DE69434342T2 - Verfahren zur selektiven Stimulierung der T-Zellproliferation. - Google Patents

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Description

  • Die Entwicklung von Techniken zur Vermehrung von T-Zellpopulationen in vitro war für viele der kürzlich erworbenen Fortschritte beim Verständnis der Antigenerkennung durch T-Zellen und der Aktivierung von T-Zellen entscheidend. Die Entwicklung von Kultivierungsverfahren für die Erzeugung von menschlichen Antigen-spezifischen T-Zellclonen war bei der Bestimmung von Antigenen, die durch Pathogene exprimiert werden, und von Tumoren, die durch T-Zellen erkannt werden, von Nutzen, um Verfahren der Immuntherapie zu etablieren, um eine Vielzahl von menschlichen Krankheiten zu behandeln. Antigen-spezifische T-Zellen können in vitro für den Gebrauch in einer adoptiven zellulären Immuntherapie vermehrt werden, für welche gezeigt wurde, dass Infusionen von solchen T-Zellen eine anti-Tumor-Reaktivität in einem Tumor tragenden Wirt aufweisen. Adoptive Immuntherapie ist auch verwendet worden, um virale Infektionen in abwehrgeschwächten Individuen zu behandeln.
  • Techniken zur Vermehrung von menschlichen T-Zellen in vitro basierten auf dem Gebrauch von akzessorischen Zellen und exogenen Wachstumsfaktoren wie IL-2. Die Verwendung von IL-2 und zum Beispiel einem anti-CD3-Antikörper zur Stimulierung der T-Zellproliferation vermehrt bekanntlich die CD8+-Subpopulation von T-Zellen. Das Benötigen von MHC-übereinstimmenden Antigen präsentierenden Zellen als akzessorische Zellen stellt ein bedeutsames Problem für Langzeit-Kultivierungssysteme dar. Antigen präsentierende Zellen besitzen eine relativ kurze Lebensdauer. Somit müssen Antigen präsentierende Zellen in einem Langzeit-Kultivierungssystem kontinuierlich aus einer Quelle erhalten und nachgefüllt werden. Die Notwendigkeit einer erneuerbaren Quelle für akzessorische Zellen ist für die Behandlung von Immunschwächen, bei denen akzessorische Zellen betroffen sind, problematisch. Während der Behandlung einer viralen Infektion können darüber hinaus akzessorische Zellen, die das Virus tragen können, zu einer Kontamination der gesamten T-Zellpopulation während einer Langzelt-Kultivierung führen. Ein alternatives Kultivierungsverfahren zur Clonierung und Vermehrung von menschlichen T-Zellen in vitro in Abwesenheit von exogenen Wachstumsfaktoren und akzessorischen Zellen wäre eindeutig von Vorteil.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein in vitro-Verfahren zur Induktion der Proliferation einer Population von T-Zellen, umfassend das Inkontaktbringen einer Population von T-Zellen mit einer Festphasenoberfläche, welche darauf direkt immobilisiert enthält:
    • (a) einen ersten Wirkstoff, welcher ein primäres Aktivierungssignal für die T-Zellen bereitstellt und dabei die T-Zellen aktiviert; und
    • (b) einen zweiten Wirkstoff, welcher ein akzessorisches Molekül auf der Oberfläche der T-Zellen stimuliert und dabei die aktivierten T-Zellen stimuliert, wobei der erste und zweite Wirkstoff dabei die T-Zellen zur Proliferation induziert.
  • Somit betrifft die Erfindung Verfahren, um selektiv die ex vivo-Vermehrung einer Population von T-Zellen in der Abwesenheit von exogenen Wachstumsfaktoren wie Lymphokinen und von akzessorischen Zellen zu induzieren. Darüber hinaus kann die T-Zell-Proliferation ohne die Notwendigkeit eines Antigens induziert werden, wodurch eine vermehrte Population von T-Zellen bereitgestellt wird, die in Bezug auf eine Antigen-Reaktivität polyclonal ist. Das Verfahren sorgt für eine andauernde Proliferation einer ausgewählten Population von CD4+- oder CD8+-T-Zellen über einen dauerhaften Zeitraum, was einen vielfachen Anstieg der Anzahl dieser Zellen bezogen auf die ursprüngliche Population von T-Zellen ergibt.
  • Dem erfindungsgemäßen Verfahren entsprechend wird eine Population von T-Zellen induziert, indem die T-Zellen aktiviert werden und ein akzessorisches Molekül auf der Oberfläche der T-Zellen durch einen Liganden, der das akzessorische Molekül bindet, stimuliert wird. Die Aktivierung einer Population von T-Zellen wird erreicht, indem die T-Zellen mit einem ersten Wirkstoff, der ein TCR/CD3-Komplex-assoziiertes Signal in den T-Zellen stimuliert, in Kontakt gebracht werden. Die Stimulierung eines TCR/CD3-Komplex-assoziierten Signals in einer T-Zelle wird entweder durch Verknüpfen des T-Zell-Rezeptor-TCR/CD3-Komplexes oder des CD2-Oberflächenproteins erreicht oder indem direkt Rezeptor-gekoppelte Signalwege stimuliert werden. Daher wird ein anti-CD3-Antikörper, ein anti-CD2-Antikörper oder ein Proteinkinase C-Aktivator gemeinsam mit einem Calcium-Ionophor verwendet, um eine Population von T-Zellen zu aktivieren.
  • Um die Proliferation zu induzieren, wird eine aktivierte Population von T-Zellen mit einem zweiten Wirkstoff, der ein akzessorisches Molekül auf der Oberfläche der T-Zellen stimuliert, in Kontakt gebracht. Zum Beispiel kann eine Population von CD4+-T-Zellen mit Hilfe eines anti-CD28-Antikörpers, der gegen das CD28-Molekül auf der Oberfläche der T-Zellen gerichtet ist, zur Proliferation stimuliert werden. Die Proliferation einer Population von CD8+-T-Zellen wird durch die Verwendung des monoclonalen Antikörpers ES5.2D8 erreicht, welcher an ein akzessorisches Molekül bindet, das ein Molekulargewicht von etwa 27 kD aufweist und auf aktivierten T-Zellen vorhanden ist. In einer anderen Ausführungsform kann die Proliferation einer aktivierten Population von T-Zellen durch die Stimulierung eines oder mehrerer intrazellulärer Signale, welche von der Verknüpfung eines akzessorischen Moleküls wie CD28 herrühren, induziert werden.
  • Nach der Aktivierung und Stimulierung eines akzessorischen Moleküls auf der Oberfläche der T-Zellen wird der Verlauf der Proliferation der T-Zellen als Reaktion auf eine dauerhafte Aussetzung gegenüber einem Liganden oder einem anderen Wirkstoff, der intrazellulär die Stimulierung eines durch das akzessorische Molekül vermittelten Reaktionsweges bewirkt, überwacht. Wenn die Rate der T-Zellproliferation abnimmt, werden die T-Zellen zum Beispiel durch einen zusätzlichen anti-CD3-Antikörper und einen costimulierenden Liganden reaktiviert und restimuliert, um eine weitere Proliferation zu induzieren. In einer Ausführungsform wird die Rate der T-Zellproliferation durch die Untersuchung der Zellgröße überwacht. In einer anderen Ausführungsform wird die T-Zellproliferation überwacht, indem die Expression der Zelloberflächenmoleküle in Reaktion auf die Aussetzung gegenüber dem Liganden oder einem anderen Wirkstoff wie B7-1 oder B7-2 überprüft wird. Die Überwachung und Restimulierung der T-Zellen kann für eine dauerhafte Proliferation wiederholt werden, um eine Population von T-Zellen herzustellen, die hinsichtlich ihrer Anzahl gegenüber der ursprünglichen Population von T-Zellen um das etwa 100- bis 100000-fache erhöht ist.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren kann verwendet werden, um ausgewählte Populationen von T-Zellen für die Verwendung bei der Behandlung einer Infektionskrankheit oder von Krebs zu vermehren. Die resultierende Population von T-Zellen kann genetisch transduziert und für eine Immuntherapie verwendet werden oder sie kann für eine in vitro-Analyse von Infektionserregern wie HIV verwendet werden. Die Proliferation einer Population von CD4+-Zellen, die von einem mit HIV infizierten Individuum erhalten werden, kann erreicht und den Zellen eine Resistenz gegenüber einer HIV-Infektion verliehen werden. Nach der Vermehrung der Population von T-Zellen auf eine ausreichende Anzahl werden die vermehrten T-Zellen dem Individuum wieder eingesetzt. In ähnlicher Weise kann eine Population von tumorinfiltrierenden Lymphocyten von einem Individuum, das unter Krebs leidet, erhalten werden und die T-Zellen können zur Proliferation auf eine ausreichende Anzahl stimuliert und dem Individuum wieder eingesetzt werden. Darüber hinaus sind die Überstände von Kulturen von T-Zellen, die in Übereinstimmung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren vermehrt wurden, eine reiche Quelle für Cytokine und können verwendet werden, um T-Zellen in vivo oder in vitro am Leben zu erhalten.
  • 1 stellt in vitro-Wachstumskurven von CD4+-T-Zellen aus peripherem Blut in Reaktion auf die Kultur entweder mit einem anti-CD3-Antikörper und Interleukin-2 (IL-2) (•-•), einem anti-CD3-Antikörper und einem anti-CD28-Antikörper mAb 9.3 (
    Figure 00040001
    ) oder mit PHA alleine dar (Δ-Δ).
  • 2 stellt die Wachstumskurve von CD4+-T-Zellen aus peripherem Blut dar, die in fötalem Kälberserum mit entweder anti-CD3-Antikörpern und IL-2 (•-•) oder mit einem anti-CD3-Antikörper und dem anti-CD28-Antikörper mAb 9.3 (
    Figure 00040002
    ) kultiviert wurden.
  • 3 stellt die Wachstumskurve von CD4+-T-Zellen aus peripherem Blut dar, die in der Anwesenheit von Phorbolmyristinsäure (PMA) und Ionomycin mit oder ohne IL-2 oder mit dem anti-CD28-Antikörper mAb 9.3 kultiviert wurden. Die Symbole sind wie folgt: PMA und Ionomycin (P+I) werden repräsentiert durch (∎); PMA, Ionomycin und IL-2 (P+I+IL-2) werden repräsentiert durch (•); und PMA, Ionomycin und anti-CD28-Antikörper (P+I+9.3) werden repräsentiert durch (
    Figure 00040003
    ).
  • 4 ist eine schematische Darstellung der selektiven Vermehrung von CD4+-T-Zellen nach einer Stimulierung mit CD28 im Vergleich zu einer T-Zell-Stimulierung mit IL-2.
  • 5 stellt eine Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierungsanalyse (FACS) dar, in welcher die Zellen nach der Isolierung (Tag 0, 5A-1 bis 5A-4) oder nach 26 Tagen in Kultur entweder mit einer CD3+-CD28-Stimulierung (5B-1 bis 5B-4) oder einer CD3+-IL-2-Stimulierung (5C-1 bis 5C-4) mit mit Phycoerythrin konjugierten anti-CD3-, CD4-, CD8-Antikörpern oder mit einem monoclonalen IgG2a-Kontrollantikörper, gefärbt wurden und die Fluoreszenz mit einem Durchflusscytometer quantifiziert, wurde.
  • 6 zeigt eine FACS-Analyse des monoclonalen Antikörpers EX5.3D10, die die Reaktivität mit CD28 im Vergleich zu dem monoclonalen anti-CD28-Antikörper 9.3 darstellt. Die folgenden Zelllinien wurden getestet: 6A-1 bis 6A-3, nicht transfizierte CHO-DG44-Zellen; 6B-1 bis 6B-3, CHO-HH-Zellen; 6C-1 bis 6C-3, nicht aktivierte Lymphocyten aus peripherem Blut; und 6D-1 bis 6D-3, Jurkat Nr.7-Zellen.
  • 7 zeigt eine FACS-Analyse des monoclonalen Antikörpers ES5.2D8, die die Bindungsreaktivität mit den folgenden Zelllinien darstellt: 7A-1 und 7A-2, CHO-DG44-Zellen; 7B-1 und 7B-2, CHO-105A-Zellen; 7C, nicht aktivierte menschliche Lymphocyten aus peripherem Blut (hPBLs); und 7D, PMA-aktivierte Lymphocyten aus peripherem Blut.
  • 8 ist eine Photographie, die eine Immunpräzipitationsanalyse von mit Detergenz behandelten Lysaten von oberflächenmarkierten aktivierten menschlichen T-Zellen darstellt und anzeigt, dass der monoclonale Antikörper ES5.2D8 mit einem Zelloberflächenprotein mit einer Größe von 27 kD reagiert.
  • 9 stellt die Erhöhungen des mittleren Zellvolumens von CD4+-T-Zellen nach der Stimulierung (S1, S2, S3, S4, S5 und S6) mit einem monoclonalen anti-CD3-Antikörper und einem monoclonalen anti-CD28-Antikörper über Tage hinweg in einer Kultur dar.
  • 10 stellt die zyklische Expression von B7-1 auf CD4+-T-Zellen nach Stimulierung (S1, S2, S3, S4 S5 und S6) mit einem monoclonalen anti-CD3-Antikörper und einem monoclonalen anti-CD28-Antikörper über Tage hinweg in Kultur dar.
  • 11 ist eine Säulengraphik, die die durch CD4+-T-Zellen nach der Stimulierung mit einem monoclonalen anti-CD3-Antikörper und einem monoclonalen anti-CD28-Antikörper oder IL-2 über Tage hinweg in einer Kultur produzierte Menge an IL-2 darstellt.
  • 12 ist eine Säulengraphik, die die durch CD4+-T-Zellen nach der Stimulierung mit einem monoclonalen anti-CD3-Antikörper und einem monoclonalen anti-CD28-Antikörper oder IL-2 über Tage hinweg in einer Kultur produzierte Menge an Granulocyten-Macrophagen-koloniestimulierendem Faktor (GM-CSF) darstellt.
  • 13 ist eine Säulengraphik, die die durch CD4+-T-Zellen nach der Stimulierung mit einem monoclonalen anti-CD3-Antikörper und einem monoclonalen anti-CD28-Antikörper oder IL-2 über Tage hinweg in einer Kultur produzierte Menge an Tumornekrosefaktor (TNF) darstellt.
  • 14 ist eine Säulengraphik, die die Vielfalt der T-Zellrezeptoren in CD4+-T-Zellen nach der Stimulierung mit einem monoclonalen anti-CD3-Antikörper und einem monoclonalen anti-CD28-Antikörper an Tag 1 und Tag 24 einer Kultur darstellt.
  • 15 stellt die Färbung der Oberfläche von CD4+-T-Zellen, die von einem HIV-seronegativen Individuum erhalten wurden, nach der Stimulierung (S1, S2 und S3) mit einem monoclonalen anti-CD3-Antikörper und einem monoclonalen anti-CD28-Antikörper über Tage hinweg in Kultur, dar.
  • 16 stellt die Färbung der Zelloberfläche von CD4+-T-Zellen, die von einem HIV-seropositiven Individuum erhalten wurden, nach der Stimulierung (S1, S2 und S3) mit einem monoclonalen anti-CD3-Antikörper und einem monoclonalen anti-CD28-Antikörper über Tage hinweg in Kultur erhalten wurden, dar.
  • 17 stellt die Vermehrung von CD8+-T-Zellen nach der Stimulierung mit einem monoclonalen anti-CD3-Antikörper und dem monoclonalen Antikörper ES5.2D8 an Tag 4 und Tag 7 der Kultur dar.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren ermöglichen die selektive Stimulierung der Proliferation und der Vermehrung einer Population von T-Zellen in vitro auf eine bedeutende Anzahl in Abwesenheit von exogenen Wachstumsfaktoren oder akzessorischen Zellen. Die Interaktion zwischen dem T-Zellrezeptor TCR/CD3-Komplex und einem Antigen, das in Verbindung mit Molekülen entweder des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) der Klasse I oder der Klasse II auf einer Antigen-präsentierenden Zelle präsentiert wird, leitet eine Serie von biochemischen Ereignissen ein, die Antigen-spezifische T-Zellen-Aktivierung genannt wird. Der Ausdruck „T-Zellen-Aktivierung" wird hier verwendet, um einen Status zu definieren, in dem eine T-Zellen-Reaktion durch ein primäres Signal wie durch den TCR/CD3-Komplex, aber nicht notwendigerweise aufgrund einer Interaktion mit einem Proteinantigen eingeleitet oder aktiviert worden ist. Eine T-Zelle wird aktiviert, wenn sie ein primäres Signalisierungsereignis empfangen hat, das eine Immunantwort durch die T-Zelle einleitet.
