TWI770455B - 抗vista抗體及片段 - Google Patents

Abstract

本發明係關於結合於T細胞活化之V域Ig抑制因子（VISTA）的新穎抗體及片段，以及其製備及使用方法。使用方法包括治療癌症之方法，其中癌症包括白血病、淋巴瘤、實體腫瘤及黑色素瘤。

Description

抗VISTA抗體及片段

本發明係關於結合於T細胞活化之V域Ig抑制因子（VISTA）的新穎抗體及片段，其製備及使用方法。

在腫瘤微環境中，由癌細胞或免疫細胞表現免疫檢查點負調節因子可抑制宿主針對腫瘤之免疫反應。為有效對抗癌症，需要阻斷腫瘤介導之對宿主免疫反應之抑制。因此，需要抑制腫瘤微環境中之免疫檢查點負調節因子的新穎及有效治療劑，其中該免疫檢查點負調節因子抑制抗腫瘤免疫反應。

本發明係關於包含結合於T細胞活化之V域Ig抑制因子（VISTA）之抗原結合區的抗體及抗體片段。VISTA為不利地抑制免疫反應之檢查點調節因子。參見Wang等人, 「VISTA, a novel mouse Ig superfamily ligand that negatively regulates T cell responses,」J. Exp. Med ., 208(3) 577-92 (2011)。其表現於正常人類嗜中性球、單核球及T細胞亞群上。此外，食蟹獼猴（cynomolgus monkey）細胞以類似於正常人類細胞之模式表現VISTA。VISTA亦表現於癌症患者之周圍血液細胞中。

抗體或抗體片段結合於VISTA調節或促進免疫反應。抗體片段可包括例如Fab、F(ab')₂ 或scFv抗體片段。抗體或抗體片段可包含抗體恆定區。抗體或抗體片段可結合於表現於造血細胞（例如骨髓細胞）及/或淋巴細胞、單核球或嗜中性球、T細胞、自然殺手（NK）細胞、自然殺手T（NKT）細胞、腫瘤細胞上及/或腫瘤微環境（TME）中的VISTA。腫瘤微環境為腫瘤之細胞環境。其可包括周圍免疫細胞、纖維母細胞、血管、其他細胞、信號傳導分子及胞外基質。

抗體或抗體片段可包含一或多個重鏈互補決定區（CDR）及/或一或多個輕鏈CDR，其包括本文所述之任何抗VISTA抗體之一或多個CDR（例如所有三個重鏈CDR、所有3個輕鏈CDR或所有6個CDR），該等抗體包括命名為VSTB112（S2）、VSTB116（S5）、VSTB95（S16）、VSTB50（S41）、VSTB53（S43）及VSTB60（S47）之抗體。在一些具體實例中，抗體或其片段選自由以下組成之群：VSTB112、VSTB95、VSTB116、VSTB50、VSTB53及VSTB60。在一個具體實例中，抗體或片段包含本文所述之任何抗VISTA抗體之一或多個重鏈CDR及一或多個輕鏈CDR。在一些具體實例中，抗體或抗體片段可進一步包含本文所述之任何抗VISTA抗體之至少一個重鏈及至少一個輕鏈。在一些具體實例中，抗體或抗體片段包含至少一個包含重鏈可變區序列之重鏈及/或至少一個包含輕鏈可變區序列之輕鏈。在一些具體實例中，抗體包含人類架構區。在一些具體實例中，抗體為全抗體。在一些具體實例中，片段為抗VISTA結合成員。在一些具體實例中，抗體之重鏈CDR以SEQ ID NO:1、2及3表示，且輕鏈CDR以SEQ ID NO:4、5及6表示。在一些具體實例中，重鏈及輕鏈可變區胺基酸序列分別以SEQ ID NO:7及8表示。

本發明亦涵蓋實質上類似於本文所述之抗體的抗VISTA抗體。舉例而言，在一個具體實例中，抗體或片段包含抗體VH域，該抗體VH域包含具有實質上類似於SEQ ID NO:1之胺基酸序列的VH CDR1、具有實質上類似於SEQ ID NO:2之胺基酸序列的VH CDR2及具有實質上類似於SEQ ID NO:3之胺基酸序列的VH CDR3，且該抗體或片段進一步包含抗體VL域，該抗體VL域包含具有實質上類似於SEQ ID NO:4之胺基酸序列的VL CDR1、具有實質上類似於SEQ ID NO:5之胺基酸序列的VL CDR2及具有實質上類似於SEQ ID NO:6之胺基酸序列的VL CDR3。

本發明亦關於競爭性抑制本文所述之抗VISTA抗體或與本文所述之抗VISTA抗體競爭結合的抗VISTA抗體。

在一些具體實例中，抗VISTA抗體為結合物之一部分，例如包含本文所述之細胞毒性分子或另一試劑之結合物。此類分子為此項技術中熟知。

在一些具體實例中，抗體或抗體片段為單株抗體。在一些具體實例中，抗體為嵌合、人類化或人類抗體。在一些具體實例中，抗體或抗體片段包含人類恆定區。在一些具體實例中，抗體或抗體片段對VISTA之抗原決定基有特異性，例如胺基酸序列SEQ ID NO:9內。在一些具體實例中，抗體或抗體片段以至少1×10^-7 公升/莫耳（例如至少1×10^-8 公升/莫耳，例如至少1×10^-9 公升/莫耳）之親和力結合於VISTA之抗原決定基。

在一些具體實例中，調節免疫反應包含增加CD45+白細胞、CD4+ T細胞及/或CD8+ T細胞。在一些具體實例中，調節免疫反應包含提高（例如T細胞）細胞激素（例如IFNγ、IL 10、TNFα、IL-17）之產生、提高T細胞反應及/或調節Foxp3表現。

本發明亦關於如下組成物，其包含本文所述之抗體或抗體片段（例如抗VISTA抗體）及醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。舉例而言，組成物可包含VISTA拮抗劑，該VISTA拮抗劑包含其抗體或抗體片段，該抗體或抗體片段包含結合於VISTA之抗原結合區；及疫苗（諸如病毒載體疫苗、細菌疫苗、DNA疫苗、RNA疫苗、肽疫苗）。在一些具體實例中，組成物為醫藥組成物，且抗體或抗體片段結合於VISTA調節或促進免疫反應。

本發明亦關於治療或預防癌症之方法，其包含投予有需要之個體（例如哺乳動物，例如人類或非人類動物）有效量之至少一種本文所述之抗體、抗體片段或組成物。

在一些具體實例中，抗體或抗體片段結合於VISTA，從而調節或促進對癌症之免疫原性反應。在一些具體實例中，癌症為白血病、淋巴瘤、骨髓發育不良症候群及/或骨髓瘤。在一些具體實例中，癌症可為任何種類或類型之白血病，包括淋巴細胞性白血病或骨髓性白血病，諸如急性淋巴母細胞性白血病（ALL）、慢性淋巴細胞性白血病（CLL）、急性骨髓（骨髓性）白血病（AML）、慢性骨髓性白血病（CML）、毛細胞白血病、T細胞前淋巴細胞性白血病、大顆粒淋巴細胞性白血病或成人T細胞白血病。在一些具體實例中，淋巴瘤為組織細胞性淋巴瘤，且在一些具體實例中，癌症為多發性骨髓瘤。在一些具體實例中，癌症為實體腫瘤，例如黑色素瘤或膀胱癌。在一些實施例中，癌症為肺癌（例如非小細胞肺癌（NSCLC））。一些治療方法進一步包含投予疫苗（諸如病毒載體疫苗、細菌疫苗、基於細胞之疫苗、DNA疫苗、RNA疫苗、肽疫苗或蛋白質疫苗）。本發明亦關於一種抑制有需要之個體中之腫瘤生長的方法，該方法包含投予本文所述之有效抗體或抗體片段或組成物。

組成物、抗體或片段或其他藥劑（例如疫苗）可藉由任何非經腸或經腸方法（例如靜脈內（IV）、皮下（SQ）或口服（PO））投予。

在一些具體實例中，組成物、抗體或片段每季投予、每週投予、每兩週投予一次、每三週投予一次或每四週投予一次。在一些具體實例中，在本文所述之抗體、片段及組成物之前、期間或之後共投予其他藥物或治療劑。共投予之藥劑可藉由與抗體、片段或組成物相同之途徑或藉由不同途徑投予。

本發明亦包括製備抗體、片段及組成物之方法，例如製備本文所述之抗體或片段之方法，其包含在製備該抗體之條件下培養宿主細胞。方法可進一步包含分離抗體。本發明亦關於包含編碼抗體及片段之核苷酸序列的核酸（例如經分離核酸）、包含此類核酸之表現載體（例如其可操作地連接於啟動子）及用此類表現載體轉形之宿主細胞。

本發明亦關於如下套組及製品，其包含有包含抗VISTA抗體之組成物及容器，且進一步包含表明組成物可用於治療癌症之藥品仿單（package insert）或標籤。

本發明亦提供一種經分離抗體或其抗體片段，其包含結合於T細胞活化之V域Ig抑制因子（VISTA）的抗原結合區，其中該抗體包含抗體VH域，該抗體VH域包含具有SEQ ID NO:25之胺基酸序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:26之胺基酸序列的VH CDR2及具有SEQ ID NO:27之胺基酸序列的VH CDR3，且該抗體進一步包含抗體VL域，該抗體VL域包含具有SEQ ID NO:28之胺基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:29之胺基酸序列的VL CDR2及具有SEQ ID NO:30之胺基酸序列的VL CDR3。在一些具體實例中，抗體或抗體片段包含一或多個人類化或人類架構區。在特定具體實例中，抗體或抗體片段包含有包含SEQ ID NO:37之抗體VH域及/或包含SEQ ID NO:44之抗體VL域。在某些具體實例中，抗體包含重鏈恆定區（例如人類重鏈恆定區）及/或輕鏈恆定區（例如人類輕鏈恆定區，諸如SEQ ID NO:56中所存在之輕鏈恆定區）。重鏈恆定區較佳為IgG1重鏈恆定區（例如SEQ ID NO:61中所存在之IgG1重鏈恆定區）。在特定具體實例中，IgG1重鏈恆定區經修飾以提高抗體之蛋白酶抗性。經修飾以提高蛋白酶抗性之IgG1重鏈恆定區之實例為SEQ ID NO:60中所存在之IgG1重鏈恆定區。在某些具體實例中，抗體或抗體片段包含有包含SEQ ID NO:60之重鏈及包含SEQ ID NO:56之輕鏈；或包含SEQ ID NO:61之重鏈及包含SEQ ID NO:56之輕鏈。在特定具體實例中，抗體或抗體片段表現於缺乏海藻糖基化酶之細胞（例如缺乏海藻糖基化酶之中國倉鼠卵巢（CHO）細胞）中。

本發明亦關於一種組成物，其包含抗體或其抗體片段，該抗體或其抗體片段包含抗體VH域，該抗體VH域包含具有SEQ ID NO:25之胺基酸序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:26之胺基酸序列的VH CDR2及具有SEQ ID NO:27之胺基酸序列的VH CDR3，且該抗體或其抗體片段進一步包含抗體VL域，該抗體VL域包含具有SEQ ID NO:28之胺基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:29之胺基酸序列的VL CDR2及具有SEQ ID NO:30之胺基酸序列的VL CDR3；及醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。

在另一具體實例中，本發明係關於一種治療有需要之個體之癌症的方法，該方法包含投予個體有效量之結合於T細胞活化之V域Ig抑制因子（VISTA）的抗體或抗體片段，其中該抗體包含抗體VH域，該抗體VH域包含具有SEQ ID NO:25之胺基酸序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:26之胺基酸序列的VH CDR2及具有SEQ ID NO:27之胺基酸序列的VH CDR3，且該抗體進一步包含抗體VL域，該抗體VL域包含具有SEQ ID NO:28之胺基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:29之胺基酸序列的VL CDR2及具有SEQ ID NO:30之胺基酸序列的VL CDR3。在特定具體實例中，癌症為肺癌。在另一具體實例中，肺癌為非小細胞肺癌（NSCLC）。在一些具體實例中，方法進一步包含投予第二癌症治療（例如手術、化學療法、放射療法、生物療法、免疫調節療法及其組合）。

本發明亦提供一種抗體或其抗體片段，其包含結合於T細胞活化之V域Ig抑制因子（VISTA）的抗原結合區，其中抗體結合於VISTA（例如人類VISTA）中之構形抗原決定基。在一些具體實例中，構形抗原決定基包含人類VISTA（SEQ ID NO:46）之殘基103-111（NLTLLDSGL（SEQ ID NO:62））及136-146（VQTGKDAPSNC（SEQ ID NO:63））或存在於該等殘基內。在另一具體實例中，構形抗原決定基包含人類VISTA（SEQ ID NO:46）之殘基24-36（LLGPVDKGHDVTF（SEQ ID NO:64））、54-65（RRPIRNLTFQDL（SEQ ID NO:65））及100-102（TMR）或存在於該等殘基內。在另一具體實例中，構形抗原決定基包含人類VISTA（SEQ ID NO:46）之FG環中之胺基酸殘基。

此外，本發明係關於一種提高有需要之個體之免疫反應的方法，其包含投予個體治療有效量之結合T細胞活化之V域Ig抑制因子（VISTA）的抗體或其抗體片段，其包含結合於VISTA之抗原結合區，從而促進對癌症之免疫反應。在特定具體實例中，免疫反應為抗腫瘤免疫反應。

在另一具體實例中，本發明提供一種引發有需要之個體之生物反應的方法，其包含投予個體治療有效量之結合T細胞活化之V域Ig抑制因子（VISTA）的抗體或其抗體片段，其包含結合於VISTA之抗原結合區，從而促進對癌症之免疫反應。生物反應之實例包括活化單核球；誘導T細胞增殖及細胞激素分泌；表現VISTA之細胞的抗體依賴性細胞介導之細胞毒性（ADCC）；及表現VISTA之細胞的抗體依賴性細胞吞噬作用（ADCP）。

本發明之例示性具體實例之描述如下。

本發明係關於命名為T細胞活化之V域免疫球蛋白抑制因子（VISTA）之新穎免疫球蛋白家族配位體（Genbank：JN602184）之抗體（Wang等人, 2010, 2011）。VISTA與PD-L1具有同源性，但展示限於造血隔室之獨特表現模式。特定言之，VISTA組成性且高度表現於CD11b^high 骨髓細胞上，且以較低水準表現於CD4⁺ 及CD8⁺ T細胞上。人類同源物與鼠VISTA共有約85%同源性且具有類似表現模式（Lines等人, Cancer Research 74:1924, 2014）。表現於抗原呈遞細胞（APC）上之VISTA經由同源受體獨立於PD-1地抑制CD4⁺ 及CD8⁺ T細胞增殖及細胞激素產生。在被動EAE（實驗性自體免疫性腦脊髓炎）疾病模型中，VISTA特異性單株抗體提高T細胞依賴性免疫反應且加重疾病。腫瘤細胞上之VISTA過度表現削弱了具有腫瘤之宿主的保護性抗腫瘤免疫性。人類VISTA之研究確定其對人類T細胞之抑制功能（Lines等人, Cancer Research 74:1924, 2014）。來自Flies等人之研究亦將VISTA（稱為PD-1H）鑑別為有效免疫抑制分子（Flies等人, 2011）。VISTA進一步詳細描述於美國公開申請案US 20130177557 A1及美國專利第7,919,585號及第8,236,304號中，其全文均以引用的方式併入本文中。

VISTA為抑制免疫反應之新穎檢查點負調節因子。如本文實施例12中所述，在鼠腫瘤模型中用VISTA特異性單株抗體處理已展示逆轉腫瘤免疫微環境之抑制特徵且提高保護性抗腫瘤免疫性，因此展現VISTA單株抗體作為癌症免疫療法之新穎治療劑的潛力。

本發明之抗體及片段

術語「抗體（antibody）」意欲包括多株抗體、單株抗體（mAb）、嵌合抗體、人類化抗體、人類抗體及抗個體基因型（anti-Id）抗體以及由任何已知技術（諸如（但不限於）酶學裂解、肽合成或重組技術）提供的其片段、區域或衍生物。本發明之抗VISTA抗體能夠結合VISTA之調節、調控或提高免疫反應之部分。在一些具體實例中，該等抗體競爭性抑制本文所述之抗VISTA抗體中之一或多者。測定兩種或兩種以上抗體是否競爭結合於同一目標的方法為此項技術中已知。舉例而言，可使用競爭性結合分析判定一種抗體是否阻斷另一抗體與目標之結合。典型地，競爭性結合分析包括使用結合於固體基板或細胞之經純化目標抗原（例如PD-1）、未標記之測試結合分子及經標記之參考結合分子。競爭性抑制藉由測定在測試結合分子存在下結合於固體表面或細胞之標記物的量來量測。通常測試結合分子過量存在。典型地，當競爭性結合分子過量存在時，其將使參考結合分子與共同抗原之特異性結合抑制至少50-55%、55-60%、60-65%、65-70%、70-75%或75%以上。在一些具體實例中，競爭性抑制使用競爭性抑制ELISA分析測定。

多株抗體為衍生自用抗原免疫之動物之血清的抗體分子的異質群。單株抗體含有特異性抗原之抗體的實質上均質群，該群含有實質上類似抗原決定基結合位點。單株抗體可藉由熟習此項技術者已知之方法獲得。參見例如Kohler及Milstein,Nature, 256:495-497 (1975)；美國專利第4,376,110號；Ausubel等人編, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1987, 1992)；及Harlow及Lane ANTIBODIES: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory (1988)；Colligan等人編, Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993)，其中所有者之內容以全文引用的方式併入本文中。此類抗體可具有任何免疫球蛋白類別，包括IgG、IgM、IgE、IgA、GILD及其任何子類。產生本發明單株抗體之融合瘤可在試管內、當場或活體內培養。

本發明亦涵蓋消化片段、其指定部分及變體，包括抗體模擬物或包含模擬抗體或其指定片段或部分之結構及/或功能的抗體部分，包括單鏈抗體及其片段。功能性片段包括結合於哺乳動物VISTA蛋白之抗原結合片段。舉例而言，本發明涵蓋能夠結合於VISTA之抗體片段或其部分，包括（但不限於）Fab（例如藉由木瓜蛋白酶消化）、Fab'（例如藉由胃蛋白酶消化及部分還原）及F(ab')₂ （例如藉由胃蛋白酶消化）、facb（例如藉由纖維蛋白溶酶消化）、pFc'（例如藉由胃蛋白酶或纖維蛋白溶酶消化）、Fd（例如藉由胃蛋白酶消化、部分還原及再凝集）、Fv或scFv（例如藉由分子生物學技術）片段。本發明之抗體片段亦包括Aaron L. Nelson, mAbs 2:1, 77-83 (2010年1月/2月)中所述之抗體片段，其內容以全文引用的方式併入。

