ES2426817T3 - Regiones Fc variantes - Google Patents

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ES2426817T3 ES08163100T ES08163100T ES2426817T3 ES 2426817 T3 ES2426817 T3 ES 2426817T3 ES 08163100 T ES08163100 T ES 08163100T ES 08163100 T ES08163100 T ES 08163100T ES 2426817 T3 ES2426817 T3 ES 2426817T3
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Weidong Jiang
Ying Tang
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MENTRIK BIOTECH LLC
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Abstract

Anticuerpo monoclonal que comprende una variante de una región Fc original,en el que la region Fc original es una región Fc de IgG1 humana, en el que la región Fc variante comprende sustituciones 247I/339Q en la región Fc, y presentandoel anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc variante ADCCpotenciada en comparación con el anticuerpo monoclonal que comprende la regiónFc original.

Description



REGIONES Fc VARIANTES de la invención La presente descripción se refiere a polipéptidos que comprenden una región Fc variante, novedosa. Específicamente, una región Fc variante, novedosa de la presente invención comprende al menos una sustitución de aminoácido descrita en el presente documento que confiere una función efectora alterada o semivida sé rica alterada a una inmunoglobulina que comprende la región Fc variante en comparación con la inmunoglobulina original que carece de esa sustitución de aminoácido. Además, la descripción proporciona un método para alterar una función efectora de un anticuerpo monoclonal o extender la semivida sé rica de un polipéptido al que se le une operativamente una región Fc variante de la invención. Se dan a conocer usos terapéuticos de polipéptidos, proteínas, particularmente anticuerpos monoclonales, que comprenden una región Fc variante de la invención.
Antecedentes de la invención
Hay al menos diecisiete anticuerpos monoclonales aprobados actualmente en los Estados Unidos para su uso como productos terapéuticos en seres humanos. Adicionalmente, hay varios cientos de anticuerpos monoclonales en ensayos clínicos y miles en pruebas preclínicas para el tratamiento de diversas enfermedades o trastornos incluyendo, por ejemplo, rechazo de trasplantes, cáncer, enfermedades inflamatorias, septicemia, nefritis, enfermedad de Alzheimer, alergias, diabetes, enfermedades autoinmunitarias, artritis, esclerosis múltiple y enfermedades infecciosas. El campo terapéutico de los anticuerpos monoclonales está posicionado para un rápido crecimiento en los próximos años. Tras las vacunas, los anticuerpos (o inmunoglobulinas, quot;Igquot;) constituyen el segundo tipo más común de agente biofarmacéutico que está sometiéndose a prueba clínicamente (Stockwin, L.H. et al. Biochemical Society Transactions, 31 :433-436,2003).
La ingeniería genética ha contribuido sustancialmente al crecimiento del campo de anticuerpos monoclonales terapéuticos. La eficacia de un posible anticuerpo monoclonal terapéutico variará a menudo con cambios modestos en la secuencia de proteína del anticuerpo. Un cambio de un único aminoácido en la región variable de un anticuerpo monoclonal tiene el potencial de alterar la afinidad con la que el anticuerpo se une al epítopo antigénico, así como propiedades del anticuerpo tales como la velocidad Kan O la velocidad Kaff. Tales cambios de aminoácidos pueden determinar el éxito o el fracaso de un anticuerpo monoclonal como agente terapéutico. De manera similar, cambios modestos en la secuencia de aminoácidos de la región Fc de un anticuerpo monoclonal pueden producir cambios profundos en las propiedades de función efectora del anticuerpo o la semivida de una proteína a la que está unida operativamente la región Fc.
La región Fc de un anticuerpo (es decir, los extremos carboxilo terminales de las cadenas pesadas de un anticuerpo que abarcan los dominios CH2, CH3 y una parte de la región bisagra (véase la figura 1)), tiene una variabilidad limitada y participa en efectuar los papeles fisiológicos desempeñados por el anticuerpo. Las funciones efectoras atribuibles a la región Fc de un anticuerpo varían con la clase y subclase de anticuerpo e incluyen (i) unión del anticuerpo mediante la región Fc a un receptor de Fc específico (UFcRquot;) sobre una célula que desencadena diversas respuestas biológicas incluyendo, por ejemplo, fagocitosis y destrucción de partículas recubiertas con anticuerpos, aclaramiento de complejos inmunitarios, liberación de mediadores inflamatorios, transferencia placentaria del anticuerpo y control de la producción de inmunoglobulinas, (ii) citotoxicidad dependiente del complemento (UCDCquot;) en la que la región Fc se une al componente C1q del complemento e inicia de ese modo la ruta clásica de activación del complemento que conduce a la lisis de la diana, (iii) citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (UADCCquot;) en la que determinadas células del sistema inmunitario humano, por ejemplo fagocitos y células NK, mediante un receptor Fcy, se unen a la región Fc de un anticuerpo mediante receptores de unión a anticuerpos específicos sobre las células inmunitarias y posteriormente señalizan la destrucción de la entidad a la que el anticuerpo esta unido y (iv) unión a mastocitos, basófilos y eosinófilos. La afinidad con la que una región Fc puede unirse a un FcR particular (por ejemplo, FcRn), o el nivel con el que una región Fc puede mediar en la activi
dad de CDC o ADCC son factores importantes para determinar la eficacia y semi
vida de proteínas terapéuticas, particularmente anticuerpos monoclonales.
La modificación particularizada de aminoácidos en la región Fc de IgG humana es
5
un área activa de estudio que produce información sobre la relación estructura
función relevante para el desarrollo de proteínas terapéuticas, particularmente an
ticuerpos monoclonales (véanse, por ejemplo, la patente estadounidense
6.1 65.745 y la publicación PCT n.o W02004/035752 referentes a la alteración de
la semivida sérica de un polipéptido operativamente unido a una región Fc y la pa
lO
tente estadounidense 6.737.056 y la publicación PCT n.o W02004/029207 refe
rentes a la alteración de una función efectora de un anticuerpo monoclonal que
comprende una región Fc modificada).
El desarrollo de proteínas terapéuticas novedosas, particularmente anticuerpos
15
monoclonales, se beneficiaría de la capacidad para diseñar racionalmente una re
gión Fc con modificaciones de aminoácidos particulares que confieren una pro
piedad beneficiosa deseada al anticuerpo de interés. No se esperaría que todos
los anticuerpos monoclonales mejorasen como agente terapéutico debido a la
misma modificación de aminoácido particular en la región Fc. Un anticuerpo mo
20
nocional terapéutico que se une a un antígeno diana puede beneficiarse de un
aumento en una función efectora particular mientras que un anticuerpo monoclo
nal terapéutico diferente que se une a un antígeno diana diferente puede benefi
ciarse de un aumento en una función efectora diferente, o incluso una disminu
ción. Un anticuerpo monoclonal terapéutico puede beneficiarse de la capacidad
25
para unirse a un receptor de Fc particular con mayor afinidad mientras que otro
anticuerpo puede mejorar como agente terapéutico uniéndose a ese receptor de
Fc a una afinidad inferior y por tanto aclarándose del cuerpo a una velocidad más
rápida. Además, una sustitución o modificación de aminoácido en una región Fc
particular y que da como resultado un efecto que beneficiaría a un anticuerpo te
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rapéutico puede depender de la diana antigénica a la que se une el anticuerpo y/o
la enfermedad o el trastorno que va a mejorarse por el anticuerpo.
Son necesarios métodos y composiciones que alteran funciones efectoras particu
lares asociadas con la región Fc de un anticuerpo para mejorar las propiedades
de anticuerpos terapéuticos existentes así como para generar anticuerpos terapéuticos novedosos con propiedades deseadas. Pueden usarse anticuerpos monocionales con regiones Fc variantes para tratar diversas enfermedades o trastornos incluyendo, por ejemplo, trastornos inflamatorios, cáncer, trastornos autoinmunitarios, trastornos de señalización celular y enfermedades infecciosas. Adicionalmente, métodos y composiciones que alteran la semivida sérica de una proteína terapéutica, o bien aumentando la semivida y de ese modo permitiendo menos dosis o bien disminuyendo la semivida y de ese modo permitiendo un aclaramiento más rápido del cuerpo, beneficiarían la generación de anticuerpos terapéuticos así como otras proteínas terapéuticas.
Lo que se necesita con el fin de mejorar la eficacia de una proteína terapéutica, particularmente un anticuerpo monoclonal, son regiones Fc variantes con propiedades mejoradas.
Sumario de la invención
El alcance de la invención está limitado por las reivindicaciones. La presente des
cripción proporciona regiones Fc variantes, es decir, regiones Fc que comprenden
una sustitución de aminoácido descrita en el presente documento (por ejemplo, véase la tabla 1), que confieren propiedades beneficiosas a los polipéptidos que comprenden dichas regiones Fc variantes.
Las posiciones de Fc de una región Fc original en las que puede hacerse cualquier sustitución de aminoácido para generar una región Fc variante incluyen las posiciones 279, 341, 343 Y 373 de la región Fc; en la que la numeración de los residuos, es decir, su número de posición, en la región Fc es la del índice de EU como en Kabat (véase la figura 2 en el presente documento). La presente descripción proporciona regiones Fc variantes que comprenden una sustitución de aminoácido en la posición 279, 341, 343 ó 373 de una región Fc original, o cualquier combinación de las mismas. La región Fc original puede tener opcionalmente residuos de aminoácido no nativos en posiciones distintas de 279, 341 , 343 Y
373. Los residuos de aminoácido nativos en estas posiciones para IgG humana son valina (279), glicina (341), prolina (343) y tirosina (373).
En realizaciones preferidas a lo largo de la presente descripción, el residuo de aminoácido que sustituye al presente en la región Fc original es un residuo de aminoácido que se produce de manera natural. A menos que se indique lo contra
rio, la región Fc original puede ser una región Fc nativa o no nativa, preferiblemente de origen humano o sustancialmente de origen humano. La secuencia de aminoácidos de la región Fc original es preferiblemente la mostrada en 8EO ID NO: 1, 2, 3 ó 4. Preferiblemente, la región Fc original tiene un residuo de aminoácido nativo presente en la posición que va a sustituirse para generar una región Fc variante. Además, en todas partes, se entiende que una región Fc variante es una región Fc original modificada para que comprenda al menos una sustitución de aminoácido tal como se describe en el presente documento. Adicionalmente, se entiende que una región Fc original puede ser una Fc de longitud completa o una parte de la misma que comprende el residuo de aminoácido que va a sustituirse para generar la región Fc variante. La presente descripción proporciona además polipéptidos, preferiblemente anticuerpos monoclonales, que comprenden una región Fc variante (o un fragmento funcional de la misma) que comprende al menos una sustitución de aminoácido en la posición 279, 341, 343 ó 373 en comparación con la región Fc original. La región Fc variante que comprende al menos una sustitución de aminoácido en la posición de Fc 279, 341, 343 ó 373 puede comprender además al menos una sustitución de aminoácido adicional en la región Fc en comparación con el residuo de aminoácido presente en la región Fc nativa del mismo tipo que la región Fc variante. En una realización, una región Fc variante (es decir, una variante de una región Fc original) comprende al menos 1, 2, 3 o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas de las siguientes: 235G, 235R, 236F, 236R, 236Y, 237K, 237N, 237R, 238E, 238G, 238H, 2381, 238L, 238V, 238W, 238Y, 244L, 245R, 247A, 2470, 247E, 247F, 247M, 247N, 2470, 247R, 2478, 247T, 247W, 247Y, 248F, 248P, 2480, 248W, 249L, 249M, 249N, 249P, 249Y, 251 H, 2511, 251W, 2540, 254E, 254F, 254G, 254H, 2541, 254K, 254L, 254M, 254N, 254P, 2540, 254R, 254V, 254W, 254Y, 255K, 255N, 256H, 2561, 256K, 256L, 256V, 256W, 256Y, 257 A, 2571, 257M, 257N, 2578, 2580, 2608, 262L, 2648, 265K, 2658, 267H, 2671, 267K, 268K, 269N, 2690, 271T, 272H, 272K, 272L, 272R, 279A, 2790,
279F, 279G, 279H, 2791, 279K, 279L, 279M, 279N, 2790, 279R, 2798, 279T,
279W, 279Y, 280T, 283F, 283G, 283H, 2831, 283K, 283L, 283M, 283P, 283R, 283T, 283W, 283Y, 285N, 286F, 288N, 288P, 292E, 292F, 292G, 2921, 292L, 293S, 293V, 301W, 304E, 307E, 307M, 312P, 315F, 315K, 315L, 315P, 315R, 316F, 316K, 317P, 317T, 318N, 318P, 318T, 332F, 332G, 332L, 332M, 332S,
332V, 332W, 3390, 339E, 339F, 339G, 339H, 3391, 339K, 339L, 339M, 339N, 339Q, 339R, 339S, 339W, 339Y, 341 0, 341E, 341F, 341 H, 3411, 341K, 341L, 341M, 341N, 341P, 341Q, 341R, 341S, 341T, 341V, 341W, 341Y, 343A, 3430, 343E, 343F, 343G, 343H, 3431, 343K, 343L, 343M, 343N, 343Q, 343R, 343S, 343T, 343V, 343W, 343Y, 3730, 373E, 373F, 373G, 373H, 3731, 373K, 373L, 373M, 373N, 373Q, 373R, 373S, 373T, 373V, 373W, 375R, 376E, 376F, 376G, 376H, 3761, 376L, 376M, 376N, 376P, 376Q, 376R, 376S, 376T, 376V, 376W, 376Y, 377G, 377K, 377P, 378N, 379N, 379Q, 379S, 379T, 3800, 380N, 380S, 380T, 3820, 382F, 382H, 3821, 382K, 382L, 382M, 382N, 382P, 382Q, 382R, 382S, 382T, 382V, 382W, 382Y, 385E, 385P, 386K, 423N, 424H, 424M, 424V, 4260, 426L, 427N, 429A, 429F, 429M, 430A, 4300, 430F, 430G, 430H, 4301, 430K, 430L, 430M, 430N, 430P, 430Q, 430R, 430S, 430T, 430V, 430W, 430Y, 431 H, 431 K, 431P, 432R, 432S, 438G, 438K, 438L, 438T, 438W, 439E, 439H, 439Q, 4400, 440E, 440F, 440G, 440H, 4401, 440K, 440L, 440M, 440Q, 440T, 440V o 442K.
En una realización preferida, una región Fc variante comprende al menos 1, 2, 3 o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas de las siguientes: 235G, 236F, 236R, 236Y, 237K, 237N, 237R, 238E, 238G, 238H, 2381, 238L, 238V, 238W, 238Y, 245R, 247A, 2470, 247E, 247F, 247M, 247N, 247Q, 247R, 247T, 247W, 247Y, 248F, 248P, 248Q, 248W, 249L, 249M, 249N, 249P, 249Y, 251 H, 2511, 251W, 2540, 254E, 254F, 254G, 254H, 2541, 254K, 254L, 254M, 254N, 254P, 254Q, 254R, 254V, 254W, 254Y, 255K, 255N, 256H, 2561, 256K, 256L, 256W, 257A, 2571, 257M, 257N, 257S, 2580, 260S, 262L, 264S, 265K, 265S, 267H, 2671, 267K, 268K, 269N, 269Q, 271T, 272H, 272K, 272R, 279A, 2790, 279G, 279H, 279N, 279Q, 279S, 279T, 279W, 279Y, 280T, 283F, 283H, 283K, 283M, 283R, 283W, 285N, 286F, 288N, 288P, 292E, 292G, 2921, 301W, 304E, 307E, 307M, 312P, 315F, 315L, 315P, 316F, 317P, 317T, 318N, 318P, 318T, 332L, 332M, 332R, 332S, 332W, 3390, 339F, 3391, 339K, 339M, 339N, 339Q, 339R, 339S, 339W, 339Y, 3410, 341E, 341F, 341H, 3411, 341K, 341L, 341M, 341N,
341P, 341Q, 341R, 341S, 341T, 341V, 341W, 341Y, 3430, 343E, 343G, 343H,
343K, 343N, 3430, 343R, 343S, 343T, 343W, 343Y, 3730, 373E, 373G, 373H, 3731, 373K, 373L, 373M, 3730, 373R, 373S, 373T, 373W, 375R, 376G, 376N, 376P, 3760, 376R, 376S, 376T, 376V, 376W, 376Y, 377G, 377K, 377P, 3780, 378N, 379N, 3790, 379T, 380N, 380S, 380T, 3820, 382F, 3821, 382K, 382L, 3820, 382R, 382S, 382T, 382V, 382W, 382Y, 385E, 386K, 423N, 424H, 424M, 424V, 4260, 426L, 427N, 429A, 429F, 429M, 430A, 4300, 430F, 430G, 430H, 4301, 430K, 430L, 430M, 430N, 430P, 4300, 430R, 430S, 430T, 430V, 430W, 430Y, 431H, 431K, 431P, 432R, 432S, 438K, 438L, 438T, 438W, 439E, 4400, 4401 o 440L. Las regiones Fc variantes se caracterizan preferiblemente usando uno o más de los métodos experimentales descritos en el presente documento. Tales regiones Fc variantes confieren una función efectora alterada o una semivida sé rica alterada a un anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc variante o una semivida sérica alterada a un polipéptido al que la región Fc variante está operativamente unida. Preferiblemente, la región Fc original de una región Fc variante de la invención es una región Fc nativa o codificada por la línea germinal de origen humano seleccionada del grupo que consiste en IgG, IgA, IgE, IgM e IgO o una variante polimórfica de la misma, o un fragmento funcional de la misma. Preferiblemente, la región Fc original es una región Fc de IgG, y más preferiblemente, una región Fc de IgG1, IgG3 o IgG4. La región Fc original puede comprender opcionalmente una
o más sustituciones de aminoácidos adicionales en comparación con la región Fc nativa, distintas de las ya descritas en el presente documento (es decir, las sustituciones enumeradas en la tabla 1), particularmente una o más sustituciones de aminoácidos conocidas en la técnica o descritas en las patentes estadounidenses
6.165.745 o 6.737.056; o las publicaciones PCT n.os W02004/035752 o W02004/029207; tal(es) sustitución/sustituciones de aminoácidos, si está(n) presente(s) en la región Fc original, entonces estarían también presentes en la región Fc variante y en un polipéptido que comprende una región Fc variante, a menos que esté en una posición posteriormente sustituida para generar la región Fc variante. En una realización preferida, un anticuerpo monoclonal que comprende una región Fc variante es un anticuerpo quimérico. En una realización más preferida, un anticuerpo monoclonal que comprende una región Fc variante es un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano en el que la secuencia de entramado y la secuencia de región constante presentes en el anticuerpo son sustancialmente de origen humano. El anticuerpo quimérico, humanizado o humano es preferiblemente un anticuerpo de longitud completa o un anticuerpo de cadena sencilla. Cuando un anticuerpo monoclonal que comprende una región Fc variante va a usarse co
mo agente terapéutico en seres humanos, preferiblemente la región Fc es sustancialmente de origen humano.
Preferiblemente, un polipéptido que comprende, o está operativamente unido a, una región Fc variante (es decir, quot;polipéptido variantequot;) tiene al menos una sustitución de aminoácido en la región Fc variante en comparación con la región Fc original, y presenta una función efectora alterada o semivida sé rica alterada en comparación con la del polipéptido que comprende la región Fc original de dicha región Fc variante, en el que la quot;al menos una sustitución de aminoácido en la región Fc variantequot; es (i) cualquier sustitución de aminoácido en la posición 279, 341, 343 ó 373 de la región Fc o (ii) al menos una de las siguientes sustituciones de aminoácidos en la región Fc: 235G, 235R, 236F, 236R, 236Y, 237K, 237N, 237R, 238E, 238G, 238H, 2381, 238L, 238V, 238W, 238Y, 244L, 245R, 247A, 2470, 247E, 247F, 247M, 247N, 247Q, 247R, 247S, 247T, 247W, 247Y, 248F, 248P, 248Q, 248W, 249L, 249M, 249N, 249P, 249Y, 251 H, 2511, 251W, 2540, 254E, 254F, 254G, 254H, 2541, 254K, 254L, 254M, 254N, 254P, 254Q, 254R, 254V, 254W, 254Y, 255K, 255N, 256H, 2561, 256K, 256L, 256V, 256W, 256Y, 257A, 2571, 257M, 257N, 257S, 2580, 260S, 262L, 264S, 265K, 265S, 267H, 2671, 267K, 268K, 269N, 269Q, 271T, 272H, 272K, 272L, 272R, 279A, 2790, 279F, 279G, 279H, 2791, 279K, 279L, 279M, 279N, 279Q, 279R, 279S, 279T, 279W, 279Y, 280T, 283F, 283G, 283H, 2831, 283K, 283L, 283M, 283P, 283R, 283T, 283W, 283Y, 285N, 286F, 288N, 288P, 292E, 292F, 292G, 2921, 292L, 293S, 293V, 301W, 304E, 307E, 307M, 312P, 315F, 315K, 315L, 315P, 315R, 316F, 316K, 317P, 317T, 318N, 318P, 318T, 332F, 332G, 332L, 332M, 332S, 332V, 332W, 3390, 339E, 339F, 339G, 339H, 3391, 339K, 339L, 339M, 339N, 339Q, 339R, 339S, 339W, 339Y, 341 0, 341E, 341F, 341H, 3411, 341 K, 341L, 341M, 341N, 341P, 341Q, 341R, 341S, 341T, 341V, 341W, 341Y, 343A, 3430, 343E, 343F, 343G, 343H, 3431, 343K, 343L, 343M, 343N, 343Q, 343R, 343S, 343T, 343V, 343W, 343Y, 3730, 373E, 373F, 373G, 373H, 3731, 373K, 373L, 373M, 373N, 373Q, 373R, 373S, 373T, 373V, 373W, 375R, 376E, 376F, 376G, 376H, 3761, 376L, 376M, 376N, 376P, 3760, 376R, 376S, 376T, 376V, 376W, 376Y, 377G, 377K, 377P, 378N, 379N, 3790, 379S, 379T, 3800, 380N, 380S, 380T, 3820, 382F, 382H, 3821, 382K, 382L, 382M, 382N, 382P, 3820, 382R, 382S, 382T, 382V, 382W, 382Y, 385E, 385P, 386K, 423N, 424H, 424M, 424V, 4260, 426L, 427N, 429A, 429F, 429M, 430A, 4300, 430F, 430G, 430H, 4301, 430K, 430L, 430M, 430N, 430P, 4300, 430R, 430S, 430T, 430V, 430W, 430Y, 431H, 431K, 431P, 432R, 432S, 438G, 438K, 438L, 438T, 438W, 439E, 439H, 4390, 4400, 440E, 440F, 440G, 440H, 4401, 440K, 440L, 440M, 4400, 440T, 440V o 442K, o (iii) al menos dos sustituciones de aminoácidos enumeradas en (i)
o (ii) anteriormente, o (iv) al menos 1, 2 ó 3 sustituciones de aminoácidos enumeradas en (i) o (ii) anteriormente además de al menos una sustitución de aminoácido en la región Fc no enumerada en (i) o (ii) anteriormente. Preferiblemente, la función efectora alterada es un aumento en AOCC, una disminución en AOCC, un aumento en COC, una disminución en COC, un aumento en la afinidad de unión a C1q, una disminución en la afinidad de unión a C1q, un aumento en la afinidad de unión a FcR (preferiblemente FcRn) o una disminución en la afinidad de unión a FcR (preferiblemente FcRn) en comparación con dicho polipéptido que carece de la sustitución de aminoácido en la región Fc (es decir, región Fc original). La descripción proporciona un anticuerpo monoclonal que comprende una región Fc variante que comprende al menos una de las siguientes sustituciones de aminoácidos en la región Fc: 247A, 247F, 247M, 247T, 247V, 247Y, 249E, 249Y, 254F, 254M, 254Y, 256A, 2580, 279A, 283A, 2831, 283K, 283M, 283R, 288N, 292A, 311A, 3110, 311N, 311T, 311V, 311Y, 315L, 318N, 318P, 318T, 318V, 332T, 332V, 3390, 339F, 339G, 3391, 339K, 339M, 339N, 3390, 339R, 339S, 339T, 376A, 376V, 377G, 377K, 379N, 380N, 380S, 382A, 3821, 385E, 427N, 429M, 434W, 4361, 440G, 440H, 4401 o 440L, [preferiblemente 247A, 247F, 247M, 247T, 247V, 247Y, 254F, 254Y, 2580, 279A, 283M, 288N, 292A, 3110, 311N, 311T, 315L, 318N, 318P, 318T, 318V, 3390, 3391, 339K, 339M, 339N, 3390, 339R, 339S, 376A, 376V, 377K, 379N, 380N, 382A, 4401 o 440L], presentando el anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc variante AOCC potenciada en comparación con el anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc original. La descripción proporciona un anticuerpo monoclonal que comprende una región Fc variante que comprende al menos una de las siguientes sustituciones de aminoácidos en la región Fc: 2350, 235R, 235S, 236F, 236R, 236Y, 237E, 237K, 237N, 237R, 238E, 238G, 238H, 2381, 238L, 238V, 238W, 238Y, 247G, 247R, 249L, 249P, 250K, 250M, 250R, 251H, 2511, 251W, 252Y, 254L, 254P, 2540, 254T, 254V, 256V, 257 A, 2571, 257M, 257N, 257S, 257V, 260S, 262L, 264S, 265H, 265K, 265S, 267G, 267H, 2671, 267K, 269N, 2690, 270A, 270G, 270K, 270M, 270N, 271T, 272H, 272K, 272L, 272N, 272R, 2790, 279F, 279K, 279L, 279W, 2830, 283F, 283G, 283H, 283L, 283W, 283Y, 285N, 288P, 292E, 292F, 292G, 2921, 293S, 293V, 301W, 304E, 307A, 307E, 307M, 311 F, 3111, 311 K, 311S, 312P, 314F, 3141, 314V, 314W, 315F, 315P, 316F, 317P, 327T, 328V, 329Y, 332G, 332K, 332L, 332R, 332W, 3410, 341E, 341F, 341H, 341 1, 341K, 341L, 341M, 341N, 341P, 3410, 341R, 341S, 341T, 341W, 341Y, 343A, 3430, 343E, 343F, 343G, 343H, 343L, 343M, 343N, 3430, 343R, 343S, 343T, 343V, 343W, 343Y, 373A, 3730, 373E, 373F, 373G, 3731, 373K, 373L, 373M, 373N, 3730, 373R, 373S, 373T, 373V, 373W, 375R, 376A, 376E, 376F, 376G, 376H, 376W, 376Y, 3790, 3820, 382S, 430H, 430K, 430N, 4300, 430R, 430W, 432R, 432S, 4341, 4400, 440T, 440V o 442K, [preferiblemente 235R, 236F, 236Y, 237E, 237K, 237N, 237R, 238E, 238G, 238H, 2381, 238L, 238V, 238W, 238Y, 247R, 250K, 251 H, 254T, 2571, 257M, 257N, 257S, 257V, 265H, 265K, 265S, 267G, 267H, 2671, 267K, 269N, 2690, 270A, 270G, 270K, 270M, 270N, 271T, 272N, 272R, 288P, 292E, 301W, 304E, 316F, 317P, 327T, 328V, 329Y, 332K, 332R, 341F, 3411, 341M, 341P, 3410, 341R, 341T, 341W, 341Y, 343W, 373A, 373E, 373G, 373S, 376A, 376W, 432R o 432S], presentando el anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc variante actividad de AOCC disminuida en comparación con el anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc original.
La descripción proporciona un anticuerpo monoclonal que comprende una región Fc variante que comprende al menos una de las siguientes sustituciones de aminoácidos en la región Fc: 238L, 244L, 245R, 249P, 252Y, 256P, 257A, 2571, 257M, 257N, 257S, 257V, 2580, 260S, 262L, 270K, 272L, 272R, 279A, 2790, 279G, 279H, 279M, 279N, 2790, 279R, 279S, 279T, 279W, 279Y, 283A, 2830, 283F, 283G, 283H, 2831, 283K, 283L, 283N, 283P, 2830, 283R, 283S, 283T, 283W, 283Y, 285N, 286F, 288N, 288P, 293V, 307E, 307M, 311A, 3111, 311 K, 311L, 311M, 311V, 311W, 312P, 316K, 317P, 318N, 318T, 332F, 332H, 332K, 332L, 332M, 332R, 332S, 332W, 339N, 339T, 339W, 341P, 343E, 343H, 343K,
3430, 343R, 343T, 343Y, 375R, 376G, 3761, 376M, 376P, 376T, 376V, 377K,
3780, 378N, 380N, 3808, 380T, 382F, 382H, 3821, 382K, 382L, 382M, 382N, 382Q, 382R, 3828, 382T, 382V, 382W, 382Y, 423N, 427N, 430A, 430F, 430G, 430H, 4301, 430K, 430L, 430M, 430N, 430Q, 430R, 4308, 430T, 430V, 430Y, 431 H, 431 K, 434F, 434G, 434H, 434W, 434Y, 4361, 436L, 436T, 438K, 438L, 438T, 438W, 440K O 442K, [preferiblemente 245R, 252Y, 256P, 257A, 2571, 257M, 257N, 2578, 257V, 2580, 2608, 262L, 279A, 2790, 279G, 279H, 279N, 279Q, 2798, 279T, 279W, 279Y, 283F, 283H, 283K, 283R, 285N, 286F, 307E, 307M, 3111, 311K, 311L, 311M, 312P, 318N, 318T, 3328, 339W, 343E, 343H, 343K, 343Q, 343R, 375R, 377K, 3780, 378N, 3808, 380T, 382F, 382K, 382Q, 382R, 3828, 382T, 382V, 382W, 382Y, 423N, 427N, 430A, 430F, 430H, 4301, 430L, 430M, 430N, 430Q, 430R, 4308, 430V, 430Y, 431H, 431 K, 434F. 434G, 434H, 434W, 434Y, 4361, 436L, 438K, 438L o 438W] presentando el anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc variante afinidad de unión a FcRn potenciada en comparación con el anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc original. La descripción proporciona un anticuerpo monoclonal que comprende una región Fc variante que comprende al menos una de las siguientes sustituciones de aminoácidos en la región Fc: 235Q, 236Y, 237K, 237R, 238E, 238G, 238H, 238W, 247A, 2470, 247E, 247F, 247G, 247H, 2471, 247L, 247M, 247N, 247Q, 247R, 2478, 247W, 247Y, 248A, 248F, 248P, 248Q, 248W, 249E, 249L, 249M, 249Y, 251F, 251 H, 251 1, 251W, 2540, 254E, 254F, 254G, 254H, 2541, 254K, 254L, 254M, 254N, 254P, 254Q, 254R, 254T, 254V, 254W, 254Y, 255K, 255N, 256F, 256H, 2561, 256K, 256M, 256R, 256W, 256Y, 2648, 2658, 265Y, 267G, 2671, 2680, 268K, 270A, 270M, 2791, 279K, 279L, 280T, 292E, 292F, 292G, 2921, 292L, 3110, 311E, 311F, 311G, 311N, 311R, 311Y, 315F, 315K, 315P, 316F, 317T, 326W, 327T, 339E, 339G, 339L, 339R, 341 0, 341E, 341 F, 3411, 341K, 341L, 341M, 341N, 341Q, 341R, 3418, 341T, 341V, 341W, 341Y, 343M, 343V, 343W, 373A, 3730, 373G, 373K, 373L, 373M, 373N, 373Q, 3738, 373T, 373V, 373W, 376H, 376L, 376W, 376Y, 424M, 424V, 4260, 429A, 429F, 429M, 4300, 430W, 431 P, 432R, 4328, 439Q, 440A, 4400, 440E, 440F o 440M, [preferiblemente 237R, 2470, 247E, 247F, 247H, 2471, 247L, 247M, 247N, 247Q, 247W, 247Y, 248A, 248F, 248P, 248Q, 248W, 249L, 249M, 249Y, 251H, 2511, 251W, 2540, 254E, 254F, 254G, 254H, 2541, 254K, 254M, 254N, 254P, 254Q, 254R, 254T,
254V, 254W, 254Y, 255K, 255N, 256F, 256H, 256K, 256M, 256R, 256W, 265Y,
280T, 292G, 2921, 3110, 311E, 311G, 311N, 315F, 315P, 316T, 317T, 327T, 3410, 341E, 341F, 3411, 341L, 341Y, 343W, 373A, 373G, 373M, 373Q, 376W,
376Y, 424M, 424V, 4300, 430W, 431P o 4328], presentando el anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc variante afinidad de unión a FcRn disminuida en comparación con el anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc original. La descripción proporciona un anticuerpo monoclonal que comprende una región Fc variante que comprende al menos una de las siguientes sustituciones de aminoácidos en la región Fc: 236Y, 244L, 247A, 2470, 247E, 247G, 247N, 247Q, 247R, 2478, 247W, 248F, 248P, 248Q, 248W, 249E, 249L, 249M, 249N, 249P, 249Y, 251F, 251H, 2511, 251W, 254A, 254F, 254K, 254L, 254M, 254R, 254Y, 255K, 256A, 256G, 2561, 256L, 256M, 256P, 256Q, 256W, 256Y, 2608, 2680, 279Q, 2798, 279W, 279Y, 280K, 280T, 283F, 283G, 283H, 2831, 283K, 283L, 283M, 283N, 283P, 283R, 2838, 283W, 292L, 307A, 307M, 311F, 3111, 311K,
311 L, 311M, 311T, 3111V, 311W, 311Y, 312P, 314F, 3141, 314V, 314W, 314Y, 315F, 315K, 315L, 315P, 315R, 316K, 317P, 317T, 318N, 318T, 332A, 3320, 332E, 332F, 332G, 332L, 332M, 332Q, 3328, 332T, 332V, 332W, 332Y, 3390, 339F, 339G, 339H, 3391, 339K, 339N, 339Q, 339R, 3398, 339T, 339W, 339Y, 3410, 341E, 341F, 341H, 3411, 341K, 341L, 341M, 341N, 341P, 341Q, 341R, 3418, 341T, 341V, 341W, 341Y, 343A, 3430, 343E, 343G, 343H, 343K, 343L, 343M, 343N, 343Q, 343R, 3438, 343T, 343W, 343Y, 3730, 373E, 373F, 373H, 3731, 373K, 373L, 373M, 373N, 373Q, 373R, 373T, 373V, 373W, 375R, 376A, 376F, 376G, 376H, 376L, 376N, 376P, 376Q, 376R, 3768, 376T, 376V, 377P, 379N, 379Q, 3798, 379T, 380A, 380N, 3808, 380T, 3821, 382L, 382Q, 382V, 386K, 4260, 426L, 429A, 429F, 429M, 430A, 4300, 430F, 430G, 430H, 4301, 430K, 430L, 430M, 430N, 430P, 430R, 4308, 430T, 430V, 430W, 430Y, 431H, 431P, 432R, 4328, 434W, 434Y, 438L, 438W, 440Q o 440Y, [preferiblemente 236Y, 248F, 248P, 248Q, 248W, 249E, 249L, 249M, 249N, 249Y, 251H, 2511, 251W, 254F, 254K, 254L, 254M, 254R, 254Y, 255K, 256A, 256G, 2561, 256L, 256M, 256P, 256Q, 256W, 2608, 280K, 283W, 307M, 311F, 3111, 311K, 311L, 311M, 311T, 311V, 311W, 311Y, 3141, 314V, 314W, 314Y, 315P, 317P, 3320, 332L, 332M, 3328, 332W, 3390, 339F, 3391, 339K, 339N, 3398, 339W, 339Y, 3410, 341E, 341F, 341H, 3411, 341K, 341L, 341M, 341N, 341P, 341Q, 341R,
3418, 341T, 341V, 341W, 341Y, 3430, 343E, 343G, 343H, 343K, 343N, 343Q,
343R, 3438, 343T, 343W, 343Y, 373E, 373F, 373H, 3731, 373K, 373L, 373Q, 373R, 373T, 373W, 376A, 376G, 376N, 376P, 376Q, 376R, 3768, 376T, 376V, 377P, 379N, 379Q, 379T, 3821, 382L, 386K, 4260, 426L, 429F, 429M, 430A, 4300, 430F, 430G, 430H, 4301, 430K, 430L, 430M, 430N, 430P, 430R, 4308, 430T, 430V, 430W, 430Y, 431 H, 431 P, 434Y, 438L o 440Y] presentando el anti cuerpo monoclonal que comprende la región Fc variante actividad de COC poten ciada en comparación con el anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc original. La descripción proporciona un anticuerpo monoclonal que comprende una región Fc variante que comprende al menos una de las siguientes sustituciones de ami noácidos en la región Fc: 235G, 2358, 236R, 237E, 237K, 237N, 237R, 238A, 238E, 238G, 238H, 2381, 238L, 238V, 238W, 238Y, 245R, 247H, 2471, 247L, 247T, 247Y, 250M, 252Y, 2540, 254E, 2541, 254P, 254Q, 254T, 254V, 255N, 257A, 2571, 257M, 257N, 2578, 257V, 262L, 2648, 265H, 265Y, 267G, 267H, 2671, 267K, 268K, 269N, 269Q, 270G, 270M, 270N, 271T, 272H, 272L, 272N, 292A, 2938, 301W, 307E, 311E, 3118, 316F, 318P, 327T, 328V, 329Y, 330K, 330R, 332E, 332M, 3431, 3738, 3780, 3800, 3820, 382F, 382N, 382P, 382R, 3828, 382W, 382Y, 385E, 385P, 423N, 424H, 424M o 427N [preferiblemente 235G, 2358, 236R, 237E, 237K, 237N, 237R, 238A, 238E, 238G, 238H, 2381, 238L, 238V, 238W, 238Y, 245R, 2471, 247L, 247T, 250M, 257A, 2571, 257M, 262L, 2648, 267G, 267H, 2671, 267K, 268K, 269N, 269Q, 270G, 270M, 270N, 271T, 272H, 301W, 3118, 327T, 329Y, 330K, 3780, 385E, 423N o 424H] presen tando el anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc variante actividad de COC disminuida en comparación con el anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc original. La descripción caracteriza además un anticuerpo monoclonal que comprende una región Fc variante de la invención, uniéndose dicho anticuerpo específicamente a un antígeno diana humano. Preferiblemente, el antígeno diana se selecciona del grupo que consiste en C03, C020, C025, TNFa, Her2/neu, C033, C052, EGFR,
EpCAM, MUC1, G03, CEA, CA125, HLA-OR, TGF, VEGF, GOF8, GOF11, greli na o cualquier precursor o fragmento funcional de los mismos. La descripción proporciona un polipéptido variante que comprende una región Fc variante que comprende al menos una de las siguientes sustituciones de aminoá cidos en la región Fc: 238L, 244L, 245R, 249P, 252Y, 256P, 257A, 2571, 257M,
257N, 257S, 257V, 2580, 260S, 262L, 270K, 272L, 272R, 279A, 2790, 279G, 279H, 279M, 279N, 2790, 279R, 279S, 279T, 279W, 279Y, 283A, 2830, 283F, 283G, 283H, 2831, 283K, 283L, 283N, 283P, 2830, 283R, 283S, 283T, 283W, 283Y, 285N, 286F, 288N, 288P, 293V, 307E, 307M, 311A, 3111, 311K, 311L, 311M, 311V, 311W, 312P, 316K, 317P, 318N, 318T, 332F, 332H, 332K, 332L, 332M, 332R, 332S, 332W, 339N, 339T, 339W, 341P, 343E, 343H, 343K, 3430, 343R, 343T, 343Y, 375R, 376G, 3761, 376M, 376P, 376T, 376V, 377K, 3780, 378N, 380N, 380S, 380T, 382F, 382H, 3821, 382K, 382L, 382M, 382N, 3820, 382R, 382S, 382T, 382V, 382W, 382Y, 423N, 427N, 430A, 430F, 430G, 430H, 4301, 430K, 430L, 430M, 430N, 4300, 430R, 430S, 430T, 430V, 430Y, 431H, 431 K, 434F, 434G, 434H, 434W, 434Y, 4361, 436L, 436T, 438K, 438L, 438T, 438W, 440K o 442K, [preferiblemente 245R, 252Y, 256P, 257 A, 2571, 257M, 257N, 257S, 257V, 2580, 260S, 262L, 279A, 2790, 279G, 279H, 279N, 2790, 279S, 279T, 279W, 279Y, 283F, 283H, 283K, 283R, 285N, 286F, 307E, 307M, 3111, 311K, 311L, 311M, 312P, 318N, 318T, 332S, 339W, 343E, 343H, 343K, 3430, 343R, 375R, 377K, 3780, 378N, 380S, 380T, 382F, 382K, 3820, 382R, 382S, 382T, 382V, 382W, 382Y, 423N, 427N, 430A, 430F, 430H, 4301, 430L, 430M, 430N, 4300, 430R, 430S, 430V, 430Y, 431H, 431K, 434F, 434G, 434H, 434W, 434Y, 4361, 436L, 438K, 438L o 438W], presentando el polipéptido variante semivida sérica potenciada en comparación con el polipéptido original (es decir,
un polipéptido idéntico al polipéptido variante pero que carece de la sustitución de aminoácido enumerada anteriormente en el presente documento). La descripción proporciona un polipéptido variante que comprende una región Fc variante que comprende al menos una de las siguientes sustituciones de aminoácidos en la región Fc: 2350, 236Y, 237K, 237R, 238E, 238G, 238H, 238W, 247A, 2470, 247E, 247F, 247G, 247H, 2471, 247L, 247M, 247N, 2470, 247R, 247S, 247W, 247Y, 248A, 248F, 248P, 2480, 248W, 249E, 249L, 249M, 249Y, 251 F, 251 H, 251 1, 251W, 2540, 254E, 254F, 254G, 254H, 2541, 254K, 254L, 254M, 254N, 254P, 2540, 254R, 254T, 254V, 254W, 254Y, 255K, 255N, 256F, 256H, 2561, 256K, 256M, 256R, 256W, 256Y, 264S, 265S, 265Y, 267G, 2671, 2680, 268K, 270A, 270M, 2791, 279K, 279L, 280T, 292E, 292F, 292G, 2921, 292L, 31 10, 311E, 311F, 311G, 311N 311R, 311Y, 315F, 315K, 315P, 316F, 317T, 326W, 327T, 339E, 339G, 339L, 339R, 3410, 341E, 341F, 3411, 341K, 341 L, 341M,
341N, 341Q, 341R, 341S, 341T, 341V, 341W, 341Y, 343M, 343V, 343W, 373A,
3730, 373G, 373K, 373L, 373M, 373N, 3730, 3738, 373T, 373V, 373W, 376H, 376L, 376W, 376Y, 424M, 424V, 4260, 429A, 429F, 429M, 4300, 430W, 431 P, 432R, 4328, 4390, 4400, 440E, 440F o 440M [preferiblemente 237R, 2470, 247E, 247F, 247H, 247L, 247M, 247N, 2470, 247W, 247Y, 248A, 248F, 248P, 2480, 248W, 249L, 249M, 249Y, 251 H, 2511, 251W, 2540, 254E, 254F, 254G, 254H, 2541, 254K, 254M, 254N, 254P, 2540, 254R, 254T, 254V, 254W, 254Y, 255K, 255N, 256F, 256H, 256K, 256M, 256R, 256W, 265Y, 280T, 292G, 2921, 3110, 311E, 311G, 311N, 315F, 315P, 316T, 317T, 327T, 3410, 341E, 341F, 3411, 341L, 341Y, 343W, 373A, 373G, 373M, 3730, 376W, 376Y, 424M, 424V, 4300, 430W, 431 P o 4328], presentando el polipéptido variante semivida sérica disminuida en comparación con el polipéptido original (es decir, un polipéptido idéntico al polipéptido variante pero que carece de la sustitución de aminoácido enumerada anteriormente en el presente documento). En una realización la descripción proporciona un método para aumentar la actividad de AOCC de un anticuerpo monoclonal, preferiblemente un anticuerpo monoclonal terapéutico (o fragmento funcional del mismo), que comprende modificar por ingeniería genética un ácido nucleico que comprende un ácido nucleico que codifica para una región Fc variante que comprende al menos una de las siguientes sustituciones de aminoácidos: 247A, 247F, 247H, 2471, 247L, 247M, 247T, 247V, 247Y, 249E, 249Y, 251 F, 254F, 254M, 254Y, 256A, 256M, 2580, 2680, 268E, 279A, 280A, 280K, 283A, 2831, 283K, 283M, 283R, 288N, 292A, 31 1A, 3110, 311N, 311T, 311V, 311Y, 315L, 318N, 318P, 318T, 318V, 330K, 332T, 332V, 3390, 339F, 339G, 3391, 339K, 339M, 339N, 3390, 339R, 3398, 339T, 376A, 376V, 377G, 377K, 379N, 380N, 3808, 382A, 3821, 385E, 427N, 429M, 434W, 4361, 440G, 440H, 4401 o 440L [preferiblemente 247A, 247F, 247M, 247T, 247V, 247Y, 254F, 254Y, 2580, 279A, 283M, 288N, 292A, 3110, 311 N, 311T, 315L, 318N, 318P, 318T, 318V, 3390, 3391, 339K, 339M, 339N, 3390, 339R, 3398, 376A, 376V, 377K, 379N, 380N, 382A, 4401 o 440L]. La molécula de ácido nucleico que codifica para la región Fc variante puede modificarse por ingeniería genética (por ejemplo, a partir de una molécula de ácido nucleico que codifica para una región Fc original o una región Fc nativa) para que comprenda al menos una sustitución de aminoácido enumerada anteriormente o bien mientras que la molécula de ácido nucleico está operativamente unida a un ácido nucleico que codifica para un anticuerpo adicional, (por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico
que codifica para el resto de la cadena pesada de Ig), o bien el método puede comprender además posteriormente unir operativamente el ácido nucleico que codifica para la región Fc variante (es decir, tras la introducción de al menos una sustitución de aminoácido enumerada anteriormente) a un ácido nucleico que codifica para un anticuerpo adicional. El método puede comprender además la expresión y purificación del anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc variante. El método puede comprender además la expresión y purificación del anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc original. El método puede comprender además medir la actividad de AOCC del anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc variante y del anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc original mediante cualquier método disponible en la técnica o tal como se describe en el presente documento. El método puede comprender además seleccionar un anticuerpo monoclonal que comprende una región Fc variante con actividad de AOCC mayor que la del anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc original (es decir, potenciada, preferiblemente en al menos el 5%, el 10%, el
12%, el 14%, el 16%, el 18%, el 20% o más). La descripción caracteriza además un anticuerpo monoclonal, o fragmento funcional del mismo, que comprende una región Fc variante producida mediante el método. En una realización la descripción proporciona un método para disminuir la actividad de AOCC de un anticuerpo monoclonal, preferiblemente un anticuerpo monoclonal terapéutico (o fragmento funcional del mismo), que comprende modificar por ingeniería genética un ácido nucleico que comprende un ácido nucleico que codifica para una región Fc variante que comprende al menos una de las siguientes sustituciones de aminoácidos: 235Q, 235R, 2355, 236F, 236R, 236Y, 237E, 237K, 237N, 237R, 238E, 238G, 238H, 2381, 238L, 238V, 238W, 238Y, 247G, 247R, 249L, 249P, 250K, 250M, 250R, 251H, 2511, 251W, 252Y, 254L, 254P, 5254Q, 254T, 254V, 256V, 257A, 2571, 257M, 257N, 2575, 257V, 2605, 262L, 2645, 265H, 265K, 2655, 267G, 5267H, 2671, 267K, 269N, 269Q, 270A, 270G, 270K, 270M, 270N, 271T, 272H, 272K, 272L, 272N, 272R, 2790, 279F, 279K, 279L, 279W, 2830, 283F, 283G, 283H, 283L, 283T, 283W, 283Y, 285N, 288P, 292E, 292F, 292G, 2921, 2935, 293V, 301W, 304E, 307A, 307E, 307M, 311F, 3111, 311K, 3115, 312P, 314F, 3141, 314V, 314W, 315F, 315P, 316F, 317P, 327T, 328V, 329Y, 332G, 332K, 332L, 332R, 332W, 3410, 341E, 341F, 341H, 3411,
341K, 341L, 341M, 341N, 341P, 341Q, 341R, 3415, 341T, 341W, 341Y, 343A,
3430, 343E, 343F, 343G, 343H, 343L, 343M, 343N, 3430, 343R, 3438, 343T, 343V, 343W, 343Y, 373A, 3730, 373E, 373F, 373G, 3731, 373K, 373L, 373M, 373N, 3730, 373R, 3738, 373T, 373V, 373W, 375R, 376A, 376E, 376F, 376G, 376H, 376W, 376Y, 3790, 3820, 3828, 429A, 429F, 430H, 430K, 430N, 4300, 430R, 430W, 432R, 4328, 4341, 4400, 440T, 440V o 442K [preferiblemente 235R, 236F, 236R, 236Y, 237E, 237K, 237N, 237R, 238E, 238G, 238H, 2381, 238L, 238V, 238W, 238Y, 247R, 249P, 250K, 251 H, 254T, 2571, 257M, 257N, 2578, 257V, 265H, 265K, 2658, 267G, 267H, 2671, 267K, 269N, 2690, 270A, 270G, 270K, 270M, 270N, 271T, 272R, 288P, 292E, 301W, 304E, 316F, 317P, 327T, 329Y, 332K, 332R, 341F, 3411, 341M, 341P, 3410, 341R, 341T, 341W, 341Y, 343W, 373A, 373E, 373G, 3738, 376W, 429A, 432R o 4328]. La molécula de ácido nucleico que codifica para la región Fc variante puede modificarse por ingeniería genética (por ejemplo, a partir de una molécula de ácido nucleico que codifica para una región Fc original o una región Fc nativa) para que comprenda al menos una sustitución de aminoácido enumerada anteriormente o bien mientras que la molécula de ácido nucleico está operativamente unida a un ácido nucleico que codifica para un anticuerpo adicional, (por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico que codifica para el resto de la cadena pesada de Ig), o bien el método puede comprender además posteriormente unir operativamente el ácido nucleico que codifica para la región Fc variante (es decir, tras la introducción de al menos una sustitución de aminoácido enumerada anteriormente) a un ácido nucleico que codifica para un anticuerpo adicional. El método puede comprender además la expresión y purificación del anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc variante. El método puede comprender además la expresión y purificación del anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc original. El método puede comprender además medir la actividad de AOCC del anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc variante y del anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc original mediante cualquier método disponible en la técnica o tal como se describe en el presente documento. El método puede comprender además seleccionar un anticuerpo monoclonal que comprende una región Fc variante con actividad de AOCC menor que la del anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc original (es decir, disminuida, preferiblemente en al menos el 5%, el 10%, el 12%, el 14%, el 16%, el 18%, el 20% o más). La invención caracteriza además un anticuerpo monoclonal, o fragmento funcional del mismo, que comprende una región Fc variante producida mediante el método.
