DE69534530T2 - Für b-zell-lymphom und leukämiezellen spezifische immunkonjugate und humane antikörper - Google Patents

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung betrifft allgemein Immunkonjugate zur diagnostischen und therapeutischen Verwendung bei Krebs. Insbesondere betrifft die Erfindung rekombinant hergestellte chimäre und humanisierte monoklonale Antikörper, die gegen B-Zell-Lymphome und Leukämiezellen gerichtet sind, wobei die Antikörper kovalent an ein diagnostisches oder therapeutisches Reagens konjugiert werden können, ohne die Antikörperbinde- und Internalisierungsfunktion zu verlieren, und mit verminderter Produktion von humanen Anti-Maus-Antikörpern.
  • Non-Hodgkins-Lymphom (NHL) und chronische lymphocytische Leukämie sind B-Zell-Malignitäten, die nach wie vor einen wich tigen Beitrag zur Krebsmortalität liefern. Die Antwort dieser Malignitäten auf verschiedene Behandlungsformen ist konfus. Sie sprechen einigermaßen gut in der Chemotherapie an, und in Fällen, in denen eine adäquate klinische Einstufung von NHL möglich ist, sowie bei Patienten mit lokalisierter Krankheit, kann eine zufrieden stellende Behandlung unter Verwendung von Strahlenfeldtherapie (Hall et al., Radiology for the Radiologist, Lippincott, Philadelphia, 1989, Seiten 365–376) erfolgen. Allerdings schränken die toxischen Nebenwirkungen, die mit der Chemotherapie verbunden sind, und die Toxizität für das hämatopoetische System von einer lokalen als auch einer Ganzkörperradiotherapie die Verwendung dieser therapeutischen Methoden ein. Etwa die Hälfte der Patienten stirbt an der Krankheit (Posner et al., Blood, 61: 705 (1983)).
  • Die Verwendung von zielgerichteten monoklonalen Antikörpern, die mit Radionukliden oder anderen cytotoxischen Agenzien konjugiert sind, eröffnet die Möglichkeit, solche Agenzien direkt der Tumorstelle zuzuführen, wobei die Exposition von normalen Geweben an toxische Agenzien begrenzt wird (Goldenberg, Semin. Nucl. Med., 19: 332 (1989)). In den letzten Jahren wurde das Potenzial der Antikörper-basierten Therapie und deren Genauigkeit in der Lokalisierung von Tumor-assoziierten Antigenen sowohl im Labor als auch in klinischen Studien demonstriert (vgl. z.B. Thorpe, TIBTECH, 11: 42 (1993); Goldenberg, Scientific American, Science & Medicine, 1: 64 (1994); Baldwin et al., U.S. 4,925,922 und 4,916,213; Young, U.S. 4918163 ; U.S. 5,204,095 ; Irie et al., U.S. 5,196,337 ; Hellstrom et al., U.S. 5,134,075 und 5,171,665). Im Allgemeinen war die Verwendung von radiomarkierten Antikörpern und Antikörperfragmenten gegen Tumor-assoziierte Marker zur Lokalisierung von Tumoren erfolg reicher als für die Therapie, teilweise deshalb, da die Antikörperaufnahme durch den Tumor im Allgemeinen niedrig ist und sich bei lediglich 0,01% bis 0,001% der gesamten injizierten Dosis bewegt (Vaughan et al., Brit. J. Radiol., 60: 567 (1987)). Eine Erhöhung der Konzentration des Radiolabels, um die Dosis für den Tumor zu erhöhen, ist kontraproduktiv, da dadurch im Allgemeinen auch die Exposition des gesunden Gewebes an Radioaktivität erhöht wird.
  • LL-2 (EPB2) ist ein muriner monoklonaler Antikörper (mAb) gegen B-Zell-Lymphome und lymphocytische Leukämiezellen, der rasch von derartigen Zellen internalisiert wird, und der einige der zuvor erwähnten Schwierigkeiten überwinden kann (Shih et al., Int. J. Cancer, 56: 538 (1994)). LL2, der von dem IgG2a-Antikörpertyp ist, wurde unter Verwendung der Raji-B-Lymphomzelllinie als Antigenquelle entwickelt (Pawlak-Byczkowska et al., Cancer res., 49: 4568 (1989)). Für den murinen LL2 (mLL2) ist bekannt, dass dieser mit einem Epitop von CD22 reagiert (Belisle et al., Proc Amer. Assn. Clin. Res., 34: A2873 (1993)). CD22-Moleküle werden im Zytoplasma von Vorläufer- und frühen Pre-B-Zellen exprimiert und erscheinen auf der Zelloberfläche von reifen B-Zellen.
  • Über Immunfärbung von Gewebeschnitten konnte gezeigt werden, dass mLL2 mit 50 von 51 getesteten B-Zell-Lymphomen reagiert. mLL2 ist ein hochsensitives Mittel, um B-Zell-Lymphome in vivo zu detektieren, wie dies durch eine Radioimmundetektionsmethode festgestellt wurde (Murphy et al., Eur. J. Nucl. Med., 19: 394 (1992)). Das mit 99mTc-markierte Fab'-Fragment von mLL2 lokalisierte 63 von 65 bekannten Läsionen in Patienten aus Phase-II-Versuchen (Mills et al., Proc. Amer. Assn. Cancer Res., 14: A2857 (1993)). Außerdem war 131I-markierter LL2 therapeutisch wirksam in Patienten mit B-Zell-Lymphomen (Goldenberg et al., J. Clin. Oncol., 9: 548 (1991)). Ein mit dem Exotoxin PE38KDEL konjugierter mLL2-Fab' induzierte eine vollständige Remission von messbaren humanen Lymphom-Heterotransplantaten (CA-46), die in Nacktmäusen gewachsen sind (Kreitman et al., Cancer Res., 53: 819 (1993)).
  • Die klinische Verwendung von mLL2 ist wie auch mit den meisten anderen viel versprechenden murinen Antikörpern durch die Entwicklung einer HAMA-Antwort im Menschen limitiert. Obwohl nicht immer eine HAMA-Antwort als Folge einer Injektion von mLL2 beobachtet werden kann, entwickeln die Patienten in einer signifikanten Anzahl von Fällen eine HAMA als Folge einer einzigen Behandlung mit mLL2. Dies kann die diagnostische und therapeutische Nützlichkeit eines solchen Antikörperkonjugates nicht nur wegen des potenziellen anaphylaktischen Problems limitieren, sondern auch, da ein Großteil des zirkulierenden Konjugates durch die zirkulierenden Anti-Maus-Antikörper komplexiert und sequestriert werden kann. Es wird durch eine Studie veranschaulicht, in der etwa 30% der Patienten eine HAMA-Antwort auf niedrigem Niveau in Folge einer einzigen Injektion von etwa 6 mg von mLL2-131I-IgG und nahezu alle eine starke HAMA-Antwort bei zusätzlichen Injektionen entwickelten. Auf der anderen Seite wurde mit mLL2-Fab', der mit 99mTc markiert wurde, keine HAMA-Antwort beobachtet. Solche HAMA-Antworten stellen im Allgemeinen ein potenzielles Hindernis dar, um das volle diagnostische und therapeutische Potenzial des mLL2-Antikörpers zu realisieren.
  • Obwohl, wie oben dargestellt, die Verwendung von Fragmenten von mLL2, wie bspw. F(ab')2 und Fab', teilweise die Probleme der Immunogenität vermindert/verhindert, gibt es Umstände, in denen das gesamte IgG wünschenswerter wäre, bspw. wenn die Induktion der zellulären Immunität für die Therapie beabsichtigt ist, oder wenn ein Antikörper mit erhöhter Überlebenszeit erforderlich wäre.
  • Um den Wert des mLL2-IgG-Antikörpers hinsichlich seiner therapeutischen oder diagnostischen Modalität zu maximieren und dessen Nützlichkeit in multiplen und kontinuierlichen Verabreichungsmodalitäten zu erhöhen, ist es eine Aufgabe der Erfindung, einen Maus/humanen chimären mAb (cLL2) und einen humanisierten mAb (hLL2) zu produzieren, der verwandt ist mit mLL2 und die Antigenbindespezifität von mLL2 beibehält, in einem Subjekt jedoch eine reduzierte HAMA auslöst, das denselben erhält.
  • Eine andere Aufgabe der Erfindung ist es, DNA-Sequenzen bereitzustellen, die für die Aminosäuresequenzen der variablen Regionen der leichten und schweren Ketten der cLL2- und hLL2-mAbs einschließlich für die komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDRs) codieren.
  • Es ist ferner eine Aufgabe dieser Erfindung, Konjugate der hLL2- und cLL2-mAbs bereitzustellen, die therapeutische oder diagnostische Modalitäten aufweisen.
  • Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist es, Methoden zur Therapie und Diagnose bereitzustellen, bei denen die humanisierten und chimären mAbs der Erfindung eingesetzt werden.
  • Diese Aufgaben werden durch die Erfindung gelöst, die unten in der Beschreibung und den beigefügten Ansprüchen beschrieben ist.
  • ZUSAMMENFASSENDE DARSTELLUNG DER ERFINDUNG
  • Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird ein cLL2-mAb bereitgestellt, der mit mLL2-mAb verwandt ist, bei dem die variablen Regionen der murinen leichten (VK) und schweren (VH) Kette mit den humanen konstanten leichten (kappa) und schweren (IgG1)-Ketten verbunden sind. Dieser chimäre mAb behält die B-Lymphomund Leukämiezell-Targeting- und -Internalisierung-Eigenschaften des parentalen mLL2 bei.
  • Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung wird ein hLL2-mAb bereitgestellt, der mit mLL2-mAb verwandt ist, bei dem die komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDRs) der leichten und schweren Ketten des mLL2-mAb mit der Gerüst(FR)-Sequenz der humanen VK- bzw. VH-Regionen und folglich mit den humanen Kappa- bzw. IgG1-konstanten Regiondomänen verbunden sind. Dieser humanisierte Antikörper behält die B-Lymphom- und Leukämie-Zell-Targeting- und -Internalisierung-Eigenschaften des parentalen mLL2-mAb bei und übt eine erniedrigte HAMA-Reaktion aus.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt werden isolierte Polynucleotide bereitgestellt, die DNA-Sequenzen aufweisen, die für die Aminosäuresequenzen der variablen leichten bzw. schweren Ketten der hLL2- und cLL2-mAbs codieren.
  • Gemäß einem weitern Aspekt werden die Aminosäuresequenzen der CDRs der VK- und VH-Ketten bereitgestellt.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt werden Konjugate bereitgestellt, bei denen der hLL2- oder cLL2-mAb kovalent mit einem diagnostischen oder therapeutischen Reagens verbunden ist.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt werden Verfahren bereitgestellt, bei denen die zuvor erwähnten mAb-Konjugate zur Diagnose oder Behandlung von B-Zell-Lymphomen und lymphocytischen Leukämien verwendet werden können.
  • Diese und andere Aspekte und Ausführungsformen der Erfindung werden durch Bezugnahme auf die folgende Beschreibung und die anhängigen Ansprüche ersichtlich.
  • BESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • 1 ist ein Vergleich der murinen mit der humanisierten LL2-VK- (1A, SEQ ID Nrn. 2 und 6) und -VH- (1B, SEQ ID Nrn. 4, 9 und 8) -Domänen. Es werden nur die hFR-Sequenzen (als REIHuVK und EUHuVH bezeichnet), die sich von den mFR-Sequenzen (als murin bezeichnet) unterscheiden, gezeigt, und mit Sternchen gekennzeichnet. In der humanisierten Struktur werden in diesen Positionen mehr Reste beibehalten. Die CDRs befinden sich in einem Kasten. Die FR-Reste, die im Computermodell CDR-Kontakte zeigen, sind unterstrichen.
  • 2 zeigt die Nachbarbeziehungen der LL2-CDRs in Bezug auf ihre Gerüstregionen (FRs). Es wurden separate Energieminimierungsmodelle für die VL- und VH-Domänen von mLL2 konstruiert, und sämtliche FR-Reste innerhalb eines Radius von –4,5 Å. oder jedes beliebige CDR-Atom wurde als potenzieller CDR-FR-Kontakt identifiziert. CDRs der leichen (L1, L2 und L3, 2A) und schweren (H1, H2 und H3, 2A) Ketten sind in „Kugelstab"-Darstellungen gezeigt, die an ihren entsprechenden raumfüllenden FRs überlagert sind.
  • 3 zeigt die leichte-Kette- (3a) -Staging-(VKpBR) und Säugetierexpressions-(pKH)-Vektoren und die schwere-Kette- (3b) -Staging- (VHpBS) und Säugetierexpression(pG1g)-Vektoren.
  • 4 zeigt die doppelsträngige DNA- und Aminosäuresequenzen der LL2-VK-Domäne (4a, SEQ ID Nrn. 1 und 2) und der LL2-VH-Domäne (4B, SEQ ID Nrn. 3 und 4). Die Aminosäuresequenzen, die durch die entsprechenden DNA-Sequenzen codiert werden, sind im Ein-Buchstaben-Code angegeben. Die CDR-Aminosäuresequenzen befinden sich in einem Kasten. Die Asn-Glykosylierungsstelle, die in FR1 von LL2VK (4A, SEQ ID Nr. 2) lokalisiert ist, ist als unterstrichene NVT-Sequenz gezeigt.
  • 5A zeigt die doppelsträngige DNA und entsprechende Aminosäurereste der hLL2-VK-Domäne (SEQ ID Nrn. 5 und 6). Die CDR-Aminosäuresequenzen befinden sich in einem Kasten. Die entsprechenden Daten für die VH-Domäne sind in 5B gezeigt (SEQ ID Nrn. 7 und 8).
  • 6 ist eine schematische Diagrammdarstellung der PCR/Gen-Synthese der humanisierten VH-Region und der Subklonierung in den Staging-Vektor, VHpBS.
  • 7 zeigt die SDS-PAGE-Analyse von mLL2- und cLL2-Antikörpern unter nicht-reduzierenden (Spuren 6 bis 8) und reduzierenden (Spuren 3 bis 5, leichte und schwere Ketten) Bedingungen. Die Spuren 3 und 6 umfassen einen Kontrollantikörper.
  • 8 zeigt eine SDS-PAGE-Analyse von verschiedenen Versionen von cLL2- und hLL2-Antikörpern unter reduzierenden (Spuren 3 bis 5) und nicht-reduzierenden (Spuren 6 bis 8) Bedingungen.
  • 9 zeigt eine SDS-PAGE-Analyse für „mix-and-match"-cLL2- und -hLL2-Antikörper unter reduzierenden (Spuren 3 bis 6) und nicht-reduzierenden (Spuren 7 bis 10) Bedingungen. cLL2 dient als Kontrolle.
  • 10 zeigt die Ergebnisse eines vergleichenden Raji-Zell-kompetitiven Antikörper-Bindeassays, der mLL2- und cLL2-Antikörper involviert, die gegen Tracer-radiomarkierten mLL2 um die Bindung an Zellen kompetitieren.
  • 11 zeigt die Ergebnisse eines vergleichenden Raji-Zell-kompetitiven Antikörper-Bindeassays, in dem gemischte humanisierte/chimäre LL2s mit cLL2 (11A) verglichen und zwei Versionen von hLL2 mit cLL2 (11B) verglichen werden.
  • 12 zeigt einen Vergleich der Antikörper-Internalisierung : Oberflächen-Bindungs-Verhältnisse als Funktion der Zeit für cLL2-, cLL2- (Q-nach-V-Mutagenese), hLL2- und mLL2-Antikörper.
  • 13 zeigt eine SDS-PAGE-Analyse von mLL2 und cLL2 nach der Deglykosylierung durch Endoglycosidase F.
  • 14 zeigt die Wirkung der Deglykosylierung von mLL2 auf die Bindeaffinität an Raji-Zellen.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • cDNAs, die für die VL- und VH-Regionen des mLL2-mAb codieren, wurden isoliert und separat rekombinant in Säugetierexpressionsvektoren subkloniert, die die Gene enthielten, die für die Kappa- bzw. IgG1-konstanten Regionen von humanen Antikörpern codieren. Cotransfektionen von Säugetierzellen mit diesen beiden rekombinanten DNAs exprimierten einen cLL2-mAb, der wie der parentale mLL2-mAb, sehr gut an B-Lymphomzellen bindet und rasch von diesen internalisiert wird.
  • Die CDRs der VK- und VH-DNAs wurden gleichermaßen rekombinant mit den Gerüst(FR)sequenzen der humanen VK- bzw. VH-Regionen verbunden, die anschließend entsprechend mit den humanen Kappa- und IgG1-konstanten Regionen verbunden wurden, so dass diese in Säugetierzellen, wie oben beschrieben, hLL2 exprimierten.
  • In dieser Beschreibung sind die Ausdrücke „cLL2" oder „cLL2-mAb" dazu vorgesehen, um auf den chimären monoklonalen Antikörper Bezug zu nehmen, der durch Verbindung oder Subklonierung der murinen VK- und VH-Regionen mit den humanen konstanten leichten bzw. schweren Ketten konstruiert wurde. Die Ausdrücke „hLL2" oder „hLL2-mAb" sind dazu vorgesehen, um auf die Humanisierung des chimären monoklonalen Antikörpers durch das Ersetzen der murinen FR-Sequenzen in cLL2 durch die der humanen Gerüstregionen Bezug zu nehmen.
  • Kovalente Konjugate zwischen cLL2- und hLL2-mAbs und einem diagnostischen oder chemotherapeutischen Reagens, formuliert in pharmazeutisch akzeptable Vehikel (siehe, z.B. Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Ausgabe, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990) können hergestellt werden, die verglichen mit Antikörperkonjugaten aus dem Stand der Technik Vorteile haben, hinsichtlich des B-Zell-Lymphom-spezifischen und Leukämiezell-spezifischen Targetings, der raschen Internalisierung in Zielzellen, der raschen intrazellulären Freisetzung des diagnostischen oder chemotherapeutischen Reagens (wodurch die Effektivität des Reagens erhöht wird) und einer potenziellen Reduzierung der HAMA-Antwort im menschlichen Patienten.
  • Da hier gezeigt wird, dass der VK-angehangene Kohlenhydratteil des cLL2-mAb nicht in die Bindung an B-Lymphomzellen involviert ist, ist es bevorzugt, Konjugate zu verwenden, bei denen das Reagens an den Antikörper über solche Kohlenhydratteile gebunden ist, wie bspw. über oxidierte Kohlenhydratderivate. Verfahren zur Herstellung solcher Konjugate und deren Verwendung in der Diagnostik und Therapie werden bspw. bereitgestellt in Shih et al., U.S.-Patent Nr. 5,057,313, Shih et al., Int. J. Cancer, 41: 832 (1988) und der ebenfalls anhängigen USSN 08/162,912, die gemeinschaftlich von Hansen et al. gehalten wird. Eine direkte Verbindung des Reagens an ein oxidiertes Kohlenhydrat ohne Verwendung eines Polymerträgers ist beschrieben in McKearn et al., U.S.-Patent Nr. 5,156,840.
  • Vorzugsweise kann mit den Antikörpern der Erfindung eine große Vielfalt von diagnostischen und therapeutischen Reagenzien konjugiert werden. Diese umfassen: chemotherapeutische Medikamente, wie bspw. Doxorubicin, Methotrexat, Taxol, und ähnliche; Chelatoren, wie bspw. DTPA, mit denen detektierbare Marker, wie bspw. fluoreszierende Moleküle oder cytotoxische Agenzien, wie bspw. Schwermetalle oder Radionucleide, komplexiert werden können; und Toxine, wie bspw. das Pseudomonas-Endotoxin, und ähnliche. Einige Ausführungsbeispiele dieser Konjugate werden in den unten stehenden Beispielen beschrieben.
  • Zelllinien und Kulturmedien, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, umfassen LL2-(EPB-2)-Hybridomzellen (Pawlak-Byczkowska et al., 1989, siehe oben), Sp2/0-Ag14-Myelomzellen (ATTC, Rockville, MD) und Raji-Zellen. Diese Zellen werden vorzugsweise in Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) kultiviert, das mit 10% FCS (Gibco/BRL, Gaithersburg, MA), 2 mM L-Glutamin und 75 μg/ml Gentamicin versetzt wurde (vollständiges DMEM). Transfektome werden in Hybridoma-Serum-Free-Medium, HSFM (Gibco/BRL, Gaithersburg, MA), enthaltend 10% FCS und 75 μg/ml Gentamicin (vollständiges HSFM), oder, wo angegeben, in HSFM, enthaltend lediglich Antikörper, wachsen gelassen. Die Selektion der Transfektome kann in vollständigem HSFM enthaltend 500 μg/ml von Hygromycin (Calbiochem, San Diego, CA) durchgeführt werden. Sämtliche Zelllinien werden vorzugsweise bei 37°C in 5% CO2 gehalten.
  • Ein wichtiger Aspekt dieser Erfindung ist, dass die variablen Domänen der Antikörper über Computermodelle modelliert werden können (siehe, z.B. Dion, in Goldenberg et al. Hrsg., Cancer Therapy With Radiolabeled Antibodies, CRC Press, Boca Rabon, FL, 1994). Im Allgemeinen wird die 3D-Struktur sowohl für den mLL22- als auch den hLL2-mAb am besten durch Homologie modelliert. Die hohe Häufigkeit der Identitäten der Reste (75,0 bis 92,3%) zwischen den abgeleiteten Primärsequenzen der FR- Regionen der mLL2-leichten-Kette und humanem REI (VK) erleichtert diesen Ansatz auf Grund der Verfügbarkeit von kristallografischen Daten aus der Proteindatenbank (Protein Data Bank, PDR Code 1REI, Bernstein et al., J. Mol. Biol., 112: 535 (1977). Gleichermaßen können die Antikörper-EU(VH)-Sequenzen als Computergegenstücke für FR1 bis FR3 der mLL2-schweren-Kette selektiert werden; FR4 basierte auf NEWM. Da die Röntgenkoordinaten-Daten für die EU-Sequenz gegenwärtig fehlen, können NEWM-Strukturdaten (PDR Code 3FAB) für FRs 1 bis 4 verwendet werden, und die Aminosäureseitengruppen können ersetzt werden, um mLL2 oder EU (hLL2) zu entsprechen, sofern erforderlich. Die CDR der leichten Kette kann aus der entsprechenden Sequenz von 1MCP (L1 und L2) und 1REI (L3) modelliert werden. Für die CDRs der schweren Kette können H1 und H2 auf 2HFL bzw. 1MCP basieren, während H3 de novo modelliert werden kann. Wann immer dies möglich ist, sollte ein Ersatz der Seitengruppe durchgeführt werden, so dass der Torsionswinkel zwischen Cα und Cβ beibehalten bleibt. Die Energieminimierung kann durch das AMBER-Kraftfeld (Weiner et al., J. Amer. Chem. Soc. 106: 765 (1984) bewerkstelligt werden, welches die konvergente Methode verwendet. Potenzielle kritische FR-CDR-Interaktionen können durch initiale Modellierung der leichten und schweren variablen Ketten von mLL2 bestimmt werden. Sämtliche FR-Reste innerhalb eines 4,5 Å-Radius sämtlicher Atome innerhalb jeder CDR können dadurch identifiziert und in dem endgültigen Konstruktionsmodell von hLL2 beibehalten werden.