  • Die Aktivierung von T-Zellen kann durch die Stimulierung des T-Zell-TCR/CD3-Komplexes oder über die Stimulierung des CD2-Oberflächenproteins erreicht werden. Ein monoclonaler anti-CD3-Antikörper kann verwendet werden, um eine Population von T-Zellen über den TCR/CD3-Komplex zu aktivieren. Obwohl eine Anzahl von monoclonalen anti-Mensch-CD3-Antikörpern im Handel erhältlich ist, ist OKT3, der aus von der American Type Culture Collection erhaltenen Hybridomzellen präpariert wurde, oder der monoclonale Antikörper G19-4 bevorzugt. In ähnlicher Weise wird die Bindung eines anti-CD2-Antikörpers T-Zellen aktivieren. Stimulierende Formen von anti-CD2-Antikörpern sind bekannt und erhältlich. Eine Stimulierung durch CD2 mit anti-CD2-Antikörpern wird typischerweise unter der Verwendung von mindestens zwei verschiedenen anti-CD2-Antikörpern erreicht. Stimulierende Kombinationen von anti-CD2-Antikörpern, die beschrieben wurden, schließen die folgenden ein: den T11.3-Antikörper in Kombination mit dem T11.1- oder dem T11.2-Antikörper (Meuer, S.C. et al. (1984) Cell 36:897–906) und den 9.6-Antikörper (der das gleiche Epitop wie T11.1 erkennt) in Kombination mit dem 9-1-Antikörper (Yang, S.Y. et al. (1986) J. Immunol. 137:1097–1100). Andere Antikörper, die an die gleichen Epitope wie die vorstehend beschriebenen Antikörper binden, können ebenfalls verwendet werden. Zusätzliche Antikörper oder Kombinationen von Antikörpern können durch Standard-Techniken hergestellt und identifiziert werden.
  • Obwohl die Stimulierung des TCR/CD3-Komplexes oder des CD2-Moleküls für die Bereitstellung eines primären Aktivierungssignals in einer T-Zelle benötigt wird, wurde eine Anzahl von Molekülen auf der Oberfläche der T-Zellen, akzessorische oder costimulierende Moleküle genannt, mit der Regulation der Transition einer ruhenden T-Zelle zu einer Blastentransformation und nachfolgend einer Proliferation und Differenzierung in Verbindung gebracht. Zusätzlich zu dem durch den TCR/CD3-Komplex bereitgestellten primären Aktivierungssignal benötigt die Induktion von T-Zellantworten also ein zweites costimulierendes Signal. Es wird angenommen, dass ein solches costimulierendes oder akzessorisches Molekül, CD28, einen Signaltransduktionsweg einleitet oder reguliert, der sich von den durch den TCR-Komplex stimulierten unterscheidet.
  • Um dementsprechend die Proliferation einer aktivierten Population von T-Zellen (d.h. eine Population von T-Zellen, die ein primäres Aktivierungssignal empfangen hat) in Abwesenheit von exogenen Wachstumsfaktoren oder akzessorischen Zellen zu induzieren, wird ein akzessorisches Molekül auf der Oberfläche der T-Zelle, wie CD28, durch einen Liganden, der das akzessorische Molekül bindet, oder durch einen Wirkstoff stimuliert, der intrazellulär in der T-Zelle die Stimulierung eines Signals, das durch die Bindung des akzessorischen Moleküls vermittelt wird, hervorruft. In einer Ausführungsform wird die Stimulierung des akzessorischen Moleküls CD28 erreicht, indem eine aktivierte Population von T-Zellen mit einem Liganden, der CD28 bindet, in Kontakt gebracht wird. Die Aktivierung der T-Zellen zum Beispiel mit einem anti-CD3-Antikörper und die Stimulierung des akzessorischen Moleküls CD28 führen zu einer selektiven Proliferation von CD4+-T-Zellen. Ein monoclonaler anti-CD28-Antikörper oder ein Fragment davon, der/das das CD28-Molekül quervernetzen kann, oder ein natürlicher Ligand für CD28 (z.B. ein Mitglied der B7-Proteinfamilie wie B7-1 (CD80) und B7-2 (CD86) (Freedman, A.S. et al. (1987) J. Immunol. 137:3260–3267; Freeman, G.J. et al. (1989) J. Immunol. 143:2714–2722; Freeman, G.J et al. (1991) J. Exp. Med. 174:625–631; Freeman, G.J. et al. (1993) Science 262:909–911; Azuma, M. et al. (1993) Nature 366:76–79; Freeman, G.J. et al. (1993) J. Exp. Med. 178:2185–2192) kann verwendet werden, um die Stimulierung des CD28-Moleküls zu induzieren. Darüber hinaus können auch Bindungshomologe eines natürlichen Liganden, ob nativ oder durch chemische oder rekombinante Techniken synthetisiert, in Übereinstimmung mit der Erfindung verwendet werden. Für die Stimulierung eines akzessorischen Moleküls nützliche Liganden sind in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung direkt auf eine Festphasenoberfläche immobilisiert. Anti-CD28-Antikörper oder Fragmente davon, die für die Stimulierung der Proliferation von CD4+-T-Zellen nützlich sind, schließen den monoclonalen Antikörper 9.3, einen IgG2a-Antikörper (Dr. Jeffery Ledbetter, Bristol Myers Squibb Corporation, Seattle, WA), den monoclonalen Antikörper KOLT-2, einen IgG1-Antikörper, 15E8, einen IgG1-Antikörper, 248.23.2, einen IgM-Antikörper und EX5.3D10, einen IgG2a-Antikörper ein.
  • Ein bevorzugter anti-CD28-Antikörper ist der monoclonale Antikörper 9.3 oder EX5.3D10. Der monoclonale Antikörper EX5.3D10 stammte von der Immunisierung einer Balb/c-Maus mit CHO (Eierstockzellen des Chinesischen Hamsters)-Zellen, die mit dem menschlichen CD28-Gen transfiziert waren (bezeichnet mit CHO-hh). Hybridome aus der Fusion wurden mit Hilfe einer Ganzzellen-ELISA-Durchmusterung gegen Jurkat (menschliche T-Leukämie)-CD28-Transfektanten, bezeichnet mit Jurkat #7, ausgewählt. Die Reaktivität des monoclonalen Antikörpers EX5.3D10 gegenüber CD28 wurde weiterhin durch eine Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierungsanalyse (FACS) bestätigt, in welcher er Seite an Seite mit dem monoclonalen Antikörper 9.3 getestet wurde (6). Keiner der Antikörper band an nicht transfizierte CHO-DG44-Zellen und ihre Bindungsprofile waren für die zwei CD28-Transfektantenlinien CHO-hh und Jurkat #7 ebenso wie für normale menschliche Lymphocyten aus peripherem Blut nahezu identisch. Ein Hybridom, das den monoclonalen Antikörper EX5.3D10 produziert, wurde am 4. Juni 1993 unter der ATCC-Hinterlegungs-Nr. HB11373 bei der American Type Culture Collection hinterlegt.
  • In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird eine aktivierte Population von CD4+-T-Zellen zur Proliferation stimuliert, indem die T-Zellen mit einem Wirkstoff in Kontakt gebracht werden, der intrazellulär die Stimulierung eines Signals in der T-Zelle hervorruft, welches durch die Verknüpfung eines akzessorischen Moleküls wie CD28 vermittelt wird. Der Ausdruck „Wirkstoff", wie er hier gebraucht wird, ist dafür gedacht, Chemikalien und andere Arzneimittel zu umfassen, welche ein costimulierendes oder anderes Signal in einer T-Zelle ohne die Notwendigkeit einer Interaktion zwischen einem T-Zelloberflächenrezeptor und einem costimulatorischen Molekül oder anderen Liganden stimulieren. Zum Beispiel kann der Wirkstoff intrazellulär die Stimulierung eines mit der CD28-Verknüpfung assoziierten Signals hervorrufen. In einer Ausführungsform ist der Wirkstoff eine nicht-proteinartige Verbindung. Da der in dem Verfahren verwendete Wirkstoff dazu gedacht ist, den natürlichen stimulierenden Rezeptor/Ligand-Mechanismus zu umgehen, ist der Ausdruck Wirkstoff nicht dazu gedacht, eine Zelle, die einen natürlichen Liganden exprimiert, einzuschließen. Natürliche Liganden für CD28 schließen Mitglieder der B7-Proteinfamilie wie B7-1 (CD80) und B7-2 (CD86) ein.
  • Es ist bekannt, dass die Stimulierung des CD28-Rezeptors zur Produktion von D-3-Phosphoinositiden in T-Zellen führt und dass die Inhibierung der Aktivität der Phosphatidylinosit 3-Kinase (PI3K) in einer T-Zelle T-Zell-Antworten wie Lymphokinproduktion und zelluläre Proliferation inhibieren kann. Es wurde gezeigt, dass in T-Zellen nach einer CD28-Verknüpfung auch eine Proteintyrosinphosphorylierung vorkommt, und es wurde demonstriert, dass ein Proteintyrosinkinase-Inhibitor, Herbimycin A, eine durch CD28 induzierte IL-2-Produktion inhibieren kann (Vandenberghe, P. et al. (1992) J. Exp. Med. 175:951–960; Lu, Y. et al. (1992) J. Immunol. 149:24–29). Um also selektiv eine Population von CD4+-T-Zellen zu vermehren, kann der durch den CD28-Rezeptor vermittelte Weg stimuliert werden, indem die T-Zellen mit einem Aktivator von PI3K oder mit einem Wirkstoff, der die Proteintyrosinphosphorylierung in der T-Zelle stimuliert, oder mit beiden in Kontakt gebracht wird. Ein Aktivator von PI3K kann auf der Basis seiner Fähigkeit, die Produktion von mindestens einem D-3-Phosphoinositid in einer T-Zelle zu stimulieren, identifiziert werden. Der Ausdruck „D-3-Phosphoinositid" soll Derivate von Phosphatidylinosit, die an der D-3-Position des Inositrings phosphoryliert sind, einschließen und umfasst die Verbindungen Phosphatidylinosit(3)-monophosphat (PtdIns(3)P), Phosphatidylinosit(3,4)-biphosphat (PtdIns(3,4)P2) und Rhosphatidylinosit(3,4,5)-triphosphat (PtdIns(3,4,5)P3). In der Anwesenheit eines PI3K-Aktivators ist somit die Menge an D-3-Phosphoinositid in der T-Zelle verglichen mit der Menge an D-3-Phosphoinositid in der T-Zelle in Abwesenheit der Substanz erhöht. Die Produktion von D-3-Phosphoinositiden (z.B. PtdIns(3)P, PtdIns(3,4)P2 und/oder PtdIns(3,4,5)P3) in einer T-Zelle kann durch Standard-Verfahren wie Hochdruckflüssigkeitschromatographie oder Dünnschichtchromatographie, wie vorstehend diskutiert, bewertet werden. In ähnlicher Weise kann die Proteintyrosinphosphorylierung in einer T-Zelle stimuliert werden, zum Beispiel indem die T-Zelle mit einem Aktivator von Proteintyrosinkinasen wie Pervanadat in Kontakt gebracht wird (siehe O'Shea, J.J. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10306–10310; und Secrist, J.P. (1993) J. Biol. Chem. 268:5886–5893). In einer anderen Ausführungsform kann die T-Zelle mit einem Wirkstoff, der die Aktivität einer zellulären Proteintyrosinphosphatase wie CD45 inhibiert, in Kontakt gebracht werden, um die Nettomenge an Proteintyrosinphosphorylierung in der T-Zelle zu erhöhen. Jeder dieser Wirkstoffe kann verwendet werden, um eine aktivierte Population von CD4+-T-Zellen in Übereinstimmung mit den hier beschriebenen Verfahren zu vermehren.
  • Um Proliferation zu induzieren und eine Population von CD8+-T-Zellen zu vermehren, wird eine aktivierte Population von T-Zellen mittels eines 27kD großen akzessorischen Moleküls, das auf aktivierten T-Zellen zu finden ist und durch den monoclonalen Antikörper ES5.2D8 erkannt wird, stimuliert. Wie in Beispiel 9 beschrieben, wurde eine Population von CD8+-T-Zellen vorzugsweise durch eine Stimulierung mit einem monoclonalen anti-CD3-Antikörper und dem monoclonalen Antikörper ES5.2D8 vermehrt. Der monoclonale Antikörper ES5.2D8 wurde produziert, indem Mäuse mit aktivierten menschlichen Blutlymphocyten immunisiert und mit rekombinantem menschlichem CTLA4-Protein, das in E. coli produziert worden war, eine Auffrischung erfolgte. Der monoclonale Antikörper ES5.2D8 gehört zu dem IgG2b-Isotyp und bindet spezifisch an Zellen, die mit menschlichem CTLA4 transfiziert wurden. Hybridome, die CTLA4-spezifische Antikörper produzieren, wurden durch Durchmusterung mittels ELISA auf menschliches CTLA4-Protein ebenso wie durch differentielle FACS von Wildtyp-CHO-DG44-Zellen gegenüber CHO-105A-Zellen, die mit dem menschlichen CTLA4-Gen transfiziert sind, identifiziert. Wie in 7 gezeigt, reagiert der Clon ES5.2D8 stark sowohl mit aktivierten menschlichen T-Zellen als auch mit CHO-105A-Zellen, aber nicht mit CHO-DCA4-Zellen, was darauf hindeutet, dass er tatsächlich an CTLA4 bindet. Eine Immunpräzipitation von mit Detergenz behandelten Lysaten von oberflächenmarkierten menschlichen aktivierten T-Zellen zeigte, dass ES5.2D8 auch mit einem 27kD großen Oberflächenprotein reagiert (8). Ein Hybridom, das den monoclonalen Antikörper ES5.2D8 produziert, wurde am 4. Juni 1993 unter der ATCC-Hinterlegungs-Nr. HB11374 bei der American Type Culture Collection hinterlegt.
  • Dementsprechend kann, um eine Population von CD8+-T-Zellen zu vermehren, ein Antikörper wie der monoclonale Antikörper ES5.2D8 oder ein anderer Antikörper, der den gleichen 27kD großen Liganden wie ES5.2D8 erkennt, verwendet werden. Wie in Beispiel 10 beschrieben, wurde das durch den monoclonalen Antikörper ES5.2D8 erkannte Epitop durch die Durchmusterung einer Phagen-Display-Bibliothek (PDL) identifiziert. Antikörper, die an das gleiche Epitop wie der monoclonale Antikörper ES5.2D8 binden, sind im Umfang der Erfindung enthalten. Solche Antikörper können durch eine Immunisierung mit einem Peptidfragment einschließlich des Epitops oder mit dem ursprünglichen 27kD großen Antigen produziert werden. Der Ausdruck „Epitop", wie er hier verwendet wird, bezeichnet den tatsächlichen strukturellen Teil des Antigens, der immunologisch durch eine Antikörperbindestelle gebunden wird. Der Ausdruck wird auch austauschbar mit „Antigendeterminante" verwendet. Ein bevorzugtes Epitop, welches durch einen Antikörper oder einen anderen Liganden, der für die Stimulierung einer Population von CD8+-T-Zellen zu verwenden ist, gebunden wird, schließt ein oder umfasst die Aminosäuresequenz:
    (Xaa1)n-Gly-Xaa2-Trp-Leu-Xaa3-Xaa4-Asp(Glu)-(Xaa5)n (SEQ ID NR. 5),
    wobei Xaa4 vorhanden sein kann oder nicht, Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4 und Xaa5 irgendein Aminosäurerest sind und n=20, mehr bevorzugt 0–10, noch mehr bevorzugt 0–5 und am meisten bevorzugt 0–3 ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist Xaa2 Cys oder Ile, Xaa3 Leu oder Arg und Xaa4, falls vorhanden, Arg oder Pro. Typischerweise sind Xaa7 und Xaa4 zusätzliche Aminosäurereste, die sich entweder an der Amino- oder an der Carboxyseite oder sowohl an der Amino- als auch an der Carboxyseite des Kern-Epitops in dem nativen 27kD großen Protein befinden. Es wird von Fachleuten anerkannt werden, dass in dem nativen Protein auch weitere nicht aufeinander folgende Aminosäurereste zu dem durch den Antikörper erkannten Konformationsepitop beitragen können. Synthetische, das Epitop umfassende Peptide können erzeugt werden, was einschließt, dass andere Aminosäurereste die sieben Kernaminosäurereste flankieren (d.h. Xaa kann alternativ ein anderer Aminosäurerest sein als die in dem nativen Protein gefundenen). Diese flankierenden Aminosäurereste können die Funktion haben, die Eigenschaften des resultierenden Peptids zu verändern, zum Beispiel die Löslichkeit zu erhöhen, die Immunogenität zu verstärken oder die Dimerisierung des resultierenden Peptids zu fördern. Wenn das Peptid als Immunogen zu verwenden ist, können eine oder mehrere geladene Aminosäuren (z.B. Lysin, Arginin) beinhaltet sein, um die Löslichkeit des Peptids zu erhöhen und/oder die Immunogenität des Peptids zu verstärken. In einer anderen Ausführungsform können Cysteinreste beinhaltet sein, um die Dimerisierung des resultierenden Peptids zu erhöhen.
