ES2426816T3 - Regiones Fc variantes - Google Patents

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ES2426816T3 ES05773014T ES05773014T ES2426816T3 ES 2426816 T3 ES2426816 T3 ES 2426816T3 ES 05773014 T ES05773014 T ES 05773014T ES 05773014 T ES05773014 T ES 05773014T ES 2426816 T3 ES2426816 T3 ES 2426816T3
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Weidong Jiang
Ying Tang
Jeffry Dean Watkins
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MENTRIK BIOTECH LLC
Applied Molecular Evolution Inc
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Abstract

Anticuerpo anti-CD20 que comprende: (a) una secuencia de aminoacidos de región variable de cadena ligera que consisteen SEQ ID NO: 13; (b) una secuencia de aminoacidos de region variable de cadena pesada que consisteen SEQ ID NO: 14; y (c) una variante de una región Fc original, en el que la región Fc original es unaregión Fc de IgG1 humana y en el que la región Fc variante comprende una sustituciónde aminoacido seleccionada del grupo que consiste en 247I1339Q y247I/339D.

Description

REGIONES Fc VARIANTES de la invención La presente descripción se refiere a polipéptidos que comprenden una región Fc variante, novedosa. Específicamente, una región Fc variante, novedosa de la presente invención comprende al menos una sustitución de aminoácido descrita en el presente documento que confiere una función efectora alterada o semivida sé rica alterada a una inmunoglobulina que comprende la región Fc variante en comparación con la inmunoglobulina original que carece de esa sustitución de aminoácido. Además, la descripción proporciona un método para alterar una función efectora de un anticuerpo monoclonal o extender la semivida sérica de un polipéptido al que se le une operativamente una región Fc variante de la invención. Se dan a conocer usos terapéuticos de polipéptidos, proteínas, particularmente anticuerpos monoclonales, que comprenden una región Fc variante de la invención.
Antecedentes de la invención
Hay al menos diecisiete anticuerpos monoclonales aprobados actualmente en los Estados Unidos para su uso como productos terapéuticos en seres humanos. Adicionalmente, hay varios cientos de anticuerpos monoclonales en ensayos clínicos y miles en pruebas preclínicas para el tratamiento de diversas enfermedades o trastornos incluyendo, por ejemplo, rechazo de trasplantes, cáncer, enfermedades inflamatorias, septicemia, nefritis, enfermedad de Alzheimer, alergias, diabetes, enfermedades autoinmunitarias, artritis, esclerosis múltiple y enfermedades infecciosas. El campo terapéutico de los anticuerpos monoclonales está posicionado para un rápido crecimiento en los próximos años. Tras las vacunas, los anticuerpos (o inmunoglobulinas, "Ig") constituyen el segundo tipo más común de agente biofarmacéutico que está sometiéndose a prueba clínicamente (Stockwin, L.H. et al. Biochemical Society Transactions, 31 :433-436,2003).
La ingeniería genética ha contribuido sustancialmente al crecimiento del campo de anticuerpos monoclonales terapéuticos. La eficacia de un posible anticuerpo monoclonal terapéutico variará a menudo con cambios modestos en la secuencia de proteína del anticuerpo. Un cambio de un único aminoácido en la región variable de un anticuerpo monoclonal tiene el potencial de alterar la afinidad con la que el anticuerpo se une al epítopo antigénico, así como propiedades del anticuerpo tales como la velocidad Kon o la velocidad Koff. Tales cambios de aminoácidos pueden determinar el éxito o el fracaso de un anticuerpo monoclonal como agente terapéutico. De manera similar, cambios modestos en la secuencia de aminoácidos de la región Fc de un anticuerpo monoclonal pueden producir cambios profundos en las propiedades de función efectora del anticuerpo o la semivida de una proteína a la que está unida operativamente la región Fc.
La región Fc de un anticuerpo (es decir, los extremos carboxilo terminales de las cadenas pesadas de un anticuerpo que abarcan los dominios CH2, CH3 y una parte de la región bisagra (véase la figura 1)), tiene una variabilidad limitada y participa en efectuar los papeles fisiológicos desempeñados por el anticuerpo. Las funciones efectoras atribuibles a la región Fc de un anticuerpo varían con la clase y subclase de anticuerpo e incluyen (i) unión del anticuerpo mediante la región Fc a un receptor de Fc específico ("FcR") sobre una célula que desencadena diversas respuestas biológicas incluyendo, por ejemplo, fagocitosis y destrucción de partículas recubiertas con anticuerpos, aclaramiento de complejos inmunitarios, liberación de mediadores inflamatorios, transferencia placentaria del anticuerpo y control de la producción de inmunoglobulinas, (ii) citotoxicidad dependiente del complemento ("CDC") en la que la región Fc se une al componente C1 q del complemento e inicia de ese modo la ruta clásica de activación del complemento que conduce a la lisis de la diana, (iii) citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos ("ADCC") en la que determinadas células del sistema inmunitario humano, por ejemplo fagocitos y células NK, mediante un receptor Fcy, se unen a la región Fc de un anticuerpo mediante receptores de unión a anticuerpos específicos sobre las células inmunitarias y posteriormente señalizan la destrucción de la entidad a la que el anticuerpo esta unido y (iv) unión a mastocitos, basófilos y eosinófilos. La afinidad con la que una región Fc puede unirse a un FcR particular (por ejemplo, FcRn), o el nivel con el que una región Fc puede mediar en la activi
dad de CDC o ADCC son factores importantes para determinar la eficacia y semi
vida de proteínas terapéuticas, particularmente anticuerpos monoclonales.
La modificación particularizada de aminoácidos en la región Fc de IgG humana es
5
un área activa de estudio que produce información sobre la relación estructura
función relevante para el desarrollo de proteínas terapéuticas, particularmente an
ticuerpos monoclonales (véanse, por ejemplo, la patente estadounidense
6. 1 65.745 y la publicación PCT n.o W02004/035752 referentes a la alteración de
la semivida sé rica de un polipéptido operativamente unido a una región Fc y la pa
lO
tente estadounidense 6.737. 056 y la publicación PCT n.o W02004/029207 refe
rentes a la alteración de una función efectora de un anticuerpo monoclonal que
comprende una región Fc modificada).
El desarrollo de proteínas terapéuticas novedosas, particularmente anticuerpos
15
monoclonales, se beneficiaría de la capacidad para diseñar racionalmente una re
gión Fc con modificaciones de aminoácidos particulares que confieren una pro
piedad beneficiosa deseada al anticuerpo de interés. No se esperaría que todos
los anticuerpos monoclonales mejorasen como agente terapéutico debido a la
misma modificación de aminoácido particular en la región Fc. Un anticuerpo mo
20
nocional terapéutico que se une a un antígeno diana puede beneficiarse de un
aumento en una función efectora particular mientras que un anticuerpo monoclo
nal terapéutico diferente que se une a un antígeno diana diferente puede benefi
ciarse de un aumento en una función efectora diferente, o incluso una disminu
ción. Un anticuerpo monoclonal terapéutico puede beneficiarse de la capacidad
25
para unirse a un receptor de Fc particular con mayor afinidad mientras que otro
anticuerpo puede mejorar como agente terapéutico uniéndose a ese receptor de
Fc a una afinidad inferior y por tanto aclarándose del cuerpo a una velocidad más
rápida. Además, una sustitución o modificación de aminoácido en una región Fc
particular y que da como resultado un efecto que beneficiaría a un anticuerpo te
30
rapéutico puede depender de la diana antigénica a la que se une el anticuerpo y/o
la enfermedad o el trastorno que va a mejorarse por el anticuerpo.
Son necesarios métodos y composiciones que alteran funciones efectoras particu
lares asociadas con la región Fc de un anticuerpo para mejorar las propiedades
de anticuerpos terapéuticos existentes así como para generar anticuerpos terapéuticos novedosos con propiedades deseadas. Pueden usarse anticuerpos monocionales con regiones Fc variantes para tratar diversas enfermedades o trastornos incluyendo, por ejemplo, trastornos inflamatorios, cáncer, trastornos autoinmunitarios, trastornos de señalización celular y enfermedades infecciosas. Adicionalmente, métodos y composiciones que alteran la semivida sérica de una proteína terapéutica, o bien aumentando la semivida y de ese modo permitiendo menos dosis o bien disminuyendo la semivida y de ese modo permitiendo un aclaramiento más rápido del cuerpo, beneficiarían la generación de anticuerpos terapéuticos así como otras proteínas terapéuticas.
Lo que se necesita con el fin de mejorar la eficacia de una proteína terapéutica, particularmente un anticuerpo monoclonal, son regiones Fc variantes con propiedades mejoradas.
Sumario de la invención El alcance de la invención está limitado por las reivindicaciones.
La presente descripción proporciona regiones Fc variantes, es decir, regiones Fc que comprenden una sustitución de aminoácido descrita en el presente documento (por ejemplo, véase la tabla 1), que confieren propiedades beneficiosas a los polipéptidos que comprenden dichas regiones Fc variantes.
Las posiciones de Fc de una región Fc original en las que puede hacerse cualquier sustitución de aminoácido para generar una región Fc variante incluyen las posiciones 279, 341, 343 Y 373 de la región Fc; en la que la numeración de los residuos, es decir, su número de posición, en la región Fc es la del índice de EU como en Kabat (véase la figura 2 en el presente documento). La presente descripción proporciona regiones Fc variantes que comprenden una sustitución de aminoácido en la posición 279, 341, 343 ó 373 de una región Fc original, o cualquier combinación de las mismas. La región Fc original puede tener opcionalmente residuos de aminoácido no nativos en posiciones distintas de 279, 34 1, 343 Y
373. Los residuos de aminoácido nativos en estas posiciones para IgG humana son valina (279), glicina (341), prolina (343) y tirosina (373).
En realizaciones preferidas a lo largo de la presente descripción, el residuo de aminoácido que sustituye al presente en la región Fc original es un residuo de aminoácido que se produce de manera natural. A menos que se indique lo contrario, la región Fc original puede ser una región Fc nativa o no nativa, preferiblemente de origen humano o sustancialmente de origen humano. La secuencia de aminoácidos de la región Fc original es preferiblemente la mostrada en SEO ID NO: 1, 2, 3 ó 4. Preferiblemente, la región Fc original tiene un residuo de aminoácido nativo presente en la posición que va a sustituirse para generar una región Fc variante. Además, en todas partes, se entiende que una región Fc variante es una región Fc original modificada para que comprenda al menos una sustitución de aminoácido tal como se describe en el presente documento. Adicionalmente, se entiende que una región Fc original puede ser una Fc de longitud completa o una parte de la misma que comprende el residuo de aminoácido que va a sustituirse para generar la región Fc variante.
La presente descripción proporciona además polipéptidos, preferiblemente anticuerpos monoclonales, que comprenden una región Fc variante (o un fragmento funcional de la misma) que comprende al menos una sustitución de aminoácido en la posición 279, 341, 343 ó 373 en comparación con la región Fc original. La región Fc variante que comprende al menos una sustitución de aminoácido en la posición de Fc 279, 341, 343 ó 373 puede comprender además al menos una sustitución de aminoácido adicional en la región Fc en comparación con el residuo de aminoácido presente en la región Fc nativa del mismo tipo que la región Fc variante.
En una realización, una región Fc variante (es decir, una variante de una región Fc original) comprende al menos 1, 2, 3 o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas de las siguientes: 235G, 235R, 236F, 236R, 236Y, 237K, 237N, 237R, 238E, 238G, 238H, 2381, 238L, 238V, 238W, 238Y, 244L, 245R, 247A, 247D, 247E, 247F, 247M, 247N, 2470, 247R, 2475, 247T, 247W, 247Y, 248F, 248P, 2480, 248W, 249L, 249M, 249N, 249P, 249Y, 251 H, 251 1, 251 W, 254D, 254E, 254F, 254G, 254H, 2541, 254K, 254L, 254M, 254N, 254P, 2540, 254R, 254V, 254W, 254Y, 255K, 255N, 256H, 2561, 256K, 256L, 256V, 256W, 256Y, 257A, 2571, 257M, 257N, 2578, 2580, 2608, 262L, 2648, 265K, 2658, 267H, 2671, 267K, 268K, 269N, 2690, 271T, 272H, 272K, 272L, 272R, 279A, 2790, 279F, 279G, 279H, 2791, 279K, 279L, 279M, 279N, 2790, 279R, 2798, 279T, 279W, 279Y, 280T, 283F, 283G, 283H, 2831, 283K, 283L, 283M, 283P, 283R, 283T, 283W, 283Y, 285N, 286F, 288N, 288P, 292E, 292F, 292G, 2921, 292L, 2938, 293V, 301W, 304E, 307E, 307M, 312P, 315F, 315K, 315L, 315P, 315R, 316F, 316K, 317P, 317T, 318N, 318P, 318T, 332F, 332G, 332L, 332M, 3328, 332V, 332W, 3390, 339E, 339F, 339G, 339H, 3391, 339K, 339L, 339M, 339N, 3390, 339R, 3398, 339W, 339Y, 3410, 341 E, 341 F, 341 H, 3411, 341 K, 341 L, 341M, 341N, 341P, 3410, 341R, 3418, 341T, 341V, 341W, 341Y, 343A, 3430, 343E, 343F, 343G, 343H, 3431, 343K, 343L, 343M, 343N, 3430, 343R, 3438, 343T, 343V, 343W, 343Y, 3730, 373E, 373F, 373G, 373H, 3731, 373K, 373L, 373M, 373N, 3730, 373R, 3738, 373T, 373V, 373W, 375R, 376E, 376F, 376G, 376H, 3761, 376L, 376M, 376N, 376P, 3760, 376R, 3768, 376T, 376V, 376W, 376Y, 377G, 377K, 377P, 378N, 379N, 3790, 3798, 379T, 3800, 380N, 3808, 380T, 3820, 382F, 382H, 3821, 382K, 382L, 382M, 382N, 382P, 3820, 382R, 3828, 382T, 382V, 382W, 382Y, 385E, 385P, 386K, 423N, 424H, 424M, 424V, 4260, 426L, 427N, 429A, 429F, 429M, 430A, 4300, 430F, 430G, 430H, 4301, 430K, 430L, 430M, 430N, 430P, 4300, 430R, 4308, 430T, 430V, 430W, 430Y, 431H, 431K, 431P, 432R, 4328, 438G, 438K, 438L, 438T, 438W, 439E, 439H, 4390, 4400, 440E, 440F, 440G, 440H, 4401, 440K, 440L, 440M, 4400, 440T, 440V o 442K.
En una realización preferida, una región Fc variante comprende al menos 1, 2, 3 o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas de las siguientes: 235G, 236F, 236R, 236Y, 237K, 237N, 237R, 238E, 238G, 238H, 2381, 238L, 238V, 238W, 238Y, 245R, 247A, 2470, 247E, 247F, 247M, 247N, 2470, 247R, 247T, 247W, 247Y, 248F, 248P, 2480, 248W, 249L, 249M, 249N, 249P, 249Y, 251H, 2511, 251 W, 2540, 254E, 254F, 254G, 254H, 2541, 254K, 254L, 254M, 254N, 254P, 2540, 254R, 254V, 254W, 254Y, 255K, 255N, 256H, 2561, 256K, 256L, 256W, 257A, 2571, 257M, 257N, 2578, 2580, 2608, 262L, 2648, 265K, 2658, 267H, 2671, 267K, 268K, 269N, 2690, 271T, 272H, 272K, 272R, 279A, 2790, 279G, 279H, 279N, 2790, 2798, 279T, 279W, 279Y, 280T, 283F, 283H, 283K, 283M, 283R, 283W, 285N, 286F, 288N, 288P, 292E, 292G, 2921, 301 W, 304E, 307E, 307M, 312P, 315F, 315L, 315P, 316F, 317P, 317T, 318N, 318P, 318T, 332L, 332M, 332R, 332S, 332W, 3390, 339F, 3391, 339K, 339M, 339N, 3390, 339R, 339S, 339W, 339Y, 3410, 341E, 341F, 341H, 3411, 341K, 341L, 341M, 341N, 341P, 3410, 341R, 341S, 341T, 341V, 341W, 341Y, 3430, 343E, 343G, 343H, 343K, 343N, 3430, 343R, 343S, 343T, 343W, 343Y, 3730, 373E, 373G, 373H, 3731, 373K, 373L, 373M, 3730, 373R, 373S, 373T, 373W, 375R, 376G, 376N, 376P, 3760, 376R, 376S, 376T, 376V, 376W, 376Y, 377G, 377K, 377P, 3780, 378N, 379N, 3790, 379T, 380N, 380S, 380T, 3820, 382F, 3821, 382K, 382L, 3820, 382R, 382S, 382T, 382V, 382W, 382Y, 385E, 386K, 423N, 424H, 424M, 424V, 4260, 426L, 427N, 429A, 429F, 429M, 430A, 4300, 430F, 430G, 430H, 4301, 430K, 430L, 430M, 430N, 430P, 4300, 430R, 430S, 430T, 430V, 430W, 430Y, 431 H, 431 K, 431 P, 432R, 432S, 438K, 438L, 438T, 438W, 439E, 4400, 44010 440L.
Las regiones Fc variantes se caracterizan preferiblemente usando uno o más de los métodos experimentales descritos en el presente documento. Tales regiones Fc variantes confieren una función efectora alterada o una semivida sérica alterada a un anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc variante o una semivida sérica alterada a un polipéptido al que la región Fc variante está operativamente unida.
Preferiblemente, la región Fc original de una región Fc variante de la invención es una región Fc nativa o codificada por la línea germinal de origen humano seleccionada del grupo que consiste en IgG, IgA, IgE, IgM e IgO o una variante polimórfica de la misma, o un fragmento funcional de la misma. Preferiblemente, la región Fc original es una región Fc de IgG, y más preferiblemente, una región Fc de IgG1 , IgG3 o IgG4. La región Fc original puede comprender opcionalmente una
o más sustituciones de aminoácidos adicionales en comparación con la región Fc nativa, distintas de las ya descritas en el presente documento (es decir, las sustituciones enumeradas en la tabla 1), particularmente una o más sustituciones de aminoácidos conocidas en la técnica o descritas en las patentes estadounidenses
6.165.745 o 6.737.056; o las publicaciones PCT n.os W02004/035752 o W02004/029207; tal(es) sustitución/sustituciones de aminoácidos, si está(n) pre
sente(s) en la región Fc original, entonces estarían también presentes en la región Fc variante y en un polipéptido que comprende una región Fc variante, a menos
que esté en una posición posteriormente sustituida para generar la región Fc variante.
En una realización preferida, un anticuerpo monoclonal que comprende una región Fc variante es un anticuerpo quimérico. En una realización más preferida, un anticuerpo monoclonal que comprende una región Fc variante es un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano en el que la secuencia de entramado y la secuencia de región constante presentes en el anticuerpo son sustancialmente de origen humano. El anticuerpo quimérico, humanizado o humano es preferiblemente un anticuerpo de longitud completa o un anticuerpo de cadena sencilla. Cuando un anticuerpo monoclonal que comprende una región Fc variante va a usarse como agente terapéutico en seres humanos, preferiblemente la región Fc es sustancialmente de origen humano.
Preferiblemente, un polipéptido que comprende, o está operativamente unido a, una región Fc variante (es decir, "polipéptido variante") tiene al menos una sustitución de aminoácido en la región Fc variante en comparación con la región Fc original, y presenta una función efectora alterada o semivida sérica alterada en comparación con la del polipéptido que comprende la región Fc original de dicha región Fc variante, en el que la "al menos una sustitución de aminoácido en la región Fc variante" es (i) cualquier sustitución de aminoácido en la posición 279, 341, 343 ó 373 de la región Fc o (ii) al menos una de las siguientes sustituciones de aminoácidos en la región Fc: 235G, 235R, 236F, 236R, 236Y, 237K, 237N, 237R, 238E, 238G, 238H, 2381, 238L, 238V, 238W, 238Y, 244L, 245R, 247A, 2470, 247E, 247F, 247M, 247N, 247Q, 247R, 2478, 247T, 247W, 247Y, 248F, 248P, 248Q, 248W, 249L, 249M, 249N, 249P, 249Y, 251 H, 251 1, 251 W, 2540, 254E, 254F, 254G, 254H, 2541, 254K, 254L, 254M, 254N, 254P, 254Q, 254R, 254V, 254W, 254Y, 255K, 255N, 256H, 2561, 256K, 256L, 256V, 256W, 256Y, 257A, 2571, 257M, 257N, 2578, 2580, 2608, 262L, 2648, 265K, 2658, 267H, 2671, 267K, 268K, 269N, 269Q, 271T, 272H, 272K, 272L, 272R, 279A, 2790, 279F, 279G, 279H, 2791, 279K, 279L, 279M, 279N, 279Q, 279R, 2798, 279T, 279W, 279Y, 280T, 283F, 283G, 283H, 2831, 283K, 283L, 283M, 283P, 283R,
283T, 283W, 283Y, 285N, 286F, 288N, 288P, 292E, 292F, 292G, 2921, 292L, 293S, 293V, 301W, 304E, 307E, 307M, 312P, 315F, 315K, 315L, 315P, 315R,
316F, 316K, 317P, 317T, 318N, 318P, 318T, 332F, 332G, 332L, 332M, 332S, 332V, 332W, 3390, 339E, 339F, 339G, 339H, 3391, 339K, 339L, 339M, 339N, 339Q, 339R, 339S, 339W, 339Y, 3410, 341 E, 341 F, 341 H, 3411, 341 K, 341 L, 341M, 341N, 341P, 341Q, 341R, 341S, 341T, 341V, 341W, 341Y, 343A, 3430, 343E, 343F, 343G, 343H, 3431, 343K, 343L, 343M, 343N, 343Q, 343R, 343S, 343T, 343V, 343W, 343Y, 3730, 373E, 373F, 373G, 373H, 3731, 373K, 373L, 373M, 373N, 373Q, 373R, 373S, 373T, 373V, 373W, 375R, 376E, 376F, 376G, 376H, 3761, 376L, 376M, 376N, 376P, 376Q, 376R, 376S, 376T, 376V, 376W, 376Y, 377G, 377K, 377P, 378N, 379N, 379Q, 379S, 379T, 3800, 380N, 380S, 380T, 3820, 382F, 382H, 3821, 382K, 382L, 382M, 382N, 382P, 382Q, 382R, 382S, 382T, 382V, 382W, 382Y, 385E, 385P, 386K, 423N, 424H, 424M, 424V, 4260, 426L, 427N, 429A, 429F, 429M, 430A, 4300, 430F, 430G, 430H, 4301, 430K, 430L, 430M, 430N, 430P, 430Q, 430R, 430S, 430T, 430V, 430W, 430Y, 431 H, 431 K, 431 P, 432R, 432S, 438G, 438K, 438L, 438T, 438W, 439E, 439H, 439Q, 4400, 440E, 440F, 440G, 440H, 4401, 440K, 440L, 440M, 440Q, 440T, 440V o 442K, o (iii) al menos dos sustituciones de aminoácidos enumeradas en (i)
o (ii) anteriormente, o (iv) al menos 1, 2 ó 3 sustituciones de aminoácidos enumeradas en (i) o (ii) anteriormente además de al menos una sustitución de aminoácido en la región Fc no enumerada en (i) o (ii) anteriormente. Preferiblemente, la función efectora alterada es un aumento en AOCC, una disminución en AOCC, un aumento en COC, una disminución en COC, un aumento en la afinidad de unión a C1 q, una disminución en la afinidad de unión a C1 q, un aumento en la afinidad de unión a FcR (preferiblemente FcRn) o una disminución en la afinidad de unión a FcR (preferiblemente FcRn) en comparación con dicho polipéptido que carece de la sustitución de aminoácido en la región Fc (es decir, región Fc original).
La descripción proporciona un anticuerpo monoclonal que comprende una región Fc variante que comprende al menos una de las siguientes sustituciones de aminoácidos en la región Fc: 247A, 247F, 247M, 247T, 247V, 247Y, 249E, 249Y, 254F, 254M, 254Y, 256A, 2580, 279A, 283A, 2831, 283K, 283M, 283R, 288N, 292A, 311A, 3110, 311N, 311T, 311V, 311Y, 315L, 318N, 318P, 318T, 318V, 332T, 332V, 3390, 339F, 339G, 3391, 339K, 339M, 339N, 339Q, 339R, 339S, 339T, 376A, 376V, 377G, 377K, 379N, 380N, 380S, 382A, 3821, 385E, 427N, 429M, 434W, 4361, 440G, 440H, 4401 o 440L, [preferiblemente 247A, 247F, 247M, 247T, 247V, 247Y, 254F, 254Y, 2580, 279A, 283M, 288N, 292A, 31 10, 31 1N, 311T, 315L, 318N, 318P, 318T, 318V, 3390, 3391, 339K, 339M, 339N, 3390, 339R, 3395, 376A, 376V, 377K, 379N, 380N, 382A, 4401 o 440L], presentando el anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc variante AOCC potenciada en comparación con el anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc original.
La descripción proporciona un anticuerpo monoclonal que comprende una región Fc variante que comprende al menos una de las siguientes sustituciones de aminoácidos en la región Fc: 2350, 235R, 2355, 236F, 236R, 236Y, 237E, 237K, 237N, 237R, 238E, 238G, 238H, 2381, 238L, 238V, 238W, 238Y, 247G, 247R, 249L, 249P, 250K, 250M, 250R, 251H, 2511, 251W, 252Y, 254L, 254P, 2540, 254T, 254V, 256V, 257A, 2571, 257M, 257N, 2575, 257V, 2605, 262L, 2645, 265H, 265K, 2655, 267G, 267H, 2671, 267K, 269N, 2690, 270A, 270G, 270K, 270M, 270N, 271T, 272H, 272K, 272L, 272N, 272R, 2790, 279F, 279K, 279L, 279W, 2830, 283F, 283G, 283H, 283L, 283W, 283Y, 285N, 288P, 292E, 292F, 292G, 2921, 2935, 293V, 301W, 304E, 307A, 307E, 307M, 311F, 3111, 311K, 3115, 312P, 314F, 3141, 314V, 314W, 315F, 315P, 316F, 317P, 327T, 328V, 329Y, 332G, 332K, 332L, 332R, 332W, 3410, 341E, 341F, 341H, 3411, 341 K, 341L, 341M, 341N, 341P, 3410, 341R, 3415, 341T, 341W, 341Y, 343A, 3430,
343E, 343F, 343G, 343H, 343L, 343M, 343N, 3430, 343R, 3435, 343T, 343V, 343W, 343Y, 373A, 3730, 373E, 373F, 373G, 3731, 373K, 373L, 373M, 373N, 3730, 373R, 3735, 373T, 373V, 373W, 375R, 376A, 376E, 376F, 376G, 376H, 376W, 376Y, 3790, 3820, 3825, 430H, 430K, 430N, 4300, 430R, 430W, 432R, 4325, 4341, 4400, 440T, 440V o 442K, [preferiblemente 235R, 236F, 236Y, 237E, 237K, 237N, 237R, 238E, 238G, 238H, 2381, 238L, 238V, 238W, 238Y, 247R, 250K, 251 H, 254T, 2571, 257M, 257N, 2575, 257V, 265H, 265K, 2655, 267G, 267H, 2671, 267K, 269N, 2690, 270A, 270G, 270K, 270M, 270N, 271T, 272N, 272R, 288P, 292E, 301W, 304E, 316F, 317P, 327T, 328V, 329Y, 332K, 332R, 341F, 3411, 341M, 341P, 3410, 341R, 341T, 341W, 341Y, 343W, 373A, 373E, 373G, 3735, 376A, 376W, 432R o 4325], presentando el anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc variante actividad de AOCC disminuida en comparación con el anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc original.
La descripción proporciona un anticuerpo monoclonal que comprende una región Fc variante que comprende al menos una de las siguientes sustituciones de aminoácidos en la región Fc: 238L, 244L, 245R, 249P, 252Y, 256P, 257A, 2571, 257M, 257N, 2578, 257V, 2580, 2608, 262L, 270K, 272L, 272R, 279A, 2790, 279G, 279H, 279M, 279N, 279Q, 279R, 2798, 279T, 279W, 279Y, 283A, 2830, 283F, 283G, 283H, 2831, 283K, 283L, 283N, 283P, 283Q, 283R, 2838, 283T, 283W, 283Y, 285N, 286F, 288N, 288P, 293V, 307E, 307M, 311A, 3111, 311K, 311L, 311M, 311V, 311W, 312P, 316K, 317P, 318N, 318T, 332F, 332H, 332K, 332L, 332M, 332R, 3328, 332W, 339N, 339T, 339W, 341P, 343E, 343H, 343K, 343Q, 343R, 343T, 343Y, 375R, 376G, 3761, 376M, 376P, 376T, 376V, 377K, 3780, 378N, 380N, 3808, 380T, 382F, 382H, 3821, 382K, 382L, 382M, 382N, 382Q, 382R, 3828, 382T, 382V, 382W, 382Y, 423N, 427N, 430A, 430F, 430G, 430H, 4301, 430K, 430L, 430M, 430N, 430Q, 430R, 4308, 430T, 430V, 430Y, 431 H, 431 K, 434F, 434G, 434H, 434W, 434Y, 4361, 436L, 436T, 438K, 438L, 438T, 438W, 440K o 442K, [preferiblemente 245R, 252Y, 256P, 257 A, 2571, 257M, 257N, 2578, 257V, 2580, 2608, 262L, 279A, 2790, 279G, 279H, 279N, 279Q, 2798, 279T, 279W, 279Y, 283F, 283H, 283K, 283R, 285N, 286F, 307E, 307M, 3111, 311K, 311L, 311M, 312P, 318N, 318T, 3328, 339W, 343E, 343H, 343K, 343Q, 343R, 375R, 377K, 3780, 378N, 3808, 380T, 382F, 382K, 382Q, 382R, 3828, 382T, 382V, 382W, 382Y, 423N, 427N, 430A, 430F, 430H, 4301, 430L, 430M, 430N, 430Q, 430R, 4308, 430V, 430Y, 431H, 431K, 434F. 434G, 434H, 434W, 434Y, 4361, 436L, 438K, 438L o 438W] presentando el anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc variante afinidad de unión a FcRn potenciada en comparación con el anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc original.
La descripción proporciona un anticuerpo monoclonal que comprende una región Fc variante que comprende al menos una de las siguientes sustituciones de aminoácidos en la región Fc: 235Q, 236Y, 237K, 237R, 238E, 238G, 238H, 238W, 247A, 2470, 247E, 247F, 247G, 247H, 2471, 247L, 247M, 247N, 247Q, 247R, 2478, 247W, 247Y, 248A, 248F, 248P, 248Q, 248W, 249E, 249L, 249M, 249Y, 251 F, 251 H, 2511, 251W, 2540, 254E, 254F, 254G, 254H, 2541, 254K, 254L, 254M, 254N, 254P, 254Q, 254R, 254T, 254V, 254W, 254Y, 255K, 255N, 256F,
256H, 2561, 256K, 256M, 256R, 256W, 256Y, 2648, 2658, 265Y, 267G, 2671, 2680, 268K, 270A, 270M, 2791, 279K, 279L, 280T, 292E, 292F, 292G, 2921, 292L,
3110, 311E, 311F, 311G, 311N, 311R, 311Y, 315F, 315K, 315P, 316F, 317T, 326W, 327T, 339E, 339G, 339L, 339R, 3410, 341E, 341F, 3411, 341 K, 341L, 341M, 341N, 341Q, 341R, 341S, 341T, 341V, 341W, 341Y, 343M, 343V, 343W, 5 373A, 3730, 373G, 373K, 373L, 373M, 373N, 373Q, 373S, 373T, 373V, 373W, 376H, 376L, 376W, 376Y, 424M, 424V, 4260, 429A, 429F, 429M, 4300, 430W, 431 P, 432R, 432S, 439Q, 440A, 4400, 440E, 440F o 440M, [preferiblemente 237R, 2470, 247E, 247F, 247H, 2471, 247L, 247M, 247N, 247Q, 247W, 247Y, 248A, 248F, 248P, 248Q, 248W, 249L, 249M, 249Y, 251H, 2511, 251W, 2540,
10 254E, 254F, 254G, 254H, 2541, 254K, 254M, 254N, 254P, 254Q, 254R, 254T, 254V, 254W, 254Y, 255K, 255N, 256F, 256H, 256K, 256M, 256R, 256W, 265Y, 280T, 292G, 2921, 3110, 311E, 311G, 311N, 315F, 315P, 316T, 317T, 327T, 3410, 341E, 341F, 3411, 341L, 341Y, 343W, 373A, 373G, 373M, 373Q, 376W, 376Y, 424M, 424V, 4300, 430W, 431 P o 432S], presentando el anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc variante afinidad de unión a FcRn disminuida en comparación con el anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc original.
