KR20160129698A - 항-b7-h5 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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리에핑 첸
셍 야오
린다 리우
솔로몬 랭거맨
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메디뮨 엘엘씨
더 존스 홉킨스 유니버시티
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Abstract

본 발명은 B7-H5:CD28H 경로의 B7-H5 리간드에 면역특이적으로 결합할 수 있는 항체 및 이의 항원 결합 단편 및 다른 분자, 및 자가면역 질환, 이식 거부 및 다른 염증성 질환의 치료 및 진단에 있어서의 이러한 분자들의 용도에 관한 것이다.

Description

항-B7-H5 항체 및 이의 용도{ANTI-B7-H5 ANTIBODIES AND THEIR USES}
연방정부 지원 연구 또는 개발에 대한 진술
본 발명은 미국 국립 보건원(NIH)의 수여 번호 RO1 CA9785 및 RO1 A172592, 및 미국 국립 암 센터(NCI)의 수여 번호 U19 CA113341 하의 정부 지원으로 수행되었다. 미정부는 본 발명의 일정 권리를 갖는다.
서열 목록에 대한 참조
본 출원은 서면 및 컴퓨터 판독 매체 둘 모두로 개시되고, 그러한 서면 및 컴퓨터 판독 개시물을 그들 전체로 참조하여 본원에 편입시키는, 37 C.F.R. § 1.821 et seq.에 따른 1 이상의 서열 목록을 포함한다.
발명의 분야
본 발명은 B7-H5:CD28H 경로의 B7-H5 리간드에 결합할 수 있는 항체 및 그들의 항원 결합 단편 및 다른 분자, 및 자가면역 질환, 이식 거부 및 다른 염증성 질환의 치료 및 진단에 있어서의 그러한 분자의 용도에 관한 것이다.
인간 및 다른 포유동물의 면역계는 감염 및 질환에 대한 보호성을 제공하는 책임이 있다. 이러한 보호성은 체액성 면역 반응 및 세포 매개 면역 반응 둘 모두에 의해 제공된다. 체액성 반응은 외래 표적(항원)을 인식하여 중화시킬 수 있는 항체 및 다른 생체분자의 생성을 일으킨다. 대조적으로, 세포 매개 면역 반응은 T 세포에 의한 대식 세포, 자연 살해 세포(NK), 및 항원-특이적 세포독성 T-림프구의 활성화, 및 항원 인식에 대응한 다양한 사이토카인의 방출을 포함한다(Dong, C. et al. (2003) "Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules," Immunolog. Res. 28(l):39-48).
항원에 대한 면역 반응을 최적으로 매개하기 위한 T 세포의 능력은 2가지 구별되는 신호전달 상호작용을 필요로 한다(Viglietta, V. et al. (2007) "Modulating Co-Stimulation," Neurotherapeutics 4:666-675; Korman, A.J. et al. (2007) "Checkpoint Blockade in Cancer Immunotherapy," Adv. Immunol. 90:297-339). 첫번째는, 항원-제시 세포(APC) 표면 상에 배열된 항원이 항원-특이적 나이브 CD4+ T 세포에게 제시되어야만 한다. 이러한 제시는 제시된 황원에 특이적인 면역 반응을 T 세포가 개시시키도록 지시하는 T 세포 수용체(TCR)를 통해 신호를 전달한다. 두번째, APC 및 개별적인 T 세포 표면 분자 간 상호작용을 통해 매개되는, 일련의 공자극성 및 공억제성 신호가 먼저 T 세포의 활성화 및 증식을 촉발시키고 궁극적으로 그들의 억제를 야기시킨다. 따라서, 제1 신호는 면역 반응에 특이성을 부여하는 한편 제2 신호는 반응의 성질, 크기 및 기간을 결정하는 역할을 한다.
면역계는 공자극성 및 공억제성 리간드와 수용체에 의해 엄격하게 제어된다. 이들 분자는 T 세포 활성화를 위한 제2 신호를 제공하고 양성 및 음성 신호의 균형잡힌 네트워크를 제공하여 감염에 대한 면역 반응을 최대화하는 한편 자기에 대한 면역성을 제한한다(Wang, L. et al. (March 7, 2011) "VISTA, A Novel Mouse Ig Superfamily Ligand That Negatively Regulates T Cell Responses," J. Exp. Med. 10.1084/jem.20100619: l-16; Lepenies, B. et al. (2008) "The Role Of Negative Costimulators During Parasitic Infections," Endocrine, Metabolic & Immune Disorders - Drug Targets 8:279-288). 특히 항원 제시 세포의 B7.1(CD80) 및 B7.2(CD86) 리간드와 CD4+ T-림프구의 CD28 및 CLTA-4 수용체 간 결합이 중요하다 (Sharpe, A.H. et al. (2002) "The B7-CD28 Superfamily," Nature Rev. Immunol. 2: 1 16-126; Dong, C. et al. (2003) "Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules," Immunolog. Res. 28(l):39-48; Lindley, P.S. et al. (2009) "The Clinical Utility Of Inhibiting CD28-Mediated Costimulation," Immunol. Rev. 229:307-321). CD28에 B7.1 또는 B7.2의 결합은 T 세포 활성화를 자극하고; CTLA4에 B7.1 또는 B7.2의 결합은 이러한 활성을 억제한다(Dong, C. et al. (2003) "Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules," Immunolog. Res. 28(l):39-48; Lindley, P.S. et al. (2009) "The Clinical Utility Of Inhibiting CD28-Mediated Costimulation," Immunol. Rev. 229:307-321; Greenwald, R.J. et al. (2005) "The B7 Family Revisited," Ann. Rev. Immunol. 23:515-548). CD28은 T 세포 표면 상에서 항상적으로 발현(Gross, J., et al. (1992) "Identification And Distribution Of The Costimulatory Receptor CD28 In The Mouse," J. Immunol. 149:380-388)되는 반면, CTLA4 발현은 T 세포 활성화 후 신속하게 상향조절된다(Linsley, P. et al. (1996) "Intracellular Trafficking Of CTLA4 And Focal Localization Towards Sites Of TCR Engagement," Immunity 4:535-543). CTLA4가 보다 높은 친화성 수용체(Sharpe, A.H. et al. (2002) "The B7-CD28 Superfamily," Nature Rev. Immunol. 2: 116-126)이므로, 결합은 우선 T 세포 증식(CD28을 통함)을 개시시키고, 이어서 그를 억제(CTLA4의 초기 발현에 의함)하여, 증식이 더 이상 필요하지 않을 때 그 효과를 약화시킨다.
CD28 수용체의 리간드에 대한 추가 조사는 일련의 관련 B7 분자("B7 수퍼패밀리")의 동정 및 특징규명을 이끌었다(Coyle, A.J. et al. (2001) "The Expanding B7 Superfamily: Increasing Complexity In Costimulatory Signals Regulating T Cell Function," Nature Immunol. 2(3):203-209; Sharpe, A.H. et al. (2002) "The B7-CD28 Superfamily," Nature Rev. Immunol. 2: 116-126; Greenwald, R.J. et al. (2005) "The B7 Family Revisited," Ann. Rev. Immunol. 23:515-548; Collins, M. et al. (2005) "The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands," Genome Biol. 6:223.1-223.7; Loke, P. et al. (2004) "Emerging Mechanisms Of Immune Regulation: The Extended B7 Family And Regulatory T Cells." Arthritis Res. Ther. 6:208-214; Korman, A.J. et al.(2007) "Checkpoint Blockade in Cancer Immunotherapy," Adv. Immunol. 90:297-339; Flies, D.B. et al. (2007) "The New B7s: Playing a Pivotal Role in Tumor Immunity," J. Immunother. 30(3):251-260; Agarwal, A. et al.(2008) "The Role Of Positive Costimulatory Molecules In Transplantation And Tolerance," Curr. Opin. Organ Transplant. 13:366-372; Lenschow, D.J. et al. (1996) "CD28/B7 System of T Cell Costimulation," Ann. Rev. Immunol. 14:233-258; Wang, S. et al. (2004) "Co-Signaling Molecules Of The B7-CD28 Family In Positive And Negative Regulation Of T Lymphocyte Responses," Microbes Infect. 6:759-766). 현재는 이 패밀리의 하기 9개 구성원이 알려져 있다: B7.1(CD80), B7.2(CD86), 유도성 공자극인자 리간드(ICOS-L, B7-H2), 프로그램밍된 사멸-1 리간드(PD-L1; B7-H1), 프로그래밍된 사멸-2 리간드(PD-L2; B7-DC), B7-H3, B7-H4(또한 B7x, B7-H6 및 B7S1이라고도 함; Sica, G.L. et al. (2003) "B7-4, A Molecule Of The B7 Family, Negatively Regulates T Cell Immunity", Immunity 18:849-861; Zang, X. et al. (2003) B7x: A Widely Expressed B7 Family Member That Inhibits T Cell Activation," Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 100: 10388-10392; Prasad, D.V. et al. (2003) B7S1, A Novel B7 Family Member That Negatively Regulates T Cell Activation," Immunity 18:863-873), B7-H6(Collins, M. et al. (2005) "The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands," Genome Biol. 6:223.1-223.7) 및 B7-H5(Flajnik, M.F. et al. (2012) "Evolution Of The B7 Family: Co-Evolution OfB7H6 And Nkp30, Identification Of A New B7 Family Member, B7H7, And Of B7's Historical Relationship With The MHC," Immunogenetics 64:571-590). B7 패밀리 유전자는 후천성 면역계의 조절에서 필수적이다. 대부분의 B7 패밀리 구성원은 면역글로불린 수퍼패밀리(IgSF)의 가변성(V)-유형 및 불변성(C)-유형 도메인 둘 모두를 함유한다.
B7 리간드는 항원 제시 세포(APC)를 포함한 많은 상이한 세포 유형의 세포 표면 상에서 발현되고 T 세포 상의 수용체 분자와 그들의 상호작용은 T 세포 활성화 및 내성을 조절하는 활성화 및/또는 억제성 신호를 제공한다(Collins, M. et al. (2005) "The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands," Genome Biol. 6:223.1-223.7). 일부 억제성 B7 리간드는 또한 종양 세포 상에서 발현되어서, 면역 반응의 억제를 야기한다(Keir, M.E. et al. (2008) "PD-1 And Its Ligands In Tolerance And Immunity," Annu. Rev. Immunol. 26:677-704; Zou, W. et al. (2008) "Inhibitory B7-Family Molecules In The Tumour Microenvironment, " Nat. Rev. Immunol. 8:467-477). 따라서, B7 리간드 및 그들 수용체의 상호작용의 자극 또는 약화는 자가면역 질환, 암 및 감염성 질환에 대한 치료적 가능성을 보유한다(WO 2011/020024; Flajnik, M.F. et al. (2012) "Evolution Of The B7 Family: Co-Evolution Of B7H6 And Nkp30, Identification Of A New B7 Family Member, B7H7, And Of B7's Historical Relationship With The MHC," Immunogenetics 64:571-590).
염증성 질환 또는 자가면역 질환의 치료에 있어 모든 종래의 진보에도 불구하고, 이러한 병태의 치료를 위한 향상된 면역요법을 제공할 수 있는 조성물에 대한 필요성이 존재한다. 본 발명은 염증성 질환, 자가면역 질환, 및 과활성 면역계를 특징으로 하는 유사한 질환 및 병태를 치료하는데 사용되는 그러한 조성물 및 그들의 용도에 관한 것이다.
B7-H5:CD28H 경로의 B7-H5 리간드에 면역특이적으로 결합할 수 있는 항체 및 그들의 항원 결합 단편 및 다른 분자, 및 자가면역 질환, 이식 거부 및 다른 염증성 질환의 치료 및 진단에서 그러한 분자들의 용도를 제공한다.
일 실시양태는 포유동물 B7-H5(구체적으로 인간 B7-H5)에 면역특이적으로 결합하는 항체 또는 항체의 항원 결합 단편을 갖는 다른 분자를 제공한다. B7-H5는 예를 들면, 생세포 표면 상에 배열된다.
예시적인 생세포는 제한없이, 대식 세포 또는 수지상 세포를 포함한다.
다른 실시양태는 B7-H5에 면역특이적으로 결합하고 CD28H와 B7-H5의 상호작용을 실질적으로 차단할 수 있는 분자를 제공한다. 또 다른 실시양태는 B7-H5에 면역특이적으로 결합하고 CD28H와 B7-H5의 상호작용을 실질적으로 차단할 수 없는 분자를 제공한다.
B7-H5 결합 분자는 6개의 CDR을 함유하는 항원 결합 단편을 가질 수 있다. CDR은 항-B7-H5 항체: 2D3 및 18C3의 CDR 중 적어도 하나의 공통 CDR을 포함하고, 나머지 모든 CDR은
(A) 항-B7-H5 항체 2D3의 3개 경쇄 및 3개 중쇄 CDR; 또는
(B) 항-B7-H5 항체 18C3의 3개 경쇄 및 3개 중쇄 CDR
에서 선택된다.
다른 실시양태는 B7-H5 결합 분자를 제공하고, 여기서 6개 CDR은
(A) 항-B7-H5 항체 2D3의 3개 경쇄 및 3개 중쇄 CDR; 또는
(B) 항-B7-H5 항체 18C3의 3개 경쇄 및 3개 중쇄 CDR이다.
일부 실시양태에서, 분자는 2 또는 그 이상의 상이한 B7-H5 항체 유래의 항원 결합 단편(Fab)을 포함하는 키메라 항체이다.
B7-H5 결합 분자는 단일클론 항체, 인간 항체, 키메라 항체 또는 인간화 항체이고/이거나 이중특이성, 삼중특이성 또는 다중특이성 항체이다.
B7-H5 결합 분자는 검출 가능하게 표지화되거나 또는 접합 독소, 약물, 수용체, 효소, 또는 수용체 리간드를 포함한다.
또 다른 실시양태는 임의의 상기 기술된 B7-H5 결합 분자의 치료적 유효량 또는 예방적 유효량, 및 생리적으로 허용되는 담체 또는 부형체를 함유하는 약학 조성물을 제공한다.
다른 실시양태에서, CD28H와 B7-H5의 상호작용을 실질적으로 차단할 수 있는 분자는 CD28H 융합 단백질, 바람직하게는 CD28H-Ig 융합 단백질이다.
질환의 치료에서 약학 조성물을 사용하는 방법을 또한 제공한다.
피험체에서 질환을 진단하는 방법은 임의의 상기 기술된 B7-H5 결합 분자에 결합하는 그들의 능력에 대해 피험체의 세포를 분석하는 단계를 포함하고, 여기서 이 방법은 피험체에서 질환의 존재를 진단하기 위한 세포학적 분석법을 제공한다.
개시된 B7-H5 결합 분자는 자가면역 질환 또는 이식 거부에 사용될 수 있다.
도 1은 B7-H5 및 이의 대항-수용체, CD28H에 대한 개략도를 제공한다.
도 2는 패널 A-J에서, B7-H5가 대식 세포 상에서 항상적으로 발현되고 수지상 세포에서 유도성임을 도시한다.
도 3은 패널 A-D에서, CD28H가 T 세포 및 자연 살해(NK) 세포 상에서는 발현되지만, B 세포에서는 발현되지 않음을 도시한다.
도 4a-4b는 CHO 형질감염체에 의해 발현된 인간 B7-H5에 결합하는 클론 2D3 및 18C3에 의해 생성된 항체의 능력을 도시한다.
도 5a-5c는 B7-H5:CD28H 상호작용을 차단하는 단리된 항체 및 대조군 Ig의 능력을 도시한다.
도 6은 T 세포 반응을 자극하는 B7-H5 Ig 융합체의 능력을 도시한다.
도 7은 사이토카인: IL-2, IFN-γ 및 IL-10의 발현을 유도하는 B7-H5의 능력을 도시한다.
도 8은 본 발명의 항-B7-H5 항체 2D3가 B7-H5에 결합할 수 있어서 그 CD28H 대항-수용체와 상호작용하는 B7-H5의 능력을 차단할 수 있음을 도시한다.
도 9는 동종이계 T 세포 반응을 억제하는 항-B7-H5 항체 2D3의 능력을 도시한다.
도 10a 및 도 10b은 인간 PBMC가 이식된 NSG 마우스의 비장(도 10a) 및 말초혈액(도 10b)에서 활성화(CD45RO+) 인간 T 세포 중 CD28H+ 세포의 비율에 대한 항-인간 B7-H5 항체의 효과를 도시한 도면이다.
도 11a 및 도 11b는 인간 PBMC가 이식된 NSG 마우스의 비장(도 11a) 및 말초혈액(도 11b)에서 나이브(CD45RO-) 인간 T 세포 중 CD28H+ 세포의 비율에 대한 항-인간 B7-H5 항체의 효과를 도시한 도면이다.
도 12a-12c은 재조합 항-인간 B7-H5 키메라 항체(2D3 및 18C3)의 결합 특성을 도시한다. 도 12a-12c는 CHO 세포에 의해 발현된 인간 B7-H5에 결합하는, 그들의 쥣과동물 IgG 이소타입에서 인간 IgG4 이소타입으로 재조합적으로 전환시킨 항-인간 B7-H5 항체(2D3 및 18C3)의 능력을 도시한다.
도 13(패널 A-C)은 CHO B7-H5 형질감염체와 CD28H 융합 단백질의 결합을 완벽하게 차단하는 재조합 항-인간 B7-H5 키메라 항체(2D3 및 18C3)의 능력을 도시한다. 인간 B7-H5 FL CHO 형질감염체는 대조군 상등액(패널 A) 또는 재조합 키메라 2D3(패널 B) 및 18C3 상등액(패널 C)과 사전항온반응되고 이후 바이오틴화 CD28HhIg 융합 단백질로 염색된다.
도 14a-14b는 항-인간 B7-H5 항체(2D3 및 18C3)의 에피토프 인식 부위를 도시한다. 도 14a 및 도 14b는 2D3 및 18C3이 B7-H5의 제1 IgG 도메인을 인식함을 보여준다. 도 14c는 B7-H5 IgV 도메인이 CD28H와 B7-H5의 상호작용을 매개함을 보여준다.
도 15는 CHO 세포의 표면 상에 발현시 인간 B7-H5와의 결합에 대한 항체 2D3 및 18C3의 친화성을 비교한 도면이다.
도 16a-16b는 TT-특이적 기억 T 세포의 소환에 대한 내생성 B7-H5:CD28H 상호작용의 효과를 도시한다. 도 16a는 항체 2D3(패널 B) 또는 대조군 Ig(패널 A)를 차단하는 B7-H5:CD28H 상호작용의 존재에서 TT 백신-유도된 T 세포 증식을 도시한다. 도 16b는 발현된 사이토카인의 수준(패널 A) 및 이러한 반응과 연관된 BrdU-양성 세포(패널 B)를 도시한 도면이다.
도 17a-17b는 2D3에 의한 내생성 B7-H5:CD28H 상호작용의 차단이 인간화 NSG 마우스의 CD8+(도 17a, 패널 A-B) 및 CD4+(도 17b, 패널 A-B) T 세포 둘 모두의 동종이계 증식성 반응을 억제함을 도시한다.
도 18은 TCR 및 B7-H5 융합 단백질의 동시 가교가 자극 후 30분에 AKT 인산화를 유도하는 반면, TCR 가교 단독은 최소 AKT 인산화를 유도함을 도시한다. 중요하게, B7-H5 공자극을 의미하는, B7-H5 항체 2D3 방해된 AKT 활성화의 내포가 T 세포 반응을 촉진하는 AKT 경로를 활용한다.
도 19는 디코이 수용체 융합 단백질 CD28HIg에 의한 B7-H5-CD28H 경로 차단이 B7-H5 형질감염된 624Mel 흑색종 세포주에 대한 동종이계 CD8 T 세포의 세포독성 사멸 활성을 억제함을 보여주고, 이는 B7-H5-CD28H 경로가 표적 세포에 대한 CD8 T 세포의 세포독성 사멸 활성을 촉진함을 의미한다.
도 20a-b는 가용성 재조합 인간 IL-2 존재 하에서 자연 살해 세포(NK) 상의 CD16 및 B7-H5 융합 단백질의 동시 가교가 NK 활성화 및 탈과립화(CD107a 표면 상향조절)를 유도하는 한편, CD16 단독 관여는 유의한 NK 탈과립화를 유도하지 않았다. B7-H5 융합 단백질 용량 의존적 NK 활성화가 관찰되었다(도 20a). 중요하게, B7-H5 항체 2D3의 내포는 NK 활성화(도 20b)를 방해하여서, B7-H5가 NK 활성화를 공자극함을 시사하였다.
본 발명은 B7-H5:CD28H 경로의 B7-H5 리간드에 면역특이적으로 결합할 수 있는 항체 및 그들의 항원 결합 단편 및 다른 분자, 및 자가면역 질환, 이식 거부 및 다른 염증성 질환의 치료 및 진단에서 그러한 분자의 용도에 관한 것이다.
B7-H5:CD28H 경로는 리간드 B7-H5 및 그의 대항-수용체 CD28H(도 1)를 포함하는 세포 면역 경로이다. B7-H5는 항원 제시 세포 상에서 발현되고, 대식 세포 상에서는 항상 발현되고 수지상 세포 상에서는 유도성이다(도 2, 패널 A-J). CD28H는 특히 나이브 T 세포, NK 세포, 및 형질세포양 수지상 세포(특히 비장, 림프절 및 흉선)에서 발현되고, 이의 발현은 성숙 또는 활성화 세포에서 하향 조절된다. γδ T 세포 또는 B 세포(도 3)에서는 발현되지 않지만, Tn, TCM, TEM, 및 TEMRA T 세포 서브셋에서는 발현된다. 인간 제대혈 T 세포는 CD4+, CD8+ 및 CD4+/CD8+ 흉선세포가 그러한 것처럼 CD28H를 발현한다. B7-H5는 CD28H 대항-수용체와 상호작용하여 면역계를 자극하여서, 강화된 면역 반응을 촉진시킨다. CD28H의 하향 조절은 생체내에서 활성화/기억 T 세포 생존을 손상시키는 것으로 확인되었다. 따라서, B7-H5와 CD28H의 상호작용은 생체내에서 천연 T 세포 프라이밍 및 활성화/기억 T 세포 생존에 중요하다. CD28H는 또한 만성적 항원 노출/소모 T 세포에서 하향 조절되는 것으로 확인되었다. CD28H는 자연 살해 세포(NK) 상에서 항상적으로 발현된다. B7-H5-CD28H 경로는 다른 NK 활성화 신호, 예컨대 CD16 가교 존재 하에서 NK 활성화 및 탈과립화를 촉진한다.
본 발명은 부분적으로, 분자, 예컨대 B7-H5에 면역특이적으로 결합하는 항체 및 그들의 항원 결합 단편("항-B7-H5 항체"), 및 특히 B7-H5:CD28H 상호작용을 차단하여 CD28H에 결합하는 B7-H5의 능력을 손상(즉, 예방 또는 약화)시키는 항-B7-H5 항체 또는 디코이 수용체 융합 단백질 CD28HIg가 CD28H 상호작용을 통해 강화된 면역 반응을 촉진하는 B7-H5의 능력을 손상시켜서, T 세포 증식 및 사이토카인 생성 및 NK 활성화의 길항제로서 작용할 수 있다는 인식을 반영한다. 이러한 분자는 면역계 활성화의 생리학적 감소를 매개할 수 있고 따라서 염증성 질환 및 자가면역 질환의 치료에서 유용하다. 구체적으로, 이러한 항체는 생체 내에서 활성화된 T 세포 및 NK 세포의 비율을 감소시킬 수 있다.
A. B7-H5
B7-H5 아미노산 서열은 기능이 알려지지 않은(Flajnik, M.F. et al. (2012) "Evolution Of The B7 Family: Co-Evolution Of B7H6 And Nkp30, Identification Of A New B7 Family Member, B7H7, And Of B7's Historical Relationship With The MHC," Immunogenetics 64:571-590), 이전에 발견된 인간 유전자, HHLA2와 유사한 것으로 확인되었다(human endogenous retrovirus-H long terminal repeat-associating protein 2(HHLA2); Mager, D.L. et al. (1999) "Endogenous Retroviruses Provide The Primary Polyadenylation Signal For Two New Human Genes (HHLA2 And HHLA3," Genomics 59:255-263). B7-H5는 또한 본원과 그외에서 B7-H7이라고도 한다. 따라서, 용어 B7-H5 및 B7-H7은 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
인간 B7-H5 서열은 닭, 주머니쥐, 유제 동물(예를 들어, 말, 돼지), 연어, 및 상어에서 동족체가 있는 것으로 확인되었다. 그러나, 오직 위유전자만이 설치류(마우스 및 래트)에서 동정되었다. 이 유전자의 아미노산 서열은 Ig 수퍼패밀리 도메인에 대한 기존 잔기의 보존과 함께, 모든 종에서 유사한 도메인 구조가 밝혀졌다.
인간 B7-H5 폴리펩티드는 길이가 414 아미노산이고 다음을 함유하는 것으로 보고되었다: 신호 서열, 3 면역글로불린 유사(Ig-유사) 도메인을 갖는 세포외 도메인, 경막 도메인, 및 세포질 도메인. 구체적으로, 인간 B7-H5 폴리펩티드는 Ig-유사 V형 1 도메인, Ig-유사 C-1형 도메인, 및 Ig-유사 V형 2 도메인을 함유하는 것으로 보고되었다. B7-H5의 다수의 천연 발생 변이체가 존재한다(예를 들면, 수탁 번호 Q9UM44-1(호모 사피언스), NP_009003(GL5901964, 호모 사피언스), 및 AAD48396(GI: 15726285, 호모 사피언스); WO 201 1/020024를 참조함).