此類片段可例如藉由此項技術中已知及/或如本文所述之酶學裂解、合成或重組技術製備。抗體亦可使用一或多個終止密碼子已引入天然終止位點之上游的抗體基因以多種截短形式製備。抗體之各種部分可藉由習知技術以化學方式接合在一起，或可使用遺傳工程改造技術製備成鄰接蛋白質。

在一個具體實例中，免疫球蛋白鏈或其部分（例如可變區，CDR）之胺基酸序列與本文所述之相應可變序列鏈之胺基酸序列具有約70-100%一致性（例如70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或其中任何範圍或值）。較佳地，使用此項技術中已知之適合電腦算法測定70-100%胺基酸一致性（例如85、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或其中任何範圍或值）。

本文提供重鏈及輕鏈可變區序列之實例。

本發明之抗體或變體指定變體可包含來自本發明抗體之任何數目之鄰接胺基酸殘基，其中該數目係選自由抗TNF抗體中鄰接殘基數之10-100%組成之整數之群。視情況，此鄰接胺基酸之子序列的長度為至少約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250個或250個以上胺基酸或其中任何範圍或值。此外，此類子序列之數目可為選自由1至20組成之群的任何整數，諸如至少 2、3、4或5。

熟習此項技術者應瞭解，本發明包括本發明之至少一種生物學活性抗體。生物學活性抗體之特定活性為天然（非合成）、內源或相關及已知抗體之至少20%、30%或40%，且較佳至少50%、60%或70%，且最佳至少80%、90%或95%-100%。分析及量化酶活性及受質特異性之量測值的方法為熟習此項技術者所熟知。

實質上類似指化合物與天然（非合成）、內源或相關及已知抗體具有至少85%（例如至少95%）一致性，且具有其活性之至少85%（例如至少95%）。

如本文所用之術語「人類抗體（human antibody）」指如下抗體，其中實質上蛋白質之各部分（例如CDR、架構、CL、CH域（例如CH1、CH2、CH3）、鉸鏈（VL、VH））在人類中實質上具有非免疫原性，其中僅少量序列改變或變化。類似地，指定為靈長類（猴、狒狒、黑猩猩及其類似物）、嚙齒動物（小鼠、大鼠及其類似物）及其他哺乳動物之抗體指此類物種、次屬、屬、次科、科特異性抗體。此外，嵌合抗體可包括以上之任何組合。此類改變或變化視情況且較佳相對於未修飾抗體保留或降低在人類或其他物種中之免疫原性。因此，人類抗體不同於嵌合或人類化抗體。據指出，人類抗體可由能夠功能上表現重排人類免疫球蛋白（例如重鏈及/或輕鏈）基因的非人類動物或原核或真核細胞製備。此外，當人類抗體為單鏈抗體時，其可包含天然人類抗體中不存在之連接肽。舉例而言，Fv可包含連接肽，諸如二至約八個甘胺酸或其他胺基酸殘基，其連接重鏈之可變區及輕鏈之可變區。認為此類連接肽具有人類來源。

亦可使用雙特異性、異特異性、異結合或類似抗體，其為對至少兩種不同抗原具有結合特異性的單株、較佳人類或人類化抗體。在本發明情形下，結合特異性中之一者針對至少一種VISTA蛋白，另一者針對任何其他抗原。用於製備雙特異性抗體之方法為此項技術中已知。雙特異性抗體之重組型製備可基於兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對之共表現，其中兩個重鏈具有不同特異性（Milstein and Cuello, Nature 305:537 (1983)）。亦參見WO 93/08829；美國專利第6,210,668號、第6,193,967號、第6,132,992號、第6,106,833號、第6,060,285號、第6,037,453號、第6,010,902號、第5,989,530號、第5,959,084號、第5,959,083號、第5,932,448號、第5,833,985號、第5,821,333號、第5,807,706號、第5,643,759號、第5,601,819號、第5,582,996號、第5,496,549號、第4,676,980、WO 91/00360、WO 92/00373、EP 03089；Traunecker等人, EMBO J. 10:3655 (1991)；Suresh等人, Methods in Enzymology 121:210 (1986)，其各以全文引用的方式併入本文中。

在一個具體實例中，本發明係關於一種以VISTA及第二目標蛋白（例如免疫檢查點蛋白）為目標的雙特異性抗體。例示性雙特異性抗體包括以VISTA及PD-L1為目標的雙特異性抗體及以VISTA及PD-L2為目標的雙特異性抗體。

對人類VISTA蛋白有特異性之人類抗體或其片段可針對適當免疫原性抗原（諸如VISTA蛋白或其部分（包括合成分子，諸如合成肽））來培養。

可類似地培養其他特異性或通用哺乳動物抗體。免疫原性抗原製備及單株抗體製備可使用任何適合技術進行。

舉例而言，融合瘤藉由融合適合永生細胞系（例如骨髓瘤細胞系，諸如（但不限於）Sp2/0、Sp2/0-AG14、NSO、NS1、NS2、AE-1、L.5、＞243、P3X63Ag8.653、Sp2 SA3、Sp2 MAI、Sp2 SS1、Sp2 SA5、U937、MLA 144、ACT IV、MOLT4、DA-1、JURKAT、WEHI、K-562、COS、RAJI、NIH 3T3、HL-60、MLA 144、NAMAIWA、NEURO 2A或其類似物，或雜合骨髓瘤、其融合產物或自其衍生之任何細胞或融合細胞，或此項技術中已知之任何其他適合細胞系，參見例如www.atcc.org）與抗體產生細胞來製備。抗體產生細胞可包括經分離或選殖之脾、周圍血液、淋巴、扁桃體或其他免疫細胞（例如B細胞）或表現重鏈或輕鏈恆定或可變或架構或互補決定區（CDR）序列的任何其他細胞。此類抗體產生細胞可為重組或內源細胞，且亦可為原核或真核細胞（例如哺乳動物哺乳動物諸如嚙齒動物、馬、綿羊、山羊、羊、靈長類）。參見例如以上Ausubel及以上Colligan, Immunology, 第2章，其以全文引用的方式併入本文中。

抗體產生細胞亦可獲自已用相關抗原免疫之人類或其他適合動物之周圍血液或較佳脾或淋巴結。任何其他適合宿主細胞亦可用於表現編碼本發明之抗體、其指定片段或變體之異質或內源性核酸。融合細胞（融合瘤）或重組細胞可使用選擇性培養條件或其他適合已知方法分離且藉由限制稀釋法或細胞分選或其他已知方法選殖。產生具有所要特異性之抗體的細胞可藉由適合分析（例如酶聯免疫吸附分析（ELISA））選擇。

如此項技術中已知及/或如本文所述，可使用製備或分離具有必需特異性之抗體的其他適合方法，包括（但不限於）自肽或蛋白質文庫（例如（但不限於）噬菌體、核糖體、寡核苷酸、RNA、cDNA或其類似物、呈現文庫；例如購自Cambridge antibody Technologies, Cambridgeshire, UK；MorphoSys, Martinsreid/Planegg, DE；Biovation, Aberdeen, Scotland, UK；Bioinvent, Lund, Sweden；Dyax Corp., Enzon, Affymax/Biosite；Xoma, Berkeley, Calif.；Ixsys。參見例如PCT/GB91/01134；PCT/GB92/01755；PCT/GB92/002240；PCT/GB92/00883；PCT/GB93/00605；PCT/GB94/01422；PCT/GB94/02662；PCT/GB97/01835；WO90/14443；WO90/14424；WO90/14430；PCT/U594/1234；WO92/18619；WO96/07754；EP 614 989 ；WO95/16027 ；WO88/06630；WO90/3809 ；美國專利第4,704,692號；PCT/US91/02989；WO89/06283；EP 371 998；EP 550 400；EP 229 046；PCT/US91/07149；或隨機產生之肽或蛋白質--美國專利第5,723,323號；第5,763,192號；第5,814,476號；第5,817,483號；第5,824,514號；第5,976,862號；WO 86/05803、EP 590 689，其各以全文引用的方式併入本文中）選擇重組抗體或依賴於使能夠產生人類抗體之譜系的轉基因動物（例如SCID小鼠，Nguyen等人, Microbiol. Immunol. 41:901-907 (1997)；Sandhu等人, Crit. Rev. Biotechnol. 16:95-118 (1996)；Eren等人, Immunol. 93:154-161 (1998)，其以及相關專利及申請案各以全文引用的方式併入本文中）免疫的方法。此類技術包括（但不限於）核糖體呈現（Hanes等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:4937-4942 (1997年5月); Hanes等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:14130-14135 (1998年11月)）；單細胞抗體製備技術（美國專利第5,627,052號，Wen等人, J. Immunol. 17:887-892 (1987)；Babcook等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-7848 (1996)）；凝膠微滴及流式細胞術（Powell等人, Biotechnol. 8:333-337 (1990)；One Cell Systems, Cambridge, Mass.；Gray等人, J. Imm. Meth. 182:155-163 (1995)；Kenny等人, Bio/Technol. 13:787-790 (1995)）；B細胞選擇（Steenbakkers等人, Molec. Biol. Reports 19:125-134 (1994)；Jonak等人, Progress Biotech, 第5卷, In Vitro Immunization in Hybridoma Technology, Borrebaeck編, Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam, Netherlands (1988)）。

亦可使用工程改造或人類化非人類或人類抗體之方法且為此項技術中所熟知。一般而言，人類化或工程改造抗體具有一或多個來自非人類來源（例如（但不限於）小鼠、大鼠、兔、非人類靈長類或其他哺乳動物）的胺基酸殘基。此等人類胺基酸殘基通常稱為「導入（import）」殘基，其典型地取自已知人類序列之「導入」可變、恆定或其他域。揭示已知人類Ig序列，例如www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi；www.atcc.org/phage/hdb.html，其各以全文引用的方式併入本文中。

如此項技術中已知，此類導入序列可用於降低免疫原性或降低、提高或改變結合、親和力、親合力、特異性、半衰期或任何其他適合特徵。一般而言，維持部分或所有非人類或人類CDR序列，而用人類或其他胺基酸置換部分或所有架構及/或恆定區之非人類序列。亦可視情況使用熟習此項技術者已知之三維免疫球蛋白模型將抗體人類化，而保持對抗原之高親和力及其他有利生物特性。可利用說明且呈現所選候選免疫球蛋白序列之可能三維構形結構的電腦程式。檢測此等呈現使得可分析殘基在候選免疫球蛋白序列的功能中的可能性作用，亦即分析影響候選免疫球蛋白結合其抗原的能力的殘基。以此方式，可自共同及導入序列選擇架構（FR）殘基且組合以使得達成所要抗體特徵（諸如對目標抗原之親和力增加）。一般而言，CDR殘基直接且最實質上參與影響抗原結合。人類化或工程改造本發明之抗體可使用任何已知方法進行，諸如（但不限於）以下文獻中所述之方法，例如Winter (Jones等人, Nature 321:522 (1986)；Riechmann等人, Nature 332:323 (1988)；Verhoeyen等人, Science 239:1534 (1988))；Sims等人, J. Immunol. 151: 2296 (1993)；Chothia及Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987)；Carter等人, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285 (1992)；Presta等人, J. Immunol. 151:2623 (1993)；美國專利第5,723,323號、第5,976862號、第5,824514號、第5,817483號、第5,814476號、第5,763,192號、第5,723,323號、第5,766,886號、第5,714,352號、第6,204,023號、第6,180,370號、第5,693,762號、第5,530,101號、第5,585,089號、第5,225,539號；第4,816,567號，其各以全文引用的方式併入本文中，包括其中所引用之參考文獻。

如本文所述及/或此項技術中已知，抗VISTA抗體亦可視情況藉由使能夠產生人類抗體之譜系的轉基因動物（例如小鼠、大鼠、兔、倉鼠、非人類靈長類及其類似物）免疫來產生。產生人類抗VISTA抗體之細胞可自此類動物分離且使用適合方法（諸如本文所述之方法）不朽化。

可產生結合於人類抗原之人類抗體之譜系的轉基因動物可藉由已知方法製備（例如（但不限於）頒予Lonberg等人之美國專利第5,770,428號、第5,569,825號、第5,545,806號、第5,625,126號、第5,625,825號、第5,633,425號、第5,661,016號及第5,789,650號；Jakobovits等人WO 98/50433、Jakobovits等人WO 98/24893、Lonberg等人WO 98/24884、Lonberg等人WO 97/13852、Lonberg等人WO 94/25585、Kucherlapate等人WO 96/34096、Kucherlapate等人EP 0463 151 B1、Kucherlapate等人EP 0710 719 A1、Surani等人美國專利第5,545,807號、Bruggemann等人WO 90/04036、Bruggemann等人EP 0438 474 B1、Lonberg等人EP 0814 259 A2、Lonberg等人GB 2 272 440 A、Lonberg等人Nature 368:856-859 (1994)、Taylor等人, Int. Immunol. 6(4)579-591 (1994)、Green等人, Nature Genetics 7:13-21 (1994)、Mendez等人, Nature Genetics 15:146-156 (1997)、Taylor等人, Nucleic Acids Research 20(23):6287-6295 (1992)、Tuaillon等人, Proc Natl Acad Sci USA 90(8)3720-3724 (1993)、Lonberg等人, Int Rev Immunol 13(1):65-93 (1995)及Fishwald等人, Nat Biotechnol 14(7):845-851 (1996)，其各以全文引用的方式併入本文中）。一般而言，此等小鼠包含至少一種包含來自至少一種人類免疫球蛋白基因座之DNA的轉基因，其在功能上重排或可進行功能性重排。此類小鼠中內源免疫球蛋白基因座可經破壞或缺失以去除動物產生由內源基因編碼之抗體的能力。

篩選特異性結合於類似蛋白質之抗體或片段可使用肽呈現文庫便利地達成。此方法包括針對具有所要功能或結構之個別成員篩選大量肽。肽呈現文庫之抗體篩選為此項技術中所熟知。所呈現之肽序列的長度可為3至5000個或5000個以上胺基酸，通常為5-100個胺基酸長，且通常為約8至25個胺基酸長。除用於產生肽文庫之直接化學合成方法以外，已描述數種重組DNA方法。一種類型包括在噬菌體或細胞之表面上呈現肽序列。各噬菌體或細胞含有編碼所呈現之特定肽序列的核苷酸序列。此類方法描述於PCT專利公開案第91/17271號、第91/18980號、第91/19818號及第93/08278號中。用於產生肽之文庫的其他系統具有試管內化學合成與重組方法的態樣。參見PCT專利公開案第92/05258號、第92/14843號及第96/19256號。亦參見美國專利第5,658,754號；及第5,643,768號。肽呈現文庫、載體及篩選套組可購自諸如Invitrogen（Carlsbad, Calif.）及Cambridge antibody Technologies（Cambridgeshire, UK）之供應商。參見例如頒予Dyax之美國專利第4,704,692號、第4,939,666號、第4,946,778號、第5,260,203號、第5,455,030號、第5,518,889號、第5,534,621號、第5,656,730號、第5,763,733號、第5,767,260號、第5,856,456號；第5,223,409號、第5,403,484號、第5,571,698號、第5,837,500號，頒予Cambridge antibody Technologies之第5,427,908號、第5,580,717號；第5,885,793號；頒予Genentech之第5,750,373號，第5,618,920號、第5,595,898號、第5,576,195號、第5,698,435號、第5,693,493號及第5,698,417號。

本發明之抗體亦可使用至少一種編碼抗VISTA抗體之核酸製備，得到轉基因動物（諸如山羊、母牛、羊及其類似物），其在乳汁中產生此類抗體。可使用已知方法提供此類動物。參見例如（但不限於）美國專利第5,827,690號；第5,849,992號；第4,873,316號；第5,849,992號；第5,994,616號；第5,565,362號；第5,304,489號及其類似專利，其各以全文引用的方式併入本文中。

本發明之抗VISTA抗體亦可根據已知方法使用轉基因植物製備。亦參見例如Fischer等人, Biotechnol. Appl. Biochem. 30:99-108 (1999年10月)、Cramer等人, Curr. Top. Microbol. Immunol. 240:95-118 (1999)及其中所引用之參考文獻；Ma等人, Trends Biotechnol. 13:522-7 (1995)；Ma等人, Plant Physiol. 109:341-6 (1995)；Whitelam等人, Biochem. Soc. Trans. 22:940-944 (1994)；及其中所引用之參考文獻。以上參考文獻各以全文引用的方式併入本文中。

本發明之抗體可以大範圍之親和力（K_D ）結合人類VISTA。在較佳具體實例中，本發明之至少一種人類單株抗體可視情況以高親和力結合人類VISTA。舉例而言，人類單株抗體可以等於或低於約10^-7 M之K_D （諸如（但不限於）0.1-9.9（或其中任何範圍或值）×10^-7 、10^-8 、10^-9 、10^-10 、10^-11 、10^-12 、10^-13 或其中任何範圍或值）結合人類VISTA。在一些具體實例中，抗體或抗體片段可以1×10^-7 公升/莫耳（例如至少1×10^-8 公升/莫耳，例如至少1×10^-9 公升/莫耳）之親和力結合人類VISTA。

抗體對抗原之親和力或親合力可使用任何適合方法進行實驗測定。（參見例如Berzofsky等人, 「Antibody-Antigen Interactions,」 Fundamental Immunology, Paul, W. E.編, Raven Press: New York, N.Y. (1984)；Kuby, Janis Immunology, W.H. Freeman and Company: New York, N.Y. (1992)；及本文所述之方法）。若在不同條件（例如鹽濃度、pH）下量測，則所量測之特定抗體-抗原相互作用之親和力可變化。因此，量測親和力及其他抗原結合參數（K_D 、K_a 、K_d ）較佳用抗體及抗原之標準化溶液及標準化緩衝液進行。

核酸分子

使用本文所提供之資訊，諸如編碼指定片段、其變體或共同序列中之至少一者的鄰接胺基酸的至少70-100%的核苷酸序列或包含此等序列中之至少一者的所寄存載體，可使用本文所述或此項技術中已知之方法獲得編碼至少一種抗VISTA抗體之本發明核酸分子，該抗VISTA抗體包含SEQ ID NO:1、2及3之重鏈可變CDR區之全部及/或SEQ ID NO:4、5及6之輕鏈可變CDR區之全部。

