炎、脉络膜炎、自体免疫性血液学障碍、慢性活动性肝炎或自体免疫性慢性活动性肝炎、慢性接触性皮炎、慢性嗜酸性球性肺炎、慢性疲劳综合征、慢性肝炎、慢性超敏性肺炎、慢性炎性关节炎、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病变(CIDP)、慢性难治炎症、慢性皮肤粘膜假丝酵母病、慢性神经病变(任选IgM多发性神经病变或IgM介导的神经病变)、慢性阻塞性气道疾病、慢性肺炎性疾病、慢性复发性多灶性骨髓炎(CRMO)、慢性甲状腺炎(桥本氏甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis))或亚急性甲状腺炎、车格-施特劳斯综合征、瘢痕性类天疱疮/良性粘膜类天疱疮、CNS炎性障碍、CNS血管炎、腹腔疾病、柯根氏综合征(Cogan’ssyndrome)、冷凝集素疾病、息肉状结肠炎、结肠炎诸如溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis)、溃疡性结肠炎(colitis ulcerosa)、胶原性结肠炎，涉及T细胞的浸润和慢性炎性应答的病症、先天性心脏阻滞、先天性风疹感染、库姆斯阳性贫血(Coombs positiveanemia)、冠状动脉疾病、柯萨奇心肌炎(Coxsackie myocarditis)、CREST综合征(钙质沉着、雷诺氏现象)、克罗恩氏病、冷球蛋白血症、库兴氏综合征(Cushing’s syndrome)、睫状体炎(任选慢性睫状体炎、异时睫状体炎、虹膜睫状体炎或富克氏睫状体炎(Fuch’scyclitis))、囊性纤维化、细胞因子诱导的毒性、耳聋、退变性关节炎、脱髓鞘性疾病(任选自体免疫脱髓鞘性疾病、脱髓鞘性神经病变)、登革热、疱疹样皮炎和异位性皮炎、皮炎(包括接触性皮炎)、皮肤肌炎、伴有急性炎性组分的皮肤病、德维克氏病(Devic’s disease)(视神经脊髓炎)、糖尿病性大动脉障碍、糖尿病性肾病变、糖尿病性视网膜病变、戴阿蒙布粒凡贫血(Diamond Blackfan anemia)、弥漫性间质性肺纤维化、扩张心肌病变、盘状狼疮、涉及白细胞血细胞渗出的疾病、德雷斯勒氏综合征(Dressier’s syndrome)、迪皮特朗氏挛缩(Dupuytren’s contracture)、埃可病毒感染、湿疹(包括变应性或特应性皮炎)、脑炎诸如拉斯穆森氏脑炎(Rasmussen’s 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disease)、桥本氏病、桥本氏脑炎、桥本氏甲状腺炎、血色素沉着病、溶血性贫血或免疫性溶血性贫血(包括自体免疫溶血性贫血(AIHA)、溶血性贫血)、甲型血友病、亨诺克-舍恩来因紫癜(purpura)、妊娠疱疹、人免疫缺陷病毒(HIV)感染、痛觉过敏、低γ球蛋白血症、性腺低能症、甲状旁腺机能减退、特发性尿崩症、特发性面神经麻痹、特发性甲状腺功能不足、特发性IgA肾病变、特发性膜性GN或特发性膜性肾病变、特发性肾脏综合征、特发性肺纤维化、特发性口炎性腹泻、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病变、IgE介导的疾病(任选过敏和变应性或特应性鼻炎)、IgG4相关的硬化性病、区域性回肠炎(ileitis regionalis)、免疫复合物性肾炎、与由细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和迟发性超敏反应、免疫介导的GN、免疫调节性脂蛋白相关的免疫应答(包括成人或急性呼吸窘迫综合征(ARDS))、包涵体肌炎、感染性关节炎、归因于抗精子抗体的不育症、全部或部分葡萄膜的炎症、炎性肠病(IBD)、炎性过度增生性皮肤疾病、炎性肌病变、胰岛素依赖性糖尿病(1型)、胰岛炎、间质性膀胱炎、间质性肺病、间质性肺纤维化、虹膜炎、缺血性再灌注障碍、关节炎症、青少年关节炎、青少年皮肤肌炎、青少年糖尿病、青少年发作型(I型)糖尿病(包括儿科胰岛素依赖性糖尿病(IDDM))、青少年发作型类风湿性关节炎、川崎综合征(Kawasaki syndrome)、干燥性角膜结膜炎、锥虫病(kypanosomiasis)、兰伯特-伊顿综合征(Lambert-Eaton syndrome)、利什曼病(leishmaniasis)、麻风病、白细胞减少、白细胞粘附缺乏症、白细胞破裂性血管炎、白血球减少症、扁平苔癣(lichenplanus)、硬化性苔癣、木质性结膜炎、线性IgA皮肤病、线性IgA疾病(LAD)、吕弗勒氏综合征(Loffler’s syndrome)、狼疮样肝炎、狼疮(包括肾炎、大脑炎、儿科狼疮、非肾性狼疮、肾外狼疮、盘状狼疮、脱发)、狼疮(SLE)、播散性红斑狼疮、莱姆关节炎(Lyme arthritis)、莱姆病、淋巴性间质性肺炎、疟疾、男性和女性自体免疫性不育症、上颌血管血管炎、中等血管血管炎(包括川崎氏病和多发性结节性动脉炎)、膜或膜性增生性GN(MPGN)(包括I型和II型以及快速进行性GN、膜性GN(膜性肾病变))、美尼尔氏病(Meniere’s disease)、脑膜炎、显微性结肠炎、显微性多血管炎、偏头痛、最小变化肾病变、混合结缔组织疾病(MCTD)、感染性单核细胞增多症(mononucleosis infectiosa)、莫伦氏溃疡(Mooren’s ulcer)、慕夏-哈伯曼病(Mucha-Habermann disease)、多灶性运动神经病变、多内分泌腺衰竭、多器官损伤综合征诸如继发于败血病、创伤或出血的那些)、多器官损伤综合征、多发性硬化症(MS)诸如脊髓-视觉MS、多发性硬化症、腮腺炎、肌肉病症、重症肌无力诸如胸腺瘤相关的重症肌无力、重症肌无力、心肌炎、肌炎、嗜睡病、坏死性小肠结肠炎和透壁性结肠炎以及自体免疫炎性肠病、坏死性血管炎、皮肤血管炎或超敏性血管炎、新生儿狼疮综合征(NLE)、肾变病、肾病综合征、神经疾病、视神经脊髓炎(德维克氏病(Devic's))、视神经脊髓炎、神经性肌强直、嗜中性白细胞减少症、非癌性淋巴细胞增多、非肉芽肿性葡萄膜炎、非恶性胸腺瘤、眼和眼眶炎症性病症、眼瘢痕性类天疱疮、卵巢炎、交感性眼炎(ophthalmia symphatica)、斜视眼阵挛肌阵挛综合征(OMS)、斜视眼阵挛或斜视眼阵挛肌阵挛综合征(OMS)和感觉神经病变、视神经炎、肉芽肿性睾丸炎(orchitis granulomatosa)、骨关节炎、复发性风湿病、胰腺炎、全部血球減少症、PANDAS(与链球菌相关的儿科自体免疫性神经精神性障碍)、副肿瘤性小脑变性、副肿瘤综合征、副肿瘤综合征(包括神经副肿瘤综合征，任选兰伯特-伊顿肌无力综合征或伊顿-兰伯特综合征)、寄生虫性疾病诸如利什曼原虫病、阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)、帕里龙伯格综合征(Parry Romberg syndrome)、扁平部睫状体炎(外周葡萄膜炎)、帕森尼奇-特纳综合征(Parsonnage-Turner syndrome)、细小病毒感染、类天疱疮诸如大疱性类天疱疮和皮肤类天疱疮、天疱疮(包括寻常天疱疮)、红斑性天疱疮、落叶状天疱疮、天疱疮粘膜类天疱疮、天疱疮、消化性溃疡、周期性麻痹、外周神经病变、静脉周脑脊髓炎、恶性贫血(pernicious anemia)(恶性贫血(anemia perniciosa))、恶性贫血、晶状体抗原性葡萄膜炎、肺变硬、POEMS综合征、I、II和III型多发性结节性动脉炎、慢性原发性多发性关节炎、多软骨炎(如难治性或复发的多软骨炎)、多内分泌腺自体免疫性疾病、多内分泌腺衰竭、多腺性综合征(任选自体免疫多腺性综合征(或多腺性内分泌病变综合征))、风湿性多肌痛、多发性肌炎、多发性肌炎/皮肤肌炎、多发性神经病变、急性多神经根炎(polyradiculitis acuta)、心切开术后综合征、后葡萄膜炎或自体免疫性葡萄膜炎、心肌梗塞后综合征、心包切开术后综合征、链球菌感染后肾炎、疫苗接种后综合征、早老性痴呆、原发性胆汁性硬化、原发性甲状腺功能不足、原发性特发性粘液性水肿、原发性淋巴细胞增多(其包括单克隆B细胞淋巴细胞增多)、任选良性单克隆γ球蛋白病和意义未确定的单克隆γ球蛋白病MGUS、原发性粘液性水肿、原发性进行性MS(PPMS)和复发缓解性MS(RRMS)、原发性硬化性胆管炎、孕酮皮炎、进行性全身性硬化、增生性关节炎、牛皮癣诸如斑块牛皮癣、牛皮癣、牛皮癣性关节炎)、肺泡蛋白沉着病、肺浸润嗜酸粒细胞增多、纯红细胞贫血或再生障碍(PRCA)、纯红细胞再生障碍、脓性或非脓性窦炎、脓疱性牛皮癣和甲牛皮癣、肾盂炎、坏疽性脓皮病、奎尔万氏甲状腺炎(Quervain’s thyroiditis)、雷诺氏现象、反应性关节炎、反复流产、血压应答降低、反射交感性营养不良、难治性口炎性腹泻、莱特尔氏病(Reiter’sdisease)或综合征、复发性多软骨炎、心肌或其他组织的再灌注损伤、再灌注损伤、呼吸窘迫综合征、多动腿综合征、视网膜自体免疫、腹膜后纤维化、雷诺氏综合征(Reynaud’ssyndrome)、风湿性疾病、风湿热、风湿病、类风湿性关节炎、类风湿性脊椎炎、风疹病毒感染、桑普特氏综合征(Sampter’s syndrome)、类肉瘤病、血吸虫病、施密特综合征(Schmidtsyndrome)、SCID和艾伯斯坦-巴尔病毒相关的疾病、巩膜病、巩膜炎、指硬皮病、硬皮病(任选全身性硬皮病)、硬化性胆管炎、播散性硬化(sclerosis disseminata)、硬化诸如全身性硬化症、感觉神经性听力损失、血清反应阴性脊椎关节炎、席汉氏综合征(Sheehan’ssyndrome)、舒尔曼氏综合征(Shulman’s syndrome)、硅肺病、休格连氏综合征(ssyndrome)、精子和睾丸自体免疫、蝶窦炎、史蒂文斯-约翰逊综合症(Stevens-Johnsonsyndrome)、僵人(stiff-man/stiff-person)综合征、亚急性细菌性心内膜炎(SBE)、亚急性皮肤红斑狼疮、突发性耳聋、苏萨克氏综合征(Susac’s syndrome)、西登哈姆氏舞蹈病(Sydenham’s chorea)、交感性眼炎、全身性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)或全身性红斑狼疮(systemic lupus erythematodes)、皮肤SLE、全身性坏死性脉管炎、ANCA相关的血管炎(任选车格-施特劳斯血管炎或综合征(CSS))、脊髓痨、高安氏动脉炎、毛细血管扩张、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、闭塞性血栓性脉管炎(thromboangiitisubiterans)、血小板减少症(包括血栓性血小板减少性紫癜(TTP)和自体免疫或免疫介导的血小板减少症，诸如特发性血小板减少性紫癜(ITP)，包括慢性或急性ITP、血小板减少性紫癜(TTP))、甲状腺毒症、组织损伤、托洛萨-亨特综合征(Tolosa-Hunt syndrome)、中毒性表皮坏死溶解、中毒性休克综合征、输血反应、婴儿期短暂低γ球蛋白血症、横贯性脊髓炎、横穿脊髓炎、热带性肺嗜酸粒细胞增多、结核病、溃疡性结肠炎、未分化结缔组织疾病(UCTD)、荨麻疹(任选慢性变应性荨麻疹和慢性特发性荨麻疹，包括慢性自体免疫性荨麻疹)、葡萄膜炎、前葡萄膜炎、葡萄膜视网膜炎、心瓣炎、血管功能异常、血管炎、脊椎关节炎、水疱大疱性皮肤病、白癜风、韦格纳氏肉芽肿病(肉芽肿病伴多血管炎(GPA))、维斯科特-奥尔德里奇综合症(Wiskott-Aldrich syndrome)或X染色体关联的高IgM综合征。
应当了解，本文鉴定的疾病病症旨在是示例性的而非穷举性的。
主题激动剂可以与其他治疗剂组合，所述其他治疗剂可以在相同或不同的时间并且以任一次序在相同或不同的组合物中施用。例如，主题激动剂可以以治疗方案施用，所述治疗方案包括施用PD-1或PD-L1激动剂、CTLA4-Ig、细胞因子、细胞因子激动剂或拮抗剂、或另一种受体激动剂或拮抗剂。
免疫应答的下调
上调或增强VISTA多肽的抑制功能可用于下调免疫应答。下调可以是抑制或阻断已经在进行中的免疫应答的形式，或者可以涉及阻止免疫应答的诱导。活化的免疫细胞的功能可以通过下调免疫细胞应答或通过在免疫细胞中诱导特异性无反应或这两种方式来抑制。例如，VISTA激动性抗体可以与在各种免疫细胞上表达的VISTA多肽结合，从而下调免疫应答。该激动性抗体可以是单特异性的或多特异性的，例如，其可以包含双特异性抗体诸如BiTE。例如，这种抗体可以包含VISTA抗原结合部分和另一种抗原结合部分，例如，其靶向免疫细胞(如T细胞、B细胞或髓样细胞)上的细胞表面受体。除了包含VISTA抗原结合位点之外，这种抗体可还包含结合至B细胞抗原受体、T细胞抗原受体、或者Fc或其他受体的结合位点，以便使该分子靶向特定的细胞群。选择用于双特异性抗体的该第二抗原可提供选择待靶向的细胞群的灵活性。促进或模拟VISTA活性的VISTA激动性抗体可以增强VISTA与其天然结合配偶体的相互作用。如本文所公开的，其他人VISTA活化性或激动性抗体可通过其抑制T细胞活性或增殖的能力和/或基于其体外或炎性疾病、变应性疾病或自体免疫疾病模型的免疫抑制作用来鉴定。
许多本领域公认的细胞活化读数可用于在存在活化剂的情况下测量例如细胞增殖或效应功能(例如抗体产生、细胞因子产生、吞噬作用)。测试抗体激动或促进人VISTA的作用从而阻断这种活化的能力可容易地通过测量该作用剂影响被测量的增殖或效应功能的降低来测定。因此，测试抗体具有免疫抑制性的能力以及阻断免疫活化的能力可以通过测量不同抗原浓度下的细胞因子产生和/或增殖来测定。
通过将抗原与根据本发明的VISTA激动性抗体共同施用，可以诱导针对特定抗原的耐受性。例如，可以诱导对特定多肽的耐受性，可以抑制对变应原或不期望对其产生免疫应答的外来多肽的免疫应答。例如，接受因子VIII的患者经常产生针对该凝血因子的抗体。将可刺激或模拟VISTA活性或VISTA与其天然结合配偶体的相互作用的根据本发明的VISTA激动性抗体与重组因子VIII共同施用可以抑制这种不希望的免疫应答。
可将根据本发明的VISTA激动性抗体与另一种作用剂组合使用以下调免疫应答，所述作用剂可阻断免疫细胞上的共刺激受体的活性或者可激发免疫细胞上表达的另一种免疫抑制受体或配体的活性。示例性的分子包括：PD-1、PDL-1激动剂、CTLA-4的可溶形式、抗B7-1抗体、抗B7-2抗体、靶向LAG-3、TIM-3、BTLA、B7-H4、B7H3等中的一者或多者的拮抗性抗体和/或靶向CD40、CD137、OX40、GITR、CD27、CD28或ICOS中的一者或多者的激动性抗体或它们的组合。这些部分可以组合在单一组合物或化合物中，例如，含有根据本发明的VISTA激动性抗体并且还包含另一种免疫激动性抗体的双特异性抗体，或者其可以包含融合多肽，该融合多肽含有与另一种免疫抑制性多肽或其他活性剂融合的根据本发明的VISTA激动性抗体。作为另一种选择，可将这些部分作为相同或不同的组合物中的单独的或离散的实体(同时或相继)施用，以下调受试者中的免疫细胞介导的免疫应答。
可以与根据本发明的VISTA激动性抗体组合的特异性免疫抑制分子的实例包括阻断共刺激信号(例如，针对CD28或ICOS)的抗体、经由CTLA4活化抑制性信号的抗体、和/或针对其他免疫细胞标志物(例如，针对CD40、CD40配体或细胞因子)的抗体、融合蛋白(例如CTLA4-Fc或PD-1-Fc)和免疫抑制性药物(例如雷帕霉素、环孢菌素A或FK506)。
在另一个实施方案中，含有根据本发明的VISTA激动性抗体的双特异性抗体可用于靶向特定细胞群体，例如，利用仅见于某种类型细胞，例如B淋巴细胞、单核细胞、树突细胞或朗格汉斯细胞上的标志物。通过激活VISTA活性或VISTA-免疫细胞相互作用来下调免疫应答(从而刺激VISTA的负信号传导功能)可用于下调免疫应答，例如，在组织、皮肤和器官移植的情况下，在移植物抗宿主疾病(GVHD)、或变态反应、或自体免疫和炎性疾病诸如全身性红斑狼疮、IBD、RA、牛皮癣和多发性硬化症中。例如，免疫细胞功能的阻断导致组织移植中组织破坏减少。通常，在组织移植中，移植物的排斥是通过由免疫细胞识别为外来物、然后是破坏移植物的免疫反应而起始。在移植之前或移植时单独或与另一种下调剂一起施用促进VISTA活性或VISTA与其天然结合配偶体的相互作用的分子可抑制共刺激信号的产生。此外，促进VISTA活性也可足以激动免疫细胞，从而在受试者中诱导耐受性。
为了在某些疾病或在某些受试者中获得足够的免疫抑制或耐受性，可能需要阻断其他分子的共刺激功能。例如，通过在移植之前或移植时施用可溶形式的以下组合来阻断B7-1和B7-2的功能可为可取的：具有这些抗原每一者的活性的肽或阻断针对这些抗原的抗体(单独地或一起在单种组合物中)。或者，促进VISTA的抑制活性以及进一步抑制B7-1和/或B7-2的共刺激活性可为可取的。
主题抗人VISTA激动性抗体尤其可用于治疗自体免疫疾病。许多自体免疫疾病是免疫细胞的不适当活化的结果，所述免疫细胞对自身组织具有反应性并且促进该疾病病理学所涉及的细胞因子和自身抗体的产生。防止自身反应性免疫细胞的活化可以减少或消除疾病症状。施用可促进VISTA或VISTA与其天然结合配偶体的相互作用的主题抗人VISTA激动性抗体可以诱导自身反应性免疫细胞的抗原特异性耐受，这可以导致疾病的长期缓解。另外，共同施用通过破坏B7分子与共刺激受体的受体-配体相互作用来阻断免疫细胞的共刺激的药剂可用于抑制免疫细胞活化以防止产生可能涉及疾病过程的自身抗体或细胞因子。
通过使用主题抗人VISTA激动性抗体刺激VISTA活性或VISTA与其天然结合配偶体的相互作用来下调免疫应答也可用于治疗自身组织的自体免疫攻击。因此，通过增加VISTA活性或VISTA与其天然结合配偶体的结合，可以减轻或改善由自体免疫攻击引起或加剧的病症(例如，心脏病、心肌梗死或动脉粥样硬化)。因此，通过使用主题抗人VISTA激动性抗体刺激VISTA活性或VISTA与其反受体的相互作用来调节由自体免疫攻击加剧的病症，诸如自体免疫障碍(以及诸如心脏病、心肌梗死和动脉粥样硬化之类的病症)在本发明的范围内。
如前所述，根据本发明的激动性抗人VISTA抗体用于预防或缓解自体免疫和炎性障碍的功效可使用许多经充分表征的人自体免疫疾病和炎性疾病的动物模型来确定。实例包括鼠实验性自体免疫性脑炎、MRL/lpr/lpr小鼠或NZB杂交小鼠中的全身性红斑狼疮、鼠自体免疫胶原关节炎、NOD小鼠和BB大鼠中的糖尿病，以及鼠实验性重症肌无力。参见Paul(编辑)，Fundamental Immunology,Raven Press，纽约1989年，第840-856页。
免疫细胞活化的抑制进一步在治疗上可用于治疗变态反应和变应性反应，例如通过抑制IgE产生。可以将促进或模拟VISTA活性或VISTA与其天然结合配偶体相互作用的主题抗人VISTA激动性抗体施用给变应性受试者以抑制受试者中免疫细胞介导的变应性应答。VISTA活性或VISTA与其天然结合配偶体的相互作用的刺激可伴随着与适当的MHC分子一起暴露于变应原。变应性反应在本质上可以是全身性或局部性的，这取决于变应原的进入途径以及IgE在肥大细胞或嗜碱性粒细胞上的沉积模式。因此，通过施用主题抗人VISTA激动性抗体，可以局部或全身抑制免疫细胞介导的变应性应答。
结合相同表位的抗VISTA抗体的选择
在某些实施方案中，根据本发明的激动性抗VISTA抗体具有所需的功能性质，诸如调节免疫刺激及相关的功能。如图4所示并在工作实施例中公开的，已经阐明了许多根据本发明的抗人VISTA激动性抗体的表位特异性。由于已经发现许多已显示可与相同表位结合的抗体具有免疫抑制性，因此预期可鉴定出与相同或重叠表位结合的其他VISTA激动性抗体，即它们将与示例性VISTA激动性抗体所结合的人VISTA多肽的一个或多个氨基酸残基相互作用。可以选择具有相同表位特异性的其他抗体和/或具有与所需抗体交叉竞争结合VISTA抗原的能力的抗体。例如，可以使用构成整个VISTA多肽的重叠肽(例如15个氨基酸)的文库或构成含有VISTA的所需表位的部分的重叠肽文库来确定所需抗体的表位特异性，并且确定结合所述文库中相同肽或其一个或多个残基的抗体结合相同线性表位或构象表位。在实施例中，使用方法确定表位特异性，所述方法可用于鉴定线性表位和构象表位。
根据本发明的激动性抗体的修饰
除在框架区或CDR区内进行的修饰之外或替代所述修饰，可对根据本发明至少一些实施方案的抗体进行工程改造以在Fc区内包括修饰，通常用以改变抗体的一种或多种功能性质，诸如血清半衰期、补体固定、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞细胞毒性。此外，可对根据本发明至少一些实施方案的抗体进行化学修饰(例如可使一个或多个化学部分附接至抗体)或修饰以改变其糖基化，同样用以改变抗体的一种或多种功能性质。下文进一步描述这类实施方案。Fc区中残基的编号方式是Kabat的EU索引的编号方式。
在一个实施方案中，修饰CH1的铰链区以使得铰链区中半胱氨酸残基的数目被改变，例如增加或减少。这个方法进一步描述于Bodmer等的美国专利No.5,677,425中。改变CH1的铰链区中半胱氨酸残基的数目以例如助于轻链和重链的装配或用以提高或降低抗体的稳定性。
在另一实施方案中，使抗体的Fc铰链区突变以降低抗体的生物半衰期。更具体地讲，将一个或多个氨基酸突变引入Fc-铰链片段的CH2-CH3结构域界面区中以使得相对于天然的Fc-铰链结构域葡萄球菌蛋白A(Staphylococcal protein A,SpA)结合，抗体具有受损的SpA结合。这个方法进一步详细描述于Ward等的美国专利No.6,165,745中。
在另一实施方案中，修饰抗体以增加其生物半衰期。各种方法是可能的。例如，可引入一个或多个以下突变：T252L、T254S和T256F，如颁给Ward的美国专利No.6,277,375中所述。作为另一种选择，为增加生物半衰期，可在CH1区或CL区内改变抗体以含有取自IgG的Fc区的CH2结构域的两个环区的补救受体结合表位，如Presta等的美国专利No.5,869,046和No.6,121,022中所述。
在其他实施方案中，通过用不同氨基酸残基置换至少一个氨基酸残基来改变Fc区以改变抗体的效应功能。例如，可用不同氨基酸残基置换选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320和322的一个或多个氨基酸以使得抗体对效应子配体具有改变的亲和力，但保留亲本抗体的抗原结合能力。对其的亲和力被改变的效应子配体可为例如Fc受体或补体的Cl组分。这个方法进一步详细描述于两者均由Winter等所完成的美国专利No.5,624,821和No.5,648,260中。
在另一个实例中，可用不同氨基酸残基置换选自氨基酸残基329、331和322的一个或多个氨基酸以使得抗体具有改变的C1q结合和/或降低或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。这个方法进一步详细描述于Idusogie等的美国专利No.6,194,551中。
在另一个实例中，改变在氨基酸位置231和239内的一个或多个氨基酸残基以由此改变抗体固定补体的能力。这个方法进一步描述于Bodmer等的PCT公布WO 94/29351中。
在另一个实例中，通过修饰在以下位置处的一个或多个氨基酸来修饰Fc区以增加抗体对Fγ受体的亲和力：238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439。这个方法进一步描述于Presta的PCT公布WO 00/42072中。此外，已对人IgGl上对FcγRI、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点进行作图，并且已描述了具有改善结合的变体(参见Shields，R.L.等(2001)J.Biol.Chem.276:6591-6604)。显示在位置256、290、298、333、334和339处的特定突变会改善与FcγRIII的结合。另外，显示以下组合突变体可改善FcγRIII结合：T256A/S298A、S298A/E333A、S298A/K224A和S298A/E333A/K334A。此外，诸如M252Y/S254T/T256E或M428L/N434S之类的突变可改善与FcRn的结合，并且可增加抗体循环半衰期(参见Chan CA和Carter PJ(2010)Nature Rev Immunol 10:301-316)。
在另一个实施方案中，可修饰抗体以消除体内Fab臂交换。具体来说，该方法涉及在其他IgG4抗体之间交换IgG4半分子(一个重链加一个轻链)，所述交换有效产生在功能上是单价的双特异性抗体。对重链的铰链区和恒定结构域的突变可消除这种交换(参见Aalberse,RC,Schuurman J.,2002,Immunology 105:9-19)。
在另一个实施方案中，修饰抗体的糖基化。例如，可制备无糖基化抗体(即抗体缺少糖基化)。可改变糖基化以例如增加抗体对抗原的亲和力。所述碳水化合物修饰可通过例如改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来实现。例如，可进行一个或多个可导致一个或多个可变区框架糖基化位点消除的氨基酸置换以由此消除在该位点处的糖基化。这种无糖基化可增加抗体对抗原的亲和力。这种方法进一步详细描述于Co等的美国专利No.5,714,350和6,350,861中。
另外地或作为另外一种选择，可制备具有改变类型的糖基化的抗体，诸如具有降低量的岩藻糖基残基的低岩藻糖基化抗体或具有增加的平分型GlcNac结构的抗体。已证明这种改变的糖基化样式会增加抗体的ADCC能力。这种碳水化合物修饰可通过例如在糖基化机制改变的宿主细胞中表达抗体来实现。糖基化机制改变的细胞已在本领域中描述并且可用作宿主细胞，在该宿主中表达根据本发明至少一些实施方案的重组抗体以由此产生具有改变的糖基化的抗体。例如，细胞系Ms704、Ms705和Ms709缺乏岩藻糖基转移酶基因FUT8(α-(1,6)岩藻糖基转移酶)，以致在Ms704、Ms705和Ms709细胞系中表达的抗体在它们的碳水化合物上缺乏岩藻糖。通过使用两种置换载体在CH0/DG44细胞中靶向破坏FUT8基因来产生Ms704、Ms705和Ms709FUT8细胞系(参见由Yamane等的美国专利公布No.20040110704以及Yamane-Ohnuki等(2004)Biotechnol Bioeng 87:614-22)。又如，Hanai等的EP 1,176,195描述了具有在功能上被破坏的FUT8基因(编码岩藻糖基转移酶)的细胞系，以致由于降低或消除了该α-1,6键相关的酶，在这种细胞系中表达的抗体展现低岩藻糖基化。Hanai等还描述了用于向结合抗体的Fc区的N-乙酰基葡萄糖胺添加岩藻糖的酶活性较低，或不具有该酶活性的细胞系，例如大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0(ATCC CRL1662)。Presta的PCT公布WO 03/035835描述了变体CHO细胞系Lecl3细胞，其具有降低的使岩藻糖附接于Asn(297)连接的碳水化合物的能力，从而也导致在该宿主细胞中表达的抗体具有低岩藻糖基化(还可参见Shields,R.L.等(2002)J.Biol.Chem.277:26733-26740)。Umana等的PCT公布WO 99/54342描述了经工程改造以表达糖蛋白修饰性糖基转移酶(例如P(l,4)-N-乙酰葡糖胺基转移酶III(GnTIII))的细胞系，以致在该工程细胞系中表达的抗体展现出增加的平分型GlcNac结构，这导致抗体的ADCC活性增加(还可参见Umana等(1999)Nat.Biotech.17:176-180)。作为另外一种选择，可使用岩藻糖苷酶来裂解掉抗体的岩藻糖残基。例如，岩藻糖苷酶α-L-岩藻糖苷酶可从抗体移除岩藻糖基残基(Tarentino,A.L.等(1975)Biochem.14:5516-23)。
本发明所设想的本文抗体的另一修饰是聚乙二醇化或添加其他水溶性部分，通常是聚合物，例如用以增强半衰期。可使抗体聚乙二醇化以例如，增加该抗体的生物(例如血清)半衰期。为使抗体聚乙二醇化，通常使抗体或其片段与聚乙二醇(PEG)诸如PEG的反应性酯或醛衍生物在其中一个或多个PEG基团变得附接于所述抗体或抗体片段的条件下反应。优选地，经由与反应性PEG分子(或类似反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应来进行聚乙二醇化。如本文所用，术语“聚乙二醇”旨在涵盖已用于衍生其他蛋白质的任何形式的PEG，诸如单(Ci-Cio)烷氧基聚乙二醇或芳氧基聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在某些实施方案中，待聚乙二醇化的抗体是无糖基化抗体。用于使蛋白质聚乙二醇化的方法在本领域中是已知的，并且可应用于根据本发明至少一些实施方案的抗体。参见例如Nishimura等的EP 0 154 316和Ishikawa等的EP 0 401 384。
工程改造抗体的方法
在某些实施方案中，根据本发明的具有VH序列和VL序列的抗VISTA抗体可分别通过修饰VH序列和/或VL序列或与之连接的恒定区来用于产生新型抗VISTA抗体。因此，在根据本发明至少一些实施方案的另一方面，将根据本发明至少一些实施方案的抗VISTA抗体的结构特征用于产生保留根据本发明至少一些实施方案的抗体的至少一种功能性质(诸如与人VISTA结合)的结构相关的抗VISTA抗体。例如，可将一种VISTA抗体的一个或多个CDR区或其突变形式与已知框架区和/或其他CDR重组组合以产生额外的、根据本发明至少一些实施方案的重组工程改造的抗VISTA抗体，如上所论述的。其他类型的修饰包括先前章节中所述的那些。用于工程改造方法的起始物质是一条或多条本文所提供的VH序列和/或VL序列或其一个或多个CDR区。为产生工程抗体，不必实际制备(即表达成蛋白质)具有一个或多个本文所提供的VH序列和/或VL序列或其一个或多个CDR区的抗体。而是，序列中所含的信息用作起始物质来产生源于原始序列的“第二代”序列，接着制备所述“第二代”序列并表达成蛋白质。
标准分子生物学技术可用于制备和表达改变的抗体序列。优选地，由改变的抗体序列编码的抗VISTA抗体是通过各种方法以及用本文提供的序列来产生的分别保留抗VISTA抗体的一种、一些或全部功能性质的抗体，所述功能性质包括：以特定KD水平或更小的KD水平与VISTA抗原结合和/或调节免疫应答和/或选择性结合至所需靶标细胞诸如像表达VISTA抗原的细胞。
可使用本领域中可用和/或本文所述的标准测定法来评估改变的抗体的功能性质。在工程改造根据本发明至少一些实施方案的抗体的方法的某些实施方案中，可随机或选择性沿抗VISTA抗体编码序列的全部或一部分引入突变，并且可针对结合活性和/或其他所需功能性质对所得经修饰的抗VISTA抗体进行筛选。
本领域中已描述了突变方法。例如，Short的PCT公布WO 02/092780描述了用于使用饱和诱变、合成连接装配或它们的组合来产生和筛选抗体突变的方法。作为另一种选择，Lazar等的PCT公布WO 03/074679描述了使用计算筛选方法来优化抗体的生理化学性质的方法。
编码抗体的核酸分子
本发明还提供编码根据本发明的抗VISTA抗体或其片段或缀合物的核酸。核酸可存在于完整细胞中、细胞溶解产物中，或呈部分纯化或基本上纯化的形式。核酸在通过标准技术(包括碱/SDS处理、CsCl分带、柱色谱法、琼脂糖凝胶电泳和本领域中熟知的其他技术)纯化而离开其他细胞组分或其他污染物例如其他细胞核酸或蛋白质时，核酸被“分离”或“致使基本上纯化”。参见F.Ausubel等(编辑)(1987)Current Protocols in MolecularBiology,Greene Publishing and Wiley Interscience,New York。根据本发明至少一些实施方案的核酸可为例如DNA或RNA，并且可含有或可不含有内含子序列。在一个优选的实施方案中，核酸是cDNA分子。
可使用标准分子生物学技术来获得根据本发明至少一些实施方案的核酸。对于由杂交瘤(例如如下文进一步描述的，由携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)表达的抗体，可通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术来获得编码由杂交瘤制备的抗体的轻链和重链的cDNA。对于从免疫球蛋白基因文库获得(例如，使用噬菌体展示技术)的抗体，可从文库回收编码抗体的核酸。
一旦获得编码VH区段和VL区段的DNA片段，即可进一步通过标准重组DNA技术来操作这些DNA片段，例如以使可变区基因转换成全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，使编码VL或VH的DNA片段有效连接至编码另一蛋白质诸如抗体恒定区或柔性接头的另一DNA片段。如先前所定义的，“有效连接”意指使两个DNA片段接合以致由所述两个DNA片段编码的氨基酸序列保持同框。
可通过使分离的编码VH区的DNA有效连接于编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的另一DNA分子来使编码VH区的DNA转换成全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如Kabat,E.A.等(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH出版号91-3242)，并且可通过标准PCR扩增来获得涵盖这些区域的DNA片段。重链恒定区可为IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但最优选是IgGl、IgG2或IgG4恒定区。对于Fab片段重链基因，可使编码VH的DNA有效连接至仅编码重链CH1恒定区的另一DNA分子。
可通过使编码VL的DNA有效连接于编码轻链恒定区CL的另一DNA分子来使分离的编码VL区的DNA转换成全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列在本领域中是已知的(参见例如Kabat,E.A.等(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH出版号91-3242)，并且可通过标准PCR扩增来获得涵盖这些区域的DNA片段。轻链恒定区可为κ或λ恒定区，但最优选是κ恒定区。
为产生scFv基因，使编码VH和VL的DNA片段有效连接至编码柔性接头例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3的另一片段，使得VH序列和VL序列可表达成连续单链蛋白质，其中VL区和VH区通过所述柔性接头接合(参见例如Bird等(1988)Science 242:423-426；Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 85:5879-5883；McCafferty等，(1990)Nature 348:552-554)。
抗VISTA单克隆抗体的产生
可通过多种技术来产生根据本发明的抗VISTA单克隆抗体(mAb)和抗原结合片段，所述技术包括常规的单克隆抗体方法学，例如Kohler和Milstein(1975)Nature 256:495的标准体细胞杂交技术。尽管体细胞杂交程序是优选的，但在原则上可采用用于产生单克隆抗体的其他技术，例如B淋巴细胞的病毒性或致癌性转化。
用于制备杂交瘤的一优选动物系统是鼠类系统。在小鼠中产生杂交瘤是一种极其完善建立的程序。用于分离供融合用的经免疫脾细胞的免疫方案和技术在本领域中是已知的。融合配偶体(例如鼠类骨髓瘤细胞)和融合程序也是已知的。可基于如上所述制备的鼠类单克隆抗体的序列来制备本发明的嵌合或人源化抗体。可从所关注的鼠类杂交瘤获得编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA，并且使用标准分子生物学技术工程改造成含有非鼠类(例如人)免疫球蛋白序列。例如，为产生嵌合抗体，可使用本领域中已知的方法来使鼠类可变区连接于人恒定区(参见例如颁给Cabilly等的美国专利No.4,816,567)。为产生人源化抗体，可使用本领域中已知的方法来将鼠类CDR区插入人框架中(参见例如颁给Winter的美国专利No.5,225,539以及颁给Queen等的美国专利No.5,530,101、No.5,585,089、No.5,693,762和No.6,180,370)。
根据本发明的至少一些实施方案，抗体是人单克隆抗体。可使用携带人免疫系统而非小鼠系统的各部分的转基因或转染色体小鼠来产生针对VISTA的所述人单克隆抗体。这些转基因和转染色体小鼠包括在本文中分别称为HuMAb MouseTM和KM MouseTM的小鼠，并且在本文中统称为“人Ig小鼠”。HuMAb MouseTM(Medarex Inc.)含有编码未重排的人重链μ和γ以及κ轻链免疫球蛋白序列以及使内源性μ和κ链基因座失活的靶向突变的人免疫球蛋白基因小型基因座(参见例如Lonberg等(1994)Nature 368(6474):856-859)。因此，所述小鼠展现出小鼠IgM或κ的表达降低，以及应答于免疫，引入的人重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变以产生高亲和力人IgGκ单克隆(Lonberg，N.等(1994)，出处同上；综述于Lonberg,N.(1994)Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101；Lonberg,N.和Huszar,D.(1995)Intern.Rev.Immunol.13:65-93，以及Harding,F.和Lonberg,N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.764:536-546中)。HuMab 的制备和使用以及由所述小鼠携带的基因组修饰进一步描述于Taylor,L.等(1992)Nucleic Acids Research 20:6287-6295；Chen,J.等(1993)International Immunology 5:647-656；Tuaillon等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:3720-3724；Choi等(1993)Nature Genetics 4:117-123；Chen,J.等(1993)EMBO J.12:821-830；Tuaillon等(1994)J.Immunol.152:2912-2920；Taylor,L.等(1994)International Immunology 6:579-591；以及Fishwild,D.等(1996)Nature Biotechnology 14:845-851中，特此将它们的全部内容以引用的方式整体明确并入本文。进一步参见：全都颁给Lonberg和Kay的美国专利No.5,545,806、No.5,569,825、No.5,625,126、No.5,633,425、No.5,789,650、No.5,877,397、No.5,661,016、No.5,814,318、No.5,874,299和No.5,770,429；颁给Surani等美国专利No.5,545,807；全部颁给Lonberg和Kay的PCT专利公布No.WO92/03918、No.WO 93/12227、No.WO 94/25585、No.WO97/13852、No.WO 98/24884和No.WO 99/45962；以及颁给Korman等的PCT专利公布No.WO01/14424。
在另一实施方案中，可使用在转基因和转染色体上携带人免疫球蛋白序列的小鼠，诸如携带人重链转基因和人轻链转染色体的小鼠来产生根据本发明至少一些实施方案的人抗体。在本文中称为“KM miceTM”的所述小鼠详述于颁给Ishida等的PCT公布WO02/43478中。
更进一步，表达人免疫球蛋白基因的备选转基因动物系统在本领域中是可用的，并且可用于产生根据本发明至少一些实施方案的抗VISTA抗体。例如，可使用称为Xenomouse(Abgenix,Inc.)的备选转基因系统；这种小鼠例如描述于颁给Kucherlapati等的美国专利No.5,939,598、No.6,075,181、No.6,114,598、No.6,150,584和No.6,162,963中。
此外，表达人免疫球蛋白基因的备选转染色体动物系统在本领域中是可用的，并且可用于产生根据本发明至少一些实施方案的抗VISTA抗体。例如，可使用称为“TC小鼠”的携带人重链转染色体和人轻链转染色体两者的小鼠；这种小鼠描述于Tomizuka等(2000)Proc.Natl.Acad Sci.USA 97:722-727中。此外，已在本领域中描述了携带人重链和轻链转染色体的母牛(Kuroiwa等(2002)Nature Biotechnology 20:889-894)，并且可用于产生根据本发明至少一些实施方案的抗VISTA抗体。
可使用用于筛选人免疫球蛋白基因的文库的噬菌体展示方法来制备根据本发明至少一些实施方案的人单克隆抗体。本领域中确立了用于分离人抗体的这种噬菌体展示方法。参见例如：颁给Ladner等的美国专利No.5,223,409、No.5,403,484和No.5,571,698；颁给Dower等的美国专利No.5,427,908和No.5,580,717；颁给McCafferty等的美国专利No.5,969,108和No.6,172,197；以及颁给Griffiths等的美国专利No.5,885,793、No.6,521,404、No.6,544,731、No.6,555,313、No.6,582,915和No.6,593,081。
也可使用已将人免疫细胞重构至其中以使得在免疫后可产生人抗体应答的SCID小鼠来制备根据本发明至少一些实施方案的人单克隆抗体。这种小鼠例如描述于颁给Wilson等的美国专利No.5,476,996和No.5,698,767中。
人IG小鼠的免疫
在一些实施方案中，人Ig小鼠用于产生根据本发明的人抗VISTA抗体，例如通过用VISTA抗原和/或重组VISTA或VISTA融合蛋白的纯化或富集的制剂使这种小鼠免疫，如由Lonberg,N.等(1994)Nature 368(6474):856-859；Fishwild,D.等(1996)NatureBiotechnology 14:845-851；以及PCT公布WO 98/24884和WO 01/14424所述。优选地，在首次输注时，小鼠将为6-16周龄。例如，VISTA抗原的纯化或重组的制剂(剂量范围为0.5-500μg)可用于经腹膜内使人Ig小鼠免疫。
—般来讲，当初始用含抗原的完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant)腹膜内(IP)免疫，随后用含抗原的不完全弗氏佐剂每隔一周IP免疫(直至总计6次)时，转基因小鼠起应答。然而，除弗氏佐剂以外的佐剂也发现是有效的。此外，发现在不存在佐剂下的完整细胞具有高度免疫原性。在免疫方案的过程中，用通过眶后放血获得的血浆样品监测免疫应答。可通过ELISA来筛选血浆(如下所述)，可将具有足够抗VISTA人免疫球蛋白滴度的小鼠用于融合。可在处死以及移除脾之前3天用抗原对小鼠经静脉内加强免疫。预期对于各免疫可能需要进行2-3次融合。对于各抗原，通常使6只至24只之间的小鼠免疫。通常，使用HCo7品系与HCol2品系两者。此外，可将HCo7转基因与HCol2转基因二者一起育种，从而获得具有两种不同人重链转基因(HCo7/HCo 12)的单一小鼠。作为另外一种选择或除此之外，可使用KM MouseTM品系。在一个示例性实施方案中，将这些小鼠工程化以选择性地产生人IgG2抗体。
产生人单克隆抗体的杂交瘤的产生
在某些实施方案中，可使用脾细胞来产生杂交瘤，所述杂交瘤产生根据本发明的人单克隆抗VISTA抗体，和/或可分离来自经免疫小鼠的淋巴结细胞，并且使其融合于适当永生化细胞系诸如小鼠骨髓瘤细胞系。可筛选产生抗原特异性抗体的所得杂交瘤。例如，可用50％PEG，使来自经免疫小鼠的脾淋巴细胞的单细胞混悬液融合于六分之一数目的P3X63-Ag8.653非分泌性小鼠骨髓瘤细胞(ATCC,CRL 1580)。将细胞以约2×105涂铺在平底微量滴定板中，随后在含有20％胎克隆血清、18％“653”条件培养基、5％三甲氧唑辛(IGEN)、4mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、5mM HEPES、0.055mM 2-巯基乙醇、50单位/毫升青霉素、50mg/ml链霉素、50mg/ml庆大霉素和1×HAT(Sigma；在融合之后24小时添加HAT)的选择性培养基中温育两周。在大约两周之后，可在其中用HT替换HAT的培养基中培养细胞。可接着通过ELISA针对人单克隆IgM和IgG抗体来筛选独立的孔。一旦发生广泛杂交瘤生长，即可通常在10-14天之后观察培养基。可再涂铺分泌抗体的杂交瘤，再次筛选，并且如果仍然是人IgG阳性，那么可通过有限稀释来进行至少两次单克隆抗体亚克隆。可接着在组织培养基中在体外培养稳定的亚克隆以产生少量抗体用于表征。
为纯化人单克隆抗体，可使所选杂交瘤在两升旋转烧瓶中生长以进行单克隆抗体纯化。可将上清液过滤并浓缩，随后用蛋白A-琼脂糖(Pharmacia,Piscataway,N.J.)进行亲和色谱法。可通过凝胶电泳和高效液相色谱法来检查洗脱的IgG以确保纯度。可将缓冲溶液交换成PBS，并且可使用1.43消光系数，通过OD280来确定浓度。可将单克隆抗体等分并储存在-80℃下。
产生单克隆抗体的转染瘤的产生