  • Wenn einmal die Sequenzen für die hLL2-VK- und -VH-Domänen konstruiert sind, kann das CDR-Aufpfropfen durch Gensynthese bewerkstelligt werden, bei der lange synthetische DNA-Oligonucleotide als Templates und kurze Oligonucleotide als Primer in einer PCR-Reaktion verwendet werden. In den meisten Fällen wird die DNA, die für die VK- oder VH-Domäne codiert, ungefähr 350 bp lang sein. Unter Ausnutzung der Codondegeneriertheit kann eine einzige Restriktionsstelle einfach an Regionen ohne Austausch der codierenden Aminosäuren eingebracht werden, die sich in der Nähe der Mitte der V-Gen-DNA-Sequenz befinden. Bspw. kann für die hLL2-VH-Domäne an den DNA-Nucleotid-Positionen 157 bis 162 (Aminosäureposition 53 und 54) eine einzige AvrII-Stelle eingebracht werden, während die original konstruierte Aminosäuresequenz beibehalten wird (4B). Zwei lange, nicht-überlappende, einzelsträngige DNA-Oligonucleotide (~150 bp) stromaufwärts und stromabwärts der AvrII-Stelle (siehe, bspw. Oligo A und Oligo B, Beispiel 3, unten) können durch einen automatisierten DNA-Oligonucleotid-Synthesizer (Cyclone Plus DNA Synthesizer, Milligen-Biosearch) hergestellt werden. Da erwartet wird, dass die Ausbeuten der DNA-Oligonucleotide mit voller Länge, wie bspw. Oligos A und B, niedrig sind, können diese durch zwei Paare von flankierenden Oligonucleotiden (Oligo SEQ ID Nrn. 10 und 11 für Oligo A; Oligo SEQ ID Nrn. 12 und 13 für Oligo B, Beispiel 3) in einer PCR-Reaktion amplifiziert werden. Die Primer können mit den notwendigen Restriktionsstellen konstruiert werden, um die folgende Subklonierung zu erleichtern. Die Primer für Oligo A und für Oligo B sollen eine überlappende Sequenz an der AvrII-Stelle enthalten, so dass das resultierende PCR-Produkt für Oligo A bzw. B im Leseraster mit der AvrII-Stelle verbunden werden kann, um eine DNA-Sequenz mit voller Länge (ca. 350 bp) zu bilden, die für die hLL2-VH-Domäne codiert. Die Ligation der PCR-Produkte für Oligo A (restriktionsverdaut mit PstI und AvrII) und B (restriktionsverdaut mit AvrII und BstEII) an der AvrII-Stelle und deren Subklonierung in die PstII/BstEII- Stellen des Stagingvektors, VHpBS, kann in einem einzigen 3-Fragmente-Ligationsschritt vervollständigt werden (siehe, bspw. Beispiel 3). Die Subklonierung der korrekten Sequenz in VHpBS kann zuerst durch Restriktionsverdauanalyse analysiert und anschließend durch Sequenzierungsreaktion gemäß Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463 (1977) bestätigt werden.
  • Das HindIII/BamHI-Fragment, das den Ig-Promotor, die Leadersequenz und die hLL2-VH-Sequenz enthält, kann aus dem Stagingvektor ausgeschnitten und an die entsprechenden Stellen in einem pSVgpt-basierenden Vektor, pG1g, kloniert werden, der die genomische Sequenz der humanen IgG-konstanten Region, einen IgG-Enhancer und einen gpt-Selektionsmarker enthält, wodurch der finale Expressionsvektor hLL2pG1g gebildet wird. Entsprechende Strategien können für die Konstruktion der hLL2-VK-Sequenz genutzt werden. Die Restriktionsstelle, die für die Ligation der PCR-Produkte für die langen Oligonucleotide (Oligos C und D, siehe Beispiele unten) ausgesucht werden, können in diesem Fall NruI sein.
  • Die DNA-Sequenz, die den Ig-Promotor, die Leadersequenz und die hLL2-VK-Sequenz enthält, kann aus dem Stagingvektor VKpBR durch Behandlung mit BamHI/HindIII ausgeschnitten werden und in die entsprechenden Stellen eines pSVhyg-basierenden Vektors, pKh, subkloniert werden, der die genomische Sequenz der konstanten Region der humanen Kappa-Kette, einen Hygromycin-Selektionsmarker, einen Ig- und einen Kappa-Enhancer, enthält, wodurch der finale Expressionsvektor hLL2pKh gebildet wird.
  • Da die Humanisierung gelegentlich in einer Verringerung oder sogar dem Verlust der Antikörperaffinität resultiert, können zusätzliche Modifizierungen erforderlich sein, um die ursprüngliche Affinität wieder herzustellen (siehe, z.B. Tempest et al., Bio/Technology 9: 266 (1991); Verhoeyen et al., Science 239: 1534 (1988)). Da bekannt ist, dass cLL2 eine Bindeaffinität aufweist, die vergleichbar ist mit der seines murinen Gegenstücks (siehe Beispiel 5, unten), können unbrauchbare Konstrukte, falls solche auftreten, in der ursprünglichen Version von hLL2 durch „Mixing-and-Matching" der leichten und schweren Kette von cLL2 gegenüber solchen der humanisierten Version identifiziert werden. SDS-PAGE-Analysen der verschiedenen „mix-and-match"-humanisierten chimären LL2 unter nicht-reduzierenden (die Disulfid L-H-Kettenverbindungen bleiben intakt) und reduzierenden Bedingungen (die Ketten werden getrennt) ermöglichen Analysen der Verhältnisse der verschiedenen Typen von leichten und schweren Ketten hinsichtlich der Eigenschaften des Moleküls. Bspw. kann die Migration in Form von multiplen Banden oder bei einer höheren apparenten molekularen Größe auf dem Vorhandensein einer Glykangruppe an der N-gekoppelten Glykosylierungsstelle beruhen, die in der FR1-Region der murinen VK-Domäne von LL2 gefunden wird. In einem anderen Beispiel weist eine diskrete Bande, die bei etwa 25 kDa migriert, die erwartete molekulare Größe für eine nicht-glykosylierte leichte Kette auf.
  • Im Allgemeinen können zur Herstellung von cLL2-mAb VH- und VK-Ketten vom mLL2 durch PCR-Klonierung unter Verwendung von DNA-Produkten und Primern erhalten werden, Orlandi et al., infra, und Leung et al., infra. Die VK-PCR-Primer können in einen pBR327-basierenden Stagingvektor (VHpBR) subkloniert werden, wie oben beschrieben. Die VH-PCR-Produkte können in einen entsprechenden pBluescript-basierenden Stagingvektor (VHpBS) subkloniert werden, wie oben beschrieben. Die Fragmente, die die VK- und VH-Sequenzen enthalten, zusammen mit den Promotor- und Signalpeptidsequenzen, können aus dem Stagingvektor unter Verwendung von HindIII- und BamHI-Restriktionsendonucleasen ausgeschnitten werden. Die VK-Fragmente (etwa 600 bp) können in einen Säugetierexpressionsvektor (bspw. pKh) auf konventionelle Art und Weise subkloniert werden. pKh ist ein pSVhyg-basierender Expressionsvektor, der die genomische Sequenz der humanen Kappa-konstanten Region, einen Ig-Enhancer, einen Kappa-Enhancer und das Hygromycin-Resistenzgen enthält. Entsprechend können die VH-Fragmente von etwa 800 bp in pG1g subkloniert werden, einen pSVgpt-basierenden Expressionsvektor, der die genomische Sequenz der humanen IgG1-konstanten Region, einen Ig-Enhancer und das Xanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase(gpt)-Gen enthält. Die beiden Plasmide können in Säugetierexpressionszellen, wie bspw. Sp2/0-Ag14-Zellen, durch Elektroporation transfiziert und auf Hygromycinresistenz selektiert werden. Kolonien, die die Selektion überleben, werden expandiert, und die Überstandflüssigkeiten werden auf die Produktion von cLL2-mAb durch ELISA-Methoden kontrolliert. Eine Transfektionseffizienz von etwa 1–10 × 106-Zellen ist wünschenswert. Mit diesem System kann ein Antikörperexpressionsspiegel von 0,10 bis 2,5 μg/ml erwartet werden.
  • Die RNA-Isolierung, die cDNR-Synthese und die Amplifizierung kann wie folgt ausgeführt werden. Die Gesamtzell-RNA kann aus einer LL2-Hybridomzelllinie präpariert werden, wobei insgesamt etwa 107 Zellen verwendet werden, gemäß Sambrook et al., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Zweite Ed., Cold Spring Harbor Press, 1989). Die Erststrang-cDNA kann von der Gesamt-RNA auf konventionelle Art und Weise revers transcribiert werden, wie bspw. durch Verwendung des SuperScript-Preamplification-Systems (Gibco/BRL., Gaithersburg, MD). Kurz gesagt können in einem Reaktionsvolumen von 20 μl 50 ng von randomisierten Primern an 5 μg RNA in Gegenwart von 2 μl von 10 × Synthesepuffer [200 mM Tris-HCl (pH 8,4), 500 mM KCl, 25 mM MgCl2, 1 mg/ml BSA], 1 μl von 10 mM dNTP-Mix, 2 μl von 0,1 M DTT und 200 Einheiten von SuperScript reverser Transcriptase angelagert werden. Der Verlängerungsschritt wird initiiert, wobei bei Raumtemperatur für 10 min fortgefahren wird, gefolgt von einer Inkubation bei 42°C für 50 min. Die Reaktion kann durch Erhitzung des Reaktionsmixes auf 90°C für 5 min beendet werden.
  • Die VK- und VH-Sequenzen für cLL2 oder hLL2 können durch PCR amplifiziert werden, wie beschrieben durch Orlandi et al., (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86: 3833 (1989)). VK-Sequenzen können unter Verwendung der Primer CK3BH und VK5-3 (Leung et al., BioTechniques, 15: 286 (1993), durch Bezugnahme inkorporiert), amplifiziert werden, während VH-Sequenzen unter Verwendung des Primers CH1B, der an die CH1-Region von murinem 1gG anlagert und VHIBACK (Orlandi et al., 1989, siehe oben), amplifiziert werden können. Die PCR-Reaktionsmischungen enthalten 10 μl des Erststrang-cDNA-Produktes, 9 μl des 10 × PCR-Puffers [500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl (pH 8,3), 15 mM MgCl2 und 0,01% (Gewicht pro Volumen) Gelatine] (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT), können 30 PCR-Zyklen unterworfen werden. Jeder PCR-Zyklus besteht vorzugsweise aus einer Denaturierung bei 94°C für 1 min, einer Anlagerung bei 50°C für 1,5 min und der Polymerisierung bei 72°C für 1,5 min. Die amplifizierten. VK- und VH- Fragmente können auf 2% Agarose (BioRad, Richmond, CA) gereinigt werden. Siehe Beispiel 3 für ein Verfahren zur Synthese eines Oligo A (149-mer) und eines Oligo B (140-mer) auf einem automatisierten Cyclon Plus DNA-Synthesizer (Milligan-Biosearch) zur Verwendung in der Konstruktion von humanisierten V-Genen.