La descripción proporciona un anticuerpo monoclonal que comprende una región
20 Fc variante que comprende al menos una de las siguientes sustituciones de aminoácidos en la región Fc: 236Y, 244L, 247A, 2470, 247E, 247G, 247N, 247Q, 247R, 247S, 247W, 248F, 248P, 248Q, 248W, 249E, 249L, 249M, 249N, 249P, 249Y, 251F, 251H, 2511, 251W, 254A, 254F, 254K, 254L, 254M, 254R, 254Y, 255K, 256A, 256G, 2561, 256L, 256M, 256P, 256Q, 256W, 256Y, 260S, 2680,
25 279Q, 279S, 279W, 279Y, 280K, 280T, 283F, 283G, 283H, 2831, 283K, 283L, 283M, 283N, 283P, 283R, 283S, 283W, 292L, 307A, 307M, 311F, 3111, 311K, 311 L, 311 M, 311T, 3111V, 311W, 311Y, 312P, 314F, 3141, 314V, 314W, 314Y, 315F, 315K, 315L, 315P, 315R, 316K, 317P, 317T, 318N, 318T, 332A, 3320, 332E, 332F, 332G, 332L, 332M, 332Q, 332S, 332T, 332V, 332W, 332Y, 3390,
30 339F, 339G, 339H, 3391, 339K, 339N, 339Q, 339R, 339S, 339T, 339W, 339Y, 3410, 341E, 341F, 341H, 3411, 341K, 341L, 341M, 341N, 341P, 341Q, 341R, 341S, 341T, 341V, 341W, 341Y, 343A, 3430, 343E, 343G, 343H, 343K, 343L, 343M, 343N, 343Q, 343R, 343S, 343T, 343W, 343Y, 3730, 373E, 373F, 373H,
3731, 373K, 373L, 373M, 373N, 373Q, 373R, 373T, 373V, 373W, 375R, 376A, 376F, 376G, 376H, 376L, 376N, 376P, 3760, 376R, 3768, 376T, 376V, 377P,
379N, 3790, 3798, 379T, 380A, 380N, 3808, 380T, 3821, 382L, 3820, 382V, 386K, 4260, 426L, 429A, 429F, 429M, 430A, 4300, 430F, 430G, 430H, 4301, 430K, 430L, 430M, 430N, 430P, 430R, 4308, 430T, 430V, 430VV, 430Y, 431H, 431 P, 432R, 4328, 434VV, 434Y, 438L, 438VV, 4400 o 440Y, [preferiblemente 236Y, 248F, 248P, 2480, 248VV, 249E, 249L, 249M, 249N, 249Y, 251H, 2511, 251VV, 254F, 254K, 254L, 254M, 254R, 254Y, 255K, 256A, 256G, 2561, 256L, 256M, 256P, 2560, 256VV, 2608, 280K, 283VV, 307M, 311F, 3111, 311K, 311L, 311 M, 311T, 311V, 311VV, 311Y, 3141, 314V, 314VV, 314Y, 315P, 317P, 3320, 332L, 332M, 3328, 332VV, 3390, 339F, 3391, 339K, 339N, 3398, 339VV, 339Y, 3410, 341E, 341F, 341H, 3411, 341K, 341L, 341M, 341N, 341P, 3410, 341R, 3418, 341T, 341V, 341VV, 341Y, 3430, 343E, 343G, 343H, 343K, 343N, 3430, 343R, 3438, 343T, 343VV, 343Y, 373E, 373F, 373H, 3731, 373K, 373L, 3730, 373R, 373T, 373VV, 376A, 376G, 376N, 376P, 3760, 376R, 3768, 376T, 376V, 377P, 379N, 3790, 379T, 3821, 382L, 386K, 4260, 426L, 429F, 429M, 430A, 4300, 430F, 430G, 430H, 4301, 430K, 430L, 430M, 430N, 430P, 430R, 4308, 430T, 430V, 430VV, 430Y, 431H, 431P, 434Y, 438L o 440Y] presentando el anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc variante actividad de COC potenciada en comparación con el anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc original.
La descripción proporciona un anticuerpo monoclonal que comprende una región Fc variante que comprende al menos una de las siguientes sustituciones de aminoácidos en la región Fc: 235G, 2358, 236R, 237E, 237K, 237N, 237R, 238A, 238E, 238G, 238H, 2381, 238L, 238V, 238VV, 238Y, 245R, 247H, 2471, 247L, 247T, 247Y, 250M, 252Y, 2540, 254E, 2541, 254P, 2540, 254T, 254V, 255N, 257A, 2571, 257M, 257N, 2578, 257V, 262L, 2648, 265H, 265Y, 267G, 267H, 2671, 267K, 268K, 269N, 2690, 270G, 270M, 270N, 271T, 272H, 272L, 272N, 292A, 2938, 301VV, 307E, 311E, 3118, 316F, 318P, 327T, 328V, 329Y, 330K, 330R, 332E, 332M, 3431, 3738, 3780, 3800, 3820, 382F, 382N, 382P, 382R, 3828, 382VV, 382Y, 385E, 385P, 423N, 424H, 424M o 427N [preferiblemente 235G, 2358, 236R, 237E, 237K, 237N, 237R, 238A, 238E, 238G, 238H, 2381, 238L, 238V, 238VV, 238Y, 245R, 2471, 247L, 247T, 250M, 257A, 2571, 257M,
262L, 2648, 267G, 267H, 2671, 267K, 268K, 269N, 2690, 270G, 270M, 270N,
271T, 272H, 301W, 3118, 327T, 329Y, 330K, 378D, 385E, 423N o 424H] presentando el anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc variante actividad de CDC disminuida en comparación con el anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc original.
La descripción caracteriza además un anticuerpo monoclonal que comprende una región Fc variante de la invención, uniéndose dicho anticuerpo específicamente a un antígeno diana humano. Preferiblemente, el antígeno diana se selecciona del grupo que consiste en CD3, CD20, CD25, TNFa, Her2/neu, CD33, CD52, EGFR, EpCAM, MUC1 , GD3, CEA, CA1 25, HLA-DR, TGFp, VEGF, GDF8, GDF1 1, grelina o cualquier precursor o fragmento funcional de los mismos.
La descripción proporciona un polipéptido variante que comprende una región Fc variante que comprende al menos una de las siguientes sustituciones de aminoácid os en la región Fc: 238L, 244L, 245R, 249P, 252Y, 256P, 257A, 2571, 257M, 257N, 2578, 257V, 258D, 2608, 262L, 270K, 272L, 272R, 279A, 279D, 279G, 279H, 279M, 279N, 279Q, 279R, 2798, 279T, 279W, 279Y, 283A, 283D, 283F, 283G, 283H, 2831, 283K, 283L, 283N, 283P, 283Q, 283R, 2838, 283T, 283W, 283Y, 285N, 286F, 288N, 288P, 293V, 307E, 307M, 311A, 3111, 311K, 311L, 311M, 311V, 311W, 312P, 316K, 317P, 318N, 318T, 332F, 332H, 332K, 332L, 332M, 332R, 3328, 332W, 339N, 339T, 339W, 341P, 343E, 343H, 343K, 343Q, 343R, 343T, 343Y, 375R, 376G, 3761, 376M, 376P, 376T, 376V, 377K, 378D, 378N, 380N, 3808, 380T, 382F, 382H, 3821, 382K, 382L, 382M, 382N, 382Q, 382R, 3828, 382T, 382V, 382W, 382Y, 423N, 427N, 430A, 430F, 430G, 430H, 4301, 430K, 430L, 430M, 430N, 430Q, 430R, 4308, 430T, 430V, 430Y, 431H, 431 K, 434F, 434G, 434H, 434W, 434Y, 4361, 436L, 436T, 438K, 438L, 438T, 438W, 440K o 442K, [preferiblemente 245R, 252Y, 256P, 257A, 2571, 257M, 257N, 2578, 257V, 258D, 2608, 262L, 279A, 279D, 279G, 279H, 279N, 279Q, 2798, 279T, 279W, 279Y, 283F, 283H, 283K, 283R, 285N, 286F, 307E, 307M, 3111, 311K, 311L, 311M, 312P, 318N, 318T, 3328, 339W, 343E, 343H, 343K, 343Q, 343R, 375R, 377K, 378D, 378N, 3808, 380T, 382F, 382K, 382Q, 382R, 3828, 382T, 382V, 382W, 382Y, 423N, 427N, 430A, 430F, 430H, 4301, 430L, 430M, 430N, 430Q, 430R, 4308, 430V, 430Y, 431H, 431K, 434F, 434G, 434H, 434W, 434Y, 4361, 436L, 438K, 438L o 438W], presentando el polipéptido variante semivida sérica potenciada en comparación con el polipéptido original (es decir, un polipéptido idéntico al polipéptido variante pero que carece de la sustitución de aminoácido enumerada anteriormente en el presente documento).
5 La descripción proporciona un polipéptido variante que comprende una región Fc variante que comprende al menos una de las siguientes sustituciones de aminoácidos en la región Fc: 2350, 236Y, 237K, 237R, 238E, 238G, 238H, 238W, 247A, 2470, 247E, 247F, 247G, 247H, 2471, 247L, 247M, 247N, 2470, 247R, 2475, 247W, 247Y, 248A, 248F, 248P, 2480, 248W, 249E, 249L, 249M, 249Y, 251F,
10 251 H, 2511, 251W, 2540, 254E, 254F, 254G, 254H, 2541, 254K, 254L, 254M, 254N, 254P, 2540, 254R, 254T, 254V, 254W, 254Y, 255K, 255N, 256F, 256H, 2561, 256K, 256M, 256R, 256W, 256Y, 2645, 2655, 265Y, 267G, 2671, 2680, 268K, 270A, 270M, 2791, 279K, 279L, 280T, 292E, 292F, 292G, 2921, 292L, 31 10, 311E, 311F, 311G, 311N 311R, 311Y, 315F, 315K, 315P, 316F, 317T, 326W, 327T, 339E, 339G, 339L, 339R, 3410, 341E, 341F, 3411, 341K, 341L, 341M, 341N, 3410, 341R, 3415, 341T, 341V, 341W, 341Y, 343M, 343V, 343W, 373A, 3730, 373G, 373K, 373L, 373M, 373N, 3730, 3735, 373T, 373V, 373W, 376H, 376L, 376W, 376Y, 424M, 424V, 4260, 429A, 429F, 429M, 4300, 430W, 431 P, 432R, 4325, 4390, 4400, 440E, 440F o 440M [preferiblemente 237R, 2470,
20 247E, 247F, 247H, 247L, 247M, 247N, 2470, 247W, 247Y, 248A, 248F, 248P, 2480, 248W, 249L, 249M, 249Y, 251H, 2511, 251W, 2540, 254E, 254F, 254G, 254H, 2541, 254K, 254M, 254N, 254P, 2540, 254R, 254T, 254V, 254W, 254Y, 255K, 255N, 256F, 256H, 256K, 256M, 256R, 256W, 265Y, 280T, 292G, 2921, 3110, 311E, 311G, 311N, 315F, 315P, 316T, 317T, 327T, 3410, 341E, 341F,
25 3411, 341L, 341Y, 343W, 373A, 373G, 373M, 3730, 376W, 376Y, 424M, 424V, 4300, 430W, 431 P o 4325], presentando el polipéptido variante semivida sérica disminuida en comparación con el polipéptido original (es decir, un polipéptido idéntico al polipéptido variante pero que carece de la sustitución de aminoácido enumerada anteriormente en el presente documento).
30 En una realización la descripción proporciona un método para aumentar la actividad de AOCC de un anticuerpo monoclonal, preferiblemente un anticuerpo monoclonal terapéutico (o fragmento funcional del mismo), que comprende modificar por ingeniería genética un ácido nucleico que comprende un ácido nucleico que
codifica para una región Fc variante que comprende al menos una de las siguientes sustituciones de aminoácidos: 247A, 247F, 247H, 2471, 247L, 247M, 247T, 247V, 247Y, 249E, 249Y, 251F, 254F, 254M, 254Y, 256A, 256M, 2580, 2680, 268E, 279A, 280A, 280K, 283A, 2831, 283K, 283M, 283R, 288N, 292A, 31 1A, 3110, 311 N, 311T, 311V, 311Y, 315L, 318N, 318P, 318T, 318V, 330K, 332T, 332V, 3390, 339F, 339G, 3391, 339K, 339M, 339N, 3390, 339R, 339S, 339T, 376A, 376V, 377G, 377K, 379N, 380N, 380S, 382A, 3821, 385E, 427N, 429M, 434W, 4361, 440G, 440H, 4401 o 440L [preferiblemente 247A, 247F, 247M, 247T, 247V, 247Y, 254F, 254Y, 2580, 279A, 283M, 288N, 292A, 3110, 311N, 311T, 31 5L, 31 8N, 31 8P, 31 8T, 31 8V, 3390, 3391, 339K, 339M, 339N, 3390, 339R, 339S, 376A, 376V, 377K, 379N, 380N, 382A, 4401 o 440L). La molécula de ácido nucleico que codifica para la región Fc variante puede modificarse por ingeniería genética (por ejemplo, a partir de una molécula de ácido nucleico que codifica para una región Fc original o una región Fc nativa) para que comprenda al menos una sustitución de aminoácido enumerada anteriormente o bien mientras que la molécula de ácido nucleico está operativamente unida a un ácido nucleico que codifica para un anticuerpo adicional, (por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico que codifica para el resto de la cadena pesada de Ig), o bien el método puede comprender además posteriormente unir operativamente el ácido nucleico que codifica para la región Fc variante (es decir, tras la introducción de al menos una sustitución de aminoácido enumerada anteriormente) a un ácido nucleico que codifica para un anticuerpo adicional. El método puede comprender además la expresión y purificación del anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc variante. El método puede comprender además la expresión y purificación del anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc original. El método puede comprender además medir la actividad de AOCC del anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc variante y del anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc original mediante cualquier método disponible en la técnica o tal como se describe en el presente documento. El método puede comprender además seleccionar un anticuerpo monoclonal que comprende una región Fc variante con actividad de AOCC mayor que la del anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc original (es decir, potenciada, preferiblemente en al menos el 5%, el 10%, el 12%, el 14%, el 16%, el 18%, el 20% o más). La descripción caracteriza además un anticuerpo monoclonal, o fragmento funcional del mismo, que comprende una región Fc variante producida mediante el método.
En una realización la descripción proporciona un método para disminuir la actividad de AOCC de un anticuerpo monoclonal, preferiblemente un anticuerpo monoclonal terapéutico (o fragmento funcional del mismo), que comprende modificar por ingeniería genética un ácido nucleico que comprende un ácido nucleico que codifica para una región Fc variante que comprende al menos una de las siguientes sustituciones de aminoácidos: 235Q, 235R, 235S, 236F, 236R, 236Y, 237E, 237K, 237N, 237R, 238E, 238G, 238H, 2381, 238L, 238V, 238W, 238Y, 247G, 247R, 249L, 249P, 250K, 250M, 250R, 251 H, 2511, 251W, 252Y, 254L, 254P, S254Q, 254T, 254V, 256V, 257A, 2571, 257M, 257N, 257S, 257V, 260S, 262L, 264S, 265H, 265K, 265S, 267G, S267H, 2671, 267K, 269N, 269Q, 270A, 270G, 270K, 270M, 270N, 271T, 272H, 272K, 272L, 272N, 272R, 2790, 279F, 279K, 279L, 279W, 2830, 283F, 283G, 283H, 283L, 283T, 283W, 283Y, 285N, 288P, 292E, 292F, 292G, 2921, 293S, 293V, 301W, 304E, 307A, 307E, 307M, 311F, 3111, 311K, 311S, 312P, 314F, 3141, 314V, 314W, 315F, 315P, 316F, 317P, 327T, 328V, 329Y, 332G, 332K, 332L, 332R, 332W, 3410, 341E, 341F, 341H, 3411, 341K, 341L, 341M, 341N, 341P, 341Q, 341R, 341S, 341T, 341W, 341Y, 343A, 3430, 343E, 343F, 343G, 343H, 343L, 343M, 343N, 343Q, 343R, 343S, 343T, 343V, 343W, 343Y, 373A, 3730, 373E, 373F, 373G, 3731, 373K, 373L, 373M, 373N, 373Q, 373R, 373S, 373T, 373V, 373W, 375R, 376A, 376E, 376F, 376G, 376H, 376W, 376Y, 379Q, 3820, 382S, 429A, 429F, 430H, 430K, 430N, 430Q, 430R, 430W, 432R, 432S, 4341, 4400, 440T, 440V o 442K [preferiblemente 235R, 236F, 236R, 236Y, 237E, 237K, 237N, 237R, 238E, 238G, 238H, 2381, 238L, 238V, 238W, 238Y, 247R, 249P, 250K, 251 H, 254T, 2571, 257M, 257N, 257S, 257V, 265H, 265K, 265S, 267G, 267H, 2671, 267K, 269N, 269Q, 270A, 270G, 270K, 270M, 270N, 271T, 272R, 288P, 292E, 301W, 304E, 316F, 317P, 327T, 329Y, 332K, 332R, 341F, 3411, 341M, 341P, 341Q, 341R, 341T, 341W, 341Y, 343W, 373A, 373E, 373G, 373S, 376W, 429A, 432R o 432S]. La molécula de ácido nucleico que codifica para la región Fc variante puede modificarse por ingeniería genética (por ejemplo, a partir de una molécula de ácido nucleico que codifica para una región Fc original o una región Fc nativa) para que comprenda al menos una sustitución de aminoácido enumerada anteriormente o bien mientras que la molécula de ácido nucleico está operativamente unida a un ácido nucleico que codifica para un anticuerpo adicional, (por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico que codifica para el resto de la cadena pesada de Ig), o bien el método puede comprender además posteriormente unir operativamente el ácido nucleico que codifica para la región Fc variante (es decir, tras la introducción de al menos una sustitución de aminoácido enumerada anteriormente) a un ácido nucleico que codifica para un anticuerpo adicional. El método puede comprender además la expresión y purificación del anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc variante. El método puede comprender además la expresión y purificación del anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc original. El método puede comprender además medir la actividad de AOCC del anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc variante y del anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc original mediante cualquier método disponible en la técnica o tal como se describe en el presente documento. El método puede comprender además seleccionar un anticuerpo monoclonal que comprende una región Fc variante con actividad de AOCC menor que la del anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc original (es decir, disminuida, preferiblemente en al menos el 5%, el 10%, el 12%, el 14%, el 16%, el 18%, el 20% o más). La invención caracteriza además un anticuerpo monoclonal, o fragmento funcional del mismo, que comprende una región Fc variante producida mediante el método.
En una realización la descripción proporciona un método para aumentar la afinidad de unión a FcRn de un anticuerpo monoclonal, preferiblemente un anticuerpo monoclonal terapéutico (o fragmento funcional del mismo), que comprende modificar por ingeniería genética un ácido nucleico que comprende un ácido nucleico que codifica para una región Fc variante que comprende al menos una de las siguientes sustituciones de aminoácidos: 238L, 244L, 245R, 249P, 252Y, 256P, 257A, 2571, 257M, 257N, 257S, 257V, 2580, 260S, 262L, 270K, 272L, 272R, 279A, 2790, 279G, 279H, 279M, 279N, 279Q, 279R, 279S, 279T, 279W, 279Y, 283A, 2830, 283F, 283G, 283H, 2831, 283K, 283L, 283N, 283P, 283Q, 283R, 283S, 283T, 283W, 283Y, 285N, 286F, 288N, 288P, 293V, 307A, 307E, 307M, 311A, 3111, 311K, 311L, 311M, 311V, 311W, 312P, 316K, 317P, 318N, 318T, 332F, 332H, 332K, 332L, 332M, 332R, 332S, 332W, 339N, 339T, 339W, 341P, 343E, 343H, 343K, 343Q, 343R, 343T, 343Y, 375R, 376G, 3761, 376M, 376P, 376T, 376V, 377K, 3780, 378N, 380N, 380S, 380T, 382F, 382H, 3821, 382K, 382L, 382M, 382N, 3820, 382R, 382S, 382T, 382V, 382W, 382Y, 423N, 427N, 430A, 430F, 430G, 430H, 4301, 430K, 430L, 430M, 430N, 4300, 430R, 430S, 430T, 430V, 430Y, 431H, 431K, 434F, 434G, 434H, 434W, 434Y, 4361, 436L, 436T, 438K, 438L, 438T, 438W, 440K O 442K [preferiblemente 245R, 252Y, 256P, 257A, 2571, 257M, 257N, 257S, 257V, 2580, 262L, 279A, 2790, 279G, 279H, 279N, 2790, 279S, 279T, 279W, 279Y, 283F, 283H, 283K, 283R, 285N, 286F, 307A, 307E, 307M, 3111, 311K, 311L, 311M, 312P, 318N, 318T, 332S, 339W, 343E, 343H, 343K, 3430, 343R, 375R, 377K, 3780, 378N, 380S, 380T, 382F, 382K, 3820, 382R, 382S, 382T, 382V, 382W, 382Y, 423N, 427N, 430A, 430F, 430H, 4301, 430L, 430M, 430N, 4300, 430R, 430S, 430V, 430Y, 431 H, 431 K, 434F, 434G, 434H, 434W, 434Y, 4361, 436L, 438K, 438L o 438W]. La molécula de ácido nucleico que codifica para la región Fc variante puede modificarse por ingeniería genética (por ejemplo, a partir de una molécula de ácido nucleico que codifica para una región Fc original o una región Fc nativa) para que comprenda al menos un sustitución de aminoácido enumerada anteriormente o bien mientras que la molécula de ácido nucleico está operativamente unida a un ácido nucleico que codifica para un anticuerpo adicional, (por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico que codifica para el resto de la cadena pesada de Ig), o bien el método puede comprender además posteriormente unir operativamente el ácido nucleico que codifica para la región Fc variante (es decir, tras la introducción de al menos una sustitución de aminoácido enumerada anteriormente) a un ácido nucleico que codifica para un anticuerpo adicional. El método puede comprender además la expresión y purificación del anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc variante. El método puede comprender además la expresión y purificación del anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc original. El método puede comprender además medir la afinidad de unión a FcRn del anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc variante y del anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc original mediante cualquier método disponible en la técnica o tal como se describe en el presente documento. El método puede comprender además seleccionar un anticuerpo monoclonal que comprende una región Fc variante con afinidad de unión a FcRn mayor que la afinidad de unión a FcRn del anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc original (es decir, potenciada, preferiblemente en al menos el 5%, el 10%, el 12%, el 14%, el 16%, el 18%, el 20% o más).
La invención caracteriza además un anticuerpo monoclonal, o fragmento funcional del mismo, que comprende una región Fc variante producida mediante el método.
En una realización la descripción proporciona un método para aumentar la semi
5 vida sérica in vivo de un polipéptido, preferiblemente un polipéptido terapéutico, que comprende modificar por ingeniería genética un ácido nucleico que comprende un ácido nucleico que codifica para una región Fc variante que comprende al menos una de las siguientes sustituciones de aminoácidos: 238L, 244L, 245R, 249P, 252Y, 256P, 257A, 2571, 257M, 257N, 2575, 257V, 2580, 2605, 262L,
10 270K, 272L, 272R, 279A, 2790, 279G, 279H, 279M, 279N, 279Q, 279R, 2795, 279T, 279W, 279Y, 283A, 2830, 283F, 283G, 283H, 2831, 283K, 283L, 283N, 283P, 283Q, 283R, 2835, 283T, 283W, 283Y, 285N, 286F, 288N, 288P, 293V, 307A, 307E, 307M, 311A, 3111, 311K, 311L, 311M, 311V, 311W, 312P, 316K, 317P, 318N, 318T, 332F, 332H, 332K, 332L, 332M, 332R, 3325, 332W, 339N,
15 339T, 339W, 341 P, 343E, 343H, 343K, 343Q, 343R, 343T, 343Y, 375R, 376G, 3761, 376M, 376P, 376T, 376V, 377K, 3780, 378N, 380N, 3805, 380T, 382F, 382H, 3821, 382K, 382L, 382M, 382N, 382Q, 382R, 3825, 382T, 382V, 382W, 382Y, 423N, 427N, 430A, 430F, 430G, 430H, 4301, 430K, 430L, 430M, 430N, 430Q, 430R, 4305, 430T, 430V, 430Y, 431H, 431 K, 434F, 434G, 434H, 434W,
20 434Y, 4361, 436L, 436T, 438K, 438L, 438T, 438W, 440K o 442K, [preferiblemente 245R, 252Y, 256P, 257A, 2571, 257M, 257N, 2575, 257V, 2580, 262L, 279A, 2790, 279G, 279H, 279N, 279Q, 2795, 279T, 279W, 279Y, 283F, 283H, 283K, 283R, 285N, 286F, 307A, 307E, 307M, 3111, 311K, 311L, 311M, 312P, 318N, 318T, 3325, 339W, 343E, 343H, 343K, 343Q, 343R, 375R, 377K, 3780, 378N, 3805, 380T, 382F, 382K, 382Q, 382R, 3825, 382T, 382V, 382W, 382Y, 423N, 427N, 430A, 430F, 430H, 4301, 430L, 430M, 430N, 430Q, 430R, 4305, 430V, 430Y, 431H, 431 K, 434F, 434G, 434H, 434W, 434Y, 4361, 436L, 438K, 438L o 438W]. La molécula de ácido nucleico que codifica para la región Fc variante puede estar operativamente unida a una molécula de ácido nucleico que codifica para
30 una proteína terapéutica. La molécula de ácido nucleico que codifica para una región Fc variante puede modificarse por ingeniería genética (por ejemplo, a partir de una molécula de ácido nucleico que codifica para una región Fc original o una región Fc nativa) para que comprenda al menos una sustitución de aminoácido enumerada anteriormente mientras que la molécula de ácido nucleico está operativamente unida a un ácido nucleico que codifica para un polipéptido adicional, (por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico que codifica para la región distinta de Fc de la proteína de fusión), o el método puede comprender además posteriormente unir operativamente el ácido nucleico que codifica para la región Fc variante tras la introducción de la al menos una sustitución de aminoácido enumerada anteriormente a un ácido nucleico que codifica para una pareja de fusión distinta de Fc. El método puede comprender además la expresión y purificación del polipéptido que comprende la región Fc variante. El método puede comprender además la expresión y purificación del polipéptido que comprende la región Fc original. El método puede comprender además medir la semivida sé rica in vivo del polipéptido que comprende la región Fc variante y del polipéptido que comprende la región Fc original mediante cualquier método disponible en la técnica o tal como se describe en el presente documento. El método puede comprender además seleccionar un polipéptido que comprende una región Fc variante en el que el polipéptido tiene semivida sé rica in vivo potenciada en comparación con la del polipéptido que comprende la región Fc original (es decir, potenciada, preferiblemente en al menos el 5%, el 10%, el 12%, el 14%, el 16%, el 18%, el 20% o más). La invención caracteriza además un polipéptido (es decir, un polipéptido de fusión) que comprende una región Fc variante producida mediante el método.
En una realización la descripción proporciona un método para disminuir la afinidad de unión a FcRn de un anticuerpo monoclonal, preferiblemente un anticuerpo monocional terapéutico (o fragmento funcional del mismo), que comprende modificar por ingeniería genética un ácido nucleico que codifica para una región Fc variante que comprende al menos una de las siguientes sustituciones de aminoácidos: 2350, 236Y, 237K, 237R, 238E, 238G, 238H, 238W, 247A, 2470, 247E, 247F, 247G, 247H, 2471, 247L, 247M, 247N, 2470, 247R, 2478, 247W, 247Y, 248A, 248F, 248P, 2480, 248W, 249E, 249L, 249M, 249Y, 251 F, 251 H, 2511, 251W, 2540, 254E, 254F, 254G, 254H, 2541, 254K, 254L, 254M, 254N, 254P, 2540, 254R, 254T, 254V, 254W, 254Y, 255K, 255N, 256F, 256H, 2561, 256K, 256M, 256R, 256W, 256Y, 2648, 2658, 265Y, 8267G, 2671, 2680, 268K, 270A, 270M, 2791, 279K, 279L, 280T, 292E, 292F, 292G, 2921, 292L, 3110, 311 E, 311 F, 311 G, 311N, 311R, 311Y, 315F, 315K, 315P, 316F, 317T, 326W, 327T, 339E, 339G, 339L, 339R, 3410, 341E, 341F, 3411, 341K, 341L, 341M, 341 N, 3410, 341R, 3418, 341T, 341V, 341W, 341Y, 343M, 343V, 343W, 373A, 3730, 373G, 373K, 373L, 373M, 373N, 3730, 3738, 373T, 373V, 373W, 376H, 376L, 376W, 376Y, 424M, 424V, 4260, 429A, 429F, 429M, 4300, 430W, 431P, 432R, 4328, 4341, 4390, 440A, 4400, 440E, 440F o 440M [preferiblemente 237R, 2470, 247E, 247F, 247H, 247L, 247M, 247N, 2470, 247W, 247Y, 248A, 248F, 248P, 2480, 2480, 249L, 249M, 249Y, 251H, 2511, 251W, 2540, 254E, 254F, 254G, 254H, 2541, 254K, 254M, 254N, 254P, 254R, 254T, 254V, 254W, 254Y, 255K, 255N, 256F, 256H, 256K, 256M, 256R, 256W, 265Y, 280T, 292G, 2921, 31 10, 31 1E, 311G, 311N, 315F, 315P, 316T, 317T, 327T, 3410, 341E, 341F, 341L, 341Y, 343W, 373A, 373G, 373M, 3730, 376W, 376Y, 424M, 424V, 4300, 430W, 431 P o 4328]. La molécula de ácido nucleico que codifica para una región Fc variante puede modificarse por ingeniería genética (por ejemplo, a partir de una molécula de ácido nucleico que codifica para una región Fc original o una región Fc nativa) para que comprenda al menos una sustitución de aminoácido enumerada anteriormente mientras que el ácido nucleico que codifica para la región Fc variante está operativamente unido a un ácido nucleico que codifica para una secuencia de anticuerpo adicional, (por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico que codifica para el resto de la cadena pesada de Ig), o el método puede comprender además posteriormente unir operativa mente el ácido nucleico que codifica para la región Fc variante tras la introducción de la al menos una sustitución de aminoácido enumerada anteriormente a un ácido nucleico que codifica para un anticuerpo adicional. El método puede comprender además la expresión y purificación del anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc variante. El método puede comprender además la expresión y purificación del anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc original. El método puede comprender además medir la afinidad de unión a FcRn del anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc variante y del anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc original mediante cualquier método disponible en la técnica o tal como se describe en el presente documento. El método puede comprender además seleccionar un anticuerpo monocional que comprende una región Fc variante con afinidad de unión a FcRn menor que la del anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc original (es decir, disminuida, preferiblemente en al menos el 5%, el 10%, el 12%, el 14%, el 16%, el 18%, el 20% o más). La descripción caracteriza además un anticuerpo monoclonal (que comprende una región Fc variante) producido mediante el método.
En otra realización la descripción proporciona un método para disminuir la semivida sérica in vivo de un polipéptido, preferiblemente un polipéptido terapéutico, que comprende modificar por ingeniería genética un ácido nucleico que codifica para una región Fc variante que comprende al menos una de las siguientes sustituciones de aminoácidos: 2350, 236Y, 237K, 237R, 238E, 238G, 238H, 238W, 247A, 247D, 247E, 247F, 247G, 247H, 2471, 247L, 247M, 247N, 2470, 247R, 247S, 247W, 247Y, 248A, 248F, 248P, 2480, 248W, 249E, 249L, 249M, 249Y, 251 F, 251 H, 251 1, 251W, 254D, 254E, 254F, 254G, 254H, 2541, 254K, 254L, 254M, 254N, 254P, 2540, 254R, 254T, 254V, 254W, 254Y, 255K, 255N, 256F, 256H, 2561, 256K, 256M, 256R, 256W, 256Y, 264S, 265S, 265Y, S267G, 2671, 268D, 268K, 270A, 270M, 2791, 279K, 279L, 280T, 292E, 292F, 292G, 2921, 292L, 31 1 D, 311 E, 311 F, 311G, 311 N, 311 R, 311Y, 315F, 315K, 315P, 316F, 317T, 326W, 327T, 339E, 339G, 339L, 339R, 341D, 341E, 341F, 3411, 341K, 341L, 341M, 341N, 3410, 341R, 341S, 341T, 341V, 341W, 341Y, 343M, 343V, 343W, 373A, 373D, 373G, 373K, 373L, 373M, 373N, 3730, 373S, 373T, 373V, 373W, 376H, 376L, 376W, 376Y, 424M, 424V, 426D, 429A, 429F, 429M, 430D, 430W, 431 P, 432R, 432S, 4341, 4390, 440A, 440D, 440E, 440F o 440M [preferiblemente 237R, 247D, 247E, 247F, 247H, 247L, 247M, 247N, 2470, 247W, 247Y, 248A, 248F, 248P, 2480, 2480, 249L, 249M, 249Y, 251 H, 251 1, 251W, 254D, 254E, 254F, 254G, 254H, 2541, 254K, 254M, 254N, 254P, 254R, 254T, 254V, 254W, 254Y, 255K, 255N, 256F, 256H, 256K, 256M, 256R, 256W, 265Y, 280T, 292G, 2921, 311D, 311E, 311G, 311N, 315F, 315P, 316T, 317T, 327T, 341D, 341E, 341F, 341L, 341Y, 343W, 373A, 373G, 373M, 3730, 376W, 376Y, 424M, 424V, 430D, 430W, 431 P o 432S]. El ácido nucleico que codifica para la región variante Fc puede estar operativa mente unido a un ácido nucleico que codifica para una proteína terapéutica. La molécula de ácido nucleico que codifica para una región Fc variante puede modificarse por ingeniería genética (por ejemplo, a partir de una molécula de ácido nucleico que codifica para una región Fc original o una región Fc nativa) para que comprenda al menos una sustitución de aminoácido enumerada anteriormente mientras que la molécula de ácido nucleico está operativamente unida a un ácido nucleico que codifica para un polipéptido adicional, (por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico que codifica para la región distinta de Fc de la proteína de fusión), o el método puede comprender además posteriormente unir operativamente el ácido nucleico que codifica para la región Fc variante tras la introducción de la al menos una sustitución de aminoácido enumerada anteriormente a ácido nucleico que codifica para una pareja de fusión distinta de Fc. El método puede comprender además la expresión y purificación del polipéptido que comprende la región Fc variante. El método puede comprender además la expresión y purificación del polipéptido que comprende la región Fc original. El método puede comprender además medir la semivida sérica in vivo del polipéptido que comprende la región Fc variante y del polipéptido que comprende la región Fc original mediante cualquier método disponible en la técnica o tal como se describe en el presente documento. El método puede comprender además seleccionar un polipéptido que comprende una región Fc variante en el que el polipéptido tiene una semivida sérica in vivo disminuida en comparación con la del polipéptido que comprende la región Fc original (es decir, disminuida, preferiblemente en al menos el 5%, el 10%, el 12%, el 14%, el 16%, el 18%, el 20% o más). La invención caracteriza además un polipéptido (es decir, un polipéptido de fusión) que comprende una región Fc variante producido mediante el método.