  • Andere Ausführungsformen der Erfindung betreffen die Vermehrung einer Population von CD8+-T-Zellen durch die Verwendung eines Wirkstoffes, der intrazellulär die Stimulierung eines Signals hervorruft, das in der T-Zelle durch die Verknüpfung des 27kD großen Proteins vermittelt wird. Wie er hier verwendet wird, umfasst der Ausdruck „Wirkstoff" Chemikalien und andere Arzneimittel, die in einer T-Zelle ein Signal stimulieren, ohne die Notwendigkeit einer Interaktion zwischen einem T-Zell-Obertlächenrezeptor und einem Liganden. Somit bindet dieser Wirkstoff nicht an den extrazellulären Teil des 27kD großen Proteins, sondern ahmt eher nach oder induziert ein intrazelluläres Signal (z.B. einen sekundären Botenstoff), das mit der Verknüpfung des Proteins durch einen geeigneten Liganden assoziiert ist. Die hier beschriebenen Liganden (z.B. der monoclonale Antikörper ES5.2D8) können verwendet werden, um ein intrazelluläres Signal/intrazelluläre Signale zu identifizieren, das/die mit einer T-Zell-Vermehrung, die durch den Kontakt des 27 kD großen Proteins mit einem geeigneten Liganden (wie in den Beispielen beschrieben) vermittelt wird, verbunden ist/sind und die resultierende intrazelluläre Signaltransduktion, die stattfindet, zu untersuchen (z.B. Proteintyrosinphosphorylierung, Calciumzustrom, Aktivierung von Serin/Threonin- und/oder Tyrosinkinasen, Phosphatidylinosit-Stoffwechsel usw.). Ein Wirkstoff, der ein intrazelluläres Signal, das mit dem 27 kD großen Protein verbunden ist, verstärkt, kann dann verwendet werden, um CD8+-T-Zellen zu vermehren. In einer anderen Ausführungsform können Wirkstoffe (z.B. kleine Moleküle, Arzneistoffe usw.) unter der Verwendung eines Systems, wie das in den Beispielen beschriebene, auf ihre Fähigkeit getestet werden, die Vermehrung von T-Zellen zu verstärken.
  • In noch einem weiteren Aspekt der Erfindung werden Verfahren für die Vermehrung einer Population von Antigen-spezifischen T-Zellen bereitgestellt. Um eine Population von Antigen-spezifischen T-Zellen herzustellen, werden die T-Zellen mit einem Antigen in einer Form in Kontakt gebracht, die geeignet ist, um ein primäres Aktivierungssignal in der T-Zelle auszulösen, d.h. das Antigen wird der T-Zelle so präsentiert, dass in der T-Zelle über den TCR/CD3-Komplex ein Signal ausgelöst wird. Zum Beispiel kann das Antigen der T-Zelle durch eine Antigenpräsentierende Zelle in Verbindung mit einem MHC-Molekül präsentiert werden. Eine Antigen-präsentierende Zelle wie eine B-Zelle, ein Makrophage, ein Monocyt, eine dendritische Zelle, eine Langerhanssche Zelle oder eine andere Zelle, die einer T-Zelle ein Antigen präsentieren kann, kann in Anwesenheit des Antigens (z.B. eines löslichen Antigens) mit der T-Zelle inkubiert werden, sodass die Antigenpräsentierende Zelle der T-Zelle das Antigen präsentiert. In einer anderen Ausführungsform kann eine Zelle, die ein relevantes Antigen exprimiert, mit der T-Zelle inkubiert werden. Zum Beispiel kann eine Tumorzelle, die mit Tumoren assoziierte Antigene exprimiert, zusammen mit einer T-Zelle inkubiert werden, um eine Tumor-spezifische Antwort hervorzurufen. In ähnlicher Weise kann eine Zelle, die mit einem Pathogen, z.B. einem Virus, infiziert ist und die Antigene des Pathogens präsentiert, mit einer T-Zelle inkubiert werden. Nach der Antigenspezifischen Aktivierung einer Population von T-Zellen können die Zellen in Übereinstimmung mit den erfindungsgemäßen Verfahren vermehrt werden. Nachdem die Antigen-Spezifität etabliert wurde, können zum Beispiel T-Zellen entsprechend den hier beschriebenen Verfahren durch die Kultur mit einem anti-CD3-Antikörper und einem anti-CD28-Antikörper vermehrt werden.
  • Der Ausdruck „Antikörper", wie er hier verwendet wird, betrifft Immunglobulinmoleküle und immunologisch aktive Bestandteile von Immunglobulinmolekülen, d.h. Moleküle, die eine Antigenbindestelle enthalten, die spezifisch ein Antigen wie CD3 oder CD28 bindet (mit einem Antigen immunologisch reagiert). Was die Struktur betrifft, umfasst der einfachste natürlich vorkommende Antikörper (z.B. IgG) vier Polypeptidketten, zwei schwere (H) Ketten und zwei leichte (L) Ketten, die miteinander über Disulfidbrücken verbunden sind. Es wurde gezeigt, dass die Antigen-bindende Funktion eines Antikörpers durch Fragmente eines natürlich vorkommenden Antikörpers bewerkstelligt werden kann. Somit ist es ebenfalls beabsichtigt, dass diese Antigen-bindenden Fragmente mit dem Ausdruck „Antikörper" bezeichnet werden. Beispiele für bindende Fragmente, die durch den Ausdruck Antikörper umfasst werden, schließen (i) ein Fab-Fragment, bestehend aus den VL-, VH-, CL- und CH1-Domänen; (ii) ein Fd-Fragment, bestehend aus den VH- und CH1-Domänen; (iii) ein Fv-Fragment, bestehend aus den VL- und VH-Domänen eines einzelnen Arms eines Antikörpers; (iv) ein dAb-Fragment (Ward et al. (1989) Nature 341:544–546), das aus einer VH-Domäne besteht; (v) eine isolierte Komplementarität bestimmende Region (CDR); und (vi) ein F(ab')2-Fragment ein, ein bivalentes Fragment, das zwei über eine Disulfidbrücke an der Gelenkregion verbundene Fab-Fragmente umfasst. Weiterhin kann, obwohl die zwei Domänen des Fv-Fragments durch verschiedene Gene codiert werden, ein synthetischer Linker hergestellt werden, der es ihnen ermöglicht, durch rekombinante Verfahren als einzelne Proteinkette hergestellt zu werden (bekannt als Einzelketten-Fv (scFv); Bird et al. (1988) Science 242:423–426; und Huston et al. (1988) PNAS 85 :5879–5883). Solche Einzelkettenantikörper sind ebenfalls durch den Ausdruck „Antikörper" umfasst. Bevorzugte Antikörperfragmente für den Gebrauch in der Vermehrung von T-Zellen sind diejenigen, welche zur Quervernetzung ihrer Zielantigene befähigt sind, z.B. bivalente Fragmente wie F(ab')2-Fragmente. In einer anderen Ausführungsform kann ein Antikörperfragment, das selbst sein Zielantigen nicht quervernetzt (z.B. ein Fab-Fragment), in Verbindung mit einem sekundären Antikörper, der zur Quervernetzung des Antikörperfragments dient, verwendet werden, wodurch das Zielantigen quervernetzt wird. Antikörper können unter der Verwendung herkömmlicher Techniken, wie hier beschrieben, fragmentiert und die Fragmente auf die gleiche Weise, wie für ganze Antikörper beschrieben, auf ihre Nützlichkeit hin untersucht werden. Es ist weiterhin beabsichtigt, dass ein erfindungsgemäßer Antikörper bispezifische und chimäre Moleküle mit einem gewünschten Bindungsteil einschließt (z.B. CD28).
  • Der Ausdruck „eine für ein Epitop gewünschte Bindungsspezifität" betrifft ebenso wie der allgemeinere Ausdruck „eine Antigenbindestelle, die spezifisch bindet (immunologisch reagiert mit)" die Fähigkeit eines einzelnen Antikörpers, auf spezifische Weise mit einem T-Zellen-Oberflächenmolekül, z.B. CD28, immunologisch zu reagieren. Das bedeutet, er betrifft eine nicht zufällige Bindungsreaktion zwischen einem Antikörpermolekül und einer antigenen Determinante des T-Zellen-Oberflächenmoleküls. Die gewünschte Bindungsspezifität wird typischerweise anhand des Referenzpunktes der Fähigkeit des Antikörpers, das T-Zell-Oberflächenmolekül und ein nicht verwandtes Antigen differenziell zu binden und dadurch zwischen zwei verschiedenen Antigenen zu unterscheiden, bestimmt, besonders, wenn die zwei Antigene einzigartige Epitope aufweisen. Ein Antikörper, der ein bestimmtes Epitop spezifisch bindet, wird als „spezifischer Antikörper" bezeichnet.
  • „Antikörperbindungsstelle", wie hier verwendet, bezeichnet den strukturellen Teil eines Antikörpermoleküls, der aus den variablen und hypervariablen Regionen einer schweren und leichten Kette besteht und ein Antigen spezifisch bindet (mit diesem immunologisch reagiert). Der Ausdruck „immunologisch reagieren" oder „reaktiv mit" in seinen verschiedenen Formen wird hier verwendet, um die Bindung zwischen einem eine Antigendeterminante enthaltenden Molekül und einem Molekül, das eine Antikörperbindungsstelle enthält, wie ein gesamtes Antikörpermolekül oder ein Teil davon zu bezeichnen.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst, dass der anti-CD3-Antikörper direkt auf einer Festphasenoberfläche (z.B. Perlen) immobilisiert ist. Ein Antikörper kann direkt oder indirekt, zum Beispiel durch einen sekundären Antikörper, auf eine feste Oberfläche wie eine Gewebekulturflasche oder eine Perle immobilisiert werden. Das Folgende ist als veranschaulichende Ausführungsform ein Protokoll zur Immobilisierung eines anti-CD3-Antikörpers auf Perlen. Es sollte erkannt werden, dass das gleiche Protokoll für die Immobilisierung anderer Antikörper oder Fragmente davon (z.B. eines anti-CD28-Antikörpers) an Perlen verwendet werden kann.
  • Protokolle
    • I. Vorabsorption eines Ziegen-anti-Maus-IgG mit OKT-3 A) BioMag-Ziegen-anti-Maus-IgG (Advanced Magnetics, Inc., Katalognummer 8-4340D) wird mit mindestens 200 μg OKT-3 pro 5 × 108 magnetischen Teilchen für 1 Stunde bei 5°C in PBS inkubiert. B) Die Teilchen werden mit Hilfe der magnetischen Trennungseinheit dreimal mit PBS gewaschen. Merke: Advanced Magnetics hat auch einen direkt konjugierten anti-Mensch-CD3 (Katalognummer 8-4703N), der die Stimulierung von T-Zellen induziert.
    • II. Vormarkierung der Lymphocyten mit OKT-3 A) 1 × 106 Zellen (PBMC) werden mit 10 μg/ml OKT-3 für 15 Minuten bei Raumtemperatur in PBS inkubiert. B) Die Zellen werden zweimal mit PBS gewaschen.
    • III. Bindung der Magnetischen Teilchen an PBMC zur Stimulierung A) Mit OKT-3 oberflächenmarkierte PBMC werden mit einer Perle pro Zelle mit Ziegen-anti-Maus-IgG (siehe vorstehend) kultiviert, gefolgt durch eine 30-minütige Inkubation bei 20°C unter leichtem Rühren. B) Ziegen-anti-Maus-IgG-Perlen, die vorher mit OKT-3 absorbiert wurden, werden für 30 Minuten bei 20°C unter schwachem Rühren mit PBMC (1:1) inkubiert und kultiviert.
    • IV. Bindung der Magnetischen Teilchen an PBMC zur Abtrennung Das Gleiche wie vorstehend (Teil III), außer dass das Verhältnis von Perle zu Zelle statt von 1:1 auf 20:1 erhöht wurde.
  • Um das erfindungsgemäße Verfahren zu praktizieren, wird eine Quelle von T-Zellen von einem Testobjekt erhalten. Der Ausdruck Testobjekt soll lebende Organismen, in denen eine Immunantwort ausgelöst werden kann, z.B. Säuger, einschließen. Beispiele für Testobjekte schließen Menschen, Hunde, Katzen, Mäuse, Ratten und transgene Arten davon ein. T-Zellen können aus einer Vielzahl von Quellen, einschließlich Leukocyten des peripheren Blutes, Knochenmark, Lymphknotengewebe, Milzgewebe und Tumore, erhalten werden. Vorzugsweise werden Leukocyten des peripheren Blutes von einem Individuum durch Leukopherese erhalten. Um T-Zellen aus Leukocyten des peripheren Blutes zu isolieren, kann es notwendig sein, Erythrocyten zu lysieren und Leukocyten des peripheren Blutes von Monocyten zum Beispiel durch Zentrifugation über einen PERCOLLTM-Gradienten zu trennen. Eine spezifische Subpopulation von T-Zellen wie CD4+- oder CD8+-T-Zellen kann durch positive oder negative Selektionstechniken weiter isoliert werden. Zum Beispiel kann eine negative Selektion einer Population von T-Zellen mit einer Kombination von Antikörpern erreicht werden, die gegen Oberflächenmarker gerichtet sind, die für die negativ selektierten Zellen einzigartig sind. Ein bevorzugtes Verfahren ist eine Zellsortierung über negative magnetische Immunadhärenz, die ein Gemisch von monoclonalen Antikörpern verwendet, die gegen Zelloberflächenmarker, die auf den negativ selektierten Zellen vorhanden sind, gerichtet sind. Um zum Beispiel CD4+-Zellen zu isolieren, schließt ein Gemisch von monoclonalen Antikörpern typischerweise Antikörper gegen CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR und CD8 ein. Weitere Gemische von monoclonalen Antikörpern werden in Tabelle 1 bereitgestellt.
  • Das Fortschreiten der negativen Selektion führt zu einer im Wesentlichen homogenen Population von CD4+- oder CD8+-T-Zellen. Die T-Zellen können, wie hier beschrieben, aktiviert werden, zum Beispiel durch Kontakt mit einem auf einer Festphasenoberfläche immobilisierten anti-CD3-Antikörper oder mit einem auf einer Festphasenoberfläche immobilisierten anti-CD2-Antikörper. Um ein akzessorisches Molekül auf der Oberfläche der T-Zellen zu stimulieren, wird ein Ligand, der das akzessorische Molekül bindet, eingesetzt. Zum Beispiel kann eine Population von CD4+-Zellen unter für die Stimulierung der Vermehrung der T-Zellen geeigneten Bedingungen mit einem anti-CD3-Antikörper und einem anti-CD28-Antikörper in Kontakt gebracht werden. Um die Vermehrung von CD8+-T-Zellen zu stimulieren, können in ähnlicher Weise ein anti-CD3-Antikörper und der monoclonale Antikörper ES5.2D8 verwendet werden. Für die Kultur von T-Zellen geeignete Bedingungen schließen ein geeignetes Medium (z.B. Minimales Essenzielles Medium oder RPMI-Medium 1640) ein, welches für die Vermehrung und Lebensfähigkeit notwendige Faktoren, einschließlich Tierserum (z.B. fötales Rinderserum) und Antibiotika (z.B. Penicillin, Streptomycin), enthalten kann. Die T-Zellen werden unter für die Förderung des Wachstums notwendigen Bedingungen, zum Beispiel bei einer geeigneten Temperatur (z.B. 37°C) und Atmosphäre (z.B. Luft plus 5% CO2), gehalten.
  • Um nach der anfänglichen Aktivierung und Stimulierung eine Langzeitstimulierung einer Population von T-Zellen beizubehalten, ist es notwendig, die T-Zellen nach einem Zeitraum der Exposition von dem aktivierenden Stimulus (z.B. dem anti-CD3-Antikörper) zu trennen. Die T-Zellen werden über den Kultivierungszeitraum hinweg mit dem costimulierenden Liganden in Kontakt gehalten. Die Rate der T-Zell-Proliferation wird regelmäßig (z.B. täglich) überwacht, zum Beispiel indem die Größe der T-Zellen untersucht wird oder das Volumen der T-Zellen wie mit einem Coulter-Zähler gemessen wird. Eine ruhende T-Zelle weist einen mittleren Durchmesser von etwa 6,8 Micron auf. Nach der anfänglichen Aktivierung und Stimulierung und in Anwesenheit des stimulierenden Liganden wird dar mittlere Durchmesser der T-Zellen an Tag 4 auf über 12 Micron anwachsen und etwa an Tag 6 anfangen, abzunehmen. Wenn der mittlere Durchmesser der T-Zellen auf ungefähr 8 Micron abnimmt, werden die T-Zellen reaktiviert und restimuliert, um eine weitere Proliferation der T-Zellen zu induzieren. In einer anderen Ausführungsform kann die Rate der T-Zell-Proliferation und die Zeit für die Restimulierung der T-Zellen überwacht werden, indem auf die Anwesenheit von Zelloberflächenmolekülen wie B7-1 und B7-2, die auf aktivierten T-Zellen induziert werden, getestet wird. Wie in Beispiel 5 beschrieben, wurde bestimmt, dass CD4+-T-Zellen den B7-1-Rezeptor ursprünglich nicht exprimieren und dass die Expression in Kultur induziert wird. Weiterhin wurde gefunden, dass die B7-1-Expression vorübergehend ist und mit einer wiederholten anti-CD3-Restimulierung reinduziert werden kann. Dementsprechend können die zyklischen Veränderungen in der B7-1-Expression als Mittel zur Überwachung der T-Zell-Proliferation verwendet werden; wobei Abnahmen in dem Niveau der B7-1-Expression bezogen auf das Niveau der Expression nach einer anfänglichen oder vorherigen Stimulierung oder das Niveau der Expression in einer nicht stimulierten Zelle den Zeitpunkt für eine Restimulierung anzeigen.