En una realización la descripción proporciona un método para aumentar la afinidad de unión a FcRn de un anticuerpo monoclonal, preferiblemente un anticuerpo monoclonal terapéutico (o fragmento funcional del mismo), que comprende modificar por ingeniería genética un ácido nucleico que comprende un ácido nucleico que codifica para una región Fc variante que comprende al menos una de las siguientes sustituciones de aminoácidos: 238L, 244L, 245R, 249P, 252Y, 256P, 257A, 2571, 257M, 257N, 257S, 257V, 2580, 260S, 262L, 270K, 272L, 272R, 279A, 2790, 279G, 279H, 279M, 279N, 2790, 279R, 279S, 279T, 279W, 279Y, 283A, 2830, 283F, 283G, 283H, 2831, 283K, 283L, 283N, 283P, 2830, 283R, 283S, 283T, 283W, 283Y, 285N, 286F, 288N, 288P, 293V, 307A, 307E, 307M, 311A, 3111, 311K, 311L, 311M, 311V, 311W, 312P, 316K, 317P, 318N, 318T, 332F, 332H, 332K, 332L, 332M, 332R, 332S, 332W, 339N, 339T, 339W, 341 P, 343E, 343H, 343K, 3430, 343R, 343T, 343Y, 375R, 376G, 3761, 376M, 376P, 376T, 376V, 377K, 3780, 378N, 380N, 380S, 380T, 382F, 382H, 3821, 382K, 382L, 382M, 382N, 3820, 382R, 382S, 382T, 382V, 382W, 382Y, 423N, 427N, 430A, 430F, 430G, 430H, 4301, 430K, 430L, 430M, 430N, 4300, 430R, 430S, 430T, 430V, 430Y, 431 H, 431 K, 434F, 434G, 434H, 434W, 434Y, 4361, 436L, 436T, 438K, 438L, 438T, 438W, 440K o 442K [preferiblemente 245R, 252Y, 256P, 257A, 2571, 257M, 257N, 257S, 257V, 2580, 262L, 279A, 2790, 279G, 279H, 279N, 2790, 279S, 279T, 279W, 279Y, 283F, 283H, 283K, 283R, 285N, 286F, 307A, 307E, 307M, 3111, 311K, 311L, 311M, 312P, 318N, 318T, 332S, 339W, 343E, 343H, 343K, 3430, 343R, 375R, 377K, 3780, 378N, 380S, 380T, 382F, 382K, 3820, 382R, 382S, 382T, 382V, 382W, 382Y, 423N, 427N, 430A, 430F, 430H, 4301, 430L, 430M, 430N, 4300, 430R, 430S, 430V, 430Y, 431 H, 431 K, 434F, 434G, 434H, 434W, 434Y, 4361, 436L, 438K, 438L o 438W]. La molécula de ácido nucleico que codifica para la región Fc variante puede modificarse por ingeniería genética (por ejemplo, a partir de una molécula de ácido nucleico que codifica para una región Fc original o una región Fc nativa) para que comprenda al menos un sustitución de aminoácido enumerada anteriormente o bien mientras que la molécula de ácido nucleico está operativamente unida a un ácido nucleico que codifica para un anticuerpo adicional, (por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico que codifica para el resto de la cadena pesada de Ig), o bien el método puede comprender además posteriormente unir operativamente el ácido nucleico que codifica para la región Fc variante (es decir, tras la introducción de al menos una sustitución de aminoácido enumerada anteriormente) a un ácido nucleico que codifica para un anticuerpo adicional. El método puede comprender además la expresión y purificación del anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc variante. El método puede comprender además la expresión y purificación del anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc original. El método puede comprender además medir la afinidad de unión a FcRn del anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc variante y del anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc original mediante cualquier método disponible en la técnica o tal como se describe en el presente documento. El método puede comprender además seleccionar un anticuerpo monoclonal que comprende una región Fc variante con afinidad de unión a FcRn mayor que la afinidad de unión a FcRn del anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc original (es decir, potenciada, preferiblemente en al menos el 5%, el 10%, el 12%, el 14%, el 16%, el 18%, el 20% o más). La invención caracteriza además un anticuerpo monoclonal, o fragmento funcional del mismo, que comprende una región Fc variante producida mediante el método. En una realización la descripción proporciona un método para aumentar la semivida sérica in vivo de un polipéptido, preferiblemente un polipéptido terapéutico, que comprende modificar por ingeniería genética un ácido nucleico que comprende un ácido nucleico que codifica para una región Fc variante que comprende al menos una de las siguientes sustituciones de aminoácidos: 238L, 244L, 245R, 249P, 252Y, 256P, 257A, 2571, 257M, 257N, 257S, 257V, 2580, 260S, 262L, 270K, 272L, 272R, 279A, 2790, 279G, 279H, 279M, 279N, 2790, 279R, 279S, 279T, 279W, 279Y, 283A, 2830, 283F, 283G, 283H, 2831, 283K, 283L, 283N, 283P, 2830, 283R, 283S, 283T, 283W, 283Y, 285N, 286F, 288N, 288P, 293V, 307A, 307E, 307M, 311A, 3111, 311K, 311L, 311M, 311V, 311W, 312P, 316K, 317P, 318N, 318T, 332F, 332H, 332K, 332L, 332M, 332R, 332S, 332W, 339N, 339T, 339W, 341P, 343E, 343H, 343K, 3430, 343R, 343T, 343Y, 375R, 376G, 3761, 376M, 376P, 376T, 376V, 377K, 3780, 378N, 380N, 380S, 380T, 382F, 382H, 3821, 382K, 382L, 382M, 382N, 3820, 382R, 382S, 382T, 382V, 382W, 382Y, 423N, 427N, 430A, 430F, 430G, 430H, 4301, 430K, 430L, 430M, 430N, 4300, 430R, 430S, 430T, 430V, 430Y, 431H, 431K, 434F, 434G, 434H, 434W, 434Y, 4361, 436L, 436T, 438K, 438L, 438T, 438W, 440K o 442K, [preferiblemente
245R, 252Y, 256P, 257A, 2571, 257M, 257N, 2578, 257V, 2580, 262L, 279A, 2790, 279G, 279H, 279N, 2790, 2798, 279T, 279W, 279Y, 283F, 283H, 283K, 283R, 285N, 286F, 307A, 307E, 307M, 3111, 311K, 311L, 311M, 312P, 318N, 31 8T, 3328, 339W, 343E, 343H, 343K, 3430, 343R, 375R, 377K, 3780, 378N, 5 3808, 380T, 382F, 382K, 3820, 382R, 3828, 382T, 382V, 382W, 382Y, 423N, 427N, 430A, 430F, 430H, 4301, 430L, 430M, 430N, 4300, 430R, 4308, 430V, 430Y, 431H, 431K, 434F, 434G, 434H, 434W, 434Y, 4361, 436L, 438K, 438L o 438W]. La molécula de ácido nucleico que codifica para la región Fc variante puede estar operativamente unida a una molécula de ácido nucleico que codifica para 10 una proteína terapéutica. La molécula de ácido nucleico que codifica para una región Fc variante puede modificarse por ingeniería genética (por ejemplo, a partir de una molécula de ácido nucleico que codifica para una región Fc original o una región Fc nativa) para que comprenda al menos una sustitución de aminoácido enumerada anteriormente mientras que la molécula de ácido nucleico está operativamente unida a un ácido nucleico que codifica para un polipéptido adicional, (por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico que codifica para la región distinta de Fc de la proteína de fusión), o el método puede comprender además posteriormente unir operativamente el ácido nucleico que codifica para la región Fc variante tras la introducción de la al menos una sustitución de aminoácido enumerada 20 anteriormente a un ácido nucleico que codifica para una pareja de fusión distinta de Fc. El método puede comprender además la expresión y purificación del polipéptido que comprende la región Fc variante. El método puede comprender además la expresión y purificación del polipéptido que comprende la región Fc original. El método puede comprender además medir la semivida sérica in vivo del po25 lipéptido que comprende la región Fc variante y del polipéptido que comprende la región Fc original mediante cualquier método disponible en la técnica o tal como se describe en el presente documento. El método puede comprender además seleccionar un polipéptido que comprende una región Fc variante en el que el polipéptido tiene semivida sé rica in vivo potenciada en comparación con la del poli
30 péptido que comprende la región Fc original (es decir, potenciada, preferiblemente en al menos el 5%, el 10%, el 12%, el 14%, el 16%, el 18%, el 20% o más). La invención caracteriza además un polipéptido (es decir, un polipéptido de fusión) que comprende una región Fc variante producida mediante el método.
En una realización la descripción proporciona un método para disminuir la afinidad de unión a FcRn de un anticuerpo monoclonal, preferiblemente un anticuerpo monocional terapéutico (o fragmento funcional del mismo), que comprende modificar por ingeniería genética un ácido nucleico que codifica para una región Fc variante que comprende al menos una de las siguientes sustituciones de aminoácidos: 235Q, 236Y, 237K, 237R, 238E, 238G, 238H, 238VV, 247A, 2470, 247E, 247F, 247G, 247H, 2471, 247L, 247M, 247N, 247Q, 247R, 247S, 247VV, 247Y, 248A, 248F, 248P, 248Q, 248VV, 249E, 249L, 249M, 249Y, 251F, 251H, 2511, 251VV, 2540, 254E, 254F, 254G, 254H, 2541, 254K, 254L, 254M, 254N, 254P, 254Q, 254R, 254T, 254V, 254VV, 254Y, 255K, 255N, 256F, 256H, 2561, 256K, 256M, 256R, 256VV, 256Y, 264S, 265S, 265Y, S267G, 2671, 2680, 268K, 270A, 270M, 2791, 279K, 279L, 280T, 292E, 292F, 292G, 2921, 292L, 3110, 311E, 311F, 311G, 311N, 311R, 311Y, 315F, 315K, 315P, 316F, 317T, 326VV, 327T, 339E, 339G, 339L, 339R, 3410, 341E, 341F, 3411, 341K, 341L, 341M, 341N, 341Q, 341R, 341S, 341T, 341V, 341VV, 341Y, 343M, 343V, 343VV, 373A, 3730, 373G, 373K, 373L, 373M, 373N, 373Q, 373S, 373T, 373V, 373VV, 376H, 376L, 376VV, 376Y, 424M, 424V, 4260, 429A, 429F, 429M, 4300, 430VV, 431P, 432R, 432S, 4341, 439Q, 440A, 4400, 440E, 440F o 440M [preferiblemente 237R, 2470, 247E, 247F, 247H, 247L, 247M, 247N, 247Q, 247VV, 247Y, 248A, 248F, 248P, 248Q, 248Q, 249L, 249M, 249Y, 251 H, 2511, 251VV, 2540, 254E, 254F, 254G, 254H, 2541, 254K, 254M, 254N, 254P, 254R, 254T, 254V, 254VV, 254Y, 255K, 255N, 256F, 256H, 256K, 256M, 256R, 256VV, 265Y, 280T, 292G, 2921, 3110, 311 E, 311G, 311N, 315F, 315P, 316T, 317T, 327T, 3410, 341E, 341F, 341L, 341Y, 343VV, 373A, 373G, 373M, 373Q, 376VV, 376Y, 424M, 424V, 4300, 430VV, 431P o 432S]. La molécula de ácido nucleico que codifica para una región Fc variante puede modificarse por ingeniería genética (por ejemplo, a partir de una molécula de ácido nucleico que codifica para una región Fc original o una región Fc nativa) para que comprenda al menos una sustitución de aminoácido enumerada anteriormente mientras que el ácido nucleico que codifica para la región Fc variante está operativamente unido a un ácido nucleico que codifica para una secuencia de anticuerpo adicional, (por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico que codifica para el resto de la cadena pesada de Ig), o el método puede comprender además posteriormente unir operativamente el ácido nucleico que codifica para la región Fc variante tras la introducción de la al menos una sustitución de aminoácido
enumerada anteriormente a un ácido nucleico que codifica para un anticuerpo
adicional. El método puede comprender además la expresión y purificación del
anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc variante. El método puede
comprender además la expresión y purificación del anticuerpo monoclonal que
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comprende la región Fc original. El método puede comprender además medir la
afinidad de unión a FcRn del anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc
variante y del anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc original median
te cualquier método disponible en la técnica o tal como se describe en el presente
documento. El método puede comprender además seleccionar un anticuerpo mo
lO
nocional que comprende una región Fc variante con afinidad de unión a FcRn
menor que la del anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc original (es
decir, disminuida, preferiblemente en al menos el 5%, el 10%, el 12%, el 14%, el
16%, el 18%, el 20% o más). La descripción caracteriza además un anticuerpo
monoclonal (que comprende una región Fc variante) producido mediante el méto
15
do.
En otra realización la descripción proporciona un método para disminuir la semivi
da sérica in vivo de un polipéptido, preferiblemente un polipéptido terapéutico, que
comprende modificar por ingeniería genética un ácido nucleico que codifica para
una región Fc variante que comprende al menos una de las siguientes sustitucio
20
nes de aminoácidos: 235Q, 236Y, 237K, 237R, 238E, 238G, 238H, 238W, 247A,
2470, 247E, 247F, 247G, 247H, 2471, 247L, 247M, 247N, 247Q, 247R, 247S,
247W, 247Y, 248A, 248F, 248P, 248Q, 248W, 249E, 249L, 249M, 249Y, 251 F,
251 H, 251 1, 251W, 2540, 254E, 254F, 254G, 254H, 2541, 254K, 254L, 254M,
254N, 254P, 254Q, 254R, 254T, 254V, 254W, 254Y, 255K, 255N, 256F, 256H,
25
2561, 256K, 256M, 256R, 256W, 256Y, 2645, 2655, 265Y, 5267G, 2671, 268D,
268K, 270A, 270M, 2791, 279K, 279L, 280T, 292E, 292F, 292G, 2921, 292L, 31 1 D,
31 1E, 31 1F, 31 1G, 31 1N, 31 1R, 31 1Y, 31 5F, 31 5K, 31 5P, 31 6F, 31 7T, 326W,
327T, 339E, 339G, 339L, 339R, 3410, 341 E, 341 F, 341 1, 341 K, 341L, 341M,
341 N, 341Q, 341R, 341S, 341T, 341V, 341W, 341Y, 343M, 343V, 343W, 373A,
30
3730, 373G, 373K, 373L, 373M, 373N, 373Q, 373S, 373T, 373V, 373W, 376H,
376L, 376W, 376Y, 424M, 424V, 4260, 429A, 429F, 429M, 4300, 430W, 431P,
432R, 432S, 4341, 439Q, 440A, 4400, 440E, 440F o 440M [preferiblemente 237R,
2470, 247E, 247F, 247H, 247L, 247M, 247N, 247Q, 247W, 247Y, 248A, 248F,
248P, 248Q, 248Q, 249L, 249M, 249Y, 251 H, 2511, 251W, 2540, 254E, 254F,
254G, 254H, 2541, 254K, 254M, 254N, 254P, 254R, 254T, 254V, 254W, 254Y, 255K, 255N, 256F, 256H, 256K, 256M, 256R, 256W, 265Y, 280T, 292G, 2921, 3110, 311E, 311G, 311N, 315F, 315P, 316T, 317T, 327T, 3410, 341E, 341F, 341L, 341Y, 343W, 373A, 373G, 373M, 3730, 376W, 376Y, 424M, 424V, 4300, 430W, 431 P o 432S]. El ácido nucleico que codifica para la región variante Fc puede estar operativamente unido a un ácido nucleico que codifica para una proteína terapéutica. La molécula de ácido nucleico que codifica para una región Fc variante puede modificarse por ingeniería genética (por ejemplo, a partir de una molécula de ácido nucleico que codifica para una región Fc original o una región Fc nativa) para que comprenda al menos una sustitución de aminoácido enumerada anteriormente mientras que la molécula de ácido nucleico está operativamente unida a un ácido nucleico que codifica para un polipéptido adicional, (por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico que codifica para la región distinta de Fc de la proteína de fusión), o el método puede comprender además posteriormente unir operativamente el ácido nucleico que codifica para la región Fc variante tras
la introducción de la al menos una sustitución de aminoácido enumerada anteriormente a ácido nucleico que codifica para una pareja de fusión distinta de Fc. El método puede comprender además la expresión y purificación del polipéptido que comprende la región Fc variante. El método puede comprender además la expresión y purificación del polipéptido que comprende la región Fc original. El método puede comprender además medir la semivida sérica in vivo del polipéptido que comprende la región Fc variante y del polipéptido que comprende la región Fc original mediante cualquier método disponible en la técnica o tal como se describe en el presente documento. El método puede comprender además seleccionar un polipéptido que comprende una región Fc variante en el que el polipéptido tiene una semivida sérica in vivo disminuida en comparación con la del polipéptido que comprende la región Fc original (es decir, disminuida, preferiblemente en al menos el 5%, el 10%, el 12%, el 14%, el 16%, el 18%, el 20% o más). La invención caracteriza además un polipéptido (es decir, un polipéptido de fusión) que comprende una región Fc variante producido mediante el método. En otra realización la descripción proporciona un método para aumentar la actividad de COC de un anticuerpo monoclonal, preferiblemente un anticuerpo monoclonal terapéutico, que comprende construir la región Fc del anticuerpo para que comprenda al menos una de las siguientes sustituciones de aminoácidos: 236Y,
244L, 247A, 2470, 247E, 247G, 247N, 2470, 247R, 2478, 247VV, 248F, 248P, 2480, 248VV, 249E, 249L, 249M, 249N, 249P, 249Y, 250K, 250R, 251F, 251H, 251 1, 251VV, 254A, 254F, 254K, 254L, 254M, 254R, 254Y, 255K, 256A, 256G, 2561, 256L, 256M, 256P, 2560, 256VV, 256Y, 2608, 2680, 2790, 2798, 279VV, 279Y, 280K, 280T, 283F, 283G, 283H, 2831, 283K, 283L, 283M, 283N, 283P, 283R, 2838, 283VV, 292L, 307A, 307M, 311F, 3111, 311K, 311L, 311M, 311T, 311V, 311VV, 311Y, 312P, 314F, 3141, 314V, 314VV, 314Y, 315F, 315K, 315L, 315P, 315R, 316K, 317P, 317T, 318N, 318T, 332A, 3320, 332E, 332F, 332G, 332H, 332L, 332M, 332N, 3320, 3328, 332T, 332V, 332VV, 332Y, 3390, 339F, 339G, 339H, 3391, 339K, 339N, 3390, 339R, 3398, 339T, 339VV, 339Y, 3410, 341E, 341F, 341H, 3411, 341K, 341L, 341M, 341N, 341P, 3410, 341R, 3418, 341T, 341V, 341VV, 341Y, 343A, 3430, 343E, 343G, 343H, 343K, 343L, 343M, 343N, 3430, 343R, 3438, 343T, 343VV, 343Y, 3730, 373E, 373F, 373H, 3731, 373K, 373L, 373M, 373N, 3730, 373R, 373T, 373V, 373VV, 375R, 376A, 376F, 376G, 376H, 376L, 376N, 376P, 3760, 376R, 3768, 376T, 376V, 377P, 379N, 3790, 3798, 379T, 380A, 380N, 3808, 380T, 3821, 382L, 3820, 382V, 386K, 4260, 426L, 429A, 429F, 429M, 430A, 4300, 430F, 430G, 430H, 4301, 430K, 430L, 430M, 430N, 430P, 430R, 4308, 430T, 430V, 430VV, 430Y, 431 H, 431P, 432R, 4328, 434VV, 434Y, 438L, 438VV, 4400 o 440Y [preferiblemente 236Y, 248F, 248P, 2480, 248VV, 249E, 249L, 249M, 249N, 249Y, 250K, 250R, 251 H, 251 1, 251VV, 254A, 254F, 254K, 254L, 254M, 254R, 254Y, 255K, 256A, 256G, 2561, 256L, 256M, 256P, 2560, 256VV, 2608, 280K, 283VV, 307M, 31 1F, 31 11, 311 K, 311 L, 311 M, 311T, 311V, 311VV, 311Y, 3141, 314V, 314VV, 314Y, 315P, 317P, 3320, 332L, 332M, 3328, 332VV, 332Y, 3390, 339F, 3391, 339K, 339N, 3398, 339T, 339VV, 339Y, 3410, 341E, 341F, 341H, 3411, 341 K, 341L, 341M, 341N, 341P, 3410, 341R, 3418, 341T, 341V, 341VV, 341Y, 3430, 343E, 343G, 343H, 343K, 343N, 3430, 343R, 3438, 343T, 343VV, 343Y, 3730, 373E, 373H, 3731, 373K, 373L, 3730, 373R, 373T, 373VV, 376A, 376G, 376N, 376P, 3760, 376R, 3768, 376T, 376V, 377P, 379N, 3790, 379T, 3821, 382L, 386K, 4260, 426L, 429F, 429M, 430A, 4300, 430F, 430G, 430H, 4301, 430K, 430L, 430M, 430N, 430P, 430R, 4308, 430T, 430V, 430VV, 430Y, 431H, 431P, 432R, 434Y, 438L o 440Y). La molécula de ácido nucleico que codifica para una región Fc variante puede modificarse por ingeniería genética (por ejemplo, a partir de una molécula de ácido nucleico que codifica para una región Fc original o una región Fc
nativa) para que comprenda al menos una sustitución de aminoácido enumerada anteriormente mientras que la molécula de ácido nucleico está operativamente unida a un ácido nucleico que codifica para un anticuerpo adicional, (por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico que codifica para el resto de la cadena pesada de Ig), o el método puede comprender además posteriormente unir operativamente el ácido nucleico que codifica para la región Fc variante tras la introducción de la al menos una sustitución de aminoácido enumerada anteriormente a un ácido nucleico que codifica para un anticuerpo adicional. El método puede comprender además la expresión y purificación del anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc variante. El método puede comprender además la expresión y purificación del anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc original. El método puede comprender además medir la actividad de COC del anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc variante y del anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc original mediante cualquier método disponible en la técnica o tal co
mo se describe en el presente documento. El método puede comprender además seleccionar un anticuerpo monoclonal que comprende una región Fc variante con actividad de COC mayor que la del anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc original (es decir, potenciada, preferiblemente en al menos el 5%, el 10%, el 12%, el 14%, el 16%, el 18%, el 20% o más). La descripción caracteriza además un anticuerpo monoclonal que comprende una región Fc variante producido mediante el método.
En otra realización la descripción proporciona un método para disminuir la respuesta de COC de un anticuerpo monoclonal, preferiblemente un anticuerpo monocional terapéutico, que comprende construir la región Fc del anticuerpo para que comprenda al menos una de las siguientes sustituciones de aminoácidos: 235G, 2355, 236R, 237E, 237K, 237N, 237R, 238A, 238E, 238G, 238H, 2381, 238L, 238V, 238W, 238Y, 245R, 247H, 2471, 247L, 247T, 247Y, 250M, 252Y, 2540, 254E, 2541, 254P, 254Q, 254T, 254V, 255N, 257A, 2571, 257M, 257N, 2575, 257V, 262L, 2645, 265H, 265Y, 267G, 267H, 2671, 267K, 268K, 269N, 269Q, 270G, 270M, 270N, 271T, 272H, 272L, 272N, 292A, 2935, 301W, 307E, 311E, 3115, 316F, 318P, 327T, 328V, 329Y, 330K, 330R, 332K, 339E, 339M, 3431, 3735, 3780, 3800, 3820, 382F, 382N, 382P, 382R, 3825, 382W, 382Y, 385E, 385P, 423N, 424H, 424M o 427N [preferiblemente 235G, 2355, 236R, 237E, 237K, 237N, 237R, 238A, 238E, 238G, 238H, 2381, 238L, 238V, 238W,
238Y, 245R, 2471, 247L, 247T, 250M, 257A, 2571, 257M, 262L, 264S, 267G, 267H, 2671, 267K, 268K, 269N, 2690, 270G, 270M, 270N, 271T, 272H, 301W, 311S, 327T, 329Y, 330K, 330R, 3780, 385E, 423N o 424H]. Lá molécula de ácido nucleico que codifica para una región Fc variante puede modificarse por ingeniería genética (por ejemplo, a partir de una molécula de ácido nucleico que codifica para una región Fc original o una región Fc nativa) para que comprenda al menos una sustitución de aminoácido enumerada anteriormente mientras que la molécula de ácido nucleico está operativa mente unida a un ácido nucleico que codifica para un anticuerpo adicional, (por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico que codifica para el resto de la cadena pesada de Ig), o el método puede comprender además posteriormente unir operativamente el ácido nucleico que codifica para la región Fc variante tras la introducción de la al menos una sustitución de aminoácido enumerada anteriormente a un ácido nucleico que codifica para un anticuerpo adicional. El método puede comprender además la expresión y purificación del anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc variante. El método puede comprender además la expresión y purificación del anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc original. El método puede comprender además medir la actividad de COC del anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc variante y del anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc original mediante cualquier método disponible en la técnica o tal como se describe en el presente documento. El método puede comprender además seleccionar un anticuerpo monoclonal que comprende una región Fc variante con actividad de COC menor que la del anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc original (es decir, disminuida, preferiblemente en al menos el 5%, el 10%, el 12%, el 14%, el 16%, el 18%, el 20% o más). La descripción caracteriza además un anticuerpo monoclonal que comprende una región Fc variante producida mediante el método. En otra realización, la descripción proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para una región Fc variante de la invención o un fragmento funcional de la misma. Más preferiblemente, la molécula de ácido nucleico aislada comprende un ácido nucleico que codifica para un polipéptido que comprende una región Fc variante de la invención. Preferiblemente, el polipéptido de región Fc variante codificado por dicho ácido nucleico tiene una sustitución de aminoácido mostrada en la tabla 1 en
comparación con la región Fc original de la variante. Preferiblemente, el polipépti
do es un anticuerpo monoclonal, e incluso más preferiblemente, el anticuerpo monocional es un anticuerpo de longitud completa o un anticuerpo de cadena sencilla. El anticuerpo monoclonal puede ser un anticuerpo monoclonal quimérico, humanizado o humano. En otra realización, la descripción proporciona un vector, preferiblemente (pero sin limitarse a) un plásmido, un vector de expresión recombinante, un vector de expresión de levaduras o un vector de expresión retroviral que comprende un polinucleótido que codifica para un polipéptido que comprende un polipéptido de región Fc variante de la invención. En otra realización, la descripción proporciona una célula huésped que comprende una molécula de ácido nucleico de la presente invención. Preferiblemente, una célula huésped comprende uno o más vectores o constructos que comprenden una molécula de ácido nucleico de la presente invención. La célula huésped es una célula en la que se ha introducido un vector de la invención (por ejemplo, mediante transformación, transducción, infección, transfección, electroporación y similares), comprendiendo dicho vector un polinucleótido que codifica para un polipéptido que comprende un polipéptido de región Fc variante. Opcionalmente, el vector puede incorporarse de manera estable en el cromosoma de la célula huésped. Los tipos de célula huésped incluyen células de mamíferos, bacterianas, vegetales y de levaduras. Preferiblemente, la célula huésped es una célula CHO, una célula COS, una célula SP2/0, una célula NSO, una célula de levaduras o un derivado o progenie de cualquier tipo de célula preferido. En otra realización, la descripción proporciona una composición farmacéutica que comprende un polipéptido que comprende una región Fc variante, o fragmento funcional de la misma. Preferiblemente, el polipéptido es un anticuerpo monoclonal, incluso más preferiblemente, un anticuerpo monoclonal terapéutico. El anticuerpo monoclonal puede ser un anticuerpo monoclonal quimérico, humanizado o humano. Alternativamente, el polipéptido puede ser un polipéptido distinto de un anticuerpo que se beneficia de una semivida sé rica alterada conferida al polipéptido al unirse operativamente a, y expresarse conjuntamente con, una región Fc variante de la invención. La composición farmacéutica puede comprender además un vehículo farmacéuticamente aceptable. En dicha composición farmacéutica, el polipéptido que comprende la región Fc variante es el principio activo. Preferiblemente, la composición farmacéutica comprende una población homogénea o sustancialmente homogénea de anticuerpo monoclonal que comprende una región Fc variante de la invención. La composición farmacéutica para uso terapéutico es preferiblemente estéril y puede estar liofilizada. La descripción proporciona un método de inhibición de la actividad de una proteína en un mamífero, preferiblemente un ser humano, que lo necesita que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz, o cantidad profilácticamente eficaz, de un polipéptido (preferiblemente un anticuerpo monoclonal) que comprende una región Fc variante de la invención a dicho mamífero. Preferiblemente, el polipéptido que comprende la región Fc variante es una pareja de unión de la proteína que va a inhibirse. Se proporciona además un método de tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno mejorado por la inhibición de la transducción de señales que resulta de la unión de un anticuerpo monoclonal que comprende una región Fc variante de la invención a su epítopo antigénico que comprende administrar a un paciente (por ejemplo, un ser humano) que necesita tal tratamiento o prevención una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de un anticuerpo monoclonal.
La descripción caracteriza un artículo de fabricación que comprende un material de envasado y un polipéptido que comprende un polipéptido de región Fc variante de la invención contenido dentro de dicho material de envasado. La descripción caracteriza además composiciones que comprenden anticuerpos monoclonales y polipéptidos heterólogos que comprenden una región Fc variante descrita en el presente documento, y un vehículo o diluyente fisiológica o farmacéuticamente aceptable.
En algunas realizaciones, la presente descripción proporciona un polipéptido que comprende: i) una región de entramado humana no modificada (quot;FRquot;) (por ejemplo, no se ha hecho ninguna alteración en un entramado humano que se produce de manera natural), y ii) una región Fc variante. En determinadas realizaciones, el entramado humano no modificado es un entramado de línea germinal humana. En otras realizaciones, la presente descripción proporciona composiciones que comprenden un polipéptido, comprendiendo el polipéptido: i) al menos una secuencia de CDR aleatorizada y ii) una región Fc variante de la invención. En realizaciones adicionales, la presente descripción proporciona composiciones que comprenden un polipéptido, comprendiendo el polipéptido: i) un entramado humano no modifi
cado (por ejemplo, entramado de línea germinal humana), ii) al menos una secuencia de CDR aleatorizada y iii) una región Fc variante.
La presente descripción contempla usos terapéuticos y de diagnóstico para polipéptidos heterólogos de anticuerpos monoclonales que comprenden una región Fc variante dada a conocer en el presente documento.
de las La figura 1 muestra una representación esquemática de una molécula de IgG con las diversas regiones y secciones marcadas. La figura 2 muestra una alineación de diversas secuencias de aminoácidos de Fc originales, incluyendo IgG1 humana «SEQ ID NO: 1) con alotipos a y distinto de a mostrados), IgG2 humana (SEQ ID NO: 2), IgG3 humana (SEQ ID NO: 3), IgG4 humana (SEQ ID NO: 4), IgG1 murina (SEQ ID NO: 5), IgG2A murina (SEQ ID NO: 6), IgG28 murina (SEQ ID NO: 7) e IgG3 murina (SEQ ID NO: 8). La figura 3 muestra diversas secuencias de aminoácidos, incluyendo la región CH2 (SEQ ID NO: 9) y la región CH3 (SEQ ID NO: 10) de IgG1 humana, así como secuencias de un alotipo f (SEQ ID NO: 11) y alotipo a, z (SEQ ID NO: 12) de IgG1 humana que incluyen las regiones CH1, bisagra, CH2 y CH3. La figura 4 muestra diversas secuencias de aminoácidos comprendidas dentro de:
(a) la región variable de cadena ligera (LCVR) de anticuerpo anti-CD20 (1) (SEQ ID NO: 13); (b) la región variable de cadena pesada (HCVR) de anticuerpo antiCD20 (1) (SEQ ID NO: 14); (c) LCVR de anticuerpo anti-CD20 (11) (SEQ ID NO: 15); Y HCVR de anticuerpo anti-CD20 (11) (SEQ ID NO: 16). La figura 4e muestra secuencias de aminoácidos comprendidas dentro de la región variable de un anticuerpo anti-CD20. (Véanse la solicitud provisional estadounidense 60/471.958, presentada el 20 de mayo de 2003 y la patente estadounidense 5.843.439). La figura 5a muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera completa para el anticuerpo anti-CD20 AME 133. La figura 5b muestra la secuencia de ácido nucleico de la cadena ligera completa para AME 133. La figura 6 muestra las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos para la cadena pesada completa de tres variantes preferidas del anticuerpo anti-CD20 AME
133. Específicamente, la figura 6a muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada completa de la variante 2471/3390. La figura 6b muestra la secuencia de ácido nucleico de la cadena pesada completa de la variante 2471/3390. La figura 6c muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada completa de la variante 2471/3390. La figura 6d muestra la secuencia de ácido nucleico de la cadena pesada completa de la variante 2471/3390. La figura 6e muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada completa de la variante 3780. La figura 6f muestra la secuencia de ácido nucleico de la cadena pesada completa de la variante 3780.
detallada A lo largo de toda la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones, la numeración de los residuos de aminoácido en una cadena pesada de inmunoglobulina (región Fc) es la del índice de EU como en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Betesda, MO (1991). El quot;índice de EU como en Kabatquot; se refiere a la numeración de residuos del anticuerpo de IgG humana y se refleja en el presente documento en la figura 2. Por ejemplo, en la posición 438, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 humanas e IgG3 murina tienen todas un aminoácido O, mientras que IgG1 murina tiene un aminoácido 1, IgG2a murina tiene un aminoácido T e IgG2B murina tiene un aminoácido K. Además, se nombran sustituciones en el presente documento mediante el número de posición de aminoácido en el que se produce la sustitución seguido por el aminoácido que sustituye al presente en la región Fc original en la misma posición (por ejemplo, 249G indica un residuo de glicina que sustituye al presente en la posición 249 de la región Fc original). El número se refiere a la posición en IgG1 humana independientemente de si la región Fc original es o no IgG1 humana; si la región Fc original no es IgG1 humana, el número se refiere a la posición homóloga en la región Fc original si estuviese alineada con IgG1 humana en esa posición. Tal como se usan en el presente documento, los términos quot;sujetoquot; y quot;pacientequot; se refieren a cualquier animal en el que puede usarse terapéuticamente un polipéptido que comprende una región Fc variante de la invención incluyendo un ser humano así como otros mamíferos (tales como por ejemplo animales domésticos (por ejemplo, caninos, felinos), animales para deportes (por ejemplo, equinos) y animales como fuente de alimentos (por ejemplo, bovinos, porcinos y ovinos»
que
pueden beneficiarse de tal terapia. Tal como se usa en el presente documento, quot;tratamiento o prevenciónquot; se refiere a una enfermedad o trastorno asociado con niveles anómalos de una proteína o que se ve beneficiado por la alteración de una actividad o un nivel de una proteí
na.
El término quot;aisladoquot; cuando se usa en relación con un ácido nucleico es un ácido nucleico que se identifica y se separa de al menos un ácido nucleico contaminan te con el que está habitualmente asociado en su fuente natural. Un ácido nucleico aislado está en una forma o entorno diferente del que se encuentra en la natura leza. Por tanto, se distinguen moléculas de ácido nucleico aislado de la molécula de ácido nucleico tal como existe en células naturales. Una molécula de ácido nu cleico aislado incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que expresan habitualmente el polipéptido codificado en las mismas en las que, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en un plásmido o una ubicación cro mosómica diferente de la de células naturales. El ácido nucleico aislado puede es tar presente en forma monocatenaria o bicatenaria. Cuando va a utilizarse una molécula de ácido nucleico aislado para expresar una proteína, el oligonucleótido
o polinucleótido contendrá como mínimo la hebra sentido o codificante, pero puede contener las hebras tanto sentido como antisentido (es decir, puede ser bicatenaria). Una molécula de ácido nucleico está quot;operativamente unidaquot; u quot;operativamente acopladaquot; cuando está colocada en una relación funcional con otra molécula de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor o potenciador está operativa mente unido a una secuencia codificante de ácido nucleico si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosomas está operativamente unido a una secuencia codificante de ácido nucleico si está situado de modo que facilita la traducción. Una molécula de ácido nucleico que codifica para una región Fc variante está operativa mente unida a una molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína heteróloga (es decir, una proteína o fragmento funcional de la misma que, tal como existe en la naturaleza, no comprende una región Fc) si está situada de manera que la proteína de fusión expresada comprende la proteína heteróloga o fragmento funcional de la misma unida o bien en sentido de 5' o bien en el sentido de 3' con respecto al polipéptido de región Fc variante; la proteína heteróloga puede estar inmediatamente adyacente al polipéptido de región Fc variante o puede estar separado de la misma por una secuencia de ligador de cualquier longitud y composición. Asimismo, una molécula de polipéptido (usado de manera sinónima en el presente documento con quot;proteína) está quot;operativamentequot; u quot;operativamente acopladaquot; cuando está colocada en una relación funcional con otro polipéptido. Tal como se usa en el presente documento, el término quot;fragmento funcionalquot; en referencia a un polipéptido o una proteína (por ejemplo, una región Fc variante, o
un anticuerpo monoclonal) se refiere a fragmentos de esa proteína que conservan al menos una función del polipéptido de longitud completa. Los fragmentos pueden oscilar en tamaño entre seis aminoácidos y la secuencia de aminoácidos entera del polipéptido de longitud completa menos un aminoácido. Un fragmento funcional de un polipéptido de región Fc variante de la presente invención conserva al menos una quot;sustitución de aminoácidoquot; tal como se define en el presente documento. Un fragmento funcional de un polipéptido de región Fc variante conserva al menos una función que se sabe en la técnica que está asociada con la región Fc (por ejemplo, ADCC, CDC, unión a receptor de Fc, unión a C1q, regulación por disminución de receptores de la superficie celular o puede, por ejemplo, aumentar la semivida in vivo o in vitro de un polipéptido al que está operativamente unido).
El término quot;purificadoquot; o quot;purificarquot; se refiere a la eliminación sustancial de al me
nos un contaminante de una muestra. Por ejemplo, un anticuerpo específico de antígeno puede purificarse mediante la eliminación completa o sustancial (al menos el 90%, el 91 %, el 92%, el 93%, el 94%, el 95% o más, preferiblemente al menos el 96%, el 97%, el 98% o el 99%) de al menos una proteína distinta de inmunoglobulina contaminante; también puede purificarse mediante la eliminación de proteína de inmunoglobulina que no se une al mismo antígeno. La eliminación de proteínas distintas de inmunoglobulina y/o la eliminación de inmunoglobulinas que no se unen a un antígeno particular da como resultado un aumento en el porcentaje de inmunoglobulinas específicas de antígeno en la muestra. En otro ejemplo, un polipéptido (por ejemplo, una inmunoglobulina) expresado en células huésped bacterianas se purifica mediante la eliminación completa o sustancial de proteínas de células huésped; el porcentaje del polipéptido aumenta de ese modo en la muestra.
