TWI756204B - 抗ｖｉｓｔａ抗體及片段、其用途及鑑定其之方法 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於結合於T細胞活化之V域Ig抑制因子(VISTA)之抗體及片段，及使用該等抗體引發某些生物反應之方法。亦包括鑑定能夠引發某些生物反應之抗VISTA抗體之方法。

Description

抗VISTA抗體及片段、其用途及鑑定其之方法
本發明係關於結合於T細胞活化之V域Ig抑制因子(VISTA)之抗體及片段、使用該等抗體引發某些生物反應之方法、以及鑑定能夠引發某些生物反應之抗VISTA抗體之方法。
【技術說明】
腫瘤微環境中因癌細胞或免疫細胞所致的負免疫調節因子之表現可抑制針對腫瘤之宿主免疫反應。為有效對抗癌症，需要阻斷腫瘤介導之對宿主免疫反應之抑制。因此，需要抑制腫瘤微環境中之負免疫調節因子的新穎及有效之治療劑，其中該負免疫調節因子抑制抗腫瘤免疫反應。
在一具體實例中，本發明提供一種引發個體中之生物反應之方法。該方法包含以下步驟：以足以引發個體中之生物反應的量向個體投予結合T細胞活化之V域Ig抑制因子(VISTA)蛋白之抗體或其抗原結合片段。在某些具體實例中，生物反應係選自由以下組成之群：循環免疫細胞數量之減少；骨髓及脾中之顆粒球數量之減少；腫瘤微環境(TME)中之嗜中性白血球、巨噬細胞、T細胞或其組合之數量的增加；及一或多種細 胞介素(例如趨化介素(chemokine))之水平之增加；或此等反應之任何組合。在一特定具體實例中，結合VISTA之抗體或其抗原結合片段包含Fc區，該Fc區結合於免疫細胞(例如NK細胞)上之Fc受體(例如CD16受體)。
在另一具體實例中，本發明提供一種鑑定結合T細胞活化之V域Ig抑制因子(VISTA)蛋白且引發生物反應之抗體的方法。該方法包含以下步驟：向細胞、組織、器官或生物體提供結合VISTA之抗體或其抗體片段，及判定抗體或其抗體片段是否誘導細胞、組織、器官或生物體中之生物反應。在某些具體實例中，生物反應係選自由組成之群：單核球之活化；T細胞之活化；循環免疫細胞數量之減少；骨髓及脾中之顆粒球數量之減少；腫瘤微環境中之嗜中性白血球、巨噬細胞或兩者之數量的增加；及一或多種細胞介素之水平之增加；或此等反應之任何組合。在一特定具體實例中，結合VISTA之抗體或其抗原結合片段包含Fc區，該Fc區結合於免疫細胞(例如NK細胞)上之Fc受體(例如CD16受體)。
本發明之方法適用於例如特性化結合VISTA蛋白之抗體，且適用於針對與潛在治療功效相關之生物活性來篩選候選抗VISTA抗體。
專利或申請案文件含有至少一個彩製圖式。在申請且支付必要費用時，專利局將提供具有彩色圖式之本專利或專利申請公開案之複本。
圖1A-1C：展示TF1 AML細胞上VISTA表現之曲線。在TF-1AML細胞系中展示藉由流式細胞測量術獲得的VISTA蛋白之表現。
圖2A-2E：展示鑑定人類骨髓及淋巴亞群之染色及設門策略的曲線。
圖3A-3G：展示來自一個健康正常供體之人類骨髓及淋巴亞群上VISTA之表現的曲線。
圖4：展示多個健康正常供體之人類骨髓及淋巴亞群上VISTA之表現的曲線。
圖5A-5B：展示鑑定人類單核球及巨噬細胞上VISTA之表現的染色及設門策略的曲線。
圖6A-6C：展示人類單核球及巨噬細胞上VISTA之表現的曲線。
圖7A-7E：展示鑑定人類T及NK細胞亞群上VISTA之表現的染色及設門策略的曲線。
圖8A-8G：展示來自一個健康正常供體之人類T及NK細胞亞群上VISTA之表現的曲線。
圖9：展示多個健康正常供體之人類T及NK細胞亞群上VISTA之表現的曲線。
圖10A-10D：展示鑑定人類樹突狀細胞亞群上VISTA之表現的染色及設門策略的曲線。
圖11A-11C：展示來自一個健康正常供體之人類樹突狀細胞亞群及嗜鹼性白血球上VISTA之表現的曲線。
圖12：展示多個健康正常供體之人類樹突狀細胞亞群及嗜鹼性白血球上VISTA之表現的曲線。
圖13A-13D：健康人類外周血液細胞上VISTA表現之分析。使用多色流式細胞測量術分析法獲得的健康人類外周血液細胞上VISTA表 現之特徵：分析來自2個不同個體之全血樣品的單核球(SSClo,CD11bhiCD14hiCD16-veCD33+veHLA-DR+veCD19-ve)(圖13A)、嗜中性白血球(SSChiCD177+CD11bhiCD14loCD16+veCD33+veHLA-DR-veCD19-ve)(圖13B)上之VISTA表現。使用Ficoll梯度分離外周血液單核細胞以分析CD4+ T細胞(CD3+veCD4+ve)(圖13C)及CD8+ T細胞(CD3+veCD8+ve)(圖13D)。
圖14A-14C：來自肺癌患者及健康對照供體之外周血液細胞上VISTA表現之分析。使用多色流式細胞測量術分析法獲得肺癌患者外周血液細胞上VISTA表現之特徵：展示來自一個個體之代表性FACS圖(圖14A)。藉由Ficoll分離外周血液單核細胞且分析單核球(CD14+ CD11b+ CD33+ HLADR+ CD15-)(圖14B)及源自骨髓之抑制因子細胞(CD14-CD11b+ CD33-HLADR-CD15+ CD16+)(圖14C)上之VISTA表現。
圖15A-15C：使用多色流式細胞測量術分析法獲得的來自患有結腸癌之患者的外周血液細胞中VISTA表現之特徵：展示來自一個個體之代表性FACS圖(圖15A)。藉由Ficoll分離外周血液單核細胞且分析單核球(CD14+ CD11b+ CD33+ HLADR+ CD15-)(圖15B)及源自骨髓之抑制因子細胞(CD14-CD11b+ CD33-HLADR-CD15+ CD16+)(圖15C)上之VISTA表現。
圖16A-16D：使用多色流式細胞測量術分析法獲得的食蟹獼猴外周血液細胞上VISTA表現之特徵：分析來自4隻不同猴之全血的單核球(SSCloCD11bhiCD14hiHLA-DRhiCD16-ve CD19-ve)(圖16A)及嗜中性白血球CD11bhiCD14loHLA-DR-ve CD16-veCD19-ve(圖16B)上之VISTA表現。使用Ficoll梯度分離來自三隻猴之外周血液單核細胞以分析CD4+ T細胞 (TCR α/β+veCD4+ve)(圖16C)及CD8+ T細胞(TCR α/β+veCD8+ve)(圖16D)。
圖17：展示血紅素細胞系中VISTA RNA之絕對表現值。
圖18：用GFP或人類VISTA穩定轉染小鼠A20細胞。將其與ova肽及DO11.10T細胞一起培育。培育開始後24小時量測T細胞之CD25表現。A20-huVISTA細胞抑制T細胞之CD25表現，但此讀出結果藉由與VSTB95一起培育而明顯恢復。
圖19A-19F：展示人類VISTA ELISA結果之曲線。
圖20A-20F：展示結合於表現人類VISTA之細胞的抗VISTA抗體的人類VISTA FACS結果。
圖21A-21D：混合淋巴細胞反應中30μg/ml至0.0μg/ml的6種候選抗VISTA抗體之稀釋研究。
圖22A-22B：SEB分析(個別CPM計數及IFN-g濃度)中30μg/ml至0.0μg/ml的6種候選抗VISTA抗體之稀釋研究。
圖23：使用塗佈於Proteon SPR晶片上之抗VISTA抗體VSTB85及VISTA蛋白獲得的感測器圖，其中指定競爭者(表16中所列之競爭者)在晶片上經過。
圖24：MB49鼠膀胱腫瘤模型之實驗設計。
圖25A-25B：雌性C57BL/6小鼠中之MB49腫瘤生長。曲線說明用抗小鼠VISTA抗體(圖25B)或對照IgG(圖25A)處理之個別小鼠的腫瘤生長。
圖26：人類VISTA之胺基酸序列(SEQ ID NO：46)。
圖27：VISTA直系同源物之多個序列對準。
圖28：如由HDX所確定，與VSTB50及VSTB60抗體(上)或VSTB95及VSTB112抗體(下)結合之人類VISTA區域。
圖29：與VSTB112結合之VISTA抗原決定基。(上)以草圖展示VISTA，並對股進行標記。將複合物中在VSTB112之5Å內的具有至少一個原子的殘基染成藍色。藍色及橙色球突出顯示鏈斷裂，且青色及綠色球分別標記VISTA結構之N端及C端。(下)結構確定中所用VISTA構築體之序列。如由PISA計算，序列下之圓圈用於指示僅使主鏈與VSTB112接觸之殘基，三角形指示側鏈接觸，且方形指示產生氫鍵或鹽橋相互作用之側鏈接觸。將形狀染色以指示具有最大數目之原子與既定殘基接觸的CDR，其中CDR顏色如圖59中所定義。次級結構要素如程式MOE所定義，其中黃色箭頭代表β股且紅色矩形指示α螺旋。
圖30：VSTB112互補位。(上)以說明方式展示VISTA抗原，且在VISTA之5埃(Å)內的VSTB112在表面中用顏色展示，用於標明以下序列中指定之CDR一致性。與CDR相鄰之接觸構架殘基類似於VSTB112Fv區之相應CDR(下)序列染色。彩色背景指定根據Kabat定義之CDR。如由PISA計算，序列下之圓圈用於指示僅使主鏈與VISTA接觸之殘基，三角形指示側鏈接觸，且方形指示產生氫鍵或鹽橋相互作用之側鏈接觸。
圖31：藉由結晶學及氫氘交換(HDX)鑑定之抗原決定基區域的比較。結構確定中所用VISTA構築體之序列。如由PISA計算，序列下之圓圈用於指示僅使主鏈與VSTB112接觸之殘基，三角形指示側鏈接觸，且方形指示產生氫鍵或鹽橋相互作用之側鏈接觸。
圖32：由VSTB174(衍生自VSTB112)活化全PBMC中之 CD14+單核球。在該實驗之各部分中，將細胞與PBS、IgG1對照抗體或VSTB174一起以1、0.1或0.01μg/ml培育。左圖展示CD80 MFI；右圖展示HLA-DR MFI(經測試而展示代表性結果之兩種供體)。
圖33：展示VSTB174針對K562-VISTA細胞之ADCC活性的曲線。
圖34：展示VSTB174針對K562-VISTA細胞之ADCP活性的曲線。所描繪之兩種抗體具有相同Fab，但VSTB174具有IgG1 Fc且VSTB140具有Fc沉默之IgG2。
圖35：展示由VSTB174、VSTB149或VSTB140 mAb針對K562-VISTA介導之吞噬作用的曲線。以在0.0008μg/ml至0.56μg/ml範圍內之7種半對數劑量測試各mAb。
圖36：展示由VSTB174、VSTB149或VSTB140 mAb針對骨髓瘤細胞系K562細胞介導之吞噬作用的曲線。以在0.0008μg/ml至0.56μg/ml範圍內之7種半對數劑量測試各mAb。
圖37：在雌性VISTA-KI小鼠中評估VSTB123 1、5、7.5及10mg/kg之MB49腫瘤功效研究。當在植入後第6天開始給藥時腫瘤體積為約50mm3。VSTB123為接枝於小鼠Fc骨架上之VSTB112 Fab且結合於VISTA-KI小鼠中之人類VISTA。
圖38：曲線展示在13/13肺癌樣品以及患者之遠端肺組織及外周血液中發現表現高/中等水平VISTA之CD14+細胞。
圖39：使用GG8對肺癌之VISTA進行IHC染色。
圖40：抗VISTA抗體經由CD16交聯觸發單核球活化。PD-L1 表現用作使用人類PBMC之骨髓活化的標記物。用作陽性對照之抗CD16誘導穩固之單核球活化；用作陰性對照之Fc阻斷劑(Fc IgG1片段之混合物)阻斷單核球活化。與人類IgG1對照相比，VSTB112而非VSTB140誘導單核球活化。
圖41：針對VSTB123或VSTB124對hVISTA KI(嵌入)小鼠中所確立MB49腫瘤之生長的影響，研究設計之示意圖。在研究第5、7、10、12、14、17、19、21、24及26天注射抗體。在第-2、-1、0、4、7、11、14、18、24、31及39天收集血液樣品。若在與抗體注射相同之天數時採取血液樣品，則首先採取血液樣品。
圖42A及42B：hVISTA KI雌性小鼠中之MB49腫瘤生長(圖42A)，及用VSTB123或VSTB124處理後hVISTA KI雌性小鼠中具有MB49腫瘤之小鼠之存活(圖42B)。在圖42A中，展示相較於小鼠IgG2a對照組，用VSTB123或VSTB124處理之雌性小鼠之平均腫瘤體積量測結果(mm3)。處理時間段為第5天-第26天。展示平均值+/-SEM。應注意y軸在曲線中不同。圖示雌性小鼠之資料直至第33天，其時>70%小鼠仍存活在各組(每組n=6或7)中。在圖42B中，圖示hVISTA KI雌性小鼠之存活百分比，VSTB123 10mg/kg，P=0.0108。處理時間段為第5天-第26天。
圖43：藉由用VSTB174處理之PBMC，41種細胞介素之表現的倍數變化。在指示濃度下用VSTB174或IgG1對照抗體處理來自三個健康人類供體之全PBMC，持續24小時。藉由41-細胞介素多重套組分析細胞介素產生。超過IgG1對照表現之平均倍數變化展示為使用對數色標之熱圖。星號指示處理樣品方法與對照樣品方法之間的顯著差異。* p<0.05，** p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。超出範圍(OOR)表示該供體中之該細胞介素之所有樣品超出精確檢測之界限(>高於，<低於)。
圖44A及44B：MB49腫瘤中之巨噬細胞活化。圖44A展示研究設計之示意圖。圖44B中指示使用VSTB123而非VSTB124的腫瘤微環境中增加之CD80+巨噬細胞。具有MB49腫瘤之hVISTA KI小鼠用VSTB123、VSTB124或對照mIgG2a處理，且其腫瘤在第三次劑量後24小時分析，以確定腫瘤浸潤性巨噬細胞上CD80之相對表現。各組含有5隻小鼠。水平條柱指示方法。*p<0.05。
圖45：MPO+細胞至腫瘤微環境之遷移。
圖46：VSTB174誘導嗜中性白血球之短暫減少。
圖47：抗VISTA抗體(例如VSTB174)提出的作用機制。
本發明之例示性具體實例之描述如下。
本發明係關於命名為T細胞活化之V域免疫球蛋白抑制因子(VISTA)之新穎免疫球蛋白家族配位體(Genbank：JN602184)之抗體(Wang等人，2010,2011)。VISTA與PD-L1具有同源性，但展示限於造血隔室之獨特表現模式。特定言之，VISTA為組成性的且高度表現於CD11b高骨髓細胞上，且以較低水平表現於CD4+及CD8+ T細胞上。人類同源物與鼠VISTA共有約85%同源性且具有類似表現模式(Lines等人，Cancer Research 74：1924,2014)。表現於抗原呈遞細胞(APC)上之VISTA經由同源受體獨立於PD-1地抑制CD4+及CD8+T細胞增殖及細胞介素產生。在被動EAE(實驗性自體免疫性腦脊髓炎)疾病模型中，VISTA特異性單株抗體提高T細 胞依賴性免疫反應且使疾病加劇。腫瘤細胞上之VISTA過度表現削弱了具有腫瘤之宿主的保護性抗腫瘤免疫性。人類VISTA之研究確認其對人類T細胞之抑制功能(Lines等人，Cancer Research 74：1924,2014)。來自Flies等人之研究亦將VISTA(稱為PD-1H)鑑定為有效免疫抑制分子(Flies等人，2011)。VISTA進一步詳細描述於美國公開申請案US 20130177557 A1及美國專利第7,919,585號及第8,236,304號中，以上者之全文均以引用的方式併入本文中。
VISTA為抑制免疫反應之新穎負免疫調節因子。如例如本文實施例12中所述，在鼠腫瘤模型中用VISTA特異性單株抗體處理已展示逆轉腫瘤免疫微環境之抑制特徵且提高保護性抗腫瘤免疫性，因此展現VISTA單株抗體作為癌症免疫療法之新穎治療劑的潛力。
本發明之抗體及片段
術語「抗體(antibody)」意欲包括多株抗體、單株抗體(mAb)、嵌合抗體、人類化抗體、人類抗體及抗個體基因型(anti-Id)抗體以及由任何已知技術(諸如(但不限於)酶學裂解、肽合成或重組技術)提供的其片段、區域或衍生物。本發明之抗VISTA抗體能夠結合VISTA之調節、調控或提高免疫反應之部分。在一些具體實例中，該等抗體競爭性抑制本文所述之抗VISTA抗體中之一或多者。判定兩種或多於兩種抗體是否競爭結合於同一目標的方法為此項技術中已知。舉例而言，可使用競爭性結合分析判定一種抗體是否阻斷另一抗體與目標之結合。典型地，競爭性結合分析涉及使用結合於固體基板或細胞之經純化目標抗原(例如PD-1)、未標記之測試結合分子及經標記之參考結合分子。競爭性抑制藉由測定在測試結合分子存在下結合於固體表面或細胞之標記物的量來量測。通常測試結合分子過量存在。典型地，當競爭性結合分子過量存在時，其將使參考結合分子與共同抗原之特異性結合抑制至少50-55%、55-60%、60-65%、65-70%、70-75%或更大。在一些具體實例中，競爭性抑制使用競爭性抑制ELISA分析測定。
多株抗體為衍生自用抗原免疫之動物之血清的抗體分子的異質群體。單株抗體含有對抗原具特異性之抗體的實質上均質群體，該群體含有實質上類似抗原決定基結合位點。單株抗體可藉由熟習此項技術者已知之方法獲得。參見例如Kohler及Milstein,Nature,256：495-497(1975)；美國專利第4,376,110號；Ausubel等人編，Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience,N.Y.,(1987,1992)；及Harlow及Lane ANTIBODIES：A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory(1988)；Colligan等人編，Current Protocols in Immunology,Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience,N.Y.,(1992,1993)，其中所有者之內容以全文引用的方式併入本文中。此類抗體可具有任何免疫球蛋白類別，包括IgG、IgM、IgE、IgA、GILD及其任何子類。產生本發明單株抗體之融合瘤可在試管內、當場或活體內培養。
本發明亦涵蓋消化片段、其指定部分及變體，包括抗體模擬物或包含模擬抗體或其指定片段或部分之結構及/或功能的抗體部分，包括單鏈抗體及其片段。功能性片段包括結合於哺乳動物VISTA蛋白之抗原結合片段。舉例而言，本發明涵蓋能夠結合於VISTA之抗體片段或其部分，包括(但不限於)Fab(例如藉由木瓜蛋白酶消化)、Fab'(例如藉由胃蛋白 酶消化及部分還原)及F(ab')2(例如藉由胃蛋白酶消化)、facb(例如藉由纖維蛋白溶酶消化)、pFc'(例如藉由胃蛋白酶或纖維蛋白溶酶消化)、Fd(例如藉由胃蛋白酶消化、部分還原及再凝集)、Fv或scFv(例如藉由分子生物學技術)片段(參見例如以上Colligan,Immunology)。本發明之抗體片段亦包括Aaron L.Nelson,mAbs 2：1,77-83(2010年1月/2月)中所述之抗體片段，其內容以全文引用的方式併入。
此類片段可例如藉由如此項技術中已知及/或如本文所述之酶學裂解、合成或重組技術製備。抗體亦可使用一或多個終止密碼子已引入天然終止位點之上游的抗體基因以多種截短形式製備。舉例而言，編碼F(ab')2重鏈部分之組合基因可經設計以包括編碼重鏈之CH1域及/或鉸鏈區的DNA序列。抗體之各種部分可藉由習知技術以化學方式接合在一起，或可使用遺傳工程改造技術製備成鄰接蛋白質。
在一個具體實例中，免疫球蛋白鏈或其部分(例如可變區，CDR)之胺基酸序列與本文所述之相對應可變序列鏈之胺基酸序列具有約70-100%一致性(例如70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或其中任何範圍或值)。較佳地，使用如此項技術中已知之適合電腦算法測定70-100%胺基酸一致性(例如85、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或其中任何範圍或值)。
本文提供重鏈及輕鏈可變區序列之實例。
本發明之抗體或其指定變體可包含來自本發明抗體之任何數目之鄰接胺基酸殘基，其中該數目係選自由抗TNF抗體中鄰接殘基數之 10-100%組成之整數之群。視情況，此鄰接胺基酸之子序列的長度為至少約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250個或更多胺基酸或其中任何範圍或值。此外，此類子序列之數目可為選自由1至20組成之群的任何整數，諸如至少2、3、4或5。
熟習此項技術者應瞭解，本發明包括本發明之至少一種生物學活性抗體。生物學活性抗體之比活性為天然(非合成)、內源性或相關及已知抗體之至少20%、30%或40%，且較佳至少50%、60%或70%，且最佳至少80%、90%或95%-100%。分析及量化酶活性及受質特異性之量測值的方法為熟習此項技術者所熟知。
實質上類似指化合物與天然(非合成)、內源性或相關及已知抗體具有至少85%(例如至少95%)一致性，且具有其活性之至少85%(例如至少95%)。
如本文所用，術語「人類抗體(human antibody)」指如下抗體，其中實質上蛋白質之各部分(例如CDR、構架、CL、CH域(例如CH1、CH2、CH3)、鉸鏈(VL、VH))在人類中實質上具有非免疫原性，其中僅少量序列改變或變化。類似地，指定為靈長類(猴、狒狒、黑猩猩及其類似物)、嚙齒動物(小鼠、大鼠及其類似物)及其他哺乳動物之抗體指此類物種、次屬、屬、次科、科特異性抗體。此外，嵌合抗體可包括以上之任何組合。此類改變或變化視情況且較佳相對於未修飾抗體保留或降低在人類或其他物種中之免疫原性。因此，人類抗體不同於嵌合或人類化抗體。據指出，人類抗體可由能夠功能上表現重排人類免疫球蛋白(例如重鏈及/ 或輕鏈)基因的非人類動物或原核或真核細胞製備。此外，當人類抗體為單鏈抗體時，其可包含天然人類抗體中不存在之連接肽。舉例而言，Fv可包含連接肽，諸如二至約八個甘胺酸或其他胺基酸殘基，其連接重鏈之可變區及輕鏈之可變區。認為此類連接肽具有人類來源。