在某些实施方案中，可使用例如如本领域中所熟知的重组DNA技术和基因转染方法的组合，在宿主细胞转染瘤中产生根据本发明的抗VISTA抗体(例如Morrison,S.(1985)Science 229:1202)。例如，为表达抗体或其抗体片段，可通过标准分子生物学技术(例如使用表达所关注抗体的杂交瘤进行PCR扩增或cDNA克隆)来获得编码部分或全长轻链和重链的DNA，并且可将该DNA插入表达载体中以使得基因有效连接至转录和翻译控制序列。在该语境中，术语“有效连接”意指将抗体基因连接至载体中以使得所述载体内的转录和翻译控制序列发挥它们调节所述抗体基因的转录和翻译的预定功能。选择表达载体和表达控制序列以可与所用表达宿主细胞相容。可将抗体轻链基因和抗体重链基因插入单独载体中，或更通常地，将两个基因均插入同一表达载体中。通过标准方法(例如抗体基因片段和载体上的互补限制位点的连接，或如果不存在限制位点，则为平末端连接)来将抗体基因插入表达载体中。本文所述的抗体的轻链和重链可变区可用于通过以下方式来产生任何抗体同种型的全长抗体基因：将它们插入已编码所需同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中以使得VH区段有效连接至载体内的CH区段，并且VL区段有效连接至载体内的CL区段。另外地或作为另外一种选择，重组表达载体可编码有助于抗体链从宿主细胞分泌的信号肽。可将抗体链基因克隆至载体中以使得信号肽同框连接至抗体链基因的氨基末端。信号肽可为免疫球蛋白信号肽或异源性信号肽(即来自非免疫球蛋白的信号肽)。
抗体与抗原结合的表征
在某些实施方案中，通过已知的抗体结合测定法技术诸如ELISA来测定根据本发明的激动性抗VISTA抗体的结合特异性。在示例性ELISA中，用纯化的抗原(在本文中是于PBS中的0.25μg/ml的VISTA)包被微量滴定板，接着用含5％牛血清白蛋白的PBS封闭。添加抗体的稀释液(例如来自经免疫小鼠的血浆的稀释液)至各孔中，并且在37℃下温育1-2小时。将板用PBS/吐温(Tween)洗涤，接着与缀合至碱性磷酸酶的二级试剂(例如对于人抗体是山羊抗人IgG Fc特异性多克隆试剂)一起在37℃下温育1小时。在洗涤之后，用pNPP底物(1mg/ml)使板显色，并且以OD 405-650加以分析。优选地，产生最高滴度的小鼠将用于融合。
如上所述的ELISA测定也可用于筛选显示出与VISTA免疫原的阳性反应性的杂交瘤。对以高亲合力结合VISTA的杂交瘤进行亚克隆，并且进一步表征。可选择来自各杂交瘤的一个保留亲本细胞的反应性(根据ELISA)的克隆用于制备5-10小瓶细胞储库储存在-140℃下，以及用于抗体纯化。
为纯化抗VISTA抗体，可使所选杂交瘤在两升旋转烧瓶中生长以进行单克隆抗体纯化。可将上清液过滤并浓缩，随后用蛋白A-琼脂糖(Pharmacia,Piscataway,N.J.)进行亲和色谱法。可通过凝胶电泳和高效液相色谱法来检查洗脱的IgG以确保纯度。可将缓冲溶液交换成PBS，并且可使用1.43消光系数，通过OD280来确定浓度。可将单克隆抗体等分并储存在-80℃下。
为确定所选抗VISTA单克隆抗体是否结合至独特表位，可使用可商购获得的试剂(Pierce,Rockford,Il.)使各抗体生物素化。可如上所述使用VISTA包被的ELISA板进行使用未标记单克隆抗体和生物素化单克隆抗体的竞争研究。可用链霉素-亲和素-碱性磷酸酶探针检测生物素化mAb结合。
为确定纯化抗体的同种型，可使用对特定同种型(如IgG2)的抗体具有特异性的试剂进行同种型ELISA。例如，为确定人单克隆抗体的同种型，可用^g/ml的抗人免疫球蛋白在4℃下将微量滴定板的各孔包被过夜。在用1％BSA封闭之后，使板与1mug/ml或更少的测试单克隆抗体或纯化的同种型对照在环境温度下反应1至2小时。可接着使各孔与人IgGl或人IgM特异性碱性磷酸酶缀合探针反应。如上所述来使板显色并加以分析。
可通过蛋白质印迹(Western blotting)来进一步分别测试抗VISTA人IgG与VISTA抗原的反应性。简而言之，可制备VISTA抗原，并且使其经受十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。在电泳之后，将分离的抗原转移至硝化纤维素膜，用10％胎牛血清封闭，并且用待测试的单克隆抗体探测。可使用抗人IgG碱性磷酸酶检测人IgG结合，并且用BCIP/NBT底物片(Sigma Chem.Co.,St.Louis,Mo.)显色。
在另一方面，本发明的特征在于抗体-药物缀合物(ADC)，其由连接至有效载荷药物(常具有细胞毒性)的抗体(或抗体片段诸如单链可变片段(scFv))组成。抗体导致ADC结合至靶标癌细胞。通常，ADC接着由细胞内化，药物被释放至细胞中。由于具有靶向性，所以副作用较低，并且产生较宽的治疗窗。亲水性接头(例如PEG4Mal)有助于防止药物通过MDR(多重药物抗性)转运体被泵出抗性癌细胞。
在另一方面，本发明的特征在于免疫缀合物，其包含缀合至治疗剂诸如细胞毒素、药物(如免疫抑制剂)或放射性毒素的抗VISTA抗体或其片段。这种缀合物在本文中称为“免疫缀合物”。包括一种或多种细胞毒素的免疫缀合物称为“免疫毒素”。细胞毒素或细胞毒性剂包括对细胞有害(例如杀死细胞)的任何试剂。实例包括泰素(Taxol)、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春花碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌、光辉霉素(mithramycin)、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质素、普鲁卡因、丁卡因(tetracaine)、利多卡因、普萘洛尔(propranolol)和嘌呤霉素以及它们的类似物或同源物。治疗剂也包括例如抗代谢剂(例如甲氨蝶呤、6-疏基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、达卡巴嗪(decarbazine))、烷化剂(例如二氯甲基二乙胺、塞替派、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素(streptozotocin)、丝裂霉素C和顺式二氯二胺合铂(II)(DDP)、顺铂)、蒽环霉素类(例如柔红霉素(先前称为道诺霉素)和多柔比星)、抗生素(例如更生霉素(先前称为放线菌素)、博来霉素、光神霉素和安曲霉素(AMC))、以及抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春花碱)。
可缀合至根据本发明至少一些实施方案的抗体的治疗性细胞毒素的其他实例包括倍癌霉素(duocarmycin)、卡奇霉素(calicheamicin)、美登素和澳瑞他汀(auristatins)以及它们的衍生物。卡奇霉素抗体缀合物的一个实例可商购获得(MylotargTM Wyeth)。
可使用本领域中可用的接头技术来使细胞毒素缀合至根据本发明至少一些实施方案的抗体。已用于使细胞毒素缀合至抗体的接头类型的实例包括但不限于腙、硫醚、酯、二硫醚和含肽接头。可选择例如易经受由于溶酶体区室内的低pH达成的裂解或易经受蛋白酶裂解的接头，所述蛋白酶为诸如优先在肿瘤组织中表达的蛋白酶诸如组织蛋白酶(cathepsin)(例如组织蛋白酶B、C、D)。对于各种类型的细胞毒素、接头和用于使治疗剂缀合至抗体的方法的进一步论述，还可参见Saito,G.等(2003)Adv.Drug Deliv.Rev.55:199-215；Trail,P.A.等(2003)Cancer Immunol.Immunother.52:328-337；Payne,G.(2003)Cancer Cell 3:207-212；Allen,T.M.(2002)Nat.Rev.Cancer 2:750-763；Pastan,I.和Kreitman,R.J.(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs 3:1089-1091；Senter,P.D.和Springer,C.J.(2001)Adv.Drug Deliv.Rev.53:247-264。
也可使本发明的抗体缀合至放射性同位素以产生细胞毒性放射性药物，也称为放射免疫缀合物。可缀合至抗体以进行诊断或治疗使用的放射性同位素的实例包括但不限于碘131、铟111、钇90和镥177。本领域中确立了用于制备放射免疫缀合物的方法。放射免疫缀合物可商购获得，包括(BiogenlDEC)和(Corixa Pharmaceuticals)，并且类似方法可用于使用根据本发明至少一些实施方案的抗体来制备放射免疫缀合物。
根据本发明至少一些实施方案的激动性抗人VISTA抗体和缀合物可用于修饰给定的生物应答，并且药物部分不应理解为限于经典的化学治疗剂。例如，药物部分可为具有所需生物活性的蛋白质或多肽。这类蛋白质可包括例如酶活性毒素或其活性片段，诸如相思豆毒素(abrin)、篦麻毒素A(ricin A)、假单胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白质诸如肿瘤坏死因子或干扰素-γ；或生物应答调节剂诸如像淋巴因子、白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其他生长因子。
用于使所述治疗性部分(moiety)缀合至抗体的技术是熟知的，参见例如Arnon等，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”，载于Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy,Reisfeld等(编辑)，第243-56页(AlanR.Liss,Inc.1985)；Hellstrom等，“Antibodies For Drug Delivery”，载于ControlledDrug Delivery(第2版)，Robinson等(编辑)，第623-53页(MarcelDekker,Inc.1987)；Thorpe,“Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review”，载于Monoclonal Antibodies‘84:Biological And Clinical Applications,Pinchera等(编辑)，第475-506页(1985)；”Analysis,Results,And FutureProspective Of TheTherapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In CancerTherapy”，载于MonoclonalAntibodies For Cancer Detection And Therapy,Baldwin等(编辑)，第303-16页(Academic Press 1985)，以及Thorpe等，”The Preparation And Cytotoxic PropertiesOf Antibody-Toxin Conjugates”,Immunol.Rev.,62:119-58(1982)。
双特异性分子
根据至少一些实施方案，本发明也涵盖多特异性抗VISTA激动性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在另一方面，本发明的特征在于双特异性分子，其包含根据本发明至少一些实施方案的抗VISTA抗体或其片段。根据本发明至少一些实施方案的抗体或其抗原结合部分可被衍生或连接至另一功能性分子例如另一肽或蛋白质(例如另一抗体或针对受体的配体)以产生结合至少两个不同结合位点或靶标分子的双特异性分子。根据本发明至少一些实施方案的抗体实际上可被衍生或连接至不止一个其他功能性分子以产生结合不止两个不同结合位点和/或靶标分子的多特异性分子；这类多特异性分子也旨在由本文所用的术语“双特异性分子”涵盖。为产生根据本发明至少一些实施方案的双特异性分子，可将抗体功能连接(例如通过化学偶联、遗传融合、非共价缔合或以其他方式)至一个或多个其他结合分子，诸如另一抗体、抗体片段、肽或结合模拟物，以使得产生双特异性分子。在某些实施方案中，双特异性抗体的其中一种结合特异性是针对VISTA,并且另一结合特异性是针对任何其他抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可结合VISTA的两个不同表位。双特异性抗体也可用于使细胞毒性剂定位于表达VISTA的细胞。双特异性抗体可被制备成全长抗体或抗体片段。
根据本发明至少一些实施方案的双特异性抗体是可同时结合至两个具有不同结构的靶标的抗体。根据本发明至少一些实施方案的双特异性抗体(bsAb)和双特异性抗体片段(bsFab)具有至少一个特异性结合至B细胞抗原或表位的臂和至少一个特异性结合可靶向缀合物的其他臂。
根据至少一些实施方案，本发明也涵盖一种融合抗体蛋白质，其是重组产生的抗原结合分子，其中连接了具有相同或不同特异性的两个或更多个不同单链抗体或抗体片段区段。可使用分子工程改造来产生多种双特异性融合抗体蛋白质。在一种形式中，双特异性融合抗体蛋白质是单价的，由例如具有针对一种抗原的单一结合位点的sent和具有针对第二抗原的单一结合位点的Fab片段组成。在另一形式中，双特异性融合抗体蛋白质是二价的，由例如具有两个针对一种抗原的结合位点的IgG和具有两个针对第二抗原的结合位点的两个scFv组成。
本发明还涵盖具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程抗体，包括“章鱼抗体”(参见例如US 2006/0025576A1)和“双重作用性FAb”或“DAF”抗体，其包含结合VISTA以及另一不同抗原的抗原结合位点(参见例如US 2008/0069820。因此，本发明包括双特异性分子，其包含至少一个针对VISTA的第一结合特异性和针对第二靶标表位的第二结合特异性。根据本发明的至少一些实施方案，第二靶标表位是Fc受体例如人FcγRI(CD64)或人FcαR受体(CD89)。因此，本发明包括能够分别结合至FcγR、FcαR或FcsR表达性效应细胞(例如单核细胞、巨噬细胞或多形核细胞(PMN))和表达VISTA的靶标细胞两者的双特异性分子。这些双特异性分子使VISTA表达性细胞靶向效应细胞，并且触发Fc受体介导的效应细胞活性，诸如吞噬VISTA表达性细胞、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、细胞因子释放或产生超氧化物阴离子。
根据本发明的其中双特异性分子是多特异性的至少一些实施方案，除抗Fc结合特异性之外，分子还可包括第三结合特异性。在一个实施方案中，第三结合特异性是抗增强因子(EF)部分，例如结合至细胞毒性活性中涉及的表面蛋白质并由此增加针对靶标细胞的免疫应答的分子。
“抗增强因子部分”可为结合至给定分子例如抗原或受体并由此导致结合决定簇对Fc受体或靶标细胞抗原的作用增强的抗体、功能性抗体片段或配体。“抗增强因子部分”可结合Fc受体或靶标细胞抗原。作为另一种选择，抗增强因子部分可结合至与第一和第二结合特异性所结合的实体不同的实体。例如，抗增强因子部分可结合细胞毒性T细胞(例如经由CD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD40、ICAM-1或导致针对靶标细胞的免疫应答增加的其他免疫细胞)。
根据本发明的至少一些实施方案，双特异性分子包含至少一个抗体或其抗体片段(包括例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或单链Fv)作为结合特异性。抗体也可为轻链或重链二聚体或其任何最小片段诸如Fv或单链构建体，如Ladner等的美国专利No.4,946,778中所述，所述专利的内容以引用的方式明确并入本文。
在一个实施方案中，针对Fcγ受体的结合特异性由单克隆抗体提供，所述单克隆抗体的结合不被人免疫球蛋白G(IgG)阻断。如本文所用，术语“IgG受体”是指位于染色体1上的八个γ链基因中的任一者。这些基因编码总计12个跨膜或可溶性受体亚型，其被分组成3个Fcγ受体类别：FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。在一个优选的实施方案中，Fcγ受体是人高亲和力FcγRI。人FcγRI是一72kDa的分子，其显示出对单体IgG的高亲和力。某些优选的抗Fcγ单克隆抗体的产生和表征由Fanger等在PCT公布WO 88/00052中以及在美国专利No.4,954,617中描述，所述专利的教导内容以引用的方式完全并入本文。这些抗体结合至FcγRI、FcγRII或FcγRIII的在与受体的Fey结合位点不同的位点处的表位，并且因此，它们的结合基本上不被生理水平的IgG阻断。已知的抗FcγRI抗体包括mAb 22、mAb 32、mAb 44、mAb 62和mAb 197。产生mAb 32的杂交瘤可从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)获得(ATCC登记号为HB9469)。在其他实施方案中，抗Fcγ受体抗体是人源化形式的单克隆抗体22(H22)。H22抗体的产生和表征描述于Graziano，R.F.等(1995)J.Immunol.155(10):4996-5002以及PCT公布WO 94/10332中。产生H22抗体的细胞系以标号HA022CLI寄存在美国典型培养物保藏中心，登记号为CRL 11177。
在其他优选实施方案中，针对Fc受体的结合特异性由结合至人IgA受体例如Fc-α受体(FcαRI(CD89))的抗体提供，所述抗体的结合优选不被人免疫球蛋白A(IgA)阻断。术语“IgA受体”旨在包括位于染色体19上的一个a-基因(FcαRI)的基因产物。已知这个基因编码55至10kDa的若干选择性剪接跨膜亚型。FcαRI(CD89)在单核细胞/巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞上，而非在非效应细胞群体上组成型表达。FcαRI对IgA1与IgA2两者均具有中等亲和力(大约5×10-7M-1)，所述亲和力在暴露于细胞因子诸如G-CSF或GM-CSF后得以增加(Morton,H.C.等(1996)Critical Reviews in Immunology16:423-440)。已描述四种标识为A3、A59、A62和A77的FcαRI特异性单克隆抗体，其在IgA配体结合结构域的外部结合FcaRI(Monteiro,R.C.等(1992)J.Immunol.148:1764)。
尽管人单克隆抗体是优选的，但可用于根据本发明至少一些实施方案的双特异性分子中的其他抗体是鼠类、嵌合和人源化单克隆抗体。本发明的双特异性分子可通过使用本领域中已知的方法使组成结合特异性例如抗FcR和抗VISTA结合特异性缀合来制备。例如，可单独产生各双特异性分子的结合特异性，接着彼此缀合。当结合特异性是蛋白质或肽时，多种偶联剂或交联剂可用于共价缀合。交联剂的实例包括蛋白A、碳二亚胺、S-乙酰基-硫代乙酸N-琥珀酰亚胺酯(SATA)、5,5’-二硫基双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻苯撑二马来酰亚胺(oPDM)、3-(2-吡啶基-二硫基)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDP)和4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-SMCC)(参见例如Karpovsky等(1984)J.Exp.Med.160:1686；Liu,M A等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:8648)。其他方法包括Paulus(1985)Behring Ins.Mitt.No.78,118-132；Brennan等(1985)Science229:81-83)，以及Glennie等(1987)J.Immunol.139:2367-2375)中所述的那些。优选的缀合剂是SATA和磺基-SMCC，两者均可从伊利诺伊州罗克福德市的Pierce Chemical公司(PierceChemical Co.,Rockford,Il.)获得。当结合部分是抗体时，它们可经由两条重链的C末端铰链区的巯基键合来缀合。在一特别优选的实施方案中，在缀合之前，对铰链区进行修饰以含有奇数个巯基残基，优选一个。
作为另一种选择，两个结合特异性均可在同一载体中编码，以及在相同宿主细胞中表达和装配。若双特异性分子是mAbXmAb、mAbXFab、FabXF(ab’)2或配体XFab融合蛋白时，这个方法特别适用。根据本发明至少一些实施方案的双特异性分子可为包含一个单链抗体和结合决定簇的单链分子，或包含两个结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性分子可包含至少两个单链分子。用于制备双特异性分子的方法例如描述于美国专利No.5,260,203、美国专利No.5,455,030、美国专利No.4,881,175、美国专利No.5,132,405、美国专利No.5,091,513、美国专利No.5,476,786、美国专利No.5,013,653、美国专利No.5,258,498和国专利No.5,482,858中。
用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于重组共表达具有不同特异性的两对免疫球蛋白重链-轻链(参见Milstein和Cuello,Nature 305:537(1983))、WO93/08829，以及Traunecker等，EMBOJ.10:3655(1991))和“突起-入-孔洞(knob-in-hole)”工程改造(参见例如美国专利No.5,731,168)。多特异性抗体也可通过以下方式来制备：工程改造静电牵引效应以制备抗体Fc异二聚分子(WO 2009/089004A1)；控制Fab臂交换(参见Labrijn等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 110(13):5145-50(2013))；交联两个或更多个抗体或片段(参见例如美国专利No.4,676,980以及Brennan等，Science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链来产生双特异性抗体(参见例如Kostelny等，J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992))；使用“双体”技术来制备双特异性抗体片段(参见例如Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993))；以及使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如Gruber等，J.Immunol.,152:5368(1994))；以及如例如Tutt等J.Immunol.147:60(1991)中所述制备三特异性抗体。
可通过例如酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)、FACS分析、生物测定法(例如生长抑制)或蛋白质印迹测定法来确认双特异性分子与它们的特定靶标的结合。这些测定法各自通常通过采用对所关注的复合物具有特异性的经标记试剂(例如抗体)来检测特别关注的蛋白质-抗体复合物的存在性。例如，可使用例如识别并特异性结合至抗体-FcR复合物的酶联抗体或抗体片段来检测FcR-抗体复合物。作为另一种选择，可使用多种其他免疫测定法中的任一种来检测复合物。例如，可放射性标记抗体，并且用于放射免疫测定法(RIA)中(参见例如Weintraub,B.,Principles of Radioimmunoassays,SeventhTraining Course on Radioligand Assay Techniques,The Endocrine Society，1986年3月，将其以引用的方式并入本文)。可通过诸如使用γ计数器或闪烁计数器之类的手段或通过放射自显影来检测放射性同位素。
激动性抗VISTA抗体及含有其的药物组合物用于治疗自体免疫性疾病的用途
根据至少一些实施方案，如本文所述的充当VISTA刺激性治疗剂的抗VISTA抗体、其片段、缀合物或含有它们的药物组合物可任选用于治疗免疫系统相关疾病。
任选地，免疫系统相关病症包括免疫相关病症、如本文所述的自体免疫性疾病、移植排斥和移植物抗宿主病，和/或用于阻断或促进由VISTA介导的免疫刺激，如本文所述的免疫相关疾病，和/或用于免疫疗法(促进或抑制免疫刺激)。
任选地，免疫病症选自自体免疫性疾病、移植排斥或移植物抗宿主病。任选地，将治疗与用于治疗免疫相关病症的另一部分组合。
因此，使用根据本发明至少一些实施方案的药剂治疗多发性硬化症可与例如任选如本文所述的用于治疗多发性硬化症的任何已知治疗剂或方法组合。
因此，使用本主题激动性抗体治疗类风湿性关节炎或其他关节炎病症可与例如任选如本文所述的用于治疗类风湿性关节炎的任何已知治疗剂或方法组合。
因此，使用本主题激动性抗体治疗IBD可与例如任选如本文所述的用于治疗IBD的任何已知治疗剂或方法组合。
因此，使用本主题激动性抗体治疗牛皮癣可与例如任选如本文所述的用于治疗牛皮癣的任何已知治疗剂或方法组合。
因此，使用本主题激动性抗体治疗1型糖尿病可与例如任选如本文所述的用于治疗1型糖尿病的任何已知治疗剂或方法组合。
因此，使用本主题激动性抗体治疗葡萄膜炎可与例如任选如本文所述的用于治疗葡萄膜炎的任何已知治疗剂或方法组合。
因此，使用本主题激动性抗体治疗休格连氏综合征(s syndrome)可与例如任选如本文所述的用于治疗休格连氏综合征的任何已知治疗剂或方法组合。
因此，使用本主题激动性抗体治疗全身性红斑狼疮可与例如任选如本文所述的用于治疗全身性红斑狼疮的任何已知治疗剂或方法组合。
因此，使用本主题激动性抗体治疗GVHD可与例如任选如本文所述的用于治疗GVHD的任何已知治疗剂或方法组合。
因此，使用本主题激动性抗体治疗慢性或急性感染和/或与其相关的肝毒性，例如肝炎，可与例如任选如本文所述的治疗慢性或急性感染和/或与其相关的肝毒性的任何已知治疗剂或方法组合。
在上述疗法中，优选地，患有其中一种以上提及的或其他自体免疫性病症或炎症性病症的受试者将被施用根据本发明的本文公开的免疫抑制性抗VISTA抗体或抗原结合片段，所述抗体模拟或激发至少一种VISTA介导的对免疫的作用，例如其抑制疾病病理学中涉及的细胞毒性T细胞或NK活性和/或促炎细胞因子产生，由此预防或改善疾病症状，并且潜在导致疾病缓解延长，例如由于诱导了可引发T细胞耐受性或延长的免疫抑制的Treg。
根据本发明的至少一些实施方案，如本文所述的治疗剂和/或含有其的药物组合物可作为唯一活性成分施用或在免疫调节方案中连同其他药物或例如用于治疗或预防同种异体移植物或异种移植物急性或慢性排斥或炎性障碍或自体免疫性障碍或用以诱导耐受性的其他抗炎剂一起施用。
激动性抗VISTA抗体及含有其的药物组合物用于治疗败血症的用途
根据至少一些实施方案，如本文所述的VISTA抗体、其片段、缀合物和/或药物组合物可用于治疗败血症。败血症是潜在危及生命的感染并发症。败血症代表复杂的临床综合征，其在针对感染的初始宿主应答变得不适当地放大和调节异常，从而变得对宿主有害时显现。败血症的初始高炎症期(‘细胞因子风暴’)之后是免疫抑制状态(Hotchkiss等2013Lancet Infect.Dis.13:260-268)。该后一种免疫性受损(也被称为‘免疫麻痹’)期显现为不能清除原发性感染，诸如HSV和巨细胞病毒之类的病毒的再活化，以及显现新的继发性感染，常伴有对具有免疫能力的患者不特别具有毒力的生物体。绝大多数的败血症患者当今仅存活于他们的初始高炎性伤害，直至在重病监护室中历经随后数日至数周以败血症诱发的多器官功能异常而告终。败血症诱导的免疫抑制日益被认定为这些易受影响的患者中的首要免疫功能异常。在原发性感染之后病原体清除受损和/或对继发性感染的易感性促成与败血症相关的高致病率和致死率。
根据本发明的至少一些实施方案，提供如本文所述的治疗剂和/或含有其的药物组合物与有效用于治疗败血症的已知治疗剂的组合的用途。
根据本发明的至少一些实施方案，提供如本文所述的治疗剂和/或含有其的药物组合物可与以下进行组合所达成的组合的用途：针对败血症的护理标准治疗或新型治疗、阻断败血症的初始高炎症期的细胞因子风暴的疗法、和/或具有免疫刺激作用以克服败血症诱导的免疫抑制期的疗法。
与如由“国际重度败血症和败血性休克管理指导方针(InternationalGuidelines for Management of Severe Sepsis and Septic Shock)”(Dellinger等2013Intensive Care Med 39:165-228)推荐的针对败血症的护理标准治疗进行组合，以下描述所述护理标准治疗中的一些。
1.具有针对所有可能病原体的活性的广谱抗生素(当败血症被诊断，但未鉴定特定病原体时开始细菌和/或真菌治疗)-实例：头孢噻肟替卡西林(Ticarcillin)和克拉维酸盐哌拉西林(Piperacillin)和他唑巴坦(tazobactam)亚胺培南(Imipenem)和西司他丁(cilastatin)美罗培南(Meropenem)克林霉素(Clindamycin)(氯洁霉素(Cleocin))、甲硝哒唑(Metronidazole)头孢曲松(Ceftriaxone)环丙沙星头孢吡肟左氧氟沙星万古霉素或所列药物的任何组合。
2.血管加压剂：实例：去甲肾上腺素、多巴胺、肾上腺素、血管加压素
3.类固醇：实例：氢化可的松、地塞米松或氟氢可的松，静脉内或另外的变力性疗法：实例：用于具有心肌功能异常的败血症患者的多巴酚丁胺(Dobutamine)
4.重组人经活化蛋白C(rhAPC)，诸如阿法多曲考津(drotrecogin alfa)(活化)(DrotAA)
5.β-阻断剂另外可减轻局部和全身性炎症。
6.代谢干预诸如丙酮酸盐、琥珀酸盐或高剂量胰岛素替代。
抗VISTA抗体和含有其的药物组合物用于降低在基因或细胞疗法或移植之后不合需要的免疫活化的用途
如本文所用，术语“基因疗法”涵盖任何类型的基因疗法、载体介导的基因疗法、基因转移、病毒介导的基因转移，并且还涵盖某些细胞疗法，例如CAR T和CAR NK细胞疗法。根据本发明的至少一些实施方案，如本文所述的靶向VISTA，并且对免疫应答具有抑制活性的激动性VISTA抗体、其片段、缀合物和/或药物组合物可作为治疗剂用于降低在用于治疗各种遗传疾病的基因疗法之后不合需要的免疫活化。不希望受限于单一假设，这类抗体对免疫应答具有VISTA样抑制活性，和/或可增强VISTA免疫抑制活性，任选通过抑制病原性T细胞和/或NK细胞。
用于治疗遗传疾病的许多基因疗法产品当前处于临床试验中。新近的研究用文件记载了使用基因疗法载体对若干遗传疾病的治疗成功。基因疗法策略表征为3个关键要素，即待转移的基因、将向其中引入基因的靶标组织、和用于促进基因进入靶标组织中的载体(基因递送载体)。绝大多数的基因疗法临床试验已利用病毒载体作为极高效的递送载体，包括逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、假型病毒和单纯疱疹病毒。然而，在人免疫系统与基因疗法载体的所有组分之间的相互作用似乎代表着对持久治疗功效的其中一个主要限制。人研究已显示宿主对病毒载体的免疫应答的可能性较高。导致形成中和抗体和/或由细胞毒性细胞破坏转导细胞的对病毒或转基因产物自身的这种免疫应答可极大干扰治疗功效(Seregin和Amalfitano 2010Viruses 2:2013；Mingozzi和High 2013 Blood122:23；Masat等2013Discov Med.15:379)。因此，开发用以规避免疫应答以及促进转基因治疗性蛋白质长期表达的策略是基因疗法在临床中取得成功的一个主要挑战。
影响针对由病毒载体编码的转基因蛋白质的免疫应答的因素包括施用途径、载体剂量、转基因蛋白质的免疫原性、宿主的炎性状况和衣壳血清型。这些因素被认为通过触发先天免疫、细胞因子产生、APC成熟、抗原递呈以及最终使天然T淋巴细胞致敏成为功能性效应子来影响免疫原性(Mingozzi和High 2013Blood 122:23)。因此，用以通过干扰这些真正机理来减弱免疫活化的理念已在逻辑上出现，其中目的在于诱导短期免疫抑制，避免在载体施用之后的早期免疫致敏，以及促进长期耐受性。
作为一种用以抑制在基因疗法之后，特别是在多次注射之后不合需要的免疫活化的策略，在动物模型中测试在载体递送时通过靶向免疫应答的两种非冗余检查点来进行的免疫调节治疗。在小鼠或猴中进行的对在腺病毒载体滴注至肺中后载体介导的免疫应答的研究显示，用抗CD40L抗体短暂治疗可导致抑制腺病毒诱导的免疫应答；因此，动物可用腺病毒载体再次施用。用这个Ab短暂治疗导致对免疫功能的长期作用，并且使对腺病毒特异性体液应答的抑制充分延长超出Ab作用不再显著时所处的时间，从而指出阻断这个共刺激路径作为免疫调节方案来使得能够施用基因转移载体的治疗潜力(Scaria等1997GeneTher.4:611；Chirmule等2000J.Virol.74:3345)。其他研究显示大约在初级载体施用时共同施用CTLA4-Ig和抗CD40L Ab使对载体的免疫应答降低，延长长期腺病毒介导的基因表达，并且使得能够进行次级腺病毒介导的基因转移，即使在这些药剂的免疫抑制性作用不再存在之后也是如此，从而指示可有可能用短暂免疫抑制性疗法获得持续性以及次级腺病毒介导的基因转移(Kay等1997Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94:4686)。在另一研究中，类似施用CTLA4-Ig和抗CD40L Ab消除了形成针对载体的中和Ab，并且使得能够进行基因转移表达，条件是在各次基因转移注射期间施用治疗剂(Lorain等2008 Molecular Therapy16:541)。此外，即使以单次施用来向小鼠施用CTLA4-Ig也导致在早期时间点抑制免疫应答，并且延长转基因表达(Adriouch等2011 Front.Microbiol.2:199)。然而，单独CTLA4-Ig不足以永久消灭针对转基因产物的免疫应答。用CTLA4-Ig和PD-L1或PDL-2靶向两种免疫检查点的联合治疗导致在较迟时间点协同改善转基因耐受性，可能是通过靶向两种非冗余免疫调节机理，从而导致长期转基因持续性和表达(Adriouch等2011 Front.Microbiol.2:199)。
根据本发明的至少一些实施方案，本主题激动剂可单独或与其他活性剂一起用于克服对基因疗法的免疫应答的限制，可用于降低在基因疗法之后不合需要的免疫活化。当前方法包括排除具有针对递送载体的抗体的患者；施用高载体剂量；使用空衣壳来吸附抗载体抗体，从而允许后续的载体转导；重复血浆交换(血浆除去法)循环以吸附免疫球蛋白并降低抗载体抗体滴度。
试图克服这些限制的新型方法可分成两个大类：选择性修饰Ad载体自身和抢先免疫调节宿主(Seregin和Amalfitano 2010 Viruses 2:2013)。第一类包含若干创新策略，包括：(1)Ad衣壳展示特异性抑制剂或配体；(2)共价修饰整个Ad载体衣壳部分；(3)使用组织特异性启动子和局部施用途径；(4)使用基因组经修饰的Ad；和(5)开发嵌合或替代性血清型Ad。
第二类的方法包括使用免疫抑制性药物或特定化合物来阻断已知由病毒载体诱导的重要免疫路径。免疫抑制剂已在临床前研究中测试，并且显示出预防或根除对转移载体和转基因产物的免疫应答的功效。这些包括一般性免疫抑制剂，诸如环孢霉素A；环磷酰胺；FK506；糖皮质素或类固醇诸如地塞米松；TLR9阻断剂诸如TLR9拮抗剂寡核苷酸ODN-2088；TNF-a阻断剂和抗TNF-a抗体或TNFR-Ig抗体、Erk以及其他信号传导抑制剂诸如U0126。在临床环境中，施用糖皮质素已成功用于钝化在用表达人因子IX转基因的腺病毒相关病毒(AAV)载体向重度乙型血友病患者中进行肝基因转移后针对病毒衣壳的T细胞应答(Nathwani等2011 N.Engl.J.Med.365:2357)。
不同于利用往往会“整体”和非特异性免疫抑制宿主的药物的先前方法，已开发更具选择性的免疫抑制性方法。这些包括使用提供对诸如CD40与CD154、ICOS与ICOSL、CD28与CD80或CD86(包括CTLA4-Ig)、NKG2D与NKG2D配体、LFA-1与ICAM、LFA-3与CD2、4-1BB与4-1BBL、OX40与OX40L、GITR与GITRL之间的正性共刺激相互作用的阻断的药剂，以及刺激负性共刺激受体诸如CTLA-4、PD-1、BTLA、LAG-3、TIM-1、TEVI-3、KIR、以及B7-H4和B7-H3的受体的药剂。这些中的一些已用于临床前或临床移植研究中(Pilat等2011 Sem.Immunol.23:293)。
在上述基因或细胞疗法中或在治疗移植适应症时，优选地，得到或将接收细胞或基因疗法或移植组织或器官的受试者将被施用本发明的本文公开的免疫抑制性抗VISTA抗体或抗原结合片段，所述抗体可增强、激动或模拟至少一种VISTA介导的对免疫的作用，例如其对细胞毒性T细胞或NK活性的抑制作用和/或其对促炎细胞因子的产生的抑制作用，或其对Treg的刺激作用，由此预防或降低宿主针对用于疗法中的细胞或基因的免疫应答或针对移植细胞、器官或组织的非所需免疫应答。优选地，治疗将引发针对移植或输注的细胞、组织或器官的延长免疫耐受性。在一些情况下，例如在含有免疫细胞的移植细胞、组织或器官的情况下，可在输注或移植之前使本文公开的免疫抑制性抗VISTA抗体或抗原结合片段与细胞、组织或器官，和/或可能与移植受体的免疫细胞接触以使免疫细胞耐受，并且潜在预防非所需免疫应答或GVHD免疫反应。
药物组合物
在另一方面，本发明提供一种组合物，例如药物组合物，其含有根据本发明的抗人VISTA抗体中的一种或组合，以及任选另外的免疫抑制剂或其他活性剂。因此，本发明的特征在于一种药物组合物，其包含治疗有效量的根据本发明至少一些实施方案的抗人VISTA抗体。特别地，本发明的特征在于一种药物组合物，其包含治疗有效[免疫抑制]量的根据本发明的抗人VISTA抗体或抗体片段。
根据本发明至少一些实施方案的药物组合物可用于治疗免疫相关障碍、自体免疫、变态反应、GVHD、炎症或与感染性障碍相关的肝毒性和/或败血症。“治疗”是指治疗性治疗与预防性或预防性措施两者。需要治疗者包括已患有所述障碍者以及将预防所述障碍者。因此，本文中待治疗的哺乳动物可已被诊断为患有所述障碍，或可易感于所述障碍或易患所述障碍。出于治疗的目的，“哺乳动物”是指分类为哺乳动物的任何动物，包括人、家养动物和农场动物，以及动物园动物、运动动物或宠物，诸如狗、马、猫、母牛等。优选地，哺乳动物是人。
术语“治疗有效量”是指根据本发明的药剂的有效治疗哺乳动物的疾病或障碍的量。本发明的治疗剂可单独或作为药物组合物的一部分向受试者提供，在所述药物组合物中，它们与药学上可接受的载体混合。在许多情况下，根据本发明的激动性或拮抗性抗VISTA抗体将与其他免疫治疗剂或用于治疗特定病症的其他治疗剂组合使用。
如果组合物的施用可由受体患者所耐受，那么它被称为“药学上可接受的载体”。如本文所用，“药学上可接受的载体”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包覆剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等等。优选地，载体适于静脉内、肌肉内、皮下、胃肠外、经脊柱或经表皮施用(例如通过注射或输注)。
这类组合物包括无菌水、缓冲盐水(例如Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)、pH和离子强度调节剂以及任选地，各添加剂，诸如去垢剂和增溶剂(例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、焦亚硫酸钠)、防腐剂(例如硫柳汞、苯甲醇)和增积物质(例如乳糖、甘露糖醇)。非水性溶剂或媒介物也可如下所详述加以使用。
可用于根据本发明至少一些实施方案的药物组合物中的适合水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其适合混合物、植物油(诸如橄榄油)以及可注射有机酯诸如油酸乙酯。适当流动性可例如通过使用包覆物质(诸如卵磷脂)、在分散液的情况下通过维持所需粒度、以及通过使用表面活性剂加以维持。视施用途径而定，活性化合物，即特异性结合任一VISTA蛋白的单克隆或多克隆抗体和抗原结合片段以及含有其的缀合物和/或替代性骨架，或双特异性分子，可以物质包覆以保护化合物免遭酸和可使化合物失活的其他天然条件的作用。根据本发明至少一些实施方案的药物化合物可包括一种或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”是指保留母体化合物的所需生物活性，并且不赋予任何非所需毒理学作用的盐(参见例如Berge,S.M.等(1977)J.Pharm.Sci.66:1-19)。所述盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括衍生自无毒无机酸，诸如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等；以及由无毒有机酸，诸如脂族单羧酸和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳族酸、脂族磺酸和芳族磺酸等的那些。碱加成盐包括衍生自碱土金属，诸如钠、钾、镁、钙等；以及衍生自无毒有机胺，诸如Ν,Ν’-二苯甲基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等的那些。
根据本发明至少一些实施方案的药物组合物也可包括药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，诸如棕榈酸抗坏血酸酯、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、a-生育酚等；和(3)金属螯合剂，诸如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等等。
这些组合物也可含有佐剂，诸如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。防止存在微生物可通过以下两种方式来确保：上文灭菌程序以及包括各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等。也可合乎需要的是将等渗剂诸如糖、氯化钠等包括至组合物中。此外，延长可注射药物形式的吸收可通过包括延迟吸收的试剂诸如单硬脂酸铝和明胶来达成。
药学上可接受的载体包括无菌水性溶液或分散液以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。针对药物活性物质使用所述介质和试剂在本领域中是已知的。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，否则设想其用于根据本发明至少一些实施方案的药物组合物中。补充性活性化合物也可掺入组合物中。
治疗性组合物通常在制造和储存条件下必须无菌且稳定。可将组合物配制成溶液、微乳液、脂质体或适于高药物浓度的其他有序结构。载体可为溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)及其适合的混合物。适当流动性可例如通过使用包覆剂(诸如卵磷脂)，在分散液的情况下通过维持所需粒度，以及通过使用表面活性剂加以维持。在许多情况下，在组合物中包括等渗剂例如糖、多元醇(诸如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化钠将是优选的。延长可注射组合物的吸收可通过在组合物中包括延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸盐和明胶来达成。可通过将活性化合物以所需量根据需要与以上列举的一种成分或成分的组合一起掺入适当溶剂中，随后进行灭菌微滤来制备无菌可注射溶液。通常，通过将活性化合物掺入含有基基础分散介质和来自以上列举的成分的所需其他成分的无菌媒介物中来制备分散液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其产生活性成分加上来自其先前无菌过滤溶液的任何额外所需成分的粉剂。
可通过将活性化合物以所需量根据需要与以上列举的一种成分或成分的组合一起掺入适当溶剂中，随后进行灭菌微滤来制备无菌可注射溶液。通常，通过将活性化合物掺入含有基基础分散介质和来自以上列举的成分的所需其他成分的无菌媒介物中来制备分散液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其产生活性成分加上来自其先前无菌过滤溶液的任何额外所需成分的粉剂。
可使用多种本领域中已知的方法中的一种或多种，经由一种或多种施用途径来施用本发明组合物。如将为熟练技术人员所了解的，施用途径和/或模式将视所需结果而变化。用于根据本发明至少一些实施方案的治疗剂的优选施用途径包括血管内递送(例如注射或输注)、静脉内、肌肉内、真皮内、腹膜内、皮下、经脊柱、口服、经肠、经直肠、经肺(例如吸入)、经鼻、局部(包括经皮、经颊和舌下)、膀胱内、玻璃体内、腹膜内、经阴道、脑递送(例如脑室内、脑内和对流增强扩散)、CNS递送(例如鞘内、脊柱周和脊柱内)或胃肠外(包括皮下、肌肉内、静脉内和真皮内)、经粘膜(例如舌下施用)、施用或通过植入物来施用、或其他胃肠外施用途径例如通过注射或输注、或本领域中已知的其他递送途径和/或施用形式。如本文所用，短语“胃肠外施用”意指除经肠和局部施用以外的通常通过注射达成的施用模式，并且包括不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。在特定实施方案中，可腹膜内或静脉内施用根据本发明至少一些实施方案的蛋白质、治疗剂或药物组合物。
作为另一种选择，根据本发明的VISTA特异性抗体或可经由非胃肠外途径来施用，诸如局部、经表皮或经粘膜施用途径，例如鼻内、口服、经阴道、经直肠、舌下或局部。