El término quot;nativoquot; cuando se refiere a un polipéptido (por ejemplo, región Fc) se usa en el presente documento para indicar que el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en la secuencia de aminoácidos del polipéptido tal como se produce comúnmente en la naturaleza o un polimorfismo del mismo que se produce de manera natural. Puede producirse un polipéptido nativo (por ejemplo, región Fc nativa) por medios recombinantes o puede aislarse de una fuente que se produce de manera natural. El término quot;vector de expresiónquot; tal como se usa en el presente documento se refiere a una molécula de ADN recombinante que contiene una secuencia codifican-te deseada y secuencias de ácido nucleico apropiadas necesarias para la expresión de la secuencia codificante operativamente unida en un organismo huésped particular. Tal como se usa en el presente documento, el término quot;célula huéspedquot; se refiere a cualquier célula eucariota o procariota (por ejemplo, células bacterianas tales como E. coli, células CHO, células de levaduras, células de mamífero, células de aves, células de anfibios, células vegetales, células de peces y células de insectos), ya estén ubicadas in vitra o in situ, o in vivo. Por ejemplo, las células huésped pueden estar ubicadas en un animal transgénico. Tal como se usa en el presente documento, un quot;polipéptido originalquot; es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que puede cambiarse o alterarse (por ejemplo, una sustitución de aminoácido) para producir una variante (es decir, polipéptido variante). En realizaciones preferidas, el polipéptido original comprende al menos una parte de una región Fc nativa o no nativa, es decir, una región Fc que se produce de manera natural o una región Fc con al menos una modificación en la secuencia de aminoácidos. En algunas realizaciones, se contemplan específicamente variantes que son más cortas o más largas que el polipéptido original. En realizaciones particularmente preferidas, el polipéptido original difiere en función (por ejemplo, función efectora potenciada o disminuida, unión a receptor, semivida in vivo o in vitra, etc.) en comparación con la variante. Tal como se usa en el presente documento, el término quot;variante de un polipéptido originalquot; se refiere a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la del polipéptido original en al menos una sustitución de aminoácido. En determinadas realizaciones, la variante comprende al menos el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85% o el 90% o
lo más preferiblemente al menos el 95%, el 97% o el 99% de una región Fc (es decir, una quot;partequot; de la región Fc). En realizaciones preferidas, una región Fc variante de un polipéptido original comprende al menos una sustitución de aminoácido con respecto al polipéptido original, siendo la sustitución en la región Fc. El polipéptido original puede ser o no un polipéptido nativo. Tal como se usa en el presente documento, el término quot;región Fcquot; se refiere a una región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina (por ejemplo, tal como se muestra en la figura 1). La quot;región Fcquot; puede ser una región Fc de secuencia nativa o una región Fc variante. Aunque los límites generalmente aceptados de la región Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina pueden variar, la región Fc de cadena pesada de IgG humana se define habitualmente en un tramo de desde un residuo de aminoácido en la posición Cys226, o desde Pr0230, hasta el extremo carboxilo terminal de la misma. En algunas realizaciones, las variantes comprenden sólo porciones de la región Fc y pueden incluir o no el extremo carboxilo terminal. La región Fc de una inmunoglobulina comprende generalmente dos dominios constantes, CH2 y CH3, tal como se muestra, por ejemplo, en la figura 1. En algunas realizaciones, se contemplan variantes que tienen uno o más de los dominios constantes. En otras realizaciones, se contemplan variantes sin tales dominios constantes (o sólo con partes de tales dominios constantes). El quot;dominio CH2quot; de una región Fc de IgG humana (también denominado dominio quot;Cy2quot;) se extiende habitualmente desde aproximadamente el aminoácido 231 hasta aproximadamente el aminoácido 340 (véase la figura 2). El dominio CH2 es único porque no está estrechamente apareado con otro dominio. Se interponen dos cadenas de hidrato de carbono ramificadas unidas a N entre los dominios CH2 de una molécula de IgG nativa intacta. El quot;dominio CH3quot; de una región Fc de IgG humana (también denominado dominio quot;Cy3quot;) es generalmente el tramo de residuos C-terminales con respecto a un dominio CH2 en una región Fc que se extiende desde aproximadamente el residuo de aminoácido 341 hasta aproximadamente el residuo de aminoácido 447 (véase la figura 2). Una quot;región Fc funcionalquot; presenta una quot;función efectoraquot; de una región Fc de secuencia nativa. Al menos una función efectora de un polipéptido que comprende una región Fc variante de la presente invención puede potenciarse o disminuirse con respecto a un polipéptido que comprende una región Fc nativa o la región Fc
original de la variante. Los ejemplos de funciones efectoras incluyen, pero no se limitan a: unión a C1q; citotoxicidad dependiente del complemento (CDC); unión a receptor de Fc; citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC); fagocitosis; regulación por disminución de receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptor de células B; BCR), etc. Tales funciones efectoras pueden requerir que la región Fc esté operativamente unida a un dominio de unión (por ejemplo, un dominio variable de anticuerpo) y pueden evaluarse usando diversos ensayos (por ejemplo, ensayo de unión a Fc, ensayos de ADCC, ensayos de CDC, agotamiento de células diana a partir de muestras de sangre completa o fraccionada, etc.). Una quot;región Fc de secuencia nativaquot; o quot;región Fc de tipo naturalquot; se refiere a una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la secuencia de aminoácidos de una región Fc comúnmente encontrada en la naturaleza. Se muestran regiones Fc humanas de secuencia nativa a modo de ejemplo en la figura 2 e incluyen una región Fc de IgG 1 humana de secuencia nativa (alotipos f y a,z, es decir, alotipos A y distintos de A); una región Fc de IgG2 humana de secuencia nativa; una región Fc de IgG3 humana de secuencia nativa; y una región Fc de IgG4 humana de secuencia nativa así como variantes de las mismas que se producen de manera natural. También se muestran en la figura 2 regiones Fc murinas de secuencia nativa. Una quot;región Fc variantequot; comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la de una región Fc de secuencia nativa (o fragmento de la misma) en virtud de al menos una quot;sustitución de aminoácidoquot; tal como se define en el presente documento. En realizaciones preferidas, la región Fc variante tiene al menos una sustitución de aminoácido en comparación con una región Fc de secuencia nativa o en la región Fc de un polipéptido original, preferiblemente 1, 2, 3, 4 ó 5 sustituciones de aminoácidos en una región Fc de secuencia nativa o en la región Fc del polipéptido original. En una realización alternativa, puede generarse una región Fc variante según los métodos en el presente documento dados a conocer y esta región Fc variante puede fusionarse con un polipéptido heterólogo de elección, tal como un dominio variable de anticuerpo o un polipéptido distinto de anticuerpo, por ejemplo, un dominio de unión de un receptor o ligando.
Tal como se usa en el presente documento, el término quot;derivadoquot; en el contexto de polipéptidos se refiere a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que se ha alterado mediante la introducción de una sustitución de residuo de aminoácido. El término quot;derivadoquot; tal como se usa en el presente documento también se refiere a un polipéptido que se ha modificado mediante la unión covalente de cualquier tipo de molécula al polipéptido. Por ejemplo, pero no a modo de limitación, un anticuerpo puede modificarse, por ejemplo, mediante glicosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización mediante grupos bloqueantes/protectores conocidos, escisión proteolítica, unión a ligando celular u otra proteína, etc. Puede producirse un polipéptido derivado mediante modificaciones químicas usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a escisión química específica, acetilación, formilación, síntesis metabólica de tunicamicina, etc. Además, un polipéptido derivado presenta una función similar o idéntica al polipéptido del que se derivó. Se entiende que un polipéptido que comprende una región Fc variante de la presente invención puede ser un derivado tal como se define en el presente documento, preferiblemente la derivatización se produce dentro de la región Fc. quot;Sustancialmente de origen humanoquot; tal como se usa en el presente documento en referencia a un polipéptido (por ejemplo, una región Fc o un anticuerpo monoclonal), indica que el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos al menos el 80%, al menos el 85%, más preferiblemente al menos el 90%, el 91 %, el 92%, el 93%, el 94% o incluso más preferiblemente al menos el 95%, el 95%, el 97%, el 98% o el 99% homóloga a la de un polipéptido de amino humano nativo. Los términos quot;receptor de Fcquot; o quot;FcRquot; se usan para describir un receptor que se une a una región Fc (por ejemplo, la región Fc de un anticuerpo). El FcR preferido es un FcR de secuencia nativa. Además, un FcR preferido es uno que se une a
un anticuerpo de IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcyRl, FcyRlI, FcyRlIl, incluyendo variantes alélicas y formas cortadas y empalmadas de manera alternativa de estos receptores. Los receptores FcyRII incluyen FcyRIIA (un quot;receptor activantequot;) y FcyRIIB (un quot;receptor inhibidorquot;), que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en los dominios citoplasmáticos de los mismos. Se revisan FcR en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991); Capel, et al., Immunomethods 4:25-34 (1 994); y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Otro FcR preferido incluye el re
ceptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de IgG maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) y Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1 994)). Otros FcR, incluyendo los que van a identificarse en el futuro, se abarcan por el término quot;FcRquot; en el presente documento.
La frase quot;citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerposquot; y quot;ADCCquot; se refieren a una reacción mediada por células en la que células citotóxicas no específicas (por ejemplo, no específicas) que expresan FcR (por ejemplo, células cito líticas naturales (quot;Natural Killer', quot;NKquot;), neutrófilos y macrófagos) reconocen anticuerpo unido sobre una célula diana y posteriormente provocan la lisis de las células diana. Las células primarias para mediar en la ADCC, las células NK, ex
presan FcyRlI1 sólo, mientras que los monocitos expresan FcyRI, FcyRII Y FcyRlI1. Tal como se usa en el presente documento, la frase quot;células efectorasquot; se refiere a leucocitos (preferiblemente humanos) que expresan uno o más FcR y realizan funciones efectoras. Preferiblemente, las células expresan al menos FcyRl1I y realizan una función efectora de ADCC. Los ejemplos de leucocitos que median en la ADCC incluyen PBMC, células NK, monocitos, células T citotóxicas y neutrófilos. Las células efectoras pueden aislarse de una fuente nativa (por ejemplo, de sangre o PBMC).
Un polipéptido variante con afinidad de unión a FcRn quot;alteradaquot; es uno que tiene afinidad de unión a FcRn o bien potenciada (es decir, aumentada, mayor o superior) o bien disminuida (es decir, reducida, disminuida o menor) en comparación con el polipéptido original variante o con un polipéptido que comprende una región Fc nativa cuando se mide a pH 6,0. Un polipéptido variante que presenta unión aumentada o afinidad de unión aumentada a un FcRn se une a FcRn con mayor afinidad que el polipéptido original. Un polipéptido variante que presenta unión disminuida o afinidad de unión disminuida a un FcRn se une a FcRn con afinidad inferior que su polipéptido original. Tales variantes que presentan unión disminuida a un FcRn pueden presentar poca o ninguna unión apreciable a un FcRn, por ejemplo, el 0-20% de unión al FcRn en comparación con un polipéptido original. Un polipéptido variante que se une a un FcRn con quot;afinidad potenciadaquot; en comparación con su polipéptido original es uno que se une a FcRn con afinidad de unión superior que el polipéptido original, cuando las cantidades de polipéptido variante y polipéptido original en un ensayo de unión son esencialmente la mis
mas, y todas las otras condiciones son idénticas. Por ejemplo, un polipéptido va riante con afinidad de unión a FcRn potenciada puede presentar un aumento de desde aproximadamente 1,10 veces hasta aproximadamente 100 veces (más normalmente desde aproximadamente 1,2 veces hasta aproximadamente 50 veces) en la afinidad de unión a FcRn en comparación con el polipéptido original, en el que la afinidad de unión a FcRn se determina, por ejemplo, en un ensayo ELI SA u otro método disponible para un experto habitual en la técnica. Tal como se usa en el presente documento, una quot;sustitución aminoácidoquot; se refie re al reemplazo de al menos un residuo de aminoácido existente en una secuencia de aminoácidos dada por otro residuo de aminoácido de quot;reemplazoquot; diferente.
El residuo o residuos de reemplazo pueden ser quot;residuos de aminoácido que se producen de manera naturalquot; (es decir, codificados por el código genético) y se leccionados de: alanina (Ala); arginina (Arg); asparagina (Asn); ácido aspártico (Asp); cisteína (Cys); glutamina (Gln); ácido glutámico (Glu); glicina (Gly); histidina (His); isoleucina (lIe): leucina (Leu); lisina (Lys); metionina (Met); fenilalanina (Phe); prolina (Pro); serina (Ser); treonina (Thr); triptófano (Trp); tirosina (Tyr); y valina (Val). La sustitución por uno o más residuos de aminoácido que no se pro ducen de manera natural también se abarca por la definición de una sustitución de aminoácido en el presente documento. Un quot;residuo de aminoácido que no se produce de manera naturalquot; se refiere a un residuo, distinto de los residuos de aminoácido que se producen de manera natural enumerados anteriormente, que puede unirse covalentemente a residuo(s) de aminoácido adyacente(s) en una cadena de polipéptido. Los ejemplos de residuos de aminoácido que no se produ cen de manera natural incluyen norleucina, ornitina, norvalina, homoserina y otros análogos de residuos de aminoácido tales como los descritos en Ellman et al. Met. Enzym. 202: 301-336 (1991). El término quot;señal de ensayoquot; se refiere a la salida de cualquier método de detec ción de interacciones proteína-proteína, incluyendo pero sin limitarse a, medicio nes de absorbancia a partir de ensayos colorimétricos, intensidad fluorescente o desintegraciones por minuto. Los formatos de ensayo podrían incluir ELlSA, FACS u otros métodos. Un cambio en la quot;señal de ensayoquot; puede reflejar un cambio en la viabilidad celular y/o un cambio en la velocidad de disociación cinéti ca, la velocidad de asociación cinética o ambas. Una quot;señal de ensayo superior" se refiere a que el número de salida medido es más grande que otro número (por
ejemplo, una variante puede tener un número medido superior (más grande) en
un ensayo ELlSA en comparación con el polipéptido original). Una senal de ensayo quot;inferiorquot; se refiere a que el número de salida medido es más pequeno que otro número (por ejemplo, una variante puede tener un número medido inferior (más pequeno) en un ensayo ELlSA en comparación con el polipéptido original). El término quot;afinidad de uniónquot; se refiere a la constante de disociación en equilibrio (expresada en unidades de concentración) asociada con cada interacción de unión Fc-receptor de Fc. La afinidad de unión está directamente relacionada con
la razón de la velocidad de disociación cinética (notificada generalmente en unidades de inversa del tiempo, por ejemplo, segundos-1) dividida entre la velocidad de asociación cinética (notificada generalmente en unidades de concentración por unidad de tiempo, por ejemplo, molar/segundo). En general, no es posible establecer de manera inequívoca si los cambios en las constantes de disociación en equilibrio se deben a diferencias en las velocidades de asociación, las velocidades de disociación o ambas a menos que cada uno de estos parámetros se determine experimentalmente (por ejemplo, mediante mediciones de BIACORE o SAPIOYNE). Tal como se usa en el presente documento, el término quot;región bisagraquot; se refiere al tramo de aminoácidos en IgG1 humana que se extiende desde Glu216 hasta
Pr0230 de IgG1 humana. Pueden alinearse regiones bisagra de otros isotipos de
IgG con la secuencia de IgG1 colocando los residuos de cisteína primero y último que forman los enlaces S-S entre cadenas pesadas en las mismas posiciones. quot;C1qquot; es un polipéptido que incluye un sitio de unión para la región Fc de una inmunoglobulina. C1q junto con dos serina proteasas, C1r y C1s, forma el complejo C1, el primer componente de la ruta de COCo Tal como se usa en el presente documento, el término quot;anticuerpoquot; se usa de manera intercambiable con quot;inmunoglobulinaquot; o quot;Igquot;, se usa en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monocionales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo siempre que presenten la actividad funcional o actividad biológica deseada. Anticuerpos de cadena sencilla, y anticuerpos quiméricos, humanos, humanizados o primatizados (injertados con COR), así como anticuerpos de cadena sencilla quiméricos o injertados con COR, y similares, que comprenden partes derivadas de
diferentes especies, también se abarcan por la presente invención y el término quot;anticuerpoquot;. Las diversas partes de estos anticuerpos pueden unirse entre sí químicamente mediante técnicas convencionales, de manera sintética o pueden prepararse como una proteína contigua usando técnicas de ingeniería genética. Por ejemplo, pueden expresarse ácidos nucleicos que codifican para una cadena quimérica o humanizada para producir una proteína contigua. Véanse, por ejemplo, la patente estadounidense n.o 4.816.567; la patente europea n.o 0.125.023 81; la patente estadounidense n.o 4.816.397; la patente europea n.o 0.120.69481; el documento WO 86/01533; la patente europea n.o 0.194.276 81; la patente estadounidense n.o 5.225.539; la patente europea n.O 0.239.400 81 Y las patentes estadounidenses n.os 5.585.089 y 5.698.762. Véanse también Newman, R. et al. 8ioTechnology, 10:1455-1460, 1993, con respecto a anticuerpo primatizado, y Ladner et al., patente estadounidense n.o 4.946.778 y 8ird, R.E. et al., Science, 242:423-426, 1988, con respecto a anticuerpos de cadena sencilla. Se entiende que todas las formas de los anticuerpos que comprenden una región Fc (o parte de la misma) se abarcan en el presente documento dentro del término quot;anticuerpoquot;. Además, el anticuerpo puede marcarse con un marcador detectable, inmovilizarse sobre una fase sólida y/o conjugarse con un compuesto heterólogo (por ejemplo, una enzima o toxina) según métodos conocidos en la técnica. Tal como se usa en el presente documento, el término quot;fragmentos de anticuerpoquot; se refiere a una parte de un anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de cadena sencilla; péptidos de Fc o Fc', Fab y fragmentos de Fab, yanticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo conservan preferiblemente al menos parte de la bisagra y opcionalmente la región CH 1 de una cadena pesada de IgG. En otras realizaciones preferidas, los fragmentos de anticuerpo comprenden al menos una parte de la región CH2 o toda la región CH2. Tal como se usa en el presente documento, el término quot;fragmento funcionalquot;, cuando se usa en referencia a un anticuerpo monoclonal, pretende referirse a una parte del anticuerpo monoclonal que todavía conserva una actividad funcional. Una actividad funcional puede ser, por ejemplo, especificidad o actividad de unión a antígeno, especificidad o actividad de unión a receptor, actividad de función efectora y similares. Los fragmentos funcionales de anticuerpos monoclonales in
cluyen, por ejemplo, cadenas pesadas o ligeras individuales y fragmentos de las mismas, tales como Vl, VH y Fd; fragmentos monovalentes, tales como Fv, Fab, y Fab'; fragmentos bivalentes tales como F(ab')2; Fv de cadena sencilla (scFv); y fragmentos de Fc. Tales términos se describen en, por ejemplo, Harlowe y lane, Antibodies: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, Nueva York (1989); Molec. Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference (Myers, R.A. (ed.), Nueva York: VCH Publisher, Inc.); Huston et al., Cell Biophysics, 22:189-224 (1993); Pluckthun y Skerra, Met. Enzymol., 178:497-515 (1989) yen Day, E.D., Advanced Immunochemistry, segunda ed., Wiley-Liss, Inc., Nueva York, NY (1990). El término fragmento funcional pretende incluir, por ejemplo, fragmentos producidos mediante digestión con proteasas o reducción de un anticuerpo monoclonal y mediante métodos de ADN recombinante conocidos por los expertos en la técnica. Tal como se usa en el presente documento, el término quot;fragmentoquot; se refiere a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de al menos 5, 15, 20, 25, 40, 50, 70, 90, 100 o más residuos de aminoácido contiguos de la secuencia de aminoácidos de otro polipéptido. En una realización preferida, un fragmento de un polipéptido conserva al menos una función del polipéptido de longitud completa. Tal como se usa en el presente documento, el término quot;anticuerpo quiméricoquot; incluye inmunoglobulinas monovalentes, divalentes o polivalentes. Un anticuerpo quimérico monovalente es un dímero formado por una cadena pesada quimérica asociada a través de puentes disulfuro con una cadena ligera quimérica. Un anticuerpo quimérico divalente es un tetrámero formado por dos dímeros de cadena pesada-cadena ligera asociados a través de al menos un puente disulfuro. Una cadena pesada quimérica de un anticuerpo para su uso en seres humanos comprende una región de unión a antígeno derivada de la cadena pesada de un anticuerpo no humano, que se une a al menos una parte de una región constante de cadena pesada humana, tal como CH1 o CH2. Una cadena ligera quimérica de un anticuerpo para su uso en seres humanos comprende una región de unión a antígeno derivada de la cadena ligera de un anticuerpo no humano, unida a al menos una parte de una región constante de cadena ligera humana (Cl). También pueden prepararse anticuerpos, fragmentos o derivados que tienen cadenas ligeras y cadenas pesadas quiméricas de la misma especificidad de unión de región variable o diferente mediante la asociación apropiada de las cadenas polipeptídicas individuales, según etapas de método conocidas. Con este enfoque, se cultivan por separado huéspedes que expresan cadenas pesadas quiméricas de huéspedes que expresan cadenas ligeras quiméricas, y se recuperan por separado las cadenas de inmunoglobulina y entonces se asocian. Alternativamente, los huéspedes pueden cultivarse conjuntamente y se deja que las cadenas se asocien espontáneamente en el medio de cultivo, seguido por la recuperación del fragmento o inmunoglobulina ensamblada o tanto las cadenas tanto pesadas como ligeras pueden expresarse en la misma célula huésped. Se conocen en la técnica métodos para producir anticuerpos quiméricos (véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os: 6.284.471; 5.807.715; 4.816.567; Y 4.816.397). Tal como se usa en el presente documento, formas quot;humanizadasquot; de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) (es decir, anticuerpos humanizados) son anticuerpos que contienen una secuencia mínima, o ninguna secuencia, derivada de inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que se reemplazan residuos de una región hipervariable del receptor por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, se reemplazan residuos de la región de entramado (FR) de la inmunoglobulina humana por residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donador. Estas modificaciones se hacen generalmente para refinar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables (CDR) corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todos o sustancialmente todos los residuos de FR son los de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también puede comprender al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), normalmente la de una inmunoglobulina humana. Se describe un método a modo de ejemplo para generar anticuerpos humanizados en la patente estadounidense 5.225.539.
Tal como se usa en el presente documento, el término quot;inmunoadhesinaquot; designa moléculas similares a anticuerpos que combinan el dominio de unión de una proteína quot;adhesinaquot; heteróloga (por ejemplo, un receptor, un ligando o una enzima) con un dominio constante de inmunoglobulina. Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden una fusión de la secuencia de aminoácidos de la adhesina con la especificidad de unión deseada que es distinta del sitio de unión a y reconocimiento de antígeno (sitio de combinación de antígeno) de un anticuerpo (es decir, es quot;heterólogaquot;) con una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina. Tal como se usa el presente documento, el término quot;dominio de unión a ligandoquot; se refiere a cualquier receptor nativo o cualquier región o derivado de la misma que conserva al menos una capacidad de unión a ligando cualitativa de un receptor nativo correspondiente. En determinadas realizaciones, el receptor es de un polipéptido de la superficie celular que tiene un dominio extracelular que es homólogo a un miembro de la superfamilia génica de inmunoglobulinas. Otros receptores, que no son miembros de la superfamilia génica de inmunoglobulinas pero que no obstante se cubren específicamente por esta definición son receptores para citocinas, y en particular receptores con actividad tirosina cinasa (tirosina cinasas receptoras), miembros de las superfamilias de hematopoyetina y receptor de factor de crecimiento nervioso y moléculas de adhesión celular (por ejemplo, E-, L-Y P-selectinas). Tal como se usa en el presente documento, el término quot;dominio de unión a receptorquot; se refiere a cualquier ligando nativo para un receptor, incluyendo, por ejemplo, moléculas de adhesión celular, o cualquier región o derivado de tal ligando nativo que conserva al menos una capacidad de unión a receptor cualitativa de un ligando nativo correspondiente. Tal como se usa en el presente documento, el término quot;quimera de anticuerpoinmunoadhesinaquot; comprende una molécula que combina al menos un dominio de unión de un anticuerpo con al menos una inmunoadhesina. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, las quimeras de CD4-lgG biespecíficas descritas en Berg el al., PNAS (USA) 88:4723-4727 (1991) y Charnow el al., J. Immunol., 153: 4268 (1994).
Tal como se usa en el presente documento, un polipéptido quot;aisladoquot; es uno que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que interferirían con usos terapéuticos o de diagnóstico para el polipéptido, y pueden in5 cluir enzimas, hormonas y otros solutos proteínicos o no proteínicos. En determinadas realizaciones, el polipéptido aislado se purifica (1) hasta más del 95% en peso de polipéptidos tal como se determina mediante el método de Lowry, y preferiblemente, más del 99% en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante el 10 uso de un secuenciador de copa giratoria, o (3) hasta la homogeneidad mediante SDS-page en condiciones reductoras o no reductoras usando azul de Coomassie
o tinción de plata. El polipéptido aislado incluye el polipéptido in situ dentro de células recombinantes puesto que al menos un componente del entorno natural del polipéptido no estará presente. Sin embargo, habitualmente, el polipéptido aislado
se preparará mediante al menos una etapa de purificación. Tal como se usa en el presente documento, el término quot;tratamientoquot; se refiere tan to a tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas. Los suje tos o pacientes que necesitan tratamiento incluyen los que ya tienen el trastorno así como aquellos en los que va a prevenirse el trastorno.
20 Tal como se usa en el presente documento, el término quot;trastornoquot; y quot;enfermedadquot; se usan de manera intercambiable para referirse a cualquier estado que se beneficiaría del tratamiento con un polipéptido variante (un polipéptido que comprende una región Fc variante de la invención), incluyendo enfermedades o trastornos agudos y crónicos (por ejemplo, estados patológicos que predisponen a un pa
ciente a un trastorno particular). En determinadas realizaciones, el trastorno es cáncer. En determinadas realizaciones, el término quot;enfermedad autoinmunitariaquot; se usa de manera intercambiable con el término quot;trastorno autoinmunitarioquot; para referirse a un estado en un sujeto caracterizado por lesión celular, tisular y/u orgánica provocada por una reacción inmunológica del sujeto frente a sus propias
30 células, tejidos y/u órganos. El término quot;enfermedad inflamatoriaquot; se usa de manera intercambiable con el término quot;trastorno inflamatorioquot; para referirse a un estado en un sujeto caracterizado por inflamación. Los trastornos autoinmunitarios pueden estar asociados o no con inflamación. Además, la inflamación puede estar provocada o no por un trastorno autoinmunitario. Determinados trastornos pueden caracterizarse como trastornos tanto autoinmunitarios como inflamatorios. Tal como se usan en el presente documento, los términos quot;cáncerquot; y quot;cancerosoquot; se refieren a, o describen el estado fisiológico en mamíferos que se caracteriza normalmente por crecimiento celular no regulado. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan al carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Ejemplos más particulares de tales cánceres incluyen cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma del pulmón, carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carci
noma endometrial o uterino, carcinoma de glándulas salivales, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y diversos tipos de cáncer de cabeza y cuello. Tal como se usa en el presente documento, el término quot;marcadorquot; se refiere a un compuesto o com
posición detectable que se conjuga directa o indirectamente con un polipéptido. El marcador puede ser por sí mismo detectable (por ejemplo, marcadores de radioisótopos o marcadores fluorescentes) o, en el caso de un marcador enzimático, puede catalizar la alteración química de un compuesto o composición sustrato que es detectable. Tal como se usa en el presente documento, el término quot;receptorquot; se refiere a un polipéptido que puede unirse a al menos un ligando. El receptor preferido es un receptor soluble o de la superficie celular que tiene un dominio de unión a ligando extracelular y, opcionalmente, otros dominios (por ejemplo, dominio transmembrana, dominio intracelular y/o anclaje a membrana). Un receptor que va a evaluarse en un ensayo descrito en el presente documento puede ser un receptor intacto o un fragmento o derivado del mismo (por ejemplo una proteína de fusión que comprende el dominio de unión del receptor fusionado a uno o más polipéptidos heterólogos). Además, el receptor que va a evaluarse para determinar sus propiedades de unión puede estar presente en una célula o aislado y opcionalmente recubierto sobre una placa de ensayo o alguna otra fase sólida o puede marcarse directamente y usarse como sonda.
Tal como se usa en el presente documento, el término quot;enfermedad sensible a anticuerposquot; se refiere a cualquier enfermedad o estado médico que se muestra que puede tratarse, al menos en parte, con terapia con anticuerpos. Los ejemplos de tales enfermedades y estados médicos incluyen, pero no se limitan a, linfoma (que se muestra que puede tratarse con RITUXAN), enfermedad infecciosa (virus sincitial respiratorio que se muestra que puede tratarse con SYNAGIS), trasplante de riñón (ZENAPAX ha mostrado ser útil), enfermedad de Crohn y artritis reumatoide (que se muestra que pueden tratarse con REMICADE), carcinoma de mama (que se muestra que puede tratarse con HERCEPTIN) y cáncer de colon (que se muestra que puede tratarse con EDRECOLOMAB). Tal como se usa en el presente documento, el término quot;enfermedad sensible a inmunoadhesinasquot; se refiere a cualquier enfermedad o estado médico que se muestra que puede tratarse, al menos en parte, con terapia con inmunoadhesinas. Tal como se usa en el presente documento, un polipéptido variante que quot;media en la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) en presencia de células efectoras humanas más eficazmentequot; que un anticuerpo original es uno que in vitro o in vivo es sustancialmente más eficaz en la mediación de la ADCC, cuando las cantidades de polipéptido variante y anticuerpo original usadas en el ensayo son esencialmente las mismas. Por ejemplo, una variante de este tipo provoca una cantidad superior de lisis de células diana en un ensayo de ADCC dado que el polipéptido original en un ensayo de ADCC idéntico. Tales variantes pueden identificarse, por ejemplo, usando un ensayo de ADCC, pero pueden emplearse también otros ensayos o métodos para determinar la actividad de ADCC (por ejemplo, modelos animales). En realizaciones preferidas, el polipéptido variante es desde aproximadamente 1,2, 1,3 ó 1,4 veces, 1,5 veces, 50 veces, 100 veces, aproximadamente 500 veces o aproximadamente 1000 veces más eficaz en la mediación de la ADCC el polipéptido original. El término quot;síntomas de una enfermedad sensible a anticuerpos o inmunoadhesinasquot; se refiere a los síntomas generalmente asociados con una enfermedad particular. Por ejemplo, los síntomas normalmente asociados con la enfermedad de Crohn incluyen: dolor abdominal, diarrea, hemorragia rectal, pérdida de peso, fiebre, pérdida de apetito, deshidratación, anemia, distensión, fibrosis, intestinos inflamados y malnutrición. La frase quot;en condiciones tales que los síntomas se reducenquot; se refiere a cualquier grado de reducción cualitativa o cuantitativa en sínto
mas detectables de cualquier enfermedad sensible a anticuerpos o inmunoadhesinas, incluyendo pero sin limitarse a, un impacto detectable en la tasa de recuperación de la enfermedad (por ejemplo, tasa de ganancia de peso), o la reducción de al menos uno de los síntomas normalmente asociados con la enfermedad particular (por ejemplo, si la enfermedad sensible a anticuerpos o inmunoadhesinas era enfermedad de Crohn, una reducción en al menos uno de los siguientes síntomas: dolor abdominal, diarrea, hemorragia rectal, pérdida de peso, fiebre, pérdida de apetito, deshidratación, anemia, distensión, fibrosis, intestinos inflamados y malnutrición).
Un anticuerpo de longitud completa (quot;inmunoglobulinaquot; o quot;Igquot;) tal como existe de manera natural es una molécula de inmunoglobulina compuesta por cuatro cad enas peptídicas, dos cadenas pesadas (H) (de aproximadamente 50-70 kOa cuando son de longitud completa) y dos cadenas ligeras (L) (de aproximadamente 25 kOa cuando son de longitud completa) interconectadas por puentes disulfuro. La parte amino-terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100-110 o más aminoácidos responsable principalmente del reconocimiento del antígeno. La parte carboxilo terminal de cada cadena define una región constante responsable principalmente de una función efectora. Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda y se caracterizan por una región constante particular. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgG, IgM, IgA, IgO e IgE, respectivamente. Cada tipo de cadena pesada se caracteriza por una región constante particular. Cada cadena pesada está compuesta por una región variable de cadena pesada (en el presente documento quot;HCVRquot;) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada está compuesta por tres dominios (CH 1, CH2, y CH3) para IgG, IgO e IgA; y 4 dominios (CH1, CH2, CH3 y CH4) para IgM e IgE. Cada cadena ligera está compuesta por una región variable de cadena ligera (en el presente documento quot;LCVRquot;) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera está compuesta por un dominio, CL. Las regiones HCVR y LCVR pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones de entramado (FR). Cada HCVR y LCVR está compuesta por tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino-terminal hasta el extremo carboxilo-terminal en el siguiente orden: FR1 , CDR1 , FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. La asignación de aminoácidos a cada dominio es según convenciones bien conocidas [por ejemplo, Kabat, quot;Sequences of Proteins of Immunological I nte restquot; , National Institutes of Health, Betesda, Md. (1991)]. La capacidad funcional de un anticuerpo para unirse a un antígeno particular está determinada colectivamente por las seis CDR. Sin embargo, incluso un único dominio variable que comprende sólo tres CDR específicas para un antígeno puede tener la capacidad para reconocer y unirse al antígeno, aunque a una afinidad inferior que un Fab completo. Pueden producirse anticuerpos monoclonales usando por ejemplo técnicas de hibridoma bien conocidas en la técnica, así como tecnologías recombinantes, tecnologías de presentación en fago, tecnologías sintéticas o combinaciones de tales tecnologías fácilmente conocidas en la técnica. El término quot;anticuerpo monoclonalquot; tal como se usa en el presente documento no se limita a anticuerpos producidos a través de la tecnología de hibridoma. quot;Anticuerpo monoclonalquot; se refiere a
un anticuerpo que se deriva de una única copia o clon, incluyendo por ejemplo, cualquier clon eucariota, procariota o de fago, y no al método mediante el que se produce. Un quot;anticuerpo monoclonalquot; puede ser un anticuerpo intacto (completo o de longitud completa), un anticuerpo sustancialmente intacto, un fragmento funcional de un anticuerpo o puede ser un anticuerpo quimérico, anticuerpo humano
o anticuerpo humanizado. Una población de quot;anticuerpos monoclonalesquot; se refiere a una población de anticuerpos homogénea o sustancialmente homogénea (o pura) (es decir, al menos aproximadamente el 90%, el 91 %, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, más preferiblemente al menos aproximadamente el 97% o el 98% o lo más preferiblemente al menos el 99% de los anticuerpos en la población son idénticos y competirían en un ensayo ELlSA por el mismo antígeno o epítopo). El término quot;se une específicamentequot; o quot;se une preferentementequot; tal como se usa en el presente documento se refiere a la situación en la que un miembro de un par de unión específica no se une significativamente a moléculas distintas de su(s) pareja(s) de unión específica. El término también puede aplicarse cuando, por ejemplo, un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo de la invención es específico para un epítopo particular que portan varios antígenos, en cuyo caso el anticuerpo específico que porta el dominio de unión a antígeno podrá unirse a los diversos antígenos que portan el epítopo. La región Fc se refiere la parte de un anticuerpo intacto, por ejemplo, IgG, generada por digestión con la enzima papaína (véase la figura 1). La región Fc es un homodímero, estando compuesta cada cadena por una parte de la región bisagra así como los dominios CH2 y CH3. La región Fc es un dímero debido a los puentes disulfuro intercatenarios formados entre las regiones bisagra y múltiples enlaces no covalentes entre los dominios CH3. IgG es la clase más abundante de Ig en el cuerpo, constituyendo aproximadamente el 75% de la inmunoglobulina total y distribuida equitativamente dentro de los conjuntos intravascular y extravascular. Se produce muy poca IgG durante las fases tempranas de la respuesta primaria a
un antígeno pero es la forma principal de anticuerpo producido durante la respuesta secundaria. Tal como se describió anteriormente, los anticuerpos tienen regiones, principalmente las regiones CH2 y CH3, que participan en funciones distintas de la unión al antígeno. Conjuntamente, estas regiones y una parte de la secuencia de ligador se conocen generalmente como la región Fc, y tienen varias funciones efectoras mediadas por la unión de moléculas efectoras. Las funciones efectoras mediadas por la región Fc del anticuerpo pueden dividirse en dos categorías: (1) funciones efectoras que funcionan tras la unión del anticuerpo a un antígeno (estas funciones implican, por ejemplo, la participación de la cascada del complemento o células que llevan receptor de Fc (FcR)); y (2) funciones efectoras que funcionan independientemente de la unión al antígeno (estas funciones confieren, por ejemplo, persistencia en la circulación y la capacidad para transferirse a través de barreras celulares mediante transcitosis). Por ejemplo, la unión del componente C1q del complemento a anticuerpos activa el sistema del complemento. Tras la opsonización, la activación del complemento es importante en la lisis de patógenos celulares. La activación del complemento también estimula la respuesta inflamatoria y también puede participar en la hipersensibilidad autoinmunitaria. Además, los anticuerpos se unen a células mediante la región Fc, con un sitio de unión a receptor de Fc en la región Fc del anticuerpo que se une a un FcR sobre una célula. Hay varios FcR que son específicos para diferentes clases de anticuerpo, incluyendo IgG, IgE, IgA e IgM. Aunque la presente invención no se limita a ningún mecanismo particular, la unión del anticuerpo a FcR sobre una superficie celular desencadena varias respuestas biológicas importantes y diversas incluyendo absorción y destrucción de partículas recubiertas con anticuerpos, aclaramiento de complejos inmunitarios, lisis de células diana recubiertas con anticuerpos por células cito líticas (ADCC), liberación de mediadores inflamatorios, transferencia placentaria y control de la producción de inmunoglobulinas. Varias funciones efectoras de anticuerpos están mediadas por FcR, que se unen a la región Fc de un anticuerpo. Los FcR se definen por su especificidad por isotipos de inmunoglobulinas; los receptores de Fc para anticuerpos de IgG se denominan FcyR, para IgE FCER, para IgA FcaR y así sucesivamente. Se han identifi
cado tres subclases de FcyR: FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) y FcyRIII (CD16). Debido a que cada subclase de FcyR se codifica por dos o tres genes, y el corte y empalme alternativo del ARN conduce a múltiples transcritos, existe una amplia diversidad de isoformas de FcyR. Los tres genes que codifican para la subclase FcyRI (FcyRIA, FcyRIB Y FcyRIC) están agrupados en la región I q21.1 del brazo largo del cromosoma 1; los genes que codifican para las isoformas de FcyRII (FcyRIIA, FcyRIIB Y FcyRIIC) y los dos genes que codifican para FcyRlI1 (FcyRIIIA Y FcyRIIIB) están agrupados todos en la región 1q22. Estos diferentes subtipos de FcR se expresan en diferentes tipos de células (por ejemplo, Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-492 (1991». Por ejemplo, en seres humanos, FcyRlIlB se encuentra sólo en neutrófilos, mientras que FcyRlIlA se encuentra en macrófagos, monocitos, células NK y una subpoblación de células T. De manera notable, FcyRIIIA está presente en células NK, uno de los tipos de células implicadas en la ADCC. El receptor FcyRlIlA humano (CD16) tiene un polimorfismo común en la posición 158 en su dominio extracelular que codifica para o bien una fenilalanina o bien una valina en esta posición. El alelo V de FcyRIIIA tiene afinidad superior por IgG1 humana que el alelo F. El alelo V158 también media en la ADCC más eficazmente. Datos clínicos han mostrado una correlación entre el genotipo de receptor FcyRIIIA en pacientes que se someten a tratamiento con Rituxan y la respuesta terapéutica. Se mostró que tanto las respuestas clínicas y moleculares como el tiempo hasta la progresión eran superiores en pacientes homocigotos para el ge
notipo FcyRIIIA-158V (aproximadamente el 20% de la población). En contraposición, pacientes heterocigotos u homocigotos para el genotipo FcyRIIIA-1 58F de afinidad inferior (aproximadamente el 80% de la población) responden peor. Estos datos sugieren que mutaciones de Fc que potencian la actividad de ADCC de los portadores de 158F podrían potenciar la eficacia clínica de la terapia del cáncer a base de anticuerpos. También está presente un polimorfismo genético en el receptor FcyRIIA humano (CD32) en la posición 131 en su dominio extracelular que codifica para o bien una histidina (H) o bien una arginina (R) en esta posición. Se ha encontrado que el polimorfismo en la posición 131 afecta a su capacidad para unirse a IgG humana. Datos recientes también muestran una correlación entre el polimorfismo en la posición 131 de FcyRIIA y la respuesta clínica a Rituxan. Pacientes homocigotos para el alelo H 131 tenían una tasa de respuesta significativamente superior que los otros 2 grupos. FcyRI, FcyRII Y FcyRlI1 son receptores de la superfamilia de inmunoglobulinas (lgSF); FcyRI tiene tres dominios IgSF en su dominio extracelular, mientras que FcyRII y FcyRlI1 tienen sólo dos dominios IgSF en sus dominios extracelulares. Otro tipo de receptor de Fc es el receptor de Fc neonatal (FcRn). FcRn es estructuralmente similar al complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) y consiste en una cadena a unida no covalentemente a 2-microglobulina.
Fc variantes La presente invención proporciona polipéptidos variantes, secuencias de ácido nucleico que codifican para los polipéptidos variantes y métodos para generar polipéptidos variantes. Preferiblemente, los polipéptidos variantes de la presente invención difieren de un polipéptido original por al menos una modificación de aminoácido, preferiblemente una sustitución de aminoácido. Un polipéptido quot;originalquot;, quot;de tipo naturalquot;, quot;de partidaquot; o quot;no variantequot; comprende preferiblemente al menos una parte de una región Fc de anticuerpo y la sustitución de aminoácido en el polipéptido variante se produce dentro de la región Fc. Un polipéptido original que comprende una región Fc puede prepararse usando técnicas disponibles en la técnica para generar polipéptidos que comprenden una región Fc o parte de la misma. En realizaciones preferidas, el polipéptido original es un anticuerpo. Sin embargo, el polipéptido original puede ser cualquier otro polipéptido que com
prenda al menos una parte de una región Fc (por ejemplo, una inmunoadhesina).
La parte de la región Fc en el polipéptido original puede ser de una secuencia na
tiva o no nativa, preferiblemente es una secuencia nativa de origen humano. En
determinadas realizaciones, puede generarse una región Fc variante (por ejem
5
plo, según los métodos dados a conocer en el presente documento) y puede fu
sionarse a un polipéptido heterólogo de elección, tal como un dominio variable de
anticuerpo o dominio de unión de un receptor o ligando, o cualquier polipéptido te
rapéutico.
En realizaciones preferidas, el polipéptido original comprende una región Fc o par
lO
te funcional de la misma. Generalmente, la región Fc del polipéptido original com
prenderá una región Fc de secuencia nativa, y preferiblemente una región Fc de
secuencia nativa humana. Sin embargo, la región Fc del polipéptido original pue
de tener una o más alteraciones o modificaciones en la secuencia de aminoácidos
preexistente (por ejemplo, una sustitución de aminoácido) con respecto a una re
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gión Fc de secuencia nativa. Por ejemplo, la actividad de unión a C1q de la región
Fc puede haberse alterado previamente o la afinidad de unión a FcyR de la región
Fc puede haberse alterado. La región Fc variante deseada o el ácido nucleico que
codifica para la región Fc variante de interés puede construirse mientras que no
está operativamente unida a la pareja de fusión deseada de la región Fc variante,
20
(por ejemplo, una región variable de anticuerpo, una proteína heteróloga) y luego
modificarse por ingeniería genética posteriormente para que esté operativamente
unida a la misma. En realizaciones adicionales, la región Fc del polipéptido origi
nal es conceptual (por ejemplo, ideada o una representación visual en un ordena
dor o en papel) y, aunque no existe físicamente, el ingeniero de anticuerpos pue
25
de decidir sobre una secuencia de aminoácidos de la región Fc variante y generar
un polipéptido que comprende esa secuencia o un ADN que codifica para la se
cuencia de aminoácidos de la región Fc variante deseada. Sin embargo, en reali
zaciones preferidas, está disponible un ácido nucleico que codifica para una re
gión Fc de un polipéptido original y esta secuencia de ácido nucleico se altera pa
30
ra generar una secuencia de ácido nucleico variante que codifica para la región Fc
variante.
Puede prepararse ácido nucleico que codifica para una variante del polipéptido
original (o simplemente una región Fc variante) mediante métodos conocidos en
la técnica usando la orientación de la presente memoria descriptiva para secuen
cias particulares. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a, la preparación mediante mutagénesis dirigida al sitio (o mediada por oligonucleótidos), mutagénesis por PCR (por ejemplo, Valletle et al., Nuc. Acids Res. 17:723-733 (1989) y mutagénesis de casete (por ejemplo, Wells et al., Gene 34:315-323 (1985) de un ácido nucleico preparado anteriormente que codifica para el polipéptido. La mutagénesis dirigida al sitio es un método preferido para preparar variantes. Esta técnica se conoce bien en la técnica (véase, por ejemplo, Carter et al. Nucleic Acids Res. 13: 4431-4443 (1985) Y Kunkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488 (1 987)). Alternativamente, o adicionalmente, puede determinarse la secuencia de aminoácidos deseada que codifica para un polipéptido variante, y puede generarse de manera sintética una secuencia de ácido nucleico que codifica para tal secuencia de aminoácidos del polipéptido variante (es decir, polipéptido que comprende una región Fc variante que comprende una sustitución de aminoácido tal como se describe en el presente documento). Esto se considera todavía que es una región Fc variante de una región Fc original aún cuando la región Fc original no era el precursor molecular de la región Fc variante sino en su lugar la secuencia de aminoácidos de la región Fc presente en el original en ausencia de la sustitución de aminoácido deseada. La secuencia de aminoácidos del polipéptido original puede modificarse con el fin de generar una región Fc variante con afinidad o actividad de unión al receptor de Fc in vitro y/o in vivo alteradas; y/o actividad de ADCC alterada in vitro y/o in vivo; y/o actividad de CDC alterada in vitro y/o in vivo. La secuencia de aminoácidos del polipéptido original también puede modificarse con el fin de generar una región Fc variante con propiedades de unión al complemento y/o semivida en circulación alteradas. Pueden lograrse modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas de la región Fc seleccionando sustituciones de aminoácidos que difieren significativamente en su efecto sobre la alteración de (a) la estructura de la cadena principal del polipéptido en la zona de la sustitución, por ejemplo, como una conformación de lámina o hélice, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o el volumen de la cadena lateral, (d) la interacción con hidrato de carbono o (e) la flexibilidad del movimiento de dominios. Los residuos que se producen de manera
natural se dividen en clases basándose en sus propiedades de cadena lateral comunes:
(1)
hidrófobos: norleucina, met, ala, val, leu, ile;
(2)
hidrófilos neutros: cys, ser, thr;
(3)
ácidos: asp, glu;
(4)
básicos: asn, gln, his, Iys, arg;
(5)
residuos que influyen en la orientación de la cadena: gly, pro; y
(6)
aromáticos: trp, tyr, phe.