용어 "천연-B7-H5"(또한 "천연-B7-H7")는 미성숙 또는 전구체 및 성숙한 형태를 포함한, 임의의 천연 발생 B7-H5 아미노산 서열을 의미한다. 대표적인 인간 B7-H5의 아미노산 서열, 수탁 번호 Q9UM44-1은 다음과 같다(서열번호 1):
Figure pct00001
인간 B7-H5는 다음을 함유하는 것으로 보고되었다: 서열번호 1의 대략 아미노산 잔기 1 내지 22에 신호 서열, 서열번호 1의 대략 아미노산 잔기 61 내지 131에 Ig-유사 V형 1 도메인(상기에 밑줄로 표시), 서열번호 1의 대략 아미노산 잔기 138 내지 222에 Ig-유사 C-1형 도메인, 서열번호 1의 대략 아미노산 잔기 235 내지 328에 Ig-유사 V형 2 도메인, 및 서열번호 1의 대략 아미노산 잔기 345 내지 365에 경막 도메인. 인간 B7-H5 폴리펩티드에 대해 예상되는 이량체 계면은 서열번호 1의 아미노산 잔기 141-144, 156, 158, 160, 162, 193-196, 198, 200, 201, 224, 및 225이다. 인간 B7-H5 폴리펩티드에 대해 예상되는 N-연결 글리코실화 부위는 서열번호 1의 아미노산 잔기 90, 103, 및 318이다. 인간 B7-H5 폴리펩티드의 천연 변이는 BOT, N344K, 및 S346R(UniProt Q9UM44)를 포함한다(WO 2011/020024를 참조하며, 이 참조문헌은 인간 B7-H5의 구조 및 서열에 대한 그 교시를 전체로 참조하여 본원에 편입시킴).
인간 B7-H5(서열번호 1)를 코딩하는 DNA 서열은 하기 서열(서열번호 2)이다:
Figure pct00002
Figure pct00003
대표적인 인간 B7-H5 IgV 도메인 인간 IgG4 융합 단백질의 아미노산 서열은 하기 서열(서열번호 3)이다(B7-H5 서열은 굵게 표시하였고, IgG4 서열은 밑줄 표시하였음):
Figure pct00004
융합 단백질은 부가적으로 N-말단 리더 서열을 포함할 수 있다(서열번호 1의 이러한 잔기 1-22, 즉 천연 발생 B7-H5 리더 서열(서열번호 4):
Figure pct00005
천연 발생 B7-H5 리더 서열을 코딩하는 DNA 서열은 하기 서열(서열번호 5)이다:
Figure pct00006
B7-H5 서열이 본 발명에 따라서, 인간 IgG4 영역에 융합되어 표시되었지만, 이러한 서열은 대안적으로 임의의 IgG 이소타입, 또는 아니면 임의의 다른 단백질에 융합될 수 있다.
인간 B7-H5IgV-hIgG4(서열번호 3)을 코딩하는 DNA 서열은 하기 서열(서열번호 6)이다:
Figure pct00007
Figure pct00008
B7-H5의 세포외 도메인을 포함하는, 대표적인 인간 B7-H5 인간 IgG4P 융합 단백질의 아미노산 서열은 하기 서열(서열번호 24)이다(B7-H5 ECD aa1-340을 갖는 B7-H5ECD-hIgG4P는 밑줄 표시하였고, 세린228의 프롤린으로의 돌연변이는 이중밑줄 표시하였음).
Figure pct00009
신호 서열은 천연 신호 서열(서열번호 29)일 수 있다:
Figure pct00010
융합 단백질은 핵산 서열(서열번호 25)에 의하 코딩된다:
Figure pct00011
Figure pct00012
광범위하게 발현되는 인간 B7-H4와 대조적으로, 인간 B7-H5는 보다 제한된 발현을 나타내는 것으로 확인되었다(예를 들면, 소화관, 신장, 폐, 상피 세포 및 림프구에서 발현됨). 인간 HHLA2는 염색체 3ql3.33 근처 B7.1 및 B7.2에서 발견되었다. B7-H5는 대식 세포에서 항상적으로 발현되고 수지상 세포(CD)에서는 유도적이다.
B. CD28H
본원 및 그외에서 H7CR이라고도 하는 CD28H는 B7-H5에 대한 대항-수용체이다. 따라서, 용어 CD28H 및 H7CR은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 본원에서 사용되는, 용어 "천연 CD28H"(또한 "천연 H7CR")는 B7-H5의 천연 발생 대항-수용체, 또는 이의 변이체를 의미한다. CD28H는 T 세포, NK 세포, 및 형질세포양 수지상 세포에 의해 발현된다. 인간 CD28H 폴리펩티드는 문헌/데이타베이스(Rahimi, N. et al. (Epub 2012 Mar 14) "Identification Of IGPR-1 As A Novel Adhesion Molecule Involved In Angiogenesis," Molec. Biol. Cell. 23(9): 1646-1656)에서 경막 및 면역글로불린 도메인 함유 2(TMIGD2)라고하지만 CD28H의 기능은 이전에 밝혀지지 않았다. 이러한 천연 CD28H 분자의 아미노산 서열에 대한 수탁 번호의 비제한적인 예에는 Q96BF3-1(호모 사피언스), Q96BF3-2(호모 사피언스), NP_653216.1(GL21389429; 호모 사피언스) 및 NP_653216.2(GI:281306838; 호모 사피언스)가 포함된다. 천연 CD28H 분자의 대표적인 아미노산 서열(Q96BF3-2)은 하기 서열번호 7로 제공된다:
Figure pct00013
인간 CD28H(서열번호 7)를 코딩하는 DNA 서열은 하기 서열(서열번호 8)이다:
Figure pct00014
C. 정의
본원에서 사용하는 바와 같이, 그러한 결합이 그 동족 항원에 대한 항체의 특이성 및 친화성을 나타내면 분자가 제2 분자에 "면역특이적으로 결합"할 수 있다고 한다. 그러한 결합이 면역글로불린 분자의 항원 인식 부위를 수반하면 항체가 항원(구체적으로 항원 B7-H5)의 표적 영역 또는 입체구조("에피토프")에 "면역특이적으로 결합"할 수 있다고 한다. 특정 항원에 면역특이적으로 결합하는 항체는 다른 항원이 예를 들어 면역분석법, BIACORE® 분석법, 또는 다른 당분야에 알려진 분석법을 통해 결정된 항원 인식 부위에 의해 인식되는 일부 서열 또는 입체구조 유사성을 갖는 경우 낮은 친화성으로 그 다른 항원에 결합할 수도 있지만, 완전히 관련없는 항원에는 결합하지 않는다. 그러나, 바람직하게는, 항체(및 그들의 항원 결합 단편)은 다른 항원과 교차 반응하지 않는다. 항체는 또한 항원 인식 부위에 관여하지 않는 분자의 도메인/다른 영역 내 결합 도메인, 예컨대 Fc 영역을 통해, 면역특이적이지 않은 방식으로, 다른 분자, 예컨대 FcR 수용체에 결합할 수도 있다.
결합 또는 나타난 효과와 관련하여 사용되는 용어 "실질적으로"는 관찰된 효과와 생리학적으로 또는 치료적으로 관련있음을 의미하려는 것이다. 따라서, 예를 들면, 분자는 그 차단 정도가 생리학적으로 또는 치료적으로 관련있다면(예를 들면, 그러한 정도가 60%가 넘게 완전하거나, 70%가 넘게 완전하거나, 75%가 넘게 완전하거나, 80%가 넘게 완전하거나, 85%가 넘게 완전하거나, 90%가 넘게 완전하거나, 95%가 넘게 완전하거나, 또는 97%가 넘게 완전하면) B7-H5의 활성을 실질적으로 차단할 수 있다. 유사하게, 분자는 면역특이성 및 특징이 60%가 넘게 동일하거나, 70%가 넘게 동일하거나, 75%가 넘게 동일하거나, 80%가 넘게 동일하거나, 85%가 넘게 동일하거나, 90%가 넘게 동일하거나, 95%가 넘게 동일하거나, 또는 97%가 넘게 동일하면, 다른 분자와 실질적으로 같은 면역특이성 및/또는 특징을 갖는다고 할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "피험체"는 포유동물, 예컨대 비영장류(예를 들어, 소, 돼지, 말, 고양이, 개, 래트 등) 및 영장류(예를 들면, 원숭이 및 인간), 가장 바람직하게는 인간을 의미하고자 한다. 용어 "환자"는 진단, 치료 또는 예방 목적으로, 본 발명의 조성물을 받은 피험체를 의미하고자 한다.
본원에서 사용하는 용어 "항체"는 "가변 영역" 항원 인식 부위를 보유하는 면역글로불린 분자를 의미하고자 한다. 용어 "가변 영역"은 면역글로불린의 그러한 도메인과 항체에 의해 광범위하게 공유되는 도메인(예컨대 항체 Fc 도메인)을 구분하고자 한다. 가변 영역은 그 잔기가 항원 결합을 책임지는 "초가변 영역"을 포함한다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR" 유래의 아미노산 잔기(즉, 전형적으로, 경쇄 가변 도메인의 잔기 24-34(L1), 50-56(L2) 및 89-97(L3), 및 중쇄 가변 도메인의 잔기 27-35(H1), 50-65(H2) 및 95-102(H3); Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) 및/또는 "초가변 루프" 유래의 잔기(즉, 경쇄 가변 도메인의 잔기 26-32(L1), 50-52(L2) 및 91-96(L3), 및 중쇄 가변 도메인의 잔기 26-32(H1), 53-55(H2) 및 96-101(H3); Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917)로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. "프레임워크 영역" 또는 "FR" 잔기는 본원에 정의된 바와 같은 초가변 영역 잔기 이 외의 가변 도메인 잔기이다. 용어 항체는 단일클론 항체, 다중특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 합성 항체, 키메라 항체, 낙타화 항체(예를 들면, 다음의 문헌들 참조: Muyldermans et al., 2001, Trends Biochem. Sci. 26:230; Nuttall et al., 2000, Cur. Pharm. Biotech. 1 :253; Reichmann and Muyldermans, 1999, J. Immunol. Meth. 231 :25; 국제 공개 특허 출원 WO94/04678 및 WO94/25591; 미국 특허 제6,005,079호), 단쇄 Fv(scFv)(예를 들면, 다음을 참조함: Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)), 단쇄 항체, 이황화-연결 Fv(sdFv), 인트라바디, 및 항-이디오타입(항-Id) 항체(예를 들면, 개시된 B7-H5 항체에 대한 항-Id 및 항-항-Id 항체)를 포함한다. 구체적으로, 이러한 항체는 임의 유형(예를 들면, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 부류(예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위부류의 면역글로불린 분자를 포함한다.
본원에서 사용하는 용어 항체의 "항원 결합 단편"은 항체의 상보성 결정 영역("CDR") 및 경우에 따라 항체의 "가변 영역" 항원 인식 부위를 포함하는 프레임워크 잔기를 함유하고, 항원에 면역특이적으로 결합하는 능력을 나타내는 항체의 1 이상의 부분을 의미한다. 이러한 단편은 Fab', F(ab')2, Fv, 단쇄(ScFv), 및 이의 돌연변이체, 쳔연 발생 변이체, 및 항체의 "가변 영역" 항원 인식 부위와 이종성 단백질(예를 들면, 독소, 상이한 항원에 대한 항원 인식 부위, 효소, 수용체 또는 수용체 리간드 등)을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "단편"은 적어도 5개 연속 아미노산 잔기, 적어도 10개 연속 아미노산 잔기, 적어도 15개 연속 아미노산 잔기, 적어도 20개 연속 아미노산 잔기, 적어도 25개 연속 아미노산 잔기, 적어도 40개 연속 아미노산 잔기, 적어도 50개 연속 아미노산 잔기, 적어도 60개 연속 아미노산 잔기, 적어도 70개 연속 아미노산 잔기, 적어도 80개 연속 아미노산 잔기, 적어도 90개 연속 아미노산 잔기, 적어도 100개 연속 아미노산 잔기, 적어도 125개 연속 아미노산 잔기, 적어도 150개 연속 아미노산 잔기, 적어도 175개 연속 아미노산 잔기, 적어도 200개 연속 아미노산 잔기, 또는 적어도 250개 연속 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 의미한다.
항-인간 B7-H5 항체의 인간, 키메라 또는 인간화 유도체는 인간에서 생체내 용도로 특히 바람직하지만, 쥣과동물 항체 또는 다른 종의 항체가 많은 용도에서 유리하게 적용될 수 있다(예를 들면, 시험관내 또는 인시츄 검출 분석법, 급성 생체내 용도 등). 인간화 항체는 1 이상의 비인간 CDR에 아미노산 잔기 치환, 결실 또는 부가를 포함할 수 있다. 인간화 항체 유도체는 비유도 인간화 항체와 비교시 실질적으로 동일한 결합성, 보다 강한 결합성 또는 보다 약한 결합성을 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, CDR의 1, 2, 3, 4, 또는 5 아미노산 잔기가 치환되거나, 결실되거나 또는 부가(즉, 돌연변이)된다. 완전한 인간 항체는 인간 피험체의 치료적 처치에 특히 바람직하다.
인간 항체는 인간 면역글로불린 서열에서 유도된 항체 라이브러리를 사용하는 상기 기술된 파지 디스플레이 방법을 포함한 당분야에 공지된 다양한 방법을 통해 제조될 수 있다(예를 들면, 미국 특허 제4,444,887호 및 제4,716,111호; 및 국제 공개 특허 출원 WO98/46645, WO98/50433, WO98/24893, WO98/16654, WO96/34096, WO96/33735, 및 WO91/10741 참조). 인간 항체는 기능성 내생성 면역글로불린을 발현할 수 없지만, 인간 면역글로불린 유전자는 발현할 수 있는 형질이식 마우스를 사용해 생산될 수 있다. 예를 들면, 인간 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자 복합체를 무작위적으로 또는 상동성 재조합을 통해 마우스 배아 줄기 세포에 도입시킨다. 대안적으로, 인간 가변 영역, 불변 영역, 및 다양성 영역을 인간 중쇄 및 경쇄 유전자 이외에도 배아 줄기 세포에 도입시킬 수 있다. 마우스 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자는 상동성 재조합을 통한 인간 면역글로불린 유전자좌의 도입과 개별적으로 또는 동시에 비기능성이게 될 수 있다. 구체적으로, JH 영역의 동형접합 결실이 내생성 항체 생산을 방해한다. 변형된 배아 줄기 세포가 증식되고 배반포에 미세주입되어 키메라 마우스가 생성된다. 이어서 키메라 마우스를 교배하여 인간 항체를 발현하는 동형접합 자손을 생성시킨다. 형질이식 마우스는 선택된 항원, 예를 들면 B7-H5 폴리펩티드의 전체 또는 일부분을 이용해 통상적인 방법론을 사용해 면역화된다. 항원에 대한 단일클론 항체는 통상적인 하이브리도마 기술을 사용해 면역화된, 형질이식 마우스로부터 획득될 수 있다(예를 들면, 미국 특허 제5,916,771호 참조). 형질이식 마우스로부터 모아진 인간 면역글로불린 이식유전자는 B 세포 분화 동안 재배열되고, 이후 클래스 스위칭 및 체세포 돌연변이를 겪는다. 따라서, 이러한 기술을 사용하여, 치료적으로 유용한 IgG, IgA, IgM 및 IgE 항체를 생산하는 것이 가능하다. 인간 항체를 생산하는 이러한 기술의 개요에 대해서는 Lonberg 및 Huszar를 참조한다(1995, Int. Rev. Immunol. 13 :65-93, 이 전체를 참조하여 본원에 편입시킴). 인간 항체 및 인간 단일클론 항체를 생산하는 이러한 기술과 이러한 항체를 생산하는 프로토콜에 대한 상세 설명은, 예를 들어, 국제 공개 특허 출원 WO98/24893, WO96/34096, 및 WO96/33735; 및 미국 특허 제5,413,923호, 제5,625,126호, 제5,633,425호, 제5,569,825호, 제5,661,016호, 제5,545,806호, 제5,814,318호, 및 제5,939,598호를 참조하며, 이들 전체를 참조하여 본원에 편입시킨다. 또한, Abgenix, Inc.(Freemont, CA) 및 Medarex(Princeton, NJ)와 같은 회사는 상기 기술된 것과 유사한 기술을 하용해 선택된 항원에 대한 인간 항체를 제공하는데 관여한다.
"키메라 항체"는 항체의 상이한 부분이 상이한 면역글로불린 분자에서 유래된 분자, 예컨대 비인간 항체에서 유래된 가변 영역 및 인간 면역글로불린 불변 영역을 갖는 항체이다. 키메라 항체를 생산하는 방법은 당분야에 공지되어 있다. 예를 들면 [Morrison, 1985, Science 229: 1202; Oi et al, 1986, BioTechniques 4:214; Gillies et al, 1989, J. Immunol. Methods 125: 191-202]; 및 미국 특허 제6,311,415호, 제5,807,715호, 제4,816,567호, 및 제4,816,397호를 참조한다. 비인간 종에서 유래된 1 이상의 CDPvS 및 인간 면역글로불린 분자 유래 프레임워크 영역을 포함하는 키메라 항체는 예를 들면, CDR-그라프팅(EP 239,400; 국제 공개 특허 출원 WO91/09967; 및 미국 특허 출원 제5,225,539호, 제5,530,101호, 및 제5,585,089호), 비니어링 또는 재표면화 방법(EP 592,106; EP 519,596; Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498; Studnicka et al, 1994, Protein Engineering 7:805; 및 Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 :969), 및 사슬 셔플링법(미국 특허 제5,565,332호)을 포함한 당분야에 공지된 다양한 기술을 사용해 생산할 수 있다.
본 발명은 특히 "인간화 항체"에 관한 것이다(예를 들면, 유럽 특허 EP 239,400, EP 592,106, 및 EP 519,596; 국제 공개 특허 출원 WO91/09967 및 WO93/17105; 미국 특허 제5,225,539호, 제5,530,101호, 제5,565,332호, 제5,585,089호, 제5,766,886호, 및 제6,407,213호; 및 [Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498; Studnicka et al, 1994, Protein Engineering 7(6):805-814; Roguska et al, 1994, PNAS 91 :969-973; Tan et al, 2002, J. Immunol 169: 1 119-1 125; Caldas et al, 2000, Protein Eng. 13 :353-360; Morea et al, 2000, Methods 20:267-79; Baca et al, 1997, J. Biol. Chem. 272: 10678-10684; Roguska et al, 1996, Protein Eng. 9:895-904; Couto et al, 1995, Cancer Res. 55 (23 Supp):5973s-5977s; Couto et al, 1995, Cancer Res. 55: 1717-22; Sandhu, 1994, Gene 150:409-10; Pedersen et al, 1994, J. Mol. Biol. 235:959-973; Jones et al, 1986, Nature 321 :522-525; Reichmann et al, 1988, Nature 332:323-329; 및 Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596]를 참조함). 본원에서 사용되는 용어 "인간화 항체"는 인간 프레임워크 영역 및 비인간(일반적으로 마우스 또는 래트) 면역글로불린 유래 1 이상의 CDR을 포함하는 면역글로불린을 의미한다. CDR을 제공하는 비인간 면역글로불린을 "도너"라고 하고 프레임워크를 제공하는 인간 면역글로불린을 "억셉터"라고 한다. 불변 영역은 존재할 필요가 없지만, 있다면, 인간 면역글로불린 불변 영역과 실질적으로 동일, 즉 적어도 85-90%, 바람직하게는 약 95% 또는 그 이상 동일해야만 한다. 따라서, 가능하게는 CDR을 제외하고, 인간화 면역글로불린의 모든 부분은 천연 인간 면역글로불린 서열의 상응하는 부분과 실질적으로 동일하다. 인간화 항체는 인간화 경쇄 및 인간화 중쇄 면역글로불린을 포함하는 항체이다. 예를 들면, 인간화 항체는 전형적인 키메라 항체를 포함하지 않는데, 예를 들면 키메라 항체의 전체 가변 영역은 비인간이기 때문이다. 도너 항체는 최종 인간화 항체가 CDR을 제공한 도너 항체와 동일한 항원에 결합할 것으로 예상되므로 "인간화" 과정에 의해, "인간화"되었다고 한다. 대부분의 부분에서, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역 잔기가 비인간 종(도너 항체), 예컨대 원하는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 비인간 영장류, 토끼, 래트 또는 마우스 유래의 초가변 영역 잔기로 치환된 인간 면역글로불린(수용자 항체)이다. 일부 예에서, 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역(FR) 잔기는 상응하는 비인간 잔기로 치환된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 도너 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함해도 된다. 이러한 변형은 항체 성능을 더 정교화시키기 위해 수행된다. 대체로, 인간화 항체는 적어도 1, 전형적으로 2, 가변 도메인의 실질적으로 전부를 포함하고, 여기서 초가변 영역의 전부 또는 실질적으로 전부는 비인간 면역글로불린의 그것에 상응하고 FR의 전부 또는 실질적으로 전부는 인간 면역글로불린 서열의 그것에 상응한다. 인간화 항체는 경우에 따라 또한 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부분, 전형적으로 아미노산 잔기 치환, 결실 또는 부가(즉, 돌연변이)의 도입에 의해 변경된, Fc RUB 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하는 인간 면역글로불린의 적어도 일부분을 포함하게 된다.
바람직한 인간 억셉터 프레임워크 서열을 코딩하는 DNA 서열은 인간 배선 VH 절편 VH1-18 및 JH6 및 인간 배선 VL 절편 VK-A26 및 JK4 유래의 FR 절편을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, CDR 중 1 이상은 통상적인 재조합 DNA 기술을 사용해 프레임워크 영역 내에 삽입된다. 프레임워크 영역은 천연 발생 또는 공통 프레임워크 영역일 수 있고, 바람직하게는 인간 프레임워크 영역이다(예를 들어, 인간 프레임워크 영역의 목록에 대해 다음의 문헌을 참조한다: Chothia et al, 1998, "Structural Determinants In The Sequences Of Immunoglobulin Variable Domain," J. Mol. Biol. 278: 457-479).
인간화 또는 키메라 B7-H5 항체는 CDR 영역의 전부 또는 실질적으로 전부가 비인간 면역글로불린(즉, 도너 항체)의 그것에 상응하고 프레임워크 영역의 전부 또는 실질적인 전부가 인간 면역글로불린 공통 서열의 그것인 적어도 하나, 전형적으로 2개의 가변 도메인의 실질적으로 전부를 포함할 수 있다. 바람직하게, B7-H5 항체는 또한 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부분, 전형적으로 인간 면역불린의 적어도 일부분을 포함한다. B7-H5 항체의 불변 도메인은 항체의 제안된 기능, 구체적으로 요구되는 이펙터 기능에 대해 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, B7-H5 항체의 불변 도메인은 인간 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 도메인이다(또는 포함한다). 특정 실시양태에서, 인간 IgG 불변 도메인, 특히 IgG1 및 IgG3 이소타입은, 인간화 B7-H5 항체가 치료 용도를 목적으로 하고 항체 이펙터 기능, 예컨대 항체-의존적 세포 매개 세포독성(ADCC) 및 보체-의존적 세포독성(CDC) 활성이 필요한 경우, 사용된다. 대안적인 실시양태에서, IgG2 및 IgG4 이소타입은, B7-H5 항체가 치료적 목적을 의도하고 항체 이펙터 기능이 필요치않을 경우, 사용된다. 본 발명은 미국 공개 특허 출원 제2005/0037000호 및 제2005/0064514호에 개시된 것과 같은 항체 이펙터 기능이 변경된 1 이상의 아미노산 변형을 포함하는 Fc 불변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, B7-H5 항체는 경쇄를 비롯하여 중쇄의 적어도 가변 도메인을 함유한다. 다른 실시양태에서, B7-H5 항체는 중쇄의 CH1, 힌지, CH2, CH3, 및 CH4 영역 중 1 이상을 더 포함할 수 있다. 항체는 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE를 포함하는, 면역글로불린의 임의 부류, 및 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하는 임의 이소타입에서 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 불변 도메인은 항체가 세포독성 활성을 나타내는 것이 바람직한 경우 보체 고정 불변 도메인이고, 그 부류는 전형적으로 IgG1이다. 다른 실시양태에서, 이러한 세포독성 활성이 바람직하지 않은 경우, 불변 도메인은 IgG2 부류일 수 있다. B7-H5 항체는 하나 이상의 부류 또는 이소타입에서 선택된 서열을 포함할 수 있고, 바람직한 이펙터 기능을 최적화하기 위해 선택된 특정 불변 도메인은 당분야의 숙련가의 범위 내이다.