En otra realización la descripción proporciona un método para aumentar la actividad de COC de un anticuerpo monoclonal, preferiblemente un anticuerpo monoclonal terapéutico, que comprende construir la región Fc del anticuerpo para que comprenda al menos una de las siguientes sustituciones de aminoácidos: 236Y, 244L, 247A, 2470, 247E, 247G, 247N, 2470, 247R, 247S, 247VV, 248F, 248P, 2480, 248VV, 249E, 249L, 249M, 249N, 249P, 249Y, 250K, 250R, 251F, 251H, 2511, 251VV, 254A, 254F, 254K, 254L, 254M, 254R, 254Y, 255K, 256A, 256G, 2561, 256L, 256M, 256P, 2560, 256VV, 256Y, 260S, 2680, 2790, 279S, 279VV, 279Y, 280K, 280T, 283F, 283G, 283H, 2831, 283K, 283L, 283M, 283N, 283P, 283R, 283S, 283VV, 292L, 307A, 307M, 311F, 3111, 311K, 311L, 311M, 311T, 311V, 311VV, 311Y, 312P, 314F, 3141, 314V, 314VV, 314Y, 315F, 315K, 315L, 315P, 315R, 316K, 317P, 317T, 318N, 318T, 332A, 3320, 332E, 332F, 332G, 332H, 332L, 332M, 332N, 3320, 332S, 332T, 332V, 332VV, 332Y, 3390, 339F, 339G, 339H, 3391, 339K, 339N, 3390, 339R, 339S, 339T, 339VV, 339Y, 3410, 341E, 341F, 341H, 3411, 341K, 341L, 341M, 341N, 341P, 3410, 341R, 341S,
341T, 341V, 341VV, 341Y, 343A, 3430, 343E, 343G, 343H, 343K, 343L, 343M, 343N, 3430, 343R, 343S, 343T, 343VV, 343Y, 3730, 373E, 373F, 373H, 3731, 373K, 373L, 373M, 373N, 3730, 373R, 373T, 373V, 373VV, 375R, 376A, 376F, 376G, 376H, 376L, 376N, 376P, 3760, 376R, 376S, 376T, 376V, 377P, 379N, 3790, 379S, 379T, 380A, 380N, 380S, 380T, 3821, 382L, 3820, 382V, 386K, 4260, 426L, 429A, 429F, 429M, 430A, 4300, 430F, 430G, 430H, 4301, 430K, 430L, 430M, 430N, 430P, 430R, 430S, 430T, 430V, 430VV, 430Y, 431H, 431P, 432R, 432S, 434VV, 434Y, 438L, 438VV, 4400 o 440Y [preferiblemente 236Y, 248F, 248P, 2480, 248VV, 249E, 249L, 249M, 249N, 249Y, 250K, 250R, 251H, 251 1, 251VV, 254A, 254F, 254K, 254L, 254M, 254R, 254Y, 255K, 256A, 256G, 2561, 256L, 256M, 256P, 2560, 256VV, 260S, 280K, 283VV, 307M, 311 F, 3111, 311K, 311L, 311M, 311T, 311V, 311VV, 311Y, 3141, 314V, 314VV, 314Y, 315P, 317P, 3320, 332L, 332M, 332S, 332VV, 332Y, 3390, 339F, 3391, 339K, 339N, 339S, 339T, 339VV, 339Y, 3410, 341E, 341F, 341H, 3411, 341K, 341L, 341M, 341N, 341P, 3410, 341R, 341S, 341T, 341V, 341VV, 341Y, 3430, 343E, 343G, 343H, 343K, 343N, 3430, 343R, 343S, 343T, 343VV, 343Y, 3730, 373E, 373H, 3731, 373K, 373L, 3730, 373R, 373T, 373VV, 376A, 376G, 376N, 376P, 3760, 376R, 376S, 376T, 376V, 377P, 379N, 3790, 379T, 3821, 382L, 386K, 4260, 426L, 429F, 429M, 430A, 4300, 430F, 430G, 430H, 4301, 430K, 430L, 430M, 430N, 430P, 430R, 430S, 430T, 430V, 430VV, 430Y, 431 H, 431 P, 432R, 434Y, 438L o 440Y]. La molécula de ácido nucleico que codifica para una región Fc variante puede modificarse por ingeniería genética (por ejemplo, a partir de una molécula de ácido nucleico que codifica para una región Fc original o una región Fc nativa) para que comprenda al menos una sustitución de aminoácido enumerada anteriormente mientras que la molécula de ácido nucleico está operativamente unida a un ácido nucleico que codifica para un anticuerpo adicional, (por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico que codifica para el resto de la cadena pesada de Ig), o el método puede comprender además posteriormente unir operativamente el ácido nucleico que codifica para la región Fc variante tras la introducción de la al menos una sustitución de aminoácido enumerada anteriormente a un ácido nucleico que codifica para un anticuerpo adicional. El método puede comprender además la expresión y purificación del anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc variante. El método puede comprender además la expresión y purificación del anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc original. El método
puede comprender además medir la actividad de COC del anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc variante y del anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc original mediante cualquier método disponible en la técnica o tal como se describe en el presente documento. El método puede comprender además seleccionar un anticuerpo monoclonal que comprende una región Fc variante con actividad de COC mayor que la del anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc original (es decir, potenciada, preferiblemente en al menos el 5%, el 10%, el 12%, el 14%, el 16%, el 18%, el 20% o más). La descripción caracteriza además un anticuerpo monoclonal que comprende una región Fc variante producido mediante el método.
En otra realización la descripción proporciona un método para disminuir la respuesta de COC de un anticuerpo monoclonal, preferiblemente un anticuerpo monocional terapéutico, que comprende construir la región Fc del anticuerpo para que comprenda al menos una de las siguientes sustituciones de aminoácidos: 235G, 235S, 236R, 237E, 237K, 237N, 237R, 238A, 238E, 238G, 238H, 2381, 238L, 238V, 238W, 238Y, 245R, 247H, 2471, 247L, 247T, 247Y, 250M, 252Y, 2540, 254E, 2541, 254P, 254Q, 254T, 254V, 255N, 257A, 2571, 257M, 257N, 257S, 257V, 262L, 264S, 265H, 265Y, 267G, 267H, 2671, 267K, 268K, 269N, 269Q, 270G, 270M, 270N, 271T, 272H, 272L, 272N, 292A, 293S, 301W, 307E, 311 E, 311 S, 316F, 318P, 327T, 328V, 329Y, 330K, 330R, 332K, 339E, 339M, 3431, 373S, 3780, 3800, 3820, 382F, 382N, 382P, 382R, 382S, 382W, 382Y, 385E, 385P, 423N, 424H, 424M o 427N [preferiblemente 235G, 235S, 236R, 237E, 237K, 237N, 237R, 238A, 238E, 238G, 238H, 2381, 238L, 238V, 238W, 238Y, 245R, 2471, 247L, 247T, 250M, 257A, 2571, 257M, 262L, 264S, 267G, 267H, 2671, 267K, 268K, 269N, 269Q, 270G, 270M, 270N, 271T, 272H, 301W, 311S, 327T, 329Y, 330K, 330R, 3780, 385E, 423N o 424H). La molécula de ácido nucleico que codifica para una región Fc variante puede modificarse por ingeniería genética (por ejemplo, a partir de una molécula de ácido nucleico que codifica para una región Fc original o una región Fc nativa) para que comprenda al menos una sustitución de aminoácido enumerada anteriormente mientras que la molécula de ácido nucleico está operativa mente unida a un ácido nucleico que codifica para un anticuerpo adicional, (por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico que codifica para el resto de la cadena pesada de Ig), o el método puede comprender además posteriormente unir operativamente el ácido nucleico que codifica para la región Fc variante tras la introducción de la al menos una sustitución de aminoácido enumerada anteriormente a un ácido nucleico que codifica para un anticuerpo adicional. El método puede comprender además la expresión y purificación del anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc variante. El método puede comprender además la expresión y purificación del anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc original. El método puede comprender además medir la actividad de CDC del anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc variante y del anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc original mediante cualquier método disponible en la técnica o tal como se describe en el presente documento. El método puede comprender además seleccionar un anticuerpo monoclonal que comprende una región Fc variante con actividad de CDC menor que la del anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc original (es decir, disminuida, preferiblemente en al menos el 5%, el 10%, el 12%, el 14%, el 16%, el 18%, el 20% o más). La descripción caracteriza además un anticuerpo monoclonal que comprende una región Fc variante producida mediante el método.
En otra realización, la descripción proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para una región Fc variante de la invención o un fragmento funcional de la misma. Más preferiblemente, la molécula de ácido nucleico aislada comprende un ácido nucleico que codifica para un polipéptido que comprende una región Fc variante de la invención. Preferiblemente, el polipéptido de región Fc variante codificado por dicho ácido nucleico tiene una sustitución de aminoácido mostrada en la tabla 1 en comparación con la región Fc original de la variante. Preferiblemente, el polipéptido es un anticuerpo monoclonal, e incluso más preferiblemente, el anticuerpo monocional es un anticuerpo de longitud completa o un anticuerpo de cadena sencilla. El anticuerpo monoclonal puede ser un anticuerpo monoclonal quimérico, humanizado o humano.
En otra realización, la descripción proporciona un vector, preferiblemente (pero sin limitarse a) un plásmido, un vector de expresión recombinante, un vector de expresión de levaduras o un vector de expresión retroviral que comprende un poli
nucleótido que codifica para un pOllpéptido que comprende un pOllpéptldo de región Fc variante de la invención.
En otra realización, la descripción proporciona una célula huésped que compren
5 de una molécula de ácido nucleico de la presente invención. Preferiblemente, una célula huésped comprende uno o más vectores o constructos que comprenden una molécula de ácido nucleico de la presente invención. La célula huésped es una célula en la que se ha introducido un vector de la invención (por ejemplo, mediante transformación, transducción, infección, transfección, electroporación y si
lO milares), comprendiendo dicho vector un polinucleótido que codifica para un polipéptido que comprende un polipéptido de región Fc variante. Opcionalmente, el vector puede incorporarse de manera estable en el cromosoma de la célula huésped. Los tipos de célula huésped incluyen células de mamíferos, bacterianas, vegetales y de levaduras. Preferiblemente, la célula huésped es una célula CHO,
15 una célula COS, una célula SP2/0, una célula NSO, una célula de levaduras o un derivado o progenie de cualquier tipo de célula preferido.
En otra realización, la descripción proporciona una composición farmacéutica que comprende un polipéptido que comprende una región Fc variante, o fragmento 20 funcional de la misma. Preferiblemente, el polipéptido es un anticuerpo monoclonal, incluso más preferiblemente, un anticuerpo monoclonal terapéutico. El anticuerpo monoclonal puede ser un anticuerpo monoclonal quimérico, humanizado o humano. Alternativamente, el polipéptido puede ser un polipéptido distinto de un anticuerpo que se beneficia de una semivida sérica alterada conferida al polipép25 tido al unirse operativamente a, y expresarse conjuntamente con, una región Fc variante de la invención. La composición farmacéutica puede comprender además un vehículo farmacéuticamente aceptable. En dicha composición farmacéutica, el polipéptido que comprende la región Fc variante es el principio activo. Preferiblemente, la composición farmacéutica comprende una población homogénea o sus
30 tancialmente homogénea de anticuerpo monoclonal que comprende una región Fc variante de la invención. La composición farmacéutica para uso terapéutico es preferiblemente estéril y puede estar liofilizada.
La descripción proporciona un método de inhibición de la actividad de una proteína en un mamífero, preferiblemente un ser humano, que lo necesita que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz, o cantidad profilácticamente eficaz, de un polipéptido (preferiblemente un anticuerpo monoclonal) que comprende una región Fc variante de la invención a dicho mamífero. Preferiblemente, el polipéptido que comprende la región Fc variante es una pareja de unión de la proteína que va a inhibirse. Se proporciona además un método de tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno mejorado por la inhibición de la transducción de señales que resulta de la unión de un anticuerpo monoclonal que comprende una región Fc variante de la invención a su epítopo antigénico que comprende administrar a un paciente (por ejemplo, un ser humano) que necesita tal tratamiento o prevención una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de un anticuerpo monoclonal.
La descripción caracteriza un artículo de fabricación que comprende un material de envasado y un polipéptido que comprende un polipéptido de región Fc variante de la invención contenido dentro de dicho material de envasado. La descripción caracteriza además composiciones que comprenden anticuerpos monoclonales y polipéptidos heterólogos que comprenden una región Fc variante descrita en el presente documento, y un vehículo o diluyente fisiológica o farmacéuticamente aceptable.
En algunas realizaciones, la presente descripción proporciona un polipéptido que comprende: i) una región de entramado humana no modificada ("FR") (por ejemplo, no se ha hecho ninguna alteración en un entramado humano que se produce de manera natural), y ii) una región Fc variante. En determinadas realizaciones, el entramado humano no modificado es un entramado de línea germinal humana. En otras realizaciones, la presente descripción proporciona composiciones que comprenden un polipéptido, comprendiendo el polipéptido: i) al menos una secuencia de CDR aleatorizada y ii) una región Fc variante de la invención. En realizaciones adicionales, la presente descripción proporciona composiciones que comprenden un polipéptido, comprendiendo el polipéptido: i) un entramado humano no modificado (por ejemplo, entramado de línea germinal humana), ii) al menos una secuencia de CDR aleatorizada y iii) una región Fc variante.
La presente descripción contempla usos terapéuticos y de diagnóstico para polipéptidos heterólogos de anticuerpos monoclonales que comprenden una región Fc variante dada a conocer en el presente documento.
de las La figura 1 muestra una representación esquemática de una molécula de IgG con las diversas regiones y secciones marcadas.
La figura 2 muestra una alineación de diversas secuencias de aminoácidos de Fc originales, incluyendo IgG1 humana ((SEO ID NO: 1) con alotipos a y distinto de a mostrados), IgG2 humana (SEO ID NO: 2), IgG3 humana (SEO ID NO: 3), IgG4 humana (SEO ID NO: 4), IgG1 murina (SEO ID NO: 5), IgG2A murina (SEO ID NO: 6), IgG28 murina (SEO ID NO: 7) e IgG3 murina (SEO ID NO: 8).
La figura 3 muestra diversas secuencias de aminoácidos, incluyendo la región CH2 (SEO ID NO: 9) y la región CH3 (SEO ID NO: 10) de IgG1 humana, así como secuencias de un alotipo f (SEO ID NO: 11) y alotipo a, z (SEO ID NO: 12) de IgG1 humana que incluyen las regiones CH1, bisagra, CH2 y CH3.
La figura 4 muestra diversas secuencias de aminoácidos comprendidas dentro de:
(a) la región variable de cadena ligera (LCVR) de anticuerpo anti-C020 (1) (SEO ID NO: 13); (b) la región variable de cadena pesada (HCVR) de anticuerpo antiC020 (1) (SEO ID NO: 14); (c) LCVR de anticuerpo anti-C020 (11) (SEO ID NO: 15); Y HCVR de anticuerpo anti-C020 (11) (SEO ID NO: 16). La figura 4e muestra secuencias de aminoácidos comprendidas dentro de la región variable de un anticuerpo anti-C020. (Véanse la solicitud provisional estadounidense 60/471.958, presentada el 20 de mayo de 2003 y la patente estadounidense 5.843.439).
La figura 5a muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera completa para el anticuerpo anti-C020 AME 133. La figura 5b muestra la secuencia de ácido nucleico de la cadena ligera completa para AME 133.
La figura 6 muestra las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos para la cadena pesada completa de tres variantes preferidas del anticuerpo anti-CD20 AME
133. Específicamente, la figura 6a muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada completa de la variante 2471/339Q. La figura 6b muestra la secuencia de ácido nucleico de la cadena pesada completa de la variante 2471/339Q. La figura 6c muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada completa de la variante 2471/339D. La figura 6d muestra la secuencia de ácido nucleico de la cadena pesada completa de la variante 2471/339D. La figura 6e muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada completa de la variante 378D. La figura 6f muestra la secuencia de ácido nucleico de la cadena pesada completa de la variante 378D.
detallada A lo largo de toda la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones, la numeración de los residuos de aminoácido en una cadena pesada de inmunoglobulina (región Fc) es la del índice de EU como en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, sa ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Betesda, MD (1991). El "índice de EU como en Kabat" se refiere a la numeración de residuos del anticuerpo de IgG humana y se refleja en el presente documento en la figura 2. Por ejemplo, en la posición 438, IgG1 , IgG2, IgG3, IgG4 humanas e IgG3 murina tienen todas un aminoácido Q, mientras que IgG1 murina tiene un aminoácido 1, IgG2a murina tiene un aminoácido T e IgG2B murina tiene un aminoácido K. Además, se nombran sustituciones en el presente documento mediante el número de posición de aminoácido en el que se produce la sustitución seguido por el aminoácido que sustituye al presente en la región Fc original en la misma posición (por ejemplo, 249G indica un residuo de glicina que sustituye al presente en la posición 249 de la región Fc original). El número se refiere a la posición en IgG1 humana independientemente de si la región Fc original es o no IgG1 humana; si la región Fc original no es IgG1 humana, el número se refiere a la posición homóloga en la región Fc original si estuviese alineada con IgG1 humana en esa posición.
Tal como se usan en el presente documento, los términos "sujeto" y "paciente" se refieren a cualquier animal en el que puede usarse terapéuticamente un polipéptido que comprende una región Fc variante de la invención incluyendo un ser humano así como otros mamíferos (tales como por ejemplo animales domésticos (por ejemplo, caninos, felinos), animales para deportes (por ejemplo, equinos) y animales como fuente de alimentos (por ejemplo, bovinos, porcinos y ovinos» que
5 pueden beneficiarse de tal terapia.
Tal como se usa en el presente documento, "tratamiento o prevención" se refiere a una enfermedad o trastorno asociado con niveles anómalos de una proteína o que se ve beneficiado por la alteración de una actividad o un nivel de una proteí
10 na.
El término "aislado" cuando se usa en relación con un ácido nucleico es un ácido nucleico que se identifica y se separa de al menos un ácido nucleico contaminante con el que está habitualmente asociado en su fuente natural. Un ácido nucleico aislado está en una forma o entorno diferente del que se encuentra en la naturaleza. Por tanto, se distinguen moléculas de ácido nucleico aislado de la molécula de ácido nucleico tal como existe en células naturales. Una molécula de ácido nucleico aislado incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que expresan habitualmente el polipéptido codificado en las mismas en las que, por 20 ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en un plásmido o una ubicación cromosómica diferente de la de células naturales. El ácido nucleico aislado puede estar presente en forma monocatenaria o bicatenaria. Cuando va a utilizarse una molécula de ácido nucleico aislado para expresar una proteína, el oligonucleótido
o polinucleótido contendrá como mínimo la hebra sentido o codificante, pero pue
25 de contener las hebras tanto sentido como antisentido (es decir, puede ser bicatenaria).
Una molécula de ácido nucleico está "operativamente unida" u "operativamente acoplada" cuando está colocada en una relación funcional con otra molécula de 30 ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor o potenciador está operativamente unido a una secuencia codificante de ácido nucleico si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosomas está operativamente unido a una secuencia codificante de ácido nucleico si está situado de modo que facilita la traducción. Una molécula de ácido nucleico que codifica para una región Fc variante
está operativamente unida a una molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína heteróloga (es decir, una proteína o fragmento funcional de la misma que, tal como existe en la naturaleza, no comprende una región Fc) si está situada de manera que la proteína de fusión expresada comprende la proteína heteróloga o fragmento funcional de la misma unida o bien en sentido de 5' o bien en el sentido de 3' con respecto al polipéptido de región Fc variante; la proteína heteróloga puede estar inmediatamente adyacente al polipéptido de región Fc variante o puede estar separado de la misma por una secuencia de ligador de cualquier longitud y composición. Asimismo, una molécula de polipéptido (usado de manera sinónima en el presente documento con "proteína) está "operativamente" u "operativamente acoplada" cuando está colocada en una relación funcional con otro polipéptido.
Tal como se usa en el presente documento, el término "fragmento funcional" en referencia a un polipéptido o una proteína (por ejemplo, una región Fc variante, o un anticuerpo monoclonal) se refiere a fragmentos de esa proteína que conservan al menos una función del polipéptido de longitud completa. Los fragmentos pueden oscilar en tamaño entre seis aminoácidos y la secuencia de aminoácidos entera del polipéptido de longitud completa menos un aminoácido. Un fragmento funcional de un polipéptido de región Fc variante de la presente invención conserva al menos una "sustitución de aminoácido" tal como se define en el presente documento. Un fragmento funcional de un polipéptido de región Fc variante conserva al menos una función que se sabe en la técnica que está asociada con la región Fc (por ejemplo, ADCC, CDC, unión a receptor de Fc, unión a C1q, regulación por disminución de receptores de la superficie celular o puede, por ejemplo, aumentar la semivida in vivo o in vitre de un polipéptido al que está operativamente unido).
El término "purificado" o "purificar" se refiere a la eliminación sustancial de al menos un contaminante de una muestra. Por ejemplo, un anticuerpo específico de antígeno puede purificarse mediante la eliminación completa o sustancial (al menos el 90%, el 91 %, el 92%, el 93%, el 94%, el 95% o más, preferiblemente al menos el 96%, el 97%, el 98% o el 99%) de al menos una proteína distinta de inmunoglobulina contaminante; también puede purificarse mediante la eliminación de proteína de inmunoglobulina que no se une al mismo antígeno. La eliminación de proteínas distintas de inmunoglobulina y/o la eliminación de inmunoglobulinas que no se unen a un antígeno particular da como resultado un aumento en el porcentaje de inmunoglobulinas específicas de antígeno en la muestra. En otro ejemplo, un polipéptido (por ejemplo, una inmunoglobulina) expresado en células huésped bacterianas se purifica mediante la eliminación completa o sustancial de proteínas de células huésped; el porcentaje del polipéptido aumenta de ese modo en la muestra.
El término "nativo" cuando se refiere a un polipéptido (por ejemplo, región Fc) se usa en el presente documento para indicar que el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en la secuencia de aminoácidos del polipéptido tal como se produce comúnmente en la naturaleza o un polimorfismo del mismo que se produce de manera natural. Puede producirse un polipéptido nativo (por ejemplo, región Fc nativa) por medios recombinantes o puede aislarse de una fuente que se produce de manera natural.
El término "vector de expresión" tal como se usa en el presente documento se refiere a una molécula de ADN recombinante que contiene una secuencia codifican-te deseada y secuencias de ácido nucleico apropiadas necesarias para la expresión de la secuencia codificante operativamente unida en un organismo huésped particular.
Tal como se usa en el presente documento, el término "célula huésped" se refiere a cualquier célula eucariota o procariota (por ejemplo, células bacterianas tales como E. coli, células CHO, células de levaduras, células de mamífero, células de aves, células de anfibios, células vegetales, células de peces y células de insectos), ya estén ubicadas in vitro o in situ, o in vivo. Por ejemplo, las células huésped pueden estar ubicadas en un animal transgénico.
Tal como se usa en el presente documento, un "polipéptido original" es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que puede cambiarse o alterarse (por ejemplo, una sustitución de aminoácido) para producir una variante (es decir, polipéptido variante). En realizaciones preferidas, el polipéptido original comprende al menos una parte de una región Fc nativa o no nativa, es decir, una región Fc que se produce de manera natural o una región Fc con al menos una modificación en la secuencia de aminoácidos. En algunas realizaciones, se contemplan específicamente variantes que son más cortas o más largas que el polipéptido original. En realizaciones particularmente preferidas, el polipéptido original difiere en función (por ejemplo, función efectora potenciada o disminuida, unión a receptor, semivida in vivo o in vitro, etc.) en comparación con la variante.
Tal como se usa en el presente documento, el término "variante de un polipéptido original" se refiere a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la del polipéptido original en al menos una sustitución de aminoácido. En determinadas realizaciones, la variante comprende al menos el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85% o el 90% o lo más preferiblemente al menos el 95%, el 97% o el 99% de una región Fc (es decir, una "parte" de la región Fc). En realizaciones preferidas, una región Fc variante de un polipéptido original comprende al menos una sustitución de aminoácido con respecto al polipéptido original, siendo la sustitución en la región Fc. El polipéptido original puede ser o no un polipéptido nativo.
Tal como se usa en el presente documento, el término "región Fc" se refiere a una región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina (por ejemplo, tal como se muestra en la figura 1). La "región Fc" puede ser una región Fc de secuencia nativa o una región Fc variante. Aunque los límites generalmente aceptados de la región Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina pueden variar, la región Fc de cadena pesada de IgG humana se define habitualmente en un tramo de desde un residuo de aminoácido en la posición Cys226, o desde Pr0230, hasta el extremo carboxilo terminal de la misma. En algunas realizaciones, las variantes comprenden sólo porciones de la región Fc y pueden incluir o no el extremo carboxilo terminal. La región Fc de una inmunoglobulina comprende generalmente dos dominios constantes, CH2 y CH3, tal como se muestra, por ejemplo, en la figura 1. En algunas realizaciones, se contemplan variantes que tienen uno o más de los dominios constantes. En otras realizaciones, se contemplan variantes sin tales dominios constantes (o sólo con partes de tales dominios constantes).
El "dominio CH2" de una región Fc de IgG humana (también denominado dominio
"Cy2") se extiende habitualmente desde aproximadamente el aminoácido 231 has
ta aproximadamente el aminoácido 340 (véase la figura 2). El dominio CH2 es
único porque no está estrechamente apareado con otro dominio. Se interponen
5
dos cadenas de hidrato de carbono ramificadas unidas a N entre los dominios
CH2 de una molécula de IgG nativa intacta.
El "dominio CH3" de una región Fc de IgG humana (también denominado dominio
"Cy3") es generalmente el tramo de residuos C-terminales con respecto a un do
lO
minio CH2 en una región Fc que se extiende desde aproximadamente el residuo
de aminoácido 341 hasta aproximadamente el residuo de aminoácido 447 (véase
la figura 2).
Una "región Fc funcional" presenta una "función efectora" de una región Fc de se
15
cuencia nativa. Al menos una función efectora de un polipéptido que comprende
una región Fc variante de la presente invención puede potenciarse o disminuirse
con respecto a un polipéptido que comprende una región Fc nativa o la región Fc
original de la variante. Los ejemplos de funciones efectoras incluyen, pero no se
limitan a: unión a C1q; citotoxicidad dependiente del complemento (CDC); unión a
20
receptor de Fc; citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos
(ADCC); fagocitosis; regulación por disminución de receptores de la superficie ce
lular (por ejemplo, receptor de células B; BCR), etc. Tales funciones efectoras
pueden requerir que la región Fc esté operativamente unida a un dominio de
unión (por ejemplo, un dominio variable de anticuerpo) y pueden evaluarse usan
25
do diversos ensayos (por ejemplo, ensayo de unión a Fc, ensayos de ADCC, en
sayos de CDC, agotamiento de células diana a partir de muestras de sangre
completa o fraccionada, etc.).
Una "región Fc de secuencia nativa" o "región Fc de tipo natural" se refiere a una
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secuencia de aminoácidos que es idéntica a la secuencia de aminoácidos de una
región Fc comúnmente encontrada en la naturaleza. Se muestran regiones Fc
humanas de secuencia nativa a modo de ejemplo en la figura 2 e incluyen una re
gión Fc de IgG 1 humana de secuencia nativa (alotipos f y a,z, es decir, alotipos A
y distintos de A); una región Fc de IgG2 humana de secuencia nativa; una región
Fc de IgG3 humana de secuencia nativa; y una región Fc de IgG4 humana de secuencia nativa así como variantes de las mismas que se producen de manera natural. También se muestran en la figura 2 regiones Fc murinas de secuencia nativa.
Una "región Fc variante" comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la de una región Fc de secuencia nativa (o fragmento de la misma) en virtud de al menos una "sustitución de aminoácido" tal como se define en el presente documento. En realizaciones preferidas, la región Fe variante tiene al menos una sustitución de aminoácido en comparación con una región Fc de secuencia nativa o en la región Fc de un polipéptido original, preferiblemente 1, 2, 3, 4 ó 5 sustituciones de aminoácidos en una región Fc de secuencia nativa o en la región Fc del polipéptido original. En una realización alternativa, puede generarse una región Fc variante según los métodos en el presente documento dados a conocer y esta región Fc variante puede fusionarse con un polipéptido heterólogo de elección, tal como un dominio variable de anticuerpo o un polipéptido distinto de anticuerpo, por ejemplo, un dominio de unión de un receptor o ligando.
Tal como se usa en el presente documento, el término "derivado" en el contexto de polipéptidos se refiere a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que se ha alterado mediante la introducción de una sustitución de residuo de aminoácido. El término "derivado" tal como se usa en el presente documento también se refiere a un polipéptido que se ha modificado mediante la unión covalente de cualquier tipo de molécula al polipéptido. Por ejemplo, pero no a modo de limitación, un anticuerpo puede modificarse, por ejemplo, mediante glicosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización mediante grupos bloqueantes/protectores conocidos, escisión proteolítica, unión a ligando celular u otra proteína, etc. Puede producirse un polipéptido derivado mediante modificaciones químicas usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a escisión química específica, acetilación, formilación, síntesis metabólica de tunicamicina, etc. Además, un polipéptido derivado presenta una función similar o idéntica al polipéptido del que se derivó. Se entiende que un polipéptido que comprende una región Fc variante de la presente invención puede ser un derivado tal como se define en el presente documento, preferiblemente la derivatización se produce dentro de la región Fc.
"Sustancialmente de origen humano" tal como se usa en el presente documento en referencia a un polipéptido (por ejemplo, una región Fc o un anticuerpo monoclonal), indica que el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos al menos el 80%, al menos el 85%, más preferiblemente al menos el 90%, el 91 %, el 92%, el 93%, el 94% o incluso más preferiblemente al menos el 95%, el 95%, el 97%, el 98% o el 99% homóloga a la de un polipéptido de amino humano nativo.
Los términos "receptor de Fc" o "FcR" se usan para describir un receptor que se une a una región Fc (por ejemplo, la región Fc de un anticuerpo). El FcR preferido es un FcR de secuencia nativa. Además, un FcR preferido es uno que se une a un anticuerpo de IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FcyRII, FcyRIII, incluyendo variantes alélicas y formas cortadas y empalmadas de manera alternativa de estos receptores. Los receptores FcyRII incluyen FcyRIIA (un "receptor activante") y FcyRIIB (un "receptor inhibidor"), que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en los dominios citoplasmáticos de los mismos. Se revisan FcR en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991); Capel, et al., Immunomethods 4:25-34 (1 994); y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Otro FcR preferido incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de IgG maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) y Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1 994)). Otros FcR, incluyendo los que van a identificarse en el futuro, se abarcan por el término "FcR" en el presente documento.
La frase "citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos" y "ADCC" se refieren a una reacción mediada por células en la que células citotóxicas no específicas (por ejemplo, no específicas) que expresan FcR (por ejemplo, células cito líticas naturales ("Natural Killer" , "NK"), neutrófilos y macrófagos) reconocen anticuerpo unido sobre una célula diana y posteriormente provocan la lisis de las células diana. Las células primarias para mediar en la ADCC, las células NK, expresan FcyRIII sólo, mientras que los monocitos expresan FcyRI, FcyRII Y FcyRIII.
Tal como se usa en el presente documento, la frase "células efectoras" se refiere a leucocitos (preferiblemente humanos) que expresan uno o más FcR y realizan funciones efectoras. Preferiblemente, las células expresan al menos FcyRIII y realizan una función efectora de ADCC. Los ejemplos de leucocitos que median en la ADCC incluyen PBMC, células NK, monocitos, células T citotóxicas y neutrófilos. Las células efectoras pueden aislarse de una fuente nativa (por ejemplo, de sangre o PBMC).
Un polipéptido variante con afinidad de unión a FcRn "alterada" es uno que tiene afinidad de unión a FcRn o bien potenciada (es decir, aumentada, mayor o superior) o bien disminuida (es decir, reducida, disminuida o menor) en comparación con el polipéptido original variante o con un polipéptido que comprende una región Fc nativa cuando se mide a pH 6,0. Un polipéptido variante que presenta unión aumentada o afinidad de unión aumentada a un FcRn se une a FcRn con mayor afinidad que el polipéptido original. Un polipéptido variante que presenta unión disminuida o afinidad de unión disminuida a un FcRn se une a FcRn con afinidad inferior que su polipéptido original. Tales variantes que presentan unión disminuida a un FcRn pueden presentar poca o ninguna unión apreciable a un FcRn, por ejemplo, el 0-20% de unión al FcRn en comparación con un polipéptido original. Un polipéptido variante que se une a un FcRn con "afinidad potenciada" en comparación con su polipéptido original es uno que se une a FcRn con afinidad de unión superior que el polipéptido original, cuando las cantidades de polipéptido variante y polipéptido original en un ensayo de unión son esencialmente la mismas, y todas las otras condiciones son idénticas. Por ejemplo, un polipéptido variante con afinidad de unión a FcRn potenciada puede presentar un aumento de desde aproximadamente 1,10 veces hasta aproximadamente 100 veces (más normalmente desde aproximadamente 1,2 veces hasta aproximadamente 50 veces) en la afinidad de unión a FcRn en comparación con el polipéptido original, en el que la afinidad de unión a FcRn se determina, por ejemplo, en un ensayo ELISA u otro método disponible para un experto habitual en la técnica.
Tal como se usa en el presente documento, una "sustitución aminoácido" se refiere al reemplazo de al menos un residuo de aminoácido existente en una secuencia de aminoácidos dada por otro residuo de aminoácido de "reemplazo" diferente. El residuo o residuos de reemplazo pueden ser "residuos de aminoácido que se producen de manera natural" (es decir, codificados por el código genético) y seleccionados de: alanina (Ala); arginina (Arg); asparagina (Asn); ácido aspártico (Asp); cisteína (Cys); glutamina (Gln); ácido glutámico (Glu); glicina (Gly); histidina (His); isoleucina (lIe): leucina (Leu); lisina (Lys); metionina (Met); fenilalanina (Phe); prolina (Pro); serina (Ser); treonina (Thr); triptófano (Trp); tirosina (Tyr); y valina (Val). La sustitución por uno o más residuos de aminoácido que no se producen de manera natural también se abarca por la definición de una sustitución de aminoácido en el presente documento. Un "residuo de aminoácido que no se produce de manera natural" se refiere a un residuo, distinto de los residuos de aminoácido que se producen de manera natural enumerados anteriormente, que puede unirse covalentemente a residuo(s) de aminoácido adyacente(s) en una cadena de polipéptido. Los ejemplos de residuos de aminoácido que no se producen de manera natural incluyen norleucina, ornitina, norvalina, homoserina y otros análogos de residuos de aminoácido tales como los descritos en Ellman et al. Met. Enzym. 202: 301-336 (1991).