可将活性化合物与将会保护化合物对抗快速释放的载体一起制备，诸如控制释放制剂，包括植入物、经皮贴片和微囊封递送系统。可使用可生物降解的生物相容性聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备这类制剂的许多方法受专利权保护或通常为本领域技术人员所知。参见例如Sustained andControlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson(编辑)，Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。
可用本领域中已知的医学装置施用治疗性组合物。例如，在一个优选的实施方案中，可用针皮下注射装置施用根据本发明至少一些实施方案的治疗性组合物，所述装置诸如美国专利No.5,399,163、No.5,383,851、No.5,312,335、No.5,064,413、No.4,941,880、No.4,790,824或No.4,596,556中公开的装置。可用于本发明中的众所周知的植入物和模块的实例包括：美国专利No.4,487,603，其公开了一种用于以受控速率分配药物的可植入微输注泵；美国专利No.4,486,194，其公开了一种用于穿过皮肤来施用药剂的治疗装置；美国专利No.4,447,233，其公开了一种用于以精确输注速率递送药物的药物输注泵；美国专利No.4,447,224，其公开了一种用于连续药物递送的变流速可植入输注装置；美国专利No.4,439,196，其公开了一种具有多室隔间的渗透药物递送系统；以及美国专利No.4,475,196，其公开了一种渗透药物递送系统。将这些专利以引用的方式并入本文。许多其他所述植入物、递送系统和模块为本领域技术人员所知。
在某些实施方案中，可配制抗VISTA抗体以确保适当的体内分布。例如，血脑屏障(BBB)可排除许多高度亲水性的化合物。为确保根据本发明至少一些实施方案的治疗性化合物跨越BBB(如果需要)，可将它们配置于例如脂质体中。对于制造脂质体的方法，参见例如美国专利No.4,522,811、No.5,374,548和No.5,399,331。脂质体可包含一种或多种被选择性转运至特定细胞或器官中、从而增强靶向药物递送的部分(参见例如V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29:685)。示例性的靶向部分包括叶酸或生物素(参见例如颁给Low等的美国专利No.5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等,(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153:1038)；抗体(P.G.Bloeman等(1995)FEBS Lett.357:140；M.Owais等(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39:180)；表面活性蛋白A受体(Briscoe等(1995)Am.J Physiol.1233:134)；pl20(Schreier等(1994)J.Biol.Chem.269:9090)；还可参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346:123；J.J.Killion；和I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4:273。
在另一个实施方案中，本发明的免疫缀合物可用于通过以下方式来使化合物(例如治疗剂、标记、细胞毒素、放射性毒素、免疫抑制剂等)靶向具有VISTA细胞表面受体的细胞：使所述化合物连接于本文公开的抗体。因此，本发明还提供用于离体或体内定位表达VISTA的细胞的方法(例如用可检测标记，诸如放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子)。作为另一种选择，免疫缀合物可用于通过使细胞毒素或放射性毒素靶向VISTA抗原来杀死具有VISTA细胞表面受体的细胞。
如本文所用，“药学上可接受的载体”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包覆剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等等。优选地，载体适于静脉内、肌肉内、皮下、胃肠外、经脊柱或经表皮施用(例如通过注射或输注)。视施用途径而定，活性化合物，即含有VISTA抗原的胞外结构域的可溶性多肽缀合物、抗体、免疫缀合物、替代性骨架和/或双特异性分子，可以物质包覆以保护化合物免遭酸和可使化合物失活的其他天然条件的作用。根据本发明至少一些实施方案的药物化合物可包括一种或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”是指保留母体化合物的所需生物活性，并且不赋予任何非所需毒理学作用的盐(参见例如Berge,S.M.等(1977)J.Pharm.Sci.66:1-19)。所述盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括衍生自无毒无机酸，诸如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等；以及衍生自无毒有机酸，诸如脂族单羧酸和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳族酸、脂族磺酸和芳族磺酸等的那些。碱加成盐包括衍生自碱土金属，诸如钠、钾、镁、钙等；以及衍生自无毒有机胺，诸如Ν,Ν’-二苯甲基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等的那些。
根据本发明至少一些实施方案的药物组合物还可包括药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，诸如棕榈酸抗坏血酸酯、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、a-生育酚等；和(3)金属螯合剂，诸如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等等。可用于根据本发明至少一些实施方案的药物组合物中的适合水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其适合的混合物、植物油(诸如橄榄油)以及可注射有机酯诸如油酸乙酯。适当流动性可例如通过使用包覆物质(诸如卵磷脂)、在分散液的情况下通过维持所需粒度、以及通过使用表面活性剂加以维持。
这些组合物也可含有佐剂，诸如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。防止存在微生物可通过以下两种方式来确保：上文灭菌程序以及包括各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等。也可合乎需要的是将等渗剂诸如糖、氯化钠等包括至组合物中。此外，延长可注射药物形式的吸收可通过包括延迟吸收的试剂诸如单硬脂酸铝和明胶来达成。
药学上可接受的载体包括无菌水性溶液或分散液以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。针对药物活性物质使用所述介质和试剂在本领域中是已知的。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，否则设想其用于根据本发明至少一些实施方案的药物组合物中。补充性活性化合物也可掺入组合物中。
治疗性组合物通常在制造和储存条件下必须无菌且稳定。可将组合物配制成溶液、微乳液、脂质体或适于高药物浓度的其他有序结构。载体可为溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)及其适合的混合物。适当流动性可例如通过使用包覆剂(诸如卵磷脂)，在分散液的情况下通过维持所需粒度，以及通过使用表面活性剂加以维持。在许多情况下，在组合物中包括等渗剂例如糖、多元醇(诸如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化钠将是优选的。延长可注射组合物的吸收可通过在组合物中包括延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸盐和明胶来达成。可通过将活性化合物以所需量根据需要与以上列举的一种成分或成分的组合一起掺入适当溶剂中，随后进行灭菌微滤来制备无菌可注射溶液。通常，通过将活性化合物掺入含有基础分散介质和来自以上列举的成分的所需其他成分的无菌媒介物中来制备分散液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其产生活性成分加上来自其先前无菌过滤溶液的任何额外所需成分的粉剂。
可通过将活性化合物以所需量根据需要与以上列举的一种成分或成分的组合一起掺入适当溶剂中，随后进行灭菌微滤来制备无菌可注射溶液。通常，通过将活性化合物掺入含有基基础分散介质和来自以上列举的成分的所需其他成分的无菌媒介物中来制备分散液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其产生活性成分加上来自其先前无菌过滤溶液的任何额外所需成分的粉剂。
可与载体物质组合以产生单一剂型的活性成分的量将视所治疗的受试者和特定施用模式而变化。可与载体物质组合以产生单一剂型的活性成分的量将通常是组合物的产生治疗作用的那个量。通常，总计100％，该量将在约0.01％至约99％的活性成分，优选约0.1％至约70％，最优选约1％至约30％的活性成分的范围内，所述活性成分与药学上可接受的载体组合。
调整剂量方案以提供最优所需应答(例如治疗应答)。例如，可施用单次团注，可随时间推移施用若干分次剂量，或可如由治疗情况的紧急性所指示，按比例降低或增加剂量。尤其有利的是以剂量单位形式配制胃肠外组合物以易于施用和达成剂量均一性。如本文所用的剂量单位形式是指适合作为用于待治疗受试者的单一剂量的物理离散单元；各单元含有经计算以产生所需治疗作用的预定量的活性化合物以及所需药物载体。根据本发明至少一些实施方案的剂量单位形式的规格由以下支配并且直接取决于以下：(a)活性化合物的独特特征和待实现的特定治疗作用，和(b)混配这种活性化合物以处理个体中的敏感性的领域中固有的限制。
对于施用本文所公开的VISTA抗体，剂量在每kg宿主体重约0.0001mg至100mg，并且更通常是0.01mg至5mg的范围内。例如，剂量可为0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重，或在1-10mg/kg的范围内。示例性的治疗方案需要每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、一个月一次、每3个月一次或每3至6个月一次进行施用。用于根据本发明至少一些实施方案的本文所公开的抗体的优选剂量方案包括经由静脉内施用1mg/kg体重或3mg/kg体重，其中使用其中一种以下给药时程给予本文所公开的抗体：(i)每4周施用一次，持续6次剂量，接着每3个月施用一次；(ii)每3周；(iii)每千克体重3mg，1次，继之以每3周，每千克体重1mg。
在一些方法中，同时施用两种或更多种具有不同结合特异性的单克隆抗体；在所述情况下，所施用的各本文所公开的抗体的剂量落在所指示的范围内。通常在多个时刻施用本文所公开的抗体。各单一剂量之间的间隔可为例如每日、每周、每月、每3个月或每年。如通过测量患者中针对靶标抗原的抗体的血液水平所指示的，间隔也可为不定期的。在一些方法中，调整剂量以实现约1-1000mug/ml的血浆抗体浓度，而在一些方法中，实现约25-300微克/ml。
作为另一种选择，治疗剂可以持续释放制剂形式施用，在所述情况下，需要的施用频率较小。剂量和频率视治疗剂在患者中的半衰期而变化。一般来讲，人抗体显示最长半衰期，随后是人源化抗体、嵌合抗体和非人抗体。融合蛋白的半衰期可广泛变化。施用剂量和频率可视治疗是预防性的还是治疗性的而变化。在预防性应用中，历经长的一段时间在相对不频繁间隔下施用相对低的剂量。一些患者在他们的剩余生命中持续接受治疗。在治疗性应用中，有时需要在相对短暂间隔下使用相对高剂量直至疾病的进展得以降低或终止，并且优选地，直至患者显示疾病的症状部分或完全改善。此后，可向患者施用预防性方案。
可改变本发明的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平以便获得活性成分的有效实现就特定患者、组合物和施用模式来说的所需治疗响应而对患者无毒的量。所选剂量水平将取决于多种药动学因素，包括所用本发明的特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性；施用途径；施用时间；所用特定化合物的排泄速率；治疗的持续时间；与所用特定组合物组合使用的其他药物、化合物和/或物质；所治疗患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康状况和先前病史；以及医学领域中熟知的类似因素。
使用体内动物模型进行功能筛选
1.在伴刀豆球蛋白A诱导的肝炎动物模型中测试根据本发明的VISTA激动性抗体
自体免疫性肝炎(AIH)是肝脏的一种慢性炎性疾病，其表征为丧失自身耐受性，从而导致针对肝脏的B细胞和T细胞应答。ConA模型代表了用于理解AIH发病机理的得到最佳表征的系统。ConA是一种凝集素，其与肝脏中富含的特定糖部分结合。ConA对这些糖残基的修饰可导致通过与肝巨噬细胞表达的经修饰MHC结构相互作用而快速激活CD4+T细胞。随着大多数经典T细胞细胞因子(IL-2、IL-3、IFNγ和TNFα)在4-6小时内达到峰值血浆水平，发生强烈但短暂的细胞因子产生。值得注意的是，ConA诱导的炎症可以通过耗竭CD4+T细胞来阻断。可将使用hV-KI小鼠的ConA模型用于证实根据本发明的激动性抗VISTA单克隆抗体的抑制活性。对小鼠进行称重并在注射15mpk的ConA前3小时用10mpk的抗VISTA抗体或适当的同种型对照处理。在这些小鼠中，腹膜内施用抗VISTA单克隆抗体，而经由尾静脉注射ConA。在ConA施用后6小时时间点，对小鼠实施安乐死并收集血液。然后通过针对32种细胞因子的多重测定法分析血浆级分的血浆细胞因子。每种抗体在独立实验中测试两次以确认活性。对于该32重测定法中的每种细胞因子，将进行单向ANOVA，使用Dunnett’s后检验将每种抗VISTA抗体与同种型对照进行比较。基于细胞因子抑制的功效(细胞因子被抑制多少)和变异性(每个实验内以及各实验之间抑制性的一致性如何)对所测抗VISTA单克隆抗体进行排序。还关注了抑制与T细胞活化相关的经典细胞因子的单克隆抗体。
数种根据本发明的抗人VISTA抗体已在ConA模型中进行了筛选并且在其中是有效的(免疫抑制性)，即它们抑制ConA诱导的细胞因子产生并促进存活，并且特别是抑制T细胞活化所涉及的细胞因子(包括IL-2)的表达。特别地，本发明人测试了INX800、INX801和INX903以及激动性抗鼠VISTA抗体，并且全部在ConA肝炎模型中有效(免疫抑制性)。因此，根据本发明的激动性抗人VISTA抗体应该可用于治疗/预防与某些慢性和急性感染性病症诸如肝炎相关的炎症和肝毒性。
2.在移植物抗宿主病动物模型中测试根据本发明的VISTA激动性抗体
GVHD是同种异体T细胞过继转移到受照射的宿主中所介导的全身性疾病。在GVHD的发病机制中有五个主要步骤是关键的：1)对宿主的损害，最常见的是以T细胞转移之前的辐射事件的形式；2)宿主APC和供体APC二者活化同种异体T细胞；3)T细胞在淋巴结和脾脏中的扩增；4)运送到外周位点诸如皮肤、肠、肝脏和肺；5)由T细胞还有募集的髓样细胞驱动的宿主受损。在某些模型，诸如F1→亲本品系中，当小鼠发展出抗核mAb和免疫复合物介导的肾小球肾炎时，发生慢性GVHD，其是狼疮的合适模型。值得注意的是，来自供体T细胞的VISTA的遗传缺失会导致比接受野生型T细胞的小鼠中所见的更具侵略性的GHVD形式。
该测定法可用于鉴定和评定激动性抗人VISTA候选物的激动作用。该测定法也可用于证实根据本发明的激动性抗体可用于治疗或预防GVHD。在该模型中，对BALB/c小鼠进行致死性照射并给予来自hV-KI小鼠的同种异体骨髓和脾T细胞以诱导GVHD；其中一组不接受T细胞作为阴性对照。将接受同种异体T细胞的小鼠分成对照Ig组和处理组。将在单个实验中使用最多四种独特的VISTA单克隆抗体，每组8只小鼠，并且将进行两次重复实验。在T细胞转移时以及转移后第2天和第4天施用10mpk或另一剂量的抗体。将跟踪每只小鼠的体重，并且将处死体重减轻超过其初始起始体重的20％的任何小鼠。产生每个实验的KaplanMeier曲线，用log-rank统计检验将每种抗VISTA抗体与对照进行比较。如果所有四种VISTA单克隆抗体完全防范GVHD，那么将在GVHD模型中进行剂量响应测定法，其中各组用10、3、1和0.3mpk的抗体处理。将计算每种抗体的LD50值。
在该动物模型中评价了许多根据本发明的激动性抗人VISTA抗体。所测的这些抗体在该模型中都是有效的(免疫抑制性)，即它们减轻了疾病的症状、减缓了疾病进展、减少了疾病相关的体重减轻并促进了存活。特别地，对INX800、INX801、INX901、INX902、INX903和INX904中的每一者进行了评价，并证明可在该动物模型中缓解或预防疾病症状。此外，使用A形式和B形式的INX901确定A或B形式在GVHD动物模型中同样有效。
3.在炎性肠病动物模型中测试根据本发明的VISTA激动性抗体
炎性肠病(IBD)、克罗恩病和溃疡性结肠炎是由宿主免疫应答、遗传易感性、环境因素和肠腔内容物之间不完全确定和复杂的相互作用引起的。最近的全基因组关联研究报道了免疫细胞调节基因与IBD易感性之间的关联。在这些研究中表现出先天性和适应性免疫细胞内在基因，从而表明这些细胞群在IBD发病机理中的核心作用。目前存在超过50种人IBD动物模型。虽然没有一种模型能够完美地模拟人IBD，但许多模型可用于研究人疾病的多个方面，包括疾病发作和进展以及伤口愈合应答。
在一个完善确立的IBD模型中，用同基因脾CD4+CD45RBhi T细胞过继转移到T细胞和B细胞缺陷的受体小鼠中来起始肠炎症。CD4+CD45RBhi T细胞群主要含有经致敏活化的幼稚T细胞，其能够诱导慢性小肠和结肠炎症。该方法允许研究人员修改关键的实验变量，包括先天性和适应性免疫细胞群，以回答与疾病发病机理有关的生物学相关问题。另外，该方法提供精确的疾病发作起始和充分表征的实验时间进程，从而允许动态研究小鼠疾病进展的临床特征。通过该方法诱导的肠炎与人IBD具有许多共同特征，包括慢性大肠和小肠穿壁性炎症(由细胞因子诸如TNF和IL-12驱动的发病机理)，以及诸如消瘦之类的全身症状。因此，其为研究人IBD发病机理的理想模型系统。
测试了根据本发明的激动性抗人VISTA抗体(INX901)并且显示在该IBD模型中是有效的。具体而言，该激动性抗体被证明可抑制细胞因子水平并有效预防或抑制(i)与结肠炎相关的体重减轻，(ii)与结肠炎进展相关的体重减轻，(iii)结肠缩短，(iv)炎性浸润物募集至结肠以及(v)结肠炎的发展。因此，根据本发明的激动性VISTA抗体可用于治疗IBD和相关的炎症和肠道病症。
4.在狼疮动物模型中测试根据本发明的VISTA激动性抗体
狼疮是一种自体免疫病症或炎性疾病，其症状包括肾脏炎症、蛋白尿增加和脾肿大。有4种类型的狼疮，其中全身性红斑狼疮或(“SLE”)是最常见的形式。这种疾病可能是轻微或严重的，可影响主要器官系统。狼疮是一种原因不明的自体免疫病症，可能会导致肾脏炎症(称为狼疮性肾炎)，该炎症可影响身体从血液中过滤废物的能力，或者如果严重的话可能会导致肾脏损害从而需要透析或肾移植。SLE也可能会导致肺部血压升高(称为肺动脉高压)，这可导致呼吸困难。另外SLE可能会导致神经系统和大脑的炎症，这可导致记忆问题、混乱、头痛和中风。另外SLE可能会导致大脑血管的炎症，这可导致高烧、癫痫和行为改变。SLE也可能导致动脉硬化或冠状动脉疾病-冠状动脉壁上沉积物的积聚-可导致心脏病发作。
测试了根据本发明的激动性抗人VISTA抗体(INX903、INX901、INX901-A和INX901-B)和抗鼠VISTA抗体并且显示在不同的狼疮模型包括MRL/lpr狼疮模型、NZBWF-1狼疮模型和B6D2F模型中是有效的。B6D2F模型是一种鼠模型，其中通过将人VISTA敲入DDE1CD8耗竭型脾细胞(供体)转移到B6D2F1宿主(受体)中来诱导SLE。在该模型中，供体CD4T细胞多克隆活化驱动同源宿主B细胞活化、扩增和它们产生导致肾病的自身抗体。转移了B6CD8耗竭型细胞的B6D2F1模型的狼疮样特征包括：(1)免疫复合物性肾小球肾炎；(2)抗核抗体；(3)抗dsDNA抗体；(4)抗RBC抗体(库姆斯测试(Coombs)阳性)。此外，该模型符合肾脏疾病严重性基于性别的差异。
在这3种不同的狼疮模型中，激动性抗人和鼠VISTA抗体被证明是有效的并且可以降低狼疮疾病发展的发病率、疾病进展，降低蛋白尿水平，抑制肾炎和肾脏损伤，减少T细胞活化和积累，减少B细胞活化和积累，以及抑制自身抗体的产生。具体而言，INX903、INX901、INX901-A和INX901-B显示可(i)减少T细胞增殖和活化，(ii)减少同源B细胞活化(MHCII表达)和积累，减少脾肿大，减少抗dsDNA IgG自身抗体生产以及减少I型干扰素信号(interferon signature)。这些免疫抑制作用也不受抗体的人IgG2恒定区是A形还是B形的影响。因此，根据本发明的激动性VISTA抗体可用于治疗狼疮和相关的炎症和自体免疫病症。
5.在牛皮癣动物模型中测试VISTA激动性抗体
咪喹莫特(IMQD)诱导的牛皮癣模型
使用咪喹莫特(IMQD)诱导的牛皮癣模型评价抗VISTA抗体治疗牛皮癣的能力。咪喹莫特(IMQD)是市售的含有TLR7/8激动剂的乳剂，其广泛用于皮肤病学病症如病毒感染和黑素瘤。多天施加IMQD至皮肤会导致角化细胞增殖所致的表皮增厚。另外，发生T细胞和髓样细胞的群体免疫浸润进真皮层中。IMQD的再次施用会产生类似于银屑病患者中观察到的皮肤病变。IL-17和IL-23被认为是针对IMQD的免疫应答所涉及的主要细胞因子。
测试了激动性抗鼠VISTA抗体并显示在该牛皮癣模型中是有效的。具体而言，该抗体减少了浸润经咪喹莫特处理的皮肤的CD3+T细胞的数目。基于所观察到的结果，VISTA激动性抗体可用于治疗或预防牛皮癣和其他T细胞介导的自体免疫性或炎性皮肤病症。
6.在关节炎动物模型中测试VISTA激动性抗体
可以在不同的动物模型中测试抗VISTA抗体治疗关节炎的免疫抑制作用。测试了激动性抗鼠和抗人VISTA抗体并显示在广泛接受的关节炎模型，即胶原诱导的关节炎或CIA模型中是有效的。在该关节炎模型中测试了INX800、INX901、INX902和INX903以及抗鼠抗VISTA抗体。通过随时间推移测量受影响关节中的炎症性肿胀来评估疾病发展。临床评分是通过每个肿胀足趾给予1分，每个肿胀的足垫给予5分，肿胀的腕或踝给予5分(CharlesRiver Labs评分系统)来实现，其中加在一起得到每只动物的最大得分60。
如下文所述，这些抗体中的每一者都降低了关节炎疾病，并且INX901和INX902显著降低了疾病分值。基于这些结果，抗人VISTA激动性抗体可用于治疗或预防类风湿性关节炎和其他炎症或自体免疫病症。
已经描述了本发明，提供以下实施例以进一步说明本发明及其固有的优点。
实施例
实施例1：利用测定法来筛选免疫抑制性抗小鼠VISTA抗体
本发明人开发了用于筛选推定的激动性抗小鼠VISTA抗体的多种测定法。如图1中所示，将体外和体内筛选测定法用于鉴定免疫抑制性抗VISTA单克隆抗体。在图1A的实验中，在指定单克隆抗体的存在下将纯化的T细胞涂铺于抗CD3之上72小时。通过H3掺入测量增殖。在图1B的实验中，在指定抗体的存在下通过ISQ脉冲的APC刺激纯化的DO11.10T细胞6天。通过使用CTV稀释染料测量增殖。在图1C中的实验中，通过将C57BL/6细胞转移到受照射的BALB/c受体中来诱导GVHD。转移后第0、2和4天给小鼠腹膜内注射200μg抗体并分析存活情况。在图1D的实验中，在施用ConA(15毫克/千克)之前3小时用10毫克/千克的指定抗体处理小鼠并通过Luminex在6下分析血浆中的IL-2。
更具体地，在第一个测定法中，分离CD4+T细胞并与Ab1、Ab2或Ab3一起温育，然后添加至抗CD3包被的平板中。培养3天后，用氚标记的胸苷对T细胞进行脉冲处理，氚标记的胸苷掺入进增殖细胞中。值得注意的是，Ab1和Ab2二者均诱导了T细胞增殖速率的显著降低，而Ab3没有作用(图1)。而在用抗原脉冲的APC刺激转基因T细胞的类似试验中，通过增殖染料稀释测量T细胞活化。与抗CD3测定法类似，Ab1抑制抗原特异性T细胞增殖约50％(图1B)。这些数据表明Ab3单克隆抗体可阻断mVISTA功能(即增强免疫应答)，而Ab1和Ab3可刺激mVISTA功能并下调关键免疫应答。
我们还测定了Ab3和Ab1是否可以使用体内动物模型，特别是在GVHD和ConA肝炎模型中进行区分。用对照抗体(仓鼠Ig)处理的患有GVHD的小鼠具有进行性疾病，并且正如预期的，需要在移植后第4周进行安乐死(图1C)。经Ab3处理的小鼠也易受GVHD影响，事实上大多数小鼠在对照处理组之前死亡，从而表明Ab3可能会加剧疾病。相反，所有经Ab1处理的小鼠均未显示出明显的GVHD症状，并且几乎所有小鼠都健康至少40天。具体而言，在这些实验中，用对照抗体(仓鼠Ig)处理的患有GVHD的小鼠具有进行性疾病，并且正如预期的，需要在移植后第4周实施安乐死(图1C)。经Ab3处理的小鼠也易受GVHD影响，事实上大多数小鼠在对照处理组之前死亡，从而表明Ab3可能会加剧疾病。相反，所有经Ab1处理的小鼠均未显示出明显的GVHD症状，并且几乎所有小鼠都健康至少40天。
在ConA模型中，发明人测试了每种VISTA抗体是否会影响对ConA的充分表征的T细胞细胞因子应答。值得注意的是，Ab1而非Ab3诱导了IL-2的血浆细胞因子水平降低(图1D)。具体而言，在ConA模型中，发明人还测试了每种VISTA抗体是否会影响对ConA的充分表征的T细胞细胞因子应答。值得注意的是，Ab1而非Ab3诱导了IL-2的血浆细胞因子水平降低(图1D)。
因此，这些结果证明抗VISTA单克隆抗体(Ab1和Ab2)二者都是免疫抑制性的，并且还显示这种免疫抑制性抗小鼠VISTA抗体可以与炎性免疫抑制性抗小鼠VISTA抗体(Ab3)区分开。如图1中所示，Ab1在包括以下的多种炎症模型中是有效的(免疫抑制性的)：GVHD、NZB/W F1狼疮样肾小球性肾炎、伴刀豆球蛋白A(ConA)诱导的肝炎、胶原抗体诱导的关节炎(CAIA)和咪喹莫特诱导的牛皮癣。在这些疾病中的每一者中，在疾病进展期间施用Ab1极大地减少了病理学和/或死亡率。所列出的每种模型就疾病进展而言对T细胞有独特的要求。GVHD和ConA二者均受Th1T细胞应答驱动。
实施例2：在不同自体免疫性疾病模型中抑制自体免疫的抗VISTA抗体的鉴定
在图2A-F中的实验中，在不同的疾病模型中再次比较了不同抗小鼠VISTA抗体的作用。在图2A中的实验中，从第25周开始直至实验结束用Ab1或仓鼠Ig(200μg)处理NZB/WF1小鼠3次/周。“X”表示对照处理组全部被处死的时间点。在图2B中的实验中，在施用15mg/kg(mpk)ConA前3小时用200μg抗体处理小鼠3小时并跟踪存活情况80小时。在图2C中的实验中，先用胶原II mAb、然后用LPS依次处理小鼠，通过测量足肿胀来测量关节炎。在这些实验中，每隔一天施用Ab1和仓鼠Ig(200μg)3次。在图2D中的实验中，每天将咪喹莫特施至小鼠的耳朵。在第14天，每隔一天施用Ab1或仓鼠Ig(200μg)，并用卡尺测量耳厚度。在相同的图2E-F中的实验中，每天将咪喹莫特施至小鼠的背部。在第9天，对小鼠实施安乐死，并将皮肤做成切片并染色以通过IHC针对CD3表达进行分析。
如图2A-F中所示，在这些实验模型中的每一者中，在具体疾病的进展期间施用Ab1极大地减少了病理学和/或死亡率。所列出的每种模型就疾病进展而言对T细胞有独特的要求。GVHD和ConA二者均受Th1T细胞应答驱动。
咪喹莫特诱导的牛皮癣是IL-17/23驱动的疾病，其中T细胞被募集到皮肤的真皮层中。Ab1急剧减少了CD3+细胞在真皮(图2E和F)的数目，但对脾T细胞群体没有影响(数据未示出)，从而表明该抗小鼠VISTA抗体优先在炎性病变处抑制免疫。
NZB/W F1狼疮是一种多因素疾病，由B细胞、T细胞和髓样细胞促成。在该模型中，Ab1的治疗性施用降低了蛋白尿水平，从而表明对肾脏的损害减少。最后，CAIA不涉及适应性免疫，而是由巨噬细胞和粒细胞驱动。在该模型中抗VISTA实现抑制表明该抗体也可能影响髓室。照此，抑制性VISTA单克隆抗体似乎介导对T细胞和先天免疫区室的作用。
因此，如图1和图2中所示，单克隆仓鼠抗小鼠VISTA抗体Ab1和AB2二者均诱导T细胞增殖速率显著降低，而Ab3无作用(图1)。在用抗原脉冲的APC刺激转基因T细胞的类似测定中，通过增殖染料稀释测量T细胞活化。与抗CD3测定法类似，Ab1抑制抗原特异性T细胞增殖约50％(图1B)。这些数据表明Ab1和Ab2可刺激VISTA功能，由此下调关键的免疫应答。
特别地，仓鼠抗小鼠VISTA抗体Ab1在包括以下的多种炎症模型中是有效的：GVHD、NZB/W F1狼疮样肾小球性肾炎、伴刀豆球蛋白A(ConA)诱导的肝炎、胶原抗体诱导的关节炎(CAIA)和咪喹莫特诱导的牛皮癣(图1和2)。在这些疾病中的每一者中，在疾病进展期间施用Ab1极大地减少了病理学和/或死亡率。所列出的每种模型就疾病进展而言对T细胞有独特的要求。GVHD和ConA二者均受Th1T细胞应答驱动。如上所述，咪喹莫特诱导的牛皮癣是IL-17/23驱动的疾病，其中T细胞被募集到皮肤的真皮层中。因此，在该特定自体免疫模型中Ab1实现抑制表明该抗体也可能影响髓室。因此，这些免疫抑制性抗小鼠VISTA单克隆抗体似乎介导对T细胞和先天免疫区室的作用。
实施例3：用于筛选激动性抗人VISTA抗体的人VISTA敲入小鼠的开发
前面的实施例涉及激动性抗小鼠VISTA抗体的分离和表征。迄今为止，文献中从未报道过激动性抗人VISTA抗体。尽管本受让人和其他组已鉴定出非常多的拮抗性抗人VISTA抗体。因此，在本发明之前，不确定是否会鉴定出激动性抗人VISTA抗体。
这样的抗体将是非常有益的，因为目前没有批准的利用NCR的天然功能来抑制免疫应答的人用治疗剂。尽管Orencia(CTLA4-Ig)是有效的，但它仅通过阻断CD28-B7相互作用和途径起作用，并且不通过刺激下调途径起作用。如下文实施例中所示的2种不同激动性抗VISTA单克隆抗体的有效免疫抑制作用所示，该途径的参与可能会证明是管理不同的人自体免疫疾病的革命。此外，抗VISTA对适应性和先天性自体免疫效应机制的免疫抑制影响使其与许多其他抗炎剂区别开来。
关于前述内容，假定筛选激动性抗人VISTA抗体的理想和必需试剂是人VISTA敲入小鼠。本受让人已产生了人VISTA敲入小鼠(“hV-KI小鼠”)。这些hV-KI小鼠表达人VISTA代替小鼠VISTA。具体而言，如图3中所示，从WT和VISTA KI小鼠的淋巴结中分离出CD4+T细胞、CD8+T细胞、Treg(CD4+FoxP3+)和单核细胞CD11b+,Ly6C+,Ly6G-，并分别用针对小鼠或人蛋白质的αVISTA抗体染色。hV-KI的表达模式与WT小鼠中所见的表达模式相同，因为CD4+和CD8+T细胞、调节性T细胞和单核细胞都在这两个品系之间表达一致量的表面蛋白(参见图3)。
另外，hV-KI小鼠不会发展出VISTA KO小鼠中观察到的任何炎性疾病的征象，从而表明hVISTA在小鼠免疫系统内是完全有功能的(数据未示出)。因此，该小鼠模型可在不同的测定法中用于筛选免疫抑制性单克隆抗体。
实施例4：推定的激动性抗人VISTA抗体的合成
图4中包含了不同的抗人VISTA抗体的序列。这些抗体特异性地结合至人VISTA，例如VSTB49-VSTB116，并具有VISTA拮抗剂特性，即当为IgG1形式时，例如当抗体包含IgG1 Fc区(其为野生型的，即未经修饰的)时，这些抗体抑制VISTA对免疫的抑制作用。
图4中所鉴定的抗体中的其中一种是1E8。该鼠抗人VISTA抗体包含下文所述的可变重链多肽和可变轻链多肽，并由本发明人转化为两种人嵌合形式。本文称为INX800的第一种嵌合抗体是通过将人IgG2重链和轻链恒定区多肽附接至1E8可变重链多肽和可变轻链多肽连接而获得的。在该第一种嵌合抗体中，IgG2恒定区内的氨基酸残基均未经修饰。
本文称为INX801的第二种嵌合抗体类似地通过将人IgG2重链和轻链恒定区多肽附接至1E8可变重链多肽和可变轻链多肽而获得。在该第二种嵌合抗体中，人IgG2 κ链内第127位的半胱氨酸残基被转化为丝氨酸。除此以外，IgG2恒定区内的氨基酸残基均未经修饰。
IE8 VH多肽
EVKLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFDFSRYWMSWVRQAPGKGLEWIGEVYPDSSTINYTPSLKDKFIISRDNAKNTLYLQMIKVRSEDTALYYCARGRGDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:57)
IE8VL多肽
DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLSWYHQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQNFWSTPFTFGSGTKLEIKR.(SEQ ID NO:58)
实施例5：在ConA动物模型中评价推定的激动性抗人VISTA抗体
在伴刀豆球蛋白A肝炎模型中比较嵌合IgG2抗体和对照抗体的作用。在该体内模型中，在施用伴刀豆球蛋白A之前3小时，将不同的动物预先给予10mg/kg的嵌合IgG2抗体(INX800或INX801)或对照抗体。抗体施用后3小时，然后给予小鼠12mg/kg的ConA。然后在ConA给药后6小时通过心脏穿刺将这些动物和对照进行放血。所有小鼠看起来都很好，没有明显的发病或死亡。
然后分析血液的细胞因子表达。具体而言，使用常规方法和通常用于细胞因子分析的细胞因子测试试剂盒，使用从所收集的血液样品获得的血浆运行32重测定法(32-plex)。如图5所示，与对照动物相比，施用INX800或INX801抗体的动物中数种促炎细胞因子的表达被显著抑制。具体而言，与对照相比，经INX800或INX801处理的动物中GM-CSF、IL-2、IL-4、IL-6、IL-17和TNF-α水平均显著较低。在INX800或INX801处理的动物中，这些细胞因子的[减少的]表达基本相同。
此外，与对照相比，INX800或INX801处理的动物中某些趋化因子(角化细胞衍生的趋化因子或“KC”)和巨噬细胞炎性蛋白2(MIP-2)的表达显著增加。同样，在INX800或INX801处理的动物中，这些蛋白质的[增加的]表达基本相同。基于这些结果，INX800和INX801似乎都是有效的VISTA激动剂，因为它们似乎引发的免疫抑制作用类似于VISTA引发的对各种炎性细胞因子表达的作用。
实施例6：在移植物抗宿主病(GVHD)动物模型中评价推定的激动性抗人VISTA抗体
还在移植物抗宿主病(GVHD)动物模型中，与未处理的动物或用无关抗体处理的对照相比，比较了相同的推定的激动性抗人VISTA抗体(INX800和INX801)的作用。在该动物模型中，将T细胞过继转移到经照射的宿主中，并测量体重作为疾病的读数。基于GVHD疾病进展，所有对照小鼠(8/8)必须实施安乐死。这些动物研究的结果在图6中示出。如图所示，由于用INX800或INX801抗体处理，所有INX800或INX801处理的小鼠都不[0/8]需要实施安乐死，因为GVHD显著被压制。基于这些结果，INX800和INX801二者似乎都是有效的VISTA激动剂，因为它们似乎有效抑制GVHD免疫应答。
实施例7：推定的激动性抗人VISTA抗体对CD3驱动的T细胞免疫应答的作用
还对相同的激动性抗人VISTA抗体(INX800和INX801)关于它们抑制CD3驱动的T细胞免疫应答的潜力的作用进行比较。在这些实验中，将板用OKT3(2.5μg/ml)包被。将T细胞与抗体预温育30分钟。然后将经抗体处理的T细胞添加至OKT3包被的平板中，并将T细胞在这些平板上培养72小时。作为抗体对CD3驱动的T细胞免疫应答的可能影响的读数，使用氚掺入法测定T细胞增殖，氚掺入法是一种广为接受的检测T细胞增殖的方法。如图7中所示，与对照T细胞培养物相比，用INX800或INX801抗体处理的培养T细胞中T细胞增殖显著降低。
实施例8：推定的激动性抗人VISTA抗体对特定T细胞群体和总T细胞数目的作用
还进行了实验以便比较相同的抗人VISTA抗体(INX800和INX801)对特定T细胞的数目以及T细胞的总数的可能作用。进行这些实验是为了评估所观察到的主题抗人VISTA抗体对细胞因子和T细胞的作用是否可归因于细胞耗竭(非特异性作用)而不是这些抗体基于它们促进特异性VISTA介导的对免疫的免疫抑制作用来引发免疫抑制作用。
两种激动性抗人VISTA抗体(INX800和INX801)均对特定T细胞群体的数目或T细胞总数没有显著作用。此外，INX800和INX801抗体的结果基本相同。示例性实验的结果在图8中示出。
基于此，观察到的INX800和INX801的激动作用似乎不归因于细胞耗竭。相反，这两种抗体看起来是基于它们促进特异性VISTA介导的对免疫的免疫抑制作用而引发对T细胞活化/增殖、GVHD免疫应答和促炎细胞因子表达的免疫抑制作用。
实施例9：不同激动性抗人VISTA抗体在不同免疫模型中的作用的总结
如下面表1和表2中所示，评估了具有图4中所示序列的不同抗人VISTA抗体的激动性或免疫抑制性作用。迄今已证明12种不同的嵌合抗人VISTA抗体具有免疫抑制性。迄今为止获得的一些结果汇总于表中。表位区组1(Bin 1)中的抗体都竞争结合至人VISTA，但不与表位区组2(Bin 2)中的抗体竞争VISTA结合。相反，表位区组2中的抗人VISTA抗体全部彼此竞争结合至人VISTA，但不与表位区组1中的抗体竞争。
表2中标为“不确定”的抗体引发不同的作用，包括在相同测定法中的免疫抑制作用或由于其他原因引发不明确的结果。如表1和表2中所示，已经分离出总共12种抗人VISTA抗体，其在MLR测定法或ConA测定法和/或其他体外和体内测定法或自体免疫疾病模型、炎性疾病模型或GVHD疾病模型中是免疫抑制性的，并且模拟或激发人VISTA的免疫抑制作用。基于这些结果，预期可通过类似方法获得其他抗人VISTA抗体，包括具有相同或不同VISTA表位特异性的那些。
此外，图9中的实验比较了不同抗人VISTA抗体在ConA测定法中的作用以及对选定促炎细胞因子和炎症标志物(即IL-2、γ干扰素和IL-12p70)的表达的作用。
表1(人或人源化抗人VISTA抗体)
表2(鼠抗人VISTA抗体)
抗体 表位区组 抑制性？ MLR中的增殖 Kd,M
1E8* 1 是 ++ 未测定
GG8 1 是 ++ 未测定
GA1 2 不确定 _ 未测定
*在两种不同的IgG2形式中显示为免疫抑制性。
实施例10：通过B细胞表位作图确定抗人VISTA抗体的表位
使用专有的方法[ProArray ultraTM]，采用定制的肽阵列(利用人VISTA片段)来确定一些推定的激动性抗人VISTA抗体的表位特异性。基本上，通过将抗体样品与ProArrayultraTM肽微阵列一起温育，然后与荧光标记的二抗温育，来进行肽-抗体结合的测定。在数个洗涤步骤之后，将ProArray ultraTM阵列干燥并使用高分辨率荧光微阵列扫描法进行扫描。
分别合成所有的肽(下面列出)，然后使用ProImmune的专有技术使之与ProArrayultraTM载玻片表面结合。这种优化的方法确保肽以这样的方式呈现在阵列上：即严格模拟相应蛋白质区域的性质，避免游离肽本身固有的生理化学变化，并产生相容的、组合的肽和蛋白质阵列平台。将测试分析物(肽和蛋白质)以离散点分配到ProArray ultraTM载玻片上，并且适当的gal文件使得所得的阵列特征能够精确对准回至沉积的分析物。
通过将抗体样品(由顾客提供)与ProArray ultraTM载玻片一起温育，然后与荧光标记的二抗一起温育来确定肽-抗体结合。在最后的温育和洗涤步骤后，将微阵列干燥并在高分辨率微阵列扫描系统中扫描。
在扫描荧光标记的ProArray ultraTM载玻片后，扫描仪记录图像，使用图像分析软件评估该图像-从而能够解读和量化与所扫描微阵列载玻片上的每个荧光点相关的荧光强度水平。肽微阵列是基于由人VISTA多肽序列合成的重叠肽文库。基于序列，使用ProImmune的ProArray ultraTM技术产生各15个氨基酸的微阵列肽(12个氨基酸重叠)。所合成的肽的详细信息列于表3(下文)中。“位置”是指在衍生所述肽的多肽序列中的起始和终止氨基酸。将合成的肽以24个相同的亚阵列固定在ProArray ultraTM载玻片上，每个亚阵列包含在一式六份的斑点中的测试肽和对照特征。肽在下表3中示出。
表3：ProArray ultraTM肽的详细信息
用特定抗人VISTA抗体进行的表位分析的结果汇总在图4中以及下面的实施例中。
实施例11：表位分组测定法
另外，具有图4中所示序列的一些抗人VISTA抗体的表位结合特性通过将这些抗体基于它们的结合特征置于不同的表位“区组”中来表征，如下文所述。
方法：将ProteOn XPR36系统(BioRad)用于进行表位分组。采用制造商关于胺偶联化学的说明书(BioRad，目录号176-2410)，用两组单克隆抗体(mAb)(每组6种)包被ProteOnGLC芯片(BioRad，目录号176-5011)。将竞争性mAb以过量(250nM终浓度)与人VISTA(25nM终浓度)一起在室温下预温育4小时，在该包被有包被mAb组的芯片上一次运行6个，缔合时间为4分钟，然后解离5分钟。每次运行之后，用100mM磷酸使芯片再生。
数据分析涉及通过配体对所有传感图进行分组并应用对准向导，其自动执行X轴和Y轴对准以及去除假象。然后对这些数据进性点间校正(Interspot correction)。
非竞争性mAb被定义为具有相同或>Al信号的结合信号(仅与人VISTA结合)。竞争性mAb定义为具有＜＜A1信号的结合信号(即仅与人VISTA结合)。例如，与VISTA复合的VSTB49和VSTB51不与包被在芯片上的VSTB85结合，因此被归类为与VSTB85竞争VISTA上的相同结合位点。用特定抗人VISTA抗体进行这种表位分组分析的结果汇总于图4中。
实施例12：使用氢/氘(H D)交换研究对抗VISTA抗体进行表位作图
抗VISTA抗体的抗体表位可通过多种方法诸如丙氨酸扫描和氢/氘(H D)交换以及如前面实施例中所述的重叠肽阵列来鉴定。用于鉴定推定的激动性抗人VISTA抗体的表位的另一示例性手段描述如下。
为了鉴定人VISTA上VSTB50、60、95和112的表位，使用相应的Fab进行溶液氢/氘交换-质谱(HDX-MS)。对于H/D交换，用于分析Fab扰动的程序类似于先前描述的程序(Hamuro等(2003)J.Biomol.Techniques 14:171-182,；Horn等(2006)Biochemistry 45:8488-8498)，进行了一些修改。使用Pierce Fab制备试剂盒(赛默飞世尔科技公司(ThermoScientific)，目录号为44985)，利用木瓜蛋白酶消化和蛋白A捕获从IgG制备Fab。人VISTA蛋白质序列含有六个N-连接的糖基化位点。为了改善序列覆盖率，用PNG酶F使该蛋白质去糖基化。将去糖基化的VISTA蛋白在氘代水溶液中温育预定时间，从而导致在可交换的氢原子上掺入氘。使该氘代VISTA蛋白与46氧化氘(D20)中的VSTB50、VSTB60、VSTB95或VSTB112的Fab在4℃下复合30秒、2分钟、10分钟和60分钟。通过低pH淬灭交换反应，并用胃蛋白酶消化该蛋白质。根据LC-MS上的质量偏移监测所鉴定肽处的氘水平。作为参考对照，类似地处理VISTA蛋白，不同之处在于不使其与Fab分子复合。与Fab结合的区域被推断为相对受到保护而免于交换的那些位点，从而含有比参考VISTA蛋白更高比例的氘。该蛋白质的约94％可以作图定位到特定的肽。
绘制了VISTA与VSTB50/VSTB60和VSTB95/VSTB112的HDX-MS扰动图，并鉴定了两个表位组。抗VISTA VSTB50识别与VSTB60相同的表位；VSTB95与VSTB112在VISTA上的另一个表位区域结合。抗VISTA VSTB50和60共享相同的表位，该表位包含以下区段：103NLTLLDSGL111(SEQ ID NO:59)和136VQTGKDAPSNC146(SEQ ID NO:60)；抗VISTA VSTB95和VSTB112似乎靶向相似的表位，所述表位包含以下片段：27PVDKGHDVTF36(SEQ ID NO:61)和54RRPIRDLTFQDL65(SEQ ID NO:62)。这些HDX-MS结果提供了具有图4中鉴定的序列的示例性抗VISTA抗体的肽水平表位。这两个表位组没有重叠的表位区域。这些结果与之前的竞争表位分组数据一致，因为它们不相互竞争。再次，如本文所述分析的各种抗人VISTA抗体的表位分析结果汇总于图4中。
实施例13：在不同的体外和体内模型中评价人IgG2骨架对α-人VISTA抗体INX901激动剂/免疫抑制活性的作用