인간화 항체의 프레임워크 및 CDR 영역은 부모 서열에 정밀하게 상응될 필요는 없으며, 예를 들어, 도너 CDR 또는 공통 프레임워크는 적어도 하나의 잔기의 치환, 삽입 또는 결실에 의해 돌연변이유발되어서 그 부위에 CDR 또는 프레임워크 잔기가 공통 또는 도너 항체에 상응하지 않게 된다. 그러나, 이러한 돌연변이는 바람직하게는 광범위하지 않다. 일반적으로, 인간화 항체 잔기의 적어도 75%는 부모 프레임워크 영역(FR) 및 CDR 서열에 상응하게 되고, 보다 흔하게는 90%, 가장 바람직하게는 95% 이상이다. 인간화 항체는 제한없이, CDR-그라프팅(유럽특허 제EP 239,400호; 국제 공개 특허 출원 WO 91/09967; 및 미국 특허 제5,225,539호, 제5,530,101호, 및 제5,585,089호), 비니어링 또는 재표면화 방법(유럽특허 제EP 592,106호 및 제EP 519,596호; Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498; Studnicka et ah, 1994, Protein Engineering 7(6):805-814; and Roguska et al, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91 :969-973), 사슬 셔플링(미국 특허 제5,565,332호), 및 예를 들면, 미국 특허 제6,407,213호, 제5,766,886호, 제5,585,089호, 국제 공개 특허 출원 WO 93/17105, [Tan et al, 2002, J. Immunol. 169: 11 19-25, Caldas et al, 2000, Protein Eng. 13:353-60, Morea et al, 2000, Methods 20:267-79, Baca et al, 1997, J. Biol Chem. 272: 10678-84, Roguska et al, 1996, Protein Eng. 9:895-904, Couto et al, 1995, Cancer Res. 55 (23 Supp):5973s-5977s, Couto et al, 1995, Cancer Res. 55: 1717-22, Sandhu, 1994, Gene 150:409-10, Pedersen et al, 1994, j. Mol Biol 235:959-73, Jones et al, 1986, Nature 321 :522-525, Riechmann et al, 1988, Nature 332:323, 및 Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596]에 개시된 기술들을 포함해, 당분야에 알려진 다양한 기술들을 통해 제조될 수 있다. 종종, 프레임워크 영역 내 프레임워크 잔기는 항원 결합을 변경, 바람직하게는 개선시키기 위해서 CDR 도너 항체로부터의 상응하는 잔기로 치환된다. 이들 프레임워크 치환은 당분야에 잘알려진 방법, 예를 들면, 특정 위치에서 흔치않은 프레임워크 잔기를 식별하기 위한 서열 비교 및 항원 결합에 중요한 프레임워크 잔기를 식별하기 위한 CDR 및 프레임워크 잔기의 상호작용의 모델링에 의해 식별된다(예를 들면, Queen et al, 미국 특허 제5,585,089호; 미국 공개 특허 출원 제2004/0049014호 및 제2003/0229208호; 미국 특허 제6,350,861호; 제6,180,370호; 제5,693,762호; 제5,693,761호; 제5,585,089호; 및 제5,530,101호 및 [Riechmann et al, 1988, Nature 332:323]을 참조함).
본 발명의 방법에서 사용되는 항체는 단일특이적일 수 있다. 또한 관심 항체는 이중특이적 항체, 삼중특이적 항체 또는 B7-H5 이외에도 다른 표적, 예컨대 면역계의 다른 분자에 대한 특이성을 나타내는 다중특이성 이상의 항체이다. 예를 들면, 이러한 항체는 B7-H5에 결합할 수 있고 특정 세포 유형 또는 조직에 항체를 표적화시키는데 중요한 항원(예를 들면, 치료되는 종양의 암 항원과 연관된 항원)에 결합할 수 있다. 다른 실시양태에서, 이러한 다중특이성 항체는 면역조정 효과의 추가적인 조정을 감소시키기 위해, 대안적이거나 또는 보충적인 면역조정 경로에 관여하는 분자(수용체 또는 리간드), 예컨대 CTLA4, TIM3, TIM4, OX40, CD40, GITR, 4-1-BB, CD27/CD70, ICOS, B7-H4, LIGHT, PD-1 또는 LAG3에 결합한다. 또한, 다중특이적 항체는 급성 및 만성 면역 반응 둘 모두를 하향조절하는데 특히 관련된, 이펙터 분자, 예컨대 사이토카인(예를 들어, IL-7, IL-15, IL-12, IL-4 TGF-베타, IL-10, IL-17, IFNg, Flt3, BLys) 및 케모카인(예를 들면, CCL21)에 결합될 수 있다.
본 발명의 항체는 폴리펩티드의 제조에 유용한 당분야에 공지된 임의 방법, 예를 들면 시험관내 합성, 재조합 DNA 생산 등에 의해 생산될 수 있다. 바람직하게, 항체는 재조합 DNA 기술에 의해 생산된다. B7-H5 항체는 재조합 면역글로불린 발현 기술을 사용해 생산될 수 있다. 인간화 항체를 포함해, 면역글로불린 분자의 재조합 생산은 미국 특허 제4,816,397호(Boss et al), 미국 특허 제6,331,415호 및 제4,816,567호( 둘 모두 Cabilly et al), 영국 특허 제GB 2,188,638(Winter et al), 및 영국 특허 제GB 2,209,757호에 기술되어 있다. 인간화 면역글로불린을 포함하여, 면역글로불린의 재조합 발현을 위한 기술은 또한 [Goeddel et al, Gene Expression Technology Methods in Enzymology Vol. 185 Academic Press (1991)], 및 [Borreback, Antibody Engineering, W. H. Freeman (1992)]에서 찾을 수 있다. 재조합 항체의 생성, 디자인 및 발현에 대한 추가적인 정보는 [Mayforth, Designing Antibodies, Academic Press, San Diego (1993)]에서 확인할 수 있다.
재조합 키메라 B7-H5 항체의 생산을 위한 예시적인 방법은 다음을 포함할 수 있다: a) 통상적인 분자 생물학 방법에 의해서, 쥣과동물 항-인간 B7-H5 단일클론 항체의 CDR 및 가변 영역이 인간 면역글로불린에서 유래된 Fc 영역에 융합된 항체 중쇄를 코딩하고 발현하는 발현 벡터를 구축하여, 키메라 항체 중쇄의 발현을 위한 벡터를 생성시키는 단계; b) 통상적인 분자 생물학 방법에 의해서, 쥣과동물 항-인간 B7-H5 단일클론 항체의 항체 경쇄를 코딩하고 발현하는 발현 벡터를 구축하여, 키메라 항체 경쇄의 발현을 위한 벡터를 생성시키는 단계; c) 통상적인 분자 생물학 방법에 의해 숙주 세포로 발현 벡터를 전달하여 키메라 항체의 발현을 위한 형질감염된 숙주 세포를 생성시키는 단계; 및 d) 통상적인 세포 배양 기술에 의해 형질감염된 세포를 배양하여 키메라 항체를 생성시키는 단계.
재조합 인간화 B7-H5 항체의 생성을 위한 예시적인 방법은 다음을 포함할 수 있다: a) 통상적인 분자 생물학 방법에 의해서, 도너 항체 결합 특이성을 보유하는데 필요한 가변 영역 프레임워크의 최소 부분 및 CDR은 인간외 면역글로불린, 예컨대 항-인간 B7-H5 단일클론 항체에서 유래되고, 항체의 나머지는 인간 면역글로불린에서 유래된 항-인간 B7-H5 중쇄를 코딩하고 발현하는 발현 벡터를 구축하여, 인간화 항체 중쇄의 발현을 위한 벡터를 생성시키는 단계; b) 통상적인 분자 생물학 방법에 의해서, 도너 항체 결합 특이성을 보유하는데 필요한 가변 영역 프레임워크의 최소 부분 및 CDR은 비인간 면역글로불린, 예컨대 쥣과동물 항-인간 B7-H5 단일클론 항체에서 유래되고, 항체의 나머지는 인간 면역글로불린에서 유래된 항체 경쇄를 코딩하고 발현하는 발현 벡터를 구축하여, 인간화 항체 경쇄의 발현을 위한 벡터를 생성시키는 단계; c) 통상적인 분자 생물학 방법에 의해 숙주 세포에 발현 벡터를 전달하여 인간화 항체의 발현을 위한 형질감염된 숙주 세포를 생성시키는 단계; 및 d) 통상적인 세포 배양 기술에 의해 형질감염된 세포를 배양하여 인간화 항체를 생성시키는 단계.
이들 예시적인 방법과 관련하여, 숙주 세포는 중쇄 및 경쇄 코딩 서열을 제외하고, 상이한 선별 마커를 함유하지만, 바람직하게는 동일한, 이러한 발현 벡터로 공형질감염될 수 있다. 이 과정은 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드의 동등한 발현을 제공한다. 대안적으로 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드 둘 모두를 코딩하는 단일 벡터가 사용될 수 있다. 중쇄 및 경쇄에 대한 코딩 서열을 cDNA 또는 게놈 DNA 또는 둘 모두를 포함할 수 있다. 재조합 B7-H5 항체를 발현시키는데 사용되는 숙주 세포는 박테리아 세포, 예컨대 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 또는 바람직하게는 진핵생물 세포(예를 들어, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 HEK-293 세포)일 수 있다. 발현 벡터의 선택은 숙주 세포의 선택에 의존적이고, 선택된 숙주 세포에서 바람직한 발현 및 조절 특징을 갖도록 선택될 수 있다. 사용될 수 있는 다른 세포주는 제한없이, CHO-K1, NSO, 및 PER.C6(Crucell, Leiden, Netherlands)을 포함한다.
임의의 상기 기술된 항체는 당분야의 숙련가에게 잘 알려진 기술을 사용해 항이디오타입 항체를 생성시키는데 사용될 수 있다(예를 들면, [ Greenspan, N.S. et al. (1989) "Idiotypes: Structure And Immunogenicity" FASEB J. 7:437-444; and isinoff, A. (1991) "Idiotypes: Concepts And Applications," J. Immunol. 147(8):2429-2438).
임의의 상기 항체의 결합 특성은, 바람직하다면, 그러한 바람직한 특징을 나타내는 변이체를 스크리닝하여 더욱 개선시킬 수 있다. 예를 들면, 그러한 항체는 당분야에 알려진 다양한 파지 디스플레이 방법을 사용해 생성시킬 수 있다. 파지 디스플레이 방법에서는, 기능성 항체 도메인이 그들을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 보유하는 파지 입자의 표면 상에 전시된다. 특정 실시양태에서, 이러한 파지는 항원 결합 도메인, 예컨대 레파토리 또는 조합성 항체 라이브러리(예를 들어, 인간 또는 쥣과동물)로부터 발현된, Fab 및 Fv 또는 이황화-결합 안정화된 Fv를 전시하는데 이용될 수 있다. 관심 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 발현하는 파지는 예를 들여, 고체 표면 또는 비드에 결합되거나 포획된 항원 또는 표지된 항원을 사용해, 항원과 함께 선택되거나 또는 동정될 수 있다. 이들 방법에서 사용되는 파지는 fd 및 M13을 포함해, 전형적으로 사상 파지이다. 항원 결합 도메인은 파지 유전자 III 또는 유전자 VIII 단백질에 재조합적으로 융합된 단백질로서 발현된다. 본 발명의 면역글로불린, 또는 이의 단편을 제조하는데 사용할 수 있는 파지 디스플레이 방법의 예는 [Brinkman, U. et al. (1995) "Phage Display Of Disulflde-Stabilized Fv Fragments" J. Immunol. Methods, 182:41-50, 1995; Ames, R.S. et al. (1995) "Conversion Of Murine Fabs Isolated From A Combinatorial Phage Display Library To Full Length Immunoglobulins" J. Immunol. Methods, 184: 177-186; Kettleborough, C.A. et al. (1994) "Isolation Of Tumor Cell-Specific Single-Chain Fv From Immunized Mice Using Phage-Antibody Libraries And The Re-Construction Of Whole Antibodies From These Antibody Fragments," Eur. J. Immunol, 24:952-958, 1994; Persic, L. et al. (1997) "An Integrated Vector System For The Eukaryotic Expression Of Antibodies Or Their Fragments After Selection From Phage Display Libraries," Gene, 187:9-18; Burton, D.R. et al. (1994) "Human Antibodies From Combinatorial Libraries," Adv. Immunol. 57: 191-280]; PCT 공개출원 WO 92/001047; WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401 ; 및 미국 특허 제5,698,426호; 제5,223,409호; 제5,403,484호; 제5,580,717호; 제5,427,908호; 제5,750,753호; 제5,821,047호; 제5,571,698호; 제5,427,908호; 제5,516,637호; 제5,780,225호; 제5,658,727호; 제5,733,743호 및 제5,969,108호에 개시되어 있다.
상기 참조문헌들에 기술된 바와 같이, 파지 선택 후, 예를 들어 이하에 상세하게 기술된 바와 같이, 파지 유래의 항체 코딩 영역을 단리하고 인간화 항체를 포함한, 전체 항체, 또는 임의의 다른 바람직한 단편을 생성시키는데 사용하고, 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모, 및 박테리아를 포함한, 임의의 바람직한 숙주에서 발현시킨다. 예를 들면, Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편을 재조합적으로 생성시키는 기술이 또한 당분야에 알려진 방법을 사용해 채택될 수 있다(예컨대, 이하 문헌들에 개시된 것들을 참조함: PCT 공개출원 WO 92/22324; Mullinax, R.L. et al. (1992) "Expression Of A Heterodimeric Fab Antibody Protein In One Cloning Step," BioTechniques, 12(6): 864-869; 및 Sawai et al. (1995) "Direct Production Of The Fab Fragment Derived From The Sperm Immobilizing Antibody Using Polymerase Chain Reaction And cDNA Expression Vectors," Am. J. Reprod. Immunol. 34:26-34; 및 Better, M. et al. (1988) "Escherichia coli Secretion Of An Active Chimeric Antibody Fragment," Science 240: 1041-1043). 단쇄 Fv 및 항체를 생성시키는데 사용될 수 있는 기술들의 예는 미국 특허 제4,946,778호 및 제5,258,498호; [Huston, J.S. et al. (1991) "Protein Engineering Of Single-Chain Fv Analogs And Fusion Proteins," Methods in Enzymology 203:46-88; Shu, L. et al, "Secretion Of A Single-Gene-Encoded Immunoglobulin From Myeloma Cells," Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 90:7995-7999; 및 Skerra. A. et al. (1988) "Assembly Of A Functional Immunoglobulin Fv Fragment In Escherichia coli," Science 240: 1038-1040]에 기술되어 있다.
파지 디스플레이 기술을 사용해 B7-H5에 대한 항체의 친화성을 증가시킬 수 있다. 이 기술은 개시된 조합 방법에서 사용될 수 있는 고 친화성 항체를 획득하는데 유용하다. 친화성 성숙화라고도 하는, 이 기술은 초기 또는 부모 항체와 비교시 항원에 대해 보다 높은 친화성으로 결합하는 항체를 동정하기 위해 그러한 수용체 또는 리간드(또는 그들의 세포외 도메인) 또는 이의 항원성 단편을 사용하는 재선택법 및 돌연변이유발법 또는 CDR 워킹을 적용한다(예를 들면, 다음의 문헌을 참조함: Glaser, S.M. et al. (1992) "Antibody Engineering By Codon-Based Mutagenesis In A Filamentous Phage Vector System," J. Immunol. 149:3903-3913). 단일 뉴클레오티드 보다는 전체 코돈의 돌연변이유발이 아미노산 돌연변이의 반무작위 레퍼토리를 생성시킨다. 단일 CDR에 단일 아미노산 변경에 의해 각각이 상이하고 각 CDR 잔기에 대해 각각의 가능한 아미노산 치환을 나타내는 변이체를 함유하는 변이체 클론의 풀로 이루어진 라이브러리를 구축할 수 있다. 항원에 대한 결합 친화성이 증가된 돌연변이체는 표지된 항원과 고정된 돌연변이체를 접촉시켜 스크리닝할 수 있다. 당분야의 임의의 스크리닝 방법을 사용하여 항원에 대한 친화력이 증가된 돌연변이체 항체를 동정할 수 있다(예를 들어, ELISA)(예를 들면, 다음의 문헌들을 참조함: Wu, H. et al. (1998) "Stepwise In Vitro Affinity Maturation Of Vitaxin, An Alphav Beta3-Specific Humanized Mab," Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95(11):6037-6042; Yelton, D.E. et al. (1995) "Affinity Maturation Of The BR96 Anti-Carcinoma Antibody By Codon-Based Mutagenesis," J. Immunol. 155: 1994-2004). 경쇄를 무작위화시키는 CDR 워킹을 사용하는 것이 가능하다(예를 들면, 다음의 문헌을 참조함: Schier et al. (1996) "Isolation Of Picomolar Affinity Anti-C-Erbb-2 Single-Chain Fv By Molecular Evolution Of The Complementarity Determining Regions In The Center Of The Antibody Binding Site," J. Mol. Biol. 263 :551-567).
따라서, 본 발명은 개선된 CDR을 동정하기 위해 무작위 돌연변이유발법의 사용을 고려한다. 파지 디스플레이 기술은 대안적으로 CDR 친화성을 증가(또는 감소)시키는데 사용될 수 있다. 친화성 성숙화라고도 하는, 이 기술은 돌연변이유발법 또는 "CDR 워킹"을 적용하고 재선택법은 초기 또는 부모 항체와 비교시 항원에 보다 높은(또는 낮은) 친화성으로 결합하는 CDR을 갖는 항체를 동정하기 위해 표적 항원 또는 이의 항원성 단편을 사용한다(예를 들면, 다음의 문헌을 참조함: Glaser, S.M. et al. (1992) "Antibody Engineering By Codon-Based Mutagenesis In A Filamentous Phage Vector System," J. Immunol. 149:3903-3913). 단일 뉴클레오티드 보다는 전체 코돈의 돌연변이유발은 아미노산 돌연변이의 반무작위 레퍼노리를 생성시킨다. 단일 CDR에 단일 아미노산 변경에 의해 각각 상이하고 각각의 CDR 잔기에 대해 각각의 가능한 아미노산 치환을 나타내는 변이체를 함유하는 변이체 클론의 풀로 이루어진 라이브러리를 구축할 수 있다. 항원에 대한 결합 친화성이 증가(또는 감소)된 돌연변이체는 고정된 돌연변이체를 표지된 항원과 접촉시켜 스크리닝할 수 있다. 당분야에 공지된 임의의 스크리닝 방법을 사용해 항원에 대한 친화력이 증가(또는 감소)된 돌연변이체 항체를 동정할 수 있다(예를 들면, ELISA)(예를 들어, 다음의 문헌들을 참조함: Wu, H. et al. (1998) "Stepwise In Vitro Affinity Maturation Of Vitaxin, An Alphav Beta3-Specific Humanized Mab," Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95(11):6037-6042; Yelton, D.E. et al. (1995) "Affinity Maturation Of The BR96 Anti-Carcinoma Antibody By Codon-Based Mutagenesis", J. Immunol. 155: 1994-2004). 경쇄를 무작위화하는 CDR 워킹을 사용하는 것이 가능하다(예를 들면, 다음의 문헌을 참조함: Schier et al. (1996) "Isolation Of Picomolar Affinity Anti-C-Erbb-2 Single-Chain Fv By Molecular Evolution Of The Complementarity Determining Regions In The Center Of The Antibody Binding Site " J. Mol. Biol. 263 :551-567).
이러한 친화성 성숙화를 수행하는 방법은 예를 들어, 다음의 문헌들에 기술되어 있다: Krause, J.C. et al. (201 1) "An Insertion Mutation That Distorts Antibody Binding Site Architecture Enhances Function Of A Human Antibody," MBio. 2(1) pii: e00345-10. doi: 10.1 128/mBio.00345-10; Kuan, C.T. et al. (2010) "Affinity-Matured Anti-Glycoprotein NMB Recombinant Immunotoxins Targeting Malignant Gliomas And Melanomas," Int. J. Cancer 10.1002/ijc.25645; Hackel, B.J. et al. (2010) "Stability And CDR Composition Biases Enrich Binder Functionality Landscapes," J. Mol. Biol. 401(l):84-96; Montgomery, D.L. et al. (2009) "Affinity Maturation And Characterization Of A Human Monoclonal Antibody Against HIV-1 gp41," MAbs l(5):462-474; Gustchina, E. et al. (2009) "Affinity Maturation By Targeted Diversification Of The CDR-H2 Loop Of A Monoclonal Fab Derived From A Synthetic Naive Human Antibody Library And Directed Against The Internal Trimeric Coiled-Coil Of Gp41 Yields A Set Of Fabs With Improved HIV-1 Neutralization Potency And Breadth," Virology 393(1): 1 12-1 19; Finlay, W.J. et al. (2009) "Affinity Maturation Of A Humanized Rat Antibody For Anti-RAGE Therapy: Comprehensive Mutagenesis Reveals A High Level Of Mutational Plasticity Both Inside And Outside The Complementarity-Determining Regions" J. Mol. Biol. 388(3):541-558; Bostrom, J. et al. (2009) "Improving Antibody Binding Affinity And Specificity For Therapeutic Development" Methods Mol. Biol. 525:353-376; Steidl, S. et al. (2008) "In Vitro Affinity Maturation Of Human GM-CSF Antibodies By Targeted CDR-Diversification," Mol. Immunol. 46(1): 135-144; 및 Barderas, R. et al. (2008) "Affinity maturation of antibodies assisted by in silico modeling," Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 105(26):9029-9034.
본 발명의 특히 임의의 상기 기술된 항체 및 그들의 항원 결합 단편의 "유도체"의 생성 및 용도를 고려한다.
용어 "유도체"는 항원에 면역특이적으로 결합하지만, "부모"(또는 야생형) 분자에 비해 1, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 아미노산 치환, 부가, 결실 또는 변형을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 의미한다. 이러한 아미노산 치환 또는 부가는 천연 발생(즉, DNA-코딩) 또는 비천연 발생 아미노산 잔기를 도입할 수도 있다. 용어 "유도체"는 예를 들면, 강화되거나 또는 손상된 이펙터 또는 결합 특징을 나타내는 변이체 Fc 영역을 갖는 항체 등을 형성하도록, 변경된 CH1, 힌지, CH2, CH3 또는 CH4 영역을 갖는 변이체를 비롯하여 임의의 항체 1.2, 4.5 또는 7.8의 키메라 또는 인간화 변이체를 포함한다. 용어 "유도체"는 부가적으로 비아미노산 변형, 예를 들면, 글리코실화(예를 들면, 변경된 만노스, 2-N-아세틸글루코사민, 갈락토스, 푸코스, 글루코스, 시알산, 5-N-아세틸뉴라민산, 5-글리콜뉴라민산 등 함량을 가짐), 아세틸화, PEG화, 인산화, 아미드화, 공지의 보호/차단 기에 의한 유도체화, 단백질가수분해 절단, 세포 리간드 또는 다른 단백질 등에 연결될 수 있는 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변경된 탄수화물 변형은 다음 중 1 이상을 조정한다: 항체의 가용성, 세포하 수송의 촉진 및 항체의 분비, 항체 조립 촉진, 입체구조 온전성, 및 항체 매개 이펙터 기능. 특정 실시양태에서, 변경된 탄수화물 변형은 그러한 탄수화물 변형이 결여된 항체에 비해 항체 매개 이펙터 기능을 강화시킨다. 변경된 항체 매개 이펙터 기능을 일으키는 탄수화물 변형은 당분야에 공지이다(예를 들어, 다음의 문헌들을 참조함: Shields, R.L. et al. (2002) "Lack Of Fucose On Human IgG N-Linked Oligosaccharide Improves Binding To Human Fcgamma RIII And Antibody-Dependent Cellular Toxicity.," J. Biol. Chem. 277(30): 26733-26740; Davies J. et al. (2001) "Expression OfGnTIII In A Recombinant Anti-CD20 CHO Production Cell Line: Expression Of Antibodies With Altered Glycoforms Leads To An Increase In ADCC Through Higher Affinity For FC Gamma RIII," Biotechnology & Bioengineering 74(4): 288-294). 탄수화물 함량을 변경시키는 방법은 당분야의 숙련가에게 공지되어 있으며, 예를 들어 다음의 문헌들을 참조한다: Wallick, S.C. et al. (1988) "Glycosylation Of A VH Residue Of A Monoclonal Antibody Against Alpha (1----6) Dextran Increases Its Affinity For Antigen," J. Exp. Med. 168(3): 1099-1 109; Tao, M.H. et al. (1989) "Studies Of Aglycosylated Chimeric Mouse-Human IgG. Role Of Carbohydrate In The Structure And Effector Functions Mediated By The Human IgG Constant Region," J. Immunol. 143(8): 2595-2601; Routledge, E.G. et al. (1995) "The Effect Of Aglycosylation On The Immunogenicity Of A Humanized Therapeutic CD3 Monoclonal Antibody," Transplantation 60(8): 847-53; Elliott, S. et al. (2003) "Enhancement Of Therapeutic Protein In Vivo Activities Through Glycoengineering," Nature Biotechnol. 21 :414-21; Shields, R.L. et al. (2002) "Lack Of Fucose On Human IgG N-Linked Oligosaccharide Improves Binding To Human Fcgamma RIII And Antibody-Dependent Cellular Toxicity. " J. Biol. Chem. 277(30): 26733-26740).
일부 실시양태에서, 인간화 항체는 유도체이다. 이러한 인간화 항체는 1 이상의 비인간 CDR에 아미노산 잔기 치환, 결실 또는 부가를 포함한다. 인간화 항체 유도체는 비유도체화 인간화 항체와 비교하여 실질적으로 동일한 결합성, 보다 양호한 결합성, 또는 악화된 결합성을 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, CDR의 1, 2, 3, 4, 또는 5 아미노산 잔기는 치환되거나, 결실되거나 또는 부가(즉, 돌연변이)된다.
유도체 항체 또는 항체 단편은 제한없이, 특이적 화학 절단, 아세틸화, 제제화, 투니카마이신의 대사 합성을 포함한, 당분야의 숙련가에게 공지된 기술을 사용해 화학적 변형에 의해 변형될 수 있다. 일 실시양태에서, 항체 유도체는 부모 항체와 유사하거나 또는 동일한 기능을 보유하게 된다. 다른 실시양태에서, 항체 유도체는 부모 항체와 비교하여 변경된 활성을 나타내게 된다. 예를 들면, 유도체 항체(또는 이의 단편)은 보다 단단하게 그 에피토프에 결합하거나 또는 부모 항체보다 단백질가수분해에 더 내성일 수 있다.