Sustituciones no conservativas implicarán intercambiar un miembro de una de estas clases por un miembro de otra clase. Sustituciones conservativas implicarán intercambiar un miembro de una de estas clases por otro miembro de la misma
clase. Tal como se demuestra en los ejemplos a continuación, puede diseñarse por in geniería genética una región Fc variante con actividad alterada (función/funciones efectora(s) y/o farmacocinética). Por ejemplo, pueden modificarse uno o más resi duos de aminoácido de la región Fc con el fin de alterar (por ejemplo, aumentar o disminuir) la actividad de ADCC o la actividad de CDC o la afinidad de unión a
FcRn. En realizaciones preferidas, una modificación es una sustitución enumerada en la tabla 1 en el presente documento. Generalmente, se hará una sustitución de aminoácido en uno o más de los residuos de la región Fc que se identifica en el presente documento que afectan a la actividad de ADCC con el fin de generar una región Fc variante de este tipo. En realizaciones preferidas, se sustituirán no más de uno a aproximadamente diez residuos de la región Fc. Las regiones Fc en el presente documento que comprenden una o más sustituciones de aminoácidos conservarán preferiblemente al menos aproximadamente el 80%, y preferiblemente al menos aproximadamente el 90%, y lo más preferiblemente al menos aproximadamente el 95%, de la secuencia de región Fc original o de una secuencia de
región Fc humana nativa.
Introduciendo la(s) modificación/modificaciones en la secuencia de aminoácidos apropiada(s) en una región Fc original, puede generarse una región Fc variante que (en comparación con la región Fc original) (a) media en la AOCC en presencia de células efectoras humanas más o menos eficazmente y/o (b) media en la COC en presencia de complemento humano más o menos eficazmente y/o (c) se une a C1q con una afinidad deseada y/o (d) se une a un receptor de Fc gamma (FcyR) o receptor de Fc neonatal (FcRn) con una afinidad deseada. Tales regiones Fc variantes comprenderán generalmente al menos una modificación de ami
noácido en la región Fc. Preferiblemente, la modificación es una sustitución de aminoácido, más preferiblemente una sustitución de aminoácido enumerada en las tablas 1-9 en el presente documento.
En realizaciones preferidas, la región Fc del polipéptido original es una región Fc humana o fragmento funcional de la misma, por ejemplo, una región Fc humana nativa de IgG1 (alotipos f y a,z), IgG2, IgG3, IgG4 humanas, y todos los alotipos conocidos o descubiertos de cualquier especie. Tales regiones tienen secuencias nativas tales como, por ejemplo, las mostradas en la figura 2 (SEQ ID NO:1-8), y
la figura 3 (SEQ ID NO: 9-12) en el presente documento.
En determinadas realizaciones, con el fin de generar una región Fc variante con actividad de AOCC potenciada, el polipéptido original tiene preferiblemente actividad de AOCC preexistente (por ejemplo, el polipéptido original comprende una región Fc de IgG1 humana o IgG3 humana). En algunas realizaciones, una va
riante tiene actividad de AOCC potenciada (por ejemplo, mayores niveles en comparación con el original según un ensayo de ADCC descrito en el presente docu mento) en comparación con el polipéptido original, es decir, un anticuerpo mono clonal que comprende la región Fc variante tiene actividad de ADCC potenciada tal como se compara en circunstancias idénticas con un anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc original o una secuencia de región Fc de IgG1 o IgG3 nativa pero por lo demás idéntica al anticuerpo monoclonal que comprende la re gión Fc variante. En realizaciones preferidas, se introduce(n) sustitución/sustituciones de aminoáci do(s) en los dominios CH2 y/o CH3 de una región Fc. En realizaciones preferidas,
la región Fc original usada como molde para generar tales variantes comprende
una región Fc de IgG humana.
En determinadas realizaciones, con el fin de generar una región Fc variante con
actividad de COC potenciada, el polipéptido original tiene preferiblemente activi
5
dad de COC preexistente. En algunas realizaciones, una variante tiene actividad
de COC potenciada (por ejemplo, mayores niveles en comparación con el original
según un ensayo de COC descrito en el presente documento) en comparación
con el polipéptido original, es decir, un anticuerpo monoclonal que comprende la
región Fc variante tiene actividad de COC potenciada tal como se compara en cir-
IO
cunstancias idénticas con un anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc
original o una secuencia de región Fc de IgG1 o IgG3 nativa pero por lo demás
idéntica al anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc variante.
Los polipéptidos variantes descritos en el presente documento pueden someterse
a modificaciones adicionales, dependiendo del uso deseado o previsto del poli
15
péptido. Tales modificaciones pueden implicar, por ejemplo, una alteración adicio
nal de la secuencia de aminoácidos (sustitución, inserción y/o deleción de resi
duos de aminoácido), modificaciones con hidratos de carbono, fusión a polipépti
do(s) heterólogo(s) y/o modificaciones covalentes. Tales modificaciones adiciona
les pueden hacerse antes de, simultáneamente con o después de la(s) modifica
20
ción/modificaciones de aminoácido(s) dada(s) a conocer en el presente documen
to que da(n) como resultado una alteración de la unión al receptor de Fc y/o acti
vidad de AOCC y/o actividad de COCo
Alternativa o adicionalmente, puede ser útil combinar modificaciones de aminoá
cidos con una o más modificaciones de aminoácidos adicionales que alteran la
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unión a C1 q y/o la función de COC de la región Fc. Por ejemplo, el polipéptido de
partida puede ser incapaz de unirse a C1q y/o mediar en la COC y puede modifi
carse según las enseñanzas en el presente documento de manera que adquiere
estas funciones efectoras adicionales. Además, pueden modificarse polipéptidos
con actividad de unión a C1 q preexistente, opcionalmente que tienen además la
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capacidad para mediar en la COC, de manera que una o ambas de estas activi
dades se potencian (o alternativamente, se disminuyen). Se describen en el pre
sente documento determinadas modificaciones de aminoácidos en la región Fc
que alteran la unión a C1q y/o modifican la actividad de COC (véanse las tablas 2,
7, 8 Y 10) y, por ejemplo, en el documento W00042072.
Tal como se dio a conocer anteriormente, puede diseñarse una región Fc o parte de la misma con función efectora alterada, por ejemplo, modificando la actividad de CDC y/o la actividad de ADCC. Por ejemplo, puede generarse una región Fc variante con actividad de CDC mejorada y actividad de ADCC mejorada. Alterna5 tivamente, cuando se desea que una función efectora se reduzca o se suprima, puede diseñarse por ingeniería genética una región Fc variante con actividad de CDC reducida y/o actividad de ADCC reducida. En otras realizaciones, puede aumentarse sólo una de estas actividades, y opcionalmente también reducirse la otra actividad, por ejemplo, para generar una región Fc variante con actividad de
10 ADCC mejorada, pero actividad de CDC reducida y viceversa. Adicionalmente, puede diseñarse por ingeniería genética una región Fc variante con afinidad de unión modificada a FcRn, proteína A y/u otras proteínas de unión a Fc. En algunas realizaciones, la presente descripción proporciona composiciones que comprenden una variante de un polipéptido original, en las que el original com
15 prende una región Fc (o parte de la misma) yen las que la variante comprende al menos una modificación de aminoácido de residuos de superficie dentro de la región Fc (véase, por ejemplo, Deisenhofer, Biochemistry, 20:2361-70, abril de 1981 , Y documento W00042072). En otras realizaciones, la presente descripción proporciona composiciones que comprenden una variante de un polipéptido origi
20 nal que tiene una región Fc, en las que la variante comprende al menos una modificación de aminoácido de residuos de superficie en la región Fc. En realizaciones adicionales, la presente descripción comprende una variante de un polipéptido original que tiene una región Fc, comprendiendo la variante al menos una modificación de aminoácido de superficie y al menos una modificación de aminoácido no de superficie, ambas en la región Fc.
Variantes de combinación En algunas realizaciones, una región Fc variante comprende dos o más modificaciones de aminoácidos (por ejemplo, sustituciones). Tales variantes de combina
30 ción pueden producirse, por ejemplo, seleccionando dos o más de las sustituciones de aminoácidos detalladas anteriormente (por ejemplo, véase la tabla 1), o una o más sustituciones de aminoácidos enumeradas en la tabla 1 además de una sustitución conocida en la técnica.
Las variantes de combinación mostradas en la tabla 10 Y otras variantes de com
binación (tales como las sustituciones dadas conocer en el documento W00042072 usadas en combinación con las dadas a conocer en el presente documento) pueden someterse a prueba para determinar una actividad dada (por ejemplo, actividad de unión a FcRn, actividad de ADCC y actividad de CDC) en una variedad de ensayos (véanse los ejemplos a continuación). En este sentido, pueden identificarse variantes de combinación útiles. En determinadas realizaciones preferidas, las múltiples sustituciones de aminoácidos presentes en una región Fc variante tienen una sustitución de aminoácido que aumenta la actividad de ADCC, y una modificación de aminoácido que aumenta la afinidad de unión a receptor de Fc neonatal (FcRn) (por ejemplo, a pH 6,0) del polipéptido que comprende la región Fc variante. En otras realizaciones, las variantes de combinación tienen un aminoácido de superficie en una región Fc variante de la presente invención, y una modificación de aminoácido de no superficie. Pueden generarse variantes de combinación adicionales en las regiones Fc variantes de la presente invención combinando dos o más de las sustituciones de aminoácidos descritas en el presente documento, o al menos una de las sustituciones de aminoácidos descritas en el presente documento con las descritas en, por ejemplo, el documento W00042072.
de variantes La presente descripción proporciona diversos ensayos para seleccionar regiones Fc variantes o polipéptidos que comprende una región Fc variante. Pueden usarse ensayos de selección para encontrar o confirmar variantes útiles. Por ejemplo, pueden seleccionarse variantes de combinación (véase, por ejemplo, la tabla 10) para encontrar variantes con unión a FcR alterada, y/o actividad de ADCC alterada y/o de CDC alterada (por ejemplo, actividad de ADCC o CDC aumentada o disminuida) y/o capacidad modificada para agotar células diana (células B, por ejemplo) a partir de sangre completa. Además, tal como se describe a continuación, los ensayos pueden emplearse para encontrar o confirmar variantes que tienen actividad terapéutica beneficiosa en un sujeto (por ejemplo, tal como un ser humano con síntomas de una enfermedad sensible a anticuerpos o inmunoadhesinas). Puede emplearse una variedad de tipos de ensayo para evaluar cualquier cambio en una variante en comparación con el polipéptido original (ensayos de selección proporcionados por ejemplo en el documento W00042072). Se describen a continuación ensayos a modo de ejemplo adicionales. En realizaciones preferidas, un polipéptido variante (es decir, polipéptido que comprende una región Fc variante o parte funcional de la misma) es un anticuerpo monoclonal que conserva esencialmente la capacidad para unirse específicamente a un antígeno (mediante una región de unión a antígeno no modificada o región de unión a antígeno modificada) en comparación con el polipéptido original (por ejemplo, la capacidad de unión es preferiblemente menos de 20 veces, 10 veces, 7 veces o menos de aproximadamente 5 veces diferente de la del polipéptido original). La capacidad de unión del polipéptido variante al antígeno puede determinarse usando técnicas tales como ELlSA, análisis de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) o radioinmunoprecipitación (RIA), por ejemplo pueden emplearse ensayos de unión a FcR para evaluar las variantes de la presente invención. Por ejemplo, puede medirse la unión a receptores de Fc tales como FcyRI, FcyRlla, FcyRllb, FcyRIII, FcRn, etc., titulando un polipéptido variante y midiendo el polipéptido variante unido usando un anticuerpo que se une al polipéptido variante en un formato de ELlSA (véanse los ejemplos a continuación). Por ejemplo, puede seleccionarse una variante que comprende un anticuerpo en un ensayo ELlSA convencional para determinar la unión a un FcRn a pH 6,0 y pH 7,0
o pH 7,4. Puede usarse una superficie sólida recubierta con estreptavidina o neutravidina para capturar FcRn marcado con biotina de cualquier especie, tal como ratón o ser humano. Tras bloquear, el receptor de captura puede incubarse con polipéptidos variantes (por ejemplo, anticuerpos) diluidos en tampones a pH 6,0 o pH 7,0. En la siguiente etapa, se añade una molécula específica para anticuerpos humanos (por ejemplo, (Fab'h de cabra anti-Fab humano conjugado con una enzima). Después de eso, puede añadirse un sustrato con el fin de determinar la cantidad de unión del polipéptido variante al FcRn inmovilizado a pH 6,0 o pH 7,0
o pH 7,4. Los resultados de este ensayo pueden compararse con la capacidad del polipéptido original (no variante) para unirse al mismo FcR. En otras realizaciones preferidas, los componentes para llevar a cabo un ELlSA (por ejemplo, con FcRn) para seleccionar variantes están envasados en un kit (por ejemplo, con instrucciones para su uso).
También puede emplearse un ensayo de ADCC para seleccionar las variantes. Los ensayos de ADCC pueden realizarse in vitro o in vivo. Para evaluar la actividad de ADCC de un polipéptido variante, puede realizarse un ensayo de ADCC in vitro usando razones de efector:diana variables. Un ensayo de ADCC a modo de ejemplo podría usar una línea celular diana que expresa cualquiera de los siguientes antígenos diana: CD20, CD22, CD33, CD40, CD63, receptor de EGF, receptor her-2, antígeno de membrana específico de la próstata, hidrato de carbono de Lewis Y, gangliósidos GD2 y GD3, lamp-i, CO-029, L6 y ephA2. Pueden obtenerse células efectoras de un donante sano (por ejemplo, el día del experimento) y PBMC purificadas usando Histopaque (Sigma). Entonces se incuban previamente las células diana con una IgG que comprende una región Fc variante de la invención a, por ejemplo, 0,1 -1.000 ng/ml durante aproximadamente 30 minutos antes de mezclar con células efectoras a razones de efector:diana de, por ejemplo,
40: 1, 20: 1 y 10: 1. Entonces puede medirse la actividad de ADCC colorimétricamente usando un kit de detección de citotoxicidad (Roche Molecular Biochemicals) para la cuantificación de la lisis y muerte celular basándose en la medición de la actividad lactato deshidrogenasa (LDH) liberada del citosol de células dañadas al sobrenadante. La actividad de ADCC también puede medirse, para ensayos de células diana cargadas con cromo, midiendo la liberación de cromo 51 resultante. Puede determinarse la citotoxicidad celular independiente de anticuerpos midiendo la actividad LDH de células efectoras y diana en ausencia de anticuerpo. Puede medirse la liberación total tras la adición de Triton X-100 al 1 % a la mezcla de células efectoras y diana. La incubación de las células efectoras y diana puede realizarse durante un periodo de tiempo optimizado (0,54-18 horas) a 37°C en un 5,0% de CO2 y al que luego le sigue la centrifugación de las placas de ensayo. Los sobrenadantes pueden transferirse entonces a placas de 96 pocillos e incubarse con reactivo de detección de LDH durante 30 minutos a 25°C. Entonces puede medirse la absorbancia de la muestra a 490 nm usando un lector de microplacas. Entonces puede calcularse el porcentaje de citotoxicidad usando la siguiente ecuación: % de citotoxicidad = valor experimental -control bajo/control alto -control bajo X 100%. Entonces puede compararse el porcentaje de citotoxicidad de anti-CD20 y variantes directamente con una cantidad igual de RITUXAN para proporcionar una medición de la eficacia relativa. Un ensayo de ADCC a modo de ejemplo podría emplear células SKW6.4 que sobreexpresan el antígeno CD20 (por ejemplo, adquiridas de la Colección Americana de Cultivos Tipo) como fuente de células diana. Se conocen en la técnica muchas variaciones de este ensayo (por ejemplo, Zuckerman et al., CRC Crit Rev Microbiol 1978; 7(1):1-26). Las células efectoras útiles para tales ensayos incluyen, pero no se limitan a, células NK, macrófagos y otras PBMC. Alternativamente, o adicionalmente, puede evaluarse la actividad de ADCC de los polipéptidos variantes de la presente invención in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el dado a conocer en Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1 998».
Las variantes también pueden seleccionarse para determinar la activación del complemento. Para evaluar la activación del complemento, puede realizarse un ensayo de CDC (véase, por ejemplo, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996». Por ejemplo, pueden diluirse con tampón diversas concentraciones del polipéptido variante y complemento humano. Pueden diluirse células que expresan el antígeno al que se une el polipéptido variante hasta una densidad de 1 x 106 células/mI. Pueden añadirse mezclas de polipéptido variante, complemento humano diluido y células que expresan el antígeno a una placa de 96 pocillos de cultivo tisular de fondo plano y dejarse incubar durante 2 horas a 37°C y un 5% de CO2 para facilitar la lisis celular mediada por complemento. Entonces pueden añadirse cincuenta microlitros de azul de alamar (Accumed International) a cada pocillo e incubarse durante la noche a 37°C. Puede medirse la absorbancia
usando un fluorímetro de 96 pocillos con excitación a 530 nm y emisión a 590 nm. Pueden expresarse los resultados en unidades relativas de fluorescencia (URF). Pueden calcularse las concentraciones de la muestra a partir de una curva patrón y puede notificarse el porcentaje de actividad en comparación con polipéptido no variante para el polipéptido variante de interés. En determinadas realizaciones, los polipéptidos variantes no activan el complemento o activan el complemento de manera escasa. Por ejemplo, un polipéptido variante presenta una actividad de CDC de aproximadamente el 0-10% en este ensayo en comparación con un anticuerpo control que tiene una región Fc de
IgG1 no mutada. Preferiblemente, la variante no parece tener ninguna actividad de CDC (por ejemplo, por encima del fondo) en el ensayo de CDC anterior. En otras realizaciones, se encuentra que un polipéptido variante de la presente invención tiene CDC potenciada en comparación con un polipéptido original (por ejemplo, que presenta preferiblemente una potenciación de aproximadamente 1,1,
1,5, 1,7 o 2 veces a aproximadamente 100 veces (o más) en la actividad de CDC in vitro o in vivo cuando se comparan los valores de Clso). También pueden seleccionarse polipéptidos variantes para determinar el agotamiento de células diana en un ensayo de sangre completa. Por ejemplo, pueden seleccionarse diversas concentraciones del polipéptido variante con especificidad de diana de CD20 para determinar el agotamiento de células B en un ensayo de sangre completa usando FACS (Vugmeyster et al., 2003 Cytometry 52A, 101109). Se incuba sangre recién extraída con concentraciones variables de polipéptido variante a 37°C y un 5% de CO2 durante 4 horas (el tiempo puede variar). Tras la incubación, se lisan los glóbulos rojos según las directrices del fabricante con un reactivo de cloruro de amonio (Beckton-Dickinson, n.o de cat. 555899) y se detectan células B mediante FACS usando un anticuerpo marcado fluorescentemente específico para células B (anti-CD 19, por ejemplo). Los resultados pueden expresarse como porcentaje del agotamiento de células B en relación con o bien una muestra no tratada o bien una muestra incubada con un anticuerpo irrelevante (que no se agota). En realizaciones preferidas, un polipéptido variante agota células B más eficazmente que el polipéptido original. Un polipéptido variante puede agotar células B, por ejemplo, en un grado de aproximadamente dos veces o más que el polipéptido original, y preferiblemente de manera aproximada cinco veces o más. Además, una variante puede presentar una mayor potencia en el agotamiento de células B. Por ejemplo, una variante puede agotar el mismo porcentaje de células B en relación con el polipéptido original, pero utilizar aproximadamente cinco veces menos, y preferiblemente de manera aproximada 10 veces menos de anticuerpo. El agotamiento de células diana mediado por variantes puede estar de aproximadamente 2 veces, 3 veces, 5 veces a aproximadamente 1000 veces o más, y preferiblemente de desde aproximadamente 5 veces hasta aproximadamente 1000 veces mejorado en comparación con el polipéptido original. Las variantes también pueden seleccionarse in vivo. Puede emplearse cualquier
tipo de ensayo in vivo. Se proporciona a continuación un ejemplo particular de un tipo de ensayo. Este ensayo a modo de ejemplo permite la evaluación preclínica de variantes de Fc in vivo. Una variante que va a someterse a prueba puede incorporarse en la región Fc de un anticuerpo particular que se sabe que tiene alguna actividad. Por ejemplo, una variante puede incorporarse en la región Fc de
una IgG anti-CD20 mediante mutagénesis. Esto permite que se comparen una IgG original y una IgG de variante de Fc directamente con RITUXAN (que se sabe que promueve regresión tumoral). La evaluación preclínica puede realizarse en 2 fases (una fase farmacocinética y una fase farmacodinámica). El objetivo de los estudios farmacocinéticos de fase I es determinar si hay diferencias en la velocidad de aclaramiento entre una IgG de variante de Fc y el anticuerpo con actividad in vivo conocida (por ejemplo, RITUXAN). Diferencias en la velocidad de aclaramiento pueden provocar diferencias en el nivel en estado estacionario de IgG en suero. Como tal, si se detectan diferencias en las concentraciones en estado estacionario, éstas deben normalizarse para permitir que se hagan comparaciones precisas. El objetivo de los estudios farmacodinámicos de fase 11 es determinar el efecto de las mutaciones de Fc sobre, en este caso, el crecimiento tumoral. Estudios previos con RITUXAN usaron una única dosis que inhibió completamente el crecimiento tumoral. Debido a que esto no permite que se midan diferencias cuantitativas, debe emplearse un intervalo de dosis. Puede realizarse la comparación farmacocinética de fase I de una variante de Fc, la Fc original de tipo natural y RITUXAN, por ejemplo, de la siguiente manera. En primer lugar, pueden inyectarse 40 J-lg (u otra dosis que va a someterse a prueba) por animal por vía intravenosa y cuantificarse el nivel en plasma de la IgG a las O, 0,25, 0,5, 1, 24, 48, 72, 96, 120, 168 Y 336 h. Los datos pueden ajustarse, por ejemplo, usando un programa farmacocinético (WinNonLin) usando un modelo farmacocinético de dos compartimentos de latencia cero para obtener la velocidad de aclaramiento. La velocidad de aclaramiento puede usarse para definir el nivel en plasma en estado estacionario con la siguiente ecuación: C= dosis/(velocidad de aclaramiento X t), en la que T es el intervalo entre dosis y C es el nivel en plasma en estado estacionario. Pueden realizarse experimentos farmacocinéticos en ratones que no llevan tumor con, por ejemplo, un mínimo de 5 ratones por punto de tiempo. Puede emplearse un modelo animal para la siguiente fase de la siguiente manera. En el flanco derecho de ratones CB17-SCID pueden implantarse 106 células Raji por vía subcutánea. El bolo intravenoso del anticuerpo con Fc variante, el anticuerpo con Fc de tipo natural y RITUXAN puede comenzar inmediatamente tras la implantación y continuar hasta que el tamaño tumoral es mayor de 2 cm de diámetro. El diámetro tumoral puede determinarse cada lunes, miércoles y viernes
midiendo la longitud, anchura y profundidad del tumor usando un calibre (volumen tumoral A x L x P). Un gráfico del volumen tumoral frente al tiempo proporciona
=
rá la velocidad de crecimiento tumoral para el cálculo farmacodinámico. Debe usare un mínimo de aproximadamente 10 animales por grupo.
5 La comparación farmacodinámica de fase 11 del anticuerpo con Fc variante, el anticuerpo con Fc de tipo natural y RITUXAN puede realizarse de la siguiente manera. Basándose en datos publicados, RITUXAN a 10 J.lg/g semanalmente inhibió completamente el crecimiento tumoral tumor in vivo (Clynes et al., Nat. Med. 6:443-6, 2000). Por tanto, puede someterse a prueba un intervalo de dosis sema
10 nal de 10 J.l9/g, 5 J.l9/g, 1 J.l9/g, 0,5 J.lg/g Y O J.lg/g. El nivel en plasma en estado estacionario al que se inhibe la velocidad de crecimiento tumoral en un 50% puede determinarse gráficamente mediante la relación entre el nivel en plasma en estado estacionario y la eficacia. El nivel en plasma en estado estacionario puede calcularse tal como se describió anteriormente. Si es necesario, puede ajustarse 1: en
15 consecuencia para cada anticuerpo con Fc variante y el anticuerpo con Fc de tipo natural dependiendo de sus propiedades farmacocinéticas para lograr un nivel en plasma en estado estacionario comparable a RITUXAN. Valores farmacodinámicos mejorados estadísticos del anticuerpo con Fc variante en comparación con el polipéptido original (por ejemplo, anticuerpo con Fc de tipo natural) y RITUXAN
20 indicarán generalmente que el anticuerpo con Fc variante confiere una actividad in vivo mejorada. Puede realizarse una comparación farmacodinámica adicional de anticuerpos con Fc variante, anticuerpos con Fc de tipo natural y RITUXAN en monos cynomolgous tal como se describió previamente (Reff et al., Blood 83, 435-445, 1994). Puede usarse una respuesta a la dosis para el agotamiento de células B periféricas y células B de ganglios linfáticos para comparar las potencias relativas de las variantes de Fc con Fc de tipo natural y RITUXAN administrados por vía intravenosa y/o por vía subcutánea. Valores farmacodinámicos mejorados estadísticos de la variante de Fc en comparación con el polipéptido original (por ejemplo, Fc
30 de tipo natural) y RITUXAN indicarán generalmente que el anticuerpo con Fc variante confiere una actividad in vivo mejorada.
En realizaciones adicionales, las variantes (es decir, polipéptido que comprende una región Fc variante de la invención, o parte funcional de la misma) se seleccionan de manera que se identifican variantes que son útiles para uso terapéutico en al menos dos especies. Tales variantes se denominan en el presente documento quot;variantes mejoradas de doble especiequot;, y son particularmente útiles para identificar variantes que son terapéuticas en seres humanos, y también demuestran (o es probable que demuestren) eficacia en un modelo animal. En este sentido, la presente invención proporciona métodos para identificar variantes que tie
nen una fuerte probabilidad de aprobarse para pruebas clínicas en seres humanos puesto que es probable que los datos de modelos animales apoyen cualquier solicitud de pruebas en seres humanos realizada a agencias reguladoras gubernamentales (por ejemplo, la Food and Drug Administration estadounidense). En determinadas realizaciones, se identifican variantes mejoradas de doble especie realizando en primer lugar un ensayo de ADCC usando células efectoras humanas para encontrar variantes mejoradas, y realizando entonces un segundo ensayo de ADCC usando células efectoras de ratón, rata o primate no humano para identificar un subconjunto de las variantes mejoradas que son variantes mejoradas de doble especie. En algunas realizaciones, la presente descripción proporciona métodos para identificar variantes mejoradas de doble especie que comprenden: a) proporcionar: i) células diana, ii) una composición que comprende una variante candidata de un polipéptido original que tiene al menos una parte de una región Fc, en la que la variante candidata comprende al menos una sustitución de aminoácido en la región Fc, y en la que la variante candidata media en la citotoxicidad de células diana en presencia de una primera especie (por ejemplo, ser humano) de células efectoras más eficazmente que el polipéptido original, y iii) células efectoras de una segunda especie (por ejemplo, ratón, rata o primate no humano), y b) incubar la composición con las células diana en condiciones tales que la variante candidata se une a las células diana generando de ese modo células diana unidas a la variante candidata, c) mezclar las células efectoras de la segunda especie con las células diana unidas a la variante candidata, y d) medir la citotoxicidad de células diana mediada por la variante candidata. En determinadas realizaciones, el método comprende además la etapa e) determinar si la variante candidata media en la citotoxicidad de células diana en presencia de las células efectoras de la segunda especie más eficazmente que el po
lipéptido original. En algunas realizaciones, el método comprende además la etapa f) identificar una variante candidata como una variante mejorada de doble especie que media en la citotoxicidad de células diana en presencia de las células efectoras de la segunda especie más eficazmente que el polipéptido original. En realizaciones preferidas, las variantes de doble especie identificadas se seleccionan entonces in vivo en uno o más ensayos en animales. En determinadas realizaciones, se identifican variantes mejoradas de doble especie realizando en primer lugar un ensayo en sangre completa usando sangre humana para encontrar variantes mejoradas y luego realizando un segundo ensayo en sangre completa usando sangre de ratón, rata o primate no humano para identificar un subconjunto de las variantes mejoradas que son variantes mejoradas de doble especie. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona métodos para identificar variantes mejoradas de doble especie, que comprenden: a) proporcionar: i) células diana, ii) una composición que comprende una variante candidata de un polipéptido original que tiene al menos una parte de una región Fc, en la que la variante candidata comprende al menos una sustitución de aminoácido en la región Fc, yen la que la variante candidata media en el agotamiento de células diana en presencia de sangre de una primera especie (por ejemplo, ser humano) más eficazmente que el polipéptido original, y iii) sangre de una segunda especie (por ejemplo, ratón, rata o primate no humano), y b) incubar la composición con las células diana en condiciones tales que la variante candidata se une a las células diana generando de ese modo células diana unidas a la variante candidata, c) mezclar la sangre de la segunda especie con las células diana unidas a la variante candidata, y d) medir el agotamiento de células diana mediado por la variante candidata. En determinadas realizaciones, el método comprende además la etapa e) determinar si la variante candidata media en el agotamiento de células diana en presencia de la sangre de la segunda especie más eficazmente que el polipéptido original. En algunas realizaciones, el método comprende además la etapa f) identificar una variante candidata como una variante mejorada de doble especie que media en el agotamiento de células diana en presencia de la sangre de la segunda especie más eficazmente que el polipéptido original. En realizaciones preferidas, las variantes de doble especie identificadas se seleccionan entonces in vivo en uno o más ensayos en animales.
ejemplo, polipéptido) es un anticuerpo. A continuación se describen técnicas para
producir anticuerpos.
Generalmente, cuando la molécula que contiene regiones Fc variantes es un anticuerpo, el anticuerpo se dirige contra antígeno de interés. Preferiblemente, el antígeno es un polipéptido y la administración del anticuerpo a un mamífero que padece una enfermedad o trastorno que se beneficiaría de una disminución en la cantidad o la actividad de la molécula antigénica puede dar como resultado un beneficio terapéutico en ese mamífero. Sin embargo, también pueden emplearse anticuerpos dirigidos contra antígenos no polipeptídicos (tales como antígenos glicolipídicos asociados a tumor; véase la patente estadounidense 5.091.178).
Los antígenos a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, moléculas tales como renina; una hormona de crecimiento, incluyendo hormona de crecimiento humana y hormona de crecimiento bovina; factor liberador de hormona de crecimiento; hormona paratiroidea; hormona estimulante del tiroides; lipoproteínas; alfa-i-antitripsina; cadena A de la insulina; cadena B de la insulina; proinsulina; hormona foliculoestimulante; calcitonina; hormona luteinizante; glucagón; factores de coagulación tales como factor VIIIC, factor IX, factor tisular (TF) y factor de von Willebrand; factores anticoagulantes tales como proteína C; péptido natriurético auricular; tensioactivo pulmonar; un activador del plasminógeno, tal como urocinasa o activador del plasminógeno de tipo tisular (t-PA) o de orina humana; bombesina; trombina; factor de crecimiento hematopoyético; factor de necrosis tumoral alfa y beta; encefalinasa; RANTES (regulador por activación de células T expresadas y secretadas normalmente); proteína inflamatoria de macrófagos humanos (MIP-1-alfa); una albúmina sé rica tal como albúmina sérica humana; sustancia inhibidora mulleriana; cadena A de la relaxina; cadena B de la relaxina; prorelaxina; péptido asociado a gonadotropina de ratón; una proteína microbiana, tal como beta-lacta masa; ADNasa; IgE; un antígeno asociado a linfocitos T citotóxicos (CTLA) , tal como CTLA-4; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); receptores para hormonas o factores de crecimiento; proteína A
o D; factores reumatoides; un factor neurotófico tal como factor neurotófico derivado de hueso (BDNF), neurotrofina 3, 4, 5 ó 6 (NT-3, NT -4, NT-5 o NT-6) , o un factor de crecimiento nervioso; factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF); factor de crecimiento de fibroblastos tal como un FGF y FGF; factor de crecimiento epidérmico (EGF); factor de crecimiento transformante (TGF) tal como TGF-alfa y TGF beta, incluyendo TGF-1 , TGF-2, TGF-3, TGF-4 o TGF-5; factor de crecimiento similar a la insulina I y 11 (IGF-I e IGF-II); des (1-3)-IGF-1 (IGF-I cerebral), proteínas de unión a factor de crecimiento similar a la insulina; proteínas CD tales como CD3, CD4, CD8, CD1 9 y CD20; eritropoyetina; factores osteoinductores; inmunotoxinas; una proteína morfogenética ósea (BMP); un factor de diferenciación del crecimiento (por ejemplo, GDF8); un interferón tal como interferón alfa, beta y gamma; factores estimuladores de colonias (CSF), por ejemplo, M-CSF, GM-CSF y G-CSF; interleucinas (IL), por ejemplo, de IL-I a IL-25; superóxido dismutasa; receptores celulares T-25; proteínas de membrana de superficie; factor de aceleración de la descomposición; antígeno viral tal como, por ejemplo, una parte de la envuelta del SIDA; proteínas de transporte; receptores de direccionamiento; adresinas; proteínas reguladoras; integrinas tales como CD11 a, CD11 b, CD11 c, CD18, una ICAM, VLA4 y VCAM; un antígeno asociado a tumor tal como receptor HER2, HER3 o HER4; grelina; un miembro de una ruta de apoptosis; y fragmentos o precursores de cualquiera de los polipéptidos enumerados anteriormente.
Los antígenos preferidos incluyen, pero no se limitan a, proteínas CD tales como CD3, CD4, CD8, CD1 9, CD20 Y CD34; miembros de la familia del receptor de ErbB tal como el receptor de EGF, el receptor HER2, HER3 o HER4; moléculas de adhesión celular tales como LFA-1 , Macl, p 150.95, VLA-4, ICAM-1, VCAM, integrina a4/p7 e integrina Xv/p3 que incluye o bien 5 o bien subunidades de la misma (por ejemplo, anticuerpos anti-CDI I a, anti-CD 18 o anti-CDI 1 b); factores de crecimiento tales como VEGF; factor tisular (TF); interferón alfa (a-IFN); factores de diferenciación del crecimiento, por ejemplo, GDF-8; una interleucina, tal como IL-8; IgE; antígenos del grupo sanguíneo; receptor de flk2/f1t3; receptor de obesidad (OB); receptor de mpl; CTLA-4; proteína C y grelina.
Pueden usarse antígenos solubles o fragmentos de los mismos, opcionalmente conjugados con otras moléculas, como inmunógenos para generar anticuerpos.
Para moléculas transmembrana, tales como receptores, pueden usarse fragmentos de estos (por ejemplo, el dominio extracelular de un receptor) como inmunógeno. Alternativamente, pueden usarse células que expresan la molécula transmembrana como inmunógeno. Tales células pueden derivarse de una fuente natural (por ejemplo, líneas de células cancerosas) o pueden ser células que se han transformado mediante técnicas recombinantes para expresar la molécula transmembrana. Otros antígenos y formas de los mismos útiles para preparar anticuerpos resultarán evidentes para el experto en la técnica.
La presente descripción proporciona anticuerpos policlonales con regiones Fc variantes. Por ejemplo, un repertorio de inmunoglobulina humana que contiene regiones constantes de IgG1 modificadas puede transplantarse a ratones con inmunoglobulinas inactivadas, dando como resultado ratones que expresan un repertorio de IgG que contiene regiones Fc modificadas (véase, por ejemplo, Mendez, MJ et al., Nature Genetics 15:146 (1997». Se generan anticuerpos policlonales preferiblemente en animales mediante inyecciones subcutáneas (sc) o intraperitoneales (ip) múltiples del antígeno relevante y un adyuvante. Puede ser útil conjugar el antígeno relevante con una proteína que es inmunogénica en la especie que va a inmunizarse (por ejemplo, hemocianina de lapa californiana, albúmina sérica, tiroglobulina bovina o inhibidor de tripsina de soja) usando un agente bifuncional o de derivatización (por ejemplo, éster de maleimidobenzoilsulfosuccinimida para la conjugación a través de residuos de cisteína, N-hidroxisuccinimida para la conjugación a través de residuos de lisina, glutaraldehído, anhídrido succínico, SOC12,
o R1N=C=NR, en el que R y R1 son grupos alquilo diferentes. Ejemplos de un protocolo de inmunización general para un conejo y un ratón son tal como siguen. Se inmunizan los animales frente al antígeno, los conjugados
inmunogénicos o los derivados combinando, por ejemplo, 100 Ilg o 5 Ilg de la proteína o el conjugado (por ejemplo, para un conejo o un ratón respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectando la disolución por vía intradérmica en múltiples sitios. Un mes más tarde se refuerzan los animales con 1/5 o 1/10 de la cantidad original de péptido o conjugado en adyuvante completo de Freund mediante inyección subcutánea en múltiples sitios. De siete a catorce días más tarde se extrae sangre de los animales y se somete a ensayo el suero para determinar el título de anticuerpos. Se refuerzan los animales hasta la meseta del título. Preferiblemente, se refuerza al animal con el conjugado del mismo antígeno, pero conjugado con una proteína diferente ylo a través de un reactivo de reticulación diferente. También pueden preparase conjugados en cultivo de células recombinantes como fusiones de proteínas. Además, se usan adecuadamente agentes de agregación tales como alumbre para potenciar la respuesta inmunitaria.
La presente descripción proporciona anticuerpos monoclonales con regiones Fc variantes. Pueden prepararse anticuerpos monoclonales de varia maneras, incluyendo el uso del método del hibridoma (por ejemplo, tal como se describe por Kohler et al., Nature, 256: 495, 1975), o mediante métodos de ADN recombinante (por ejemplo, patente estadounidense No. 4.816.567).
En el método del hibridoma, se inmuniza un ratón u otro animal huésped apropiado, tal como un hámster o un macaco, para provocar linfocitos que producen o pueden producir anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína usada para la inmunización. Alternativamente, pueden inmunizarse linfocitos in vitro. Entonces se fusionan linfocitos con células de mieloma usando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma. Las células de hibridoma así preparadas se siembran y se hacen crecer en un medio de cultivo adecuado que contiene preferiblemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma originales no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma originales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas incluirá normalmente hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT) , sustancias que impiden el crecimiento de células deficientes en HGPRT. Las células de mieloma preferidas son aquellas que se fusionan eficazmente, soportan la producción de anticuerpo de alto nivel estable por las células productoras de anticuerpo seleccionadas y son sensibles a un medio tal como medio HAT. Entre ellas, las líneas de células de mieloma preferidas son líneas de mieloma murinas, tales como las derivadas de tumores de ratón MOPC-21 y MPC-1 I disponibles del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California EE.UU., y las células SP-2 o X63-Ag8-653 disponibles de la Colección Americana de Cultivos Tipo, Rockville, Mariland EE.UU. También se han descrito líneas de células de mieloma humanas y de heteromieloma de ratón-humanas para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (por ejemplo, Kozbor, J. Immunol., 133:
3001 (1984» .
Se somete a prueba medio de cultivo en el que están haciéndose crecer células de hibridoma para determinar la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferiblemente, la especificidad de unión de anticuerpos
monoclonales producidos por células de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitra, tal como RIA o ELlSA. Tras identificar las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, pueden subclonarse los clones mediante procedimientos de dilución limitante y hacerse crecer mediante métodos convencionales. Los medios de cultivo adecuados para este fin incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden hacerse crecer in vivo como tumores ascíticos en un animal. Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan adecuadamente del medio de cultivo, líquido ascítico o suero mediante procedimientos de purificación de inmunoglobulinas convencionales tales como, por ejemplo, proteína A-Sepharose, cromatografía con hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad. El ADN que codifica para los anticuerpos monoclonales se aísla fácilmente y se secuencia usando procedimientos convencional (por ejemplo, usando sondas oligonucleotídicas que pueden unirse específicamente a genes que codifican para las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos monoclonales). Las células de hibridoma sirven como fuente preferida de tal ADN. Una vez aislado, puede colocarse el ADN en vectores de expresión, que entonces se transfectan en células huésped tales como células de E. co/i, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que no producen de otro modo proteína de inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. La producción recombinante de anticuerpos se describe con más detalle a continuación.
En algunas realizaciones, se aíslan anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de bibliotecas de fagos de anticuerpo generadas usando las técnicas descritas, por ejemplo, en McCafferty et al. , Nature, 348: 552554 (1990). Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, usando bibliotecas de fagos. Publicaciones posteriores describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (intervalo de nM) mediante intercambio de cadenas (Marks et al. , BioTechnology, 10: 779-783 (1992», así como infección combinatoria y recombinación in vivo como estrategia para construir bibliotecas de fagos muy grandes (por ejemplo, Waterhouse et al. , Nuc. Acids. Res., 21: 2265-2266 (1 993». Por tanto, estas técnicas y técnicas similares son alternativas viables a las técnicas de hibridoma de anticuerpos monoclonales tradicionales bien conocidas en la técnica para el aislamiento de anticuerpos monoclonales. Además, puede modificarse el ADN, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante por dominios constantes de cadena pesada y ligera humanos en lugar de las secuencias murinas homólogas (por ejemplo, patente estadounidense n.o 4.816.567, y Morrison, et al. , Proc. Nat. Acad. Sci USA, 81: 6851 (1984), o uniendo covalentemente a la secuencia que codifica para inmunoglobulina la totalidad o parte de la secuencia codificante para un polipéptido distinto de inmunoglobulina. Normalmente tales polipéptidos distintos de inmunoglobulina se sustituyen por los dominios constantes de un anticuerpo, o se sustituyen por los dominios variables de un sitio de combinación de antígeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprende un sitio de combinación de antígeno que tiene especificidad por un antígeno y otro sitio de combinación de antígeno que tiene especificidad por un antígeno diferente.
humanizados humanos
La presente descripción proporciona anticuerpos humanizados y humanos con regiones Fc variantes. En realizaciones preferidas, un anticuerpo humanizado comprende secuencias de aminoácidos de anticuerpo humano junto con residuos de aminoácido que no son de un anticuerpo humano. En algunas realizaciones, las secuencias humanas en un anticuerpo humanizado comprenden las regiones de entramado (quot;FRquot;) y las secuencias o residuos que no son de un anticuerpo humano comprenden una o más CDR. Merece la pena indicar que las FR y las CDR pueden definirse basándose en la numeración de residuos de aminoácido en las regiones pesada y VL. Se pretende que el término CDR signifique los sitios de combinación de antígeno no contiguos encontrados dentro de la región variable de polipéptidos de cadena tanto pesada como ligera. Estas regiones se han definido por Kabat et al. (J. Biol. Chem. 252: 6609-6616 (1977) Y Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological lnterest (1991); quot;Kabatquot;, Chothia et al. (J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); quot;Chothiaquot; y MacCallum et al (J. Mol. Biol 262:732745 (1996); quot;MacCallumquot;, en los que las definiciones incluyen residuos de aminoácido solapantes o subconjuntos de residuos de aminoácido cuando se comparan entre sí. No obstante, se pretende que la aplicación de cualquiera de estas definiciones, solas (por ejemplo, la definición de Kabat) o en combinación (únicamente a modo de ejemplo, la definición combinada de Kabat y Chothia) para referirse a una CDR de un anticuerpo (incluyendo un anticuerpo humanizado) esté dentro del alcance del término tal como se define y se usa en el presente documento. Además, se pretende que el término quot;entramadoquot;, cuando se usa en referencia a una región variable de anticuerpo, signifique todos los residuos de aminoácido fuera de las regiones CDR dentro de la región variable de un anticuerpo. Por tanto, un entramado de región variable tiene aproximadamente 100-120 aminoácidos de longitud pero se pretende que haga referencia únicamente a los aminoácidos fuera de las CDR. Se pretende que el término quot;región de entramadoquot; signifique cada dominio del entramado que está separado por las CDR. Por tanto, para el ejemplo específico de una región VH y para las CDR tal como se definen por Kabat, región de entramado 1 (FR 1) corresponde al dominio de la región variable que abarca los aminoácidos 1-30; región de entramado 2 (FR2) corresponde al dominio de la región variable que abarca los aminoácidos 36-49; región 3 (FR3) corresponde al dominio de la región variable que abarca los aminoácidos 66-94, y región 4 (FR4) corresponde al dominio de la región variable desde el aminoácido 103 hasta el final de la región variable. Las FR para la cadena ligera están separadas de manera similar por cada una de las CDR de región variable de cadena ligera. De manera similar, usando la definición de CDR de Chothia o MacCallum,
o cualquier combinación de definiciones de CDR, los límites de entramado están separados por los extremos terminales de CDR respectivas tal como se describió anteriormente. A pesar de las múltiples definiciones de CDR, en algunas realizaciones se prefiere usar la definición de Kabat para definir las CDR. Los residuos en un anticuerpo humanizado que no son de un anticuerpo humano pueden ser residuos o secuencias importados de, o derivados de, otra especie (incluyendo, pero sin limitarse a, ratón), o estas secuencias pueden ser secuencias de aminoácidos al azar (por ejemplo, generadas a partir de secuencias de ácido nucleico aleatorizadas), que se insertan en la secuencia de anticuerpo humanizado. Tal como se indicó anteriormente, las secuencias de aminoácidos humanas en un anticuerpo humanizado son preferiblemente las FR, mientras que los residuos que no son de un anticuerpo humano (tanto si se derivan de otra especie como si son secuencias de aminoácidos al azar) corresponden preferiblemente a las CDR. Sin embargo, en algunas realizaciones, una o más FR pueden contener uno o más residuos de aminoácido no humanos. En casos de alteraciones o modificaciones (por ejemplo, mediante introducción de un residuo no humano) en un entramado por lo demás humano, es posible que la FR alterada o modificada esté adyacente a una CDR modificada de otra especie o una secuencia de CDR al azar, mientras que en otras realizaciones, una FR alterada no está adyacente a una secuencia de CDR alterada de otra especie o una secuencia de CDR al azar. En algunas realizaciones, las secuencias de entramado de un anticuerpo humanizado son completamente humanas (es decir, no se realiza ningún cambio de entramado en el entramado humano). En realizaciones preferidas, las secuencias de entramado de un anticuerpo humanizado son completamente de línea germinal humana (es decir, no se realiza ningún cambio de entramado en el entramado de línea germinal humana). Los residuos de aminoácido no humanos de otra especie, o una secuencia al azar, se denominan con frecuencia residuos quot;importadosquot;, que se toman normalmente de un dominio variable quot;importadoquot;. La humanización puede realizarse esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (por ejemplo, Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1 988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)), sustituyendo CDR de roedor (u otro mamífero) o secuencias de CDR por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Además, también pueden generarse anticuerpos en los que sustancialmente menos que un dominio variable humano intacto se ha sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana (por ejemplo, patente estadounidense 4.816.567). En la práctica, normalmente los anticuerpos humanizados son anticuerpos humanos en los que algunos residuos de CDR y posiblemente algunos residuos de FR se sustituyen por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedor o, tal como se indicó anteriormente, en los que se han sustituido secuencias de CDR por secuencias al azar. Únicamente a modo de ejemplo no limitativo, se describen métodos para conferir afinidad de unión a CDR donadora a un entramado de región variable aceptara de anticuerpo en el documento WO 01/27160 Al, yen las solicitudes de patente estadounidense con números de serie 09/434.870 y 09/982.464. La elección de dominios variables humanos, tanto ligero como pesado, que van a usarse en la preparación de los anticuerpos humanizados es importante para reducir la antigenicidad. Según el denominado método de quot;ajuste óptimoquot;, se examina la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor que va a humanizarse con respecto a la biblioteca completa de secuencias de dominio variable humano conocidas. Entonces se acepta la secuencia humana que es más próxima a la del roedor como entramado humano (FR) para el anticuerpo humanizado (por ejemplo, Sims et al., J. Immnunol., 151: 2296 (1993), Y Chothia et al., J. Mol. Biol., 196: 901 (1987)). Otro método usa un entramado particular derivado de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligera o pesada. Puede usarse el mismo entramado para varios anticuerpos humanizados diferentes (por ejemplo, Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151: 2623 (1993)).