天然人IgG2骨架上的抗体作为由重链铰链、CH1和轻链中存在的半胱氨酸之间的二硫键改组引起的亚型的混合物存在(Zhang,A.,(2015),“Conformational differencein human IgG2 disulfide isoforms revealed by hydrogen/deuterium exchange massspectrometry”,Biochemistry,54(10),1956-1962；图10)。基于Dillon等所开发的方法(“Optimization of a reversed-phase high-performance liquid chromatography/mass spectrometry method for characterizing recombinant antibodyheterogeneity and stability”,J Chromatography A,1120(1),112-120)，通过RP-HPLC(图10)评估了这些亚型。相对于Dillon(同上)中的方法该优化方法使用梯度更缓且含量更高的有机流动相B。如下制备从INX901富集的单独的A型和B型：严格根据Dillon(同上)中所报道的条件，但结合以下步骤：缓冲液交换回DPBS并在富集反应后采用内毒素去除程序(图11)。
在准备这些实验的过程中，观察到A富集形式的逆转比预期更快地发生，并且残留的氧化还原试剂浓度低于预期。因此采用了快速离心的基于尺寸排阻的脱盐程序，这似乎在很大程度上阻止了这种逆转。如图10中的分图(A)中所示，二硫键改组导致亚型A和B，以及A/B的过渡状态(复制自Zhang,A.等，2015)。(B)可通过RP-HPLC区分亚型(来自Zhang,A.等，2015的图)。(C)所观察到的INX901的RP-HPLC色谱图。
下面描述发明人优化的用于检测IgG2各亚型的RP-HPLC方法。在图11中：(黑线，顶部)色谱图示出了定义B型的明显的最左边的峰。(红线，底部)色谱图示出了定义A型的明显的右边的峰。
用于亚型检测的优化RP-HPLC方法
流动相A制备(0.1％v/v TFA水溶液)：
1.在1.0升量筒中测量1.0升Milli-Q水
2.使用1mL玻璃Hamilton注射器向该1L水中添加1.0mL TFA
3.将该溶液转移至1L瓶中，充分混合。
4.有效期限为制备后2周
流动相B制备(70％v/v IPA、20％v/v ACN、9.9％v/v水、0.1％v/v TFA)：
1.将700mL IPA测量到1.0L量筒中
2.将200mL ACN测量到250mL量筒中并转移至该装有700mL IPA的1.0L量筒中
3.将Milli-Q水添加到该装有700mL IPA和200mL ACN的1.0L量筒中，直至液体达到1.0L刻度。
4.使用1mL玻璃Hamilton注射器向该1L水中添加1.0mL TFA
5.将该溶液转移至1L瓶中，充分混合。
6.有效期限为制备后2周
RP-HPLC色谱条件
1.柱A(大管径)：Zorbax 300SB-C8,5μm,2.1x150mm，<<或者>>
2.柱B(窄管径)：Zorbax 300SB-C8,3.5μm,1x50mm
3.流动相A：0.1％v/v TFA水溶液
4.流动相B：70％v/v IPA、20％v/v ACN、9.9％v/v水、0.1％v/v TFA
5.流速：0.5mL/min(对于柱A)或0.25mL/min(对于柱B)
6.柱室：75.0±1.0℃
7.检测：214nm
8.RP-HPL流动相梯度(下表)
时间(分钟) 流动相B％
0 15
2 26
34 36
35 75
36 15
40 15
INX901二硫键亚型的富集方法
B型富集
1.向无内毒素的无热原管中添加：
2.1mL的INX901(5.66mg/mL)
792.6μL的1M Tris pH 8.0
495.4μL的无内毒素水
396.3μL额外的无内毒素水
237.8μL的100mM半胱氨酸
39.6μL的100mM胱胺
2.进行手指涡旋(finger vortex)(轻微地)，然后盖上盖于2-8℃下放置24小时
3.在室温下在0.3M NaOH中浸泡Pall microsep旋转浓缩器2小时，然后用10×DPBS冲洗3次，然后用无内毒素水冲洗3次。使用前在BSC中风干
4.按照供应商关于再生0.5mL内毒素移除柱的说明，对于步骤3使用0.2N NaOH/95％乙醇(室温下2小时)选项；使用1×DPBS作为最终平衡缓冲液
5.在独立的Pall microsep(如上所述准备)中浓缩约4,020μL反应物(来自步骤2)。
6.以2,500×G浓缩35分钟至少于0.4mL(≥10×)，然后用4mL 1×DPBS重新稀释，再重复2次
7.以2,500×G浓缩15分钟至2mL以下，然后加回1×DPBS至2mL
8.将所有2mL缓冲液交换的样品添加至再生的、旋转干燥的、底部带盖的内毒素移除柱，将顶部盖紧，倒置，在室温下放置，再每隔约20分钟倒置3次，然后将样品离心取出到非热原管中(根据供应商的说明，在500×G下1分钟)，置于2-8℃下
A型富集
1.向无内毒素的无热原管中添加：
1750μL INX901(6.2mg/mL)
370μL的无内毒素水
700μL 1M Tris pH8.0
435μL 8M GdCl
210μL 0.1M半胱氨酸盐酸盐(用1M母液新鲜制备)
35μL 0.1M胱胺-2HC(用1M母液新鲜制备)
(最体积为3500μL)
2.进行手指涡旋(轻微地)，然后盖上盖于2-8℃下放置24小时
3.按照供应商的说明准备#7-2mL Zeba离心柱(Thermo P/N 89890)，平衡进1×Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS)。
4.将500μL上述反应混合物上样到#7柱每一者上，并以1000×G离心2分钟(也按照供应商的说明)，收集到洁净的无热原管中。
5.置于去热原的PALL microsep中，离心总计1小时10分钟，浓缩至大约1.7mL，浓度约为5mg/mL
6.将上述全部约1.7mL添加至按照供应商的说明准备(包括在室温下在0.2M NaOH中过夜)的一个0.5mL内毒素移除离心柱(Thermo P/N 88274)，平衡进1×DPBS中。在室温下放置约1小时，然后在4℃下再另外放置大约1小时，在两种情况下每隔15分钟翻转该盖好的管。
7.通过500×G离心1分钟回收制备物(也按照供应商的说明)。
8.回收体积：大约1.3mL，浓度为4.61mg/mL(所有浓度均基于NanoDrop的内置IgG，消光系数0.73)
IgG2A型锁定变体和IgG2B型锁定变体
特异性置换IgG2的氨基酸序列能够防止二硫化物改组，并且取决于突变将会导致A样或B样的锁定构象(Martinez等，(2008).“Disulfide connectivity of humanimmunoglobulin G2structural isoforms”,Biochemistry,47(28),7496-7508；Allen等，(2009),“Interchain disulfide bonding in human IgG2antibodies probed by site-directed mutagenesis”,Biochemistry,48(17),3755-3766)。
因此，本发明人设计了具有C233S(A锁定形式)或C127S(B锁定形式)突变(Eu编号方式)的INX901和INX908变体以匹配White等(2015)(“Conformation of the humanimmunoglobulin G2hinge imparts superagonistic properties to immunostimulatoryanticancer antibodies”,Cancer Cell,27(1),138-148)使用的IgG2变体。
下面列出恒定重链序列。
IgG2C233S(A型锁定形式)
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCSVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:63)
IgG2C127S(B型锁定形式)
ASTKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:64)
沉默Fc变体
本发明人通过在IgG1骨架上引入以下点突变，设计了具有沉默Fc区的INX901和INX908变体：L234A/L235A/G237A/P238A/H268A/A330S/P331S(McCarthy等(2015)，美国专利申请14/818864。美国华盛顿特区)。在一种类型的变体(INX901Si和INX908Si)中，重恒定区的CH1/铰链区是天然IgG1，其不支持天然IgG2的二硫键改组(图12，中间)。在第二种类型的变体(INX901HSi和INX908HSi)中，CH1/铰链区是天然IgG2，其支持二硫键改组(White,A.L.等，2015)(图12，底部)。下面列出了两种类型的变体的恒定重链序列。
具有沉默Fc的IgG1(INX901Si和INX908Si)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:65)
IgG2CH1/铰链+IgG1沉默Fc(INX901HSi和INX908HSi)
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:66)
图12中的实验就二硫键改组比较了INX901Fc沉默变体的免疫特性。(顶部)IgG2骨架上的INX901表现出预期的A亚型、A/B亚型和B亚型的混合物。(中间)沉默IgG1骨架上的INX901Si作为单一亚型存在。(底部)INX901HSi具有IgG1沉默Fc区，其中CH1/铰链来自IgG2，其使得二硫键改组等同于天然IgG2。这些结果表明FcR结合似乎影响本发明抗体的激动剂特性。
实施例14：各种Ig骨架中的INX901和INX908的功能，以确定铰链区和Fc区的需要
我们进行了实验以评估抗人VISTA抗体INX901和INX908的重链的CH1/铰链区和Fc区的功能要求。在它们的原始状态下，两种分子都在天然人IgG2骨架上，因此是构象不同的亚型的混合物，从而导致二硫键改组。选择高细胞密度混合淋巴细胞反应(MLR)用于这些研究，因为先前的数据表明该测定法为INX901和INX908二者提供了稳健的功能读数。对INX901和/或INX908进行了以下修饰以研究特定亚型是否负责功能：向A或B亚型的生化倾斜(skewing)，将构象“锁定”为A型或B型的遗传修饰，以及嵌合分子，其中Fc被沉默并且CH1/铰链区来自IgG1(其中不发生二硫键改组)，或来自IgG2(其允许天然二硫键改组)。
该测定法的结果表明，无论是A形式、B形式还是表征天然IgG2的形式的混合物，INX901和INX908都保留功能。此外，INX901和INX908都需要活性的Fc区才能实现功能。
MLR是标准的免疫学测定法，其依赖于I类MHC和II类MHC错配以驱动同种异体T细胞应答。从两个错配的个体中分离外周血单核细胞，一起温育，由于这些错配，发生增殖和细胞因子产生。先前已报道高细胞密度条件(HCD)(意即具有>1×107个细胞/ml的培养物)体外阐明了抗体的激动功能。我们以前的数据表明INX901和INX908二者都能在MLR中在HCD条件下抑制NFα的表达。
在就每种抗体的IgG2二硫键亚型和/或Fc沉默进行遗传修饰或生化修饰后将HCDMLR测定法用于评估INX901和INX908功能。在运行MLR之前，每种抗体均通过ELISA证实结合重组VISTA。INX901被送往科罗拉多州路易斯维尔市(Louisville,CO)的Elion，LLC公司，在那里通过氧化还原将其修饰为主要是A型(INX901A倾斜形式)或B型(INX901B倾斜形式)。如先前实施例中所述，通过RP-HPLC确认倾斜。(图11)。每种抗体以及亲本INX901在HCD MLR中以剂量响应形式稀释，并通过Luminex测量细胞因子产生。先前的数据已表明TNFα和/或IL-2是亲本INX901抗体的抗体功能的稳健读数。在两个单独的MLR中，与IgG2对照相比，INX901亲本、INX901A倾斜形式和INX901B倾斜形式减少了TNFα和IL-2二者(图13)。
为了证实来自图13的数据，使用突变制备INX901的另外的变体以产生A型或B型的锁定变体。另外，制备具有完全沉默的Fc区的嵌合形式的INX901以测试Fc结构域的功能。INX901Si是一种完全沉默的IgG1抗体。INX901HSi具有完全沉默的IgG1Fc，但还具有IgG2CH1/铰链区，其能够实现与天然IgG2无法区分的二硫键改组。在运行MLR之前，每种抗体均通过ELISA证实结合重组VISTA。确认来自所述生化倾斜形式的数据，INX901的A锁定形式和B锁定形式二者都能够减少IL-2和TNFα二者的产生(图14)。相反，INX901的Si和HSi形式都不能减少IL-2和TNFα的产生(图14)。
为了证实来自图14的数据，对INX908抗体进行相同的突变以产生A型或B型的锁定变体。另外，制备具有完全沉默的Fc区的嵌合形式的INX908以测试Fc结构域的功能。INX908Si是一种完全沉默的IgG1抗体。INX908HSi具有完全沉默的IgG1Fc，但含有IgG2CH1/铰链区。在运行MLR之前，每种抗体均通过ELISA证实结合重组VISTA。确认用INX901变体获得的数据，INX908的A锁定形式和B锁定形式二者都能够减少IL-2和TNFα二者的产生(图15)。相反，INX908的Si和HSi形式都不能减少IL-2和TNFα的产生(图15)。
实施例15：使用PEPPSCAN方法对激动性抗体进行不连续表位作图
Pepscan使用肽阵列来确定线性和不连续表位二者。该方法是许多研究人员和公司用于确定抗体表位的公认方法。图16示意性地描述了用于鉴定根据本发明的各种激动性抗人VISTA抗体所结合的线性表位和不连续表位的技术。
CLIPS技术的原理
CLIPS技术在结构上将肽固定为确定的三维结构。这可产生甚至最复杂的结合位点的功能模拟物。CLIPS技术现在通常用于将肽库形成单环结构、双环结构或三环结构以及片层样折叠和螺旋样折叠。CLIPS反应发生在CLIPS支架的溴基团与半胱氨酸的巯基侧链之间。在温和条件下个反应快速且是特异的。利用这种简练的化学方法，天然蛋白质序列被转化为具有一系列结构的CLIPS构建体。
组合CLIPS文库筛选细节
CLIPS文库筛选开始于使用组合矩阵设计将靶标蛋白质转化为具有多达10,000种重叠肽构建体的文库。在固体载体上，合成线性肽矩阵，随后将其成形为空间限定的CLIPS构建体。呈现正确构象的不连续表位的两个部分的构建体以高亲和力结合抗体，对该亲和力进行检测和定量。呈现不完整表位的构建体以较低亲和力结合抗体，而不含该表位的构建体根本不结合。在迭代筛选中使用亲和力信息来详细定义表位的序列和构象。该表位分析的结果汇总如下。
抗体INX901、INX902、INX904、INX906、INX907、INX908
当在中等严格度条件下测试时，抗体INX901、INX902、INX904、INX906、INX907、INX908强烈结合线性表位模拟物和构象表位模拟物。结合的肽含有核心序列48NVTLTCRLLGPV60(SEQ ID NO:67)、79EVQTCSERRPIR90(SEQ ID NO:68)、123SDHHGNFS130(SEQID NO:69)和153HHHSEH158(SEQ ID NO:70)，其中肽段79EVQTCSERRPIR90(SEQ ID NO:68)是表位的主要部分。
对采用线性表位模拟物时所记录的数据另外进行分析使得我们能鉴定对INX904、INX906、INX907和INX908的结合而言重要的残基，因为在某些位置上的双Ala突变体显著降低了信号强度。具体而言，置换48NVTLTCRLLGPV60(SEQ ID NO:71)内的残基CR可影响INX906、INX907和INX908的结合。另外置换79EVQTCSERRPIR90(SEQ ID NO:68)内的残基TC可明显影响INX904和INX907的结合。
抗体INX800
当在中等严格度条件下测试时，抗体INX800不能可检测地结合线性表位模拟物和简单约束的表位模拟物，但显示出可检测的与不连续表位模拟物的结合。用不连续表位模拟物获得的数据分析表明，抗体INX800识别具有核心序列53TCRLLGPVDKG63(SEQ ID NO:72)、101HGGHQAA107(SEQ ID NO:73)、121SASDHHGNFS130(SEQ ID NO:74)和153HHHSEHRVHGAM164(SEQ ID NO:75)的不连续表位，其中序列153HHHSEHRVHGAM164(SEQ ID NO:76)代表主要的识别位点。
抗体INX803和INX804
当在高严格度条件下测试时，抗体INX803和INX804不结合阵列上存在的任何肽。当在中等严格度条件下测试时，两种抗体都结合不连续的表位模拟物。对结合图谱进行累积分析表明，两种抗体类似地识别肽段52LTCRLLGPV60(SEQ ID NO:77)、79EVQTCSERRPIR90(SEQ ID NO:78)、98HLHHGGHQAA107(SEQ ID NO:79)、123SDHHGNFS130(SEQ ID NO:80)、153HHHSEHRVHGAM164(SEQ ID NO:81)，其中区域52LTCRLLGPV60(SEQ ID NO:77)是主要的识别位点。
抗体INX900
当在高严格度条件下测试时，抗体INX900非常弱地结合具有核心序列79EVQTCSERRPIR90(SEQ ID NO:68)的线性表位模拟物。值得注意的是，使用以下不连续的表位模拟物时观察到更高的结合，该表位模拟物除了序列79EVQTCSERRPIR90(SEQ ID NO:68)之外，还含有核心序列56LLGPVDKGHDVTFYK70(SEQ ID NO:82)、113LAQRHGLESASDHHG127(SEQID NO:83)、153HHHSEHRVHGAM164(SEQ ID NO:84)。
抗体INX903
当在高严格度条件下测试时，抗体INX903不结合线性表位模拟物，但弱结合构象表位模拟物。对所记录的强度谱进行分析表明，抗体识别由核心序列79EVQTCSERR87(SEQ IDNO:85)、93TFQDLHLHHGGHQAA107(SEQ ID NO:86)、146CLVVEIRHHHSEH158(SEQ ID NO:87)构成的不连续表位，其中序列79EVQTCSERR87(SEQ ID NO:85)是该表位的核心。
抗体INX905
当在高严格条件下测试时，抗体INX905结合具有核心序列79EVQTCSERRP88(SEQ IDNO:88)的线性肽。采用双Ala突变体获取的数据表明，79EVQTCSERRP88(SEQ ID NO:88)内的基序RR对于识别是关键的。采用不连续表位模拟物时所记录的强度谱表明，添加肽序列53TCRLLGPVDKG63(SEQ ID NO:89)、123SDHHG127(SEQ ID NO:90)和153HHHSEHRVHGAM164(SEQ IDNO:91)可加强抗体的结合。图17显示大多数激动性抗人VISTA抗体结合至相同的核心序列。图18还汇总了表位结果。图19示出了激动性抗人VISTA抗体所结合的表位，并进一步鉴定了与结合有关的重要残基。
实施例16：使用激动性抗VISTA抗体来治疗炎性肠病
用同基因脾CD4+CD45RBhi T细胞过继转移到T细胞和B细胞缺陷的受体小鼠中来起始肠炎症。CD4+CD45RBhi T细胞群主要含有经致敏活化的幼稚T细胞，其能够诱导慢性小肠和结肠炎症。该方法提供精确的疾病发作起始和充分表征的实验时间进程，从而允许动态研究小鼠疾病进展的临床特征。通过该方法诱导的肠炎与人IBD具有许多共同特征，包括慢性大肠和小肠穿壁性炎症(由细胞因子诸如TNF和IL-12驱动的发病机理)，以及诸如消瘦之类的全身症状。因此，其为研究人IBD发病机理的理想模型系统。
材料和方法
在DDE1CD4+CD45RBhi脾细胞转移后第0、3和6天进行INX901处理。在第14天，通过流式细胞术分析外周血。在整个实验期间记录小鼠体重。一旦小鼠开始体重减轻，则在第46天终止实验并通过流式细胞术分析心脏血液和脾细胞；在测量后，解剖结肠并进行处理以用于组织学分析。有两个处理组：人IgG2和INX901(每组8只小鼠)，以及对照组(8只小鼠)，对照组经由静脉注射接受整个CD4+细胞，并且其为疾病发展的阴性对照。
小鼠
供体小鼠：人VISTA敲入(DDE1)小鼠具有敲入的人VISTA cDNA代替小鼠VISTA基因，并且仅在RNA和蛋白质水平上表达人VISTA。小鼠在宾西法尼亚州博耶敦市的Sage Labs公司(Sage Labs,Boyertown,PA)繁育。将8-12周龄的小鼠首先在检疫设施中过渡3周，然后转移到我们的常规设施。使用4个月大的雄性DDE1小鼠。
受体小鼠：9周龄雄性Rag1敲除小鼠购自Jackson Lab公司(B6.129S7-Rag1tm1Mom /J)。
脾细胞分离和转移
使用StemCell EasySepTM小鼠幼稚CD4+T细胞分离试剂盒(#19765)通过阴性选择分离CD4+T细胞，跳过记忆T细胞耗竭步骤。将一个DDE1脾脏在2个载玻片之间机械解离，并按照制造商的说明分离CD4T细胞。简言之，将脾细胞重悬于PBS 2％FBS、1mM EDTA中。然后将它们与大鼠血清和CD4T细胞分离混合物一起温育。7.5分钟后，加入磁珠并温育2.5分钟。然后将含有脾细胞和磁珠的管置于磁铁上，2.5分钟后，将未结合的细胞转移到新管中。我们获得了总共11.3x106个CD4T细胞。每只对照小鼠静脉内(i.v.)注射200μl中的0.5×106个细胞。
幼稚CD4T细胞转移：对11个DDE1脾脏进行T细胞分离。如上所述按照制造商的说明使用StemCell EasySepTM小鼠幼稚CD4+T细胞分离试剂盒(#19765)通过负选择分离幼稚CD4+，增添记忆T细胞耗竭步骤。
为了选择CD45RB+细胞，将CD4+细胞以100×106个细胞/ml重悬于PBS 2％FBS、2mMEDTA(结合缓冲液)和抗CD45RB PE抗体中，并在4℃下温育10分钟。于结合缓冲液中洗涤2次后，添加抗PE MicroBeads(Miltenyi#130-048-801)并在4℃下温育15分钟。于结合缓冲液中洗涤2次后，将细胞重悬于1ml结合缓冲液中并置于2个Miltenyi MS柱上。每柱1ml洗脱细胞两次。获得总共5.6x106个CD4+CD45RB+细胞。小鼠通过静脉内注射接受200μl中的0.329×106个细胞。
使用以下组合(panel)通过流式细胞术评价细胞纯度：
CD4APC-Cy7(BioLegend公司，1:200浓度)
CD45RB PE(BioLegend公司，1:200浓度)
Yellow Live/Dead(英杰公司(Invitrogen)，1:1000浓度)
抗人VISTA抗体及剂量
INX901和对照人IgG2以3mg/kg的剂量给予。在第0天，在将细胞静脉内转移进受体Rag1KO小鼠内前3小时腹膜内注射抗体。然后经由腹膜内(i.p.)注射在第3天和第6天给小鼠给药。对照组接受人IgG2(批号AB150073–4.7mg/mL)。处理组接受INX901(批号BP-021-016-14–5.46mg/mL)。
评价外周血中的“绝对”免疫细胞变化
在供体细胞转移后第14天，通过流式细胞术评价眶后血的供体CD4T细胞积聚和活化状态。简而言之，在含有10μl肝素的Eppendorf管中收集血液。为了获得接近绝对细胞计数，通过在10μl中直接添加抗体混合物+小鼠Fc block对100μl全血进行染色。在4℃下30分钟后，向每份样品添加760μl的ACK裂解缓冲液。温育20分钟后，将样品在PBS中洗涤一次。使样品在MACSQuant流式细胞仪上运行并用FlowJo程序分析。
抗体混合物
荧光团 FITC PE PerCP Cy5.5 PE-Cy7 APC eFluor 780 BV421 BV510
抗原 CD62L CD45RB CD11b CD25 PD1 CD44 CD4 CD45
稀释度 1:200 1:200 1:200 1:200 1:200 1:200 1:200 1:200
用于组织学分析的组织收集
在第46天，对小鼠实施安乐死并解剖结肠。在测量长度后，将结肠清空，转移到盒中。在10％福尔马林中过夜后，将盒转移到70％乙醇中并由病理学部门处理以供石蜡包埋、切片和H-E染色。
评价终末时间点时脾脏中的免疫细胞变化
简而言之，收集脾脏并机械解离。在ACK裂解后，洗涤细胞并用以下抗体混合物染色。使样品在MACSQuant流式细胞仪上运行并用FlowJo程序分析。
抗体混合物
INX901处理导致外周血中的CD4T细胞数目降低
在第14天分析外周血中的免疫细胞变化显示CD4T细胞(以绝对计数或以CD5+细胞的比例)降低并且剩余的CD4T细胞主要是CD45RBhi(图20)。如图所示，在100μl血液中的绝对数目(左图)；CD45+细胞的频率(中图)；CD4+细胞的频率(右图)(每组n＝8，SEM，统计非配对T检验，无相等SD)。如CD62L和CD45RB的统计学上更高的表达水平所示，在INX901处理后第14天存在的小群体CD4T细胞似乎仍然是幼稚的(图21)。该图示出了外周血中CD4T细胞活化状态的变化。(每组n＝8，SEM，统计非配对T检验，无相等SD)(MFI：中值荧光强度)。
到第30天，接受CD45RBhi幼稚CD4T细胞的小鼠随着结肠炎的进展开始体重减轻，而接受完整T细胞级分的对照组没有发展任何疾病(图22)。与对照组相比，INX901处理阻止了体重减轻并且小鼠显示出体重增加。在第46天对小鼠实施安乐死，并分别收集结肠和脾脏用于组织学分析和流式细胞术。
此外，与对照(总CD4)组相比时患有结肠炎的小鼠显示出结肠缩短，在用INX901处理的组中没有发生缩短。如图23所示，虽然与对照(总CD4)组相比时患有结肠炎的小鼠显示出结肠缩短，但在用INX901处理的组中没有发生缩短。如图24中另外所示，与接受总细胞转移且随后没有发展任何结肠炎的对照组(靠上的图)相比，经受CD4CD45RBhi细胞转移的小鼠均发生结肠炎，如肠绒毛之间存在重要的炎性浸润所示(箭头，中间的低放大倍数和高放大倍数图片)。如所分析的所有样品(每组8只小鼠)中完全没有炎性浸润所表明的，INX901处理完全阻止了结肠炎的发展。
如图所示，INX901处理防止了结肠炎的发展。每个小鼠组的结肠的H-E染色切片的代表性图片。放大倍数：顶部的图片为4倍，底部的图片为20倍。箭头指示具有丰富炎性浸润的区域。注意，它们在INX901处理的结肠样品中完全不存在。
对表达CD3(图25)和CD11b(图26)的细胞进行的免疫组织化学染色证实了IgG2处理的动物中的结肠炎发展。对照和INX901处理样品中相似数目的CD3+和CD11b+细胞再次表明INX901处理后完全没有疾病。图25显示INX901处理阻止了CD3+T细胞募集至结肠。每个小鼠组的结肠的CD3染色切片的代表性图片。(放大倍数：顶部的图片为4倍，底部的图片为20倍)。
图26显示INX901处理阻止了髓样(CD11b+)细胞募集至结肠。每个小鼠组的结肠的CD11b染色切片的代表性图片。放大倍数：顶部的图片为4倍，底部的图片为20倍。此外，进一步显示INX901处理可诱导长期CD4T细胞变化。通过流式细胞术对脾细胞的分析显示，在INX901处理后40天，与IgG2处理组相比，CD4T细胞频率仍然高度显著降低，并且10％至30％的CD4T细胞仍然是CD45RB+(图27(左图和右图))。在INX901处理后未观察到调节性T细胞的变化(图27，中间的图)。如图所示，在第46天(最后的抗体剂量后40天)收集脾脏并通过流式细胞术进行分析(每组n＝8或4，SEM，统计非配对T检验，无相等SD)。
因此我们已经证明，如不存在体重减轻、结肠长度改变以及结肠中的炎症浸润所表明的，抗VISTA抗体INX901处理可以防止结肠炎的发展。另外，我们观察到保留幼稚T细胞特征诸如CD45RB表达的CD4T细胞的长期降低(处理后14天和40天)。因此，抗VISTA激动性抗体可用于治疗或预防结肠炎。
实施例17：使用激动性抗VISTA抗体来治疗牛皮癣
咪喹莫特(IMQD)诱导的牛皮癣模型
咪喹莫特(IMQD)是市售的含有TLR7/8激动剂的乳剂，其广泛用于皮肤病学病症如病毒感染和黑素瘤。多天施加IMQD至皮肤会导致角化细胞增殖所致的表皮增厚。另外，发生T细胞和髓样细胞的群体免疫浸润进真皮层中。IMQD的再次施用会产生类似于银屑病患者中观察到的皮肤病变。IL-17和IL-23被认为是针对IMQD的免疫应答所涉及的主要细胞因子。
在这些实验中，我们测试了8G8(仓鼠α小鼠VISTA抗体)对IMQD诱导的牛皮癣的功能。每隔一天将8G8给予小鼠，同时将IMQD局部施用至小鼠背部7天。然后将皮肤分离、固定并包埋于石蜡块中。然后将切片染色以供H-E分析以及通过IHC分析几种免疫群体的表达。值得注意的是，8G8显著减少了真皮中的总的细胞浸润物，其中大部分似乎是CD3+群体的减少。
材料和方法
小鼠处理
1.从Jackson公司购买7周龄小鼠Balb/c小鼠并在DHMC的SPF条件下存放。在实验开始之前将小鼠的背部剃毛。
2.咪喹莫特购自Dartmouth Hitchcock实验动物设施。每天通过使用Q-tip将62.5mg施用至皮肤。
3.每隔一天以200μg/小鼠施用8G8。
4.在第7天处死小鼠并通过从剃毛部分切取正方形来分离皮肤。将皮肤置于福尔马林中24小时，然后送至Dartmouth病理学部门进行石蜡包埋。
脾脏分析
1.分离脾脏并研磨成单细胞悬浮液。
2.离心后，使用ACK溶液裂解红细胞(室温下5分钟)。
3.将细胞离心并重悬于PBS中，然后计数。
4.在存在小鼠Fc block的情况下，在冰上20分钟，用CD4、CD8、CD19、CD11b、Ly6C和Ly6G标记来自每个脾的1×105个细胞。
5.将标记的细胞在Miltenyi MACSquant上运行并使用FlowJo进行分析。
6.在PRISM 6中进行统计分析，其中通过单因素方差分析进行各组比较，然后进行Sidak多重比较检验。P值表示如下：p<0.0001****，p<0.001***，p<0.01**，p<0.05*。
H-E和IHC分析
1.将样品置于盒中并在室温下在10％福尔马林中固定过夜，然后在PBS中简单洗涤，转移并保存在70％乙醇(飞世尔科技公司(Fisher Scientific))中，然后转移至达特茅斯盖瑟医学院(Geisel School of Medicine at Dartmouth)的病理转化研究中心(PathologyTranslational Research Core)，在这里将它们进行石蜡包埋、切片然后染色。
2.使用Leica BOND RX自动染色机将石蜡包埋的组织切片(4μm)染色。脱蜡后，对切片进行抗原修复(Bond表位修复溶液2，100℃，20分钟)，并在室温下在Leica稀释剂中与一抗一起温育(参见下面的稀释度)30-60分钟。然后将载玻片在PBS中洗涤3次，每次5分钟，并与二抗(来自Leica Bond Refine检测试剂盒，DS9800)一起温育。在PBS中最后洗涤3次后，将切片与DAB(Leica Bond聚合物检测试剂盒)一起温育、漂洗、用苏木精复染并封片。
3.用R统计编程语言对CD3+浸润进行统计分析。对每组进行异常值(在“异常值”包中)的卡方检验，如果p<0.05，则除去该数据点。然后使用合并方差的t检验比较各组，p<0.05表示为*。
结果
我们测定了激动性抗VISTA抗体是否在牛皮癣模型中有效，特别是我们测定了激动性抗人抗体8G8是否能够改变针对咪喹莫特诱导的牛皮癣的免疫应答。每天将IMQD乳剂施用于Balb/c小鼠的背部皮肤，持续7天。在初始IMQD处理时(第0天)和第2天、第4天和第6天给予小鼠200μg的8G8或仓鼠Ig。在第7天处死小鼠，并通过H-E和IHC分析皮肤的几种免疫亚组标志物。
H-E分析表明，与对照相比，8G8处理的小鼠的真皮中致密有核细胞(淋巴细胞特有)的数目减少(参见图28)。因此，我们针对免疫细胞表达的几种细胞表面标志物进行了IHC分析。值得注意的是，与仓鼠Ig对照组相比，8G8处理的小鼠中CD3+细胞的数目减少(参见图29、图30)。IMQD牛皮癣被认为是通常是由T细胞、特别是产生IL-17的群体(包括Th17和γδT细胞)驱动的。
我们还对脾脏群体进行了剖析，以了解8G8处理是否减少了总体T细胞群，或者是否仅在皮肤中观察到CD3+减少。没有观察到T细胞群的变化，然而用8G8确实发生CD11b+Ly6G-群体(总量的百分比)和CD19+群体(总数)的小幅下降(参见图31)。
因此，这些实验揭示抗人VISTA激动性抗体在牛皮癣模型中是有效的，因为8G8显示能减少浸润经咪喹莫特处理的皮肤的CD3+T细胞的数目。基于这些结果，VISTA激动性抗体可用于治疗或预防牛皮癣和其他T细胞介导的自体免疫性或炎性皮肤病症。
实施例18：激动性抗VISTA抗体INX800和INX801在伴刀豆球蛋白A诱导的肝炎模型中的用途
伴刀豆球蛋白A(ConA)是一种凝集素，其与特定的糖结合，最终导致免疫系统的活化，主要是在肝脏中。ConA诱导多种细胞因子，诸如T细胞衍生的IL-2、IL-3、IL-4、TNF-α和IFN-γ的快速产生。T细胞活化和随后的细胞因子应答可诱导急性肝炎，并且在高剂量模型中诱导死亡。ImmuNext已创造了一种人VISTA敲入小鼠，其中人VISTA取代小鼠VISTA而表达。小鼠表型正常，从而表明hVISTA在小鼠中恰当地起作用。因此，我们在这些小鼠的肝炎ConA模型中测试了两种抗人VISTA抗体(称为INX800和INX801)。
材料和方法
从Jackson公司购买10周龄小鼠小鼠并在DHMC的SPF条件下存放。
将来自白刀豆(Canavalia ensiformis)(西格玛公司(Sigma)，目录号为C2010-100MG)的伴刀豆球蛋白A在10ml新鲜PBS中重构并在室温下振荡30分钟。制备300μL等分试样供-20℃下储存。
通过以PBS溶液腹膜内注射，在ConA处理前3小时向小鼠施用200μLα-hVISTA抗体或对照Ig对照(Crown Biosciences公司)。以10mpk给予抗体。
对动物进行称重并给予15mg/kg ConA以供细胞因子分析实验。通过尾静脉进行注射。在所有情况下，每隔几小时监测小鼠的发病率，如果触摸到冷则处死。
为了进行细胞因子分析，通过用CO2处死然后进行心脏穿刺将小鼠放血。将血液收集在血浆收集管中，然后离心以移除细胞组分。将样品在-80℃下短时间储存，然后按照制造商的说明进行多重分析。
在与样品相同的基质中用三倍稀释步骤由重组细胞因子标准品产生校准曲线。
将高加标样品和低加标样品(来自刺激的人PBMC和树突细胞的上清液)包括在内以测定细胞因子回收率。
在技术上一式三份测量标准品和质量对照，每个三次重复测试样品测量一次，并从所有读数中减去空白值。所有测定法均在室温下避光于96孔过滤板(马萨诸塞州比尔里卡市的密理博公司(Millipore,Billerica,MA))中直接进行。
简而言之，将孔用含有1％BSA的100μl PBS预先润湿，然后添加珠以及标准品、样品、加标样品或空白，最终体积为100μl，并在室温下伴随连续摇动温育30分钟。
用含有1％BSA和0.05％吐温20的100μl PBS将珠洗涤三次。
将生物素化抗体的混合物(50μl/孔)添加至珠中，在室温下伴随连续摇动温育30分钟。
将珠洗涤三次，然后添加链霉亲和素-PE 10分钟。将珠再次洗涤三次并重悬于125μl含有1％BSA和0.05％吐温20的PBS中。
使用Bio-Plex阵列读取器测量珠的荧光强度。使用带有五参数曲线拟合的Bio-Plex Manager软件进行数据分析。
在R Statistical Computing Language或Prism 6中进行细胞因子分析的统计分析。将低于检测限(<OOR)的细胞因子浓度值重新调整至最低可检测浓度，并将高于精确定量(>OOR)的值重新调整至最大可线性量化的浓度。使用带有Tukey真正显著差检验(TukeyHonest Significant Differences)的单因素方差分析进行抗体处理组和Ig对照之间的成对比较。小于0.1的P值被认为是显著的并表示如下：p<0.0001****，p<0.001***，p<0.01**，p<0.05*，p<0.1～。
结果
设计两个重复实验(#13和#14)以确定INX800和/或INX801(二者均为抗hVISTA抗体)是否能够改变针对ConA的细胞因子应答。在用ConA(15mg/kg)处理前3小时给予小鼠10mpk的INX800、INX801或对照Ig，然后在6小时时间点处死小鼠，并通过32重测定法测定细胞因子应答。大多数细胞因子没有变化，然而IL-2被INX800和INX801持续降低(图32、图33)。所有细胞因子谱均可在附录中的链接中查看。
还分析了未处理小鼠和来自实验14的小鼠的免疫群体的变化，以确定细胞因子的减少是否与任何T细胞耗竭迹象相关。流动门控策略包括以下的标志物：B220(B细胞)、CD3、CD4和CD8(T细胞)；以及CD11b和Gr1(髓样细胞)。对于任何群体，未观察到细胞总数与抗体处理的统计上显著的相关性(参见图34)。因此，INX801和INX801二者都能够抑制ConA诱导的IL-2应答。在天然小鼠中或在ConA应答期间没有明显的由INX800或INX801引起的细胞耗竭迹象。这些实验结果表明，VISTA激动性抗体可用于治疗和预防肝炎感染以及急性感染期间引起炎症和细胞因子应答。这些实验结果表明，VISTA激动性抗体可用于治疗和预防与肝炎以及影响肝脏的其他感染和炎性疾病相关的肝毒性或肝损伤。
实施例19：激动性抗VISTA抗体8G8和13F3在伴刀豆球蛋白A诱导的肝炎模型中的用途
前面的实施例中描述了ConA模型。在这些实验中，我们检测了两种不同的α-mVISTA抗体(8G8和13F3)影响ConA诱导的细胞因子应答的能力。由于8G8能够减少数种T细胞衍生细胞因子的产生，我们还检查了其是否能够防护致死剂量的ConA。
材料和方法
从Jackson公司购买7周龄小鼠小鼠并在DHMC的SPF条件下存放。
将来自白刀豆(Canavalia ensiformis)(西格玛公司(Sigma)，目录号为C2010-100MG)的伴刀豆球蛋白A在10ml新鲜PBS中重构并在室温下振荡30分钟。制备300μL等分试样供-20℃下储存。
在ConA处理前3小时，通过在PBS中注射I.P，将200μLα-mVISTA抗体8G8和13F3或仓鼠Ig对照(BioXcell)给予小鼠。
对动物进行称重并给予15mg/kg ConA以供细胞因子分析实验或给予30mg/kgConA以供死亡实验。通过尾静脉进行注射。在所有情况下，每隔几小时监测小鼠的发病率，如果触摸到冷则处死。
为了进行细胞因子分析，通过面颊穿刺或通过用CO2处死然后进行心脏穿刺将小鼠放血。在血浆收集管中收集血液，在室温下温育30分钟，然后离心以除去细胞组分。将样品在-80℃下短时间储存，然后按照制造商的说明进行多重分析。
在与样品相同的基质中用三倍稀释步骤由重组细胞因子标准品产生校准曲线。
将高加标样品和低加标样品(来自刺激的人PBMC和树突细胞的上清液)包括在内以测定细胞因子回收率。
在技术上一式三份测量标准品和质量对照，每个三次重复测试样品测量一次，并从所有读数中减去空白值。所有测定法均在室温下避光于96孔过滤板(马萨诸塞州比尔里卡市的密理博公司(Millipore,Billerica,MA))中直接进行。
简而言之，将孔用含有1％BSA的100μl PBS预先润湿，然后添加珠以及标准品、样品、加标样品或空白，最终体积为100μl，并在室温下伴随连续摇动温育30分钟。
用含有1％BSA和0.05％吐温20的100μl PBS将珠洗涤三次。
将生物素化抗体的混合物(50μl/孔)添加至珠中，在室温下伴随连续摇动温育30分钟。
将珠洗涤三次，然后添加链霉亲和素-PE 10分钟。将珠再次洗涤三次并重悬于125μl含有1％BSA和0.05％吐温20的PBS中。
使用Bio-Plex阵列读取器测量珠的荧光强度。使用带有五参数曲线拟合的Bio-Plex Manager软件进行数据分析。
在R Statistical Computing Language或Prism 6中进行细胞因子分析的统计分析。将低于检测限(<OOR)的细胞因子浓度值重新调整至最低可检测浓度，并将高于精确定量(>OOR)的值重新调整至最大可线性量化的浓度。使用带有Tukey真正显著差检验的单因素方差分析进行抗体处理组和Ig对照之间的成对比较。对于所有测试和比较，P值小于0.05被认为是显著的。
结果
我们的初始实验设计用于确定8G8或13F3(均为抗mVISTA抗体)是否能够改变针对ConA的细胞因子应答。在用ConA(15mg/kg)处理前3小时给予小鼠200μg的8G8、13F3或仓鼠Ig，然后在6小时时间点处死小鼠，并通过32重测定法测定细胞因子应答(图35)。大多数细胞因子没有变化，然而在存在8G8而不是13F3的情况下IL-2减少。然后，我们想确定IL-2的减少是否与保护免于ConA诱导的死亡相关。为此，用8G8或仓鼠Ig预处理小鼠，然后以30mg/kg给予ConA并跟踪存活情况(图36)。所有经仓鼠Ig处理的小鼠必须在40小时内实施安乐死，而80％的经8G8处理的小鼠在72小时内存活并且看起来健康。因此，激动性抗体8G8而不是13F3可在ConA诱导的肝炎模型中诱导IL-2的变化。另外8G8可以防止ConA的致命攻击(30mg/kg)。这些实验结果表明，VISTA激动性抗体可用于治疗和预防肝炎感染以及急性或慢性感染期间引起病理性炎症和促炎细胞因子应答。这些实验结果还表明，VISTA激动性抗体可用于治疗和预防与肝炎以及影响肝脏的其他感染和炎性疾病相关的肝毒性或肝损伤。
实施例20：激动性抗VISTA抗体INX903在伴刀豆球蛋白A诱导的肝炎模型中的用途
前面的实施例中描述了ConA模型。在这些实验中，我们使用INX800作为对照，在肝炎的ConA模型中测试了另外的抗人VISTA抗体INX903。在一项实验中，我们还将INX903和INX800与拮抗性VISTA抗体进行了比较，该拮抗性VISTA抗体之前已表明可增强免疫细胞产生的细胞因子。
材料和方法
从Jackson公司购买10周龄小鼠小鼠并在DHMC的SPF条件下存放。
将来自白刀豆(Canavalia ensiformis)(西格玛公司(Sigma)，目录号为C2010-100MG)的伴刀豆球蛋白A在10ml新鲜PBS中重构并在室温下振荡30分钟。制备300μL等分试样供-20℃下储存。
通过以PBS溶液腹膜内注射，在ConA处理前3小时向小鼠施用200μLα-hVISTA抗体或对照Ig对照(Crown Biosciences公司)。以10mpk给予抗体。
对动物进行称重并给予15mg/kg ConA以供细胞因子分析实验。通过尾静脉进行注射。在所有情况下，每隔几小时监测小鼠的发病率，如果触摸到冷则处死。
为了进行细胞因子分析，通过用CO2处死然后进行心脏穿刺将小鼠放血。将血液收集在血浆收集管中，然后离心以移除细胞组分。将样品在-80℃下短时间储存，然后按照制造商的说明通过Luminex或MSD多重分析法进行分析。
以R统计计算语言进行细胞因子分析的统计分析。将低于检测限(<OOR)的细胞因子浓度值重新调整至最低可检测浓度，并将高于精确定量(>OOR)的值重新调整至最大可线性量化的浓度。使用带有Tukey真正显著差检验的单因素方差分析进行抗体处理组和Ig对照之间的成对比较。小于0.1的P值被认为是显著的并表示如下：p<0.0001****，p<0.001***，p<0.01**，p<0.05*，p<0.1～。
这些实验的结果包含在图37和图38中。在图37中，检测了用对照Ig、INX800或INX903处理的小鼠在6小时时间点时的血浆中的IL-2表达。在-3小时时用每种指定的抗体预处理小鼠。在时间0时，给予小鼠15mg/kg的ConA，然后在6小时时间点时处死并放血。图38示出了用对照Ig、2种激动性VISTA抗体(INX800和INX903)或VISTA拮抗性抗体处理的小鼠的6小时时间点的血浆中的IL-2和MIP-1β表达。在-3小时时用每种指定的抗体预处理小鼠。在时间0时，给予小鼠15mg/kg的ConA，然后在6小时时间点时处死并放血。这些实验表明INX800和INX903能够抑制ConA诱导的细胞因子应答。
这些实验结果表明，VISTA激动性抗体可用于治疗和预防肝炎感染以及急性或慢性感染期间引起病理性炎症和促炎细胞因子应答。这些实验结果还表明，VISTA激动性抗体可用于治疗和预防与肝炎以及影响肝脏的其他急性或慢性感染和炎性疾病相关的肝毒性或肝损伤。
实施例21：激动性抗VISTA抗体8G8在胶原诱导的关节炎或CIA模型中的用途
用佐剂中的II型胶原蛋白(CII)对啮齿动物和灵长类动物进行免疫可诱导自体免疫性关节炎，即所谓的胶原诱导的关节炎或CIA，其在许多方面可重现类风湿性关节炎(RA)症状。CII是动关节的软骨(RA的炎症部位)的主要组成蛋白，可在RA患者中检测到针对CII的免疫。
识别各种CII上的保守表位的含5种单克隆抗体的混合物(致关节炎性5单克隆抗体混合物)可在未处理小鼠中诱导关节炎。该模型称为胶原抗体诱导的关节炎(CAIA)。用5抗体混合物进行的体外研究表明，即使在不存在炎性介质的情况下，这些抗体也可能对软骨细胞是致病性的，并损害软骨的形成；它们还抑制胶原合成、原纤维形成，并且引起细胞外基质中的CII原纤维解体，基质合成增加或不增加。此外，该5抗体混合物还对预先形成的软骨具有有害作用。
在这些实验中，我们测试了8G8(仓鼠抗小鼠VISTA单克隆抗体)处理对RA的CAIA小鼠模型的影响。从第-2天开始，每隔一天给小鼠给予8G8。在第0天向它们施用含5种抗体的混合物，在第3天施用LPS。通过随时间推移测量受影响关节中的炎症性肿胀来评估疾病发展。临床评分是通过每个肿胀足趾给予1分，每个肿胀的足垫给予5分，肿胀的腕或踝给予5分(Charles River Labs评分系统)来实现，其中加在一起得到每只动物的最大得分60。
材料和方法
小鼠处理
从Jackson Labs获得8周龄的DBA小鼠。在将它们的尾巴进行纹标之前使得它们适应2天。
CAIA诱导：在第0天，给小鼠腹膜内(ip)注射购自AMSBIO/Chondrex的含5种抗体的混合物，剂量为每只小鼠1.5mg。然后在第3天，它们经腹膜内接受50μg LPS(购自AMSBIO公司)。
抗VISTA处理：在整个实验过程中，从第-2天开始每隔一天给予小鼠抗VISTA8G8或对照仓鼠IgG，剂量为10mg/Kg。(参见图39)