本發明之核酸分子可為藉由選殖或以合成方法製備而獲得的RNA（諸如mRNA、hnRNA、tRNA或任何其他形式）形式或DNA（包括（但不限於）cDNA及基因組DNA）形式。DNA可為三股、雙股或單股或其任何組合。DNA或RNA之至少一個股的任何部分可為編碼股，亦稱為有義股，或其可為非編碼股，亦稱為反義股。

本發明之經分離核酸分子可包括包含開放閱讀框架（ORF）之核酸分子，開放閱讀框架例如（但不限於）至少一種CDR之至少一個指定部分，如至少一個重鏈或輕鏈之CDR1、CDR2及/或CDR3；包含抗VISTA抗體或片段（例如包含可變區之片段）之編碼序列的核酸分子；及包含不同於上述之核苷酸序列但由於遺傳密碼之簡并性仍編碼至少一種如本文所述及/或此項技術中已知之抗VISTA抗體的核酸分子。熟習此項技術者產生編碼本發明之特定抗VISTA抗體的此類簡并核酸變體為常規的。參見例如以上Ausubel等人，且此類核酸變體包括於本發明中。

如本文所表明，包含編碼抗VISTA抗體之核酸的本發明核酸分子可包括（但不限於）編碼抗體片段之胺基酸序列的核酸分子；整個抗體或其部分之編碼序列；抗體、片段或部分之編碼序列以及其他序列，諸如在存在或不存在上述其他編碼序列下至少一種信號前導序列或融合肽之編碼序列，諸如至少一種內含子，以及其他非編碼序列，包括（但不限於）非編碼5'及3'序列，諸如在轉錄、mRNA加工（包括拼接）及聚腺苷酸化信號（例如--mRNA之核糖體結合及穩定性）中起作用之經轉錄未轉譯序列；編碼其他胺基酸之其他編碼序列，諸如提供其他功能之編碼序列。因此，編碼抗體之序列可與標記序列（諸如編碼有助於純化包含抗體片段或部分之融合抗體的肽的序列）融合。

編碼本發明之抗體、片段及區域之恆定（C）區的人類基因可藉由已知方法衍生自人類胎兒肝臟文庫。人類C區基因可衍生自任何人類細胞，包括表現且產生人類免疫球蛋白之人類細胞。人類C_H 區可衍生自人類H鏈之任何已知類別或同型，包括γ、μ、α、δ或ε且其次型，諸如G1、G2、G3及G4。因為H鏈同型負責抗體之各種效應功能，故C_H 區之選擇將由所要效應功能（諸如補體固定）或抗體依賴性細胞毒性（ADCC）中之活性引導。

組成物

本文所揭示之醫藥組成物根據標準程序製備且以經選擇以治療（例如減輕、預防或去除所治療病狀或減緩或中斷其進展）的劑量投予（參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA及Goodman and Gilman's The Pharmaceutical Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, N.Y.，其內容以引用的方式併入本文中以用於投予各種藥劑進行人類治療之方法的一般描述）。包含所揭示之抗體及藥劑的組成物可使用控制或持續釋放傳遞系統（例如膠囊、可生物降解基質）傳遞。適用於投予所揭示化合物之用於藥物傳遞之延緩釋放傳遞系統的實例描述於例如美國專利第US 5,990,092號；第5,039,660號；第4,452,775號；第3,854,480號中，其整個教示以引用的方式併入本文中。

為自本發明之抗VISTA抗體及/或片段製備醫藥組成物，醫藥學上可接受之載劑可為固體或液體。固體形式製劑包括粉末、錠劑、丸劑、膠囊、扁囊劑、栓劑及分散性顆粒。舉例而言，本發明化合物可為粉末形式以用於在傳遞時復原。固體載劑可為一或多種物質，其亦可充當稀釋劑、調味劑、增溶劑、潤滑劑、懸浮劑、黏合劑、防腐劑、錠劑崩解劑或囊封材料。在呈粉末形式時，載劑為細粉狀固體，其與細粉狀活性成分形成混合物。

粉末及錠劑較佳含有約1至約70%活性成分。適合載劑為碳酸鎂、硬脂酸鎂、滑石、糖、乳糖、果膠、糊精、澱粉、明膠、黃蓍、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、低熔點蠟、可可油及其類似物。錠劑、粉末、扁膠劑、口含錠、速熔條（fast-melt strip）、膠囊及丸劑可用作適用於經口投予的含有活性成分的固體劑型。

液體形式製劑包括溶液、懸浮液、保留灌腸劑及乳液，例如水或丙二醇水溶液。為進行非經腸注射，液體製劑可在聚乙二醇水溶液中調配。

醫藥組成物可為單位劑型。在此類形式中，組成物再分為含有適量活性成分之單位劑量。單位劑型可為封裝製劑，該封裝含有個別量之單位劑量。劑量可視患者之要求、所治療病狀之嚴重性、所用化合物及投藥路徑而變化。測定針對特定情況之適當劑量在此項技術之技能範圍內。

此外，必要時，醫藥組成物可含有其他相容藥劑，例如藥物、治療劑或預防劑。治療劑或預防劑包括（但不限於）肽、多肽、蛋白質、融合蛋白、核酸分子、小分子、模擬劑、合成藥物、無機分子及有機分子。此類藥劑（例如抗癌劑）之類別的實例包括（但不限於）細胞毒素、血管生成抑制劑、免疫調節劑、腫瘤免疫劑及用於緩解疼痛或抵消一或多種治療劑之有毒作用的藥劑（例如使用降低糖皮質激素之高血鈣作用的雙膦酸鹽）。

適用於本文所述之組成物及方法的血管生成抑制劑、藥劑及療法包括（但不限於）血管生長抑素（纖維蛋白溶酶原片段）；抗血管生成抗凝血酶III；安吉酶（angiozyme）。雙膦酸鹽包括（但不限於）阿侖膦酸鹽（alendronate）、氯屈膦酸鹽（clodronate）、依替膦酸鹽（etidronate）、伊班膦酸鹽（ibandronate）、帕米膦酸鹽（pamidronate）、利塞膦酸鹽（risedronate）、替魯膦酸鹽（tiludronate）及唑來膦酸鹽（zoledronate）。

適用於本文所述之組成物及方法的免疫調節劑及療法包括（但不限於）抗T細胞受體抗體，諸如抗CD3抗體（例如諾維（Nuvion）（Protein Design實驗室）、OKT3（Johnson & Johnson）或抗CD20抗體美羅華（Rituxan）（IDEC））、抗CD52抗體（例如坎帕斯1H（CAMPATH 1H）（Ilex））、抗CD11a抗體（例如西利姆（Xanelim）（Genentech））；抗細胞激素或抗細胞激素受體抗體及拮抗劑，諸如抗IL-2受體抗體（賽尼哌（Zenapax）（Protein Design實驗室））、抗IL-6受體抗體（例如MRA（Chugai））及抗IL-12抗體（CNTO1275（Janssen））、抗TNFα抗體（雷米卡德（Remicade）（Janssen））或TNF受體拮抗劑（恩博（Enbrel）（Immunex））、抗IL-6抗體（BE8（Diaclone））及思圖昔單抗（siltuximab）（CNTO32（Centocor））及免疫特異性結合於腫瘤相關抗原之抗體（例如曲妥珠單抗（trastuzimab）（Genentech））。

適用於本文所述之組成物及方法的腫瘤免疫劑包括（但不限於）伊派利單抗（ipilimumab）（抗CTLA-4）、尼沃單抗（nivolumab）（抗-PD-1）、派立珠單抗（pembrolizumab）（抗-PD-1）、抗PD-L1抗體及抗LAG-3抗體。

組成物較佳以含有治療有效量之抗體或片段的劑量單位形式製備。劑量單位之實例為錠劑及膠囊。出於治療目的，除活性成分之外，錠劑和膠囊可含有習知載劑，諸如結合劑，例如阿拉伯樹膠、明膠、聚乙烯吡咯啶酮、山梨糖醇或黃蓍；填充劑，例如磷酸鈣、甘胺酸、乳糖、玉米澱粉、山梨糖醇或蔗糖；潤滑劑，例如硬脂酸鎂、聚乙二醇、二氧化矽或滑石；崩解劑，例如馬鈴薯澱粉；調味劑或著色劑；或可接受之潤濕劑。通常呈水溶液或油溶液、懸浮液、乳液、糖漿或酏劑形式的口服液體製劑可含有習知添加劑，諸如懸浮劑、乳化劑、非水性劑、防腐劑、著色劑及調味劑。液體製劑之添加劑的實例包括阿拉伯膠、杏仁油、乙醇、經部分分離之椰子油、明膠、葡萄糖漿、甘油、氫化食用脂肪、卵磷脂、甲基纖維素、對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯、丙二醇、山梨糖醇或山梨酸。

關於製備及使用本文所述之化合物及組成物的方法的其他一般細節為此項技術中熟知。參見例如美國專利第7,820,169號，其全部內容併入本文中。

治療方法

熟習此項技術者（例如臨床醫師）可考慮所選藥劑、醫藥調配物及投藥路徑、各種患者因素及其他考慮因素來確定投予特定抗體、片段或組成物之適合劑量及路徑以向個體投予。劑量較佳不會引起或產生最少或不產生不良副作用。在標準多重給藥方案中，藥理學藥劑可以經設計以在進行治療之個體中維持預定或最佳血漿濃度的劑量時程投予。抗體、片段及組成物可以任何適當劑量範圍或治療有效量添加，例如0.1 mg/kg、0.2 mg/kg、0.3 mg/kg、0.4 mg/kg、0.5 mg/kg、0.6 mg/kg、0.7 mg/kg、0.8 mg/kg、0.9 mg/kg、1.0 mg/kg、1.5 mg/kg、2.0 mg/kg、2.5 mg/kg、3.0 mg/kg、4.0 mg/kg、5.0 mg/kg、6.0 mg/kg、7.0 mg/kg、8.0 mg/kg、9.0 mg/kg、10.0 mg/kg、11.0 mg/kg、12.0 mg/kg、13.0 mg/kg、14.0 mg/kg、15.0 mg/kg、16.0 mg/kg、17.0 mg/kg、18.0 mg/kg、19.0 mg/kg、20.0 mg/kg、30 mg/kg、40 mg/kg、50 mg/kg 60 mg/kg、70 mg/kg、80 mg/kg、90 mg/kg及100 mg/kg。在一個具體實例中，所投予組成物、抗體或片段之劑量為每次投予0.1-15 mg/kg。

抗體或片段可每天投予一次、至少一次、兩次、至少兩次、三次或至少三次。抗體或片段可每週投予一次、至少一次、兩次、至少兩次、三次、至少三次、四次、至少四次、五次、至少五次、六次或至少六次。抗體或片段可每個月投予一次、每個月至少一次、每個月兩次、每個月至少兩次、每個月三次或每個月至少三次。抗體或抗體片段可每年投予一次、每年至少一次、每年兩次、每年至少兩次、每年三次、每年至少三次、每年四次、每年至少四次、每年五次、每年至少五次、每年六次或每年至少六次。

抗VISTA抗體、片段及組成物可例如經由非經腸或經腸方法投予，包括（但不限於）靜脈內、皮下、經口、經直腸、肌肉內、腹膜內、經黏膜、經皮、鞘內、經鼻或表面投予。一般技術者應認識到以下劑型可包含化合物或本發明化合物之相應醫藥學上可接受之鹽作為活性成分。在一些具體實例中，劑型可包含化合物或化合物之相應醫藥學上可接受之鹽作為活性成分。

本發明之抗VISTA抗體可作為組合療法之一部分投予（例如彼此一起投予或與一或多種其他治療劑一起投予）。本發明化合物可以在一種或多種其他治療劑之前、之後或同時投予。在一些具體實例中，本發明化合物及其他治療劑可以各別調配物或結合調配物形式同時（例如同步）共投予。或者，藥劑可以各別組成物形式在熟練臨床醫師確定之適當時間範圍（例如足以使療法之藥物作用重疊的時間）內依序投予。本發明化合物及一或多種其他治療劑可以單次劑量或多次劑量以適合於達成所要治療作用之次序及時程投予。

本發明亦提供一種調節或治療細胞、組織、器官、動物或患者之至少一種惡性疾病的方法。在一些具體實例中，本發明之化合物及組成物用於治療或預防癌症。癌症可包括任何器官或身體系統之任何惡性或良性腫瘤。實例包括（但不限於）以下：乳癌、消化道癌、腸胃癌、內分泌癌、神經內分泌癌、眼癌、泌尿生殖癌、生殖細胞癌、婦科癌、頭頸癌、血液/血癌、肌肉骨胳癌、神經癌、呼吸道/胸癌、膀胱癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、子宮內膜癌、腎臟癌、胰臟癌、肝癌、胃癌、睾丸癌、食道癌、前列腺癌、腦癌、子宮頸癌、卵巢癌及甲狀腺癌。其他癌症可包括白血病、黑色素瘤及淋巴瘤及本文所述之任何癌症。在一些具體實例中，實體腫瘤以骨髓及/或T細胞浸潤。在一些具體實例中，癌症為白血病、淋巴瘤、骨髓發育不良症候群及/或骨髓瘤。在一些具體實例中，癌症可為任何種類或類型之白血病，包括淋巴細胞性白血病或骨髓性白血病，諸如急性淋巴母細胞性白血病（ALL）、慢性淋巴細胞性白血病（CLL）、急性骨髓（骨髓性）白血病（AML）、慢性骨髓性白血病（CML）、毛細胞白血病、T細胞前淋巴細胞性白血病、大顆粒淋巴細胞性白血病或成人T細胞白血病。在一些具體實例中，淋巴瘤為組織細胞性淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤或霍奇金氏淋巴瘤（Hodgkin lymphoma），且在一些具體實例中，癌症為多發性骨髓瘤。在一些具體實例中，癌症為實體腫瘤，例如黑色素瘤或膀胱癌。在一個實施例中，癌症為肺癌，例如非小細胞肺癌（NSCLC）。

本發明亦提供一種調節或治療細胞、組織、器官、動物或患者之至少一種惡性疾病的方法，包括（但不限於）以下中之至少一者：白血病、急性白血病、急性淋巴母細胞性白血病（ALL）、B細胞、T細胞或FAB ALL、急性骨髓性白血病（AML）、慢性骨髓細胞性白血病（CML）、慢性淋巴細胞性白血病（CLL）、毛細胞白血病、骨髓發育不良症候群（MDS）、淋巴瘤、霍奇金氏病（Hodgkin's disease）、惡性淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤（non-hodgkin's lymphoma）、伯基特氏淋巴瘤（Burkitt's lymphoma）、多發性骨髓瘤、卡波西氏肉瘤（Kaposi's sarcoma）、結腸直腸癌、胰腺癌、鼻咽癌、惡性組織細胞增多病、副腫瘤症候群/惡性血鈣過多、實體腫瘤、腺癌、肉瘤、惡性黑色素瘤、血管瘤、轉移性疾病、癌症相關骨骼再吸收、癌症相關骨痛及其類似疾病。在一些具體實例中，實體腫瘤以骨髓及/或T細胞浸潤。在一特定具體實例中，實體腫瘤為肺癌，諸如非小細胞肺癌（NSCLC）。

在一些具體實例中，本文所述之化合物及療法與疫苗（諸如病毒載體疫苗、細菌疫苗、基於細胞之疫苗、DNA疫苗、RNA疫苗、肽疫苗或蛋白質疫苗）一起共投予。此類疫苗為此項技術中所熟知。參見例如Jeffrey Schlom, 「Therapeutic Cancer Vaccines: Current Status and Moving Forward,」J Natl Cancer Inst ; 104:599-613 (2012)，其內容全部併入本文中。

在一些具體實例中，本文所述之化合物及療法與用於化學療法、激素療法及生物療法之藥劑及/或雙膦酸鹽一起共投予。在一些具體實例中，用於化學療法之藥劑包括以下中之一或多者：卡鉑（arboplatin）（鉑爾定（Paraplatin））、順鉑（cisplatin）（普拉迪諾（Platinol）、普拉迪諾-AQ）、環磷醯胺（賽特杉（Cytoxan）、尼歐薩（Neosar））、小紅莓（doxorubicin）（阿德力黴素（Adriamycin））、依託泊苷（etoposide）（維派德（VePesid））、氟尿嘧啶（5-FU）、吉西他濱（gemcitabine）（健擇（Gemzar））、伊立替康（irinotecan）（坎普土沙（Camptosar））、太平洋紫杉醇（paclitaxel）（紫杉醇（Taxol））、拓朴替康（topotecan）（和美新（Hycamtin））、長春新鹼（vincristine）（安可平（Oncovin）、文卡薩（Vincasar）PFS）、長春花鹼（vinblastine）（長春鹼（Velban））。

在其他實施例中，本文所述之抗VISTA化合物及療法與一或多種如下免疫檢查點抗體一起共投予，諸如尼沃單抗、派立珠單抗、曲美單抗（tremelimumab）、伊派利單抗、抗PD-L1抗體、抗PD-L2抗體、抗TIM-3抗體、抗LAG-3v、抗OX40抗體及抗GITR抗體。