En otras realizaciones, no hay necesidad de quot;seleccionar previamentequot; un entramado de anticuerpo humano particular (es decir, no hay necesidad de seleccionar un entramado humano con la homología o identidad de secuencia más próxima a un anticuerpo candidato dado que va a humanizarse). En estas realizaciones, puede usarse un entramado humano común o universal para aceptar una o más CDR no humanas. En la realización preferida, se usa un único entramado universal, completamente humano, como entramado para todos los anticuerpos que van a humanizarse, independientemente de su homología con la(s) secuencia(s) de entramado de los anticuerpos candidatos. Con respecto a esto, pueden generarse anticuerpos humanizados sin realizar ningún cambio en la región de entramado. Este entramado universal, completamente humano, puede aceptar entonces una
o más secuencias de CDR. En una realización, la una o más secuencias de CDR son secuencias de CDR de un anticuerpo de otra especie (por ejemplo, ratón o rata) que se han modificado en comparación con la CDR correspondiente en el anticuerpo intacto de la otra especie (es decir, hay una introducción simultánea de la
CDR y modificación de la CDR que está introduciéndose en el entramado humano universal). La modificación corresponde a uno o más cambios de aminoácidos (en la CDR modificada) en comparación con la CDR correspondiente en el anticuerpo intacto de la otra especie. En una realización, se incluyen todos los residuos de aminoácido en la CDR en una biblioteca, mientras que en otras realizaciones, no se incluyen todos los residuos de aminoácido de CDR en una biblioteca. En otra realización, la una o más secuencias de CDR son secuencias al azar, que sustituyen a secuencias de CDR. En realizaciones preferidas, se humanizan anticuerpos con retención de alta afinidad por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. En algunas realizaciones, la afinidad del anticuerpo humanizado por el antígeno es superior a la afinidad del anticuerpo intacto, no humanizado, correspondiente o fragmento o parte del mismo (por ejemplo, el anticuerpo de roedor candidato). Con respecto a esto, en algunas realizaciones, se preparan anticuerpos humanizados mediante un procedimiento de análisis de las secuencias originales y diversos productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias originales y humanizadas. Hay modelos de inmunoglobulina tridimensionales comúnmente disponibles y resultan familiares para los expertos en la técnica. Hay programas informáticos disponibles que ilustran y presentan estructuras conformacionales tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspección de estas presentaciones permite el análisis del papel probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antígeno. De esta manera, pueden seleccionarse y combinarse residuos de FR del receptor y secuencias importadas de modo que se logra la característica de anticuerpo deseada, tal como afinidad aumentada por el/los antígeno(s) diana. En general, los residuos de CDR están implicados directamente y muy sustancialmente en influir sobre la unión a antígeno.
Puede emplearse una variedad de métodos específicos, bien conocidos por un experto en la técnica, para introducir CDR de anticuerpo (o secuencias al azar que sustituyen a CDR de anticuerpo) en entramados de anticuerpo (véanse, por ejemplo, las solicitudes estadounidenses 09/434.879 y 09/982.464). En algunas realizaciones, pueden usarse oligonucleótidos solapantes para sintetizar un gen de anticuerpo, o parte del mismo (por ejemplo, un gen que codifica para un anticuerpo humanizado). En otras realizaciones, puede llevarse a cabo la mutagénesis de un molde de anticuerpo usando los métodos de Kunkel (citado a continuación), por ejemplo para introducir una CDR modificada o una secuencia al azar para sustituir a una CDR. En algunas realizaciones, se humanizan por separado regiones variables de cadena ligera y pesada, y después se coexpresan como una región variable humanizada. En otras realizaciones, regiones variables humanizadas constituyen la región variable de un anticuerpo intacto. En algunas realizaciones, la región Fc del anticuerpo intacto que comprende una región variable humanizada se ha modificado (por ejemplo, se ha realizado al menos una modificación de aminoácido en la región Fc). Por ejemplo, un anticuerpo que se ha humanizado con CDR aleatorizada y sin cambios de entramado puede comprender al menos una modificación de aminoácido en la región Fc. En otras realizaciones, se emplean animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que pueden, tras inmunización, producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigota del gen de la región de unión (JH) de cadena pesada de anticuerpo en ratones mutantes quiméricos y de línea germinal da como resultado la completa inhibición de la producción de anticuerpo endógeno. La transferencia de la matriz génica de inmunoglobulina de línea germinal humana en ratones mutantes de línea germinal de este tipo dará como resultado la producción de anticuerpos humanos tras la exposición a antígeno (véanse, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551 (1993), Y Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258 (1993». También pueden derivarse anticuerpos humanos de bibliotecas de presentación en fago (por ejemplo, Hoogenboom et al., J. Mol. BioL, 227: 381 (1991), Y Vaughan et al., Nature Biotech 14: 309 (1 996».
La presente descripción proporciona métodos para generar anticuerpos humanizados (y fragmentos de anticuerpo) que comprenden al menos una sustitución de aminoácido enumerada en la tabla 1 en el presente documento, en la región Fc (en comparación con un polipéptido original que comprende una región Fc sin la sustitución de aminoácido). A continuación se comentan métodos adicionales para generar tales anticuerpos humanizados. La presente descripción también proporciona composiciones que comprenden los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo generados mediante esos métodos. De manera importante, los métodos de humanización comentados a continuación, y otros métodos de humanización (por ejemplo, comentados anteriormente), pueden combinarse con las regiones Fc variantes. Con respecto a esto, pueden construirse anticuerpos humanizados con regiones Fc alteradas, únicas. En algunas realizaciones, se proporciona un método de construcción de una población de ácidos nucleicos que codifican para región VH alterada, que comprende: a) proporcionar una representación de secuencias de aminoácidos de referencia primera y segunda, comprendiendo la primera secuencia de referencia la secuencia de una región VH donadora, comprendiendo la región variable donadora
i) FR y ii) tres CDR tal como se define por las definiciones combinadas de Kabat y Chothia; comprendiendo la segunda secuencia de referencia la secuencia de una región VH aceptora que comprende FR; b) sintetizar primeros oligonucleótidos que codifican para partes de las FR de la región VH aceptora, en el que las partes de las FR en comparación con la segunda secuencia de referencia no están modificadas; y una población de segundos oligonucleótidos, que codifican cada uno para i) al menos una parte de una primera CDR que se ha modificado, seleccionándose la primera CDR del grupo que consiste en HCDR1 , HCDR2 y HCDR3, en el que la primera CDR modificada comprende un aminoácido diferente en una
o más posiciones en comparación con las CDR donadoras correspondientes de la primera secuencia de referencia y ii) una o más partes de FR no modificadas que pueden hibridarse con los primeros oligonucleótidos; c) mezclar los primeros oligonucleótidos con la población de segundos oligonucleótidos para crear oligonucleótidos solapantes; y d) tratar los oligonucleótidos solapantes en condiciones tales que se construye una población de ácidos nucleicos que codifican para región VH alterada, en el que las FR codificadas por los ácidos nucleicos que codifican
para región VH alterada no están modificadas con respecto a la segunda secuen
cia de referencia. En otras realizaciones, se proporciona un método de construcción de una población de ácidos nucleicos que codifican para región VL alterada, que comprende: a) proporcionar una representación de secuencias de aminoácidos de referencia primera y segunda, comprendiendo la primera secuencia de referencia la secuencia de una región VL donadora, comprendiendo la región variable donadora i) FR Y ii) tres CDR tal como se define por las definiciones combinadas de Kabat y Chothia; comprendiendo la segunda secuencia de referencia la secuencia de una región VL aceptora que comprende FR; b) sintetizar primeros oligonucleótidos que codifican para partes de las FR de la región VL aceptora, en el que las partes de las FR en comparación con la segunda secuencia de referencia no están modificadas; y una población de segundos oligonucleótidos, que codifican cada uno para i) al menos una parte de una primera CDR que se ha modificado, seleccionándose la primera CDR del grupo que consiste en LCDR1 , LCDR2 y LCDR3, en el que la primera CDR modificada comprende un aminoácido diferente en una o más posiciones en comparación con las CDR donadoras correspondientes de la primera secuencia de referencia y ii) una o más partes de FR no modificadas que pueden hibridarse con los primeros oligonucleótidos; c) mezclar los primeros oligonucleótidos con la población de segundos oligonucleótidos para crear oligonucleótidos solapantes; y d) tratar los oligonucleótidos solapantes en condiciones tales que se construye una población de ácidos nucleicos que codifican para región VL alterada, en el que las FR codificadas por los ácidos nucleicos que codifican para región VL alterada no están modificadas con respecto a la segunda secuencia de referencia. En algunas realizaciones, se contempla un método de construcción de una población de ácidos nucleicos que codifican para región VH alterada, que comprende: A) proporcionar una representación de secuencias de aminoácidos de referencia primera y segunda, comprendiendo la primera secuencia de referencia la secuencia de una región VH donadora, comprendiendo la región variable donadora i) FR Y ii) tres CDR tal como se define por las definiciones combinadas de Kabat y Chothia; comprendiendo la segunda secuencia de referencia la secuencia de una región VH aceptora que comprende FR; B) sintetizar una población de primeros oligonucleótidos, codificando cada uno para al menos una parte de una primera
CDR seleccionada del grupo que consiste en HCDR1 , HCDR2 y HCDR3, en el que la primera CDR modificada comprende un aminoácido diferente en una o más posiciones en comparación con las CDR donadoras correspondientes de la primera secuencia de referencia; y segundos oligonucleótidos que codifican para i) partes de las FR de la región VH aceptora, en el que las partes de las FR en comparación con la secuencia de referencia no están modificadas y ii) una o más partes de una CDR que pueden hibridarse con la población de primeros oligonucleótidos; C) mezclar la población de primeros oligonucleótidos con los segundos oligonucleótidos para crear oligonucleótidos solapantes; y O) tratar los oligonucleótidos solapantes en condiciones tales que se construye una población de ácidos nucleicos que codifican para región VH alterada, en el que las FR codificadas por los ácidos nucleicos que codifican para región VH alterada no están modificados con
respecto a la segunda secuencia de referencia.
En otras realizaciones, se proporciona un método de construcción de una población de ácidos nucleicos que codifican para región VL alterada, que comprende: A) proporcionar una representación de secuencias de aminoácidos de referencia primera y segunda, comprendiendo la primera secuencia de referencia la secuencia de una región VL donadora, comprendiendo la región variable donadora i) FR Y ii) tres CDR tal como se define por las definiciones combinadas de Kabat y Chothia; comprendiendo la segunda secuencia de referencia la secuencia de una región VL aceptora que comprende FR; B) sintetizar a) una población de primeros oligonucleótidos, codificando cada uno para al menos una parte de una primera CDR seleccionada del grupo que consiste en LCDR1 , LCDR2 Y LCDR3, en el que la primera CDR modificada comprende un aminoácido diferente en una o más posiciones en comparación con las CDR donadoras correspondientes de la primera secuencia de referencia; y b) segundos oligonucleótidos que codifican para i) partes de las FR de la región VL aceptora, en el que las partes de las FR en comparación con la secuencia de referencia no están modificadas y ii) una o más partes de una CDR que pueden hibridarse con la población de primeros oligonucleótidos; C) mezclar la población de primeros oligonucleótidos con los segundos oligonucleótidos para crear oligonucleótidos solapantes; y O) tratar los oligonucleótidos solapantes en condiciones tales que se construye una población de ácidos nucleicos que codifican para región VL alterada, en el que las FR codificadas por los ácidos nucleicos que codifican para región VL alterada no están modificadas con respecto a la segunda secuencia de referencia. En algunas realizaciones, la representación de secuencias de referencia primera y segunda es en forma electrónica. En algunas realizaciones, el método comprende además la etapa de (e) coexpresar la población de ácidos nucleicos que codifican para región VH alterada con un ácido nucleico que codifica para región variable de cadena ligera para producir una población diversa de regiones variables heteroméricas alteradas. En algunas realizaciones, la síntesis comprende síntesis química. En algunas realizaciones, el aceptor es humano. En algunas realizaciones, el tratamiento de la etapa (d) comprende la extensión mediante una polime
rasa. En otras realizaciones, se contempla un método de construcción de una población de ácidos nucleicos que codifican para región VH alterada, que comprende: a) proporcionar una representación de secuencias de aminoácidos de referencia primera y segunda, comprendiendo la primera secuencia de referencia la secuencia de una región VH donadora, comprendiendo la región variable donadora i) FR Y ii) tres CDR, comprendiendo la segunda secuencia de referencia una región VH; b) sintetizar una población de secuencias génicas de anticuerpo de región VH alterada, en el que las FR de las regiones VH alteradas son idénticas a las FR de la segunda secuencia de referencia y al menos una primera CDR de las regiones variables de anticuerpo alteradas se ha modificado, en el que la primera CDR modificada comprende un aminoácido diferente en una o más posiciones en comparación con la CDR donadora correspondiente de la primera secuencia de referencia. En algunas realizaciones, se contempla un método de construcción de una población de ácidos nucleicos que codifican para región VL alterada, que comprende: a) proporcionar una representación de secuencias de aminoácidos de referencia primera y segunda, comprendiendo la primera secuencia de referencia la secuencia de una región VL donadora, comprendiendo la región variable donadora i) FR Y ii) tres CDR; comprendiendo la segunda secuencia de referencia la secuencia de una región VL aceptora que comprende FR; b) sintetizar una población de secuencias génicas de anticuerpo de región VL alterada, en el que las FR de las regiones VL alteradas son idénticas a las FR de la segunda secuencia de referencia y al menos una primera CDR de la región VL de anticuerpo alterada se ha modifi
cado, en el que la primera CDR modificada comprende un aminoácido diferente en una o más posiciones en comparación con la CDR donadora correspondiente de la primera secuencia de referencia. En algunas realizaciones, la representación de secuencias de referencia primera y segunda es en forma electrónica. En algunas realizaciones, el método comprende además la etapa de coexpresar la población de ácidos nucleicos que codifican pa ra región VL alterada con un ácido nucleico que codifica para región VH para pro ducir una población diversa de regiones variables heteroméricas alteradas. En al gunas realizaciones, el aceptor es humano. En algunas realizaciones, la síntesis implica el uso de oligonucleótidos solapantes. Aún en otras realizaciones, se contempla un método de construcción de una po blación de ácidos nucleicos que codifican para región VH alterada, que compren de: a) proporcionar una representación de una secuencia de aminoácidos de refe rencia, comprendiendo la secuencia de referencia la secuencia de una región VH aceptora que comprende FR; b) sintetizar una población de secuencias génicas de anticuerpo de región VH alterada, en el que las FR de las regiones VH altera das son idénticas a las FR de la secuencia de referencia y al menos una primera CDR de las regiones variables de anticuerpo alteradas comprende una secuencia de aminoácidos al azar. En otras realizaciones, se contempla un método de construcción de una población de ácidos nucleicos que codifican para región VL alterada, que comprende: a) proporcionar una representación de una secuencia de aminoácidos de referencia, comprendiendo la secuencia de referencia la secuencia de una región VL acepto ra que comprende FR; b) sintetizar una población de secuencias génicas de anticuerpo de región VL alterada, en el que las FR de las regiones VL alteradas son idénticas a las FR de la secuencia de referencia y al menos una primera CDR de las regiones VL de anticuerpo alteradas comprende una secuencia de aminoáci dos al azar. Aún en otras realizaciones, se contempla un método de construcción de una población de ácidos nucleicos que codifican para región VH alterada, que compren de: a) proporcionar una representación de una secuencia de aminoácidos de refe rencia, comprendiendo la secuencia de referencia la secuencia de una región VH aceptora humana que comprende FR; b) sintetizar una población de secuencias génicas de anticuerpo de región VH alterada, en el que las FR de las regiones VH
alteradas son idénticas a las FR de la secuencia de referencia humana y al menos una primera CDR de las regiones variables de anticuerpo alteradas comprende una secuencia de aminoácidos al azar. En algunas realizaciones, la representa
ción de la secuencia de referencia humana es en forma electrónica.
En otras realizaciones, se contempla un método de construcción de una población de ácidos nucleicos que codifican para región VL alterada, que comprende: a) proporcionar una representación de una secuencia de aminoácidos de referencia, comprendiendo la secuencia de referencia la secuencia de una región VL acepto
ra humana que comprende FR; b) sintetizar una población de secuencias génicas de anticuerpo de región VL alterada, en el que las FR de las regiones VL alteradas son idénticas a las FR de la secuencia de referencia humana y al menos una primera CDR de las regiones VL de anticuerpo alteradas comprende una secuencia de aminoácidos al azar.
En algunas realizaciones, la representación de la secuencia de referencia es en forma electrónica. En algunas realizaciones, el método comprende además la etapa de coexpresar la población de ácidos nucleicos que codifican para región VL alterada con un ácido nucleico que codifica para región VH para producir una población diversa de regiones variables heteroméricas alteradas. En algunas realizaciones, la síntesis implica el uso de oligonucleótidos solapantes. En algunas
realizaciones, las CDR se definen mediante la definición de Kabat.
En algunas realizaciones, se modifican una o más FR simultáneamente con la introducción de una o más CDR modificadas. En otras realizaciones, los entramados modificados están adyacentes a las CDR modificadas.
En algunas realizaciones, la presente descripción proporciona métodos de construcción de una población de ácidos nucleicos que codifican para región VH alterada, que comprenden: a) proporcionar una representación de secuencias de aminoácidos de referencia primera y segunda, comprendiendo la primera secuencia de aminoácidos de referencia la secuencia de una región VH donadora, comprendiendo la región variable donadora i) FR Y ii) tres CDR tal como se define por las definiciones combinadas de Kabat y Chothia; comprendiendo la segunda secuencia de aminoácidos de referencia la secuencia de una región VH aceptora que comprende FR; b) sintetizar a) una primera población de oligonucleótidos, que comprende oligonucleótidos que codifican para una FR de región VH modificada, o parte de la misma, en los que la FR de región VH, o parte de la misma,
contiene una pluralidad de aminoácidos cambiados en una o más posiciones en comparación con la secuencia de referencia de región de entramado aceptora, en los que las posiciones de entramado que se cambian se seleccionan de entre las posiciones de entramado aceptoras de la segunda secuencia de referencia que se diferencian en la posición correspondiente en comparación con las posiciones de entramado donadoras de la primera secuencia de referencia; y b) una segunda población de oligonucleótidos, que codifican cada uno para i) al menos una CDR modificada, o parte de la misma, en los que la CDR modificada, o parte de la misma, comprende un aminoácido diferente en una o más posiciones en comparación con la secuencia de referencia de aminoácidos de CDR donadora correspondiente y ii) una o más partes de FR adyacentes que pueden hibridarse con la primera población de oligonucleótidos; y c) mezclar las poblaciones de oligonucleótidos primera y segunda para crear oligonucleótidos solapantes; y d) tratar los oligonucleótidos solapantes en condiciones tales que se construye una población de ácidos nucleicos que codifican para región VH alterada. En determinadas realizaciones, la representación de secuencias de referencia primera y segunda es en forma electrónica. En otras realizaciones, los métodos comprenden además la etapa de (e) coexpresar la población de ácidos nucleicos que codifican para región VH alterada con un ácido nucleico que codifica para región VL para producir una población diversa de regiones variables heteroméricas alteradas. En realizaciones adicionales, la síntesis comprende síntesis química. En algunas realizaciones, el aceptor es humano. En realizaciones preferidas, la una o más de la población diversa de regiones variables heteroméricas alteradas son parte de un anticuerpo que comprende una región Fc, en el que la región Fc comprende al menos una sustitución de aminoácido en comparación con un polipéptido original que tiene una región Fc. En otras realizaciones, la presente descripción proporciona métodos de construcción de una población de ácidos nucleicos que codifican para región VL alterada, que comprenden: a) proporcionar una representación de secuencias de aminoácidos de referencia primera y segunda, comprendiendo la primera secuencia de aminoácidos de referencia la secuencia de una región VL donadora, comprendiendo la región variable donadora i) FR Y ii) tres CDR tal como se define por las definiciones combinadas de Kabat y Chothia; comprendiendo la segunda secuencia de aminoácidos de referencia la secuencia de una región VL aceptora que
comprende FR; b) sintetizar a) una primera población de oligonucleótidos, que comprende oligonucleótidos que codifican para una FR de región VL modificada,
o parte de la misma, en los que la región de entramado de región VL, o parte de la misma, contiene una pluralidad de aminoácidos cambiados en una o más posiciones en comparación con la secuencia de referencia de región de entramado aceptora, en los que las posiciones de entramado que se cambian se seleccionan de entre las posiciones de entramado aceptoras de la segunda secuencia de referencia que se diferencian en la posición correspondiente en comparación con las posiciones de entramado donadoras de la primera secuencia de referencia; y b) una segunda población de oligonucleótidos, que codifican cada uno para i) al menos una CDR modificada, o parte de la misma, en los que la CDR modificada, o parte de la misma, comprende un aminoácido diferente en una o más posiciones en comparación con la secuencia de referencia de aminoácidos de CDR donadora correspondiente y ii) una o más partes de FR adyacentes que pueden hibridarse con la primera población de oligonucleótidos; y c) mezclar las poblaciones de oligonucleótidos primera y segunda para crear oligonucleótidos solapantes; y d) tratar los oligonucleótidos solapantes en condiciones tales que se construye una población de ácidos nucleicos que codifican para región VL alterada. En otras realizaciones, la representación de secuencias de referencia primera y segunda es en forma electrónica. En realizaciones adicionales, los métodos comprenden además la etapa de (e) coexpresar la población de ácidos nucleicos que codifican para región VL alterada con un ácido nucleico que codifica para región variable de cadena pesada para producir una población diversa de regiones variables heteroméricas alteradas. En algunas realizaciones, los métodos comprenden a) proporcionar una representación de secuencias de aminoácidos de referencia primera y segunda, comprendiendo la primera secuencia de aminoácidos de referencia la secuencia de una región VH donadora, comprendiendo la región variable donadora i) FR Y ii) tres CDR tal como se define por las definiciones combinadas de Kabat y Chothia; comprendiendo la segunda secuencia de aminoácidos de referencia la secuencia de una región VH aceptora que comprende FR; b) sintetizar a) una primera población de oligonucleótidos, que comprende oligonucleótidos que codifican para una región de entramado de región VH modificada, o parte de la misma, en los que la FR de región VH, o parte de la misma, contiene una pluralidad de aminoácidos
cambiados en una o más posiciones en comparación con la secuencia de referencia de FR aceptora en los que las posiciones de entramado que se cambian se seleccionan de entre las posiciones de entramado aceptoras de la segunda secuencia de referencia que se diferencian en la posición correspondiente en comparación con las posiciones de entramado donadoras de la primera secuencia de referencia; y b) una segunda población de oligonucleótidos, que codifican cada uno para i) al menos una CDR modificada, o parte de la misma, en los que la CDR modificada, o parte de la misma, comprende un aminoácido diferente en una
o más posiciones en comparación con la secuencia de referencia de aminoácidos de CDR donadora correspondiente y ii) una o más partes de FR adyacentes que pueden hibridarse con la primera población de oligonucleótidos; y c) mezclar las poblaciones de oligonucleótidos primera y segunda para crear oligonucleótidos solapantes; y d) extender los oligonucleótidos solapantes con una ADN polimerasa en condiciones tales que se construye una población de ácidos nucleicos que codifican para región VH alterada. Todavía en otras realizaciones, la presente descripción proporciona métodos de construcción de una población de ácidos nucleicos que codifican para región VL alterada, que comprenden: a) proporcionar una representación de secuencias de aminoácidos de referencia primera y segunda, comprendiendo la primera secuencia de aminoácidos de referencia la secuencia de una región VL donadora, comprendiendo la región variable donadora i) FR Y ii) tres CDR tal como se define por las definiciones combinadas de Kabat y Chothia; comprendiendo la segunda secuencia de aminoácidos de referencia la secuencia de una región VL aceptora que comprende FR; b) sintetizar a) una primera población de oligonucleótidos, que comprende oligonucleótidos que codifican para una FR de región VL modificada, o parte de la misma, en los que la FR de región VL, o parte de la misma, contiene una pluralidad de aminoácidos cambiados en una o más posiciones en comparación con la secuencia de referencia de FR aceptora, en los que las posiciones de entramado que se cambian se seleccionan de entre las posiciones de entramado aceptoras de la segunda secuencia de referencia que se diferencian en la posición correspondiente en comparación con las posiciones de entramado donadoras de la primera secuencia de referencia; y b) una segunda población de oligonucleótidos, que codifican cada uno para i) al menos una CDR modificada, o parte de la misma, en los que la CDR modificada, o parte de la misma, comprende un aminoácido diferente en una o más posiciones en comparación con la secuencia de referencia de aminoácidos de CDR donadora correspondiente y ii) una
o más partes de FR adyacentes que pueden hibridarse con la primera población de oligonucleótidos; y c) mezclar las poblaciones de oligonucleótidos primera y segunda para crear oligonucleótidos solapantes; y d) extender los oligonucleótidos solapantes con una ADN polimerasa en condiciones tales que se construye una población de ácidos nucleicos que codifican para región VL alterada. En algunas realizaciones, se introducen una o más modificaciones en el entramado, simultáneamente con la introducción de una o más CDR modificadas. Las CDR modificadas pueden comprender una o más alteraciones de aminoácido en comparación con la CDR de una secuencia de referencia. En determinadas realizaciones, los métodos de construcción de una población de ácidos nucleicos que codifican para región VH alterada, comprenden: a) proporcionar una representación de secuencias de aminoácidos de referencia primera y segunda, comprendiendo la primera secuencia de aminoácidos de referencia la secuencia de una región VH donadora, comprendiendo la región variable donadora i) FR Y ii) tres CDR tal como se define por las definiciones combinadas de Kabat y Chothia; comprendiendo la segunda secuencia de aminoácidos de referencia la secuencia de una región VH aceptora que comprende FR; b) sintetizar i) una primera población de oligonucleótidos, que codifican cada uno para al menos una CDR modificada, en los que la CDR modificada comprende un aminoácido diferente en una o más posiciones en comparación con la secuencia de referencia de aminoácidos de CDR donadora correspondiente; y ii) una segunda población de oligonucleótidos, que comprende oligonucleótidos que codifican para partes modificadas de un entramado de región VH, conteniendo la parte modificada una pluralidad de aminoácidos cambiados en una o más posiciones en comparación con la secuencia de referencia de región de entramado aceptora, en los que las posiciones de entramado que se cambian se seleccionan de entre las posiciones de entramado aceptoras de la segunda secuencia de referencia que se diferencian en la posición correspondiente en comparación con las posiciones de entramado donadoras de la primera secuencia de referencia; c) mezclar las poblaciones de oligonucleótidos primera y segunda en condiciones tales que al menos una parte de los oligonucleótidos se hibridan para crear oligonucleótidos solapantes; y d) tratar los oligonucleótidos solapantes en condiciones tales que se construye una población
de ácidos nucleicos que codifican para región VH alterada. En determinadas realizaciones, la representación de secuencias de referencia primera y segunda es en forma electrónica. En realizaciones adicionales, los métodos comprenden además la etapa de (e) coexpresar la población de ácidos nucleicos que codifican para región VH alterada con un ácido nucleico que codifica para región VL para producir una población diversa de regiones variables heteroméricas alteradas. En otras realizaciones, el aceptor es humano. En otras realizaciones, la presente descripción proporciona métodos de construcción de una población de ácidos nucleicos que codifican para región VL alterada, que comprenden: a) proporcionar una representación de secuencias de aminoácidos de referencia primera y segunda, comprendiendo la primera secuencia de aminoácidos de referencia la secuencia de una región VL donadora, comprendiendo la región variable donadora i) FR Y ii) tres CDR tal como se define por las definiciones combinadas de Kabat y Chothia; comprendiendo la segunda secuencia de aminoácidos de referencia la secuencia de una región VL aceptora que comprende FR; b) sintetizar i) una primera población de oligonucleótidos, que codifican cada uno para al menos una CDR modificada, en los que la CDR modificada comprende un aminoácido diferente en una o más posiciones en comparación con la secuencia de referencia de aminoácidos de CDR donadora correspondiente; y ii) una segunda población de oligonucleótidos, que comprende oligonucleótidos que codifican para partes modificadas de un entramado de región VL, conteniendo la parte modificada una pluralidad de aminoácidos cambiados en una
o más posiciones en comparación con la secuencia de referencia de FR aceptora, en los que las posiciones de entramado que se cambian se seleccionan de entre las posiciones de entramado aceptoras de la segunda secuencia de referencia que se diferencian en la posición correspondiente en comparación con las posiciones de entramado donadoras de la primera secuencia de referencia; c) mezclar las poblaciones de oligonucleótidos primera y segunda en condiciones tales que al menos una parte de los oligonucleótidos se hibridan para crear oligonucleótidos solapantes; y d) tratar los oligonucleótidos solapantes en condiciones tales que se construye una población de ácidos nucleicos que codifican para región VL alterada.
En determinadas realizaciones, pueden generarse los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo que comprenden una variante de Fc y una región variante de cadena pesada alterada. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la presente descripción proporciona métodos de construcción de una población de ácidos nucleicos que codifican para región VH alterada, que comprenden: a) proporcionar una representación de secuencias de aminoácidos de referencia primera y segunda, comprendiendo la primera secuencia de referencia la secuencia de una región VH donadora, comprendiendo la región variable donadora i) FR Y ii) tres CDR tal co
mo se define por las definiciones combinadas de Kabat y Chothia; comprendiendo la segunda secuencia de referencia la secuencia de una región VH aceptora que comprende FR; b) sintetizar A) primeros oligonucleótidos que codifican para partes de las FR de la región VH aceptora, en los que las partes de las FR en comparación con la segunda secuencia de referencia no están modificadas; y B) una población de segundos oligonucleótidos, que codifican cada uno para i) al menos una parte de una primera CDR que se ha modificado, seleccionándose la primera CDR del grupo que consiste en HCDR1 , HCDR2 y HCDR3, en los que la primera CDR modificada comprende un aminoácido diferente en una o más posiciones en comparación con las CDR donadoras correspondientes de la primera secuencia de referencia y ii) una o más partes de FR no modificadas que pueden hibridarse con los primeros oligonucleótidos; c) mezclar los primeros oligonucleótidos con la población de segundos oligonucleótidos para crear oligonucleótidos solapantes; y d) tratar los oligonucleótidos solapantes en condiciones tales que se construye una población de ácidos nucleicos que codifican para región VH alterada, en los que las FR codificadas por los ácidos nucleicos que codifican para región VH alterada no están modificados con respecto a la segunda secuencia de referencia. En algunas realizaciones, los métodos comprenden además la etapa de coexpresar la población de ácidos nucleicos que codifican para región VH alterada con un ácido nucleico que codifica para región VL para producir una población diversa de regiones variables heteroméricas alteradas. En otras realizaciones, la presente descripción proporciona métodos de construcción de una población de ácidos nucleicos que codifican para región VL alterada, que comprenden: a) proporcionar una representación de secuencias de aminoácidos de referencia primera y segunda, comprendiendo la primera secuencia de referencia la secuencia de una región VL donadora, comprendiendo la región variable donadora i) FR Y ii) tres CDR tal como se define por las definiciones combinadas de Kabat y Chothia; comprendiendo la segunda secuencia de referencia la secuencia de una región VL aceptora que comprende FR b) sintetizar a) primeros oligonucleótidos que codifican para partes de las FR de la región VL aceptora, en los que las partes de las FR en comparación con la segunda secuencia de referencia no están modificadas; y b) una población de segundos oligonucleótidos, que codifican cada uno para i) al menos una parte de una primera CDR que se ha modificado, seleccionándose la primera CDR del grupo que consiste en LCDR 1, LCDR2 y LCDR3, en los que la primera CDR modificada comprende un aminoácido diferente en una o más posiciones en comparación con las CDR donadoras correspondientes de la primera secuencia de referencia y ii) una o más partes de FR no modificadas que pueden hibridarse con los primeros oligonucleótidos; c) mezclar los primeros oligonucleótidos con la población de segundos oligonucleótidos para crear oligonucleótidos solapantes; y d) tratar los oligonucleótidos solapantes en condiciones tales que se construye una población de ácidos nucleicos que codifican para región VL alterada, en los que las FR codificadas por los ácidos nucleicos que codifican para región VL alterada no están modificadas con respecto a la segunda secuencia de referencia. En otras realizaciones, la presente descripción proporciona métodos de construcción de una población de ácidos nucleicos que codifican para región VH alterada, que comprenden: A) proporcionar una representación de secuencias de aminoácidos de referencia primera y segunda, comprendiendo la primera secuencia de referencia la secuencia de una región VH donadora, comprendiendo la región variable donadora i) FR Y ii) tres CDR tal como se define por las definiciones combinadas de Kabat y Chothia; comprendiendo la segunda secuencia de referencia la secuencia de una región VH aceptora que comprende FR; B) sintetizar a) una población de primeros oligonucleótidos, codificando cada uno para al menos una parte de una primera CDR seleccionada del grupo que consiste en HCDR1 , HCDR2 Y HCDR3, en los que la primera CDR modificada comprende un aminoácido diferente en una o más posiciones en comparación con las CDR donadoras correspondientes de la primera secuencia de referencia; y b) segundos oligonucleótidos que codifican para i) partes de las FR de la región VH aceptora, en los que las partes de las FR en comparación con la secuencia de referencia no están modificadas y ii) una o más partes de una CDR que pueden hibridarse con la po
blación de primeros oligonucleótidos; C) mezclar la población de primeros oligonucleótidos con los segundos oligonucleótidos para crear oligonucleótidos solapantes; y O) tratar los oligonucleótidos solapantes en condiciones tales que se construye una población de ácidos nucleicos que codifican para región VH alterada, en los que las FR codificadas por los ácidos nucleicos que codifican para región VH alterada no están modificadas con respecto a la segunda secuencia de referencia. En determinadas realizaciones, los métodos comprenden además la etapa de coexpresar la población de ácidos nucleicos que codifican para región VH alterada con un ácido nucleico que codifica para región VL para producir una población diversa de regiones variables heteroméricas alteradas. En otras realizaciones, la presente descripción proporciona métodos de construcción de una población de ácidos nucleicos que codifican para región VL alterada, que comprenden: A) proporcionar una representación de secuencias de aminoácidos de referencia primera y segunda, comprendiendo la primera secuencia de referencia la secuencia de una región VL donadora, comprendiendo la región variable donadora i) FR Y ii) tres CDR tal como se define por las definiciones combinadas de Kabat y Chothia; comprendiendo la segunda secuencia de referencia la secuencia de una región VL aceptora que comprende FR; B) sintetizar a) una población de primeros oligonucleótidos, codificando cada uno para al menos una parte de una primera CDR seleccionada del grupo que consiste en LCDR1 , LCDR2 y LCDR3, en los que la primera CDR modificada comprende un aminoácido diferente en una o más posiciones en comparación con las CDR donadoras correspondientes de la primera secuencia de referencia; y b) segundos oligonucleótidos que codifican para i) partes de las FR de la región VL aceptora, en los que las partes de las FR en comparación con la secuencia de referencia no están modificadas y ii) una o más partes de una CDR que pueden hibridarse con la población de primeros oligonucleótidos; C) mezclar la población de primeros oligonucleótidos con los segundos oligonucleótidos para crear oligonucleótidos solapantes; y D) tratar los oligonucleótidos solapantes en condiciones tales que se construye una población de ácidos nucleicos que codifican para región VL alterada, en los que las FR codificadas por los ácidos nucleicos que codifican para región VL alterada no están modificadas con respecto a la segunda secuencia de referencia.
En otras realizaciones, la presente descripción proporciona métodos de mejora de la afinidad de unión de una región variable de anticuerpo humanizado mutada, que comprenden: a) proporcionar una secuencia de ácido nucleico que codifica para una primera región variable de anticuerpo humanizado mutada, compren5 diendo la región variable mutada (i) un entramado de anticuerpo humano de tipo natural, (ii) tres CDR de cadena pesada no humanas, y (iii) tres CDR de cadena ligera no humanas, en los que las CDR se definen mediante las definiciones combinadas de Kabat y Chothia, en los que al menos una de las CDR de cadena ligera es una CDR de cadena ligera que contiene mutación al menos con al menos un 10 aminoácido diferente en al menos una posición en comparación con la CDR no humana de tipo natural correspondiente, yen los que la primera región variable de anticuerpo mutada tiene una afinidad de unión superior a la región variable de anticuerpo no mutada correspondiente; b) mutar la secuencia de ácido nucleico que codifica para la primera región variable de anticuerpo mutada en condiciones tales 15 que se codifica una segunda región variable de anticuerpo humanizado mutada, comprendiendo la segunda región variable de anticuerpo humanizado mutada al menos un aminoácido diferente adicional en al menos una posición en la CDR de cadena ligera que contiene mutación, dando como resultado la mutación adicional en combinación con la primera mutación una afinidad de unión superior. En algu
20 nas realizaciones, la CDR de cadena ligera que contiene mutación de la primera región variable de anticuerpo humanizado mutada es CDR3 (LCDR3). En otras realizaciones, al menos una de las CDR de cadena pesada no humanas de la primera región variable de anticuerpo humanizado mutada comprende una mutación, de tal manera que se codifica un aminoácido diferente en al menos una posición en comparación con la CDR no humana de tipo natural correspondiente. En realizaciones adicionales, la mutación de CDR de cadena pesada está en HCDR3. En algunas realizaciones, la presente descripción proporciona métodos de modificación simultánea de al menos una CDR y al menos una FR mientras se constru
30 ye una población de ácidos nucleicos que codifican para región VH alterada, que comprenden: a) proporcionar una representación de secuencias de aminoácidos de referencia primera y segunda, comprendiendo la primera secuencia de aminoácidos de referencia la secuencia de una región VH donadora, comprendiendo la región variable donadora i) cuatro FR y ii) tres CDR tal como se define por las
definiciones combinadas de Kabat y Chothia; comprendiendo la segunda secuencia de aminoácidos de referencia la secuencia de una región VH aceptora que comprende cuatro FR, tal como se define por las definiciones combinadas de Kabat y Chothia; b) sintetizar i) para cada FR que va a modificarse, una población de oligonucleótidos, codificando cada uno para una FR modificada, o parte de la misma, conteniendo la FR modificada o parte de la misma una pluralidad de aminoácidos cambiados en una o más posiciones en comparación con la región de entramado correspondiente en la secuencia de referencia de región VH aceptora, en los que las posiciones de FR que están cambiadas se seleccionan de entre las posiciones de entramado acepto ras de la segunda secuencia de referencia que se diferencian en la posición correspondiente en comparación con las posiciones de región de entramado donadora de la primera secuencia de referencia; y ii) para cada CDR que va a modificarse, una población de oligonucleótidos, codificando cada uno para una CDR modificada, o parte de la misma, en los que la CDR modificada comprende un aminoácido diferente en una o más posiciones en comparación con la secuencia de referencia de aminoácidos de CDR donadora correspondiente; y iii) para cada una de cualquier FR restante y no modificada, oligonucleótidos que codifican para la FR, o parte de la misma, que tienen la misma secuencia que la FR correspondiente de la segunda secuencia aceptora de referencia; y iv) para cada una de cualquier CDR restante y no modificada, oligonucleótidos que codifican para la CDR, o parte de la misma, que tienen la misma secuencia que la CDR correspondiente de la primera secuencia donadora de referencia, en los que oligonucleótidos individuales de (i) a (iv) que codifican para partes adyacentes de la región VH tienen secuencias solapantes en sus extremos terminales; y c) mezclar los oligonucleótidos y las poblaciones de oligonucleótidos sintetizados en la etapa b) en condiciones tales que las secuencias solapantes de oligonucleótidos individuales se hibridan para crear oligonucleótidos solapantes; y d) tratar los oligonucleótidos solapantes en condiciones tales que se forma una población de nucleótidos que codifican para región VH alterada. En determinadas realizaciones, la representación de secuencias de referencia primera y segunda es en forma electrónica. En realizaciones adicionales, la región de entramado que va a modificarse se selecciona del grupo que consiste en HFR1 , HFR2 Y HFR3. En otras realizaciones, la CDR que va a modificarse es HCDR3. En otras realizaciones, el método comprende además la etapa de e) coexpresar la población de
ácidos nucleicos que codifican para región VH con un ácido nucleico que codifica para región VL para producir una población diversa de regiones variables heteroméricas alteradas. En diferente realizaciones, el método comprende además la etapa de e) coexpresar la población de ácidos nucleicos que codifican para región VH con una población de ácidos nucleicos que codifican para región VL para producir una población diversa de regiones variables heteroméricas alteradas. En otras realizaciones, se emplean los métodos de modificación simultánea de al menos una CDR y al menos una FR mientras se construye una población de ácidos nucleicos que codifican para región VL alterada, comprendiendo dicho método: a) proporcionar una representación de secuencias de aminoácidos de referencia primera y segunda, comprendiendo la primera secuencia de aminoácidos de referencia la secuencia de una región VL donadora, comprendiendo la región variable donadora i) cuatro FR y ii) tres CDR tal como se define por las definiciones combinadas de Kabat y Chothia; comprendiendo la segunda secuencia de aminoácidos de referencia la secuencia de una región VL aceptora que comprende cuatro FR, tal como se define por las definiciones combinadas de Kabat y Chothia; b) sintetizar i) para cada FR que va a modificarse, una población de oligonucleótidos, codificando cada uno para una FR modificada, o parte de la misma, conteniendo la FR modificada, o parte de la misma, una pluralidad de aminoácidos cambiados en una o más posiciones en comparación con la región de entra
mado correspondiente en la secuencia de referencia de región VL aceptora, en el que las posiciones de FR que están cambiadas se seleccionan de entre las posiciones de FR aceptora de la segunda secuencia de referencia que se diferencian en la posición correspondiente en comparación con las posiciones de FR donadoras de la primera secuencia de referencia; y ii) para cada CDR que va a modificarse, una población de oligonucleótidos, codificando cada uno para una CDR modificada, o parte de la misma, en el que la CDR modificada comprende un aminoácido diferente en una o más posiciones en comparación con la secuencia de referencia de aminoácidos de CDR donadora correspondiente; y iii) para cada una de cualquier región FR restante y no modificada, oligonucleótidos que codifican para la FR, o parte de la misma, que tiene la misma secuencia que la FR correspondiente de la segunda secuencia aceptora de referencia; y iv) para cada una de cualquier CDR restante y no modificadas, oligonucleótidos que codifican para la CDR, o parte de la misma, que tiene la misma secuencia que la CDR correspondiente de la primera secuencia donadora de referencia, en el que, oligonucleótidos individuales de (i) a (iv) que codifican para partes adyacentes de la región VL tienen secuencias solapantes en sus extremos terminales, y c) mezclar los oligonucleótidos y las poblaciones de oligonucleótidos sintetizados en la etapa b) en condiciones tales que las secuencias solapantes de oligonucleótidos individuales se hibridan para crear oligonucleótidos solapantes; y d) tratar los oligonucleótidos solapantes en condiciones tales que se forma una población de nucleótidos que codifican para región alterada. En determinadas realizaciones, los métodos comprenden además la etapa de coexpresar la población de ácidos nucleicos que co
lO difican para región VL con una población de ácidos nucleicos que codifican para región VH para producir una población diversa de regiones variables heteroméricas alteradas.