统计分析
使用Excel进行数据管理和使用GraphPad Prism进行绘图，对CAIA评分进行分析。使用R统计计算软件的宏来进行统计分析，该宏可测量两组经差异处理的小鼠之间肿瘤体积的差异，并且被称为“混合效应重复测量”。
结果
该实验的目的是确定激动性抗VISTA抗体是否在关节炎模型中有效。在实验中，据显示抗VISTA激动性抗体8G8可以在RA的CAIA实验模型中影响疾病进展。图40中的数据显示，响应于8G8，疾病进展和范围显著降低(交互作用项P<0.000005)。如所示的，在第-2天开始处理，随后每隔一天对小鼠进行给药。(每组n＝10)。8G8处理显著降低了疾病严重程度(交互作用项P<0.000005)。
实施例22：激动剂(INX903)抗VISTA抗体在胶原诱导的关节炎或CIA模型中的用途
前面的实施例中描述了CIA模型。在本实验中，我们测试了INX903(人抗人VISTA-IgG2)处理对RA的CAIA小鼠模型的影响。从第-2天开始，每隔一天给予小鼠INX903。在第0天向它们施用含5种抗体的混合物，在第3天施用LPS。通过随时间推移测量受影响关节中的炎症性肿胀来评估疾病发展。临床评分是通过每个肿胀足趾给予1分，每个肿胀的足垫给予5分，肿胀的腕或踝给予5分(Charles River Labs评分系统)来实现，其中加在一起得到每只动物的最大得分60。
材料和方法
小鼠处理
图41中图示了实验方案。
在宾夕法尼亚州博耶敦市的Horizon Discovery(Sage)Labs公司(HorizonDiscovery(Sage)Labs,Boyertown,PA)繁育hVISTA敲入(KI)小鼠。将8-12周龄的小鼠首先在检疫设施中过渡3周，然后转移到常规设施。将4个月大的小鼠用于该实验。在实验开始前2天，将小鼠的尾纹标。
CAIA诱导：在第0天，给小鼠腹膜内(ip)注射购自AMSBIO/Chondrex的含5种抗体的混合物，剂量为每只小鼠5mg。然后在第3天，它们经腹膜内接受50μg LPS(购自AMSBIO公司)。
抗VISTA处理：在实验的整个过程中，从第-2天开始每隔一天给予小鼠抗VISTA抗体INX903或对照人IgG2，剂量为10mg/Kg。
如图42所示，在第-2天开始处理，随后每隔一天对小鼠进行给药。(对照组中n＝9，INX903处理组中n＝8；从对照组中移除了1只小鼠，因为它从未显示任何疾病迹象)。INX903处理显著降低了疾病严重程度(交互作用项P＝0.0005)。如先前实施例中那样分析CAIA评分。图42中所示数据表明，响应于INX903，疾病进展以及范围有显著降低(交互作用项P＝0.0005)。
实施例23：激动剂(INX903)抗VISTA抗体在胶原诱导的关节炎或CIA模型中的用途
在本实验中，我们再次测试了INX903(人抗人VISTA-IgG2)处理对RA的CAIA小鼠模型的影响。从第-2天开始，每隔一天给予小鼠INX903。在第0天向它们施用含5种抗体的混合物，在第3天施用LPS。通过随时间推移测量受影响关节中的炎症性肿胀来评估疾病发展。临床评分是通过每个肿胀足趾给予1分，每个肿胀的足垫给予5分，肿胀的腕或踝给予5分(Charles River Labs评分系统)来实现，其中加在一起得到每只动物的最大得分60。
材料和方法
小鼠处理
在宾夕法尼亚州博耶敦市的Horizon Discovery(Sage)Labs公司繁育hVISTA敲入(KI)小鼠。将8-12周龄的小鼠首先在检疫设施中过渡3周，然后转移到常规设施。将4个月大的小鼠用于该实验。在实验开始前2天，将小鼠的尾纹标。
CAIA诱导：在第0天，给小鼠腹膜内(ip)注射购自AMSBIO/Chondrex的含5种抗体的混合物，剂量为每只小鼠5mg。然后在第3天，它们经腹膜内接受50μg LPS(购自AMSBIO公司)。
抗VISTA处理：如下所示，在实验的整个过程中，从第-2天开始每隔一天给予小鼠抗VISTA抗体INX903或对照人IgG2，剂量为10mg/Kg。
如先前实施例中那样分析CAIA评分。
图43中所示数据显示，响应于INX903，疾病进展以及范围显著降低(交互作用项P＝0.01)。
实施例24：激动性抗VISTA抗体(8G8)在胶原诱导的关节炎或CIA模型中的作用
在这些实验中，我们测试了8G8(仓鼠抗小鼠VISTA单克隆抗体)处理对RA的CAIA小鼠模型的影响。从第-2天开始，每隔一天向小鼠给予8G8(激动性抗鼠VISTA抗体)。在第0天向它们施用含5种抗体的混合物，在第3天施用LPS。通过随时间推移测量受影响关节中的炎症性肿胀来评估疾病发展。临床评分是通过每个肿胀足趾给予1分，每个肿胀的足垫给予5分，肿胀的腕或踝给予5分(Charles River Labs评分系统)来实现，其中加在一起得到每只动物的最大得分60。如图44中所示，8G8抗体导致响应于8G8，疾病进展和范围显著降低(交互作用项P<0.0001)。
实施例25：胶原蛋白抗体诱导的类风湿性关节炎小鼠模型中激动性抗体(INX800、901和902)对疾病进展的作用
我们测试了INX800(嵌合型小鼠抗人VISTA-IgG2)、INX901和INX902(人抗人VISTA-IgG2)处理对RA的CAIA小鼠模型的影响。从第-2天开始，每隔一天向小鼠给予INX800、INX901或INX902。在第0天向它们施用含5种抗体的混合物，在第3天施用LPS。通过随时间推移测量受影响关节中的炎症性肿胀来评估疾病发展。临床评分是通过每个肿胀足趾给予1分，每个肿胀的足垫给予5分，肿胀的腕或踝给予5分(Charles River Labs评分系统)来实现，其中加在一起得到每只动物的最大得分60。
如前所述分析CAIA评分。如图45所示，INX800处理定性地降低了疾病进展，尽管在该实验中没有统计学意义(交互作用P＝0.46)。相反，如图46中所示，INX901处理完全阻止了疾病进展(交互作用P<0.0001)。如图47中进一步所示，INX902处理完全阻止了疾病进展(交互作用P<0.0001)。
实施例26：激动性VISTA抗体(8G8)在C57/Bl6GVHD模型中的作用
最常研究的MHC错配的急性GvHD小鼠模型是C57/Bl6(H2b)→BALB/c(H2d)(将细胞分离物从C57/Bl6(H2b)供体移植到BALB/c(H2d)受体中)。这里我们使用C57/Bl6小鼠作为转移进受照射的BALB/c受体中的脾细胞和骨髓的供体。我们检验了仓鼠α-小鼠VISTA抗体8G8与仓鼠α-小鼠VISTA抗体13F3和仓鼠IgG对照相比的免疫抑制功效。
材料和方法
从Charles River Laboratories公司购买10周龄雌性BALB/c受体小鼠和C57/Bl6供体小鼠。将所有小鼠于SPF条件下圈养在DHMC动物房中。
使受体小鼠在转移前第0天(上午9点30分和下午1点30分)经受450cGy的铯-137源的两次全身照射(TBI)。
使供体小鼠安乐死并通过用HBSS冲洗股骨和胫骨来收获骨髓。使用ACT溶液裂解红细胞。制备从脾脏分离的单细胞悬浮液并使用ACT溶液裂解红细胞。
受体小鼠接受1000万个骨髓细胞和1000万个脾细胞以及200ug仓鼠IgG(BioXcell，BE0091，批号为18206/1015)或8G8(批号为AB-130318)或13F3-2E9(批号为BP-075-014)。通过尾静脉静脉内注射施用细胞和抗体。
在第2、4和6天腹膜内注射另外三剂量的抗体。
定期对小鼠进行称重以监测疾病进展。然而，由于辐射病，所有小鼠都体重减轻很多，在实验期间提供了液体恢复性食物。当出现发病迹象时，对小鼠实施安乐死。
结果
图48A-B示出了急性GvHD疾病模型中用8G8、13F3或对照仓鼠IgG抗体处理的受体小鼠的体重和存活情况。图48A示出了第21天的小鼠外观，图48B示出了存活情况。如图所示，仓鼠α-小鼠VISTA抗体8G8是免疫抑制性的并且强烈地减轻疾病严重性，如第21天小鼠皮毛外观所示(图48a)，并且防范GvHD诱导的致死性(图48b)。相比之下，13F3没有显示任何此类保护。因此仓鼠8G8α-小鼠VISTA是免疫抑制性的，强烈地减轻急性GvHD严重程度，从而促进长期存活。相反，13F3没有改变疾病进展。
实施例27：激动性VISTA抗体(INX901、INX902、INX903和INX904)在C57/Bl6GVHD疾病模型中的用途
我们通过测量它们在C57/Bl6GvHD模型中调节疾病进展/严重性的能力，检验了α-人VISTA抗体INX901、INX902、INX903和INX904与人Ig对照相比的免疫抑制功效。我们还通过对在处理后41天从受体小鼠取得的外周血进行流式细胞术分析来验证存活小鼠中供体T细胞和完全嵌合状态的存在。
材料和方法
从Jackson公司购买9-11周龄的雄性BALB/c受体小鼠。具有C57/Bl6背景的11周龄雄性人KI VISTA供体小鼠(DDE1)购自Sage labs公司。将所有小鼠于SPF条件下圈养在DHMC动物房中。
使受体小鼠在转移前的第-1天和第0天经受300cGy的铯-137源的全身照射(TBI)。
使供体小鼠安乐死并通过用HBSS冲洗股骨和胫骨来收获骨髓。使用ACK溶液裂解红细胞。通过阴性选择从脾中分离T细胞(Stemcell#19851)。
受体小鼠接受1000万骨髓细胞和200万T细胞以及10mg/kg的人IgG2(CrownBioscience公司，批号为AB150073)或INX901(批号为BP-021-016-2)、INX902(批号为BP-021-016-3)、INX903(批号为BP-021-016-4)或INX904(批号为BP-021-016-5)。通过尾静脉静脉内注射施用细胞和抗体。
定期对小鼠进行称重以监测疾病进展并且如果它们的体重下降低于其初始体重的75％则实施安乐死。
外周的血流式细胞术分析
在转移后41天通过眶后放血从小鼠分离外周血。
用Biolegend公司的荧光标记的针对CD45、CD11b、CD3、H2Kd(受体)和H2Kb(供体)的抗体使全血染色，然后使用BD FACS裂解溶液(#349202)裂解RBC。将细胞裂解后用PBS洗涤一次。
将标记的细胞在Miltenyi MACSquant上运行并使用FlowJo进行分析。
结果
图49A-C显示了在实验过程中每个处理组的平均(图A和图B)体重减轻和存活情况(图C)。免疫抑制性α-人VISTA抗体可以基于它们抑制或减弱疾病高峰期时的GVHD疾病严重程度(体重减轻)的影响进行排序(图49A)。
INX904(黄色)抑制性差，只有一半的小鼠存活。INX901(绿色)、INX902(红色)和INX903(橙色)具有强烈的抑制性，并且INX901具有完全保护性，完全抑制疾病，INX902和INX903强烈减轻疾病严重程度。如所示的，α-人VISTA处理的小鼠长期存活(图49B和图C)。
41天后，从存活的小鼠收获外周血，并通过针对供体(H2Kb)或受体(H2Kd)MHC I类分子进行染色来测试嵌合状态(供体来源的造血系统)。图50A示出了存活的α-人VISTA处理的小鼠的一个实例，其中与BALB/c对照的血液相比，血液中绝大多数CD11b表达供体类型的MHC I类分子。值得注意的是，仅接受骨髓细胞的8只小鼠中的4只以及用INX901处理的8只小鼠中有3只由于“移植物移入失败”而未能达到嵌合状态(图50B)，并且从分析中回顾性地移除。这种现象可以通过次优的照射剂量和INX901抑制T细胞活化的高效力来解释。众所周知，T细胞有助于移植物移入，特别是在低剂量的TBI下(“The history and future of T-cell depletion as graft-versus-host disease prophylaxis for allogeneichematopoietic stem cell transplantation”,Vincent T.Ho,Robert J.Soiffer Blood2001 98:3192-3204；doi:10.1182/blood.V98.12.3192)。100％的用INX902、INX903和INX904处理的小鼠中实现完全嵌合。在所有存活的嵌合小鼠的血液中对供体来源的T细胞进行计数。所有经α-人VISTA处理的存活嵌合小鼠在血液中的T细胞数目比仅接受骨髓细胞的小鼠高4至9倍(图50C)，从而不认可α-人VISTA抗体的耗竭作用。
因此，INX901、INX902、INX903和INX904这些α-人VISTA抗体均显示出免疫抑制活性并且部分减弱或完全抑制急性GvHD。
实施例28：α-人VISTA抗体INX901(10mg/kg)对NSG小鼠异种GvHD的作用
异种移植物抗宿主病(GvHD)的人源化小鼠模型允许体内研究人药物靶标特异性的免疫调节化合物。这些是基于注射了来自人的外周血单核细胞(PBMC)的免疫缺陷型小鼠品系。NOD-SCID IL-2Rγnull(NSG)品系缺乏成熟的T细胞、B细胞和自然杀伤细胞，并且可适于异种GvHD研究。在异种GvHD的NSG模型中，供体人T细胞在受体小鼠中强烈地扩增并影响抗宿主细胞反应性，从而导致皮肤组织浸润。小鼠体重减轻，如果不治疗将会死于GvHD。疾病进展的时间范围可以是3至5周。可通过在转移人PBMC之前用3Gy照射小鼠来加速疾病发生和进展的时间。在这种情况下，疾病在大约1-2周后开始，并且小鼠将在2-3周死于疾病。
在本文中我们描述了实验结果，其中我们检验了人VISTA特异性抗体INX901调节NSG GvHD中的疾病进展的能力。简而言之，我们照射小鼠并给小鼠注射250万个人PBMC以及单剂量的对照免疫球蛋白(Ig)或INX901。我们通过对在处理后10天从受体小鼠取得的外周血进行流式细胞术分析来验证人T细胞的存在。通过定期对小鼠进行称重来监测疾病进展。可以看出，NX901显著降低了疾病进展并增加了小鼠的存活。
材料和方法
小鼠和疾病诱导
从DHMC的Steve Fiering实验室购得7周龄的NSG小鼠，并在DHMC的SPF条件下圈养。在实验开始之前将小鼠纹标。
从DHMC献血者计划(DHMC blood donor program)的志愿捐赠者提供的血浆分离置换法沉积物(apheresis cone)中分离人外周血。
通过Ficoll梯度离心分离PBMC。
在细胞转移(DHMC)之前以3Gy照射小鼠。
六只小鼠接受在200μl PBS中的10mg/ml人IgG(Crown Bioscience公司，批号为AB150073)中稀释的250万个PBMC。六只小鼠接受在200μl PBS中的10mg/ml INX901(批号为BP-021-016-2)中稀释的250万个PBMC。经由尾静脉注射递送所有治疗剂。
定期对小鼠进行称重以监测疾病进展并且如果它们的体重下降低于其起始体重的80％则实施安乐死。
外周的血流式细胞术分析
在处理后10天通过眶后放血从小鼠分离外周血。
使细胞经历RBC裂解，彻底冲洗并采用Biolegend公司的荧光标记的抗体(抗小鼠CD45BrV421、抗小鼠CD3-APC-Cy7、抗人CD45-PE和抗人CD3-PE-Cy7)使用标准的免疫流式细胞术规程染色。
将标记的细胞在Miltenyi MACSquant上运行并使用FlowJo进行分析。
结果
图51A中的实验比较了实验过程中组内小鼠的平均体重。图51B比较了各个小鼠的体重。图52示出了处理后第10天小鼠外周血的流式细胞术分析结果。该实验显示在异种GvHD疾病模型中用INX901或对照抗体处理的NSG小鼠中的T细胞扩增，其中值表示人CD3+T细胞占小鼠外周循环中的总CD45+细胞的百分比。
这些结果表明，在INX901处理组中外周人T细胞的扩增减少，并且INX901处理组中的小鼠不像对照处理组那样快速或一致地减轻体重。这些结果提供了进一步的证据，即VISTA激动性抗体可用于治疗和预防GvHD疾病。
实施例29：仓鼠α-小鼠VISTA抗体8G8(8mg/Kg)对注射了C57/Bl6T细胞和骨髓的受照射BALB/c小鼠中的GvHD的功效
我们通过仓鼠α-小鼠VISTA抗体8G8与仓鼠IgG对照相比调节GVHD疾病进展/严重程度的能力检验了其免疫抑制功效。
材料和方法
从Jackson公司购买10周龄雄性BALB/c受体小鼠和C57/Bl6供体小鼠。将所有小鼠于SPF条件下圈养在DHMC动物房中。
使受体小鼠在转移前的第-1天和第0天经受300cGy的铯-137源的全身照射(TBI)。
使供体小鼠安乐死并通过用HBSS冲洗股骨和胫骨来收获骨髓。使用ACK溶液裂解红细胞。通过阴性选择从脾中分离T细胞(Stemcell#19851)。
受体小鼠接受1000万个骨髓细胞和200万个T细胞以及200ug仓鼠IgG(BioXcell，BE0091批号为18206/1015)或8G8(批号为AB130318-1)。通过尾静脉静脉内注射施用细胞和抗体。
定期对小鼠进行称重以监测疾病进展并且如果它们的体重下降低于其初始体重的75％则实施安乐死。
结果
图53A-C示出了实验过程中每个处理组的平均体重减轻(a)和个体体重减轻(b)以及存活情况(c)。免疫抑制性仓鼠α-小鼠VISTA抗体8G8强烈地减轻疾病高峰期(第8-10天)时的疾病严重程度并促进大多数小鼠的长期存活。具体而言，图53A示出了按组计算的平均体重减轻(每组n＝8只小鼠)；图53B示出了按组计算的个体体重减轻(每组n＝8只小鼠)，图53C示出了存活情况。这些结果表明8G8是免疫抑制性的，并且强烈地减轻急性GvHD严重程度，从而促进长期存活。这些结果提供了进一步的证据，即VISTA激动性抗体可用于治疗和预防GvHD疾病。
实施例30：α-人VISTA抗体INX902(10mg/kg、2.5mg/kg和1mg/kg)对注射了DDE1T细胞和骨髓的受照射BALB/c小鼠的GvHD的剂量功效
在这些实验中，将完全C57/Bl6人VISTA敲入小鼠(DDE1)用作转移到受照射的BALB/c受体中的T细胞和骨髓的供体。通过定期对小鼠进行称重来监测疾病进展。我们通过测量不同剂量的α-人VISTA抗体INX902以及人Ig对照调节疾病进展/严重程度的能力，检验了INX902与人Ig对照相比的免疫抑制功效。我们还通过对在处理后21天从受体小鼠取得的外周血进行流式细胞术分析来验证存活小鼠中供体T细胞和嵌合状态的存在。
材料和方法
GvHD模型和疾病严重程度评价
从Jackson公司购买10周龄的雄性BALB/c受体小鼠。具有C57/Bl6背景的14周龄雄性人KI VISTA供体小鼠(DDE1)购自Sage labs公司。将所有小鼠于SPF条件下圈养在DHMC动物房中。
使受体小鼠在转移前的第-1天和第0天经受350cGy的铯-137源的全身照射(TBI)。
使供体小鼠安乐死并通过用HBSS冲洗股骨和胫骨来收获骨髓。使用ACK溶液裂解红细胞。通过阴性选择从脾中分离T细胞(Stemcell#19851)。
受体小鼠接受1000万骨髓细胞和200万T细胞以及10mg/kg人IgG2(CrownBioscience公司，批号为AB150073)或10mg/kg、2.5mg/kg或1mg/kg的INX902(批号为：BP-021-016-3)。通过尾静脉静脉内注射施用细胞和抗体。
定期对小鼠进行称重以监测疾病进展并且如果它们的体重下降低于其初始体重的75％则实施安乐死。
外周的血流式细胞术分析
在转移后21天通过眶后放血从小鼠分离外周血。
用Biolegend公司的荧光标记的针对CD45、CD11b、CD3、H2Kd(受体)和H2Kb(供体)的抗体使全血染色，然后使用BD FACS裂解溶液(#349202)裂解RBC。将细胞裂解后用PBS洗涤一次。
将标记的细胞在Miltenyi上运行并使用FlowJo进行分析。
结果
通过转移从人VISTA-KI小鼠分离的同种异体(C57/Bl6)骨髓和脾T细胞，在受照射的BALB/c受体中诱导急性GvHD。通过跟踪体重减轻来测量疾病严重程度。
图54A-B示出了INX902处理的小鼠的平均体重减轻(A)和存活情况(B)。与对照Ig处理的小鼠相比，INX902在所有测试剂量下均减弱疾病严重程度，如通过减少的体重减轻来评估的(图54A)。在防止体重减轻(图54A)和死亡(图54B)方面，INX902在较高剂量(10m/kg)下似乎比在较低剂量下更有效。
21天后，从存活的小鼠收获外周血，并通过针对供体(H2Kb)或受体(H2Kd)MHC I类分子进行染色来测试嵌合状态(供体来源的造血系统)。图55A示出了INX902处理的小鼠中嵌合状态的百分比。在照射剂量为350cGy的情况下，所有小鼠均达到完全嵌合状态，包括仅接受骨髓细胞的那些。图55B显示与仅接受骨髓细胞的小鼠相比，INX902处理的小鼠中T细胞数目增加。具体而言，图55A-B示出了急性GvHD疾病模型中用多种剂量的INX902或对照Ig处理的存活小鼠中的嵌合状态。图55A示出了INX902处理的小鼠的血液中供体来源的CD11b的百分比，图55B示出了INX902处理的小鼠或DDE1对照小鼠的25μl血液中的供体来源的细胞数目。
因此，使用INX902激动性抗体在受照射的BALB/c受体中有效治疗急性GvHD。这些结果提供了进一步的证据，即VISTA激动性抗体可用于治疗和预防GvHD疾病。
实施例31：α-人VISTA抗体INX902和INX903(10mg/kg、2.5mg/kg和1mg/kg)对注射了DDE1T细胞和骨髓的受照射BALB/c小鼠的GvHD的剂量功效
我们通过测量不同剂量的α-人VISTA抗体INX901和INX903以及人Ig对照调节GVHD疾病进展/严重程度的能力，检验了INX901和INX903与人Ig对照相比的免疫抑制功效。我们还通过对在处理后27-34天从受体小鼠取得的外周血进行流式细胞术分析来验证存活小鼠中的嵌合状态。
材料和方法
GvHD模型和疾病严重程度评价
从Jackson公司购买9周龄的雄性BALB/c受体小鼠。具有C57/Bl6背景的12周龄雄性人KI VISTA供体小鼠(DDE1)购自Sage labs公司。将所有小鼠于SPF条件下圈养在DHMC动物房中。
使受体小鼠在转移前的第-1天和第0天经受300cGy的铯-137源的全身照射(TBI)。
使供体小鼠安乐死并通过用HBSS冲洗股骨和胫骨来收获骨髓。使用ACK溶液裂解红细胞。通过阴性选择从脾中分离T细胞(Stemcell#19851)。
受体小鼠接受1000万骨髓细胞和200万T细胞以及10mg/kg人IgG2(CrownBioscience公司，批号为AB150073)或10mg/kg、2.5mg/kg或1mg/kg的INX901(批号为BP-021-016-2)或INX903(批号为BP-021-016-4)。通过尾静脉静脉内注射施用细胞和抗体。
定期对小鼠进行称重以监测疾病进展并且如果它们的体重下降低于其初始体重的75％则实施安乐死。
外周的血流式细胞术分析
在转移后第27天(INX901)或34天(INX903)通过眶后放血从小鼠分离外周血。
用Biolegend公司的荧光标记的针对CD45、CD11b、CD3、H2Kd(受体)和H2Kb(供体)的抗体使全血染色，然后使用BD FACS裂解溶液(#349202)裂解RBC。将细胞裂解后用PBS洗涤一次。
将标记的细胞在Miltenyi MACSquant上运行并使用FlowJo进行分析。
结果
通过转移从人VISTA-KI小鼠分离的同种异体(C57/Bl6)骨髓和脾T细胞，在受照射的BALB/c受体中诱导急性GvHD。通过跟踪体重减轻来测量疾病严重性。图56A-D示出了实验过程中INX901(图56C和图56D)和INX903(图56A和图56B)处理的小鼠的平均(图56A和图56C)体重减轻和存活情况(b和d)。
与对照Ig处理的小鼠相比，INX903在所有测试剂量下减轻疾病严重性，如通过减少的体重减轻来评估的(图56A)。INX903还可在所有测试剂量下增加存活，其中最低剂量1mg/kg看起来比较高剂量更具保护性(图56B)。
与对照Ig处理的小鼠相比，INX901在所有测试剂量下完全抑制疾病，如通过不存在体重减轻来评估的(图56C)。INX901还可在所有测试剂量下增加存活，其中最低剂量1mg/kg看起来比较高剂量更具保护性(图56D)。
在27至34天后，从存活的小鼠收获外周血，并通过针对供体(H2Kb)或受体(H2Kd)MHC I类分子进行染色来测试嵌合状态(供体来源的造血系统)。
图57A示出了经INX903处理的小鼠中的嵌合状态的百分比，图57B示出了经INX901处理的小鼠中的嵌合状态的百分比。仅接受骨髓细胞的所有小鼠和几乎所有接受T细胞并且用INX901处理的小鼠由于“移植物移入失败”而未能达到嵌合状态(图57A和图57B)。这种现象可以通过次优的照射剂量和INX901抑制T细胞活化的高效力来解释。如上所述，众所周知的是T细胞有助于移植物移入，特别是在低剂量的TBI下。作为其证据，几乎所有接受T细胞并且用抑制性较低的INX903处理的小鼠中实现了完全嵌合(图57A)。
因此，INX901和INX903分别在低至1mg/kg的剂量下抑制或减弱急性GvHD。较低剂量似乎比较高剂量更有效，但死亡也可能是由于在低剂量TBI的情况下接受强免疫抑制性抗体的小鼠中的移植物移入失败。这些结果提供了进一步的证据，即VISTA激动性抗体可用于治疗和预防GvHD疾病。
实施例32：α-人VISTA抗体INX803、INX804(10mg/Kg)对注射了DDE1T细胞和骨髓的受照射BALB/c小鼠的GvHD的功效比较
在这些实验中，我们将完全C57/Bl6人VISTA敲入小鼠(DDE1)用作转移到受照射的BALB/c受体中的T细胞和骨髓的供体。通过定期对小鼠进行称重来监测疾病进展。我们通过测量它们调节疾病进展/严重性的能力，检验了α-人VISTA抗体INX803和INX804与人Ig对照相比的免疫抑制功效。
材料和方法
GvHD模型和疾病严重程度评价
从Jackson公司购买9周龄的雄性BALB/c受体小鼠。具有C57/Bl6背景的10周龄雄性人KI VISTA供体小鼠(DDE1)购自Sage labs公司。将所有小鼠于SPF条件下圈养在DHMC动物房中。
使受体小鼠在转移前的第-1天和第0天经受350cGy的铯-137源的全身照射(TBI)。
使供体小鼠安乐死并通过用HBSS冲洗股骨和胫骨来收获骨髓。使用ACK溶液裂解红细胞。通过阴性选择从脾中分离T细胞(Stemcell#19851)。
受体小鼠接受1000万骨髓细胞和200万T细胞以及10mg/kg人IgG2(CrownBioscience公司，批号为AB150073)或INX803(批号为BP-018-016)、INX804(批号为BP-019-016)。通过尾静脉静脉内注射施用细胞和抗体。
定期对小鼠进行称重以监测疾病进展并且如果它们的体重下降低于其初始体重的75％则实施安乐死。
结果
图58A-C显示了实验过程中每个处理组的平均体重减轻(图58A)和个体体重减轻(图58B)以及存活情况(图58C)。INX803(绿色)是强烈抑制性的，抑制疾病发展并完全保护小鼠。INX804可减弱疾病高峰时的疾病严重程度，但未能长期为小鼠提供完全保护，其中一半最终死于GvHD。因此，所测α-人VISTA抗体在其减弱或完全抑制急性GvHD的能力方面显示出免疫抑制活性。这些结果提供了进一步的证据，即抗人VISTA激动性抗体可用于治疗和预防GvHD疾病。
实施例33：α-人VISTA抗体INX800和INX801对注射了DDE1T细胞和骨髓的受照射BALB/c小鼠的GvHD的功效
在这些实验中，我们再次将完全C57/Bl6人VISTA敲入小鼠(DDE1)用作转移到受照射的BALB/c受体中的T细胞和骨髓的供体。通过定期对小鼠进行称重来监测疾病进展。我们通过测量调节疾病进展/严重性的能力，检验了与人Ig对照相比，10mg/kg的α-人VISTA抗体INX800和INX801的免疫抑制功效。
材料和方法
GvHD模型和疾病严重程度评价
从Jackson公司购买9周龄的雄性BALB/c受体小鼠。具有C57/Bl6背景的12周龄雄性人KI VISTA供体小鼠(DDE1)购自Sage labs公司。将所有小鼠于SPF条件下圈养在DHMC动物房中。
使受体小鼠在转移前的第-1天和第0天经受300cGy的铯-137源的全身照射(TBI)。
使供体小鼠安乐死并通过用HBSS冲洗股骨和胫骨来收获骨髓。使用ACK溶液裂解红细胞。通过阴性选择从脾中分离T细胞(Stemcell#19851)。
受体小鼠接受500万骨髓细胞和160万T细胞以及10mg/kg人IgG2(CrownBioscience公司，批号为AB150073)、10mg/kg的INX800或INX801。通过尾静脉静脉内注射施用细胞和抗体。
定期对小鼠进行称重以监测疾病进展并且如果它们的体重下降低于其初始体重的80％则实施安乐死。
结果
INX800和INX801小鼠二者的体重减轻均低于对照处理组(图59)。事实上，来自对照组的所有小鼠必须在2周内处死，而用INX800或INX801处理的所有小鼠则存活>32(图59)。在该实验中，通过将T细胞和BM从hV-KI小鼠转移到经照射的Balb/c受体中诱导急性GvHD。通过体重减轻跟踪小鼠的疾病，如果体重减轻超过初始起始体重的20％则处死小鼠。
因此，10mg/kg的剂量下INX800和INX801二者均减弱急性GvHD。与Ig对照组相比，这些小鼠体重减轻较少并且存活增加。这些结果提供了进一步的证据，即抗人VISTA激动性抗体可用于治疗和预防急性和慢性形式的GvHD疾病。
实施例34：抗鼠VISTA抗体在NZBWF-1狼疮模型中的作用
NZBWF-1狼疮模型
新西兰黑小鼠×新西兰白小鼠(NZBWF-1)是市售的狼疮易感品系，可通过TheJackson Laboratory公司获得。这些小鼠自发地发展类似于全身性红斑狼疮(SLE)患者的狼疮，在雌性小鼠中流行。疾病的标志包括蛋白尿、肾小球肾炎的发作、自身反应性抗体诸如双链DNA抗体的水平升高、溶血性贫血以及肾脏中的免疫复合物沉积。在细胞水平，已经报道了T细胞、B细胞和骨髓细胞异常。
在这些实验中，我们检验了8G8(一种仓鼠α小鼠VISTA抗体)在雌性NZBWF-1小鼠中的功能。每周三次用对照Ig或8G8处理小鼠。每周监测小鼠的蛋白尿和体重。在处理期间每两周收集血清。在实验结束时，收获血清、脾脏和肾脏。将血清储存在-80℃下直至Luminex测定法需要。
处理脾脏以供流式细胞术分析、细胞分选，或在OCT中快速冷冻以供免疫荧光染色和RNA分离(用于基因分析和nanoString分析)。将一个肾脏在OCT中快速冷冻以供免疫荧光染色和RNA分离(用于基因谱分析和nanoString分析)。固定第二个肾脏并用石蜡包埋。将石蜡切片进行H-E染色以供临床病理学分析。
材料和方法
小鼠处理
从Jackson公司购买8周龄雌性NZBWF-1小鼠并在DHMC的SPF条件下存放。
在Dartmouth Hitchcock实验动物设施中每周监测蛋白尿和体重。
通过腹膜内注射每周三次以300μg/小鼠施用对照IgG/仓鼠Ig或8G8。
根据动物设施规程，在健康状况不佳和活动减少的情况下处死小鼠。
蛋白尿
化学测试条10购自罗氏公司(Roche)。从小鼠收集尿液并置于化学测试条上。为了测定尿液中的蛋白质，使用以下比色标度：0mg/dL、痕量(1mg/dL)、30mg/dL、100mg/dL和500mg/dL。
血清分析
收集血清并储存在-80℃下直至需要。使用32Milliplex小鼠细胞因子/趋化因子磁珠板(32Milliplex Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel)(密理博公司)测定趋化因子和细胞因子水平，并在Bio-plex 200系统(伯乐公司(Bio Rad)生命科学研究部(Life Science Research))上运行该测定法。使用Bio-Plex Manager 6.0软件分析数据。
临床病理学
将肾脏置于盒中并在室温下在10％福尔马林中固定过夜，然后在PBS中简单洗涤，转移并保存在70％乙醇(飞世尔科技公司)中，然后转移至达特茅斯盖瑟医学院的病理转化研究中心，在这里将它们进行石蜡包埋、切片然后染色。
使用Leica BOND RX自动染色机将石蜡包埋的组织切片(4μm)染色。脱蜡后，对切片进行抗原修复(Bond表位修复溶液2，100℃，20分钟)，并在室温下在Leica稀释剂中与一抗一起温育(参见下面的稀释度)30-60分钟。然后将载玻片在PBS中洗涤3次，每次5分钟，并与二抗(来自Leica Bond Refine检测试剂盒，DS9800)一起温育。在PBS中最后洗涤3次后，将切片与DAB(Leica Bond聚合物检测试剂盒)一起温育、漂洗、用苏木精复染并封片。
将由病理学家评估临床病理学。
结果
该实验设计用于检验8G8是否介导雌性NZBWF-1小鼠中的免疫抑制作用。从16周龄开始每周一次监测小鼠的蛋白尿发展。在第32周(检测到蛋白尿后一周)通过腹膜内注射每周三次用300μg的仓鼠Ig或8G8处理小鼠。在第33周，仓鼠Ig组中的所有小鼠由于健康状况不佳而被处死，并且收集脾、肾和血浆。如图60所示，8G8组中的小鼠显示出更好的健康状况和减少的蛋白尿。
为了确定8G8对血浆中的介质的作用，运行32重小鼠细胞因子/趋化因子磁性Luminex测定法。检测到LIX/CXCL5的显著减少和IL-9的增加(图61)。具体而言，如图61中所示，检测了经对照Ig和8G8处理的NZBWF-1小鼠的血清中的LIX/CXCL5和IL-9水平。在第33周从对照IgG(n＝5)和8G8小鼠(n＝5)收集血清，并使用Bio-plex 200系统运行32重测定法(32plex)评估趋化因子和细胞因子，并通过Bio Plex manager 6.0软件分析。数据显示为平均值+/-SEM，统计显著性由未配对Student t检验测定。在图61中，**表示组之间的显著性(p<0.01)。
LIX/CXCL5的减少是值得注意的，因为其表达受IL-17调节并且是狼疮中的致病细胞因子。其还与SLE中的中性粒细胞募集和加速的动脉粥样硬化相关(Nalbandian等，“Interleukin-17and systemic lupus erythematosus:current concepts”,Clinicaland Experimental Immunology.2009；157(2):209-15；Lopez-Pedrera等，“Acceleratedatherosclerosis in systemic lupus erythematosus:role of proinflammatorycytokines and therapeutic approaches”,Journal of Biomedicine&Biotechnology,2010，文章ID为607084)。IL-9的增加表明8G8可促进抗炎环境，因为IL-9可以在减少SLE中的炎症中发挥作用(Leng等，“Potential roles of IL-9in the pathogenesis ofsystemic lupus erythematosus”,American Journal of Clinical and ExperimentalImmunology 2012；1(1):28-32)。
结论
激动性抗VISTA抗体激动性8G8改善了存活情况、增加了保护性抗炎细胞因子以及减少了炎性细胞因子并进一步减少了蛋白尿的发展(图60、图61)。这些结果表明，激动性抗VISTA抗体可用于治疗或预防狼疮以及用于管理狼疮的病理性副作用诸如其对肾功能的有害作用以及用于增强存活。
实施例35：抗小鼠VISTA抗体在NZBWF-1狼疮模型中的作用
NZBWF-1狼疮模型
上文描述了NZBWF-1狼疮模型。在使用NZBWF-1狼疮模型的这组实验中，我们再次检验了8G8(一种仓鼠α小鼠VISTA抗体)在雌性NZBWF-1小鼠中的功能。每周三次用对照Ig或8G8处理小鼠。每周监测小鼠的蛋白尿和体重。在处理期间每两周收集血清。在实验结束时，收获血清、脾脏和肾脏。将血清储存在-80℃下直至Luminex测定法需要。
处理脾脏以供流式细胞术分析、细胞分选，或在OCT中快速冷冻以供免疫荧光染色和RNA分离(用于基因分析和nanoString分析)。将一个肾脏在OCT中快速冷冻以供免疫荧光染色和RNA分离(用于基因谱分析和nanoString分析)。固定第二个肾脏并用石蜡包埋。将石蜡切片进行H-E染色以供临床病理学分析。
材料和方法
小鼠处理
从Jackson公司购买8周龄雌性NZBWF-1小鼠，并在DHMC的SPF条件下存放。
在Dartmouth Hitchcock实验动物设施中每周监测蛋白尿和体重。
通过腹膜内注射每周三次以300μg/小鼠施用对照IgG/仓鼠Ig或8G8。
根据动物设施规程，在健康状况不佳和活动减少的情况下处死小鼠。
蛋白尿
化学测试条10购自罗氏公司。从小鼠收集尿液并置于化学测试条上。为了测定尿液中的蛋白质，使用以下比色标度：0mg/dL、痕量(1mg/dL)、30mg/dL、100mg/dL和500mg/dL。
血清分析
收集血清并储存在-80℃下直至需要。使用32Milliplex小鼠细胞因子/趋化因子磁珠板(32Milliplex Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel)(密理博公司)测定趋化因子和细胞因子水平，并在Bio-plex 200系统(伯乐公司生命科学研究部)上运行该测定法。使用Bio-Plex Manager 6.0软件分析数据。
髓源性抑制细胞分离试剂盒
使用来自Miltenyi Biotec公司的髓源性抑制细胞分离试剂盒(Myeloid-DerivedSuppressor Cell Isolation Kit)根据制造商的说明分离髓源性抑制细胞(MDSC)。
RNA分离和nanoString
使用Trizol(生命科技公司(Life Technologies))和PureLink RNA Mini试剂盒(Ambion公司)从MDSC分离RNA。在小鼠炎症nanoString 12测定法(nanoString科技公司(nanoString Technologies))上运行RNA，并使用nSolver分析软件对数据进行定量。
临床病理学
将肾脏置于盒中并在室温下在10％福尔马林中固定过夜，然后在PBS中简单洗涤，转移并保存在70％乙醇(飞世尔科技公司)中，然后转移至达特茅斯盖瑟医学院的病理转化研究中心，在这里将它们进行石蜡包埋、切片然后染色。
使用Leica BOND RX自动染色机将石蜡包埋的组织切片(4μm)染色。脱蜡后，对切片进行抗原修复(Bond表位修复溶液2，100℃，20分钟)，并在室温下在Leica稀释剂中与一抗一起温育(参见下面的稀释度)30-60分钟。然后将载玻片在PBS中洗涤3次，每次5分钟，并与二抗(来自Leica Bond Refine检测试剂盒，DS9800)一起温育。在PBS中最后洗涤3次后，将切片与DAB(Leica Bond聚合物检测试剂盒)一起温育、漂洗、用苏木精复染并封片。
将由病理学家评估临床病理学。
结果
该实验设计用于检验8G8是否介导雌性NZBWF-1小鼠中的免疫抑制作用。从22周龄开始每周一次监测小鼠的蛋白尿发展。在第28周(检测到蛋白尿后一周)通过腹膜内注射每周三次用300μg的仓鼠Ig或8G8处理小鼠。对照组中的疾病严重程度持续增加，而8G8组中的小鼠显示蛋白尿水平降低(图62)。
如图所示，激动性抗VISTA抗体8G8减少了蛋白尿的发展(图62)。
实施例36：在I MRL/lpr狼疮模型中评价抗VISTA抗体
I MRL/lpr狼疮动物模型
如上所述，MRL/lpr是市售的狼疮易感品系，可通过The Jackson Laboratory公司获得。由于Fas的自发突变(Faslpr)，这些小鼠显示出淋巴组织增生的迹象。疾病的标志包括免疫复合物肾小球肾炎和高水平的循环免疫复合物。还已报道了T细胞室中的异常。在该实验中，我们检验了8G8(一种仓鼠α小鼠VISTA抗体)在雌性MRL/lpr小鼠中的功能。每周三次用对照Ig/仓鼠Ig或8G8处理小鼠。每周监测小鼠的蛋白尿和体重。在处理期间每两周收集血清。在实验结束时，收获血清、脾脏和肾脏。将血清储存在-80℃下直至Luminex测定法需要。处理脾脏和淋巴结以供细胞分选，或在OCT中快速冷冻以供免疫荧光染色和RNA分离(用于基因分析和nanoString分析)。将一个肾脏在OCT中快速冷冻以供免疫荧光染色和RNA分离(用于基因谱分析和nanoString分析)。固定第二个肾脏并用石蜡包埋。将石蜡切片进行H-E染色以供临床病理学分析。
材料和方法
小鼠处理
从Jackson公司购买12周龄雌性NZBWF-1小鼠，并在DHMC的SPF条件下存放。
在Dartmouth Hitchcock实验动物设施中每周监测蛋白尿和体重。
通过腹膜内注射每周三次以300μg/小鼠施用对照Ig/仓鼠Ig或8G8。
当蛋白尿为500mg/dL时处死小鼠。
蛋白尿
化学测试条10购自罗氏公司。从小鼠收集尿液并置于化学测试条上。为了测定尿液中的蛋白质，使用以下比色标度：0mg/dL、痕量(1mg/dL)、30mg/dL、100mg/dL和500mg/dL。
血清分析
收集血清并储存在-80℃下直至需要。使用32Milliplex小鼠细胞因子/趋化因子磁珠板(32Milliplex Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel)(密理博公司)测定趋化因子和细胞因子水平，并在Bio-plex 200系统(伯乐公司生命科学研究部)上运行该测定法。使用Bio-Plex Manager 6.0软件分析数据。
RNA分离和nanoString
使用Trizol(生命科技公司)和PureLink RNA Mini试剂盒(Ambion公司)分离RNA。在小鼠炎症nanoString 12测定法(nanoString科技公司)上运行RNA，并使用nSolver分析软件对数据进行定量。
临床病理学
将肾脏置于盒中并在室温下在10％福尔马林中固定过夜，然后在PBS中简单洗涤，转移并保存在70％乙醇(飞世尔科技公司)中，然后转移至达特茅斯盖瑟医学院的病理转化研究中心，在这里将它们进行石蜡包埋、切片然后染色。
使用Leica BOND RX自动染色机将石蜡包埋的组织切片(4μm)染色。脱蜡后，对切片进行抗原修复(Bond表位修复溶液2，100℃，20分钟)，并在室温下在Leica稀释剂中与一抗一起温育(参见下面的稀释度)30-60分钟。然后将载玻片在PBS中洗涤3次，每次5分钟，并与二抗(来自Leica Bond Refine检测试剂盒，DS9800)一起温育。在PBS中最后洗涤3次后，将切片与DAB(Leica Bond聚合物检测试剂盒)一起温育、漂洗、用苏木精复染并封片。
将由病理学家评估临床病理学。
结果
该实验设计用于检验8G8是否介导雌性MRL/lpr小鼠中的免疫抑制作用。从15周龄开始每周一次监测小鼠的蛋白尿发展。在第16周，通过腹膜内注射每周三次用300μg的仓鼠Ig或8G8处理小鼠。为了确定8G8对血浆中的介质的作用，收集血浆并储存在-80℃下。收获脾脏和淋巴结并快速冷冻以供免疫荧光染色和RNA分离。激动性抗VISTA抗体8G8降低了以高蛋白尿水平为特征的疾病发展的发生率(参见图63)。
如图63所示，激动性抗小鼠VISTA抗体8G8在实验中可减少MRL/lpr小鼠中的蛋白尿发展，其中每周监测15周龄雌性MRL/lpr小鼠的蛋白尿。使用化学测试条记录蛋白尿值并定量为mg/dL。在第16周，通过腹膜内注射每周三次用300ug仓鼠IgG(黑色线条，n＝8)或300ug 8G8(红色线条，n＝8)处理小鼠。由于化学测试条的技术问题，第21周的数据被丢弃。(图63A)示出了带标准误差条的蛋白尿平均值。(图63B)每个时间点的疾病发生率计算为每组中表现出等于或大于100mg/dL的蛋白尿的小鼠的百分比。因此，8G8降低了以高蛋白尿水平为特征的疾病发展的发生率。
如图64中所示，8G8还在实验中减少MRL/lpr小鼠的脾肿大，在该实验中在第23周从每周三次通过腹膜内注射用300ug对照Ig/仓鼠Ig或300ug 8G8处理的小鼠收获脾脏。与8G8处理的小鼠相比，在对照Ig处理的小鼠中观察到脾肿大。(代表性脾脏在图中示出)。
如图65中进一步所示，8G8还在实验中减少MRL/lpr小鼠的颈部淋巴结的淋巴组织增生，在该实验中在第23周从每周三次用300ug对照Ig/仓鼠Ig或300ug 8G8通过腹膜内注射处理的小鼠收获颈部淋巴结。与8G8处理的小鼠相比，在对照Ig处理的小鼠中观察到淋巴组织增生。这里显示的是代表性的颈部淋巴结。
这些结果还表明，激动性抗VISTA抗体可用于治疗或预防狼疮以及用于管理狼疮的病理性副作用诸如其对肾功能、对脾脏以及对病理性淋巴组织增生的有害作用。
实施例37：在I MRL/lpr狼疮模型中评价抗VISTA抗体
I MRL/lpr狼疮动物模型
上文描述了MRL/lpr狼疮模型。在该实验中，我们再次检验了8G8(一种仓鼠α小鼠VISTA抗体)在雌性MRL/lpr小鼠中的作用。每周三次用PBS、对照Ig/仓鼠Ig或8G8处理小鼠。每周监测小鼠的蛋白尿和体重。在处理期间每两周收集血清。在实验结束时，收获血清、淋巴结、脾脏和肾脏。将血清储存在-80℃下。将器官固定并进行石蜡包埋。将石蜡切片进行H-E染色以供临床病理学分析。
材料和方法
小鼠处理
从Jackson公司购买8周龄雌性MRL/lpr小鼠并在DHMC的SPF条件下存放。
在Dartmouth Hitchcock实验动物设施中每周监测蛋白尿和体重。
从第11周开始通过腹膜内注射每周三次给每只小鼠施用10mg/kg的对照Ig/仓鼠Ig或8G8或200μl PBS。
当蛋白尿为500mg/dL时处死小鼠。
蛋白尿
化学测试条10购自罗氏公司。从小鼠收集尿液并置于化学测试条上。为了测定尿液中的蛋白质，使用以下比色标度：0mg/dL、痕量(1mg/dL)、30mg/dL、100mg/dL和500mg/dL。
血清分析
收集血清并储存在-80℃下直至需要。
临床病理学
将肾脏置于盒中并在室温下在10％福尔马林中固定过夜，然后在PBS中简单洗涤，转移并保存在70％乙醇(飞世尔科技公司)中，然后转移至达特茅斯盖瑟医学院的病理转化研究中心，在这里将它们进行石蜡包埋、切片然后染色。
使用Leica BOND RX自动染色机将石蜡包埋的组织切片(4μm)染色。脱蜡后，对切片进行抗原修复(Bond表位修复溶液2，100℃，20分钟)，并在室温下在Leica稀释剂中与一抗一起温育(参见下面的稀释度)30-60分钟。然后将载玻片在PBS中洗涤3次，每次5分钟，并与二抗(来自Leica Bond Refine检测试剂盒，DS9800)一起温育。在PBS中最后洗涤3次后，将切片与DAB(Leica Bond聚合物检测试剂盒)一起温育、漂洗、用苏木精复染并封片。