在另一具體實例中，本文所述之抗VISTA化合物及療法與吲哚胺2,3-二加氧酶（IDO）之小分子抑制劑一起共投予。

本發明之抗VISTA化合物及組成物可投予有需要之個體以預防（包括預防癌症之復發）或治療（例如控制或改善癌症或其一或多種症狀）癌症。任何藥劑或療法（例如化學療法、輻射療法、標靶療法（諸如伊馬替尼（imatinib）、索拉非尼（sorafenib）及維羅非尼（vemurafenib））、激素療法及/或生物療法或免疫療法）可與本文所述之本發明之化合物或組成物組合使用。抗癌劑包括（但不限於）5-氟尿嘧啶；阿西維辛（acivicin）；阿地白介素（aldesleukin）；六甲蜜胺（altretamine）；胺格魯米特（aminoglutethimide）；安吖啶（amsacrine）；阿那曲唑（anastrozole）；安麯黴素（anthramycin）；天冬醯胺酶（asparaginase）；阿紮胞苷（azacitidine）；阿紮替派（azetepa）；阿佐黴素（azotomycin）；巴馬司他（batimastat）；比卡魯胺（bicalutamide）；硫酸博萊黴素（bleomycin sulfate）；布喹那鈉（brequinar sodium）；溴匹立明（bropirimine）；白消安（busulfan）；卡鉑（carboplatin）；卡莫司汀（carmustine）；鹽酸卡柔比星（carubicin hydrochloride）；卡折來新（carzelesin）；西地芬戈（cedefingol）；苯丁酸氮芥（chlorambucil）；西羅黴素（cirolemycin）；順鉑；克拉屈濱（cladribine）；甲磺酸克立那托（crisnatol mesylate）；環磷醯胺；阿糖胞苷（cytarabine）；達卡巴嗪（dacarbazine）；放線菌素（dactinomycin）；鹽酸道諾黴素（daunorubicin hydrochloride）；地西他濱（decitabine）；右奧馬鉑（dexormaplatin）；地紮胍寧（dezaguanine）；甲磺酸地紮胍寧（dezaguanine mesylate）；地吖醌（diaziquone）；多烯紫杉醇（docetaxel）；小紅莓；鹽酸小紅莓；曲洛昔芬（droloxifene）；檸檬酸曲洛昔芬（droloxifene citrate）；丙酸屈他雄酮（dromostanolone propionate）；達佐黴素（duazomycin）；依達曲沙（edatrexate）；鹽酸依氟鳥胺酸（eflornithine hydrochloride）；恩洛鉑（enloplatin）；恩普胺酯（enpromate）；依匹哌啶（epipropidine）；鹽酸表柔比星（epirubicin hydrochloride）；厄布洛唑（erbulozole）；鹽酸依索比星（esorubicin hydrochloride）；雌氮芥（estramustine）；雌氮芥磷酸鈉（estramustine phosphate sodium）；依他噠唑（etanidazole）；依託泊苷（etoposide）；磷酸依託泊苷（etoposide phosphate）；法紮拉濱（fazarabine）；非瑞替尼（fenretinide）；氟尿苷（floxuridine）；磷酸氟達拉賓（fludarabine phosphate）；氟尿嘧啶；氟西他濱（flurocitabine）；磷喹酮（fosquidone）；福司曲星鈉（fostriecin sodium）；吉西他濱（gemcitabine）；鹽酸吉西他濱；羥基脲；鹽酸艾達黴素（idarubicin hydrochloride）；異環磷醯胺（ifosfamide）；伊莫福新（ilmofosine）；介白素II（包括重組介白素II或rIL2）、干擾素α-2a；干擾素α-2b；干擾素α-m；干擾素α-n3；干擾素β-I a；干擾素γ-I b；異丙鉑（iproplatin）；鹽酸伊立替康（irinotecan hydrochloride）；乙酸蘭瑞肽（lanreotide acetate）；來曲唑（letrozole）；乙酸亮丙立德（leuprolide acetate）；鹽酸利阿唑（liarozole hydrochloride）；洛美曲索鈉（lometrexol sodium）；洛莫司汀（lomustine）；鹽酸洛索蒽醌（losoxantrone hydrochloride）；馬索羅酚（masoprocol）；鹽酸氮芥（mechlorethamine hydrochloride）；乙酸甲地孕酮（megestrol acetate）；乙酸甲烯雌醇（melengestrol acetate）；美法侖（melphalan）；美諾立爾（menogaril）；巰基嘌呤；甲胺喋呤；甲胺喋呤鈉；氯苯胺啶（metoprine）；美妥替哌（meturedepa）；絲裂黴素（mitomycin）；米托司培（mitosper）；米托坦（mitotane）；鹽酸米托蒽醌（mitoxantrone hydrochloride）；黴酚酸（mycophenolic acid）；諾考達唑（nocodazole）；奧馬鉑（ormaplatin）；太平洋紫杉醇；培門冬酶（pegaspargase）；甲基比裂黴素（porfromycin）；潑尼氮芥（prednimustine）；鹽酸丙卡巴肼（procarbazine hydrochloride）；嘌呤黴素（puromycin）；羅穀亞胺（rogletimide）；鹽酸沙芬戈（safingol hydrochloride）；司莫司汀（semustine）；辛曲秦（simtrazene）；司泊索非鈉（sparfosate sodium）；司帕黴素（sparsomycin）；螺莫司汀（spiromustine）；螺鉑（spiroplatin）；鏈黑黴素（streptonigrin）；鏈脲菌素（streptozocin）；磺氯苯脲（sulofenur）；他利黴素（talisomycin）；喃氟啶（tegafur）；鹽酸替洛蒽醌（teloxantrone hydrochloride）；替莫泊芬（temoporfin）；替尼泊甙（teniposide）；替羅昔隆（teroxirone）；睾內酯（testolactone）；硫米嘌呤（thiamiprine）；硫鳥嘌呤（thioguanine）；噻替派（thiotepa）；噻唑呋林（tiazofurin）；替拉紮明（tirapazamine）；拓朴替康（topotecan）；曲美沙特（trimetrexate）；葡萄糖醛酸曲美沙特（trimetrexate glucuronate）；曲普瑞林（triptorelin）；尿嘧啶氮芥（uracil mustard）；烏瑞替派（uredepa）；伐普肽（vapreotide）；維替泊芬（verteporfin）；硫酸長春花鹼（vinblastine sulfate）；硫酸長春新鹼（vincristine sulfate）；長春地辛（vindesine）；硫酸長春地辛；硫酸長春匹定（vinepidine sulfate）；硫酸長春甘酯（vinglycinate sulfate）；硫酸長春羅新（vinleurosine sulfate）；酒石酸長春瑞賓（vinorelbine tartrate）；硫酸長春羅定（vinrosidine sulfate）；硫酸長春利定（vinzolidine sulfate）；伏羅唑（vorozole）；折尼鉑（zeniplatin）；淨司他丁（zinostatin）；鹽酸左柔比星（zorubicin hydrochloride）。標靶療法包括（但不限於）酪胺酸激酶抑制劑（例如伊馬替尼、索拉非尼及維羅非尼）。本發明亦涵蓋投予本發明之抗VISTA化合物與放射療法之組合，該放射療法包含使用x射線、γ射線及其他輻射來源來殺滅癌細胞。癌症治療為此項技術中已知且描述於諸如Physician's Desk Reference（第57版, 2003）之文獻中。

本文所述之抗VISTA抗體亦適用於例如治療慢性感染性疾病（諸如尤其HIV、HBV、HCV及HSV）。

本文表1A、1B及2中提供用於選擇本發明之抗VISTA抗體的各種特性及序列資訊。

表1A：所選全人類或人類化抗人類VISTA抗體之CDR序列

表1B：所選全人類或人類化抗人類VISTA抗體之重鏈及輕鏈序列

*VSTB140、VSTB149及VSTB174中之恆定區序列加有下劃線。^Δ VSTB149之重鏈中的賦予蛋白酶抗性之胺基酸殘基以粗體表示。

表2：所選抗VISTA抗體之解離常數（K_D ）

實施例

實施例1：分析人類造血細胞上之VISTA表現

方法：

製備且染色新鮮人類PBMC以進行VISTA表現

在來自數個供體之新鮮分離之人類PBMC（周圍血液單核細胞）上測試VISTA之表現。使用抗人類VISTA-生物素（GA-1）進行染色（5 μg/ml）。使用小鼠IgG1,K-生物素（純系MOPC-21，5 μg/ml）作為同型對照。

供體材料

自Biological Specialty公司（Colmar,PA）獲得血液樣品且當天進行分析。快遞10 ml含有硫酸肝素之全血進行分析。

樣品製備

用無菌PBS 1:1稀釋血液。在50 ml錐形管中，使22 ml經稀釋之臍帶血在20 ml無菌Ficoll-Hypaque（GE Healthcare目錄號17-144003）上分層。在室溫下將管以1800 rpm離心20分鐘。使用1 ml移液器收集離心後界面處之單核細胞且合併於兩個50 ml錐形管中。向各管添加無菌PBS以使體積補足50 ml且在4℃下將細胞以300 g離心10分鐘。丟棄上清液。將細胞再懸浮於50 ml無菌PBS中且在4℃下將管以300 g旋轉10分鐘。丟棄上清液。合併細胞且再懸浮於50 ml無菌PBS中，隨後計數。

染色方案：使用含有5×10⁷ 個PBMC之冷凍小瓶進行補償控制，且用作染色之對照。

使用以下試劑及/或消耗品：

來自BD Biosciences之FACS染色緩衝液（BSA）（目錄號554657），其補充有0.2% EDTA；磷酸鹽緩衝生理食鹽水（PBS）（Gibco目錄號14190）；96孔聚丙烯圓底盤（BD #3077）；1.2 ml聚丙烯排管（Corning #4451）；經生物素標記之抗VISTA純系GA-1，其來自ImmunoNext批號080612B（以5 μg/ml使用）；經生物素標記之mIgG1,K同型對照（純系MOPC-21），Biolegend目錄號400104，批號B116649（以5 μg/ml使用）；抗人類抗體（參見下表之染色法）；近紅外活/死細胞染料（Invitrogen，目錄號L10119）；及抗生蛋白鏈菌素試劑，包括STP-APC（BD Biosciences目錄號554067，批號04251）（以於FACS緩衝液中之1:200稀釋度使用）、STP-PE（Biolegend目錄號405203，批號B139688）（以於FACS緩衝液中之1:200稀釋度使用）、STP-PE Cy7（展示同型對照樣品中之非特異性結合）、STP-Q605（Invitrogen目錄號Q10101MP，批號53449A）（以於FACS緩衝液中之1:200稀釋度使用）。

細胞表面染色方案

染色之前，將1×10⁶ 個細胞轉移於96孔圓底盤中且用150 μl PBS洗滌。隨後在4℃下將盤以1300 rpm離心3分鐘。

隨後，將細胞再次用PBS洗滌且如上所述進行離心。

隨後在50 μl含有0.25 μl近紅外活/死細胞染料之PBS中進行活/死細胞染色。在室溫下10分鐘後，用150 μl FACs染色緩衝液洗滌孔且在4℃下以1300 rpm離心3分鐘。丟棄上清液。

於50 μl FACS染色緩衝液中將細胞以1:100用人類血清阻斷。在4℃下培育盤15分鐘。隨後用150 μl FACs染色緩衝液洗滌孔且在4℃下以1300 rpm離心3分鐘。丟棄上清液。

隨後將含有以下抗體之混合物添加於各孔中以進行表面染色：混合物描述於下表3-6中。視相關群體而定將各混合物與其他混合物分開使用。

表3：譜系染色

表4：T細胞染色

表5：DC染色

表6：骨髓染色

表面染色後，如先前所述用FACS染色緩衝液洗滌細胞兩次且在4℃下以1300 rpm離心5分鐘。將樣品再懸浮於50 μl含有經適當螢光標記之抗生蛋白鏈菌素的FACS染色緩衝液中。在4℃下培育樣品30分鐘。用150 μl FACS染色緩衝液洗滌細胞且在4℃下以1300 rpm離心5分鐘。重複此洗滌步驟，隨後將樣品再懸浮於250 μl FACS染色緩衝液中。當天在BD LSRFortessa™ 細胞分析儀（BD Biosciences）上分析樣品。

資料分析

使用FlowJo型號9軟體再分析流式細胞術資料以對特定表型群體設門。使用幾何平均值之列舉來比較不同細胞亞群中之VISTA表現。藉由自抗VISTA處理樣品之平均值減去同型對照值將各群體針對背景進行標準化。用Prism製作曲線且在僅比較兩個樣品時使用史都登氏T檢驗（student's T-test）進行統計或使用進行單因子ANOVA以及邦弗朗尼事後檢驗（Bonferroni post-test）統計。

結果：

人類骨髓及淋巴亞群上之VISTA表現：

如圖2A-2E、3A-3G、4、5A-5B及6A-6C中所示，CD14⁺ 單核球上之VISTA表現顯著不同於全部其他群體（p＜0.001）。其他群體之間未發現顯著差異。單核球在周圍血液中表現最高水準之VISTA，其中CD14⁺ CD16^- 亞群相較於CD14^lo CD16⁺ 細胞具有顯著較高表現。儘管APC展示中等表現，但淋巴亞群展示低表現量。

人類T及NK亞群上之VISTA表現：

如圖7A-7E、8A-8G及9中所示，對於NK亞群，CD56^lo 細胞展現顯著高於CD56^Hi NK細胞之VISTA表現量。在T細胞亞群中，CD8⁺ 記憶細胞表現最高表現量，但其並不顯著高於CD8⁺ 初始（naive）或CD4⁺ T細胞。

人類樹突狀細胞亞群上之VISTA表現：

如圖10A-10D、11A-11C及12中所示，未發現VISTA表現存在顯著差異；DC及嗜鹼性球展現低VISTA表現，其中漿細胞樣樹突狀細胞（pDC）一般較高但程度並不顯著。

結論：此等結果展示各種免疫細胞亞群上之VISTA表現且VISTA最高地表現於單核球上，其中一些表現在不同T細胞亞群及NK細胞上且幾乎不表現於B細胞上。

實施例2：周圍血液細胞上之VISTA表現

方法：

全血染色：用下示抗體混合物藉由在4℃下培育30分鐘將新鮮分離之全血（100 μl）染色。用RBC裂解緩衝液將紅血球（RBC）裂解且用染色緩衝液洗滌剩餘細胞1次。使細胞再懸浮於200 μl染色緩衝液中。使用MACSQuant流式細胞儀收集資料且使用FlowJo分析軟體分析。

周圍血液單核細胞（PBMC）染色：使用Ficoll梯度自全血分離周圍血液單核細胞。用100 μl染色緩衝液中之抗體混合物將新鮮分離之1×10⁶ 個PBMC染色。在4℃下培育樣品30分鐘，隨後用染色緩衝液洗滌一次。使細胞再懸浮於100 μl染色緩衝液中。使用MACSQuant®流式細胞儀（Miltenyi Biotec）收集資料且使用FlowJo分析軟體分析。

所用抗體為CD11b、CD33、CD177、CD16、CD15、CD14、CD20、HLADR、CD3、CD4、CD8、CD127、CD69及FOXP3抗體（Biolegend, San Diego, CA）。由ImmuNext（Lebanon, NH）製備APC結合之小鼠抗人類VISTA（純系GG8）。

結論：

健康人類周圍血液細胞上之VISTA表現

使用多色流式細胞術分析全血及周圍血液單核細胞的VISTA表現。如圖13A及13B中所示，在單核球上偵測到VISTA表現之最高水準，繼而為嗜中性球。CD4+與CD8+T細胞君表現低水準之VISTA，如圖13C及13D中所示。

癌症患者周圍血液細胞上之VISTA表現

如圖14A-C中所示，分析來自肺癌患者之周圍血液單核細胞（PBMCs）。圖14A為展示CD14⁺ 單核球及源自CD15⁺ 骨髓之抑制細胞（MDSC）的分析結果的代表性流式細胞分析骨髓圖。結果表明表型CD15⁺ 細胞為源自嗜中性球之MDSC。另外，此等細胞不存在於健康血液樣品中。圖14B為源自健康及癌症患者之單核球上VISTA表現之代表性直方圖，表明相較於健康對照，較高水準之VISTA表現於癌症患者細胞上。類似地，在癌症患者之MDSC上發現較高水準之VISTA，如圖14C中所示。

圖15A為展示結腸癌患者之血液中源自嗜中性球之MDSC的存在的代表性FACS圖。圖15B及15C為展示相較於健康供體血液樣品較高水準之VISTA表現於癌症患者單核球上的代表性直方圖。

食蟹獼猴周圍血液細胞上之VISTA表現

如圖16A及16B中所示，猴全血之流式細胞術分析揭示類似於人類細胞的VISTA表現模式。相較於CD4⁺ （圖16C）及CD8⁺ （圖16D）T細胞，單核球與嗜中性球均表現最高水準之VISTA。

實施例3：血紅素惡性細胞系中RNA層面及蛋白質層面的VISTA表現

因為VISTA表現於血紅素惡性病中，故抗VISTA抗體可能以惡性細胞為目標而破壞以及阻斷VISTA且促進抗腫瘤免疫反應。

資料包括約140種血紅素惡性細胞系（在分析中重複一些細胞系）之RNAseq分析結果。資料展示於圖17中。

將RNAseq值以FPKM（每1百萬個所定位片段中外顯子之每千個鹼基的片段）值形式列出。

本質上，此意謂計數屬於基因之外顯子區域中的所有讀取結果，且藉由基因之長度與每個樣品之讀取總數標準化（以計算樣品間差異）。截止值為1；高於1為VISTA表現陽性（RNA層面），低於1為VISTA表現陰性。

結果表明多個細胞系在RNA層面為陽性，主要為急性骨髓性白血病及慢性骨髓性白血病。此可因為VISTA高度表現於正常骨髓細胞中而預期到，且因為認為其功能為減弱免疫反應，包括抗腫瘤免疫反應。

實施例4：針對VISTA之單株抗體的產生

噬菌體淘選

執行二十四個噬菌體淘選實驗以富集對Cyno VISTA-His具有活性之噬菌體。使用獼猴VISTA蛋白進行此等實驗，因為其相較於人類VISTA蛋白展示較佳生物素結合。為確定噬菌體實驗成功，將來自個別輪淘選之噬菌體池添加至塗有經生物素標記之cyno VISTA-His的中性鏈親和素盤且用結合HRP之抗M13抗體偵測。自噬菌體選擇輪挑取個別集落且在96孔盤中製備Fab蛋白。分析所表現之Fab上清液的與經生物素標記之cyno VISTA-His的結合。此操作得到超過200個成功結果。

擴增來自Fab盤之VH及VL區，提交以進行DNA測序且作為FASTA文件輸出。當挑取將轉化為MAB且以MAB形式測試之純系時，該等純系基於序列多樣性以及具有有限轉譯後修飾風險及儘可能具有較少疏水性殘基來選擇。

將來自噬菌體純系之VH及VL次選殖於哺乳動物IgG1/κ表現載體中且轉染於HEK293細胞中。將抗體在蛋白A瓊脂糖快速流動親和力樹脂上純化。藉由定量ELISA使用Nanodrop量測來確定噬菌體MAB之濃度。抗體組以高水準表現。SDS-PAGE分析展現各表現之抗體變體的完整性。