亦可使用雙特異性、異特異性、異結合或類似抗體，其為對至少兩種不同抗原具有結合特異性的單株、較佳人類或人類化抗體。在本發明情形下，結合特異性中之一者針對至少一種VISTA蛋白，另一者針對任何其他抗原。用於製備雙特異性抗體之方法為此項技術中已知。雙特異性抗體之重組型製備可基於兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對之共表現，其中兩個重鏈具有不同特異性(Milstein and Cuello,Nature 305：537(1983))。亦參見WO 93/08829；美國專利第6,210,668號、第6,193,967號、第6,132,992號、第6,106,833號、第6,060,285號、第6,037,453號、第6,010,902號、第5,989,530號、第5,959,084號、第5,959,083號、第5,932,448號、第5,833,985號、第5,821,333號、第5,807,706號、第5,643,759號、第5,601,819號、第5,582,996號、第5,496,549號、第4,676,980、WO 91/00360、WO 92/00373、EP 03089；Traunecker等人，EMBO J.10：3655(1991)；Suresh等人，Methods in Enzymology 121：210(1986)，以上者各自以全文引用的方式併入本文中。
在一個具體實例中，本發明係關於一種以VISTA及第二目標蛋白(例如免疫檢查點蛋白)為目標的雙特異性抗體。例示性雙特異性抗體包括以VISTA及PD-L1為目標的雙特異性抗體及以VISTA及PD-L2為目標的雙特異性抗體。
特異於人類VISTA蛋白之人類抗體或其片段可針對適當免 疫原性抗原(諸如VISTA蛋白或其部分(包括合成分子，諸如合成肽))來培養。
可類似地培養其他特異性或通用哺乳動物抗體。免疫原性抗原製備及單株抗體製備可使用任何適合技術進行。
舉例而言，融合瘤藉由融合適合永生細胞系(例如骨髓瘤細胞系，諸如(但不限於)Sp2/0、Sp2/0-AG14、NSO、NS1、NS2、AE-1、L.5、>243、P3X63Ag8.653、Sp2 SA3、Sp2 MAI、Sp2 SS1、Sp2 SA5、U937、MLA 144、ACT IV、MOLT4、DA-1、JURKAT、WEHI、K-562、COS、RAJI、NIH 3T3、HL-60、MLA 144、NAMAIWA、NEURO 2A或其類似物，或雜合骨髓瘤、其融合產物或自其衍生之任何細胞或融合細胞，或如此項技術中已知之任何其他適合細胞系，參見例如www.atcc.org)與抗體產生細胞來製備。抗體產生細胞可包括經分離或選殖之脾、外周血液、淋巴、扁桃體或其他免疫細胞(例如B細胞)或表現重鏈或輕鏈恆定或可變或構架或互補決定區(CDR)序列的任何其他細胞。此類抗體產生細胞可為重組型或內源性細胞，且亦可為原核或真核細胞(例如哺乳動物，諸如嚙齒動物、馬、綿羊、山羊、羊、靈長類)。參見例如以上Ausubel及以上Colligan,Immunology,第2章，以上者以全文引用的方式併入本文中。
抗體產生細胞亦可獲自已用相關抗原免疫之人類或其他適合動物之外周血液或脾或淋巴結。任何其他適合宿主細胞亦可用於表現編碼本發明之抗體、其指定片段或變體之異質或內源性核酸。融合細胞(融合瘤)或重組細胞可使用選擇性培養條件或其他適合已知方法分離，且藉由限制稀釋法或細胞分選或其他已知方法選殖。產生具有所期望特異性之 抗體的細胞可藉由適合分析(例如酶聯免疫吸附分析(ELISA))選擇。
如此項技術中已知及/或如本文所述，可使用製備或分離具有必需特異性之抗體的其他適合方法，包括(但不限於)自肽或蛋白質文庫(例如(但不限於)噬菌體、核糖體、寡核苷酸、RNA、cDNA或其類似物、呈現文庫；例如購自Cambridge antibody Technologies,Cambridgeshire,UK；MorphoSys,Martinsreid/Planegg,DE；Bioyation,Aberdeen,Scotland,UK；Bioinvent,Lund,Sweden；Dyax Corp.,Enzon,Affymax/Biosite；Xoma,Berkeley,Calif.；Ixsys。參見例如PCT/GB91/01134；PCT/GB92/01755；PCT/GB92/002240；PCT/GB92/00883；PCT/GB93/00605；PCT/GB94/01422；PCT/GB94/02662；PCT/GB97/01835；WO90/14443；WO90/14424；WO90/14430；PCT/U594/1234；WO92/18619；WO96/07754；EP 614 989；WO95/16027；WO88/06630；WO90/3809；美國專利第4,704,692號；PCT/US91/02989；WO89/06283；EP 371 998；EP 550 400；EP 229 046；PCT/US91/07149；或隨機產生之肽或蛋白質--美國專利第5,723,323號；第5,763,192號；第5,814,476號；第5,817,483號；第5,824,514號；第5,976,862號；WO 86/05803、EP 590 689，以上者各自以全文引用的方式併入本文中)選擇重組抗體或依賴於使能夠產生人類抗體之譜系的基因轉殖動物(例如SCID小鼠，Nguyen等人，Microbiol.Immunol.41：901-907(1997)；Sandhu等人，Crit.Rev.Biotechnol.16：95-118(1996)；Eren等人，Immunol.93：154-161(1998)，其以及相關專利及申請案各自以全文引用的方式併入本文中)免疫的方法。此類技術包括(但不限於)核糖體呈現(Hanes等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94：4937-4942(1997年5月)；Hanes等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95：14130-14135(1998年11月))；單細胞抗體 製備技術(美國專利第5,627,052號，Wen等人，J.Immunol.17：887-892(1987)；Babcook等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：7843-7848(1996))；凝膠微滴及流式細胞測量術(Powell等人，Biotechnol.8：333-337(1990)；One Cell Systems,Cambridge,Mass.；Gray等人，J.Imm.Meth.182：155-163(1995)；Kenny等人，Bio/Technol.13：787-790(1995))；B細胞選擇(Steenbakkers等人，Molec.Biol.Reports 19：125-134(1994)；Jonak等人，Progress Biotech，第5卷，In Vitro Immunization in Hybridoma Technology,Borrebaeck編，Elsevier Science Publishers B.V.,Amsterdam,Netherlands(1988))。
亦可使用工程改造或人類化非人類或人類抗體之方法且為此項技術中所熟知。一般而言，人類化或工程改造抗體具有一或多個來自非人類來源(例如(但不限於)小鼠、大鼠、兔、非人類之靈長類或其他哺乳動物)的胺基酸殘基。此等人類胺基酸殘基通常稱為「導入(import)」殘基，其典型地取自已知人類序列之「導入」可變、恆定或其他域。揭示了已知人類Ig序列，例如www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi；www.atcc.org/phage/hdb.html，以上者各自以全文引用的方式併入本文中。
如此項技術中已知，此類導入序列可用於降低免疫原性或降低、提高或改變結合、親和力、親合力、特異性、半衰期或任何其他適合特徵。一般而言，維持部分或所有非人類或人類CDR序列，而用人類或其他胺基酸置換部分或所有構架及/或恆定區之非人類序列。亦可視情況使用熟習此項技術者已知之三維免疫球蛋白模型將抗體人類化，而保持對抗原之高親和力及其他有利生物特性。可利用說明且呈現所選候選免疫球蛋白序列之可能三維構形結構的電腦程式。檢測此等呈現使得可分析殘基在候 選免疫球蛋白序列的功能中的可能性作用，亦即分析影響候選免疫球蛋白結合其抗原的能力的殘基。以此方式，可自共同及導入序列選擇構架(FR)殘基且組合以使得達成所期望之抗體特徵(諸如對目標抗原之親和力增加)。一般而言，CDR殘基直接且最實質上參與影響抗原結合。人類化或工程改造本發明之抗體可使用任何已知方法進行，諸如(但不限於)以下文獻中所述之方法，例如Winter(Jones等人，Nature 321：522(1986)；Riechmann等人，Nature 332：323(1988)；Verhoeyen等人，Science 239：1534(1988))；Sims等人，J.Immunol.151：2296(1993)；Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.196：901(1987)；Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：4285(1992)；Presta等人，J.Immunol.151：2623(1993)；美國專利第5,723,323號、第5,976862號、第5,824514號、第5,817483號、第5,814476號、第5,763,192號、第5,723,323號、第5,766,886號、第5,714,352號、第6,204,023號、第6,180,370號、第5,693,762號、第5,530,101號、第5,585,089號、第5,225,539號；第4,816,567號，以上者各自以全文引用的方式併入本文中，包括其中所引用之參考文獻。
如本文所述及/或如此項技術中已知，抗VISTA抗體亦可視情況藉由使能夠產生人類抗體之譜系的基因轉殖動物(例如小鼠、大鼠、兔、倉鼠、非人類之靈長類及其類似物)免疫來產生。產生人類抗VISTA抗體之細胞可自此類動物分離且使用適合方法(諸如本文所述之方法)不朽化。
可產生結合於人類抗原之人類抗體之譜系的基因轉殖動物可藉由已知方法製備(例如(但不限於)頒予Lonberg等人之美國專利第5,770,428號、第5,569,825號、第5,545,806號、第5,625,126號、第5,625,825 號、第5,633,425號、第5,661,016號及第5,789,650號；Jakobovits等人WO 98/50433、Jakobovits等人WO 98/24893、Lonberg等人WO 98/24884、Lonberg等人WO 97/13852、Lonberg等人WO 94/25585、Kucherlapate等人WO 96/34096、Kucherlapate等人EP 0463 151 B1、Kucherlapate等人EP 0710 719 A1、Surani等人美國專利第5,545,807號、Bruggemann等人WO 90/04036、Bruggemann等人EP 0438 474 B1、Lonberg等人EP 0814 259 A2、Lonberg等人GB 2 272 440 A、Lonberg等人Nature 368：856-859(1994)、Taylor等人，Int.Immunol.6(4)579-591(1994)、Green等人，Nature Genetics 7：13-21(1994)、Mendez等人，Nature Genetics 15：146-156(1997)、Taylor等人，Nucleic Acids Research 20(23)：6287-6295(1992)、Tuaillon等人，Proc Natl Acad Sci USA 90(8)3720-3724(1993)、Lonberg等人，Int Rev Immunol 13(1)：65-93(1995)及Fishwald等人，Nat Biotechnol 14(7)：845-851(1996)，以上者各自以全文引用的方式併入本文中)。一般而言，此等小鼠包含至少一種包含來自至少一種人類免疫球蛋白基因座之DNA的轉殖基因，其在功能上重排或可進行功能性重排。此類小鼠中內源性免疫球蛋白基因座可經破壞或缺失以去除動物產生由內源性基因編碼之抗體的能力。
篩選特異性結合於類似蛋白質之抗體或片段可使用肽呈現文庫便利地達成。此方法涉及針對具有所期望功能或結構之個別成員篩選大量肽。肽呈現文庫之抗體篩選為此項技術中所熟知。所呈現之肽序列的長度可為3至5000個或更多個胺基酸，通常為5-100個胺基酸長，且通常為約8至25個胺基酸長。除用於產生肽文庫之直接化學合成方法以外，已描述數種重組DNA方法。一種類型涉及在噬菌體或細胞之表面上呈現肽序 列。各噬菌體或細胞含有編碼所呈現之特定肽序列的核苷酸序列。此類方法描述於PCT專利公開案第91/17271號、第91/18980號、第91/19818號及第93/08278號中。用於產生肽之文庫的其他系統具有試管內化學合成與重組方法的態樣。參見PCT專利公開案第92/05258號、第92/14843號及第96/19256號。亦參見美國專利第5,658,754號；及第5,643,768號。肽呈現文庫、載體及篩選套組可購自諸如Invitrogen(Carlsbad,Calif.)及Cambridge antibody Technologies(Cambridgeshire,UK)之供應商。參見例如頒予Dyax之美國專利第4,704,692號、第4,939,666號、第4,946,778號、第5,260,203號、第5,455,030號、第5,518,889號、第5,534,621號、第5,656,730號、第5,763,733號、第5,767,260號、第5,856,456號；第5,223,409號、第5,403,484號、第5,571,698號、第5,837,500號，頒予Cambridge antibody Technologies之第5,427,908號、第5,580,717號；第5,885,793號；頒予Genentech之第5,750,373號，第5,618,920號、第5,595,898號、第5,576,195號、第5,698,435號、第5,693,493號及第5,698,417號。
本發明之抗體亦可使用至少一種編碼抗VISTA抗體之核酸製備，得到基因轉殖動物(諸如山羊、母牛、羊及其類似物)，其在乳汁中產生此類抗體。可使用已知方法提供此類動物。參見例如(但不限於)美國專利第5,827,690號；第5,849,992號；第4,873,316號；第5,849,992號；第5,994,616號；第5,565,362號；第5,304,489號及其類似專利，以上者各自以全文引用的方式併入本文中。
本發明之抗VISTA抗體亦可根據已知方法使用基因轉殖植物製備。亦參見例如Fischer等人，Biotechnol.Appl.Biochem.30：99-108(1999 年10月)、Cramer等人，Curr.Top.Microbol.Immunol.240：95-118(1999)及其中所引用之參考文獻；Ma等人，Trends Biotechnol.13：522-7(1995)；Ma等人，Plant Physiol.109：341-6(1995)；Whitelam等人，Biochem.Soc.Trans.22：940-944(1994)；及其中所引用之參考文獻。以上參考文獻各自以全文引用的方式併入本文中。
本發明之抗體可以大範圍之親和力(KD)結合人類VISTA。在一較佳具體實例中，本發明之至少一種人類單株抗體可視情況以高親和力結合人類VISTA。舉例而言，人類單株抗體可以等於或低於約10-7M之KD(諸如(但不限於)0.1-9.9(或其中任何範圍或值)×10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12、10-13或其中任何範圍或值)結合人類VISTA。在一些具體實例中，抗體或抗體片段可以1×10-7公升/莫耳(例如至少1×10-8公升/莫耳，例如至少1×10-9公升/莫耳)之親和力結合人類VISTA。
抗體對抗原之親和力或親合力可使用任何適合方法進行實驗測定。(參見例如Berzofsky等人，「Antibody-Antigen Interactions,」Fundamental Immunology,Paul,W.E.編，Raven Press：New York,N.Y.(1984)；Kuby,Janis Immunology,W.H.Freeman and Company：New York,N.Y.(1992)；及本文所述之方法)。若在不同條件(例如鹽濃度、pH)下量測，則所量測之特定抗體-抗原相互作用之親和力可變化。因此，量測親和力及其他抗原結合參數(KD、Ka、Kd)較佳用抗體及抗原之標準化溶液及標準化緩衝液進行。
核酸分子
使用本文所提供之資訊，諸如編碼指定片段、其變體或共同序列中之至少一者的鄰接胺基酸的至少70-100%的核苷酸序列，或包含此等 序列中之至少一者的所寄存載體，可使用本文所述或此項技術中已知之方法獲得編碼至少一種抗VISTA抗體之本發明核酸分子，該抗VISTA抗體包含SEQ ID NO：1、2及3之重鏈可變CDR區之全部及/或SEQ ID NO：4、5及6之輕鏈可變CDR區之全部。
本發明之核酸分子可為藉由選殖或以合成方法製備而獲得的RNA(諸如mRNA、hnRNA、tRNA或任何其他形式)形式或DNA(包括(但不限於)cDNA及基因組DNA)形式。DNA可為三股、雙股或單股或其任何組合。DNA或RNA之至少一個股的任何部分可為編碼股，亦稱為有義股，或其可為非編碼股，亦稱為反義股。
本發明之經分離核酸分子可包括包含開放閱讀框架(ORF)之核酸分子，開放閱讀框架例如(但不限於)至少一種CDR之至少一個指定部分，如至少一個重鏈或輕鏈之CDR1、CDR2及/或CDR3；包含抗VISTA抗體或片段(例如包含可變區之片段)之編碼序列的核酸分子；及包含不同於上述之核苷酸序列但由於遺傳密碼之簡并性仍編碼至少一種如本文所述及/或此項技術中已知之抗VISTA抗體的核酸分子。熟習此項技術者產生編碼本發明之特定抗VISTA抗體的此類簡并核酸變體為常規的。參見例如以上Ausubel等人，且此類核酸變體包括於本發明中。
如本文所指示，包含編碼抗VISTA抗體之核酸的本發明核酸分子可包括(但不限於)編碼抗體片段之胺基酸序列之核酸分子；全部抗體或其部分之編碼序列；抗體、片段或部分之編碼序列以及其他序列，諸如在存在或不存在上述其他編碼序列下至少一種信號前導序列或融合肽之編碼序列，諸如至少一種內含子，以及其他非編碼序列，包括(但不限 於)非編碼5'及3'序列，諸如在轉錄、mRNA加工(包括拼接)及聚腺苷酸化信號(例如--mRNA之核糖體結合及穩定性)中起作用之經轉錄未轉譯序列；編碼其他胺基酸之其他編碼序列，諸如提供其他功能之編碼序列。因此，編碼抗體之序列可與標記序列(諸如編碼有助於純化包含抗體片段或部分之融合抗體的肽的序列)融合。
編碼本發明之抗體、片段及區域之恆定(C)區的人類基因可藉由已知方法衍生自人類胎兒肝臟文庫。人類C區基因可衍生自任何人類細胞，包括表現且產生人類免疫球蛋白之人類細胞。人類CH區可衍生自人類H鏈之任何已知類別或同型，包括γ、μ、α、δ或ε且其次型，諸如G1、G2、G3及G4。因為H鏈同型負責抗體之各種效應功能，故CH區之選擇將由所期望的效應功能(諸如補體固定)或抗體依賴性細胞毒性(ADCC)中之活性引導。
組成物
本文所揭示之醫藥組成物根據標準程序製備且以經選擇以治療(例如減輕、預防或去除所治療病狀或減緩或中斷其進展)的劑量投予(參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,PA及Goodman and Gilman's The Pharmaceutical Basis of Therapeutics,McGraw-Hill,New York,N.Y.，以上者之內容以引用的方式併入本文中，以用於投予各種藥劑進行人類治療之方法的一般描述)。包含所揭示之抗體及藥劑的組成物可使用控制或持續釋放遞送系統(例如膠囊、可生物降解基質)遞送。適用於投予所揭示化合物的組成物之用於藥物遞送之延緩釋放遞送系統的實例描述於例如美國專利第US 5,990,092號；第5,039,660號；第 4,452,775號；第3,854,480號中，以上者之全部教示內容以引用的方式併入本文中。