将由病理学家评估临床病理学。
结果
该实验设计用于检验8G8是否介导雌性MRL/lpr小鼠中的免疫抑制作用。从9周龄开始每周一次监测小鼠的蛋白尿发展。在第11周，通过腹膜内注射每周三次用200μl PBS或10mg/kg的仓鼠Ig或8G8处理小鼠。为了确定8G8对血浆中的介质的作用，收集血浆并储存在-80℃下。
因此，VISTA激动剂8G8降低了以高蛋白尿水平为特征的疾病发展的发生率(参见图66)。在实验中，每周监测9周龄雌性MRL/lpr小鼠的蛋白尿。使用化学测试条记录蛋白尿值并定量为mg/dL。在第11周，通过腹膜内注射每周三次用200μl PBS(黑色虚线，n＝8)或10mg/kg仓鼠Ig(实心黑线，n＝8)或10mg/kg 8G8(红色线条，n＝2)处理小鼠。(图66A)示出了带标准误差条的蛋白尿平均值。(图66B)每个时间点的疾病发生率计算为每组中表现出等于或大于100mg/dL的蛋白尿的小鼠的百分比。
这些结果还表明，激动性抗VISTA抗体可用于治疗或预防狼疮以及用于管理狼疮的病理性副作用诸如其对肾功能的有害作用。
实施例38：全身性红斑狼疮的小鼠模型中抗人VISTA激动性抗体INX903对疾病诱导的作用
在本实验中，我们测试了抗人VISTA激动性抗体在可公认的狼疮模型中的作用。在该小鼠模型中，通过将人VISTA敲入DDE1CD8耗竭型脾细胞(供体)转移到B6D2F1宿主(受体)中来诱导SLE。此外在该模型中，供体CD4T细胞多克隆活化可驱动同源宿主B细胞活化、扩增以及它们产生导致肾病的自身抗体。
该狼疮动物模型满足11个美国风湿病学会(American College ofRheumatology,ACR)狼疮标准(“Systemic lupus erythematosus”；Tsokos GC.N Engl JMed.2011Dec 1；365(22):2110-21)中的4个。转移了B6CD8耗竭型细胞的B6D2F1模型的狼疮样特征包括：(1)免疫复合物性肾小球肾炎；(2)抗核抗体；(3)抗dsDNA抗体；(4)抗RBC抗体(库姆斯测试(Coombs)阳性)。此外，该模型符合肾脏疾病严重性基于性别的差异。
更具体地，我们测试了INX903(人抗人VISTA-IgG2)的作用，其中在SLE诱导的早期阶段进行处理。本领域公认的是，两周表型能可靠地预测长期临床表型并且可以充当长期疾病的早期替代标志(“Advances in lupus stemming from the parent-into-F1model”.Via CS.Trends Immunol.，2010年6月，31(6):236-45)。
材料和方法
研究设计
汇总实验参数的示意图包含在图67中。如其中所示，在DDE1转移后第0、2和6天施用INX903(含有VSTB95抗体可变区的抗人IgG2激动性抗体)。在每个时间点，分析每组4只小鼠加1只未处理小鼠。处理脾脏用于流式细胞术，并从心脏血液回收血清用于通过ELISA检测抗dsDNA IgG。
小鼠
人VISTA KI(DDE1)小鼠具有敲入的人VISTA cDNA代替小鼠VISTA基因，并且仅在RNA和蛋白质水平上表达人VISTA。小鼠在宾夕法尼亚州博耶敦市的Sage Labs公司繁育。将8-12周龄的小鼠首先在检疫设施中过渡3周，然后转移到我们的常规设施。使用4个月大的雌性DDE1小鼠。从Jackson Lab公司购得9周龄雌性B6D2F1小鼠。
脾细胞分离和转移
每个B6D2F1小鼠受体转移1个DDE1供体脾脏的等价物。
通过机械破碎从36个DDE1脾制备单细胞悬浮液。用ACK裂解红细胞。
根据制造商的说明，使用Mouse CD8(Lyt 2)(赛默飞公司(Thermofisher)，编号为11447D)耗竭CD8T细胞。
为了跟踪细胞增殖，根据制造商的说明，用Cell Trace Violet(CellTraceTMViolet细胞增殖试剂盒，用于流式细胞术(赛默飞公司，编号为C34557))对脾细胞染色。
获得总共1,230×106个CD8耗竭的脾细胞。
每只B6D2F1小鼠接受34×106个CD8耗竭的脾细胞，每尾静脉注射(iv)200μl体积。
抗人VISTA抗体及剂量
INX903以10mg/kg的剂量给予。
在第0天，在静脉内注射转移到受体B6D2F1小鼠之前，将抗体直接添加到细胞悬浮液中。
然后经由腹膜内(ip)注射在第2天和第6天给小鼠给药。
对照组接受人IgG2(批号AB150073–4.7mg/mL)。
处理组接受INX903(批号BP-021-016-4–6mg/mL)。
通过流式细胞术分析免疫细胞
在供体细胞转移后第1、3、7和14天，通过流式细胞术评价脾上的供体CD4T细胞活化、增殖、积聚以及宿主B细胞活化和积聚。在每个时间点分析每组四只动物+1只未处理小鼠。将脾脏机械破碎，用ACK缓冲液裂解RBC，并使用Cellometer自动细胞计数系统和AOPI评价总的有活力的有核细胞数量。如下所示，用以下组合对200万个细胞进行染色：
第1天
后面的日子：
使样品在MacsQuant流式细胞仪上运行并用FlowJo程序分析。
供体CD4T细胞鉴定为活的CD4+B220-H2Kb+H2Kd-，并分析活化标志物表达(CD69或CD25)和增殖(Cell Trace Violet稀释)。通过应用供体CD4T细胞占脾中总活细胞数的百分比来计算每个脾脏的供体CD4细胞数。
受体B细胞鉴定为活的CD4-B220+H2Kb+H2Kd+，并分析MHC II类分子表达。在每个时间点，未处理的B6D2F1用于基础MHC II类分子表达比较。通过应用宿主B细胞占脾中总活细胞数的百分比来计算每个脾脏的受体B细胞数。
抗双链DNA抗体检测
在第7天和第14天使用来自Alpha Diagnostic公司的ELISA试剂盒(目录号为5120)根据制造商的说明定量血清中的抗dsDNA IgG。
受体和供体细胞群的鉴定
如图68所示，通过转移DDE1脾细胞(减去CD8+细胞)产生的SLE小鼠显示存在供体和受体B细胞和CD4T细胞二者。供体CD4T细胞鉴定为活的、CD4+B220-H2Kb+H2Kd-。受体B细胞鉴定为活的、CD4-B220+H2Kb+H2Kd+。在图68的实验中，供体和宿主细胞群通过它们的MHC I类等位基因来区分。宿主B6D2F1细胞表达H-2Kb和H-2Kd二者，而供体DDE1细胞仅表达H-2Kb。
INX903导致SLE疾病进展减少
为了确定抗VISTA激动性抗体INX903是否可以影响早期疾病进展，我们评价了受体B细胞活化、dsDNA抗体的产生、CD4T细胞活化和增殖。结果显示INX903施用可导致受体B细胞活化和积聚减少并导致脾肿大。人IgG2(人IgG2)处理组中移植后MHC II类IAd随时间推移表达增加证明了B细胞活化，而在INX903处理组中没有观察到IAd的变化，其似乎与未处理小鼠相似。这些结果如图69A中所示。需要注意的是，这是一种间接作用，因为来自受体小鼠的B细胞不表达人VISTA，因此不能直接对INX903作出应答。
人IgG2(人IgG2)处理组中移植后的B细胞逐渐扩增(在第14天达到正常F1值的200％并且导致轻度脾肿大)在INX903处理组中也被阻止(参见图69B和C)。图中的数据进一步显示通过INX903处理也防止了SLE进展期间的B细胞活化。图69A含有受体B细胞上MHC IIIAd表达的直方图。图69B示出了实验过程中受体B细胞和脾细胞的总数以及实验过程中受体B细胞上的II类MHC IAd的MFI(n＝4,SEM)。图69C示出了第14天时经处理的动物的脾脏大小。
图70中的实验数据进一步证明，INX903施用可导致抗dsDNA自身抗体产生减少。在这些实验中，在第7天和第14天在未处理小鼠(n＝2)和人IgG2或INX903处理的小鼠(n＝4,SEM)中通过ELISA测量血清中的抗dsDNA IgG滴度。图71中的实验数据另外还表明，INX903施用可导致T细胞活化和增殖减少。如其中所示，CD69表达在早期时间点降低。具体而言，可以看出，在INX903处理的CD4T细胞(n＝4)中第1天CD69表达降低。
图72和图73中的实验数据进一步表明，转移后供体CD4+T细胞的积聚持续减少。尽管以与人IgG2处理组相同的频率进行分组，但INX903处理的小鼠中CD4T细胞随时间推移而显著降低(n＝4)。这些实验结果表明，施用示例性的抗人VISTA激动性抗体导致以下结果：(I)T细胞增殖和活化减少(这是唯一可用的可跟踪疾病起始的T细胞的模型)；(ii)同源B细胞活化(MHCII表达)和积聚减少；(iii)脾肿大减少以及(iv)抗dsDNA IgG自身抗体产生减少。
虽然是在相对短的持续时间后观察，但这些结果是显著的，因为在该模型中，已知2周表型能可靠地预测长期临床表型并且可充当长期疾病的早期替代标志物。
实施例39：α-小鼠VISTA抗体8G8对全身性红斑狼疮-MRL/lpr-SCD8G8MRL1的作用
在该实验中，我们再次检验了8G8(一种仓鼠抗小鼠VISTA激动性抗体)在雌性MRL/lpr小鼠中的作用。每周三次用对照Ig/仓鼠Ig或8G8处理小鼠。每周监测小鼠的蛋白尿和体重。在处理期间每两周收集血清。在实验结束时，收获血清、脾脏和肾脏。将血清储存在-80℃下直至需要进行luminex测定法。处理脾脏和淋巴结以供细胞分选，或在OCT中快速冷冻以供免疫荧光染色和RNA分离(用于基因分析和nanoString分析)。将一个肾脏在OCT中快速冷冻以供免疫荧光染色和RNA分离(用于基因谱分析和nanoString分析)。固定第二个肾脏并进行石蜡包埋。将石蜡切片进行H-E染色以供临床病理学分析。
材料和方法
小鼠处理
从Jackson公司购买12周龄雌性NZBWF-1小鼠并在DHMC的SPF条件下存放。
在Dartmouth Hitchcock实验动物设施中每周监测蛋白尿和体重。
通过腹膜内注射每周三次以300μg/小鼠施用对照Ig/仓鼠Ig或8G8。
当蛋白尿为500mg/dL时处死小鼠。
蛋白尿
化学测试条10购自罗氏公司。从小鼠收集尿液并置于化学测试条上。为了测定尿液中的蛋白质，使用以下比色标度：0mg/dL、痕量(1mg/dL)、30mg/dL、100mg/dL和500mg/dL。
血清分析
收集血清并储存在-80℃下直至需要。使用32Milliplex小鼠细胞因子/趋化因子磁珠板(32Milliplex Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel)(密理博公司)测定趋化因子和细胞因子水平，并在Bio-plex 200系统(伯乐公司生命科学研究部)上运行该测定法。使用Bio-Plex Manager 6.0软件分析数据。
RNA分离和nanoString
使用Trizol(生命科技公司)和PureLink RNA Mini试剂盒(Ambion公司)分离RNA。在小鼠炎症nanoString 12测定法(nanoString科技公司)上运行RNA，并使用nSolver分析软件对数据进行定量。
临床病理学
将肾脏置于盒中并在室温下在10％福尔马林中固定过夜，然后在PBS中简单洗涤，转移并保存在70％乙醇(飞世尔科技公司)中，然后转移至达特茅斯盖瑟医学院的病理转化研究中心，在这里将它们进行石蜡包埋、切片然后染色。
使用Leica BOND RX自动染色机将石蜡包埋的组织切片(4μm)染色。脱蜡后，对切片进行抗原修复(Bond表位修复溶液2，100℃，20分钟)，并在室温下在Leica稀释剂中与一抗一起温育(参见下面的稀释度)30-60分钟。然后将载玻片在PBS中洗涤3次，每次5分钟，并与二抗(来自Leica Bond Refine检测试剂盒，DS9800)一起温育。在PBS中最后洗涤3次后，将切片与DAB(Leica Bond聚合物检测试剂盒)一起温育、漂洗、用苏木精复染并封片。
由病理学家评估临床病理学。
结果
从15周龄开始每周一次监测小鼠的蛋白尿发展。在第16周，通过腹膜内注射每周三次用300μg的仓鼠Ig或8G8处理小鼠。为了确定8G8对血浆中的介质的作用，收集血浆并储存在-80℃下。收获脾脏和淋巴结并快速冷冻以供免疫荧光染色和RNA分离。如图74A-B所示，8G8可减少MRL/lpr小鼠中的蛋白尿发展。在这些实验中，每周监测15周龄雌性MRL/lpr小鼠的蛋白尿。使用化学测试条记录蛋白尿值并定量为mg/dL。在第16周，通过腹膜内注射每周三次用300ug仓鼠IgG(黑色线条，n＝8)或300ug 8G8(红色线条，n＝8)处理小鼠。由于化学测试条的技术问题，第21周的数据被丢弃。(图74A)示出了带标准误差条的蛋白尿平均值。(图74B)每个时间点的疾病发生率计算为每组中表现出等于或大于100mg/dL的蛋白尿的小鼠的百分比。
如图75中进一步所示，8G8施用还可减少MRL/lpr小鼠中的脾肿大。在这些实验中，在第23周从每周三次通过腹膜内注射用300ug对照Ig/仓鼠Ig或300ug 8G8处理的小鼠收获脾脏。与8G8处理的小鼠相比，在对照Ig处理的小鼠中观察到脾肿大。这里显示的是代表性的脾脏。
如图76中进一步所示的，8G8施用也可减少MRL/lpr小鼠颈部淋巴结的淋巴组织增生。在这些实验中，在第23周从每周三次通过腹膜内注射用300ug对照Ig/仓鼠Ig或300ug8G8处理的小鼠收获颈部淋巴结。与8G8处理的小鼠相比，在对照Ig处理的小鼠中观察到淋巴组织增生。
实施例40：α-小鼠VISTA抗体8G8对全身性红斑狼疮(新西兰黑小鼠×新西兰白小鼠(NZBWF-1小鼠))的作用
我们检验了8G8(一种仓鼠α小鼠VISTA抗体)在雌性NZBWF-1小鼠中的功能。每周三次用对照Ig或8G8处理小鼠。每周监测小鼠的蛋白尿和体重。在处理期间每两周收集血清。在实验结束时，收获血清、脾脏和肾脏。将血清储存在-80℃下直至需要进行luminex测定法。
处理脾脏以供流式细胞术分析、细胞分选，或在OCT中快速冷冻以供免疫荧光染色和RNA分离(用于基因分析和nanoString分析)。将一个肾脏在OCT中快速冷冻以供免疫荧光染色和RNA分离(用于基因谱分析和nanoString分析)。固定第二个肾脏并进行石蜡包埋。将石蜡切片进行H-E染色以供临床病理学分析。
材料和方法
小鼠处理
从Jackson公司购买8周龄雌性NZBWF-1小鼠并在DHMC的SPF条件下存放。
在Dartmouth Hitchcock实验动物设施中每周监测蛋白尿和体重。
通过腹膜内注射每周三次以300μg/小鼠施用对照IgG/仓鼠Ig或8G8。
根据动物设施规程，在健康状况不佳和活动减少的情况下处死小鼠。
蛋白尿
化学测试条10购自罗氏公司。从小鼠收集尿液并置于化学测试条上。为了测定尿液中的蛋白质，使用以下比色标度：0mg/dL、痕量(1mg/dL)、30mg/dL、100mg/dL和500mg/dL。
血清分析
收集血清并储存在-80℃下直至需要。使用32Milliplex小鼠细胞因子/趋化因子磁珠板(密理博公司)测定趋化因子和细胞因子水平，并在Bio-plex 200系统(伯乐公司生命科学研究部)上运行测定法。使用Bio-Plex Manager 6.0软件分析数据。
髓源性抑制细胞分离试剂盒
使用来自Miltenyi Biotec公司的髓源性抑制细胞分离试剂盒(Myeloid-DerivedSuppressor Cell Isolation Kit)根据制造商的说明分离髓源性抑制细胞(MDSC)。
RNA分离和nanoString
使用Trizol(生命科技公司(Life Technologies))和PureLink RNA Mini试剂盒(Ambion公司)从MDSC分离RNA。在小鼠炎症nanoString 12测定法(nanoString科技公司(nanoString Technologies))上运行RNA，并使用nSolver分析软件对数据进行定量。
免疫荧光染色
将肾脏包埋于OCT中并切制9μm切片，于-80℃下保存。将载玻片在室温下放置20分钟，在预冷的丙酮中固定10分钟并移出以蒸发过量的丙酮，在PBS中再水化5分钟并使用ImmEdge笔(Vector Labs公司)圈定切片。将它们于10％山羊血清(JacksonImmunoResearch公司)在室温下温育1小时并洗涤。将切片用稀释于PBS中的针对C3和IgG的直接缀合抗体在室温下染色2小时并洗涤2分钟，然后用DAPI(生命科技公司)在ProLongGold防褪色封固剂(ProLong Gold Antifade Mountant)中固定，并在室温下在黑暗中保存48小时。在蔡司共聚焦显微镜(Zeiss Confocal Microscope)上获取图像并用LSM510Meta软件分析。
临床病理学
将肾脏置于盒中并在室温下在10％福尔马林中固定过夜，然后在PBS中简单洗涤，转移并保存在70％乙醇(飞世尔科技公司)中，然后转移至达特茅斯盖瑟医学院的病理转化研究中心，在这里将它们进行石蜡包埋、切片然后染色。
使用Leica BOND RX自动染色机将石蜡包埋的组织切片(4μm)染色。脱蜡后，对切片进行抗原修复(Bond表位修复溶液2，100℃，20分钟)，并在室温下在Leica稀释剂中与一抗一起温育(参见下面的稀释度)30-60分钟。然后将载玻片在PBS中洗涤3次，每次5分钟，并与二抗(来自Leica Bond Refine检测试剂盒，DS9800)一起温育。在PBS中最后洗涤3次后，将切片与DAB(Leica Bond聚合物检测试剂盒)一起温育、漂洗、用苏木精复染并封片。
由病理学家评估临床病理学。
结果
该实验设计用于检验8G8是否介导雌性NZBWF-1小鼠中的免疫抑制作用。从22周龄开始每周一次监测小鼠的蛋白尿发展。在第28周(检测到蛋白尿后一周)通过腹膜内注射每周三次用300μg的仓鼠Ig或8G8处理小鼠。对照组中疾病严重程度持续增加，而8G8组的小鼠则显示出降低的蛋白尿水平。
具体而言，如图77中所示，8G8抗体施用可减少NZBWF-1小鼠中的蛋白尿发展。如其中所示，每周监测这些22周龄雌性NZBWF-1小鼠的蛋白尿。使用化学测试条记录蛋白尿值并定量为mg/dL。在第28周，通过腹膜内注射每周三次用300ug仓鼠IgG(黑色线条，n＝6)或300ug 6G8(红色线条，n＝8)处理小鼠。
如图78所示，8G8对NZBWF-1小鼠中的免疫复合物沉积没有影响。如其中所示，每周监测相同的22周龄雌性NZBWF-1小鼠的蛋白尿。每周三次用300ug仓鼠Ig(n＝8)或300ug8G8处理小鼠。为了确定B6、仓鼠Ig和8G8小鼠中的免疫复合物(IC)沉积，在冷冻OCT肾切片上进行免疫荧光染色，以通过共聚焦显微镜以40倍放大倍数检测C3(红色)和IgG(绿色)IC。
结果进一步显示在下表中。这些值进一步证实，8G8可减少NZBWF-1小鼠的肾损伤。在实验中，使用来自仓鼠Ig或8G8处理的NZBWF-1小鼠和C57BL/6小鼠(未处理小鼠对照)的石蜡包埋的肾脏来检验临床病理学，这些肾脏经H-E染色并且针对间质炎症和肾小球损伤进行盲法临床检查。*表示组间的显著性。
表4：8G8可减少NZBWF-1小鼠的肾损伤
结论
本文公开的这些动物测定法及其他实验的结果表明，激动性或免疫抑制性抗VISTA激动性抗体可用于治疗和预防自体免疫病症、变应性病症、炎症性病症或治疗上需要免疫抑制的其他病症；并且特别是提供令人信服的证据，即激动性抗VISTA激动性抗体可用于治疗和预防狼疮、GVHD、RA、IBD、慢性感染和肝毒性、牛皮癣以及用于预防、减轻或管理其他急性和慢性自体免疫病症、变应性病症、炎症性病症的症状。
本申请中引用的参考文献
将在本申请中引用的以下参考文献及其他参考文献以引用的方式全文并入本文。
1 Dong,C.,Juedes,A.E.,Temann,U.A.,Shresta,S.,Allison,J.P.,Ruddle,N.H.andFlavell,R.A.,ICOS co-stimulatory receptor is essential for T-cell activationand function.Nature 2001.409:97-101.
2 Suh,W.K.,Gajewska,B.U.,Okada,H.,Gronski,M.A.,Bertram,E.M.,Dawicki,W.,Duncan,G.S.,Bukczynski,J.,Plyte,S.,Elia,A.,Wakeham,A.,Itie,A.,Chung,S.,DaCosta,J.,Arya,S.,Horan,T.,Campbell,P.,Gaida,K.,Ohashi,P.S.,Watts,T.H.,Yoshinaga,S.K.,Bray,M.R.,Jordana,M.and Mak,T.W.,The B7family member B7-H3preferentially down-regulates T helper type 1-mediated immune responses.NatImmunol 2003.4:899-906.
3 Borriello,F.,Sethna,M.P.,Boyd,S.D.,Schweitzer,A.N.,Tivol,E.A.,Jacoby,D.,Strom,T.B.,Simpson,E.M.,Freeman,G.J.and Sharpe,A.H.,B7-1 and B7-2 haveoverlapping,critical roles in immunoglobulin class switching and germinalcenter formation.Immunity 1997.6:303-313.
4 Chambers,C.A.,sullivan,T.J.and Allison,J.P.,Lymphoproliferation inCTLA-4-deficient mice is mediated by costimulation-dependent activation ofCD4+T cells.Immunity 1997.7:885-895.
5 Waterhouse,P.,Penninger,J.M.,Timms,E.,Wakeham,A.,Shahinian,A.,Lee,K.P.,Thompson,C.B.,Griesser,H.and Mak,T.W.,Lymphoproliferative disorders withearly lethality in mice deficient in Ctla-4.Science 1995.270:985-988.
6 Tivol,E.A.,Borriello,F.,Schweitzer,A.N.,Lynch,W.P.,Bluestone,J.A.andSharpe,A.H.,Loss of CTLA-4 leads to massive lymphoproliferation and fatalMultiorgan tissue destruction,revealing a critical negative regulatory roleof CTLA-4.Immunity 1995.3:541-547.
7 Nishimura,H.,Nose,M.,Hiai,H.,Minato,N.and Honjo,T.,Development oflupus-like autoimmune diseases by disruption of the PD-1 gene encoding anITIM motif-carrying immunoreceptor.Immunity 1999.11:141-151.
8 Keir,M.E.,Liang,S.C.,Guleria,I.,Latchman,Y.E.,Qipo,A.,Albacker,L.A.,Koulmanda,M.,Freeman,G.J.,Sayegh,M.H.and Sharpe,A.H.,Tissue expression of PD-L1 mediates peripheral T cell tolerance.J Exp Med 2006.203:883-895.
9 Ortler,S.,Leder,C.,Mittelbronn,M.,Zozulya,A.L.,Knolle,P.A.,Chen,L.,Kroner,A.and Wiendl,H.,B7-H1 restricts neuroantigen-specific T cell responsesand confines inflammatory CNS damage:implications for the lesion pathogenesisof Multiple sclerosis.Eur J Immunol 2008.38:1734-1744.
10 Zhu,G.,Augustine,M.M.,Azuma,T.,Luo,L.,Yao,S.,Anand,S.,Rietz,A.C.,Huang,J.,Xu,H.,Flies,A.S.,Flies,S.J.,Tamada,K.,Colonna,M.,van Deursen,J.M.andChen,L.,B7-H4-deficient mice display augmented neutrophil-mediated innateimmunity.Blood 2009.113:1759-1767.
11 Chen,Y.,Wang,Q.,Shi,B.,Xu,P.,Hu,Z.,Bai,L.and Zhang,X.,Development of asandwich ELISA for evaluating soluble PD-L1(CD274)in human sera of differentages as well as supernatants of PD-L1(+)cell lines.Cytokine 2011.
12 Greenwald,R.J.,Freeman,G.J.and Sharpe,A.H.,The B7 familyrevisited.Annu Rev Immunol 2005.23:515-548.
13 Zhu,Y.,Yao,S.,Iliopoulou,B.P.,Han,X.,Augustine,M.M.,Xu,H.,Phennicie,R.T.,Flies,S.J.,Broadwater,M.,Ruff,W.,Taube,J.M.,Zheng,L.,Luo,L.,Zhu,G.,Chen,J.and Chen,L.,B7-H5 costimulates human T cells via CD28H.Nat Commun 2013.4:2043.
14 Brandt,C.S.,Baratin,M.,Yi,E.C.,Kennedy,J.,Gao,Z.,Fox,B.,Haldeman,B.,Ostrander,C.D.,Kaifu,T.,Chabannon,C.,Moretta,A.,West,R.,Xu,W.,Vivier,E.andLevin,S.D.,The B7 family member B7-H6is a tumor cell ligand for theactivating natural killer cell receptor NKp30 in humans.J Exp Med 2009.206:1495-1503.
15 Wang,L.,Rubinstein,R.,Lines,J.L.,Wasiuk,A.,Ahonen,C.,Guo,Y.,Lu,L.F.,Gondek,D.,Wang,Y.,Fava,R.A.,Fiser,A.,Almo,S.and Noelle,R.J.,VISTA,a novelmouse Ig superfamily ligand that negatively regulates T cell responses.J ExpMed 2011.208:577-592.
16 Lines,J.L.,Sempere,L.F.,Wang,L.,Panttazi,E.,Mak,J.,O'Connell,S.,Ceeraz,S.,Suriawinata,A.A.,Yan,S.,Ernstoff,M.S.and Noelle,R.J.,VISTA is animmune checkpoint regulator for human T cells.in revision(Cancer Research).
17 LeMercier,I.,Lines,J.L.,Sergent,P.,Li,J.,Noelle,R.J.and Wang,L.,VISTAregulates the development of protective anti-tumor immunity.in revision(Cancer Research).
18 Wolchok,J.D.,Kluger,H.,Callahan,M.K.,Postow,M.A.,Rizvi,N.A.,Lesokhin,A.M.,Segal,N.H.,Ariyan,C.E.,Gordon,R.A.,Reed,K.,Burke,M.M.,Caldwell,A.,Kronenberg,S.A.,Agunwamba,B.U.,Zhang,X.,Lowy,I.,Inzunza,H.D.,Feely,W.,Horak,C.E.,Hong,Q.,Korman,A.J.,Wigginton,J.M.,Gupta,A.and Sznol,M.,Nivolumab plusipilimumab in advanced melanoma.N Engl J Med 2013.369:122-133.
19 Iliopoulos,D.,Kavousanaki,M.,Ioannou,M.,Boumpas,D.and Verginis,P.,Thenegative costimulatory molecule PD-1 modulates the balance between immunityand tolerance via miR-21.Eur J Immunol 2011.41:1754-1763.
20 Ansari,M.J.,Salama,A.D.,Chitnis,T.,Smith,R.N.,Yagita,H.,Akiba,H.,Yamazaki,T.,Azuma,M.,Iwai,H.,Khoury,S.J.,Auchincloss,H.,Jr.and Sayegh,M.H.,The programmed death-1(PD-1)pathway regulates autoimmune diabetes in nonobesediabetic(NOD)mice.J Exp Med 2003.198:63-69.
21 Bertsias,G.K.,Nakou,M.,Choulaki,C.,Raptopoulou,A.,Papadimitraki,E.,Goulielmos,G.,Kritikos,H.,Sidiropoulos,P.,Tzardi,M.,Kardassis,D.,Mamalaki,C.and Boumpas,D.T.,Genetic,immunologic,and immunohistochemical analysis ofthe programmed death 1/programmed death ligand 1 pathway in human systemiclupus erythematosus.Arthritis Rheum2009.60:207-218.
22 Prokunina,L.,Castillejo-Lopez,C.,Oberg,F.,Gunnarsson,I.,Berg,L.,Magnusson,V.,Brookes,A.J.,Tentler,D.,Kristjansdottir,H.,Grondal,G.,Bolstad,A.I.,Svenungsson,E.,Lundberg,I.,Sturfelt,G.,Jonssen,A.,Truedsson,L.,Lima,G.,Alcocer-Varela,J.,Jonsson,R.,Gyllensten,U.B.,Harley,J.B.,Alarcon-Segovia,D.,Steinsson,K.and Alarcon-Riquelme,M.E.,A regulatory polymorphism in PDCD1 isassociated with susceptibility to systemic lupus erythematosus in humans.NatGenet 2002.32:666-669.
23 Ozkaynak,E.,Wang,L.,Goodearl,A.,McDonald,K.,Qin,S.,O'Keefe,T.,Duong,T.,Smith,T.,Gutierrez-Ramos,J.C.,Rottman,J.B.,Coyle,A.J.and Hancock,W.W.,Programmed death-1 targeting can promote allograft survival.J Immunol2002.169:6546-6553.
24 Watson,M.P.,George,A.J.and Larkin,D.F.,Differential effects ofcostimulatory pathway modulation on corneal allograft survival.InvestOphthalmol Vis Sci 2006.47:3417-3422.
25 Podojil,J.R.,Liu,L.N.,Marshall,S.A.,Chiang,M.Y.,Goings,G.E.,Chen,L.,Langermann,S.and Miller,S.D.,B7-H4Ig inhibits mouse and human T-cell functionand treats EAE via IL-10/Treg-dependent mechanisms.J Autoimmun 2013.44:71-81.
26 Sica,G.L.,Choi,I.H.,Zhu,G.,Tamada,K.,Wang,S.D.,Tamura,H.,Chapoval,A.I.,Flies,D.B.,Bajorath,J.and Chen,L.,B7-H4,a molecule of the B7 family,negatively regulates T cell immunity.Immunity2003.18:849-861.
27 Wang,X.,Hao,J.,Metzger,D.L.,Mui,A.,Ao,Z.,Verchere,C.B.,Chen,L.,Ou,D.and Warnock,G.L.,B7-H4 induces donor-specific tolerance in mouse isletallografts.Cell Transplant 2012.21:99-111.
28 Yamaura,K.,Watanabe,T.,Boenisch,O.,Yeung,M.,Yang,S.,Magee,C.N.,Padera,R.,Datta,S.,Schatton,T.,Kamimura,Y.,Azuma,M.and Najafian,N.,In vivo functionof immune inhibitory molecule B7-H4 in alloimmune responses.Am J Transplant2010.10:2355-2362.
29 Yi,K.H.and Chen,L.,Fine tuning the immune response through B7-H3 andB7-H4.Immunol Rev 2009.229:145-151.
30 Wang,X.,Hao,J.,Metzger,D.L.,Ao,Z.,Chen,L.,Ou,D.,Verchere,C.B.,Mui,A.and Warnock,G.L.,B7-H4 Treatment of T Cells Inhibits ERK,JNK,p38,and AKTActivation.PLoS One 2012.7:e28232.
31 Terawaki,S.,Tanaka,Y.,Nagakura,T.,Hayashi,T.,Shibayama,S.,Muroi,K.,Okazaki,T.,Mikami,B.,Garboczi,D.N.,Honjo,T.and Minato,N.,Specific and high-affinity binding of tetramerized PD-L1 extracellular domain to PD-1-expressing cells:possible application to enhance T cell function.Int Immunol2007.19:881-890.
32 Sedy,J.R.,Gavrieli,M.,Potter,K.G.,Hurchla,M.A.,Lindsley,R.C.,Hildner,K.,Scheu,S.,Pfeffer,K.,Ware,C.F.,Murphy,T.L.and Murphy,K.M.,B and Tlymphocyte attenuator regulates T cell activation through interaction withherpesvirus entry mediator.Nat Immunol 2005.6:90-98.
33 Parisi,S.,Battista,M.,Musto,A.,Navarra,A.,Tarantino,C.and Russo,T.,Aregulatory loop involving Dies1 and miR-125a controls BMP4 signaling in mouseembryonic stem cells.FASEB J 2012.26:3957-3968.
34 Youngnak,P.,Kozono,Y.,Kozono,H.,Iwai,H.,Otsuki,N.,Jin,H.,Omura,K.,Yagita,H.,Pardoll,D.M.,Chen,L.and Azuma,M.,Differential binding properties ofB7-H1 and B7-DC to programmed death-1.Biochem Biophys Res Commun 2003.307:672-677.
35 Butte,M.J.,Keir,M.E.,Phamduy,T.B.,Sharpe,A.H.and Freeman,G.J.,Programmed death-1 ligand 1 interacts specifically with the b7-1costimulatorymolecule to inhibit T cell responses.Immunity 2007.27:111-122.
36 Sharpe,A.H.and Freeman,G.J.,The B7-CD28 superfamily.Nat RevImmunol2002.2:116-126.
37 Bartel P.L.et al.(1993)Using the two-hybrid system to detect protein-protein interactions.In Cellular Interactions in Development:A PracticalApproach,D.A.Hartley,Ed.,Oxford University Press,Oxford；pp 153-179.
38 Béranger F.et al.(1997)Getting more from the two-hybrid system:N-terminal fusions to LexA are efficient and sensitive baits for two-hybridstudies.NAR 25:2035-36.
39 Formstecher E.et al.(2005)Protein interaction mapping:a Drosophilacase study.Genome Res.15:37684.
40 Fromont-Racine M.,Rain J.C.,and Legrain P.(1997)Toward a functionalanalysis of the yeast genome through exhaustive two-hybridscreens.Nat.Genet.16:277-82.
41 Rain J.C.et al.(2001)The protein-protein interaction map ofHelicobacter pylori.Nature 409:211-15.
42 Vojtek A.and Hollenberg S.M.(1995)Ras-Raf interaction:two-hybridanalysis.Methods Enzymol.255:33142.
43 Wojcik J.,Boneca I.G.,and Legrain P.(2002)Prediction,assessment andvalidation of protein interaction maps in bacteria.J.Mol.Biol.323:763-70.
44.Franklin EC,Kunkel HG.Immunologic Differences Between the 19 S and 7 SComponents of Normal Human γ-Globulin.The Journal of Immunology.1957；78(1):11-8.
45.Roda G,Jharap B,Neeraj N,Colombel J-F.Loss of Response to Anti-TNFs:Definition,Epidemiology,and Management.Clin Trans Gastroenterol.2016；7:e135.doi:10.1038/ctg.2015.63.
46.Greenwald RJ,Freeman GJ,Sharpe AH.The B7 family revisited.AnnualReview of Immunology.2005；23:515-48.PubMed PMID:15771580.
47.Lines JL,Pantazi E,Mak J,Sempere LF,Wang L,O'Connell S,Ceeraz S,Suriawinata AA,Yan S,Ernstoff MS,Noelle R.VISTA is an immune checkpointmolecule for human T cells.Cancer Research.2014；74(7):1924-32.doi:10.1158/0008-5472.CAN-13-1504.PubMed PMID:24691993；PMCID:3979527.
48.Le Mercier I,Chen W,Lines JL,Day M,Li J,Sergent P,Noelle RJ,WangL.VISTA Regulates the Development of Protective Antitumor Immunity.CancerResearch.2014；74(7):1933-44.doi:10.1158/0008-5472.CAN-13-1506.PubMed PMID:24691994；PMCID:PMC4116689.
49.Flies DB,Han X,Higuchi T,Zheng L,Sun J,Ye JJ,Chen L.Coinhibitoryreceptor PD-1H preferentially suppresses CD4(+)T cell-mediated immunity.TheJournal of Clinical Investigation.2014；124(5):1966-75.doi:10.1172/JCI74589.PubMed PMID:24743150；PMCID:4001557.
50.Lines JL,Sempere LF,Broughton T,Wang L,Noelle R.VISTA Is a NovelBroad-Spectrum Negative Checkpoint Regulator for Cancer Immunotherapy.CancerImmunology research.2014；2(6):510-7.doi:10.1158/2326-6066.CIR-14-0072.PubMedPMID:24894088.
51.Wang L,Le Mercier I,Putra J,Chen W,Liu J,Schenk AD,Nowak EC,Suriawinata AA,Li J,Noelle RJ.Disruption of the immune-checkpoint VISTA geneimparts a proinflammatory phenotype with predisposition to the development ofautoimmunity.Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America.2014；111(41):14846-51.doi:10.1073/pnas.1407447111.PubMedPMID:25267631；PMCID:4205642.
52.Wang L,Rubinstein R,Lines JL,Wasiuk A,Ahonen C,Guo Y,Lu LF,Gondek D,Wang Y,Fava RA,Fiser A,Almo S,Noelle RJ.VISTA,a novel mouse Ig superfamilyligand that negatively regulates T cell responses.The Journal of ExperimentalMedicine.2011；208(3):577-92.Epub 2011/03/09.doi:jem.20100619[pii]10.1084/jem.20100619.PubMed PMID:21383057；PMCID:3058578.