藉由擴增來自最後一輪淘選之多株抗體混合物的VH域以選殖於具有VL多樣性之噬菌體載體中來進行噬菌體抗體之線上成熟。此操作得到富集之VH池，其經取樣具有額外VL多樣性。對噬菌體進行1-2輪嚴格淘選，以期鑑別VISTA ECD His蛋白質之極高親和力結合物。操作單株Fab ELISA以確定成熟成功。將ELISA及表現資料根據來自原始重生淘選實驗之設定成100%的參考純系標準化，且鑑別相較於參考純系對cyno VISTA抗原具有較高結合信號的親和力成熟純系。此製程產生數個在低抗原濃度（1 nM）下篩選時展現高達200%結合的純系，對具有最高親和力之純系測序且製成MAB。

融合瘤產生

使一組BALB/cAnNCrl小鼠接受一次50 μg於傳氏完全佐劑（Complete Freund's Adjuvant）中乳化的Hu VISTA-Ig重組蛋白（Sino）的腹膜內（IP）注射，繼而在兩週後接受一次50 μg於傳氏不完全佐劑（Incomplete Freund's Adjuvant）中乳化的Hu VISTA-Ig重組蛋白的腹膜內注射。兩週後，使小鼠接受一次50 μg於傳氏不完全佐劑中乳化的cyno VISTA-Fc重組蛋白的腹膜內注射。使所有小鼠在尾巴底部接受最後一次含有25 μg人類及25 μg cyno VISTA之PBS的注射，五天後收集脾以進行融合。

使另一組BALB/cAnNCrl小鼠接受一次50 μg於傳氏完全佐劑中乳化的Hu VISTA-His重組蛋白的腹膜內注射。兩週後，使小鼠接受一次50 μg於傳氏不完全佐劑中乳化的Hu VISTA-His重組蛋白的腹膜內注射。兩週後，使小鼠接受一次50 μg於傳氏不完全佐劑中乳化的Cyno VISTA-His重組蛋白的腹膜內注射。兩週後，使所有小鼠接受最後一次含有25 μg Hu VISTA-His及25 μg Cyno VISTA-His之PBS的注射，三天後收集脾以進行融合。

在融合當天，藉由CO₂ 窒息使小鼠安樂死，移出脾且置於10 mL冷磷酸鹽緩衝生理食鹽水中。藉由用小研杵將脾研磨穿過細目篩且在室溫下用PBS沖洗來製備脾細胞之單細胞懸浮液。用PBS洗滌細胞一次且進行RBC裂解。簡言之，將細胞再懸浮於3 mL RBC裂解緩衝液（Sigma #R7757）/脾中且置於冰上5分鐘。在室溫下用PBS再洗滌細胞一次且進行標記以進行磁性分選。按照製造商之說明，用抗鼠Thy1.2、抗鼠CD11b及抗鼠IgM磁珠（分別為Miltenyi Biotec # 130-049-101、130-049-601及130-047-301）標記細胞，隨後使用具有Midi MACS之MS管柱分選。使陰性細胞洗提份（陽性細胞洗提份丟棄）與FO細胞融合。以1:1比率之鼠骨髓瘤細胞與活脾細胞進行融合。簡言之，將脾及骨髓瘤細胞混合在一起，粒化且用50 mL PBS洗滌一次。在37℃下用每10e8個脾細胞1 mL聚乙二醇（PEG）溶液（2 g PEG（分子量4000）、2 mL DMEM、0.4 mL DMSO）使集結粒再懸浮30秒。隨後將細胞/融合混合物在輕柔攪拌下浸於37℃水浴中約60秒。藉由經1分鐘緩慢添加37℃ DMEM終止融合反應。將融合細胞在室溫下靜置5分鐘，隨後以150×g離心5分鐘。隨後將細胞再懸浮於含有HAT（Sigma目錄號H0262）之培養基E-HAT（MediumE，StemCell Technologies目錄號03805）中，且接種於96孔平底聚苯乙烯組織培養盤（Corning # 3997）中。

使用捕捉EIA針對特異於cyno VISTA之抗體篩選融合瘤上清液。簡言之，用於塗佈緩衝液（Thermo 28382）中之山羊抗小鼠IgG（Fc）抗體（Jackson #115-006-071）以4 μg/ml塗佈盤（Nunc-Maxisorp #446612）至少60分鐘。在室溫下將盤用每孔200微升0.4%（w/v）牛血清白蛋白（BSA）之PBS溶液阻斷30分鐘。洗滌盤一次，每孔添加50 μl融合瘤上清液且在室溫下培育至少30分鐘。洗滌盤一次，每孔添加50 μl 0.1 μg/mL cyno VISTA-huIg且在室溫下培育30分鐘。洗滌盤一次，向盤添加1:40,000抗生蛋白鏈菌素HRP（Jackson 016-030-084）於0.4% BSA/PBS中之溶液且在室溫下培育30分鐘。洗滌盤3次，隨後每孔使用100 μl TMB Turbo受質（Thermo Scientific 34022）顯色，在室溫下培育約10分鐘。使用每孔25 μl 4 N硫酸終止反應且使用自動盤分光光度計在450 nm下量測吸光度。選擇15個初級成功結果以藉由限制稀釋法次選殖且以相同初級篩選格式篩選。

使用人類VISTA-Ig交叉篩選所有cyno VISTA活性融合瘤細胞系以評定交叉反應性。簡言之，用於0.1 M碳酸鈉-碳酸氫鈉緩衝液（pH 9.4，Pierce 28382BupH™）中之山羊抗ms Fc（Jackson#115-006-071）以4 μg/mL塗佈盤（Nunc-Maxisorp #446612），在4℃下隔夜。無需進行洗滌，用200 μl阻斷劑（0.4%BSA（Sigma）（w/v）於PBS（Invitrogen）中之溶液）阻斷孔，在4℃下隔夜。移除阻斷溶液後，在室溫下在經塗佈盤上培育未稀釋融合瘤上清液30分鐘。用PBST（0.02%吐溫（Tween）20（Sigma）（w/v）之PBS溶液）洗滌盤一次，隨後與於阻斷劑中稀釋至100 ng/ml之Hu VISTA-Ig一起培育30分鐘。用洗滌盤一次且在室溫下用以阻斷劑1:10,000稀釋之山羊抗人類Fc-HRP（Jackson #109-036-098）探測30分鐘。再次洗滌盤，隨後每孔使用100 μl TMB Turbo受質（Thermo Scientific 34022）顯色，在室溫下培育約10分鐘。使用每孔25 μl 4 N硫酸終止反應且使用自動盤分光光度計在450 nm下量測吸光度。

對人類與獼猴VISTA展示活性之融合瘤的V區抗體序列進行選殖。在反轉錄酶（RT）反應之前用Invitrogen之SuperScript III細胞直接cDNA系統製備融合瘤細胞。簡言之，丟棄培養基且將盤置於冰上且再懸浮於200 μl冷PBS中。將四十微升轉移於MicroAmp快速96孔反應PCR盤中且將盤置於冷金屬盤基座上，用塑膠膜密封且以700 rpm旋轉3分鐘。丟棄PBS且向各孔中添加10 μl再懸浮緩衝液及1 μl裂解增強劑。密封盤，在75℃下培育10分鐘且儲存在-80℃下。

為進行RT反應，各孔含有5 μl水、1.6 μl 10×DNase緩衝液、1.2 μl 50 mM EDTA、2 μl Oligo(dT)20（50 mM）及1 μl 10 mM dNTP混合物。在70℃下培育盤5分鐘，繼而在冰上培育2分鐘，隨後向各孔添加以下試劑：6 μl 5×RT緩衝液、1 μl RNaseOUT™（40 U/μl）、1 μl SuperScript™ III RT（200 U/μl）及1 μl 0.1 M DTT。密封盤，置於預熱至50℃之熱循環器上且在50℃下培育50分鐘，繼而使其滅活（在85℃下培育5分鐘）。將反應物在冰上冷凍且將單股cDNA儲存在-80℃下直至進一步使用。

為進行V區擴增，提供20 μl PCR反應物。各孔含有16.2 μl水、2.0 μl 10× PCR反應緩衝液、0.8 μl MgSO₄ （50 mM）、0.4 μl 10 mM dNTP、0.15 μl 100 μM正向引子混合物、0.05 μl 100 μM反向引子、0.2 μl HiFi Tag酶。將如上所述製備之cDNA轉移（每孔2 μl）至PCR組分混合物，密封盤且操作擴增反應；對於VH，程式為（i）94℃ 1分鐘，（ii）94℃ 15秒，（iii）55℃ 30秒，（iv）68℃ 1分鐘。重複步驟（ii-iv）總共35個循環，繼而在68℃下最後延長3分鐘。對於VL，程式為（i）94℃ 1分鐘，（ii）94℃ 15秒，（iii）55℃ 30秒，（iv）65℃ 30秒，（v）68℃ 1分鐘。重複步驟（ii-v）總共35個循環，繼而在68℃下最後延長3分鐘。

預混合正向引子且將此混合物與反向引子以比率3:1使用。在瓊脂糖凝膠上檢驗PCR產物。製備反應物以藉由添加強化子（In-Fusion HC選殖套組，目錄號639650，Clontech）進行infusion選殖。將五微升PCR反應物轉移至PCR盤，繼而每孔轉移2 μl強化子。密封盤且在熱循環器中培育（在37℃下15分鐘且在80℃下15分鐘）。藉由Esp3I消化製備目的載體（vDR243或vDR301）；（在37℃下在3 μl Tango緩衝液、2 l Esp3I及水中於30 μl反應物中消化1.5 μg載體2小時）。

為進行infusion選殖，將經2 μl強化子處理之PCR產物與100 ng Esp3I消化之載體及2 μl5×infusion酶（Clontech）混合。以96孔盤格式進行infusion反應。在50℃下在PCR機上培育盤15分鐘且藉由在42℃下在不震盪下熱休克40秒將斯黛拉感勝任細胞（Stella competent cell）轉形，且與所選抗生素一起展塗於LB瓊脂盤上且在37℃下培育隔夜。第二天，將集落挑取於含有LB/卡本西林（Carbenicillin）培養基之96孔深孔盤中且在37℃下生長隔夜。由與等體積30 w/v%甘油混合之隔夜培養物製成冷凍儲備液。使用測序引子SPF0052對V區測序。分析序列，每個融合瘤vH及vL選擇一個陽性孔，再排列於新盤中且在具有安比西林之富集培養基中生長隔夜。隨後將純系進行miniprep DNA製備以小規模轉染於96孔盤中。

使用內部軟體程式將重鏈與輕鏈之四十八個所選小鼠融合瘤序列進行人類架構調適。對於小鼠vH或vL中之每一者選擇一個人類架構。經由反向轉譯獲得V區DNA序列。由整合DNA技術（Coralville, IA）將對應於HFA胺基酸序列之合成DNA區域定序。分別向預切割之vDR149及vDR157、人類IgG1及人類κ中進行選殖。使用Qiagen Endo-free Maxi-prep套組製備。使用Expi293（100 ml）培養物表現此抗體組。

實施例5：用於在試管內進行人類VISTA-IGT細胞抑制分析之方案

用GFP或人類VISTA穩定轉染小鼠A20細胞。將其與ova肽及DO11.10 T細胞一起培育。培育開始後24小時量測T細胞之CD25表現。A20-huVISTA細胞抑制T細胞之CD25表現，但此讀出結果藉由與VSTB95一起培育而明顯恢復（圖18）。

實施例6：抗VISTA抗體之人類架構區調適

使用內部軟體程式藉由CDR接枝（Jones等人,Nature , 321: 522-525 (1986)）進行重鏈與輕鏈之小鼠融合瘤序列的人類架構調適。程式根據Kabat定義（Wu, T. T. & Kabat, E. A. (1970).J Exp Med, 132, 211-50）描繪V區序列之互補決定區（CDR）且使用Blast比較架構區與人類生殖系基因。選擇與小鼠架構具有最高序列一致性之人類生殖系作為用於人類架構調適（HFA）之接受者基因。在一些狀況下，基於前述具有良好表現之人類架構的經歷，選擇密切相關之人類生殖系基因作為替代。經由反向轉譯獲得選用於小鼠vH或vL V區中之每一者的人類架構的DNA序列。由整合DNA技術（Coralville, IA）將對應於HFA胺基酸序列之合成DNA區域定序。分別向人類IgG1及人類κ中進行選殖。

實施例7：抗VISTA抗體構築體

用於細胞系產生之分子的質體及序列資訊：產生質體構築體以用於具有VSTB112可變區及IgG1κ恆定區（VSTB174，由於恆定區之異型變化而產生之新編號）、IgG2δ恆定區（VSTB140）或IgG1抗蛋白酶恆定區（VSTB149）的抗VISTA抗體。

Lonza載體

Biologics Research（BR）及Pharmaceutical Development&Manufacturing Sciences（PDMS）中建立pEE6.4及pEE12.4中國倉鼠卵巢（CHO）表現載體系統（Lonza Biologics公共有限公司）作為在哺乳動物表現細胞系中產生治療性mAb的主要表現系統。各載體含有驅動重鏈（HC）或輕鏈（LC）表現之人類巨細胞病毒（huCMV-MIE）啟動子且含有安比西林抗性基因。pEE12.4載體亦包括編碼麩醯胺酸合成酶（GS）之基因。需要麩醯胺酸合成酶活性之生長條件對細胞施加選擇性壓力來維持表現載體（GS基因表現系統手冊4.0版（GS Gene Expression System Manual Version））。使用pEE6.4作為單基因載體選殖HC基因且使用pEE12.4作為單基因載體選殖LC基因。由此兩種Lonza單基因載體產生Lonza雙基因質體。

所選 VISTA mAb 之可變重鏈區的胺基酸序列

＞ VSTB112重鏈（SEQ ID NO:37）

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSSYGWSYEFDYWGQGTLVTVSS

＞ VSTB50重鏈（SEQ ID NO:38）

QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGLNWVRQAPGQGLEWMGWINPYTGEPTYADDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQICSLKAEDTAVYYCAREGYGNYIFPYWGQGTLVTVSS

＞ VSTB53重鏈（SEQ ID NO:39）

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTHYTIHWVRQAPGQGLEWMGYIIPSSGYSEYNQKFKDRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGAYDDYYDYYAMDYWGQGTLVTVSS

＞ VSTB95重鏈（SEQ ID NO:40）

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRNYGMSWVRQAPGKGLEWVASIISGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIYDHDGDYYAMDYWGQGTTVTVSS

所選 VISTA mAb 之可變輕鏈區的胺基酸序列

＞VSTB50輕鏈（SEQ ID NO:41）

DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRASESVDTYANSLMHWYLQKPGQPPQLLIYRASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQTNEDPRTFGQGTKLEIK

＞VSTB53輕鏈（SEQ ID NO:42）

DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASHVPWTFGQGTKLEIK

＞VSTB95輕鏈（SEQ ID NO:43）

DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPWTFGQGTKLEIK

＞VSTB112輕鏈（SEQ ID NO:44）

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDTRLNWYQQKPGKAPKLLIYSASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSAYNPITFGQGTKVEIK

＞VSTB116輕鏈（SEQ ID NO:45）

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSINTNLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQARDTPITFGQGTKVEIK

實施例8：抗VISTA抗體之ELISA及FACS篩選

此等實驗用於確定在ELISA中所產生抗體結合人類或獼猴VISTA蛋白之能力，以及使用FACS篩選確定抗體結合表現人類或獼猴VISTA蛋白之K562細胞（人類骨髓性白血病細胞系）的表面上VISTA蛋白之能力。

方法：

ELISA程序概述：在4℃下用1 μg/ml SB0361（人類）或SB0361（cyno（獼猴））蛋白塗佈盤隔夜，該等蛋白質為來自各別物種之VISTA的胞外域。將抗體自初始濃度1:4逐步稀釋，稀釋至1 μg/ml，總共獲得4種濃度，且在室溫（RT）下培育2小時。使用小鼠抗人類IgG1-HRP（辣根過氧化酶）進行偵測且在室溫下培育1小時。使用PBS-吐溫（0.05%）進行所有洗滌。

FACS程序概述：用5 μg/ml各測試抗體對2 × 10⁵ 個K562-G8（人類）或K562-C7（獼猴）細胞染色且在4℃下培育30分鐘。使用5 μg/ml之山羊抗人類IgG1-PE（藻紅素）抗體作為次級偵測抗體。在BD Fortessa上操作細胞且使用FlowJo軟體（Tree Star, Inc., Ashlang, OR）分析活群體之MFI（平均螢光強度）。

資料分析/結果：對於各抗體，對於4個分析中之每一者的ELISA與FACS分析，關於抗體是否穩固地結合給出主觀分值（是/否）。若對於任一分析中之結合，抗體給出「否」結果，則重複分析以確認其為陰性。結果展示於下表7及圖19A-19F及20A-20F中。

表7.