為了自本發明之抗VISTA抗體及/或片段製備醫藥組成物，醫藥學上可接受之載劑可為固體或液體。固體形式製劑包括散劑、錠劑、丸劑、膠囊、扁囊劑、栓劑及分散性顆粒。舉例而言，本發明化合物可為粉末形式以用於在遞送時復原。固體載劑可為一或多種物質，其亦可充當稀釋劑、調味劑、增溶劑、潤滑劑、懸浮劑、黏合劑、防腐劑、錠劑崩解劑或囊封材料。在呈散劑形式時，載劑為細粉狀固體，其與細粉狀活性成分形成混合物。
散劑及錠劑較佳含有約1至約70%活性成分。適合載劑為碳酸鎂、硬脂酸鎂、滑石、糖、乳糖、果膠、糊精、澱粉、明膠、黃蓍、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、低熔點蠟、可可油及其類似物。錠劑、散劑、扁膠劑、口含錠、速熔條(fast-melt strip)、膠囊及丸劑可用作適用於經口投予的含有活性成分的固體劑型。
液體形式製劑包括溶液、懸浮液、保留灌腸劑及乳液，例如水或丙二醇水溶液。為進行非經腸注射，液體製劑可在聚乙二醇水溶液中調配。
醫藥組成物可呈單位劑型。在此類形式中，組成物再分為含有適量活性成分之單位劑量。單位劑型可為封裝製劑，該封裝含有個別量之單位劑量。劑量可視患者之要求、所治療病狀之嚴重性、所用化合物及投藥途徑而變化。測定針對特定情況之適當劑量在此項技術之技能範圍內。
此外，必要時，醫藥組成物可含有其他相容藥劑，例如藥物、 治療劑或預防劑。治療劑或預防劑包括(但不限於)肽、多肽、蛋白質、融合蛋白、核酸分子、小分子、模擬劑、合成藥物、無機分子及有機分子。此類藥劑(例如抗癌劑)之類別的實例包括(但不限於)細胞毒素、血管生成抑制劑、免疫調節劑、腫瘤免疫劑及用於緩解疼痛或抵消一或多種治療劑之有害作用的藥劑(例如使用降低糖皮質激素之高血鈣作用的雙膦酸鹽)。
適用於本文所述之組成物及方法的血管生成抑制劑、藥劑及療法包括(但不限於)血管生長抑素(纖維蛋白溶酶原片段)；抗血管生成抗凝血酶III；安吉酶(angiozyme)。雙膦酸鹽包括(但不限於)阿侖膦酸鹽(alendronate)、氯屈膦酸鹽(clodronate)、依替膦酸鹽(etidronate)、伊班膦酸鹽(ibandronate)、帕米膦酸鹽(pamidronate)、利塞膦酸鹽(risedronate)、替魯膦酸鹽(tiludronate)及唑來膦酸鹽(zoledronate)。
適用於本文所述之組成物及方法的免疫調節劑及療法包括(但不限於)抗T細胞受體抗體，諸如抗CD3抗體(例如諾維(Nuvion)(Protein Design實驗室)、OKT3(Johnson & Johnson)或抗CD20抗體美羅華(Rituxan)(IDEC))、抗CD52抗體(例如坎帕斯1H(CAMPATH 1H)(Ilex))、抗CD11a抗體(例如西利姆(Xanelim)(Genentech))；抗細胞介素或抗細胞介素受體抗體及拮抗劑，諸如抗IL-2受體抗體(賽尼哌(Zenapax)(Protein Design實驗室))、抗IL-6受體抗體(例如MRA(Chugai))及抗IL-12抗體(CNTO1275(Janssen))、抗TNF α抗體(雷米卡德(Remicade)(Janssen))或TNF受體拮抗劑(恩博(Enbrel)(Immunex))、抗IL-6抗體(BE8(Diaclone))及思圖昔單抗(siltuximab)(CNTO32(Centocor))及免疫特異性結合於腫 瘤相關抗原之抗體(例如曲妥珠單抗(trastuzimab)(Genentech))。
適用於本文所述之組成物及方法的腫瘤免疫劑包括(但不限於)伊派利單抗(ipilimumab)(抗CTLA-4)、尼沃單抗(nivolumab)(抗-PD-1)、派立珠單抗(pembrolizumab)(抗-PD-1)、抗PD-L1抗體及抗LAG-3抗體。
組成物較佳以含有治療有效量之抗體或片段的劑量單位形式製備。劑量單位之實例為錠劑及膠囊。出於治療目的，除活性成分之外，錠劑和膠囊可含有習知載劑，諸如結合劑，例如阿拉伯樹膠、明膠、聚乙烯吡咯啶酮、山梨糖醇或黃蓍；填充劑，例如磷酸鈣、甘胺酸、乳糖、玉米澱粉、山梨糖醇或蔗糖；潤滑劑，例如硬脂酸鎂、聚乙二醇、二氧化矽或滑石；崩解劑，例如馬鈴薯澱粉；調味劑或著色劑；或可接受之濕潤劑。通常呈水溶液或油溶液、懸浮液、乳液、糖漿或酏劑形式的口服液體製劑可含有習知添加劑，諸如懸浮劑、乳化劑、非水性劑、防腐劑、著色劑及調味劑。液體製劑之添加劑的實例包括阿拉伯膠、杏仁油、乙醇、經部分分離之椰子油、明膠、葡萄糖漿、甘油、氫化食用脂肪、卵磷脂、甲基纖維素、對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯、丙二醇、山梨糖醇或山梨酸。
關於製備及使用本文所述之化合物及組成物的方法的其他一般細節為此項技術中熟知。參見例如美國專利第7,820,169號，其全部內容併入本文中。
治療方法
熟習此項技術者(例如臨床醫師)可考慮所選藥劑、醫藥調配物及投藥途徑、各種患者因素及其他考慮因素來確定投予特定抗體、片 段或組成物之適合劑量及途徑以向個體投予。劑量較佳不會引起或產生最少不良副作用或不產生不良副作用。在標準多重給藥方案中，藥理學藥劑可以經設計以在進行治療之個體中維持預定或最佳血漿濃度的劑量時程投予。抗體、片段及組成物可以任何適當劑量範圍或治療有效量添加，例如0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg、1.0mg/kg、1.5mg/kg、2.0mg/kg、2.5mg/kg、3.0mg/kg、4.0mg/kg、5.0mg/kg、6.0mg/kg、7.0mg/kg、8.0mg/kg、9.0mg/kg、10.0mg/kg、11.0mg/kg、12.0mg/kg、13.0mg/kg、14.0mg/kg、15.0mg/kg、16.0mg/kg、17.0mg/kg、18.0mg/kg、19.0mg/kg、20.0mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、50mg/kg60mg/kg、70mg/kg、80mg/kg、90mg/kg及100mg/kg。在一個具體實例中，所投予組成物、抗體或片段之劑量為每次投予0.1-15mg/kg。
抗體或片段可每天投予一次、至少一次、兩次、至少兩次、三次或至少三次。抗體或片段可每週投予一次、至少一次、兩次、至少兩次、三次、至少三次、四次、至少四次、五次、至少五次、六次或至少六次。抗體或片段可每個月投予一次、每個月至少一次、每個月兩次、每個月至少兩次、每個月三次或每個月至少三次。抗體或抗體片段可每年投予一次、每年至少一次、每年兩次、每年至少兩次、每年三次、每年至少三次、每年四次、每年至少四次、每年五次、每年至少五次、每年六次或每年至少六次。
抗VISTA抗體、片段及組成物可例如經由非經腸或經腸方法投予，包括(但不限於)靜脈內、皮下、經口、經直腸、肌肉內、腹膜內、經黏膜、經皮、鞘內、經鼻或表面投予。一般技術者應認識到以下劑 型可包含化合物或本發明化合物之相對應醫藥學上可接受之鹽作為活性成分。在一些具體實例中，劑型可包含化合物或化合物之相對應醫藥學上可接受之鹽作為活性成分。
本發明之抗VISTA抗體可作為組合療法之一部分投予(例如彼此一起投予或與一或多種其他治療劑一起投予)。本發明化合物可在一種或多種其他治療劑之前、之後投予或與其同步投予。在一些具體實例中，本發明化合物及其他治療劑可以各別調配物或結合調配物形式同時(例如同步)共投予。或者，藥劑可以各別組成物形式在如熟練臨床醫師確定之適當時間範圍(例如足以使療法之藥物作用重疊的時間)內依序投予。本發明化合物及一或多種其他治療劑可以單次劑量或多次劑量以適合於達成所期望治療作用之順序及時程投予。
本發明亦提供一種調節或治療細胞、組織、器官、動物或患者之至少一種惡性疾病的方法。在一些具體實例中，本發明之化合物及組成物用於治療或預防癌症。癌症可包括任何器官或身體系統之任何惡性或良性腫瘤。實例包括(但不限於)以下：乳癌、消化道癌/腸胃癌、內分泌癌、神經內分泌癌、眼癌、泌尿生殖癌、生殖細胞癌、婦科癌、頭頸癌、血液癌/血癌、肌肉骨胳癌、神經癌、呼吸道癌/胸癌、膀胱癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、子宮內膜癌、腎臟癌、胰臟癌、肝癌、胃癌、睾丸癌、食道癌、前列腺癌、腦癌、子宮頸癌、卵巢癌及甲狀腺癌。其他癌症可包括白血病、黑色素瘤及淋巴瘤及本文所述之任何癌症。在一些具體實例中，實體腫瘤浸潤骨髓及/或T細胞。在一些具體實例中，癌症為白血病、淋巴瘤、骨髓發育不良症候群及/或骨髓瘤。在一些具體實例中，癌症可為任何種類 或類型之白血病，包括淋巴細胞性白血病或骨髓性白血病，諸如急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、急性骨髓(骨髓性)白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、毛細胞白血病、T細胞前淋巴細胞性白血病、大顆粒淋巴細胞性白血病或成人T細胞白血病。在一些具體實例中，淋巴瘤為組織細胞性淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤或霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)，且在一些具體實例中，癌症為多發性骨髓瘤。在一些具體實例中，癌症為實體腫瘤，例如黑色素瘤或膀胱癌。在一特定具體實例中，癌症為肺癌，例如非小細胞肺癌(NSCLC)。
本發明亦提供一種調節或治療細胞、組織、器官、動物或患者之至少一種惡性疾病的方法，包括(但不限於)以下中之至少一者：白血病、急性白血病、急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、B細胞、T細胞或FAB ALL、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓細胞性白血病(CML)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、毛細胞白血病、骨髓發育不良症候群(MDS)、淋巴瘤、霍奇金氏病(Hodgkin's disease)、惡性淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(non-hodgkin's lymphoma)、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、多發性骨髓瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、結腸直腸癌、胰腺癌、鼻咽癌、惡性組織細胞增多病、副腫瘤症候群/惡性血鈣過多、實體腫瘤、腺癌、肉瘤、惡性黑色素瘤、血管瘤、轉移性疾病、癌症相關之骨骼再吸收、癌症相關之骨痛及其類似疾病。在一些具體實例中，實體腫瘤浸潤骨髓及/或T細胞。在一特定具體實例中，實體腫瘤為肺癌，諸如非小細胞肺癌(NSCLC)。
在一些具體實例中，本文所述之化合物及療法與疫苗(諸如 病毒載體疫苗、細菌疫苗、基於細胞之疫苗、DNA疫苗、RNA疫苗、肽疫苗或蛋白質疫苗)一起共投予。此類疫苗為此項技術中所熟知。參見例如Jeffrey Schlom,「Therapeutic Cancer Vaccines：Current Status and Moving Forward,」J Natl Cancer Inst,104：599-613(2012)，其內容全部併入本文中。
在一些具體實例中，本文所述之化合物及療法與用於化學療法、激素療法及生物療法之藥劑及/或雙膦酸鹽一起共投予。在一些具體實例中，用於化學療法之藥劑包括以下中之一或多者：卡鉑(carboplatin)(鉑爾定(Paraplatin))、順鉑(cisplatin)(普拉迪諾(Platinol)、普拉迪諾-AQ)、環磷醯胺(賽特杉(Cytoxan)、尼歐薩(Neosar))、小紅莓(doxorubicin)(阿德力黴素(Adriamycin))、依託泊苷(etoposide)(維派德(VePesid))、氟尿嘧啶(5-FU)、吉西他濱(gemcitabine)(健擇(Gemzar))、伊立替康(irinotecan)(坎普土沙(Camptosar))、太平洋紫杉醇(paclitaxel)(紫杉醇(Taxol))、拓朴替康(topotecan)(和美新(Hycamtin))、長春新鹼(vincristine)(安可平(Oncovin)、文卡薩(Vincasar)PFS)、長春花鹼(vinblastine)(長春鹼(Velban))。
在其他具體實例中，本文所述之抗VISTA化合物及療法與一或多種如下免疫檢查點抗體一起共投予，諸如尼沃單抗、派立珠單抗、曲美單抗(tremelimumab)、伊派利單抗、抗PD-L1抗體、抗PD-L2抗體、抗TIM-3抗體、抗LAG-3v、抗OX40抗體及抗GITR抗體。
在另一具體實例中，本文所述之抗VISTA化合物及療法與吲哚胺2,3-二加氧酶(IDO)之小分子抑制劑一起共投予。
本發明之抗VISTA化合物及組成物可投予至有需要之個體 以預防(包括預防癌症之復發)或治療(例如控制或改善癌症或其一或多種症狀)癌症。已知適用的或已經使用或目前正使用以用於預防、治療、控制或改善癌症或其一或多種症狀之任何藥劑或療法(例如化學療法、輻射療法、目標療法(諸如伊馬替尼(imatinib)、索拉非尼(sorafenib)及維羅非尼(vemurafenib))、激素療法及/或生物療法或免疫療法)可與本文所述之本發明之化合物或組成物組合使用。抗癌劑包括(但不限於)5-氟尿嘧啶；阿西維辛(acivicin)；阿地白介素(aldesleukin)；六甲蜜胺(altretamine)；胺格魯米特(aminoglutethimide)；安吖啶(amsacrine)；阿那曲唑(anastrozole)；安麯黴素(anthramycin)；天冬醯胺酶(asparaginase)；阿紮胞苷(azacitidine)；阿紮替派(azetepa)；阿佐黴素(azotomycin)；巴馬司他(batimastat)；比卡魯胺(bicalutamide)；硫酸博萊黴素(bleomycin sulfate)；布喹那鈉(brequinar sodium)；溴匹立明(bropirimine)；白消安(busulfan)；卡鉑；卡莫司汀(carmustine)；鹽酸卡柔比星(carubicin hydrochloride)；卡折來新(carzelesin)；西地芬戈(cedefingol)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；西羅黴素(cirolemycin)；順鉑；克拉屈濱(cladribine)；甲磺酸克立那托(crisnatol mesylate)；環磷醯胺；阿糖胞苷(cytarabine)；達卡巴嗪(dacarbazine)；放線菌素(dactinomycin)；鹽酸道諾黴素(daunorubicin hydrochloride)；地西他濱(decitabine)；右奧馬鉑(dexormaplatin)；地紮胍寧(dezaguanine)；甲磺酸地紮胍寧(dezaguanine mesylate)；地吖醌(diaziquone)；多烯紫杉醇(docetaxel)；小紅莓；鹽酸小紅莓；曲洛昔芬(droloxifene)；檸檬酸曲洛昔芬(droloxifene citrate)；丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)；達佐黴素(duazomycin)；依達曲沙(edatrexate)；鹽酸依氟鳥胺酸(eflornithine hydrochloride)；恩洛鉑 (enloplatin)；恩普胺酯(enpromate)；依匹哌啶(epipropidine)；鹽酸表柔比星(epirubicin hydrochloride)；厄布洛唑(erbulozole)；鹽酸依索比星(esorubicin hydrochloride)；雌氮芥(estramustine)；雌氮芥磷酸鈉(estramustine phosphate sodium)；依他噠唑(etanidazole)；依託泊苷(etoposide)；磷酸依託泊苷(etoposide phosphate)；法紮拉濱(fazarabine)；非瑞替尼(fenretinide)；氟尿苷(floxuridine)；磷酸氟達拉賓(fludarabine phosphate)；氟尿嘧啶；氟西他濱(flurocitabine)；磷喹酮(fosquidone)；福司曲星鈉(fostriecin sodium)；吉西他濱(gemcitabine)；鹽酸吉西他濱；羥基脲；鹽酸艾達黴素(idarubicin hydrochloride)；異環磷醯胺(ifosfamide)；伊莫福新(ilmofosine)；介白素II(包括重組介白素II或rIL2)、干擾素α-2a；干擾素α-2b；干擾素α-m；干擾素α-n3；干擾素β-Ia；干擾素γ-Ib；異丙鉑(iproplatin)；鹽酸伊立替康(irinotecan hydrochloride)；乙酸蘭瑞肽(lanreotide acetate)；來曲唑(letrozole)；乙酸亮丙立德(leuprolide acetate)；鹽酸利阿唑(liarozole hydrochloride)；洛美曲索鈉(lometrexol sodium)；洛莫司汀(lomustine)；鹽酸洛索蒽醌(losoxantrone hydrochloride)；馬索羅酚(masoprocol)；鹽酸氮芥(mechlorethamine hydrochloride)；乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)；乙酸甲烯雌醇(melengestrol acetate)；美法侖(melphalan)；美諾立爾(menogaril)；巰基嘌呤；甲胺喋呤；甲胺喋呤鈉；氯苯胺啶(metoprine)；美妥替哌(meturedepa)；絲裂黴素(mitomycin)；米托司培(mitosper)；米托坦(mitotane)；鹽酸米托蒽醌(mitoxantrone hydrochloride)；黴酚酸(mycophenolic acid)；諾考達唑(nocodazole)；奧馬鉑(ormaplatin)；太平洋紫杉醇；培門冬酶(pegaspargase)；甲基比裂黴素(porfromycin)；潑尼氮芥(prednimustine)； 鹽酸丙卡巴肼(procarbazine hydrochloride)；嘌呤黴素(puromycin)；羅谷亞胺(rogletimide)；鹽酸沙芬戈(safingol hydrochloride)；司莫司汀(semustine)；辛曲秦(simtrazene)；司泊索非鈉(sparfosate sodium)；司帕黴素(sparsomycin)；螺莫司汀(spiromustine)；螺鉑(spiroplatin)；鏈黑黴素(streptonigrin)；鏈脲菌素(streptozocin)；磺氯苯脲(sulofenur)；他利黴素(talisomycin)；喃氟啶(tegafur)；鹽酸替洛蒽醌(teloxantrone hydrochloride)；替莫泊芬(temoporfin)；替尼泊甙(teniposide)；替羅昔隆(teroxirone)；睾內酯(testolactone)；硫米嘌呤(thiamiprine)；硫鳥嘌呤(thioguanine)；噻替派(thiotepa)；噻唑呋林(tiazofurin)；替拉紮明(tirapazamine)；拓朴替康(topotecan)；曲美沙特(trimetrexate)；葡萄糖醛酸曲美沙特(trimetrexate glucuronate)；曲普瑞林(triptorelin)；尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；烏瑞替派(uredepa)；伐普肽(vapreotide)；維替泊芬(verteporfin)；硫酸長春花鹼(vinblastine sulfate)；硫酸長春新鹼(vincristine sulfate)；長春地辛(vindesine)；硫酸長春地辛；硫酸長春匹定(vinepidine sulfate)；硫酸長春甘酯(vinglycinate sulfate)；硫酸長春羅新(vinleurosine sulfate)；酒石酸長春瑞賓(vinorelbine tartrate)；硫酸長春羅定(vinrosidine sulfate)；硫酸長春利定(vinzolidine sulfate)；伏羅唑(vorozole)；折尼鉑(zeniplatin)；淨司他丁(zinostatin)；鹽酸左柔比星(zorubicin hydrochloride)。目標療法包括(但不限於)酪胺酸激酶抑制劑(例如伊馬替尼、索拉非尼及維羅非尼)。本發明亦涵蓋投予本發明之抗VISTA化合物與放射療法之組合，該放射療法包含使用x射線、γ射線及其他輻射來源來殺滅癌細胞。癌症治療為此項技術中已知且描述於諸如Physician's Desk Reference(第57版，2003)之文獻中。
本文所述之抗VISTA抗體亦適用於例如治療慢性感染性疾病(諸如尤其HIV、HBV、HCV及HSV)。