  • Für die Induktion einer Langzeitstimulierung einer Population von CD4+- oder CD8+-T-Zellen kann es notwendig sein, die T-Zellen mit einem anti-CD3-Antikörper und einem anti-CD28-Antikörper oder dem monoclonalen Antikörper ES5.2D8 einigen Male zu reaktivieren und zu restimulieren, um eine Population von CD4+- oder CD8+-T-Zellen mit einer um das etwa 10- bis etwa 1000-fache der ursprünglichen Population von T-Zellen erhöhten Anzahl zu produzieren. Unter der Verwendung dieser Methodik ist es möglich, Anstiege in einer Population von T-Zellen um das etwa 100- bis etwa 100000-fache der ursprünglichen ruhenden Population von T-Zellen zu erreichen. Darüber hinaus sekretieren die durch das erfindungsgemäße Verfahren vermehrten T-Zellen, wie in Beispiel 6 beschrieben, große Mengen an Cytokinen (z.B. IL-2, IFNγ, IL-4, GM-CSF und TNFα) in die Kulturüberstände. Zum Beispiel sekretieren CD4+-T-Zellen, die durch die Verwendung von anti-CD3- und anti-CD28-Costimulierung vermehrt wurden, im Vergleich zu einer Stimulierung mit IL-2 große Mengen an GM-CSF und TNFα in das Kulturmedium. Diese Cytokine können aus den Kulturüberständen gereinigt werden oder die Überstände können direkt für die Erhaltung der Zellen in Kultur verwendet werden. In ähnlicher Weise können die T-Zellen, die durch das erfindungsgemäße Verfahren vermehrt wurden, zusammen mit dem Kulturüberstand und den Cytokinen verabreicht werden, um das Wachstum der Zellen in vivo zu unterstützen. In Patienten mit Tumoren zum Beispiel können die T-Zellen von dem Individuum erhalten und in vitro vermehrt werden und die resultierende Population von T-Zellen und der Überstand, einschließlich Cytokinen wie TNFα, können dem Patienten wieder verabreicht werden, um das Wachstum der T-Zellen in vivo zu verbessern.
  • Obwohl die in den hier beschriebenen Verfahren verwendeten Antikörper auf einfache Weise aus öffentlichen Quellen wie der ATCC zu erhalten sind, können Antikörper gegen akzessorische T-Zell-Oberflächenmoleküle, den CD3-Komplex oder CD2 mittels Standardtechniken produziert werden. Methodiken zur Erzeugung von Antikörpern zum Gebrauch in den erfindungsgemäßen Verfahren werden nachstehend genauer beschrieben.
  • I. Antikörperproduktion
  • A. Das Immunogen.
  • Der Ausdruck „Immunogen" wird hier verwendet, um eine Zusammensetzung zu beschreiben, die ein Peptid oder Protein als aktiven Bestandteil für die Präparation von Antikörpern gegen ein Antigen (z.B. CD3, CD28) enthält. Wenn ein Peptid oder Protein verwendet wird, um Antikörper zu induzieren, muss es klar sein, dass das Peptid alleine, als Konjugat verbunden mit einem Träger oder als Peptidpolymer verwendet werden kann.
  • Um geeignete Antikörper zu erzeugen, sollte das Immunogen eine wirksame immunogene Menge eines Peptides oder Proteins enthalten, gegebenenfalls als Konjugat mit einem Träger verbunden. Die wirksame Menge an Peptid pro Dosierungseinheit hängt, wie im Fachgebiet gut bekannt ist, unter anderem von der Art des inokulierten Tieres, dem Körpergewicht des Tieres und dem gewählten Immunisierungsschema ab. Die Immunogenpräparation wird typischerweise Peptidkonzentrationen von etwa 10 Microgramm bis etwa 500 Milligramm pro Immunisierungsdosierung, vorzugsweise etwa 50 Microgramm bis etwa 50 Milligramm pro Dosierung enthalten. Eine Immunisierungspräparation kann auch ein Adjuvans als Teil des Verdünnungsmittels einschließen. Adjuvantien wie vollständiges Freundsches Adjuvans (CFA), unvollständiges Freundsches Adjuvans (IFA) und Alaun sind im Fachgebiet gut bekannte Materialien und sind aus verschiedenen Quellen im Handel erhältlich.
  • Fachleute werden anerkennen, dass anstelle der Verwendung von natürlich vorkommenden Formen des Antigens (z.B. CD3, CD28) für die Immunisierung alternativ synthetische Peptide eingesetzt werden können, gegen die für den Gebrauch in dieser Erfindung Antikörper erzeugt werden können. Sowohl lösliche als auch membrangebundene Formen des Proteins oder der Peptidfragmente sind für einen Gebrauch als Immunogen geeignet und können auch mittels einer Immunaffinitäts-Reinigung isoliert werden. Eine gereinigte Form des Proteins, das, wie vorstehend beschrieben oder wie im Fachgebiet bekannt, isoliert werden kann, kann selbst direkt als Immunogen verwendet werden oder kann in einer anderen Ausführungsform durch herkömmliche Techniken, einschließlich chemische Kupplungsverfahren ebenso wie gentechnische Veränderung unter der Verwendung eines clonierten Gens des Proteins, mit einem geeigneten Trägerprotein verbunden werden. Das gereinigte Protein kann auch kovalent oder nicht kovalent mit nicht proteinartigen Materialien wie Lipiden oder Kohlenhydraten modifiziert werden, um die Immunogenität oder Löslichkeit zu erhöhen. In einer anderen Ausführungsform kann ein gereinigtes Protein mit einem Viruspartikel, einem replizierenden Virus oder einem anderen Mikroorganismus gekoppelt oder in dieses/n aufgenommen werden, um die Immunogenität zu erhöhen. Das Protein kann zum Beispiel an das Viruspartikel oder den Mikroorganismus oder einen immunogenen Bestandteil davon chemisch angeheftet werden.
  • In einer veranschaulichenden Ausführungsform wird ein gereinigtes CD28-Protein oder ein Peptidfragment davon (z.B. hergestellt durch limitierte Proteolyse oder rekombinante DNA-Techniken) mit einem Träger, der in Tieren immunogen ist, verbunden. Bevorzugte Träger schließen Proteine wie Albumine, Serumproteine (z.B. Globuline und Lipoproteine) und Polyaminosäuren ein. Beispiele für nützliche Proteine schließen Rinderserumalbumin, Kaninchenserumalbumin, Thyroglobulin, KLH (keyhole limpet hemocyanin, Ei-Ovalbumin und Rinder-Gamma-Globuline ein. Synthetische Polyaminosäuren wie Polylysin oder Polyarginin sind ebenfalls nützliche Träger. Hinsichtlich der kovalenten Anheftung des CD28-Proteins oder von Peptidfragmenten an einen geeigneten immunogenen Träger gibt es eine Anzahl von chemischen quervernetzenden Wirkstoffen, die Fachleuten bekannt sind. Bevorzugte quervernetzende Wirkstoffe sind heterobifunktionelle Quervernetzer, welche verwendet werden können, um Proteine schrittweise zu verknüpfen. Eine große Vielzahl von heterobifunktionellen Quervernetzern sind im Fachgebiet bekannt, einschließlich Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexan-1-carboxylat (SMCC), m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester (MBS); N-Succinimidyl (4-iodacetyl)-aminobenzoat (SIAB), Succinimidyl-4(p-maleimidophenyl)-butyrat (SMPB), 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimidhydochlorid (EDC); 4-Succinimidyl-oxycarbonyl-a-methyl-a-(2-pyridyldithio)-toluol (SMPT), N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat (SPDP), Succinimidyl-6-[3-(2-pyridyldithio)-propionat]-hexanat (LC-SPDP).
  • Es kann auch wünschenswert sein, ein Tier einfach mit ganzen Zellen, die ein relevantes Protein (z.B. CD28) auf ihrer Oberfläche exprimieren, zu immunisieren. Verschiedene Zelllinien, einschließlich, aber nicht beschränkt auf T-Zellen, können als Immunogen verwendet werden, um monoclonale Antikörper gegen ein Antigen zu erzeugen. Zum Beispiel können T-Zellen des peripheren Blutes von einem Testobjekt, das CD28 konstitutiv exprimiert, erhalten werden, können aber in vitro mit anti-CD3-Antikörpern, PHA oder PMA aktiviert werden. In einer anderen Ausführungsform kann ein Antigen-spezifischer (z.B. alloreaktiver) T-Zellclon aktiviert werden, CD28 zu exprimieren, indem der T-Zelle das Antigen zusammen mit einem costimulierenden Signal präsentiert wird. Ganze Zellen, die als Immunogene zur Produktion von CD28-spezifischen Antikörpern verwendet werden können, schließen auch rekombinante Transfektanten ein. Zum Beispiel können COS- und CHO-Zellen durch Transfektion mit einer CD28-cDNA rekonstituiert werden, um Zellen, die CD28 auf ihrer Oberfläche exprimieren, herzustellen. Diese transfektanten Zellen können dann als Immunogene verwendet werden, um anti-CD28-Antikörper zu produzieren. Andere Beispiele für transfektante Zellen sind bekannt, besonders eukaryontische Zellen, die das CD28-Protein glycosylieren können, aber jegliche Prozedur, die zur Expression von transfizierten CD28-Genen auf der Zelloberfläche führt, könnte verwendet werden, um das Ganzzellen-Immunogen herzustellen.
  • Alternativ zu einer CD28-exprimierenden Zelle oder einem isolierten CD28-Protein können auch Peptdifragmente von CD28 oder einem anderen Oberflächenantigen wie das 27 kD große Antigen als Immunogene verwendet werden, um Antikörper zu erzeugen. Zum Beispiel umfasst das durch den monoclonalen Antikörper ES5.2D8 gebundene Epitop eine Aminosäuresequenz: (Xaa1)n-Gly-Xaa2-Trp-Leu-Xaa3-Xaa4-Asp(Glu)-(Xaa5)n (SEQ ID Nr.5), wobei Xaa4 vorhanden sein kann oder nicht, Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4 und Xaa5 irgendein Aminosäurerest sind und n=0-20, mehr bevorzugt 0–10, noch mehr bevorzugt 0–5 und am meisten bevorzugt 0–3 ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist Xaa2 Cys oder Ile, Xaa3 ist Leu oder Arg und Xaa4 ist, falls vorhanden, Arg oder Pro. Somit kann ein Peptid mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NR.5 als Immunogen verwendet werden. Dementsprechend umfasst die Erfindung weiterhin ein isoliertes Peptid, umfassend eine Aminosäuresequenz: (Xaa1)n-Gly-Xaa2-Trp-Leu-Xaa3-Xaa4-Asp(Glu)-(Xaa5)n (SEQ ID Nr.5), wobei Xaa4 vorhanden sein kann oder nicht, Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4 und Xaa5 irgendein Aminosäurerest sind und n=0-20, mehr bevorzugt 0–10, noch mehr bevorzugt 0–5 und am meisten bevorzugt 0–3 ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist Xaa2 Cys oder Ile, Xaa3 ist Leu oder Arg und Xaa4 ist, falls vorhanden, Arg oder Pro. In einer anderen Ausführungsform ist gefunden worden, dass der monoclonale Antikörper ES5.2D8 mit einer Anzahl anderer Peptidsequenzen kreuzreagiert (wie in Beispiel 3 beschrieben, durch Phagen-Display-Technologie bestimmt). Beispiele für diese anderen Peptidsequenzen sind nachstehend gezeigt:
  • Figure 00230001
  • Jedes dieser Peptide oder andere Peptide, die den Abschnitt von sieben Aminosäuren, der fett geschrieben ist (was das durch den Antikörper gebundene Epitop darstellt), möglicherweise flankiert durch alternative Aminosäurereste, enthalten, können ebenfalls als Immunogene zur Produktion eines Antikörpers für den Gebrauch in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden und sind durch die Erfindung umfasst. Für den Gebrauch als Immunogene können die Peptide modifiziert werden, um die Löslichkeit zu erhöhen und/oder die Immunogenität zu verstärken, wie vorstehend beschrieben.
  • B. Polyclonale Antikörper.
  • Polyclonale Antikörper gegen ein gereinigtes Protein oder ein Peptidfragment davon können im Allgemeinen durch mehrfache subkutane (sc) oder intraperitoneale (ip) Injektionen eines geeigneten Immunogens wie der extrazellulären Domäne des Proteins und eines Adjuvans in Tieren erzeugt werden. Ein polyclonales Antiserum kann zum Beispiel, wie in Lindsten, T. et al. (1993) J.
  • Immunol. 151:3489–3499 beschrieben, hergestellt werden. In einer beispielhaften Ausführungsform werden Tiere typischerweise gegen das immunogene Protein, Peptid oder Derivat immunisiert, indem etwa 1 μg bis 1 mg Protein mit vollständigem Freundschem Adjuvans kombiniert und die Lösung an mehreren Stellen intradermal injiziert wird. Einen Monat später erhalten die Tiere mit 1/5 bis 1/10 der ursprünglichen Menge an Immunogen in vollständigem Freundschem Adjuvans (oder einem anderen geeigneten Adjuvans) durch subkutane Injektion an mehreren Stelle eine Auffrischung. Sieben bis 14 Tage später lässt man die Tiere ausbluten und das Serum wird hinsichtlich des anti-Protein- oder -Peptid-Titers (z.B. durch ELISA) getestet. Die Tiere erhalten eine Auffrischung bis der Titer sich einpendelt. Auch aggregierende Mittel wie Alaun können verwendet werden, um die Immunantwort zu verstärken.
  • Solche durch Säuger produzierten Populationen von Antikörpermolekülen werden als „polyclonal" bezeichnet, weil die Population Antikörper mit unterschiedlichen Immunspezifitäten und Affinitäten für das Antigen umfasst. Die Antikörpermoleküle werden dann aus dem Säuger (z.B. aus dem Blut) gewonnen und durch gut bekannte Techniken wie Protein A-Chromatographie isoliert, um die IgG-Fraktion zu erhalten. Um die Spezifität des Antikörpers zu erhöhen, können die Antikörper mittels Immunaffinitätschromatographie unter der Verwendung von an Festphase fixiertem Immunogen gereinigt werden. Der Antikörper wird mit dem an der Festphase fixierten Immunogen für einen Zeitraum in Kontakt gebracht, der für das Immunogen ausreichend ist, um mit den Antikörpermolekülen immunologisch zu reagieren, um einen an der Festphase fixierten Immunkomplex zu bilden. Die gebundenen Antikörper werden von dem Komplex durch Standardtechniken getrennt.
  • C. Monoclonale Antikörper.
  • Der Ausdruck "monoclonaler Antikörper" oder "monoclonale Antikörperzusammensetzung", wie er hier verwendet wird, bezeichnet eine Population von Antikörpermolekülen, die nur eine Art von Antigenbindungsstelle enthält, die mit einem bestimmten Epitop eines Antigens immunologisch reagieren kann. Eine monoclonale Antikörperzusammensetzung zeigt also typischerweise eine einzelne Bindungsaffinität für ein bestimmtes Protein, mit dem es immunologisch reagiert. Vorzugsweise ist der in dem vorliegenden Verfahren verwendete monoclonale Antikörper des Weiteren gekennzeichnet als immunologisch mit einem von Mensch stammenden Protein reagierend.
  • Monoclonale Antikörper, die in den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, sind gegen ein Epitop von einem Antigenen) auf T-Zellen gerichtet, sodass die Bildung eines Komplexes zwischen dem Antikörper und dem Antigen (hier auch als Ligierung bezeichnet) die Stimulierung und die Vermehrung der T-Zellen induziert. Ein monoclonaler Antikörper gegen ein Epitop eines Antigens (z.B. CD3, CD28) kann durch die Verwendung einer Technik hergestellt werden, die mittels kontinuierlicher Zelllinien in Kultur für die Produktion von Antikörpermolekülen sorgt. Diese schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf die ursprünglich durch Köhler und Milstein (1975, Nature 256:495–497) beschriebene Hybridomtechnik und die aktuellere menschliche B-Zellen-Hybridomtechnik (Kozbor et al. (1983) Immunol. Today 4:72), EBV-Hybridomtechnik (Cole of al. (1985), Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., S. 77–96) und Triomtechniken. Andere Verfahren, die auf wirksame Weise für die vorliegende Erfindung nützliche monoclonale Antikörper liefern können, schließen Phagen-Display-Techniken ein (Marks et al. (1992) J. Biol. Chem. 16007–16010).