15 La presente descripción proporciona anticuerpos multiespecíficos que comprenden una región Fc variante. Los anticuerpos multiespecíficos tienen especificidades de unión para al menos dos antígenos diferentes. Aunque normalmente tales moléculas sólo se unirán a dos antígenos (es decir, anticuerpos biespecíficos,
20 BsAb) , anticuerpos con especificidades adicionales tales como anticuerpos triespecíficos se abarcan por esta expresión cuando se usa en el presente documento. Los ejemplos de BsAb incluyen, pero no se limitan a, aquellos con un brazo dirigido contra un antígeno de célula tumoral y el otro brazo dirigido contra una molécula desencadenante citotóxica tal como anti-FcyRI/anti-CD 15, anti-pl
25 85HER2/FcyRIII (CD 16), anti-CD3/anti-célula B maligna (D1 DO), anti-CD3/anti-pl 85HER2, anti-CD3/anti-p97, anti-CD3/anti-carcinoma de células renales, antiCD3/anti-OVCAR-3, anti-CD3/L-D I (anti-carcinoma de colon), anti-CD3/antianálogo de hormona estimulante de melanocitos, anti-receptor de EGF/anti-CD3, anti-CD3/anti-CAMAI, anti-CD3/anti-CD19, anti-CD3/MoV18, anti-molécula de ad
30 hesión a células neuronales (NCAM)/anti-CD3, anti-proteína de unión a folato (FBP)/anti-CD3, anti-antígeno asociado con carcinoma de páncreas (AMOC31)/anti-CD3; BsAb con un brazo que se une específicamente a un antígeno tumoral y un brazo que se une a una toxina tal como anti-saporina/anti-id-1 , antiCD22/anti-saporina, anti-CD7/anti-saporina, anti-CD38/anti-saporina, antiCEAlanti-cadena A de ricina, anti-interferón a (IFN-a)/anti-idiotipo de hibridoma, anti-CEAlanti-alcaloide de la vinca; BsAb para convertir profármacos activados por enzimas tales como anti-CD30/anti-fosfatasa alcalina (que cataliza la conversión de profármaco fosfato de mitomicina en alcohol de mitomicina); BsAb que pueden usarse como agentes fibrinolíticos tales como anti-fibrina/anti-activador de plasminógeno tisular (tPA) , anti-fibrina/anti-activador de plasminógeno de tipo urocinasa (uPA); BsAb para dirigir complejos inmunitarios a receptores de superficie celular tales como anti-lipoproteína de baja densidad (LDL)/anti-FcR (por ejemplo, FcyRI, FcyRII o FcyRIII); BsAb para su uso en la terapia de enfermedades infecciosas tales como anti-CD3/anti-virus del herpes simple (VHS), anticomplejo receptor de células T:CD3/anti-influenza, anti-FcyR/anti-VIH; BsAb para
la detección de tumores in vitre o in vivo tales como anti-CEAlanti-EOTUBE, antiCEAlanti-DPTA, anti-pI85HER2/anti-hapteno; BsAb como adyuvantes de vacuna; y BsAb como herramientas de diagnóstico tales como anti-lgG de conejo/antiferritina, anti-peroxidasa del rábano (HRP)/anti-hormona, anti-somatostatina/antisustancia P, anti-HRP/anti-FITC, anti-CEAlanti-p-galactosidasa. Los ejemplos de anticuerpos triespecíficos incluyen, pero no se limitan a, antiCD3/anti-CD4/anti-CD37, anti-CD3/anti-CD5/anti-CD37 y anti-CD3/anti-CD8/antiCD37. Pueden prepararse anticuerpos biespecíficos como anticuerpos de longitud completa o como fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos F(ab'h). En la técnica se conocen métodos para preparar anticuerpos biespecíficos. La producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud completa se basa en la coexpresión de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, en la que las dos cadenas tienen especificidades diferentes (por ejemplo, Millstein et al., Nature, 305: 537-539 (1 983». Debido al ordenamiento al azar de cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una posible mezcla de diez moléculas de anticuerpo diferentes, de las cuales sólo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta puede realizarse mediante etapas de cromatografía de afinidad. Se dan a conocer procedimientos similares en el documento WO 93/08829 y en Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991). En otro enfoque, se fusionan dominios variables de anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) con secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión se realiza preferiblemente con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones bisagra, CH2 y CH3. Se prefiere tener la primera región constante de cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para la unión de la cadena ligera presente en al menos una de las fusiones. Se insertan ADN que codifican para las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, en vectores de expresión separados, y se transfectan conjuntamente en un organismo huésped adecuado. Esto proporciona una gran flexibilidad en el ajuste de las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptido en realizaciones en las que proporciones distintas de las tres cadenas polipeptídicas usadas en la construcción proporcionan los rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias codificantes para dos o para las tres cadenas polipeptídicas en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas polipeptídicas en proporciones iguales da como resultado altos rendimientos o cuando las proporciones no tienen significación particular. En una realización preferida de este enfoque, los anticuerpos biespecíficos están compuestos por una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo, y un par cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo (véase, por ejemplo, el documento WO 94/04690). Según otro enfoque descrito en el documento W096/2701 1 la superficie de contacto entre un par de moléculas de anticuerpo puede diseñarse por ingeniería para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recubren a partir de un cultivo de células recombinantes. Los anticuerpos específicos también incluyen anticuerpos reticulados o quot;heteroconjugadosquot;. Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado puede acoplarse a avidina, el otro a biotina.
B. Moléculas de inmunoadhesina
La presente descripción también proporciona moléculas de inmunoadhesina que comprenden una región Fc variante. Un tipo de diseño de inmunoadhesina combina el/los dominio(s) de unión de la adhesina (por ejemplo, el dominio extracelular (ECD) de un receptor) con la región Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina (por ejemplo, una región Fc variante). De manera habitual, cuando se preparan las inmunoadhesinas, se fusionará ácido nucleico que codifica para el do
minio de unión de la adhesina en el extremo C-terminal con ácido nucleico que codifica para el extremo N-terminal de una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina, sin embargo también son posibles fusiones N-terminales. Normalmente, en tales fusiones el polipéptido quimérico codificado conservará al menos dominios bisagra, CH2 y CH3 funcionalmente activos de la región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina. También se realizan fusiones con el extremo C-terminal de la parte Fc de un dominio constante, o inmediatamente N-terminal a la CH1 de la cadena pesada o la región correspondiente de la cadena ligera. El sitio preciso en el que se realiza la fusión no es crítico; se conocen bien sitios particulares y pueden seleccionarse con el fin de optimizar la actividad biológica, secreción o características de unión de la inmunoadhesina. En algunas realizaciones, se fusiona la secuencia de adhesina con el extremo Nterminal de la región Fc variante de inmunoglobulina G1 . Es posible fusionar la región constante de cadena pesada completa con la secuencia de adhesina. Sin embargo, en realizaciones preferidas, se usa en la fusión una secuencia que comienza en la región bisagra justo en sentido de 5' del sitio de escisión de papaína que define Fc de IgG químicamente (es decir, residuo 216, considerando que el primer residuo de la región constante de cadena pesada es 114), o sitios análogos de otras inmunoglobulinas. En determinadas realizaciones preferidas, se fusiona la secuencia de aminoácidos de adhesina con (a) la región bisagra y CH2 y CH3 o (b) los dominios CH1 , bisagra, CH2 y CH3, de una cadena pesada de IgG. En algunas realizaciones, las inmunoadhesinas son biespecíficas. Alternativamente, las secuencias de adhesina pueden insertarse entre secuencias de cadena pesada y cadena ligera de inmunoglobulina, de manera que se obtiene una inmunoglobulina que comprende una cadena pesada quimérica. En tales realizaciones, las secuencias de adhesina pueden fusionarse con el extremo 3' de una cadena pesada de inmunoglobulina en cada brazo de una inmunoglobulina, o bien entre el dominio bisagra y el CH2 o bien entre los dominios CH2 y CH3 (véase, por ejemplo, Hoogenboom et al., Mol. Immunol. 28:1027-1037 (1991). Aunque no se requiere la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en las inmunoadhesinas de la presente invención, puede estar presente una cadena ligera de inmunoglobulina o bien asociada covalentemente con un polipéptido de fusión de adhesina-cadena pesada de inmunoglobulina o bien fusionada directamente con la adhesina. En el primer caso, normalmente se expresa conjuntamen
te ADN que codifica para una cadena ligera de inmunoglobulina con el ADN que codifica para la proteína de fusión de adhesina-cadena pesada de inmunoglobulina. Tras la secreción, la cadena pesada y la cadena ligera híbridas estarán covalentemente asociadas para proporcionar una estructura de tipo inmunoglobulina que comprende dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina unidos mediante enlace disulfuro. Se dan a conocer métodos adecuados para la preparación de tales estructuras, por ejemplo, en la patente estadounidense n.o
4.816.567. En realizaciones preferidas, se construyen inmunoadhesinas fusionando la secuencia de ADNc que codifica para la parte de adhesina en marco con una secuencia de ADNc de inmunoglobulina. Sin embargo, también puede usarse la fusión con fragmentos de inmunoglobulina genómicos. Generalmente, este último tipo de fusión requiere la presencia de secuencias reguladoras de Ig para la expresión. Pueden aislarse ADN que codifican para regiones constantes de cadena pesada de IgG basándose en secuencias publicadas de bibliotecas de ADNc derivadas de linfocitos de sangre periférica o bazo, mediante hibridación o mediante técnicas de PCR. Los ADNc que codifican para las partes de quot;adhesinaquot; y de inmunoglobulina de la inmunoadhesina pueden insertarse en tándem en un vector de plásmido que dirige la expresión eficaz en las células huésped elegidas.
Semivida alterada de variantes El receptor de Fc nenonatal quot;FcRnquot; es un homólogo de complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) que no sólo suministra IgG a través de la barrera materno-fetal durante la gestación, sino que también está implicado en la regulación de la semivida sérica de IgG. Para una revisión reciente sobre FcRn véase Ghetie, V y
E.S. Ward, Annu. Rev. Immunol. 18:739-766, 2000. FcRn se une a IgG de una manera dependiente del pH produciéndose la unión a pH ligeramente ácidos y produciéndose poca unión o unión no detectable a pH 7,4. Se plantea que las IgG se captan por células que expresan FcRn y entran en endosomas ácidos en los que se produce la interacción FcRn-lgG. Entonces se transportan las IgG a la superficie celular y se liberan a pH casi neutro. Las IgG que no se unen a FcRn tras la captación en células entran en compartimentos lisosómicos y se degradan. Concuerda con este modelo la hipótesis de que polipéptidos que comprenden una
región Fc variante que se une a FcRn con afinidad aumentada tienen una semivida sérica más larga que aquéllos con una afinidad menor. El papel de FcRn como transportador de IgG indica que regiones Fc variantes con afinidad alterada por FcRn pueden tener utilidad terapéutica o bien en el contexto de un anticuerpo monoclonal o bien cuando se unen operativamente a una proteína heteróloga, es decir, distinta de anticuerpo. Los polipéptidos terapéuticos que se beneficiarán por aclararse rápidamente del sujeto o del paciente o por no transportarse a través de la membrana placentaria, por ejemplo, polipéptidos radiomarcados, se beneficiarán por unirse operativamente a una región Fc que presenta una afinidad de unión a FcRn disminuida. Alternativamente, polipéptidos que se beneficiarán de tener una semivida sérica más larga y por tanto necesitan administrarse pocas veces o por transportarse a través de la membrana placentaria preferiblemente se unirán operativamente a una región Fc que presenta afinidad de unión a FcRn potenciada (véanse las tablas 2, 5 Y 6). Se contemplan numerosas combinaciones de características de Fc, por ejemplo, puede generarse una región Fc con afinidad de unión a FcRn potenciada pero con poca o ninguna actividad de CDC o ADCC incorporando una o más sustituciones de aminoácidos de Fc que potencian la afinidad de unión a FcRn tal como se indica en la tabla 2 en, por ejemplo, una región Fc original de IgG4, o en una región Fc original de IgG1 en combinación con sustitución de aminoácido que disminuye la actividad de CDC y ADCC. Polipéptidos preferidos que se beneficiarán de una semivida sérica aumentada por estar operativamente unidos a una región Fc variante de la invención que presenta una afinidad de unión a FcRn potenciada en comparación con el polipéptido original son polipéptidos terapéuticos de mamífero incluyendo moléculas tales como, por ejemplo, renina; una hormona de crecimiento; hormona de crecimiento humana; hormona de crecimiento bovina; factor de liberación de hormona de crecimiento; grelina; hormona paratiroidea; hormona estimulante del tiroides; lipoproteína; cadena A de la insulina; cadena 8 de la insulina; a1-antitripsina; PAI-1; proinsulina; trombopoyetina; hormona foliculoestimulante; calcitonina; hormona luteinizante; glucagones; factores de coagulación tales como factor VIIIC, factor IX, factor tisular y factor de von Willdebrand; factores anticoagulantes tales como proteína C; factor naturiético auricular; tensioactivo pulmonar; un activador de plasminógeno, tal como urocinasa o activador de plasminógeno de tipo tisular (t-PA) o
de orina humana; bombesina; trombina; factor de crecimiento hematopoyético; interleucinas, por ejemplo, IL-1 a IL-10, IL-20; factor de necrosis tumoral alfa y beta; encefalinasa; una albúmina sérica tal como albúmina sérica humana; sustancia inhibidora mulleriana; cadena A de la relaxina; cadena B de la relaxina; prorelaxina; péptido asociado a gonadotropina de ratón; una proteína microbiana, tal como beta-Iactamasa; ADNasa; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); receptores para hormonas o factores de crecimiento; integrina; proteína A o D; factores reumatoides; un factor neurotrófico tal como factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), neurotrofina 3, 4, S ó 6 (NT-3, NT -4, NT-S o NT6), o un factor de crecimiento nervioso tal como NGF-beta, cardiotrofinas (factor de hipertrofia cardiaco) tal como cardiotrofina 1 (CT-1); factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGR); factor de crecimiento de fibroblastos tal como aFGF y bFGF, factor de crecimiento epidérmico (EGF) o su receptor; factor de crecimiento transformante (TGF) tal como TGF-alfa y TGF-beta, incluyendo TGF
p1, EGF-p2, EGF-p3, EGF-p4 o TGF-pS; factor de crecimiento similar a la insulina I y 11; des(1-3)-IGF-1 (IGF-I cerebral), proteínas de unión a factor de crecimiento similar a la insulina; proteínas CD tales como CD-3, CD-4, CD-8 y CD-1 9; eritropoyetina; factores osteoinductores; inmunotoxinas; una proteína morfogenética ósea, un factor de diferenciación del crecimiento (por ejemplo, GDF-8); un interferón tal como interferón alfa, beta y gamma; factores estimulantes de colonias (CSF), por ejemplo, M-CSF; GM-CSF y G-CSF; un anticuerpo anti-HER-2 sin una región Fc nativa de una IgG; un anticuerpo anti-VSR sin una región Fc nativa de una IgG; superóxido dismutasa; receptores de células T; proteínas de membrana de superficie; factor acelerador de la degradación; antígeno viral tal como, por ejemplo, una parte de la envuelta de VIH-1; proteína de transporte; receptores de direccionamiento; adresinas; proteínas reguladoras; anticuerpos sin una región Fc nativa de una IgG; y fragmentos o precursores de cualquiera de los polipéptidos indicados anteriormente. La región Fc variante que comprende una sustitución de aminoácido que confiere una semivida sé rica alterada al polipéptido (es decir, afinidad de unión a FcRn potenciada) al que está operativamente unida está de manera preferible operativamente unida al extremo carboxilo o amino-terminal del polipéptido de interés generando de ese modo una proteína de fusión.
Secuencias de ácido nucleico codifican Fc variantes La presente descripción también proporciona secuencias de ácido nucleico que codifican para regiones Fc variantes, así como composiciones, vectores y células huésped que comprenden secuencias de ácido nucleico que codifican para regiones Fc variantes. La presente descripción también proporciona métodos recombinantes para producir una región Fc variante. Generalmente, para la producción recombinante de variantes, se aísla ácido nucleico que codifica para la variante y se inserta en un vector. Pueden transfectarse células huésped con el vector, permitiendo de ese modo amplificar la secuencia de ácido nucleico y/o producir el péptido variante. Pueden aislarse y secuenciarse secuencias de ácido nucleico que codifican para las variantes peptídicas de la presente invención usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas oligonucleotídicas que pueden unirse específicamente a ácido nucleico que codifica para la variante). Generalmente, la secuencia de ácido nucleico que codifica para la variante está operativamente unida a otros elementos, tales como una secuencia señal (por ejemplo, secuencias señal secretoras), un origen de replicación, al menos un gen marcador, un potenciador, un promotor o un terminador de la transcripción. En determinadas realizaciones, se transfectan de manera . estable células huésped con ácido nucleico que codifica para una variante para generar una línea celular que expresa una variante particular. En realizaciones preferidas, las variantes se expresan en células CHO, NSO, Sp2/0, PER.C6 o HEK293. En la técnica se conocen bien métodos recombinantes. Pueden mutarse secuencias de ácido nucleico de tal manera que pueden producirse regiones Fc variantes. Por ejemplo, puede mutarse una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región Fc original (por ejemplo, SEO ID NO: 1-12) de tal manera que se obtiene como resultado al menos un cambio de aminoácido cuando se expresa la secuencia de ácido nucleico. Además, pueden mutarse secuencias de ácido nucleico que codifican para al menos una parte de una región Fc original para producir secuencias de aminoácidos que comprenden al menos una parte de una región Fc variante. En determinadas realizaciones, se emplea síntesis basada en codones para generar secuencias mutadas. Los ejemplos de síntesis basada en codones incluyen, por ejemplo, las descritas en las patentes estadounidenses 5.264.563, 5.523.388 Y 5.808.022. En resumen, puede realizarse síntesis basada en codones acoplan
do secuencialmente monómeros sobre soportes separados para formar al menos dos tupletes diferentes. El acoplamiento puede realizarse en recipientes de reac ción separados, después mezclando los soportes de los recipientes de reacción y dividiendo los soportes mezclados en dos o más recipientes de reacción separados, y repitiendo las etapas de acoplamiento, mezclado y división una o más ve ces en los recipientes de reacción, terminando con una etapa de mezclado o divi sión. Adicionalmente, pueden escindirse los oligonucleótidos de los soportes.
Formulaciones usos En algunas realizaciones, la presente descripción proporciona formulaciones tera péuticas que comprenden las variantes descritas en el presente documento. Por ejemplo, tales composiciones pueden incluir un polipéptido variante (o parte del mismo), proporcionado junto con líquidos, geles, portadores sólidos, diluyentes, adyuvantes y excipientes fisiológicamente tolerables, y combinaciones de los mismos (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980)). Además, pueden usarse variantes polipeptídicas junto con, antes o después de otros agentes terapéuticos, incluyendo, pero sin limitarse a, salicilatos, esteroides, inmunosupresores, anticuerpos o antibióticos. Los agentes terapéuticos particula res que pueden usarse con las variantes de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, los siguientes agentes, compuestos de azobenceno (patente es tadounidense n.o 4.312.806), derivados de rodamina sustituidos con bencilo (pa tente estadounidense n.o 5.216.002), sales de zinc de L-carnosina (patente estadounidense n.o 5.238.931), 3-fenil-5-carboxipirazoles e isotiazoles (patente esta dounidense n.o 5.294.630), IL-10 (patente estadounidense n.o 5.368.854), inhibi dores de la síntesis de leucotrieno de quinolina (patente estadounidense n.O
5.391 .555), 2'-haI0-2'-desoxiadenosina (patente estadounidense n.o 5.506.21 3), compuestos de fenol y benzamida (patente estadounidense n.o 5.552.439), tributirina (patente estadounidense n.o 5.569.680), determinados péptidos (patente estadounidense n.o 5.756.449), ácidos omega-3 poliinsaturados (patente estadounidense n.o 5.792.795), bloqueantes de VLA-4 (patente estadounidense n.o 5.932.214), metasulfobenzoato de prednisolona (patente estadounidense n.o
5.834.021), agentes limitadores de citocinas (patente estadounidense n.o 5.888.969) y nicotina (patente estadounidense n.O 5.889.028). Pueden usarse polipéptidos variantes junto con agentes que reducen la viabilidad o el potencial proliferativo de una célula. Los agentes que reducen la viabilidad o
5 el potencial proliferativo de una célula pueden funcionar de una variedad de maneras incluyendo, por ejemplo, inhibir la síntesis de ADN, inhibir la división celular, inducir la apoptosis, o inducir la muerte celular no apoptótica. Los ejemplos específicos de agentes citotóxicos y citostáticos incluyen, pero no se limitan a, proteína antiviral de fitolaca, abrina, ricina y cada una de sus cadenas A, doxorubicina, cis
10 platino, yodo 131, itrio 90, renio 188, bismuto 212, taxol, 5-fluorouracilo, VP-16, bleomicina, metotrexato, vindesina, adriamicina, vincristina, vinblastina, BCNU, mitomicina y ciclofosfamida y determinadas citocinas tales como TNF-a y TNF-p. Por tanto, los agentes citotóxicos y citostáticos pueden incluir, por ejemplo, radionúclidos, fármacos quimioterápicos, proteínas y lectinas.
15 Las composiciones terapéuticas pueden comprender, por ejemplo, aditivos normalmente empleados tales como aglutinantes, cargas, portadores, conservantes, agentes estabilizantes, emulsionantes, tampones y excipientes tales como, por ejemplo, calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, y similares. Estas com
20 posiciones contienen normalmente el 1 %-95% de principio activo, preferiblemente el 2%-70% de principio activo. Los polipéptidos variantes también pueden mezclarse con diluyentes o excipientes que son compatibles y fisiológicamente tolerables. Son diluyentes y excipientes adecuados, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, o similares, y combinaciones de los mismos. Además, si se desea, las composiciones pueden contener cantidades minoritarias de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes estabilizantes o de tamponamiento del pH. En algunas realizaciones, las composiciones terapéuticas se preparan o bien como suspensiones o disoluciones líquidas, como pulverizaciones o bien en formas
30 sólidas. Las formulaciones orales incluyen habitualmente aditivos normalmente empleados tales como aglutinantes, cargas, portadores, conservantes, agentes estabilizantes, emulsionantes, tampones y excipientes tales como, por ejemplo, calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, y similares. Estas composiciones adoptan la forma de disoluciones, suspensiones, comprimidos, pastillas, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida o polvos, y contienen normalmente el 1 %95% de principio activo, preferiblemente el 2%-70%. Se describe un ejemplo de una composición oral útil para administrar las composiciones terapéuticas de la presente invención en la patente estadounidense n.o 5.643.602. Las formulaciones adicionales que son adecuadas para otros modos de administración, tales como administración tópica, incluyen ungüentos, tinturas, cremas, lociones, parches transdérmicos y supositorios. Para los ungüentos y las cremas, los aglutinantes, portadores y excipientes tradicionales pueden incluir, por ejemplo, polialquilenglicoles o triglicéridos. Se describe un ejemplo de un método de administración tópica en la patente estadounidense n.o 5.834.016. También pueden emplearse otros métodos de administración liposómicos (véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 5.851 .548 y 5.71 1 .964). Las formulaciones también pueden contener más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular que esté tratándose, preferiblemente aquellos con actividades complementarias que no se afectan adversamente unos a otros. Tales moléculas están presentes de manera adecuada en combinación en cantidades que son eficaces para el fin previsto. También pueden prepararse preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el polipéptido variante, matrices que están en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen, pero
no se limitan a, poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(metacrilato de 2hidroxietilo) o poli(alcohol vinílico», polilactidas, copolímeros de ácido L-glutámico y L-glutamato de y-etilo, etileno-acetato de vinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como el LUPRON DEPOT (microesferas inyectables compuestas por copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida) y poli (ácido D-(-)-3-hidroxibutírico). Mientras que polímeros tales como etileno-acetato de vinilo y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, determinados hidrogeles liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos.
Los polipéptidos variantes pueden usarse para tratar a un sujeto. Tal tratamiento puede administrarse a un sujeto con una enfermedad, o puede administrarse de manera profiláctica a un sujeto (por ejemplo, a un sujeto predispuesto a padecer una enfermedad). Los ejemplo de estados que pueden tratarse incluyen, pero no se limitan a, cáncer (por ejemplo, en el que el polipéptido variante se une al receptor HER2, CD20 o factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF)); estados alérgicos tales como asma (con un anticuerpo anti-lgE); y trastornos mediados por LFA-1 (por ejemplo, en los que el polipéptido variante es un anticuerpo anti-LFA-I
o anti-ICAM-I), etc. En realizaciones preferidas, las variantes polipeptídicas usadas para tratar a sujetos comprenden anticuerpos o inmunoadhesinas. También en realizaciones preferidas, las enfermedades tratadas son enfermedades sensibles a anticuerpos o inmunoadhesinas. Los ejemplos de enfermedades sensibles a anticuerpos incluyen enfermedades y estados médicos tales como: linfoma (que se muestra que puede tratarse con RITUXAN, un anticuerpo anti-CD20), enfermedad infecciosa (que se muestra que puede tratarse con SYNAGIS, un anticuerpo dirigido a la proteína F del virus sincitial respiratorio), trasplante de riñón (ZENAPAX, un anticuerpo antireceptor de IL-2, ha mostrado ser útil), enfermedad de Crohn y artritis reumatoide (que se muestra que puede tratarse con REMICADE, un anticuerpo anti-TNFa), carcinoma de mama (que se muestra que puede tratarse con HERCEPTIN, un anticuerpo anti-20 HER2) y cáncer de colon (que se muestra que puede tratarse con EDRECOLOMAB, un anticuerpo anti-17-1A). Los polipéptidos variantes usados para tratar cáncer comprenderán preferiblemente una sustitución de aminoácido en la región Fc de la invención que confiere actividad de ADCC potenciada y/o actividad de CDC potenciada al polipéptido. En algunas realizaciones, se emplea un polipéptido variante con actividad de ADCC mejorada en el tratamiento de enfermedades o trastornos en el que se desea la destrucción o eliminación de tejido o microorganismos foráneos. Por ejemplo, puede usarse la variante para tratar cáncer; trastornos inflamatorios; infecciones (por ejemplo, infecciones bacterianas, virales, fúngicas o por levaduras); y otros estados (tales como bocio) en los que se desea la eliminación de tejido. En otras realizaciones, el polipéptido variante tiene actividad de ADCC disminuida. Tales variantes pueden usarse para tratar enfermedades o trastornos en los que se desea un polipéptido que contiene región Fc con una semivida larga, pero
preferiblemente el polipéptido no tiene funciónlfunciones efectora(s) no desea da(s). Por ejemplo, el polipéptido que contiene región Fc puede ser un anticuerpo anti-factor tisular (TF); anticuerpo anti-lgE; y anticuerpo anti-integrina (por ejem plo, un anticuerpo anti-a 437). El mecanismo de acción deseado de tales polipéptidos que contienen región Fc puede ser bloquear pares de unión ligando receptor. Además, el polipéptido que contiene región Fc con actividad de ADCC disminuida puede ser un anticuerpo agonista. Los polipéptidos variantes usados para tratar cáncer comprenderán preferible mente una sustitución de aminoácido en la región Fc de la invención (véase, por ejemplo, la tabla 2 en el presente documento) que confiere actividad de ADCC po tenciada y/o actividad de CDC potenciada al polipéptido. Los polipéptidos variantes pueden administrarse mediante cualquier medio ade cuado, incluyendo administración parenteral, subcutánea, tópica, intraperitoneal, intrapulmonar e intranasal e intralesional (por ejemplo, para el tratamiento inmunosupresor local). Las infusiones parenterales incluyen administración intramus cular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutánea. Además, la variante polipeptídica se administra de manera adecuada mediante infusión por pulsos, particularmente con dosis decrecientes del polipéptido variante. Preferiblemente, la dosificación se administra mediante inyecciones, lo más preferiblemente inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica. Para la prevención o el tratamiento de una enfermedad, la dosificación apropiada de variante polipeptídica dependerá del tipo de enfermedad que va a tratarse, la gravedad y el transcurso de la enfermedad, si el polipéptido variante se administra para fines preventivos o terapéuticos, la terapia previa, la historia clínica del pa ciente y la respuesta a la variante polipeptídica, y el criterio del médico encargado. El polipéptido variante se administra de manera adecuada al paciente en una vez
o a lo largo de una serie de tratamientos. Por ejemplo, dependiendo del tipo y la gravedad de la enfermedad, aproximadamente de O,1 g/kg a 15 mg/kg (por ejemplo, 0,120 mg/kg) de polipéptido variante es una dosificación candidata inicial para la administración al paciente, ya sea, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas, o mediante infusión continua. Una dosificación diaria típica puede oscilar entre aproximadamente
1 g/kg Y 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anterior
mente. Para administraciones repetidas a lo largo de varios días o más, depen
diendo del estado, el tratamiento se mantiene hasta que los síntomas se reducen
suficientemente o se eliminan. El progreso de esta terapia se monitoriza fácilmen
te mediante técnicas y ensayos convencionales, y puede usarse para ajustar la
5
dosificación para alcanzar un efecto terapéutico.
Estas cantidades sugeridas de polipéptido variante están sujetas a una gran can
tidad de criterio terapéutico. El factor clave en la selección de una dosis y calen
dario apropiados es el resultado obtenido. Los factores para su consideración en
este contexto incluyen el trastorno particular que está tratándose, el mamífero par
lO
ticular que está tratándose, el estado clínico del paciente individual, la causa del
trastorno, el sitio de administración del anticuerpo, el tipo particular de anticuerpo,
el método de administración, el calendario de administración y otros factores co
nocidos por los profesionales médicos.
Una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido variante que va a admi
15
nistrarse es el nivel de dosificación requerido para un paciente de tal manera que
se reducen los síntomas de la enfermedad que está tratándose. Adicionalmente,
una cantidad terapéutica mente eficaz puede referirse a la cantidad de agente te
rapéutico suficiente para retrasar o minimizar o prevenir la aparición de la enfer
medad, por ejemplo, retrasar o minimizar o prevenir la diseminación del cáncer.
20
Una cantidad terapéuticamente eficaz puede referirse a la cantidad de agente te
rapéutico (por ejemplo, polipéptido variante), también puede referirse a la cantidad
del agente terapéutico que proporciona un beneficio terapéutico en el tratamiento
o la gestión de una enfermedad en un sujeto. Además, una cantidad terapéutica
mente eficaz con respecto a un agente terapéutico de la invención se refiere a la
25
cantidad de agente terapéutico solo, o en combinación con otras terapias, que
proporciona un beneficio terapéutico en el tratamiento o la gestión de una enfer
medad en un sujeto. No se necesita formular el polipéptido variante, pero opcio
nalmente se hace, con uno o más agentes usados actualmente para prevenir o
tratar el trastorno en cuestión. La cantidad eficaz de tales otros agentes depende
30
de la cantidad de polipéptido variante presente en la formulación, el tipo de tras
torno o tratamiento, y otros factores comentados anteriormente. Un primer agente
profiláctico o terapéutico (por ejemplo, polipéptido variante o polipéptido que com
prende una región Fc variante de la invención o fragmento funcional de la misma)
puede administrarse antes de, concomitantemente con o después de la adminis
tración de un segundo agente profiláctico o terapéutico a un sujeto con un trastor no. Los agentes terapéuticos pueden congelarse o liofilizarse para su almacenamien to y reconstituirse en un portador estéril adecuado antes de su uso. La liofilización
5 y reconstitución pueden conducir a diversos grados de pérdida de actividad de anticuerpo. Pueden tener que ajustarse las dosificaciones para compensar. Generalmente, se prefiere un pH de entre 6 y 8. En el presente documento se contempla el uso de un anticuerpo monoclonal que comprende una región Fc variante de la presente invención para tratar o prevenir
10 al menos uno de los trastornos mencionados anteriormente (por ejemplo, cáncer) en los que antígeno al que se une el anticuerpo monoclonal es perjudicial o que se beneficia de niveles disminuidos del antígeno. Adicionalmente, se contempla el uso de un anticuerpo que comprende una región Fc variante de la presente invención para su uso en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de al menos uno de los trastornos mencionados anteriormente. Tal como se usan en el presente documento, los términos quot;tratamientoquot;, quot;tratarquot; y similares se refieren a obtener un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en cuanto a prevenir parcial o completamente una enfermedad o síntoma de la misma y/o puede ser terapéutico en cuanto a una cu
20 ra parcial o completa de una enfermedad y/o efecto adverso atribuible a la enfermedad. quot;Tratamientoquot;, tal como se usa en el presente documento, incluye la administración de un compuesto de la presente invención para el tratamiento de una enfermedad o un estado en un mamífero, particularmente en un ser humano, e incluye: (a) prevenir que se produzca la enfermedad en un sujeto que puede estar
25 predispuesto a la enfermedad pero al que aún no se le ha diagnosticado que la tiene; (b) inhibir la enfermedad, es decir, detener su desarrollo; y (c) aliviar la enfermedad, es decir, provocar la regresión de la enfermedad o del trastorno o aliviar síntomas o complicaciones del mismo. Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para proporcionar la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una res
30 puesta terapéutica o profiláctica). Por ejemplo, puede administrarse un único bolo, pueden administrarse varias dosis divididas a lo largo del tiempo o puede reducirse o aumentarse proporcionalmente la dosis tal como se indica por las exigencias de la situación terapéutica.
Se da a conocer un anticuerpo anti-CD20 que comprende una región Fc variante (véanse, por ejemplo, el ejemplo 4 y la figura 4 en el presente documento). Un an5 ticuerpo anti-CD20 comprende una región Fc variante, o parte de la misma que comprende la sustitución de aminoácido, enumerada en las tablas 1-10 en el presente documento, el anticuerpo anti-CD20 puede comprender además un péptido con la secuencia mostrada en SEO ID NO: 13, 14, 15 ó 16. En otra realización, un anticuerpo anti-CD20 comprende una región Fc variante o parte de la misma que
10 comprende la sustitución de aminoácido, enumerada en las tablas 1-10 en el presente documento, y que comprende además péptidos con las secuencias mostradas en:
a) SEO ID NO: 13 y SEO ID NO: 14;
b) SEO ID NO: 15 y SEO ID NO: 16; c) SEO ID NO: 17, 18, 19,20,21 Y 22; o 20 d) SEO ID NO: 23, 24, 25, 26, 27 Y 28. Más preferiblemente, un anticuerpo anti-CD20 comprende una región Fc variante,
o parte de la misma, que comprende sustitución/sustituciones de aminoácido(s) seleccionada(s) del grupo que consiste en:
a) 2471 Y 339D; b) 2471 Y 3390; y 30 c) 378D; y comprende además una región variable que comprende polipéptidos con las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en:
a) SEO ID NO: 13 y SEO ID NO: 14;
b) SEO ID NO: 15 y SEO ID NO: 16;
c) SEO ID NO: 17, 18, 19,20,21 Y 22; Y
d) SEO ID NO: 23, 24, 25, 26, 27 Y 28.
Usos de Fc variante adicionales
Las variantes, y secuencias de ácido nucleico que codifican para variantes, de la presente descripción pueden usarse de muchas maneras. Por ejemplo, pueden usarse variantes en ensayos de selección de fármacos. Por ejemplo, pueden evaluarse compuestos candidatos para determinar su capacidad para alterar o interferir con funciones efectoras de Fc poniendo en contacto una variante con el compuesto candidato y determinando la unión del compuesto candidato a la variante. Puede inmovilizarse la variante usando métodos conocidos en la técnica tales como unión de una proteína de fusión GST-variante a una perla polimérica que contiene glutatión. Se construye un gen quimérico que codifica para una proteína de fusión de GST fusionando AON que codifica para la variante de interés al AON que codifica para el extremo carboxilo terminal de GST (véase, por ejemplo, Smith et al., Gene 67:31 [1988]). Entonces se transforma el constructo de fusión en un sistema de expresión adecuado (por ejemplo, E. coli XA90) en el que puede inducirse la expresión de la proteína de fusión de GST con isopropil-f-Otiogalactopiranósido (IPTG). La inducción con IPTG debe proporcionar la proteína de fusión como constituyente principal de proteínas celulares solubles. Las proteí
nas de fusión pueden purificarse mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica, incluyendo la purificación mediante cromatografía de afinidad con glutatión. La unión del compuesto candidato a la variante está correlacionada con la capacidad del compuesto para alterar la una o más funciones efectoras. En otro método de selección, se inmoviliza o bien la variante o bien un FcR seleccionado usando métodos conocidos en la técnica, tal como adsorción sobre una placa de microtitulación de plástico o unión específica de una proteína de fusión de GST a una perla polimérica que contiene glutatión. Por ejemplo, se une GST
variante a perlas de glutatión-Sepharose. Entonces se pone en contacto la varian te inmovilizada con un FcR y un compuesto candidato. Entonces se retira el pép tido no unido y se solubiliza el complejo y se analiza para determinar la cantidad de péptido marcado unido. Una disminución en la unión es una indicación de que el compuesto candidato inhibe la interacción de la variante con el FcR. Este mé todo de selección es particularmente útil con variantes de la presente invención que muestra un nivel aumentado de Una variación de este método permite la se lección de compuestos que pueden alterar un complejo variante/receptor de Fc anteriormente formado. Por ejemplo, en algunas realizaciones se inmoviliza un complejo que comprende una variante unida a un FcR tal como se describió ante riormente y se pone en contacto con un compuesto candidato. La disolución del complejo por el compuesto candidato se correlaciona con la capacidad del com puesto para alterar o inhibir la interacción entre la variante que está sometiéndose a prueba yel FcR que está. Con respecto a esto, pueden identificarse compuestos con el potencial terapéutico (por ejemplo, en seres humanos) (por ejemplo, compuestos útiles para tratar una enfermedad humana, tal como enfermedades autoinmunitarias ). Otra técnica para la selección de fármacos proporciona una selección de alto ren dimiento para compuestos que tienen una afinidad de unión adecuada a péptidos variantes y se describe en detalle en el documento WO 84/03564. En resumen, se sintetizan grandes números de compuestos de prueba peptídicos pequeños dife
rentes sobre un sustrato sólido, tal como pasadores de plástico o alguna otra su perficie. Entonces se hacen reaccionar los compuestos de prueba peptídicos con péptidos variantes y se lavan. Entonces se detectan los péptidos variantes unidos
mediante métodos bien conocidos en la técnica. Otra técnica usa anticuerpos dirigidos a péptidos variantes. Tales anticuerpos que pueden unirse específicamente a péptidos variantes compiten con un compuesto de prueba por la unión a una variante dada. De esta manera, los anticuerpos pue den usarse para detectar la presencia de cualquier péptido que comparte uno o más determinantes antigénicos del péptido variante. La presente descripción contempla muchos otros medios de selección de com puestos. Los ejemplos proporcionados anteriormente se presentan simplemente
para ilustrar una gama de técnicas disponibles. Un experto habitual en la técnica apreciará que pueden usarse muchos otros métodos de selección.
En particular, la presente descripción contempla el uso de líneas celulares transfectadas con ácido nucleico que codifica para al menos una región Fe variante para seleccionar compuestos por su actividad, y en particular para la selección de alto rendimiento de compuestos a partir de bibliotecas combinatorias (por ejemplo,
bibliotecas que contienen más de 10compuestos). Las líneas celulares de la presente invención pueden usarse en una variedad de métodos de selección. Las variantes pueden usarse como agente de purificación por afinidad. Por ejemplo, la variante puede inmovilizarse sobre una fase sólida tal como una resina Sephadex o papel de filtro, usando métodos bien conocidos en la técnica. Entonces se pone en contacto la variante inmovilizada con una muestra que contiene el antígeno que va a purificarse, y posteriormente se lava el soporte con un disolvente adecuado que eliminará sustancialmente todo el material la muestra excepto el antígeno que va a purificarse, que está unido a la variante polipeptídica inmovilizada. Finalmente, se lava el soporte con otro disolvente adecuado, tal como tampón de glicina, pH 5,0, que liberará el antígeno del polipéptido variante. El polipéptido variante también puede ser útil en ensayos de diagnóstico (por ejemplo, para detectar la expresión de un antígeno de interés en células específicas, tejidos o suero). Para aplicaciones de diagnóstico, la variante se marcará normalmente con un resto detectable (tales marcadores también son útiles en los ensayos de la región Fe descritos anteriormente). Hay numerosos marcadores disponibles, incluyendo, pero sin limitarse a, radioisótopos (por ejemplo, 35S, 14C, 1251, 3H y 1311), marcadores fluorescentes (por ejemplo, quelatos de tierras raras (quelatos de europio) o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, Lissamine, ficoeritrina y Texas Red), y diversos marcadores de enzima-sustrato (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.O 4.275.149), y luciferasa, luciferina, 2,3-dihidroftalazindionas, malato deshidrogenasa, ureasa, peroxidasa tal como peroxidasa del rábano (HRPO), fosfatasa alcalina, 3-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, sacárido oxidasas (por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa), oxidasas heterocíclicas (tal como uricasa y xantina oxidasa), lactoperoxidasa, microperoxidasa y similares). Los ejemplos de combinaciones enzima-sustrato incluyen, por ejemplo: (i) peroxidasa del rábano (HRPO) con hidrógeno peroxidasa como sustrato, en las que la hidrógeno peroxidasa oxida un precursor colorante (por ejemplo, ortofenilen-diamina (OPD) o clorhidrato de 3,3',5,5'-tetrametil-bencidina (TMB» ; (ii) fosfatasa alcalina (AP) con fosfato de para-nitrofenilo como sustrato cromogénico; y (iii) Dgalactosidasa (R-D-Gai) con un sustrato cromogénico o sustrato fluorogénico.
Las variantes también pueden usarse para ensayos de diagnóstico in vivo. Por
5 ejemplo, se marca el polipéptido variante con un radionúclido de modo que el antígeno o las células que lo expresan pueden localizarse usando inmunoescintigrafía.
Tabla 1 Variantes de Fe
235 G, 236 F. R, Y 237 K, N, R 238 E. G. H, 1, L, V, W, y244 L
245 R
247 A, D, E, F, M, N, O, S, T. W, y248
F, P, O, W L, MI N, P, Y H, W
249 1,
2S1
F, G, H, t, K, L, M, N, p, O, R. V, N, Y
D, E, 255 K, M 1, K, L, V, N, S
Y
H,
257 A, 1, M,
258 D
260 S
262 L
264 S
265 K, S
268 K
269 N, Q
271 T
272 H, K, L, R
S,
T,
L, M, N,
Q,279 A, D.
'fF, G, H, 1,
T
F G.
L, M, P, R, T. W, y
I,
288 N, P 292 E. F, G, l, L
293 S, V 301 W
304 312
E E, H
P
315 F, K, P,
R
316 F, K
317 P, T
318 N, P, T
332 F, G, L, M, S, V,
ti
L, M, N. Q. R, S, W. yQ, R, S,
O, E, F. G. H, 1, R,
T, V, N, YD, E, F, I, K, M. N, P,
S, T, V, ti, Y
T, V, W
R,M, N,
I,
O.
A, D, E, F, G, H,
F, G, Q.
M. N,
R.
L,D. I,E,
375 R P, O, R, S, T, V, W,
L, M, N, yG,
G. R,
O, N
P
N, Q, S, T
N,
S, T380 O,
R, T, V. O.
F, H, I, K, M, N, P,
N, y
38S
P
386 K
N
VH,
L
427 N
429 A,
M
1, K,
V, N,
Y
S,A, D, F, G, H, N, O, R.
431 H, K, P 432 R, S 438 a, K, L. T, w 439 E, H, O
O, T, V
440 D, E, F, G, H, l. K, L, M, 442 K
+ Posición de aminoácido de Fc según la numeración de EU
*
Por ejemplo, en la posición 249: 249L, 249M, 249N o 249Y
Tabla 2 Variantes de Fc: cambios de la función efectora
Varia n* te
ADCC poten- ADCC disminui- Unión FcRn a po- Unión FcRn a CDC potenciada CDC disminui
ciada
da tenciada disminuida da
235G 2350 235R 2358 236F 236R 236Y 237E 237K 237N 237R 238A 238E 238G 238H 2381 238L 238V 238W 238Y 244L 245R 247A 2470 247E 247F 247G 247H 2471 247L 247M 247N 247Q 247R 247$ 247T247V247W 247Y248A248F 248P 2480 248W
X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X
249E X X X
X
X
X
X
X
X
X
'X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
251 F
X X X
251 H
X X X
251 1
X X X
X X X X X
254A X X 2540 X X 254E X X 254F X X X 254G X 254H X 2541 X X 254K X X 254L X X X 254M X X X 254N X 254P X X X 2540 X X X 254A X X 254T
X X X 254V X X X 254W X X 254Y X X X 255K X X 255N X X 256A X X X 256F X X 2566 X X 256H X 2561 X X 256K X 256L X
256P
X X X X X
256R
256V X
X X X
256W X X 258Y X X 257A X X X
257. X X X 257M X X X 257N X X X 2578 X X X 257V X X X 2580 X X 260S X X X 262L X X X 264S X X X 265H X X 285K X 285S X X 265Y X X X 267G X X X 267H X X
267K
X X X X X
2680 X X X 268E X X 268K X X 269N X X 2690 X X 27M X X X 2700 X X 270K X
X X 270M X X X 270N X X
X X X X X
272H
272L
X X X X X
X
272N X 272R X X
279F
X
X
X
X
X
2190 X
279.