  • Die PCR-Produkte für VK können in einen Stagingvektor subkloniert werden, wie bspw. einen pBR327-basierenden Stagingvektor VKpBR, der einen Ig-Promotor, eine Signalpeptidsequenz und geeignete Restriktionsstellen zur Erleichterung der Ligation der VK-PCR-Produkte im Leseraster enthält. Die PCR-Produkte für VK können in einen entsprechenden Stagingvektor subkloniert werden, wie bspw. den pBluescript-basierenden VHpBS. Individuelle Klone, die die entsprechenden PCR-Produkte enthalten, können sequenziert werden, bspw. durch das Verfahren von Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 74: 5463 (1977).
  • Die hier beschriebenen DNA-Sequenzen sind so zu verstehen, als dass diese sämtliche Allele, Mutanten und Varianten hiervon umfassen, gleich ob diese natürlich vorkommen oder induziert werden.
  • Die beiden Plasmide können in eine geeignete Zelle, bspw. das Myelom Sp2/0Ag14, cotransfiziert werden, Kolonien werden auf Hygromycinresistenz selektiert und Überstandflüssigkeiten werden auf die Produktion von cLL2- oder hLL2-Antikörper mittels, bspw. eines ELISA-Assays, überwacht, wie unten beschrieben.
  • Die Transfektion und der Assay auf Antikörpersekretierende Klone mittels ELISA können wie folgt ausgeführt werden. Etwa 10 μg von hLL2pKh (Leichte-Kette-Expressionsvektor) und 20 μg von hLL2pG1g (Schwere-Kette-Expressionsvektor) können für die Transfektion von 5 × 106 SP2/0-Myelomzellen durch Elektroporation (BioRad, Richmond, CA) gemäß Co et al., J. Immunol., 148: 1149 (1992), verwendet werden. Nach der Transfektion können die Zellen in 96-Vertiefungen-Mikrotiterplatten in vollständigem HSFM-Medium (GIBCO, Gaithersburg, MD) bei 37°C, 5% CO2, wachsen gelassen werden. Der Selektionsprozess kann nach zwei Tagen durch Zugabe von Hygromycin-Selektionsmedium (Calbiochem, San Diego, CA) mit einer Endkonzentration von 500 μg/ml Hygromycin initiiert werden. Typischerweise tauchen Kolonien 2–3 Wochen nach der Elektroporation auf. Die Kulturen können dann für weitere Analysen expandiert werden.
  • Transfektom-Klone, die positiv hinsichtlich der Selektion auf die chimäre oder humanisierte schwere Kette sind, können mittels ELISA-Assays identifiziert werden. Kurz gesagt, Proben aus dem Überstand (100 μl) aus den Transfektom-Kulturen werden in dreifachen Ansätzen in ELISA-Mikrotiterplatten gegeben, die zuvor mit Ziegen-anti-humanem(GAH)-IgG, F(ab')2-Fragment-spezifischem Antikörper (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) beschichtet wurden. Die Platten werden für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Ungebundene Proteine werden durch dreimaliges Waschen mit Waschpuffer (PBS, enthaltend 0,05% Polysorbat 20) entfernt. Meerrettichperoxidase(HRP)-konjugierte GAH-IgG, Fc-Fragment-spezifische Antikörper (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) werden in die Vertiefungen gegeben, (100 μl der Antikörperstammlösung, verdünnt × 104, versetzt mit dem unkonjugierten Antikörper auf eine Endkonzentration von 1,0 μg/ml). Nach einer Inkubation von 1 h werden die Platten gewaschen, typischerweise drei Mal. Eine Reaktionslösung [100 μl, enthaltend 167 μg von Orthophenylen-Diamin (OPD) (Sigma, St. Louis, MO), 0,025% Wasserstoffperoxidase in PBS] wird in die Vertiefungen gegeben. Die Farbentwicklung im Dunkeln wird über einen Zeitraum von 30 Minuten ermöglicht. Die Reaktion wird durch die Zugabe von 50 μl einer 4 N HCl-Lösung in jede Vertiefung abgestoppt, bevor die Absorption bei 490 nm in einem automatisierten ELISA-Lesegerät (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT) gemessen wird. Gebundene chimäre Antikörper werden dann relativ zu einem irrelevanten Antikörperstandard (erhältlich bei Scotgen, Ltd., Edinburg, Schottland) bestimmt.
  • Antikörper können aus Zellkulturmedium wie folgt isoliert werden. Transfektomkulturen werden an serumfreies Medium gewöhnt. Zur Herstellung von chimärem Antikörper werden die Zellen in einer 500 ml-Kultur in Rollerflaschen unter Verwendung von HSFM wachsen gelassen. Die Kulturen werden zentrifugiert und der Überstand wird durch eine 0,2 μm-Membran filtriert. Das filtrierte Medium wird über eine Protein-A-Säule (1 × 3 cm) mit einer Flussrate von 1 ml/min gegeben. Das Harz wird dann mit etwa 10 Säulenvolumen von PBS gewaschen und Protein-A-gebundener Antikörper wird von der Säule mit 0,1 M Glycinpuffer (pH 3,5) enthaltend 10 mM EDTA eluiert. Fraktionen von 1,0 ml werden in Röhrchen gesammelt, die 10 μl von 3 M Tris (pH 8,6) enthalten, und die Proteinkonzentrationen werden über die Absorption bei 280/260 nm bestimmt. Die Peakfraktionen werden gepoolt, gegen PBS dialysiert, und der Antikörper wird konzentriert, bspw. mit Centricon 30 (Amicon, Beverly, MA). Die Antikörperkonzentration wird mittels ELISA bestimmt, wie zuvor, und dessen Konzentration wird auf etwa 1 mg/ml unter Verwendung von PBS eingestellt. Natriumazid, 0,01% (w/v), wird auf geeignete Art und Weise der Probe als Konservierungsmittel zugegeben.
  • Vergleichbare Bindeaffinitäten der so isolierten mLL2-, cLL2- und hcLL2-Antikörper können durch einen direkten Radioimmunassay bestimmt werden. mLL2 kann mit 131I oder 125I unter Verwendung der Chloramin-T-Methode (siehe, bspw. Greenwood et al., Biochem. J., 89: 123 (1963)) markiert werden. Die spezifische Aktivität des iodierten Antikörpers ist typischerweise auf etwa 10 μCi/μg eingestellt. Unmarkierte und markierte Antikörper werden unter Verwendung von Reaktionsmedium (HSFM, versetzt mit 1% Pferdeserum und 100 μg/ml Gentamicin) auf die geeigneten Konzentrationen eingestellt. Die geeigneten Konzentrationen von sowohl markierten als auch unmarkierten Antikörpern werden zusammen zu den Reaktionsröhrchen in einem Gesamtvolumen von 100 μl zugegeben. Eine Kultur von Raji-Zellen wird getestet und die Zellkonzentration bestimmt. Die Kultur wird zentrifugiert und die gesammelten Zellen werden einmal in Reaktionsmedium gewaschen, gefolgt von einer Resuspendierung in Reaktionsmedium auf eine Endkonzentration von etwa 107 Zellen/ml. Sämtliche Verfahren werden in der Kälte bei 4°C durchgeführt. Die Zellsuspension, 100 μl, wird in die Reaktionsröhrchen gegeben. Die Reaktion wird bei 4°C für 2 h mit periodischem vorsichtigem Schütteln der Reaktionsröhrchen durchgeführt, um die Zellen zu resuspendieren. Nach der Reaktionsperiode werden 5 ml Waschpuffer (PBS, enthaltend 1% BSA) zu jedem Röhrchen zugegeben. Die Suspension wird zentrifugiert und das Zellpellet wird ein zweites Mal mit weiteren 5 ml Waschpuffer gewaschen. Nach der Zentrifugation wird die Menge von verbleibender Radioaktivität, die in dem Zellpellet zurückbleibt, in einem Gammazähler (Minaxi, Packard Instruments, Sterling, VA) bestimmt.
  • Die Bindeaffinitäten der „mix-and-match"- und vollständig humanisierten Antikörper an das Antigen der Raji-Zelloberfläche können mit denen von cLL2 unter Verwendung von verschiedenen Konzentrationen von mLL2 F(ab')2-Fragmenten ohne den Fc-Teil als Kompetitoren verglichen werden, wie dies mittels eines Durchflusszytometrieassays evaluiert werden kann. Reste von oberflächengebundenen LL2-Antikörpern, die die humanen Fc-Teile tragen (cLL2 und „mix-and-match"-LL2) können durch einen FITC-markierten anti-humanen-Fc-spezifischen Antikörper in einem Durchflusszytometrieassay detektiert werden. Wo die „mix-and-match"-LL2-Antikörper Antigenbindeaffinitäten aufweisen, die denen von cLL2 entsprechen, kann geschlussfolgert werden, dass die ursprünglichen Konstruktionen für die Humanisierung sowohl der leichten als auch schweren Kette die mLL2-Immunreaktivität beibehalten.
  • Die Internalisierung von mLL2-, cLL2- und hLL2-Antikörpern in Zielzellen kann durch Fluoreszenzmarkierung verfolgt werden, im Wesentlichen gemäß dem Verfahren von Pirker et al., J. Clin. Invest., 76: 1261 (1985). Kultivierte Raji-Zellen werden zentrifugiert und die Zellen werden in frischem Medium in einer Konzentration von etwa 5 × 106 Zellen/ml resuspendiert. Zu jeder Vertiefung einer 96-Vertiefungen-Mikrotiterplatte werden 100 μl der Zellsuspension zugegeben. Die Antikörper, 40 μg/ml, in einem Volumen von 100 μl werden in die Reaktionsvertiefungen in zeitlich abgestimmten Intervallen zugegeben, so dass sämtliche Reaktionen gleichzeitig beendet werden. Die Platte wird bei 37°C in einem CO2-Zellkultur-Inkubator inkubiert. Ungebundene Antikörper werden entfernt, indem die Zellen dreimal mit kaltem 1 %igem FCS/PBS am Ende der Inkubation gewaschen werden. Die Zellen werden dann mit 1 ml von Formaid-Fresh [10%ige Forma linlösung (Fisher, Fair Lawn, NJ)] für 15 min bei 4°C behandelt. Nach dem Waschen werden Antikörper, die entweder auf der Zelloberfläche oder in den Zellen vorhanden sind, durch Behandlung mit FITC-markiertem Ziege-anti-Maus-Antikörper (Tago, Burlingame, CA) oder einem FITC-markierten Ziege-anti-human-Antikörper (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) detektiert, in Abhängigkeit davon, ob der getestete Antikörper murin, chimär, bzw. humanisiert ist. Die Fluoreszenzverteilungen werden unter Verwendung eines BH-2-Fluoreszenzmikroskops (Olympus, Lake Success, NY) evaluiert.