53.Flies DB,Han X,Higuchi T,Zheng L,Sun J,Ye JJ,Chen L.Coinhibitoryreceptor PD-1H preferentially suppresses CD4(+)T cell–mediated immunity.TheJournal of Clinical Investigation.2014；124(5):1966-75.doi:10.1172/JCI74589.PubMed PMID:PMC4001557.
54.Yoon KW,Byun S,Kwon E,Hwang SY,Chu K,Hiraki M,Jo SH,Weins A,HakroushS,Cebulla A,Sykes DB,Greka A,Mundel P,Fisher DE,Mandinova A,Lee SW.Control ofsignaling-mediated clearance of apoptotic cells by the tumor suppressorp53.Science.2015；349(6247):1261669.doi:10.1126/science.1261669.PubMed PMID:26228159.
55.Bettelli E,Pagany M,Weiner HL,Linington C,Sobel RA,Kuchroo VK.MyelinOligodendrocyte Glycoprotein–specific T Cell Receptor Transgenic Mice DevelopSpontaneous Autoimmune Optic Neuritis.The Journal of ExperimentalMedicine.2003；197(9):1073-81.doi:10.1084/jem.20021603.
56.Ceeraz S,Sergent P,Plummer S,Schned A,Pechenick D,Burns C,NoelleR.VISTA deficiency accelerates the development of fatal murine lupusnephritis.Arthritis and Rheumatology.2016；submitted.
57.Liu J,Yuan Y,Chen W,Putra J,Suriawinata AA,Schenk AD,Miller HE,GuleriaI,Barth RJ,Huang YH,Wang L.Immune-checkpoint proteins VISTA and PD-1nonredundantly regulate murine T-cell responses.Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America.2015；112(21):6682-7.doi:10.1073/pnas.1420370112.PubMed PMID:25964334；PMCID:PMC4450438.
58.Flies DB,Higuchi T,Chen L.Mechanistic Assessment of PD-1H CoinhibitoryReceptor-Induced T Cell Tolerance to Allogeneic Antigens.Journal ofImmunology.2015；194(11):5294-304.doi:10.4049/jimmunol.1402648.PubMed PMID:25917101；PMCID:PMC4433880.
59.DiLillo DJ,Ravetch JV.Fc-Receptor Interactions Regulate Both Cytotoxicand Immunomodulatory Therapeutic Antibody Effector Functions.CancerImmunology Research.2015；3(7):704-13.doi:10.1158/2326-6066.cir-15-0120.
60.White AL,Chan HT,French RR,Willoughby J,Mockridge CI,Roghanian A,Penfold CA,Booth SG,Dodhy A,Polak ME,Potter EA,Ardern-Jones MR,Verbeek JS,Johnson PW,Al-Shamkhani A,Cragg MS,Beers SA,Glennie MJ.Conformation of thehuman immunoglobulin G2 hinge imparts superagonistic properties toimmunostimulatory anticancer antibodies.Cancer Cell.2015；27(1):138-48.doi:10.1016/j.ccell.2014.11.001.PubMed PMID:25500122；PMCID:PMC4297290.
61.Dubey AK,Handu SS,Dubey S,Sharma P,Sharma KK,Ahmed QM.Belimumab:Firsttargeted biological treatment for systemic lupus erythematosus.J PharmacolPharmacother.2011；2(4):317-9.doi:10.4103/0976-500X.85930.PubMed PMID:22025872；PMCID:PMC3198539.
62.Wallace DJ,Hobbs K,Clowse ME,Petri M,Strand V,Pike M,Merrill JT,Leszczynski P,Neuwelt CM,Jeka S,Houssiau F,Keiserman M,Ordi-Ros J,Bongardt S,Kilgallen B,Galateanu C,Kalunian K,Furie R,Gordon C.Long-term safety andefficacy of epratuzumab in the treatment of moderate-to-severe systemic lupuserythematosus:results from an open-label extension study.Arthritis Care Res(Hoboken).2015.doi:10.1002/acr.22694.PubMed PMID:26316325.
63.Van Wauwe JP,De Mey JR,Goossens JG.OKT3:a monoclonal anti-human Tlymphocyte antibody with potent mitogenic properties.The Journal ofImmunology.1980；124(6):2708-13.
64.Robertson JM,Jensen PE,Evavold BD.DO11.10 and OT-II T Cells Recognizea C-Terminal Ovalbumin 323–339 Epitope.The Journal of Immunology.2000；164(9):4706-12.doi:10.4049/jimmunol.164.9.4706.
65.Wang H-X,Liu M,Weng S-Y,Li J-J,Xie C,He H-L,Guan W,Yuan Y-S,GaoJ.Immune mechanisms of Concanavalin A model of autoimmune hepatitis.WorldJournal of Gastroenterology:WJG.2012；18(2):119-25.doi:10.3748/wjg.v18.i2.119.PubMed PMID:PMC3257438.
66.Weiner GJ.Building better monoclonal antibody-based therapeutics.NatRev Cancer.2015；15(6):361-70.doi:10.1038/nrc3930.PubMed PMID:25998715；PMCID:PMC4491443.
67.Ravetch JV,Bolland S.IgG Fc receptors.Annual Review ofImmunology.2001；19:275-90.doi:10.1146/annurev.immunol.19.1.275.PubMed PMID:11244038.
68.Li F,Smith P,Ravetch JV.Inhibitory Fcγreceptor is required for themaintenance of tolerance through distinct mechanisms.Journal of Immunology(Baltimore,Md:1950).2014；192(7):3021-8.doi:10.4049/jimmunol.1302934.PubMedPMID:PMC3967505.
69.Hinton PR,Johlfs MG,Xiong JM,Hanestad K,Ong KC,Bullock C,Keller S,TangMT,Tso JY,Vasquez M,Tsurushita N.Engineered human IgG antibodies with longerserum half-lives in primates.The Journal of Biological Chemistry.2004；279(8):6213-6.doi:10.1074/jbc.C300470200.PubMed PMID:14699147.
70.Vaccaro C,Zhou J,Ober RJ,Ward ES.Engineering the Fc region ofimmunoglobulin G to modulate in vivo antibody levels.NatureBiotechnology.2005；23(10):1283-8.doi:10.1038/nbt1143.PubMed PMID:16186811.
71.Borrok MJ,Wu Y,Beyaz N,Yu X-Q,Oganesyan V,Dall'Acqua WF,Tsui P.pH-dependent Binding Engineering Reveals an FcRn Affinity Threshold That GovernsIgG Recycling.The Journal of Biological Chemistry.2015；290(7):4282-90.doi:10.1074/jbc.M114.603712.PubMed PMID:PMC4326836.
72.Oyarzun P,Ellis JJ,Gonzalez-Galarza FF,Jones AR,Middleton D,Boden M,Kobe B.A bioinformatics tool for epitope-based vaccine design that accountsfor human ethnic diversity:Application to emerging infectiousdiseases.Vaccine.2015；33(10):1267-73.doi:http://dx.doi.org/10.1016/j.vaccine.2015.01.040.
73.Haskins K,Kubo R,White J,Pigeon M,Kappler J,Marrack P.The majorhistocompatibility complex-restricted antigen receptor on T cells.I.Isolationwith a monoclonal antibody.The Journal of Experimental Medicine.1983；157(4):1149-69.Epub 1983/04/01.PubMed PMID:6601175；PMCID:Pmc2186983.
74.Markees TG,Phillips NE,Noelle RJ,Shultz LD,Mordes JP,Greiner DL,Rossini AA.Prolonged survival of mouse skin allografts in recipients treatedwith donor splenocytes and antibody to CD40 ligand.Transplantation.1997；64(2):329-35.
75.Ehst BD,Ingulli E,Jenkins MK.Development of a novel transgenic mousefor the study of interactions between CD4 and CD8 T cells during graftrejection.American Journal of Transplantation:Official journal of theAmerican Society of Transplantation and the American Society of TransplantSurgeons.2003；3(11):1355-62.PubMed PMID:14525595.
76.Wu S,Jin L,Vence L,Radvanyi LG.Development and application of'phosphoflow'as a tool for immunomonitoring.Expert Rev Vaccines.2010；9(6):631-43.doi:10.1586/erv.10.59.PubMed PMID:20518718；PMCID:PMC2933839.
77.Weissmuller S,Kronhart S,Kreuz D,Schnierle B,Kalinke U,Kirberg J,Hanschmann KM,Waibler Z.TGN1412 Induces Lymphopenia and Human CytokineRelease in a Humanized Mouse Model.PloS One.2016；11(3):e0149093.doi:10.1371/journal.pone.0149093.PubMed PMID:26959227；PMCID:PMC4784892.
78.Piccotti JR,Alvey JD,Reindel JF,Guzman RE.T-cell-dependent antibodyresponse:assay development in cynomolgus monkeys.J Immunotoxicol.2005；2(4):191-6.doi:10.1080/15476910500362838.PubMed PMID:18958673.
79.Muller PY,Brennan FR.Safety assessment and dose selection for first-in-human clinical trials with immunomodulatory monoclonal antibodies.ClinPharmacol Ther.2009；85(3):247-58.doi:10.1038/clpt.2008.273.PubMed PMID:19177065
序列表
SEQ ID NO:1：智人(Homo sapiens)VISTA(别名：B7-H5；B7H5；DD1α；GI24；PP2135；SISP1)氨基酸序列
SEQ ID NO:2：小鼠(Mus musculus)VISTA氨基酸序列
SEQ ID NO:3：小鼠VISTA氨基酸序列
SEQ ID NO:4：智人VISTA(别名：B7-H5；B7H5；DD1α；GI24；PP2135；SISP1)核酸序列
SEQ ID NO:5：智人VISTA(别名：B7-H5；B7H5；DD1α；GI24；PP2135；SISP1)编码核酸序列
SEQ ID NO:6：小鼠VISTA编码核酸序列

Claims (119)

1.一种治疗或预防自体免疫病症、变应性病症或炎症性病症的方法，包括给有需要的患者施用治疗或预防有效量的分离的抗体或其抗体片段，所述抗体或其抗体片段包含特异性地结合至人T细胞活化的V结构域Ig抑制因子(人VISTA)的抗原结合区，其中所述抗体或抗体片段可激发或促进VISTA对免疫的一种或多种作用。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗体包含人IgG2恒定区或人IgG2Fc区。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述抗体的所述人IgG2恒定区或Fc区结合至Fcγ受体，包括人CD32A。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述IgG2恒定区或Fc区包含结合至Fcγ受体的天然人IgG2。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述FcγR包括以下中的一种或多种：hFcγRI(CD64)、FcγRIIA或hFcγRIIB(CD32或CD32A)以及FcγRIIIA(CD16A)或FcγRIIIB(CD16B)。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述分离的抗体或其抗体片段与具有图4的序列的任何抗人VISTA抗体竞争或者结合至包括具有图4的序列的任何抗人VISTA抗体所结合的表位或与所述表位重叠的VISTA表位。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述分离的抗体或抗体片段与包含LLDSGLYCCLVVEIRHHHSEHRVH(SEQ ID NO:92)的残基的表位的一个或多个残基相结合或相互作用。
8.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述分离的抗体或抗体片段与包含79EVQTCSERRPIR90(SEQ ID NO:68)、48NVTLTCRLLGPV60、153HHHSEHRVHGAM164、52LTCRLLGPV60、56LLGPVDKGHDVTFYK70、113LAQRHGLESASDHHG127、153HHHSEHRVHGAM164、93TFQDLHLHHGGHQAA107、146CLVVEIRHHHSEH158、53TCRLLGPVDKG63、123SDHHG127和/或153HHHSEHRVHGAM164的一个或多个残基的表位的一个或多个残基相结合或相互作用。
9.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述分离的抗体或抗体片段与包含79EVQTCSERRPIR90(SEQ ID NO:68)的一个或多个残基的表位的一个或多个残基相结合或相互作用。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述分离的抗体或抗体片段可促进或增强人VISTA对免疫的至少一种作用，例如其对以下任一者或多者的抑制作用：T细胞免疫、单核细胞活化、T细胞增殖诱导；细胞因子表达、单核细胞的存活增加的诱导或抑制、表达VISTA的细胞中抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)的诱导；以及表达VISTA的细胞中抗体依赖的细胞吞噬作用(ADCP)的诱导。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述分离的抗体或抗体片段包含特异性地结合至人VISTA的抗原结合区，其中所述抗体或抗体片段包含的可变重链序列和可变轻链序列具有与具有图4中所示的CDR多肽及可变重链多肽和可变轻链多肽的抗人VISTA抗体任一者相同的CDR多肽。
12.根据前述权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述分离的抗体或抗体片段包含与选自VSTB49-VSTB116的抗体相同的CDR。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述分离的抗体或抗体片段包含的可变重链多肽和/或可变轻链多肽与选自VSTB49-VSTB116中的任一者的抗人VISTA抗体的可变重链多肽和/或可变轻链多肽具有至少90％的序列同一性，其中VSTB49-VSTB116的所述可变重链多肽序列和可变轻链多肽序列在图4中示出。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述分离的抗体或抗体片段包含的可变重链多肽和/或可变轻链多肽与选自VSTB49-VSTB116中的任一者的抗人VISTA抗体的可变重链多肽和/或可变轻链多肽具有至少95％的序列同一性，其中VSTB49-VSTB116的所述可变重链多肽序列和可变轻链多肽序列在图4中示出。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述分离的抗体或抗体片段包含的可变重链多肽和/或可变轻链多肽与选自VSTB49-VSTB116中的任一者的抗人VISTA抗体的可变重链多肽和/或可变轻链多肽具有至少96％-99％的序列同一性。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述分离的抗体或抗体片段包含的可变重链多肽和/或可变轻链多肽与选自VSTB49-VSTB116其中一者的抗人VISTA抗体的可变重链多肽和/或可变轻链多肽相同，其中VSTB49-VSTB116的所述可变重链多肽序列和可变轻链多肽序列在图4中示出。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述分离的抗体或抗体片段包含人恒定结构域。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述分离的抗体或抗体片段包含选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的人恒定结构域，所述人恒定结构域可任选进行修饰，例如通过缺失突变、置换突变或添加突变或上述突变的任何组合进行修饰。
19.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或抗体片段，其中所述分离的抗体或抗体片段包含其中所述抗体片段包含Fab、F(ab’)2或scFv抗体片段，或者是Fab、F(ab’)2或scFv抗体片段。
20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述分离的抗体或抗体片段包含激动性抗人VISTA抗体或抗体片段，所述激动性抗人VISTA抗体或抗体片段可促进或增强人VISTA对免疫的至少一种作用，例如选自其对T细胞免疫、单核细胞活化的抑制作用、T细胞增殖的抑制；细胞因子表达、单核细胞的存活增加的诱导或抑制、表达VISTA的细胞中抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)的抑制；以及表达VISTA的细胞中抗体依赖的细胞吞噬作用(ADCP)的抑制。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述抗体包含人IgG2恒定区或Fc区。
22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述分离的抗体或抗体片段可促进或增强人VISTA对免疫的抑制作用，例如其对以下任一者或多者的作用：T细胞免疫、单核细胞活化、T细胞增殖；细胞因子表达、单核细胞存活、表达VISTA的细胞中抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)；以及表达VISTA的细胞中抗体依赖的细胞吞噬作用(ADCP)。
23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述分离的抗体或抗体片段可抑制T细胞免疫和/或促炎细胞因子表达。
24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述分离的抗体或抗体片段包含人Fc区，例如人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4或者前述任一者的嵌合体。
25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述分离的抗体或抗体片段包含嵌合型、人型、多特异型或人源化型抗体或抗体片段。
26.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述分离的抗体或抗体片段包含突变的人IgG2恒定结构域或Fc区。
27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述分离的抗体或抗体片段包含人IgG2恒定结构域或其片段或者hIgG1、hIgG3、hIgG4、IgA、IgD、IgE或IgM，其中所述抗体的整个或基本上整个铰链结构域和CH1结构域以及任选整个或基本上整个轻链恒定区已用hIgG2的相应的整个或基本上整个轻链以及铰链结构域和CH1结构域(“H2区”或“H2结构域”)置换。
28.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述分离的抗体或抗体片段(i)包含IgG2Fc区，其中第127位的重链半胱氨酸残基和第214位的轻链半胱氨酸残基(其中编号方式是根据Kabat)中的一者或二者缺失或改变成不同的氨基酸残基，从而导致所得的经修饰的抗体的激动特性相对于其中这些残基未改变的抗体增加，(ii)所述抗体的H2区中第214位的半胱氨酸残基被突变或用另一个氨基酸置换和/或重链的第127、232或233位的半胱氨酸残基中的一者或多者缺失或用另一个氨基酸置换，(iii)其包含人IgG2恒定结构域，其中至少一个半胱氨酸残基缺失或改变成另一个氨基酸，(iv)其与VSTB95(可变重链序列和可变轻链序列在图4中示出)竞争或与所述VSTB95结合至人VISTA上的相同表位。
29.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述分离的抗体或抗体片段：
(i)包含SEQ ID NO:100、101和102的VH CDR以及SEQ ID NO:103、104和105的VL CDR；
(ii)包含SEQ ID NO:110、111和112的VH CDR以及SEQ ID NO:113、114和115的VL CDR；
(iii)包含SEQ ID NO:120、121和122的VH CDR以及SEQ ID NO:123、124和125的VL CDR；
(iv)包含SEQ ID NO:130、131和132的VH CDR以及SEQ ID NO:133、134和135的VL CDR；
(v)包含SEQ ID NO:140、141和142的VH CDR以及SEQ ID NO:143、144和145的VL CDR；
(vi)包含SEQ ID NO:150、151和152的VH CDR以及SEQ ID NO:153、154和155的VL CDR；
(vii)包含SEQ ID NO:160、161和162的VH CDR以及SEQ ID NO:163、164和165的VL CDR；
(viii)包含SEQ ID NO:170、171和172的VH CDR以及SEQ ID NO:173、174和175的VLCDR；
(ix)包含SEQ ID NO:180、181和182的VH CDR以及SEQ ID NO:183、184和185的VL CDR；
(x)包含SEQ ID NO:190、191和192的VH CDR以及SEQ ID NO:193、194和195的VL CDR；
(xi)包含SEQ ID NO:200、201和202的VH CDR以及SEQ ID NO:203、204和205的VL CDR；
(xii)包含SEQ ID NO:210、211和212的VH CDR以及SEQ ID NO:213、214和215的VL CDR；
(xiii)包含SEQ ID NO:220、221和222的VH CDR以及SEQ ID NO:223、224和225的VLCDR；
(xiv)包含SEQ ID NO:230、231和232的VH CDR以及SEQ ID NO:233、234和235的VL CDR；
(xv)包含SEQ ID NO:240、241和242的VH CDR以及SEQ ID NO:243、244和245的VL CDR；
(xvi)包含SEQ ID NO:250、251和252的VH CDR以及SEQ ID NO:253、254和255的VL CDR；
(xvii)包含SEQ ID NO:260、261和262的VH CDR以及SEQ ID NO:263、264和265的VLCDR；
(xviii)包含SEQ ID NO:270、271和272的VH CDR以及SEQ ID NO:273、274和275的VLCDR；
(xix)包含SEQ ID NO:280、281和282的VH CDR以及SEQ ID NO:283、284和285的VL CDR；
(xx)包含SEQ ID NO:290、291和292的VH CDR以及SEQ ID NO:293、294和295的VL CDR；
(xxi)包含SEQ ID NO:300、301和302的VH CDR以及SEQ ID NO:303、304和305的VL CDR；
(xxii)包含SEQ ID NO:310、311和312的VH CDR以及SEQ ID NO:313、314和315的VLCDR；
(xxiii)包含SEQ ID NO:320、321和322的VH CDR以及SEQ ID NO:323、324和325的VLCDR；
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(xxvi)包含SEQ ID NO:350、351和352的VH CDR以及SEQ ID NO:353、354和355的VLCDR；
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(xxxiii)包含SEQ ID NO:420、421和422的VH CDR以及SEQ ID NO:423、424和425的VLCDR；
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(xxxviii)包含SEQ ID NO:470、471和472的VH CDR以及SEQ ID NO:473、474和475的VLCDR；
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(xli)包含SEQ ID NO:500、501和502的VH CDR以及SEQ ID NO:503、504和505的VL CDR多肽；
(xlii)包含SEQ ID NO:510、511和512的VH CDR以及SEQ ID NO:513、514和515的VL CDR多肽；
(xliii)包含SEQ ID NO:520、521和522的VH CDR以及SEQ ID NO:523、524和525的VLCDR多肽；
(xliv)包含SEQ ID NO:530、531和532的VH CDR以及SEQ ID NO:533、534和535的VL CDR多肽；
(xlv)包含SEQ ID NO:540、541和542的VH CDR以及SEQ ID NO:543、544和545的VL CDR多肽；
(xlvi)包含SEQ ID NO:550、551和552的VH CDR以及SEQ ID NO:553、554和555的VL CDR多肽；
(xlvii)包含SEQ ID NO:560、561和562的VH CDR以及SEQ ID NO:563、564和565的VLCDR；
(xlviii)包含SEQ ID NO:570、571和572的VH CDR以及SEQ ID NO:573、574和575的VLCDR；
(xlix)包含SEQ ID NO:580、581和582的VH CDR以及SEQ ID NO:583、584和585的VLCDR；
(l)包含SEQ ID NO:590、591和592的VH CDR以及SEQ ID NO:593、594和595的VL CDR；
(li)包含SEQ ID NO:600、601和602的VH CDR以及SEQ ID NO:603、604和605的VL CDR；
(lii)包含SEQ ID NO:610、611和612的VH CDR以及SEQ ID NO:613、614和615的VL CDR；
(liii)包含SEQ ID NO:620、621和622的VH CDR以及SEQ ID NO:623、624和625的VLCDR；
(liv)包含SEQ ID NO:630、631和632的VH CDR以及SEQ ID NO:633、634和635的VL CDR；
(lv)包含SEQ ID NO:640、641和642的VH CDR以及SEQ ID NO:643、644和645的VL CDR；
(lvi)包含SEQ ID NO:650、651和652的VH CDR以及SEQ ID NO:653、654和655的VL CDR；
(lvii)包含SEQ ID NO:660、661和662的VH CDR以及SEQ ID NO:663、664和665的VLCDR；
(lviii)包含SEQ ID NO:670、671和672的VH CDR以及SEQ ID NO:673、674和675的VLCDR；
(lix)包含SEQ ID NO:680、681和682的VH CDR以及SEQ ID NO:683、684和685的VL CDR；
(lx)包含SEQ ID NO:690、691和692的VH CDR以及SEQ ID NO:693、694和695的VL CDR；
(lxi)包含SEQ ID NO:700、701和702的VH CDR以及SEQ ID NO:703、704和705的VL CDR；
(lxii)包含SEQ ID NO:710、711和712的VH CDR以及SEQ ID NO:713、714和715的VLCDR；
(lxiii)包含SEQ ID NO:720、721和722的VH CDR以及SEQ ID NO:723、724和725的VLCDR；
(lxiv)包含SEQ ID NO:730、731和732的VH CDR以及SEQ ID NO:733、734和735的VLCDR；
(lxv)包含SEQ ID NO:740、741和742的VH CDR以及SEQ ID NO:743、744和745的VL CDR；
(lxvi)包含SEQ ID NO:750、751和752的VH CDR以及SEQ ID NO:753、754和755的VLCDR；
(lxvii)包含SEQ ID NO:760、761和762的VH CDR以及SEQ ID NO:763、764和765的VLCDR；
(lxviii)包含SEQ ID NO:770、771和772的VH CDR以及SEQ ID NO:773、774和775的VLCDR；
(lxix)包含SEQ ID NO:780、781和782的VH CDR以及SEQ ID NO:783、784和785的VLCDR；
(lxx)包含SEQ ID NO:790、791和792的VH CDR以及SEQ ID NO:793、794和795的VL CDR；
(lxxi)包含SEQ ID NO:800、801和802的VH CDR以及SEQ ID NO:803、804和805的VLCDR；以及
(lxxii)包含SEQ ID NO:810、811和812的VH CDR以及SEQ ID NO:813、814和815的VLCDR。
30.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述分离的抗体或抗体片段：
(i)包含SEQ ID NO:106的VH多肽以及SEQ ID NO:108的VL多肽；
(ii)包含SEQ ID NO:116的VH多肽以及SEQ ID NO:118的VL多肽；
(iii)包含SEQ ID NO:126的VH多肽以及SEQ ID NO:128的VL多肽；
(iv)包含SEQ ID NO:136的VH多肽以及SEQ ID NO:138的VL多肽；
(v)包含SEQ ID NO:146的VH多肽以及SEQ ID NO:148的VL多肽；
(vi)包含SEQ ID NO:156的VH多肽以及SEQ ID NO:158的VL多肽；
(vii)包含SEQ ID NO:166的VH多肽以及SEQ ID NO:168的VL多肽；
(viii)包含SEQ ID NO:176的VH多肽以及SEQ ID NO:178的VL多肽；
(ix)包含SEQ ID NO:186的VH多肽以及SEQ ID NO:188的VL多肽；
(x)包含SEQ ID NO:196的VH多肽以及SEQ ID NO:198的VL多肽；
(xi)包含SEQ ID NO:206的VH多肽以及SEQ ID NO:208的VL多肽；
(xii)包含SEQ ID NO:216的VH多肽以及SEQ ID NO:218的VL多肽；
(xiii)包含SEQ ID NO:226的VH多肽以及SEQ ID NO:228的VL多肽；
(xiv)包含SEQ ID NO:236的VH多肽以及SEQ ID NO:238的VL多肽；
(xv)包含SEQ ID NO:246的VH多肽以及SEQ ID NO:248的VL多肽；
(xvi)包含SEQ ID NO:256的VH多肽以及SEQ ID NO:258的VL多肽；
(xvii)包含SEQ ID NO:266的VH多肽以及SEQ ID NO:268的VL多肽；
(xviii)包含SEQ ID NO:276的VH多肽以及SEQ ID NO:278的VL多肽；
(xix)包含SEQ ID NO:286的VH多肽以及SEQ ID NO:288的VL多肽；
(xx)包含SEQ ID NO:296的VH多肽以及SEQ ID NO:298的VL多肽；
(xxi)包含SEQ ID NO:306的VH多肽以及SEQ ID NO:308的VL多肽；
(xxii)包含SEQ ID NO:316的VH多肽以及SEQ ID NO:318的VL多肽；
(xxiii)包含SEQ ID NO:326的VH多肽以及SEQ ID NO:328的VL多肽；
(xxiv)包含SEQ ID NO:336的VH多肽以及SEQ ID NO:338的VL多肽；
(xxv)包含SEQ ID NO:346的VH多肽以及SEQ ID NO:348的VL多肽；
(xxvi)包含SEQ ID NO:356的VH多肽以及SEQ ID NO:358的VL多肽；
(xxvii)包含SEQ ID NO:366的VH多肽以及SEQ ID NO:368的VL多肽；
(xxviii)包含SEQ ID NO:376的VH多肽以及SEQ ID NO:378的VL多肽；
(xxix)包含SEQ ID NO:386的VH多肽以及SEQ ID NO:388的VL多肽；
(xxx)包含SEQ ID NO:396的VH多肽以及SEQ ID NO:398的VL多肽；
(xxxi)包含SEQ ID NO:406的VH多肽以及SEQ ID NO:408的VL多肽；
(xxxii)包含SEQ ID NO:416的VH多肽以及SEQ ID NO:418的VL多肽；
(xxxiii)包含SEQ ID NO:426的VH多肽以及SEQ ID NO:428的VL多肽；
(xxxiv)包含SEQ ID NO:436的VH多肽以及SEQ ID NO:438的VL多肽；
(xxxv)包含SEQ ID NO:446的VH多肽以及SEQ ID NO:448的VL多肽；
(xxxvi)包含SEQ ID NO:456的VH多肽以及SEQ ID NO:458的VL多肽；
(xxxvii)包含SEQ ID NO:466的VH多肽以及SEQ ID NO:468的VL多肽；
(xxxviii)包含SEQ ID NO:476的VH多肽以及SEQ ID NO:478的VL多肽；
(xxxix)包含SEQ ID NO:486的VH多肽以及SEQ ID NO:488的VL多肽；
(xl)包含SEQ ID NO:496的VH多肽以及SEQ ID NO:498的VL多肽；
(xli)包含SEQ ID NO:506的VH多肽以及SEQ ID NO:508的VL多肽；
(xlii)包含SEQ ID NO:516的VH多肽以及SEQ ID NO:518的VL多肽；
(xliii)包含SEQ ID NO:526的VH多肽以及SEQ ID NO:528的VL多肽；
(xliv)包含SEQ ID NO:536的VH多肽以及SEQ ID NO:533、534和535的VL多肽；
(xlv)包含SEQ ID NO:546的VH多肽以及SEQ ID NO:548的VL多肽；
(xlvi)包含SEQ ID NO:556的VH多肽以及SEQ ID NO:558的VL多肽；
(xlvii)包含SEQ ID NO:566的VH多肽以及SEQ ID NO:568的VL多肽；
(xlviii)包含SEQ ID NO:576的VH多肽以及SEQ ID NO:578的VL多肽；
(xlix)包含SEQ ID NO:586的VH多肽以及SEQ ID NO:588的VL多肽；
(l)包含SEQ ID NO:596的VH多肽以及SEQ ID NO:598的VL多肽；
(li)包含SEQ ID NO:606的VH多肽以及SEQ ID NO:608的VL多肽；
(lii)包含SEQ ID NO:616的VH多肽以及SEQ ID NO:618的VL多肽；
(liii)包含SEQ ID NO:626的VH多肽以及SEQ ID NO:628的VL多肽；
(liv)包含SEQ ID NO:636的VH多肽以及SEQ ID NO:638的VL多肽；
(lv)包含SEQ ID NO:646的VH多肽以及SEQ ID NO:648的VL多肽；
(lvi)包含SEQ ID NO:656的VH多肽以及SEQ ID NO:658的VL多肽；
(lvii)包含SEQ ID NO:666的VH多肽以及SEQ ID NO:668的VL多肽；
(lviii)包含SEQ ID NO:676的VH多肽以及SEQ ID NO:678的VL多肽；
(lix)包含SEQ ID NO:686的VH多肽以及SEQ ID NO:688的VL多肽；
(lx)包含SEQ ID NO:696的VH多肽以及SEQ ID NO:698的VL多肽；
(lxi)包含SEQ ID NO:706的VH多肽以及SEQ ID NO:708的VL多肽；
(lxii)包含SEQ ID NO:716的VH多肽以及SEQ ID NO:718的VL多肽；
(lxiii)包含SEQ ID NO:726的VH多肽以及SEQ ID NO:728的VL多肽；
(lxiv)包含SEQ ID NO:736的VH多肽以及SEQ ID NO:738的VL多肽；
(lxv)包含SEQ ID NO:746的VH多肽以及SEQ ID NO:748的VL多肽；
(lxvi)包含SEQ ID NO:756的VH多肽以及SEQ ID NO:758的VL多肽；
(lxvii)包含SEQ ID NO:766的VH多肽以及SEQ ID NO:768的VL多肽；
(lxviii)包含SEQ ID NO:776的VH多肽以及SEQ ID NO:778的VL多肽；
(lxix)包含SEQ ID NO:786的VH多肽以及SEQ ID NO:788的VL多肽；
(lxx)包含SEQ ID NO:796的VH多肽以及SEQ ID NO:798的VL多肽；
(lxxi)包含SEQ ID NO:806的VH多肽以及SEQ ID NO:808的VL多肽；以及
(lxxii)包含SEQ ID NO:816的VH多肽以及SEQ ID NO:818的VL多肽。
31.根据权利要求29或30所述的方法，其中所述分离的抗体或抗体片段包含人IgG2恒定结构域，其中任选至少一个半胱氨酸缺失或改变成另一氨基酸。
32.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述分离的抗体或抗体片段构成激动性抗人VISTA抗体或抗体片段，所述激动性抗人VISTA抗体或抗体片段介导以下免疫抑制作用中的任一种或至少一种的组合：(i)降低免疫应答、(ii)降低T细胞活化、(iii)降低细胞毒性T细胞活性、(iv)降低天然杀伤(NK)细胞活性、(v)降低T细胞活性、(vi)降低促炎细胞因子分泌、(vii)降低IL-2分泌；(viii)降低γ干扰素产生、(ix)降低Th1应答、(x)降低Th2应答、(xi)增加调节T细胞的细胞数目和/或活性、(xii)增加调节细胞活性和/或髓源性抑制细胞(MDSC)、iMC、间充质基质细胞、表达TIE2的单核细胞中的一者或多者、(xiii)增加调节细胞活性和/或髓源性抑制细胞(MDSC)、iMC、间充质基质细胞、表达TIE2的单核细胞中的一者或多者的活性、(xiii)增加M2巨噬细胞、(xiv)增加M2巨噬细胞活性、(xv)增加N2中性粒细胞、(xvi)增加N2中性粒细胞活性、(xvii)增加T细胞活化的抑制、(xviii)增加CTL活化的抑制、(xix)增加NK细胞活化的抑制、(xx)增加T细胞耗竭、(xxi)降低T细胞应答、(xxii)降低细胞毒性细胞的活性、(xxiii)减少抗原特异性记忆应答、(xxiv)抑制细胞的凋亡或溶解、(xxv)降低对细胞的细胞毒性作用或细胞抑制作用、(xxvi)减少对细胞的直接杀死、(xxvii)降低Thl7活性和/或(xxviii)减少补体依赖的细胞毒性和/或抗体依赖细胞介导的细胞毒性，前提条件是所述抗VISTA抗体或抗原结合片段可引发与(i)-(xxviii)中的一者或多者相反的作用并且任选用于治疗自体免疫、变态反应、炎症、移植或败血症。
33.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其用于治疗或预防类风湿性关节炎。
34.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其用于治疗或预防GVHD。
35.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其用于治疗或预防牛皮癣。
36.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其用于治疗或预防IBD或结肠炎或另一种炎性或自体免疫性肠障碍。
37.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其用于治疗或预防狼疮。
38.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其用于治疗或预防慢性或急性感染或者与之相关的炎症或肝毒性。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述感染由肝炎例如甲型、乙型、丙型、丁型或戊型肝炎引起。
40.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法包括给有需要的受试者施用可在体外和/或体内实现以下免疫抑制作用中的任一种或至少一种的组合的激动性抗体或抗体片段：(i)降低免疫应答、(ii)降低T细胞活化、(iii)降低细胞毒性T细胞活性、(iv)降低天然杀伤(NK)细胞活性、(v)降低T细胞活性、(vi)降低促炎细胞因子分泌、(vii)降低IL-2分泌；(viii)降低γ干扰素产生、(ix)降低Th1应答、(x)降低Th2应答、(xi)增加调节T细胞的细胞数目和/或活性、(xii)增加调节细胞活性和/或髓源性抑制细胞(MDSC)、iMC、间充质基质细胞、表达TIE2的单核细胞中的一者或多者、(xiii)增加调节细胞活性和/或髓源性抑制细胞(MDSC)、iMC、间充质基质细胞、表达TIE2的单核细胞中的一者或多者的活性、(xiii)增加M2巨噬细胞、(xiv)增加M2巨噬细胞活性、(xv)增加N2中性粒细胞、(xvi)增加N2中性粒细胞活性、(xvii)增加T细胞活化的抑制、(xviii)增加CTL活化的抑制、(xix)增加NK细胞活化的抑制、(xx)增加T细胞耗竭、(xxi)降低T细胞应答、(xxii)降低细胞毒性细胞的活性、(xxiii)减少抗原特异性记忆应答、(xxiv)抑制细胞的凋亡或溶解、(xxv)降低对细胞的细胞毒性作用或细胞抑制作用、(xxvi)减少细胞的直接杀死、(xxvii)降低Th17活性和/或(xxviii)减少补体依赖的细胞毒性和/或抗体依赖细胞介导的细胞毒性，前提条件是所述抗VISTA抗体或抗原结合片段可引发与(i)-(xxviii)中的一者或多者相反的作用并且任选用于治疗自体免疫、变态反应、炎症、移植或败血症。
41.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其用于在人受试者中治疗或预防变态反应、自体免疫、移植、基因疗法、炎症、癌症、GVHD或败血症，或者用于治疗或预防与上述任一者相关的炎症、自体免疫性或变应性副作用。
42.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括施用另一免疫调节抗体或融合蛋白，其选自靶向CTLA4、PD-1、PDL-1、LAG-3、TIM-3、BTLA、B7-H4、B7-H3、VISTA中的一者或多者的免疫抑制性抗体或融合蛋白，和/或靶向CD40、CD137、OX40、GITR、CD27、CD28或ICOS中的一者或多者的激动性抗体或融合蛋白。
43.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其包括在治疗之前、治疗同时和/或治疗之后测定个体的细胞中或体液中的VISTA蛋白。
44.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其包括测定造血细胞上的VISTA水平。
45.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其包括测定选自髓系细胞和/或淋巴细胞、单核细胞或中性粒细胞、T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞或自然杀伤T(NKT)细胞中的任何一种或多种的造血细胞上的VISTA水平。
46.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述激动性抗人VISTA抗体或片段包含与选自VSTB49-VSTB116的抗体相同的CDR和可任选进行突变的人IgG2Fc区。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述IgG2恒定区或Fc区保留天然FcR结合和/或结合CD32A的能力。
48.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述激动性抗人VISTA抗体或片段具有对人VISTA的亲和力或KD，所述亲和力或KD在37℃下通过表面等离振子共振测定为50M或更低。
49.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述激动性抗人VISTA抗体或片段具有对人VISTA的亲和力或KD，所述亲和力或KD在37℃下通过表面等离振子共振测定为1nM或更低。
50.一种使用激动性抗人VISTA抗体在体外或体内引发免疫抑制的方法。
51.一种使用根据权利要求29、30或31所述的激动性抗VISTA抗体治疗自体免疫病症的方法。
52.一种使用根据权利要求29、30或31所述的激动性抗VISTA抗体治疗变应性病症的方法。
53.一种使用根据权利要求29、30或31所述的激动性抗VISTA抗体治疗炎症性病症的方法。
54.一种通过施用免疫抑制性或激动性抗人VISTA抗体或抗体片段在有需要的受试者例如患有急性或慢性人自体免疫病症、变应性病症和炎症性病症的个体中治疗或预防自体免疫、变态反应和炎症的方法，其中所述免疫抑制性或激动性抗人VISTA抗体或抗体片段。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述免疫抑制性或激动性抗人VISTA抗体或抗体片段激发人VISTA对免疫的至少一种作用，例如其对T细胞活性、分化和增殖、细胞因子水平以及B细胞免疫的抑制作用。
56.一种治疗或预防狼疮或狼疮样病症或狼疮样症状的方法或者一种逆转、稳定和减少与狼疮或狼疮样病症相关的病理症状的方法，所述方法通过施用免疫抑制性或激动性抗人VISTA抗体或抗体片段来实现。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述激动性抗人VISTA抗体或抗体片段可激发人VISTA对免疫的至少一种作用，例如其对T细胞活性、分化和增殖、细胞因子水平和B细胞免疫的抑制作用。
58.根据权利要求56或57所述的方法，其中所述狼疮或狼疮样病症选自“全身性红斑狼疮”或(“SLE”)、皮肤型狼疮或皮肤狼疮、药物诱导的狼疮和新生儿狼疮。
59.根据权利要求56、57或58所述的方法，其中所述狼疮或狼疮样病症是全身性红斑狼疮(“SLE”)。
60.一种通过施用免疫抑制性或激动性抗人VISTA抗体或抗体片段来在有需要的受试者中治疗或预防与自体免疫病症或炎症性病症相关的肾炎、炎症性肾损伤或蛋白尿的方法。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述激动性抗人VISTA抗体或抗体片段可激发人VISTA对免疫的至少一种作用，例如其对T细胞活性、分化和增殖的抑制作用、其对细胞因子水平和B细胞免疫的作用。
62.一种通过施用免疫抑制性或激动性抗人VISTA抗体或抗体片段来在有需要的受试者中治疗或预防涉及炎症诱导的脾肿大或淋巴组织增生的炎症性病症的方法。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述免疫抑制性或激动性抗人VISTA抗体或抗体片段可激发人VISTA对免疫的至少一种作用，例如其对T细胞活性、分化和增殖、细胞因子水平和B细胞免疫的抑制作用。
64.一种通过施用免疫抑制性或激动性抗人VISTA抗体或抗体片段来在有需要的受试者中促进IL-9表达和/或减少LIX/CXCL5表达的方法。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述激动性抗人VISTA抗体或抗体片段可激发人VISTA对免疫的至少一种作用，例如其对T细胞活性、分化和增殖、细胞因子水平和B细胞免疫的抑制作用。
66.一种治疗、抑制或预防狼疮或狼疮样病症的至少一种病理性副作用的方法，其中所述症状包括蛋白尿、自身抗体、细胞因子及与炎症相关的其他因子的表达增加、肾脏炎症(即狼疮性肾炎)、肾脏损伤、肺部血压增加(即肺动脉高压)、呼吸困难、神经系统和脑的炎症、颅内血管炎症、动脉硬化或冠状动脉疾病、皮疹、皮肤损害、脱发或前述症状的任何组合，所述方法通过施用免疫抑制性或激动性抗人VISTA抗体或抗体片段来实现。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述激动性抗人VISTA抗体或抗体片段可激发人VISTA对免疫的至少一种作用，例如其对T细胞活性、分化和增殖、细胞因子水平和B细胞免疫的抑制作用。
68.根据前述权利要求任一项所述的方法，其还包括施用用于治疗狼疮的另一种药物，所述另一种药物任选选自皮质类固醇、其他抗炎药剂、抗疟疾药物、抗凝血剂、ACTH、其他免疫抑制剂诸如甲氨蝶呤、环磷酰胺和其他免疫调节抗体诸如贝利木单抗(belimumab)。
69.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述激动性抗VISTA抗体包含以下的任何组合：其增强VISTA对T细胞免疫的抑制作用、其抑制CD4+或CD8+ T细胞增殖、其抑制CD4+或CD8+ T细胞活化、其抑制促炎细胞因子或炎症性化学引诱物诸如KC和MIP-2的产生和/或其抑制体液免疫和/或自身抗体的产生。
70.一种在人类患者中预防GVHD并发症如急性或慢性GVHD的发展的方法，其包括给所述人类患者施用免疫抑制性或激动性抗人VISTA抗体或抗体片段。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述激动性抗人VISTA抗体或抗体片段可激发人VISTA对免疫的至少一种作用，例如其对T细胞活性、分化和增殖、细胞因子水平以及B细胞免疫的抑制作用。
72.一种在人类患者中治疗GVHD并发症如急性或慢性GVHD的方法，其包括给所述人类患者施用免疫抑制性或激动性抗人VISTA抗体或抗体片段。
73.根据权利要求72所述的方法，其中所述免疫抑制性或激动性抗人VISTA抗体或抗体片段。
74.根据权利要求73所述的方法，其中所述抗体可激发人VISTA对免疫的至少一种作用，例如其对T细胞活性、分化和增殖、细胞因子水平以及B细胞免疫的抑制作用。
75.一种处理待移植进受体中的器官、组织或免疫细胞以预防急性或慢性GvHD应答的方法，所述方法通过使所述待移植进受体中的器官、组织或免疫细胞与免疫抑制性或激动性抗人VISTA抗体或抗体片段接触来实现。
76.根据权利要求75所述的方法，其中所述抗体可激发人VISTA对免疫的至少一种作用，例如其对T细胞活性、分化和增殖、细胞因子水平和B细胞免疫的抑制作用。
77.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述移植的细胞、组织或器官是同种异体或异种的，例如同种异体骨髓或造血细胞或者骨髓谱系细胞的同种异体前体。
78.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述免疫抑制性或激动性抗人VISTA抗体或所述抗体片段在移植之前、同时或之后或它们的组合施用。
79.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述移植物包含施用给所述受试者以治疗血液的恶性或遗传性疾病或其他疾病，例如再生障碍性贫血、骨髓纤维化或化疗和放疗后的骨髓衰竭的同种异体细胞。
80.一种用于在作为骨髓移植受体的受试者中降低机会性感染的易感性的方法，包括选择已具有同种异体骨髓或造血干细胞移植物的受试者；并给所述受试者施用治疗有效量的包含VISTA激动性抗体的药物组合物和有效量的机会性感染的抗原；其中所述药物组合物和所述抗原可在所述受试者中降低所述机会性感染的易感性。
81.根据前述权利要求任一项所述的方法，还包括将所述移植细胞、组织或器官与免疫抑制性药物一起施用或相接触，以及/或者所述方法还包括施用或使用另一种药物，所述另一种药物任选选自TNF-α拮抗剂、IL-6拮抗剂、羟氯喹、皮质类固醇、其他抗炎剂、抗凝剂、ACTH和其他免疫抑制剂诸如甲氨蝶呤、环磷酰胺、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、来氟米特(leflunomide)、金硫基苹果酸钠(sodium aurothiomalate)、环孢菌素、B细胞耗竭性和抑制性抗体以及其他免疫调节抗体。
82.一种治疗或预防牛皮癣或另一种炎症性皮肤病症例如涉及免疫细胞如T细胞浸润的炎症性皮肤病症的方法，或者一种逆转、稳定和减少与牛皮癣或另一种炎性皮肤病症例如涉及免疫细胞浸润的炎症性皮肤病症相关的病理症状的方法，所述方法通过施用免疫抑制性或激动性抗人VISTA抗体或抗体片段来实现。
83.根据权利要求82所述的方法，其中所述激动性抗人VISTA抗体或抗体片段可激发人VISTA对免疫的至少一种作用，例如其对T细胞活性、分化和增殖、细胞因子水平和B细胞免疫的抑制作用。
84.根据权利要求82或83所述的方法，其中所述牛皮癣或另一种炎症性皮肤病症例如涉及免疫细胞浸润的炎症性皮肤病症选自斑块状牛皮癣、脓疱性牛皮癣、皮褶性牛皮癣、滴状牛皮癣、红皮病性牛皮癣、药物诱导的牛皮癣，或者包含斑块状牛皮癣。
85.一种通过施用免疫抑制性或激动性抗人VISTA抗体或抗体片段在有需要的受试者中治疗或预防、抑制、逆转或防止CD3+ T细胞浸润进组织中的方法，其中所述浸润与自体免疫病症或炎症性病症的病理学相关。
86.根据权利要求85所述的方法，其中所述激动性抗人VISTA抗体或抗体片段可激发人VISTA对免疫的至少一种作用，例如其对T细胞活性、分化和增殖的抑制作用、其对细胞因子水平和B细胞免疫的作用。
87.一种通过施用免疫抑制性或激动性抗人VISTA抗体或抗体片段来治疗、抑制或预防牛皮癣或另一种炎症性皮肤病症的至少一种病理性副作用的方法，其中所述症状包括严重瘙痒、皮肤斑块、发红、其他皮肤变色或斑片、皮疹、皮肤脓疱、皮肤鳞屑、指甲凹陷或变色或者前述症状的任何组合。
88.根据权利要求82-87所述的方法，其中所述激动性抗人VISTA抗体或抗体片段可激发人VISTA对免疫的至少一种作用，例如其对T细胞活化、分化和增殖的抑制作用、其对抗炎和促炎细胞因子水平的作用以及其对B细胞免疫的抑制作用。
89.根据前述权利要求任一项所述的方法，其还包括施用用于治疗牛皮癣或另一种炎症性皮肤病症的另一种药物，所述另一种药物任选选自IL-12拮抗剂、IL-17拮抗剂、IL-23拮抗剂、TNF-α拮抗剂、IL-6拮抗剂、羟氯喹、皮质类固醇、其他抗炎剂、ACTH和其他免疫抑制剂诸如甲氨蝶呤、环磷酰胺、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、来氟米特(leflunomide)、金硫基苹果酸钠(sodium aurothiomalate)、环孢菌素、类视黄醇类、维生素D类似物、环孢菌素、氨甲酰羟基脲(hydroxycarbamide)、富马酸酯诸如富马酸二甲酯，以及其他免疫调节抗体。
90.一种治疗或预防关节炎或关节炎样病症或者关节炎和关节炎样症状的方法，或者一种逆转、稳定和减轻与关节炎和关节炎样病症相关的病理症状的方法，所述方法通过施用免疫抑制性或激动性抗人VISTA抗体或抗体片段来实现。
91.根据权利要求90所述的方法，其中所述免疫抑制性或激动性抗人VISTA抗体或抗体片段可激发人VISTA对免疫的至少一种作用，例如其对T细胞活性、分化和增殖、细胞因子水平以及B细胞免疫的抑制作用。
92.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述关节炎和关节炎样病症选自类风湿性关节炎(“RA”)、牛皮癣关节炎(“PA”)和骨关节炎(“OA”)。
93.根据权利要求90所述的方法，其中所述关节炎和关节炎样病症是RA。
94.一种通过施用免疫抑制性或激动性抗人VISTA抗体或抗体片段来在有需要的受试者中治疗或预防与自体免疫或炎症性病症相关的关节炎症或关节疼痛的方法。
95.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述免疫抑制性或激动性抗人VISTA抗体或抗体片段可激发人VISTA对免疫的至少一种作用，例如其对T细胞活性、分化和增殖的抑制作用、其对细胞因子水平以及B细胞免疫的作用。
96.一种通过施用免疫抑制性或激动性抗人VISTA抗体或抗体片段来治疗、抑制或预防关节炎或关节炎样病症的至少一种病理副性作用的方法，其中所述症状包括关节损伤、关节疼痛、肺或心脏炎症、低红血细胞计数、发热、急性或慢性疲劳、血管炎、纤维化诸如肺纤维化、肾淀粉样变性、动脉粥样硬化、心肌梗塞、中风或前述症状的任何组合。
97.一种在人类患者中预防或治疗急性或慢性感染以及与急性或慢性感染相关的炎性应答和/或细胞因子应答的方法，其包括给所述人类患者施用免疫抑制性或激动性抗人VISTA抗体或抗体片段。
98.根据权利要求97所述的方法，其中所述免疫抑制性或激动性抗人VISTA抗体或抗体片段可激发人VISTA对免疫的至少一种作用，例如其对T细胞活性、分化和增殖、促炎细胞因子水平和B细胞免疫的抑制作用。
99.一种在人类患者中预防或治疗急性或慢性肝炎感染以及与急性或慢性肝炎感染相关的炎症性应答和/或细胞因子应答的方法，其包括给所述人类患者施用免疫抑制性或激动性抗人VISTA抗体或抗体片段。
100.根据权利要求99所述的方法，其中所述激动性抗人VISTA抗体或抗体片段可激发人VISTA对免疫的至少一种作用，例如其对T细胞活性、分化和增殖、促炎细胞因子水平和B细胞免疫的抑制作用。
101.一种在人类患者中预防或治疗肝毒性或肝损伤例如与急性或慢性感染相关的肝毒性或肝损伤以及与急性或慢性感染或肝硬化或者酒精或药物滥用相关的炎性应答和/或细胞因子应答的方法，其包括给所述人类患者施用激动性抗人VISTA抗体或抗体片段。
102.根据权利要求101所述的方法，其中所述激动性抗人VISTA抗体或抗体片段可激发人VISTA对免疫的至少一种作用，例如其对T细胞活性、分化和增殖、促炎细胞因子水平和B细胞免疫的抑制作用。
103.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述受治疗的患者患有甲型、乙型、丙型、丁型、戊型或庚型肝炎。
104.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述受治疗的患者患有甲型或丙型肝炎。
105.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述激动性抗人VISTA抗体或抗体片段可激发人VISTA对免疫的至少一种作用，例如其对T细胞活化、分化和增殖的抑制作用、其对抗炎和促炎细胞因子水平的作用以及其对B细胞免疫的抑制作用。
106.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述激动性抗VISTA抗体通过全身性或非全身性施用途径模式施用。
107.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述激动性抗VISTA抗体通过注射、局部、吸入或口服来施用。
108.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述激动性抗VISTA抗体通过静脉内施用、皮下施用、动脉内施用、肌肉内施用、肠胃外施用、脊柱施用或表皮施用(例如通过注射或输注)来施用。
109.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述激动性抗VISTA抗体通过全身性或非全身性施用途径模式施用。
110.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述激动性抗VISTA抗体通过静脉内施用、皮下施用、动脉内施用、肌肉内施用、肠胃外施用、脊柱施用或表皮施用(例如通过注射或输注)来施用。
111.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中将所述VISTA激动性抗体与另一种免疫激动剂联合施用，所述另一种免疫激动剂为例如激动性抗PD-1抗体或抗体片段、激动性抗PD-L1抗体或抗体片段、激动性PD-L1多肽或其片段(其可以是单价的或多聚体的)、激动性PD-1多肽或其片段(其可以是单价的或多聚体的)或包含前述任一者的复合物或融合蛋白。
112.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述VISTA激动性抗体是人型、人源化型、多特异性型或嵌合型的。
113.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述VISTA激动性抗体包含可任选进行突变的人IgG2恒定区或Fc区。
114.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述VISTA激动性抗体包含人IgG2恒定结构域或其片段或者hIgG1、hIgG3、hIgG4、IgA、IgD、IgE或IgM，其中所述抗体的整个或基本上整个铰链结构域和CH1结构域以及任选整个或基本上整个轻链恒定区已用hIgG2的相应的整个或基本上整个轻链以及铰链结构域和CH1结构域(“H2区”或“H2结构域”)置换。
115.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述VISTA激动性抗体包含人IgG2恒定结构域或其片段，其中第127位的重链半胱氨酸残基和第214位的轻链半胱氨酸残基(其中编号方式是根据Kabat)中的一者或二者缺失或改变成不同的氨基酸残基，从而导致所得的经修饰的抗体的激动特性相对于其中这些残基未改变的抗体增加。
116.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述VISTA激动性抗体包含人IgG2恒定结构域或其片段，其中所述抗体的H2区中第214位的半胱氨酸残基被突变或用另一个氨基酸置换和/或重链的第127、232或233位的半胱氨酸残基中的一者或多者缺失或用另一个氨基酸置换。
117.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述VISTA激动性抗体包含人IgG2恒定结构域或其片段，其中至少一个半胱氨酸残基缺失或改变成另一个氨基酸。
118.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述激动性抗体包含根据权利要求29-31中任一项中所述的抗体。
119.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述VISTA激动性抗体与1E8、GA1、GG8中的任一者或具有图4中所示序列的任何其他抗体竞争，或与1E8、GA1、GG8中的任一者或具有图4中所示序列的任何其他抗体结合至人VISTA上的相同表位。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108795875A (zh) * 2012-04-30 2018-11-13 达特茅斯大学理事会 T细胞受体缺陷型t细胞组合物
CN110642950A (zh) * 2019-07-25 2020-01-03 熊浩 一种人源化t细胞活化的v域免疫抑制因子抗原结合片段
CN111004327A (zh) * 2019-08-15 2020-04-14 北京天广实生物技术股份有限公司 结合vista的抗体及其用途

Families Citing this family (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107098958B (zh) 2010-03-26 2021-11-05 达特茅斯大学理事会 Vista调节性t细胞介体蛋白、vista结合剂及其用途
US10745467B2 (en) 2010-03-26 2020-08-18 The Trustees Of Dartmouth College VISTA-Ig for treatment of autoimmune, allergic and inflammatory disorders
US20150231215A1 (en) 2012-06-22 2015-08-20 Randolph J. Noelle VISTA Antagonist and Methods of Use
US9890215B2 (en) 2012-06-22 2018-02-13 King's College London Vista modulators for diagnosis and treatment of cancer
CA2884704C (en) 2012-09-07 2023-04-04 Randolph J. Noelle Vista modulators for diagnosis and treatment of cancer
WO2014190356A2 (en) * 2013-05-24 2014-11-27 Amplimmune, Inc. Anti-b7-h5 antibodies and their uses
MX369173B (es) 2013-12-24 2019-10-30 Janssen Pharmaceutica Nv Anticuerpos y fragmentos anti-vista.