X
X
219K
X X
219L
X X
279M
X
X
2190 X
X
219R
X 279S X
X
219T
X 279W X X X 279Y X X 280A X
X 280K X
X
280T
X X 283A X X 2830 X X 283F X X X 283G X X X 283H X X X
283. X X
X 263K X X X 283L X X
X 283M X
X
·283N X
X 283P X X 2830 X 283R X X
X 283$ X X 283T X 283W X X X 283Y X X 285N X X 286F X 288N X X 288P X X 292A X
X 292E X X 292F X X 292G X X 2921 X X 292L X X 293S X X 293V X X 301W X X 304E X 307A X X
X 307E X X X 307M X X
X 31 1A X
X 31 10 X
X 31 1E X X
31 1F
X X X 31 1G
X 31 11 X X X 311K X X 31 R X X
X 31 1M
X
X 31 1R
X X 311N X
X
X
X
31 1T X X 311V X
X X
31 1W X X
311Y X
X )(
X X
X
314F X X X 31 41
X X
31 4V
X X X 314W X X X-314Y X315F X X X
315K
X X 315L X
X
31 5P
X X X 31SA
X
X
X
X
3161lt;
X
X
317P
X X
X
317T
X X
318N X
)(
X
X
X
X
X
X
318V X 326W X X X 327T X X
X 328V
X 329Y X
X 330K X X 330R X
X
332A X
332D X X
332E X
X
332F
X X 332G
X
332H X X X
332K X
X
X
332l X X X
332M 332N
X 3320 X 332R X X 332S X X
X
332T X 332V X X 332W X X X 332Y
X 3390 X
X
339F
339G
X X
X
X
X X
X
339H X 3391 X X 339K X X 339L X
339M X
X 339N X X X
339Q X X 339R X X X 339S X X
339T X X X S39W X X 339Y X 3410 X X X 341E X X X 34tF X X X 34t H X X 3411 X X X 341 K X X X 341L X X X 341M X X X 341N X X X 341P X X X 341Q X X X 341R X X X 3415 X X X 341T X X X 341V X X 341W X X X 341Y X
X X X
343A X 3430 X X 343E X X X 343F X
X
343G X
343H X X X X
X
343K X X
343l X
343M X X X X
343N X X
3430 x X X
343R X X X
3435 X X
343T X X 343V X X X X
343W X
343Y X X
X
373A X X X X
3730 X X
373E X X
373F X 373G X X X
373H
X
3731 X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
313N
373R
373V
373W X X X
375A X X X X
376A X X 376E X 376F X X
X
3700 X X X
316H X X
3761 X X X
3761 316M X 316N X
37SP X X 3760 X 316R X X
3768 X
31ST X
376V X X X 376W X X 376Y X X 377G X 377K X X 3np x 3780 X X 37aN X 379N X X 3790 X X 3798 X 379T X 3aOA X X 3800 X 3S0N X X X 380S X X X 380T X X 382A X 3820 X X 3S2F X X X 382M X 3821 X X X 382K X 382L X X 382M X 382N X X 382P X 3820 X X 382R X X 3828 X X X 382T X 382V X X 382W X X 382Y X X 385 E X X 385P X 386K X 423N X X
424H X 424M X X X 424V X 4260
X X 426L X 427N X X X 429A X X X 429F X X X
429M X X X 430A X X 4300 X X 430F X X 4300 X
X
430H X X X 4301 X X 4301lt; X X X 430l X X
430M X X 430N X X X 43QP X 4300 X X 430R X X X
430T
X X X X
430V
X X
430W
X X X
430Y
X X
431 H
X X
431 K
X
431 P
X X
432R
X X X
432S
X X X
434H
X X X X
4341 X X X 434W X X X 434Y X
X X
436' X X 4361 X 436T X X 438G
X
438K X 438l X X X
438T X 438W X X X
439E
439H X
4390 X X 440A X X 4400 X X 440E
X 440F
X X X
440G X 440H X X
4401 X X 440K X X 440L X X X .woM X X 4«JN 4400 X 440R 4«JT X 440V X 44CN1 440Y X 442K X X
Variantes sometidas a prueba en anticuerpo anti-CD20, región Fc de IgG1
Tabla 3 ADCC potenciada Tabla 4 ADCC disminuida
Posición+ Sustitución de aminoácido
247 A, F. H, 1# L. M, T, V, Y 249 E, Y 251 F 254 F, M, Y 256 A, M 258 O 268 D, E 279 A 280 A, K 283 A, 1, K, M, R 288 N 292 A 311 A, DO' N, T, V, Y 315 L 318 N, P, T, V 330 K 332 1'; V 339 D, F, G,. l. K, M, N, Q, R, S, T 376 A, V 377 G, K 379 N 380 N, S 392 Al 1 385 E 427 N 429 M 434 W 436 1
+ Posición de aminoácido de Fc según la numeración de EU
375 R 376 A, E. F, G. H, W, y37S O 382 D, S 429 A, F 430 H, K. N, O. R, W 432 R, S 434 1 440 D. T, V 442
+ Posición de aminoácido de Fe según la numeración de EU
Tabla 5 Afinidad de unión a FcRn potenciada
244 L 245 R
P
252 Y 256 P 257 A, l. M, N, S, V 258 D 260 S
262 L
270 K
272 L, R A, D, G, H,
N, Q, R, S, T, W,
y
R, S, T, W,
y
F, G,
K,
P,
A, D, R, L,I,
Q.
285 N 286 F 288 N. P 293 V
A, E, M
ti
311 A, 1, K, L, M, 312 P 316 K 317 P 318 N, T
332 F, H, K. L. M, R. S, w 339 N, T, W
341 P 343 E. H, K, Q, R, T, Y 375 R 376 G. 1, M, P, T, V 377 K
378 D. N 380 N. S, T
F,
H. K.
M, N, Q, R. S, T, V, N, Y
423 N
427 N
430 A, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R,
S, T, V, Y
431 H, K
434 F, G, H, M, Y
436 I, L, T
438 K. L, T, W
440 K
+ Posición de aminoácido de Fc según la numeración de EU
Tabla 6 Afinidad de unión a FcRn disminuida
Posición+ Sustitución de aminoácido
235 Q236 Y237 K, R 238 E, G, H. W 247 A, D, E, F, G, H, r. L. M, N, Q, R, S, N. Y 248 A, F. p, Q, w 249 E, L, M. Y 251 F, H, l. N 254 D, E, F. G, H. r, K, L. M, N, P. O. R. T, V, 255 K, N 256 F, H, l. K, M, R, W, y 264 S 265 S, Y 267 G. I 268 D, K 270 A, M 279 l., K. L 280 T 292 E, F. G, I, L 311 D, E. F. G, N, R, Y 315 F, K, P 316 F 317 T 326 ti 327 T 339 E, G, L. R 341 D, E, F, 1, K, L. M, N, Q, R. S. T, V. W, y 343 M, V, N 373 A, D, G, K, L. M. N, O. S. T. V, w 376 H, L. N, Y 424 M, V 426 D 429 A, F, M 430 O, ti 431 P 432 R, S 434 1 439 Q440 A. D.
N, Y
+ Posición de aminoácido de Fc según la numeración de EU
Tabla 7 cee potenciada
Posición+ Sustitución de aminoácido
244 L
G, N,
W Q, R,
A,
248 P, S, W
D,
E. N, P, Y
249 E, L, 250 K, R
251 F. H, 1, W
F. K, L, M. R. Y
254 255
X
w,
256 A, G, 1, L, M, P,
260 S 268 D 2quot;79 Q, S, w, 280 X, T
283 F,
292 L
H, 1, K. L. M, N, P, R, S, W
307 A, H 311 F, 1, X. L, M, T, V, W, 312 P
314 F, 1, V. W,
315 F, X, L. P, R 316 K 317 P, T 318 N, T
R, S. s, T, V, W,L, M,
M,
H,F.A, D, E. a,
H, 1,
W,
X,
F,
R,
N, Y
N,
T. V,R,
1, X,
L,341 D,
A,
373 D,
E, E,
N, N,
F, E, G, H, F, H, 1,
W.S,
X,
L, M,
L, M.
R, T, V, w
R
Q,N. R,L,
S, T. V
A, F, P
N,
TN, s,
TS.380 A,
V
382 1, L. 386 K
A,
L
F, M
430 A, D, F, G, R, 1, K, L, M, N, P, R, S, T. V, W,
H,
M,
P
S
Y
438 L, W
440 O.
+ Posición de aminoácido de Fc según la numeración de EU
Tabla 8 cee disminuida
Posición+ Sustitución de aminoácido
235 G, S 236 R 237 B, k, N, R 238 A, E, G, H, 1, L, V, W, y 245 R 247 N, 1, L, T, Y 250 M 252 Y 254 D, E, I, P, O, T, V 255 N 257 A# 1, M, N, S, V 262 L 264 S 265 ni y 267 G, H, 1, K 268 K 269 N, Q 270 G, M, N 271 T 212 H, L, N 292 A 293 S 301 W 307 E 311 E, S 316 F 318 P 327 T 328 V 329 Y 330 K, R 332 E, M 343 1 373 S 379 D 380 D 382 D. F, N, P, R, S, W, y 385 E, P 423 N 424 H, M
+ Posición de aminoácido de Fe según la numeración de EU
Los siguientes ejemplos se proporcionan con el fin de demostrar e ilustrar adicio
nalmente determinadas realizaciones preferidas y aspectos de la presente invención y no deben interpretarse como limitativos del alcance de la misma. EJEMPLO I -Selección de Fc variantes en de ADCC Este ejemplo describe cómo se seleccionan regiones Fc variantes, en el contexto de un anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo anti-CD20) en un ensayo de ADCC.
i. Aislamiento de células mononucleares de Se obtienen aproximadamente 50 mi de sangre periférica a partir de un donante sano y se diluyen 1:2 con solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,0. Se mezclan las disoluciones agitando suavemente el tubo. Se recubren de manera cuidadosa aproximadamente 12 mi de Histopaque-1077 (n.o de cat. de Sigma 1077 -1) bajo la muestra de sangre diluida seguido por centrifugación en una centrífuga Sorvall RT6000B con rotor flotante a 1000 rpm durante 10 mino con freno desactivado. Se descarta la fase superior del gradiente mediante aspiración y se recoge la interfase que contiene CMSP, de color blanco, y se lava 3 veces con solución salina equilibrada de Hank (n.o de cat. de Gibco 14025-092). Se suspende el sedimento celular lavado en aproximadamente 20 mi de medios RPMI 1640 que contienen suero bovino fetal al 10% (FBS) (n.o de cat. de Omega Scientific FB-01). Se dividen las CMSP resuspendidas en dos matraces de cultivo T-175 y se añaden 30 mi de RPMI que contiene FBS al 10% a cada uno, seguido por incubación durante la noche en un incubador a 37°C, CO2 al 5%. Al día siguiente se recogen las CMSP no adherentes en tubos Falcon de 50 mi, se centrifugan como anteriormente y se resuspenden en RPMI que contiene FBS al 1 % que carece de rojo de fenol. Se diluye 10 veces una pequeña parte de las células resuspendidas y se cuentan usando un hemocitómetro. Se colocan las CMSP restantes en el incubador hasta que se necesitan.
Pueden obtenerse líneas de células B que expresan CD20 Wil.2 y SKW6.4 de ATCC y hacerse crecer según se recomienda. Un día antes de usarse, se dividen 2 veces las células. Al día siguiente se ajusta el número de células hasta 4 X 105
células/mi y se añaden alícuotas de 50 JlI (20.000 células/pocillo) a una placa de cultivo tisular de 96 pocillos.
iii. Diluciones de
Antes de la selección, se expresa IgG que comprende una variante de Fe de la presente invención, se purifica y se cuantifica usando un ELlSA convencional. Para la selección de ADCC de un único punto primaria, se diluyen variantes de IgG hasta 40 ng/ml en medios RPMI que contienen FBS al 1 % que carece de rojo de fenol. Se diluye 4 veces la concentración de IgG final en el ensayo (es decir, concentración final de 10 ng/ml). Se añaden alícuotas de cincuenta microlitros de IgG a las células diana y se incuban durante aproximadamente 15 minutos a 37°C antes de añadir las células efectoras a las células diana opsonizadas. Cuando se realizan titulaciones de IgG, se varía la concentración de IgG en el intervalo de desde aproximadamente 0,0001 hasta 1 Jlg/ml. Se preparan diluciones de IgG usando una placa de microtitulación de 96 pocillos diluyendo las muestras en RPM I que contiene FBS al 1 % que carece de rojo de fenol. Entonces se añaden las muestras de IgG diluidas a la placa de ensayo que contiene las células diana.
iv. Células efectoras
Se ajusta la concentración de CMSP de modo que la razón de efector con respecto a diana está en el intervalo de 10-20:1 (es decir, 2-4 X 106 células/mi). Se añaden cien microlitros de las CMSP resuspendidas a cada pocillo de las células diana opsonizadas. Se incuban las placas a 37°C en presencia de CO2 al 5% durante 3-4 horas.
v. Detección de liberación de lactato
Se mide la lisis de células diana detectando la liberación de enzima LDH a partir del citoplasma de células dañadas en el sobrenadante de cultivo. Tras la incubación de las células diana opsonizadas con las células efectoras, se centrifugan las placas de ensayo a 2000 rpm durante 5 minutos. Cuidadosamente, se retiran aproximadamente 75 I del sobrenadante de cultivo celular mientras que se evitan los residuos y las células sedimentadas. Se añade este sobrenadante directamente a una placa de microtitulación y a esto se le añaden 75 I de reactivo de detección de LDH (n.o de cat. de Roche 1 644 793). Entonces se incuba la placa durante aproximadamente 15-30 mino y se lee la absorbancia a 490 nm usando un lector de microplacas Vmax Kinetic de Molecular Devices.
vi. Análisis de datos
Todos los ensayos de selección de ADCC se realizan por duplicado. Cada placa de ensayo contiene controles para determinar la lisis de diana espontánea, lisis de efector más diana espontánea en ausencia de IgG y lisis total de células diana. La lisis total de células diana se alcanza mediante la adición de Triton X-100 al 1 % a las células diana. Se incluyen controles de tipo natural en cada placa de ensayo y se calcula el promedio de la señal de ensayo de ADCC. Se resta el valor de fondo, obtenido a partir de los controles de lisis espontánea, de cada muestra. Se resta el valor de fondo, obtenido a partir de la IgG diluida, de cada muestra. Se convierten los datos de valores de absorbancia en porcentajes de lisis específica basándose en los controles de lisis espontánea y total. Se calcula el porcentaje de lisis específica a partir de la siguiente ecuación: porcentaje de lisis específica
=
(A490 experimental -A490 de fondo)/(A490 máxima -A490 de fondo) X 100, en la que la A490 de fondo es la suma de la A490 obtenida a partir de las células efectoras y diana en ausencia de IgG y el fondo de IgG debido a LDH contaminante presente en los sobrenadantes de IgG en bruto. Se normaliza el porcentaje de la actividad de variante de Fc con respecto al promedio de los controles de tipo natural. Se calcula el promedio del porcentaje de la actividad normalizada para placas de ensayo por duplicado y se calcula la desviación estándar entre placas de ensayo individuales para cada muestra.
vii. Resultados
En las tablas 9 (sustituciones individuales) y 10 (sustituciones combinatorias) a continuación se muestra la actividad específica de ADCC relativa. Los valores de CDC notificados en la tabla 9 se generan tal como se describe en el ejemplo 2 en
el presente documento y el valor del ensayo de unión a FcRn notificado en la tabla 9 se genera tal como se describe en el ejemplo 3 en el presente documento. En las tablas 1 y 2 anteriores se resumen adicionalmente los resultados. Las sustituciones combinatorias que producen un valor de ADCC superior a cualquier 5 sustitución individual sola son: 247F,339D; 2471,339D; 247L,339D; 247L,339T; Y 2471,339Q. Las sustituciones combinatorias que producen una ADCC inferior al 80% de la ADCC de tipo natural aunque tenían una ADCC superior a la del tipo natural cuando se sometieron a prueba solas son: 247A,339D; 247Y,339H; 2471,3391; 247T,3391; 247L,339N; 247A,339Q; Y 247A,339R. Las sustituciones
10 combinatorias que producen una ADCC inferior al 10% de la ADCC de tipo natural aunque tenían una ADCC superior a la del tipo natural cuando se sometieron a prueba solas son: 2471,3391; 247T,3391; Y 247L,339N.
Tabla 9
*
wr Posición y ADCC % de FcRn, pH % de DCD % de n= variantes * CV 6,0 CV CV
WT (a.z) 100 100 100 L 235A 87 23.2 102 11.9 67 7.9 2
235 E 80
17.4
16.2 48
2
L
235G 93 30.3
L
21.2 58 46.0 2
14.4 98
L 235Q 06 1.8 e1 L 236R
45 10.5 93 34.1 110 13.8 2
L
40.0
O 262.9

235S 92 2.0
G
236F O 942.1 88 7.9 O 283.3 2
G
236A O 228.7 101 20.6 14 110.1 ..
G
236Y 8 72.7 76 1 0.0 168 0.3 2
G
237E O 89.2 93 35 .0 36 28.8 ..
G
O 107.5 91
22 31.5
..
G 237R O 81 .3 56 60.6 28
P 238A O 205.8 90 9.6 29 49.5 ..
101.0 4
P 238E O 20.6 76 6.7 24
120.5 4
P 238G O 92.8 66 6.9
P
238H O
206.3 4
18 54.1
p 2381 O 180.4
P 23BL O 37.4 115 13.6 34 50.1 ..
..
P 238V 46 11.8 102 8.3 67 192 P 238W O 66.6 87 5.4 23 103.4
..
P 238V
O
34.0
15.8 16 288.8 4
P 244l n 23.4 124 9.6 134 6.0 2
P 245R 62 15.0 1 88 . 7.2
42
2
P 247A 122 16.2 97 0.3 11 6 0.9 2
1 .1 2
2.8
P 2470
23.4 54
P
10.3
0.0
247E 95
34.1 6
144 18.8 6 1258.9
P
'6.1 75 4.2 137 0.9 2
P 247H 145 11.2 35 252.4 79
P
79 30.7
22 198.3 6
P 247L 144 10.1 57 33.7 O 722.7
21.0 18 1599.0 114 7.2 6
P 247M
1 09 4.0 2
p
91 37.2 41
P 247Q 103 8.5 26 294.3 1 37 3.1 4
P 247R 58 15.5 72 12 1 27 4.9 2
P 247S 106
p 247T 129 112
81 15.0 130 2.6 2
27.5 37 34.8 10
P 247V 120 1 3.5 Na na na na 2 p 247W 102 6.5 O 1314.2 122 0.5 2
7.1 6P 247Y 143 8.4 7 na
K 248A 100 5.4 15 119.9 102 2.4 2
O 559A 202 4.0 2
K 248F
1 07
99.4 226 1.3 2
K 248P 103 9.1
K 2480 101 0.5 38 89.3 174 17.9 2 K 248W 102 9.4 30 54.5 166 8.3 2
16.1
4
78 22.4
D 249E 110 6.1
3.2 2
15 179.9 O 249l 73
O
249M
50 4.5 163 1.2 2
9.6
112 14.0 255 10.9 4
O 249N 94 15.9
O 249P 56 4.0 1 38 21.0 119 0.2 2
1 70 6.6
O 249Y 110
96 30.1 199 1 3.5 6
T 250K 38
47 6.6 4
T 250M 78 11.0 165
288
T 250R 84 0.7 62
160 16.6
251F
6.0 64 47.6
251 '
9.8 7
333.3 190 18.8 2
L
251W 95 2.9 O na 161 17.3 2
M
252Y 61 5.8 964 27.9 62 46.1 4
I
2S3A 103 6.1 O 12.0 81 23.9 4
S
254A 99 20.1 7 733.0 139 11 .2 ..
S
2540 101 14.2 7 113.9 74 31 .2 2
S
254E
102
6 107.9
35.2
S 254F 121 1 1 .2 O 1087.4 206 1 4.4 6 S 254G 100 14.7 7 86.8 102 6.1 2 S 254H 108 20.0 O 74.3 85 22.0 4
S 2541 99 2.5 25 64.3 80 11.5 4 S 254K 109 1 4.8 9 n.2 137 6.1 2
S 254L 89 9.8
12.6 227 12.1 6
6S 254M 89 11.9 O 212.1 248
S 254N 90 13.3 8 5.6 76 34.6 2
S 254P 78 17.7 3 141.4 25.2 2
S 2540 84 12.6 9 121.2 74 25.2 2 -._---------99 1.3 ----14--128:-2--------152--4.8 2
S 254R
254T 54 51.9 32 34.7 75 12.1 2 S 254V 68 40.5 31 40.5 84 4.4 2 S 254W 98 6.0 O 116. 1 188 7.7 6
S
254Y 1 1 7
O
129.1 211 1 5.7 6
4
R 255K 96 3.5 41 65.9 276
R 255N 84 1 7.7 27 162.7 81 18.1 2 T 256A 115 16.5 160 3.0 190 19.6 2
T 2560 97 5.3 544 10.6 86
T
256E 91 12.9 339 8.4 104 72 6
T
256F 11 9 3.3 S 435.0 128 26.6 2
T
256G es 20.0 162 8.0 221 24.5 2
T 256H 103 6.3
26
6.1
1 1 .9
T 256l 93 1 1 .5 72 3.7 157 16.2 4 T 256K 100 6.7 31 20.6 92 20.2 2
T
256L
3.9 78 60.5
267 22.7 4
T 256M 122 17.4 35 78.9 200 1 4.8 1 0 T 2S6N 102 7.2 229 6.4 86 23.2 2
T 256P 109 1 1.8 190 6.1 260 11.8 8 T 2560 100 17.2 64 14.2 152 1 1 .3 4
T 2S6R 94 8.8 33 60.0 71 47.1 2
T 256S 103
1 69 3.1 101 15.9 2
T 256V 82 1 1 .1 1 14 30.5 109 11.0 2 T 256W 96 8.5 1 4 84.5 170 1 4.quot; 4 T 256Y 97 7.2 68 18.6 127 18.0 2
P 2S7A 86 11 .5 31 9 15.0
34
P 257.
1022 14.5 46 22.4
P 257M 26 11.0 835 19.1 48 48.4 4
P 257N 27 1 3. 1 867 15.1 62 31 .4 4
184 6.8 46 30. 1
P
41.5 27
143.5
P 257V 18
91.9
25aO 115 1.0 361 20.5 110 9.6 4
E
5.6 124 7.4 171 17.1 2
T 260S 93
30 48.0 2
V 262L 61 2.9 525 15.1
V 2648 10 39.8 78 20.0
50
81 0.5 2
O 265H 8 118.9 19 36.1
O 265K 10
146.2
84 46.4
O 2658 9 106.3 66 28.9 103 13.3 2 O 265V 3 7.6 33 88.8 62 21.5 2
8.6 86 0.9 60 18.1 4
S 261G 29
48.4 86 16.8 47 41 .1 4
S 267H O S 2671 O 78.0 83 11.8 50 37.8 4 S 267K O 73.3 102 1 4.2 26 47.1 4
H 2680 1 1 0 7.8 68 32.4 122 1 0.7 6 H 268e 1 1 0 8.3 126 17.8 100 8.4 8 H 268K 98 17.6 86 10.4 24 112.7 4
e
92 17.0 30 69.4 4
47 3.6 98 3.5 22 82.8 4
E 2690
o 270A 41 35.5 87 6.0 36 66.5 4
o 2700 o 102.2 108 16.5 37 21 .8 4
o 270K
15
8.4 o 462.9 4
19.2 81 5.2 25 606.9 4
o 270M 49
o 270N 28 1185..2 94-8.2 34 103.7 4
P 271T 26 53.9 96 20.4 S2 89. 1 4
13.6
23.0
34.8 2
272H
e
70 8.9 320 20.4 118 28.7 4
E
E 272l 78 21 .1 129 3.9 71 3.1 2
71 34.6 2
E 272N 90
7.5
3.3 102 1.2 2
E 272R 50 2.1
2 1 .2 2
V
279A
5.0
11 4 14.6
87
98 8.5 2
0.3
V 2790
10.0 2
14.3
V 279F 81 4.8 113
11.8 109 18.0 2
V 279G 98 2.4 256
V
279H
28.1 127 22.7 6
21.0 2
83 1.3
V 2791 1 01 1 .6
V 279K 91 1.5 79
106 0.7
5.7 2V 279L 96 3.0 78 1 3.9
3.5 91 10.3 2
V 279M 107 8.3 122 V 219N 102 32.0 204 19.5 85 50.2 6
V 2790 85 28.3 181
4.8 130
V 2795 94
122 16.7
219T 95 15.5 265 6.9
V 27M 68
24.8 162 22.8 125
V 279Y 26.8 139 8.6 144 O 280A 111 44.9 55 50.1 135 28.7 2
D 280K
131
47.6
O 280T 108 na 60 12.6 122 8.7 4
E 283A 101 2.1
02 96 17.9
92 1 0.3
E 2830 84 8.4 110 4.0
E 283F
0.1 168 38.6
20.4 2
E 283G 93 3. 1 1 37 4.4 135 8.5 2 E 283H 87 6.1 206 6.5 123 15.9 2
E
2831
1 06
5.6
126 1 2.3 2
e 283K 109 5.8 246 5.1 133 8.0 2
E
0. 1 21 26
92 3. 1
95
13.8 120
E 283M 112 135 23.4 8
E 283N 1 02 3.8
136
118 11.8 4
E 2B3P 97 11.9
8.0 1 22 22.9 2E 2830 95 5.3
E 283R 102 0.3 282 8.1 144 16.7 2
91 1.5 143 11.1
E
108 11.0 2
103 3.2 1 43
E
1.3 2
2.1
E 283W 90 2.8
4.1 136 17.2 2
E 2B3Y 81 6.7
H 285N 93 2.6 202 19.8 113
N 286F 107 1.1 301 32.3 108 16.1 4
K 288N 110 8.7
13.2
19.1 4
1.1 119 3.0 116 15.7 2
K 288P
67.5 74 21.1 4
A 292A 11. 2.9
R 292E 35 21 .4 65 48.5 92 32.1 2 R 292F 13 16.4 64 7.6 101 8.3 2
60
119 32.8 2
A 292G 94
R
1.5 56 23.6 1 06 3.7
6B 40.0 123 7.2 2
R 292L
E 2935 68 1,4 101 23.0 98 0. 1 2
E 293V 73
12.5
18.0
107 24.0 2
A 301W 5 105.4 119 1 8.1 49 31 .1 4
S 304E 24 32.9 101 8.7 122 11.3 2
233 14.5
6.5 4
T 307A 87 492 34.6 81 2.4 4
T ao7E 88
150 6.5
T 307M 82
139 7.0 89 28.3
o 31 1A 1 06
o 3110 111 6.0 38 22.2 ea 13.6 2
0.7 2
o 311E 102 1.7 46 17.7
o 31 1F 69 6.9
1.5
20.7 2
o 31 1G 98 1.9 58 21 .5 92 9.6 2
11.3 8
o 31 11 87 8.2 437 9.6 236
o 311K 80 13.4 165
1 70 9.3
186 9.2 191 8.1 4
o 311l 107 6.7
a 311N 115
1.9
126 23.3
o 31 1P 99 8.0 89 300.5 172 67.9 4
o S1 1R 96
14 84.5 170 1 4.4 2
o
92.8 2
Q 31 16 B6 8.8 97
Q 311T 111 10.2 131 14.0 168 23.4 2 Q 31 1V 108 1.7 558 19.5 240 23.3 4 Q 311W 104 8.2 215 2.8 251 18.1 4 a 31 1Y 107 3.0 94 0.3 21 1 25.0 2
1.4 546 16.1 148 11.6 2o 312P 7.8 42 41 .2 108 5.5 2
L 314F
L 3141 83 1 3.0 86 22.7 184 14.2 4 l 31 4V 65 14.0 21 128.8 179 10.9 4 l 314W 79 11.0 5 80.2 190 2.0 4 1-31 4Y 87 13.6 64 81 .4 238 3.2 4
N 31SF 83 12.8 51
140 15.3 2
N 31 5K 108 3.5 88 10.2 148 8.2 2 N 315L 112 6.2 103 10.5 145 5.5 2
231
4
N 315P 62 10.2 14 289.1
N 31SA 96 24.4 71
135 0.4 2
G 316F 54 26.0 34 12.4 81 10.0 2
G 3161lt;
28.8
131 8.9 8.6 2
K 311P 54 21.5 145 1.6 1 90 4.1 4
K
317T
10.9 49 4.8 118 4.0 2
E 318N 123 72 21 6 7.5 120 7.0 4 E 318P 120 10.8 75 27.1 79 11.0 4 E 31ST 109 5.7 304 56.8 118 10.5 4
114 21 2 95 11.5 4
E 318V 116
214 2
K 326W 74 17.9 93 5.7
A 327T 4 13.4 54 19.5 7 206.2 2
l 328V 76
3.2 101
6.3 56 4
P 329Y 53 41 .5 107 13.2 25 90.3 4
6
S30K 134 9.3 108 51.4 43
A
330R 1 03 5.5 121 39.4
36.6 6
A
I 332A 100 6.1 96 27.6 130 5.0 4 I 3320 1 43 3.1 78 33.7 151 11.5 6 332E 168 10.6 86 222 143 9.8 18
332F
149 11.0 4
• 332G 74 19.8 94 1.4 121 11.5 2 332H 82 4.3 129 1.1 150 11.5 2 332K 12 114.5 146 7.0 67 15.5 2 332l 94 0.9 127 2.6 154 5.1 2 332M 98 2.2 128 16.1 118 6.6 2
332N 95 1 5.3 92 16.1 137 5.1 4 332Q 99 8.4 98 7.9 148 8.5 6
332R 12 135.5 114
88 30.0 2
263 64.1 177 16.5
3325 96
332T 112 7.5
5.3
4.5 4
332V 109 1 .1 115 19.5 1 47 25.1 2
332W 81 16.8 123
150 9.7 2
332Y 93 13.1 93 12.3 152 5.3 2 A 3390 131 10.4 80 26.4 183 20.3 6
91 0.1
A 339E
0.4
4.2
8.5 6
A 339F 104 3.3 120 24.6
A 339G
61 6.5 118 0.3 2
A 339H 1 1 4 23.4 107 1 0.0 136 0.5 2 A 339f 136 14.6 80 30.6 20S 22.8 6 A 339K 129 24.2 83 29.0 201 21 .0 6
A 339l 97
8.7 83
2
1 1 5 6.8 11' 7.2 57 B.a 2
A
110 6.3 146
240 17.5 4
A
A 339C 128 15.8 102 1 9.8 138 1 1.0 6 A 339A 117 14.4 82 1 3.4 128 2.1 2
A 339S 124 13.0
23.6 1 70 . 22.5 6
A 339T 142 142 138 6.2 220 20.2 10 A 339W 92 13.4 156 11.4 243 10.6 6 A 339Y 97 1 7.0 92 19.8 265 21 .9 1 0
62 6.9 52 37.8 172
G 3410
6.9 50 18.1 161 3.8 2
G 341E
G 341 F 24 100.8 52 41 .9 227 14.7 6
G 341H 54
65 63.7 245 16.0 6
G 341 1 44 15.5 36 17.2 173 5.3 2
G 341 K n
67 18.9 161 2.6 2
G 341L 64 24.3 54 19.8 171 4.2 2
G 341M
SS
79 9.7
232 1 1 .1
G 341 N 83 9.1 53 17.0 162 9.5 2 G 34 1 P 3S 47.2 127 9.9 228 1 6.2 6 G 34 10 59 1 8.7 72 1.0 166 7.7 2
G 341 R
1 4.9
78 7.4
7 . 5
G 3415 65 26.6 55 12.2 224 9.2 6 G 341T O 866.0 68 54.0 176 10.0 2 G 341V 65 171.0 69 15.0 213 9.6 4
8.9
178 8.7 2
25.8G 341W 14
54 5.2 1 84 1 4.3 2
G 341 Y 26
5.9 2
P 343A 75 18.6 ,,0 37.7
18.3 2
P 3430 69 11.5
157 17.6 2
P 343E 65 34.9
89 13.0 99 1058.4 4
P 343F 74 20.6
110 14.9 244 11.1 6
P 343G 75 29.1
191 1.2
P 343H 78 33.8
3.1 2
114 16.7 86 10.5 2
P 343. 92
P 343K
232 2.6 185 9.1
P 343L 63 17.2 125 3.8 127
p
343M
60
83 13.7 134 18.7 4
105 1 9.9 196 182 2
P 343N 67
442 14.0 178
P 3430
72
9.9 4
P 343R 94 1.3 198 10.4 179
P 343S 84
101 14.3 207 11.9 6
126 16.1 151 4.4 2
P 343T 69 ....2
P 343V 70 1.9
77
12.0 2
343W 48 22.3 56 6.4 194 17.9 2
p
112 7.2 270 14.4
P 343Y
121 28.7 2
Y 313A 56 3.7 33 15.0
Y 3730 74 17.7 14
32.5
10.2 6
V 373E 41 23.6 106 20.8 1 51 19.5 2
12.7 117 1.0 2
Y 373F 76 2.6 110
Y 373G 39 21.6 38
:2
169 8.2 4
Y 373H 79 34.2 100 13.9 Y 3731 65 9.0 73 14.0 154 6.4 :2 Y 373K 76 12.2 10 2.9 246 6.9 6 189 6.2 6
Y 373L 76 21.4 66 17.0 Y 373M 78 1.2 53 25.8 115 3.2 2 Y 313N 64 21.5 61 23.3 148 12.1 2
Y
63 11.0 55 24.7 158 17.7 :2
101 24.1 221
Y 37aR 81
24.8 2
74 1.9 72
373S
Y
Y
70 3.0 82 16.6 151 5.7 2
1.1 2
Y 373V 73 2.1 69 14.3 115
23.3 75 18.5 237 20.8 6
Y
n
10.9 595 15.9 166 1.1 2
S
37SA 1 11 1 8.2 155 26.7 180 5.2 2
O O 37SE as 1 2.3 82 29.5 98 13.5 2
7.3 116 1 2.6 119 8.6 2
O 376F 84 O 376G 73 3.1 135 3.9 164 0.6 2 O 376H 74 16.1 81 1 8.6 118 5.6 2 O 3761 1 00 14.1 144 7.2 101 50.5 10 O 316L 88 16.7 78 3.0 142 3.2 2 O 376M 86 21 .6 129 1.4 91 15.1 2
O 376N
14.5 94 24.2 173 14.9 4
O 376P 85 15.1 203 12.9 153 19.6 6 O 376Q 88 5.0 116 22.7 176 19.9 4 O 376R 95 6.0 103 12.3 166 4.6 2 O 376S 85 21 .4 134 27.3 209 25.3 2 O 316T 102 20.0 160 11.2 224 10.1 6
O 376V 112 8.1 251 15.0 210 11.1 12 O 376W 53 22.0 1 171 9.9 89 34.8 2 O 376Y 78 4.2 53 25.8 98 39.9 2 377G 107 2.4 76 28.8 92 7.6
377K
10.0 39.0 204
,
3np 99 '1.3 98 32.4 245 6.5 4
A
3780 98 6.6 163 13.9 19 91 .9 6
A
378N 1 01 7.1 180 3.0 90 30.7 2
4V 379N 96 19.5
V S79Q 113
85 27.3 218
1.4 2
V 379S 80 18.4 86
V 319T 101 16.6 109 14.9 237 22 4
E S80A 106 3.2 152 28.B 139 4.2 2 13 44.2 78 0.7 2
E 3800 102 2.1
E
111 7.7 142 19.0 139 7.3 2
E SBOS 110 8.5 230 24.1 1 31 0.1 2
E 380T
172 11.0 1 1 5
E 3B2A 110 6.0 103 7.8 82 29.6 2 e 8820 95 0.8 73 25.7 80 34.2 2
e 382F 121 13.8
16.6 28.2 6
e 382H 89 17.9 135 2.8 84 20.4 2
e 382. 109 131 6.2 219 5.4 6
E 382K 96 2.6 153 30.2 92 15.6 4
E 382L 93 16.5 126 11.1 1 56 7.7 2 E 382M 89 14.6 135 8.6 126 20.3 2
5.2
69 2E 382N 99 1.1 131
122 22.0 69 14.6 2
e 382P 85 16.8 E 3820 105 12.2 162 12.0 140 19.3 2
8.4 165 2.7 85 3.0 4
e 382R
4.1 2
E 3825 8S 2.9 1 51 10.0
E 382T 89 10.2 112 5.2 109 30.0 2 E 382V 83 32.5 173 6.2 167 0.4 2
E 382W 97 10.5 172
1.9 2
E 382V 105 1 1 .5 1 88 14.5 78 3.3 4 G 3S5E 108 5.5 98 18.8 o 1586.3 2 101 23.2 82 15.8 2
G 3B5P 100 3.2
1 15 4.8 266 1.6 4
a 386K 96 9.5
F 423N 107 8.5
2.1
48 27.5 2
5 424H 116 29.8 91 7.3 58 9.3 2
S 424M 91 3.5 60 60.0
S 424V 1 03 9.3 57 35.4 115 10.5 ..
S 4260 105 24.3 65 10.0 31 8
S 426l 91 35.3 111
193 20.4 4
192 5.9 64 23.1 2
loe 5.5
H 429A 44 81.7 61 11.4 141 1.9 2 H 429F 70 11.1 77 16.5 288 12.8 4
B3 12.2 173 3.2
H 429M 103 0.7
7.1 2E 430A 100 8.3 179 6.6 204
E 4300 96 8.2 44 25.5 190 4.6 4
8.1 2E 430F 111 13.0 218 19.4 203
E 430G 97 7.8 1 31 10.8
E 430H 91
7.7
192 8.0 227
e 4301 87 19.3 308 6.6 297 17.2 6 E 4301lt; 66 9.5 1 31 12.6 203 16.0 4
E 430l 98 33.3 242
263 10.6 6
e 430M 102 16.1 195 8.7 22:1 4.6 6 E ..aQN 82 24.6 171 13.0 162 2.2
2 E 430P 103 13.1 86 16.7 254 23.5 8
8.3 320 12.8
E 4300
6.6 227 7.9 8
E 430R
E 430S 88 30.1 1 83 3.4 221 18.5 2 E 430T B2 22. 9 137 23.7 249 8.2 6
E
430V
35.6
281 7.0 276 17.5 6
E
430W 78 8.3 11 95.0 171 5.4 2
E
430Y n 44.5 1 26 12.5 231 na 2
A
431 H 81 44.0 151 11.5 236 na 2
A 431 K 98 26.6 176 113 2
13.8 21 0 8.0 2
A 431 P 62 12.0 29 L 432A 58 23. 1 38 15.6 175 13.3 2
L 4325 58
70 3.6 1 24 0.2 2
N 434F na na 1008 1.4 na na 4 105 17.9 358 20.2 26 128.9 4
N 434G N 434H 90 1 2.9 855 20.4 57 9.1 6
N 4341 81 9.3 6
725.4 73
N 434W 108 6.6 1335 1 8.8 1 38 1.7 2
N
434Y 106
1815 38.8 291 15.5
..
V 4361 119 18.0 194 24.2 3S 8.7 2 Y 436L 112 27.2 172 8.1 90 1 6.3 4 48 20.3 · 2
Y 436T 90 35.0 115 7.2
a 438G 93
98 14.4 68 26.2 2
Q 438K 99 31 .7 169 12.3 116 43.0 2 a 438L 94 32.5 200 14.7 190 5.5 4
o 4381 96 37.4 126 9.5 56 26.8 2
Q 43BW 93 32.5 164 8.2 126 1.7 2 53 40.3 2
K 439E 103 28.9 94 9.0
99 0.9 77 17.8 2K 439H 91 74 0.9 64 26.5 2
K 4390
S 440A 79 42.3 82 2.0 85 22.5 2
S 440D 82 18.4 12
98 9.4
S
4.0 73 2.8 87 35.3 2
S 440F 111 16.1 87 8.2 73 18.5
83 8.5
S 440G 106 1.9 1 01 8.1
2.1 96 18.3
S 440H 108 2.1 110
S 4401 121
98 6.2 86 2.6 2
S 440K 116 16.7 132 7.8
71
S 440L
1 12
126 2.2 n 4.5 4
S 440M 84 51.0 80 8.2 81 20.6 2 S 440N 78 34.3 82 25.4 108 15.8 2
S 4400
73
81
1 32 16.6 2
S 440R 91 11.3 88 16.2 85 29.8 2 S 440T 89 2.1 71 39.0 115 17.4 2
S 440V
11 .3 98 18.7 110 16.4 2
S 440W 114 17.6 85 13.8 132 14.8 2 S 440V 109 6.8 100 14.2 224 14.1 16 S 4421lt; 80 51.9 138 4.5 100 11.1 2
Na = no disponible o no realizado
Por ejemplo, L235A indica una Fc en el que la leucina presente en el aminoácido de Fc número 235 (según la numeración de EU) se ha sustituido por un residuo de alanina sometido a prueba en este caso: la región Fc es una Fc de IgG1 , el anticuerpo es un anticuerpo anti-CD20.
Tabla 10 Variantes de combinación -ADCC
Variante ADCC promedio como % de n= %dewt CD
Tipo natural 100 2.42 2
247A.3390 71.50 2 2
8. 4
187.21 2 2
126.46
247F.339H 101 .54
2
11 4.24 4.91
126.94
120.92 2
2
74.75 2. 247T 339H
247V.339H
-
96.95
2
11 6.53 5.52 2 247H.3391 108.27 2.97 2 2471.3391 -4.07 2 2 247T 339. 9,51 2
247Y.3391
2
13.51
247F 339K 105.85 10.1 1 2 97.S9 2
97.41 2
247T.339K 2
247Y.339K 2 332E 2
247A.339N
2
8.95 2
119.62 2
247Y 339N 2
332E 2
69,94 8.45 2
247F.3390 2.35 2
2
2
247L 3390 4.58 2
119.70 2
2.24 2
68.57 8.33 2
1 1 .85 2 2 247f.339R 16.31 2
12.03 2 247T 339R 12.17 2
247Y 339R 98,58 13.09 2 247L.339T 148.48
wt = tipO natural % de CV=
n = número de muestras medidas y calculado su promedio
Tabla 11 Variantes de combinación con potenciación de ADCC
Variante de Fc ADCC CESO (ng/ml)
Tipo natural
6.8
247L
2.2
330K
3. 1
332E
3.8
247L, 330K
2474 332E
0.73
2471-, 3391'
2.0
330Kt 332E
330K. 339T 2.0 332E. 339T 1.0
332E, 339T 0.75
247L 330K. 332E 0.25
330K, 332E. 339T 0.25
5
2471., 330K, 332E, 339T 0.25 * Las actividades de ADCC se calcularon a partir de curvas de titulación Tabla 12 Variantes de combinación
Mutación Tipo natural 247H3390
ADCC 100 118 % de CV 8.5 FcRn6.0 100 NIO % de CV NID CDC 100 NIO % de CV NID n= 4

247l332E3761 137 8.1 74 8.0 76 4.3 4 247T339N 114 4.8 NID NIO NJD NID 4 251F332E 147 12.4 72 2.2 196 2.6 6
247L251 F330R332E 184 13.3
50 5.9 43
2471.251 F3761 77 29.7 61 8.7 12quot; 11.3 2 247L332E 168 7.3 78 4.9 65 6.2 6
251F332E3761 136 15.9 68 5.0 160 10.9 4
251F3761 114 8.1 66 2.9 102
256P31 11 107 0.2 268 1.2 357 10.0
256P314Y332E440Y 146 3.1 86 19.5 190
256P314Y440Y 112 22.6 79 3.0 228 2 4256P332E 174 16.3 121 8.2 189
256P332E440Y 184 25.4 117 6.5 230 10.0
256P43OQ 109
2.6 150 3.3
256P434H 106 1.2 342 2.9
256P440Y 169 19.7 122 0.7 247 26.6 2
257131 1r 52
409 3.9
81 2
25713111434H 48 12.2 553 4.9 75 8.8 6 25714300 26 8.1 304 0.6 55 12.9 4
2571434H 67 472 6.3 61 14.0 2
2680332E 137 12.4 92 13.7 128 4.1 4
268E332E 178 B8 2.0 160
..
272R279l 56 0.2 156 1.2 72 2
279A288N 107
NIO NID NIO NID 4
N/O NID NID NID NID
279A288N311T318V 110 9.0
279A28BN31 8N 110
..