本文表1A、1B及2中提供用於選擇本發明之抗VISTA抗體的各種特性及序列資訊。
Figure 106104421-A0202-12-0034-1
表1B：所選全人類或人類化抗人類VISTA抗體之重鏈及輕鏈序列
Figure 106104421-A0202-12-0035-2
Figure 106104421-A0202-12-0036-3
Figure 106104421-A0202-12-0037-4
Figure 106104421-A0202-12-0038-5
Figure 106104421-A0202-12-0039-7
*VSTB140、VSTB149及VSTB174中之恆定區序列加有下劃線。△VSTB149之重鏈中的賦予蛋白酶抗性之胺基酸殘基以粗體表示。
Figure 106104421-A0202-12-0039-8
Figure 106104421-A0202-12-0040-9
引發生物反應之方法
在一具體實例中，本發明提供一種使用結合T細胞活化之V域Ig抑制因子(VISTA)蛋白之抗體來引發個體中之生物反應的方法。該方法包含以下步驟：以足以引發個體中之生物反應的量向個體投予結合VISTA蛋白之抗體或其抗原結合片段。
在某些具體實例中，藉由結合VISTA之抗體或抗原結合片段引發之生物反應為：循環免疫細胞數目之減少；骨髓及/或脾中之顆粒球數目之減少；腫瘤微環境(TME)中之嗜中性白血球、巨噬細胞、T細胞或其組合之數目的增加；一或多種細胞介素之水平之增加；或此等反應之任 何組合。
在一具體實例中，所引發之生物反應為循環免疫細胞數目之減少。所減少之循環免疫細胞可為例如單核球、嗜中性白血球、淋巴細胞、嗜伊紅白血球、嗜鹼性白血球或其任何組合。在一個具體實例中，循環免疫細胞數目之減少為短暫的。
如本文所用，循環免疫細胞數目之「短暫」減少係指相對於投予抗體或抗原結合片段之前的水平而暫時性減少，其中下降之水平在後續時間點恢復至先前水平或超越先前水平。
在一具體實例中，所引發之生物反應為個體之一或多種組織(例如骨髓)及/或器官(例如脾)中之顆粒球數目的減少。
在一具體實例中，所引發之生物反應為腫瘤微環境(TME)中之免疫細胞數目之增加。在TME中增加之免疫細胞可包括(但不限於)嗜中性白血球、巨噬細胞、T細胞或其任何組合。
在一具體實例中，所引發之生物反應為一或多種細胞介素(例如一或多種趨化介素)之水平之增加。可回應於抗VISTA抗體或抗原結合片段之投予而增加的細胞介素之實例包括例如IL-6、TNF α、MCP-3、MDC、MIP-1 β、IP-10、IL-1R α、GM-CSF、IL-12p70、GRO、MIP-1 α、IL-1 β、RANTES、G-CSF、IL-1 α、IL-7、IL-12p40、IL-13、IFN γ、TNF β、IFN α、IL-4、IL-10、FGF-2、弗拉塔凱(fractalkine)、VEGF、IL-17A、Flt3L、IL-9、TGF α、IL-15、EGF、PDGF-α α、MCP-1、IL-8、sCD40L、伊紅趨素、IL-2、IL-3及IL-5及PDGF-BB。
在一特定具體實例中，投予至個體之結合VISTA之抗體或 其抗原結合片段包含具有效應功能之Fc區(例如結合於細胞上之Fc受體)。在一特定具體實例中，抗體或其抗原結合片段結合於免疫細胞(例如NK細胞)上之CD16受體(例如Fc γ RIIIa、Fc γ RIIIb)。
在一具體實例中，投予至個體之結合VISTA之抗體或其抗原結合片段包含抗體VH域，該抗體VH域包含具有SEQ ID NO：25之胺基酸序列之VH CDR1、具有SEQ ID NO：26之胺基酸序列之VH CDR2及具有SEQ ID NO：27之胺基酸序列之VH CDR3，且該抗體或其抗原結合片段進一步包含抗體VL域，該抗體VL域包含具有SEQ ID NO：28之胺基酸序列之VL CDR1、具有SEQ ID NO：29之胺基酸序列之VL CDR2及具有SEQ ID NO：30之胺基酸序列之VL CDR3。在一特定具體實例中，抗體為VSTB174或其抗原結合片段。
在一具體實例中，投予結合VISTA之抗體或其抗原結合片段之個體為哺乳動物。在一個具體實例中，哺乳動物為人類。在另一具體實例中，哺乳動物為非人類之靈長類。在又另一具體實例中，哺乳動物為嚙齒動物(例如小鼠、大鼠)。
在一具體實例中，個體患有癌症(例如實體腫瘤、白血病、淋巴瘤)。在一些具體實例中，癌症為白血病、淋巴瘤、骨髓發育不良症候群及/或骨髓瘤。在一些具體實例中，癌症可為任何種類或類型之白血病，包括淋巴細胞性白血病或骨髓性白血病，諸如急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、急性骨髓(骨髓性)白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、毛細胞白血病、T細胞前淋巴細胞性白血病、大顆粒淋巴細胞性白血病或成人T細胞白血病。在一些具體實例中，淋巴 瘤為組織細胞性淋巴瘤，且在一些具體實例中，癌症為多發性骨髓瘤。在一些具體實例中，癌症為實體腫瘤，例如黑色素瘤、乳癌或膀胱癌。在一些具體實例中，癌症為肺癌(例如非小細胞肺癌(NSCLC))。在一些具體實例中，癌症為膀胱癌。在一些具體實例中，癌症為乳癌。
抗體或其片段可藉由任何適合之非經腸或經腸方法投予，該等方法包括例如靜脈內(IV)、皮下(SQ)或經口(PO)。
篩選抗VISTA抗體之方法
在一具體實例中，本發明提供一種鑑定結合T細胞活化之V域Ig抑制因子(VISTA)蛋白且引發生物反應之抗體的方法。該方法包含以下步驟：向例如細胞、組織、器官及/或生物體提供結合VISTA之抗體或其抗體片段，及判定抗體或其抗體片段是否誘導細胞、組織、器官或生物體中之生物反應。
在一具體實例中，待確定之生物反應包括單核球之活化；T細胞之活化；循環免疫細胞數目之減少；骨髓及脾中之顆粒球數目之減少；腫瘤微環境(TME)中之嗜中性白血球、巨噬細胞、T細胞或其組合之數目的增加；一或多種細胞介素之水平之增加；或此等反應之任何組合。
在一具體實例中，待根據本發明方法鑑定之結合VISTA之抗體或其抗原結合片段包含具有效應功能之Fc區(例如結合於細胞上之Fc受體)。在一特定具體實例中，抗體或其抗原結合片段結合於免疫細胞(例如NK細胞)上之CD16受體(例如Fc γ RIIIa、Fc γ RIIIb)。
在一具體實例中，待根據本發明方法鑑定之結合VISTA之抗體或其抗原結合片段包含抗體VH域，該抗體VH域包含具有SEQ ID NO：25之胺基酸序列之VH CDR1、具有SEQ ID NO：26之胺基酸序列之VH CDR2及具有SEQ ID NO：27之胺基酸序列之VH CDR3，且該抗體或其抗原結合片段進一步包含抗體VL域，該抗體VL域包含具有SEQ ID NO：28之胺基酸序列之VL CDR1、具有SEQ ID NO：29之胺基酸序列之VL CDR2及具有SEQ ID NQ：30之胺基酸序列之VL CDR3。
在一具體實例中，可在各種類型的樣品中分析生物反應，該等樣品包括(但不限於)組織樣品、生物流體樣品(例如哺乳動物血漿、血清、淋巴、全血、脊髓液、羊膜液或其他動物衍生之流體)、細胞(例如腫瘤細胞、免疫細胞)樣品及其類似物。樣品可包括例如：(a)包含未固定之新鮮組織及/或細胞之製備物；(b)固定且包埋之組織樣本，諸如所存檔材料；及(c)冷凍之組織或細胞。因此，樣品可為新鮮或保藏的，例如在液體溶液中、快速冷凍或凍乾的、塗片或乾燥的、包埋的或固定在載片或其他載體上。
在一些具體實例中，組織或細胞樣品為固定或包埋的。使用固定劑以例如按可再生及類生命之方式保藏細胞及組織。固定劑亦使細胞及組織穩定，從而使其免遭嚴密之處理及染色技術之破壞。舉例而言，包含組織塊、組織切片或組織塗片之樣品可浸沒於固定劑流體中，或在塗片之情況下經乾燥。
可使用例如藉由血液抽取、脊髓抽液、組織塗片或刮擦或組織活檢自個體取樣之任何方法來獲得樣品。因此，樣品可為活檢標本(例如腫瘤、息肉、腫塊(實體、細胞))、抽出物、塗片或血液樣品。樣品可為具有腫瘤(例如癌生長)及/或腫瘤細胞或懷疑具有腫瘤及/或腫瘤細胞之 組織。舉例而言，腫瘤活檢可以切開活檢之方式獲得，該切開活檢為自目標區域移除全部(切除活檢)或部分(切取活檢)腫塊之程序。或者，腫瘤樣品可經由經皮活檢獲得，該經皮活檢為用類似針之儀器經由小切口或穿刺(在存在或不存在成像裝置之輔助下)進行以獲得個別細胞或細胞簇(例如細針抽吸(FNA))或組織之核心或片段(核心活檢)的程序。
可以細胞學(例如塗片)、組織學(例如冷凍或石蠟切片)之方式或使用任何其他適合方法(例如分子診斷方法)來檢測樣品。亦可藉由試管內收集衍生自個體組織之經培養人類細胞來獲得腫瘤樣品。必要時可在分析之前藉由適合儲存方法儲存腫瘤樣品，該等方法在可分析條件諸如快速冷凍或可控制的冷凍流程下保藏樣品之蛋白質及/或核酸。必要時，可在存在低溫保護劑例如二甲亞碸(DMSO)、甘油或丙二醇-蔗糖下進行冷凍。出於分析之目的，可在儲存前後按需要收集腫瘤樣品。
在一具體實例中，可使用試管內分析確定生物反應，該試管內分析包括例如免疫及免疫化學方法，包括(但不限於)流式細胞測量術(例如FACS分析)、細胞介素釋放分析、趨化介素釋放分析、細胞活化分析、細胞增殖分析、細胞遷移分析、酶聯免疫吸附分析(ELISA)，包括化學發光分析、放射免疫分析、免疫墨點(例如西方墨點)、免疫組織化學(IHC)、免疫沈澱及其他基於抗體之定量方法(例如Luminex®基於珠粒之分析)。其他適合之方法包括例如質譜分析。
在一具體實例中，可在非人類動物中活體內確定生物反應。在一個具體實例中，非人類動物為非人類之靈長類。在又另一具體實例中，非人類動物為嚙齒動物(例如小鼠、大鼠)。在一些具體實例中，非人類動 物為基因轉殖動物。
在一具體實例中，非人類動物患有癌症(例如實體腫瘤、白血病、淋巴瘤)。在一些具體實例中，癌症為白血病、淋巴瘤、骨髓發育不良症候群及/或骨髓瘤。在一些具體實例中，癌症可為任何種類或類型之白血病，包括淋巴細胞性白血病或骨髓性白血病，諸如急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、急性骨髓(骨髓性)白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、毛細包白血病、T細胞前淋巴細胞性白血病、大顆粒淋巴細胞性白血病或成人T細胞白血病。在一些具體實例中，淋巴瘤為組織細胞性淋巴瘤，且在一些具體實例中，癌症為多發性骨髓瘤。在一些具體實例中，癌症為實體腫瘤，例如黑色素瘤、乳癌或膀胱癌。在一些具體實例中，癌症為肺癌(例如非小細胞肺癌(NSCLC))。在一些具體實例中，癌症為膀胱癌。在一些具體實例中，癌症為乳癌。
在一具體實例中，待分析之生物反應為循環免疫細胞數目之減少。所減少之循環免疫細胞可為例如單核球、嗜中性白血球、淋巴細胞、嗜伊紅白血球、嗜鹼性白血球或其任何組合。在一個具體實例中，循環免疫細胞數目之減少為短暫的。
在一具體實例中，待分析之生物反應為個體之一或多個組織(例如骨髓)或器官(例如脾)中之顆粒球數目的減少。
在一具體實例中，待分析之生物反應為腫瘤微環境(TME)中之免疫細胞數目之增加。在TME中增加之免疫細胞可包括(但不限於)嗜中性白血球、巨噬細胞、T細胞或其任何組合。
在一具體實例中，待分析之生物反應為一或多種細胞介素 (例如一或多種趨化介素)之水平之增加。可回應於抗VISTA抗體或抗原結合片段之投予而增加的細胞介素之實例包括例如IL-6、TNF α、MCP-3、MDC、MIP-1 β、IP-10、IL-1R α、GM-CSF、IL-12p70、GRO、MIP-1 α、IL-1 β、RANTES、G-CSF、IL-1 α、IL-7、IL-12p40、IL-13、IFN γ、TNF β、IFN α、IL-4、IL-10、FGF-2、弗拉塔凱、VEGF、IL-17A、Flt3L、IL-9、TGF α、IL-15、EGF、PDGF-α α、MCP-1、IL-8、sCD40L、伊紅趨素、IL-2、IL-3及IL-5及PDGF-BB。
實施例
實施例1：分析人類造血細胞上之VISTA表現
方法：
用於VISTA表現之新鮮人類PBMC的製備及染色
在來自數個供體之新鮮分離之人類PBMC(外周血液單核球)上測試VISTA之表現。使用抗人類VISTA-生物素(GA-1)進行染色(5μg/ml)。使用小鼠IgG1,K-生物素(純系MOPC-21，5μg/ml)作為同型對照。
供體材料
自Biological Specialty公司(Colmar,PA)獲得血液樣品且收集並當天進行分析。寄送10ml含有硫酸肝素之全血進行分析。
樣品製備
在無菌PBS中以1：1稀釋血液。在50ml錐形管中，使22ml經稀釋之臍帶血在20ml無菌Ficoll-Hypaque(GE Healthcare目錄號17-144003)上分層。在室溫下將管以1800rpm離心20分鐘。使用1ml移液器收集離心後界面處之單核細胞且合併於兩個50ml錐形管中。向各管添加無菌PBS 以使體積補足50ml且在4℃下將細胞以300g離心10分鐘。丟棄上清液。將細胞再懸浮於50ml無菌PBS中且在4℃下將管以300g旋轉10分鐘。丟棄上清液。合併細胞且再懸浮於50ml無菌PBS中，隨後計數。
染色方案：使用含有5×107個PBMC之冷凍小瓶進行補償控制，且用作染色之對照。
使用以下試劑及/或消耗品：
來自BD Biosciences之FACS染色緩衝液(BSA)(目錄號554657)，其補充有0.2% EDTA；磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)(Gibco目錄號14190)；96孔聚丙烯圓底盤(BD #3077)；1.2ml聚丙烯排管(Corning #4451)；經生物素標記之抗VISTA純系GA-1，其來自ImmunoNext批號080612B(以5μg/ml使用)；經生物素標記之mIgG1,K同型對照(純系MOPC-21)，Biolegend目錄號400104，批號B116649(以5μg/ml使用)；抗人類抗體(參見下表之染色法)；近紅外活/死細胞染料(Invitrogen，目錄號L10119)；及抗生蛋白鏈菌素試劑，包括STP-APC(BD Biosciences目錄號554067，批號04251)(以於FACS緩衝液中1：200稀釋之形式使用)、STP-PE(Biolegend目錄號405203，批號B139688)(以於FACS緩衝液中1：200稀釋之形式使用)、STP-PE Cy7(展示同型對照樣品中之非特異性結合)、STP-Q605(Invitrogen目錄號Q10101MP，批號53449A)(以於FACS緩衝液中1：200稀釋之形式使用)。
細胞表面染色方案
染色之前，將1×106個細胞轉移於96孔圓底盤中且用150μl PBS洗滌。隨後在4℃下將盤以1300rpm離心3分鐘。
隨後，將細胞再次用PBS洗滌且如上所述進行離心。
隨後在50μl含有0.25μl近紅外活/死細胞染料之PBS中進行活/死細胞染色。在室溫下10分鐘後，用150μl FACs染色緩衝液洗滌孔且在4℃下以1300rpm離心3分鐘。丟棄上清液。
於50μl FACS染色緩衝液中將細胞以1：100用人類血清阻斷。在4℃下培育盤15分鐘。隨後用150μl FACs染色緩衝液洗滌孔且在4℃下以1300rpm離心3分鐘。丟棄上清液。
隨後將含有以下抗體之混合物添加於各孔中以進行表面染色：混合物描述於下表3-6中。視相關群體而定將各混合物與其他混合物分開使用。
Figure 106104421-A0202-12-0049-10
Figure 106104421-A0202-12-0049-11
Figure 106104421-A0202-12-0050-12
Figure 106104421-A0202-12-0050-13
表面染色後，如先前所述用FACS染色緩衝液洗滌細胞兩次且在4℃下以1300rpm離心5分鐘。將樣品再懸浮於50μl含有經適當螢光標記之抗生蛋白鏈菌素的FACS染色緩衝液中。在4℃下培育樣品30分鐘。用150μl FACS染色緩衝液洗滌細胞且在4℃下以1300rpm離心5分鐘。重複此洗滌步驟，隨後將樣品再懸浮於250μl FACS染色緩衝液中。當天在BD LSRFortessaTM細胞分析儀(BD Biosciences)上分析樣品。
資料分析
使用FlowJo型號9軟體再分析流式細胞測量術資料以對特定表型群體設門。使用幾何平均值之列舉來比較不同細胞亞群中之VISTA表現。藉由自抗VISTA處理樣品之平均值減去同型對照值將各群體針對背景進行標準化。用Prism製作曲線且在僅比較兩個樣品時使用斯圖登氏T檢驗(student's T-test)進行統計或使用進行單因子ANOVA以及邦弗朗尼事後 檢驗(Bonferroni post-test)統計。
結果：
人類骨髓及淋巴亞群上之VISTA表現：
如圖2A-2E、3A-3G、4、5A-5B及6A-6C中所示，CD14+單核球上之VISTA表現顯著不同於全部其他群體(p<0.001)。其他群體之間未發現顯著差異。單核球在外周血液中表現最高水平之VISTA，其中CD14+CD16-亞群相較於CD14loCD16+細胞具有顯著較高表現。儘管APC展示VISTA之中等表現，但淋巴亞群展示低表現水平。
人類T及NK亞群上之VISTA表現：
如圖7A-7E、8A-8G及9中所示，對於NK亞群，CD56lo細胞展現顯著高於CD56Hi NK細胞之VISTA表現水平。在T細胞亞群中，CD8+記憶細胞表現最高表現水平，但其並不顯著高於CD8+初始或CD4+T細胞。
人類樹突狀細胞亞群上之VISTA表現：
如圖10A-10D、11A-11C及12中所示，未發現VISTA表現存在顯著差異；DC及嗜鹼性白血球展現低VISTA表現，其中漿細胞樣樹突狀細胞(pDC)一般較高但程度並不顯著。
結論：此等結果展示各種免疫細胞亞群上之VISTA表現且VISTA最高地表現於單核球上，其中一些表現在不同T細胞亞群及NK細胞上且幾乎不表現於B細胞上。
實施例2：外周血液細胞上之VISTA表現
方法：
全血染色：用下示抗體混合物藉由在4℃下培育30分鐘將 新鮮分離之全血(100μl)染色。用RBC裂解緩衝液將紅血細胞(RBC)裂解且用染色緩衝液洗滌剩餘細胞1次。使細胞再懸浮於200μl染色緩衝液中。使用MACSQuant流式細胞儀收集資料且使用FlowJo分析軟體分析。
外周血液單核細胞(PBMC)染色：使用Ficoll梯度自全血分離外周血液單核細胞。用100μl染色緩衝液中之抗體混合物將新鮮分離之1×106個PBMC染色。在4℃下培育樣品30分鐘，隨後用染色緩衝液洗滌一次。使細胞再懸浮於100μl染色緩衝液中。使用MACSQuant®流式細胞儀(Miltenyi Biotec)收集資料且使用FlowJo分析軟體分析。
所用抗體為CD11b、CD33、CD177、CD16、CD15、CD14、CD20、HLADR、CD3、CD4、CD8、CD127、CD69及FOXP3抗體(Biolegend,San Diego,CA)。由ImmuNext(Lebanon,NH)製備APC結合之小鼠抗人類VISTA(純系GG8)。
結論：
健康人類外周血液細胞上之VISTA表現
使用多色流式細胞測量術分析全血及外周血液單核細胞的VISTA表現。如圖15A及15B中所示，在單核球上偵測到VISTA表現之最高水平，繼而為嗜中性白血球。如圖13C及13D中所示，CD4+與CD8+T細胞均表現低水平之VISTA。
癌症患者外周血液細胞上之VISTA表現
如圖14A-C中所示，分析來自肺癌患者之外周血液單核細胞(PBMCs)。圖14A為展示CD14+單核球及源自CD15+骨髓之抑制細胞(MDSC)的分析結果的代表性FACS圖。結果表明表型CD15+細胞為源自 嗜中性白血球之MDSC。另外，此等細胞不存在於健康血液樣品中。圖14B為源自健康及癌症患者之單核球上VISTA表現之代表性直方圖，表明相較於健康對照，更高水平之VISTA表現於癌症患者細胞上。類似地，在癌症患者之MDSC上發現更高水平之VISTA，如圖14C中所示。
圖15A為展示結腸癌患者之血液中源自嗜中性白血球之MDSC的存在的代表性FACS圖。圖15B及15C為展示相較於健康供體血液樣品，更高水平之VISTA表現於癌症患者單核球上的代表性直方圖。
食蟹獼猴外周血液細胞上之VISTA表現
如圖16A及16B中所示，猴全血之流式細胞測量術分析揭示類似於人類細胞的VISTA表現模式。相較於CD4+(圖16C)及CD8+(圖16D)T細胞，單核球與嗜中性白血球均表現最高水平之VISTA。
實施例3：血紅素惡性細胞系中RNA層面及蛋白質層面的VISTA表現
因為VISTA表現於血紅素惡性病中，故抗VISTA抗體可能以惡性細胞為目標而破壞以及阻斷VISTA且促進抗腫瘤免疫反應。
資料包括約140種血紅素惡性細胞系(在分析中重複一些細胞系)之RNAseq分析結果。資料展示於圖17中。
將RNAseq值以FPKM(每1百萬個所定位片段中外顯子之每千個鹼基的片段)值形式列出。
本質上，此意謂計數屬於基因之外顯子區域中的所有讀取結果，且藉由基因之長度與每個樣品之讀取總數標準化(以計算樣品間差異)。截止值為1；高於1為VISTA表現陽性(RNA層面)，低於1為VISTA 表現陰性。