유도체화된 항체는 포유동물, 바람직하게는 인간에서 부모 항체의 반감기(예를 들어, 혈청 반감기)를 변경시키는데 사용될 수 있다. 바람직하게 이러한 변경은 반감기가 15일 이상, 바람직하게는 20일 이상, 25일 이상, 30일 이상, 35일 이상, 40일 이상, 45일 이상, 2개월 이상, 3개월 이상, 4개월 이상, 또는 5개월 이상이게 한다. 포유동물, 바람직하게 인간에서 본 발명의 인간화 항체 또는 이의 단편의 증가된 반감기는 포유동물에서 상기 항체 또는 항체 단편의 높은 혈청 역가를 초래하여서, 상기 항체 또는 항체 단편의 투여 빈도를 감소시키고/시키거나 투여되는 상기 항체 또는 항체 단편의 농도를 감소시킨다. 생체내 반감기가 증가된 항체 또는 이의 단편은 당분야의 숙련가에게 알려진 기술을 통해 생성시킬 수 있다. 예를 들면, 생체내 반감기가 증가된 항체 또는 이의 단편은 Fc 도메인과 FcRn 수용체 간 상호작용에 관여하는 것으로 동정된 아미노산 잔기를 변경(예를 들어, 치환, 결실 또는 부가)하여 생성시킬 수 있다. 인간화 B7-H5 항체는 생물학적 반감기가 증가되도록 조작될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제6,277,375호 참조). 예를 들어, 인간화 B7-H5 항체는 생체내 또는 혈청 반감기가 증가되도록 Fc-힌지 도메인을 조작할 수 있다.
생체내 반감기가 증가된 항체 또는 이의 단편은 상기 항체 또는 항체 단편에 중합체 분자, 예컨대 고분자량 폴리에틸렌글리콜(PEG)에 부착시켜 생성될 수 있다. PEG는 리신 잔기에 존재하는 엡실론-아미노 기를 통해서 또는 상기 항체 또는 항체 단편의 N 말단 또는 C 말단에 PEG의 부위-특이적 접합을 통해서 다중작용성 링커와 함께 또는 없이 상기 항체 또는 항체 단편에 부착될 수 있다. 생물학적 활성 손실이 최소인 선형 또는 분지형 중합체 유도체화가 사용된다. 항체에 PEG 분자의 적절한 접합을 보장하기 위해서 SDS-PAGE 및 질량 분광법을 통해 접합 정도를 세밀하게 모니터링한다. 미반응된 PEG는 예를 들어 크기 배제 또는 이온 교환 크로마토그래피를 통해 항체-PEG 접합체로부터 분리될 수 있다.
B7-H5 항체는 또한 실질적으로 면역원성 반응없이 포유동물 순환계에 주사될 수 있는 조성물을 제공하기 위해 Davis et al.(미국 특허 제4,179,337호 참조)에 의해 기술된 방법 및 커플링제에 의해 변형될 수 있다.
일 실시양태는 인간화 B7-H5 항체의 프레임워크 잔기의 변형을 포함한다. 프레임워크 영역 내 프레임워크 잔기는 항원 결합을 변경, 바람직하게는 개선시키도록 CDR 도너 항체 유래의 상응하는 잔기로 치환될 수 있다. 이들 프레임워크 치환은 당분야에 공지된 방법들, 예를 들어, 항원 결합에 중요한 프레임워크 잔기를 동정하기 위한 프레임워크 잔기와 CDR의 상호작용의 모델링 및 특정 위치에 흔치않은 프레임워크 잔기를 동정하기 위한 서열 비교를 통해 동정된다(예를 들어, 미국 특허 제5,585,089호; 및 Riechmann, L. et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies For Therapy," Nature 332:323-327).
또 다른 실시양태는 이종성 분자(즉, 미관련 분자)에 재조합적으로 융합되거나 또는 화학적으로 접합(공유 및 비공유 접합 포함)된 항-인간 B7-H5 항체(보다 바람직하게는, 인간화 항체) 및 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 융합이 반드시 직접적일 필요는 없으며, 링커 서열을 통해 일어날 수 있다.
일 실시양태에서 그러한 이종성 분자는 적어도 10, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90 또는 적어도 100 아미노산을 갖는 폴리펩티드이다. 그러한 이종성 분자는 대안적으로, 효소, 호르몬, 세포 표면 수용체, 약물 모이어티, 예컨대 독소(예컨대 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소(즉, PE-40), 디프테리아 독소, 리신, 겔로닌, 또는 미국자리공 항바이러스 단백질), 단백질(예컨대 종양 괴사 인자, 인터페론(예를 들어, α-인터페론, β-인터페론), 신경 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자, 조직 플라스미노겐 활성인자, 또는 아폽토시스제(예를 들어, 종양 괴사 인자-α, 종양 괴사 인자-β)), 생물학적 반응 변형제(예컨대 림포카인(예를 들어, 인터루킨-1("IL-1"), 인터루킨-2("IL-2"), 인터루킨-6("IL-6")), 과립구 대식 세포 콜로니 자극 인자("GM-CSF"), 과립구 콜로니 자극 인자("G-CSF"), 또는 대식 세포 콜로니 자극 인자("M-CSF")), 또는 성장 인자(예를 들어, 성장 호르몬("GH"))), 세포독소(예를 들어, 세포증식억제제 또는 세포파괴제, 예컨대 파클리탁솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티디움 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜키신, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시 안트라신 디온, 메토잔트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데히드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 및 퓨로마이신 및 이의 유사체 또는 상동체), 항대사산물(예를 들어, 메토트렉세이트, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 데카르바진), 알킬화제(예를 들어, 메클로레타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, BiCNU®(카르무스틴; BSNU) 및 로무스틴(CCNU), 시클로토스파미드, 부설판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 시스디클로로디아민 플래티넘(II)(DDP) 시스플라틴), 안트라시클린(예를 들어, 다우노루비신(이전에 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제(예를 들어, 닥티노마이신(이전에 악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신, 및 안트라마이신(AMC)), 또는 항세포분열제(예를 들어, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)일 수 있다.
이러한 치료적 모이어티를 항체에 접합시키는 기술은 당분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 다음의 문헌들을 참조한다: Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Reisfeld et al. (eds.), 1985, pp. 243-56, Alan R. Liss, Inc.); Hellstrom et al, "Antibodies For Drug Delivery", in CONTROLLED DRUG DELIVERY (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), 1987, pp. 623-53, Marcel Dekker, Inc.); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in MONOCLONAL ANTIBODIES '84: BIOLOGICAL AND CLINICAL APPLICATIONS, Pinchera et al. (eds.), 1985, pp. 475-506); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in MONOCLONAL ANTIBODIES FOR CANCER DETECTION AND THERAPY, Baldwin et al. (eds.), 1985, pp. 303-16, Academic Press; 및 Thorpe et al. (1982) "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates," Immunol. Rev. 62: 119-158.
일 실시양태에서, B7-H5 항체 항체 또는 B7-H5 융합 분자는 Fc 부분을 포함한다. 이러한 분자의 Fc 부분은 예를 들어 이펙터 기능, 반감기 제어, 조직 접근성을 개선시키고, 생물리적 특징, 예컨대 안정성을 증가시키고, 생산 효율성(및 비용 절감)을 개선시키기 위해, 이소타입 또는 하위부류에 의해 다양화되고/되거나, 키메라 또는 하이브리드이고/이거나, 변형될 수 있다. 개시된 융합 단백질의 구축에 유용한 많은 변형 및 그들의 제조 방법은 당분야에 공지이고, 예를 들어, 다음의 문헌들을 참조한다: Mueller, J.P. et al. (1997) "Humanized Porcine VCAM-Speciflc Monoclonal Antibodies With Chimeric IgG2/G4 Constant Regions Block Human Leukocyte Binding To Porcine Endothelial Cells," Mol. Immun. 34(6):441-452, Swann, P.G. (2008) "Considerations For The Development Of Therapeutic Monoclonal Antibodies," Curr. Opin. Immun. 20:493-499 (2008), 및 Presta, L.G. (2008) "Molecular Engineering And Design Of Therapeutic Antibodies," Curr. Opin. Immun. 20:460-470. 일부 실시양태에서, Fc 영역은 천연 IgG1, IgG2, 또는 IgG4 Fc 영역이다. 일부 실시양태에서, Fc 영역은 하이브리드, 예를 들어 IgG2/IgG4 Fc 불변 영역으로 이루어진 키메라이다. Fc 영역에 대한 변형은 제한없이, Fc 감마 수용체 및 보체와의 결합을 방지하도록 변형된 IgG4, 1 이상의 Fc 감마 수용체와의 결합이 개선되도록 변형된 IgG1, 이펙터 기능이 최소화되도록 변형된 IgG1(아미노산 변화), 글리칸 무함유/변경된 글리칸(전형적으로 발현 숙주 변화에 의함)을 갖는 IgG1, 및 FcRn과의 변경된 pH-의존적 결합의 IgG1, 및 안정성 향상을 위해 힌지 영역 아미노산 잔기 #228의 세린을 프롤린(S228P)으로 변화시킨 IgG4를 포함한다. Fc 영역은 전체 힌지 영역, 또는 전체 미만의 힌지 영역을 포함할 수 있다.
비호지킨 림프종 또는 발덴스트롬 마크로글로불린혈증에 대해 리툭시맙(CD20에 대한 키메라 마우스/인간 IgG1 단일클론 항체)으로 치료된 환자에서 치료적 결과는 인간 IgG1의 Fc 도메인에 대한 개별적인 고유 친화성을 갖는 Fcγ 수용체의 대립유전자 변이체의 개별 발현과 상관있었다. 구체적으로, 저 친화성 활성화 Fc 수용체 CD16A(FcγRIIIA)의 고친화성 대립유전자를 갖는 환자는 보다 높은 반응율을 나타내었고, 비호지킨 림프종의 경우, 미진행 생존이 개선되었다. 다른 실시양태에서, Fc 도메인은 저 친화성 억제성 Fc 수용체 CD32B(FcγRIIB)와의 결합성을 감소시키고 저 친화성 활성 Fc 수용체 CD16A(FcγRIIIA)와의 야생형 결합도를 유지하거나 또는 그 결합이 향상되는 1 이상의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 보유할 수 있다.
다른 실시양태는 그들 반감기를 증가시키는 FcR과의 결합이 감소된 IgG2-4 하이브리드 및 IgG4 돌연변이체를 포함한다. 대표적인 IgG2-4 하이브리드 및 IgG4 돌연변이체는 다음의 문헌들에 기술되어 있다: Angal, S. et al. (1993) "A Single Amino Acid Substitution Abolishes The Heterogeneity Of Chimeric Mouse/Human (Igg4) Antibody," Molec. Immunol. 30(1): 105-108; Mueller, J.P. et al. (1997) "Humanized Porcine VCAM-Speciflc Monoclonal Antibodies With Chimeric Igg2/G4 Constant Regions Block Human Leukocyte Binding To Porcine Endothelial Cells," Mol. Immun. 34(6):441-452; 및 미국 특허 제6,982,323호. 일부 실시양태에서, IgG1 및/또는 IgG2 도메인은 결실되며, 예를 들어, [Angal, s. et al.]은 세린 241이 프롤린으로 치환된 IgG1 및 IgG2를 기술한다.
유도체화된 항체에서 치환, 부가 또는 결실은 항체의 Fc 영역에 존재할 수 있고 따라서 1 이상의 FcR에 대한 항체의 결합 친화성을 변형시킬 수 있다. 1 이상의 Fc R과의 결합이 변형된 항체를 변형시키는 방법은 당분야에 공지이고, 예를 들어, PCR 공개 특허 출원 WO 04/029207, WO 04/029092, WO 04/028564, WO 99/58572, WO 99/51642, WO 98/23289, WO 89/07142, WO 88/07089, 및 미국 특허 제5,843,597호 및 제5,642,821호에 기술되어 있다. 일 특정 실시양태에서, Fc 영역의 변형 결과 항체-매개 이펙터 기능이 변경된 항체, 다른 Fc 수용체(예를 들어, Fc 활성화 수용체)와의 결합 변경, 변경된 항체-의존적 세포 매개 세포독성(ADCC) 활성, 변경된 C1q 결합 활성, 변경된 보체-의존적 세포독성 활성(CDC), 식균세포 활성, 또는 이의 임의 조합이 야기된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 분자가 예를 들면, 활성화 수용체, 예컨대 FcγRIIA 또는 FcγRIIIA에 대해 감소된 활성을 나타내거나, 또는 억제 수용체, 예컨대 FcγRIIB에 대해 증가된 활성을 나타내게, 변경된 Fc 수용체(FcR) 결합 활성을 나타내도록 그 Fc 영역이 변형된 항체를 포함한다. 바람직하게, 이러한 항체는 감소된 항체-의존적 세포 매개 세포독성(ADCc) 또는 보체 의존적 세포독성(CDC) 활성(야생형 Fc 수용체와 비교하여)을 나타낸다.
Fc-매개 이펙터 기능에 영향을 주는 변형은 당분야에 잘알려져 있다(예를 들어, 다음의 문헌들을 참조함: 미국 특허 제6,194,551호, 및 WO 00/42072; Stavenhagen, J.B. et al. (2007) "Fc Optimization Of Therapeutic Antibodies Enhances Their Ability To Kill Tumor Cells In Vitro And Controls Tumor Expansion In Vivo Via Low-Affinity Activating Fcgamma Receptors," Cancer Res. 57(18):8882-8890; Shields, R.L. et al. (2001) "High Resolution Mapping of the Binding Site on Human IgGl for FcyRI, FcyRII, FcyRIII, and FcRn and Design of IgGl Variants with Improved Binding to the FcyR," J. Biol. Chem. 276(9):6591-6604). FcγRIIA 또는 FcγRIIIA에 대한 결합은 감소하였지만, FcγRIIB에 대한 결합은 변하지 않거나 또는 강화된 인간 IgG1 Fc 도메인의 예시적인 변이체는 S239A, H268A, S267G, E269A, E293A, E293D, Y296F, R301A,V303A, A327G, K322A, E333A, K334A, K338A, A339A, D376A를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 그 Fc 영역이 결실된 항체를 포함한다(예를 들어, Fab 또는 F(ab)2 등).
본 발명의 임의의 분자는 정제를 용이하게 하기 위해 마커 서열, 예컨대 펩티드와 융합될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 마커 아미노산 서열은 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질에서 유래된 에피토프에 상응하는 헥사-히스티딘 펩티드, 헤마글루티닌 "HA" 태그(Wilson, LA. et al. (1984) "The Structure Of An Antigenic Determinant In A Protein," Cell, 37:767-778) 및 "플래드" 태그(Knappik, A. et al. (1994) "An Improved Affinity Tag Based On The FLAG Peptide For The Detection And Purification Of Recombinant Antibody Fragments," Biotechniques 17(4):754-761)이다.
본 발명은 또한 혈청 반감기를 증가시키는 것이 바람직한 진단제 또는 치료제 또는 임의의 다른 분자에 접합되는 항체 또는 그들의 항원 결합 단편을 포함한다. 항체는 예를 들면 소정 치료 계획의 효능을 결정하기 위한 임상 시험 절차의 일부로서 질환, 질병 또는 감염의 발병 또는 진행을 모니터링하기 위해 진단적으로(생체내, 인시츄 또는 시험관내) 사용될 수 있다. 검출은 항체를 검출 가능한 물질에 커플링시켜 용이하게 할 수 있다. 검출 가능한 물질의 예에는 다양한 효소, 보결기, 형광발광 물질, 발광성 물질, 생체발광성 물질, 방사능 물질, 양전자 방출 금속, 및 비방사능 상자성 금속 이온이 포함된다. 검출 가능한 물질은 당분야에 공지된 기술을 이용하여 중간체(예컨대 당분야에 알려진 링커)를 통해 간접적으로 또는 항체에 직접적으로 커플링되거나 또는 접합될 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따른 진단제로서 사용하기 위해 항체에 접합될 수 있는 금속 이온에 대해 미국 특허 제4,741,900호를 참조한다. 이러한 진단 및 검출은 제한없이, 다양한 효소, 제한없이, 홀스래디쉬 퍼옥시다아제, 알칼리 포스파타아제, 베타-갈락토시다아제, 또는 아세틸콜린스테라아제를 포함한 효소; 보결기 복합체, 예컨대 제한없이, 스트렙타비딘/바이오틴 및 아비딘/바이오틴; 형광발광성 물질, 예컨대 제한없이 엄벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 파이코에리쓰린; 발광성 물질, 예컨대 제한없이, 루미놀; 생체발광성 물질, 예컨대 제한없이, 루시퍼라아제, 루시페린, 및 애퀴오린; 방사능 물질, 예컨대 제한없이, 비스무쓰(213Bi), 탄소(14C), 크롬(51Cr), 코발트(57Co), 불소(18F), 가돌리늄(153Gd, 159Gd), 갈륨(68Ga, 67Ga), 게르마늄(68Ge), 홀뮴(166Ho), 인듐(115In, 113In, 112In, 111In), 요오드(131I, 125I, 123I, 121I), 란타늄(140La), 루테튬(177Lu), 망간(54Mn), 몰리브데늄(99Mo), 팔라듐(103Pd), 인(32P), 프라세오디뮴(142Pr), 프로메튬(149Pm), 레늄(186Re, 188Re), 로듐(105Rh), 루테뮴(97Ru), 사마리움(153Sm), 스칸디움(47Sc), 셀레늄(75Se), 스트론튬(85Sr), 황(35S), 테크네튬(99Tc), 탈륨(201Ti), 주석(113Sn, 117Sn), 트리튬(3H), 크세논(133Xe), 이터비움(169Yb, 175Yb), 이트륨(90Y), 아연(65Zn); 다양한 양전자 방출 단층촬영을 사용한 양전자 방출 금속, 및 비방사능 상자성 금속 이온을 포함한 검출 가능한 물질에 항체를 커플링시켜 수행될 수 있다.
본 발명의 분자는 제2 항체에 접합되어 Segal의 미국 특허 제4,676,980호에 기술된 바와 같은 이종접합체를 형성할 수 있다. 이러한 이종접합체 항체는 부가적으로 햅텐(예컨대 플루오레세인 등), 또는 세포 마커(예를 들면, PD-1, 4-1-BB, B7-H4, B7-H5, CD4, CD8, CD 14, CD25, CD27, CD40, CD68, CD163, CTLA4, GITR, LAG-3, OX40, TIM3, TIM4, TLR2, LIGHT 등) 또는 사이토카인(예를 들면, IL-7, IL-15, IL-12, IL-4 TGF-베타, IL-10, IL-17, IFNg, Flt3, BLys) 또는 케모카인(예를 들면, CCL21) 등에 결합할 수 있다.
본 발명의 분자는 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편과의 결합을 통해 지지체에 고정시킨 표적 항원에 결합할 수 있는 표적 항원 또는 다른 분자의 면역어세이 또는 정제에 특히 유용한, 고체 지지체에 부착될 수 있다. 이러한 고체 지지체는 제한없이, 유리, 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 나이론, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드 또는 폴리프로필렌을 포함한다.
본 발명은 부가적으로, 임의의 이러한 항체, 융합 단백질 또는 단편을 코딩하는 핵산 분자(DNA 또는 RNA)를 비롯하여, 세포주에서 이러한 핵산 분자를 전달 또는 복제하여 그러한 항체, 융합 단백질 또는 단편을 발현할 수 있는 벡터 분자(예컨대 플라스미드)를 포함한다. 핵산은 단일가닥, 이중가닥일 수 있고, 단일가닥과 이중가닥 부분 둘 모두를 포함할 수도 있다.
D. 본 발명의 바람직한 조절인자 조성물
본원에서 사용되는 용어 "조절하다"는 효과 또는 결과를 변경시키는 능력을 의미한다. 구체적으로, 본 발명은 인간 B7-H5에 면역특이적으로 결합하는 항-인간 B7-H5 항체 또는 임의의 이의 항원 결합 단편 또는 B7-H5와 그 동족 리간드 간 결합을 조정할 수 있고/있거나 B7-H5-동족 대항 수용체 결합의 결과로서 발생하는 신호 전달을 조정할 수 있는 B7-H5에 생리특이적으로 결합하는 분자를 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다. 부가적으로, 다중특이적 항-B7-H5 항체, 항-B7-H5 항원 결합 단편 및 CH28H 또는 다른 세포 리간드 또는 수용체에 결합하는 부가적인 능력을 갖는 그들의 개별 융합 생성물은 CD28H를 발현하는 세포에 그러한 리간드 또는 수용체를 발현하는 세포의 공동국재화를 용이하게 하는데 특별히 유용하다.
본 발명은 B7-H5에 면역특이적으로 결합하고 시험관내, 수용 피험체 또는 환자에서 CD28H와 B7-H5의 상호작용을 실질적으로 차단할 수 있는, 항체, 또는 이의 단편, 또는 그러한 항체 또는 단편을 포함하는, 융합 분자에 관한 것이다. 본원에서 사용하는 "CD28H와 B7-H5의 상호작용을 실질적으로 차단할 수 있는" 분자는 이러한 분자의 제공이 본원에 개시된 임의의 어세이를 통해 측정시 B7-H5-CD28H 상호작용을 50%가 넘게, 보다 바람직하게는 60%가 넘게, 70%가 넘게, 80%가 넘게, 90%가 넘게, 95%가 넘게, 99%가 넘게 약화되거나 또는 가장 바람직하게는 이러한 상호작용을 완전하게 약화시킨다. 이러한 항체, 단편 및 융합 분자는 B7-H5-CD28H 상호작용의 생물학적 효과를 약화시키는데 특히 유용하다.
따라서 본 발명은 특히 인간화 항체 및 단편 또는 인간 항체 및 단편을 포함한 그러한 실시양태의 분자에 관한 것이다.
가장 바람직하게는, 그러한 분자는, 내생적 농도로 발현되어 피험체 세포의 표면 상에 배열될 때 B7-H5에 결합할 수 있는 충분한 친화성 및 친화력을 보유한다. 용어 "내생적 농도"는 분자가 정상 세포, 암 세포, 또는 병원체에 감염된 세포에서 천연적으로 발현(즉, 발현 벡터 또는 재조합 프로모터의 부재 하에서)되는 수준을 의미한다.
(1) 바람직한 항-인간 B7-H5 항체 및 그들의 CDR
본 발명에 따라서, 그러한 분자는 인간 B7-H5에 면역특이적인 항체를 생성시키기 위한 하이브리도마 라인을 스크리닝하고, 이후 선택적으로 그러한 라인 중에서 활성(예를 들면, 중화 활성, 효현 활성, 변경된 신호 전달 활성 등)에 대해 스크리닝하여 생성시킬 수 있다. 본 발명은 특히, 햄스터 항-인간 B7-H5 클론: 2D3 및 18C3을 제공한다. 항체 2D3 및 18C3은 인간 B7-H5에 결합할 수 있고 CD28H와 B7-H5의 상호작용을 실질적으로 차단할 수 있다. CD28H와 B7-H5의 상호작용을 실질적으로 차단할 수 있는 항체는 염증성 질환 및 자가변역 질환의 치료에서 특별한 용도를 갖는다. CD28H와 B7-H5의 상호작용을 실질적으로 차단할 수 없는 항체는 진단에서 특별한 용도를 갖는데, 그러한 항체는 B7-H5:CD28H 상호작용의 존재, 위치 및 유포를 검출하는데 사용될 수 있기 때문이다.
CD28H와 B7-H5의 상호작용을 차단할 수 있는 항-인간 B7-H5 클론에 의해 발현되는 항체는 서열분석되어 그들의 가변 도메인이 밝혀졌다. 가변 도메인의 CDR 서열은 굵게 밑줄표시하였다:
항-인간 B7-H5 클론 2D3
중쇄 가변 영역(서열번호 9):
Figure pct00015
중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 10):
Figure pct00016
경쇄 가변 영역(서열번호 1l):
Figure pct00017
경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 12):
Figure pct00018
항-인간 B7-H5 클론 18C3
중쇄 가변 영역 (서열번호 13):
Figure pct00019
중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 14):
Figure pct00020
경쇄 가변 영역(서열번호 15):
Figure pct00021
경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 28):
Figure pct00022
(2) B7- H5:CD28H 상호작용을 차단하는 본 발명의 항-인간 B7-H3 항체의 공통 CDR
공통 CDR 서열 및 유사한 결합 속성을 제공하는 가능성있는 변이체 CDR 서열을 동정하기 위해서 동정된 항체의 CDR 분석을 수행하였다. 그러한 변이체 CDR은 표 1에 따라 Blosum62.iij 분석을 사용해 산출하였다. 표 1은 Blosum62.iij 치환 점수를 나타낸다. 점수가 높을수록 치환이 더 보존성임을 나타내고 따라서 그 치환이 기능에 영향을 미치지 않을 가능성이 더 있다.
Figure pct00023
본 발명은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 변이체 CDR을 갖는 신규한 항체 및 항원 결합 단편의 형성을 가능하게 한다. 본 발명의 방법은 실질적인 개수의 구별되는 CDR을 동정하였기 때문에, 본 발명은 특정 동정된 CDR의 임의 변이체에서 필요할 가능성이 있는 CDR 잔기의 인식을 가능하게 한다. 이러한 잔기는 표 2 및 표 3에 굵게 나타내었다. 비교된 CDR 중에서 다양한 것으로 확인된 잔기들의 경우. 표 1의 치환 점수는 허용된 치환의 정체를 결정하는 수단을 제공한다. 예를 들어, 특정 CDR의 특정 잔기가 R 또는 S처럼 다양하게 확인되면, R 및 S는 치환 점수가 -1이므로, 치환 점수가 -1 또는 그 이상인 R 또는 S의 임의 치환이, 기능성 항-B7-H5 항체 또는 항원 결합 단편을 형성시키기 위해 변이체 CDR이 대신 적용될 수 있게 허용하는 특정 CDR의 그것과 충분히 유사한 결합 속성을 갖는 변이체 CDR을 생성시키는 것이 관찰된 변이체(R 또는 S)만큼 가능성있다(또는 R 또는 S보다 더 가능성있다). 각 위치에 대해서, 보다 높은 치환 점수를 갖는 잔기의 선택은 보다 낮은 치환 점수를 갖는 잔기의 선택보다 선호된다.