實施例9：使用混合淋巴細胞反應（MLR）及葡萄球菌（STAPHYLOCOCCUS ）腸毒素B（SEB）活化分析篩選抗人類VISTA抗體之結果

此研究之目的為提供如下資料，其在混合淋巴細胞反應（MLR）分析以及葡萄球菌腸毒素B活化（SEB）分析中支持提高細胞免疫反應之多功能α-VISTA抗體之鑑別。

混合淋巴細胞反應（MLR）為標準免疫分析，其取決於MHC I類及II類錯配來驅動同種異體T細胞反應。自兩個錯配個體分離周圍血液單核細胞，一起培育，且由於此等錯配，發生增殖及細胞激素產生。

材料及方法：

藉由組合500 ml RPMI與50 ml人類AB血清、5 ml青黴素/鏈黴素（10,000 U/ml）、5 ml L-麩醯胺酸（100×）及10 ml HEPES（1 M）製備10% AB培養基。培養基儲存不超過14天。藉由用9.8 ml RPMI稀釋0.2 ml胸苷儲備液（1 mCi/ml）來製備1 mCi氚化胸苷。

用10% AB血清培養基將可溶性VISTA抗體稀釋至20 μg/ml。將100 μl適當抗體溶液添加至96孔U底盤（Falcon產品#353077或等效物）之適當孔中。添加各種細胞群體後，最終濃度為10 μg/ml。

分離白血球：供體為至少18歲，大體上健康且自當地群體隨機選擇。將供體血液自分離管轉移至50 ml錐形瓶。每25 ml血液下置放15 ml Ficoll 1077，小心使其不與血液混合。在室溫下在不進行制動下將細胞以1250 g離心25分鐘。在Ficoll與血清之界面處分離白血球且用40 ml漢克氏平衡鹽溶液（Hanks Balances Salt Solution，HBSS）稀釋細胞。在4℃下以453 g（1500 rpm）離心10分鐘。將細胞再懸浮於50 ml HBSS中且藉由將500 μl傳遞至各別管中計數。

混合淋巴細胞反應（MLR）96孔盤設定：基於欲分析之樣品數確定分析所需之「刺激細胞（stimulator cell）」及「反應細胞（responder cell）」的適當數目。將刺激群體以96孔U底盤每孔0.5 × 10⁵ 個細胞接種且將反應群體以每孔1.0 × 10⁵ 個細胞接種。所有條件必須重複進行三次。將適當數目之「刺激細胞」吸於新錐形瓶中且如先前所述進行離心。將細胞再懸浮於10 ml中且用4000拉德（rad）照射。如先前所述將細胞離心，以1 × 10⁶ 個/毫升之濃度再懸浮於10% AB血清培養基中且向適當孔中添加50 μl。分離所要數目之反應細胞，如先前所述進行離心，以2 × 10⁶ 個/毫升之濃度再懸浮於10% AB血清培養基中且向適當孔中添加50 μl。在37℃及5% CO₂ 下培育細胞5天。在第五天，移出30 μl上清液以分析干擾素γ（IFN-γ）產生。在第五天，向各孔添加25 μl 40 μCi/ml氚化胸苷溶液且在37℃及5% CO₂ 下培育8小時。根據製造商之說明將細胞轉移至96孔微閃爍盤中。根據製造商之說明使用微閃爍計數器計數。藉由ELISA（eBioscience目錄號88-7316-88）使用製造商之方案測定IFN-γ濃度。

資料分析：計算未處理孔之平均每分鐘計數（CPM）或IFN-γ濃度。計算各測試組之平均CPM或IFN-γ。將資料組進行Log₁₀ 轉化。使用各化合物之12個MLR倍數-分值，計算各化合物之12個測試組的平均值：12個實驗之平均分值=Σ[(log₁₀ (測試化合物三次重複實驗之平均CPM))-(log₁₀ (未處理之三次重複實驗之平均CPM))]/12。

接受準則：在操作分析之前測試所有測試試劑及適當對照之內毒素且含量應＜0.1 EU/mg。單獨反應細胞之平均CPM計數低於700 CPM，表明細胞在單獨培育時靜止。MLR組之CPM為單獨培育之反應細胞之CPM的至少2倍，表明反應發生且供體錯配。所有MLR分析包括人類IgG1陰性對照蛋白。基於使用史都登氏t檢驗，人類IgG1陰性對照之結果並非在統計學上不同於未處理樣品。

MLR中抗VISTA抗體之篩選：所有化合物之初始篩選。用抗VISTA抗體操作MLR前，確定抗體結合細胞結合之VISTA（經由FACS分析）及VISTA蛋白（經由ELISA）。抗體S26（VSTB77）、S30（VSTB86）、S31（VSTB88）、S32（VSTB90）及S39（VSTB74）在此初次篩選中不合格，但仍在分析中測試。出於初步篩選之目的，在MLR中以10 μg/ml測試所有抗體，其中量測之參數為增殖及IFN-γ（圖21A-21D及22A-22B）。

選擇前六個抗體。由初始篩選，選擇六個候選物以進行進一步分析：VSTB112（S2）、VSTB116（S5）、VSTB95（S16）、VSTB50（S41）、VSTB53（S43）及VSTB60（S47）。

MLR中前六個候選物之稀釋研究：方案調整。該方案與先前所述相同，但進行一些調整：將抗體稀釋至以下濃度：30、10、3、1、0.3、0.1、0.03、0.01及0 μg/ml。

測定IC₅₀ 值：使用原始CPM計數及IFN-γ濃度來測定各抗體之IC₅₀ 值。經由使用程式「EZ-R stats.」進行IC₅₀ 值計算。使用六個個別反應者測定IC₅₀ 值。在MLR中獲得個別CPM計數及IFN-γ濃度，且對前面之候選物進行劑量滴定。

表8：MLR中對於CPM與IFN-γ之IC₅₀ 值

** 值為抗體濃度之log₁₀ 。

結論：初步篩選表明多種VISTA特異性抗體能夠提高MLR細胞免疫反應。基於功效及變化將抗體分級且基於此等結果，選擇VSTB112、VSTB116、VSTB95、VSTB50、VSTB53及VSTB60在劑量滴定實驗中評估。在劑量滴定實驗中，相較於其他五種抗體，VSTB60誘導較弱反應。

葡萄球菌腸毒素B（SEB）活化分析：SEB為誘導特定Vβ+ T細胞活化的細菌超抗原。分離周圍血液單核細胞且與培養物中之SEB抗原一起培育，從而誘導穩固細胞激素產生。對前五種候選物進行此分析。

10% AB培養基之製備、1 mCi氚化胸苷之製備、可溶性VISTA抗體之製備及白血球之分離均如上文在MLR中描述般進行。

SEB 96孔盤設定：基於欲分析之樣品數確定分析所需之反應細胞的適當數目。將反應群體以96孔U底盤每孔2.0 × 10⁵ 個細胞接種。所有條件必須重複進行三次。如先前所述將細胞離心且以4 × 10⁶ 個/毫升之濃度再懸浮於10% AB血清培養基中且向適當孔中添加50 μl。添加50 μl 10% AB血清培養基，其含有濃度為40 ng/ml之SEB抗原。在所述實驗中，自Sigma Aldrich（目錄號S0812）獲得SEB。孔中之最終濃度為10 ng/ml。在37℃及5% CO₂ 下培育細胞3天。在第三天，移出30 μl上清液以分析IFN-γ產生。向各孔添加25 μl 1 mCi/ml氚化胸苷溶液且在37℃及5% CO₂ 下培育8小時。根據製造商之說明將細胞轉移至96孔微閃爍盤中。根據製造商之說明使用微閃爍計數器計數。藉由ELISA（eBioscience目錄號88-7316-88）使用製造商之方案測定IFN-γ濃度。

方案：資料分析。對於所有濃度之各抗體計算平均每分鐘計數（CPM）或IFN-γ濃度。接受準則如先前所述執行。如所述進行IC₅₀ 值測定。在SEB分析中獲得個別CPM計數及IFN-γ濃度，且對前面之候選物進行劑量滴定。

表9：SEB中對於CPM與IFN-γ之IC₅₀ 值。

**值為抗體濃度之log₁₀ 。

結論：在SEB分析中VISTA特異性抗體以劑量依賴方式提高細胞激素產生及增殖。來自SEB研究之IC₅₀ 值一般類似於MLR稀釋研究之結果。

實施例10：抗原決定基分組（binning）分析

方法：使用ProteOn XPR36系統（BioRad）執行抗原決定基分組。使用製造商關於胺偶合化學法（BioRad，目錄號176-2410）之說明用兩組6種單株抗體（mAb）塗佈ProteOn GLC晶片（BioRad，目錄號176-5011）。

在室溫下將過量競爭性mAb（250 nM最終濃度）與人類VISTA（25 nM最終濃度）一起預培育4小時，且在塗有塗佈mAb組之晶片上一次操作6個，其中締合時間為4分鐘，繼而解離5分鐘。各操作後，用100 mM磷酸將晶片再生。

資料分析涉及藉由配位體將所有感測器圖譜分組及施加對準嚮導，其自動進行X及Y軸對準及假影移除。隨後對資料施用Interspot校正。

非競爭性mAb定義為結合信號相同或＞A1信號（僅結合於人類VISTA）。

競爭性mAb定義為結合信號＜＜A1信號（亦即僅結合於人類VISTA）。

結果：在圖23中所示之例示性感測器圖譜中，將VSTB85抗體塗佈於Proteon SPR晶片上且使與指定競爭者一起預培育之VISTA蛋白在晶片上經過。VSTB50為非競爭性抗體之實例，因為當操作VISTA/VSTB50複合物時可見陽性反應。與VISTA複合之GG8、VSTB49及VSTB51不結合於晶片上所塗佈之VSTB85，因此分類為與VSTB85競爭VISTA上之相同結合位點。

表10：

實施例11：PROTEON親和力測定

使用抗IgG Fc塗佈之表面在ProteOn晶片上捕捉抗體。測試抗體與VISTA蛋白濃度在0.39 nM至100 nM範圍內之人類及獼猴（VISTA）胞外域（ECD）的結合。使抗原與塗有抗體之晶片結合/締合4分鐘，隨後監測解離30分鐘。藉由用100 mM磷酸處理18秒進行兩次使晶片再生。在25℃下操作所有實驗且將數據擬合1:1朗格繆爾結合模型（Langmuir binding model）。

實施例12：抗VISTA處理在MB49鼠膀胱腫瘤模型中之作用

方法：

用MB49腫瘤細胞注射C57BL/6小鼠。形成腫瘤後，開始抗VISTA處理。隨後監測腫瘤生長3次/週。根據IACUC法規，在腫瘤之任何尺寸達到15 mm後，處死小鼠。

對於各實驗，融化MB49細胞之冷凍小瓶且在具有10%血清及青黴素/鏈黴素抗生素之RPMI 1640 (+ L-Glut)中生長。培養三天後，使用StemPro Accutase收集細胞且以5×10⁶ 個細胞/毫升之濃度再懸浮於RPMI中，且每隻小鼠注射50 μl。

6-8週齡雌性C57BL/6小鼠購自National Cancer研究所。到達後，使其適應一天，隨後刮去其右側腹之毛且將其尾部刺上標記。隨後三-五天後對其進行注射。

腫瘤注射（皮內）：在小鼠經刮毛側腹皮內（i.d.）注射50 μl MB49細胞懸浮液（約250,000個細胞）。

監測腫瘤生長：使用電子測徑規首先跨越最寬尺寸（L）且其次在第一量測之90°角度（W）量測腫瘤生長。腫瘤體積如下獲得：

體積= (L² _* W² )/2 。

在腫瘤直徑達到約5 mm（體積約60 mm³ ）後認為形成腫瘤。形成後，開始處理。在處理過程中，每週量測腫瘤生長三次且直至實驗終止。

抗VISTA處理：腹膜內注射10 mg/kg嵌合13F3-mIgG2a單株抗體。注射時程為每週三次歷時四週。

小鼠安樂死：按照IACUC要求，在動物腫瘤之最長尺寸達到15 mm後，使動物安樂死。

分析功效：使用Excel進行資料管理且使用GraphPad Prism繪圖來分析小鼠腫瘤體積。使用R統計計算軟體的宏進行統計分析。

實驗設計展示於圖24中。

結果：

雌性小鼠之Ch13F3-mIgG2a處理使得70%動物中產生完全腫瘤抑制（CR）且在30%動物（n=7）中產生部分緩解（PR）（表11及圖25B）。相比之下，所有對照mIgG2a處理小鼠展示腫瘤進行性生長（6/6）（圖25A）。此等資料展示抗VISTA處理可對腫瘤生長具有極大作用。

表11：完全緩解（CR）與部分緩解（PR）

人類VISTA序列展示於圖26及27中，自前述Wang等人,2011修改，該文獻之全部內容併入本文中。

實施例13：使用氫/氘（H/D）交換研究進行抗VISTA抗體之抗原決定基定位

為鑑別人類VISTA上針對VSTB50、60、95及112之抗原決定基，使用相應Fab進行溶液氫/氘交換質譜（HDX-MS）。為進行H/D交換，用於分析Fab擾動之程序類似於先前所述（Hamuro等人, J. Biomol. Techniques 14:171-182, 2003；Horn等人, Biochemistry 45:8488-8498, 2006），但進行一些修改。自IgG藉由木瓜蛋白酶消化製備Fab且使用Pierce Fab製備套組（Thermo Scientific，目錄號44985）捕捉蛋白A。人類VISTA蛋白序列含有六個N連接之糖基化位點。為改良序列覆蓋度，用PNGaseF將蛋白質去糖基化。在氘化水溶液中培育去糖基化VISTA蛋白預定時間，使得在可交換氫原子處併入氘。在4℃下，在46 μL氧化氘（D₂ O）中，使氘化VISTA蛋白與VSTB50、VSTB60、VSTB95或VSTB112之任一Fab複合30秒、2分鐘、10分鐘及60分鐘。藉由降低pH值淬滅交換反應且用胃蛋白酶消化蛋白質。所鑑別肽之氘含量由LC-MS上之質量偏移監測。作為參考對照，類似地處理VISTA蛋白，除了其不與Fab分子複合以外。結合於Fab之區域據推斷為相對不易交換因此相較於參考VISTA蛋白含有較高分率氘的彼等位點。約94%蛋白質可定位於特定肽。

用VSTB50/VSTB60及VSTB95/VSTB112進行的VISTA的溶液HDX-MS擾動定位分別展示於圖28上圖及下圖中。鑑別兩個抗原決定基。抗VISTA VSTB50與VSTB60識別相同抗原決定基；VSTB95結合於VISTA上VSTB112所結合之另一抗原決定基區。抗VISTA VSTB50及60共有相同抗原決定基，其包含區段₁₀₃ NLTLLDSGL111（SEQ ID NO:62）及₁₃₆ VQTGKDAPSNC146（SEQ ID NO:63）（圖28上圖）。抗VISTA VSTB95及112似乎以類似抗原決定基為目標，該等抗原決定基包含區段₂₇ PVDKGHDVTF36（SEQ ID NO:75）及₅₄ RRPIRNLTFQDL65（SEQ ID NO:65）（圖28下圖）。有兩個其他區段展示VSTB95及112產生弱擾動，包括殘基39-52及118-134。然而，降低程度不如不同定位中之前述區域（27-36及54-65）強。儘管展示由VSTB95及112產生強擾動之一種肽100TMR102位於VISTA表面之另一表面上，但其距離抗原決定基區域27-36及54-65很遠。此擾動可能歸因於別位作用。此等HDX-MS結果提供抗VISTA抗體之肽層面抗原決定基。對於此兩種抗原決定基不存在重疊抗原決定基區域。此等結果在其不彼此競爭方面符合前述競爭分組資料。

實施例14：藉由蛋白質結晶學確定人類VISTA ECD:VSTB112 FAB複合物之結構

在致力於確定VISTA結構及描繪定義VISTA細胞外域（ECD）與第一抗體VSTB112之Fab片段之間的相互作用的抗原決定基及互補位中，使複合物結晶且確定結構，解析度為1.85Å。致力於確定與抗體VSTB112之Fab片段複合的人類VISTA中ECD之結構以確定VISTA ECD自身之結構與定義用於此相互作用之抗原決定基/互補位。該結構揭示VISTA採用IgV摺疊，其鏈拓撲學類似於TCR Vα鏈。除橋接β夾層之背面及正面中的B與F股的標準二硫鍵以外，該結構揭示ECD具有兩個額外二硫鍵，一個將CC'環繫栓於前片，第二個在A'與G'股之間。儘管VISTA分子之間存在晶體接觸，但其為少量的且基於此結構並無VISTA ECD之二聚物的證據。VSTB112抗原決定基經展示包含VISTA BC、CC'及FG環之部分以及正面β片最接近彼等環之殘基（C'CFG ）。互補位主要偏向重鏈相互作用，其中CDR L3產生最少接觸。

定義VISTA:VSTB112相互作用之抗原決定基/互補位

VSTB112 Fab在結合VISTA ECD後埋藏1024.3 Å2之表面區域，其中埋藏之重鏈表面佔此總數之715.3 Å2。VISTA與VSTB112輕鏈之間形成七個氫鍵及4個鹽橋相互作用，且VISTA與VSTB112重鏈之間形成10個氫及2個鹽橋相互作用。VSTB112識別前片股C'、C、F及G中FG環近端之之殘基以及BC、FG及CC'環中之殘基（圖29及30）。與CC'環之相互作用佔與僅在FG環中具有殘基E125及R127之Fab輕鏈的接觸的大多數，從而產生額外輕鏈相互作用。對應於VISTA FG環之殘基119至127佔結合VSTB112後埋藏之表面區域的總共1034.8 Å2的38%。值得注意地，此環具有高極性，其包含以下序列-IRHHHSEHR-（SEQ ID NO:76）。另外，VSTB112 CDR H3中之W103很好地針對VISTA殘基H122及H123之主鏈封裝，且VISTA H121為與CDR H2中F55之芳族環之相互作用的邊緣。

藉由結晶學及HDX鑑別之抗原決定基區域的比較展示於圖31中。

實施例15：藉由抗VISTA抗體活化T細胞及單核球

在兩個試管內分析（混合白血球反應（MLR）及SEB（葡萄球菌腸毒素B））中評估抗VISTA抗體之功能作用。兩個分析均量測T細胞增殖及細胞激素誘導作為其主要讀取結果，但此等作用歸因於不同機制。在MLR中，將來自兩個不同人類供體之周血液單核細胞（PBMC）一起培育，一個供體之T細胞與另一供體之樹突狀細胞之間的主要組織相容複合體（MHC）錯配引起T細胞增殖及干擾素（IFNγ）產生。在SEB分析中，將來自單一供體之PBMC與細菌超抗原一起培育，細菌超抗原直接將抗原呈遞細胞（APC）表面上之MHC II級蛋白連接於T細胞上之T細胞受體（TCR），從而引起T細胞活化、增殖及細胞激素分泌。在兩種分析中，作為VSTB174母分子之VSTB112展現對T細胞增殖及細胞激素產生的劑量依賴性誘導且在候選物中最有效（圖21A-21D，表12）。

表12.MLR分析讀取結果之EC50值。VSTB112（VSTB174之母分子）為最有效分子。

單核球活化分析

表12中所示之分析資料用VSTB174之母分子VSTB112產生。為充分瞭解VSTB174之活性，進行單核球活化分析。結果展示將VSTB174與全PBMC一起培育誘導CD14+單核球上活化標記物（CD80及HLA-DR）上調，從而表明結合於已知表現高水準VISTA之免疫細胞亞群之抗體的作用（圖32）。另一問題為對全PBMC中單核球活化之作用是否可由結合VISTA且具有IgG1 Fc之任何抗體促進。抗體VSTB103及VSTB63以高親和力（分別為KD 6.36E-10及8.30E-10）結合於VISTA且與VSTB112及VSTB111類似地結合於表現VISTA蛋白之細胞。VSTB103與VSTB112在同一抗原決定基組，而VSTB63在不同抗原決定基組中；兩種抗體均不促進單核球活化。綜合而言，此等結果展示VSTB174可對T細胞活化/增殖發揮其作用的一種機制為經由NK細胞所促進之單核球活化。