結果指示多個細胞系在RNA層面為陽性，主要為急性骨髓性白血病及慢性骨髓性白血病。此可因為VISTA高度表現於正常骨髓細胞中而預期到，且因為認為其功能為減弱免疫反應，包括抗腫瘤免疫反應。
實施例4：針對VISTA之單株抗體的產生
噬菌體淘選(Phage Panning)
執行二十四個噬菌體淘選實驗以富集對Cyno VISTA-His具有活性之噬菌體。使用獼猴VISTA蛋白進行此等實驗，因為其相較於人類VISTA蛋白展示較佳生物素結合。為確定噬菌體實驗成功，將來自個別輪淘選之噬菌體池添加至塗有經生物素標記之cyno VISTA-His的中性鏈親和素盤且用結合HRP之抗M13抗體偵測。自噬菌體選擇輪挑取個別集落且在96孔盤中製備Fab蛋白。分析所表現之Fab上清液的與經生物素標記之cyno VISTA-His的結合。此操作得到大於200個成功結果。
擴增來自Fab盤之VH及VL區，提交以進行DNA測序且作為FASTA文件輸出。當挑取將轉化為MAB且以MAB形式測試之純系時，該等純系基於序列多樣性以及具有有限轉譯後修飾風險及儘可能具有較少疏水性殘基來選擇。
將來自噬菌體純系之VH及VL次選殖於哺乳動物IgG1/κ表現載體中且轉染於HEK293細胞中。將抗體在蛋白A瓊脂糖快速流動親和力樹脂上純化。藉由定量ELISA使用Nanodrop量測來確定噬菌體MAB之濃度。抗體組以高水平表現。SDS-PAGE分析展現各表現之抗體變體的完整性。
藉由擴增來自最後一輪淘選之多株抗體混合物的VH域以選殖於具有VL多樣性之噬菌體載體中來進行噬菌體抗體之同步(in-line)成熟。此操作得到富集之VH池，其經取樣具有額外VL多樣性。對噬菌體進行1-2輪嚴格淘選，以期鑑定VISTA ECD His蛋白質之極高親和力結合物。操作單株Fab ELISA以確定成熟成功。將ELISA及表現資料根據來自原始重生淘選實驗之設定成100%的參考純系標準化，且鑑定相較於參考純系對cyno VISTA抗原具有較高結合信號的親和力成熟純系。此製程產生數個在低抗原濃度(1nM)下篩選時展現高達200%結合的純系，對具有最高親和力之純系測序且製成MAB。
融合瘤產生
使一組BALB/cAnNCrl小鼠接受一次50μg於傳氏完全佐劑(Complete Freund's Adjuvant)中乳化的Hu VISTA-Ig重組蛋白(Sino)的腹膜內(IP)注射，繼而在兩週後接受一次50μg於傳氏不完全佐劑(Incomplete Freund's Adjuvant)中乳化的Hu VISTA-Ig重組蛋白的腹膜內注射。兩週後，使小鼠接受一次50μg於傳氏不完全佐劑中乳化的cyno VISTA-Fc重組蛋白的腹膜內注射。使所有小鼠在尾巴底部接受最後一次含有25μg人類及25μg cyno VISTA之PBS的注射，五天後收集脾以進行融合。
使另一組BALB/cAnNCrl小鼠接受一次50μg於傳氏完全佐劑中乳化的Hu VISTA-His重組蛋白的腹膜內注射。兩週後，使小鼠接受一次50μg於傳氏不完全佐劑中乳化的Hu VISTA-His重組蛋白的腹膜內注射。兩週後，使小鼠接受一次50μg於傳氏不完全佐劑中乳化的Cyno VISTA-His重組蛋白的腹膜內注射。兩週後，使所有小鼠接受最後一次含有 25μg Hu VISTA-His及25μg Cyno VISTA-His之PBS的注射，三天後收集脾以進行融合。
在融合當天，藉由CO2窒息使小鼠安樂死，移出脾且置於10mL冷磷酸鹽緩衝生理食鹽水中。藉由用小研杵將脾研磨穿過細目篩且在室溫下用PBS沖洗來製備脾細胞之單細胞懸浮液。用PBS洗滌細胞一次且進行RBC裂解。簡言之，將細胞再懸浮於3mL RBC裂解緩衝液(Sigma #R7757)/脾中且置於冰上5分鐘。在室溫下用PBS再洗滌細胞一次且進行標記以進行磁性分選。按照製造商之說明，用抗鼠Thy1.2、抗鼠CD11b及抗鼠IgM磁珠(分別為Miltenyi Biotec # 130-049-101、130-049-601及130-047-301)標記細胞，隨後使用具有Midi MACS之MS管柱分選。使陰性細胞洗提份(陽性細胞洗提份丟棄)與FO細胞融合。以1：1比率之鼠骨髓瘤細胞與活脾細胞進行融合。簡言之，將脾及骨髓瘤細胞混合在一起，粒化且用50mL PBS洗滌一次。在37℃下用每10e8個脾細胞1mL聚乙二醇(PEG)溶液(2g PEG(分子量4000)、2mL DMEM、0.4mL DMSO)使集結粒再懸浮30秒。隨後將細胞/融合混合物在溫和攪拌下浸於37℃水浴中約60秒。藉由經1分鐘緩慢添加37℃ DMEM來終止融合反應。將融合細胞在室溫下靜置5分鐘，且隨後以150×g離心5分鐘。隨後將細胞再懸浮於含有HAT(Sigma目錄號H0262)之培養基E-HAT(MediumE，StemCell Technologies目錄號03805)中，且接種於96孔平底聚苯乙烯組織培養盤(Corning # 3997)中。
使用捕捉EIA針對特異於cyno VISTA之抗體篩選融合瘤上清液。簡言之，用塗佈緩衝液(Thermo 28382)中之山羊抗小鼠IgG(Fc) 抗體(Jackson #115-006-071)以4μg/ml塗佈盤(Nunc-Maxisorp #446612)至少60分鐘。在室溫下將盤用每孔200微升0.4%(w/v)牛血清白蛋白(BSA)之PBS溶液阻斷30分鐘。洗滌盤一次，且每孔添加50μl融合瘤上清液且在室溫下培育至少30分鐘。洗滌盤一次，每孔添加50μl 0.1μg/mL cyno VISTA-huIg且在室溫下培育30分鐘。洗滌盤一次，且向盤中添加1：40,000抗生蛋白鏈菌素HRP(Jackson 016-030-084)於0.4% BSA/PBS中之溶液且在室溫下培育30分鐘。洗滌盤3次，隨後每孔使用100μl TMB Turbo受質(Thermo Scientific 34022)顯色，在室溫下培育約10分鐘。使用每孔25μl 4N硫酸終止反應且使用自動盤分光光度計在450nm下量測吸光度。選擇15個初級成功結果以藉由限制稀釋法次選殖且以相同初級篩選格式篩選。
使用人類VISTA-Ig交叉篩選所有cyno VISTA活性融合瘤細胞系以評定交叉反應性。簡言之，用0.1M碳酸鈉-碳酸氫鈉緩衝液(pH 9.4，Pierce 28382BupHTM)中之山羊抗ms Fc(Jackson#115-006-071)以4μg/mL塗佈盤(Nunc-Maxisorp #446612)，在4℃下隔夜。無需進行洗滌，用200μl阻斷劑(0.4% BSA(Sigma)(w/v)於PBS(Invitrogen)中之溶液)阻斷孔，在4℃下隔夜。移除阻斷溶液後，在室溫下在經塗佈盤上培育未稀釋融合瘤上清液30分鐘。用PBST(0.02%吐溫(Tween)20(Sigma)(w/v)之PBS溶液)洗滌盤一次，隨後與於阻斷劑中稀釋至100ng/ml之Hu VISTA-Ig一起培育30分鐘。用洗滌盤一次且在室溫下用以阻斷劑1：10,000稀釋之山羊抗人類Fc-HRP(Jackson #109-036-098)探測30分鐘。再次洗滌盤，隨後每孔使用100μl TMB Turbo受質(Thermo Scientific 34022)顯色，在室溫下培育約10分鐘。使用每孔25μl 4N硫酸終止反應且使用自動盤分光光度計在 450nm下量測吸光度。
對人類與獼猴VISTA展示活性之融合瘤的V區抗體序列進行選殖。在反轉錄酶(RT)反應之前用Invitrogen之SuperScript III細胞直接cDNA系統製備融合瘤細胞。簡言之，丟棄培養基且將盤置於冰上且再懸浮於200μl冷PBS中。將四十微升轉移於MicroAmp快速96孔反應PCR盤中且將盤置於冷金屬盤基座上，用塑膠膜密封且以700rpm旋轉3分鐘。丟棄PBS且向各孔中添加10μl再懸浮緩衝液及1μl裂解增強劑。密封盤，且在75℃下培育10分鐘且儲存在-80℃下。
為進行RT反應，各孔含有5μl水、1.6μl 10×DNase緩衝液、1.2μl 50mM EDTA、2μl Oligo(dT)20(50mM)及1μl 10mM dNTP混合物。在70℃下培育盤5分鐘，繼而在冰上培育2分鐘，隨後向各孔添加以下試劑：6μl 5×RT緩衝液、1μl RNaseOUTTM(40U/μl)、1μl SuperScriptTM III RT(200U/μl)及1μl 0.1M DTT。密封盤，置於預熱至50℃之熱循環器上且在50℃下培育50分鐘，繼而使其失活(在85℃下培育5分鐘)。將反應物在冰上冷凍且將單股cDNA儲存在-80℃下直至進一步使用。
為進行V區擴增，提供20μl PCR反應物。各孔含有16.2μl水、2.0μl 10×PCR反應緩衝液、0.8μl MgSO4(50mM)、0.4μl 10mM dNTP、0.15μl 100μM正向引子混合物、0.05μl 100μM反向引子、0.2μl HiFi Tag酶。將如上所述製備之cDNA轉移(每孔2μl)至PCR組分混合物，密封盤且操作擴增反應；對於VH，程式為(i)94℃ 1分鐘，(ii)94℃ 15秒，(iii)55℃ 30秒，(iv)68℃ 1分鐘。重複步驟(ii-iv)總共35 個循環，繼而在68℃下最後延長3分鐘。對於VL，程式為(i)94℃ 1分鐘，(ii)94℃ 15秒，(iii)55℃ 30秒，(iv)65℃ 30秒，(v)68℃ 1分鐘。重複步驟(ii-v)總共35個循環，繼而在68℃下最後延長3分鐘。
預混合正向引子且將此混合物與反向引子以比率3：1使用。在瓊脂糖凝膠上檢驗PCR產物。製備反應物以藉由添加強化子(In-Fusion HC選殖套組，目錄號639650，Clontech)進行infusion選殖。將五微升PCR反應物轉移至PCR盤，繼而每孔轉移2μl強化子。密封盤且在熱循環器中培育(在37℃下15分鐘且在80℃下15分鐘)。藉由Esp3I消化製備目的載體(vDR243或vDR301)；(在37℃下在3μl Tango緩衝液、2 1 Esp3I及水中於30μl反應物中消化1.5μg載體2小時)。
為進行infusion選殖，將經2μl強化子處理之PCR產物與100ng Esp3I消化之載體及2μl 5×infusion酶(Clontech)混合。以96孔盤格式進行infusion反應。在50℃下在PCR機上培育盤15分鐘，且藉由在42℃下在不震盪下熱休克40秒將斯黛拉勝任細胞(Stella competent cell)轉型，且與所選抗生素一起展塗於LB瓊脂盤上且在37℃下培育隔夜。第二天，將集落挑取於含有LB/卡本西林(Carbenicillin)培養基之96孔深孔盤中且在37℃下生長隔夜。由與等體積30w/v%甘油混合之隔夜培養物製成冷凍儲備液。使用測序引子SPF0052對V區測序。分析序列，每個融合瘤vH及vL選擇一個陽性孔，再排列於新盤中且在具有安比西林(ampicillin)之富集培養基中生長隔夜。隨後將純系進行小規模純化(miniprep)DNA製備以小規模轉染於96孔盤中。
使用內部軟體程式將重鏈與輕鏈之四十八個所選小鼠融合 瘤序列進行人類構架調適。對於小鼠vH或vL中之每一者選擇一個人類構架。經由反向轉譯獲得V區DNA序列。由整合DNA技術(Coralville,IA)將對應於HFA胺基酸序列之合成DNA區域定序。分別向預切割之vDR149及vDR157、人類IgG1及人類κ中進行選殖。使用Qiagen Endo-free Maxi-prep套組製備。使用Expi293(100ml)培養物表現此抗體組。
實施例5：用於在試管內進行人類VISTA-IGT細胞抑制分析之方案
用GFP或人類VISTA穩定轉染小鼠A20細胞。將其與ova肽及DO11.10 T細胞一起培育。培育開始後24小時量測T細胞之CD25表現。A20-huVISTA細胞抑制T細胞之CD25表現，但此讀出結果藉由與VSTB95一起培育而明顯恢復(圖18)。
實施例6：抗VISTA抗體之人類構架區調適
使用內部軟體程式藉由CDR接枝(Jones等人，Nature,321：522-525(1986))進行重鏈與輕鏈之小鼠融合瘤序列的人類構架調適。程式根據Kabat定義(Wu,T.T.& Kabat,E.A.(1970).J Exp Med,132,211-50)描繪V區序列之互補決定區(CDR)且使用Blast比較構架區與人類生殖系基因。選擇與小鼠構架具有最高序列一致性之人類生殖系作為用於人類構架調適(HFA)之接受者基因。在一些狀況下，基於前述具有良好表現之人類構架的經歷，選擇密切相關之人類生殖系基因作為替代。經由反向轉譯獲得選用於小鼠vH或vL V區中之每一者的人類構架的DNA序列。由整合DNA技術(Coralville,IA)將對應於HFA胺基酸序列之合成DNA區域定序。分別向人類IgG1及人類κ中進行選殖。
實施例7：抗VISTA抗體構築體
用於細胞系產生之分子的質體及序列資訊：產生質體構築體以用於具有VSTB112可變區及IgG1 κ恆定區(VSTB174，由於恆定區之異型變化而產生之新編號)、IgG2 δ恆定區(VSTB140)或IgG1抗蛋白酶恆定區(VSTB149)的抗VISTA抗體。
Lonza載體
Biologics Research(BR)及Pharmaceutical Development & Manufacturing Sciences(PDMS)中建立pEE6.4及pEE12.4中國倉鼠卵巢(CHO)表現載體系統(Lonza Biologics公共有限公司)作為在哺乳動物表現細胞系中產生治療性mAb的主要表現系統。各載體含有驅動重鏈(HC)或輕鏈(LC)表現之人類巨細胞病毒(huCMV-MIE)啟動子且含有安比西林抗性基因。pEE12.4載體亦包括編碼麩醯胺酸合成酶(GS)之基因。需要麩醯胺酸合成酶活性之生長條件對細胞施加選擇性壓力來維持表現載體(GS基因表現系統手冊4.0版(GS Gene Expression System Manual Version 4.0))。使用pEE6.4作為單基因載體選殖HC基因且使用pEE12.4作為單基因載體選殖LC基因。由此兩種Lonza單基因載體產生Lonza雙基因質體。
所選VISTA mAb之可變重鏈區的胺基酸序列
>VSTB112重鏈(SEQ ID NO：37)
Figure 106104421-A0202-12-0061-14
>VSTB50重鏈(SEQ ID NO：38)
Figure 106104421-A0202-12-0062-15
>VSTB53重鏈(SEQ ID NO：39)
Figure 106104421-A0202-12-0062-16
>VSTB95重鏈(SEQ ID NO：40)
Figure 106104421-A0202-12-0062-17
所選VISTA mAb之可變輕鏈區的胺基酸序列
>VSTB50輕鏈(SEQ ID NO：41)
Figure 106104421-A0202-12-0062-18
>VSTB53輕鏈(SEQ ID NO：42)
Figure 106104421-A0202-12-0062-19
>VSTB95輕鏈(SEQ ID NO：43)
Figure 106104421-A0202-12-0062-20
Figure 106104421-A0202-12-0063-21
>VSTB112輕鏈(SEQ ID NO：44)
Figure 106104421-A0202-12-0063-22
>VSTB116輕鏈(SEQ ID NO：45)
Figure 106104421-A0202-12-0063-23
實施例8：抗VISTA抗體之ELISA及FACS篩選
此等實驗用於確定在ELISA中所產生抗體結合人類或獼猴VISTA蛋白之能力，以及使用FACS篩選確定抗體結合表現人類或獼猴VISTA蛋白之K562細胞(人類骨髓性白血病細胞系)的表面上VISTA蛋白之能力。
方法：
ELISA程序概述：在4℃下用1μg/ml SB0361(人類)或SB0361(cyno(獼猴))蛋白塗佈盤隔夜，該等蛋白質為來自各別物種之VISTA的胞外域。將抗體自初始濃度1：4逐步稀釋，稀釋至1μg/ml，總共獲得4種濃度，且在室溫(RT)下培育2小時。使用小鼠抗人類IgG1-HRP(辣根過氧化酶)進行偵測且在室溫下培育1小時。使用PBS-吐溫(0.05%)進行所有洗滌。
FACS程序概述：用5μg/ml各測試抗體對2×105個K562-G8(人類)或K562-C7(獼猴)細胞染色且在4℃下培育30分鐘。使用5μg/ml之山羊抗人類IgG1-PE(藻紅素)抗體作為次級偵測抗體。在BD Fortessa上操作細胞且使用FlowJo軟體(Tree Star,Inc.,Ashlang,OR)分析活群體之MFI(平均螢光強度)。
資料分析/結果：對於各抗體，對於4個分析中之每一者的ELISA與FACS分析，關於抗體是否穩固地結合給出主觀分值(是/否)。若對於任一分析中之結合，抗體給出「否」結果，則重複分析以確認其為陰性。結果展示於下表7及圖19A-19F及20A-20F中。
Figure 106104421-A0202-12-0064-24
Figure 106104421-A0202-12-0065-25
實施例9：使用混合淋巴細胞反應(MLR)及葡萄球菌(STAPHYLOCOCCUS)腸毒素B(SEB)活化分析來篩選抗人類VISTA抗體之結果
此研究之目的為提供如下資料，其在混合淋巴細胞反應(MLR)分析以及葡萄球菌腸毒素B活化(SEB)分析中支持對提高細胞免疫反應之多功能α-VISTA抗體之鑑定。
混合淋巴細胞反應(MLR)為標準免疫分析，其視MHC I類及II類錯配而定來驅動同種異體T細胞反應。自兩個錯配個體分離外周血液單核細胞，一起培育，且由於此等錯配，發生增殖及細胞介素產生。
材料及方法：
藉由組合500ml RPMI與50ml人類AB血清、5ml青黴素/ 鏈黴素(10,000U/ml)、5ml L-麩醯胺酸(100×)及10ml HEPES(1M)製備10% AB培養基。培養基儲存不超過14天。藉由在9.8ml RPMI中稀釋0.2ml胸苷儲備液(1mCi/ml)來製備1mCi氚化胸苷。
在10% AB血清培養基中將可溶性VISTA抗體稀釋至20μg/ml。將100μl適當抗體溶液添加至96孔U底盤(Falcon產品#353077或等效物)之適當孔中。添加各種細胞群體後，最終濃度為10μg/ml。
分離白血球：供體為至少18歲，大體上健康且自當地群體隨機選擇。將供體血液自分離管轉移至50ml錐形瓶。每25ml血液下置放15ml Ficoll 1077，小心使其不與血液混合。在室溫下在不進行制動下將細胞以1250g離心25分鐘。在Ficoll與血清之界面處分離白血球且將細胞稀釋於40ml漢克氏平衡鹽溶液(Hanks Balances Salt Solution，HBSS)中。在4℃下將細胞以453g(1500rpm)離心10分鐘。將細胞再懸浮於50ml HBSS中且藉由將500μl轉移至各別管中計數。
混合淋巴細胞反應(MLR)96孔盤設定：基於待分析之樣品數確定分析所需之「刺激細胞(stimulator cell)」及「反應細胞(responder cell)」的適當數目。將刺激群體以96孔U底盤每孔0.5×105個細胞接種且將反應群體以每孔1.0×105個細胞接種。所有條件必須重複進行三次。將適當數目之「刺激細胞」吸於新錐形瓶中且如先前所述進行離心。將細胞再懸浮於10ml中且用4000拉德(rad)照射。如先前所述將細胞離心，以1×106個/毫升之濃度再懸浮於10% AB血清培養基中且向適當孔中添加50μl。分離所要數目之反應細胞，如先前所述進行離心，以2×106個/毫升之濃度再懸浮於10% AB血清培養基中且向適當孔中添加50μl。在37℃及5% CO2 下培育細胞5天。在第五天，移出30μl上清液以分析干擾素γ(IFN-γ)產生。在第五天，向各孔添加25μl 40μCi/ml氚化胸苷溶液且在37℃及5% CO2下培育8小時。根據製造商之說明將細胞轉移至96孔微閃爍盤中。根據製造商之說明使用微閃爍計數器計數。藉由ELISA(eBioscience目錄號88-7316-88)使用製造商之方案測定IFN-γ濃度。
資料分析：計算未處理孔之平均每分鐘計數(CPM)或IFN-γ濃度。計算各測試組之平均CPM或IFN-γ。將資料組進行Log10轉化。使用各化合物之12個MLR倍數-分值，計算各化合物之12個測試組的平均值：12個實驗之平均分值=Σ[(log10(測試化合物三次重複實驗之平均CPM))-(log10(未處理之三次重複實驗之平均CPM))]/12。
接受準則：在操作分析之前測試所有測試試劑及適當對照之內毒素且含量應<0.1EU/mg。單獨反應細胞之平均CPM計數低於700CPM，指示細胞在單獨培育時靜止。MLR組之CPM為單獨培育之反應細胞之CPM的至少2倍，指示反應發生且供體錯配。所有MLR分析包括人類IgG1陰性對照蛋白。基於使用斯圖登氏t檢驗，人類IgG1陰性對照之結果並非在統計學上不同於未處理之樣品。
MLR中抗VISTA抗體之篩選：初始篩選所有化合物。用抗VISTA抗體操作MLR前，確認抗體結合經細胞結合之VISTA(經由FACS分析)及VISTA蛋白(經由ELISA)。抗體S26(VSTB77)、S30(VSTB86)、S31(VSTB88)、S32(VSTB90)及S39(VSTB74)在此初次篩選中不合格，但仍在分析中測試。出於初步篩選之目的，在MLR中以10μg/ml測試所有抗體，其中量測之參數為增殖及IFN-γ(圖21A-21D及22A-22B)。