  • In einer Ausführungsform ist die in dem vorliegenden Verfahren angewendete Antikörperpräparation ein monoclonaler Antikörper, der durch eine Hybridomzelllinie produziert wurde. Hybridomfusionstechniken wurden zuerst durch Köhler und Milstein eingeführt (Köhler et al. Nature (1975) 256:495–497; Brown et al. (1981) J. Immunol. 12:53946; Brown et al. (1980) J. Biol. Chem. 255:4980–83; Yeh et al. (1976) PNAS 76:2927–31; und Yeh et al. (1982) Int. J. Cancer 29:269–75). Somit können die monoclonalen Antikörperzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung durch das folgende Verfahren hergestellt werden, umfassend die Schritte der:
    • (a) Immunisierung eines Tieres mit einem Protein (z.B. CD28) oder einem Peptid davon. Die Immunisierung wird typischerweise bewerkstelligt, indem das Immunogen einem immunologisch kompetenten Säuger in einer immunologisch wirksamen Menge, d.h. einer ausreichenden Menge, um eine Immunantwort hervorzurufen, verabreicht wird. Vorzugsweise ist der Säuger ein Nagetier wie ein Kaninchen, eine Ratte oder eine Maus. Der Säuger wird dann für eine Zeitraum erhalten, der für den Säuger ausreichend ist, um Zellen zu produzieren, die Antikörpermoleküle, die mit dem Immunogen immunologisch reagieren, sekretieren. Solch eine Immunreaktion wird nachgewiesen, indem die so hergestellten Antikörpermoleküle auf ihre Immunreaktivität mit einer Präparation des Immunogenproteins getestet werden. Gegebenenfalls kann es erwünscht sein, die Antikörpermoleküle mit einer Präparation des Proteins in der Form zu testen, in der es durch die Antikörpermoleküle in einem Test nachzuweisen ist, z.B. eine membranassoziierte Form des Antigens (z.B. CD28). Diese Screening-Verfahren, z.B. der enzymgekoppelte Immunadsorptionstest (ELISA) und/oder die Durchflusscytometrie, sind Fachleuten gut bekannt.
    • (b) Eine Suspension von Antikörper-produzierenden Zellen, die aus jedem immunisierten Säuger, der den erwünschten Antikörper produziert, entnommen wurden, wird dann präpariert. Nach einer ausreichenden Zeit wird die Maus geopfert und somatische Antikörper-produzierende Lymphocyten werden erhalten. Antikörper-produzierende Zellen können aus Lymphknoten, Milz und peripherem Blut von sensibilisierten Tieren stammen. Milzzellen werden bevorzugt und können unter der Verwendung von im Fachgebiet gut bekannten Verfahren in einem physiologisch verträglichen Medium auf mechanische Weise in einzelne Zellen getrennt werden. Mauslymphocyten ergeben einen höheren Prozentsatz an stabilen Fusionen mit den nachstehend beschriebenen Mausmyelomen. Somatische Zellen von Ratten, Kaninchen und Fröschen können ebenfalls verwendet werden. Die Chromosomen der Milzzellen, die die gewünschten Immunglobuline codieren, werden unsterblich gemacht, indem die Milzzellen im Allgemeinen in Anwesenheit eines Fusionsmittels wie Polyethylenglycol (PEG) mit Myelomzellen fusioniert werden. Standardverfahren entsprechend kann jede einer Anzahl von Myelomzelllinien als Fusionspartner verwendet werden; zum Beispiel die P3-NS1/1-Ag4-1-, P3-x63-Ag8.653- oder Sp2/O-Ag14-Myelomlinien. Diese Myleomlinien sind von der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Md. erhältlich.
  • Die resultierenden Zellen, die die gewünschten Hybridome einschließen, werden dann in einem selektiven Medium wie HAT-Medium, in dem unfusionierte parentale Myelom- oder Lymphocytenzellen nach und nach sterben, wachsen gelassen. Nur die Hybridomzellen überleben und können unter Bedingungen der limitierten Verdünnung angezogen werden, um isolierte Clone zu erhalten. Die Überstände der Hybridome werden auf die Anwesenheit des Antikörpers der gewünschten Spezifität getestet, z.B. durch Immuntesttechniken unter der Verwendung des Antigens, das für die Immunisierung verwendet worden war. Positive Clone können dann unter den Bedingungen der limitierten Verdünnung subcloniert und der produzierte monoclonale Antikörper isoliert werden. Es existieren viele herkömmliche Verfahren für die Isolierung und Reinigung der monoclonalen Antikörper, um sie von anderen Proteinen und anderen Kontaminanten zu befreien. Häufig verwendete Verfahren für die Reinigung von monoclonalen Antikörpern schließen Ammoniumsulfat-Fällung, Ionenaustauschchromatographie und Affinitätschromatographie ein (siehe z.B. Zola et al. in Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques And Applications, Hurell (Hrsg.) S. 51–52 (CRC Press 1982)). Hybridome, die entsprechend dieser Verfahren hergestellt wurden, können unter der Verwendung von im Fachgebiet bekannten Techniken in vitro oder in vivo (in Aszitesflüssigkeit) vermehrt werden.
  • Im Allgemeinen kann die einzelne Zelllinie in vitro, zum Beispiel in Labor-Kulturgefäßen, vermehrt werden und das Kulturmedium, das hohe Konzentrationen eines einzelnen spezifischen monoclonalen Antikörpers enthält, kann durch Dekantieren, Filtration oder Zentrifugation geerntet werden. In einer anderen Ausführungsform kann die Ausbeute an monoclonalem Antikörper erhöht werden, indem eine Probe des Hybridoms in ein histokompatibles Tier von der Art injiziert wird, die verwendet wurde, um die somatischen Zellen und Myelomzellen für die ursprüngliche Fusion bereitzustellen. In dem injizierten Tier entwickeln sich Tumore, die den spezifischen monoclonalen Antikörper, der durch das fusionierte Zellhybrid produziert wird, sekretieren. Die Körperflüssigkeiten des Tieres wie Aszitesflüssigkeit oder Serum stellen monoclonale Antikörper in hohen Konzentrationen bereit. Wenn menschliche Hybridome oder EBV-Hybridome verwendet werden, ist es notwendig, die Abstoßung des in die Tiere wie zum Beispiel Mäuse injizierten Xenotransplantats zu verhindern. Es können immungeschwächte oder nackte Mäuse verwendet werden oder das Hybridom kann zunächst als solider subkutaner Tumor in bestrahlte nackte Mäuse eingebracht werden, in vitro kultiviert werden und dann intraperitoneal in durch Pristan sensibilisierte bestrahlte nackte Mäuse injiziert werden, welche Aszitestumore entwickeln, die große Mengen an spezifischen menschlichen monoclonalen Antikörpern sekretieren.
  • Für die Präparation dieser Zusammensetzungen nützliche Medien und Tiere sind jeweils im Fachgebiet gut bekannt und im Handel erhältlich und schließen synthetische Kulturmedien, Inzuchtmäuse und ähnliches ein. Ein beispielhaftes synthetisches Medium ist Dulbeccos minimales essenzielles Medium (DMEM; Dulbecco et al. (1959) Virol. 8:396), ergänzt mit 4,5 mg/l Glucose, 20 mM Glutamin und 20% fötalem Kälberserum. Ein beispielhafter Inzuchtmausstamm ist Balb/c.
  • D. Kombinatorische Antikörper.
  • Erfindungsgemäße monoclonale Antikörperzusammensetzungen können auch durch andere Verfahren, die Fachleuten auf dem Gebiet der rekombinanten DNA-Technologie gut bekannt sind, produziert werden. Ein alternatives Verfahren, bezeichnet als „kombinatorisches Antikörper-Display"-Verfahren, wurde entwickelt, um Antikörperfragmente mit einer bestimmten Antigenspezifität zu identifizieren und zu isolieren, und es kann verwendet werden, um monoclonale Antikörper zu produzieren (für Beschreibungen des kombinatorischen Antikörper-Display siehe z.B. Sastry et al. (1989) PNAS 86:5728; Huse et al. (1989) Science 246:1275; und Orlandi et al. (1989 PNAS 86:3833). Nach der Immunisierung eines Tieres mit einem geeigneten Immunogen (z.B. CD3, CD28), wie vorstehend beschrieben, wird das Antikörper-Repertoire des resultierenden B-Zellen-Pools cloniert. Es gibt allgemein bekannte Verfahren für das direkte Erhalten der DNA-Sequenz der variablen Regionen einer diversen Population von Immunglobulinmolekülen durch die Verwendung eines Gemisches von Oligomerprimern und PCR. Zum Beispiel können gemischte Oligonucleotidprimer, die den 5'-Leader (Signalpeptid)-Sequenzen und/oder Gerüst 1 (FR1)-Sequenzen entsprechen, ebenso wie Primer für eine konservierte konstante 3'-Region für die PCR-Amplifikation der variablen Regionen der schweren und leichten Kette einer Anzahl von murinen Antikörpern verwendet werden (Larrick et al. (1991) Biotechniques 11:152–156). Eine ähnliche Strategie kann auch verwendet werden, um menschliche variable Regionen der schweren und leichten Kette von menschlichen Antikörpern zu amplifizieren (Larrick et al. (1991) Methods: Companion to Methods in Enzymology 2:106–110).
  • In einer beispielhaften Ausführungsform wird RNA unter der Verwendung von Standardprotokollen aus aktivierten B-Zellen zum Beispiel aus peripheren Blutzellen, Knochenmark oder Milzpräparationen isoliert (z.B. US-Patent Nr. 4,683,202, Orlandi et al., PNAS (1989) 86:3833–3837; Sastry et al., PNAS (1989) 86:5728–5732; und Huse et al. (1989) Science 246:1275–1281). Erststrang-cDNA wird unter der Verwendung von Primern, die für die konstante Region der schweren Kette(n) und jede der leichten κ- und λ-Ketten spezifisch sind, und von Primern für die Signalsequenz synthetisiert. Unter der Verwendung von PCR-Primern für die variable Region werden die variablen Regionen sowohl der schweren als auch der leichten Ketten jeweils alleine oder in Kombination amplifiziert und in geeignete Vektoren für die weitere Manipulation bei der Erzeugung der Dislpay-Verpackungen ligiert. Innerhalb der Amplifikationsprotokolle nützliche Oligonucleotidprimer können einzigartig oder degeneriert sein oder sie können Inosin an degenerierten Positionen aufweisen. Es können auch Erkennungssequenzen für Restriktionsendonucleasen in die Primer eingebaut werden, um die Clonierung des amplifizierten Fragments in einen Vektor in einem für die Expression vorher bestimmten Leserahmen zu erlauben.
  • Die V-Genbibliothek, die von dem aus der Immunisierung stammenden Antikörper-Repertoire cloniert wurde, kann durch eine Population von Display-Verpackungen, die vorzugsweise von filamentösen Phagen stammen, exprimiert werden, um eine Antikörper-Display-Bibliothek zu erzeugen. Im Idealfall umfasst die Display-Verpackung ein System, das die Probennahme aus sehr großen vielfältigen Antikörper-Display-Bibliotheken, eine schnelle Sortierung nach jeder Affinitätstrennungsrunde und eine einfache Isolierung des Antikörpergens aus gereinigten Display-Verpackungen erlaubt. Zusätzlich zu den im Handel erhältlichen Kits zur Erzeugung von Phagen-Display-Bibliotheken (z.B. das Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Katalog-Nr. 27-9400-01; und der Stratagene SurfZAPTM-Phagen-Display-Kit, Katalog-Nr. 240612) können Beispiele für Verfahren und Reagentien, die für den Gebrauch bei der Erzeugung einer vielfältigen Antikörper-Display-Bibliothek besonders geeignet sind, gefunden werden, zum Beispiel in Ladner et al., US-Patent Nr. 5223409; Kang et al., Internationale Offenlegung Nr. WO 92/18619; Dower et al., Internationale Offenlegung Nr. WO 91/17271; Winter et al., Internationale Offenlegung Nr. WO 92/20791; Markland et al., Internationale Offenlegung Nr. WO 92/15679; Breitling et al, Internationale Offenlegung Nr. WO 93/01288; McCafferty et al., Internationale Offenlegung Nr. WO 92/01047; Garrard et al., Internationale Offenlegung Nr. WO 92/09690; Ladner et al., Internationale Offenlegung Nr. WO 90/02809; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370–1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81–85; Huse et al. (1989) Science 246:1275–1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12:725–734; Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol. 226:889–896; Clackson et al. (1991) Nature 352:624–628; Gram et al. (1992) PNAS 89:3576–3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9:1373–1377; Hoogenboom et al. (1991) Nucl. Acids Res. 19:4133–4137; und Barbas et al. (1991) PNAS 88:7978–7982.
  • In bestimmten Ausführungsformen können die V-Regiondomänen der schweren und leichten Ketten auf dem gleichen Polypeptid exprimiert werden, durch einen flexiblen Linker verknüpft werden, um ein Einzelketten-Fv-Fragment zu bilden, und das scFv-Gen nachfolgend in den/das gewünschte(n) Expressionsvektor oder Phagengenom cloniert werden. Wie allgemein beschrieben in McCafferty et al., Nature (1990) 348:552–554, können vollständige VH- und VL-Domänen eines Antikörpers, verknüpft durch einen flexiblen (Gly4-Ser)3-Linker, verwendet werden, um einen Einzelkettenantikörper herzustellen, der auf der Basis der Antigenaffinität die Display-Verpackung separierbar werden lässt. Isolierte scFv-Antikörper, die gegen das Antigen immunreaktiv sind, können nachfolgend für den Gebrauch in dem vorliegenden Verfahren in einem Arzneimittel formuliert werden.
  • Wenn sie einmal auf der Oberfläche einer Display-Verpackung (z.B. filamentöser Phage) präsentiert wurde, wird die Antikörperbibliothek mit dem Protein oder einem Peptidfragment davon durchmustert, um Verpackungen zu identifizieren und zu isolieren, die einen Antikörper mit einer Spezifität für das Protein exprimieren. Die Nucleinsäure, die den ausgewählten Antikörper codiert, kann aus der Display-Verpackung (z.B. aus dem Phagengenom) gewonnen und durch rekombinante Standard-DNA-Techniken in andere Expressionsvektoren subcloniert werden.
  • E. Hybridome und Verfahren der Präparation.
  • Für die vorliegende Erfindung nützliche Hybridome sind solche, die dadurch gekennzeichnet sind, die Kapazität zu haben, einen monoclonalen Antikörper zu produzieren, der auf spezifische Weise mit einem relevanten Antigen (z.B. CD3, CD28) immunologisch reagiert. Verfahren zur Erzeugung von Hybridomen, die Antikörpermoleküle produzieren, z.B. sekretieren, die eine gewünschte Immunspezifität aufweisen, z.B. die Fähigkeit, mit dem CD28-Antigen und/oder einem identifizierbaren Epitop von CD28 immunologisch zu reagieren, sind im Fachgebiet gut bekannt. Besonders anwendbar ist die Hybridomtechnologie, die durch Niman et al. (1983) PNAS 80:4949–4953; und durch Galfre et al. (1981) Meth. Enzymol. 73:3–46 beschrieben wird.
  • II. Anwendungen der erfindungsgemäßen Verfahren
  • Das erfindungsgemäße Verfahren kann verwendet werden, um eine Population von CD4+- oder CD8+-T-Zellen für den Gebrauch bei der Behandlung von Infektionskrankheiten, Krebs und innerhalb einer Immuntherapie selektiv zu vermehren. Als Ergebnis des hier beschriebenen Verfahrens kann eine Population von T-Zellen, die hinsichtlich ihrer Antigenreaktivität polyclonal, aber hinsichtlich CD4+ oder CD8+ im Wesentlichen homogen ist, produziert werden. Darüber hinaus erlaubt das Verfahren die Vermehrung einer Population von T-Zellen auf eine Anzahl, die ausreicht, um die Gesamtpopulation von CD4+- oder CD8+-T-Zellen eines Individuums zu rekonstituieren (die Population von Lymphocyten in einem Individuum ist ungefähr 1011). Die resultierende Population von T-Zellen kann genetisch transduziert und für eine Immuntherapie verwendet werden oder sie kann in Verfahren von in vitro-Analysen von infektiösen Stoffen verwendet werden. Zum Beispiel kann eine Population von tumorinfiltrierenden Lymphocyten von einem unter Krebs leidenden Individuum erhalten und die T-Zellen stimuliert werden, um sie bis zu einer ausreichenden Anzahl zu vermehren. Die resultierende T-Zell-Population kann genetisch transduziert werden, um den Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) oder einen anderen Faktor zu exprimieren, und dem Individuum zurückgegeben werden.
  • Eine bestimmte Anwendung für CD4+-T-Zellen, die durch das erfindungsgemäße Verfahren vermehrt wurden, liegt in der Behandlung einer HIV-Infektion in einem Individuum. Eine andauernde Infektion mit HIV führt nach und nach zu einer merklichen Abnahme der Anzahl der CD4+-T-Lymphocyten. Diese Abnahme wiederum verursacht einen nachhaltigen Zustand der Immunschwäche, was den Patienten für eine Reihe von lebensbedrohlichen opportunistischen Infektionen empfänglich werden lässt. Es ist zu erwarten, dass das Auffüllen der Anzahl der CD4+-T-Zellen auf normale Mengen die Immunfunktionen in einem bedeutenden Ausmaß wiederherstellt. Somit stellt das hier beschriebene Verfahren ein Mittel für die selektive Vermehrung von CD4+-T-Zellen auf eine ausreichende Anzahl bereit, um diese Population in einem mit HIV infizierten Patienten zu rekonstituieren. Es kann auch notwendig sein, das Infizieren der T-Zellen während einer Langzeitstimulierung zu vermeiden, oder es kann wünschenswert sein, die T-Zellen dauerhaft resistent gegen eine HIV-Infektion werden zu lassen. Es gibt eine Anzahl von Techniken, durch welche man T-Zellen entweder resistent gegen eine HIV-Infektion oder unfähig zur Produktion eines Virus, bevor die T-Zellen dem infizierten Individuum zurückgegeben werden, werden lässt. Zum Beispiel können einer oder mehrere anti-retrovirale Wirkstoffe vor der Vermehrung mit den CD4+-T-Zellen kultiviert werden, um die HIV-Replikation oder eine virale Produktion zu hemmen (z.B. Wirkstoffe, die auf die reverse Transkriptase und/oder andere Komponenten der viralen Maschinerie abzielen, siehe z.B. Chow et al. (1993) Nature 361:650–653).