El término "señal de ensayo" se refiere a la salida de cualquier método de detección de interacciones proteína-proteína, incluyendo pero sin limitarse a, mediciones de absorbancia a partir de ensayos colorimétricos, intensidad fluorescente o desintegraciones por minuto. Los formatos de ensayo podrían incluir ELlSA, FACS u otros métodos. Un cambio en la "señal de ensayo" puede reflejar un cambio en la viabilidad celular y/o un cambio en la velocidad de disociación cinética, la velocidad de asociación cinética o ambas. Una "señal de ensayo superior" se refiere a que el número de salida medido es más grande que otro número (por ejemplo, una variante puede tener un número medido superior (más grande) en un ensayo ELlSA en comparación con el polipéptido original). Una señal de ensayo "inferior" se refiere a que el número de salida medido es más pequeño que otro número (por ejemplo, una variante puede tener un número medido inferior (más pequeño) en un ensayo ELlSA en comparación con el polipéptido original).
El término "afinidad de unión" se refiere a la constante de disociación en equilibrio (expresada en unidades de concentración) asociada con cada interacción de unión Fc-receptor de Fc. La afinidad de unión está directamente relacionada con la razón de la velocidad de disociación cinética (notificada generalmente en unidades de inversa del tiempo, por ejemplo, segundos·1) dividida entre la velocidad de asociación cinética (notificada generalmente en unidades de concentración por unidad de tiempo, por ejemplo, molar/segundo). En general, no es posible establecer de manera inequívoca si los cambios en las constantes de disociación en equilibrio se deben a diferencias en las velocidades de asociación, las velocidades de disociación o ambas a menos que cada uno de estos parámetros se determine experimentalmente (por ejemplo, mediante mediciones de BIACORE o SAPIOYNE).
Tal como se usa en el presente documento, el término "región bisagra" se refiere al tramo de aminoácidos en IgG 1 humana que se extiende desde Glu216 hasta Pr0230 de IgG1 humana. Pueden alinearse regiones bisagra de otros isotipos de IgG con la secuencia de IgG1 colocando los residuos de cisteína primero y último que forman los enlaces S-S entre cadenas pesadas en las mismas posiciones.
"C1q" es un polipéptido que incluye un sitio de unión para la región Fc de una inmunoglobulina. C1q junto con dos serina proteasas, C1r y C1s, forma el complejo C1 , el primer componente de la ruta de COCo
Tal como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo" se usa de manera intercambiable con "inmunoglobulina" o "Ig", se usa en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monocionales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo siempre que presenten la actividad funcional o actividad biológica deseada. Anticuerpos de cadena sencilla, y anticuerpos quiméricos, humanos, humanizados o primatizados (injertados con COR), así como anticuerpos de cadena sencilla quiméricos o injertados con COR, y similares, que comprenden partes derivadas de diferentes especies, también se abarcan por la presente invención y el término "anticuerpo". Las diversas partes de estos anticuerpos pueden unirse entre sí químicamente mediante técnicas convencionales, de manera sintética o pueden prepararse como una proteína contigua usando técnicas de ingeniería genética.
Por ejemplo, pueden expresarse ácidos nucleicos que codifican para una cadena quimérica o humanizada para producir una proteína contigua. Véanse, por ejemplo, la patente estadounidense n.o 4.816.567; la patente europea n.o 0.125.023 81; la patente estadounidense n.o 4.816.397; la patente europea n.o 0.120.694 81 ; el documento WO 86/01533; la patente europea n.o 0.194.276 81; la patente estadounidense n.o 5.225.539; la patente europea n.o 0.239.400 81 Y las patentes estadounidenses n.os 5.585.089 y 5.698.762. Véanse también Newman, R. et al. 8ioTechnology, 10: 1455-1460, 1993, con respecto a anticuerpo primatizado, y ladner et al., patente estadounidense n.o 4.946.778 y 8ird, R.E. et al., Science, 242:423-426, 1988, con respecto a anticuerpos de cadena sencilla. Se entiende que todas las formas de los anticuerpos que comprenden una región Fc (o parte de la misma) se abarcan en el presente documento dentro del término "anticuerpo". Además, el anticuerpo puede marcarse con un marcador detectable, inmovilizarse sobre una fase sólida y/o conjugarse con un compuesto heterólogo (por ejemplo, una enzima o toxina) según métodos conocidos en la técnica.
Tal como se usa en el presente documento, el término "fragmentos de anticuerpo" se refiere a una parte de un anticuerpo intacto. los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de cadena sencilla; péptidos de Fc o Fc', Fab y fragmentos de Fab, y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo. los fragmentos de anticuerpo conservan preferiblemente al menos parte de la bisagra y opcionalmente la región CH1 de una cadena pesada de IgG. En otras realizaciones preferidas, los fragmentos de anticuerpo comprenden al menos una parte de la región CH2 o toda la región CH2.
Tal como se usa en el presente documento, el término "fragmento funcional", cuando se usa en referencia a un anticuerpo monoclonal, pretende referirse a una parte del anticuerpo monoclonal que todavía conserva una actividad funcional. Una actividad funcional puede ser, por ejemplo, especificidad o actividad de unión a antígeno, especificidad o actividad de unión a receptor, actividad de función efectora y similares. los fragmentos funcionales de anticuerpos monoclonales incluyen, por ejemplo, cadenas pesadas o ligeras individuales y fragmentos de las mismas, tales como Vl, VH y Fd; fragmentos monovalentes, tales como Fv, Fab, y Fab'; fragmentos bivalentes tales como F(ab')2; Fv de cadena sencilla (scFv); y fragmentos de Fc. Tales términos se describen en, por ejemplo, Harlowe y lane, Antibodies: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, Nueva York (1989); Molec. Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference (Myers, R.A. (ed.), Nueva York: VCH Publisher, Inc.); Huston et al., Cell Biophysics, 22:189-224 (1993); Pluckthun y Skerra, Met. Enzymol., 178:497-515 (1989) yen Day, E.D., Advanced Immunochemistry, segunda ed., Wiley-Liss, Inc., Nueva York, NY (1990). El término fragmento funcional pretende incluir, por ejemplo, fragmentos producidos mediante digestión con proteasas o reducción de un anticuerpo monoclonal y mediante métodos de ADN recombinante conocidos por los expertos en la técnica.
Tal como se usa en el presente documento, el término "fragmento" se refiere a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de al menos 5, 15, 20, 25, 40, 50, 70, 90, 100 o más residuos de aminoácido contiguos de la secuencia de aminoácidos de otro polipéptido. En una realización preferida, un fragmento de un polipéptido conserva al menos una función del polipéptido de longitud completa.
Tal como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo quimérico" incluye inmunoglobulinas monovalentes, divalentes o polivalentes. Un anticuerpo quimérico monovalente es un dímero formado por una cadena pesada quimérica asociada a través de puentes disulfuro con una cadena ligera quimérica. Un anticuerpo quimérico divalente es un tetrámero formado por dos dímeros de cadena pesada-cadena ligera asociados a través de al menos un puente disulfuro. Una cadena pesada quimérica de un anticuerpo para su uso en seres humanos comprende una región de unión a antígeno derivada de la cadena pesada de un anticuerpo no humano, que se une a al menos una parte de una región constante de cadena pesada humana, tal como CH1 o CH2. Una cadena ligera quimérica de un anticuerpo para su uso en seres humanos comprende una región de unión a antígeno derivada de la cadena ligera de un anticuerpo no humano, unida a al menos una parte de una región constante de cadena ligera humana (Cl). También pueden prepararse anticuerpos, fragmentos o derivados que tienen cadenas ligeras y cadenas pesadas quiméricas de la misma especificidad de unión de región variable o diferente mediante la asociación apropiada de las cadenas polipeptídicas individuales, según etapas de método conocidas. Con este enfoque, se cultivan por separado huéspedes que expresan cadenas pesadas quiméricas de huéspedes que expresan cadenas ligeras quiméricas, y se recuperan por separado las cadenas de inmunoglobulina y entonces se asocian. Alternativamente, los huéspedes pueden cultivarse conjuntamente y se deja que las cadenas se asocien espontáneamente en el medio de cultivo, seguido por la recuperación del fragmento o inmunoglobulina ensamblada o tanto las cadenas tanto pesadas como ligeras pueden expresarse en la misma célula huésped. Se conocen en la técnica métodos para producir anticuerpos quiméricos (véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os: 6.284.471; 5.807.715; 4.816.567; Y 4.81 6.397).
Tal como se usa en el presente documento, formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) (es decir, anticuerpos humanizados) son anticuerpos que contienen una secuencia mínima, o ninguna secuencia, derivada de inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que se reemplazan residuos de una región hipervariable del receptor por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, se reemplazan residuos de la región de entramado (FR) de la inmunoglobulina humana por residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donador. Estas modificaciones se hacen generalmente para refinar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables (CDR) corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todos o sustancialmente todos los residuos de FR son los de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también puede comprender al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), normalmente la de una inmunoglobulina humana. Se describe un método a modo de ejemplo para generar anticuerpos humanizados en la patente estadounidense 5.225.539.
Tal como se usa en el presente documento, el término "inmunoadhesina" designa moléculas similares a anticuerpos que combinan el dominio de unión de una proteína "adhesina" heteróloga (por ejemplo, un receptor, un ligando o una enzima) con un dominio constante de inmunoglobulina. Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden una fusión de la secuencia de aminoácidos de la adhesina con la especificidad de unión deseada que es distinta del sitio de unión a y reconocimiento de antígeno (sitio de combinación de antígeno) de un anticuerpo (es decir, es "heteróloga") con una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina.
Tal como se usa el presente documento, el término "dominio de unión a ligando" se refiere a cualquier receptor nativo o cualquier región o derivado de la misma que conserva al menos una capacidad de unión a ligando cualitativa de un receptor nativo correspondiente. En determinadas realizaciones, el receptor es de un polipéptido de la superficie celular que tiene un dominio extracelular que es homólogo a un miembro de la superfamilia génica de inmunoglobulinas. Otros receptores, que no son miembros de la superfamilia génica de inmunoglobulinas pero que no obstante se cubren específicamente por esta definición son receptores para citocinas, y en particular receptores con actividad tirosina cinasa (tirosina cinasas receptoras), miembros de las superfamilias de hematopoyetina y receptor de factor de crecimiento nervioso y moléculas de adhesión celular (por ejemplo, E-, L-Y P-selectinas).
Tal como se usa en el presente documento, el término "dominio de unión a receptor" se refiere a cualquier ligando nativo para un receptor, incluyendo, por ejemplo, moléculas de adhesión celular, o cualquier región o derivado de tal ligando nativo que conserva al menos una capacidad de unión a receptor cualitativa de un ligando nativo correspondiente.
Tal como se usa en el presente documento, el término "quimera de anticuerpoinmunoadhesina" comprende una molécula que combina al menos un dominio de unión de un anticuerpo con al menos una inmunoadhesina. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, las quimeras de CD4-lgG biespecíficas descritas en
Berg et al., PNAS (USA) 88:4723-4727 (1991) y Charnow et al., J. Immunol., 153: 4268 (1994).
Tal como se usa en el presente documento, un polipéptido "aislado" es uno que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que interferirían con usos terapéuticos o de diagnóstico para el polipéptido, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteínicos o no proteínicos. En determinadas realizaciones, el polipéptido aislado se purifica (1) hasta más del 95% en peso de polipéptidos tal como se determina mediante el método de Lowry, y preferiblemente, más del 99% en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de copa giratoria, o (3) hasta la homogeneidad mediante SOS-page en condiciones reductoras o no reductoras usando azul de Coomassie
o tinción de plata. El polipéptido aislado incluye el polipéptido in situ dentro de células recombinantes puesto que al menos un componente del entorno natural del polipéptido no estará presente. Sin embargo, habitualmente, el polipéptido aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación.
Tal como se usa en el presente documento, el término "tratamiento" se refiere tanto a tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas. Los sujetos o pacientes que necesitan tratamiento incluyen los que ya tienen el trastorno así como aquellos en los que va a prevenirse el trastorno.
Tal como se usa en el presente documento, el término "trastorno" y "enfermedad" se usan de manera intercambiable para referirse a cualquier estado que se beneficiaría del tratamiento con un polipéptido variante (un polipéptido que comprende una región Fc variante de la invención), incluyendo enfermedades o trastornos agudos y crónicos (por ejemplo, estados patológicos que predisponen a un paciente a un trastorno particular). En determinadas realizaciones, el trastorno es cáncer. En determinadas realizaciones, el término "enfermedad autoinmunitaria" se usa de manera intercambiable con el término "trastorno autoinmunitario" para referirse a un estado en un sujeto caracterizado por lesión celular, tisular y/u orgánica provocada por una reacción inmunológica del sujeto frente a sus propias células, tejidos y/u órganos. El término "enfermedad inflamatoria" se usa de manera intercambiable con el término "trastorno inflamatorio" para referirse a un estado en un sujeto caracterizado por inflamación. Los trastornos autoinmunitarios pueden estar asociados o no con inflamación. Además, la inflamación puede estar provocada o no por un trastorno autoinmunitario. Determinados trastornos pueden caracterizarse como trastornos tanto autoinmunitarios como inflamatorios.
Tal como se usan en el presente documento, los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a, o describen el estado fisiológico en mamíferos que se caracteriza normalmente por crecimiento celular no regulado. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Ejemplos más particulares de tales cánceres incluyen cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma del pulmón, carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándulas salivales, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y diversos tipos de cáncer de cabeza y cuello. Tal como se usa en el presente documento, el término "marcador" se refiere a un compuesto o composición detectable que se conjuga directa o indirectamente con un polipéptido. El marcador puede ser por sí mismo detectable (por ejemplo, marcadores de radioisótopos o marcadores fluorescentes) o, en el caso de un marcador enzimático, puede catalizar la alteración química de un compuesto o composición sustrato que es detectable.
Tal como se usa en el presente documento, el término "receptor" se refiere a un polipéptido que puede unirse a al menos un ligando. El receptor preferido es un receptor soluble o de la superficie celular que tiene un dominio de unión a ligando extracelular y, opcionalmente, otros dominios (por ejemplo, dominio transmembrana, dominio intracelular y/o anclaje a membrana). Un receptor que va a evaluarse en un ensayo descrito en el presente documento puede ser un receptor intacto o un fragmento o derivado del mismo (por ejemplo una proteína de fusión que comprende el dominio de unión del receptor fusionado a uno o más polipéptidos heterólogos). Además, el receptor que va a evaluarse para determinar sus propiedades de unión puede estar presente en una célula o aislado y opcionalmente recubierto sobre una placa de ensayo o alguna otra fase sólida o puede marcarse directamente y usarse como sonda.
Tal como se usa en el presente documento, el término "enfermedad sensible a anticuerpos" se refiere a cualquier enfermedad o estado médico que se muestra que puede tratarse, al menos en parte, con terapia con anticuerpos. Los ejemplos de tales enfermedades y estados médicos incluyen, pero no se limitan a, linfoma (que se muestra que puede tratarse con RITUXAN), enfermedad infecciosa (virus sincitial respiratorio que se muestra que puede tratarse con SYNAGIS), trasplante de riñón (ZENAPAX ha mostrado ser útil), enfermedad de Crohn y artritis reumatoide (que se muestra que pueden tratarse con REMICADE), carcinoma de mama (que se muestra que puede tratarse con HERCEPTIN) y cáncer de colon (que se muestra que puede tratarse con EDRECOLOMAB). Tal como se usa en el presente documento, el término "enfermedad sensible a inmunoadhesinas" se refiere a cualquier enfermedad o estado médico que se muestra que puede tratarse, al menos en parte, con terapia con inmunoadhesinas.
Tal como se usa en el presente documento, un polipéptido variante que "media en la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) en presencia de células efectoras humanas más eficazmente" que un anticuerpo original es uno que in vitre o in vivo es sustancialmente más eficaz en la mediación de la ADCC, cuando las cantidades de polipéptido variante y anticuerpo original usadas en el ensayo son esencialmente las mismas. Por ejemplo, una variante de este tipo provoca una cantidad superior de lisis de células diana en un ensayo de ADCC dado que el polipéptido original en un ensayo de ADCC idéntico. Tales variantes pueden identificarse, por ejemplo, usando un ensayo de ADCC, pero pueden emplearse también otros ensayos o métodos para determinar la actividad de ADCC (por ejemplo, modelos animales). En realizaciones preferidas, el polipéptido variante es desde aproximadamente 1,2, 1,3 ó 1,4 veces, 1,5 veces, 50 veces, 100 veces, aproximadamente 500 veces o aproximadamente 1000 veces más eficaz en la mediación de la ADCC el polipéptido original.
El término "síntomas de una enfermedad sensible a anticuerpos o inmunoadhesinas" se refiere a los síntomas generalmente asociados con una enfermedad particular. Por ejemplo, los síntomas normalmente asociados con la enfermedad de Crohn incluyen: dolor abdominal, diarrea, hemorragia rectal, pérdida de peso, fiebre, pérdida de apetito, deshidratación, anemia, distensión, fibrosis, intestinos inflamados y malnutrición. La frase "en condiciones tales que los síntomas se reducen" se refiere a cualquier grado de reducción cualitativa o cuantitativa en síntomas detectables de cualquier enfermedad sensible a anticuerpos o inmunoadhesinas, incluyendo pero sin limitarse a, un impacto detectable en la tasa de recuperación de la enfermedad (por ejemplo, tasa de ganancia de peso), o la reducción de al menos uno de los síntomas normalmente asociados con la enfermedad particular (por ejemplo, si la enfermedad sensible a anticuerpos o inmunoadhesinas era enfermedad de Crohn, una reducción en al menos uno de los siguientes síntomas: dolor abdominal, diarrea, hemorragia rectal, pérdida de peso, fiebre, pérdida de apetito, deshidratación, anemia, distensión, fibrosis, intestinos inflamados y malnutrición).
Un anticuerpo de longitud completa ("inmunoglobulina" o "Ig") tal como existe de manera natural es una molécula de inmunoglobulina compuesta por cuatro cadenas peptídicas, dos cadenas pesadas (H) (de aproximadamente 50-70 kOa cuando son de longitud completa) y dos cadenas ligeras (L) (de aproximadamente 25 kOa cuando son de longitud completa) interconectadas por puentes disulfuro. La parte amino-terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100-110 o más aminoácidos responsable principalmente del reconocimiento del antígeno. La parte carboxilo terminal de cada cadena define una región constante responsable principalmente de una función efectora.
Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda y se caracterizan por una región constante particular. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgG, IgM, IgA, IgO e IgE, respectivamente. Cada tipo de cadena pesada se caracteriza por una región constante particular.
Cada cadena pesada está compuesta por una región variable de cadena pesada (en el presente documento "HCVR") y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada está compuesta por tres dominios (CH1, CH2, y CH3) para IgG, IgO e IgA; y 4 dominios (CH1, CH2, CH3 y CH4) para IgM e IgE. Cada cadena ligera está compuesta por una región variable de cadena ligera (en el presente documento "LCVR") y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera está compuesta por un dominio, CL. Las regiones HCVR y LCVR pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (COR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones de entramado (FR). Cada HCVR y LCVR está compuesta por tres COR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino-terminal hasta el extremo carboxilo-terminal en el siguiente orden: FR1 , COR1 , FR2, COR2, FR3, COR3, FR4. La asignación de aminoácidos a cada dominio es según convenciones bien conocidas [por ejemplo, Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological lnterest", National Institutes of Health, Betesda, Md. (1991 )]. La capacidad funcional de un anticuerpo para unirse a un antígeno particular está determinada colectivamente por las seis COR. Sin embargo, incluso un único dominio variable que comprende sólo tres COR específicas para un antígeno puede tener la capacidad para reconocer y unirse al antígeno, aunque a una afinidad inferior que un Fab completo.
Pueden producirse anticuerpos monoclonales usando por ejemplo técnicas de hibridoma bien conocidas en la técnica, así como tecnologías recombinantes, tecnologías de presentación en fago, tecnologías sintéticas o combinaciones de tales tecnologías fácilmente conocidas en la técnica. El término "anticuerpo monoclonal" tal como se usa en el presente documento no se limita a anticuerpos producidos a través de la tecnología de hibridoma. "Anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo que se deriva de una única copia o clon, incluyendo por ejemplo, cualquier clon eucariota, procariota o de fago, y no al método mediante el que se produce. Un "anticuerpo monoclonal" puede ser un anticuerpo intacto (completo o de longitud completa), un anticuerpo sustancialmente intacto, un fragmento funcional de un anticuerpo o puede ser un anticuerpo quimérico, anticuerpo humano
o anticuerpo humanizado.
Una población de "anticuerpos monoclonales" se refiere a una población de anticuerpos homogénea o sustancialmente homogénea (o pura) (es decir, al menos aproximadamente el 90%, el 91 %, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, más preferiblemente al menos aproximadamente el 97% o el 98% o lo más preferiblemente al menos el 99% de los anticuerpos en la población son idénticos y competirían en un ensayo ELlSA por el mismo antígeno o epítopo).
El término "se une específicamente" o "se une preferentemente" tal como se usa en el presente documento se refiere a la situación en la que un miembro de un par de unión específica no se une significativamente a moléculas distintas de su(s) pareja(s) de unión específica. El término también puede aplicarse cuando, por ejemplo, un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo de la invención es específico para un epítopo particular que portan varios antígenos, en cuyo caso el anticuerpo específico que porta el dominio de unión a antígeno podrá unirse a los diversos antígenos que portan el epítopo.
La región Fc se refiere la parte de un anticuerpo intacto, por ejemplo, IgG, generada por digestión con la enzima papaína (véase la figura 1). La región Fc es un homodímero, estando compuesta cada cadena por una parte de la región bisagra así como los dominios CH2 y CH3. La región Fc es un dímero debido a los puentes disulfuro intercatenarios formados entre las regiones bisagra y múltiples enlaces no covalentes entre los dominios CH3. IgG es la clase más abundante de Ig en el cuerpo, constituyendo aproximadamente el 75% de la inmunoglobulina total y distribuida equitativamente dentro de los conjuntos intravascular y extravascular. Se produce muy poca IgG durante las fases tempranas de la respuesta primaria a un antígeno pero es la forma principal de anticuerpo producido durante la respuesta secundaria.
Tal como se describió anteriormente, los anticuerpos tienen regiones, principalmente las regiones CH2 y CH3, que participan en funciones distintas de la unión al antígeno. Conjuntamente, estas regiones y una parte de la secuencia de ligador se conocen generalmente como la región Fc, y tienen varias funciones efectoras mediadas por la unión de moléculas efectoras.
Las funciones efectoras mediadas por la región Fc del anticuerpo pueden dividirse en dos categorías: (1) funciones efectoras que funcionan tras la unión del anticuerpo a un antígeno (estas funciones implican, por ejemplo, la participación de la cascada del complemento o células que llevan receptor de Fc (FcR»; y (2) funciones efectoras que funcionan independientemente de la unión al antígeno (estas funciones confieren, por ejemplo, persistencia en la circulación y la capacidad para transferirse a través de barreras celulares mediante transcitosis). Por ejemplo, la unión del componente C1q del complemento a anticuerpos activa el sistema del complemento. Tras la opsonización, la activación del complemento es importante en la lisis de patógenos celulares. La activación del complemento también estimula la respuesta inflamatoria y también puede participar en la hipersensibilidad autoinmunitaria. Además, los anticuerpos se unen a células mediante la región Fc, con un sitio de unión a receptor de Fc en la región Fc del anticuerpo que se une a un FcR sobre una célula. Hay varios FcR que son específicos para diferentes cIases de anticuerpo, incluyendo IgG, IgE, IgA e IgM. Aunque la presente invención no se limita a ningún mecanismo particular, la unión del anticuerpo a FcR sobre una superficie celular desencadena varias respuestas biológicas importantes y diversas incluyendo absorción y destrucción de partículas recubiertas con anticuerpos, aclaramiento de complejos inmunitarios, lisis de células diana recubiertas con anticuerpos por células citolíticas (ADCC), liberación de mediadores inflamatorios, transferencia placentaria y control de la producción de inmunoglobulinas.
Varias funciones efectoras de anticuerpos están mediadas por FcR, que se unen a la región Fc de un anticuerpo. Los FcR se definen por su especificidad por isotipos de inmunoglobulinas; los receptores de Fc para anticuerpos de IgG se denominan FcyR, para IgE FCER, para IgA FcaR y así sucesivamente. Se han identificado tres subclases de FcyR: FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) Y FcyRlI1 (CD16).
Debido a que cada subclase de FcyR se codifica por dos o tres genes, y el corte y empalme alternativo del ARN conduce a múltiples transcritos, existe una amplia diversidad de isoformas de FcyR. Los tres genes que codifican para la subclase FcyRI (FcyRIA, FcyRIB Y FcyRIC) están agrupados en la región I q21.1 del brazo largo del cromosoma 1; los genes que codifican para las isoformas de FcyRII (FcyRIIA, FcyRIIB Y FcyRIIC) y los dos genes que codifican para FcyRIII (FcyRIIIA Y FcyRIIIB) están agrupados todos en la región 1 q22. Estos diferentes subtipos de FcR se expresan en diferentes tipos de células (por ejemplo, Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-492 (1991)). Por ejemplo, en seres humanos, FcyRIIIB se encuentra sólo en neutrófilos, mientras que FcyRIIIA se encuentra en macrófagos, monocitos, células NK y una subpoblación de células T. De manera notable, FcyRIIIA está presente en células NK, uno de los tipos de células implicadas en la ADCC.
El receptor FcyRIIIA humano (CD16) tiene un polimorfismo común en la posición 158 en su dominio extracelular que codifica para o bien una fenilalanina o bien una valina en esta posición. El alelo V de FcyRIIIA tiene afinidad superior por IgG1 humana que el alelo F. El alelo V1 58 también media en la ADCC más eficazmente. Datos clínicos han mostrado una correlación entre el genotipo de receptor FcyRlIlA en pacientes que se someten a tratamiento con Rituxan y la respuesta terapéutica. Se mostró que tanto las respuestas clínicas y moleculares como el tiempo hasta la progresión eran superiores en pacientes homocigotos para el genotipo FcyRIIIA-158V (aproximadamente el 20% de la población). En contraposición, pacientes heterocigotos u homocigotos para el genotipo FcyRIIIA-158F de afinidad inferior (aproximadamente el 80% de la población) responden peor. Estos datos sugieren que mutaciones de Fc que potencian la actividad de ADCC de los portadores de 158F podrían potenciar la eficacia clínica de la terapia del cáncer a base de anticuerpos. También está presente un polimorfismo genético en el receptor FcyRllA humano (CD32) en la posición 131 en su dominio extracelular que codifica para o bien una histidina (H) o bien una arginina (R) en esta posición. Se ha encontrado que el polimorfismo en la posición 131 afecta a su capacidad para unirse a IgG humana. Datos recientes también muestran una correlación entre el polimorfismo en la posición 131 de FcyRIIA y la respuesta clínica a Rituxan. Pacientes homocigotos para el alelo H131 tenían una tasa de respuesta significativamente superior que los otros 2 grupos.
FcyRI, FcyRII Y FcyRIII son receptores de la superfamilia de inmunoglobulinas (lgSF); FcyRI tiene tres dominios IgSF en su dominio extracelular, mientras que FcyRII y FcyRl1I tienen sólo dos dominios IgSF en sus dominios extracelulares. Otro tipo de receptor de Fc es el receptor de Fc neonatal (FcRn). FcRn es estructuralmente similar al complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) y consiste en una cadena a unida no covalentemente a (32-microglobulina.
Fc variantes La presente invención proporciona polipéptidos variantes, secuencias de ácido nucleico que codifican para los polipéptidos variantes y métodos para generar polipéptidos variantes. Preferiblemente, los polipéptidos variantes de la presente invención difieren de un polipéptido original por al menos una modificación de aminoácido, preferiblemente una sustitución de aminoácido. Un polipéptido "original", "de tipo natural", "de partida" o "no variante" comprende preferiblemente al menos una parte de una región Fc de anticuerpo y la sustitución de aminoácido en el polipéptido variante se produce dentro de la región Fc. Un polipéptido original que comprende una región Fc puede prepararse usando técnicas disponibles en la técnica para generar polipéptidos que comprenden una región Fc o parte de la misma. En realizaciones preferidas, el polipéptido original es un anticuerpo. Sin embargo, el polipéptido original puede ser cualquier otro polipéptido que comprenda al menos una parte de una región Fc (por ejemplo, una inmunoadhesina). La parte de la región Fc en el polipéptido original puede ser de una secuencia nativa o no nativa, preferiblemente es una secuencia nativa de origen humano. En determinadas realizaciones, puede generarse una región Fc variante (por ejemplo, según los métodos dados a conocer en el presente documento) y puede fusionarse a un polipéptido heterólogo de elección, tal como un dominio variable de anticuerpo o dominio de unión de un receptor o ligando, o cualquier polipéptido terapéutico.
En realizaciones preferidas, el polipéptido original comprende una región Fc o parte funcional de la misma. Generalmente, la región Fc del polipéptido original comprenderá una región Fc de secuencia nativa, y preferiblemente una región Fc de secuencia nativa humana. Sin embargo, la región Fc del polipéptido original puede tener una o más alteraciones o modificaciones en la secuencia de aminoácidos preexistente (por ejemplo, una sustitución de aminoácido) con respecto a una región Fc de secuencia nativa. Por ejemplo, la actividad de unión a C1q de la región Fc puede haberse alterado previamente o la afinidad de unión a FcyR de la región Fc puede haberse alterado. La región Fc variante deseada o el ácido nucleico que codifica para la región Fc variante de interés puede construirse mientras que no está operativamente unida a la pareja de fusión deseada de la región Fc variante, (por ejemplo, una región variable de anticuerpo, una proteína heteróloga) y luego modificarse por ingeniería genética posteriormente para que esté operativamente unida a la misma. En realizaciones adicionales, la región Fc del polipéptido original es conceptual (por ejemplo, ideada o una representación visual en un ordenador o en papel) y, aunque no existe físicamente, el ingeniero de anticuerpos puede decidir sobre una secuencia de aminoácidos de la región Fc variante y generar un polipéptido que comprende esa secuencia o un ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos de la región Fc variante deseada. Sin embargo, en realizaciones preferidas, está disponible un ácido nucleico que codifica para una región Fc de un polipéptido original y esta secuencia de ácido nucleico se altera para generar una secuencia de ácido nucleico variante que codifica para la región Fc variante.
Puede prepararse ácido nucleico que codifica para una variante del polipéptido original (o simplemente una región Fc variante) mediante métodos conocidos en la técnica usando la orientación de la presente memoria descriptiva para secuencias particulares. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a, la preparación mediante mutagénesis dirigida al sitio (o mediada por oligonucleótidos), mutagénesis por PCR (por ejemplo, Valletle et al., Nuc. Acids Res. 17:723-733 (1989) y mutagénesis de casete (por ejemplo, Wells et al., Gene 34:315-323 (1985) de un ácido nucleico preparado anteriormente que codifica para el polipéptido. La mutagénesis dirigida al sitio es un método preferido para preparar variantes. Esta técnica se conoce bien en la técnica (véase, por ejemplo, Carter et al. Nucleic Acids Res. 13: 4431-4443 (1985) Y Kunkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488 (1 987».
Alternativamente, o adicionalmente, puede determinarse la secuencia de aminoácidos deseada que codifica para un polipéptido variante, y puede generarse de manera sintética una secuencia de ácido nucleico que codifica para tal secuencia de aminoácidos del polipéptido variante (es decir, polipéptido que comprende una 5 región Fc variante que comprende una sustitución de aminoácido tal como se describe en el presente documento). Esto se considera todavía que es una región Fc variante de una región Fc original aún cuando la región Fc original no era el precursor molecular de la región Fc variante sino en su lugar la secuencia de aminoácidos de la región Fc presente en el original en ausencia de la sustitución de
10 aminoácido deseada.
La secuencia de aminoácidos del polipéptido original puede modificarse con el fin de generar una región Fc variante con afinidad o actividad de unión al receptor de Fc in vitro y/o in vivo alteradas; y/o actividad de ADCC alterada in vitro y/o in vivo;
y/o actividad de CDC alterada in vitro y/o in vivo. La secuencia de aminoácidos del polipéptido original también puede modificarse con el fin de generar una región Fc variante con propiedades de unión al complemento y/o semivida en circulación alteradas.
20 Pueden lograrse modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas de la región Fc seleccionando sustituciones de aminoácidos que difieren significativamente en su efecto sobre la alteración de (a) la estructura de la cadena principal del polipéptido en la zona de la sustitución, por ejemplo, como una conformación de lámina o hélice, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o
el volumen de la cadena lateral, (d) la interacción con hidrato de carbono o (e) la flexibilidad del movimiento de dominios. Los residuos que se producen de manera natural se dividen en clases basándose en sus propiedades de cadena lateral comunes:
30 (1) hidrófobos: norleucina, met, ala, val, leu, ile;
(2)
hidrófilos neutros: cys, ser, thr;
(3)
ácidos: asp, glu;
(4)
básicos: asn, gln, his, Iys, arg;
(5)
residuos que influyen en la orientación de la cadena: gly, pro; y
(6)
aromáticos: trp, tyr, phe.
Sustituciones no conservativas implicarán intercambiar un miembro de una de estas clases por un miembro de otra clase. Sustituciones conservativas implicarán intercambiar un miembro de una de estas clases por otro miembro de la misma clase.
Tal como se demuestra en los ejemplos a continuación, puede diseñarse por ingeniería genética una región Fc variante con actividad alterada (función/funciones efectora(s) y/o farmacocinética). Por ejemplo, pueden modificarse uno o más residuos de aminoácido de la región Fc con el fin de alterar (por ejemplo, aumentar o disminuir) la actividad de ADCC o la actividad de CDC o la afinidad de unión a FcRn. En realizaciones preferidas, una modificación es una sustitución enumerada en la tabla 1 en el presente documento. Generalmente, se hará una sustitución de aminoácido en uno o más de los residuos de la región Fc que se identifica en el presente documento que afectan a la actividad de ADCC con el fin de generar una región Fc variante de este tipo. En realizaciones preferidas, se sustituirán no más de uno a aproximadamente diez residuos de la región Fc. Las regiones Fc en el presente documento que comprenden una o más sustituciones de aminoácidos conservarán preferiblemente al menos aproximadamente el 80%, y preferiblemente al menos aproximadamente el 90%, y lo más preferiblemente al menos aproximadamente el 95%, de la secuencia de región Fc original o de una secuencia de región Fc humana nativa.