選擇前六個抗體。由初始篩選，選擇六個候選物以進行進一步分析：VSTB112(S2)、VSTB116(S5)、VSTB95(S16)、VSTB50(S41)、VSTB53(S43)及VSTB60(S47)。
MLR中前六個候選物之稀釋研究：方案調整。該方案與先前所述相同，但進行一些調整：將抗體稀釋至以下濃度：30、10、3、1、0.3、0.1、0.03、0.01及0μg/ml。
測定IC50值：使用原始CPM計數及IFN-γ濃度來測定各抗體之IC50值。經由使用程式「EZ-R stats.」進行IC50值計算。使用六個個別反應者測定IC50值。在MLR中獲得個別CPM計數及IFN-γ濃度，且對前面之候選物進行劑量滴定。
Figure 106104421-A0202-12-0068-26
結論：初步篩選指示多種VISTA特異性抗體能夠提高MLR細胞免疫反應。隨後基於功效及變化將抗體分級且基於此等結果，選擇VSTB112、VSTB116、VSTB95、VSTB50、VSTB53及VSTB60在劑量滴定實驗中評估。在劑量滴定實驗中，相較於其他五種抗體，VSTB60誘導較弱反應。
葡萄球菌腸毒素B(SEB)活化分析：SEB為誘導特定V β+T細胞活化的細菌超抗原。分離外周血液單核細胞且與培養物中之SFB抗原一起培育，從而誘導穩固細胞介素產生。對前五種候選物進行此分析。
10% AB培養基之製備、1mCi氚化胸苷之製備、可溶性VISTA抗體之製備及白血球之分離均如上文在MLR中描述般進行。
SEB 96孔盤設定：基於待分析之樣品數確定分析所需之反應細胞的適當數目。將反應群體以96孔U底盤每孔2.0×105個細胞接種。所有條件必須重複進行三次。如先前所述將細胞離心且以4×106個/毫升之濃度再懸浮於10% AB血清培養基中且向適當孔中添加50μl。添加50μl 10% AB血清培養基，其含有濃度為40ng/ml之SEB抗原。在所述實驗中，自Sigma Aldrich(目錄號S0812)獲得SEB。孔中之最終濃度為10ng/ml。在37℃及5% CO2下培育細胞3天。在第三天，移出30μl上清液以分析IFN-γ產生。向各孔添加25μl 1mCi/ml氚化胸苷溶液且在37℃及5% CO2下培育8小時。根據製造商之說明將細胞轉移至96孔微閃爍盤中。根據製造商之說明使用微閃爍計數器計數。藉由ELISA(eBioscience目錄號88-7316-88)使用製造商之方案測定IFN-γ濃度。
方案：資料分析。對於所有濃度之各抗體計算平均每分鐘計數(CPM)或IFN-γ濃度。接受準則如先前所述執行。如所述進行IC50值測定。在SEB分析中獲得個別CPM計數及IFN-γ濃度，其中對前面之候選物進行劑量滴定。
Figure 106104421-A0202-12-0069-27
結論：在SEB分析中VISTA特異性抗體以劑量依賴方式提 高細胞介素產生及增殖。來自SEB研究之IC50值一般類似於MLR稀釋研究之結果。
實施例10：抗原決定基分組分析
方法：使用ProteOn XPR36系統(BioRad)執行抗原決定基分組。使用製造商關於胺偶合化學法(BioRad，目錄號176-2410)之說明用兩組6種單株抗體(mAb)塗佈ProteOn GLC晶片(BioRad，目錄號176-5011)。
在室溫下將過量競爭性mAb(250nM最終濃度)與人類VISTA(25nM最終濃度)一起預培育4小時，且在塗有塗佈mAb組之晶片上一次操作6個，其中締合時間為4分鐘，繼而解離5分鐘。各操作後，用100mM磷酸將晶片再生。
資料分析涉及藉由配位體將所有感測器圖譜分組及施加對準嚮導，其自動進行X及Y軸對準及假影移除。隨後對資料施用Interspot校正。
非競爭性mAb定義為結合信號相同或>A1信號(僅結合於人類VISTA)。
競爭性mAb定義為結合信號<<A1信號(亦即僅結合於人類VISTA)。
結果：在圖23中所示之例示性感測器圖譜中，將VSTB85抗體塗佈於Proteon SPR晶片上且使與指定競爭者一起預培育之VISTA蛋白在晶片上經過。VSTB50為非競爭性抗體之實例，因為當操作VISTA/VSTB50複合物時可見陽性反應。與VISTA複合之GG8、VSTB49及VSTB51不結合於晶片上所塗佈之VSTB85，且因此分類為與VSTB85競爭VISTA上之相同 結合位點。
Figure 106104421-A0202-12-0071-28
Figure 106104421-A0202-12-0072-29
實施例11：PROTEON親和力測定
使用抗IgG Fc塗佈之表面在ProteOn晶片上捕捉抗體。測試抗體與VISTA蛋白濃度在0.39nM至100nM範圍內之人類及獼猴(VISTA)胞外域(ECD)的結合。使抗原與塗有抗體之晶片結合/締合4分鐘，隨後監測解離30分鐘。藉由用100mM磷酸處理18秒進行兩次使晶片再生。在25℃下操作所有實驗且將資料擬合至1：1朗格繆爾結合模型(Langmuir binding model)。
實施例12：抗VISTA處理在MB49鼠膀胱腫瘤模型中之作用
方法：
用MB49腫瘤細胞注射C57BL/6小鼠。形成腫瘤後，開始抗VISTA處理。隨後監測腫瘤生長3次/週。根據IACUC法規，在腫瘤之任何尺寸達到15mm後，使小鼠安樂死。
對於各實驗，融化MB49細胞之冷凍小瓶且在具有10%血清及青黴素/鏈黴素抗生素之RPMI 1640(+L-Glut)中生長。培養三天後，使用StemPro Accutase收集細胞且以5×106個細胞/毫升之濃度再懸浮於RPMI中， 且每隻小鼠注射50μl。
6-8週齡雌性C57BL/6小鼠購自國家癌症研究所(National Cancer Institute)。到達後，使其適應一天，隨後刮去其右側腹之毛且將其尾部刺上標記。隨後三-五天後對其進行注射。
腫瘤注射(皮內)：在小鼠經刮毛側腹上皮內(i.d.)注射50μl MB49細胞懸浮液(約250,000個細胞)。
監測腫瘤生長：使用電子測徑規首先跨越最寬尺寸(L)且其次在第一量測之90°角度(W)量測腫瘤生長。腫瘤體積如下獲得：體積=(L 2 * W 2 )/2
在腫瘤直徑達到約5mm(體積約60mm3)後認為形成腫瘤。形成後，開始處理。在處理過程中，每週量測腫瘤生長三次且直至實驗終止。
抗VISTA處理：腹膜內注射10mg/kg嵌合13F3-mIgG2a單株抗體。注射時程為每週三次歷時四週。
小鼠安樂死：按照IACUC要求，在動物腫瘤之最長尺寸達到15mm後，使動物安樂死。
分析功效：使用Excel進行資料管理且使用GraphPad Prism繪圖來分析小鼠腫瘤體積。使用R統計計算軟體的宏進行統計分析。
實驗設計展示於圖24中。
結果：
雌性小鼠之Ch13F3-mIgG2a處理使得70%動物中產生完全腫瘤排斥(CR)且在30%動物(n=7)中產生部分緩解(PR)(表13及圖25B)。 相比之下，所有對照mIgG2a處理小鼠展示腫瘤進行性生長(6/6)(圖25A)。此等資料展現抗VISTA處理可對腫瘤生長具有極大作用。
Figure 106104421-A0202-12-0074-30
人類VISTA序列展示於圖26及27中，自前述Wang等人，2011修改，該文獻之全部內容併入本文中。
實施例13：使用氫/氘(H/D)交換研究進行抗VISTA抗體之抗原決定基定位
為鑑定人類VISTA上針對VSTB50、60、95及112之抗原決定基，使用相應Fab進行溶液氫/氘交換質譜(HDX-MS)。為進行H/D交換，用於分析Fab擾動之程序類似於先前所述(Hamuro等人，J.Biomol.Techniques 14：171-182,2003；Horn等人，Biochemistry 45：8488-8498,2006)，但進行一些修改。在木瓜蛋白酶消化下由IgG製備Fab且使用Pierce Fab製備套組(Thermo Scientific，目錄號44985)捕捉蛋白A。人類VISTA蛋白序列含有六個N連接之糖基化位點。為改良序列覆蓋度，用PNGaseF將蛋白質去糖基化。在氘化水溶液中培育去糖基化VISTA蛋白預定時間，使得在可交換氫原子處併入氘。在4℃下，在46μL氧化氘(D2O)中，使氘化VISTA蛋白與VSTB50、VSTB60、VSTB95或VSTB112之任一Fab複合30秒、2分鐘、10分鐘及60分鐘。藉由降低pH值淬滅交換反應且用胃蛋白酶消化蛋白質。所鑑定肽之氘含量由LC-MS上之質量偏移監測。作為參考對照，類似地處理VISTA蛋白，除了其不與Fab分子複合以外。結合於Fab之區域據推斷為相對不易交 換因此相較於參考VISTA蛋白含有較高分率氘的彼等位點。約94%蛋白質可定位於特定肽。
用VSTB50/VSTB60及VSTB95/VSTB112進行的VISTA的溶液HDX-MS擾動定位分別展示於圖28上圖及下圖中。鑑定兩個抗原決定基。抗VISTA VSTB50與VSTB60一樣識別相同抗原決定基；VSTB95結合於VISTA上VSTB112所結合之另一抗原決定基區域。抗VISTA VSTB50及60共有相同抗原決定基，其包含區段103NLTLLDSGL111(SEQ ID NO：62)及136VQTGKDAPSNC146(SEQ ID NO：63)(圖28上圖)。抗VISTA VSTB95及112似乎以類似抗原決定基為目標，該等抗原決定基包含區段27PVDKGHDVTF36(SEQ ID NO：75)及54RRPIRDLTFQDL65(SEQ ID NO：65)(圖28下圖)。有兩個其他區段展示VSTB95及112產生弱擾動，包括殘基39-52及118-134。然而，降低程度不如不同定位中之前述區域(27-36及54-65)強。儘管展示由VSTB95及112產生強擾動之一種肽100TMR102位於VISTA表面之另一表面上，但其距離抗原決定基區域27-36及54-65很遠。此擾動可能歸因於別位作用。此等HDX-MS結果提供抗VISTA抗體之肽層面抗原決定基。對於此兩種抗原決定基不存在重疊抗原決定基區域。此等結果在其不彼此競爭方面符合前述競爭分組資料。
實施例14：藉由蛋白質結晶學確定人類VISTA ECD：VSTB112 FAB複合物之結構
在致力於確定VISTA結構及描繪定義VISTA細胞外域(ECD)與第一抗體VSTB112之Fab片段之間的相互作用的抗原決定基及互補位中，使複合物結晶且確定結構，解析度為1.85Å。致力於確定與抗體 VSTB112之Fab片段複合的人類VISTA中ECD之結構，以確定VISTA ECD自身之結構與定義用於此相互作用之抗原決定基/互補位。該結構揭示VISTA採用IgV摺疊，其鏈拓撲學類似於TCR V α鏈。除橋接β夾層之背面及正面中的B與F股的標準二硫鍵以外，該結構揭示ECD具有兩個額外二硫鍵，一個將CC'環繫栓於前片，第二個在A'與G'股之間。儘管VISTA分子之間存在晶體接觸，但其為少量的且基於此結構並無VISTA ECD之二聚物的證據。VSTB112抗原決定基經展示包含VISTA BC、CC'及FG環之部分以及正面β片最接近彼等環之殘基(C'CFG)。互補位主要偏向重鏈相互作用，其中CDR L3產生最少接觸。
定義VISTA：VSTB112相互作用之抗原決定基/互補位
VSTB112Fab在結合VISTA ECD時埋藏1024.3 Å2之表面區域，其中埋藏之重鏈表面佔此總數之715.3 Å2。VISTA與VSTB112輕鏈之間形成七個氫鍵及4個鹽橋相互作用，且VISTA與VSTB112重鏈之間形成10個氫及2個鹽橋相互作用。VSTB112識別前片股C'、C、F及G中FG環近端之之殘基以及BC、FG及CC'環中之殘基(圖29及30)。與CC'環之相互作用佔與僅在FG環中具有殘基E125及R127之Fab輕鏈的接觸的大多數，從而產生額外輕鏈相互作用。對應於VISTA FG環之殘基119至127佔結合VSTB112時埋藏之表面區域的總共1034.8 Å2的38%。值得注意地，此環具有高極性，其由以下序列-IRHHHSEHR-(SEQ ID NO：76)組成。另外，VSTB112 CDR H3中之W103很好地針對VISTA殘基H122及H123之主鏈封裝，且VISTA H121為與CDR H2中F55之芳族環之相互作用的邊緣。
藉由結晶學及HDX鑑定之抗原決定基區域的比較展示於圖 31中。
實施例15：藉由抗VISTA抗體活化T細胞及單核球
在兩個試管內分析(混合白血球反應(MLR)及SEB(葡萄球菌腸毒素B))中評估抗VISTA抗體之功能作用。兩個分析均量測T細胞增殖及細胞介素誘導作為其主要讀取結果，但此等作用歸因於不同機制。在MLR中，將來自兩個不同人類供體之外周血液單核細胞(PBMC)一起培育，且一個供體之T細胞與另一供體之樹突狀細胞之間的主要組織相容性複合體(MHC)錯配引起T細胞增殖及干擾素(IFN γ)產生。在SEB分析中，將來自單一供體之PBMC與細菌超抗原一起培育，細菌超抗原直接將抗原呈遞細胞(APC)表面上之MHC II級蛋白連接於T細胞上之T細胞受體(TCR)，從而引起T細胞活化、增殖及細胞介素分泌。在兩種分析中，作為VSTB174母分子之VSTB112展現對T細胞增殖及細胞介素產生的劑量依賴性誘導且在候選物中最有效(圖21A-21D，表12)。
Figure 106104421-A0202-12-0077-31
單核球活化分析
表12中所示之分析資料用VSTB174之母分子VSTB112產生。為充分瞭解VSTB174之活性，進行單核球活化分析。結果展示將 VSTB174與全PBMC一起培育誘導CD14+單核球上活化標記物(CD80及HLA-DR)之上調，從而指示結合於已知表現高水平VISTA之免疫細胞亞群之抗體的作用(圖32)。另一問題為對全PBMC中單核球活化之作用是否可由結合VISTA且具有IgG1 Fc之任何抗體促進。抗體VSTB103及VSTB63以高親和力(分別為KD 6.36E-10及8.30E-10)結合於VISTA，且與VSTB112及VSTB111類似地結合於表現VISTA蛋白之細胞。VSTB103與VSTB112一樣在同一抗原決定基組，而VSTB63在不同抗原決定基組中；兩種抗體均不促進單核球活化。綜合而言，此等結果展示VSTB174可對T細胞活化/增殖發揮其作用的一種機制為經由NK細胞所促進之單核球活化。
製備培養基
將500ml RPMI 1640(Corning，10-040-CV)與50ml人類AB血清(Valley Biomedical公司，批號3C0405)、5ml青黴素/鏈黴素(Lonza，17-602E)(10,000U/ml)、5ml L-麩醯胺酸(100×)(Gibco，25030-081)及10ml HEPES(1M)(Fisher BP299-100，批號-1)組合。將培養基在4℃下儲存不超過14天。
製備可溶性VISTA及對照抗體
在10% AB血清培養基中將抗體稀釋至2×所期望的濃度，VSTB174：批號VSTB174.003。
向96孔U底盤(Falcon，353077)之適當孔中添加100μl適當抗體溶液。以100μl添加各種細胞群體後，各抗體之最終濃度為1、0.1或0.01g/ml。以1μg/ml之最終濃度添加IgG1對照抗體CNTO 3930(批號6405，ENDO<0.1EU/mg)。
分離PBMC。
供體為至少18歲，大體上健康且自當地群體隨機選擇。
將供體血液自分離管轉移至50ml錐形瓶。
在下方置放15ml Ficoll 1077(SIGMA，10771)，小心使其不與血液混合。對每25ml血液進行此操作。
在室溫下在不進行制動下將細胞以1250g離心25分鐘。
在Ficoll與血清之界面處分離白血球且將細胞稀釋於40ml漢克氏平衡鹽溶液(HBSS)中。
將細胞在4℃下以453g(1500rpm)離心10分鐘。
將細胞再懸浮於50ml HBSS中且藉由將500 1轉移至各別微量離心管(eppendorf tube)中計數。
另外，根據製造商之說明(目錄號130-096-537)使用來自Miltenyi之泛單核球分離套組，藉由在數個處理組中陰性選擇來分離CD14+細胞。
試管內培養設定
基於待分析之樣品數確定分析所需之適當細胞數目。將反應群體以96孔U底盤每孔2.0×105個細胞接種。對於CD14陰性選擇群體，接種0.5×105個細胞。所有條件重複進行三次。
如上所述將細胞離心，對於全PBMC群體以2×106個/毫升之濃度且對於CD14陰性選擇群體以0.5×106個/毫升之濃度再懸浮於10% AB血清培養基中，且向適當孔中添加100 1以使各孔中之總體積達200 1。
在37℃及5% CO2下培育細胞1、2或3天。
抗體染色及流式細胞測量術
將96孔U底盤以453g離心5分鐘且移除上清液。
用200μl PBS洗滌細胞且如步驟5.5.1中離心。
丟棄上清液且再懸浮於50μl含有以下抗體之PBS中：
˙CD14-APC(純系HCD14)1：250(Biolegend目錄號325608)
˙HLA-DR-PE Cy7(純系L243)1：250(Biolegend目錄號307616)
˙CD80-PE(純系2D10)1：250(Biolegend目錄號305208)
˙Hu FcR結合抑制劑(eBioscience目錄號14-9161-73)
在黑暗中在濕冰上培育20分鐘。
添加150μl PBS且如步驟5.5.1中離心。
添加150 1 PBS緩衝液且經由FACS進行分析。
在Miltenyi MACSQuant 10參數流式細胞儀上操作樣品且使用FlowJo 9.7.5分析CD14+群體上HLA-DR及CD80之表現。使用螢光強度幾何平均值(MFI)(定義一組數字之中心趨勢的統計參數)作為用於處理比較之指定統計參數。
統計分析
所有統計在Prism GraphPad型號6中進行。在各時間點使用單因子ANOVA在各組間進行成對比較，且對多樣性進行圖基校正(Tukey correction)。所有測試之P值均低於0.05且認為對比為顯著的。對於所有曲線及表格，* p<0.05，** p<0.01，*** p<0.001，****p<0.0001。
實施例16：抗VISTA抗體之ADCC及ADCP活性
VSTB174具有IgG1 Fc，其可賦予抗體依賴性細胞介導之細 胞毒性(ADCC)及抗體依賴性細胞介導之吞噬作用(ADCP)活性。進行兩種類型分析且展示VSTB174可能裂解或吞噬K562-VISTA細胞(圖33-34)，但K562骨髓瘤細胞系母細胞不會(資料未示)。VSTB174調節VISTA之抑制作用的另一作用機制可為表現高水平VISTA之細胞的裂解或吞噬，因此自局部微環境將其移除。
實施例17：其他抗VISTA抗體之ADCP活性
使用試管內吞噬作用分析來研究由抗人類VISTA mAb(VSTB173及VSTB174)提高巨噬細胞介導之異位表現VISTA之細胞的吞噬作用。將此等mAb選殖於不同Fc主鏈(IgG1 WT(野生型)、IgG1 PR(蛋白酶抗性)及IgG2 σ)中，且假定可能對提高吞噬作用具有不同活性。IgG1及IgG1 PR主鏈能夠結合於Fc受體且具有引起ADCP之潛力，而IgG2 σ不結合於Fc受體且不能介導ADCP。
在ADCP分析中用K562母細胞及K562-VISTA目標細胞測試抗VISTA抗體。如圖35-36中所示，VSTB174、VSTB149、VSTB173及VSTB145提高K562-VISTA細胞之hMac吞噬作用。具有不結合Fc受體之IgG2 σ Fc的VISTA抗體VSTB140或VSTB132正如所料不能提高吞噬作用。具有IgG1 Fc之VISTA mAb VSTB174及VSTB173展示相較於具有IgG1PR Fc之VSTB149及VSTB145吞噬作用更穩固(對於EC50值，參見表13及14)。
Figure 106104421-A0202-12-0081-32
Figure 106104421-A0202-12-0081-33
VSTB174及VSTB173展示在最高濃度下微弱地提高K562母細胞之吞噬作用(圖35-36)，其可歸因於K562細胞之VISTA低表現。其他抗VISTA抗體不能提高K562細胞之吞噬作用。
在K562-VISTA吞噬作用分析中各以兩種不同濃度測試陰性對照抗體，但其不誘導任何吞噬作用。此結果指示抗VISTA抗體介導之吞噬作用為特異性地且歸因於K562-VISTA細胞之VISTA抗原表現。
實施例18：其他抗VISTA抗體之ADCC活性
為測試其誘導ADCC之能力，測試以下三種人類抗VISTA抗體：
VSTB174(IgG1)
VSTB149(IgG1 PR)
VSTB174.LF(IgG1 LF(低海藻糖))。
在兩個各別實驗中，以六個不同濃度在同一盤內測試各抗體，重複三次，獲得總共六個資料點。
10、1、0.1及0.01μg/mL之VSTB174、VSTB149及VSTB174.LF各展現可量測之ADCC活性，而僅LF抗體在0.001μg/mL下展現可量測之ADCC活性；在0.0001μg/mL下抗體均不展現ADCC。當此等抗體中之每一者具有IgG1或IgG1變體Fc時，此結果可預期。LF抗體展現增加之ADCC效能，其藉由與常規IgG1抗體曲線(0.02381μg/mL)相比，LF抗體曲線之EC50值較小(0.002293μg/mL)來證明。IgG1 PR抗體曲線之EC50值類似於常規IgG1曲線(0.01846μg/mL)。
表15.如藉由ADCC分析所測定之三種測試抗VISTA抗體之 EC50值(μg/mL).