製備培養基

將500 ml RPMI 1640（Corning，10-040-CV）與50 ml人類AB血清（Valley Biomedical公司，批號3C0405）、5 ml青黴素/鏈黴素（Lonza，17-602E）（10,000 U/ml）、5 ml L-麩醯胺酸（100×）（Gibco，25030-081）及10 ml HEPES（1 M）（Fisher BP299-100，批號-1）組合。將培養基在4℃下儲存不超過14天。

製備可溶性VISTA及對照抗體

將抗體用10% AB血清培養基稀釋至2×所要濃度，VSTB174：批號VSTB174.003。

向96孔底盤（Falcon，353077）之適當孔中添加100 μl適當抗體溶液。以100 μl添加各種細胞群體後，各抗體之最終濃度為1、0.1或0.01 g/ml。以1 μg/ml之最終濃度添加IgG1對照抗體CNTO 3930（批號6405，ENDO ＜0.1 EU/mg）。

分離PBMC。

供體為至少18歲，大體上健康且自當地群體隨機選擇。

將供體血液自分離管轉移至50 ml錐形瓶。

在下方置放15 ml Ficoll 1077（SIGMA，10771），小心使其不與血液混合。對每25 ml血液進行此操作。

在室溫下在不進行制動下將細胞以1250 g離心25分鐘。

在Ficoll與血清之界面處分離白血球且用40 ml漢克氏平衡鹽溶液（HBSS）稀釋細胞。

將細胞在4℃下以453 g（1500 rpm）離心10分鐘。

將細胞再懸浮於50 ml HBSS中且藉由將500 μl轉移至各別艾本德管（eppendorf tube）中計數。

另外，根據製造商之說明（目錄號130-096-537）使用來自Miltenyi之泛單核球分離套組，藉由在數個處理組中陰性選擇來分離CD14+細胞。

試管內培養設定

基於欲分析之樣品數確定分析所需之適當細胞數目。將反應群體以96孔U底盤每孔2.0 × 10⁵ 個細胞接種。對於CD14陰性選擇群體，接種0.5×10⁵ 個細胞。所有條件重複進行三次。

如上所述將細胞離心，對於全PBMC群體以2 × 10⁶ 個/毫升之濃度且對於CD14陰性選擇群體以0.5 × 10⁶ 個/毫升之濃度再懸浮於10% AB血清培養基中且向適當孔中添加100 μl以使各孔中之總體積達200 l。

在37℃及5% CO₂ 下培育細胞1、2或3天。

抗體染色及流式細胞術

將96孔U底盤以453 g離心5分鐘且移除上清液。

用200 μl PBS洗滌細胞且如步驟5.5.1中離心。

丟棄上清液且再懸浮於50 μl含有以下抗體之PBS中： ․  CD14-APC（純系HCD14）1:250（Biolegend目錄號325608） ․  HLA-DR-PE Cy7（純系L243）1:250（Biolegend目錄號307616） ․  CD80-PE（純系2D10）1:250（Biolegend目錄號305208） ․  Hu FcR結合抑制劑（eBioscience目錄號14-9161-73）

在黑暗中在濕冰上培育20分鐘。

添加150 μl PBS且如步驟5.5.1中離心。

添加150 l PBS緩衝液且經由FACS進行分析。

在Miltenyi MACSQuant 10參數流式細胞儀上操作樣品且使用FlowJo 9.7.5分析CD14+群體上HLA-DR及CD80之表現。使用螢光強度幾何平均值（MFI）（定義一組數字之中心趨勢的統計參數）作為用於處理比較之指定統計參數。

統計分析

所有統計在Prism GraphPad型號6中進行。在各時間點使用單因子ANOVA在各組間進行逐對比較，且對多樣性進行圖克校正（Tukey correction）。所有測試之p值均低於0.05且認為對比為顯著的。對於所有曲線及表格，* p＜0.05，** p＜0.01，*** p＜0.001，****p＜0.0001。

實施例16：抗VISTA抗體之ADCC及ADCP活性

VSTB174具有IgG1 Fc，其可賦予抗體依賴性細胞介導之細胞毒性（ADCC）及抗體依賴性細胞介導之吞噬作用（ADCP）活性。進行兩種類型分析且展示VSTB174可能裂解或吞噬K562-VISTA細胞（圖33-34），但K562骨髓瘤細胞系母細胞不會（資料未示）。VSTB174調節VISTA之抑制作用的另一作用機制可為表現高水準VISTA之細胞的裂解或吞噬，因此自局部微環境將其移除。

實施例17：抗VISTA抗體之ADCP活性

使用試管內吞噬作用分析來研究由抗人類VISTA mAb（VSTB173及VSTB174）提高巨噬細胞介導之異位表現VISTA之細胞的吞噬作用。將此等mAb選殖於不同Fc主鏈（IgG1 WT（野生型）、IgG1 PR（蛋白酶抗性）及IgG2σ）中且假定可能對提高吞噬作用具有不同活性。IgG1及IgG1 PR主鏈能夠結合於Fc受體且具有引起ADCP之潛力，而IgG2σ不結合於Fc受體且不能調節ADCP。

在ADCP分析中用K562母細胞及K562-VISTA目標細胞測試抗VISTA抗體。如圖35-36中所示，VSTB174、VSTB149、VSTB173及VSTB145提高K562-VISTA細胞之hMac吞噬作用。具有不結合Fc受體之IgG2σFc的VISTA抗體VSTB140或VSTB132正如所料不能提高吞噬作用。具有IgG1 Fc之VISTA mAb VSTB174及VSTB173展示相較於具有IgG1PR Fc之VSTB149及VSTB145吞噬作用更穩固（對於EC₅₀ 值，參見表13及14）。

表13.抗人類VISTA mAb EC₅₀ 值。

表14.抗人類mAb EC₅₀ 值。

VSTB174及VSTB173展示在最高濃度下微弱地提高K562母細胞之吞噬作用（圖35-36），其可歸因於K562細胞之VISTA低表現。其他抗VISTA抗體不能提高K562細胞之吞噬作用。

在K562-VISTA吞噬作用分析中各以兩個不同濃度測試陰性對照抗體，但其不誘導任何吞噬作用。此結果表明抗VISTA抗體介導之吞噬作用為特異性地且歸因於K562-VISTA細胞之VISTA抗原表現。

實施例18：其他抗VISTA抗體之ADCC活性

為測試其誘導ADCC之能力，測試以下三種人類抗VISTA抗體： VSTB174（IgG1） VSTB149（IgG1 PR） VSTB174.LF（IgG1 LF（低海藻糖））。

在兩個各別實驗中，以六個不同濃度在同一盤內測試各抗體，重複三次，獲得總共六個資料點。

10、1、0.1及0.01 μg/mL之VSTB174、VSTB149及VSTB174.LF各展現可量測之ADCC活性，而僅LF抗體在0.001 μg/mL下展現可量測之ADCC活性；在0.0001 μg/mL下抗體均不展現ADCC。當此等抗體各具有IgG1或IgG1變體Fc時，此結果可預期。LF抗體展現增加之ADCC效能，其藉由與常規IgG1抗體曲線（0.02381 μg/mL）相比，LF抗體曲線之EC₅₀ 值較小（0.002293 μg/mL）來證明。IgG1 PR抗體曲線之EC₅₀ 值類似於常規IgG1曲線（0.01846 μg/mL）。

表15.如藉由ADCC分析所測定，三種測試抗VISTA抗體之EC₅₀ 值（μg/mL）。

在10、1、0.1及0.01 μg/mL抗體濃度下，人類IgG1、人類IgG1 PR及人類IgG1 LF抗體均展示可量測之ADCC介導之殺滅作用，而僅LF抗體在0.001 μg/mL抗體濃度下展示殺滅作用。抗VISTA抗體在0.0001 μg/mL抗體濃度下均不展示殺滅作用。

如EC₅₀ 值中可見，相較於常規IgG1抗體或IgG1 PR抗體，LF抗體展示約10倍有效ADCC殺滅作用。

實施例19：VSTB174對人類及獼猴VISTA之親和力

藉由表面電漿子共振（SPR）法在ProteOn儀器上測定VSTB174對人類及食蟹獼猴VISTA細胞外域（ECD）之親和力。VSTB174對各蛋白質呈現極類似KD值，對於人類ECD為1.56E-10 M，且對於獼猴VISTA為8.66E-11 M。

實施例20：在鼠腫瘤模型中VISTA抗體展現功效

小鼠品系、試劑及腫瘤模型

為進行活體內研究，使用回交於C57BL/6背景上之人類VISTA 嵌入（knockin）（VISTA-KI）小鼠。

使用接枝於小鼠Fc IgG2a上之VSTB174可變區（VSTB123）產生抗人類VISTA抗體以使得能夠在VISTA-KI小鼠中測試。

在VISTA KI小鼠中評估MB49膀胱癌。

除展現抗VISTA抗體療法抑制野生型小鼠之腫瘤生長的已公開研究（Le Mercier等人, 2014）以外，已用替代性倉鼠抗體使用不同給藥時程在野生型小鼠中及在用VSTB123處理之VISTA-KI小鼠中展現抗腫瘤功效。

在VISTA-KI小鼠中MB49腫瘤模型中之活體內功效研究

在雌性VISTA-KI小鼠中進行MB49功效研究，以在1-10 mg/kg範圍內之數個劑量測試VSTB123。在第0天向小鼠皮內注射250,000個MB49腫瘤細胞。在第6天，如圖37中所示開始給藥（10 mg/kg同型對照mIgG2a或指定劑量VSTB123；10隻小鼠/組）。

如圖37中所示，在較高與較低劑量下，VSTB123更有效。10 mg/kg及7.5 mg/kg之劑量等效，而在給予5或1 mg/kg之小鼠中腫瘤生長更快速。

實施例21：用抗VISTA抗體偵測人類腫瘤中之VISTA表現 圖1展示AML腫瘤細胞之VISTA表現-其及圖17中之RNA序列表現資料支持如下想法：VISTA由AML細胞表現，且抗VISTA藥物經由以此等用於免疫調節或抗體介導之殺滅的細胞為目標而有效。

自來自外科切除術之肺腫瘤樣品獲得評估肺癌中之VISTA表現的資料。針對VISTA及多種其他標記物之表現將細胞解離及特性化。結果展示13/13肺腫瘤（鱗狀癌或腺癌）含有CD14+VISTA+骨髓細胞（圖38）。

實施例22：使用抗VISTA抗體偵測肺腫瘤中之VISTA表現

使用純系GG8（一種抗人類VISTA小鼠IgG1）進行免疫組織化學分析。使用此mAb研究非小細胞肺癌（NSCLC）FFPE腫瘤切片中VISTA之染色。

在染色前用標準抗原修復法處理FFPE腫瘤切片。以1:500稀釋度使用GG8小鼠抗人類VISTA抗體。依序使用兔抗小鼠多株抗體及抗兔聚合物HRP偵測GG8結合。繼而用蘇木精對比染色，隨後對腫瘤切片評分。

肺癌中之VISTA表現主要受限於免疫浸潤（圖39中所示之實例）且高水準之VISTA陽性細胞存在於多個肺癌樣品中。

實施例23：與VSTB174之FAB片段複合的人類VISTA之細胞外域（ECD）的結構

產生VISTA抗原變體且經純化以用於結晶學。內部表現經his標記之重組VSTB174 Fab且純化。產生晶體且用於使用同步輻射收集VISTA ECD:VSTB174 Fab複合物之較高解析度資料，且使用同源建模及電子密度分析的組合解決結構確定（圖29（上圖））。

藉由X射線結晶學測定VISTA ECD:VSTB174 Fab複合物之結構，解析度為1.85Å，得到VISTA ECD之第一結構且描繪VSTB174抗原決定基及互補位。VISTA ECD採用IgV摺疊，其拓撲學類似於CTLA-4 ECD，但具有在β夾層之前片延伸的獨特G'股。A'及G'另外經由A'股中之殘基C12與G'股中之C146之間形成的二硫橋鍵以化學方式繫栓。發現六個半胱胺酸參與三個分子內二硫鍵，且基於晶體接觸，不存在二聚VISTA之證據。

VSTB174識別前片股C'、C、F及G中在FG環近端之殘基以及BC、FG及CC'環中之殘基。

本文中所引用之所有專利、公開申請案及參考文獻之教示以全文引用的方式併入本文中。

儘管本發明已參照其例示性具體實例特定展示及描述，但熟習此項技術者應瞭解，在不背離由隨附申請專利範圍涵蓋的本發明之範疇之情況下，可在其中做出形式及細節之各種改變。

無

專利或申請案文件含有至少一個彩製圖式。在申請且支付必要費用後，專利局將提供具有彩色圖式之本專利或專利申請公開案之複本。

圖1A-1C：展示TF1 AML細胞上VISTA表現之曲線。在TF-1 AML細胞系中展示藉由流式細胞術獲得的VISTA蛋白之表現。

圖2A-2E：鑑別人類骨髓及淋巴亞群之染色及設門策略的曲線。

圖3A-3G：展示來自健康正常供體之人類骨髓及淋巴亞群上VISTA之表現的曲線。

圖4：展示多個健康正常供體之人類骨髓及淋巴亞群上VISTA之表現的曲線。

圖5A-5B：展示鑑別人類單核球及巨噬細胞上VISTA之表現的染色及設門策略的曲線。

圖6A-6C：展示人類單核球及巨噬細胞上VISTA之表現的曲線。

圖7A-7E：展示鑑別人類T及NK細胞亞群上VISTA之表現的染色及設門策略的曲線。

圖8A-8G：展示來自健康正常供體之人類T及NK細胞亞群上VISTA之表現的曲線。

圖9：展示多個健康正常供體之人類T及NK細胞亞群上VISTA之表現的曲線。

圖10A-10D：展示鑑別人類樹突狀細胞亞群上VISTA之表現的染色及設門策略的曲線。

圖11A-11C：展示來自健康正常供體之人類樹突狀細胞亞群及嗜鹼性球上VISTA之表現的曲線。

圖12：展示多個健康正常供體之人類樹突狀細胞亞群及嗜鹼性球上VISTA之表現的曲線。

圖13A-13D：健康人類周圍血液細胞上VISTA表現之分析。使用多色流式細胞術分析法獲得的健康人類周圍血液細胞上VISTA表現之特徵：分析來自2個不同個體之全血樣品的單核球（SSC^lo, CD11b^hi CD14^hi CD16^-ve CD33^+ve HLA- DR^+ve CD19^-ve ）（圖13A）、嗜中性球（SSC^hi CD177⁺ CD11b^hi CD14^lo CD16^+ve CD33^+ve HLA-DR^-ve CD19^-ve ）（圖13B）上之VISTA表現。使用Ficoll梯度分離周圍血液單核細胞以分析CD4+ T細胞（CD3^+ve CD4^+ve ）（圖13C）及CD8+ T細胞（CD3^+ve CD8^+ve ）（圖13D）。

圖14A-14C：來自肺癌患者及健康對照供體之周圍血液細胞上VISTA表現之分析。使用多色流式細胞術分析法獲得肺癌患者周圍血液細胞上VISTA表現之特徵：展示來自一個個體之代表性FACS圖（圖14A）。藉由Ficoll分離周圍血液單核球且分析單核球（CD14+ CD11b+ CD33+ HLADR+ CD15-）（圖14B）及源自骨髓之抑制因子細胞（CD14-CD11b+ CD33-HLADR-CD15+ CD16+）（圖14C）上之VISTA表現。

圖15A-15C：使用多色流式細胞術分析法獲得的來自患有結腸癌之患者的周圍血液細胞中VISTA表現之特徵：展示來自一個個體之代表性FACS圖（圖15A）。藉由Ficoll分離周圍血液單核球且分析單核球（CD14+ CD11b+ CD33+ HLADR+ CD15-）（圖15B）及源自骨髓之抑制因子細胞（CD14-CD11b+ CD33-HLADR-CD15+ CD16+）（圖15C）上之VISTA表現。

圖16A-16D：使用多色流式細胞術分析法獲得的食蟹獼猴周圍血液細胞上VISTA表現之特徵：分析來自4隻不同猴之全血的單核球（SSC^lo CD11b^hi CD14^hi HLA-DR^hi CD16^-ve CD19^-ve ）（圖16A）及嗜中性球CD11b^hi CD14^lo HLA-DR^-ve CD16^-ve CD19^-ve （圖16B）上之VISTA表現。使用Ficoll梯度分離來自三隻猴之周圍血液單核細胞以分析CD4+ T細胞（TCRα/β^+ve CD4^+ve ）（圖16C）及CD8+ T細胞（TCRα/β^+ve CD8^+ve ）（圖16D）。

圖17：展示血紅素細胞系中VISTA RNA之絕對表現值。

圖18：用GFP或人類VISTA穩定轉染小鼠A20細胞。將其與ova肽及DO11.10 T細胞一起培育。培育開始後24小時量測T細胞之CD25表現。A20-huVISTA細胞抑制T細胞之CD25表現，但此讀出結果藉由與VSTB95一起培育而明顯恢復。

圖19A-19F：展示人類VISTA ELISA結果之曲線。

圖20A-20F：展示結合於表現人類VISTA之細胞的抗VISTA抗體的人類VISTA FACS結果。

圖21A-21D：混合淋巴細胞反應中30 μg/ml至0.0 μg/ml的6種候選抗VISTA抗體之稀釋研究。

圖22A-22B：SEB分析（個別CPM計數及IFN-g濃度）中30 μg/ml至0.0 μg/ml的6種候選抗VISTA抗體之稀釋研究。

圖23：使用塗佈於Proteon SPR晶片上之抗VISTA抗體VSTB85及VISTA蛋白獲得的感測器圖，其中指定競爭者（表16中所列之競爭者）在晶片上經過。

圖24：MB49鼠膀胱腫瘤模型之實驗設計。

圖25A-25B：雌性C57BL/6小鼠中之MB49腫瘤生長。曲線說明用抗小鼠VISTA抗體（圖25B）或對照IgG（圖25A）處理之個別小鼠的腫瘤生長。

圖26：人類VISTA之胺基酸序列（SEQ ID NO:46）。

圖27：VISTA直系同源物之多個序列對準。

圖28：如由HDX所測定，與VSTB50及VSTB60抗體（上）或VSTB95及VSTB112抗體（下）結合之人類VISTA區域。

圖29：與VSTB112結合之VISTA抗原決定基。（上）以草圖展示VISTA，並對股進行標記。將複合物中在VSTB112之5Å內的具有至少一個原子的殘基染成藍色。藍色及橙色球突出顯示鏈斷裂，且青色及綠色球分別標記VISTA結構之N端及C端。（下）結構測定中所用VISTA構築體之序列。如由PISA計算，序列下之圓圈用於指示僅使主鏈與VSTB112接觸之殘基，三角形指示側鏈接觸，且方形指示產生氫鍵或鹽橋相互作用之側鏈接觸。將形狀染色以指示具有最大數目之原子與既定殘基接觸的CDR，其中CDR顏色如圖59中所定義。次級結構要素如程式MOE所定義，其中黃色箭頭代表β股且紅色矩形指示α螺旋。