표 2는 항-B7-H5 항체의 중쇄 CDR의 분석결과를 나타내고 본 발명의 관찰 및 바람직한 변이체 경쇄("LC") 항-B7-H5 CDR을 제공한다.
Figure pct00024
표 3은 항-B7-H5 항체의 경쇄 CDR의 분석결과를 나타내고 본 발명의 관찰 및 바람직한 변이체 항-B7-H5-중쇄("HC") CDR의 공통 서열을 제공한다.
Figure pct00025
Figure pct00026
따라서, 항-B7-H5 항체의 CDR을 보유하는 항체 및 이의 항원 결합 단편: 2D3 및 13C3 이외에도, 본 발명은 부가적으로 상기 기술된 경쇄 및/또는 중쇄 공통 서열을 갖는 CDR을 보유하는 항체 및 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 발명은 임의의 상기 클론에 의해 생성된 햄스터 단일클론 항체의 가변 중쇄 및/또는 경쇄의 아미노산 서열과 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일하고, B7-H5와의 면역특이적 결합을 나타내는 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄의 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이의 단편을 포함한다. 본 발명은 또한 상기 열거한 클론의 CDR의 아미노산 서열과 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일하고, B7-H5와의 면역특이적 결합을 나타내는 CDR을 포함하는 항체 또는 이의 단편을 포함한다. 2종 아미노산 서열의 동일성 비율 결정은 BLAST 단백질 비교에 의해 결정할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 항체는 1, 2, 또는 3 경쇄 CDR 및 1, 2, 또는 3 중쇄 CDR(가장 바람직하게는 3 경쇄 CDR 및 3 중쇄 CDR)을 포함하는 면역글로불린 분자(예를 들면, 항체, 디아바디, 융합 단백질 등)이고, 여기서 경쇄 CDR은
(1) 항-인간 B7-H5 항체 2D3/18C3의 경쇄 CDR1;
(2) 항-인간 B7-H5 항체 2D3 또는 항-인간 B7-H5 항체 18C3의 경쇄 CDR2 또는 이러한 항체의 CDR2의 공통 서열; 및
(3) 항-인간 B7-H5 항체 2D3/18C3의 경쇄 CDR3
을 포함한다.
대안적으로 바람직한 실시양태에서, 면역글로불린 분자는 1, 2, 또는 3 경쇄 CDR 및 1, 2, 또는 3 중쇄 CDR(가장 바람직하게는 3 경쇄 CDR 및 3 중쇄 CDR)을 포함하고, 여기서 중쇄 CDR은
(1) 항-인간 B7-H5 항체 2D3/18C3의 중쇄 CDR1;
(2) 항-인간 B7-H5 항체 2D3/18C3의 중쇄 CDR2; 및
(2) 항-인간 B7-H5 항체 2D3/18C3의 중쇄 CDR3
을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 기술된 바람직한 항체의 1, 2, 3, 4, 5, 또는 그 이상, 바람직하게는 모든 6 CDR을 포함하고 인간 B7-H5에 결합하는 능력을 나타낸다.
(3) CD28H 융합 단백질
CD28H 융합 단백질이 B7-H5와 CD28H 간 신호 전달의 길항제일 수 있음을 발견하였다. 따라서, CD28H 융합 단백질 및 면역계를 하향조절하기 위한 이의 사용 방법이 또한 개시된다. 따라서, 수용체 융합 폴리펩티드는 전형적으로 경막 CD28H에 결합하는 리간드의 능력을 차단하고 B7-H5:CD28H 매개 신호 전달을 유도하거나 또는 유지한다.
본원에 개시된 CD28H 융합 폴리펩티드는 (i) 제2 폴리펩티드에 직접 융합되거나, 또는 (ii) 경우에 따라 제2 폴리펩티드에 융합된 링커 펩티드 서열에 융합된 CD28H 폴리펩티드의 전부 또는 일부를 포함한다. 이러한 융합 단백질은 이량체 또는 다량체를 형성할 수 있다. 펩티드/폴리펩티드 링커 도메인은 개별 도메인이거나, 또는 대안적으로 융합 단백질의 다른 도메인(CD28H 폴리펩티드 또는 제2 폴리펩티드) 중 하나 안에 포함될 수 있다. 유사하게, 융합 단백질을 이량체 또는 다량체화하는 기능의 도메인은 개별 도메인이거나, 또는 융합 단백질의 다른 도메인(CD28H 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드 또는 펩티드/폴리펩티드 링커 도메인) 중 하나 내에 함유될 수 있다. 일 실시양태에서, 이량체화/다량체화 도메인 및 펩티드/폴리펩티드 링커 도메인은 동일하다.
본원에 개시된 융합 단백질은 화학식 I: N-R1-R2-R3-C이고, 여기서 "N"은 융합 단백질의 N-말단을 의미하고, "C"는 융합 단백질의 C-말단을 의미한다. 바람직한 실시양태에서, "R1"은 CD28H 폴리펩티드이고, "R2"는 선택적인 펩티드/폴리펩티드 링커 도메인이고, "R3"은 제2 폴리펩티드이다. 대안적으로, R3은 CD28H 폴리펩티드일 수 있고, R1은 제2 폴리펩티드일 수 있다.
a. 제1 융합 파트너
수용체 융합 단백질은 전장 CD28H 폴리펩티드를 포함하거나, 또는 전장 CD28H의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서 제1 융합 파트너는 CD28H의 가용성 단편, 예를 들어 CD28H의 세포외 도메인의 전부 또는 일부분, 또는 이의 변이체이다. 임의의 포유동물 서열 CD28H를 사용할 수 있다. 예로서, 인간 서열과 기지의 이소형 및 이의 변이체는 상기 서열에서 제공한다. 일부 실시양태에서, 다른 포유동물 서열, 예컨대 마우스 서열은 당분야에서 공지이고 사용할 수 있다. 개시된 융합 단백질에서 유용한 인간 CD28H 폴리펩티드는 서열번호 7과의 서열 동일성이 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100%인 아미노산 서열, 바람직하게는 서열번호 7의 세포외 도메인과의 서열 동일성이 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100%인 아미노산 서열을 갖는다. 개시된 융합 단백질에서 유용한 인간 CD28H 폴리펩티드는 서열번호 8과의 서열 동일성이 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100%인 핵산 서열, 또는 바람직하게는 서열번호 8의 핵산 서열에 의해 코딩되는 세포외 도메인과의 서열 동일성이 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100%인 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다.
b. 제2 융합 파트너
CD28H 폴리펩티드는 제2 폴리펩티드에 융합될 수 있다. 제2 폴리펩티드의 존재는 융합 폴리펩티드의 가용성, 안정성, 친화성 및/또는 원자가를 변경시킬 수 있다. 본원에서 사용하는 "원자가"는 분자 당 이용할 수 있는 결합 부위의 수를 의미한다. 일 실시양태에서, 제2 폴리펩티드는 상이한 공급원 또는 상이한 단백질에서 유래된 폴리펩티드이다.
일 실시양태에서, 제2 폴리펩티드는 바람직하게는 인간 면역글로불린 Cγ1 사슬의 힌지, CH2 및 CH3 영역, 또는 쥣과동물 면역글로불린 Cγ2a 사슬의 힌지, CH2 및 CH3 영역에 상응하는 아미노산 서열을 갖는, 면역글로불린 중쇄 불변 영역의 1 이상의 도메인을 함유한다.
바람직한 이량체 융합 단백질에서, 이량체는 이량체화된 정상 Ig 중쇄에서 이황화 연결된 동일 Cys 잔기인 Ig 중쇄 중 2의 힌지 영역 내 Cys 잔기의 공유 결합에 의한다. 이러한 단백질을 CD28H-Ig라고 한다.
일 실시양태에서, 면역글로불린 불변 도메인은 특정 세포 유형과의 결합을 강화시키거나, 생체이용률을 증가시키거나, 또는 CD28H 폴리펩티드, 융합 단백질, 또는 이의 단편의 안정성을 증가시키는 1 이상의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 함유할 수 있다. 적합한 아미노산 치환은 상기 기술된 바와 같이, 보존성 및 비보존성 치환을 포함한다.
다른 실시양태에서, 제2 폴리펩티드는 추가적인 분자가 CD28H 융합 단백질에 결합할 수 있는 접합 도메인을 가질 수 있다. 이러한 일 실시양태에서, 접합된 분자는 특정 장기 또는 조직으로 융합 단백질을 표적화할 수 있다. 이러한 다른 실시양태에서, 접합된 분자는 CD28H 융합 단백질의 효과를 강화 또는 증가시킬 수 있는 다른 면역조정제이다. 다른 실시양태에서, 접합된 분자는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이다.
융합 단백질의 Fc 부분은 이소타입 또는 하위부류에 의해 다양하고/하거나, 키메라 또는 하이브리드이고/이거나, 예를 들면, 이펙터 기능, 반감기의 제어, 조직 접근성을 개선시키고, 생물리적 특징, 예컨대 안정성을 증가시키고, 생산 효율을 개선(및 비용 절감)시키도록 변형될 수 있다. 개시된 융합 단백질의 제작에 유용한 많은 변형 및 이들의 제조 방법은 당분야에 공지되어 있고, 예를 들면, 다음의 문헌들을 참조한다: [Mueller, et al, Mol. Immun., 34(6):441-452 (1997), Swann, et al, Cur. Opin. Immun., 20:493-499 (2008), 및 Presta, Cur. Opin. Immun. 20:460-470 (2008)]. 일부 실시양태에서, Fc 영역은 천연 IgG1, IgG2, 또는 IgG4 Fc 영역이다. 일부 실시양태에서, Fc 영역은 하이브리드, 예를 들면, IgG2/IgG4 Fc 불변 영역으로 이루어진 키메라이다. Fc 영역에 대한 변형은 제한없이, Fc 감마 수용체 및 보체와의 결합을 방지하도록 변형된 IgG4, 1 이상의 Fc 감마 수용체와의 결합을 개선하도록 변형된 IgG1, 이펙터 기능을 최도화하도록 변형(아미노산 변화)된 IgG1, 글리칸 무함유/변경된 IgG1(전형적으로 발현 숙주의 변화에 의함), 및 FcRn과의 변경된 pH-의존적 결합성을 갖는 IgG1을 포함한다. Fc 영역은 전체 힌지 영역, 또는 전체 미만의 힌지 영역을 포함할 수 있다.
비호지킨 림프종 또는 발덴스트롬 마크로글로불린혈증에 대해 리툭시맙(CD20에 대한 키메라 마우스/인간 IgG1 단일클론 항체)으로 치료된 환자에서 치료 결과는 인간 IgG1의 Fc 도메인에 대해 개별적인 고유 친화성을 갖는 Feγ 수용체의 대립유전자 변이체의 개별적인 발현과 상관있었다. 구체적으로, 저 친환성 활성화 Fc 수용체 CD16A(FcγRIIIA)의 고친화성 대립유전자를 갖는 환자는 보다 높은 반응율을 보였고, 비호지킨 림프종의 경우, 개선된 무진행 생존을 보였다. 다른 실시양태에서, Fc 도메인은 저친화성 억제 Fc 수용체 CD32B(FcγRIIB)와의 결합을 감소시키고 저친화성 활성화 Fc 수용체 CD16A(FcγRIIIA)와의 결합의 야생형 수준을 보유하거나 또는 강화시키는 1 이상의 아미노산 잔기, 결실 또는 치환을 함유할 수 있다.
다른 실시양태는 그들의 반감기를 증가시키는 FcR과의 결합이 감소된 IgG2-4 하이브리드 및 IgG4 돌연변이체를 포함한다. 대표적인 IG2-4 하이브리드 및 IgG4 돌연변이체는 다음의 문헌들에 기술되어 있다: Angal, S. et al, Molecular Immunology, 30(1): 105-108 (1993); Mueller, J. et al, Molecular Immonology, 34(6): 441-452 (1997); 및 Wang et al.의 미국 특허 제6,982,323호. 일부 실시양태에서, IgG1 및/또는 IgG2 도메인이 결실되며, 예를 들어, Angal et al.은 세린 241이 프롤린으로 치환된 IgG1 및 IgG2를 기술한다.
바람직한 실시양태에서, Fc 도메인은 CD16A와의 결합이 강화된 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 함유한다. CD16A와의 결합을 증가시키고 CD32B와의 결합을 감소시킨 인간 IgG1의 Fc 도메인 내 다수의 치환이 당분야에 알려져 있고, 예를 들어, [Stavenhagen, et al, Cancer Res., 57(18):8882-90 (2007)]에 기술되어 있다. CD32B와의 결합이 감소되고/되거나 CD16A와의 결합이 증가된 인간 IgG1 Fc 도메인의 예시적인 변이체는 F243L, R929P, Y300L, V305I 또는 P296L 치환을 포함한다. 이들 아미노산 치환은 임의 조합으로 인간 IgG1 Fc 도메인에 존재할 수 있다. 일 실시양태에서, 인간 IgG1 Fc 도메인 변이체는 F243L, R929P 및 Y300L 치환을 포함한다. 다른 실시양태에서, 인간 IgG1 Fc 도메인 변이체는 F243L, R929P, Y300L, V305I 및 P296L 치환을 포함한다. 다른 실시양태에서, 인간 IgG1 Fc 도메인 변이체는 N297Q 치환을 포함하며, 이 돌연변이는 FcR 결합을 없애기 때문이다.
c. 펩티드 또는 폴리펩티드 링커 도메인
개시된 CD28H 융합 단백질은 경우에 따라 제2 폴리펩티드로부터 CD28H 폴리펩티드를 이격시키는 펩티드 또는 폴리펩티드 링커 도메인을 포함한다.
1. 항체의 힌지 영역
일 실시양태에서, 링커 도메인은 면역글로불린의 힌지 영역을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 힌지 영역은 인간 면역글로불린으로부터 유래된다. 힌지가 유도될 수 있는 적합한 인간 면역글로불린은 IgG, IgD 및 IgA를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 힌지 영역은 인간 IgG에서 유래된다. 면역글로불린 힌지 영역 및 다른 도메인의 아미노산 서열은 당분야에 잘알려져 있다.
2. 다른 펩티드/폴리펩티드 링커 도메인
다른 적합한 펩티드/폴리펩티드 링커 도메인은 천연 발형 또는 비천연 발생 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함한다. 펩티드 링커 서열은 길이가 적어도 2 아미노산이다. 바람직하게 펩티드 또는 폴리펩티드 도메인은 탄성 펩티드 또는 폴리펩티드이다. 본원에서 "탄성 링커"는 탄성 링커가 없는 2개의 연결된 폴리펩티드 보다 2개의 연결된 폴리펩티드에 대해 높은 회전 자유를 제공하는 펩티드 결합(들)에 의해 연결된 2 이상의 아미노산 잔기를 함유하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 의미한다. 이러한 회전 자유는 탄성 링커에 의해 연결된 2 이상의 항원 결합 부위가 각각 표적 항원(들)에 보다 효율적으로 접근할 수 있게 한다. 예시적인 탄성 펩티드/폴리펩티드는 제한없이, 아미노산 서열 Gly-Ser, Gly-Ser-Gly-Ser(서열번호 16), Ala-Ser, Gly-Gly-Gly-Ser(서열번호 17), (Gly4-Ser)3(서열번호 18) 및 (Gly4-Ser)4(서열번호 19)을 포함한다. 부가적인 탄성 펩티드/폴리펩티드 서열은 당분야에 공지되어 있다.
일 실시양태에서, 제1 융합 파트너는 CD28H의 단편이다. 바람직한 실시양태에서, 융합 단백질은 Ig Gc 영역에 융합된, CD28H의 세포외 도메인, 또는 이의 단편을 포함한다. 재조합 CD28H-Ig 융합 단백질은 이전에 기술된 바와 같이, 뉴로필린 또는 플렉신의 세포외 도메인의 코딩 영역, 또는 이의 단편을 인간 IgG1 또는 마우스 IgG2a의 Fc 영역, 또는 다른 적합한 IgG 도메인에 융합시켜 제조될 수 있다(Chapoval, et al, Methods Mol. Med., 45:247-255 (2000)).
d. 예시적인 융합 단백질
대표적인 인간 CD28H-Ig 융합 단백질의 아미노산 서열은 (서열번호 20)CD28H-hIgG4(CD28H ECD aa23-140, 경쇄 카파 신호 펩티드: CD28H 서열은 굵게 표시하였고; 돌연변이된 인간 IgG4 Fc 서열은 밑줄표시하고, 세린 228에서 프롤린 돌연변이는 이중밑줄표시하였다)이다:
Figure pct00027
융합 단백질은 부가적으로 N-말단 리더 서열(경쇄 카파 리더 서열(서열번호 21의 잔기 1-20),
Figure pct00028
또는 천연 발생 CD28H 리더 서열, 예컨대 하기 서열(서열번호 22)을 포함한다:
Figure pct00029
본 발명에 따라서, CD28H 서열을 인간 IgG4 영역에 융합된 것으로 도시하였지만, 이러한 서열은 대안적으로 임의의 Ig 이소타입, 또는 임의의 다른 단백질에 융합될 수 있다.
서열번호 21의 신호 서열을 포함하는 서열번호 20의 인간 CD28H-Ig를 코딩하는 DNA 서열은 하기 서열(서열번호 23)이다:
Figure pct00030
E. 본 발명의 바람직한 조성물의 치료적 및 예방적 용도
본원에서 사용하는 용어 "치료하다", "치료하는", "치료" 및 "치료적 용도"는 감소되거나 또는 증가된 면역 반응으로 득을 보는 질환 또는 질병의 1 이상의 증상의 제거, 감소 또는 완화를 의미한다. 본원에서 사용되는 "치료 유효량"은 질환 또는 병태의 증상의 감소 또는 완화를 매개하기에 충분한, 변경된 면역 반응, 보다 바람직하게는 임상적으로 관련있는 변경된 면역 반응을 매개하기에 충분한 치료제의 양을 의미한다. 효과는 그 규모가 수용 피험체의 건강 또는 예후에 영향을 미치기에 충분하다면 임상적으로 관련있다. 치료 유효량은 질환 진행을 감소 또는 최소화, 예를 들면 자가면역 반응 또는 염증성 반응 또는 이식 거부를 지연 또는 최소화하기에 충분한 치료제의 양을 의미한다. 치료 유효량은 또한 질환의 치료 또는 관리에서 치료적 이득을 제공하는 치료제의 양을 의미한다. 또한, 치료제, B7-H5 항체 또는 B7-H5 융합 단백질 또는 CD28H 융합 단백질과 관련하여 치료 유효량은 질환의 치료 또는 관리에서 치료적 이득을 제공하는, 예를 들면 질환을 치료 또는 관리하기에 충분한 치료 항체의 치료 효율을 강화시키기에 충분한, 치료제 단독, 또는 다른 치료제와 조합된 양을 의미한다.
본원에서 사용하는 용어 "예방제"는 질병 또는 질환의 임의 증상을 검출하기 전에 그러한 질병 또는 질환을 예방하는데 사용될 수 있는 작용제를 의미한다. "예방적 유효"량은 그러한 보호를 매개하는데 충분한 예방제의 양이다. 예방적 유효량은 또한 질환의 예방에서 예방적 이득을 제공하는 예방제의 양을 의미한다. 또한, 예방제와 관련하여 예방적 유효량은 질환의 예방에서 예방적 이득을 제공하는 예방제 단독, 또는 다른 작용제와 조합된 양을 의미한다.
본원에서 제공하는 투약량 및 투여 빈도는 용어 치료 유효 및 예방적 유효를 포함한다. 용량 및 빈도는 또한 전형적으로 투여되는 특정 치료제 또는 예방제, 암의 중증도 및 유형, 투여 경로를 비롯해, 환자의 체중, 반응 및 과거 약력에 의존적인 각 환자에 특이적인 요인들에 따라 다양하게 된다. 적합한 치료 계획은 그러한 요인들을 고려하고 예를 들면, 문헌에 보고되고 [Physician 's Desk Reference (56th Ed., 2002)]에서 추천하는 용량에 따라서 당분야의 숙련가가 선택할 수 있따.
본 발명은 B7-H5에 결합하여 B7-H5 기능 및/또는 CD28H와의 결합을 길항(즉, 약화 또는 손상)시켜서 T 세포 증식 및/또는 사이토카인 생성을 약화 또는 손상시키는 분자, 예컨대 항-B7-H5 항체(및 B7-H5에 결합하는 이러한 항체의 단편) 또는 CD28H Ig에 관한 것이다. 피험체에 이러한 분자의 투여는 피험체의 면역계를 하향 조절한다.
면역계의 이러한 하향-조정은 염증성 및 자가면역 질환 및 이식 거부의 치료에서 바람직하다. 본 발명의 항체를 투여하여 치료할 수 있는 자가면역 질병의 예는 제한없이, 원형 탈모증, 강직성 척추염, 항인지질 증후군, 자가면역 애디슨병, 부신의 자가면역 질환, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 자가면역 난소염 및 고환염, 자가면역 혈소판감소증, 베체트병, 수포성 유천포창, 심근병증, 셀리악 스프루-피부염, 만성 피로 면역 이상기능 증후군(CFIDS), 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증, 척-스트라우스 증후군, 반흔성 유사천포창, 크레스트 증후군, 한랭응집소병, 크론병, 원판상 루푸스, 본태성 혼합 한랭글로불린혈증, 섬유근통-섬유근염, 사구체신염, 그레이브병, 길랑-바레 증후군, 하시모토 갑상선염, 특발성 폐섬유증, 특발성 혈소판감소성 자반(ITP), IgA 신경병증, 소아 관절염, 편평태선, 홍반성 낭창, 메니에르병, 혼합 결합 조직병, 다발성 경화증, 시신경 척수염(NMO), 제1형 또는 면역 매개 당뇨병, 중증 근무력증, 심상성 천포창, 악성 빈혈, 결절성 다발동맥염, 다연골염, 다선성 증후군, 류마티스성 다발근통, 다발성근염 및 피부근염, 원발성 무감마글로불린혈증, 원발성 담즙성 간경화증, 건선, 건선성 관절염, 레이놀드 현상, 라이터 증후군, 류마티스 관절염, 유육종증, 경피증, 쇼그렌 증후군, 근육강직 증후군, 전신 홍반성 낭창, 홍반성 낭창, 다카야스 동맥염, 측두 동맥염/ 거대 세포 동맥염, 궤양성 대장염, 포도막염, 맥관염, 예컨대 포진성 피부염, 혈관염, 백반증, 및 베게너 육아종증을 포함한다.
개시된 항-B7-H5 항체 및 항원 결합 단편 및 CD28H 융합 단백질, 특히 이의 CD28H-Ig 융합 단백질로 예방, 치료 또는 관리할 수 있는 염증성 질환의 예는 제한없이 천식, 뇌염, 염증성 장질환, 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD), 알레르기성 질병, 패혈성 쇼크, 폐섬유증, 미분화성 척추관절증, 미분화성 관절증, 관절염, 염증성 골용해증, 및 만성 바이러스 또는 박테리아 감염에 기인한 만성 염증을 포함한다.
항-B7-H5 항체는 B7-H5의 항-이디오타입 펩티드 또는 항체(Wallmann, J. et al. (2010) "Anti-Ids in Allergy: Timeliness of a Classic Concept," World Allergy Organiz. J. 3(6): 195-201 ; Nardi, M. et al. (2000) "Antiidiotype Antibody Against Platelet Anti-GpIIIa Contributes To The Regulation Of Thrombocytopenia In HIV-1-ITP Patients," J. Exp. Med. 191(12):2093-2100) 또는 모방체(Zang, Y.C. et al. (2003) "Human Anti-Idiotypic T Cells Induced By TCR Peptides Corresponding To A Common CDR3 Sequence Motif In Myelin Basic Protein-Reactive T Cells," Int. Immunol. 15(9): 1073-1080; Loiarro, M. et al. (Epub 2010 Apr 8) "Targeting TLR/IL-1R Signalling In Human Diseases," Mediators Inflamm. 2010:674363)를 생성하는데 적용될 수 있다. 이러한 분자는 B7-H5의 대용체로서 제공되고, 따라서 피험체에 그들의 투여는 CD28H 대항 수용체를 관여시켜 내생성 B7-H5 수용체에 결합하는 것을 방지하여 그러한 피험체의 면역계를 하향 조정한다. 이러한 분자는 그라프트 대 숙주 질환, 염증성, 및 자가면역 질환의 치료에서 유용하다.
따라서, 본 발명의 항체 및 이의 항원 결합 단편 및 융합 단백질은 그라프트 대 숙주 질환, 염증성 및 자가면역 질환의 치료에서 유용하다.
유사하게, 이러한 항체 및 이러한 수용체/리간드 간 결합을 강화시키는 효현제 항체, 및 다른 수용체 효현제, 예컨대 B7-H5 융합 단백질은 B7-H5 신호전달의 효현제로서 유용성을 가지며, 따라서 암 및 감염성 질환의 치료에서 유용하다. 따라서, 본 발명은 또한 CD28H에 결합하여 CD28H 기능(즉, 신호 전달) 및/또는 B7-H5와의 결합을 효현시켜서 T 세포 증식 및/또는 사이토카인 생성을 증가 또는 자극시키는 CD28H 효현제 분자, 예컨대 B7-H5-Ig 융합 단백질에 관한 것이다. 피험체에 이러한 분자의 투여는 피험체의 면역계를 상향 조절하고 암 또는 감염 질환을 갖는 피험체를 치료하는데 사용될 수 있다. B7-H5 경로에 T 세포 활성화가 관여하므로, 이러한 분자는 백신과 병용시 특히 유용하다.