Figure 106104421-A0202-12-0083-34
在10、1、0.1及0.01μg/mL抗體濃度下，人類IgG1、人類IgG1 PR及人類IgG1 LF抗體均展示可量測之ADCC介導之殺滅作用，而僅LF抗體在0.001μg/mL抗體濃度下展示殺滅作用。抗VISTA抗體在0.0001μg/mL抗體濃度下均不展示殺滅作用。
如EC50值中可見，相較於常規IgG1抗體或IgG1 PR抗體，LF抗體展示約10倍更有效之ADCC殺滅作用。
實施例19：VSTB174對人類及獼猴VISTA之親和力
藉由表面電漿子共振(SPR)法在ProteOn儀器上測定VSTB174對人類及食蟹獼猴VISTA細胞外域(ECD)之親和力。VSTB174對各蛋白質呈現極類似KD值，對於人類ECD為1.56E-10M，且對於獼猴VISTA為8.66E-11M。
實施例20：在鼠腫瘤模型中VISTA抗體展現功效
小鼠品系、試劑及腫瘤模型
為進行活體內研究，使用回交於C57BL/6背景上之人類VISTA嵌入(VISTA-KI)小鼠。
使用接枝於小鼠Fc IgG2a上之VSTB174可變區(VSTB123)產生抗人類VISTA抗體以使得能夠在VISTA-KI小鼠中測試。
在VISTA KI小鼠中評估MB49膀胱癌。
除展現抗VISTA抗體療法抑制野生型小鼠之腫瘤生長的已 公開研究(Le Mercier等人，2014)以外，已用替代性倉鼠抗體使用不同給藥時程在野生型小鼠中及在用VSTB123處理之VISTA-KI小鼠中展現抗腫瘤功效。
在VISTA-KI小鼠中MB49腫瘤模型中之活體內功效研究
在雌性VISTA-KI小鼠中進行MB49功效研究，以在1-10mg/kg範圍內之數個劑量測試VSTB123。在第0天向小鼠皮內注射250,000個MB49腫瘤細胞。在第6天，如圖37中所示開始給藥(10mg/kg同型對照mIgG2a或指定劑量VSTB123；10隻小鼠/組)。
如圖37中所示，在較高與較低劑量下，VSTB123更有效。10mg/kg及7.5mg/kg之劑量等效，而在給予5或1mg/kg之小鼠中腫瘤生長更快速。
實施例21：用抗VISTA抗體偵測人類腫瘤中之VISTA表現
圖1展示AML腫瘤細胞系之VISTA表現-其及圖17中之RNA序列表現資料支持如下想法：VISTA由AML細胞表現，且抗VISTA藥物經由以此等用於免疫調節或抗體介導之殺滅的細胞為目標而有效。
自來自外科切除術之肺腫瘤樣品獲得評估肺癌中之VISTA表現的資料。針對VISTA及多種其他標記物之表現將細胞解離及特性化。結果展示13/13肺腫瘤(鱗狀癌或腺癌)含有CD14+VISTA+骨髓細胞(圖38)。
實施例22：使用抗VISTA抗體偵測肺腫瘤中之VISTA表現
使用純系GG8(一種抗人類VISTA小鼠IgG1)進行免疫組織化學分析。使用此mAb研究非小細胞肺癌(NSCLC)FFPE腫瘤切片中 VISTA之染色。
在染色前用標準抗原修復法處理FFPE腫瘤切片。以1：500稀釋度使用GG8小鼠抗人類VISTA抗體。依序使用兔抗小鼠多株抗體及抗兔聚合物HRP偵測GG8結合。繼而用蘇木精對比染色，隨後對腫瘤切片評分。
肺癌中之VISTA表現主要受限於免疫浸潤(圖39中所示之實例)且高水平之VISTA陽性細胞存在於多個肺癌樣品中。
實施例23：與VSTB174之FAB片段複合的人類VISTA之細胞外域(ECD)的結構
產生VISTA抗原變體且經純化以用於結晶學。內部表現經his標記之重組型VSTB174 Fab且純化。產生晶體且用於使用同步加速器輻射(synchrotron radiation)收集VISTA ECD：VSTB174 Fab複合物之較高解析度資料，且使用同源建模及電子密度分析的組合來解決結構確定(圖29(上圖))。
藉由X射線結晶學確定VISTA ECD：VSTB174 Fab複合物之結構，解析度為1.85Å，得到VISTA ECD之第一結構且描繪VSTB174抗原決定基及互補位。VISTA ECD採用IgV摺疊，其拓撲學類似於CTLA-4 ECD，但具有在β夾層之前片延伸的獨特G'股。A'及G'另外經由A'股中之殘基C12與G'股中之C146之間形成的二硫橋鍵以化學方式繫栓。發現六個半胱胺酸參與三個分子內二硫鍵，且基於晶體接觸，不存在二聚VISTA之證據。
VSTB174識別前片股C'、C、F及G中在FG環近端之殘基以及BC、FG及CC'環中之殘基。
實施例24：抗VISTA抗體所致之單核球活化需要CD16(Fc γ RIII)交聯
本研究經設計以評估抗VISTA抗體活化培養物中之單核球之能力。藉由上調單核球活化之典型標記物CD80、CD86、HLA-DR及PD-L1之表面表現來評估單核球活化。在VSTB174具有活性Fc之條件下，研究抗VISTA介導之單核球活化中CD16及其他Fc受體之作用。特定言之，檢測抗CD16、抗CD32及抗CD64抗體在阻斷抗VISTA介導之單核球活化方面的能力，其中使用VSTB112(HuIgG1活性Fc)或VSTB140(IgG2 σ沉默Fc)來引發單核球活化。可溶性Fc片段亦用於同一分析中以非特異性地阻斷Fc結合。
PBMC(其缺少嗜中性白血球)上之CD16表現典型地受限於NK細胞及發炎性單核球(CD14+/-、CD16+)。去除NK細胞以確定其在抗VISTA誘導之單核球活化中之作用。另外，阻斷能夠使單核球活化之經活化NK細胞之主要產物IFN-γ，以分析其個別貢獻。
方法
製備培養基
在含有10%人類AB血清(Sigma-Aldrich，目錄號H5667)及1%青黴素/鏈黴素(Life Technologies；目錄號15140-122)之RPMI(Life Technologies；目錄號11875-093)中進行所有稀釋及培養。
阻斷抗體
在如所指示之完全培養基中，將抗CD16(Biolegend目錄號302050，純系3G8)、抗CD32(BD目錄號552930，純系FLI8.26)及抗CD64 (Biolegend目錄號305016，純系10.1)稀釋至20μg/ml。亦在完全培養基中將自產之阻斷劑(IHB)稀釋至8mg/mL。
針對所指示之各活化/阻斷條件，在96孔盤上重複三次地塗覆50μl此等儲備液。不含有抗體之50μl培養基用於「無阻斷劑對照」。
細胞製備
在37度水浴中將2小瓶之冷凍PBMC(HemaCare PB009C-1，每小瓶10×106個細胞)/各所指示供體融化，在完全培養基中稀釋至10mL，且在1500RPM下離心5分鐘。
移除含有經稀釋之冷凍培養基之培養基，且用10mL新鮮培養基洗滌細胞且如上短暫離心。在此旋轉之前，針對各樣品，保留10μl樣品。
藉由在錐蟲藍中以1：2稀釋樣品且在CountessTM自動細胞計數器(目錄號C10227)上計數，來確定細胞計數。將細胞以2×106個細胞/毫升的濃度再懸浮於完全培養基中。將100μL此細胞製備物添加至所有實驗孔中。在37℃下培育含細胞/阻斷抗體混合物之盤15分鐘。
活化
在完全培養基中將VSTB112、VSTB140及HuIgG1同型對照(11.76mg/mL)均稀釋至20μg/ml。培育步驟完成後，將50μl活化抗體儲備液添加至含有細胞及阻斷試劑之適當孔中。阻斷抗體及活化抗體之最終濃度為5μg/ml。IHB之最終濃度為2mg/mL。在37℃下培育細胞隔夜(20小時)。
分析
培育後，在1500RPM下使所有實驗盤短暫離心5分鐘。將150μL培養基經由吸液移除且儲存在-80℃下以用於稍後的分析。將150μL FACS緩衝液(Becton Dickinson；目錄號554657)添加至各孔中，藉由吸液混合，且在1500RPM下使樣品再次短暫離心5分鐘。將細胞再懸浮於50uL含有2mg/mL IHB之FACS緩衝液中，且在4℃下在黑暗中培育20分鐘。培育後，將50μl稀釋於FACS緩衝液中之以下染色混合物添加至所有樣品(所有抗體按1：25稀釋)中：CD14-APC(Biolegend，純系HCD14)；CD80-PE(Biolegend，純系CD10)；CD86-FITC(Biolegend，純系IT2.2)；HLA-DR-APCCy7(Biolegend，純系L243)；PD-L1-PeCy7(Biolegend，純系29E2A3)。在4℃下在黑暗中培育樣品30分鐘。培育後，將100μL FACS緩衝液添加至各孔中，且在1500RPM下使盤短暫離心5分鐘。如上所述洗滌細胞1次，且最後根據製造商之說明將其再懸浮於200μL含有Aqua LIVE/DEAD®(LifeTechnologies，目錄號L34957)之FACS緩衝液中。在BD FACSCantoTM II上操作樣品且用FlowJo ver9.2分析。
結果
培養完成後，分析活CD14+細胞之CD80、CD86、HLA-DR及PD-L1之表現(圖40，展示PD-L1表現)。與用HuIgG1同型對照處理之PBMC培養物中之單核球相比，用VSTB112處理之培養物中之單核球具有增加水平之此等標記物中之每一者。此增加之水平在供體間不同(資料未示)。用VSTB140處理之培養物中之單核球不展示升高水平之活化標記物，指示活性Fc域為作用所需(圖40)。此外，向培養物中添加Fc片段之競爭性結合抑制劑(IHB)消除VSTB112介導之活化且在一些情況下完全消除。 此作用不為CD32或CD64依賴性的，因為阻斷此等受體之抗體不阻斷VSTB112介導之單核球活化(資料未示)。
PBMC(其缺少嗜中性白血球)上之CD16表現典型地受限於NK細胞及發炎性單核球(CD14+/-、CD16+)。初始資料已鑑定NK細胞在抗VISTA抗體所致之試管內單核球活化中之作用。NK細胞之缺失或IFN γ受體之阻斷顯著降低抗VISTA誘導之單核球活化之程度，表明NK細胞及IFN γ貢獻於抗VISTA介導之試管內單核球活化(資料未示)。
概言之，使用CD80、CD86、HLA-DR及PD-L1作為單核球活化之標記物，比較非特異性人類IgG1對照抗體(CNTO 3930)與VSTB112(抗體VSTB174之母分子)及其沉默Fc衍生物VSTB140在活化PBMC培養物中之單核球方面的能力。藉由所有參數，VSTB112活化單核球且VSTB140不活化單核球。由於VSTB140不能活化且歸因於可溶性Fc片段部分消除VSTB112之活化能力的能力，因此此活性似乎為Fc依賴性的(圖40，展示PD-L1作為單核球活化之標記物)。另外，此活化視此等培養物中NK細胞之存在及IFN-γ之抗體誘導之產生而定，因為自試管內培養系統移除此等組分中之任一者明顯地減弱單核球活化(資料未示)。如本文所示，活化機制似乎視Fc受體CD16之交聯而定，因為其可藉由添加交聯CD16之抗體、甚至在不存在結合VISTA之抗體下完全且穩固地經模擬。
實施例25：抗VISTA抗體所致之腫瘤生長抑制需要效應功能
T細胞之負調節因子VISTA在許多造血細胞上表現，且在腫瘤微環境中高度表現(Le Mercier，等人，Cancer Research 74(7)：1933-44, 2014)。活體內用抗小鼠VISTA抗體處理具有腫瘤之小鼠顯著地使得腫瘤生長降低(Le Mercier，等人)。
進行此研究以確定抗人類VISTA抗體VSTB123及VSTB124對雄性或雌性hVISTA KI(嵌入)小鼠中之所確立MB49腫瘤之生長的影響。此等小鼠嵌入人類VISTA cDNA來替代小鼠VISTA基因，且在RNA及蛋白質層面上僅表現人類VISTA。MB49腫瘤細胞表現雄性H-Y抗原(Wasiuk等人，Cancer Immunol Immunother 61：2273-82,2012)，其在雄性小鼠中為自體抗原但在雌性小鼠中為外來抗原。當腫瘤之直徑達至3-5mm時開始處理。每週以10及5mg/kg投加抗VISTA或對照抗體3次，共十次劑量。在實驗過程期間，評估所有小鼠組之腫瘤體積、存活率、重量及外周血液中免疫群體之變化。亦評估藥物之藥物動力學(PK)及抗藥物抗體(ADA)開發。
方法
研究設計
在雄性及雌性hVISTA KI小鼠中進行平行且相同之研究。對於各性別，將小鼠分成5組，每組6-7隻小鼠，分別經10或5mg/kg之VSTB123或VSTB124或10mg/kg之mIgG2a對照抗體處理。針對實驗設計，參見圖41。
細胞來源及製備
MB49細胞獲自Dr.R.Noelle之實驗室(最初來自Dr.P.Matzinger)。MB49細胞經過確認無黴漿菌及其他污染物(在IDDEX RADIL下測試之IMPACTTM SC，箱號22209-2014)。使一個細胞小瓶融化且在具有10% FBS及青黴素/鏈黴素抗生素之RPMI 1640(+L-Glut)中生長。 培養三天後，藉由與StemPro® Accutase®一起短暫培育來收集細胞，將其洗滌兩次且以5×106個細胞/毫升再懸浮於冷RPMI中，之後注射於小鼠中。所有培養試劑均購自Gibco及Hyclone。
測試劑及劑量
VSTB123及VSTB124為由Janssen製備之嵌合抗人類VISTA抗體。各者具有衍生自VSTB174但選殖於小鼠IgG2a Fc(VSTB123)或小鼠IgG2a ala/ala沉默Fc(VSTB124)中之相同抗人類VISTA可變區。在PBS中稀釋抗體及mIgG2a(BioXcell BE0085，純系C1.18.14批號5035/0514)對照，且藉由腹膜內注射以0.2ml之體積投予，以遞送10或5mg/kg之劑量。
小鼠
在Sage實驗室(Boyertown,PA)飼養hVISTA KI小鼠。將8-12週齡之小鼠首先在檢疫機構中過渡3週，且隨後轉移至常規機構。讓其適應2天，之後刮去其右側腹之毛且將其尾部刺上標記。稍後注射腫瘤細胞5天。
皮內細胞注射
在小鼠經刮毛右側腹上皮內注射50μl MB49細胞懸浮液(約250,000個細胞)。自實驗移除注射不佳(自注射部位洩漏或皮下注射而非皮內注射)之所有小鼠。
隨機化、處理開始及腫瘤量測
當腫瘤之直徑達至3mm與5mm之間時，在注射後第4天量測大多數雄性小鼠之腫瘤。基於如下觀測：藉由量測或目視檢查大多數小鼠展示腫瘤生長之跡象，將小鼠隨機分配至處理組。在第5天開始處理。 在處理過程中，每週監測腫瘤生長2-3次且直至實驗終止。使用公式(L×W2)/2來確定腫瘤體積(L為腫瘤之長度或最長尺寸，且W為腫瘤之寬度)。
當對於3次連續量測腫瘤為初始體積之一半(或大小更加減小但大於13.5mm3)時，達至部分緩解(PR)。當對於3次連續量測任何腫瘤小於13.5mm3時，達至完全緩解。
結果
如圖42A(左)中所示，相較於對照組，用10mg/kg之VSTB123處理之雌性小鼠展示腫瘤體積顯著地減小。抗體之3次劑量後，可早在第13天偵測到對腫瘤生長之影響。另外，各VSTB123處理組中之一些小鼠展示完全且持久之腫瘤消退：10mg/kg組中5/7隻小鼠，且5mg/kg組中3/6隻小鼠。6隻對照組小鼠均不消退(資料未示)。
在任一劑量下，VSTB124處理不抑制雌性之腫瘤生長(圖42A，右)。由於VSTB123具有可結合於Fc受體之小鼠IgG2a，而VSTB124具有沉默Fc，因此此結果表明Fc結合對於此模型中之功效為重要的。
持續52天地監測小鼠之存活率(圖42B)。對於雌性小鼠，更難以比較存活率，因為52天時六隻對照動物中之兩隻仍存活。然而，用10mg/kg之VSTB123處理之7/7隻小鼠在第52天存活(p=0.0108)，而用5mg/kg之VSTB123處理之4/6隻小鼠在該天仍存活。用VSTB124處理雌性小鼠未使存活率得到提高。
如本文所展現，具有MB49腫瘤之雌性hVISTA KI小鼠中，在85%(5/7隻小鼠)之組中，在10mg/kg下，用VSTB123處理引起完全緩解(CR)，其中存活率顯著增加(p=0.0108)；在3/6隻小鼠(50%)中，5mg/kg 之VSTB123處理引起CR。相反，VSTB124不顯著影響腫瘤之生長或存活。與VSTB123之結果相比較，此結果表明MB49模型中使用抗VISTA抗體之功效可能需要活性Fc。
實施例26：VSTB174觸發細胞介素之釋放
如藉由共刺激標記物(諸如CD80及HLADR)之上調所量測，抗VISTA抗體誘導全PBMC培養物中之CD14+單核球之活化。本研究確定了用抗VISTA抗體VSTB174培養之人類PBMC培養物中之細胞介素之變化(若存在)。
單核球為先天性白細胞，其代表藉由Ficoll密度離心分離之約10-30%之外周血液。已展示基於單核球表現之共刺激蛋白質及細胞介素之水平，單核球在發炎性及抗炎性反應兩者中起重要作用。如藉由細胞表面上之共刺激標記物(諸如CD80及HLA-DR)之上調所量測，抗VISTA抗體(包括VSTB174)活化全PBMC培養物中之CD14+單核球。為判定該分析中抗VISTA抗體處理是否將改變細胞介素之產生，用VSTB174處理全PBMC24小時，且藉由Luminex®分析上清液之41種細胞介素之不同表現。
如本文所示，在試管內，抗人類VISTA抗體VSTB174與全PBMC之培養使得人類PBMC中許多細胞介素之表現顯著增加。
方法
製備培養基
將500ml RPMI 1640(Corning，10-040-CV)與50ml人類AB血清(Valley Biomedical公司，批號3C0405)、5ml青黴素/鏈黴素(Lonza，17-602E)(10,000U/ml)、5ml L-麩醯胺酸(100×)(Gibco，25030-081)及10 ml HEPES(1M)(Fisher BP299-100，批號-1)組合。將培養基在4℃下儲存不超過14天。
製備抗VISTA VSTB174及對照抗體
在10% AB血清培養基中將抗體稀釋至2×所期望的濃度。向96孔底盤(Falcon，353077)之適當孔添加100μl適當抗體溶液。添加100μl細胞後，各抗體之最終濃度為10、1、0.1或0.01μg/ml。以10μg/ml之最終濃度添加IgG1對照抗體CNTO 3930(批號6405，ENDO<0.1EU/mg)。各條件重複進行三次。
分離PBMC
供體為至少18歲，大體上健康且自當地群體隨機選擇。對於此研究，三種供體提供PBMC。將供體血液自分離管轉移至50ml錐形瓶。在下方置放15ml Ficoll 1077(SIGMA，10771)，小心使其不與血液混合。對每25ml血液進行此操作。在室溫下在不進行制動下將細胞以1250g離心25分鐘。在Ficoll與血清之界面處分離白血球且將細胞稀釋於40ml漢克氏平衡鹽溶液(HBSS)中。將細胞在4℃下以453g(1500rpm)離心10分鐘。將細胞再懸浮於50ml HBSS中且藉由將500μl轉移至各別微量離心管中計數。
試管內培養設定
基於待分析之樣品數確定分析所需之適當細胞數目。將PBMC以96孔U底盤每孔2.0×105個細胞接種。所有條件以技術方式重複進行三次。
將細胞在4℃下以453g(1500rpm)離心10分鐘，且以2× 106個/毫升之濃度再懸浮於10% AB血清培養基中，且向適當孔中添加100μl以使各孔中之總體積達200μl。在37℃及5% CO2下培育細胞24小時。收集100μl上清液以藉由Luminex®分析。
多重分析
使用Millipore人類細胞/化學MAG預混合41 Plex套組(目錄號HCYTMAG-60K-PX41,EMD Millipore公司，Billerica,MA)量測細胞介素。用三倍稀釋步驟在與樣品相同之基質中製備重組型細胞介素標準物之校準曲線。包括高尖峰及低尖峰(來自經刺激之人類PBMC及樹突狀細胞之上清液)以確定細胞介素恢復。以技術方式重複三次地量測標準物及品質對照，各重複三次之測試樣品量測一次，且自所有讀數減去空白值。所有分析直接在96孔過濾盤(Millipore,Billerica,MA)中在室溫下進行且避光。簡言之，將孔與100μl含有1% BSA之PBS預濕潤，隨後以100μl之最終體積添加珠粒以及標準物、樣品、尖峰或空白，且在室溫下在連續震盪下一起培育30分鐘。用100μl含有1% BSA及0.05%吐溫20之PBS洗滌珠粒三次。在室溫下在連續震盪下將經生物素標記之抗體之混合物(50微升/孔)添加至珠粒中，以進行30分鐘培育。洗滌珠粒三次，隨後添加抗生蛋白鏈菌素-PE，持續10分鐘。再次洗滌珠粒三次且將其再懸浮於125μl含有1% BSA及0.05%吐溫20之PBS中。使用Bio-Plex®陣列讀取器量測珠粒之螢光強度。具有五參數曲線擬合之Bio-Plex®管理者(Manager)軟體用於資料分析。
統計分析
以R統計計算語言進行所有統計。將低於偵測之細胞介素 濃度值(<OOR)重新按比例調整至最低可偵測濃度，且將高於精確定量之值(>OOR)重新按比例調整至最大線性可定量濃度。在統計分析之前基於格拉布氏(Grubbs)p<0.05及距離組平均值大於1標準差之離群值距離，使用單一步驟移除統計離群值。在各時間點使用單因子ANOVA在圖基可靠顯著差異下，進行組間之成對比較。所有測試之P值均低於0.05且認為對比為顯著的。對於所有曲線及表格，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。使用熱圖用細胞介素之完全層級聚類產生圖43。g圖中之雙函數以R形式封裝。
結果
為確定抗VISTA抗體對全PBMC之作用，將不同濃度之VSTB174添加至細胞培養物中，持續24小時，且分析上清液之41種細胞介素之水平。用VSTB174處理之全PBMC在大量細胞介素之表現方面具有統計學上顯著之增加，該等細胞介素中之多者標準地由單核球及顆粒球細胞表現(圖43)。在由VSTB174驅動之反應之強度方面，各供體PBMC反應為唯一的。與供體3相比，供體1及2展示更多種分析物顯著增加(圖43)。此外，當所有三個供體展示特定分析物顯著增加時，供體3之超過基線之倍數變化通常最低(資料未示)。
當藥物在0.1-10μg/ml之間存在時，最可能偵測到VSTB174之作用，其中在0.01μg/ml下很少的分析物顯著上調(圖43)。
針對所有供體顯著高於IgG1對照之細胞介素為以下各者：IL-6、TNF α、MCP-3、MDC、MIP-1 β、IP-10、IL-1R α、GM-CSF、IL-12p70及GRO。
一些細胞介素僅在供體1及2中顯著升高：MIP-1 α、IL-1 β、RANTES、G-CSF、IL-1 α、IL-7、IL-12p40、IL-13、IFN γ、TNF β、IFN α(在供體3中升高，但仍接近於基線)、IL-4、IL-10、FGF-2、弗拉塔凱、VEGF、IL-17、Flt3L、IL-9、TGF α、IL-15、EGF及PDGF-α α。
兩種細胞介素MCP-1及IL-8僅在供體3中顯著升高。對於供體1及2，此等細胞介素之基線水平高於可在分析中定量之範圍，因此有可能地在VSTB174處理下分析物變得較高，但其不可量測(列舉為OOR>)。對於供體3，MCP-1及IL-8之基線及處理水平在分析之動態範圍內。
在VSTB174處理下與任何供體中之基線相比，數種細胞介素未變化：sCD40L、伊紅趨素、IL-5、PDGF-β β、IL-2、IL-3。在用藥物處理之供體1中，IL-2、IL-3及sCD40L顯著升高，但IL-2及IL-3之水平仍保持極低。在0.1μg/ml劑量下且非在任何其他劑量下，sCD40L僅在供體1中變得較高。
如本文所展現，在多種人類供體樣品中，VSTB174以劑量依賴性方式誘導PBMC之許多細胞介素之經增強產生。