  • Die Rate der Antikörperinternalisierung kann gemäß Opresko et al., (J. Biol. Chem., 262: 4116 (1987)) bestimmt werden, unter Verwendung von radioiodierten Antikörpern als Tracer. Kurz gesagt, radiomarkierte Antikörper (1 × 104 cpm) werden mit Raji-Zellen (1 × 106 Zellen/ml) bei 4°C für 2 h in 0,5 ml DMEM-Medium enthaltend 1% humanes Serum inkubiert. Nach dem Reaktionsintervall werden nicht-spezifisch gebundene Antikörper durch dreimaliges Waschen mit 0,5 ml von DMEM-Medium entfernt. Zu jedem der Reaktionsröhrchen werden 0,5 ml von DMEM-Medium hinzugegeben und die Suspension wird bei 37°C zur Bestimmung der Internalisierung inkubiert. Zu zeitlich abgestimmten Intervallen werden Zellen in drei parallelen Ansätzen entfernt und unmittelbar in einem Eisbad abgekühlt, um die weitere Internalisierung zu stoppen. Die Zellen werden bei 1000 × g für 5 min bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und die Radioaktivität hiervon wird gezählt. Die oberflächengebundene Radioaktivität wird durch Behandlung mit 1 ml von 0,1 M Acetat/0,1 M Glycinpuffer bei pH 3,0 für 8 min in der Kälte entfernt. Die durch die Säurebehandlung entfernte und die mit den Zellen assoziiert verbleibende Radioaktivität wird bestimmt. Das Verhältnis von CPMInternalisierung/CPMOberfläche wird gegen die Zeit aufgetragen, um die Rate der Internalisierung aus der Neigung zu bestimmen.
  • Detaillierte Protokolle zur Oligonucleotid-gerichteten Mutagenese und verwandte Techniken zur Mutagenese von klonierter DNA sind wohl bekannt. Siehe bspw. Sambrook et al. und Ausubel et al., oben.
  • Asn-gekoppelte Glykosylierungsstellen können in die Antikörper unter Verwendung von konventionellen ortsspezifischen Oligonucleotidmutagenesereaktionen eingebracht werden. Zur Einführung eines Asn in Position 18 eines Kappa-Proteins kann bspw. das Codon 18 von AGG in AAC geändert werden. Um dies zu erreichen, wird ein Einzelstrang-DNA-Template, das die Sequenz der leichten Kette des Antikörper enthält, aus einem geeigneten Strang von E. coli (z.B. dut–ung–) präpariert, um ein DNA-Molekül zu erhalten, das eine kleine Anzahl von Uracils anstelle von Thymidins enthält. Solch ein DNA-Template kann durch M13-Klonierung oder durch in vitro-Transkription unter Verwendung eines SP6-Promotors erhalten werden, siehe, z.B. Ausubel et al., Hrsg., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, NY, 1987. Ein Oligonucleotid, das die mutierte Sequenz enthält, wird auf konventionelle Art und Weise synthetisiert, an das einzelsträngige Template angelagert und das Produkt wird mit T4-DNA-Polymerase und T4-DNA-Ligase behandelt, um ein doppelsträngiges DNA-Molekül herzustellen. Die Transformation von Wildtyp-E. coli(dut+ung+)-Zellen mit der doppelsträngigen DNA liefert eine effiziente Wiederherstellung von mutierter DNA.
  • Alternativ kann eine Asn-gekoppelte Glykosylierungsstelle in eine leichte Kette eines Antikörpers eingebracht werden, in dem ein Oligonucleotid, das die gewünschte Mutation enthält, als Primer, und DNA-Klone der variablen Regionen für die VL-Kette verwendet werden, oder durch Verwendung von RNA aus Zellen, die den interessierenden Antikörper produzieren, als Template; siehe ebenfalls Huse, in ANTIBODY ENGINEERING: A PRACTICAL GUIDE, Boerrebaeck, Hrsg., E. H. Freeman & Co., Seiten 103–120, 1992. Eine ortsspezifische Mutagenese kann bspw. unter Verwendung des TRANSFORMERTM-Kits (Clontech, Palo Alto, CA) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt werden.
  • Alternativ kann eine Glykosylierungsstelle durch Synthetisierung einer Antikörperkette mit gegenseitig primenden Oligonucleotiden eingebracht werden, wobei eines die gewünschte Mutation enthält; siehe bspw. Uhlmann, Gene 71: 29 (1988); Wosnick et al., Gene 60: 115 (1988); Ausubel et al., oben, die durch Inbezugnahme inkorporiert werden.
  • Obwohl die obige allgemeine Beschreibung auf das Einbringen einer Asn-Glykosylierungsstelle in Position 18 der leichten Kette eines Antikörpers Bezug nimmt, ist es dem Fachmann klar, dass es möglich ist, Asn-gekoppelte Glykosylierungsstellen überall in der leichten Kette, oder sogar in die variable Region der schweren Kette einzubringen.
  • Die unten beschriebenen repräsentativen Ausführungsformen dienen lediglich dazu, die Erfindung zu illustrieren. Für den Fachmann ist ersichtlich, dass Variationen der vorliegenden Materialien in den breiten generischen Bereich der beanspruchten Erfindung fallen.
  • Beispiel 1
  • Wahl der humanen Gerüstregionen und Sequenzkonstruktion für die Humanisierung des LL2-monoklonalen Antikörpers
  • Durch Vergleich der murinen variablen (V) Gerüstregion-(FR)-Sequenzen von LL2 mit denen von humanen Antikörpern in der Kabat-Datenbank (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. Ed., U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office, Washington, D.C.), die durch Inbezugnahme inkorporiert ist, wurden die humanen REI- (1A, Sequenz ID Nr. 6) und EU- (1B, Sequenz ID Nrn. 9 und 10) -Sequenzen als diejenigen gefunden, die den höchsten Grad an Sequenzhomologie mit den FRs von VK- bzw. VH-Domänen von LL2 aufweisen. Deshalb wurden die REI- und EU-FRs als die humanen Gerüstregionen selektiert, auf die die CDRs für LL2-VK bzw. -VH aufgepfropft wurden. Anstelle der EU-Sequenz wurde jedoch die FR4-Sequenz von NEWM verwendet, um die EU-FR4-Sequenz für die Humanisierung der LL2-schweren-Kette zu ersetzen. Basierend auf den Ergebnissen von Computermodellstudien (2A und 2B) wurden die murinen FR-Reste, die potenzielle CDR-Kontakte haben, die die Affinität und Spezifität des resultierenden Antikörpers beeinflussen könnten, in der Konstruktion der humanisierten FR-Sequenzen beibehalten (1).
  • Es wurden zwei Versionen von humanisierter schwerer Kette konstruiert. In der ersten Version (hLL2-1, SEQ ID Nr. 9), wurde Glutamin (Q) an Aminosäureposition 5 (Kabat-Zählweise) eingebracht, um eine PstI-Restriktionsstelle einzubringen, um deren Subklonierung in den Stagingvektor zu erleichtern (3). Dieser murine Rest wurde durch Oligo-gerichtete Mutagenese in den humanen EU-Rest Valin (V) in hLL2-2 (SEQ ID Nr. 8) konvertiert. Es ist zu bemerken, dass in der originalen murinen Kabat-kettenvariablen Sequenz eine potenzielle N-gekoppelte Glykosylierungsstelle an den Positionen 18 bis 20 (1, SEQ ID Nr. 2) identifiziert und zur Addition von Kohlenhydrat verwendet wurde. Diese Glykosylierungsstelle war nicht in der REI-FR-Sequenz enthalten, die für die LL2-leichte-Kette-Humanisierung verwendet wurde.
  • Siehe Beispiel 3 für mehr Details bezüglich des Oligonucleotids.
  • Beispiel 2
  • PCR-Klonierung und Sequenzaufklärung für die variablen Regionen der schweren und leichten Kette von LL2
  • Die variablen Regionen für sowohl die schwere (VH) und leichte (VK) Kette von mLL2 (IgG2a) wurden durch PCR-Klonierung unter Verwendung von DNA-Primer erhalten, wie oben allgemein und im Detail im Beispiel 3 unten beschrieben. Da die PCR anfällig ist für Mutationen, wurde vor der Verwendung für die Konstruktion des chimären Antikörpers die Sequenz der variablen Region von parallelen individuellen Klonen entweder von der schweren oder der leichten Kette für sechs Klone bestimmt und bestätigt, dass diese identisch sind.
  • Die PCR-Produkte für VK wurden in einen pBR327-basierenden Stagingvektor, VKpBR, subkloniert, der einen Ig-Promotor, eine Signalpeptidsequenz und geeignete Restriktionsstellen enthält, um die Ligation der VK-PCR-Produkte im Leseraster zu erleich tern (3A). Die PCR-Produkte für VH wurden in einen entsprechenden pBluescript-basierenden Stagingvektor, VHpBS, subkloniert (3B).
  • Wie oben erwähnt, wurden zumindest sechs individuelle Klone, die die jeweiligen PCR-Produkte enthielten, gemäß der Methode von Sanger et al., 1977, oben, sequenziert. Für alle wurde gezeigt, dass diese identische Sequenzen trugen, und deren entsprechende Sequenzen wurden aufgeklärt, wie in 4A für LL2-VK (SEQ ID Nr. 1) und in 4B für LL2-VH (SEQ ID Nr. 3) gezeigt. Innerhalb der Sequenzen, die für die VK- und VH-Regionen codieren, wurden keine fehlerhaften Mutationen identifiziert. Ein Vergleich der Sequenzen der PCR-amplifizierten variablen Region von LL2 mit der Kabat-Datenbank (Kabat et al., oben) deutet darauf hin, dass die VK- und VH-Sequenzen von LL2 zu der Untergruppe 5 bzw. 2B gehören. Wichtige Reste, wie bspw. Cys für die Disulfidbindung innerhalb der Domäne, wurden an geeigneten Positionen beibehalten.
  • In der FR1-Gerüstregion von VK wurde eine N-gekoppelte Kohlenhydratanbringungsstelle, Asn-Val-Thr, an Position 18 bis 20 identifiziert (4A, SEQ ID Nr. 2), was darauf hindeutet, dass VK von LL2 glycosyliert sein könnte. Wie dies unten im Detail erläutert wird, demonstrierte die SDS-PAGE-Analyse unter reduzierenden Bedingungen, dass diese Asn-Glycosylierungsstelle in der Tat zur Kohlenhydratanbringung verwendet wird. Das Vorhandensein der Glycosylierungsstelle in der variablen Region scheint jedoch die Immunreaktivität des Antikörpers nicht zu beeinflussen. Ein Vergleich der Immunreaktivität von mLL2 mit der von cLL2 in einem kompetitiven RIA zeigte, dass die beiden Antikörper nahezu identische Aktivitäten haben.
  • Beispiel 3
  • PCR/Gen-Synthese der humanisierten V-Gene
  • Die konstruierte Sequenz für die hLL2-VH-Domäne, die Konstruktion der hLL2-VH-Domäne durch lange Oligonucleotide und durch PCR, und der Stagingvektor VHpBS, der die hLL2-VH-Domäne enthält, werden in der Skizze, die in 6 gezeigt ist, zusammengefasst.