본원에서 제공되는 CD28H 효현제는 면역 반응-자극 치료제로서 생체내 및 생체외에서 대체로 유용하다. 예를 들면, CD28H 효현제는 CD28H 효현제의 양을 피험체에 투여하여 암의 치료를 위해 숙주에서 면역 반응을 자극하거나 또는 강화시키는데 유용하다. 제공되는 조성물 및 방법으로 치료될 수 있는 암의 유형은 제한없이, 방광, 뇌, 유방, 자궁경부, 직결장, 식도, 신장, 간, 폐, 비인두, 췌장, 전립선 피부, 위, 자궁, 난소, 고환 및 혈액의 암을 포함한다.
치료될 수 있는 악성 종양은 종양이 유래된 조직의 배아 기원에 따라 본원에서 분류한다. 암종은 내배엽 또는 외배엽 조직, 예컨대 피부 또는 내부 장기 및 분비선의 상피 내벽에서 발생된 종양이다. 덜 빈번하게 발생되는 육종은 중배엽 결합 조직, 예컨대 뼈, 지방, 및 연골에서 유래된다. 백혈병 및 림프종은 골수의 조혈 세포의 악성 종양이다. 백혈병은 단일 세포로서 증식되지만, 림프종은 종양 덩어리로 성장하는 경향이 있다. 악성 종양은 신체의 수많은 장기 또는 조직에서 나타나 암을 정착시킨다.
CD28H 효현제는 제한없이, 면역결핍(e.g., HIV), 유두종(e.g., HPV), 헤르페스(e.g., HSV), 뇌염, 인플루엔자(e.g., 인간 인플루엔자 바이러스 A), 및 일반 감기(e.g., 인간 리노바이러스) 바이러스 감염을 포함한, 국소 또는 전신 바이러스 감염의 치료를 위해 투여될 수 있다. 예를 들면, CD28H 효현제 조성물을 포함하는 약학 제제는 바이러스 피부 질환, 예컨대 헤르페스 병변 또는 대상포진, 또는 생식기 혹을 치료하기 위해 국소적으로 투여될 수 있다. CD28H 효현제 조성물의 약학 제제는 또한 제한없이, AIDS, 인플루엔자, 일반 감기, 또는 뇌염을 포함한, 전신 바이러스 질환을 치료하는데 투여될 수 있다.
치료할 수 있는 대표적인 감염은 제한없이, 악티노마이세스(Actinomyces), 아나바에나(Anabaena), 바실러스(Bacillus), 박테로이데스(Bacteroides), 브델로비브리오(Bdellovibrio), 보르데텔라(Bordetella), 보렐리아(Borrelia), 캄필로박터(Campylobacter), 카울로박터(Caulobacter), 클라미디아(Chlamydia), 클로로비움(Chlorobium), 크로마티움(Chromatium), 클로스트리디움(Clostridium), 코리네박테리움(Corynebacterium), 사이토파가(Cytophaga), 데이노코커스(Deinococcus), 에스케리치아(Escherichia), 프란시셀라(Francisella), 할로박테리움(Halobacterium), 헬리오박터(Heliobacter), 해모필러스(Haemophilus), 헤모필러스 인플루엔자 B형(Hemophilus influenza type B)(HIB), 히스토플라스마(Histoplasma), 하이포미크로비움(Hyphomicrobium), 레지오넬라(Legionella), 리슈마니아(Leishmania), 렙트스피로시스(Leptspirosis), 리스테리아(Listeria), 메닌고코커스(Meningococcus) A, B 및 C, 메타노박테리움(Methanobacterium), 마이크로코커스(Micrococcus), 마이오박테리움(Myobacterium), 마이코플라스마(Mycoplasma), 믹소코커스(Myxococcus), 나이세리아(Neisseria), 니트로박터(Nitrobacter), 오실라토리아(Oscillatoria), 프로클로론(Prochloron), 프로테우스(Proteus), 슈도모나스(Pseudomonas), 포도스피릴륨(Phodospirillum), 리켓챠(Rickettsia), 살모넬라(Salmonella), 시겔라(Shigella), 스피릴륨(Spirillum), 스피로채타(Spirochaeta), 스타필로코커스(Staphylococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 설폴로버스(Sulfolobus), 써모플라스마(Thermoplasma), 티오바실러스(Thiobacillus), 및 트레포네마(Treponema), 비브리오(Vibrio), 여시니아(Yersinia), 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 히스토플라스마 캡설라넘(Histoplasma capsulatum), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 노카르디아 아스테로이데스(Nocardia asteroides), 리켓챠 리켓시(Rickettsia ricketsii), 리켓챠 티피(Rickettsia typhi), 마이코플라즈마 뉴모니아(Mycoplasma pneumoniae), 클라미디알 프시타시(Chlamydial psittaci), 클라미디알 트라코마티스(Chlamydial trachomatis), 플라스모듐 팔시파럼(Plasmodium falciparum), 플라스모듐 바이박스(Plasmodium vivax), 트리파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei), 엔트아메바 히스톨리티카(Entamoeba histolytica), 톡소플라즈마 곤디(Toxoplasma gondii), 트리코모나스 바지날리스(Trichomonas vaginalis) 및 스키스토소마 만소니(Schistosoma mansoni)를 포함한 미생물에 의해 야기되는 감염을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
개시된 CD28H 효현제 또는 이를 코딩하는 핵산은 단독으로 또는 임의의 다른 적합한 치료와 병용하여 투여될 수 있다. 일 실시양태에서 CD28H 효현제는 백신 조성물과 함께, 또는 그의 성분으로서 투여될 수 있다. 백신 조성물의 적합한 성분은 항원 및/또는 보조제이다. 개시된 CD28H 효현제는 백신의 투여 전, 그와 동시발생적으로, 또는 그 후에 투여될 수 있다. 일 실시양태에서, CD28H 효현제는 백신 투여와 동시에 투여된다.
개시된 CD28H 효현제 조성물은 사전에 존재하는 항원, 예컨대 암을 갖는 피험체의 종양 항원에 대한 피험체의 면역 반응을 개시하거나 또는 강화시키는데 사용될 수 있는, 예방 백신, 또는 치료 백신과 함께 투여될 수 있다.
예방, 치료 또는 탈감작된 면역 반영의 바람직한 결과는 당분야에 잘알려진 원리에 따라, 질환에 따라 다양할 수 있다. 유사하게, 암, 알레르겐 또는 감염성 작용제에 대한 면역 반응은 질환을 완전하게 치료하거나, 증상을 완화시키거나, 또는 질환에 대한 전반적인 치료 중재술의 한 측면일 수 있다. 예를 들면, 암에 대한 면역 반응의 자극은 치료에 영향을 미치기 위해서 수술적, 화학요법, 방사선, 호르몬 및 다른 면역학적 접근법과 커플링될 수 있다.
F. 투여 방법
다양한 전달 시스템에 공지되어 있고 치료 또는 예방 조성물을 투여하는데 사용될 수 있고, 예를 들면 리포솜내 캡슐화, 미세입자, 미세캡슐, 항체 또는 융합 단백질을 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체-매개 세포내흡수(예를 들어, [Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432] 참조), 레트로바이러스 또는 다른 벡터의 일부로서 핵산의 구축물 등이 있다.
항체 및 융합 단백질을 투여하는 방법은 제한없이 비경구 투여(예를 들어, 피내, 근육내, 복강내, 정맥내 및 피하), 경막외, 및 점막(예를 들어, 비내 및 경구 경로)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체 또는 융합 단백질은 근육내, 정맥니 또는 피하 투여된다. 조성물은 임의의 편리한 경로, 예를 들면, 주입 또는 볼러스 주사에 의해, 상피 또는 점막피부 내막(예를 들면, 경구 점막, 직강 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여되고 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신이거나 또는 국소일 수 있다. 또한, 폐 투여가 예를 들어, 흡입기 또는 네뷸라이저, 및 에어로졸화제와의 제제의 사용에 의해 적용될 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제6,019,968호; 제5,985, 20호; 제5,985,309호; 제5,934,272호; 제5,874,064호; 제5,855,913호; 제5,290,540호; 및 제4,880,078호; 및 PCT 공개 특허 출원 WO 92/19244; WO 97/32572; WO 97/44013; WO 98/31346; 및 WO 99/66903을 참조한다. 특정 실시양태에서, 치료가 필요한 영역에 국소적으로 약학 조성물을 투여하는 것이 바람직할 수 있고, 이는 예를 들면, 제한없이, 국소 주입, 주사, 또는 임플란트를 통해 수행될 수 있고, 상기 임플란트는 막, 예컨대 시알라스틱 막, 섬유를 포함한, 다공성, 비다공성, 또는 젤라틴성 재료이다. 바람직하게, 항체 또는 융합 단백질을 투여시 항체 또는 융합 단백질이 흡수되지 않는 재료를 사용하도록 주의해야 한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 융합 단백질은 항체 또는 융합 단백질의 표적 전달을 위한 리포솜으로 제제화된다. 리포솜은 수층을 캡슐화시키는 동심으로 정렬된 인지질 이중층으로 구성된 소포체이다. 리포솜은 전형적으로 다양한 유형의 지질, 인지질, 및/또는 계면활성제를 포함한다. 리포솜의 성분은 생물학적 막의 지질 배열과 유사한, 이중층 구조로 배열된다. 리포솜은 부분적으로 그들의 생체적합성, 낮은 면역원성, 및 낮은 독성덕분에 특히 바람직한 전달 비히클이다. 리포솜을 제조하는 방법은 당분야에 공지이고 본 발명에 포함되며, 예를 들어 [Epstein et al, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 82: 3688; Hwang et al, 1980 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030-4]; 미국 특허 제4,485,045호 및 제4,544,545호를 참조한다.
예컨대 미국 특허 제5,013,556[호에 개시된 바와 같은, 혈청 반감기가 연장된, 즉 순환 시간이 증강된 리포솜을 제조하는 방법을 사용해 리포솜-항체 조성물을 제조할 수 있다. 바람직한 리포솜은 순환계로부터 빠르게 제거되지 않으며, 즉 단핵 식균세포 시스템(MPS)에 흡수되지 않는다. 본 발명은 당분야에 알려진 공통 방법으로 제조된 입체적으로 안정한 리포솜을 포함한다. 특정 작용 기전에 의해 제한하지 않지만, 입체적으로 안정한 리포솜은 혈청 단백질과 리포솜의 원치않는 반응을 감소시키고, 혈청 성분의 옵소틴화를 감소시키며 MPS에 의한 인식을 감소시킨, 부피가 크고 고도로 탄성인 친수성 모이어티를 갖는 지질 성분을 함유한다. 입체적으로 안정한 리포솜은 폴리에틸렌 글리콜을 사용해 제조하는 것이 바람직하다. 리포솜 및 입체적으로 안정한 리포솜의 제조는 예를 들어, [Bendas et al., 2001 BioDrugs, 15(4): 215-224; Allen et al., 1987 FEBS Lett. 223 : 42-6; Klibanov et al, 1990 FEBS Lett, 268: 235-7; Blum et al, 1990, Biochim. Biophys. Acta., 1029: 91-7; Torchilin et al, 1996, J. Liposome Res. 6: 99-116; Litzinger et al, 1994, Biochim. Biophys. Acta, 1190: 99-107; Maruyama et al, 1991, Chem. Pharm. Bull, 39: 1620-2; Klibanov et al., 1991, Biochim Biophys Acta, 1062; 142-8; Allen et al, 1994, Adv. Drug Deliv. Rev, 13 : 285-309]를 참조한다. 본 발명은 또한 예를 들어, 미국 특허 제4,544,545호를 참조하는 바와 같이, 특정 장기 표적화, 또는 미국 공개 특허 출원 제2005/0074403호를 참조하는 바와 같이, 특정 세포 표적화를 위해 적합화된 리포솜을 포함한다. 개시된 조성물 및 방법에서 사용하기 위해 특히 유용한 리포솜은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤, 및 PEG 유도체화 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 사용한 역상 증발 방법을 통해 생성될 수 있다. 리포솜은 정해진 기공 크기의 필터를 통해 압출시켜서 바람직한 직경의 리포솜을 생성시킨다. 일부 실시양태에서, 항체의 단편, 예를 들어 F(ab')는 이전에 기술된 방법을 사용해 리포솜에 접합될 수 있으며, 예를 들어, [Martin et al, 1982, J. Biol. Chem. 257: 286-288]를 참조한다.
B7-H5 항체, 또는 B7-H5 또는 CD28H 융합 단백질은 또한 면역리포솜으로 제제화될 수 있다. 면역리포솜은 리포솜 조성물을 의미하는데, 여기서 항체 또는 이의 단편이 리포솜 표면에 공유적으로 또는 비공유적으로 연결된다. 리포솜 표면에 항체를 연결하는 화학은 당분야에 공지이고 본 발명에 포함되며, 예를 들어, 미국 특허 제6,787,153호, [Allen et al, 1995, Stealth Liposomes, Boca Rotan: CRC Press, 233-44; Hansen et al, 1995, Biochim. Biophys. Acta, 1239: 133-144]를 참조한다. 가장 바람직한 실시양태에서, 개시된 방법 및 조성물에서 사용하기 위한 면역리포솜은 또한 입체적으로 안정하다. 바람직하게, 항체 또는 융합 단백질은 리포솜의 지질 이중층에 안정하게 뿌리내린, 소수성 앵커에 공유적으로 또는 비공유적으로 연결된다. 소수성 앵커의 예에는 제한없이, 인지질, 예를 들어, 포스파티딜에탄올아민(PE), 포스파티딜이노시톨(PI)이 포함된다. 항체와 소수성 앵커 사이에 공유 결합을 얻기 위해서, 당분야에 공지된 임의의 생화학적 전략을 사용할 수 있으며, 예를 들어, [J. Thomas August, ed., 1997, Gene Therapy: Advances in Pharmacology, Volume 40, Academic Press, San Diego, CA, p. 399-435]를 참조한다. 예를 들면, 항체 분자 상의 작용기는 리포솜 회합된 소수성 앵커 상의 활성 기와 반응할 수 있으며, 예를 들어, 항체의 리신 측쇄의 아미노 기가 리포솜 회합된 수용성 카르보디이미드로 활성화된 N-글루타릴-포스파티딜에탄올아민에 커플링되거나, 또는 환원된 항체의 티올 기가 티올 반응성 앵커, 예컨대 피리딜티오프로피오닐포스파티딜에탄올아민을 통해 리포솜에 커플링될 수 있다. 예를 들면, [Dietrich et al, 1996, Biochemistry, 35: 1100-1105; Loughrey et al, 1987, Biochim. Biophys. Acta, 901: 157-160; Martin et al, 1982, J. Biol. Chem. 257: 286-288; Martin et al, 1981, Biochemistry, 20: 4429-38]를 참조한다. 특정 작용 기전에 의해 한정하지 않지만, 항체 또는 융합 단백질을 포함하는 면역리포솜 제제는 치료제로서 특히 효과적인데, 그들이 항체 또는 융합 단백질을 표적 세포, 즉 항체 또는 융합 단백질이 결합하는 수용체를 포함하는 세포의 세포질로 전달시키기 때문이다. 면역리포솜은 바람직하게 혈액, 특히 표적 세포에서 반감기가 증가되었으며, 표적 세포의 세포질로 내재화될 수 있어서 치료제의 손실 또는 내부리소솜 경로에 의해 분해를 피할 수 있다.
면역리포솜 조성물은 1 이상의 소포체 형성 지질, 항체 또는 이의 단편 또는 유도체 또는 융합 단백질, 및 경우에 따라 친수성 중합체를 포함한다. 소포체 형성 지질은 바람직하게는 2개의 탄화수소 사슬, 예컨대 아실 사슬 및 극성 헤드기를 갖는 지질이다. 소포체 형성 지질의 예에는 인지질, 예를 들어 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티드산, 포스파티딜이노시톨, 스핑고미엘린, 및 당지질, 예를 들어 세레브로시드, 강글리오시드를 포함한다. 제제에 유용한 추가적인 지질은 당분야의 숙련가에게 공지이고 본 발명에 포함된다. 일부 실시양태에서, 면역리포솜 조성물은 리포솜의 혈청 반감기를 증가시키는, 친수성 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 및 강글리오시드 GM1을 더 포함한다. 친수성 중합체를 접합시키는 방법은 당분야에 알려져 있고 본 발명에 포함된다. 면역리포솜 및 그들의 제조 방법에 대한 리뷰를 위해, 예를 들어, 미국 공개 특허 출원 제2003/0044407호; PCT 국제 특허 출원 WO 97/38731, [Vingerhoeads et al, 1994, Immunomethods, 4: 259-72; Maruyama, 2000, Biol. Pharm. Bull. 23(7): 791-799; Abra et al, 2002, Journal of Liposome Research, 12(1&2): 1-3; Park, 2002, Bioscience Reports, 22(2): 267-281; Bendas et al, 2001 BioDrugs, 14(4): 215-224, J. Thomas August, ed., 1997, Gene Therapy: Advances in Pharmacology, Volume 40, Academic Press, San Diego, CA, p. 399-435]를 참조한다.
항체 및 융합 단백질은 항체의 양을 표시하는, 밀봉 용기, 예컨대 앰풀 또는 샤세에 포장될 수 있다. 일 실시양태에서, 항체는 건조 멸균된 동결건조 분말 또는 무수 농축물로서 밀봉 용기에 제공되고 예를 들어 물 또는 염수를 사용해 피험체에 투여하기 적절한 농도로 재구성될 수 있다. 바람직하게, 항체 또는 융합 단백질은 적어도 5 mg, 보다 바람직하게는 적어도 10 mg, 적어도 15 mg, 적어도 25 mg, 적어도 35 mg, 적어도 45 mg, 적어도 50 mg, 또는 적어도 75 mg의 단위 용량으로 밀봉 용기에 건조 멸균 동결건조 분말로서 제공된다. 동결건조된 항체 또는 융합 단백질은 그들 원래 용기 내에서 2 내지 8℃에 저장되어야 하고 항체는 재구성된 후 12시간 이내, 바람직하게는 6시간 이내, 5시간 이내, 3시간 이내, 또는 1시간 이내에 투여되어야 한다. 대안적인 실시양태에서, 항체 또는 융합 단백질은 항체, 융합 단백질, 또는 접합된 분자의 양 및 농도가 표시된 밀봉 용기에 액체 형태로 제공된다. 바람직하게, 항체 또는 융합 단백질의 액체 형태는 밀봉 용기에 적어도 1 mg/mL, 보다 바람직하게 적어도 2.5 mg/mL, 적어도 5 mg/mL, 적어도 8 mg/mL, 적어도 10 mg/mL, 적어도 15 mg/kg, 적어도 25 mg/mL, 적어도 50 mg/mL, 적어도 100 mg/mL, 적어도 150 mg/mL, 적어도 200 mg/mL의 융합 단백질의 항체를 제공한다.
제제에 적용되는 정확한 용량은 또한, 투여 경로, 및 병태의 심각성에 의존적이고, 의사의 판단 및 각 환자의 상황에 따라 결정되어야 한다. 유효한 용량은 시험관내 또는 동물 모델 시험 시스템에서 유도된 용량-반응 곡선으로부터 외삽시킬 수 있다. 항체 및 융합 단백질의 경우, 환자에 투여되는 용량은 전형적으로 환자 체중에 대해 0.0001 mg/kg 내지 100 mg/kg이다. 바람직하게, 환자에 투여되는 용량은 환자 체중에 대해 0.0001 mg/kg 내지 20 mg/kg, 0.0001 mg/kg 내지 10 mg/kg, 0.0001 mg/kg 내지 5 mg/kg, 0.0001 내지 2 mg/kg, 0.0001 내지 1 mg/kg, 0.0001 mg/kg 내지 0.75 mg/kg, 0.0001 mg/kg 내지 0.5 mg/kg, 0.0001 mg/kg 내지 0.25 mg/kg, 0.0001 내지 0.15 mg/kg, 0.0001 내지 0.10 mg/kg, 0.001 내지 0.5 mg/kg, 0.01 내지 0.25 mg/kg 또는 0.01 내지 0.10 mg/kg이다. 일반적으로, 인간 항체는 외부 폴리펩티드에 대한 면역 반응으로 인해 다른 종 유래의 항체 보다 인간 체내에서 반감기가 보다 길다. 따라서, 보다 낮은 인간 항체 용량 및 낮은 투여 빈도가 종종 가능하다. 또한, 항체 또는 이의 단편, 또는 융합 단백질의 투여 빈도 및 용량은 예를 들면 지질화와 같은 변형에 의해 항체 또는 융합 단백질의 흡수 및 조직 침주를 증강시켜 감소시킬 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 조성물은 제어 방출 또는 지속 방출 시스템으로 전달될 수 있다. 당분야의 숙련가에게 공지된 임의 기술을 사용하여 1 이상의 항체 또는 융합 단백질을 포함하는 지속 방출 제제를 생성시킬 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제4,526,938호; PCT 공개 특허 출원 WO 91/05548; PCT 공개 특허 출원 WO 96/20698; [Ning et al, 1996, "Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel," Radiotherapy & Oncology 39: 179-189, Song et al, 1995, "Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek et al, 1997, "Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application," Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854; 및 Lam et al, 1997, "Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery," Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760]를 참조한다. 일 실시양태에서, 제어 방출 시스템에 펌프를 사용할 수 있다(Langer, 상동; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20; Buchwald et al, 1980, Surgery 88:507; 및 Saudek et al, 1989, N. Engl. J. Med. 321 :574). 다른 실시양태에서, 중합성 재료를 사용해 항체의 제어 방출을 획득할 수 있다(예를 들어, 다음의 문헌들을 참조함: Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, 1983, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; 또한, Levy et al, 1985, Science 228: 190; During et al, 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al, 1989, J. Neurosurg. 7 1 : 105); 미국 특허 제5,679,377호; 미국 특허 제5,916,597호; 미국 특허 제5,912,015호; 미국 특허 제5,989,463호; 미국 특허 제5,128,326호; PCT 공개 특허 출원 WO 99/15154; 및 PCT 공개 특허 출원 WO 99/20253). 지속 방출 제제에 사용되는 중합체의 예에는 제한없이, 폴리(2-히드록시에틸메타크릴레이트), 폴리(메틸메타크릴레이트, 폴리(아크릴산), 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트), 폴리(메타크릴산), 폴리글리코리드(PLG), 폴리언하이드리드, 폴리(N-비닐 피롤리돈), 폴리(비닐알콜), 폴리아크릴아미드, 폴리(에틸렌글리콜), 폴리락티드(PLA), 폴리(락티드-코-글리코리드)(PLGA), 및 폴리오르쏘에스테르가 포함된다. 또 다른 실시양태에서, 제어 방출 시스템은 치료 표적(예를 들면, 폐)에 가깝게 위치시켜서, 오직 전신 용량의 일부분만 필요할 수 있다(예를 들어, [Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)] 참조). 다른 실시양태에서, 제어 방출 임플란트로서 유용한 중합성 조성물은 Dunn et al.(예를 들어 미국 특허 제5,945,155호)에 따라 사용할 수 있다. 이러한 특정 방법은 중합체 시스템으로부터 생체활성 재료의 인시츄 제어 방출의 치료적 효과를 기반으로 한다. 일반적으로 이식은 치료적 처치를 필요로 하는 환자의 체내 어느곳에서건 일어날 수 있다. 다른 실시양태에서, 비중합성 지속 전달 시스템을 사용하여서 피험체 체내 비중합성 임플란트가 약물 전달 시스템으로 사용된다. 체내 이식시, 임플란트의 유기 용매가 조성물로부터 주변 조직 유체로 방산되거나, 분산되거나, 또는 침출되고, 비중합성 재료가 점차적으로 응집되거나 또는 침전되어, 고형, 미세다공성 매트릭스를 형성한다(미국 특허 제5,888,533호 참조). 제어 방출 시스템은 Langer의 리뷰(1990, Science 249: 1527-1533)에 설명되어 있다. 당분야의 숙련가에게 알려진 임의 기술을 사용하여, 1 이상의 치료제, 즉 B7-H5 항체 또는 CD28H 융합 단백질을 포함하는 지속 방출 제제를 생성시킬 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제4,526,938호; 국제 공개 특허 출원 WO 91/05548 및 WO 96/20698; [Ning et al, 1996, Radiotherapy & Oncology 39: 179-189; Song et al, 1995, PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek et al, 1997, Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854; 및 Lam et al, 1997, Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760]를 참조한다.
치료 또는 예방 조성물이 B7-H5 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 항체, 또는 CD28H 융합 단백질, 예를 들면 CD28H-Ig 융합 단백질을 코딩하는 핵산인 특정 실시양태에서, 핵산은 적절한 핵산 발현 벡터의 일부로서 구축하여 레트로바이러스 벡터(예를 들면, 미국 특허 제4,980,286호 참조)에 의해, 또는 직접 주사에 의해, 또는 미세입자 충격법(예를 들면, 유전자총; 바이로리스틱, Dupont)을 사용하여, 또는 지질 또는 세포 표면 수용체 또는 형질감염제로 코팅하거나, 또는 핵으로 진입하는 것으로 알려진 호메오박스-유사 펩티드(예를 들면, [Joliot et al, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1864-1868] 참조)에 연결시켜 투여하여, 세포내가 되도록 투여해서, 그 코딩되는 항체 또는 융합체의 발현이 촉진되도록 생체내 투여할 수 있다. 대안적으로, 핵산은 세포내로 유입되어 상동성 재조합에 의한 발현을 위해 숙주 세포 DNA 내에 도입될 수 있다.