此外，雌性hVISTA KI小鼠中之活體內研究亦展示回應於VSTB123，促炎性細胞介素(例如MCP-1、IP-10、IL-8、IL-6、MIP-1b、IL-10、IL-7、IFN-γ、G-CSF、RANTES、IL-15、TNF α、IL-1 β、MIP-1a、IL-1a、GM-CSF、IL-12p40、IL-13及/或伊紅趨素)之產生增加。特定言之，已展示上調之細胞介素涉及骨髓細胞之補充、遷移或活化。植入有MB49腫瘤細胞之hVISTA KI小鼠以及未處理hVISTA KI小鼠均展示類似之細胞介素釋放特徵(資料未示)。
實施例27：VSTB123誘導CD80+巨噬細胞遷移至腫瘤環境
VISTA為在大多數造血細胞上表現之T細胞之負調節因子。進行本研究以鑑定回應於用抗人類VISTA抗體VSTB123或VSTB124之處理，具有MB49腫瘤之hVISTA KI小鼠中免疫群體數目及活化表型之變化。hVISTA KI小鼠嵌入人類VISTA cDNA來替代小鼠VISTA基因，且先前經確認在RNA及蛋白質層面上僅表現人類VISTA。MB49腫瘤細胞表現雄性H-Y抗原，其在雄性小鼠中為自體抗原但在雌性小鼠中為外來抗原，且在腫瘤微環境中高度表現。如本文所示，具有腫瘤之小鼠之回應為以下方面：用VSTB123或VSTB124處理後骨髓浸潤增加，且在VSTB123處理下在腫瘤浸潤性巨噬細胞上CD80活化標記物之表現增加。
方法
研究設計
將hVISTA KI小鼠分成3組，各組有5隻雌性小鼠。在第0天在各小鼠右側腹上注射MB49腫瘤細胞。在第7、9及11天，用10mg/kg之mIgG2a對照抗體、VSTB123或VSTB124注射小鼠。在第12天，使小鼠安樂死且藉由多個參數分析血液、脾及腫瘤。圖44A說明此實驗設計。
小鼠
在Sage實驗室(Boyertown,PA)飼養hVISTA KI小鼠。將8-12週齡之小鼠首先在檢疫機構中過渡3週，且隨後轉移至常規機構。讓其適應2天，之後刮去其右側腹之毛且將其尾部刺上標記。稍後注射腫瘤細胞5天。
細胞來源及製備
MB49細胞獲自Dr.R.Noelle之實驗室(最初來自Dr.P.Matzinger)。MB49細胞經過確認無黴漿菌及其他污染物(在IDDEX RADIL下測試之IMPACTTM SC，箱號22209-2014)。使一個細胞小瓶融化且在具有10% FBS及青黴素/鏈黴素抗生素之RPMI 1640(+L-Glut)中生長。培養三天後，藉由與StemPro® Accutase®一起短暫培育來收集細胞，將其洗滌兩次且以5×106個細胞/毫升之濃度再懸浮於冷RPMI中，且每小鼠注射50ml(2.5×105個細胞)。所有培養試劑均購自Gibco及Hyclone。
皮內細胞注射
在小鼠經刮毛側腹上皮內注射50ml MB49細胞懸浮液(約250,000個細胞)。自實驗移除注射不佳(自注射部位洩漏或皮下注射而非皮內注射)之所有小鼠。
測試劑及給藥
VSTB123及VSTB124由Janssen產生。VSTB123為抗人類VISTA抗體，其由muIgG2a Fc骨架上之VSTB174可變區組成。VSTB124為抗人類VISTA抗體，其由具有使Fc沉默之ala/ala突變的muIgG2a Fc骨架上之VSTB174可變區組成。對照小鼠抗體(mIgG2a)由BioXcell產生，純系C1.18.4，批號5386-2/1014，8.4mg/ml 1×於PBS中。
在PBS中將抗體稀釋至1mg/ml以用於給藥。用0.2ml之體積腹膜內注射小鼠，以遞送10mg/kg之最終濃度。如圖44A中所概述，腫瘤注射後，小鼠在第7、9及11天接受抗體療法。
組織收集
按照Dartmouth IACUC方案使用CO2使小鼠安樂死。藉由心 臟穿刺使小鼠放血且收集血液。解剖脾及腫瘤。
根據製造商之說明使用HBSS中之膠原蛋白酶(1mg/ml，Sigma Aldrich)及溫和MACSTM解離劑(Miltenyi Biotec)來解離脾。使細胞通過40μm過濾器，隨後在3ml ACK裂解緩衝液(Lonza，批號0000400419)中經歷紅血細胞裂解，持續5分鐘。在HBSS中洗滌1次後，將細胞再懸浮於PBS中且免疫染色。
根據製造商之說明，使用腫瘤解離套組及溫和的MACSTM解離劑(Miltenyi Biotec)解離腫瘤。解離以下，使細胞通過40μm過濾器，隨後使用ACK裂解緩衝液經歷紅血細胞裂解。在HBSS中洗滌1次後，將細胞再懸浮於所追蹤體積之PBS中且免疫染色。
藉由機械中斷且通過40μm過濾器來製備引流淋巴結之單細胞懸浮液。洗滌細胞，計數，且再懸浮於RPMI中。
使血液樣品短暫離心以分離血漿及全血細胞。收集血漿，且隨後冷凍且保持在-80℃下以用於細胞介素及ANA ELISA分析。使全血細胞在3ml ACK裂解緩衝液(Lonza，批號0000400419)中經歷紅血細胞裂解，持續5分鐘。在HBSS中洗滌1次後，將細胞再懸浮於PBS中且用於免疫染色。
流式細胞測量術
在4℃下用抗鼠CD16/32(Miltenyi)(1：200)Fc阻斷單細胞懸浮液15分鐘。將細胞與PBS中所稀釋之抗體混合物一起培育30分鐘。在PBS中洗滌2次後，在冰上將細胞再懸浮於固定/滲透工作溶液(eBioscience)中30分鐘。使細胞旋轉，丟棄上清液且再懸浮於PBS中且 培育隔夜。
骨髓組：
- 活/死黃(Life Technologies)(1：1000)
- Ly6G-FITC(Biolegend，1A8)(1：200)
- CD45-PE(Biolegend，30-F11)(1：800)
- CD80-PE/CF594(BD Biosciences，16-10A1)(1：200)
- Ly6C-PerCP/Cy5.5(Biolegend，HK1.4)(1：100)
- CD11c-PE/Cy7(Biolgend，N418)(1/200)
- MHC II類-Alexa Fluor 647(Biolegend，M5/114.15.2)(1/400)
- CD86-Alexa Fluor 700(Biolegend，GL-1)(1/200)
- F4/80-APC/Cy7(Biolegend，BM8)(1/200)
- CD11b-BrV421(Biolegend，M1/70)(1/100)
沖洗細胞且在Gallios10色流式細胞儀上操作。在活/死及陽性CD45染色上對所有細胞設門。顆粒球為CD11b+、Ly6G+及Ly6C-。單核球為CD11b+、Ly6G-及Ly6C+。巨噬細胞為CD11b+、Ly6G-、Ly6C-及F4/80+。樹突狀細胞在Ly6G-、Ly6C-、CD11c+上設門且為CD11b培養基或為高的。使用FlowJo分析流式細胞測量術。
統計分析
所有統計在Prism GraphPad型號6中進行。對於各條件，使用ANOVA在圖基校正下比較值。在所有情況下，對經mIgG2a對照處理之動物進行比較。藉由星號使用GraphPad標準概述顯著性，其中一個星號指示*P<0.05，兩個**指示P<0.01，三個***指示P<0.001，且四個****指示 P<0.0001。
結果
分析自抗VISTA或對照抗體處理之動物之側腹解剖的腫瘤，以藉由流式細胞測量術確定對細胞群體之影響。針對活化標記物CD80、CD86及MHC II類之表現的抗VISTA誘導之變化，檢測腫瘤浸潤性巨噬細胞。圖44B說明流式細胞測量術分析之結果。無關於處理，腫瘤浸潤性巨噬細胞比脾巨噬細胞表現更高水平之CD86(資料未示)，但取決於抗VISTA處理而不進一步上調CD86。相反，CD80表現在用VSTB123處理之hVISTA KI小鼠之腫瘤浸潤性巨噬細胞上顯著增加，但在用VSTB124處理之彼等者上不如此(圖44B)。
實施例28：VSTB123誘導MPO+細胞遷移至腫瘤微環境
進行本研究以鑑定回應於用抗人類VISTA抗體VSTB123或VSTB124之處理，具有MB49腫瘤之hVISTA KI小鼠中腫瘤環境中之變化(若存在)。如本文所示，VSTB123誘導髓過氧化酶染色之細胞遷移至腫瘤環境。
方法
如實施例27中所述處理之具有MB49腫瘤之hVISTA KI小鼠死亡後，快速解剖腫瘤及脾。隨後將腫瘤及脾樣品置於盒中且在室溫下於10%福馬林中固定2-3週(且典型地固定4天或更少天數)，隨後在PBS中簡單洗滌且轉移並保持於70%乙醇(Fisher Scientifics)中，之後轉移至Dartmouth之蓋澤爾醫學院(Geisel School of Medicine)之病理學轉譯研究核心(Pathology Translational Research Core)，在其中樣品經石蠟包埋，切片且 隨後染色。
使用Leica BOND RX自動染色機將經石蠟包埋之組織切片(4μm)染色。脫蠟後，使切片經歷抗原修復(Bond抗原決定基修復溶液2，100℃，20分鐘)，且在室溫下於Leica稀釋劑中與初級抗體(參見下表17中之稀釋度)一起培育30-60分鐘。隨後在PBS中洗滌載片3次，每次洗滌5分鐘，且與二級抗體(來自Leica Bond精簡偵測套組，DS9800)一起培育。在PBS中最終洗滌3次後，將切片與DAB(Leica Bond聚合物偵測套組)一起培育，沖洗，用蘇木精對比染色且安放。
用Leica(Aperio® AT2，SCN400)全載片掃描儀掃描載片。使用HALO軟體(Indica實驗室)定量全載片掃描。
Figure 106104421-A0202-12-0103-35
結果
如本文所述掃描髓過氧化酶(MPO)染色之載片，且在Aperio® ImageScope中評估。十二個腫瘤樣品(6個mIgG2a，6個VSTB123腫瘤)以單獨及聚集體形式目測到。MPO染色之陽性細胞在形態上與嗜中性白血球一致。在IgG處理之對照中，MPO細胞展示緻密但局部之邊界清楚的簇，其位於整個腫瘤組織中。典型地，此等緻密聚集體圍繞單脂肪細胞。在VSTB123處理之腫瘤中觀測到更多的MPO陽性細胞，展示與mIgG2a對照相比腫瘤軟組織中更廣泛之浸潤性分佈。
實施例29：VSTB174誘導血液中短暫之嗜中性白血球減少
藉由靜脈內快速注射向食蟹獼猴投予VSTB174(CNTO 8548)1個月，以評估潛在毒性且評估毒性之潛在可逆性(若存在)。量測臨床病理學參數(例如血液學)，包括紅血細胞質量及全血細胞計數。如本文所示，VSTB174誘導循環嗜中性白血球之短暫減少。
方法
出於此研究之目的，本文所述之程序應用於所有動物直至第36天。
測試物：VSTB174，50mg/ml，維持在-70℃下且避光。在每日給藥時，自冷凍儲存移出儲備測試物之新小瓶，平衡大約1小時至環境室溫，且溫和地旋動小瓶(非震盪或渦旋)以混合溶液，直至其為均質的。測試物之標稱濃度(50mg/mL)用於稀釋計算，以製備劑量溶液。藉由用對照物(0.9%氯化鈉)稀釋測試物同時在生物安全罩下來製備調配物。經由0.22微米針筒過濾器(PVDF膜)過濾最終測試物調配物，且保持不超過4小時，之後填充適當大小之注射器以用於給藥。針對待投予之體積，注射器大小儘可能最小。在製備之4小時內使用所製備的給藥注射器。製備程序維持於原始資料中。丟棄殘餘體積。
對照物：注射用之0.9%氯化鈉，USP；批號P326603，儲存在室溫下。
實驗設計展示於表18中。
Figure 106104421-A0202-12-0105-36
測試物及對照物之投予
經由在5週裏(亦即第1、8、15、22及29天)每週一次地(總計5次劑量)靜脈內(緩慢推注)注射於適合外周靜脈中，來向組1、2、3及4中之適當動物投予測試物或對照物。各動物之劑量體積基於至給藥之前的天數所獲得之最近體重量測。暫時限制動物之劑量投予且不給其服鎮靜劑。拋棄式無菌注射器用於各動物/劑量。給藥之第一天指定為第1天。
樣品收集
藉由靜脈穿刺收集血液。處理前及屍體解剖當天藉由自特定不鏽鋼籠罐排出來收集尿液。當籠罐收集不成功時，在屍體解剖時藉由膀胱穿刺術(cystocentesis)收集尿液。收集後，將樣品轉移至適當實驗室以供處理。在臨床化學血液收集之前使動物禁食。如下收集樣品：第(-2)週、第(-1)週、第1天(給藥後4小時)、第2天、第4天、第8天(預)、第15天(預)、第22天(預)、第29天(給藥後4小時)、第31天、第34天、第6週、第7週及第8週。
血液學
分析血液樣品之嗜中性白血球數(絕對值)。由各血液學樣 品製備血液塗片。將血液塗片標記、染色、儲存且存檔。
結果
一般而言，在水平
Figure 106104421-A0202-12-0106-188
30mg/kg/週下，在食蟹獼猴中，藉由每週一次地靜脈內(緩慢推注)注射5週(亦即第1、8、15、22及29天)(總計5次劑量)投予VSTB174一般具有良好耐受性。在100mg/kg/週下，嗜中性白血球在第2天開始明顯減少，第29天逐漸返至基線，隨後在第31及34天發生給藥後減少(圖46)。
本文所引用之所有專利、公開申請案及參考文獻之教示內容以全文引用之方式併入。
雖然本發明已參照其實施例具體實例經特定展示及描述，但熟習此項技術者應理解，在不脫離由隨附申請專利範圍涵蓋的本發明之範圍之情況下，可在其中進行形式及細節之各種改變。
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 61
Figure 106104421-A0305-02-0136-102
Figure 106104421-A0305-02-0137-19
<210> 62
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 62
Figure 106104421-A0305-02-0137-104
<210> 63
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 63
Figure 106104421-A0305-02-0138-105
<210> 64
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人
<400> 64
Figure 106104421-A0305-02-0138-106
<210> 65
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 65
Figure 106104421-A0305-02-0138-108
<210> 66
<211> 309
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 66
Figure 106104421-A0305-02-0138-109
Figure 106104421-A0305-02-0139-21
<210> 67
<211> 311
<212> PRT
<213> 智人
<400> 67
Figure 106104421-A0305-02-0139-110
Figure 106104421-A0305-02-0140-22
<210> 68
<211> 312
<212> PRT
<213> 紅大袋鼠
<400> 68
Figure 106104421-A0305-02-0140-112
Figure 106104421-A0305-02-0141-23
<210> 69
<211> 310
<212> PRT
<213> 海豚
<400> 69
Figure 106104421-A0305-02-0141-113
Figure 106104421-A0305-02-0142-24
<210> 70
<211> 288
<212> PRT
<213> 原雞
<400> 70
Figure 106104421-A0305-02-0142-116
Figure 106104421-A0305-02-0143-25
<210> 71
<211> 261
<212> PRT
<213> 非洲爪蟾
<400> 71
Figure 106104421-A0305-02-0143-117
Figure 106104421-A0305-02-0144-26
<210> 72
<211> 315
<212> PRT
<213> 斑胸草雀
<400> 72
Figure 106104421-A0305-02-0144-118
Figure 106104421-A0305-02-0145-27
<210> 73
<211> 275
<212> PRT
<213> 斑馬魚
<400> 73
Figure 106104421-A0305-02-0145-119
<210> 74
<211> 293
<212> PRT
<213> 紅鰭東方豚
<400> 74
Figure 106104421-A0305-02-0146-121
<210> 75
<211> 168
<212> PRT
<213> 智人
<400> 75
Figure 106104421-A0305-02-0147-122
<210> 76
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 76
Figure 106104421-A0305-02-0147-123
<210> 77
<211> 169
<212> PRT
<213> 智人
<400> 77
Figure 106104421-A0305-02-0147-126
Figure 106104421-A0305-02-0148-28
<210> 78
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 78
Figure 106104421-A0305-02-0148-127
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<210> 79
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 79
Figure 106104421-A0305-02-0149-130

Claims (25)

  1. 一種與T細胞活化之V域Ig抑制因子(VISTA)蛋白結合之抗體或其抗原結合片段之用途，其係用於製造用於在個體中減少循環嗜中性白血球數目的醫藥品，其中該抗體或其抗原結合片段包含：(a)抗體VH域，其包含具有SEQ ID NO：25之胺基酸序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO：26之胺基酸序列的VH CDR2及具有SEQ ID NO：27之胺基酸序列的VH CDR3，及(b)抗體VL域，其包含具有SEQ ID NO：28之胺基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO：29之胺基酸序列的VL CDR2及具有SEQ ID NO：30之胺基酸序列的VL CDR3。
  2. 如申請專利範圍第1項之用途，其中循環嗜中性白血球數目之減少為短暫的。
  3. 如申請專利範圍第1項之用途，其中：(a)所述抗體VH域與SEQ ID NO：37具有約90%的一致性；且(b)所述抗體VL域與SEQ ID NO：44具有約90%的一致性。
  4. 如申請專利範圍第1項之用途，其中：(a)所述抗體VH域與SEQ ID NO：37具有約95%的一致性；且(b)所述抗體VL域與SEQ ID NO：44具有約95%的一致性。
  5. 如申請專利範圍第1項之用途，其中：(a)所述抗體VH域與SEQ ID NO：37具有約97%的一致性；且(b)所述抗體VL域與SEQ ID NO：44具有約97%的一致性。
  6. 如申請專利範圍第1項之用途，其中：(a)所述抗體VH域與SEQ ID NO：37具有約99%的一致性；且(b)所述抗體VL域與SEQ ID NO：44具有約99%的一致性。
  7. 如申請專利範圍第1項之用途，其中：(a)所述抗體VH域包含SEQ ID NO：37的胺基酸序列；且(b)所述抗體VL域包含SEQ ID NO：44的胺基酸序列。
  8. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該抗體或其抗原結合片段包含與免疫細胞上之Fc受體結合的Fc區。
  9. 如申請專利範圍第8項之用途，其中該Fc受體為CD16受體。
  10. 如申請專利範圍第8項之用途，其中該Fc區為IgG1 Fc區。
  11. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該抗體或其抗原結合片段包含IgG1κ恆定區。
  12. 如申請專利範圍第1項之用途，其中所述抗體或其抗原結合片段包含：(a)包含SEQ ID NO：61的胺基酸序列之抗體重鏈；及(b)包含SEQ ID NO：56的胺基酸序列之抗體輕鏈。
  13. 如申請專利範圍第1項之用途，其中所述抗體或其抗原結合片段包含：(a)包含SEQ ID NO：55的胺基酸序列之抗體重鏈；及(b)包含SEQ ID NO：56的胺基酸序列之抗體輕鏈。
  14. 如申請專利範圍第1項至第13項中任一項之用途，其中該個體為哺乳動物。
  15. 如申請專利範圍第14項之用途，其中該哺乳動物為人類。
  16. 如申請專利範圍第14項之用途，其中該哺乳動物為非人類之靈長類。
  17. 如申請專利範圍第14項之用途，其中該哺乳動物為嚙齒動物。
  18. 一種鑑定與VISTA蛋白結合且減少循環嗜中性白血球數目之抗體的方法，該方法包含：a)提供第一血液樣本與第二血液樣本，第一血液樣本是來自經投予抗VISTA抗體或其抗原結合片段的第一個體，第二血液樣本是來自未經投予該抗體或其抗原結合片段的第二個體；及b)使用試管內分析來測定第一血液樣本中的嗜中性白血球數目相較於第二血液樣本是否減少。
  19. 如申請專利範圍第18項之方法，其中該抗VISTA抗體或其抗原結合片段包含與免疫細胞上之Fc受體結合之Fc區。
  20. 如申請專利範圍第19項之方法，其中該Fc受體為CD16受體。
  21. 如申請專利範圍第19項之方法，其中該Fc區為IgG1 Fc區。
  22. 如申請專利範圍第19項之方法，其中該抗體或其抗原結合片段包含IgG1κ恆定區。
  23. 如申請專利範圍第18項至第22項中任一項之方法，其中該抗VISTA抗體或其抗原結合片段包含：(a)抗體VH域，該抗體VH域包含具有SEQ ID NO：25之胺基酸序列之VH CDR1、具有SEQ ID NO：26之胺基酸序列之VH CDR2及具有SEQ ID NO：27之胺基酸序列之VH CDR3，及(b)抗體VL域，該抗體VL域包含具有SEQ ID NO：28之胺基酸序列之VL CDR1、具有SEQ ID NO：29之胺基酸序列之VL CDR2及具有SEQ ID NO：30之胺基酸序列之VL CDR3。
  24. 如申請專利範圍第18項之方法，其中該試管內分析為免疫組織化學(IHC)染色分析、血液塗片染色或流式細胞測量術分析。
  25. 如申請專利範圍第18項之方法，其中循環嗜中性白血球數目之減少為短暫的。
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