Introduciendo la(s) modificación/modificaciones en la secuencia de aminoácidos apropiada(s) en una región Fc original, puede generarse una región Fc variante que (en comparación con la región Fc original) (a) media en la ADCC en presencia de células efectoras humanas más o menos eficazmente y/o (b) media en la CDC en presencia de complemento humano más o menos eficazmente y/o (c) se une a C1q con una afinidad deseada y/o (d) se une a un receptor de Fc gamma (FcyR) o receptor de Fc neonatal (FcRn) con una afinidad deseada. Tales regiones Fc variantes comprenderán generalmente al menos una modificación de aminoácido en la región Fc. Preferiblemente, la modificación es una sustitución de aminoácido, más preferiblemente una sustitución de aminoácido enumerada en las tablas 1-9 en el presente documento.
En realizaciones preferidas, la región Fc del polipéptido original es una región Fc humana o fragmento funcional de la misma, por ejemplo, una región Fc humana nativa de IgG1 (alotipos f y a,z), IgG2, IgG3, IgG4 humanas, y todos los alotipos conocidos o descubiertos de cualquier especie. Tales regiones tienen secuencias nativas tales como, por ejemplo, las mostradas en la figura 2 (SEQ ID NO:1-8), y la figura 3 (SEQ ID NO: 9-12) en el presente documento.
En determinadas realizaciones, con el fin de generar una región Fc variante con actividad de ADCC potenciada, el polipéptido original tiene preferiblemente actividad de ADCC preexistente (por ejemplo, el polipéptido original comprende una región Fc de IgG1 humana o IgG3 humana). En algunas realizaciones, una variante tiene actividad de ADCC potenciada (por ejemplo, mayores niveles en comparación con el original según un ensayo de ADCC descrito en el presente documento) en comparación con el polipéptido original, es decir, un anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc variante tiene actividad de ADCC potenciada tal como se compara en circunstancias idénticas con un anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc original o una secuencia de región Fc de IgG1 o IgG3 nativa pero por lo demás idéntica al anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc variante.
En realizaciones preferidas, se introduce(n) sustitución/sustituciones de aminoácido(s) en los dominios CH2 y/o CH3 de una región Fc. En realizaciones preferidas, la región Fc original usada como molde para generar tales variantes comprende una región Fc de IgG humana.
En determinadas realizaciones, con el fin de generar una región F c variante con actividad de CDC potenciada, el polipéptido original tiene preferiblemente actividad de CDC preexistente. En algunas realizaciones, una variante tiene actividad de CDC potenciada (por ejemplo, mayores niveles en comparación con el original según un ensayo de CDC descrito en el presente documento) en comparación con el polipéptido original, es decir, un anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc variante tiene actividad de CDC potenciada tal como se compara en circunstancias idénticas con un anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc original o una secuencia de región Fc de IgG1 o IgG3 nativa pero por lo demás idéntica al anticuerpo monoclonal que comprende la región Fc variante.
Los polipéptidos variantes descritos en el presente documento pueden someterse a modificaciones adicionales, dependiendo del uso deseado o previsto del polipéptido. Tales modificaciones pueden implicar, por ejemplo, una alteración adicional de la secuencia de aminoácidos (sustitución, inserción y/o deleción de residuos de aminoácido), modificaciones con hidratos de carbono, fusión a polipéptido(s) heterólogo(s) y/o modificaciones covalentes. Tales modificaciones adicionales pueden hacerse antes de, simultáneamente con o después de la(s) modificación/modificaciones de aminoácido(s) dada(s) a conocer en el presente documento que da(n) como resultado una alteración de la unión al receptor de Fc y/o actividad de ADCC y/o actividad de CDC.
Alternativa o adicionalmente, puede ser útil combinar modificaciones de aminoácidos con una o más modificaciones de aminoácidos adicionales que alteran la unión a C1q y/o la función de CDC de la región Fc. Por ejemplo, el polipéptido de partida puede ser incapaz de unirse a C1q y/o mediar en la CDC y puede modificarse según las enseñanzas en el presente documento de manera que adquiere estas funciones efectoras adicionales. Además, pueden modificarse polipéptidos con actividad de unión a C1 q preexistente, opcionalmente que tienen además la capacidad para mediar en la CDC, de manera que una o ambas de estas actividades se potencian (o alternativamente, se disminuyen). Se describen en el presente documento determinadas modificaciones de aminoácidos en la región Fc que alteran la unión a C1q y/o modifican la actividad de CDC (véanse las tablas 2, 7, 8 y 10) y, por ejemplo, en el documento W00042072.
Tal como se dio a conocer anteriormente, puede diseñarse una región Fc o parte de la misma con función efectora alterada, por ejemplo, modificando la actividad de CDC y/o la actividad de ADCC. Por ejemplo, puede generarse una región Fc variante con actividad de CDC mejorada y actividad de ADCC mejorada. Alternativamente, cuando se desea que una función efectora se reduzca o se suprima, puede diseñarse por ingeniería genética una región Fc variante con actividad de CDC reducida y/o actividad de ADCC reducida. En otras realizaciones, puede aumentarse sólo una de estas actividades, y opcionalmente también reducirse la otra actividad, por ejemplo, para generar una región Fc variante con actividad de ADCC mejorada, pero actividad de CDC reducida y viceversa. Adicionalmente, puede diseñarse por ingeniería genética una región Fc variante con afinidad de unión modificada a FcRn, proteína A y/u otras proteínas de unión a Fc.
En algunas realizaciones, la presente descripción proporciona composiciones que comprenden una variante de un polipéptido original, en las que el original comprende una región Fc (o parte de la misma) y en las que la variante comprende al menos una modificación de aminoácido de residuos de superficie dentro de la región Fc (véase, por ejemplo, Deisenhofer, Biochemistry, 20:2361-70, abril de 1981 , Y documento W00042072). En otras realizaciones, la presente descripción proporciona composiciones que comprenden una variante de un polipéptido original que tiene una región Fc, en las que la variante comprende al menos una modificación de aminoácido de residuos de superficie en la región Fc. En realizaciones adicionales, la presente descripción comprende una variante de un polipéptido original que tiene una región Fc, comprendiendo la variante al menos una modificación de aminoácido de superficie y al menos una modificación de aminoácido no de superficie, ambas en la región Fc.
Variantes de combinación En algunas realizaciones, una región Fc variante comprende dos o más modificaciones de aminoácidos (por ejemplo, sustituciones). Tales variantes de combinación pueden producirse, por ejemplo, seleccionando dos o más de las sustituciones de aminoácidos detalladas anteriormente (por ejemplo, véase la tabla 1), o una o más sustituciones de aminoácidos enumeradas en la tabla 1 además de una sustitución conocida en la técnica.
Las variantes de combinación mostradas en la tabla 10 Y otras variantes de combinación (tales como las sustituciones dadas conocer en el documento W00042072 usadas en combinación con las dadas a conocer en el presente documento) pueden someterse a prueba para determinar una actividad dada (por ejemplo, actividad de unión a FcRn, actividad de ADCC y actividad de CDC) en una variedad de ensayos (véanse los ejemplos a continuación). En este sentido, pueden identificarse variantes de combinación útiles.
En determinadas realizaciones preferidas, las múltiples sustituciones de aminoácidos presentes en una región Fc variante tienen una sustitución de aminoácido que aumenta la actividad de ADCC, y una modificación de aminoácido que aumenta la afinidad de unión a receptor de Fc neonatal (FcRn) (por ejemplo, a pH 6,0) del polipéptido que comprende la región Fc variante. En otras realizaciones, las variantes de combinación tienen un aminoácido de superficie en una región Fc variante de la presente invención, y una modificación de aminoácido de no superficie. Pueden generarse variantes de combinación adicionales en las regiones Fc variantes de la presente invención combinando dos o más de las sustituciones de aminoácidos descritas en el presente documento, o al menos una de las sustituciones de aminoácidos descritas en el presente documento con las descritas en, por ejemplo, el documento W00042072.
de variantes La presente descripción proporciona diversos ensayos para seleccionar regiones Fc variantes o polipéptidos que comprende una región Fc variante. Pueden usarse ensayos de selección para encontrar o confirmar variantes útiles. Por ejemplo, pueden seleccionarse variantes de combinación (véase, por ejemplo, la tabla 10) para encontrar variantes con unión a FcR alterada, y/o actividad de ADCC alterada y/o de CDC alterada (por ejemplo, actividad de ADCC o CDC aumentada o disminuida) y/o capacidad modificada para agotar células diana (células B, por ejemplo) a partir de sangre completa. Además, tal como se describe a continuación, los ensayos pueden emplearse para encontrar o confirmar variantes que tienen actividad terapéutica beneficiosa en un sujeto (por ejemplo, tal como un ser humano con síntomas de una enfermedad sensible a anticuerpos o inmunoadhesinas). Puede emplearse una variedad de tipos de ensayo para evaluar cualquier cambio en una variante en comparación con el polipéptido original (ensayos de selección proporcionados por ejemplo en el documento W00042072). Se describen a continuación ensayos a modo de ejemplo adicionales.
En realizaciones preferidas, un polipéptido variante (es decir, polipéptido que comprende una región Fc variante o parte funcional de la misma) es un anticuerpo monoclonal que conserva esencialmente la capacidad para unirse específicamente a un antígeno (mediante una región de unión a antígeno no modificada o región de unión a antígeno modificada) en comparación con el polipéptido original (por ejemplo, la capacidad de unión es preferiblemente menos de 20 veces, 10 veces, 7 veces o menos de aproximadamente 5 veces diferente de la del polipéptido original). La capacidad de unión del polipéptido variante al antígeno puede determinarse usando técnicas tales como ELlSA, análisis de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) o radioinmunoprecipitación (RIA), por ejemplo pueden emplearse ensayos de unión a FcR para evaluar las variantes de la presente invención. Por ejemplo, puede medirse la unión a receptores de Fc tales como FcyRI, FcyRlla, FcyRllb, FcyRIII, FcRn, etc., titulando un polipéptido variante y midiendo el polipéptido variante unido usando un anticuerpo que se une al polipéptido variante en un formato de ELlSA (véanse los ejemplos a continuación). Por ejemplo, puede seleccionarse una variante que comprende un anticuerpo en un ensayo ELlSA convencional para determinar la unión a un FcRn a pH 6,0 Y pH 7,0
o pH 7,4. Puede usarse una superficie sólida recubierta con estreptavidina o neutravidina para capturar FcRn marcado con biotina de cualquier especie, tal como ratón o ser humano. Tras bloquear, el receptor de captura puede incubarse con polipéptidos variantes (por ejemplo, anticuerpos) diluidos en tampones a pH 6,0 o pH 7,0. En la siguiente etapa, se añade una molécula específica para anticuerpos humanos (por ejemplo, (Fab'h de cabra anti-Fab humano conjugado con una enzima). Después de eso, puede añadirse un sustrato con el fin de determinar la cantidad de unión del polipéptido variante al FcRn inmovilizado a pH 6,0 o pH 7,0
o pH 7,4. Los resultados de este ensayo pueden compararse con la capacidad del polipéptido original (no variante) para unirse al mismo FcR. En otras realizaciones preferidas, los componentes para llevar a cabo un ELlSA (por ejemplo, con FcRn)
para seleccionar variantes están envasados en un kit (por ejemplo, con instrucciones para su uso).
También puede emplearse un ensayo de ADCC para seleccionar las variantes. Los ensayos de ADCC pueden realizarse in vitro o in vivo. Para evaluar la actividad de ADCC de un polipéptido variante, puede realizarse un ensayo de ADCC in vitro usando razones de efector:diana variables. Un ensayo de ADCC a modo de ejemplo podría usar una línea celular diana que expresa cualquiera de los siguientes antígenos diana: CD20, CD22, CD33, CD40, CD63, receptor de EGF, receptor her-2, antígeno de membrana específico de la próstata, hidrato de carbono de Lewis Y, gangliósidos GD2 y GD3, lamp-i, CO-029, L6 y ephA2. Pueden obtenerse células efectoras de un donante sano (por ejemplo, el día del experimento) y PBMC purificadas usando Histopaque (Sigma). Entonces se incuban previamente las células diana con una IgG que comprende una región Fc variante de la invención a, por ejemplo, 0,1 -1.000 ng/ml durante aproximadamente 30 minutos antes de mezclar con células efectoras a razones de efector:diana de, por ejemplo,
40:1, 20: 1 y 10: 1. Entonces puede medirse la actividad de ADCC colorimétricamente usando un kit de detección de citotoxicidad (Roche Molecular Biochemicals) para la cuantificación de la lisis y muerte celular basándose en la medición de la actividad lactato deshidrogenasa (LDH) liberada del citosol de células dañadas al sobrenadante. La actividad de ADCC también puede medirse, para ensayos de células diana cargadas con cromo, midiendo la liberación de cromo 51 resultante. Puede determinarse la citotoxicidad celular independiente de anticuerpos midiendo la actividad LDH de células efectoras y diana en ausencia de anticuerpo. Puede medirse la liberación total tras la adición de Triton X-100 al 1 % a la mezcla de células efectoras y diana. La incubación de las células efectoras y diana puede realizarse durante un periodo de tiempo optimizado (0,54-1 8 horas) a 37°C en un 5,0% de CO2 y al que luego le sigue la centrifugación de las placas de ensayo. Los sobrenadantes pueden transferirse entonces a placas de 96 pocillos e incubarse con reactivo de detección de LDH durante 30 minutos a 25°C. Entonces puede medirse la absorbancia de la muestra a 490 nm usando un lector de microplacas. Entonces puede calcularse el porcentaje de citotoxicidad usando la siguiente ecuación: % de citotoxicidad = valor experimental -control bajo/control alto -control bajo X 100%. Entonces puede compararse el porcentaje de citotoxicidad de anti-CD20 y variantes directamente con una cantidad igual de RITUXAN para proporcionar una medición de la eficacia relativa. Un ensayo de ADCC a modo de ejemplo podría emplear células SKW6.4 que sobreexpresan el antígeno CD20 (por ejemplo, adquiridas de la Colección Americana de Cultivos Tipo) como fuente de células diana. Se conocen en la técnica muchas variaciones de este ensayo (por ejemplo, Zuckerman et al., CRC Crit Rev Microbiol 1978; 7(1): 1-26).
Las células efectoras útiles para tales ensayos incluyen, pero no se limitan a, células NK, macrófagos y otras PBMC. Alternativamente, o adicionalmente, puede evaluarse la actividad de ADCC de los polipéptidos variantes de la presente invención in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el dado a conocer en Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1 998)).
Las variantes también pueden seleccionarse para determinar la activación del complemento. Para evaluar la activación del complemento, puede realizarse un ensayo de CDC (véase, por ejemplo, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996)). Por ejemplo, pueden diluirse con tampón diversas concentraciones del polipéptido variante y complemento humano. Pueden diluirse células que expresan el antígeno al que se une el polipéptido variante hasta una densidad de 1 x 106 células/mI. Pueden añadirse mezclas de polipéptido variante, complemento humano diluido y células que expresan el antígeno a una placa de 96 pocillos de cultivo tisular de fondo plano y dejarse incubar durante 2 horas a 37°C y un 5% de CO2 para facilitar la lisis celular mediada por complemento. Entonces pueden añadirse cincuenta microlitros de azul de alamar (Accumed International) a cada pocillo e incubarse durante la noche a 37°C. Puede medirse la absorbancia usando un fluorímetro de 96 pocillos con excitación a 530 nm y emisión a 590 nm. Pueden expresarse los resultados en unidades relativas de fluorescencia (URF). Pueden calcularse las concentraciones de la muestra a partir de una curva patrón y puede notificarse el porcentaje de actividad en comparación con polipéptido no variante para el polipéptido variante de interés.
En determinadas realizaciones, los polipéptidos variantes no activan el complemento o activan el complemento de manera escasa. Por ejemplo, un polipéptido variante presenta una actividad de CDC de aproximadamente el 0-10% en este ensayo en comparación con un anticuerpo control que tiene una región Fc de IgG1 no mutada. Preferiblemente, la variante no parece tener ninguna actividad de CDC (por ejemplo, por encima del fondo) en el ensayo de CDC anterior. En otras realizaciones, se encuentra que un polipéptido variante de la presente invención tiene CDC potenciada en comparación con un polipéptido original (por ejemplo, que presenta preferiblemente una potenciación de aproximadamente 1,1, 1,5, 1,7 o 2 veces a aproximadamente 100 veces (o más) en la actividad de CDC in vitre o in vivo cuando se comparan los valores de C150).
También pueden seleccionarse polipéptidos variantes para determinar el agotamiento de células diana en un ensayo de sangre completa. Por ejemplo, pueden seleccionarse diversas concentraciones del polipéptido variante con especificidad de diana de CD20 para determinar el agotamiento de células S en un ensayo de sangre completa usando FACS (Vugmeyster et al., 2003 Cytometry 52A, 101109). Se incuba sangre recién extraída con concentraciones variables de polipéptido variante a 37°C y un 5% de CO2 durante 4 horas (el tiempo puede variar). Tras la incubación, se lisan los glóbulos rojos según las directrices del fabricante con un reactivo de cloruro de amonio (Seckton-Dickinson, n.o de cat. 555899) y se detectan células S mediante FACS usando un anticuerpo marcado fluorescentemente específico para células S (anti-CD 19, por ejemplo). Los resultados pueden expresarse como porcentaje del agotamiento de células S en relación con o bien una muestra no tratada o bien una muestra incubada con un anticuerpo irrelevante (que no se agota).
En realizaciones preferidas, un polipéptido variante agota células S más eficazmente que el polipéptido original. Un polipéptido variante puede agotar células S, por ejemplo, en un grado de aproximadamente dos veces o más que el polipéptido original, y preferiblemente de manera aproximada cinco veces o más. Además, una variante puede presentar una mayor potencia en el agotamiento de células S. Por ejemplo, una variante puede agotar el mismo porcentaje de células S en relación con el polipéptido original, pero utilizar aproximadamente cinco veces menos, y preferiblemente de manera aproximada 10 veces menos de anticuerpo. El agotamiento de células diana mediado por variantes puede estar de aproximadamente 2 veces, 3 veces, 5 veces a aproximadamente 1000 veces o más, y preferiblemente de desde aproximadamente 5 veces hasta aproximadamente 1000 veces mejorado en comparación con el polipéptido original.
Las variantes también pueden seleccionarse in vivo. Puede emplearse cualquier tipo de ensayo in vivo. Se proporciona a continuación un ejemplo particular de un tipo de ensayo. Este ensayo a modo de ejemplo permite la evaluación preclínica de variantes de Fc in vivo. Una variante que va a someterse a prueba puede incorporarse en la región Fc de un anticuerpo particular que se sabe que tiene alguna actividad. Por ejemplo, una variante puede incorporarse en la región Fc de una IgG anti-CD20 mediante mutagénesis. Esto permite que se comparen una IgG original y una IgG de variante de Fc directamente con RITUXAN (que se sabe que promueve regresión tumoral). La evaluación preclínica puede realizarse en 2 fases (una fase farmacocinética y una fase farmacodinámica). El objetivo de los estudios farmacocinéticos de fase I es determinar si hay diferencias en la velocidad de aclaramiento entre una IgG de variante de Fc y el anticuerpo con actividad in vivo conocida (por ejemplo, RITUXAN). Diferencias en la velocidad de aclaramiento pueden provocar diferencias en el nivel en estado estacionario de IgG en suero. Como tal, si se detectan diferencias en las concentraciones en estado estacionario, éstas deben normalizarse para permitir que se hagan comparaciones precisas. El objetivo de los estudios farmacodinámicos de fase " es determinar el efecto de las mutaciones de Fc sobre, en este caso, el crecimiento tumoral. Estudios previos con RITUXAN usaron una única dosis que inhibió completamente el crecimiento tumoral. Debido a que esto no permite que se midan diferencias cuantitativas, debe emplearse un intervalo de dosis.
Puede realizarse la comparación farmacocinética de fase I de una variante de Fc, la Fc original de tipo natural y RITUXAN, por ejemplo, de la siguiente manera. En primer lugar, pueden inyectarse 40 J..lg (u otra dosis que va a someterse a prueba) por animal por vía intravenosa y cuantificarse el nivel en plasma de la IgG a las O, 0,25, 0,5, 1, 24, 48, 72, 96, 120, 168 Y 336 h. Los datos pueden ajustarse, por ejemplo, usando un programa farmacocinético (WinNonLin) usando un modelo farmacocinético de dos compartimentos de latencia cero para obtener la velocidad de aclaramiento. La velocidad de aclaramiento puede usarse para definir el nivel en plasma en estado estacionario con la siguiente ecuación: C= dosis/(velocidad de aclaramiento X t), en la que T es el intervalo entre dosis y C es el nivel en plasma en estado estacionario. Pueden realizarse experimentos farmacocinéticos en ratones que no llevan tumor con, por ejemplo, un mínimo de 5 ratones por punto de tiempo.
Puede emplearse un modelo animal para la siguiente fase de la siguiente manera. En el flanco derecho de ratones CB17-SCID pueden implantarse 106 células Raji por vía subcutánea. El bolo intravenoso del anticuerpo con Fc variante, el anticuerpo con Fc de tipo natural y RITUXAN puede comenzar inmediatamente tras la implantación y continuar hasta que el tamaño tumoral es mayor de 2 cm de diámetro. El diámetro tumoral puede determinarse cada lunes, miércoles y viernes midiendo la longitud, anchura y profundidad del tumor usando un calibre (volumen tumoral = A x L x P). Un gráfico del volumen tumoral frente al tiempo proporcionará la velocidad de crecimiento tumoral para el cálculo farmacodinámico. Debe usare un mínimo de aproximadamente 10 animales por grupo.
La comparación farmacodinámica de fase 11 del anticuerpo con Fc variante, el anticuerpo con Fc de tipo natural y RITUXAN puede realizarse de la siguiente manera. Basándose en datos publicados, RITUXAN a 1 O g/g semanalmente inhibió completamente el crecimiento tumoral tumor in vivo (Clynes et al., Nat. Med. 6:443-6, 2000). Por tanto, puede someterse a prueba un intervalo de dosis semanal de 1 O g/g, 5 g/g, 1 g/g, 0,5 g/g Y O g/g. El nivel en plasma en estado estacionario al que se inhibe la velocidad de crecimiento tumoral en un 50% puede determinarse gráficamente mediante la relación entre el nivel en plasma en estado estacionario y la eficacia. El nivel en plasma en estado estacionario puede calcularse tal como se describió anteriormente. Si es necesario, puede ajustarse 't en consecuencia para cada anticuerpo con Fc variante y el anticuerpo con Fc de tipo natural dependiendo de sus propiedades farmacocinéticas para lograr un nivel en plasma en estado estacionario comparable a RITUXAN. Valores farmacodinámicos mejorados estadísticos del anticuerpo con Fc variante en comparación con el polipéptido original (por ejemplo, anticuerpo con Fc de tipo natural) y RITUXAN indicarán generalmente que el anticuerpo con Fc variante confiere una actividad in vivo mejorada.
Puede realizarse una comparación farmacodinámica adicional de anticuerpos con Fc variante, anticuerpos con Fc de tipo natural y RITUXAN en monos cynomolgous tal como se describió previamente (Reff et al., Blood 83, 435-445, 1994). Puede usarse una respuesta a la dosis para el agotamiento de células B periféricas y células B de ganglios linfáticos para comparar las potencias relativas de las variantes de Fc con Fc de tipo natural y RITUXAN administrados por vía intravenosa y/o por vía subcutánea. Valores farmacodinámicos mejorados estadísticos de la variante de Fc en comparación con el polipéptido original (por ejemplo, Fc de tipo natural) y RITUXAN indicarán generalmente que el anticuerpo con Fc variante confiere una actividad in vivo mejorada.
En realizaciones adicionales, las variantes (es decir, polipéptido que comprende una región Fc variante de la invención, o parte funcional de la misma) se seleccionan de manera que se identifican variantes que son útiles para uso terapéutico en al menos dos especies. Tales variantes se denominan en el presente documento "variantes mejoradas de doble especie", y son particularmente útiles para identificar variantes que son terapéuticas en seres humanos, y también demuestran (o es probable que demuestren) eficacia en un modelo animal. En este sentido, la presente invención proporciona métodos para identificar variantes que tienen una fuerte probabilidad de aprobarse para pruebas clínicas en seres humanos puesto que es probable que los datos de modelos animales apoyen cualquier solicitud de pruebas en seres humanos realizada a agencias reguladoras gubernamentales (por ejemplo, la Food and Drug Administration estadounidense).
En determinadas realizaciones, se identifican variantes mejoradas de doble especie realizando en primer lugar un ensayo de ADCC usando células efectoras humanas para encontrar variantes mejoradas, y realizando entonces un segundo ensayo de ADCC usando células efectoras de ratón, rata o primate no humano para identificar un subconjunto de las variantes mejoradas que son variantes mejoradas de doble especie. En algunas realizaciones, la presente descripción proporciona métodos para identificar variantes mejoradas de doble especie que comprenden: a) proporcionar: i) células diana, ii) una composición que comprende una variante candidata de un polipéptido original que tiene al menos una parte de una
región Fc, en la que la variante candidata comprende al menos una sustitución de aminoácido en la región Fc, y en la que la variante candidata media en la citotoxicidad de células diana en presencia de una primera especie (por ejemplo, ser humano) de células efectoras más eficazmente que el polipéptido original, y iii) cé5 lulas efectoras de una segunda especie (por ejemplo, ratón, rata o primate no humano), y b) incubar la composición con las células diana en condiciones tales que la variante candidata se une a las células diana generando de ese modo células diana unidas a la variante candidata, c) mezclar las células efectoras de la segunda especie con las células diana unidas a la variante candidata, y d) medir la
10 citotoxicidad de células diana mediada por la variante candidata.
En determinadas realizaciones, el método comprende además la etapa e) determinar si la variante candidata media en la citotoxicidad de células diana en presencia de las células efectoras de la segunda especie más eficazmente que el po15 lipéptido original. En algunas realizaciones, el método comprende además la etapa f) identificar una variante candidata como una variante mejorada de doble especie que media en la citotoxicidad de células diana en presencia de las células efectoras de la segunda especie más eficazmente que el polipéptido original. En realizaciones preferidas, las variantes de doble especie identificadas se seleccio
20 nan entonces in vivo en uno o más ensayos en animales.
En determinadas realizaciones, se identifican variantes mejoradas de doble especie realizando en primer lugar un ensayo en sangre completa usando sangre humana para encontrar variantes mejoradas y luego realizando un segundo ensayo en sangre completa usando sangre de ratón, rata o primate no humano para identificar un subconjunto de las variantes mejoradas que son variantes mejoradas de doble especie. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona métodos para identificar variantes mejoradas de doble especie, que comprenden: a) proporcionar: i) células diana, ii) una composición que comprende una va30 riante candidata de un polipéptido original que tiene al menos una parte de una región Fc, en la que la variante candidata comprende al menos una sustitución de aminoácido en la región Fc, y en la que la variante candidata media en el agotamiento de células diana en presencia de sangre de una primera especie (por ejemplo, ser humano) más eficazmente que el polipéptido original, y iii) sangre de
una segunda especie (por ejemplo, ratón, rata o primate no humano), y b) incubar la composición con las células diana en condiciones tales que la variante candidata se une a las células diana generando de ese modo células diana unidas a la variante candidata, c) mezclar la sangre de la segunda especie con las células diana unidas a la variante candidata, y d) medir el agotamiento de células diana mediado por la variante candidata. En determinadas realizaciones, el método comprende además la etapa e) determinar si la variante candidata media en el agotamiento de células diana en presencia de la sangre de la segunda especie más eficazmente que el polipéptido original. En algunas realizaciones, el método comprende además la etapa f) identificar una variante candidata como una variante mejorada de doble especie que media en el agotamiento de células diana en presencia de la sangre de la segunda especie más eficazmente que el polipéptido original. En realizaciones preferidas, las variantes de doble especie identificadas se seleccionan entonces in vivo en uno o más ensayos en animales.
En determinadas realizaciones, se identifican variantes mejoradas de doble especie realizando cualquiera de los ensayos anteriores usando componentes humanos (por ejemplo, células humanas, FcR humano, etc.) para identificar variantes mejoradas, y luego realizando el mismo ensayo (o un ensayo diferente) con componentes de animales no humanos (por ejemplo, células de ratón, FcR de ratón, etc.). En este sentido, puede identificarse un subconjunto de variantes que tienen un buen rendimiento según criterios dados en tanto ensayos basados en seres humanos como ensayos basados en una segunda especie.
Un procedimiento a modo de ejemplo para identificar variantes mejoradas de doble especie es tal como sigue. En primer lugar, se muta una secuencia de ácido nucleico que codifica para al menos una parte de una región Fc de IgG de manera que la secuencia de aminoácidos expresada tiene al menos un cambio de aminoácido, generando de ese modo una variante. Esta variante de IgG expresada se caracteriza entonces en un ensayo de ADCC usando PBMC humanas o un subconjunto (células NK o macrófagos, por ejemplo). Si se encuentra actividad de ADCC potenciada, entonces se selecciona la variante en un segundo ensayo de ADCC usando PBMC de ratón o rata. Alternativamente, o además, puede realizarse un ensayo con la variante para unirse a líneas celulares o receptores de roedores clonados. Finalmente, si se encuentra que la variante mejora en el segundo ensayo, lo que la convierte en una variante mejorada doble, entonces la variante se selecciona in vivo en ratones o ratas.
La regiones Fc variantes pueden ser parte de moléculas más grandes. Las moléculas más grandes pueden ser, por ejemplo, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos biespecíficos, inmunoadhesinas, etc. Adicionalmente, una región Fc variante pue
10 de estar operativamente unida a un polipéptido distinto de anticuerpo al que le puede conferir una semivida alterada (aumentada o disminuida). Como tal, es evidente que existe una amplia gama de aplicaciones para las regiones Fc variantes.
En realizaciones preferidas, la molécula que contiene regiones Fc variantes (por ejemplo, polipéptido) es un anticuerpo. A continuación se describen técnicas para producir anticuerpos.
20 Generalmente, cuando la molécula que contiene regiones Fc variantes es un anticuerpo, el anticuerpo se dirige contra antígeno de interés. Preferiblemente, el antígeno es un polipéptido y la administración del anticuerpo a un mamífero que padece una enfermedad o trastorno que se beneficiaría de una disminución en la cantidad o la actividad de la molécula antigénica puede dar como resultado un
25 beneficio terapéutico en ese mamífero. Sin embargo, también pueden emplearse anticuerpos dirigidos contra antígenos no polipeptídicos (tales como antígenos glicolipídicos asociados a tumor; véase la patente estadounidense 5.091.178).
Los antígenos a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, moléculas tales
30 como renina; una hormona de crecimiento, incluyendo hormona de crecimiento humana y hormona de crecimiento bovina; factor liberador de hormona de crecimiento; hormona paratiroidea; hormona estimulante del tiroides; lipoproteínas; alfa-i-antitripsina; cadena A de la insulina; cadena B de la insulina; proinsulina; hormona foliculoestimulante; calcitonina; hormona luteinizante; glucagón; factores de coagulación tales como factor VIIIC, factor IX, factor tisular (TF) y factor de von Willebrand; factores anticoagulantes tales como proteína C; péptido natriurético auricular; tensioactivo pulmonar; un activador del plasminógeno, tal como urocinasa o activador del plasminógeno de tipo tisular (t-PA) o de orina humana; bombesina; trombina; factor de crecimiento hematopoyético; factor de necrosis tumoral alfa y beta; encefalinasa; RANTES (regulador por activación de células T expresadas y secretadas normalmente); proteína inflamatoria de macrófagos humanos (MIP-1-alfa); una albúmina sérica tal como albúmina sérica humana; sustancia inhibidora mulleriana; cadena A de la relaxina; cadena B de la relaxina; prorelaxina; péptido asociado a gonadotropina de ratón; una proteína microbiana, tal como beta-Iactamasa; AONasa; IgE; un antígeno asociado a linfocitos T citotóxicos (CTLA), tal como CTLA-4; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); receptores para hormonas o factores de crecimiento; proteína A
o O; factores reumatoides; un factor neurotófico tal como factor neurotófico derivado de hueso (BONF), neurotrofina 3, 4, 5 ó 6 (NT-3, NT -4, NT-5 o NT-6), o un factor de crecimiento nervioso; factor de crecimiento derivado de las plaquetas (POGF); factor de crecimiento de fibroblastos tal como un FGF y FGF; factor de crecimiento epidérmico (EGF); factor de crecimiento transformante (TGF) tal como TGF-alfa y TGF beta, incluyendo TGF-1 , TGF-2, TGF-3, TGF-4 o TGF-5; factor de crecimiento similar a la insulina I y 11 (IGF-I e IGF-II); des (1-3)-IGF-1 (IGF-I cerebral), proteínas de unión a factor de crecimiento similar a la insulina; proteínas CO tales como C03, C04, C08, C019 y C020; eritropoyetina; factores osteoinductores; inmunotoxinas; una proteína morfogenética ósea (BMP); un factor de diferenciación del crecimiento (por ejemplo, GOF8); un interferón tal como interferón alfa, beta y gamma; factores estimuladores de colonias (CSF), por ejemplo, M-CSF, GM-CSF y G-CSF; interleucinas (IL), por ejemplo, de IL-I a IL-25; superóxido dismutasa; receptores celulares T-25; proteínas de membrana de superficie; factor de aceleración de la descomposición; antígeno viral tal como, por ejemplo, una parte de la envuelta del SIDA; proteínas de transporte; receptores de direccionamiento; adresinas; proteínas reguladoras; integrinas tales como C01 1 a, C01 1 b, C011c, C018, una ICAM, VLA4 y VCAM; un antígeno asociado a tumor tal como receptor HER2, HER3 o HER4; grelina; un miembro de una ruta de apoptosis; y fragmentos o precursores de cualquiera de los polipéptidos enumerados anteriormente.