항체 또는 융합 단백질의 치료 또는 예방적 유효량으로 피험체의 치료는 단일 치료를 포함하거나, 또는 바람직하게는 일련의 치료를 포함할 수 있다.
G. 약학 조성물
조성물은 단위 제형의 제조에 사용할 수 있는 약학 조성물(즉, 피험체 또는 환자에 투여하기 적합한 조성물) 및 약학 조성물의 제조에 유용한 대량 약물 조성물(예를 들면, 불순하거나 또는 멸균되지 않은 조성물)을 포함한다. 이러한 조성물은 예방적 또는 치료 유효량의 본원에 개시된 예방제 및/또는 치료제 또는 그러한 작용제의 조합 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 바람직하게, 개시된 조성물은 예방적 또는 치료 유효량의 항체 또는 융합 단백질 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
특정 실시양태에서, 용어 "약학적으로 허용되는"은 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되었거나 미국 약전 또는 동물, 보다 구체적으로 인간에서 사용을 위해 일반적으로 인식되는 다른 약전에 열거되었음을 의미한다. 용어 "담체"는 치료제와 함께 투여되는 희석제, 보조제(예를 들면, 프로인트 보조제(완전 및 불완전)), 부형제, 또는 비히클을 의미한다. 이러한 약학적 담체는 페트롤륨, 동물, 식물 또는 합성 기원의 것들, 예컨대 땅콩유, 대두유, 미네랄유, 참깨유 등을 포함한, 오일 및 물과 같은 멸균 액체일 수 있다. 물은 약학 조성물이 정맥내 투여될 때 바람직한 담체이다. 염수액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액을 또한 특히 주사용 용액을 위한 액상 담체로서 사용할 수 있다. 적합한 약학 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 초크, 실리카겔, 스테아르산나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 조성물은, 바람직하다면, 또한 소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 에멀션, 정제, 알약, 캡슐, 분말, 지속 방출 제제 등의 형태를 취할 수 있다.
대체로, 조성물의 성분은 단위 제형에 개별적으로 또는 함께 혼합되어, 예를 들면 활성제의 양이 표시된 밀봉 용기, 예컨대 앰풀 또는 샤세 내 건조 동결건조 분말 또는 무수 농축물로서 제공된다. 조성물이 주입에 의해 투여되는 경우, 멸균 약학 등급 물 또는 염수를 함유하는 주입병에 분배될 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 주사용 멸균 수 또는 염수의 앰풀이 제공되어 투여 전에 성분들을 혼합하게 된다.
조성물은 중성 또는 염 형태로 제제화될 수 있다. 약학적으로 허용되는 염은 제한없이, 음이온, 예컨대 염산, 인산, 아세트산 옥살산, 타르타르산 등에 의해 유도된 것들과 형성된 것, 및 양이온, 예컨대 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 철 수산화물, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등에서 유도된 것과 형성된 것들을 포함한다.
H. 키트
일 실시양태는 항체 또는 융합 단백질로 채워진 1 이상의 용기를 포함하는 약학 팩 또는 키트를 제공한다. 부가적으로, 질환의 치료에 유용한 1 이상의 다른 예방제 또는 치료제는 또한 약학 팩 또는 키트에 포함될 수 있다. 일 실시양태는 약학 조성물의 성분 중 1 이상으로 채워진 1 이상의 용기를 포함하는 약학 팩 또는 키트를 제공한다. 경우에 따라 이러한 용기(들)와 연관된 것으로는 의약 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관이 규정한 형태의 주의서가 있을 수 있으며, 이러한 주의서는 인간 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매 기관의 승인을 반영한다.
본 발명은 상기 방법에서 사용할 수 있는 키트를 제공한다. 일 실시양태에서, 키트는 1 이상의 항체 또는 융합 단백질을 포함한다. 다른 실시양태에서, 키트는 1 이상의 용기에, 암의 치료에 유용한 1 이상의 다른 예방제 또는 치료제를 더 포함한다. 다른 실시양태에서, 키트는 암과 연관된 1 이상의 암 항원에 결합하는 1 이상의 세포독성 항체를 더 포함한다. 일정 실시양태에서, 다른 예방제 또는 치료제는 화힉요법제이다. 다른 실시양태에서, 예방제 또는 치료제는 생물학적 또는 호르몬 요법제이다.
I. 진단 방법
B7-H5 항체 및 그들의 항원 결합 단편은 진단 목적, 예컨대 B7-H5 발현과 연관된 질환, 질병 또는 감염을 검출, 진단 또는 모니터링하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명은 (a) 그러한 항원에 면역특이적으로 결합하는 1 이상의 항체(또는 이의 단편)을 사용하여 피험체의 세포 또는 조직 샘플에서 B7-H5의 발현을 분석하는 단계; 및 (b) 항원의 수준을 대조군 수준, 예를 들면, 정상 조직 샘플의 수준과 비교하여, 항원의 대조군 수준과 비교해 항원의 분석된 수준의 증가 또는 감소가 질환, 질병 또는 감염을 나타내는 것인 단계를 포함하는, 질환, 질병 또는 감염, 특히 자가면역 질환의 검출 또는 진단법을 제공한다. 이러한 항체 및 단편은 바람직하게 면역분석법, 예컨대 효소 연결 면역흡착 분석법(ELISA), 방사성 면역분석법(RIA), 및 형광 활성화 세포 분류법(FACS)에 적용된다.
일 실시양태는 시험관내 또는 인시츄 조직 샘플 또는 생체내의 세포에서 IHC 분석을 위한 시약으로서, 이러한 항체 및 단편, 및 특히 인간 B7-H5에 결합하는 그러한 항체 및 단편의 용도에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 항체 및 단편은 인간에서 질환, 질병 또는 감염의 검출 및 진단에서 유용하다. 일 실시양태에서, 그러한 진단은 a) B7-H5에 면역특이적으로 결합하는 표지된 항체 또는 항원 결합 단편의 유효량을 피험체에게 (예를 들면, 비경구적으로, 피하로, 또는 복강내로) 투여하는 단계; b) 표지된 분자가 B7-H5가 발현되는 피험체의 부위에 우선적으로 농축되게하는 (그리고 미결합 분자는 배경 수준으로 제거되게하는) 투여 후 시간 간격 동안 대기하는 단계; c) 배경 수준을 결정하는 단계; 및 d) 피험체에서 표지된 항체를 검출하여, 상기 배경 수준 이상으로 표지된 항체의 검출은 피험체가 질환, 질병, 또는 감염을 가짐을 나타내는 것인 단계를 포함한다. 이러한 실시양태에 따라서, 항체는 당분야의 숙련가에게 알려진 영상 시스템을 사용해 검출할 수 있는 영상화 모이어티로 표지된다. 배경 수준은 특정 시스템에 대해 이전에 결정된 표준값에 대해 검출된 표지화 분자의 양을 비교하는 것을 포함한, 다양한 방법에 의해 결정될 수 있다.
피험체의 크기 및 사용되는 영상화 시스템이 진단 영상을 생성하는데 필요한 영상 모이어티의 분량을 결정하게 된다는 것은 당분야에서 이해할 수 있을 것이다. 생체내 종양 영상화는 [S.W. Burchiel et al, "Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments," (Chapter 13 in TUMOR IMAGING: THE RADIOCHEMICAL DETECTION OF CANCER, S.W. Burchiel and B. A. Rhodes, eds., Masson Publishing Inc. (1982)에 기술되어 있다.
사용되는 표지 유형 및 투여 방식을 포함한, 몇몇 변수에 의존적으로, 표지된 분자가 피험체의 부위에 우선적으로 농축되게 하고 미결합 표지 분자는 배경 수준으로 제거되는 투여 후 시간 간격은 6 내지 48시간 또는 6 내지 24시간 또는 6 내지 12시간이다. 다른 실시양태에서, 투여 후 시간 간격은 5 내지 20일 또는 5 내지 10일이다.
일 실시양태에서, 질환, 질병 또는 감염을 모니터링하는 것은 예를 들면, 초기 진단 후 1개월, 초기 진단 후 6개월, 초기 진단 후 1년 등에, 질환, 질병 또는 감염의 진단 방법을 반복하여 수행된다.
표지된 분자의 존재는 생체내 스캐닝을 위해 당분야에 알려진 방법을 사용해 피험체에서 검출할 수 있다. 이들 방법은 사용된 표지 유형에 의존적이다. 당분야의 숙련가는 특정 표지를 검출하는 절절한 방법을 결정할 수 있다. 개시된 진단 방법에 사용할 수 있는 방법 및 장치는 제한없이, 컴퓨터 단층촬영법(CT), 전신 스캔법, 예컨대 양전자 방출 단층촬영법(PET), 자기 공명 영상법(MRI), 및 초음파검사법을 포함한다.
특정 실시양태에서, 분자는 방사성동위원소로 표지되고 방사능 반응성 수술 장비를 사용해 환자에서 검출된다(Thurston et al, 미국 특허 제5,441,050호). 다른 실시양태에서, 분자는 형광발광성 화합물로 표지되어 형광발괄 반응성 스캐닝 장비를 사용해 환자에서 검출된다. 다른 실시양태에서, 분자는 양전자 방출 금속으로 표지되어서 양전자 방출-단층촬영법을 사용해 환자에서 검출된다. 또 다른 실시양태에서 분자는 상자성 표지로 표지되어 자기 공명 영상법(MRI)을 사용해 환자에서 검출된다.
이제 일반적으로 본 발명을 기술하였지만, 이하 실시예를 참조하여 보다 쉽게 이해할 수 있을 것이지만, 이는 예시를 위해 제공하는 것이며 특정하지 않는한 본 발명을 제한하려는 의도가 아니다.
실시예 1
항-인간 B7-H5 항체의 단리 및 특징규명
항-인간 B7-H5 항체는 B7-H5로 햄스터를 면역화하고, B7-H5 면역반응성 항체를 발현하는 하이브리도마를 단리하여 획득하였다. 항체-생성 클론 2D3 및 18C3을 단리하였다. 도 4a-4b는 CHO 형질감염체에 의해 발현된 인간 B7-H5에 결합하는 클론 2D3 및 18C에 의해 생성된 항체의 능력을 보여준다.
B7-H5:CD28H 상호작용을 차단하는 단리된 항체의 능력은 이러한 항체 존재 하에서 인간 B7-H5-발현 CHO 형질감염체를 항온반응시키고 CD28H Ig(서열번호 20) 및 항-인간 Ig PE의 농도를 증가시켜서 결정하였다.
이러한 실험에서, 비차단 항체의 존재 하에서 항온반응시킨 세포는 CD28H Ig 에 결합할 수 있다(제2 이동 피크로서 확인)(도 5a-5b). 항체 2D3 및 18C3은 B7-H5:CD28H 상호작용을 차단할 수 있는 것으로 확인되었다.
본 발명의 항-B7-H5 항체(2D3)는 B7-H5:CD28H 상호작용을 차단하는 그 능력에 대해 시험되었다. B7-H5 Ig 융합체를 제조하였고 CD28H에 결합하여서 T 세포 반응을 자극할 수 있는 것으로 확인되었다(도 6). 융합 단백질은 쥣과동물 IgG2a 서열에 융합된 B7-H5의 세포외 도메인(서열번호 26)이다.
Figure pct00031
IgG2a 서열은 다음의 서열(서열번호 27)이다:
Figure pct00032
mIgG2a는 C-말단 Lys의 결실 또는 Fab 팔을 안정화시키기 위한 S->P 변형을 필요로하지 않는다(이하에 보다 상세히 기술하고 서열번호 20으로 표시된 바와 같음). 융합 단백질은 또한 다른 Ig 서열, 예를 들어 인간 IgG4로 제조될 수 있다. 인간 IgG4의 경우, 상기 기술된 예시적인 hIgG4 단백질에서 예시한 바와 같이, S->P 변형 및/또는 최종 Lys 잔기의 결실을 포함하는 것이 바람직할 수 있다.
융합 단백질은 CD33 신호 펩티드(천연 신호 펩티드 아님)를 코딩하는 벡터로부터 발현시켰다.
도 7은 사이토카인(IL-2, IFN-γ 및 IL-10)의 발현을 유도하는 B7-H5 Ig의 능력을 보여주어서, 면역계를 자극하는 분자의 능력이 확인되었다. 항-B7-H5 항체 2D3의 제공은 이러한 자극을 억제하였다(도 8). 항체는 또한 동종이계 T-세포 반응을 억제할 수 있는 것으로 확인되었다(도 9). 이들 결과는 그 CD28H 대항-수용체와 상호작용하는 B7-H5의 능력을 차단하도록 B7-H5에 결합할 수 있는 본 발명의 항체가 면역계 활성화에서 생리적 감소를 매개할 수 있음을 시사한다.
실시예 2
항-인간 B7-H5 항체는 생체내에서 활성화된 T 세포의 비율을 감소시킨다
항-인간 B7-H5 항체의 생체내 효과를 조사하기 위해서, 2천만 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 NOD scid IL2 수용체 감마 사슬 넉아웃(NSG) 마우스의 복강에 주사하였다(예를 들어, 다음의 문헌들을 참조함: Iorns, E. et al.(Epub 2012 Oct 31) "A New Mouse Model For The Study Of Human Breast Cancer Metastasis," PLoS One 7(10):e47995; Misharin, A.V. et al. (2012) "Development Of A New Humanized Mouse Model To Study Acute Inflammatory Artiritis" J. Transl. Med. 10: 190; Waldron-Lynch, F. et al. (Epub 2012 Aug 17) "Analysis Of Human Biologies With A Mouse Skin Transplant Model In Humanized Mice" Amer. J. Transplant. 12(10):2652-2662; Volk, A. et al. (2012) "Comparison Of Three Humanized Mouse Models For Adoptive T Cell Transfer," J. Gene Med. 14(8):540-548; Racki, W.J. et al. (2010) "NOD-scid IL2rgamma(null) Mouse Model Of Human Skin Transplantation And Allograft Rejection," Transplantation 89(5):527-536). 인산 완충 염수(PBS) 또는 항-인간 B7-H5 항체(2D3)를 동물의 꼬리 정맥에 주사하고 CD45RO+ 세포 중에서 CD28H+ 세포의 비율을 결정하였다.
도 10a 및 도 10b에 도시된 바와 같이, 비장(도 10a) 및 말초 혈액(도 10b)에서 활성화된(CD45RO+) 인간 T 세포 중 CD28H+의 비율은 항-인간 B7-H5 항체의 처리시 감소되었다. 따라서 B7-H5 항체 처리는 생체내에서 활성화된 T 세포의 비율을 감소시킨다. 대조적으로, 그러한 처리는 나이브(CD45RO-) T 세포 개체군에 대해서는 제한된 효과만을 가졌다(도 11a 및 도 11b).
실시예 3
재조합 항-인간 B7-H5 항체는 항원 특이성을 보유한다
IgG4 항체는 고유한 구조 및 기능적 특성을 가지며 생체내에서 "반-항체 교환"을 겪어서, 2종의 상이한 결합 특이성으로 구성된 재조합 항체가 얻어진다(Nirula, A. et al. (2011) "What Is Igg4? A Review Of The Biology Of A Unique Immunoglobulin Subtype," Curr. Opin. Rheumatol. 23(1):119-124; Aalberse, R.C. et al. (2009) "Immunoglobulin G4: An Odd Antibody," Clin. Exp. Allergy 39(4):469-477). Ser228은 Pro로 돌연변이되어 팔부분이 안정화된다. 키메라 hIgG4P는 "반-항체 교환"을 하지 않는다.
본 발명의 인간 B7-H5-결합 항체(항체 2D3 및 18C3)은 그들의 천연 햄스터 이소타입으로부터 인간 IgG4P 이소타입으로 재조합적으로 전환되었다. 인간 B7-H5를 발현하는 CHO 형질감염체는 이후 재조합 항체의 존재 하에서 항온반응시켰다. 도 12a-c에 도시한 바와 같이, 둘 모두의 인간 IgG4P 유도체 항체는 인간 B7-H5에 대한 면역특이적 결합 능력을 보유하고 B7-H5-CD28H 상호작용을 파괴하는 차단 능력을 보유하는 것으로 확인되었다(도 13, 패널 A-C). 도 14a-14b는 항체 2D3 및 18C3이 CD28H와 B7-H5의 상호작용을 매개하는, B7-H5의 제1 IgV 도메인을 인식함을 보여준다(도 14c). 도 15는 CHO 세포의 표면 상에서 발현되는 인간 B7-H5와의 결합에 대한 항체 2D3 및 18C3의 친화성을 비교하였다.
실시예 4
B7-H5:CD28H 상호작용의 차단은 파상풍 변성독소(TT)-특이적 T 세포 반응을 억제한다
기억-특이적 T 세포의 소환에 대한 B7-H5:CD28H 상호작용의 효과를 결정하기 위해서, 인간 PBMC와 자가 수지상 세포로 재구성된 NSG 마우스를 파상풍 변성독소("TT") 백신으로 면역화시켰다. 동일한 날에, 마우스를 대조군 Ig, 또는 항-인간 B7-H5 항체 2D3로 처리하였다. 7일 후, 복강 세포를 회수하고, TT 항원으로 재자극시켰다. T 세포 분열은 BrdU 도입을 통해 분석하였다. 배양 상등액 중 사이토카인을 인간 Thl/Th2 CBA 키트로 조사하였다.
이러한 조사 결과는 도 16a-16b에 도시하였다. 내생성 B7-H5:CD28H 상호작용은 TT-특이적 기억 T 세포의 소환에 중요한 것으로 나타났는데 B7-H5 차단 mAb 2D3으로 마우스 주사가 BrdU 도입으로 표시되는 바와 같이, TT 백신-유도 T 세포 증식을 유의하게 억제하였기 때문이다(도 16a, 패널 A-B). 결과적으로, IFN-γ, IL-5 및 IL-10을 포함하는 세포 배양액 중 사이토카인은 2D3 mAb에 의해 모두 실질적으로 감소하였다(도 16b, 패널 A-B). 함께 취합하여, 결과들은 B7-H5:CD28H 상호작용이 기억 T 세포의 소환에서 중요한 역할을 함을 시사한다.
실시예 5
B7-H5:CD28H 상호작용의 차단은 동종이계 T 세포 반응을 억제한다
생체내에서 동종이계 반응에 대한 B7-H5:CD28H 상호작용의 효과를 결정하기 위해서, 인간화 NSG 마우스를 동종이계 인간 대식 세포로 공격하였다. 같은 날, 각 마우스를 대조군 또는 2D3 mAb로 접종하였다. 7일에, 비장세포를 회수하고 동종이계 CD4 및 CD8 T 세포 증식을 세포내 염색을 통한 Ki-67 발현에 의해 평가하였다.
이 조사의 결과는 도 17에 나타내었다. 도 17에 도시한 바와 같이, 내생성 B7-H5:CD28H 상호작용은 동종이계 T 세포 반응에 중요한 것으로 나타났는데 B7-H5 차단 mAb 2D3로 마우스를 주사한 것이 Ki-67 발현으로 표시한 바와 같이, CD8+(도 17a) 및 CD4+(도 17b) T 세포 증식 둘 모두를 유의하게 억제하였다.
실시예 6
B7-H5:CD28H 상호작용의 차단은 인간 T 세포에서 AKT 활성화를 억제한다
이러한 조사 결과는 도 18에 나타내었다. 도 18에 나타낸 바와 같이, 내생성 B7-H5:CD28H 상호작용은 TCR 신호 존재 하에서 AKT 경로 활성화에 중요한 것으로 나타났다. TCR 및 B7-H5 융합 단백질의 동시 가교는 자극 후 30분에 AKT 인산화를 유도시킨 반면, TCR 가교 단독은 최소 AKT 인산화를 유도하였다. B7-H5 차단 항체 2D3의 포함은 AKT 활성화를 방해하여서, B7-H5 차단이 T 세포 AKT 경로 활성화를 차단할 수 있음을 시사한다.
실시예 7
B7-H5:CD28H 상호작용의 차단은 종양 세포에 대한 세포독성 T 림프구 사멸을 억제한다
이러한 조사 결과는 도 19에 도시하였다. 도 19에 도시한 바와 같이, 디코이 수용체 융합 단백질에 의한 B7-H5-CD28H 경로의 차단이 몇몇 이펙터 대 표적(E:T) 비 조건에서 CTL 사멸을 억제하는 것처럼, 세포독성 T 세포 발현된 CD28H에 대한 종양 연관 B7-H5의 상호작용은 세포독성 사멸 활성을 공자극하였다.
실시예 8
B7-H5:CD28H 상호작용의 차단은 자연 살해 세포 활성화를 억제한다
이러한 조사 결과는 도 20a-b에 도시하였다. 도 20a에서, 가용성 재조합 인간 IL-2의 존재 하에서 자연 살해 세포(NK)에 대한 CD16 및 B7-IT5 융합 단백질의 동시 가교는 NK 활성화 및 탈과립화를 유도(CD107a 표면 상향조절)하는 반면, CD16 단독 관여는 유의한 NK 탈과립화를 유도하지 않았다. B7-H5 항체 2D3에 의한 B7-H5-CD28H 경로 차단은 NK 탈과립화를 억제(도 20b)하여서, B7-H5가 NK 활성화를 공자극함을 시사한다.
본 명세서에 언급된 모든 출판물 및 특허는 각각의 개별 출판물 또는 특허 출원이 그 전체로 참조하여 편입시킨다고 구체적으로 및 개별적으로 표시한 만큼 동일한 정도로 참조하여 본원에 편입된다. 본 발명을 이의 특정 실시양태와 관련하여 기술하였지만, 추가의 변형을 가할 수 있고 본 출원은 대체로 본 발명의 원리에 따른 임의의 변동, 용도, 또는 적용을 포괄하고자 하며 본 발명이 속하는 분야에서의 공지되거나 또는 관례적인 실시에 속하고 앞서 기재된 바와 같은 필수 특징에 적용될 수 있는 본 발명으로부터의 벗어남을 포함할 수 있음을 이해한다.