  • Einige Verfahren können verwendet werden, um T-Zellen genetisch zu transduzieren, Moleküle zu produzieren, die eine HIV-Infektion oder -Replikation hemmen. In einer Ausführungsform können zum Beispiel T-Zellen genetisch transduziert werden, um transdominante Inhibitoren zu produzieren, die mutierte nicht funktionelle Formen von normalen HIV-Genprodukten darstellen. Transdominante Inhibitoren oligomerisieren oder wetteifern um die Bindung mit den Wildtyp-HIV-Proteinen. Einige transdominante Inhibitoren stammten von HIV-Proteinen einschließlich tat, rev und gag. Die Funktion von tat ist es, die Transkription von viralen Genen zu verstärken, indem es an das Transaktivierungs-Reaktionselement (tar) bindet, das in der Promotorregion der meisten HIV-Gene zu finden ist. Rev ermöglicht durch die Bindung an das rev-Reaktionselement (RRE), das am 5'-Ende von ungespleißten HIV-Transkripten zu finden ist, den Transport von unprozessierter mRNA aus dem Zellkern in das Cytoplasma für die Verpackung in Virionen. Gag wird zunächst als einzelnes Polypeptid synthetisiert und nachfolgend durch eine viruscodierte Protease gespalten, wodurch die drei strukturellen Proteine p15, p17 und p24 entstehen. Es wurde gezeigt, dass von diesen Genprodukten abstammende transdominante Inhibitoren die Infektion von Zellen, die mit HIV-Isolaten aus Labortieren kultiviert wurden, hemmen. Ein Beispiel für einen transdominanten Inhibitor, der anscheinend seine Wirkung ausübt, indem er nicht funktionelle Multimere mit Wildtyp-Rev bildet, ist RevM10. Das RevM10-Konstrukt hat eine Infektion von CEM-Zellen durch HTLV-IIIB für bis zu 28 Tage blockiert (Malim et al. JEM 176:1197, Bevec et al. PNAS 89:9870). In diesen Untersuchungen konnte RevM10 eine nachteilige Wirkung auf die normale T-Zell-Funktion nicht zeigen, wie anhand der Kriterien der Wachstumsrate und der II-2-Sekretion bewertet wurde.
  • In einem anderen Ansatz können T-Zellen transduziert werden, um als „Lockvogel-Moleküle" bekannte Moleküle zu produzieren, welche Bindungselemente für virale Proteine, die für die Replikation oder den Zusammenbau entscheidend sind, wie TAR, darstellen. Es wurde gefunden, dass eine Retrovirus-vermittelte Expression von TAR in CEM SS-Zellen in großen Mengen das ARV-2-HIV-Isolat wirksam blockiert, wie durch einen RT-Test gemessen wurde (Sullenger et al. Cell 63:601). Wichtig dabei war, dass sie auch eine SIV (SIVmac251)-Infektion blockierte, was nahe legt, dass eine Inhibierung der HIV-Infektion mit molekularen Lockvögeln allgemein bei verschiedenen Isolaten anwendbar sein kann und dadurch das Problem der Hypervariabilität verringern kann. Weiterhin wurde gezeigt, dass eine TAR-Expression keine erkennbaren Wirkungen auf die Lebensfähigkeit der Zellen ausübt (Sullenger et al. J. Virol. 65:6811). Ein weiterer "molekularer Lockvogel", den T-Zellen nach Transduktion produzieren können, ist ein lösliches CD4, das an dem Carboxy-Terminus mit einer KDEL (Lysin-Asparaginsäure-Glutaminsäure-Leucin)-Sequenz, eine Sequenz für eine Retention im ER, markiert wurde (Buonocore und Rose, PNAS 90:2695)(Nature 345:625). Die sCD4-KDEL-Genexpression wird durch die HIV-LTR getrieben. Mit dem sCD4-KDEL-Konstrukt transduzierte H9-Zellen zeigen eine Hochregulation der Expression von intrazellulärem CD4 nach einer HIV-Infektion. Diese Strategie blockierte in wirksamer Weise die Produktion von HIV-MN für bis zu 60 Tage nach der Infektion. Der vorgeschlagene Vorteil dieses Inhibitors ist, dass das Virus dieser Wirkung nicht durch Mutieren entkommen können sollte, weil die CD4-Bindung für die Infektiösität von HIV wesentlich ist.
  • T-Zellen können auch transduziert werden, um Antisense-Moleküle oder Ribozyme zu exprimieren, welche die virale Replikation oder Infektion blockieren. Virale Replikation kann mittels einer Vielzahl von Antisense-Strategien gehemmt werden. Ein bestimmtes Ribozym, welches die HIV-Integrase spaltet (Sioud und Drlica, PNAS 88:7303), wurde entwickelt und könnte einen Ansatz für die Blockierung der Infektion im Gegensatz zu der reinen viralen Produktion bieten.
  • Ein weiterer Ansatz, eine HIV-Infektion zu blockieren, beinhaltet die Transduktion von T-Zellen mit HIV-regulierten Toxinen. Zwei Beispiele für diese Art des Ansatzes sind das Diphtherietoxin A-Gen (Harrison et al. AIDS Res. Hum. Retro. 8:39) und das Thymidinkinasegen vom Typ I des Herpes simplex-Virus (HSV-TK) (Caruso und Klatzmann, PNAS 89:182). In beiden Fällen befand sich die Transkription unter der Kontrolle von regulatorischen HIV-Sequenzen. Während das Diphtherietoxin an sich toxisch ist, benötigt die HSV-TK die Zugabe von Acyclovir, um infizierte Zellen abzutöten. Die Verwendung von HSV-TK, gefolgt durch die Zugabe von 10 μM Acyclovir für 17 Tage, blockiert zum Beispiel völlig die HIV-Infektion von HUT 78-Zellen für bis zu 55 Tage in Kultur.
  • Die Verfahren für die Stimulierung und Vermehrung einer Population von Antigen-spezifischen T-Zellen sind in therapeutischen Situationen nützlich, in denen es wünschenswert ist, die Immunantwort nach der Verabreichung der T-Zellen an ein Testobjekt hochzuregulieren (z.B. eine Antwort zu induzieren oder eine bestehende Antwort zu verstärken). Zum Beispiel kann das Verfahren verwendet werden, um eine T-Zellantwort gegen tumorassoziierte Antigene zu verstärken. Tumorzellen von einem Testobjekt exprimieren typischerweise tumorassoziierte Antigene, können aber nicht dazu in der Lage sein, ein costimulatorisches Signal in T-Zellen zu stimulieren (z.B. weil ihnen die Expression von costimulatorischen Molekülen fehlt). Somit können Tumorzellen in vitro mit T-Zellen aus einem Testobjekt und mit Antigen-spezifischen T-Zellen, die dem erfindungsgemäßen Verfahren entsprechend vermehrt wurden, in Kontakt gebracht und die T-Zellen dem Testobjekt zurückgegeben werden. In einer anderen Ausführungsform können T-Zellen, wie hier beschrieben, stimuliert und vermehrt werden, um die Reaktionsfähigkeit gegenüber pathogenen Wirkstoffen wie Viren (z.B. menschliches Immunschwäche Virus), Bakterien, Parasiten und Pilzen zu induzieren oder zu verstärken.
  • Diese Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter veranschaulicht, was nicht als Beschränkung aufgefasst werden soll. Die Inhalte aller Referenzen und offengelegten Patentanmeldungen, die innerhalb dieser Anmeldung zitiert wurden, sind hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen. Die folgende im Abschnitt Materialien und Verfahren beschriebene Methodik wurde innerhalb der nachstehend dargestellten Beispiele verwendet.
  • VERFAHREN UND MATERIALIEN
  • Präparation von immobilisiertem anti-CD3-Antikörper
  • Gewebekulturflaschen wurden mit monoclonalem anti-CD3-Antikörper beschichtet. Obwohl eine Anzahl von monoclonalen anti-Mensch-CD3-Antikörpern erhältlich ist, wurde in dieser Prozedur OKT3, das von von der American Type Culture Collection erhaltenen Hybridomzellen präpariert wurde, verwendet. Für jeden anti-CD3-Antikörper muss die optimale Konzentration für die Beschichtung auf Gewebekulturflaschen experimentell bestimmt werden. Es wurde bestimmt, dass die optimale Konzentration für OKT3 typischerweise in dem Bereich von 0,1 bis 10 Microgramm pro Milliliter liegt. Um eine Beschichtungslösung herzustellen, wurde der Antikörper in 0,05 M Tris-HCl, pH 9,0 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) suspendiert. Beschichtungslösung in ausreichender Menge, um den Boden einer Gewebekulturflasche zu bedecken, wurde zugegeben (Falcon, Nunc oder Costar) und über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Flaschen wurden dreimal mit Phosphatgepufferter Salzlösung ohne Calcium oder Magnesium (PBS ohne Ca oder Mg) gewaschen und Blockierungspuffer (PBS ohne Ca oder Mg plus 5% Rinderserumalbumin) wurde zugegeben, um den Boden der Flasche zu bedecken, und sie wurden zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dieser Inkubation wurden die Flaschen direkt verwendet oder zur Lagerung eingefroren, wobei die Blockierungslösung in der Flasche verblieb.
  • Isolierung von Leukocyten aus peripherem Blut (PBLs)
  • Proben wurden durch Leukopherese von gesunden Spendern erhalten. Unter sterilen Bedingungen wurden die Leukocyten in eine T800-Kulturflasche überführt. Der Beutel wurde mit balancierter Hank-Salzlösung ohne Calcium oder Magnesium (HBSS ohne) (Whittaker Bioproducts, Inc., Walkersville, MD) gewaschen. Die Zellen wurden mit HBSS ohne verdünnt und gut gemischt. Die Zellen wurden dann zu gleichen Teilen auf zwei sterile 200 Milliliter-Plastikgewebekulturröhrchen mit konischem Boden aufgeteilt. Jedes Röhrchen wurde mit HBSS ohne auf 200 ml gebracht und bei 1800 U/min für 12 Minuten in einer Beckman TJ-6-Zentrifuge rotiert. Der Überstand wurde abgesaugt und jeder Niederschlag in 50 ml HBSS ohne resuspendiert. Die Zellen wurden in zwei 50 ml-Röhrchen mit konischem Boden überführt und bei 1500 U/min für acht Minuten rotiert. Der Überstand wurde wiederum abgesaugt.
  • Um die Erythrocyten zu lysieren, wurden die Zellniederschläge in 50 ml ACK-Lysepuffer (Biofluids, Inc., Rockville MD, Katalog #304) für drei Minuten bei Raumtemperatur unter sanftem Rühren resuspendiert. Die Zellen wurden wiederum für acht Minuten bei 1500 U/min durch Rotieren pelletiert. Nach dem Absaugen des Überstandes wurden die Niederschläge in 32 ml HBSS ohne in einem 50 ml-Röhrchen vereinigt.
  • Die Trennung der PBLs von Monocyten wurde durch eine Zentrifugation über einen PERCOLLTM-Gradienten bewerkstelligt. Um 1 Liter PERCOLLTM-Lösung herzustellen (PERCOLLTM-MO) wurden 716 ml PERCOLLTM (Pharmacia, Piscataway, NJ, Katalog #17-0891-01) mit 100 ml 1,5 M Natriumchlorid, 20 ml 1 M Natrium-HEPES und 164 ml Wasser vermischt. Alle Reagentien müssen Gewebekulturgrad aufweisen und steril filtriert sein. Nach dem Mischen wurde diese Lösung durch einen sterilen 0,2 μm3-Filter filtriert und bei 4°C gelagert. 24 ml PERCOLLTM-MO wurde zu jedem der zwei 50 ml-Röhrchen mit konischem Boden gegeben. Zu jedem Röhrchen wurde 16 ml der Zellsuspension gegeben. Die Lösung wurde gut gemischt, indem die Röhrchen sanft invertiert wurden. Die Röhrchen wurden für 30 Minuten bei 2800 U/min ohne Bremse rotiert. Die Röhrchen wurden aus der Zentrifuge mit Vorsicht entnommen, um die Schichten nicht zu vermischen. Die PBLs befanden sich am Boden der Röhrchen. Dann wurde der Überstand abgesaugt und die PBLs wurden in HBSS ohne gewaschen, indem sie für 8 Minuten bei 1500 U/min zentrifugiert wurden.
  • Zellsortierung über negative magnetische Immunadhärenz
  • Die Zellsortierung über negative magnetische Immunadhärenz muss bei 4°C durchgeführt werden. Die gewaschenen Zellniederschläge, die aus dem vorstehend beschriebenen PERCOLLTM-Gradienten erhalten wurden, wurden in Beschichtungsmedium (RPMI-1640 (BioWhittaker, Walkersville, MD, Katalog # 12-167Y), 3% fötalem Kälberserum (FCS) (oder 1 % menschliches AB–-Serum oder 0,5% Rinderserumalbumin), 5 mM EDTA (Quality Biological, Inc., Gaithersburg, MD, Katalog # 14-117-1 ), 2 mM L-Glutamin (BioWhittaker, Walkersville, MD, Katalog # 17-905C), 20 mM HEPES (BioWhittaker, Walkersville, MD, Katalog #17-757A) und 50 μg/ml Gentamicin (BioWhittaker, Walkersville, MD, Katalog # 17-905C) auf eine Zelldichte von 20 × 106 pro ml resuspendiert. Ein Gemisch von gegen Zelloberflächenmarker gerichteten monoclonalen Antikörpern wurde bis zu einer Endkonzentration von 1 μg/ml für jeden Antikörper zugegeben. Die Zusammensetzung dieses Gemischs ist gewählt, um entweder CD4+- oder CD28+-T-Zellen anzureichern. Somit wird das Gemisch typischerweise Antikörper gegen CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR und (nur für CD4+-Zellen) CD8 einschließen. (Siehe Tabelle 1 für eine Liste von Gemischen von monoclonalen Antikörpern zur Sortierung). Das die Zellen und Antikörper enthaltende Röhrchen wurde für 30–45 Minuten bei 4°C rotiert. Am Ende dieser Inkubation wurden die Zellen dreimal mit Beschichtungsmedium gewaschen, um ungebundenen Antikörper zu entfernen. Magnetische Perlen, die mit Ziege-anti-Maus-IgG (Dynabeads M-450, Katalog #11006, P&S Biochemicals, Gaithersburg, MD) beschichtet waren und vorher mit Beschichtungsmedium gewaschen wurden, wurden in einem Verhältnis von drei Perlen pro Zelle zugegeben. Die Zellen und Perlen wurden dann für 1–1,5 Stunden bei 4°C rotiert. Die Antikörper-beschichteten Zellen wurden unter der Verwendung eines Magnetteilchen-Konzentrators gemäß der Angaben des Herstellers (MPC-1, Katalog # 12001, P&S Biochemicals, Gaithersburg, MD) entfernt. Die nicht anheftenden Zellen wurden aus dem Beschichtungsmedium herausgewaschen und in einem geeigneten Kulturmedium resuspendiert.
  • TABELLE 1: Gemische von monoclonalen Antikörpern zur Sortierung: (Kursiv geschriebene mAbs sind vom ATCC erhältlich)
    Figure 00370001
  • Figure 00380001
  • Figure 00390001
  • Langzeitstimulierung:
  • Mit monoclonalem anti-CD3-Antikörper vorbeschichtete Gewebekulturflaschen wurden aufgetaut und dreimal mit PBS gewaschen. Die gereinigten T-Zellen wurden in einer Dichte von 2 × 106/ml zugegeben. Der monoclonale anti-CD28-Antikörper mAb 9.3 (Dr. Jeffery Ledbetter, Bristol Myers Squibb Corporation, Seattle, WA) oder EX5.3D10, ATCC-Hinterlegungs-Nr. HB11373 (Repligen Corporation, Cambridge, MA) wurde in einer Konzentration von 1 μg/ml zugegeben und die Zellen wurden bei 37°C über Nacht kultiviert. Die Zellen wurden dann durch kräftiges Pipettieren von der Flasche abgelöst und in einer Dichte von 0,5 × 106/ml in eine frische unbehandelte Flasche überführt. Danach wurden die Zellen jeden zweiten Tag durch kräftiges Pipettieren resuspendiert und auf 0,5 × 106/ml verdünnt. Der mittlere Durchmesser der Zellen wurde täglich mit einem Counter-Counter 2M, der mit einem Coulter-Channelyzer gekoppelt war, überwacht. Ruhende T-Zellen haben einen mittleren Durchmesser von 6,8 Micron. Mit diesem Stimulierungsprotokoll erhöhte sich der mittlere Durchmesser auf über 12 Micron an Tag 4 und begann dann etwa an Tag 6 abzunehmen. Wenn der mittlere Durchmesser auf etwa 8 Micron gesunken war, wurden die Zellen wiederum wie vorstehend über Nacht mit anti-CD3 und anti- CD28 stimuliert. Es war wichtig, dass den Zellen nicht erlaubt wurde, zu dem Ruhedurchmesser zurückzukehren. Dieser Zyklus wurde drei Monate lang wiederholt. Es kann erwartet werden, dass die Zeit zwischen den Restimulierungen mehr und mehr abnehmen wird.