Los antígenos preferidos incluyen, pero no se limitan a, proteínas CD tales como CD3, CD4, CD8, CD1 9, CD20 Y CD34; miembros de la familia del receptor de ErbB tal como el receptor de EGF, el receptor HER2, HER3 o HER4; moléculas de adhesión celular tales como LFA-1 , Macl, p 150.95, VLA-4, ICAM-1 , VCAM, integrina a4/p7 e integrina Xv/p3 que incluye o bien 5 o bien subunidades de la misma (por ejemplo, anticuerpos anti-CDI la, anti-CD 18 o anti-CDI 1b); factores de crecimiento tales como VEGF; factor tisular (TF); interferón alfa (a-IFN); factores de diferenciación del crecimiento, por ejemplo, GDF-8; una interleucina, tal como IL-8; IgE; antígenos del grupo sanguíneo; receptor de flk2/flt3; receptor de obesidad (OB); receptor de mpl; CTLA-4; proteína C y grelina.
Pueden usarse antígenos solubles o fragmentos de los mismos, opcionalmente conjugados con otras moléculas, como inmunógenos para generar anticuerpos. Para moléculas transmembrana, tales como receptores, pueden usarse fragmentos de estos (por ejemplo, el dominio extracelular de un receptor) como inmunógeno. Alternativamente, pueden usarse células que expresan la molécula transmembrana como inmunógeno. Tales células pueden derivarse de una fuente natural (por ejemplo, líneas de células cancerosas) o pueden ser células que se han transformado mediante técnicas recombinantes para expresar la molécula transmembrana. Otros antígenos y formas de los mismos útiles para preparar anticuerpos resultarán evidentes para el experto en la técnica.
La presente descripción proporciona anticuerpos policlonales con regiones Fc variantes. Por ejemplo, un repertorio de inmunoglobulina humana que contiene regiones constantes de IgG1 modificadas puede transplantarse a ratones con inmunoglobulinas inactivadas, dando como resultado ratones que expresan un repertorio de IgG que contiene regiones Fc modificadas (véase, por ejemplo, Mendez, MJ et al., Nature Genetics 15: 146 (1997)). Se generan anticuerpos policlonales preferiblemente en animales mediante inyecciones subcutáneas (sc) o intraperitoneales (ip) múltiples del antígeno relevante y un adyuvante. Puede ser útil conjugar el antígeno relevante con una proteína que es inmunogénica en la especie que va a inmunizarse (por ejemplo, hemocianina de lapa californiana, albúmina sérica, tiroglobulina bovina o inhibidor de tripsina de soja) usando un agente bifuncional o de derivatización (por ejemplo, éster de maleimidobenzoilsulfosuccinimida para la conjugación a través de residuos de cisteína, N-hidroxisuccinimida para la conjugación a través de residuos de lisina, glutaraldehído, anhídrido succínico, SOC12,
o R1 N=C=NR, en el que R y R1 son grupos alquilo diferentes.
Ejemplos de un protocolo de inmunización general para un conejo y un ratón son tal como siguen. Se inmunizan los animales frente al antígeno, los conjugados inmunogénicos o los derivados combinando, por ejemplo, 100 Ilg o 5 Ilg de la proteína o el conjugado (por ejemplo, para un conejo o un ratón respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectando la disolución por vía intradérmica en múltiples sitios. Un mes más tarde se refuerzan los animales con 1/5 o 1/10 de la cantidad original de péptido o conjugado en adyuvante completo de Freund mediante inyección subcutánea en múltiples sitios. De siete a catorce días más tarde se extrae sangre de los animales y se somete a ensayo el suero para determinar el título de anticuerpos. Se refuerzan los animales hasta la meseta del título. Preferiblemente, se refuerza al animal con el conjugado del mismo antígeno, pero conjugado con una proteína diferente y/o a través de un reactivo de reticulación diferente. También pueden preparase conjugados en cultivo de células recombinantes como fusiones de proteínas. Además, se usan adecuadamente agentes de agregación tales como alumbre para potenciar la respuesta inmunitaria.
La presente descripción proporciona anticuerpos monoclonales con regiones Fc variantes. Pueden prepararse anticuerpos monoclonales de varia maneras, incluyendo el uso del método del hibridoma (por ejemplo, tal como se describe por Kohler et al., Nature, 256: 495, 1975), o mediante métodos de ADN recombinante (por ejemplo, patente estadounidense No. 4.816.567).
En el método del hibridoma, se inmuniza un ratón u otro animal huésped apropiado, tal como un hámster o un macaco, para provocar linfocitos que producen o pueden producir anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína usada para la inmunización. Alternativamente, pueden inmunizarse linfocitos in vitro. Entonces se fusionan linfocitos con células de mieloma usando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma. Las células de hibridoma así preparadas se siembran y se hacen crecer en un medio de cultivo adecuado que contiene preferiblemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma originales no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma originales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas incluirá normalmente hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), sustancias que impiden el crecimiento de células deficientes en HGPRT.
Las células de mieloma preferidas son aquellas que se fusionan eficazmente, soportan la producción de anticuerpo de alto nivel estable por las células productoras de anticuerpo seleccionadas y son sensibles a un medio tal como medio HAT. Entre ellas, las líneas de células de mieloma preferidas son líneas de mieloma murinas, tales como las derivadas de tumores de ratón MOPC-21 y MPC-1 I disponibles del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California EE.UU., y las células SP-2 o X63-Ag8-653 disponibles de la Colección Americana de Cultivos Tipo, Rockville, Mariland EE.UU. También se han descrito líneas de células de mieloma humanas y de heteromieloma de ratón-humanas para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (por ejemplo, Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984)).
Se somete a prueba medio de cultivo en el que están haciéndose crecer células de hibridoma para determinar la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferiblemente, la especificidad de unión de anticuerpos monoclonales producidos por células de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, tal como RIA o ELlSA. Tras identificar las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, pueden subclonarse los clones mediante procedimientos de dilución limitante y hacerse crecer mediante métodos convencionales. Los medios de cultivo adecuados para este fin incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden hacerse crecer in vivo como tumores ascíticos en un animal. Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan adecuadamente del medio de cultivo, líquido ascítico o suero mediante procedimientos de purificación de inmunoglobulinas convencionales tales como, por ejemplo, proteína A-Sepharose, cromatografía con hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.
El AON que codifica para los anticuerpos monoclonales se aísla fácilmente y se secuencia usando procedimientos convencional (por ejemplo, usando sondas oligonucleotídicas que pueden unirse específicamente a genes que codifican para las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos monoclonales). Las células de hibridoma sirven como fuente preferida de tal AON. Una vez aislado, puede colocarse el AON en vectores de expresión, que entonces se transfectan en células huésped tales como células de E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que no producen de otro modo proteína de inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. La producción recombinante de anticuerpos se describe con más detalle a continuación.
En algunas realizaciones, se aíslan anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de bibliotecas de fagos de anticuerpo generadas usando las técnicas descritas, por ejemplo, en McCafferty et al., Nature, 348: 552554 (1990). Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, usando bibliotecas de fagos. Publicaciones posteriores describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (intervalo de nM) mediante intercambio de cadenas (Marks et al., BioTechnology, 10: 779-783 (1 992)), así como infección combinatoria y recombinación in vivo como estrategia para construir bibliotecas de fagos muy grandes (por ejemplo, Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21: 2265-2266 (1993)). Por tanto, estas técnicas y técnicas similares son alternativas viables a las técnicas de hibridoma de anticuerpos monoclonales tradicionales bien conocidas en la técnica para el aislamiento de anticuerpos monoclonales. Además, puede modificarse el AON, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante por dominios constantes de cadena pesada y ligera humanos en lugar de las secuencias murinas homólogas (por ejemplo, patente estadounidense n.o 4.816.567, y Morrison, et al. , Proc. Nat. Acad. Sci USA, 81 : 6851 (1 984), o uniendo covalentemente a la secuencia que codifica para inmunoglobulina la totalidad o parte de la secuencia codificante para un polipéptido distinto de inmunoglobulina.
Normalmente tales polipéptidos distintos de inmunoglobulina se sustituyen por los dominios constantes de un anticuerpo, o se sustituyen por los dominios variables de un sitio de combinación de antígeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprende un sitio de combinación de antígeno que tiene especificidad por un antígeno y otro sitio de combinación de antígeno que tiene especificidad por un antígeno diferente.
humanizados humanos
La presente descripción proporciona anticuerpos humanizados y humanos con regiones Fc variantes. En realizaciones preferidas, un anticuerpo humanizado comprende secuencias de aminoácidos de anticuerpo humano junto con residuos de aminoácido que no son de un anticuerpo humano. En algunas realizaciones, las secuencias humanas en un anticuerpo humanizado comprenden las regiones de entramado ("FR") y las secuencias o residuos que no son de un anticuerpo humano comprenden una o más CDR. Merece la pena indicar que las FR y las CDR pueden definirse basándose en la numeración de residuos de aminoácido en las regiones pesada y VL. Se pretende que el término CDR signifique los sitios de combinación de antígeno no contiguos encontrados dentro de la región variable de polipéptidos de cadena tanto pesada como ligera. Estas regiones se han definido por Kabat et al. (J. Biol. Chem. 252: 6609-6616 (1977) Y Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological lnterest (1991); "Kabat", Chothia et al. (J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); "Chothia" y MacCallum et al (J. Mol. Biol 262:732745 (1996); "MacCallum", en los que las definiciones incluyen residuos de aminoácido solapantes o subconjuntos de residuos de aminoácido cuando se comparan entre sí. No obstante, se pretende que la aplicación de cualquiera de estas definiciones, solas (por ejemplo, la definición de Kabat) o en combinación (únicamente a modo de ejemplo, la definición combinada de Kabat y Chothia) para referirse a una CDR de un anticuerpo (incluyendo un anticuerpo humanizado) esté
dentro del alcance del término tal como se define y se usa en el presente docu
mento.
Además, se pretende que el término "entramado", cuando se usa en referencia a una región variable de anticuerpo, signifique todos los residuos de aminoácido fuera de las regiones CDR dentro de la región variable de un anticuerpo. Por tanto, un entramado de región variable tiene aproximadamente 100-120 aminoácidos de longitud pero se pretende que haga referencia únicamente a los aminoácidos fuera de las CDR. Se pretende que el término "región de entramado" signifique cada dominio del entramado que está separado por las CDR. Por tanto, para el ejemplo específico de una región VH y para las CDR tal como se definen por Kabat, región de entramado 1 (FR 1) corresponde al dominio de la región variable que abarca los aminoácidos 1-30; región de entramado 2 (FR2) corresponde al dominio de la región variable que abarca los aminoácidos 36-49; región 3 (FR3) corresponde al dominio de la región variable que abarca los aminoácidos 66-94, y región 4 (FR4) corresponde al dominio de la región variable desde el aminoácido 103 hasta el final de la región variable. Las FR para la cadena ligera están separadas de manera similar por cada una de las CDR de región variable de cadena ligera. De manera similar, usando la definición de CDR de Chothia o MacCallum,
o cualquier combinación de definiciones de CDR, los límites de entramado están separados por los extremos terminales de CDR respectivas tal como se describió anteriormente. A pesar de las múltiples definiciones de CDR, en algunas realizaciones se prefiere usar la definición de Kabat para definir las CDR.
Los residuos en un anticuerpo humanizado que no son de un anticuerpo humano pueden ser residuos o secuencias importados de, o derivados de, otra especie (incluyendo, pero sin limitarse a, ratón), o estas secuencias pueden ser secuencias de aminoácidos al azar (por ejemplo, generadas a partir de secuencias de ácido nucleico aleatorizadas), que se insertan en la secuencia de anticuerpo humanizado. Tal como se indicó anteriormente, las secuencias de aminoácidos humanas en un anticuerpo humanizado son preferiblemente las FR, mientras que los residuos que no son de un anticuerpo humano (tanto si se derivan de otra especie como si son secuencias de aminoácidos al azar) corresponden preferiblemente a las CDR. Sin embargo, en algunas realizaciones, una o más FR pueden
contener uno o más residuos de aminoácido no humanos. En casos de alteraciones o modificaciones (por ejemplo, mediante introducción de un residuo no humano) en un entramado por lo demás humano, es posible que la FR alterada o modificada esté adyacente a una CDR modificada de otra especie o una secuencia de 5 CDR al azar, mientras que en otras realizaciones, una FR alterada no está adyacente a una secuencia de CDR alterada de otra especie o una secuencia de CDR al azar. En algunas realizaciones, las secuencias de entramado de un anticuerpo humanizado son completamente humanas (es decir, no se realiza ningún cambio de entramado en el entramado humano). En realizaciones preferidas, las secuen
10 cias de entramado de un anticuerpo humanizado son completamente de línea germinal humana (es decir, no se realiza ningún cambio de entramado en el entramado de línea germinal humana).
Los residuos de aminoácido no humanos de otra especie, o una secuencia al azar, se denominan con frecuencia residuos "importados", que se toman normalmente de un dominio variable "importado". La humanización puede realizarse esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (por ejemplo, Jones et al. , Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al. , Nature, 332: 323-327 (1 988); Verhoeyen et al. , Science, 239: 1534-1536 (1988», sustituyendo CDR de 20 roedor (u otro mamífero) o secuencias de CDR por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Además, también pueden generarse anticuerpos en los que sustancialmente menos que un dominio variable humano intacto se ha sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana (por ejemplo, patente estadounidense 4.816.567). En la práctica, normalmente los an25 ticuerpos humanizados son anticuerpos humanos en los que algunos residuos de CDR y posiblemente algunos residuos de FR se sustituyen por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedor o, tal como se indicó anteriormente, en los que se han sustituido secuencias de CDR por secuencias al azar. Únicamente a modo de ejemplo no limitativo, se describen métodos para conferir afinidad de unión a
30 CDR donadora a un entramado de región variable aceptora de anticuerpo en el documento WO 01/27160 Al, yen las solicitudes de patente estadounidense con números de serie 09/434.870 y 09/982.464.
La elección de dominios variables humanos, tanto ligero como pesado, que van a usarse en la preparación de los anticuerpos humanizados es importante para reducir la antigenicidad. Según el denominado método de "ajuste óptimo", se examina la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor que va a humanizarse con respecto a la biblioteca completa de secuencias de dominio variable humano conocidas. Entonces se acepta la secuencia humana que es más próxima a la del roedor como entramado humano (FR) para el anticuerpo humanizado (por ejemplo, Sims et al., J. Immnunol., 151: 2296 (1993), Y Chothia et al., J. Mol. Biol., 196: 901 (1987». Otro método usa un entramado particular derivado de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligera o pesada. Puede usarse el mismo entramado para varios anticuerpos humanizados diferentes (por ejemplo, Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151: 2623 (1 993».
En otras realizaciones, no hay necesidad de "seleccionar previamente" un entramado de anticuerpo humano particular (es decir, no hay necesidad de seleccionar un entramado humano con la homología o identidad de secuencia más próxima a un anticuerpo candidato dado que va a humanizarse). En estas realizaciones, puede usarse un entramado humano común o universal para aceptar una o más CDR no humanas. En la realización preferida, se usa un único entramado universal, completamente humano, como entramado para todos los anticuerpos que van a humanizarse, independientemente de su homología con la(s) secuencia(s) de entramado de los anticuerpos candidatos. Con respecto a esto, pueden generarse anticuerpos humanizados sin realizar ningún cambio en la región de entramado. Este entramado universal, completamente humano, puede aceptar entonces una
o más secuencias de CDR. En una realización, la una o más secuencias de CDR son secuencias de CDR de un anticuerpo de otra especie (por ejemplo, ratón o rata) que se han modificado en comparación con la CDR correspondiente en el anticuerpo intacto de la otra especie (es decir, hay una introducción simultánea de la CDR y modificación de la CDR que está introduciéndose en el entramado humano universal). La modificación corresponde a uno o más cambios de aminoácidos (en la CDR modificada) en comparación con la CDR correspondiente en el anticuerpo intacto de la otra especie. En una realización, se incluyen todos los residuos de aminoácido en la CDR en una biblioteca, mientras que en otras realizaciones, no se incluyen todos los residuos de aminoácido de CDR en una biblioteca. En otra realización, la una o más secuencias de CDR son secuencias al azar, que sustituyen a secuencias de CDR.
En realizaciones preferidas, se humanizan anticuerpos con retención de alta afinidad por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. En algunas realizaciones, la afinidad del anticuerpo humanizado por el antígeno es superior a la afinidad del anticuerpo intacto, no humanizado, correspondiente o fragmento o parte del mismo (por ejemplo, el anticuerpo de roedor candidato). Con respecto a esto, en algunas realizaciones, se preparan anticuerpos humanizados mediante un procedimiento de análisis de las secuencias originales y diversos productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias originales y humanizadas. Hay modelos de inmunoglobulina tridimensionales comúnmente disponibles y resultan familiares para los expertos en la técnica. Hay programas informáticos disponibles que ilustran y presentan estructuras conformacionales tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspección de estas presentaciones permite el análisis del papel probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antígeno. De esta manera, pueden seleccionarse y combinarse residuos de FR del receptor y secuencias importadas de modo que se logra la característica de anticuerpo deseada, tal como afinidad aumentada por el/los antígeno(s) diana. En general, los residuos de CDR están implicados directamente y muy sustancialmente en influir sobre la unión a antígeno.
Puede emplearse una variedad de métodos específicos, bien conocidos por un experto en la técnica, para introducir CDR de anticuerpo (o secuencias al azar que sustituyen a CDR de anticuerpo) en entramados de anticuerpo (véanse, por ejemplo, las solicitudes estadounidenses 09/434.879 y 09/982.464). En algunas realizaciones, pueden usarse oligonucleótidos solapantes para sintetizar un gen de anticuerpo, o parte del mismo (por ejemplo, un gen que codifica para un anticuerpo humanizado). En otras realizaciones, puede llevarse a cabo la mutagénesis de un molde de anticuerpo usando los métodos de Kunkel (citado a continuación), por ejemplo para introducir una CDR modificada o una secuencia al azar para sustituir a una CDR. En algunas realizaciones, se humanizan por separado regiones variables de cadena ligera y pesada, y después se coexpresan como una región variable humanizada. En otras realizaciones, regiones variables humanizadas constituyen la región variable de un anticuerpo intacto. En algunas realizaciones, la región Fc del anticuerpo intacto que comprende una región variable humanizada se ha modificado (por ejemplo, se ha realizado al menos una modificación de aminoácido en la región Fc). Por ejemplo, un anticuerpo que se ha humanizado con CDR aleatorizada y sin cambios de entramado puede comprender al menos una modificación de aminoácido en la región Fc.
En otras realizaciones, se emplean animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que pueden, tras inmunización, producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigota del gen de la región de unión (JH) de cadena pesada de anticuerpo en ratones mutantes quiméricos y de línea germinal da como resultado la completa inhibición de la producción de anticuerpo endógeno. La transferencia de la matriz génica de inmunoglobulina de línea germinal humana en ratones mutantes de línea germinal de este tipo dará como resultado la producción de anticuerpos humanos tras la exposición a antígeno (véanse, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551 (1993), Y Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258 (1 993». También pueden derivarse anticuerpos humanos de bibliotecas de presentación en fago (por ejemplo, Hoogenboom et al. , J. Mol. Biol., 227: 381 (1991), Y Vaughan et al., Nature Biotech 14: 309 (1 996».
La presente descripción proporciona métodos para generar anticuerpos humanizados (y fragmentos de anticuerpo) que comprenden al menos una sustitución de aminoácido enumerada en la tabla 1 en el presente documento, en la región Fc (en comparación con un polipéptido original que comprende una región Fc sin la sustitución de aminoácido). A continuación se comentan métodos adicionales para generar tales anticuerpos humanizados. La presente descripción también proporciona composiciones que comprenden los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo generados mediante esos métodos. De manera importante, los métodos de humanización comentados a continuación, y otros métodos de humanización (por ejemplo, comentados anteriormente), pueden combinarse con las regiones Fc variantes. Con respecto a esto, pueden construirse anticuerpos humanizados con regiones Fc alteradas, únicas.
En algunas realizaciones, se proporciona un método de construcción de una población de ácidos nucleicos que codifican para región VH alterada, que comprende: a) proporcionar una representación de secuencias de aminoácidos de referencia primera y segunda, comprendiendo la primera secuencia de referencia la se10 cuencia de una región VH donadora, comprendiendo la región variable donadora i) FR Y ii) tres CDR tal como se define por las definiciones combinadas de Kabat y Chothia; comprendiendo la segunda secuencia de referencia la secuencia de una región VH aceptora que comprende FR; b) sintetizar primeros oligonucleótidos que codifican para partes de las FR de la región VH aceptora, en el que las partes de las FR en comparación con la segunda secuencia de referencia no están modificadas; y una población de segundos oligonucleótidos, que codifican cada uno para i) al menos una parte de una primera CDR que se ha modificado, seleccionándose la primera CDR del grupo que consiste en HCDR1 , HCDR2 y HCDR3, en el que la primera CDR modificada comprende un aminoácido diferente en una 20 o más posiciones en comparación con las CDR donadoras correspondientes de la primera secuencia de referencia y ii) una o más partes de FR no modificadas que pueden hibridarse con los primeros oligonucleótidos; c) mezclar los primeros oligonucleótidos con la población de segundos oligonucleótidos para crear oligonucleótidos solapantes; y d) tratar los oligonucleótidos solapantes en condiciones ta
25 les que se construye una población de ácidos nucleicos que codifican para región VH alterada, en el que las FR codificadas por los ácidos nucleicos que codifican para región VH alterada no están modificadas con respecto a la segunda secuencia de referencia.
30 En otras realizaciones, se proporciona un método de construcción de una población de ácidos nucleicos que codifican para región VL alterada, que comprende: a) proporcionar una representación de secuencias de aminoácidos de referencia
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primera y segunda, comprendiendo la primera secuencia de referencia la secuencia de una región VL donadora, comprendiendo la región variable donadora i) FR y ii) tres CDR tal como se define por las definiciones combinadas de Kabat y Chothia; comprendiendo la segunda secuencia de referencia la secuencia de una región VL aceptora que comprende FR; b) sintetizar primeros oligonucleótidos que codifican para partes de las FR de la región VL aceptora, en el que las partes de las FR en comparación con la segunda secuencia de referencia no están modificadas; y una población de segundos oligonucleótidos, que codifican cada uno para i) al menos una parte de una primera CDR que se ha modificado, seleccionándose la primera CDR del grupo que consiste en LCDR1 , LCDR2 y LCDR3, en el que la primera CDR modificada comprende un aminoácido diferente en una o más posiciones en comparación con las CDR donadoras correspondientes de la primera secuencia de referencia y ii) una o más partes de FR no modificadas que pueden hibridarse con los primeros oligonucleótidos; c) mezclar los primeros oligonucleótidos con la población de segundos oligonucleótidos para crear oligonucleótidos solapantes; y d) tratar los oligonucleótidos solapantes en condiciones tales que se construye una población de ácidos nucleicos que codifican para región VL alterada, en el que las FR codificadas por los ácidos nucleicos que codifican para región VL alterada no están modificadas con respecto a la segunda secuencia de referencia.
En algunas realizaciones, se contempla un método de construcción de una población de ácidos nucleicos que codifican para región VH alterada, que comprende: A) proporcionar una representación de secuencias de aminoácidos de referencia primera y segunda, comprendiendo la primera secuencia de referencia la secuencia de una región VH donadora, comprendiendo la región variable donadora i) FR Y ii) tres CDR tal como se define por las definiciones combinadas de Kabat y Chothia; comprendiendo la segunda secuencia de referencia la secuencia de una región VH aceptora que comprende FR; B) sintetizar una población de primeros oligonucleótidos, codificando cada uno para al menos una parte de una primera CDR seleccionada del grupo que consiste en HCDR1 , HCDR2 Y HCDR3, en el que la primera CDR modificada comprende un aminoácido diferente en una o más posiciones en comparación con las CDR donadoras correspondientes de la primera secuencia de referencia; y segundos oligonucleótidos que codifican para i) partes de las FR de la región VH aceptora, en el que las partes de las FR en comparación con la secuencia de referencia no están modificadas y ii) una o más partes de una CDR que pueden hibridarse con la población de primeros oligonucleótidos; C) mezclar la población de primeros oligonucleótidos con los segundos oligonucleótidos para crear oligonucleótidos solapantes; y O) tratar los oligonucleótidos solapantes en condiciones tales que se construye una población de ácidos nucleicos que codifican para región VH alterada, en el que las FR codificadas por los ácidos nucleicos que codifican para región VH alterada no están modificados con respecto a la segunda secuencia de referencia.
En otras realizaciones, se proporciona un método de construcción de una población de ácidos nucleicos que codifican para región VL alterada, que comprende: A) proporcionar una representación de secuencias de aminoácidos de referencia primera y segunda, comprendiendo la primera secuencia de referencia la secuencia de una región VL donadora, comprendiendo la región variable donadora i) FR Y ii) tres CDR tal como se define por las definiciones combinadas de Kabat y Chothia; comprendiendo la segunda secuencia de referencia la secuencia de una región VL aceptora que comprende FR; 8) sintetizar a) una población de primeros oligonucleótidos, codificando cada uno para al menos una parte de una primera CDR seleccionada del grupo que consiste en LCDR1 , LCDR2 Y LCDR3, en el que la primera CDR modificada comprende un aminoácido diferente en una o más posiciones en comparación con las CDR donadoras correspondientes de la primera secuencia de referencia; y b) segundos oligonucleótidos que codifican para i) partes de las FR de la región VL aceptora, en el que las partes de las FR en comparación con la secuencia de referencia no están modificadas y ii) una o más partes de una CDR que pueden hibridarse con la población de primeros oligonucleótidos; C) mezclar la población de primeros oligonucleótidos con los segundos oligonucleótidos para crear oligonucleótidos solapantes; y O) tratar los oligonucleótidos solapantes en condiciones tales que se construye una población de ácidos nucleicos que codifican para región VL alterada, en el que las FR codificadas por los ácidos nucleicos que codifican para región VL alterada no están modificadas con respecto a la segunda secuencia de referencia.
En algunas realizaciones, la representación de secuencias de referencia primera y segunda es en forma electrónica. En algunas realizaciones, el método comprende además la etapa de (e) coexpresar la población de ácidos nucleicos que codifican para región VH alterada con un ácido nucleico que codifica para región variable de cadena ligera para producir una población diversa de regiones variables heteroméricas alteradas. En algunas realizaciones, la síntesis comprende síntesis química. En algunas realizaciones, el aceptor es humano. En algunas realizaciones, el tratamiento de la etapa (d) comprende la extensión mediante una polimerasa.
En otras realizaciones, se contempla un método de construcción de una población de ácidos nucleicos que codifican para región VH alterada, que comprende: a) proporcionar una representación de secuencias de aminoácidos de referencia primera y segunda, comprendiendo la primera secuencia de referencia la secuencia de una región VH donadora, comprendiendo la región variable donadora i) FR Y ii) tres CDR, comprendiendo la segunda secuencia de referencia una región VH; b) sintetizar una población de secuencias génicas de anticuerpo de región VH alterada, en el que las FR de las regiones VH alteradas son idénticas a las FR de la segunda secuencia de referencia y al menos una primera CDR de las regiones variables de anticuerpo alteradas se ha modificado, en el que la primera CDR modificada comprende un aminoácido diferente en una o más posiciones en comparación con la CDR donadora correspondiente de la primera secuencia de referencia.
En algunas realizaciones, se contempla un método de construcción de una población de ácidos nucleicos que codifican para región VL alterada, que comprende: a) proporcionar una representación de secuencias de aminoácidos de referencia primera y segunda, comprendiendo la primera secuencia de referencia la secuencia de una región VL donadora, comprendiendo la región variable donadora i) FR Y ii) tres CDR; comprendiendo la segunda secuencia de referencia la secuencia de una región VL aceptora que comprende FR; b) sintetizar una población de secuencias génicas de anticuerpo de región VL alterada, en el que las FR de las regiones VL alteradas son idénticas a las FR de la segunda secuencia de referencia y al menos una primera CDR de la región VL de anticuerpo alterada se ha modificado, en el que la primera CDR modificada comprende un aminoácido diferente en una o más posiciones en comparación con la CDR donadora correspondiente de la primera secuencia de referencia.
En algunas realizaciones, la representación de secuencias de referencia primera y segunda es en forma electrónica. En algunas realizaciones, el método comprende además la etapa de coexpresar la población de ácidos nucleicos que codifican para región VL alterada con un ácido nucleico que codifica para región VH para producir una población diversa de regiones variables heteroméricas alteradas. En algunas realizaciones, el aceptor es humano. En algunas realizaciones, la síntesis implica el uso de oligonucleótidos solapantes.
Aún en otras realizaciones, se contempla un método de construcción de una población de ácidos nucleicos que codifican para región VH alterada, que comprende: a) proporcionar una representación de una secuencia de aminoácidos de referencia, comprendiendo la secuencia de referencia la secuencia de una región VH aceptora que comprende FR; b) sintetizar una población de secuencias génicas de anticuerpo de región VH alterada, en el que las FR de las regiones VH alteradas son idénticas a las FR de la secuencia de referencia y al menos una primera CDR de las regiones variables de anticuerpo alteradas comprende una secuencia de aminoácidos al azar.
En otras realizaciones, se contempla un método de construcción de una población de ácidos nucleicos que codifican para región VL alterada, que comprende: a) proporcionar una representación de una secuencia de aminoácidos de referencia, comprendiendo la secuencia de referencia la secuencia de una región VL aceptora que comprende FR; b) sintetizar una población de secuencias génicas de anticuerpo de región VL alterada, en el que las FR de las regiones VL alteradas son idénticas a las FR de la secuencia de referencia y al menos una primera CDR de las regiones VL de anticuerpo alteradas comprende una secuencia de aminoácidos al azar.
Aún en otras realizaciones, se contempla un método de construcción de una población de ácidos nucleicos que codifican para región VH alterada, que comprende: a) proporcionar una representación de una secuencia de aminoácidos de referencia, comprendiendo la secuencia de referencia la secuencia de una región VH aceptora humana que comprende FR; b) sintetizar una población de secuencias génicas de anticuerpo de región VH alterada, en el que las FR de las regiones VH alteradas son idénticas a las FR de la secuencia de referencia humana y al menos una primera CDR de las regiones variables de anticuerpo alteradas comprende una secuencia de aminoácidos al azar. En algunas realizaciones, la representación de la secuencia de referencia humana es en forma electrónica.
En otras realizaciones, se contempla un método de construcción de una población de ácidos nucleicos que codifican para región VL alterada, que comprende: a) proporcionar una representación de una secuencia de aminoácidos de referencia, comprendiendo la secuencia de referencia la secuencia de una región VL aceptora humana que comprende FR; b) sintetizar una población de secuencias génicas de anticuerpo de región VL alterada, en el que las FR de las regiones VL alteradas son idénticas a las FR de la secuencia de referencia humana y al menos una primera CDR de las regiones VL de anticuerpo alteradas comprende una secuencia de aminoácidos al azar.
En algunas realizaciones, la representación de la secuencia de referencia es en forma electrónica. En algunas realizaciones, el método comprende además la etapa de coexpresar la población de ácidos nucleicos que codifican para región VL alterada con un ácido nucleico que codifica para región VH para producir una población diversa de regiones variables heteroméricas alteradas. En algunas realizaciones, la síntesis implica el uso de oligonucleótidos solapantes. En algunas realizaciones, las CDR se definen mediante la definición de Kabat.
En algunas realizaciones, se modifican una o más FR simultáneamente con la introducción de una o más CDR modificadas. En otras realizaciones, los entramados modificados están adyacentes a las CDR modificadas.
En algunas realizaciones, la presente descripción proporciona métodos de construcción de una población de ácidos nucleicos que codifican para región VH alterada, que comprenden: a) proporcionar una representación de secuencias de aminoácidos de referencia primera y segunda, comprendiendo la primera secuencia de aminoácidos de referencia la secuencia de una región VH donadora, comprendiendo la región variable donadora i) FR Y ii) tres CDR tal como se define por las definiciones combinadas de Kabat y Chothia; comprendiendo la segunda secuencia de aminoácidos de referencia la secuencia de una región VH aceptora que comprende FR; b) sintetizar a) una primera población de oligonucleótidos, que comprende oligonucleótidos que codifican para una FR de región VH modificada, o parte de la misma, en los que la FR de región VH, o parte de la misma, contiene una pluralidad de aminoácidos cambiados en una o más posiciones en comparación con la secuencia de referencia de región de entramado aceptora, en los que las posiciones de entramado que se cambian se seleccionan de entre las posiciones de entramado aceptoras de la segunda secuencia de referencia que se diferencian en la posición correspondiente en comparación con las posiciones de entramado donadoras de la primera secuencia de referencia; y b) una segunda población de oligonucleótidos, que codifican cada uno para i) al menos una CDR modificada, o parte de la misma, en los que la CDR modificada, o parte de la misma, comprende un aminoácido diferente en una o más posiciones en comparación con la secuencia de referencia de aminoácidos de CDR donadora correspondiente y ii) una o más partes de FR adyacentes que pueden hibridarse con la primera población de oligonucleótidos; y c) mezclar las poblaciones de oligonucleótidos primera y segunda para crear oligonucleótidos solapantes; y d) tratar los oligonucleótidos solapantes en condiciones tales que se construye una población de ácidos nucleicos que codifican para región VH alterada. En determinadas realizaciones, la representación de secuencias de referencia primera y segunda es en forma electrónica. En otras realizaciones, los métodos comprenden además la etapa de (e) coexpresar la población de ácidos nucleicos que codifican para región VH alterada con un ácido nucleico que codifica para región VL para producir una población diversa de regiones variables heteroméricas alteradas. En realizaciones adicionales, la síntesis comprende síntesis química. En algunas realizaciones, el aceptor es humano. En realizaciones preferidas, la una o más de la población diversa de regiones variables heteroméricas alteradas son parte de un anticuerpo que comprende una región Fc, en el que la región Fc comprende al menos una sustitución de aminoácido en comparación con un polipéptido original que tiene una región Fc.