  • Zur Konstruktion der hLL2-VH-Domäne wurde Oligo A (149-mer) und Oligo B (140-mer) auf einem automatisierten CYCLONE PLUSTM-DNA-Synthesizer (Milligan Bioresearch) synthetisiert.
  • Oligo A (SEQ ID Nr. 10, unten) repräsentiert den Minusstrang der hLL2-VH-Domäne, komplementär zu nt 24 bis 172.
  • Sequenz ID Nr. 10
    Figure 00300001
  • Oligo B (Sequenz ID Nr. 11, unten) repräsentiert den Minusstrang der hLL2-VH-Domäne, komplementär zu nt 180 bis 320.
  • Sequenz ID Nr. 11
    Figure 00310001
  • Oligos A und B wurden von dem Träger abgespalten und durch Behandlung mit konzentriertem Ammoniumhydroxid deprotektiert. Nachdem die Proben vakuumgetrocknet (SpeedVac, Savant, Farmingdale, NY) und in 100 μl Wasser resuspendiert wurden, wurden die unvollständigen Oligomere (kleiner als 100-mer) durch Zentrifugation über eine CHROMOSPIN-100TM-Säule (Clonetech, Palo Alto, CA) entfernt, bevor die DNA-Oligomere durch PCR amplifiziert wurden. Sämtliche flankierenden Primer für die separaten Amplifikationen und PCR-Klonierung von Oligos A und B wurden durch SDS-PAGE gereinigt, im Wesentlichen gemäß der Methoden von Sambrook et al., 1989, oben. Von dem CHROMASPIN-gereinigten Oligo A wurde 1 μl der Probenstammlösung in einem Reaktionsvolumen von 100 μl PCR-amplifiziert durch Zugabe von 5 μl von 5 μM der Oligosequenz ID Nr. 12:
    Figure 00310002
    und der Oligo-Sequenz ID Nr. 13:
    Figure 00310003
    in Gegenwart von 10 μl an 10 × PCR-Puffer (500 mM KCl, 100 mM Tris.HCL-Puffer, pH 8.3, 15 mM MgCl2) und 5 Einheiten von AMPLITAQTM-DNA-Polymerase (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, Ct). Diese Reaktionsmischung wurde 13 Zyklen einer PCR-Reaktion unterworfen, bestehend aus Denaturierung bei 94°C für 1 Minute, Anlagerung bei 50°C für 1,5 Minuten, und Polymerisierung bei 72°C für 1,5 Minuten.
  • Das Oligo 8 wurde PCR-amplifiziert, wobei die Primerpaare mit der Sequenz ID Nr. 14:
    Figure 00320001
    und der Sequenz ID Nr. 15:
    Figure 00320002
    unter entsprechenden Bedingungen verwendet wurden.
  • Die doppelsträngigen PCR-amplifizierten Produkte für die Oligos A und B wurden gelgereinigt, restriktionsverdaut mit PstI/AvrII (PCR-Produkt von Oligo A) und BstEII/AvrII (PCR-Produkt von Oligo B) und in die komplementären PstI/BstEII-Stellen des Schwere-Kette-Stagingvektors, VHpBS, subkloniert. Die humanisierte VH-Sequenz wurde in den pG1g-Vektor subkloniert, was in dem finalen Humanen-IgG1-schwere-Kette-Expressionsvektor, hLL2pG1g, resultiert.
  • Zur Konstruktion der Volllängen-DNA der humanisierten VK-Sequenz wurden Oligo E (150-mer) und Oligo F (121-mer) synthetisiert, wie oben beschrieben. Oligo-E-Sequenz ID Nr. 16:
    Figure 00330001
    repräsentiert den Minusstrang der humanisierten VK-Domäne, komplementär zu nt 31 bis 180, und diese Sequenz wurde PCR-amplifiziert durch Verwendung der Oligo-Sequenz ID Nr. 17:
    Figure 00330002
    und Oligo-Sequenz ID Nr. 18:
    Figure 00330003
    Oligo-F-Sequenz ID Nr. 19:
    Figure 00330004
    repräsentiert den Minusstrang der humanisierten LL2-VK-Domäne, komplementär zu nt 208 bis 328, und wurde PCR-amplifiziert unter Verwendung der Oligo Sequenz ID Nr. 20:
    Figure 00330005
    und Oligo-Sequenz ID Nr. 21:
    Figure 00340001
  • Die gelgereinigten PCR-Produkte für die Oligos E und F wurden restriktionsverdaut mit PvuII/NruI bzw. NruI/BglIII. Die beiden PCR-Fragmente E und F wurden dann an der NruI-Stelle verbunden und an die komplementären PvuI/BcII-Stellen des Leichte-Kette-Stagingvektors, VKpBR, ligiert. Die humanisierte VK-Sequenz wurde in den Vektor pKh subkloniert, um den finalen Humane-Kappa-Kette-Expressionsvektor, hLL2pKh, zu bilden.
  • Um die humanisierten Antikörper zu exprimieren, wurden etwa 10 μg von liniarisiertem hLL2pKh und 20 μg von linearisiertem hLL2pG1g verwendet, um 5 × 106 SP2/0-Zellen durch Elektroporation zu transfizieren. Die Transfektome wurden mit Hygromycin bei 500 μg/ml selektiert und sekretierter Antikörper wurde auf eine 1 × 3 cm-Säule von Protein A gereinigt. Nach der Konzentrierung des gereinigten Antikörpers durch Centricon 30-Zentrifugation wurde die Antikörperkonzentration mittels ELISA bestimmt. Die Endkonzentration des Antikörpers wurde auf 1 mg/ml in PBS-Puffer enthaltend 0,01% (w/v) Natriumazid als Konservierungsmittel eingestellt.
  • In 1 wird die Aminosäuresequenz zwischen den murinen und humanisierten LL2-VK-Domänen (1A, SEQ ID Nrn. 2 und 6) und zwischen den murinen und humanisierten LL2-VH-Domänen (1B, SEQ ID Nr. 4, 9 und 8) verglichen. In der VK-Kette wurden humane REI-Gerüstsequenzen für alle FRs verwendet. In der VH-Kette wurden humane EU-Gerüstregionensequenzen für FR 1 bis 3 verwendet, und NEWM-Sequenzen wurden verwendet für FR-4. Es sind nur FR-Sequenzen gezeigt, die sich von denen der Maus unterscheiden. Sternchen zeigen murine FR-Sequenzen an, die an entsprechenden Positionen unterschiedlich sind von humanen FR. Murine Reste an diesen Positionen wurden in der humanisierten Struktur beibehalten. CDRs sind in Kästen dargestellt.
  • In 4A (Sequenz ID Nrn. 1 und 2) sind doppelsträngige DNA und entsprechende Aminosäuresequenzen (gezeigt im Einbuchstabencode) der murinen LL2-VK-Domäne gezeigt. Die CDR1-3-Aminosäuresequenzen sind in Kästen dargestellt. Die entsprechende Darstellung für VH ist in 4B gezeigt (Sequenz ID Nrn. 3 und 4).
  • In 5A (Sequenz ID Nrn. 5 und 6) und 5B (Sequenz ID Nrn. 7 und 8) sind doppelsträngige DNA-Sequenzen und Aminosäuresequenzen von humanisierter LL2-VK bzw. LL2-VH gezeigt. Die Aminosäuresequenzen sind im Einbuchstabencode dargestellt, und CDR-Aminosäuresequenzen sind in einem Kasten dargestellt.
  • Beispiel 4
  • Konstruktion, Expression und Reinigung von chimären LL2-Antikörpern
  • Fragmente, die die VK- und VH-Sequenzen von LL2 zusammen mit den Promotor- und Signalpeptidsequenzen enthalten, wurden aus LL2VKpBR bzw. LL2VHpBS durch doppelten Restriktionsverdau mit HindIII und BamHI ausgeschnitten. Die VK-Fragmente von etwa 600 bp wurden in die HindIII/BamHI-Stelle des Säugetierexpressionsvektors, pKh, subkloniert (3A). pKh ist ein pSVhyg-basierender Expressionsvektor, der die genomische Sequenz der humanen Kappa-konstanten Region, ein Ig-Enhancer, ein Kappa-Enhancer und das Hygromycinresistenzgen enthält. Entsprechend wurden VH-Fragmente von von ca. 800 bp in die entsprechende HindIII/BamHI-Stelle von pG1g subkloniert (3B), einem pSVgpt-basierenden Expressionsvektor, der die genomische Sequenz von der humanen IgG1-konstanten Region, einen Ig-Enhancer und das Xanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase(gpt)-Gen trägt. Die finalen Expressionsvektoren werden als LL2pKh bzw. LL2pG1g bezeichnet.
  • Die beiden Plasmide wurden in SP2/0-Ag14-Zellen durch Elektroporation kotransfiziert und auf Hygromycinresistenz selektiert. Die Überstände aus Kolonien, die die Selektion überlebten, wurden auf die Sekretion von chimären Antikörpern mittels ELISA-Assay überprüft (siehe oben). Die Transfektionseffizienz war ungefähr 1–10 × 106 Zellen. Es wurde festgestellt, dass das Niveau der Antikörperexpression in einer Endkultur in einem Bereich von > 0,10 bis 2,5 μg/ml variiert.
  • 7 zeigt die Ergebnisse der Analyse von Protein-A-gereinigtem mLL2 (Spuren 4 und 7) und cLL2 (Spuren 5 und 8) durch SDS-PAGE unter reduzierenden bzw. nicht-reduzierenden Bedingungen. HMW steht für „high molecular weight"-Proteinmarker, und LMW für „light molecular weight"-Marker. Die leichten Ketten für sowohl mLL2 als auch cLL2 (Spuren 4 und 5) migrieren hauptsächlich als Doppelbande mit einem apparenten Molekulargewicht, das höher ist als erwartet. Da bekannt ist, dass die humane Kappa-konstante Region von cLL2 keine potenzielle Glykosylierungsstelle enthält, kann daraus geschlossen werden, dass die potenzielle Glykosylierungsstelle, die in der FR1-Region der LL2-VK-Domäne identifiziert wurde, verwendet wurde.
  • 8 zeigt die Ergebnisse der Analyse verschiedener Versionen von hLL2- und cLL2-Antikörpern durch SDS-PAGE unter reduzierenden und nicht-reduzierenden Bedingungen. Wie zuvor sind LMW und HMW Molekulargewichtsmarker. Spuren 3 und 6 sind cLL2-Antikörper. Spuren 4 und 7 sind hLL2 mit sieben murinen FR-Resten in der VH-Domäne (hLL2-1). Die Spuren 5 und 8 sind hLL2 mit sechs murinen FR-Resten in der VH-Domäne (hLL2-2). Die humanisierten leichten Ketten migrieren schneller und eher als diskrete Banden verglichen mit den chimären leichten Ketten.