  • Beispiel 1: Langzeitwachstum von CD4+-T-Zellen mit anti-CD- und anti-CD28-Antikörpern
  • Früher bekannte Verfahren, T-Zellen in vitro zu kultivieren, benötigen die Zugabe von exogenen Versorgerzellen oder zellulären Wachstumsfaktoren (wie Interleukin 2 oder 4) und eine Quelle für ein Antigen oder mitogenes Pflanzenlektin. CD28+-T-Zellen aus peripherem Blut wurden über negative Selektion unter der Verwendung von magnetischen Immunperlen und monoclonalen Antikörpern, wie vorstehend in dem Abschnitt Verfahren und Materialien beschrieben, isoliert. CD4+-Zellen wurden aus der Population von T-Zellen weiter isoliert, indem die Zellen mit monoclonalen anti-CD8-Antikörpern behandelt und die CD8+-Zellen mit magnetischen Immunperlen entfernt wurden. Kurz gesagt wurden T-Zellen aus einer Leukopherese eines normalen Spenders erhalten und mittels FICOLLTM-Dichtegradientenzentrifugation, gefolgt durch eine magnetische Immunperlensortierung gereinigt. Die resultierenden CD28+-CD4+-T-Zellen wurden in einem definierten Medium (X-Vivo10, enthaltend Gentamicin und L-Glutamin (Whittaker Bioproducts)) mit einer Ausgangsdichte von 2,0 × 106/ml kultiviert, indem die Zellen Kulturschalen, die an Plastik adsorbierte Ziegen-anti-Maus-IgG (Kirkegaard und Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) und anti-CD3-mAb G19-4 enthielten, zugegeben wurden. Nach 48 Stunden wurden die Zellen entnommen und in Flaschen gegeben, die entweder hIL-2 (5%, CalBiochem) oder anti-CD28-mAb (500 ng/ml) enthielten. Die mit IL-2 kultivierten Zellen wurden in Abständen von zwei Tagen mit frischem IL-2 versorgt. Allen Kulturen wurde nötigenfalls frisches Medium zugegeben, um eine Zelldichte von 0,5 × 106/ml beizubehalten. Die Zellen wurden in Abständen von ungefähr einer Woche durch die Kultur auf an Plastik adsorbierten anti-CD3-mAb für 24 Stunden restimuliert, die Zellen wurden dann entnommen und bei 1,0 × 106/ml in frisches Medium in Flaschen gegeben, die entweder IL-2 oder anti-CD28-mAb enthielten.
  • In dem in 1 gezeigten Beispiel enthielt das Kulturgefäß anfänglich 50 × 106 Zellen und die Zellen wurden in einer optimalen Menge an mitogenem Lektin-PHA kultiviert oder mit einer zyklischen Stimulierung der an Plastik immobilisierten anti-CD3-mAb in Anwesenheit von Interleukin-2 oder des anti-CD28-mAb 9.3 kultiviert. Die Zellen, die in PHA alleine kultiviert wurden, zeigten keine Proliferation, wobei alle Zellen etwa an Tag 20 der Kultur starben, was die funktionelle Abwesenheit von akzessorischen Zellen zeigt. Im Gegensatz dazu erreichten die Zellen, die in Anwesenheit von anti-CD3 mit IL-2 oder anti-CD28 gewachsen waren, eine logarithmische Wachstumsphase mit gleichen Wachstumsraten in den ersten drei Wochen der Kultur. Die anti-CD3-Kulturen begannen jedoch während der vierten Woche der Kultur in den Wachstumsraten zu divergieren, wobei die IL-2 gefütterten Zellen nach einer Vermehrung bis ~2,8log10 eine Plateauphase erreichten. Im Gegensatz dazu blieben die in Anwesenheit von anti-CD28 gewachsenen Kulturen bis zur sechsten Woche der Kultur in logarithmischem Wachstum, wobei bis zu dieser Zeit eine Vermehrung bis ~3,8log10 stattgefunden hatte. Somit ist eine Stimulierung des CD28-Rezeptors, vielleicht durch anti-CD28-Quervernetzung, in der Lage das Wachstum von CD4+-T-Zellen in Abwesenheit von fötalem Kälberserum oder akzessorischen Zellen zu stimulieren und darüber hinaus können unter der Verwendung von anti-CD28 im Gegensatz zu der Zugabe von exogenem IL-2 etwa 10-fach mehr Zellen erhalten werden. In wiederholten Experimenten ergab die Vermehrung von CD4+-T-Zellen unter der Verwendung von anti-CD28-Antikörpern beständig mehr CD4+-T-Zellen als die Vermehrung unter der Verwendung von IL-2 (z.B. bis zu 1000-fach mehr Zellen). Dieses System hat den zusätzlichen Vorteil, dass es nicht auf die Anwesenheit von akzessorischen Zellen angewiesen ist, was in klinischen Situationen von Vorteil sein kann, wenn akzessorische Zellen limitierend oder fehlerhaft sind.
  • Beispiel 2: Langzeitwachstum von anti-CD28-behandelten T-Zellen in Medium, das fötales Kälberserum enthält
  • Eine weitere Serie von Experimenten testete, ob der Wachstumsvorteil der Stimulierung des CD28-Rezeptors auf das Ersetzen von Faktoren, die normalerweise in fötalem Kälberserum vorhanden sind, beruhte. T-Zellen wurden aus einer Leukopherese eines normalen Spenders erhalten und mittels FICOLLTM- Dichtegradientenzentrifugationen, gefolgt durch eine magnetische Immunperlensortierung, gereinigt. Die resultierenden CD28+-CD4+-T-Zellen wurden in einer Ausgangsdichte von 2,0 × 106/ml in Medium (RPMI-1640 enthaltend 10% hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum [Hyclone, Logan, Utah] und Gentamicin und L-Glutamin) kultiviert, indem die Zellen in Kulturschalen, die an Plastik adsorbiertes OKT3 enthielten, gegeben wurden. Nach 48 Stunden wurden die Zellen entnommen und in Flaschen, die entweder hIL-2 (10% Endkonzentration, CalBiochem) oder anti-CD28-mAb 9.3 (800 ng/ml) enthielten, gegeben. Die Zellen wurden nötigenfalls mit frischem Medium versorgt, um eine Zelldichte von 0,5 × 106/ml beizubehalten, und in Abständen von ungefähr einer Woche durch die Kultur auf an Plastik adsorbierten anti-CD3-mAb für 24 Stunden restimuliert.
  • Wie in 2 gezeigt, erreichten die Zellen die logarithmische Wachstumsphase mit gleichen Wachstumsraten innerhalb der ersten drei Wochen der Kultur. Die anti-CD3-Kulturen begannen jedoch während der vierten Woche der Kultur in den Wachstumsraten zu divergieren, wobei die IL-2 gefütterten Zellen nach einer Vermehrung bis ~4,0log10 eine Plateauphase erreichten. Im Gegensatz dazu blieben die in Anwesenheit von anti-CD28 gewachsenen Kulturen bis zur fünften Woche der Kultur in logarithmischem Wachstum, wobei bis zu dieser Zeit eine Vermehrung bis ~5,1log10 stattgefunden hatte. Somit führte die Stimulierung durch CD28 zu einer ~125000-fachen Vermehrung der Ausgangskultur, während die Fütterung mit IL-2 zu einer 10000-fachen Vermehrung der Zellen führte.
  • Beispiel 3: Langzeitwachstum von T-Zellen in Phorbolester, Ionomycin und anti-CD28-stimulierten T-Zellen
  • Weitere Experimente testeten, ob alternative Verfahren zur Aktivierung von T-Zellen ebenfalls ein CD28-stimuliertes Wachstum ermöglichen würden. Eine pharmakologische Aktivierung von T-Zellen mit PMA und Ionomycin ist angedacht, um die Aktivierung der Antigenrezeptoren der T-Zellen über den TCR/CD3-Komplex nachzuahmen. T-Zellen wurden aus einer Leukopherese eines normalen Spenders erhalten und mittels FICOLLTM- und PERCOLLTM-Dichtegradientenzentrifugationen, gefolgt durch eine magnetische Immunperlensortierung, gereinigt. Die resultierenden CD28+-CD4+-T-Zellen wurden in einer Ausgangsdichte von 2,0 × 106/ml kultiviert, indem die Zellen in Kulturschalen, die Phorbolmyristinsäure (PMA 3 ng/ml, Sigma) und Ionomycin (120 ng/ml, CalBoichem, Charge #3710232) enthielten, gegeben wurden. Nach 24 Stunden wurden die Zellen auf 0,5 × 106/ml verdünnt und in Flaschen, die entweder rIL-2 (50 IU/ml, Boehringer Mannheim, Charge #11844900) oder anti-CD28-mAb (1 μg/ml) enthielten, gegeben. Die Zellen wurden nötigenfalls mit frischem Medium versorgt, um eine Zelldichte von 0,5 × 106/ml beizubehalten, und zyklisch in Abständen von ungefähr einer Woche durch die erneute Zugabe von PMA und Ionomycin restimuliert. Den IL-2 enthaltenden Kulturen wurde in täglichen Abständen frisches IL-2 zugefügt.
  • Die Ergebnisse dieses Experiments sind in 3 gezeigt. T-Zellen, die aus akzessorischen Zellen gereinigt wurden, wuchsen nicht an Zellzahl in der Anwesenheit von PMA („P" in der Figur) und Ionomycin („I" in der Figur), mit oder ohne IL-2. Die Zellen verklumpten und wurden größer, wie durch Größenanalyse angezeigt, was darauf hindeutet, dass die Zellen induziert worden waren, in die G1-Phase des Zellzyklus einzutreten, dass sie aber nicht zu DNA-Synthese und Zellteilung fortschritten. Im Gegensatz dazu führte die Zugabe von CD28-mAb zu Zellen, die mit PMA und Ionomycin behandelt worden waren, zu logarithmischem Zellwachstum. Somit wird anti-CD3-mAb nicht benötigt, um eine Aktivierung von T-Zellen auszuüben. Es sollte erkannt werden, dass andere Aktivatoren der Proteinkinase C wie Bryostatin oder Diacylglycerin anstelle von PMA verwendet werden können.
  • Beispiel 4: Immunphänotyp von Zellen, die mit anti-CD3-Stimulierung und der Zugabe von IL-2 oder anti-CD28-mAb kultiviert wurden
  • Um die Untergruppen von T-Zellen, die vermehrt wurden, zu untersuchen, wurden PBL für 16 Tage unter der Verwendung von entweder anti-CD3 und IL-2 oder anti-CD3 und anti-CD28 vermehrt. 4 zeigt die selektive Anreicherung von CD4-Zellen aus Lymphocyten aus peripherem Blut. Mononucleare Zellen wurden mittels FICOLLTM-Hypaque-Dichtegradientenzentrifugation aus Blut isoliert. Die Zellen wurden mit monoclonalen CD4- und CD8-Antikörpern gefärbt und hinsichtlich des Prozentsatzes positiver Zellen an Tag 0 analysiert. Die Zellen wurden dann auf dem an Plastik immobilisierten monoclonalen anti-CD3-Antikörper G19-4 plus IL-2 oder auf dem an Plastik immobilisierten monoclonalen anti-CD3-Antikörper G19-4 plus dem monoclonalen anti-CD28-Antikörper 9.3 (0,5 μg/ml) kultiviert. Die Zellen wurden an Tag 16 aus der Kultur isoliert und wiederholtes Färben der CD4- und CD8-Antigene wurde mittels Durchflusscytometrie durchgeführt. Die Daten wurden durch Vorwärtswinkellichtstreuung und Seitenstreuung für die Lymphcytenpopulation kontrolliert. Durch diese Analyse war der Prozentsatz an CD4- und CD8-Zellen 8,0% und 84,5% bei in IL-2 gewachsenen Zellen und 44,6% und 52,5% bei in CD28 gewachsenen Zellen. Diese Ergebnisse legen nahe, dass eine CD28-Vermehrung CD4+-Zellen begünstigt, im Gegensatz zu der anerkannten Beobachtung, dass bei in IL-2 gewachsenen Zellen CD8+-Zellen dominieren (zum Beispiel siehe D.A. Cantrell und K.A. Smith (1983) J. Exp. Med. 158:1895 und Gullberg, M. und K.A. Smith (1986) J. Exp. Med. 163:270).
  • Um diese Möglichkeit weiter zu testen, wurden CD4+-T-Zellen unter der Verwendung von negativer Selektion mit monoclonalen Antikörpern und magnetischen Immunperlen, wie vorstehend beschrieben, auf 98% Reinheit angereichert. Eine Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierungs (FACS)-Analyse wurde verwendet, um den Phänotyp der mit anti-CD3 und anti-CD28 kultivierten T-Zellen zu untersuchen. Die Zellen wurden durch Zentrifugation pelletiert und in PBS/1% BSA resuspendiert. Die Zellen wurden dann durch die zweimalige Wiederholung dieser Prozedur gewaschen. Die Zellen wurden pelletiert und in 100 μl primärer Antikörperlösung resuspendiert, verwirbelt und für eine Stunde auf Eis gehalten. Nach zweimaligem Waschen in PBS/1% BSA wurden die Zellen in 100 μl Fluorescein-markiertem Ziege-anti-Maus-IgG resuspendiert und für 30 Minuten auf Eis inkubiert. Am Ende dieser Inkubation wurden die Zellen zweimal in PBS gewaschen und in 500 μl 1% Paraformaldehyd in PBS resuspendiert. Die markierten Zellen wurden auf einem Ortho-Cytofluorograph analysiert. Die Zellen wurden nach der Isolierung oder nach 26 Tagen in Kultur mit mit Phycoerythrin konjugierten anti-CD3 (Leu-4), -CD4 (Leu-3A), -CD8 (OKT8) oder mit monoclonalen IgG2a-Kontrollantikörpern gefärbt und die Fluoreszenz mit einem Durchflusscytometer quantifiziert. Die Zellen wurde für einen Monat kultiviert, unter der Verwendung von anti-CD3 und entweder IL-2 oder anti-CD28, um die Zellen zu vermehren. Es gab eine gleiche Vermehrung der Zellen innerhalb der ersten 26 Tage der Kultur (nicht gezeigt), wie jedoch in 5 zu sehen ist, divergierte der Phänotyp der Zellen mehr und mehr mit der zunehmenden Zeit in Kultur, sodass an Tag 26 der Kultur die vorherrschende Zelle in der anti-CD28-Kultur CD4+ war, während die Zellen in der IL- 2-Kultur vorherrschend CD8+ waren. Somit ist die CD28-Rezeptorstimulierung, vielleicht durch Quervernetzung, in der Lage, auf selektive Weise T-Zellen des CD4-Phänotyps zu vermehren, während das herkömmliche Verfahren der Kultur von T-Zellen in vitro Zellen des CD8-Phänotyps ergibt. Weitere Experimente sind mit ähnlichen Ergebnissen durchgeführt worden, was darauf hindeutet, dass CD28-Stimulierung von anfänglich gemischten Zellpopulationen in der Lage ist, Kulturen zu ergeben, die vorherrschend oder ausschließlich CD4-T-Zellen enthalten, und somit kann man CD4-Zellen, die anfänglich in limitierenden Mengen vorhanden sind, vermehren und „retten".
  • Beispiel 5: Verwendung der Zellgrößenbestimmung oder zyklischen Expression von B7 auf CD4+-T-Zellen, um die Vermehrung von T-Zellen zu überwachen
  • Um den Zeitpunkt für die Restimulierung der T-Zellen zu bestimmen, wurden die Veränderungen im Zellvolumen unter der Verwendung eines Coulter-Counters ZM, der mit einem Coulter gekoppelt ist, überwacht. CD28+-CD4+-T-Zellen wurden, wie beschrieben, durch magnetische Immunselektion isoliert und in Anwesenheit von anti-CD28-mAb 9.3 (0,5 μg/ml) kultiviert und mit dem an Plastik immobilisierten monoclonalen anti-CD3-Antikörper G19-4, wie angezeigt, restimuliert. 9 zeigt die zyklischen Veränderungen im Zellvolumen während sechs aufeinander folgenden Restimulierungen („S1" bis „S6"), die im Wesentlichen, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt wurden. Kurz dargestellt wurden die Zellen über drei Wochen hinweg mit anti-CD3 und anti-CD28 in Kultur vermehrt. Die Zellen wurden bei jeder Restimulierung mit anti-CD3-Antikörper in frisches Medium gegeben. Die Stimulierungen fanden in Abständen von zehn Tagen statt. Die Zellen wurden stimuliert, sobald das Zellvolumen auf < 400 fl absank.