En otras realizaciones, la presente descripción proporciona métodos de construcción de una población de ácidos nucleicos que codifican para región VL alterada, que comprenden: a) proporcionar una representación de secuencias de aminoácidos de referencia primera y segunda, comprendiendo la primera secuencia de aminoácidos de referencia la secuencia de una región VL donadora, comprendiendo la región variable donadora i) FR Y ii) tres CDR tal como se define por las definiciones combinadas de Kabat y Chothia; comprendiendo la segunda secuencia de aminoácidos de referencia la secuencia de una región VL aceptora que comprende FR; b) sintetizar a) una primera población de oligonucleótidos, que comprende oligonucleótidos que codifican para una FR de región VL modificada,
o parte de la misma, en los que la región de entramado de región VL, o parte de la misma, contiene una pluralidad de aminoácidos cambiados en una o más posiciones en comparación con la secuencia de referencia de región de entramado aceptora, en los que las posiciones de entramado que se cambian se seleccionan de entre las posiciones de entramado acepto ras de la segunda secuencia de referencia que se diferencian en la posición correspondiente en comparación con las posiciones de entramado donadoras de la primera secuencia de referencia; y b) una segunda población de oligonucleótidos, que codifican cada uno para i) al menos una CDR modificada, o parte de la misma, en los que la CDR modificada, o parte de la misma, comprende un aminoácido diferente en una o más posiciones en comparación con la secuencia de referencia de aminoácidos de CDR donadora correspondiente y ii) una o más partes de FR adyacentes que pueden hibridarse con la primera población de oligonucleótidos; y c) mezclar las poblaciones de oligonucleótidos primera y segunda para crear oligonucleótidos solapantes; y d) tratar los oligonucleótidos solapantes en condiciones tales que se construye una población de ácidos nucleicos que codifican para región VL alterada. En otras realizaciones, la representación de secuencias de referencia primera y segunda es en forma electrónica. En realizaciones adicionales, los métodos comprenden además la etapa de (e) coexpresar la población de ácidos nucleicos que codifican para región VL alterada con un ácido nucleico que codifica para región variable de cadena pesada para producir una población diversa de regiones variables heteroméricas alteradas.
En algunas realizaciones, los métodos comprenden a) proporcionar una representación de secuencias de aminoácidos de referencia primera y segunda, comprendiendo la primera secuencia de aminoácidos de referencia la secuencia de una
región VH donadora, comprendiendo la región variable donadora i) FR Y ii) tres CDR tal como se define por las definiciones combinadas de Kabat y Chothia; comprendiendo la segunda secuencia de aminoácidos de referencia la secuencia de una región VH aceptora que comprende FR; b) sintetizar a) una primera pobla5 ción de oligonucleótidos, que comprende oligonucleótidos que codifican para una región de entramado de región VH modificada, o parte de la misma, en los que la FR de región VH, o parte de la misma, contiene una pluralidad de aminoácidos cambiados en una o más posiciones en comparación con la secuencia de referencia de FR aceptora en los que las posiciones de entramado que se cambian se 10 seleccionan de entre las posiciones de entramado aceptoras de la segunda secuencia de referencia que se diferencian en la posición correspondiente en comparación con las posiciones de entramado donadoras de la primera secuencia de referencia; y b) una segunda población de oligonucleótidos, que codifican cada uno para i) al menos una CDR modificada, o parte de la misma, en los que la CDR modificada, o parte de la misma, comprende un aminoácido diferente en una
o más posiciones en comparación con la secuencia de referencia de aminoácidos de CDR donadora correspondiente y ii) una o más partes de FR adyacentes que pueden hibridarse con la primera población de oligonucleótidos; y c) mezclar las poblaciones de oligonucleótidos primera y segunda para crear oligonucleótidos
20 solapantes; y d) extender los oligonucleótidos solapantes con una ADN polimerasa en condiciones tales que se construye una población de ácidos nucleicos que codifican para región VH alterada.
Todavía en otras realizaciones, la presente descripción proporciona métodos de
25 construcción de una población de ácidos nucleicos que codifican para región VL alterada, que comprenden: a) proporcionar una representación de secuencias de aminoácidos de referencia primera y segunda, comprendiendo la primera secuencia de aminoácidos de referencia la secuencia de una región VL donadora, comprendiendo la región variable donadora i) FR Y ii) tres CDR tal como se define por
30 las definiciones combinadas de Kabat y Chothia; comprendiendo la segunda secuencia de aminoácidos de referencia la secuencia de una región VL aceptora que comprende FR; b) sintetizar a) una primera población de oligonucleótidos, que comprende oligonucleótidos que codifican para una FR de región VL modificada, o parte de la misma, en los que la FR de región VL, o parte de la misma, contiene una pluralidad de aminoácidos cambiados en una o más posiciones en comparación con la secuencia de referencia de FR aceptora, en los que las posiciones de entramado que se cambian se seleccionan de entre las posiciones de entramado aceptoras de la segunda secuencia de referencia que se diferencian en la posición correspondiente en comparación con las posiciones de entramado donadoras de la primera secuencia de referencia; y b) una segunda población de oligonucleótidos, que codifican cada uno para i) al menos una CDR modificada, o parte de la misma, en los que la CDR modificada, o parte de la misma, comprende un aminoácido diferente en una o más posiciones en comparación con la secuencia de referencia de aminoácidos de CDR donadora correspondiente y ii) una
o más partes de FR adyacentes que pueden hibridarse con la primera población de oligonucleótidos; y c) mezclar las poblaciones de oligonucleótidos primera y segunda para crear oligonucleótidos solapantes; y d) extender los oligonucleótidos solapantes con una ADN polimerasa en condiciones tales que se construye una población de ácidos nucleicos que codifican para región VL alterada.
En algunas realizaciones, se introducen una o más modificaciones en el entramado, simultáneamente con la introducción de una o más CDR modificadas. Las CDR modificadas pueden comprender una o más alteraciones de aminoácido en comparación con la CDR de una secuencia de referencia. En determinadas realizaciones, los métodos de construcción de una población de ácidos nucleicos que codifican para región VH alterada, comprenden: a) proporcionar una representación de secuencias de aminoácidos de referencia primera y segunda, comprendiendo la primera secuencia de aminoácidos de referencia la secuencia de una región VH donadora, comprendiendo la región variable donadora i) FR Y ii) tres CDR tal como se define por las definiciones combinadas de Kabat y Chothia; comprendiendo la segunda secuencia de aminoácidos de referencia la secuencia de una región VH aceptora que comprende FR; b) sintetizar i) una primera población de oligonucleótidos, que codifican cada uno para al menos una CDR modificada, en los que la CDR modificada comprende un aminoácido diferente en una o más posiciones en comparación con la secuencia de referencia de aminoácidos de CDR donadora correspondiente; y ii) una segunda población de oligonucleótidos, que comprende oligonucleótidos que codifican para partes modificadas de un entramado de región VH, conteniendo la parte modificada una pluralidad de aminoácidos cambiados en una o más posiciones en comparación con la secuencia de referencia de región de entramado aceptara, en los que las posiciones de entramado que se cambian se seleccionan de entre las posiciones de entramado aceptaras de la segunda secuencia de referencia que se diferencian en la posición correspondiente en comparación con las posiciones de entramado donadoras de la primera secuencia de referencia; c) mezclar las poblaciones de oligonucleótidos primera y segunda en condiciones tales que al menos una parte de los oligonucleótidos se hibridan para crear oligonucleótidos solapantes; y d) tratar los oligonucleótidos solapantes en condiciones tales que se construye una población de ácidos nucleicos que codifican para región VH alterada. En determinadas realizaciones, la representación de secuencias de referencia primera y segunda es en forma electrónica. En realizaciones adicionales, los métodos comprenden además la etapa de (e) coexpresar la población de ácidos nucleicos que codifican para región VH alterada con un ácido nucleico que codifica para región VL para producir una población diversa de regiones variables heteroméricas alteradas. En otras realizaciones, el aceptar es humano.
En otras realizaciones, la presente descripción proporciona métodos de construcción de una población de ácidos nucleicos que codifican para región VL alterada, que comprenden: a) proporcionar una representación de secuencias de aminoácidos de referencia primera y segunda, comprendiendo la primera secuencia de aminoácidos de referencia la secuencia de una región VL donadora, comprendiendo la región variable donadora i) FR Y ii) tres CDR tal como se define por las definiciones combinadas de Kabat y Chothia; comprendiendo la segunda secuencia de aminoácidos de referencia la secuencia de una región VL aceptara que comprende FR; b) sintetizar i) una primera población de oligonucleótidos, que codifican cada uno para al menos una CDR modificada, en los que la CDR modificada comprende un aminoácido diferente en una o más posiciones en comparación con la secuencia de referencia de aminoácidos de CDR donadora correspondiente; y ii) una segunda población de oligonucleótidos, que comprende oligonucleótidos que codifican para partes modificadas de un entramado de región VL, conteniendo la parte modificada una pluralidad de aminoácidos cambiados en una
o más posiciones en comparación con la secuencia de referencia de FR aceptara, en los que las posiciones de entramado que se cambian se seleccionan de entre
las posiciones de entramado aceptoras de la segunda secuencia de referencia que se diferencian en la posición correspondiente en comparación con las posiciones de entramado donadoras de la primera secuencia de referencia; c) mezclar las poblaciones de oligonucleótidos primera y segunda en condiciones tales que al menos una parte de los oligonucleótidos se hibridan para crear oligonucleótidos solapantes; y d) tratar los oligonucleótidos solapantes en condiciones tales que se construye una población de ácidos nucleicos que codifican para región VL alterada.
En determinadas realizaciones, pueden generarse los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo que comprenden una variante de Fc y una región variante de cadena pesada alterada. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la presente descripción proporciona métodos de construcción de una población de ácidos nucleicos que codifican para región VH alterada, que comprenden: a) proporcionar una representación de secuencias de aminoácidos de referencia primera y segunda, comprendiendo la primera secuencia de referencia la secuencia de una región VH donadora, comprendiendo la región variable donadora i) FR Y ii) tres CDR tal como se define por las definiciones combinadas de Kabat y Chothia; comprendiendo la segunda secuencia de referencia la secuencia de una región VH aceptora que comprende FR; b) sintetizar A) primeros oligonucleótidos que codifican para partes de las FR de la región VH aceptora, en los que las partes de las FR en comparación con la segunda secuencia de referencia no están modificadas; y B) una población de segundos oligonucleótidos, que codifican cada uno para i) al menos una parte de una primera CDR que se ha modificado, seleccionándose la primera CDR del grupo que consiste en HCDR1 , HCDR2 Y HCDR3, en los que la primera CDR modificada comprende un aminoácido diferente en una o más posiciones en comparación con las CDR donadoras correspondientes de la primera secuencia de referencia y ii) una o más partes de FR no modificadas que pueden hibridarse con los primeros oligonucleótidos; c) mezclar los primeros oligonucleótidos con la población de segundos oligonucleótidos para crear oligonucleótidos solapantes; y d) tratar los oligonucleótidos solapantes en condiciones tales que se construye una población de ácidos nucleicos que codifican para región VH alterada, en los que las FR codificadas por los ácidos nucleicos que codifican para región VH alterada no están modificados con respecto a la segunda secuencia de referencia. En algunas realizaciones, los métodos comprenden además la etapa de coexpresar la población de ácidos nucleicos que codifican para región VH alterada con un ácido nucleico que codifica para región VL para producir una población diversa de regiones variables heteroméricas alteradas.
En otras realizaciones, la presente descripción proporciona métodos de construcción de una población de ácidos nucleicos que codifican para región VL alterada, que comprenden: a) proporcionar una representación de secuencias de aminoácidos de referencia primera y segunda, comprendiendo la primera secuencia de re10 ferencia la secuencia de una región VL donadora, comprendiendo la región variable donadora i) FR Y ii) tres CDR tal como se define por las definiciones combinadas de Kabat y Chothia; comprendiendo la segunda secuencia de referencia la secuencia de una región VL aceptora que comprende FR b) sintetizar a) primeros oligonucleótidos que codifican para partes de las FR de la región VL aceptora, en los que las partes de las FR en comparación con la segunda secuencia de referencia no están modificadas; y b) una población de segundos oligonucleótidos, que codifican cada uno para i) al menos una parte de una primera CDR que se ha modificado, seleccionándose la primera CDR del grupo que consiste en LCDR 1, LCDR2 y LCDR3, en los que la primera CDR modificada comprende un aminoáci20 do diferente en una o más posiciones en comparación con las CDR donadoras correspondientes de la primera secuencia de referencia y ii) una o más partes de FR no modificadas que pueden hibridarse con los primeros oligonucleótidos; c) mezclar los primeros oligonucleótidos con la población de segundos oligonucleótidos para crear oligonucleótidos solapantes; y d) tratar los oligonucleótidos solapantes
25 en condiciones tales que se construye una población de ácidos nucleicos que codifican para región VL alterada, en los que las FR codificadas por los ácidos nucleicos que codifican para región VL alterada no están modificadas con respecto a la segunda secuencia de referencia.
30 En otras realizaciones, la presente descripción proporciona métodos de construcción de una población de ácidos nucleicos que codifican para región VH alterada, que comprenden: A) proporcionar una representación de secuencias de aminoácidos de referencia primera y segunda, comprendiendo la primera secuencia de referencia la secuencia de una región VH donadora, comprendiendo la región variable donadora i) FR Y ii) tres CDR tal como se define por las definiciones combinadas de Kabat y Chothia; comprendiendo la segunda secuencia de referencia la secuencia de una región VH aceptora que comprende FR; B) sintetizar a) una población de primeros oligonucleótidos, codificando cada uno para al menos una parte de una primera CDR seleccionada del grupo que consiste en HCDR1 , HCDR2 y HCDR3, en los que la primera CDR modificada comprende un aminoácido diferente en una o más posiciones en comparación con las CDR donadoras correspondientes de la primera secuencia de referencia; y b) segundos oligonucleótidos que codifican para i) partes de las FR de la región VH aceptora, en los que las partes de las FR en comparación con la secuencia de referencia no están modificadas y ii) una o más partes de una CDR que pueden hibridarse con la población de primeros oligonucleótidos; C) mezclar la población de primeros oligonucleótidos con los segundos oligonucleótidos para crear oligonucleótidos solapantes; y D) tratar los oligonucleótidos solapantes en condiciones tales que se construye una población de ácidos nucleicos que codifican para región VH alterada, en los que las FR codificadas por los ácidos nucleicos que codifican para región VH alterada no están modificadas con respecto a la segunda secuencia de referencia.
En determinadas realizaciones, los métodos comprenden además la etapa de coexpresar la población de ácidos nucleicos que codifican para región VH alterada con un ácido nucleico que codifica para región VL para producir una población diversa de regiones variables heteroméricas alteradas.
En otras realizaciones, la presente descripción proporciona métodos de construcción de una población de ácidos nucleicos que codifican para región VL alterada, que comprenden: A) proporcionar una representación de secuencias de aminoácidos de referencia primera y segunda, comprendiendo la primera secuencia de referencia la secuencia de una región VL donadora, comprendiendo la región variable donadora i) FR Y ii) tres CDR tal como se define por las definiciones combinadas de Kabat y Chothia; comprendiendo la segunda secuencia de referencia la secuencia de una región VL aceptora que comprende FR; B) sintetizar a) una población de primeros oligonucleótidos, codificando cada uno para al menos una parte de una primera CDR seleccionada del grupo que consiste en LCDR1 , LCDR2 y LCDR3, en los que la primera CDR modificada comprende un aminoácido diferente en una o más posiciones en comparación con las CDR donadoras correspondientes de la primera secuencia de referencia; y b) segundos oligonucleótidos que codifican para i) partes de las FR de la región VL aceptora, en los que las partes de las FR en comparación con la secuencia de referencia no están modificadas y ii) una o más partes de una CDR que pueden hibridarse con la población de primeros oligonucleótidos; C) mezclar la población de primeros oligonucleótidos con los segundos oligonucleótidos para crear oligonucleótidos solapantes; y O) tratar los oligonucleótidos solapantes en condiciones tales que se construye una población de ácidos nucleicos que codifican para región VL alterada, en los que las FR codificadas por los ácidos nucleicos que codifican para región VL alterada no están modificadas con respecto a la segunda secuencia de referencia.
En otras realizaciones, la presente descripción proporciona métodos de mejora de la afinidad de unión de una región variable de anticuerpo humanizado mutada, que comprenden: a) proporcionar una secuencia de ácido nucleico que codifica para una primera región variable de anticuerpo humanizado mutada, comprendiendo la región variable mutada (i) un entramado de anticuerpo humano de tipo natural, (ii) tres CDR de cadena pesada no humanas, y (iii) tres CDR de cadena ligera no humanas, en los que las CDR se definen mediante las definiciones combinadas de Kabat y Chothia, en los que al menos una de las CDR de cadena ligera es una CDR de cadena ligera que contiene mutación al menos con al menos un aminoácido diferente en al menos una posición en comparación con la CDR no humana de tipo natural correspondiente, yen los que la primera región variable de anticuerpo mutada tiene una afinidad de unión superior a la región variable de anticuerpo no mutada correspondiente; b) mutar la secuencia de ácido nucleico que codifica para la primera región variable de anticuerpo mutada en condiciones tales que se codifica una segunda región variable de anticuerpo humanizado mutada, comprendiendo la segunda región variable de anticuerpo humanizado mutada al menos un aminoácido diferente adicional en al menos una posición en la CDR de cadena ligera que contiene mutación, dando como resultado la mutación adicional en combinación con la primera mutación una afinidad de unión superior. En algunas realizaciones, la CDR de cadena ligera que contiene mutación de la primera región variable de anticuerpo humanizado mutada es CDR3 (LCDR3).
En otras realizaciones, al menos una de las CDR de cadena pesada no humanas de la primera región variable de anticuerpo humanizado mutada comprende una mutación, de tal manera que se codifica un aminoácido diferente en al menos una posición en comparación con la CDR no humana de tipo natural correspondiente. En realizaciones adicionales, la mutación de CDR de cadena pesada está en HCDR3.
En algunas realizaciones, la presente descripción proporciona métodos de modificación simultánea de al menos una CDR y al menos una FR mientras se construye una población de ácidos nucleicos que codifican para región VH alterada, que comprenden: a) proporcionar una representación de secuencias de aminoácidos de referencia primera y segunda, comprendiendo la primera secuencia de aminoácidos de referencia la secuencia de una región VH donadora, comprendiendo la región variable donadora i) cuatro FR y ii) tres CDR tal como se define por las definiciones combinadas de Kabat y Chothia; comprendiendo la segunda secuencia de aminoácidos de referencia la secuencia de una región VH aceptora que comprende cuatro FR, tal como se define por las definiciones combinadas de Kabat y Chothia; b) sintetizar i) para cada FR que va a modificarse, una población de oligonucleótidos, codificando cada uno para una FR modificada, o parte de la misma, conteniendo la FR modificada o parte de la misma una pluralidad de aminoácidos cambiados en una o más posiciones en comparación con la región de entramado correspondiente en la secuencia de referencia de región VH aceptora, en los que las posiciones de FR que están cambiadas se seleccionan de entre las posiciones de entramado aceptoras de la segunda secuencia de referencia que se diferencian en la posición correspondiente en comparación con las posiciones de región de entramado donadora de la primera secuencia de referencia; y ii) para cada CDR que va a modificarse, una población de oligonucleótidos, codificando cada uno para una CDR modificada, o parte de la misma, en los que la CDR modificada comprende un aminoácido diferente en una o más posiciones en comparación con la secuencia de referencia de aminoácidos de CDR donadora correspondiente; y iii) para cada una de cualquier FR restante y no modificada, oligonucleótidos que codifican para la FR, o parte de la misma, que tienen la misma secuencia que la FR correspondiente de la segunda secuencia aceptora de referen
cia; y iv) para cada una de cualquier CDR restante y no modificada, oligonucleótidos que codifican para la CDR, o parte de la misma, que tienen la misma secuencia que la CDR correspondiente de la primera secuencia donadora de referencia, en los que oligonucleótidos individuales de (i) a (iv) que codifican para partes ad5 yacentes de la región VH tienen secuencias solapantes en sus extremos terminales; y c) mezclar los oligonucleótidos y las poblaciones de oligonucleótidos sintetizados en la etapa b) en condiciones tales que las secuencias solapantes de oligonucleótidos individuales se hibridan para crear oligonucleótidos solapantes; y d) tratar los oligonucleótidos solapantes en condiciones tales que se forma una polO blación de nucleótidos que codifican para región VH alterada. En determinadas realizaciones, la representación de secuencias de referencia primera y segunda es en forma electrónica. En realizaciones adicionales, la región de entramado que va a modificarse se selecciona del grupo que consiste en HFR1 , HFR2 Y HFR3. En otras realizaciones, la CDR que va a modificarse es HCDR3. En otras realiza15 ciones, el método comprende además la etapa de e) coexpresar la población de ácidos nucleicos que codifican para región VH con un ácido nucleico que codifica para región VL para producir una población diversa de regiones variables heteroméricas alteradas. En diferente realizaciones, el método comprende además la etapa de e) coexpresar la población de ácidos nucleicos que codifican para región
20 VH con una población de ácidos nucleicos que codifican para región VL para producir una población diversa de regiones variables heteroméricas alteradas.
En otras realizaciones, se emplean los métodos de modificación simultánea de al menos una CDR y al menos una FR mientras se construye una población de áci25 dos nucleicos que codifican para región VL alterada, comprendiendo dicho método: a) proporcionar una representación de secuencias de aminoácidos de referencia primera y segunda, comprendiendo la primera secuencia de aminoácidos de referencia la secuencia de una región VL donadora, comprendiendo la región variable donadora i) cuatro FR y ii) tres CDR tal como se define por las definiciones 30 combinadas de Kabat y Chothia; comprendiendo la segunda secuencia de aminoácidos de referencia la secuencia de una región VL aceptora que comprende cuatro FR, tal como se define por las definiciones combinadas de Kabat y Chothia; b) sintetizar i) para cada FR que va a modificarse, una población de oligonucleótidos, codificando cada uno para una FR modificada, o parte de la misma,
conteniendo la FR modificada, o parte de la misma, una pluralidad de aminoácidos cambiados en una o más posiciones en comparación con la región de entramado correspondiente en la secuencia de referencia de región VL aceptora, en el que las posiciones de FR que están cambiadas se seleccionan de entre las posiciones de FR aceptora de la segunda secuencia de referencia que se diferencian en la posición correspondiente en comparación con las posiciones de FR donadoras de la primera secuencia de referencia; y ii) para cada CDR que va a modificarse, una población de oligonucleótidos, codificando cada uno para una CDR modificada, o parte de la misma, en el que la CDR modificada comprende un aminoácido diferente en una o más posiciones en comparación con la secuencia de referencia de aminoácidos de CDR donadora correspondiente; y iii) para cada una de cualquier región FR restante y no modificada, oligonucleótidos que codifican para la FR, o parte de la misma, que tiene la misma secuencia que la FR correspondiente de la segunda secuencia aceptora de referencia; y iv) para cada una de cualquier CDR restante y no modificadas, oligonucleótidos que codifican para la CDR, o parte de la misma, que tiene la misma secuencia que la CDR correspondiente de la primera secuencia donadora de referencia, en el que, oligonucleótidos individuales de (i) a (iv) que codifican para partes adyacentes de la región VL tienen secuencias solapantes en sus extremos terminales, y c) mezclar los oligonucleótidos y las poblaciones de oligonucleótidos sintetizados en la etapa b) en condiciones tales que las secuencias solapantes de oligonucleótidos individuales se hibridan para crear oligonucleótidos solapantes; y d) tratar los oligonucleótidos solapantes en condiciones tales que se forma una población de nucleótidos que codifican para región alterada. En determinadas realizaciones, los métodos comprenden además la etapa de coexpresar la población de ácidos nucleicos que codifican para región VL con una población de ácidos nucleicos que codifican para región VH para producir una población diversa de regiones variables heteroméricas alteradas.
La presente descripción proporciona anticuerpos multiespecíficos que compren den una región Fc variante. Los anticuerpos multiespecíficos tienen especificida des de unión para al menos dos antígenos diferentes. Aunque normalmente tales
moléculas sólo se unirán a dos antígenos (es decir, anticuerpos biespecíficos, BsAb), anticuerpos con especificidades adicionales tales como anticuerpos triespecíficos se abarcan por esta expresión cuando se usa en el presente documento. Los ejemplos de BsAb incluyen, pero no se limitan a, aquellos con un brazo dirigido contra un antígeno de célula tumoral y el otro brazo dirigido contra una molécula desencadenante citotóxica tal como anti-FcyRI/anti-CD 15, anti-pl 85HER2/FcyRIII (CD 16), anti-CD3/anti-célula B maligna (D1 DO), anti-CD3/anti-pl 85HER2, anti-CD3/anti-p97, anti-CD3/anti-carcinoma de células renales, antiCD3/anti-OVCAR-3, anti-CD3/L-D I (anti-carcinoma de colon), anti-CD3/antianálogo de hormona estimulante de melanocitos, anti-receptor de EGF/anti-CD3, anti-CD3/anti-CAMAI, anti-CD3/anti-CD1 9, anti-CD3/MoV1 8, anti-molécula de adhesión a células neuronales (NCAM)/anti-CD3, anti-proteína de unión a folato (FBP)/anti-CD3, anti-antígeno asociado con carcinoma de páncreas (AMOC31)/anti-CD3; BsAb con un brazo que se une específicamente a un antígeno tumoral y un brazo que se une a una toxina tal como anti-saporina/anti-id-1, antiCD22/anti-saporina, anti-CD7/anti-saporina, anti-CD38/anti-saporina, antiCEAlanti-cadena A de ricina, anti-interferón a (IFN-a)/anti-idiotipo de hibridoma, anti-CEAlanti-alcaloide de la vinca; BsAb para convertir profármacos activados por enzimas tales como anti-CD30/anti-fosfatasa alcalina (que cataliza la conversión de profármaco fosfato de mitomicina en alcohol de mitomicina); BsAb que pueden usarse como agentes fibrinolíticos tales como anti-fibrina/anti-activador de plasminógeno tisular (tPA) , anti-fibrina/anti-activador de plasminógeno de tipo urocinasa (uPA); BsAb para dirigir complejos inmunitarios a receptores de superficie celular tales como anti-lipoproteína de baja densidad (LDL)/anti-FcR (por ejemplo, FcyRI, FcyRII o FcyRIII); BsAb para su uso en la terapia de enfermedades infecciosas tales como anti-CD3/anti-virus del herpes simple (VHS), anticomplejo receptor de células T:CD3/anti-influenza, anti-FcyR/anti-VIH; BsAb para la detección de tumores in vitre o in vivo tales como anti-CEAlanti-EOTUBE, antiCEAlanti-DPTA, anti-pI85HER2/anti-hapteno; BsAb como adyuvantes de vacuna; y BsAb como herramientas de diagnóstico tales como anti-lgG de conejo/antiferritina, anti-peroxidasa del rábano (HRP)/anti-hormona, anti-somatostatina/antisustancia P, anti-HRP/anti-FITC, anti-CEAlanti-p-galactosidasa.
Los ejemplos de anticuerpos triespecíficos incluyen, pero no se limitan a, antiCD3/anti-CD4/anti-CD37, anti-CD3/anti-CD5/anti-CD37 y anti-CD3/anti-CD8/antiCD37. Pueden prepararse anticuerpos biespecíficos como anticuerpos de longitud completa o como fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos F(ab'h). En la técnica se conocen métodos para preparar anticuerpos biespecíficos. La producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud completa se basa en la coexpresión de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, en la que las dos cadenas tienen especificidades diferentes (por ejemplo, Millstein et al. , Nature, 305: 537-539 (1983)). Debido al ordenamiento al azar de cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una posible mezcla de diez moléculas de anticuerpo diferentes, de las cuales sólo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta puede realizarse mediante etapas de cromatografía de afinidad. Se dan a conocer procedimientos similares en el documento WO 93/08829 y en Traunecker et al. , EMBO J., 10: 3655-3659 (1991).
En otro enfoque, se fusionan dominios variables de anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) con secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión se realiza preferiblemente con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones bisagra, CH2 y CH3. Se prefiere tener la primera región constante de cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para la unión de la cadena ligera presente en al menos una de las fusiones. Se insertan ADN que codifican para las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, en vectores de expresión separados, y se transfectan conjuntamente en un organismo huésped adecuado. Esto proporciona una gran flexibilidad en el ajuste de las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptido en realizaciones en las que proporciones distintas de las tres cadenas polipeptídicas usadas en la construcción proporcionan los rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias codificantes para dos o para las tres cadenas polipeptídicas en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas polipeptídicas en proporciones iguales da como resultado altos rendimientos o cuando las proporciones no tienen significación particular. En una realización preferida de este enfoque, los anticuerpos biespecíficos están compuestos por una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo, y un par cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo (véase, por ejemplo, el documento WO .
5 94/04690). Según otro enfoque descrito en el documento W096/2701 1 la superficie de contacto entre un par de moléculas de anticuerpo puede diseñarse por ingeniería para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recubren a partir de un cultivo de células recombinantes. Los anticuerpos específicos también incluyen anticuerpos reticulados o "heteroconjugados". Por ejemplo, uno de los an
10 ticuerpos en el heteroconjugado puede acoplarse a avidina, el otro a biotina.
B. Moléculas de inmunoadhesina
La presente descripción también proporciona moléculas de inmunoadhesina que
15 comprenden una región Fc variante. Un tipo de diseño de inmunoadhesina combina el/los dominio(s) de unión de la adhesina (por ejemplo, el dominio extracelular (ECO) de un receptor) con la región Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina (por ejemplo, una región Fc variante). De manera habitual, cuando se preparan las inmunoadhesinas, se fusionará ácido nucleico que codifica para el do
20 minio de unión de la adhesina en el extremo C-terminal con ácido nucleico que codifica para el extremo N-terminal de una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina, sin embargo también son posibles fusiones N-terminales.
Normalmente, en tales fusiones el polipéptido quimérico codificado conservará al menos dominios bisagra, CH2 y CH3 funcionalmente activos de la región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina. También se realizan fusiones con el extremo C-terminal de la parte Fc de un dominio constante, o inmediatamente N-terminal a la CH1 de la cadena pesada o la región correspondiente de la cadena ligera. El sitio preciso en el que se realiza la fusión no es crítico; se conocen
30 bien sitios particulares y pueden seleccionarse con el fin de optimizar la actividad biológica, secreción o características de unión de la inmunoadhesina.
En algunas realizaciones, se fusiona la secuencia de adhesina con el extremo Nterminal de la región Fc variante de inmunoglobulina G1 . Es posible fusionar la región constante de cadena pesada completa con la secuencia de adhesina. Sin embargo, en realizaciones preferidas, se usa en la fusión una secuencia que comienza en la región bisagra justo en sentido de 5' del sitio de escisión de papaína que define Fc de IgG químicamente (es decir, residuo 216, considerando que el primer residuo de la región constante de cadena pesada es 114), o sitios análogos de otras inmunoglobulinas. En determinadas realizaciones preferidas, se fusiona la secuencia de aminoácidos de adhesina con (a) la región bisagra y CH2 y CH3 o (b) los dominios CH1 , bisagra, CH2 y CH3, de una cadena pesada de IgG. En algunas realizaciones, las inmunoadhesinas son biespecíficas. Alternativamente, las secuencias de adhesina pueden insertarse entre secuencias de cadena pesada y cadena ligera de inmunoglobulina, de manera que se obtiene una inmunoglobulina que comprende una cadena pesada quimérica. En tales realizaciones, las secuencias de adhesina pueden fusionarse con el extremo 3' de una cadena pesada de inmunoglobulina en cada brazo de una inmunoglobulina, o bien entre el dominio bisagra y el CH2 o bien entre los dominios CH2 y CH3 (véase, por ejemplo, Hoogenboom et al. , Mol. Immunol. 28:1027-1037 (1991).
Aunque no se requiere la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en las inmunoadhesinas de la presente invención, puede estar presente una cadena ligera de inmunoglobulina o bien asociada covalentemente con un polipéptido de fusión de adhesina-cadena pesada de inmunoglobulina o bien fusionada directamente con la adhesina. En el primer caso, normalmente se expresa conjuntamente ADN que codifica para una cadena ligera de inmunoglobulina con el ADN que codifica para la proteína de fusión de adhesina-cadena pesada de inmunoglobulina. Tras la secreción, la cadena pesada y la cadena ligera híbridas estarán covalentemente asociadas para proporcionar una estructura de tipo inmunoglobulina que comprende dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina unidos mediante enlace disulfuro. Se dan a conocer métodos adecuados para la preparación de tales estructuras, por ejemplo, en la patente estadounidense n.o
4.816.567.
En realizaciones preferidas, se construyen inmunoadhesinas fusionando la secuencia de ADNc que codifica para la parte de adhesina en marco con una secuencia de ADNc de inmunoglobulina. Sin embargo, también puede usarse la fusión con fragmentos de inmunoglobulina genómicos. Generalmente, este último tipo de fusión requiere la presencia de secuencias reguladoras de Ig para la expresión. Pueden aislarse ADN que codifican para regiones constantes de cadena pesada de IgG basándose en secuencias publicadas de bibliotecas de ADNc derivadas de linfocitos de sangre periférica o bazo, mediante hibridación o mediante técnicas de PCR. Los ADNc que codifican para las partes de "adhesina" y de inmunoglobulina de la inmunoadhesina pueden insertarse en tándem en un vector de plásmido que dirige la expresión eficaz en las células huésped elegidas.
Semivida alterada de variantes El receptor de Fc nenonatal "FcRn" es un homólogo de complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) que no sólo suministra IgG a través de la barrera maternofetal durante la gestación, sino que también está implicado en la regulación de la semivida sérica de IgG. Para una revisión reciente sobre FcRn véase Ghetie, Vy
E.S. Ward, Annu. Rev. Immunol. 18:739-766, 2000. FcRn se une a IgG de una manera dependiente del pH produciéndose la unión a pH ligeramente ácidos y produciéndose poca unión o unión no detectable a pH 7,4. Se plantea que las IgG se captan por células que expresan FcRn y entran en endosomas ácidos en los que se produce la interacción FcRn-lgG. Entonces se transportan las IgG a la superficie celular y se liberan a pH casi neutro. Las IgG que no se unen a FcRn tras la captación en células entran en compartimentos lisosómicos y se degradan. Concuerda con este modelo la hipótesis de que polipéptidos que comprenden una región Fc variante que se une a FcRn con afinidad aumentada tienen una semivida sérica más larga que aquéllos con una afinidad menor.