  • 9 zeigt das Ergebnis einer SDS-PAGE-Analyse für „mix-and-match"- und cLL2- und hLL2-Antikörper unter sowohl reduzierenden als auch nicht-reduzierenden Bedingungen. Die Spuren 1 und 2 sind Molekulargewichtsmarker. Die Spuren 3 und 7 sind cLL2. Die Spuren 4 und 8 sind „mix-and-match" mit einer humanisierten leichten und schweren Kette [(hL/cH)LL2]. Die Spuren 5 und 9 sind chimäre leichte und humanisierte schwere (Version 1)-Ketten [(cL/hH)LL2-1]. Die Spuren 6 und 10 sind chimäre leichte und eine humanisierte schwere (Version 2)-Ketten [(hL/cH)LL2-2]. Die humanisierte LL2-Version 1 enthält 7 murine FR-Reste in der VH-Domäne, während Version 2 6 murine FR-Reste in der VH-Domäne enthält. Es ist bemerkenswert, dass die Position der leichten Kette von (hL/cH)LL2 (Spur 4) sich von den anderen unterscheidet, was darauf hindeutet, dass dort keine Kohlenhydratanbringung an die humanisierte LL2 leichte Kette erfolgt.
  • Beispiel 5
  • Bindung von cLL2-Antikörpern an Oberflächenantigene von Raji-Zellen
  • Ein kompetitiver Zellbindungsassay wurde durchgeführt, um die Immunreaktivität von cLL2 relativ zu dem parentalen mLL2 zu bewerten. Unter Verwendung von 131I-markiertem mLL2 (0,025 μg/ml) als Sonde wurden Raji-Zellen mit den Antikörpern inkubiert und die relative Bindung an Zellen wurde aus dem Anteil von zellgebundenem markiertem mLL2 bestimmt (siehe oben). wie durch die kompetitiven Assays, die in 10 beschrieben sind, gezeigt, wiesen sowohl der mLL2- als auch der cLL2-Antikörper vergleichbare Bindungsaktivitäten auf.
  • Die Ergebnisse wurden durch einen zweiten Kompetitionsassay. basierend auf Durchflusszytometrie, bestätigt. Kurz gesagt, unter Verwendung von Raji-Zellen, wie zuvor, und der Variierung der Konzentration von einem der Antikörper relativ zu dem anderen, wie zuvor, wurde die Menge von gebundenem mLL2 oder cLL2 mit FITC-markiertem Anti-Maus-Fc- oder Anti-humanen-Fc-Antikörper gefolgt durch eine Analyse unter Verwendung der Durchflusszytometrie bestimmt.
  • Beispiel 6
  • Bindung von hLL2-Antikörpern an Raji-Zellen
  • In Experimenten, die denen aus Beispiel 5 entsprechen, wurden die Antigenbindeaffinitäten der drei verschiedenen Kom binationen von „mix-and-match"- oder humanisiertem LL2 mit denen von cLL2 in dem Durchflusszytometrieassay verglichen.
  • Kurz gesagt wurde 1 μg von cLL2-, „mix-and match"-LL2-, hLL2-1- oder hLL2-2-Antikörpern mit 108 Raji-Zellen in Gegenwart von variierenden Konzentrationen von mLL2-F(ab')2-Fragmenten (als Kompetitor) in einem Endvolumen von 100 μl von PBS-Puffer, versetzt mit 1% FCS und 0,01% Natriumazid, inkubiert. Die Mischung wurde für 30 Minuten bei 4°C inkubiert und dreimal mit PBS gewaschen, um ungebundene Antikörper zu entfernen. Unter Ausnutzung der Gegenwart von humanen Fc-Anteilen in den Antikörpern wurden die Bindungsspiegel der Antikörper durch Zugabe eines 20 × verdünnten FITC-markierten Ziege-anti-humanem-IgG1, Fc-Fragment-spezifischen Antikörpern (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) bewertet. Die Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen und die Fluoreszenzintensitäten wurden durch einen FACSCAN-Fluoreszenz-aktivierten Zellsorter (Becton-Dickinson, Bedford, MA) gemessen. Die Ergebnisse sind in 11A gezeigt.
  • Unter Verwendung der gleichen Methoden wurde cLL2 mit zwei Versionen von hLL2 verglichen (11B).
  • Die Ergebnisse, die in den 11A und B gezeigt sind, demonstrieren, dass die Immunreaktivität von cLL2 ähnlich oder identisch ist mit der von humanisierten oder „mix-and-match"-Antikörpern. In Zusammenschau mit dem Vergleich von cLL2 mit mLL2 (10) wurde die Authentizität der Sequenzen für den erhaltenen chimären und humanisierten VK und VH etabliert und die Funktionalität von cLL2 und hLL2 bestätigt.
  • Beispiel 7
  • Internalisierung von mLL2 und cLL2 durch Raji-Zellen
  • Eine der einzigartigen Eigenschaften des LL2-Antikörpers ist dessen rasche Internalisierung nach der Bindung an Raji-Zellen (Shih et al., 1994, oben). Muriner LL2 wird nach der Internalisierung wahrscheinlich rasch zu dem Golgi-Apparat und von dort zu den Lysosomen, der Organelle, die für die Degration einer großen Vielfalt von Biochemikalien verantwortlich ist (Keisari et al., Immunochem., 10: 565 (1973)), transferiert.
  • Die Raten der Antikörperinternalisierung wurden gemäß Opresko et al., 1987, oben, bestimmt. Das Verhältnis von CPMintrazellulär/CPMOberfläche wurde als Funktion der Zeit bestimmt.
  • Die Raten der LL2-Antikörperinternalisierung wurde durch Inkubation von radiomarkiertem LL2-Antikörper (1 × 106 cpm) mit 0,5 × 106 Raju-Zellen in 0,5 ml von DMEM-Puffer enthaltend 1% humanes Serum für 2 h bei 4°C bestimmt. Überschüssiges humanes Serum wurde einbezogen, um die Fc-Rezeptoren auf der Oberfläche von Raji-Zellen abzusättigen, um nicht-Antigen-spezifische Internalisierung, die durch die Fc-Rezeptoren vermittelt wird, auszuschließen oder zu minimieren. Ungebundene radiomarkierte LL2-Antikörper wurden von den Zellen durch dreimaliges Waschen mit 0,5 ml-Anteilen von DMEM bei 4°C entfernt. Die Zellen wurden dann bei 37°C inkubiert und, zu zeitlich abgestimmten Intervallen, wurden Aliqote der Zellsuspension auf Eis transferiert, um die Internalisierung zu stoppen. Die Zellen in diesen Aliquoten wurden durch Zentrifugation bei 1000 × g für 5 min bei 4°C isoliert und oberflächengebundener radiomarkierter LL2 wurde von den Zellen mit 1 ml von 0,1 M Glycinacetatpuffer, pH 3, für 8 min bei 4°C abgelöst. Die so erhaltene Radioaktivität (CPM Oberfläche) und die in den Zellen verbleibende Radioaktivität (CPM intrazellulär) wurden bestimmt. Die Raten der Internalisierung wurden aus der Neigung der Kurve der Verhältnisse von Radioaktivität intrazellulär : Oberfläche als Funktion der Zeit berechnet.
  • Wie in 12 gezeigt, wurden die mLL2-, cLL2-, cLL2Q- und hLL2-Antikörper mit vergleichbaren Raten internalisiert (Ke = 0,107 (mLL2) bis 0,1221 (cLL2Q, NVT-nach-QVT-Mutation). Diese Zahlen deuten darauf hin, dass ungefähr 50% des oberflächengebundenen Antikörpers in 10 min internalisiert werden können. Die Ergebnisse zeigen, dass weder die Chimärisierung, die Humanisierung noch die Deglykosylierung durch Mutagenese von mLL2-Antikörpern die Raten der Internalisierung beeinträchtigen.
  • Die Muster der Internalisierung für mLL2, cLL2 und hLL2 wurde ferner über Fluoreszenzmikroskopie über die Zeit hinweg unter Verwendung einer FITC-markierten zweiten Antikörpersonde, wie in der Beschreibung beschrieben, verfolgt. Die Internalisierung von beiden Antikörpern wurde zum frühesten messbaren Zeitpunkt beobachtet. Nach 5 Minuten wurden die Antikörper sowohl auf der Zelloberfläche als auch internalisiert in Bereiche, die unmittelbar an der Membran als cytoplasmatische Mikrovesikel anliegen, gesehen. Nach 15 min nach der Inkubation beginnen die feinen Punkte, die um die Intramembran herum verteilt sind, in eine Gruppe von Körnchen an Orten zu verschmelzen, von denen angenommen wird, dass diese dem Golgi-Apparat entsprechen. Nachdem nach 30 min mehr Antikörper internalisiert wurden, wurde die Rückverteilung der gruppierten Antikörper in diffuse Lokalisierungen, wahrscheinlich in die Lysosomen, in denen die Antikörper degradiert werden, beobachtet. 2 h nach der Inkubation wurden die meisten der Antikörper innerhalb der Zelle gefunden. Eine starke Oberflächenfärbung wurde nur dann beobachtet, wenn der LL2 für 20 min auf Eis inkubiert wurde. Sowohl mLL2 als auch cLL2 wurden mit einem vergleichbaren Muster internalisiert. Die Internalisierung von LL2 war spezifisch mit der Antigen-Antikörper-Bindung assoziiert, da der irrelevante humanisierte Kontrollantikörper lediglich eine schwache Oberflächenfärbung demonstrierte.
  • Der A103-Antikörper (ein IgG2a-Antikörper, der an die Oberfläche sämtlicher humaner Epithelzellen bindet, jedoch nicht effizient internalisiert (Mattes et al., Hybridoma, 2: 253 (1983)), zeigte eine starke Membranfärbung nach bis zu 2 h, während der Anti-Transferin-Rezeptor-Antikörper (5F9) rasch internalisiert, wie dies auch LL2 tat.
  • Beispiel 8
  • Die Rolle der Glycosylierungsstelle in der FR1-Region der LL2-VK-Sequenz
  • Von besonderem erfinderischem Interesse ist die Identifizierung der Asn-Glykosylierungsstelle an Position 18 bis 20 innerhalb der FR1-Region der Sequenz der LL2-NVT-leichen Kette (4A, SEQ ID Nr. 2). Wie oben gezeigt, weist die SDS-PAGE-Analyse unter reduzierenden Bedingungen darauf hin, dass die Asn-Glykosylierungsstelle zur Anbringung von Kohlenhydraten verwendet wird.
  • In diesem Beispiel wurde der Einfluss des Kohlenhydratteils an Position 18 bis 20 auf die funktionellen Aktivitäten der leichten Ketten untersucht.
  • Die murinen und chimären LL2-leichten-Ketten wurden mit (+) oder ohne (–) Endoglykosidase F auf konventionelle Art und Weise behandelt, und die Antikörperprodukte wurden mittels SDS-PAGE unter reduzierenden und nicht-reduzierenden Bedingungen untersucht (13). Die Antikörpertypen haben sich in ihrem elektrophoretischen Verhalten nicht unterschieden. In beiden Fällen reduzierte die Deglykosylierung die Migrationsrate der leichten Kette.
  • Der Effekt der Deglykosylierung auf die Bindeaktivität des mLL2-Antikörpers an Raji-Zellen ist in 14 gezeigt. Die Entfernung des Kohlenhydrates durch Endoglykosidase F hatte keinen Einfluss auf die Bindeaktivität.
  • An Position 18 der leichten Kette wurde eine Mutation eingebracht, so dass Asn durch Gln ersetzt wurde, um LL2Q-VK-FR1 herzustellen. SDS-PAGE-Analysen demonstrierten, dass die NVT-nach-QVT-Mutation die Glykosylierung des Antikörpers aufhob. Der Vergleich der Raji-Zell-Bindeaffinität von cLL2 mit oder ohne der Leichte-Kette-VK-Glykosylierung demonstrierte, dass der Kohlenhydratteil ohne Einfluss auf die Bindung des Antikörpers an diese Zellen war.