SEQUENCE LISTING <110> The Johns Hopkins University Amplimmune, Inc. Chen, Lieping Yao, Sheng Liu, Linda Langermann, Solomon <120> Anti-B7-H5 Antibodies and Their Uses <130> AMP 1164 <150> 61/827,216 <151> 2013-05-24 <160> 29 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 414 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Lys Ala Gln Thr Ala Leu Ser Phe Phe Leu Ile Leu Ile Thr Ser 1 5 10 15 Leu Ser Gly Ser Gln Gly Ile Phe Pro Leu Ala Phe Phe Ile Tyr Val 20 25 30 Pro Met Asn Glu Gln Ile Val Ile Gly Arg Leu Asp Glu Asp Ile Ile 35 40 45 Leu Pro Ser Ser Phe Glu Arg Gly Ser Glu Val Val Ile His Trp Lys 50 55 60 Tyr Gln Asp Ser Tyr Lys Val His Ser Tyr Tyr Lys Gly Ser Asp His 65 70 75 80 Leu Glu Ser Gln Asp Pro Arg Tyr Ala Asn Arg Thr Ser Leu Phe Tyr 85 90 95 Asn Glu Ile Gln Asn Gly Asn Ala Ser Leu Phe Phe Arg Arg Val Ser 100 105 110 Leu Leu Asp Glu Gly Ile Tyr Thr Cys Tyr Val Gly Thr Ala Ile Gln 115 120 125 Val Ile Thr Asn Lys Val Val Leu Lys Val Gly Val Phe Leu Thr Pro 130 135 140 Val Met Lys Tyr Glu Lys Arg Asn Thr Asn Ser Phe Leu Ile Cys Ser 145 150 155 160 Val Leu Ser 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cccggacccc cgaagtgacc 540 tgcgtggtgg tggatgtgtc ccaggaagat cccgaggtgc agttcaattg gtacgtggac 600 ggcgtggaag tgcacaacgc caagaccaag cccagagagg aacagttcaa ctccacctac 660 cgggtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac caggattggc tgaacggcaa agagtacaag 720 tgcaaggtgt ccaacaaggg cctgcccagc tccatcgaaa agaccatctc caaggccaag 780 ggccagcccc gggaacccca ggtgtacaca ctgcctccaa gccaggaaga gatgaccaag 840 aaccaggtgt cactgacctg tctcgtgaag ggcttctacc cctccgatat cgccgtggaa 900 tgggagtcca acggccagcc tgagaacaac tacaagacca ccccccctgt gctggactcc 960 gacggctcct tcttcctgta ctcccgcctg accgtggaca agtccagatg gcaggaaggc 1020 aacgtgttct cctgctccgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagtcc 1080 ctgagcctgt cccccggcaa gtga 1104 <210> 24 <211> 546 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide - B7-H5ECD-hIgG4P fusion protein <400> 24 Ile Phe Pro Leu Ala Phe Phe Ile Tyr Val Pro Met Asn Glu Gln Ile 1 5 10 15 Val Ile Gly Arg Leu Asp Glu Asp Ile Ile Leu Pro Ser Ser Phe Glu 20 25 30 Arg Gly Ser Glu Val Val Ile His 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Gly 85 90 95 Cys Cys Cys Ala Thr Gly Ala Ala Cys Gly Ala Gly Cys Ala Gly Ala 100 105 110 Thr Cys Gly Thr Gly Ala Thr Cys Gly Gly Cys Cys Gly Gly Cys Thr 115 120 125 Gly Gly Ala Cys Gly Ala Gly Gly Ala Thr Ala Thr Thr Ala Thr Cys 130 135 140 Cys Thr Gly Cys Cys Cys Thr Cys Cys Ala Gly Cys Thr Thr Cys Gly 145 150 155 160 Ala Gly Cys Gly Gly Gly Gly Cys Thr Cys Cys Gly Ala Gly Gly Thr 165 170 175 Cys Gly Thr Gly Ala Thr Cys Cys Ala Cys Thr Gly Gly Ala Ala Gly 180 185 190 Thr Ala Cys Cys Ala Gly Gly Ala Cys Thr Cys Cys Thr Ala Cys Ala 195 200 205 Ala Gly Gly Thr Gly Cys Ala Cys Thr Cys Cys Thr Ala Cys Thr Ala 210 215 220 Cys Ala Ala Gly Gly Gly Cys Thr Cys Cys Gly Ala Cys Cys Ala Cys 225 230 235 240 Cys Thr Gly Gly Ala Ala Thr Cys Cys Cys Ala Gly Gly Ala Cys Cys 245 250 255 Cys Cys Ala Gly Ala Thr Ala Cys Gly Cys Cys Ala Ala Cys Cys Gly 260 265 270 Gly Ala Cys Cys Ala Gly Cys Cys Thr Gly Thr Thr Cys Thr Ala Cys 275 280 285 Ala Ala Cys Gly Ala Gly Ala Thr Cys Cys Ala Gly Ala Ala Cys Gly 290 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505 510 Cys Thr Gly Gly Ala Ala Gly Ala Thr Gly Gly Ala Cys Ala Ala Cys 515 520 525 Ala Cys Cys Cys Cys Cys Ala Thr Cys Thr Cys Cys Gly Ala Gly Ala 530 535 540 Ala Cys Ala Ala Cys Ala Thr Gly Gly Ala Ala Gly Ala Gly Ala Cys 545 550 555 560 Ala Gly Gly Cys Thr Cys Cys Cys Thr Gly Gly Ala Cys Thr Cys Cys 565 570 575 Thr Thr Cys Thr Cys Cys Ala Thr Cys Ala Ala Cys Thr Cys Cys Cys 580 585 590 Cys Cys Cys Thr Gly Ala Ala Cys Ala Thr Thr Ala Cys Cys Gly Gly 595 600 605 Cys Thr Cys Cys Ala Ala Cys Thr Cys Cys Thr Cys Cys Thr Ala Cys 610 615 620 Gly Ala Gly Thr Gly Cys Ala Cys Cys Ala Thr Cys Gly Ala Gly Ala 625 630 635 640 Ala Cys Thr Cys Cys Cys Thr Gly Cys Thr Gly Ala Ala Gly Cys Ala 645 650 655 Gly Ala Cys Cys Thr Gly Gly Ala Cys Cys Gly Gly Cys Ala Gly Ala 660 665 670 Thr Gly Gly Ala Cys Thr Ala Thr Gly Ala Ala Gly Gly Ala Cys Gly 675 680 685 Gly Cys Cys Thr Gly Cys Ala Cys Ala Ala Gly Ala Thr Gly Cys Ala 690 695 700 Gly Thr Cys Cys Gly Ala Gly Cys Ala Cys Gly Thr Gly Thr Cys Cys 705 710 715 720 Cys Thr Gly Thr Cys Cys Thr Gly Cys Cys Ala Gly Cys Cys Cys Gly 725 730 735 Thr Gly Ala Ala Cys Gly Ala Cys Thr Ala Cys Thr Thr Cys Ala Gly 740 745 750 Cys Cys Cys Cys Ala Ala Cys Cys Ala Gly Gly Ala Cys Thr Thr Cys 755 760 765 Ala Ala Ala Gly Thr Gly Ala Cys Cys Thr Gly Gly Thr Cys Cys Cys 770 775 780 Gly Gly Ala Thr Gly Ala Ala Gly Thr Cys Cys Gly Gly Cys Ala Cys 785 790 795 800 Cys Thr Thr Cys Ala Gly Cys Gly Thr Gly Cys Thr Gly Gly Cys Cys 805 810 815 Thr Ala Cys Thr Ala Cys Cys Thr Gly Thr Cys Cys Ala Gly Cys Thr 820 825 830 Cys Cys Cys Ala Gly Ala Ala Cys Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala Thr 835 840 845 Cys Ala Ala Cys Gly Ala Gly Thr Cys Cys Cys Gly Gly Thr Thr Cys 850 855 860 Thr Cys Cys Thr Gly Gly Ala Ala Cys Ala Ala Ala Gly Ala Gly Cys 865 870 875 880 Thr Gly Ala Thr Cys Ala Ala Cys Cys Ala Gly Thr Cys Cys Gly Ala 885 890 895 Cys Thr Thr Cys Thr Cys Cys Ala Thr Gly Ala Ala Cys Cys Thr Gly 900 905 910 Ala Thr Gly Gly Ala Cys Cys Thr Gly Ala Ala Cys Cys Thr Gly Thr 915 920 925 Cys Cys Gly Ala Cys Ala Gly Cys Gly Gly Cys Gly Ala Gly Thr Ala 930 935 940 Cys Cys Thr Gly Thr Gly Cys Ala Ala Cys Ala Thr Cys Thr Cys Cys 945 950 955 960 Ala Gly Cys Gly Ala Cys Gly Ala Gly Thr Ala Cys Ala Cys Cys Cys 965 970 975 Thr Gly Cys Thr Gly Ala Cys Cys Ala Thr Cys Cys Ala Cys Ala Cys 980 985 990 Cys Gly Thr Gly Cys Ala Cys Gly Thr Gly Gly Ala Ala Cys Cys Cys 995 1000 1005 Thr Cys Cys Cys Ala Gly Gly Ala Ala Ala Cys Cys Gly Ala Gly 1010 1015 1020 Thr Cys Thr Ala Ala Gly Thr Ala Cys Gly Gly Cys Cys Cys Thr 1025 1030 1035 Cys Cys Cys Thr Gly Cys Cys Cys Ala Cys Cys Thr Thr Gly Thr 1040 1045 1050 Cys Cys Cys Gly Cys Cys Cys Cys Thr Gly Ala Ala Thr Thr Thr 1055 1060 1065 Cys Thr Gly Gly Gly Cys Gly Gly Ala Cys Cys Cys Thr Cys Thr 1070 1075 1080 Gly Thr Gly Thr Thr Cys Cys Thr Gly Thr Thr Cys Cys Cys Cys 1085 1090 1095 Cys Cys Ala Ala Ala Gly Cys Cys Cys Ala Ala Gly Gly Ala Cys 1100 1105 1110 Ala Cys Cys Cys Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Cys Thr Cys Cys 1115 1120 1125 Cys Gly Gly Ala Cys Cys Cys Cys Cys Gly Ala Ala Gly Thr Gly 1130 1135 1140 Ala Cys Ala Thr Gly Cys Gly Thr Gly Gly Thr Gly Gly Thr Gly 1145 1150 1155 Gly Ala Thr Gly Thr Gly Thr Cys Cys Cys Ala Gly Gly Ala Ala 1160 1165 1170 Gly Ala Thr Cys Cys Cys Gly Ala Gly Gly Thr Gly Cys Ala Gly 1175 1180 1185 Thr Thr Cys Ala Ala Thr Thr Gly Gly Thr Ala Cys Gly Thr Gly 1190 1195 1200 Gly Ala Cys Gly Gly Cys Gly Thr Gly Gly Ala Ala Gly Thr Gly 1205 1210 1215 Cys Ala Cys Ala Ala Cys Gly Cys Cys Ala Ala Gly Ala Cys Cys 1220 1225 1230 Ala Ala Gly Cys Cys Cys Ala Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Ala 1235 1240 1245 Cys Ala Gly Thr Thr Cys Ala Ala Cys Thr Cys Cys Ala Cys Cys 1250 1255 1260 Thr Ala Cys Cys Gly Gly Gly Thr Gly Gly Thr Gly Thr Cys Thr 1265 1270 1275 Gly Thr Gly Cys Thr Gly Ala Cys Cys Gly Thr Gly Cys Thr Gly 1280 1285 1290 Cys Ala Cys Cys Ala Gly Gly Ala Cys Thr Gly Gly Cys Thr Gly 1295 1300 1305 Ala Ala Cys Gly Gly Cys Ala Ala Ala Gly Ala Gly Thr Ala Cys 1310 1315 1320 Ala Ala Gly Thr Gly Cys Ala Ala Gly Gly Thr Gly Thr Cys Cys 1325 1330 1335 Ala Ala Cys Ala Ala Gly Gly Gly Cys Cys Thr Gly Cys Cys Cys 1340 1345 1350 Ala Gly Cys Thr Cys Cys Ala Thr Cys Gly Ala Ala Ala Ala Gly 1355 1360 1365 Ala Cys Cys Ala Thr Cys Thr Cys Cys Ala Ala Gly Gly Cys Cys 1370 1375 1380 Ala Ala Gly Gly Gly Cys Cys Ala Gly Cys Cys Cys Cys Gly Gly 1385 1390 1395 Gly Ala Ala Cys Cys Cys Cys Ala Gly Gly Thr Gly Thr Ala Cys 1400 1405 1410 Ala Cys Ala Cys Thr Gly Cys Cys Thr Cys Cys Ala Ala Gly Cys 1415 1420 1425 Cys Ala Gly Gly Ala Ala Gly Ala Gly Ala Thr Gly Ala Cys Cys 1430 1435 1440 Ala Ala Gly Ala Ala Cys Cys Ala Gly Gly Thr Gly Thr Cys Cys 1445 1450 1455 Cys Thr Gly Ala Cys Thr Thr Gly Cys Cys Thr Cys Gly Thr Gly 1460 1465 1470 Ala Ala Gly Gly Gly Cys Thr Thr Cys Thr Ala Cys Cys Cys Cys 1475 1480 1485 Thr Cys Cys Gly Ala Thr Ala Thr Cys Gly Cys Cys Gly Thr Gly 1490 1495 1500 Gly Ala Ala Thr Gly Gly Gly Ala Gly Thr Cys Cys Ala Ala Cys 1505 1510 1515 Gly Gly Cys Cys Ala Gly Cys Cys Thr Gly Ala Gly Ala Ala Cys 1520 1525 1530 Ala Ala Cys Thr Ala Cys Ala Ala Gly Ala Cys Cys Ala Cys Cys 1535 1540 1545 Cys Cys Cys Cys Cys Thr Gly Thr Gly Cys Thr Gly Gly Ala Cys 1550 1555 1560 Thr Cys Cys Gly Ala Cys Gly Gly Cys Thr Cys Thr Thr Thr Cys 1565 1570 1575 Thr Thr Cys Cys Thr Gly Thr Ala Cys Thr Cys Cys Cys Gly Cys 1580 1585 1590 Cys Thr Gly Ala Cys Cys Gly Thr Gly Gly Ala Cys Ala Ala Gly 1595 1600 1605 Thr Cys Cys Ala Gly Ala Thr Gly Gly Cys Ala Gly Gly Ala Ala 1610 1615 1620 Gly Gly Cys Ala Ala Cys Gly Thr Gly Thr Thr Cys Thr Cys Cys 1625 1630 1635 Thr Gly Cys Ala Gly Cys Gly Thr Gly Ala Thr Gly Cys Ala Cys 1640 1645 1650 Gly Ala Gly Gly Cys Cys Cys Thr Gly Cys Ala Cys Ala Ala Cys 1655 1660 1665 Cys Ala Cys Thr Ala Cys Ala Cys Cys Cys Ala Gly Ala Ala Gly 1670 1675 1680 Thr Cys Cys Cys Thr Gly Ala Gly Cys Cys Thr Gly Thr Cys Cys 1685 1690 1695 Cys Cys Cys Gly Gly Cys Thr Gly Ala 1700 1705 <210> 26 <211> 318 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Polypeptide - extracellular domain <400> 26 Ile Phe Pro Leu Ala Phe Phe Ile Tyr Val Pro Met Asn Glu Gln Ile 1 5 10 15 Val Ile Gly Arg Leu Asp Glu Asp Ile Ile Leu Pro Ser Ser Phe Glu 20 25 30 Arg Gly Ser Glu Val Val Ile His Trp Lys Tyr Gln Asp Ser Tyr Lys 35 40 45 Val His Ser Tyr Tyr Lys Gly Ser Asp His Leu Glu Ser Gln Asp Pro 50 55 60 Arg Tyr Ala Asn Arg Thr Ser Leu Phe Tyr Asn Glu Ile Gln Asn Gly 65 70 75 80 Asn Ala Ser Leu Phe Phe Arg Arg Val Ser Leu Leu Asp Glu Gly Ile 85 90 95 Tyr Thr Cys Tyr Val Gly Thr Ala Ile Gln Val Ile Thr Asn Lys Val 100 105 110 Val Leu Lys Val Gly Val Phe Leu Thr Pro Val Met Lys Tyr Glu Lys 115 120 125 Arg Asn Thr Asn Ser Phe Leu Ile Cys Ser Val Leu Ser Val Tyr Pro 130 135 140 Arg Pro Ile Ile Thr Trp Lys Met Asp Asn Thr Pro Ile Ser Glu Asn 145 150 155 160 Asn Met Glu Glu Thr Gly Ser Leu Asp Ser Phe Ser Ile Asn Ser Pro 165 170 175 Leu Asn Ile Thr Gly Ser Asn Ser Ser Tyr Glu Cys Thr Ile Glu Asn 180 185 190 Ser Leu Leu Lys Gln Thr Trp Thr Gly Arg Trp Thr Met Lys Asp Gly 195 200 205 Leu 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65 70 75 80 Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His 85 90 95 Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys 100 105 110 Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser 115 120 125 Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met 130 135 140 Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro 145 150 155 160 Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn 165 170 175 Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met 180 185 190 Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser 195 200 205 Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr 210 215 220 Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys 225 230 <210> 28 <211> 337 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide - Polynucleotide Encoding Light Chain Variable Region Anti-Human B7-H5 Clone 18C3 <400> 28 gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact 60 atgagctgca aatccagtca gagtctgctc aacagtagaa cccgaaagaa ccagttggct 120 tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tctactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gcaagcaatc ttataatctt 300 cggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaac 337 <210> 29 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide - signal sequence <400> 29 Met Lys Ala Gln Thr Ala Leu Ser Phe Phe Leu Ile Leu Ile Thr Ser 1 5 10 15 Leu Ser Gly Ser Gln Gly 20

Claims (50)

  1. 6개 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
    여기서, 상기 CDR은
    (1) 서열번호 11의 3개 경쇄 CDR 및 서열번호 9의 3개 중쇄 CDR, 또는
    (2) 서열번호 15의 3개 경쇄 CDR 및 서열번호 13의 3개 중쇄 CDR
    을 포함하고,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 B7-H5에 결합하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 3개 경쇄 CDR은 서열번호 11의 아미노산 27-38을 포함하는 제1 경쇄 CDR, 서열번호 11의 아미노산 56-58을 포함하는 제2 경쇄 CDR, 및 서열번호 11의 아미노산 95-102를 포함하는 제3 경쇄 CDR을 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 3개 중쇄 CDR은 서열번호 9의 아미노산 26-33을 포함하는 제1 중쇄 CDR, 서열번호 9의 아미노산 51-58을 포함하는 제2 중쇄 CDR, 및 서열번호 9의 아미노산 97-106을 포함하는 제3 중쇄 CDR을 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 제1항에 있어서, 3개 경쇄 CDR은 서열번호 15의 아미노산 27-38을 포함하는 제1 경쇄 CDR, 서열번호 15의 아미노산 56-58을 포함하는 제2 경쇄 CDR, 및 서열번호 15의 아미노산 95-102를 포함하는 제3 경쇄 CDR을 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 3개 중쇄 CDR은 서열번호 13의 아미노산 26-33을 포함하는 제1 중쇄 CDR, 서열번호 13의 아미노산 51-58을 포함하는 제2 중쇄 CDR, 및 서열번호 13의 아미노산 97-106을 포함하는 제3 중쇄 CDR을 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  10. 제1항에 있어서, 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  11. 제1항에 있어서, 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  12. 제1항에 있어서, 결합되는 B7-H5가, 생세포의 표면 상에 배열되거나 또는 내생적 또는 형질감염 농도로 발현되는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  13. 제7항에 있어서, 생세포가 대식 세포 또는 수지상 세포인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  14. 제1항에 있어서, B7-H5가 인간 B7-H5인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  15. 제1항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
    (A) CD28H에 결합하는 B7-H5의 리간드의 능력을 약화시키고;
    (B) CD28H에 B7-H5가 결합한 결과로서 일어나는 신호 전달을 길항하고;
    (C) 동종이계 T 세포 반응을 억제하고;
    (D) 이들의 조합을 나타내는 것인
    항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 면역글로불린 불변 영역(Fc) 유래의 1 이상의 불변 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  17. 제16항에 있어서, 불변 도메인이 인간 불변 도메인인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  18. 제17항에 있어서, 인간 불변 도메인이 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 도메인인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  19. 제18항에 있어서, 인간 IgG 불변 도메인이 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 도메인인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 검출 가능하게 표지되거나 또는 접합 독소, 약물, 수용체, 효소, 수용체 리간드를 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 단일클론 항체, 인간 항체, 키메라 항체 또는 인간화 항체인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 이중특이적, 삼중특이적 또는 다중특이적 항체인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  23. 1 이상의 인간 IgG4 불변 도메인, 및
    서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 또는
    서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역
    을 포함하는 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 CD28H-Ig 융합 단백질 및 생리적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 피험체의 면역계를 하향조절하는 방법에 사용하기 위한 것인 약학 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 피험체가 자가면역 질환을 갖는 것인 약학 조성물.
  27. 제24항에 있어서, 자가면역 질환을 치료하는 방법에 사용하기 위한 것인 약학 조성물.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 자가면역 질환이 원형 탈모증, 강직성 척추염, 항인지질 증후군, 자가면역 애디슨병, 부신의 자가면역 질환, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 자가면역 난소염 및 고환염, 자가면역 혈소판감소증, 베체트병, 수포성 유천포창, 심근병증, 셀리악 스프루-피부염, 만성 피로 면역 이상기능 증후군(CFIDS), 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증, 척-스트라우스 증후군, 반흔성 유사천포창, 크레스트 증후군, 한랭응집소병, 크론병, 원판상 루푸스, 본태성 혼합 한랭글로불린혈증, 섬유근통-섬유근염, 사구체신염, 그레이브병, 길랑-바레 증후군, 하시모토 갑상선염, 특발성 폐섬유증, 특발성 혈소판감소성 자반(ITP), IgA 신경병증, 소아 관절염, 편평태선, 홍반성 낭창, 메니에르병, 혼합 결합 조직병, 다발성 경화증, 시신경 척수염(NMO), 제1형 또는 면역 매개 당뇨병, 중증 근무력증, 심상성 천포창, 악성 빈혈, 결절성 다발동맥염, 다연골염, 다선성 증후군, 류마티스성 다발근통, 다발성근염 및 피부근염, 원발성 무감마글로불린혈증, 원발성 담즙성 간경화증, 건선, 건선성 관절염, 레이놀드 현상, 라이터 증후군, 류마티스 관절염, 유육종증, 경피증, 쇼그렌 증후군, 근육강직 증후군, 전신 홍반성 낭창, 홍반성 낭창, 다카야스 동맥염, 측두 동맥염/거대 세포 동맥염, 궤양성 대장염, 포도막염, 맥관염, 예컨대 포진성 피부염, 혈관염, 백반증, 및 베게너 육아종증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 약학 조성물.
  29. 제25항에 있어서, 피험체가 염증성 질환을 갖는 것인 약학 조성물.
  30. 제24항에 있어서, 염증성 질환을 치료하는 방법에 사용하기 위한 것인 약학 조성물.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 염증성 질환이 천식, 뇌염, 염증성 장질환, 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD), 알레르기성 질병, 패혈성 쇼크, 폐섬유증, 미분화성 척추관절증, 미분화성 관절증, 관절염, 염증성 골용해증, 및 만성 바이러스 또는 박테리아 감염에 기인한 만성 염증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 약학 조성물.
  32. 제25항에 있어서, 피험체가 이식을 받았거나 또는 받을 것인 약학 조성물.
  33. 제24항에 있어서, 이식 거부를 치료하거나 또는 예방하는 방법에 사용하기 위한 것인 약학 조성물.
  34. 피험체에서 면역계를 하향조절하기 위한 의약의 제조에 있어서의, 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 CD28H-Ig 융합 단백질의 용도.
  35. 피험체에서 자가면역 질환을 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서의, 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 CD28H-Ig 융합 단백질의 용도.
  36. 피험체에서 염증성 질환을 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서의, 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 CD28H-Ig 융합 단백질의 용도.
  37. 피험체에서 이식 거부를 치료하거나 또는 예방하기 위한 의약의 제조에 있어서의, 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 CD28H-Ig 융합 단백질의 용도.
  38. 질환, 질병 또는 감염을 검출하거나 또는 진단하는 방법으로서, (a) 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 사용하여 피험체의 세포 또는 조직 샘플에서 B7-H5의 발현을 분석하는 단계; 및 (b) B7-H5의 수준을 대조군 수준과 비교하는 단계로서, 대조군 수준과 비교하여 B7-H5의 분석된 수준의 증가는 질환, 질병 또는 감염을 나타내는 것인 단계를 포함하는 검출 또는 진단 방법.
  39. 제38항에 있어서, B7-H5의 발현을, 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA), 방사성 면역분석법(RIA), 또는 형광 활성화 세포 분류법(FACS)에 의해 분석하는 것인 검출 또는 진단 방법.
  40. 질환, 질병 또는 감염의 진행을 모니터링하는 방법으로서, (a) 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 사용하여, 제1 시점에, 피험체의 세포 또는 조직 샘플에서 B7-H5의 발현을 분석하는 단계; 및 (b) 제2 시점, 또는 시간 경과에 따라, 피험체의 세포 또는 조직 샘플에서 B7-H5의 발현 수준을 비교하는 단계로서, B7-H5의 분석된 수준의 증가는 질환, 질병 또는 감염의 진행을 나타내는 것인 단계를 포함하는 모니터링 방법.
  41. 제30항에 있어서, B7-H5의 발현을, 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA), 방사성 면역분석법(RIA), 또는 형광 활성화 세포 분류법(FACS)에 의해 분석하는 것인 방법.
  42. 치료에 대한 반응을 모니터링하는 방법으로서, (a) 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 사용하여, 치료 전에, 피험체의 세포 또는 조직 샘플에서 B7-H5의 발현을 분석하는 단계; 및 (b) 치료 후 하나 이상의 시점에 미리, 피험체의 세포 또는 조직 샘플에서 B7-H5의 발현을 분석하고, 시간 경과에 따라 B7-H5의 수준을 비교하는 단계로서, B7-H5의 치료 전 수준과 비교하여 B7-H5의 분석된 수준의 감소는 치료에 대한 반응을 나타내는 것인 단계를 포함하는 모니터링 방법.
  43. 제42항에 있어서, B7-H5의 발현을, 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA), 방사성 면역분석법(RIA), 또는 형광 활성화 세포 분류법(FACS)에 의해 분석하는 것인 모니터링 방법.
  44. B7-H5의 발현 증가를 특징으로 하는 질환에 대해 피험체를 치료하는 방법에 사용하기 위한 약학 조성물로서, 상기 방법은
    (i) (a) B7-H5에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 사용하여 피험체의 세포 또는 조직 샘플에서 B7-H5의 발현을 분석하는 단계;
    (b) B7-H5의 수준을 대조군 수준과 비교하는 단계로서, 대조군 수준과 비교하여 B7-H5의 분석된 수준의 증가는, 피험체가 B7-H5의 발현 증가를 특징으로 하는 질환을 가짐을 나타내는 것인 단계
    에 의해 피험체가 B7-H5의 발현 증가를 특징으로 하는 질환을 가지고 있는지 여부를 결정하는 단계; 및
    (ii) 피험체가 B7-H5의 발현 증가를 특징으로 하는 질환을 가지고 있다면, 제24항의 약학 조성물의 치료 유효량을 피험체에게 투여하는 단계
    를 포함하는 것인 약학 조성물.
  45. 제44항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 약학 조성물.
  46. 제44항에 있어서, B7-H5의 발현 증가를 특징으로 하는 질환이 자가면역 질환인 약학 조성물.
  47. 제44항에 있어서, B7-H5의 발현 증가를 특징으로 하는 질환이 염증성 질환인 약학 조성물.
  48. CD28H의 발현 증가를 특징으로 하는 질환에 대해 피험체를 치료하는 방법에 사용하기 위한 약학 조성물로서, 상기 방법은
    (i) (a) 항-CD28H 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 사용하여 피험체의 세포 또는 조직 샘플에서 CD28H의 발현을 분석하는 단계;
    (b) CD28H의 수준을 대조군 수준과 비교하는 단계로서, 대조군 수준과 비교하여 CD28H의 분석된 수준의 증가는, 피험체가 CD28H의 발현 증가를 특징으로 하는 질환을 가짐을 나타내는 것인 단계
    에 의해 피험체가 CD28H의 발현 증가를 특징으로 하는 질환을 가지고 있는지 여부를 결정하는 단계; 및
    (ii) 피험체가 CD28H의 발현 증가를 특징으로 하는 질환을 가지고 있다면, 제24항의 약학 조성물의 치료 유효량을 피험체에게 투여하는 단계
    를 포함하는 것인 약학 조성물.
  49. 제48항에 있어서, CD28H의 발현 증가를 특징으로 하는 질환이 자가면역 질환인 약학 조성물.
  50. 제48항에 있어서, CD28H의 발현 증가를 특징으로 하는 질환이 염증성 질환인 약학 조성물.
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