  • In einem anderen Experiment wurde die zyklische Expression des B7-1-Antigens verwendet, um die Zeit für die Restimulierung der T-Zellen zu bestimmen. Die aus dem in 10 gezeigten Experiment erhaltenen Zellen wurden mit einem CTLA-4lg-Fusionsprotein (erhalten von Repligen Corporation; siehe auch Linsley, P.S. et al. (1991) J. Exp. Med. 174:561–569) gefärbt und mittels Durchflusscytometrie analysiert, um die B7-1-Rezeptor-Expression zu messen. Es wurde bestimmt, dass CD4+-T-Zellen anfänglich den B7-1-Rezeptor nicht exprimieren und dass die Expression mit der Kultur induziert wird. Weiterhin wurde gefunden, dass die B7-1-Expression vorübergehend ist und dass sie mit wiederholter anti-CD3-Restimulierung reinduziert wird.
  • Beispiel 6: Produktion von Cytokinen durch T-Zellen nach einer anti-CD28-Stimulierung
  • Experimente wurden durchgeführt, um die durch T-Zellen nach einer anti-CD28-Stimulierung produzierten Cytokine zu analysieren. CD28+-CD4+-T-Zellen wurden isoliert, wie in den vorherigen Beispielen beschrieben. Die Zellen wurden mit an Plastik immobilisierten anti-CD3-mAb und IL-2 (200 U/ml) oder anti-CD3 und anti-CD28 ohne zugegebenes Lymphokin stimuliert. Die Zellen wurden mit anti-CD3-Antikörper restimuliert, wie durch Veränderungen des Zellvolumens, wie in Beispiel 5 beschrieben, bestimmt wurde. Der Zellkulturüberstand wurde zu den angedeuteten Zeitpunkten entnommen und hinsichtlich IL-2 (11), GM-CSF (12) und TNF-α (13) analysiert. IL-2 wurde durch einen Biotest auf CTLL-2-Zellen bestimmt, während TNF-α und GM-CSF mittels ELISA gemäß der Angaben des Herstellers gemessen wurden (TNFα, GMCSF:R&D Systems, Minneapolis, MN). Die für die verschiedenen Cytokine gezeigten Daten stammen aus getrennten Experimenten. In anderen Experimenten (nicht gezeigt) wurde gezeigt, dass eine anti-CD3- plus anti-CD28-Stimulierung große Mengen an IL-4 und IL-5 in Kulturüberständen nach ungefähr 10 Tagen der Kultur hervorruft, obwohl nur geringe Mengen dieser Cytokine während der frühen Periode der Kultur vorhanden waren.
  • Die Muster der Cytokinsekretion bei Zellen, die dem in den Beispielen beschriebenen Protokoll entsprechend durch verschiedene Restimulierungen vermehrt wurden, wurde mit denen von Zellen verglichen, die mit anti-CD3 plus IL-2 über drei Wochen hinweg in Kultur vermehrt wurden. Die Zellen wurden bei jeder Restimulierung mit anti-CD3-Antikörper in frisches Medium überführt. Die Stimulierungen fanden in Abständen von 10 Tagen statt. Nach 24 Stunden weiterer Kultur wurde ein Aliquot des Zellkulturüberstandes für einen Test entnommen. ELISA-Tests für einzelne Cytokine wurden mit Kits verschiedener Hersteller (IL-2:T Cell Diagnostics, Cambridge, MA; IFN-γ Endogen, Inc., Boston, MA; IL-4, TNF-α, GMCSF:R&D Systems, Minneapolis, MN) nach den mit den Kits gelieferten Vorgaben durchgeführt. Wie aus den Ergebnissen eines in Tabelle 2 gezeigten repräsentativen Experiments zu sehen ist, führen beide Protokolle zu sehr ähnlichen Mengen an IL-2- und IL-4-Sekretion. Die größere Menge an GM-CSF- und TNFα-Sekretion nach einer anti-CD3- und anti-CD28-Co-Stimulierung legt nahe, dass die proliferative Kapazität dieser Kombination von Stimulantien teilweise auf ihrer Fähigkeit beruht, eine autokrine Schleife zu stimulieren.
  • Tabelle 2 Vergleich der sekretierten Cytokine von T-Zellen, die mit anti-CD3 und IL-2 vermehrt wurden, gegenüber T-Zellen, die mit anti-CD3 und anti-CD28 vermehrt wurden
    Figure 00480001
  • Beispiel 7: Polyclonalität von T-Zellen nach einer anti-CD28-Stimulierung
  • Die Polyclonalität einer Population von T-Zellen nach einer Stimulierung mit einem anti-CD3- und einem anti-CD28-Antikörper, wie in den vorherigen Beispielen beschrieben durchgeführt. CD28+-CD4+-T-Zellen wurden, wie in den vorherigen Beispielen beschrieben, wurde isoliert. Die Zellen wurden, mit an Plastik immobilisiertem anti-CD3-mAb und anti-CD28-mAb stimuliert und eine FACS-Analyse wurde unter der Verwendung einer Gruppe von anti-TCR-Antikörpern (Vβ5a, Vβ5b, Vβ5c, Vβ6a, Vβ8a, Vβ12a und Vα2a), erhalten von Pharmingen, im Wesentlichen, wie in Beispiel 4 beschrieben, durchgeführt. Die Polyclonalität der Population von T-Zellen wurde vor (Tag1) und nach der Stimulierung (Tag 24) bestimmt. Wie in 14 gezeigt, wird die TCR-Diversität einer durch CD28 stimulierten Population von T-Zellen an Tag 24 aufrechterhalten.
  • Beispiel 8: Vergleich der Zelloberflächenfärbung von T-Zellen von HIV+- und HIV–-Individuen nach einer anti-CD28-Stimulierung
  • Eine weitere Serie von Experimenten wurde durchgeführt, um die Expression von verschiedenen Zelloberflächenmarkern auf Zellen von HIV-seropositiven und – seronegativen Individuen, die entsprechend der in den vorherigen Beispielen beschriebenen Prozeduren vermehrt wurden, zu bestimmen. CD28+-CD4+-T-Zellen wurden, wie hier beschrieben, erhalten. In diesen Experimenten war der anti-CD3-mAb mit einer ersten Markierung (z.B. Rhodamin) und der geeignete zweite Antikörper (z.B. anti-CD28, anti-CD4, anti-CD8) mit einer zweiten Markierung (z.B. Fluorescein) markiert. T-Zellen wurden mit an Plastik immobilisiertem anti-CD3-mAb und anti-CD28-mAb, wie hier beschrieben, stimuliert und der Prozentsatz an T-Zellen, die eine Vielzahl von Zelloberflächenmarkern bei den verschiedenen Stimulierungen (d.h. S1, S2 und S3) exprimieren, wurde durch FACS-Analyse bestimmt. Wie in den 15 und 16 gezeigt, ist die Gesamtverteilung der Zelloberflächenmarker auf T-Zellen, die von HIV-seropositiven und -seronegativen Individuen erhalten wurden, während des Stimulierungstests ungefähr gleich. Es ist bemerkenswert, dass die Anwesenheit eines Zelloberflächenmarkers, CD45RA, der ein Marker für naive T-Zellen ist, über den Verlauf der Vermehrung von CD28-stimulierten T-Zellen abnimmt. Im Gegensatz dazu steigt der Prozentsatz der T-Zellen, die den Memory-T-Zellenoberflächenmarker CD45RO exprimieren, mit der CD28-Stimulierung an. Somit werden bei einer Vermehrung von T-Zellen durch CD28-Stimulierung vorzugsweise Memory-T-Zellen vermehrt oder naive T-Zellen in Memory-T-Zellen umgewandelt. Es sollte bemerkt werden, dass die Abnahme des Prozentsatzes an T-Zellen, die CD28 exprimieren, aufgrund der Anwesenheit des anti-CD28-Antikörpers in der T-Zellkultur über den gesamten Test hinweg ein experimenteller Artefakt ist. Die Anwesenheit des anti-CD28-Antikörpers verhindert das Anfärben des CD28-Antigens.
  • Beispiel 9: Langzeitwachstum von CD8+-T-Zellen mit anti-CD3 und dem monoclonalen Antikörper ES5.2D8
  • Experimente wurden durchgeführt, um festzustellen, ob eine Population von CD8+-T-Zellen durch eine Stimulierung mit einem anti-CD3-mAb und dem monoclonalen Antikörper ES5.2D8 bevorzugt vermehrt werden kann. CD28+-T-Zellen wurden, im Wesentlichen wie in Beispiel 1 beschrieben, erhalten. Um auf CD8-Expression zu testen, wurden ein primärer anti-CD8-Antikörper und ein markierter geeigneter sekundärer Antikörper in einer FACS-Analyse verwendet, um den Prozentsatz positiver Zellen zu bestimmen. Wie in 17 gezeigt, war die CD8+-Fraktion an Tag 7 nach der Stimulierung der T-Zellen mit dem anti-CD3-mAb G19-4sp und dem mAb ES5.2D8 von ungefähr 20% auf über 40% angestiegen. Es wurde auch gefunden, dass ein anderer monoclonaler Antikörper ER4.7G11 (bezeichnet als 7G11) CD8+-T-Zellen stimuliert. Dieser Antikörper wurde gegen rekombinantes menschliches CTLA4 erzeugt und wurde am 3. Juni 1994 unter der Hinterlegungs-Nr. __ beim ATCC hinterlegt. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass die Bindung entweder einer bestimmten Region von CTLA4 oder eines kreuzreagierenden Zelloberflächenproteins CD8+-T-Zellen auf selektive Weise aktiviert.
  • Beispiel 10: Bestimmung des Epitops des monoclonalen Antikörpers ES5.2D8
  • Um das Epitop des monoclonalen Antikörpers ES5.2D8 zu bestimmen, wurde eine Epitopkartierung mittels eines Screenings einer Phagen-Display-Bibliothek (PDL) durchgeführt und unter der Verwendung von synthetischen Peptiden bestätigt. Eine zufällige 20 Aminosäuren-PDL wurde präpariert, indem ein degeneriertes Oligonucleotid in den fUSE5-Vektor cloniert wurde (Scott, J.K. und Smith, G.P. (1990) Science 249:386–390), wie beschrieben in Cwirla, S.E. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378–6382. Die PDL wurde verwendet, um mittels einer in Jellis, C.L. et al. (1993) Gene 137:63–68 beschriebenen Mikropanning-Technik kurze Peptide zu identifizieren, die den mAb ES5.2D8 spezifisch binden. Einzelne Phagenclone wurden aufgrund ihrer Affinität für immobilisierte mAb aus der Bibliothek gereinigt und das zufällige Peptid wurde durch DNA-Sequenzierung identifiziert. Kurz dargestellt wurde mAB ES5.2D8 auf Nunc Maxisorp-Platten mit 96 Vertiefungen beschichtet und mit 5 × 1010 Phagen, die 8 × 106 verschiedene Phagen repräsentieren, die zufällige 20 Aminosäuren-Peptide präsentieren, inkubiert. Spezifisch gebundene Phagen wurden eluiert, amplifiziert und dann mit dem Antikörper ein zweites Mal inkubiert. Nach der dritten Runde wurden 7 Phagen isoliert und die DNA wurde für eine Sequenzierung präpariert.
  • Die Sequenzanalyse dieser Clone zeigte, dass drei der sieben Sequenzen identisch waren und eine vierte ähnlich war:
    Figure 00510001
    Auf der Basis dieser Daten wurde ein Epitop mit der Sequenz G X W L X D/E (SEQ ID NR.5) vorgeschlagen.
  • Fachleute werden viele Äquivalente zu den spezifischen Ausführungsformen der hier beschriebenen Erfindung kennen oder in der Lage sein, diese unter der Verwendung von nicht mehr als routinemäßigem Experimentieren zu ermitteln.

Claims (32)

  1. In vitro-Verfahren zur Induktion der Proliferation einer Population von T-Zellen, umfassend das Inkontaktbringen einer Population von T-Zellen mit einer Festphasenoberfläche, welche darauf direkt immobilisiert enthält: (a) einen ersten Wirkstoff, welcher ein primäres Aktivierungssignal für die T-Zellen bereitstellt und dabei die T-Zellen aktiviert; und (b) einen zweiten Wirkstoff, welcher ein akzessorisches Molekül auf der Oberfläche der T-Zellen stimuliert und dabei die aktivierten T-Zellen stimuliert, wobei der erste und zweite Wirkstoff dabei die T-Zellen zur Proliferation induziert.
  2. Verfahren nach Anspruch 1 zur Induktion der Proliferation einer Population von CD4+-T-Zellen, weiterhin umfassend das Isolieren einer Population von CD4+-T-Zellen vor Schritt (a).
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der erste Wirkstoff ein TCR/CD3-Komplex-assoziiertes Signal in den T-Zellen stimuliert.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei der erste Wirkstoff ein anti-CD3-Antikörper ist.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei der anti-CD3-Antikörper ein monoclonaler Antikörper gegen menschliches CD3 ist.
  6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der erste Wirkstoff ein anti-CD2-Antikörper ist.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das akzessorische Molekül auf der T-Zelle CD28 ist.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei der zweite Wirkstoff ein anti-CD28-Antikörper ist.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei der anti-CD28-Antikörper ein monoclonaler Antikörper gegen menschliches CD28 ist.
  10. Verfahren nach Anspruch 8, wobei der anti-CD3-Antikörper OKT3 ist und der anti-CD28-Antikörper 9.3 oder EX5.3D10 ist.
  11. Verfahren nach Anspruch 7, wobei der zweite Wirkstoff eine stimulierende Form eines natürlichen Liganden für CD28 ist.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei der natürliche Ligand B7-1 oder B7-2 ist.
  13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, weiterhin umfassend: die Überwachung der Proliferation der T-Zellen, sowie die Reaktivierung und Restimulierung der T-Zellen mit dem ersten und zweiten Wirkstoff, wenn die Rate der T-Zellproliferation abnimmt, um eine weitere Proliferation der T-Zellen zu induzieren.
  14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei der Schritt der Überwachung der Proliferation der T-Zellen durch die Untersuchung der Zellgröße oder die Bestimmung des Expressionsniveaus eines Zelloberflächenmoleküls vorgenommen wird und der Schritt der Reaktivierung und Restimulierung eingeleitet wird, wenn die Größe der T-Zellen abgenommen hat oder wenn das Niveau des Zelloberflächenmoleküls gesunken ist.
  15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Zelloberflächenmolekül B7-1 ist.
  16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die Population der T-Zellen von einem mit HIV infizierten Individuum erhältlich ist.
  17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei das Verfahren weiterhin die Verleihung von Resistenz der T-Zellen gegenüber einer HIV-Infektion umfasst.
  18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Verleihung von Resistenz der T-Zellen gegenüber einer HIV-Infektion durch das Inkontaktbringen der T-Zellen mit wenigstens einem anti-retroviralen Wirkstoff, der HIV-Replikation oder virale Produktion hemmt, vorgenommen wird.
  19. Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Verleihung von Resistenz der T-Zellen gegenüber einer HIV-Infektion durch die genetische Transduktion der T-Zellen vorgenommen wird, um Moleküle zu produzieren, welche eine HIV-Infektion oder -Replikation hemmen.
  20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die T-Zellen aus einem Individuum, welches an einer mit einem genetischen Defekt assoziierten Immunschwäche leidet, genetisch transduziert werden, um den Defekt zu korrigieren.
  21. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die T-Zellen durch Kontakt mit einem Antigen oder einem Teil davon aktiviert werden.
  22. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, weiterhin umfassend die Wiederholung der Schritte (a) bis (b), um eine Population von T-Zellen zu erzeugen, welche 100- bis 100 000-fach größer ist als die ursprüngliche T-Zellpopulation.
  23. Verfahren nach Anspruch 1 zur Induktion der Proliferation einer Population von CD8+ Zellen.
  24. Verfahren nach Anspruch 23, wobei das akzessorische Molekül ein Molekulargewicht von etwa 27kD auf aktivierten T-Zellen hat.
  25. Verfahren nach Anspruch 23 oder 24, weiterhin umfassend die Wiederholung der Schritte (a) bis (b), um eine Population von CD8+-T-Zellen zu erzeugen, welche 100- bis 100 000-fach größer ist als die ursprüngliche T-Zellpopulation.
  26. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 25, wobei der zweite Wirkstoff der monoclonale Antikörper ES5.2D8 ist.
  27. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 26, wobei die Population von CD8+-T-Zellen tumorinfiltrierende Lymphocyten sind, welche von einem unter Krebs leidenden Individuum erhältlich sind.
  28. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die Population von T-Zellen von einem unter Krebs leidenden Individuum erhältlich ist.
  29. Zusammensetzung, umfassend eine Festphasenoberfläche wie in einem der Ansprüche 1, 3 bis 12, 24 oder 26 definiert.
  30. Zusammensetzung nach Anspruch 29, welche kovalent daran verknüpft enthält: (a) einen anti-CD3-Antikörper; und (b) einen anti-CD28-Antikörper.
  31. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 29 oder 30, wobei die Festphasenoberfläche eine Perle oder eine Kulturschalenoberfläche ist.
  32. Zusammensetzung nach Anspruch 31, wobei die Perle eine magnetische Perle ist.
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