  • Es kann schlussgefolgert werden, dass das Vorhandensein der Kohlenhydratstelle in der variablen Region die Immunreaktivität des Antikörpers nicht beeinflusst. Computermodellstudien deuten darauf hin, dass der VK-Kohlenhydrat-Teil in dem LL2 von den CDRs entfernt positioniert ist und eine „Kappe" über die unteren Schleifen der FR-assoziierten β-Fässer, die die CDRs tragen, ausbildet.
  • Die Humanisierung ohne den Einschluss der ursprünglichen Glykosylierungsstelle resultierte in einem CDR-aufgepfropften LL2-Antikörper mit einer Immunreaktivität, die vergleichbar ist mit jener von dessen murinen Gegenstück.
  • Diese Eigenschaften weisen darauf hin, dass die Glykosylierungsstelle dazu verwendet werden kann, um therapeutische oder diagnostische Agenzien mit dem LL2 zu konjugieren, ohne die Fähigkeit des Antikörpers zu gefährden, B-Lymphome oder Leukämiezellen zu binden und in diese zu internalisieren.
  • Beispiel 9
  • Konjugation von LL2 an dessen Kohlenhydrat-tragende Stelle
  • Die ersichtlich fehlende Involvierung des Kohlenhydratteils der variablen Region in die funktionellen Aktivitäten von mLL2-, cLL2- und hLL2-mAbs deuten darauf hin, dass dieser Teil nutzbringend als Anbringungsstelle für cytotoxische oder Detektionsagenzien, wie bspw. Radionuclide oder Toxine, verwendet werden kann, und dadurch potenzielle Interferenzen mit der Bindung des Konjugates an eine Zelloberfläche vermieden werden können.
  • Unter Verwendung von Verfahren, die in Shih et al., U.S.-Patent Nr. 5,057,313 (das durch Inbezugnahme inkorporiert ist), wurde zur Herstellung von Antikörperkonjugaten über einen oxi dierten Kohlenhydratteil des Antikörpers und eine primäre Alkylaminogruppe eines polymeren Trägers, an dem kovalent ein oder mehrere einer Vielfalt von Medikamenten, Toxinen, Chelatoren und detektierbaren Markern gebunden ist, ein Doxorubicin-Dextran-LL2-Antikörper-Fragment ohne angebrachte Glycane hergestellt, das mehrere Kopien des Medikamentes enthielt. Die involvierten Kohlenhydratteile der cLL2-VK-FR1-Region waren jene, die kovalent an die Asn-Glykosylierungsstelle gebunden waren.
  • In einer Synthese wurde Dextran (18–40 kDa) in ein Aminodextran durch Oxidation des Dextrans mit NaIO4, einer Schiff'schen Basenbildung mit NH2-CH2-CHOH-CH2-NH2, und einer Reduktion mit NaBH4, konvertiert. Das Aminodextran wurde dann mit Dexorubicin (DOX) in Gegenwart von Bernsteinanhydrid und 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid kondensiert, um DOX-Aminodextran herzustellen. Das letztere wurde dann mit einer Aldehydgruppe von LL2-VK-FR1 kondensiert, die durch Oxidation des Kohlenhydratteils des Antikörperfragmentes mit NaIO4 hergestellt wurde.
  • In einer Präparation von DOX-LL2 war die Anzahl von Molen von DOX, die an das Dextran angebracht waren, 14 Mol pro Mol Dextran, und die Anzahl von Molen von Doxorubicin pro Mol F(ab')2 war 8,9. Die Immunreaktivität in dem obigen Raji-Zell-Bindeassay lag bei etwa 80% der Kontrollwerte.
  • Dieses Konjugationssystem ist nicht auf den mLL2-Antikörper beschränkt. In einer vergleichenden Studie wurden 15–19 Mole von DOX/mol von cLL2 gebunden.
  • Die Konjugationsmöglichkeiten sind nicht auf die Verwendung eines Trägerdextrans wie in dem obigen Beispiel beschränkt. Bspw. kann der Kohlenhydratteil der LL2-VK-FR1-Region oxidiert werden, um Aldehydgruppen herzustellen. Diese wiederum können mit einer Aminogruppe an einem beliebigen Medikament reagieren, um eine Schiff'sche Base herzustellen, die nach der Reduktion multiple Kopien des Medikamentes liefert, die stabil mit dem Antikörper über Alkylamingruppen verbunden sind.
  • Wenn es sich bei dem Medikament bspw. um Aminohexyl-DTPA handelt (ein chelierendes Agens), wird ein LL2 hergestellt, der kovalent an einen Chelator gebunden ist. Der Chelator kann dazu verwendet werden, um in Zielgewebe bspw. ein Radionuclid oder ein paramagnetisches Metallion mit einem Potenzial für diagnostische oder therapeutische Verwendungen zu bringen. Es wurden DTPA-LL2-Konjugate hergestellt, die 5,5 mol des Chelators/mol von Antikörper enthielten, die wiederum 47,3% von Y-90 und 97,4% In-111 chelierten.
  • Es wird betont, dass die oben beschriebenen Beispiele lediglich verschiedene spezifische Ausführungsformen der Erfindung beschreiben, und dass die Anmelder nicht beabsichtigen, durch diese spezifischen Beispiele den Umfang der Ansprüche zu begrenzen.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00470001
  • Figure 00480001
  • Figure 00490001
  • Figure 00500001
  • Figure 00510001
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  • Figure 00550001

Claims (22)

  1. Isoliertes Polynucleotid codierend die Aminosäuresequenz einer variablen Region einer schweren Kette eines gegen Lymphom/Leukämie-Zellen (LL2) gerichteten monoklonalen Antikörpers (mAb), das Folgendes aufweist: i) die komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDRs) der schweren Kette eines Maus-LL2 (mLL2), wobei CDR1 die Aminosäuren 31 bis 35 von SEQ ID Nr. 4, CDR2 die Aminosäuren 50 bis 66 von SEQ ID Nr. 4 und CDR3 99 bis 105 von SEQ ID Nr. 4 aufweist, wobei der LL2-mAb die Immunreaktivität des mLL2 beibehält; und ii) Gerüstregionen (FRs) einer variablen Region einer schweren Kette von zumindest einem humanen Antikörper; wobei der LL2-mAb die Immunreaktivität von mLL2 beibehält.
  2. Isoliertes Polynucleotid nach Anspruch 1 codierend die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 8 oder 9.
  3. Isoliertes Polynucleotid nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, das die Nucleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 7 aufweist.
  4. Isoliertes Polynucleotid codierend die Aminosäuresequenz einer variablen Region einer leichten Kette eines gegen Lymphom/Leukämie-Zellen (LL2) gerichteten monoklonalen Antikörpers (mAb); das Folgendes aufweist: i) die komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDRs) der leichten Kette eines Maus-LL2 (mLL2) mAb, wobei CDR1 die Aminosäuren 24 bis 40 von SEQ ID Nr. 2, CDR2 die Aminosäuren 56 bis 62 von SEQ ID Nr. 2 und CDR3 95 bis 102 von SEQ ID Nr. 2 aufweist; und iii) Gerüstregionen (FRs) einer variablen Region einer leichten Kette von zumindest einem humanen Antikörper; wobei der LL2-mAb die Immunreaktivität von mLL2 beibehält.
  5. Isoliertes Polynucleotid nach Anspruch 4 codierend die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 6.
  6. Isoliertes Polynucleotid nach Anspruch 4 oder Anspruch 5, das die Nucleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 5 aufweist.
  7. Isoliertes Polynucleotid, das ein Polynucleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 und ein Polynucleotid gemäß einem der Ansprüche 4 bis 6 aufweist.
  8. Expressionsvektor, der ein Polynucleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 aufweist.
  9. Wirtszelle, die ein Polynucleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 aufweist.
  10. Wirtszelle nach Anspruch 9, wobei die Zelle eine Säugetierzelle ist.
  11. Wirtszelle nach Anspruch 10, wobei die Säugetierzelle eine Myelomzelle ist.
  12. Verfahren zur Expression einer variablen Region einer schweren Kette eines LL2-monoklonalen Antikörpers (mAb), das Folgendes aufweist: (a) Transfizieren einer Säugetierzelle mit einem Polynucleotid, das ein Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 aufweist; und (b) Kultivieren der Zelle, die die variable Region der schweren Kette eines LL2-mAb oder des Fragmentes davon sekretiert.
  13. Verfahren zur Expression einer variablen Region einer leichten Kette eines LL2-monoklonalen Antikörpers (mAb), das Folgendes aufweist: (a) Transfizieren einer Säugetierzelle mit einem Polynucleotid, das ein Polynucleotid nach einem der Ansprüche 4 bis 6 aufweist; und (b) Kultivieren der Zelle, die die variable Region der schweren Kette eines LL2-mAb oder des Fragmentes davon sekretiert.
  14. Verfahren zur Expression eines LL2-monoklonalen Antikörpers (mAb), das Folgendes aufweist: (a) Transfizieren einer Säugetierzelle mit einem Polynucleotid, das ein Polynucleotid nach Anspruch 7 aufweist; und (b) Kultivieren der Zelle, die den LL2-mAb oder das Fragment davon sekretiert.
  15. Schwere Kette eines LL2-monoklonalen Antikörpers (mAb), die eine variable Region aufweist, die von einem Polynucleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 codiert ist.
  16. Leichte Kette eines LL2-monoklonalen Antikörpers (mAb), die eine variable Region aufweist, die von einem Polynucleotid gemäß einem der Ansprüche 4 bis 6 codiert ist.
  17. LL2-monoklonaler Antikörper (mAb) oder ein Antigenbindefragment davon, der bzw. das eine schwere Kette eines LL2-monoklonalen Antikörpers (mAb) gemäß Anspruch 15 und eine leichte Kette eines LL2-monoklonalen Antikörpers gemäß Anspruch 16 aufweist.
  18. Diagnostisches oder therapeutisches Konjugat, das zielgerichtet ist gegen eine B-Lymphomzelle und eine Leukämiezelle, und das den LL2-mAb nach Anspruch 17 aufweist, der an die Zellen bindet, wobei der LL2-mAb oder das Fragment davon an ein diagnostisches oder therapeutisches Reagens gebunden ist.
  19. Konjugat nach Anspruch 18, wobei das diagnostische oder therapeutische Reagens ein chemotherapeutisches Medikament aufweist, wie z.B. Doxorubicin, Methothrexat, Taxol, einen detektierbaren Marker, wie z.B. ein fluoreszierendes Molekül, oder ein cytotoxisches Agens, wie z.B. ein Schwermetall, ein Radionuclid oder ein Toxin, wie z.B. Pseudomonas-Exotoxin.
  20. Konjugat nach Anspruch 18, wobei das Agens an den mAb oder das Fragment davon mittels eines Kohlenhydratteils des mAb oder Fragments davon gebunden ist.
  21. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 17 oder Konjugat gemäß einem der Ansprüche 18 bis 20 zur therapeutischen Verwendung.
  22. Verwendung eines monoklonalen Antikörpers gemäß Anspruch 17 oder eines Konjugates gemäß einem der Ansprüche 18 bis 20 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Diagnose oder Behandlung eines B-Zell-Lymphoms oder einer Lymphom/Leukämie.
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