圖30：VSTB112互補位。（上）以說明方式展示VISTA抗原，且在VISTA之5埃（Å）內的VSTB112在表面中用顏色展示，用於標明以下序列中指定之CDR一致性。與CDR相鄰之接觸架構殘基類似於VSTB112 Fv區之相應CDR（下）序列染色。彩色背景指定根據Kabat定義之CDR。如由PISA計算，序列下之圓圈用於指示僅使主鏈與VISTA接觸之殘基，三角形指示側鏈接觸，且方形指示產生氫鍵或鹽橋相互作用之側鏈接觸。

圖31：藉由結晶學及氫氘交換（HDX）鑑別之抗原決定基區域的比較。結構測定中所用VISTA構築體之序列。如由PISA計算，序列下之圓圈用於指示僅使主鏈與VSTB112接觸之殘基，三角形指示側鏈接觸，且方形指示產生氫鍵或鹽橋相互作用之側鏈接觸。

圖32：由VSTB174（衍生自VSTB112）活化整個PBMC中之CD14+單核球。在該實驗之各部分中，將細胞與PBS、IgG1對照抗體或VSTB174一起以1、0.1或0.01 μg/ml培育。左圖展示CD80 MFI；右圖展示HLA-DR MFI（經測試而展示代表性結果之兩種供體）。

圖33：展示VSTB174針對K562-VISTA細胞之ADCC活性的曲線。

圖34：展示VSTB174針對K562-VISTA細胞之ADCP活性的曲線。所描繪之兩種抗體具有相同Fab，但VSTB174具有IgG1 Fc且VSTB140具有Fc沉默之IgG2。

圖35：展示由VSTB174、VSTB149或VSTB140 mAb針對K562-VISTA介導之吞噬作用的曲線。以在0.0008 μg/ml至0.56 μg/ml範圍內之7種半對數劑量測試各mAb。

圖36：展示由VSTB174、VSTB149或VSTB140 mAb針對骨髓瘤細胞系K562細胞介導之吞噬作用的曲線。以在0.0008 μg/ml至0.56 μg/ml範圍內之7種半對數劑量測試各mAb。

圖37：在雌性VISTA-KI小鼠中評估VSTB123 1、5、7.5及10 mg/kg之MB49腫瘤功效研究。當在植入後第6天開始給藥時腫瘤體積為約50 mm³ 。VSTB123為接枝於小鼠Fc骨架上之VSTB112 Fab且結合於VISTA-KI小鼠中之人類VISTA。

圖38：曲線展示在13/13肺癌樣品以及患者之遠端肺組織及周圍血液中發現表現高/中等水準VISTA之CD14+細胞。

圖39：使用GG8對肺癌之VISTA進行IHC染色。

Claims (66)

1. 一種經分離的抗體或其抗體片段，其包含與人類T細胞活化之V域Ig抑制因子(VISTA)結合的抗原結合區域，其中所述抗體或抗體片段包含：(a)重鏈可變(VH)域，其包含具有SEQ ID NO：1之胺基酸序列的VH CDR1；具有SEQ ID NO：2之胺基酸序列的VH CDR2及具有SEQ ID NO：3之胺基酸序列的VH CDR3；且進一步包含輕鏈可變(VL)域，其包含具有SEQ ID NO：4之胺基酸序列的VL CDR1；具有SEQ ID NO：5之胺基酸序列的VL CDR2；及具有SEQ ID NO：6之胺基酸序列的VL CDR3；或(b)VH域，其包含具有SEQ ID NO：13之胺基酸序列的VH CDR1；具有SEQ ID NO：14之胺基酸序列的VH CDR2；及具有SEQ ID NO：15之胺基酸序列的VH CDR3；且進一步包含VL域，其包含具有SEQ ID NO：16之胺基酸序列的VL CDR1；具有SEQ ID NO：17之胺基酸序列的VL CDR2；及具有SEQ ID NO：18之胺基酸序列的VL CDR3。
2. 如請求項1之抗體或抗體片段，其中所述抗體或抗體片段包含：(a)請求項1的(a)中之CDR序列，及(i)VH域，其包含SEQ ID NO：38的胺基酸序列；及/或(ii)VL域，其包含SEQ ID NO：41的胺基酸序列；或(b)請求項1的(b)中之CDR序列，及(i)VH域，其包含於具有SEQ ID NO：51的胺基酸序列之重鏈多肽中；及/或(ii)VL域，其包含於具有SEQ ID NO：52的胺基酸序列之輕鏈多肽中。
3. 如請求項1之抗體或抗體片段，其中所述抗體片段為Fab、F(ab')₂或scFv抗體片段。
4. 如請求項2之抗體或抗體片段，其中所述抗體片段為Fab、F(ab')₂或scFv抗體片段。
5. 如請求項1之抗體或抗體片段，其包含人類或非人類抗體恆定區。
6. 如請求項2之抗體或抗體片段，其包含人類或非人類抗體恆定區。
7. 如請求項5之抗體或抗體片段，其包含人類IgG1抗體恆定區。
8. 如請求項6之抗體或抗體片段，其包含人類IgG1抗體恆定區。
9. 如請求項1之抗體或抗體片段，其中被所述經分離之抗體或抗體片段結合的VISTA是人類VISTA或食蟹獼猴(cyno)VISTA。
10. 如請求項2之抗體或抗體片段，其中被所述經分離之抗體或抗體片段結合的VISTA是人類VISTA或食蟹獼猴VISTA。
11. 如請求項9之抗體或抗體片段，其中所述人類VISTA或食蟹獼猴VISTA表現在造血細胞上、腫瘤細胞上或在腫瘤微環境(TME)中。
12. 如請求項10之抗體或抗體片段，其中所述人類VISTA或食蟹獼猴VISTA表現在造血細胞上、腫瘤細胞上或在腫瘤微環境(TME)中。
13. 如請求項11之抗體或抗體片段，其中所述造血細胞是骨髓系細胞及/或淋巴球、單核球、嗜中性球、T細胞、自然殺手(NK)細胞或自然殺手T(NKT)細胞。
14. 如請求項12之抗體或抗體片段，其中所述造血細胞是骨髓系細胞及/或淋巴球、單核球、嗜中性球、T細胞、自然殺手(NK)細胞或自然殺手T(NKT)細胞。
15. 如請求項1之抗體或抗體片段，其進一步包含至少一個重鏈及至少一個輕鏈。
16. 如請求項2之抗體或抗體片段，其進一步包含至少一個重鏈及至少一個輕鏈。
17. 如請求項2之抗體或抗體片段，其中所述抗體包含：(a)請求項1的(a)中之CDR序列，及(i)重鏈，其包含SEQ ID NO：47的胺基酸序列；及/或(ii)輕鏈，其包含SEQ ID NO：48的胺基酸序列；或(b)請求項1的(b)中之CDR序列，及(i)重鏈多肽，其包含SEQ ID NO：51的胺基酸序列；及/或(ii)輕鏈，其包含SEQ ID NO：52的胺基酸序列。
18. 如請求項1之抗體或抗體片段，其中所述抗體是單株抗體；是人類化抗體；包含一或多個人類或人類化的架構區；或包含人類恆定區。
19. 如請求項2之抗體或抗體片段，其中所述抗體是單株抗體；是人類化抗體；包含一或多個人類或人類化的架構區；或包含人類恆定區。
20. 如請求項1之抗體或抗體片段，其中所述抗體以至少1×10^-9M、至少1×10^-8M或至少1×10^-7M之親和力結合至VISTA。
21. 如請求項1之抗體或抗體片段，其抑制或阻斷由VISTA所引起的免疫抑制反應及/或引發抗腫瘤反應。
22. 如請求項2之抗體或抗體片段，其抑制或阻斷由VISTA所引起的免疫抑制反應及/或引發抗腫瘤反應。
23. 如請求項21之抗體或抗體片段，其中：所述由VISTA所引起的免疫抑制反應之抑制或阻斷造成以下者之一或多者：CD45⁺白血球增加、CD4⁺ T細胞增加、CD8⁺ T細胞增加或表現VISTA的免疫細胞減少；或 所述由VISTA所引起的免疫抑制反應之抑制或阻斷造成增強的細胞激素製造、增強的T-細胞反應及/或調節Foxp3表現。
24. 如請求項22之抗體或抗體片段，其中：所述由VISTA所引起的免疫抑制反應之抑制或阻斷造成以下者之一或多者：CD45⁺白血球增加、CD4⁺ T細胞增加、CD8⁺ T細胞增加或表現VISTA的免疫細胞減少；或所述由VISTA所引起的免疫抑制反應之抑制或阻斷造成增強的細胞激素製造、增強的T-細胞反應及/或調節Foxp3表現。
25. 如請求項1之抗體或抗體片段，其包含全抗體。
26. 如請求項2之抗體或抗體片段，其包含全抗體。
27. 如請求項1之抗體或抗體片段，其中所述抗體或抗體片段表現在缺乏海藻糖基化(fucosylation)酶之細胞中。
28. 如請求項1之抗體或抗體片段，其中所述抗體或抗體片段表現於CHO細胞中。
29. 如請求項2之抗體或抗體片段，其中所述抗體或抗體片段表現於CHO細胞中。
30. 一種組成物，其包含如請求項1-29中任一項之抗體或抗體片段以及醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
31. 一種組成物，其包含：(a)VISTA拮抗劑，其包含如請求項1-29中任一項之抗體或其抗體片段；及(b)疫苗。
32. 一種醫藥組成物，其包含：(a)VISTA拮抗劑，其包含如請求項1-29中任一項之抗體或其抗體片段；及(b)疫苗； 其中所述抗體或抗體片段與VISTA之結合調節或增強被VISTA抑制的免疫反應。
33. 如請求項31之組成物，其中所述疫苗是病毒載體疫苗、細菌疫苗、DNA疫苗、RNA疫苗、肽疫苗或蛋白質疫苗。
34. 如請求項32之醫藥組成物，其中所述疫苗是病毒載體疫苗、細菌疫苗、DNA疫苗、RNA疫苗、肽疫苗或蛋白質疫苗。
35. 一種如請求項1-29中任一項之抗體或抗體片段的用途，其係用於製造用於治療或預防有需要的個體中之癌症的醫藥品。
36. 一種如請求項30之組成物的用途，其係用於製造用於治療或預防有需要的個體中之癌症的醫藥品。
37. 一種如請求項31之組成物的用途，其係用於製造用於治療或預防有需要的個體中之癌症的醫藥品。
38. 一種如請求項32之醫藥組成物的用途，其係用於製造用於治療或預防有需要的個體中之癌症的醫藥品。
39. 一種如請求項33之組成物的用途，其係用於製造用於治療或預防有需要的個體中之癌症的醫藥品。
40. 一種如請求項34之醫藥組成物的用途，其係用於製造用於治療或預防有需要的個體中之癌症的醫藥品。
41. 如請求項35之用途，其中所述個體是人類或非人類哺乳動物。
42. 如請求項36之用途，其中所述個體是人類或非人類哺乳動物。
43. 如請求項37之用途，其中所述個體是人類或非人類哺乳動物。
44. 如請求項38之用途，其中所述個體是人類或非人類哺乳動物。
45. 如請求項39之用途，其中所述個體是人類或非人類哺乳動物。
46. 如請求項40之用途，其中所述個體是人類或非人類哺乳動物。
47. 如請求項35之用途，其中所述癌症是白血病、淋巴瘤、骨髓發育不良症候群、骨髓瘤、實體腫瘤；膀胱癌、乳癌、肺癌或任何前述者之組合。
48. 如請求項36之用途，其中所述癌症是白血病、淋巴瘤、骨髓發育不良症候群、骨髓瘤、實體腫瘤；膀胱癌、乳癌、肺癌或任何前述者之組合。
49. 如請求項47之用途，其中所述白血病是淋巴細胞性白血病、骨髓性白血病、急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、急性骨髓(骨髓性)白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、毛細胞白血病、前淋巴細胞性T細胞白血病、大顆粒淋巴細胞性白血病或成人T細胞白血病；或所述肺癌是非小細胞肺癌(NSCLC)。
50. 如請求項48之用途，其中所述白血病是淋巴細胞性白血病、骨髓性白血病、急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、急性骨髓(骨髓性)白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、毛細胞白血病、前淋巴細胞性T細胞白血病、大顆粒淋巴細胞性白血病或成人T細胞白血病；或所述肺癌是非小細胞肺癌(NSCLC)。
51. 如請求項47之用途，其中所述實體腫瘤被包含骨髓細胞、T細胞或骨髓細胞與T細胞之組合的腫瘤基質包圍；及/或其中所述實體腫瘤被骨髓細胞、T細胞或骨髓細胞與T細胞之組合浸潤。
52. 如請求項48之用途，其中所述實體腫瘤被包含骨髓細胞、T細胞或骨髓細胞與T細胞之組合的腫瘤基質包圍；及/或其中所述實體腫瘤被骨髓細胞、T細胞或骨髓細胞與T細胞之組合浸潤。
53. 一種如請求項1-29中任一項之抗體或抗體片段之用途，其係用於製造用於在有需要的個體中抑制腫瘤生長的醫藥品。
54. 如請求項53之用途，其中：(i)所述醫藥品是非經腸投予或經腸(non-parenterally)投予，(ii)所述醫藥品是靜脈內、皮下或經口投予；(iii)所投予之組成物、抗體或抗體片段之劑量為每次投予0.1-15mg/kg；(iv)醫藥品是每週投予一次、每兩週投予一次、每三週投予一次、每月投予一次、每2個月投予一次或每3個月投予一次；或前述者之任何組合。
55. 一種經分離的核酸，其包含編碼如請求項1-29中任一項之抗體或抗體片段的核苷酸序列。
56. 一種表現載體，其包含可操作地連接至啟動子之如請求項55之核酸。
57. 一種宿主細胞，其係以如請求項56之表現載體轉形。
58. 一種生產如請求項1-29中任一項之抗體或抗體片段的方法，所述方法包含在用於生產所述抗體或抗體片段的條件下培養如請求項57之宿主細胞。
59. 如請求項58之方法，其進一步包含分離所述抗體或抗體片段。
60. 一種製品，其包含如請求項30之組成物及容器，且還包含表明該組成物可用於治療癌症之藥品仿單(package insert)或標籤。
61. 一種製品，其包含如請求項31之組成物及容器，且還包含表明該組成物可用於治療癌症之藥品仿單或標籤。
62. 如請求項35之用途，其包括第二癌症治療。
63. 如請求項62之用途，其中所述第二癌症治療是手術、化學療法、放射療法、生物療法、標靶療法、或免疫調節療法或其組合。
64. 一種抗體或其抗體片段之用途，其係用於製造在有需要的個體中增強免疫反應的醫藥品，其中所述抗體結合T細胞活化之V域Ig抑制因子(VISTA)，且所述抗體片段包含結合至VISTA的抗原結合區，其中所述抗體或其抗體片段結合至VISTA，從而增強對癌症的免疫反應；且其中所述抗體或抗體片段包含：(a)重鏈可變(VH)域，其包含具有SEQ ID NO：1之胺基酸序列的VH CDR1；具有SEQ ID NO：2之胺基酸序列的VH CDR2及具有SEQ ID NO：3之胺基酸序列的VH CDR3；且進一步包含輕鏈可變(VL)域，其包含具有SEQ ID NO：4之胺基酸序列的VL CDR1；具有SEQ ID NO：5之胺基酸序列的VL CDR2；及具有SEQ ID NO：6之胺基酸序列的VL CDR3；或(b)VH域，其包含具有SEQ ID NO：13之胺基酸序列的VH CDR1；具有SEQ ID NO：14之胺基酸序列的VH CDR2；及具有SEQ ID NO：15之胺基酸序列的VH CDR3；且進一步包含VL域，其包含具有SEQ ID NO：16之胺基酸序列的VL CDR1；具有SEQ ID NO：17之胺基酸序列的VL CDR2；及具有SEQ ID NO：18之胺基酸序列的VL CDR3。
65. 如請求項64之用途，其中所述免疫反應為抗腫瘤免疫反應。
66. 一種抗體或其抗體片段之用途，其係用於製造在有需要的個體中引發生物反應的醫藥品，其中所述抗體結合T細胞活化之V域Ig抑制因子(VISTA)，且所述抗體片段包含結合至VISTA的抗原結合區，其中所述抗體或其抗體片段結合至VISTA，從而引發生物反應；且其中所述抗體或抗體片段包含：(a)重鏈可變(VH)域，其包含具有SEQ ID NO：1之胺基酸序列的VH CDR1；具有SEQ ID NO：2之胺基酸序列的VH CDR2及具有SEQ ID NO：3之胺基酸序列的VH CDR3；且進一步包含輕鏈可變(VL)域，其包含具有SEQ ID NO：4之胺基酸序列的VL CDR1；具有SEQ ID NO：5之胺基酸序列的VL CDR2；及具有SEQ ID NO：6之胺基酸序列的VL CDR3；或(b)VH域，其包含具有SEQ ID NO：13之胺基酸序列的VH CDR1；具有SEQ ID NO：14之胺基酸序列的VH CDR2；及具有SEQ ID NO：15之胺基酸序列的VH CDR3；且進一步包含VL域，其包含具有SEQ ID NO：16之胺基酸序列的VL CDR1；具有SEQ ID NO：17之胺基酸序列的VL CDR2；及具有SEQ ID NO：18之胺基酸序列的VL CDR3；且其中所述生物反應是選自由以下者所組成之群組：a.活化單核球；b.誘導T-細胞增殖及細胞激素分泌；c.增加單核球存活；d.在表現VISTA的細胞中誘導抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；及e.在表現VISTA的細胞中誘導抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)。

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