US11014987B2 (en) 2013-12-24 2021-05-25 Janssen Pharmaceutics Nv Anti-vista antibodies and fragments, uses thereof, and methods of identifying same
CN107073109B (zh) 2014-06-11 2021-08-06 凯西·A·格林 Vista激动剂和拮抗剂抑制或增强体液免疫的用途
WO2016090347A1 (en) 2014-12-05 2016-06-09 Immunext, Inc. Identification of vsig8 as the putative vista receptor and its use thereof to produce vista/vsig8 modulators
BR112017027870A2 (pt) 2015-06-24 2018-08-28 Janssen Pharmaceutica Nv anticorpos e fragmentos anti-vista
BR112018016461A2 (pt) 2016-02-12 2019-10-01 Janssen Pharmaceutica Nv anticorpos e fragmentos anti-vista, usos dos mesmos e métodos de identificação dos mesmos
MX2018012469A (es) 2016-04-15 2019-07-04 Immunext Inc Anticuerpos vista antihumanos y uso de los mismos.
KR20230133934A (ko) 2016-10-11 2023-09-19 아게누스 인코포레이티드 항-lag-3 항체 및 이의 사용 방법
CN111201038A (zh) 2017-01-11 2020-05-26 戊瑞治疗有限公司 Psgl-1拮抗剂及其用途
WO2018156180A1 (en) 2017-02-24 2018-08-30 Kindred Biosciences, Inc. Anti-il31 antibodies for veterinary use
JP7211961B2 (ja) 2017-03-14 2023-01-24 ファイヴ プライム セラピューティクス インク 酸性ｐＨでＶＩＳＴＡに結合する抗体
BR112020011810A2 (pt) * 2017-12-12 2020-11-17 Macrogenics, Inc. molécula de ligação cd16 x antígeno de doença, composição farmacêutica, uso da composição farmacêutica, e método para o tratamento de uma doença
US20190300610A1 (en) * 2018-03-29 2019-10-03 Hummingbird Bioscience Pte. Ltd. Vista antigen-binding molecules
GB201814562D0 (en) 2018-09-07 2018-10-24 Hummingbird Bioscience Pte Ltd Vista antigen-binding molecules
BR112021000934A2 (pt) 2018-07-20 2021-04-27 Pierre Fabre Medicament receptor para vista
US10836828B2 (en) 2019-02-06 2020-11-17 Pionyr Immunotherapeutics, Inc. Anti-TREM1 antibodies and related methods
BR112021015479A2 (pt) * 2019-02-06 2021-12-28 Pionyr Immunotherapeutics Inc Anticorpos anti-trem1 e métodos relacionados
EP3946622A1 (en) * 2019-04-01 2022-02-09 Lakepharma, Inc. Btla-binding (cd272) antibodies for modulating immune response and treating disease
EP3980463A4 (en) * 2019-06-04 2023-06-28 Verseau Therapeutics, Inc. Anti-psgl-1 compositions and methods for modulating myeloid cell inflammatory phenotypes and uses thereof
CA3148740A1 (en) * 2019-08-06 2021-02-11 Aprinoia Therapeutics Limited Antibodies that bind to pathological tau species and uses thereof
WO2021041972A1 (en) * 2019-08-29 2021-03-04 Kindred Biosciences, Inc. Anti-il31 antibodies for veterinary use
KR20220155336A (ko) * 2020-03-18 2022-11-22 킨드레드 바이오사이언시스, 인코포레이티드 수의학적 용도를 위한 항-il4 수용체 항체
US20230235034A1 (en) * 2020-05-26 2023-07-27 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Monoclonal antibodies against pathological tau, and methods using same
WO2022036196A2 (en) * 2020-08-14 2022-02-17 The Trustees Of Dartmouth College Use of vista agonist for treatment/prevention of cytokine storm or crs or sepsis and/or acute or chronic respiratory distress syndrome (rds)
US11124568B1 (en) * 2020-08-19 2021-09-21 Vitruviae LLC CD3/CD25 antibodies for neuro-immune diseases
US11197910B1 (en) 2020-08-19 2021-12-14 Vitruviae LLC Fusion proteins for the diagnosis, prophylaxis and treatment of infectious diseases
CA3197359A1 (en) * 2020-11-04 2022-05-12 Randolph J. Noelle Vista agonist for treatment/prevention of ischemic and/or reperfusion injury
EP4301472A1 (en) 2021-03-05 2024-01-10 Dynamicure Biotechnology LLC Anti-vista constructs and uses thereof
TW202309088A (zh) 2021-04-30 2023-03-01 法商皮爾法伯製藥公司 新的穩定抗ｖｉｓｔａ抗體
EP4359002A1 (en) * 2021-06-25 2024-05-01 Sunnybrook Research Institute Vista agonists and related compositions and methods
CN118076893A (zh) * 2021-10-08 2024-05-24 艾贝乐医药科技有限公司 用于检测钙粘蛋白-17蛋白的组合物和方法
WO2023213814A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Pierre Fabre Medicament New formulation of anti vista antibody
WO2024053929A1 (ko) * 2022-09-05 2024-03-14 주식회사 시클리드 항 vista 모노클로날 항체 및 이의 용도
WO2024054929A1 (en) * 2022-09-07 2024-03-14 Dynamicure Biotechnology Llc Anti-vista constructs and uses thereof
WO2024121380A1 (en) 2022-12-08 2024-06-13 Pierre Fabre Medicament Vaccinal composition and adjuvant

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103119054A (zh) * 2010-03-26 2013-05-22 达特茅斯大学理事会 Vista调节性t细胞介体蛋白、vista结合剂及其用途
WO2015179799A1 (en) * 2014-05-22 2015-11-26 The General Hospital Corporation DD1alpha RECEPTOR AND USES THEREOF IN IMMUNE DISORDERS

Family Cites Families (238)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
NO812612L (no) 1980-08-06 1982-02-08 Ferring Pharma Ltd Enzym-inhibitorer.
US4366241A (en) 1980-08-07 1982-12-28 Syva Company Concentrating zone method in heterogeneous immunoassays
US4517288A (en) 1981-01-23 1985-05-14 American Hospital Supply Corp. Solid phase system for ligand assay
US4475196A (en) 1981-03-06 1984-10-02 Zor Clair G Instrument for locating faults in aircraft passenger reading light and attendant call control system
US4447233A (en) 1981-04-10 1984-05-08 Parker-Hannifin Corporation Medication infusion pump
US4873191A (en) 1981-06-12 1989-10-10 Ohio University Genetic transformation of zygotes
US4439196A (en) 1982-03-18 1984-03-27 Merck & Co., Inc. Osmotic drug delivery system
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4447224A (en) 1982-09-20 1984-05-08 Infusaid Corporation Variable flow implantable infusion apparatus
US4870009A (en) 1982-11-22 1989-09-26 The Salk Institute For Biological Studies Method of obtaining gene product through the generation of transgenic animals
US4487603A (en) 1982-11-26 1984-12-11 Cordis Corporation Implantable microinfusion pump system
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4486194A (en) 1983-06-08 1984-12-04 James Ferrara Therapeutic device for administering medicaments through the skin
EP0154316B1 (en) 1984-03-06 1989-09-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified lymphokine and production thereof
US5288641A (en) 1984-06-04 1994-02-22 Arch Development Corporation Herpes Simplex virus as a vector
US4736866A (en) 1984-06-22 1988-04-12 President And Fellows Of Harvard College Transgenic non-human mammals
JPS6147500A (ja) 1984-08-15 1986-03-07 Res Dev Corp Of Japan キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法
EP0173494A3 (en) 1984-08-27 1987-11-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric receptors by dna splicing and expression
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
US4699880A (en) 1984-09-25 1987-10-13 Immunomedics, Inc. Method of producing monoclonal anti-idiotype antibody
JPS61134325A (ja) 1984-12-04 1986-06-21 Teijin Ltd ハイブリツド抗体遺伝子の発現方法
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US5374548A (en) 1986-05-02 1994-12-20 Genentech, Inc. Methods and compositions for the attachment of proteins to liposomes using a glycophospholipid anchor
MX9203291A (es) 1985-06-26 1992-08-01 Liposome Co Inc Metodo para acoplamiento de liposomas.
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
DE3689123T2 (de) 1985-11-01 1994-03-03 Xoma Corp Modulare einheit von antikörpergenen, daraus hergestellte antikörper und verwendung.
CA1291031C (en) 1985-12-23 1991-10-22 Nikolaas C.J. De Jaeger Method for the detection of specific binding agents and their correspondingbindable substances
JPS63502716A (ja) 1986-03-07 1988-10-13 マサチューセッツ・インステチュート・オブ・テクノロジー 糖タンパク安定性の強化方法
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
EP0264166B1 (en) 1986-04-09 1996-08-21 Genzyme Corporation Transgenic animals secreting desired proteins into milk
US4954617A (en) 1986-07-07 1990-09-04 Trustees Of Dartmouth College Monoclonal antibodies to FC receptors for immunoglobulin G on human mononuclear phagocytes
US4902505A (en) 1986-07-30 1990-02-20 Alkermes Chimeric peptides for neuropeptide delivery through the blood-brain barrier
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4881175A (en) 1986-09-02 1989-11-14 Genex Corporation Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
US4987071A (en) 1986-12-03 1991-01-22 University Patents, Inc. RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods
US5116742A (en) 1986-12-03 1992-05-26 University Patents, Inc. RNA ribozyme restriction endoribonucleases and methods
EP0307434B2 (en) 1987-03-18 1998-07-29 Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. Altered antibodies
US5013653A (en) 1987-03-20 1991-05-07 Creative Biomolecules, Inc. Product and process for introduction of a hinge region into a fusion protein to facilitate cleavage
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5132405A (en) 1987-05-21 1992-07-21 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
DE3856559T2 (de) 1987-05-21 2004-04-29 Micromet Ag Multifunktionelle Proteine mit vorbestimmter Zielsetzung
US4904582A (en) 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US4873316A (en) 1987-06-23 1989-10-10 Biogen, Inc. Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals
US5080891A (en) 1987-08-03 1992-01-14 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
US5476996A (en) 1988-06-14 1995-12-19 Lidak Pharmaceuticals Human immune system in non-human animal
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
ATE135370T1 (de) 1988-12-22 1996-03-15 Kirin Amgen Inc Chemisch modifizierte granulocytenkolonie erregender faktor
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5328470A (en) 1989-03-31 1994-07-12 The Regents Of The University Of Michigan Treatment of diseases by site-specific instillation of cells or site-specific transformation of cells and kits therefor
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
US5763266A (en) 1989-06-15 1998-06-09 The Regents Of The University Of Michigan Methods, compositions and devices for maintaining and growing human stem and/or hematopoietics cells
DE3923279A1 (de) 1989-07-14 1990-01-18 Will W Prof Dr Minuth Minusheets ist ein neues produkt, um zellen in beliebigen behaeltnissen in hochdifferenzierter form auf einer moeglichst natuerlichen unterlage zu kultivieren
DE69032809T2 (de) 1989-11-06 1999-07-08 Cell Genesys Inc Herstellung von Proteinen mittels homologer Rekombination
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
US5272071A (en) 1989-12-22 1993-12-21 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Method for the modification of the expression characteristics of an endogenous gene of a given cell line
US6153737A (en) 1990-01-11 2000-11-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Derivatized oligonucleotides having improved uptake and other properties
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
AU633698B2 (en) 1990-01-12 1993-02-04 Amgen Fremont Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5283173A (en) 1990-01-24 1994-02-01 The Research Foundation Of State University Of New York System to detect protein-protein interactions
US5521288A (en) 1990-03-26 1996-05-28 Bristol-Myers Squibb Company CD28IG fusion protein
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
WO1992003918A1 (en) 1990-08-29 1992-03-19 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5747469A (en) 1991-03-06 1998-05-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions comprising DNA damaging agents and p53
US5547853A (en) 1991-03-12 1996-08-20 Biogen, Inc. CD2-binding domain of lymphocyte function associated antigen 3
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
EP1400536A1 (en) 1991-06-14 2004-03-24 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
US5844095A (en) 1991-06-27 1998-12-01 Bristol-Myers Squibb Company CTLA4 Ig fusion proteins
US5851795A (en) 1991-06-27 1998-12-22 Bristol-Myers Squibb Company Soluble CTLA4 molecules and uses thereof
IL99120A0 (en) 1991-08-07 1992-07-15 Yeda Res & Dev Multimers of the soluble forms of tnf receptors,their preparation and pharmaceutical compositions containing them
US6335434B1 (en) 1998-06-16 2002-01-01 Isis Pharmaceuticals, Inc., Nucleosidic and non-nucleosidic folate conjugates
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
US5932448A (en) 1991-11-29 1999-08-03 Protein Design Labs., Inc. Bispecific antibody heterodimers
ATE275198T1 (de) 1991-12-02 2004-09-15 Medical Res Council Herstellung von antikörpern auf phagenoberflächen ausgehend von antikörpersegmentbibliotheken.
EP0746609A4 (en) 1991-12-17 1997-12-17 Genpharm Int NON-HUMAN TRANSGENIC ANIMALS CAPABLE OF PRODUCING HETEROLOGOUS ANTIBODIES
US5776427A (en) 1992-03-05 1998-07-07 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for targeting the vasculature of solid tumors
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
AU4116793A (en) 1992-04-24 1993-11-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
US6172208B1 (en) 1992-07-06 2001-01-09 Genzyme Corporation Oligonucleotides modified with conjugate groups
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
EP0672131B1 (en) 1992-10-30 2003-12-17 The General Hospital Corporation A novel cell cycle control protein
GB9223377D0 (en) 1992-11-04 1992-12-23 Medarex Inc Humanized antibodies to fc receptors for immunoglobulin on human mononuclear phagocytes
GB9225453D0 (en) 1992-12-04 1993-01-27 Medical Res Council Binding proteins
GB9302660D0 (en) 1993-02-10 1993-03-24 Sihra Kirpal S A building system
AU6445894A (en) 1993-03-19 1994-10-11 Duke University Method of treatment of tumors with an antibody binding to tenascin
EP0754225A4 (en) 1993-04-26 2001-01-31 Genpharm Int HETEROLOGIC ANTIBODY-PRODUCING TRANSGENIC NON-HUMAN ANIMALS
DE69434342T2 (de) 1993-06-04 2006-03-16 The United States Of America Represented By The Secretary Of The Navy Verfahren zur selektiven Stimulierung der T-Zellproliferation.
JPH08511420A (ja) 1993-06-16 1996-12-03 セルテック・セラピューテイクス・リミテッド 抗 体
CA2170869C (en) 1993-09-03 1999-09-14 Phillip Dan Cook Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides
CA2195557C (en) 1994-08-12 2006-10-17 Shui-On Leung Immunoconjugates and humanized antibodies specific for b-cell lymphoma and leukemia cells
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5801155A (en) 1995-04-03 1998-09-01 Epoch Pharmaceuticals, Inc. Covalently linked oligonucleotide minor grove binder conjugates
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6096532A (en) 1995-06-07 2000-08-01 Aastrom Biosciences, Inc. Processor apparatus for use in a system for maintaining and growing biological cells
US5985653A (en) 1995-06-07 1999-11-16 Aastrom Biosciences, Inc. Incubator apparatus for use in a system for maintaining and growing biological cells
US6410690B1 (en) 1995-06-07 2002-06-25 Medarex, Inc. Therapeutic compounds comprised of anti-Fc receptor antibodies
US5811097A (en) 1995-07-25 1998-09-22 The Regents Of The University Of California Blockade of T lymphocyte down-regulation associated with CTLA-4 signaling
GB9517779D0 (en) 1995-08-31 1995-11-01 Roslin Inst Edinburgh Biological manipulation
GB9517780D0 (en) 1995-08-31 1995-11-01 Roslin Inst Edinburgh Biological manipulation
US5723125A (en) 1995-12-28 1998-03-03 Tanox Biosystems, Inc. Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide
US6750334B1 (en) 1996-02-02 2004-06-15 Repligen Corporation CTLA4-immunoglobulin fusion proteins having modified effector functions and uses therefor
US6444806B1 (en) 1996-04-30 2002-09-03 Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc. Conjugates and methods of forming conjugates of oligonucleotides and carbohydrates
US5922845A (en) 1996-07-11 1999-07-13 Medarex, Inc. Therapeutic multispecific compounds comprised of anti-Fcα receptor antibodies
US6653104B2 (en) 1996-10-17 2003-11-25 Immunomedics, Inc. Immunotoxins, comprising an internalizing antibody, directed against malignant and normal cells
ATE336240T1 (de) 1996-11-13 2006-09-15 Cold Spring Harbor Lab Therapeutische verwendung von stickstoffmonoxydinhibitoren
US6593372B2 (en) 1996-11-13 2003-07-15 Cold Spring Harbor Laboratory Therapeutic uses for nitric oxide inhibitors
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
US20060084082A1 (en) 1997-03-07 2006-04-20 Human Genome Sciences, Inc. 186 human secreted proteins
DE19742706B4 (de) 1997-09-26 2013-07-25 Pieris Proteolab Ag Lipocalinmuteine
WO1999026657A1 (en) 1997-11-25 1999-06-03 Musc Foundation For Research Development Inhibitors of nitric oxide synthase
US6982323B1 (en) 1997-12-23 2006-01-03 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Chimeric proteins for diagnosis and treatment of diabetes
US6006758A (en) 1998-02-03 1999-12-28 University Of Maryland Method and device for the detection and removal of head lice
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
PT1071700E (pt) 1998-04-20 2010-04-23 Glycart Biotechnology Ag Modificação por glicosilação de anticorpos para melhorar a citotoxicidade celular dependente de anticorpos
US6300319B1 (en) 1998-06-16 2001-10-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Targeted oligonucleotide conjugates
US6383778B1 (en) 1998-07-28 2002-05-07 The Regents Of The University Of California Nucleic acids encoding a G-protein coupled receptor involved in sensory transduction
US7098312B2 (en) 1998-09-01 2006-08-29 Genetech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20030096955A1 (en) 1998-09-01 2003-05-22 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US6335437B1 (en) 1998-09-07 2002-01-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for the preparation of conjugated oligomers
IL127127A0 (en) 1998-11-18 1999-09-22 Peptor Ltd Small functional units of antibody heavy chain variable regions
CA2352286C (en) 1998-11-24 2011-07-12 Bristol-Myers Squibb Company Intracellular targeted delivery of compounds by 70 kd heat shock protein
US6818418B1 (en) 1998-12-10 2004-11-16 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
US7115396B2 (en) 1998-12-10 2006-10-03 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
KR100940380B1 (ko) 1999-01-15 2010-02-02 제넨테크, 인크. 효과기 기능이 변화된 폴리펩티드 변이체
ES2571230T3 (es) 1999-04-09 2016-05-24 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Procedimiento para controlar la actividad de una molécula inmunofuncional
US6696686B1 (en) 1999-06-06 2004-02-24 Elgems Ltd. SPECT for breast cancer detection
EP1194539A2 (en) 1999-06-25 2002-04-10 Universität Zürich Hetero-associating coiled-coil peptides and screening method therefor
WO2001001137A1 (en) 1999-06-30 2001-01-04 Children's Medical Center Corporation Fusion protein and uses thereof
US7754855B1 (en) 1999-07-13 2010-07-13 Bolder Biotechnology, Inc. Immunoglobulin fusion proteins
MXPA02001877A (es) 1999-08-23 2002-08-20 Dana Farber Cancer Inst Inc Pd-1, un receptor para b7-4, y usos del mismo.
MXPA02001911A (es) 1999-08-24 2003-07-21 Medarex Inc Anticuerpos ctla-4 humanos y sus usos.
US6395437B1 (en) 1999-10-29 2002-05-28 Advanced Micro Devices, Inc. Junction profiling using a scanning voltage micrograph
MY135721A (en) 2000-03-24 2008-06-30 Pharmacia Corp Amidino compounds useful as nitric oxide synthase inhibitors
NZ521540A (en) 2000-04-11 2004-09-24 Genentech Inc Multivalent antibodies and uses therefor
US6545170B2 (en) 2000-04-13 2003-04-08 Pharmacia Corporation 2-amino-5, 6 heptenoic acid derivatives useful as nitric oxide synthase inhibitors
US6559279B1 (en) 2000-09-08 2003-05-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Process for preparing peptide derivatized oligomeric compounds
CA2421447C (en) 2000-09-08 2012-05-08 Universitat Zurich Collections of repeat proteins comprising repeat modules
CA2424668A1 (en) 2000-10-06 2002-04-11 Novartis Ag Targeting molecules for adenoviral vectors
ES2405944T3 (es) 2000-11-30 2013-06-04 Medarex, Inc. Ácidos nucleicos que codifican las secuencias de inmunoglobulina humana reorganizadas a partir de ratones transcromoscómicos transgénicos zadas
US6911311B2 (en) 2001-01-04 2005-06-28 Myriad Genetics, Inc. Method of detecting protein-protein interactions
US20050063948A1 (en) 2001-03-08 2005-03-24 Dickerson Erin B. Methods for targeting interleukin-12 to malignant endothelium
WO2002097031A2 (en) 2001-03-28 2002-12-05 Incyte Genomics, Inc. Molecules for diagnostics and therapeutics
ITTV20010035A1 (it) 2001-03-30 2002-09-30 Bettio Group Srl Zanzariera con dispositivo di aggancio e sgancio rapido della barra maniglia
WO2002092780A2 (en) 2001-05-17 2002-11-21 Diversa Corporation Novel antigen binding molecules for therapeutic, diagnostic, prophylactic, enzymatic, industrial, and agricultural applications, and methods for generating and screening thereof
DK2116259T3 (da) 2001-05-24 2012-05-21 Zymogenetics Inc TACI-immunoglobulinfusionsproteiner
US20030031671A1 (en) 2001-08-01 2003-02-13 Sydney Welt Methods of treating colon cancer utilizing tumor-specific antibodies
AU2002319544B2 (en) 2001-08-10 2008-07-10 Aberdeen University Antigen binding domains from fish
US6797493B2 (en) 2001-10-01 2004-09-28 Lee-Hwei K. Sun Fc fusion proteins of human granulocyte colony-stimulating factor with increased biological activities
AU2002337935B2 (en) 2001-10-25 2008-05-01 Genentech, Inc. Glycoprotein compositions
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
AU2003217912A1 (en) 2002-03-01 2003-09-16 Xencor Antibody optimization
ES2330211T3 (es) 2002-03-15 2009-12-07 Schering Corporation Metodo para modular los receptores cd200.
CN102911987B (zh) 2002-04-09 2015-09-30 协和发酵麒麟株式会社 基因组被修饰的细胞
FI2206517T3 (fi) 2002-07-03 2023-10-19 Ono Pharmaceutical Co Immuunopotentioivia koostumuksia käsittäen anti-PD-L1 -vasta-aineita
GB2392158B (en) 2002-08-21 2005-02-16 Proimmune Ltd Chimeric MHC protein and oligomer thereof
US7521543B2 (en) 2002-10-23 2009-04-21 Ludwig Institute For Cancer Research A34 and A33-like 3 DNA, proteins, antibodies thereto and methods of treatment using same
EP1563074B1 (en) 2002-11-12 2018-01-10 VAXum, LLC. Adenoviral vector vaccine
WO2004056875A1 (en) 2002-12-23 2004-07-08 Wyeth Antibodies against pd-1 and uses therefor
US20090010920A1 (en) 2003-03-03 2009-01-08 Xencor, Inc. Fc Variants Having Decreased Affinity for FcyRIIb
JP4871126B2 (ja) 2003-07-04 2012-02-08 アフィボディ・アーベー Ｈｅｒ２に対する結合親和性を有するポリペプチド
AU2003275958A1 (en) 2003-08-25 2005-03-10 Pieris Proteolab Ag Muteins of tear lipocalin
US20060134105A1 (en) 2004-10-21 2006-06-22 Xencor, Inc. IgG immunoglobulin variants with optimized effector function
SG149004A1 (en) 2003-12-05 2009-01-29 Bristol Myers Squibb Co Inhibitors of type 2 vascular endothelial growth factor receptors
US20050256576A1 (en) 2004-05-13 2005-11-17 Moskowitz Nathan C Artificial expansile total lumbar and thoracic discs for posterior placement without supplemental instrumentation and its adaptation for anterior placement of artificial cervical, thoracic and lumbar discs
DE602005016917D1 (de) 2004-05-13 2009-11-12 Lilly Co Eli Fgf-21-fusionsproteine
DK1781682T3 (da) 2004-06-24 2013-06-03 Mayo Foundation B7-H5, et kostimulerende polypeptid
EP1814573B1 (en) 2004-10-29 2016-03-09 ratiopharm GmbH Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (fgf)
ES2545533T3 (es) 2004-11-01 2015-09-11 The Regents Of The University Of California Composiciones y métodos para modificación de biomoléculas
US7700099B2 (en) 2005-02-14 2010-04-20 Merck & Co., Inc. Non-immunostimulatory antibody and compositions containing the same
US8231872B2 (en) 2005-04-25 2012-07-31 The Trustees Of Dartmouth College Regulatory T cell mediator proteins and uses thereof
US8236304B2 (en) 2005-04-25 2012-08-07 Trustees Of Dartmouth College Use of PD-L3 proteins and PD-L3 specific antibodies or antibody fragments to regulate CD4+ and CD8+ T cell immunity
MX349137B (es) 2005-06-08 2017-07-13 Dana-Farber Cancer Inst Metodos y composiciones para el tratamiento de infecciones persistentes y cancer por inhibicion de la ruta de muerte celular programada (pd-1).
US20070009880A1 (en) 2005-07-11 2007-01-11 Toledo Luis H Methods And Solutions For Storing Donor Organs
US7531164B2 (en) 2005-10-21 2009-05-12 Duke University Preventing bacterial or viral infectivity and composition containing infection preventing additive
US7655778B2 (en) 2006-02-28 2010-02-02 Curonix Co., Ltd. SISP-1, a novel p53 target gene and use thereof
WO2008027236A2 (en) 2006-08-30 2008-03-06 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
EP1958957A1 (en) 2007-02-16 2008-08-20 NascaCell Technologies AG Polypeptide comprising a knottin protein moiety
SI2235064T1 (sl) 2008-01-07 2016-04-29 Amgen Inc. Metoda za izdelavo heterodimernih molekul - protitelesa fc z uporabo elektrostatičnih usmerjevalnih učinkov
AU2009276717A1 (en) 2008-07-28 2010-02-04 Emergent Product Development Seattle, Llc Multi-specific binding proteins targeting B cell disorders
US20110159023A1 (en) 2008-08-25 2011-06-30 Solomon Langermann Pd-1 antagonists and methods for treating infectious disease
EP2349291B1 (en) 2008-10-03 2012-12-05 Emory University Agonists of toll-like receptor 5 for the treatment of graft-versus-host disease
US20100316639A1 (en) 2009-06-16 2010-12-16 Genentech, Inc. Biomarkers for igf-1r inhibitor therapy
US10053513B2 (en) 2009-11-30 2018-08-21 Janssen Biotech, Inc. Antibody Fc mutants with ablated effector functions
MY159679A (en) 2009-12-10 2017-01-13 Hoffmann La Roche Antibodies binding preferentially human csf1r extracellular domain 4 and their use
JP5786204B2 (ja) 2010-01-19 2015-09-30 イミューノメディクス、インコーポレイテッドＩｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ， Ｉｎｃ． インスリン様増殖因子ｉ型受容体（ｉｇｆ−１ｒ）を標的とする新規クラスの単一特異性ヒト化抗体および二重特異性ヒト化抗体
US20180237525A9 (en) 2010-03-26 2018-08-23 Randolph J. Noelle VISTA Agonist and Methods of Use
US10745467B2 (en) 2010-03-26 2020-08-18 The Trustees Of Dartmouth College VISTA-Ig for treatment of autoimmune, allergic and inflammatory disorders
US20150231215A1 (en) 2012-06-22 2015-08-20 Randolph J. Noelle VISTA Antagonist and Methods of Use
US20110243943A1 (en) 2010-04-02 2011-10-06 Athena Discovery, Inc. Treatment using relaxin-fusion proteins with extended in vivo half-lives
JP6126991B2 (ja) * 2010-09-27 2017-05-10 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド ヒトｉｉ型コラーゲンに結合する抗体
US9028826B2 (en) 2011-04-04 2015-05-12 The Trustees Of Dartmouth College Methods of immune therapy with anti-CD154 antibodies having impaired FcR binding and/or complement binding properties
KR102221068B1 (ko) 2011-08-10 2021-02-25 란케나우 인스티튜트 포 메디칼 리서치 자가면역 및 염증성 질환의 치료를 위한 방법 및 조성물
WO2013184912A2 (en) 2012-06-06 2013-12-12 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Binding agents that modulate the hippo pathway and uses thereof
US9890215B2 (en) 2012-06-22 2018-02-13 King's College London Vista modulators for diagnosis and treatment of cancer
EP2864352B1 (en) 2012-06-22 2018-08-08 The Trustees Of Dartmouth College Novel vista-ig constructs and the use of vista-ig for treatment of autoimmune, allergic and inflammatory disorders
CA2884704C (en) 2012-09-07 2023-04-04 Randolph J. Noelle Vista modulators for diagnosis and treatment of cancer
WO2014190356A2 (en) 2013-05-24 2014-11-27 Amplimmune, Inc. Anti-b7-h5 antibodies and their uses
AU2014274660B2 (en) 2013-06-06 2019-05-16 Pierre Fabre Médicament Anti-C10orf54 antibodies and uses thereof
US11014987B2 (en) 2013-12-24 2021-05-25 Janssen Pharmaceutics Nv Anti-vista antibodies and fragments, uses thereof, and methods of identifying same
MX369173B (es) * 2013-12-24 2019-10-30 Janssen Pharmaceutica Nv Anticuerpos y fragmentos anti-vista.
CA2936926C (en) 2014-01-14 2023-08-29 Mark Spaller Vista antagonist and methods of use
EP3125920B1 (en) 2014-04-04 2020-12-23 Del Mar Pharmaceuticals Dianhydrogalactitol, diacetyldianhydrogalactitol or dibromodulcitol to treat non-small-cell carcinoma of the lung and ovarian cancer
CN107073109B (zh) 2014-06-11 2021-08-06 凯西·A·格林 Vista激动剂和拮抗剂抑制或增强体液免疫的用途
WO2016090347A1 (en) 2014-12-05 2016-06-09 Immunext, Inc. Identification of vsig8 as the putative vista receptor and its use thereof to produce vista/vsig8 modulators
BR112017027870A2 (pt) 2015-06-24 2018-08-28 Janssen Pharmaceutica Nv anticorpos e fragmentos anti-vista
BR112018016461A2 (pt) 2016-02-12 2019-10-01 Janssen Pharmaceutica Nv anticorpos e fragmentos anti-vista, usos dos mesmos e métodos de identificação dos mesmos
MX2018012469A (es) * 2016-04-15 2019-07-04 Immunext Inc Anticuerpos vista antihumanos y uso de los mismos.
WO2017181109A1 (en) 2016-04-15 2017-10-19 Michael Molloy Anti-human vista antibodies and use thereof
US11649285B2 (en) 2016-08-03 2023-05-16 Bio-Techne Corporation Identification of VSIG3/VISTA as a novel immune checkpoint and use thereof for immunotherapy

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103119054A (zh) * 2010-03-26 2013-05-22 达特茅斯大学理事会 Vista调节性t细胞介体蛋白、vista结合剂及其用途
WO2015179799A1 (en) * 2014-05-22 2015-11-26 The General Hospital Corporation DD1alpha RECEPTOR AND USES THEREOF IN IMMUNE DISORDERS

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANN L WHITE等: "Conformation of the human immunoglobulin G2 hinge imparts superagonistic properties to immunostimulatory anticancer antibodies", 《CANCER CELL》 *
DALLAS B FLIES等: "Coinhibitory receptor PD-1H preferentially suppresses CD4+ T cell–mediated immunity", 《J CLIN INVEST》 *
DALLAS B FLIES等: "Cutting edge: A Monoclonal Antibody Specific for the Programmed Death-1 Homolog Prevents Graft Versus Host Disease in Mouse Models", 《J IMMUNOL》 *
DALLAS B FLIES等: "Mechanistic Assessment of PD-1H Coinhibitory Receptor-Induced T Cell Tolerance to Allogeneic Antigens", 《J IMMUNOL》 *
LEKH N DAHAL等: "FcγR requirements leading to successful immunotherapy", 《IMMUNOL REV》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108795875A (zh) * 2012-04-30 2018-11-13 达特茅斯大学理事会 T细胞受体缺陷型t细胞组合物
CN110642950A (zh) * 2019-07-25 2020-01-03 熊浩 一种人源化t细胞活化的v域免疫抑制因子抗原结合片段
CN110642950B (zh) * 2019-07-25 2021-10-01 广东新征程生命科学有限公司 一种人源化t细胞活化的v域免疫抑制因子抗原结合片段
CN111004327A (zh) * 2019-08-15 2020-04-14 北京天广实生物技术股份有限公司 结合vista的抗体及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
MY198667A (en) 2023-09-14
KR102564248B1 (ko) 2023-08-09
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US11649283B2 (en) 2023-05-16
SG11201808633RA (en) 2018-10-30
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US20170306023A1 (en) 2017-10-26
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CL2019002195A1 (es) 2020-01-10
MX2023007987A (es) 2023-09-22
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