NID
NID NID 4
279A288N31 8T 116 5.1 NIO NID NID NID 4 279A288N318V 118 8.8 NID NID NID NID 4 279A311T31 BT 110 7.9 NID NID NID NID 4
288N311T318T 115
NIO NID NID NIO 4
311T318T 107 5.3 NID NID NID NID 4 31 4Y332E440Y 156 5.4 82 0.9 155 0.0 2 31 4Y440Y 1 25 12.7 78 8.5 108 2.6 2
88 8.3 43330K332O 179 2.9 2
0.0 42 1 .033OK332E 202 5.6 2
330A332D 152 6.3 88 6.3 44 1 .5 2
33QA332E 161 94 2.1 44.0
332E3761 132 8.6 102 7.6 5.2
332E376V 139 1.9 132 261 8.6
332E440Y 203 13.0 94 5.7 159 5.9 4
343A345 O 121 16.0 1.6 291 3.3 2
376V43OQ 92 1.5 212 4.2 256 12.2 .. 376V430R 84 2.7 188 9.1 191 1.0 2
376V434H 97 3.3
3.3 95
Tabla 13 Variantes de combinación
Mutación
FcRn6.0 % de CV n=
Tipo natural
100
2580272R 382.8 8.2 2 258D283R 41 1.1 3.7 2 25BD286F 445.0 1 .7 2 258D307E -237.1 4.8 :2 258031 11 522.0 7.0 2 258D376V 415.1 4.3 2 272R283R 439.3 21 .7 2 212A288F 338.4 8.8 2 272R31 1t 39&.1 14.4 2 272R376V 368.7 8.1 2 279D307E 522.4 8.8 2
400.2 8.1 2 283R31 11 531 .3 6.1 2 283A376V 474.8 1.1 2 286F307E 431 .2 3.8 2 286F31 11 412.3 0.0 2 286F376V 348.9 1.5 2 307E376V 480.1 4.3 2 311 1376V 413.5 38.1 2
2 -Caracterización de la actividad de CDC de variantes
Este ejemplo describe cómo se determina la actividad de CDC de diversas regio
5 nes Fc variantes. Este ensayo se lleva a cabo usando complemento humano (Quidel Corp., n.o de cat. Al 13) con células 15 Ramos (n.o de RA 1) (n.o de registro de ATCC CRL1596). Se cultivan células Ramos en medios RPMI1640 de Gibco que contienen FBS al 10% a 37°C y CO2 al 5%. El día antes del ensayo, se siembran las células
10 a 1 x 106 células en un matraz T175. Al día siguiente, se resuspenden las células hasta 3,57 x 105 células/mi en RPM 11640 sin rojo de fenal que contiene FBS al 1 %. Se distribuyen 70 f.ll de células por pocillo en una placa de fondo plano Costar 3917. Para la curva de titulación, se prepara IgG con una región Fc variante en una dilución en serie de 3 veces en medios RPM11640. Para el ensayo de explo
15 ración de biblioteca de un único punto, se normaliza variante de IgG expresada de manera transitoria en sobrenadante de cultivo a 1 f.lg/ml en medios de simulación. Se añaden treinta microlitros de IgG variante (es decir, concentración final de 200 ng/ml) y 50 f.ll de complemento humano (Quidel Corp., n.o de cat. de A113) diluido
1:5 en RPMI 1640 + FBS a1 1% a la célula diana y se mezcla bien mediante pipe20 tea suave. Se incuban las placas a 37°C en presencia de CO2 al 5% durante 1,5 horas. Tras la adición de 15 J..ll/pocillo de Alamar Blue (Serotec, n.o de cat. BUF012B) continúa la incubación durante la noche. Después se mide la señal de fluorescencia mediante un lector de multidetector EnVision 2100 de PerkinElmer con excitación a 560 nm y emisión a 590 nm.
ii. Análisis de datos
Todos los ensayos de un único punto se realizan por duplicado. Cada placa de ensayo contiene controles para lisis de células diana espontáneas mediante complemento humano en ausencia de IgG y lisis máxima de células diana en presencia de Triton X-100 al 1 %. Se incluyen tres controles de tipo natural en cada placa de ensayo y se calcula el promedio de la señal de ensayo de CDC. Se resta el valor de fondo, obtenido a partir de control de lisis espontánea, de cada muestra. Se convierten los datos de señales de fluorescencia a porcentaje de lisis específica basándose en controles de lisis espontánea y máxima. Se calcula el porcentaje de lisis específica a partir de la siguiente ecuación: porcentaje de lisis específica
=
(señal de fluorescencia experimental -señal espontánea)/(señal de lisis máxima señal espontánea) X 100. Entonces se calcula el porcentaje de actividad de variante de Fc con respecto al promedio de tres controles de tipo natural. Se calcula el promedio de las actividades en porcentaje con respecto a tipo natural para placas de ensayo por duplicado y se calcula la desviación estándar entre placas de ensayo individuales.
3 -Caracterización de la unión a FcRn Este ejemplo describe ensayos para determinar la unión de receptor neo natal de Fc (FcRn) a IgG con una región Fc variante. Se recubre una placa de ELlSA de 96 pocillos con fondo en U (Costar) con 50 J..ll/pocillo de Neutravidin 2 J..lg/ml (Pierce Biotechnology, n.o de cat. 3 1000) en tampón carbonato 50 mM (pH 9,3) a 4°C durante la noche. Se retira la NeutraAvidin no unida y se lava la placa tres veces con PBST (PBS que contiene Tween 20 al 0,1%). Se aplican cincuenta microlitros de FcRn soluble marcado con biotina a
2,5 J..lg/ml en PBS por pocillo y se incuban a temperatura ambiente durante 1 h.
Después se añaden 75 ¡..tI de tampón de bloqueo de caseína (Pierce Biotechnology, n.o de cat. 37528) a la placa durante 1 hora. Entonces se lava la placa de ELISA con PBST y se incuba con 50 ¡..tI/pocillo de IgG variante. Para la curva de titulación, se prepara IgG que va a someterse a prueba mediante una dilución en serie de 3 veces en tampón de unión a FcRn (NaP04 100 mM, Tween-20 al 0,05%, opcionalmente a pH diferentes (desde 6,0 hasta 7,4)). Para la selección de un único punto, se normaliza IgG variante expresada de manera transitoria en sobrenadante de cultivo hasta una concentración final de 50 ng/ml y se ajusta el pH con tampón de unión a FcRn a 6,0. En las siguientes etapas, se usa tampón de unión a FcRn a pH correspondiente para lavar la placa y diluir los reactivos. Se lleva a cabo la reacción de unión a temperatura ambiente durante 1 h. Tras tres lavados, se detecta la IgG unida mediante conjugado (Fab'h de cabra anti-Fab humanoHRP durante 1 h. Se desarrolla actividad HRP en sustrato de HRP de Pierce (Turbo TMB-ELlSA, n.o de cat. 34022) durante 5-30 minutos. Se detiene la reacción mediante adición de 50 ¡..tI de H2S04 2 M Y se lee la absorbancia a 450 nm con un lector de microplacas VMAX (Molecular Devices).
EJEMPLO 4 -de seres humanos con variante de Fc 1332E anti-CD20 Estudios in vitro y modelos de tumor murinos (Clynes RA, et al. Nat Med. 6:443 (2000)) proporcionan evidencias de que la ADCC desempeña un papel en los efectos antitumorales de anticuerpos anti-CD20, tales como RITUXAN. Puede tratarse a pacientes humanos con anticuerpos de variante de Fc 1332E anti-CD20 o RITUXAN, de una manera similar a la dada a conocer en Cartron et al., Blood
99:754 (2002). Por ejemplo, pacientes que presentan enfermedad en estadio 11 a IV según la clasificación de Ann-Arbor, que tienen al menos un sitio de enfermedad medible, y baja carga tumoral según los criterios de GELF, pueden tratarse con un total de cuatro dosis de aproximadamente 375 mg/m2 de una variante de Fc anti-CD20 o con RITUXAN administrados mediante infusión intravenosa (días 1, 8, 15 Y 22). El criterio de valoración de la eficacia principal es la tasa de respuesta objetiva, es decir, la proporción de pacientes que alcanzan o bien remisión completa (RC), o bien RC no confirmada (RCnc) o bien respuesta parcial (RP) según criterios recientemente propuestos por un comité de expertos internacional. La respuesta clínica puede evaluarse en el mes dos (M2). También puede evaluarse a los pacientes para determinar la progresión a 1 año (M12). Pueden compararse las tasas de respuesta objetiva a M2 y M 12 para pacientes tratados con RITUXAN o variante de Fc anti-CD20 de tal manera que puedan cuantificarse las actividades ADCC mejoradas proporcionadas por una variante de Fc. Puede repetirse el mismo ejemplo con otras variantes anti-CD20 (véanse, por ejemplo, las tablas 1-10 en el presente documento). Adicionalmente, la potencia potenciada de las variantes puede permitir diferentes vías de administración, inyecciones menos frecuentes y/o administración de dosis
menores.
Lista de secuencias
lt;1 10gt; Applied Molecular Evolution (AME)
lt;120gt; Regiones Fc variantes
lt;130gt; x16877
lt;140gt; Documento US 60/643.718
lt;141gt;
lt;150gt; Documento US 60/638.442
lt;151gt;
lt;150gt; Documento US 60/609.101
lt;151gt; 09-1 0-2004
lt;1 50gt; Documento US 60/604.339
lt;151gt;
lt;150gt; Documento US 60/602.953
lt;151gt;
lt;1 50gt; Documento US 60/598.855
lt;151gt;
lt;160gt; 36
lt;170gt; Patentln versión 3.3
lt;210gt; 1
lt;211gt; 218
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 1
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser val phe Leu Phe pro Pro 1 5 10 15
Lys Pro Lys ASp Thr Leu Met Ile ser Arg Thr pro Glu val Thr cys 20 25 30
val val val ASp val ser His Glu ASp Pro Glu val Lys phe Asn Trp 35 40 45
Tyr val ASp Gly val Glu val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 50 55 60
Gl u Gl n Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg val val Ser val Leu Th r val Leu 65 70 75 80
His Gln ASP Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys val Ser Asn 85 90
Lys Ala Leu Pro Ala pro Ile Glu Lys Thr Ile ser Lys Ala Lys Gly 100 105 110
Met Thr Lys Asn Gln val Ser Leu Thr cys Leu val Lys Gly Phe ryr 130 135 140
pro Ser ASp Ile Ala val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 145 150 155 160
Asn Tyr Lys Thr Thr pro Pro val Leu ASP Ser ASp Gly Ser phe Phe 165 170 175
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr val ASP
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 180
val phe Ser cys Ser val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 195 200 205
Gl n Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gl y Lys 210 215
5 lt;210gt; 2
lt;211gt; 217
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 2
pro Al a pro Pro val Al a Gl y Pro ser val phe Leu phe pro pro Lys 1 5 10 15
Pro Lys ASp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu val Thr cys val 20 25 30
val val ASp val ser H;S Glu ASP Pro Glu val Gln Phe Asn Trp Tyr 35 40 45
val
ASp Gly val Glu val H;S Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
Gln phe Asn ser Thr phe Arg val val ser val Leu Thr val val H;S 65 70 75 80
Gl n Asp Trp Leu Asn Gl y Lys Gl u Tyr Lys Cys Lys val ser Asn Lys85 90 95
Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln 100 105 110
Glu Glu Met 115 120
pro Arg Glu Pro Gln val Tyr Thr Leu Pro Pro ser
Th r
Asn Gln val ser Leu Thr cys Leu val Lys Gly phe Tyr Pro 135 140
ser ASp Ile Ala val Glu Trp Glu ser Asn
Gln pro Glu Asn Asn 145 150
Tyr Lys Thr Thr pro Pro Met Leu ASp ser ASp Gly Ser phe Phe Leu 165 170 175
Tyr ser Lys Leu Thr val ASp Lys ser Arg Trp Gln Gln
Asn val O 5
Phe Ser
Ser val Met His Glu Ala Leu H;S Asn H;S Tyr Thr Gln 200 205
Lys Ser Leu ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215
lt;210gt; 3
lt;211gt; 218
5 lt;212gt; PRT
lt;213gt; Homo sapiens
lt;400gt; 3
pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly pro Ser val phe Leu phe Pro Pro 1 5 10 15
Lys Pro Lys ASp Thr Leu Met Ile ser Arg Thr pro Glu val Thr Cys20 25 30
val val val ASp val Ser His Glu ASP Pro Glu val Gln phe Lys Trp 35 40 45
TYr val ASP Gly val Glu val His Asn Ala Lys Thr Lys pro Arg Glu 50
55 60
Glu Gln phe Asn ser Thr Phe Arg val val Ser val Leu Thr val Leu
65 70 75 80
His Gln ASP Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys cys Lys val ser Asn
85 90 95 LYS Ala Leu pro Ala pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly 100 105 110 Gln pro Arg Glu pro Gln val Tyr Thr Leu pro pro ser Arg Glu Glu 115 120 125 Met Thr Lys Asn Gln val Ser Leu Thr cys Leu val Lys Gly phe Tyr 130 135 140
pro ser ASP Ile Ala val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln pro Glu Asn 145 150 155 160 Asn Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu ASP Ser ASP Gly ser Phe Phe
165 170 175 Leu TYr Ser
Leu Thr val ASP Lys ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 185 190
Ile phe Ser Cys Ser val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg phe Thr 195 200 205
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215
lt;210gt; 4
lt;211gt; 218 5 lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 4
Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser val Phe Leu Phe Pro Pro 1 5 10 15
Lys pro Lys ASP Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu val Thr cys20 25 30
val val val ASp val Ser Gln Glu ASp Pro Glu val Gln Phe Asn Trp 35 40 45
Tyr val ASp Gly val Glu val His Asn Ala Lys Thr Lys pro Arg Glu 50 55 60
Glu Gln phe Asn Ser Thr Tyr Arg val val Ser val Leu Thr val Leu 65 70 75 80
His Gln ASP Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys val Ser Asn 85 90 95
Lys Gly Leu pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 100 105 110
Met Thr Lys Asn Gln val Ser Leu Thr Cys Leu val Lys Gly Phe Tyr 130 135 140
pro Ser ASp Ile Ala val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln pro Glu Asn 145 150 155 160
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro val Leu ASp ser ASp Gly ser phe Phe 165 170 175
Leu Tyr Ser
Leu Thr val ASp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn 185 190
val Phe Ser Cys ser val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 195 200 205
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 210 215
lt;210gt; 5
lt;211gt; 215
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Mus sp.
lt;400gt; 5
Thr val pro Glu val ser Ser val Phe Ile Phe pro Pro lys Pro lys1 5 10 15
ASp val leu Thr Ile Thr Leu Thr pro Lys val Thr Cys val val val 20 25 30
ASp Ile ser lys ASp ASp Pro Glu val Gln Phe Ser Trp Phe val ASP 35 40 45
ASp val Glu val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe
Asn ser Thr phe Arg ser val ser Glu Leu Pro Ile Met H;s Gln ASp65 70 75 SO
CYS Leu Asn Gl y
Glu Phe lys Cys Arg val Asn Ser Ala Ala Phe 90 95
Pro Ala pro Ile Glu lys Thr Ile Ser lys Thr lys Gl y
Pro lys roo W5
Ala pro Gln val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala lys 115 120 125
Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp ASn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys 145 150 155 160
Asn Thr Gln Pro Ile Met ASp Thr ASp Gly Ser Tyr Phe val
Ser 165 170
lys Leu Asn val Gln Lys Ser ASquot; Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr lS0 lS5 190
Cys ser val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser 195 200 205
Leu Ser His Ser pro Gly 210
lt;210gt; 6
lt;211gt; 218 5 lt;212gt; PRT
lt;213gt; Mus sp.
lt;400gt; 6
Pro Ala pro Asn Leu Leu Gly Gly pro Ser val phe Ile phe pro pro 1 5 10 15
Lys Ile Lys ASp Val Leu Met Ile ser Leu Ser pro Ile val Thr Cys20 25 30
val val Val ASp Val ser Glu ASp ASp Pro ASp val Gln Ile ser Trp35 40 45
phe val
Asn Asn Val Gl u val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg
Glu ASp Tyr Asn ser Thr Leu Arg Val val Ser Ala Leu pro Ile Gln 65 70 75 80
His Gln ASp Trp Met ser Gly Lys Glu phe Lys Cys Lys Val Asn Asn 85 90 95
Lys ASp Leu pro Ala Pro Ile Glu
Thr Ile Ser LYS pro Lys Gly 100
110 Ser val
Ala pro Gln Val Tyr Val Leu pro pro pro Glu Glu Glu 120 125
Met Thr Lys Lys Gl n val Thr Leu Thr Cys Met val Thr ASp phe Met 130 135 140
Pro Glu ASp Ile Tyr val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu 145 150 155 160
Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro val Leu ASp Ser ASp Gly ser Tyr phe 165 170 175
Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Gl u
Lys Asn Trp val Gl u Arg Asn 180
ser Tyr ser Cys Ser val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr 195 200 205
Thr Lys ser Phe ser Arg Thr pro Gly Lys 210 215
lt;210gt; 7
lt;21 1gt; 218 5 lt;212gt; PRT
lt;213gt; Mus sp.
lt;400gt; 7
Pro Ala Pro Asquot; Leu Glu Gly Gly Pro ser val phe Ile Phe Pro Pro 1 5 10 15
Asn Ile Lys ASp val Leu Met Ile Ser Leu Thr pro Lys val Thr cys20 25 30
val val val ASp val Ser Gl u ASp ASP pro ASp val Gln Ile Ser Trp 35 40 45
Phe val Asn Asn val Glu val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg50 SS 60
Glu ASp Tyr Asn Ser Thr Ile Arg val val Ser His Leu pro Ile Gln 65 70 75 80
His Gln ASp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys cys Lys val Asn Asn 85 90 95
Lys ASP Leu pro Ser pro Ile Gl u
Thr Ile ser Lys Pro Lys Gly 100
110 Leu val
Ala Pro Gln val Tyr Thr Leu pro pro Pro Ala Glu Gl n 120 125
Leu Ser Arg Lys ASP val Ser Leu Thr Cys Leu val val Gly Phe Asn 130 135 140
pro Gly ASp Ile Ser val Glu Trp Thr Ser ASquot; Gly His Thr Glu Glu 145 150 155 160
Asn Tyr Lys Asp Thr Ala Pro val Leu ASp Ser ASp Gl y ser Tyr phe165 170 175
Ile Tyr Ser Lys Leu Asn Met Lys Thr Ser Lys Trp Glu Lys Thr ASp180 185 190
Ser phe ser Cys Asn val Arg His Glu Gly Leu Lys Asn Tyr Tyr Leu 195 200 205
Lys Lls Thr Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys 2 O 215
lt;210gt; 8
lt;211gt; 218 5 lt;212gt; PRT
lt;213gt; Mus sp.
lt;400gt; 8
pro Pro Gly Asn tle Leu Gly Gly pro Ser val phe Ile phe pro pro 1 5 10 15
Lys pro Lys ASp Ala Leu Met tle Ser Leu Thr pro Lys val Thr eys20 25 30
val val val ASp val Ser Glu ASP ASp pro ASp val His val Ser Trp 35 40 45
Phe val ASP Asn Lys Glu val His Thr Ala Trp Thr Gln pro Arg Glu 50 55 60
Ala Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg val val ser Ala Leu Pro Ile Gln 65 70 75 80
H;S Gln ASp Trp Met Arg Gly Lys Glu Phe Lys cys Lys val Asn Asn 85 90 95
Lys Ala Leu Pro Ala pro Ile Glu
Thr tle Ser Lys pro Lys Gly 100
Arg Ala Gln Thr Pro Gln val Tyr Thr Ile pro pro pro Arg Glu Gln 115 120 125
Met Ser Lys Lys Lys val Ser Leu Thr cys Leu val Th r Asn Phe Phe
130 135 140 Ser Glu Ala Ile Ser val Glu Trp Glu Arg Asn Gly Glu Leu Glu Gln 145 150 155 160
ASp Tyr Lys Asn Thr pro pro Ile Leu ASp Ser ASp Gly Thr
phe165 170
Leu Tyr Ser
Leu Thr val ASP Thr ASp Ser Trp Leu Gln Gly Glu 185 190
tle Phe Thr cys Ser val val His Glu Ala Leu H;S Asn His H;s Thr 195 200 205
Gln Lys Asn Leu Ser Arg Ser pro Gly Lys 210 215
lt;210gt; 9
lt;211gt; 110 5 lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 9
Ala pro Glu Leu Leu Gly Gly pro Ser val phe Leu Phe pro pro Lys 1 5 10 15
pro Lys ASp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr pro Glu Val Thr Cys val 20 25 30
val val ASp val Ser His Glu ASP pro Glu val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45
val ASp Gly val Glu val His Asn Ala Lys Thr Lys pro Arg Glu Glu 50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr
Arg val val ser val Leu Thr val Leu His 65
75 80
Gl n ASP Trp Leu Asn Gl y Lys Gl u Tyr Lys cys Lys val Ser Asn Lys85 90 95
Ala Leu pro Ala pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys100 105 110
lt;210gt; 10
lt;21 1gt; 107
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Homo sapiens
lt;400gt; 10
Gly Gln pro Arg Glu pro Gln val Tyr Thr Leu pro pro Ser Arg Glu 1 5 10 15
Glu Met Thr Lys Asn Gln val Ser Leu Thr cys Leu val Lys Gly phe 20 25 30
Tyr pro Ser ASp Ile Ala val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln pro Glu 35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr pro Pro val Leu ASP Ser ASp Gly ser Phe 50 55 60
phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr val ASp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80
Asn val phe Ser
Ser val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr90 95
Thr Gln Lys Ser Leu ser Leu Ser pro Gly Lys 100 105
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lt;21 1gt; 330 10 lt;21 2gt; PRT
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Ala Ser Thr lys Gly Pro Ser val Phe pro leu Ala pro Ser Ser lys 1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala leu Gly cys leu val
ASP Tyr 20 25
phe pro Glu Pro val Thr val Ser Trp Asn Ser Gly Ala leu Thr Ser 35 40 45
Gly val His Thr phe pro Ala val leu Gln Ser ser Gly leu Tyr Ser 50 55 60
leu Ser Ser val val Thr val Pro Ser Ser ser leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80
Tyr rl e Cys Asn val Asn Hi s lys pro Ser Asn Thr lys val ASp lys 85 90 95
Arg val Glu pro lys Ser Cys ASp lys Thr Hi s Thr Cys pro Pro Cys 100 105 110
Pro Ala pro Glu leu leu Gly Gly Pro Ser val phe leu phe pro Pro
115 120 125 Lys pro Lys ASp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu val Thr cys 130 135 140 val val val ASp val Ser Hi s Gl u ASp pro Gl u val Lys phe Asn Trp
145
150 155 160
Tyr val ASp Gl y val Glu val Hi s Asn Al a Lys Thr Lys pro165 170
Gl u
Gl u Gl n Tyr Asn Ser Th r Tyr Arg val val Ser val Leu Thr val 180 185 190
Leu
Lys Ala Leu pro Ala pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220
Gln pro Arg Glu Pro Gln val Tyr Thr Leu pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln val ser Leu Thr cys Leu val Lys Gly phe Tyr 245 250 255
pro ser ASp Ile Ala val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln pro Glu Asn 260 265 270
ser Phe Phe .
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro val Leu ASP ser ASp
275 280
Leu
Ser Lys Leu Thr val ASp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 295 300
Val phe Ser Cys Ser val Met His Glu Ala Leu H;s Asn His Tyr Thr 305 310 315 320
Gl n Lys ser Leu ser Leu Ser pro Gl y Lys 325 330
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Al a Ser Thr Lys Gly Pro Ser val phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu val Lys ASp Tyr 20 25 30
phe Pro Glu Pro val Thr val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45
Gly val H;S Thr phe Pro Ala val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60
Leu Ser ser val val Thr val Pro Ser ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80
Tyr Ile cys Asn val Asn H; S Lys Pro Ser Asn Thr Lys val ASp Lys 85 90 95
Lys val Glu Pro Lys Ser Cys ASp Lys Thr Hi s Thr cys Pro pro Cys100 105 110
pro Ala pro Glu Leu Leu Gly
pro Ser val Phe Leu phe pro Pro 115
125 Lys Pro Lys ASp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr pro Glu val Thr Cys130 135 140
val val val ASp val Ser H;S Glu ASp Pro Glu val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr val ASp Gly val Glu val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
Gl u 165 170
Glu Gln Tyr Asn ser Thr Tyr Arg val val Ser val Leu Thr val Leu 180 185 190
H;S Gln ASp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys val Ser Asn 195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220
Gln pro Arg Glu pro Gln val Tyr Thr Leu pro Pro ser Arg ASp Glu
225 230 235 240
Leu val LYS Gly phe Tyr 245
Leu Thr Lys Asn Gln val Ser Leu Thr 255
pro Ser Asp 1le Ala val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln pro Glu Asn 260 265 270
Ser Phe Phe 275 280
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro val Leu ASp ser ASp
Leu Tyr ser Lys Leu Thr Val ASp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Asn val 290 295 300
phe Ser cys Ser val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 305 310 315 320
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gl y Lys 325
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Ala Thr Ser Ala Leu Al a Ser Gly Ile Pro ASP Arg phe Ser Gly Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Thr ASp phe Thr Leu Thr Ile ser Arg Leu Glu pro Glu 65 70 75 80
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Phe
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Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Arg Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
Asn Met His Trp val Arg Gln Met pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Ala Ile Tyr pro Leu Thr Gly ASp Thr Ser
Asn Gl n Lys Ser 50 55
Lys Leu Gln val Thr Ile Ser Ala ASp Lys Ser Ile ser Thr Ala Tyr65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser ASp Thr Ala Met Tyr
Cys85 90
Ala Arg Ser Thr Tyr val Gly Gly Asp Trp Gln phe ASp val Trp100 105 110
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lt;220gt;
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Gln Ile val Leu Ser Gln Ser pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Lys val Thr Met Thr cys Arg Ala Ser ser Ser val Ser Tyr Ile 20 25 30
His Trp phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser pro Lys pro Trp Ile Tyr35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly val Pro val Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Ser Leu Thr Ile Ser Arg val Glu Ala Glu 65
75 80
ASp Ala Ala Thr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn pro Pro Thr 90 95
10 Phe
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lt;211gt; 111
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Gln val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu val Lys Ala Gly Ala 1 5 10 15
Ser val Lys Met ser Cys Lys Ala ser Gly Tyr Thr phe Thr ser Tyr20 25 30
Asn Met His Trp val Lys ln Thr pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45
Gly Ala Ile Tyr pro Gly Asn Gly ASp Thr ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60
Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala ASp Lys Ser ser Ser Thr Ala Tyr70 75 80 Met Gl n Leu Ser Ser Leu Thr ser Gl u ASp ser Al a val Tyr cys85 90
Ala Arg ser Thr Tyr Tyr Gly Gly
Trp Tyr Phe Asn val Trp 5 100
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Arg Ala Ser Ser ser val Pro Tyr Ile His
1 5 W
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Ala Thr ser Ala Leu Ala Ser 1 5
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Leu
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Ser Thr ryr val Gly Gly Asp Trp Gln Phe ASp val
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1 5
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Gl y Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met Hi s 1 5 10
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5
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Al a 1
Il e Tyr Pro Gl y Asn Gly ASp Thr 5 ser 10 Tyr Asn Gl n lys Phe lys 15
Gl y
lt;21 0gt; 28
10
lt;21 1gt; 12
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lt;220gt;
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15
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ser1
Thr Tyr Tyr Gl y Gl y ASP Trp Tyr phe Asn val 5 10
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20
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Ser Gly Thr 115 120
Ala Ser val val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys130 135 140
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Asn
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Glu val Gln Leu val Gln Ser Gly Ala Glu val Lys Lys pro Gly Glu 1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile ser cys Lys Gly Ser Gly Arg Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
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Gly Ala Ile Tyr pro Leu Thr Gly ASp Thr ser
Asn Gl n Lys ser 50 55
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Ala Leu Gly cys Leu val Lys ASp Tyr Phe pro Glu Pro val Thr val 145 150 155 160
val Leu Gln Ser ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser val val Thr val UO a5 o
pro ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn val Asn His 195 200 205
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ASp Lys Thr Hi s Thr
Pro pro cys pro Ala pro Glu Leu Leu Gly 225
235 240
Il e Lys Asp Thr Leu Met 245
Gl y Pro Ser val Phe leu Phe Pro Pro 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu val Thr Cys val val val ASp val Ser His 260 265 270
Glu Asp Pro Glu val Lys Phe Asn Trp Tyr Val ASp Gly val Glu val 275 280 285
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val val Ser val leu Thr val leu His Gln ASp Trp leu Asn 310 315 lys Glu Tyr lys lys val ser Asn Ala leu Pro Ala Pro Ile
Glu lys Thr Ile Ser lys Gln lys Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 350
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ASp lys Ser
His Glu Ala leu H;s Asn His Tyr Thr Gln lys Ser leu Ser leu Ser 435 440 445
Pro Gly lys 450
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lt;211gt; 1356
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tccaaacaga aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggac 1080 gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1140 atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260 tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320 acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaatga 1356
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Gly pro Ser 115 120
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Ser Trp Asn ser
Ala Leu Thr ser Gly val His Thr phe Pro Ala 170 175
val Leu Gln ser Ser Gly Leu Tyr ser Leu Ser ser val val Thr val 180 135 190
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val Glu val 275 280
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Gl u
Lys Th r Il e Ser 340 Lys ASp Lys Gl y Gln Pro Arg Glu 345 Pro Gl n val 350
Tyr
Thr Leu 355 Pro Pro ser Arg ASp Gl u 360 Leu Thr Lys Asn Gl n 365 val Ser
Leu Thr 370
Cys Leu val Lys Phe Tyr Pro Ser ASp 380 Il e Ala Val Gl u
Gl u
Ser Asn Gly Gl n Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Th r Thr 390 395 pro Pro 400
val
Leu ASp Ser ASp Gl y Ser 405 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys410 Leu Th r val 415
ASp Lys
Ser Trp Gl n Gl n Gl y Asn val Phe Ser Cys 425 ser val 430 Met
Hi s Glu Al a 435
Leu His ASquot; His Tyr440 Thr Gl n Lys Ser Leu Ser 44 5 Leu Ser
pro
Lys
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ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gagatcgact 300 tacgtgggcg gtgactggca gttcgatgtc tggggcaagg ggaccacggt caccgtctcc 360 tcagcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420 gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480 tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaggttgag 660 cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720 ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa atcaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780 cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900 aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960 aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1020 tccaaagaca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggac 1080 gagctgacca agaaccaggt cagcctgac tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1140 atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260 tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320 acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaatga 1356
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Glu val Gln leu val Gln Ser Gly Ala Glu val lys lys Pro Gly Glu 1 S 10 lS
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Arg Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
Asn Met Hi s Trp val Arg Gl n Met pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Al a Ile Tyr Pro leu Thr Gly ASP Thr ser Tyr Asn Gln lys Ser 50 55 60
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Leu Gl n Trp ser ser Leu Lys Al a ser ASp Thr Al a Met Tyr
cys85 90
Ala Arg ser Thr Tyr val Gly Gly ASp Trp Gln Phe ASp val Trp Gly 100 105 110
Lys Gly Thr Thr val Thr val ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro ser 115 120 125
val phe Pro Leu Ala pro Ser Ser Lys ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu val Lys Asp Tyr phe pro Glu Pro val Thr val 145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr ser Gly val His Thr phe Pro Ala 165 170 175
val Leu Gl n ser Ser Gl y Leu Tyr Ser Leu Ser ser val val Thr val 180 185 190
Pro Ser Ser ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile cys Asn val Asn His 195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys val ASp Lys Lys val Gl u pro Lys ser cys210 215 220
ASp Lys Thr His Thr cys Pro Pro cys Pro Ala pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240
Gly Pro ser val Phe Leu phe Pro pro LYS Pro Lys ASp Thr Leu Met 245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu val Thr Cys val val val ASp val Ser His 260 265 270
Glu ASP pro Glu val Lys phe Asn Trp Tyr val ASP Gly val Glu val 275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn ser Thr Tyr 290 295 300
Arg val val Ser val Leu Thr val Leu Hi s Gln ASP Trp Leu Asn 305 310 315
Lys Gl u Tyr Lys Cys Lys val 325
ser Asn Al a Leu pro Al a Pro Ile 335
Gl u Lys Thr
Ile Ser 340 Lys Al a Lys Gl y Gl n Pro Arg Gl u pro Gl n val 345 350
Tyr Thr
Leu 355 pro Pro Ser Arg ASp 360 Gl u Leu Thr Lys Asn 365 Gl n val Ser
Leu Thr Cys Leu val 370
Lys Gl y phe Tyr 375 Pro Ser ASp Ile ASp val 380 Gl u
Trp Gl u 385
ser Asn Gl y Gl n 390 Pro Gl u Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 395 Pro Pro 400
val
Leu ASP ser ASP Gl y Ser phe phe Leu Tyr 405 410 ser Lys Leu Thr val 415
ASp Lys
ser Trp Gln Gl n Gl y Asn val phe Se r cys Ser val 425 430 Met
Hi s Gl u Al a 435
Leu Hi s Asn Hi s Tyr Thr Gl n 440 Lys ser Leu 445 ser Leu ser
5
pro Gl y Lys 450 lt;210gt; 36 lt;21 1gt; 1356 lt;212gt; ADN lt;213gt; Artificial lt;220gt; lt;223gt; Constructo sintético lt;400gt; 36 gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc tcctgtaagg gttctggccg tacatttacc agttacaata tgcactgggt gcgccagatg cccgggaaag gcctggagtg gatgggggct atttatccct tgacgggtga tacttcctac aatcagaagt cgaaactcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcag caccgcctac ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gagatcgact tacgtgggcg gtgactggca gttcgatgtc tggggcaagg ggaccacggt caccgtctcc tcagcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg tcgtggaact caggcgccCt gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 60 120 180 240 300 360 420 480 540
tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaggttgag 660 cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720 ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780 cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900 aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960 aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1020 tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggac 1080 gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1140 atcgacgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260 tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320 acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaatga 1356

Claims (11)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Anticuerpo monoclonal que comprende una variante de una región Fc original, en el que la región Fc original es una región Fc de IgG1 humana, en el que la región Fc variante comprende sustituciones 2471/3390 en la región Fc, y presentando el anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc variante ADCC potenciada en comparación con el anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc original.
  2. 2.
    Anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1, siendo el anticuerpo monoclonal un anticuerpo monoclonal quimérico, humanizado o humano.
  3. 3.
    Anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, siendo el anticuerpo monoclonal un anticuerpo de longitud completa o un anticuerpo monoclonal de cadena sencilla.
  4. 4.
    Anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, uniéndose dicho anticuerpo específicamente a un antígeno diana humano seleccionado del grupo que consiste en CD3, CD20, CD25, TNFa, Her2/neu, CD33, CD52, EGFR, EpCAM, MUC1, GD3, CEA, CA125, HLADR, o cualquier precursor
    o fragmento funcional de los mismos.
  5. 5.
    Procedimiento de producción de un anticuerpo monoclonal variante con respuesta de ADCC potenciada en comparación con el anticuerpo monoclonal original de dicho anticuerpo monoclonal variante, que comprende modificar por ingeniería genética la región Fc del anticuerpo monoclonal original para que comprenda sustituciones de aminoácidos 2471/3390, en el que la región Fc del anticuerpo monoclonal original es una región Fc de IgG1 humana.
  6. 6.
    Composición farmacéutica que comprende el anticuerpo monoclonal variante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
  7. 7.
    Anticuerpo monoclonal según las reivindicaciones 1 a 4, para su uso como medicamento.
    zrircmli P iiiiiii
    g ttttEtt
    5 MEM e ggn20
  8. 444.3 JO
    wvee e
    Illt 2quot;
    1 N 11114 W WM M
  9. 0000.10.0
  10. 11. 0.00.00.0.0. W 4:4066.12. c610.
    O a1.1
    f 11Eiffl
    15 MASS
    ,tluttt
    0
    0000000 m ,-. 14o-i mb-io-o m
    1112 §§
    t
    t 6. , 1tt t 4 1 1
    WiWW0.A0..
    N25 P.. WWWWwWw .......
    mwwww04444
    04 6 00.000.0.0. 444044W4
    re
    m
    VI
    csm m
    Gr4nrigli
    M
    ....quot;... m
    HP14
    Minn MIN
    ROR2222R
    ociaclooam
    ........
    gliR22201
    0)011001 U)010)
    /1151111
    2333gt22 3222322 222220
    .56AZ SA
    40 mramw.lramm
    rliblinp*Mr
    11111iii
    FIG. 3
    A. CH2 original ( SEQ ID NO: 9 )
    A PELLGG PS VFLFP P KP KDTLMI SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNANTK P REEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KC KVSNKAL PAP I EKT I SKAK
    B. CH3 original (SEQ ID NO:10)
    GQPREPQVYTLPPSREEMTKNOVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWMIGNVFSCSVMHE,ALHNHYTQKSLSLSPGK
    C. Polipeptido original (alotipo f) (SEQ ID NO:11)
    ASTKG PSVFPLA PS SKSTSGGTAALGCLVKDY FPE PVTVS WNS GALTSGVHTFPAVLQS S GLY S LS SVVTVPS SSLGTQTY I CNVNHKPSNTKVDKRVEPKS CDKTHTCP PC PAPELLGG PSVFLFP PKPKDTLM I SRTPEVTCVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVMNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYYCKVSNKALPAP I EKT I S KAKGQ PREPQVYTLP P SREE MT KNQVSLTCLVKG FY PSD I AVEWE SNGQP ENNY KTTP PVLD SDG S F FLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
    D. Polipeptido original (alotipo a, z) (SEQ ID NO:12)
    AS TKG PSVFPLAPS SKSTSGGTAALGCLVKDYFP E PVTVSWNSGALTSGVHT FPAVLQSS GLYS LS SVVTVP S SSLGTQTY I CNVNH KPSNTKVDKKVEPKS CDKTHTC PPC PA PELLGG PS VFL FPPKPHL TLM I SRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKPNWYVOGVEVHNAKTKPREEQYN S TYRVVSVLTVLH QDWLNGKEY KC KVSNKAL PAP I E KT I S KAKGQ PRE PQVYTLP PSRDE LT KNQVSLTCLVKG FY PSD IAVEWE SNGQ PENNY KTTP PVLDSDGS FFLYSKLTVDKSRW QQNVFSCSVNIHEALHNHYTQKSLSLS PGK
    FIG. 4
    A. (SEQ ID NO: 13)
    EIVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASSSVP YIHWYQQKPG QAPRLLIYAT SALASGIPDR FSGSGSGTDF TLT/SRLEPE DFAVYYCQQW LSNPPTF
    B. (SEC+ ID NO: 14)
    EVQLVQSGAE VKKPGESLKI SCKGSGRTFT SYNMHWVRQM PGKGLEWMGA IYPLTGDTSY NQKSKLQVTI SADKSISTAY LQWSSLKASD TAMYYCARST YVGGDWQFDV W
    C. LCVR de anti-CD20 (II) (SEQ ID NO: 15)
    QIVLSQSPAI LSASPGEKVT MTCRASSSVS YIHWFQQKPG SSPKPWIYAT SNLASGVPVR FSGSGSGTSY SLTISRVEAE DAATYYCQQW TSNPPTF
    D. HCVR de anti-CD20 (II) (SEQ ID NO: 16)
    QVQLOQPGAE LVKAGASVKM SCKASGYTFT SYNMHWVKQT PGRGLEWIGA
    IYPGNGDTSY NQKFKGKATL TADKSSSTAY MQLSSLTSED SAVYYCARST YYGGDWYFNV W
    E.
    Anti CD2 0- ( I )
    LCVR CDR1
    ( SEQ ID NO; 17 ) : RASSSVPYIH
    LCVR CDR2
    ( SEQ ID NO: 1 8 ) : ATSALAS
    LcyR CDR3
    ( SEQ ID NO: 1 9 ) : QQWLSNPPT
    HCVR CDR1 (SEQ ID NO: 20) : GRTFTSYNMH HCVR CDR2 (SEQ ID NO: 21 ) : AIYPLTGDTSYNQKSKL HCVR CDR3 (SEQ ID NO: 22 ) : STYVGGDWQFDV
    Anti-CD20 (II ) LCVR CDR1 (SEQ ID NO: 23 ) : RASSSVSYIH LCVR CDR2 (SEQ ID NO: 24 ) : ATSNLAS LCVR CDR3 (SEQ ID NO: 25 ) : QQWTSNPPT
    HCVR CDR1 (SEQ ID NO: 26 ) : GYTFTSYNMH HCVR CDR2 (SEQ ID NO: 27 ) : AIYPGNGDTSYNQKFKG HCVR CDR3 (SEQ ID NO: 28 ) : STYYGGDWYFNV
    FIG. 5
    A.SEQ ID NO:29: Secuencia de aminoAcidos de la cadena ligera completa de AMC 13s
    E I VLTQS PGTLSLS PGERATLSCRASSSVPY I HWYQQKPGQAPRLL I YATSALASG I PDR
    FSGSGSGTDFTLT I S RLEPED FAVYYCQQWL SNP PTFGQGTKLE I KRTVAAPSVF I FPPS DEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSOESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL SKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
    -
    La region constante est& subrayada
  11. 3.SEQ ID NO:30: Secuencia de Acid° nucleic° de la cadena ligera completa de ANS 133
    GAAATTGTGTTGACG CAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACC CTCTCCTGCAGGG CCAGCTCAAGTGTACCGTACATCCACTGGTACCAGCAGAAACCTGGC CAGGCTCCCAGGCTCCTGATCTATGCCAGA-T-CGGGIPC4GGGTTCTGGCATCCe-AGACAGG TTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAA GATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTGGCTGAGTAACCCACCCACTTTTGGCCAGGGG ACCAAGCTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCT GATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCC AGAGAGGCCAAAGTAC.AGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAG AGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGC CTCAGCAGCACCCTGACGCTG AGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTG
    AGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
    FIG. 6
    A.scm rco NO: 31: Secuencia de aminolcidos de la cadena pesada cempleta de AXE 133 (variants 2471/33912) EVQLVQSGAEVKKPGESIXISCKGSGRTFTSYNNHWVROMPGKGLEWMGAIYPLTGDTSY NQKSKLQVTISADKSISTAYLQNSSLKASEITAMYYCARSTYVGGDWWWWGKGTTVTVS SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVICDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTOTYICNVNHKPSNTINDKWEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG GPSVFLFPPKTICDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVICFNWTVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHOWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKQKGQPRENNYTLPFSRD ELTKNCIVSLTCINKGFYPSDIAVENESNG(RENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR NQQGNVFSCSVMNEALHNHYTOKSIASLSPGK
    -La region constante esta subrayada; Las variantes estan en negrita
    B.SEQ 1D NO: 32: Secuencia de &cid° nucleico de la cadena pesada campleta de AMR 133 (variants 2471/339(2) GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCAGAGGTGAAAAAGCCCGGGGAGTCTCTGAAGATC
    TCCTGTAAGGGTTCTGGCCGTACATTTACCAGTTACAATATGCACTGGGTGCGCCAGATG CCCGGGAAAGGCCTGGAGTGGATGGGGGCTATTTATCCCTTGACGGGTGATACTTCCTAC AATCAGAAGTCGAAACTCCAGGTCACCATCTCAGCCGACAAGTCCATCAGCACCGCCTAC CTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCTCGGACACCGCCATGTATTACTGTGCGAGATCGACT TACGTGGGCGGTGACTGGCAGTTCGATGTCTGGGGCAAGGGGACCACGGTCACCGTCTCC TCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCT GGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGOTG TCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCC TCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGMGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAG ACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTTGAG CCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGG GGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAAATCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACC CCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAAC TGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTAC AACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGC AAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGA.GAAAACCATC TCCAAACAGAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAC GAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGAC ATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCC GTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGG TGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTOCACAACCACTAC
    ACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
    -
    Las variantes estan en negrita y subrayadas
    FIG. 6
    C. EINQ rp NO: 33: Socuencia de .inoaidog de la cadana plead complota de AN 133 (247I/3390)
    EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGRTFTSYNMHWVRQMPGKGLEMMGAIYPLTGDTSY
    NQKSKLQVTISADKSISTAYLQVISSLKASDTAMYYCARSTYVGGDWQFDVWGKGTTVTVS
    SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWI4SGALTSGVHTFPAVLQS
    SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNEKPSNTICVDKKVEPK,SCDKTHTCPPCPAPELLG
    GPSVFLFPPKIKDTLMISRTPEVTCVVVDVSMEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY
    NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKDKGQPREPQVYTLPPSRD
    ELTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
    WOQGNVFSCSVMHEAL}INHYTQlKSLSLSPGK
    _ La region constante estA subrayada; las variantes estan en negrita
    D. 81Q ID NO: 34: Seauencia de Acid° nucleic° de la cadena peaada eempleta de ANC 133 (247I/339D)
    GAGGTGC.AGCTGGTGCAGTCTGGAGCAGAGGTGAAAAAGCCCGGGGAGTCTCTGAAGATC
    TCCTGTAAGGGTTCTGGCCGTACATTTACCAGTTACAATATGCACTGGGTOCGCCAGATG
    CCCGGGAAAGGCCTGGAGTGGATGGGGGCTATTTATCCCTTGACGGGTGATACTTCCTAC
    AATCAGAAGTCGAAACTCCAGGTCACCATCTCAGCCGACAAGTCCATCAGCACCGCCTAC
    CTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCTCGGACACCGCCATGTATTACTGTGCGAGATCGACT
    TACGTGGGCGGTGACTGGCAGTTCGATGTCTGGGGCAAGGGGACCACGGTCACCGTCTCC TCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCT GGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTG TCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCC TCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAG ACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTTGAG CCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGG GGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAAATCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACC CCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAAC TGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTAC AACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACIGGCTGAATGGC AAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATC TCCAAAGACAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAC GAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAOCGAC ATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCC GTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGG TGGC.AGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTAC
    ACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGITTCCOGGTAAATGA
    -
    Las variantes estan en negrita y subrayadas
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