El papel de FcRn como transportador de IgG indica que regiones Fc variantes con afinidad alterada por FcRn pueden tener utilidad terapéutica o bien en el contexto de un anticuerpo monoclonal o bien cuando se unen operativamente a una proteína heteróloga, es decir, distinta de anticuerpo. Los polipéptidos terapéuticos que se beneficiarán por aclararse rápidamente del sujeto o del paciente o por no transportarse a través de la membrana placentaria, por ejemplo, polipéptidos radiomarcados, se beneficiarán por unirse operativamente a una región Fc que presenta una afinidad de unión a FcRn disminuida. Alternativamente, polipéptidos que se beneficiarán de tener una semivida sérica más larga y por tanto necesitan administrarse pocas veces o por transportarse a través de la membrana placentaria preferiblemente se unirán operativamente a una región Fc que presenta afinidad de unión a FcRn potenciada (véanse las tablas 2, 5 Y 6). Se contemplan numerosas combinaciones de características de Fc, por ejemplo, puede generarse una región Fc con afinidad de unión a FcRn potenciada pero con poca o ninguna actividad de CDC o ADCC incorporando una o más sustituciones de aminoácidos de Fc que potencian la afinidad de unión a FcRn tal como se indica en la tabla 2 en, por ejemplo, una región Fc original de IgG4, o en una región Fc original de IgG1 en combinación con sustitución de aminoácido que disminuye la actividad de CDC y ADCC.
Polipéptidos preferidos que se beneficiarán de una semivida sé rica aumentada por estar operativamente unidos a una región Fc variante de la invención que presenta una afinidad de unión a FcRn potenciada en comparación con el polipéptido original son polipéptidos terapéuticos de mamífero incluyendo moléculas tales como, por ejemplo, renina; una hormona de crecimiento; hormona de crecimiento humana; hormona de crecimiento bovina; factor de liberación de hormona de crecimiento; grelina; hormona paratiroidea; hormona estimulante del tiroides; lipoproteína; cadena A de la insulina; cadena B de la insulina; a1-antitripsina; PAI-1; proinsulina; trombopoyetina; hormona foliculoestimulante; calcitonina; hormona luteinizante; glucagones; factores de coagulación tales como factor VIIIC, factor IX, factor tisular y factor de von Willdebrand; factores anticoagulantes tales como proteína C; factor naturiético auricular; tensioactivo pulmonar; un activador de plasminógeno, tal como urocinasa o activador de plasminógeno de tipo tisular (t-PA) o de orina humana; bombesina; trombina; factor de crecimiento hematopoyético; interleucinas, por ejemplo, IL-1 a IL-10, IL-20; factor de necrosis tumoral alfa y beta; encefalinasa; una albúmina sérica tal como albúmina sé rica humana; sustancia inhibidora mulleriana; cadena A de la relaxina; cadena B de la relaxina; prorelaxina; péptido asociado a gonadotropina de ratón; una proteína microbiana, tal como beta-Iactamasa; ADNasa; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); receptores para hormonas o factores de crecimiento; integrina; proteína A o D; factores reumatoides; un factor neurotrófico tal como factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), neurotrofina 3, 4, 5 ó 6 (NT-3, NT -4, NT-5 o NT6), o un factor de crecimiento nervioso tal como NGF-beta, cardiotrofinas (factor de hipertrofia cardiaco) tal como cardiotrofina 1 (CT -1); factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGR); factor de crecimiento de fibroblastos tal como aFGF y bFGF, factor de crecimiento epidérmico (EGF) o su receptor; factor de crecimiento transformante (TGF) tal como TGF-alfa y TGF-beta, incluyendo TGF1 , EGF-2, EGF-3, EGF-4 o TGF-5; factor de crecimiento similar a la insulina I y 11; des(1-3)-IGF-1 (IGF-I cerebral), proteínas de unión a factor de crecimiento similar a la insulina; proteínas CD tales como CD-3, CD-4, CD-8 y CD-19; eritropoyetina; factores osteoinductores; inmunotoxinas; una proteína morfogenética ósea, un factor de diferenciación del crecimiento (por ejemplo, GDF-8); un interferón tal como interferón alfa, beta y gamma; factores estimulantes de colonias (CSF), por ejemplo, M-CSF; GM-CSF y G-CSF; un anticuerpo anti-HER-2 sin una región Fc nativa de una IgG; un anticuerpo anti-VSR sin una región Fc nativa de una IgG; superóxido dismutasa; receptores de células T; proteínas de membrana de superficie; factor acelerador de la degradación; antígeno viral tal como, por ejemplo, una parte de la envuelta de VIH-1; proteína de transporte; receptores de direccionamiento; adresinas; proteínas reguladoras; anticuerpos sin una región Fc nativa de una IgG; y fragmentos o precursores de cualquiera de los polipéptidos indicados anteriormente.
La región Fc variante que comprende una sustitución de aminoácido que confiere una semivida sérica alterada al polipéptido (es decir, afinidad de unión a FcRn potenciada) al que está operativamente unida está de manera preferible operativamente unida al extremo carboxilo o amino-terminal del polipéptido de interés generando de ese modo una proteína de fusión.
Secuencias de ácido nucleico codifican Fc variantes La presente descripción también proporciona secuencias de ácido nucleico que codifican para regiones Fc variantes, así como composiciones, vectores y células huésped que comprenden secuencias de ácido nucleico que codifican para regiones Fc variantes. La presente descripción también proporciona métodos recombinantes para producir una región Fc variante.
Generalmente, para la producción recombinante de variantes, se aísla ácido nucleico que codifica para la variante y se inserta en un vector. Pueden transfectarse células huésped con el vector, permitiendo de ese modo amplificar la secuencia de ácido nucleico y/o producir el péptido variante. Pueden aislarse y secuenciarse secuencias de ácido nucleico que codifican para las variantes peptídicas de la presente invención usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas oligonucleotídicas que pueden unirse específicamente a ácido nucleico que codifica para la variante). Generalmente, la secuencia de ácido nucleico que codifica para la variante está operativamente unida a otros elementos, tales como una secuencia señal (por ejemplo, secuencias señal secretoras), un origen de replicación, al menos un gen marcador, un potenciador, un promotor o un terminador de la transcripción. En determinadas realizaciones, se transfectan de manera estable células huésped con ácido nucleico que codifica para una variante para generar una línea celular que expresa una variante particular. En realizaciones preferidas, las variantes se expresan en células CHO, NSO, Sp2/0, PER.C6 o HEK293. En la técnica se conocen bien métodos recombinantes.
Pueden mutarse secuencias de ácido nucleico de tal manera que pueden producirse regiones Fc variantes. Por ejemplo, puede mutarse una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región Fc original (por ejemplo, SEQ ID NO: 1-12) de tal manera que se obtiene como resultado al menos un cambio de aminoácido cuando se expresa la secuencia de ácido nucleico. Además, pueden mutarse secuencias de ácido nucleico que codifican para al menos una parte de una región Fc original para producir secuencias de aminoácidos que comprenden al menos una parte de una región Fc variante.
En determinadas realizaciones, se emplea síntesis basada en codones para generar secuencias mutadas. Los ejemplos de síntesis basada en codones incluyen, por ejemplo, las descritas en las patentes estadounidenses 5.264.563, 5.523.388 Y 5.808.022. En resumen, puede realizarse síntesis basada en codones acopIando secuencialmente monómeros sobre soportes separados para formar al menos dos tupletes diferentes. El acoplamiento puede realizarse en recipientes de reacción separados, después mezclando los soportes de los recipientes de reacción y dividiendo los soportes mezclados en dos o más recipientes de reacción separados, y repitiendo las etapas de acoplamiento, mezclado y división una o más ve
ces en los recipientes de reacción, terminando con una etapa de mezclado o divi sión. Adicionalmente, pueden escindirse los oligonucleótidos de los soportes. Formulaciones usos En algunas realizaciones, la presente descripción proporciona formulaciones tera péuticas que comprenden las variantes descritas en el presente documento. Por ejemplo, tales composiciones pueden incluir un polipéptido variante (o parte del mismo), proporcionado junto con líquidos, geles, portadores sólidos, diluyentes, adyuvantes y excipientes fisiológicamente tolerables, y combinaciones de los mismos (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences 168 edición, Osol, A. Ed. (1980)).
Además, pueden usarse variantes polipeptídicas junto con, antes o después de otros agentes terapéuticos, incluyendo, pero sin limitarse a, salicilatos, esteroides, inmunosupresores, anticuerpos o antibióticos. Los agentes terapéuticos particula res que pueden usarse con las variantes de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, los siguientes agentes, compuestos de azobenceno (patente es tadounidense n.O 4.312.806), derivados de rodamina sustituidos con bencilo (pa tente estadounidense n.O 5.216.002), sales de zinc de L-carnosina (patente estadounidense n.o 5.238.931), 3-fenil-5-carboxipirazoles e isotiazoles (patente esta dounidense n.O 5.294.630), IL-10 (patente estadounidense n.O 5.368.854), inhibi dores de la síntesis de leucotrieno de quinolina (patente estadounidense n.O
5.391 .555), 2'-haI0-2'-desoxiadenosina (patente estadounidense n.O 5.506.21 3), compuestos de fenol y benzamida (patente estadounidense n.O 5.552.439), tributirina (patente estadounidense n.O 5.569.680), determinados péptidos (patente estadounidense n.O 5.756.449), ácidos omega-3 poliinsaturados (patente estadounidense n.O 5.792.795), bloqueantes de VLA-4 (patente estadounidense n.O 5.932.214), metasulfobenzoato de prednisolona (patente estadounidense n.O 5.834.021), agentes limitadores de citocinas (patente estadounidense n.O 5.888.969) y nicotina (patente estadounidense n.O 5.889.028).
Pueden usarse polipéptidos variantes junto con agentes que reducen la viabilidad o el potencial proliferativo de una célula. Los agentes que reducen la viabilidad o el potencial proliferativo de una célula pueden funcionar de una variedad de maneras incluyendo, por ejemplo, inhibir la síntesis de AON, inhibir la división celular, inducir la apoptosis, o inducir la muerte celular no apoptótica. Los ejemplos específicos de agentes citotóxicos y citostáticos incluyen, pero no se limitan a, proteína antiviral de fitolaca, abrina, ricina y cada una de sus cadenas A, doxorubicina, cisplatino, yodo 131, itrio 90, renio 188, bismuto 212, taxol, 5-f1uorouracilo, VP-16, bleomicina, metotrexato, vindesina, adriamicina, vincristina, vinblastina, BCNU, mitomicina y ciclofosfamida y determinadas citocinas tales como TNF-a y TNF-. Por tanto, los agentes citotóxicos y citostáticos pueden incluir, por ejemplo, radionúclidos, fármacos quimioterápicos, proteínas y lectinas.
Las composiciones terapéuticas pueden comprender, por ejemplo, aditivos normalmente empleados tales como aglutinantes, cargas, portadores, conservantes, agentes estabilizantes, emulsionantes, tampones y excipientes tales como, por ejemplo, calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, y similares. Estas composiciones contienen normalmente el 1 %-95% de principio activo, preferiblemente el 2%-70% de principio activo.
Los polipéptidos variantes también pueden mezclarse con diluyentes o excipientes que son compatibles y fisiológicamente tolerables. Son diluyentes y excipientes adecuados, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, o similares, y combinaciones de los mismos. Además, si se desea, las composiciones pueden contener cantidades minoritarias de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes estabilizantes o de tamponamiento del pH.
En algunas realizaciones, las composiciones terapéuticas se preparan o bien como suspensiones o disoluciones líquidas, como pulverizaciones o bien en formas sólidas. Las formulaciones orales incluyen habitualmente aditivos normalmente empleados tales como aglutinantes, cargas, portadores, conservantes, agentes estabilizantes, emulsionantes, tampones y excipientes tales como, por ejemplo, calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, y similares. Estas composiciones adoptan la forma de disoluciones, suspensiones, comprimidos, pastillas, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida o polvos, y contienen normalmente el 1 %95% de principio activo, preferiblemente el 2%-70%. Se describe un ejemplo de una composición oral útil para administrar las composiciones terapéuticas de la presente invención en la patente estadounidense n.o 5.643.602.
Las formulaciones adicionales que son adecuadas para otros modos de administración, tales como administración tópica, incluyen ungüentos, tinturas, cremas, lociones, parches transdérmicos y supositorios. Para los ungüentos y las cremas, los aglutinantes, portadores y excipientes tradicionales pueden incluir, por ejemplo, polialquilenglicoles o triglicéridos. Se describe un ejemplo de un método de administración tópica en la patente estadounidense n.O 5.834.016. También pueden emplearse otros métodos de administración liposómicos (véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 5.851.548 y 5.711.964).
Las formulaciones también pueden contener más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular que esté tratándose, preferiblemente aquellos con actividades complementarias que no se afectan adversamente unos a otros. Tales moléculas están presentes de manera adecuada en combinación en cantidades que son eficaces para el fin previsto.
También pueden prepararse preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el polipéptido variante, matrices que están en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen, pero no se limitan a, poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(metacrilato de 2hidroxietilo) o poli(alcohol vinílico», polilactidas, copolímeros de ácido L-glutámico y L-glutamato de y-etilo, etileno-acetato de vinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como el LUPRON DEPOT (microesferas inyectables compuestas por copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida) y poli(ácido D-(-)-3-hidroxibutírico). Mientras que polímeros tales como etileno-acetato de vinilo y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, determinados hidrogeles liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos.
Los polipéptidos variantes pueden usarse para tratar a un sujeto. Tal tratamiento puede administrarse a un sujeto con una enfermedad, o puede administrarse de manera profiláctica a un sujeto (por ejemplo, a un sujeto predispuesto a padecer una enfermedad). Los ejemplo de estados que pueden tratarse incluyen, pero no 5 se limitan a, cáncer (por ejemplo, en el que el polipéptido variante se une al receptor HER2, CD20 o factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF)); estados alérgicos tales como asma (con un anticuerpo anti-lgE); y trastornos mediados por LFA-1 (por ejemplo, en los que el polipéptido variante es un anticuerpo anti-LFA-I
o anti-ICAM-I), etc.
10 En realizaciones preferidas, las variantes polipeptídicas usadas para tratar a sujetos comprenden anticuerpos o inmunoadhesinas. También en realizaciones preferidas, las enfermedades tratadas son enfermedades sensibles a anticuerpos o inmunoadhesinas. Los ejemplos de enfermedades sensibles a anticuerpos incluyen
15 enfermedades y estados médicos tales como: linfoma (que se muestra que puede tratarse con RITUXAN, un anticuerpo anti-CD20), enfermedad infecciosa (que se muestra que puede tratarse con SYNAGIS, un anticuerpo dirigido a la proteína F del virus sincitial respiratorio), trasplante de riñón (ZENAPAX, un anticuerpo antireceptor de IL-2, ha mostrado ser útil), enfermedad de Crohn y artritis reumatoide
20 (que se muestra que puede tratarse con REMICADE, un anticuerpo anti-TNFa), carcinoma de mama (que se muestra que puede tratarse con HERCEPTIN, un anticuerpo anti-20 HER2) y cáncer de colon (que se muestra que puede tratarse con EDRECOLOMAB, un anticuerpo anti-17-1A). Los polipéptidos variantes usados para tratar cáncer comprenderán preferiblemente una sustitución de aminoácido
25 en la región Fc de la invención que confiere actividad de ADCC potenciada y/o actividad de CDC potenciada al polipéptido.
En algunas realizaciones, se emplea un polipéptido variante con actividad de ADCC mejorada en el tratamiento de enfermedades o trastornos en el que se
30 desea la destrucción o eliminación de tejido o microorganismos foráneos. Por ejemplo, puede usarse la variante para tratar cáncer; trastornos inflamatorios; infecciones (por ejemplo, infecciones bacterianas, virales, fúngicas o por levaduras); y otros estados (tales como bocio) en los que se desea la eliminación de tejido. En otras realizaciones, el polipéptido variante tiene actividad de ADCC disminuida. Tales variantes pueden usarse para tratar enfermedades o trastornos en los que se desea un polipéptido que contiene región Fc con una semivida larga, pero preferiblemente el polipéptido no tiene funciónlfunciones efectora(s) no deseada(s). Por ejemplo, el polipéptido que contiene región Fc puede ser un anticuerpo anti-factor tisular (TF); anticuerpo anti-lgE; y anticuerpo anti-integrina (por ejemplo, un anticuerpo anti-a 437). El mecanismo de acción deseado de tales polipéptidos que contienen región Fc puede ser bloquear pares de unión ligandoreceptor. Además, el polipéptido que contiene región Fc con actividad de ADCC disminuida puede ser un anticuerpo agonista.
Los polipéptidos variantes usados para tratar cáncer comprenderán preferiblemente una sustitución de aminoácido en la región Fc de la invención (véase, por ejemplo, la tabla 2 en el presente documento) que confiere actividad de ADCC potenciada y/o actividad de CDC potenciada al polipéptido.
Los polipéptidos variantes pueden administrarse mediante cualquier medio adecuado, incluyendo administración parenteral, subcutánea, tópica, intraperitoneal, intrapulmonar e intranasal e intralesional (por ejemplo, para el tratamiento inmunosupresor local). Las infusiones parenterales incluyen administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutánea. Además, la variante polipeptídica se administra de manera adecuada mediante infusión por pulsos, particularmente con dosis decrecientes del polipéptido variante. Preferiblemente, la dosificación se administra mediante inyecciones, lo más preferiblemente inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica.
Para la prevención o el tratamiento de una enfermedad, la dosificación apropiada de variante polipeptídica dependerá del tipo de enfermedad que va a tratarse, la gravedad y el transcurso de la enfermedad, si el polipéptido variante se administra para fines preventivos o terapéuticos, la terapia previa, la historia clínica del paciente y la respuesta a la variante polipeptídica, y el criterio del médico encargado. El polipéptido variante se administra de manera adecuada al paciente en una vez
o a lo largo de una serie de tratamientos.
Por ejemplo, dependiendo del tipo y la gravedad de la enfermedad, aproximadamente de 0,1 f.!g/kg a 15 mg/kg (por ejemplo, 0,120 mg/kg) de polipéptido variante es una dosificación candidata inicial para la administración al paciente, ya sea, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas, o mediante infusión continua. Una dosificación diaria típica puede oscilar entre aproximadamente 1 f.!g/kg Y 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas a lo largo de varios días o más, dependiendo del estado, el tratamiento se mantiene hasta que los síntomas se reducen suficientemente o se eliminan. El progreso de esta terapia se monitoriza fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales, y puede usarse para ajustar la dosificación para alcanzar un efecto terapéutico.
Estas cantidades sugeridas de polipéptido variante están sujetas a una gran cantidad de criterio terapéutico. El factor clave en la selección de una dosis y calendario apropiados es el resultado obtenido. Los factores para su consideración en este contexto incluyen el trastorno particular que está tratándose, el mamífero particular que está tratándose, el estado clínico del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración del anticuerpo, el tipo particular de anticuerpo, el método de administración, el calendario de administración y otros factores conocidos por los profesionales médicos.
Una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido variante que va a administrarse es el nivel de dosificación requerido para un paciente de tal manera que se reducen los síntomas de la enfermedad que está tratándose. Adicionalmente, una cantidad terapéuticamente eficaz puede referirse a la cantidad de agente terapéutico suficiente para retrasar o minimizar o prevenir la aparición de la enfermedad, por ejemplo, retrasar o minimizar o prevenir la diseminación del cáncer. Una cantidad terapéuticamente eficaz puede referirse a la cantidad de agente terapéutico (por ejemplo, polipéptido variante), también puede referirse a la cantidad del agente terapéutico que proporciona un beneficio terapéutico en el tratamiento
o la gestión de una enfermedad en un sujeto. Además, una cantidad terapéuticamente eficaz con respecto a un agente terapéutico de la invención se refiere a la cantidad de agente terapéutico solo, o en combinación con otras terapias, que proporciona un beneficio terapéutico en el tratamiento o la gestión de una enfermedad en un sujeto. No se necesita formular el polipéptido variante, pero opcionalmente se hace, con uno o más agentes usados actualmente para prevenir o tratar el trastorno en cuestión. La cantidad eficaz de tales otros agentes depende de la cantidad de polipéptido variante presente en la formulación, el tipo de trastorno o tratamiento, y otros factores comentados anteriormente. Un primer agente profiláctico o terapéutico (por ejemplo, polipéptido variante o polipéptido que comprende una región Fc variante de la invención o fragmento funcional de la misma) puede administrarse antes de, concomitantemente con o después de la administración de un segundo agente profiláctico o terapéutico a un sujeto con un trastorno.
Los agentes terapéuticos pueden congelarse o liofilizarse para su almacenamiento y reconstituirse en un portador estéril adecuado antes de su uso. La liofilización y reconstitución pueden conducir a diversos grados de pérdida de actividad de anticuerpo. Pueden tener que ajustarse las dosificaciones para compensar. Generalmente, se prefiere un pH de entre 6 y 8.
En el presente documento se contempla el uso de un anticuerpo monoclonal que comprende una región Fc variante de la presente invención para tratar o prevenir al menos uno de los trastornos mencionados anteriormente (por ejemplo, cáncer) en los que antígeno al que se une el anticuerpo monoclonal es peudicial o que se beneficia de niveles disminuidos del antígeno. Adicionalmente, se contempla el uso de un anticuerpo que comprende una región Fc variante de la presente invención para su uso en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de al menos uno de los trastornos mencionados anteriormente.
Tal como se usan en el presente documento, los términos "tratamiento", "tratar" y similares se refieren a obtener un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en cuanto a prevenir parcial o completamente una enfermedad o síntoma de la misma y/o puede ser terapéutico en cuanto a una cura parcial o completa de una enfermedad y/o efecto adverso atribuible a la enfermedad. "Tratamiento", tal como se usa en el presente documento, incluye la administración de un compuesto de la presente invención para el tratamiento de una enfermedad o un estado en un mamífero, particularmente en un ser humano, e incluye: (a) prevenir que se produzca la enfermedad en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad pero al que aún no se le ha diagnosticado que la tiene; (b) inhibir la enfermedad, es decir, detener su desarrollo; y (c) aliviar la enfermedad, es decir, provocar la regresión de la enfermedad o del trastorno o aliviar síntomas o complicaciones del mismo. Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para proporcionar la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica o profiláctica). Por ejemplo, puede administrarse un único bolo, pueden administrarse varias dosis divididas a lo largo del tiempo o puede reducirse o aumentarse proporcionalmente la dosis tal como se indica por las exigencias de la situación terapéutica.
anti-CD20 Se da a conocer un anticuerpo anti-CD20 que comprende una región Fc variante (véanse, por ejemplo, el ejemplo 4 y la figura 4 en el presente documento). Un anticuerpo anti-CD20 comprende una región Fc variante, o parte de la misma que comprende la sustitución de aminoácido, enumerada en las tablas 1-10 en el presente documento, el anticuerpo anti-CD20 puede comprender además un péptido con la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 13, 14, 15 ó 16. En otra realización, un anticuerpo anti-CD20 comprende una región Fc variante o parte de la misma que comprende la sustitución de aminoácido, enumerada en las tablas 1-10 en el presente documento, y que comprende además péptidos con las secuencias mostradas en:
a) SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14;
b) SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16;
c) SEQ ID NO: 17, 18, 19, 20, 21 Y 22; o
d) SEQ ID NO: 23, 24, 25, 26, 27 Y 28.
El anticuerpo anti-CD20 de la invención comprende una región Fc variante, que comprende sustitución/sustituciones de aminoácido(s) seleccionada(s) del grupo que consiste en: a) 2471 Y 3390; Y
b) 2471 Y 339Q;
y comprende además una región variable que comprende polipéptidos con las SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14.
Usos de Fc variante adicionales Las variantes, y secuencias de ácido nucleico que codifican para variantes, de la presente descripción pueden usarse de muchas maneras. Por ejemplo, pueden usarse variantes en ensayos de selección de fármacos. Por ejemplo, pueden evaluarse compuestos candidatos para determinar su capacidad para alterar o interferir con funciones efectoras de Fc poniendo en contacto una variante con el compuesto candidato y determinando la unión del compuesto candidato a la variante. Puede inmovilizarse la variante usando métodos conocidos en la técnica tales como unión de una proteína de fusión GST-variante a una perla polimérica que contiene glutatión. Se construye un gen quimérico que codifica para una proteína de fusión de GST fusionando AON que codifica para la variante de interés al AON que codifica para el extremo carboxilo terminal de GST (véase, por ejemplo, Smith et al., Gene 67:31 [1988]). Entonces se transforma el constructo de fusión en un sistema de expresión adecuado (por ejemplo, E. coli XA90) en el que puede inducirse la expresión de la proteína de fusión de GST con isopropil-f-Otiogalactopiranósido (IPTG). La inducción con IPTG debe proporcionar la proteína de fusión como constituyente principal de proteínas celulares solubles. Las proteínas de fusión pueden purificarse mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica, incluyendo la purificación mediante cromatografía de afinidad con glutatión. La unión del compuesto candidato a la variante está correlacionada con la capacidad del compuesto para alterar la una o más funciones efectoras.
En otro método de selección, se inmoviliza o bien la variante o bien un FcR seleccionado usando métodos conocidos en la técnica, tal como adsorción sobre una placa de microtitulación de plástico o unión específica de una proteína de fusión de GST a una perla polimérica que contiene glutatión. Por ejemplo, se une GSTvariante a perlas de glutatión-Sepharose. Entonces se pone en contacto la variante inmovilizada con un FcR y un compuesto candidato. Entonces se retira el péptido no unido y se solubiliza el complejo y se analiza para determinar la cantidad de péptido marcado unido. Una disminución en la unión es una indicación de que el compuesto candidato inhibe la interacción de la variante con el FcR. Este método de selección es particularmente útil con variantes de la presente invención que muestra un nivel aumentado de Una variación de este método permite la selección de compuestos que pueden alterar un complejo variante/receptor de Fc anteriormente formado. Por ejemplo, en algunas realizaciones se inmoviliza un complejo que comprende una variante unida a un FcR tal como se describió anteriormente y se pone en contacto con un compuesto candidato. La disolución del complejo por el compuesto candidato se correlaciona con la capacidad del compuesto para alterar o inhibir la interacción entre la variante que está sometiéndose a prueba y el FcR que está. Con respecto a esto, pueden identificarse compuestos con el potencial terapéutico (por ejemplo, en seres humanos) (por ejemplo, compuestos útiles para tratar una enfennedad humana, tal como enfermedades autoinmunitarias).
Otra técnica para la selección de fármacos proporciona una selección de alto rendimiento para compuestos que tienen una afinidad de unión adecuada a péptidos variantes y se describe en detalle en el documento WO 84/03564. En resumen, se sintetizan grandes números de compuestos de prueba peptídicos pequeños diferentes sobre un sustrato sólido, tal como pasadores de plástico o alguna otra superficie. Entonces se hacen reaccionar los compuestos de prueba peptídicos con péptidos variantes y se lavan. Entonces se detectan los péptidos variantes unidos mediante métodos bien conocidos en la técnica.
Otra técnica usa anticuerpos dirigidos a péptidos variantes. Tales anticuerpos que pueden unirse específicamente a péptidos variantes compiten con un compuesto de prueba por la unión a una variante dada. De esta manera, los anticuerpos pueden usarse para detectar la presencia de cualquier péptido que comparte uno o más determinantes antigénicos del péptido variante.
La presente descripción contempla muchos otros medios de selección de compuestos. Los ejemplos proporcionados anteriormente se presentan simplemente para ilustrar una gama de técnicas disponibles. Un experto habitual en la técnica apreciará que pueden usarse muchos otros métodos de selección.
En particular, la presente descripción contempla el uso de líneas celulares transfectadas con ácido nucleico que codifica para al menos una región Fc variante para seleccionar compuestos por su actividad, y en particular para la selección de alto rendimiento de compuestos a partir de bibliotecas combinatorias (por ejemplo, bibliotecas que contienen más de 104 compuestos). Las líneas celulares de la presente invención pueden usarse en una variedad de métodos de selección.
Las variantes pueden usarse como agente de purificación por afinidad. Por ejemplo, la variante puede inmovilizarse sobre una fase sólida tal como una resina Sephadex o papel de filtro, usando métodos bien conocidos en la técnica. Entonces se pone en contacto la variante inmovilizada con una muestra que contiene el antígeno que va a purificarse, y posteriormente se lava el soporte con un disolvente adecuado que eliminará sustancialmente todo el material la muestra excepto el antígeno que va a purificarse, que está unido a la variante polipeptídica inmovilizada. Finalmente, se lava el soporte con otro disolvente adecuado, tal como tampón de glicina, pH 5,0, que liberará el antígeno del polipéptido variante.
El polipéptido variante también puede ser útil en ensayos de diagnóstico (por ejemplo, para detectar la expresión de un antígeno de interés en células específicas, tejidos o suero). Para aplicaciones de diagnóstico, la variante se marcará normalmente con un resto detectable (tales marcadores también son útiles en los ensayos de la región Fc descritos anteriormente). Hay numerosos marcadores disponibles, incluyendo, pero sin limitarse a, radioisótopos (por ejemplo, 35S, 14C, 1251, 3H Y 1311), marcadores fluorescentes (por ejemplo, quelatos de tierras raras (quelatos de europio) o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, Lissamine, ficoeritrina y Texas Red), y diversos marcadores de enzimasustrato (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.o 4.275.149), y luciferasa, luciferina, 2,3-dihidroftalazindionas, malato deshidrogenasa, ureasa, peroxidasa tal como peroxidasa del rábano (HRPO), fosfatasa alcalina, 3-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, sacárido oxidasas (por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa), oxidasas heterocíclicas (tal como uricasa y xantina oxidasa), lactoperoxidasa, microperoxidasa y similares). Los ejemplos de combinaciones enzima-sustrato incluyen, por ejemplo: (i) peroxidasa
5 del rábano (HRPO) con hidrógeno peroxidasa como sustrato, en las que la hidrógeno peroxidasa oxida un precursor colorante (por ejemplo, ortofenilen-diamina (OPD) o clorhidrato de 3,3',5,5'-tetrametil-bencidina (TMB)); (ii) fosfatasa alcalina (AP) con fosfato de para-nitrofenilo como sustrato cromogénico; y (iii) Dgalactosidasa (R-D-Gai) con un sustrato cromogénico o sustrato fluorogénico.
10 Las variantes también pueden usarse para ensayos de diagnóstico in vivo. Por ejemplo, se marca el polipéptido variante con un radionúclido de modo que el antígeno o las células que lo expresan pueden localizarse usando inmunoescintigrafía.
Tabla 1 Variantes de Fe
Posición+
Sustitución de aminoácido
235
G, R
236
F, R, Y
237
K, N. R
238
E, G, H. l. L, V, W, y
244
L
245
R
247
A, D, E, F, M, N, O, R, S, T. N, Y
248
P, PI O, W
249
L, Mi N, P, Y
251 254
a, 1, w O, E, F, G, H, 1, K. L, M, N, P, O, R. V, W. y
255
K, N
256
a, 1, K, L. V, W. '{
257
A. li M, N, S
258
D
260
S
262
L
264
S
265
K, S
268 K 269 N. O 271 T 272 H, K, L. R
1, R, L, M,
Q,
R, S, T, w, "f
F,
G,
A, D,
280 T
F, G, H, 1, K, L, M, P, R. T, W, y
286 F 288 N, P
293 S, 301 W 304 E
F,
V
G, 1,
L
E, M
312 P
K, l., P, R
316 F, K 317 P, T 318 N, P, T
W
G, L,
S, M, N, Q, R, S, W,
yO,
H, 1, R, L,
E, F, M, V, N, YS,P, Q,O, E, F, H, 1, K,
O, N, O, R, S, T, V,
1, K, L, y
El F,
A,
O,
S, T, V, N
H, 1, R' L, M,E, F,
375 R
O, R, S, T, V, W, y
376 E, F, G, H, 1, L, M, N, P,
K, P N
Q, s. T
379 N,
D, N. S, T P,
O. R,
S,
382 D,
V, N,H, 1,
M, YL,
E, P
386 K 423 N
M, v
O, L
427 N 429 A, F, M
A, D,
T,M, N, P, O, R, S,O, H, K, V.
y
l.,
431 H, K, P
S
T, W
439 E. H, O
M, O. V
D, E, F, O, H, 1, K,
442 K
+ Posición de aminoácido de Fc según la numeración de EU Por ejemplo, en la posición 249: 249L, 249M, 249N o 249Y
Tabla 2 Variantes de Fc: cambios de la función efectora
Varian* te
ADCC poten- ADCC disminui- Unión FcRn a po- Unión FcRn a CDC potenciada CDC disminui
ciada
da tenciada disminuida da
23SG 2350 235R 235S 23eF 236R 236Y 237E 237K 237N 237R 238A 238E 238G 238H 2381 238L 238V 238W 238Y 244L 245A 247A 2470 247E 247F 247G 247H 2471 241L 247M 241N 2470 247A 2478 247T 247V 247W 247Y 248A 248F 248P 2480 248W
X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X x X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X )( X X X X
249E X
X X 249l X X
X
250M
X X 250R
X
X X 251F X
X X 251H X X X
251 1
X X X 251W
X X X 252Y
X X
X 254A
X X 2540
X
X 254 E
X
X 254F X
X X 2S4G
X 254H
X 2541
X
X 254K
X X 254L
X X X 254M X
X X 254N
X 254P
X X
X 254Q X
X
X 254R
X X 254T
X X
X
254V
X X
X 254W
X X 2S4Y X
X X 255K
X X 255N
X
X 256A X X
X 256F X
X 256G X
X 256H
X 2561
X X
X X X X 'X X X
X X X
X
X
X
256M X
X X
256P
X
X
2S6Q
X X
256R
X
X 256W X X 256Y X X 257A X X X 2571 X X X 257M X X X 257N X X X 2575 X X X 257V X X X 2580 X X 2605 X X X 262L X X X 2645 X X X 265H X X 265K X 2655 X X 265Y X X X 267G X X X 267H X X
267K
X X X X X
2680 X X X
268K X X
X X
269N X X 2690 X X 270A X X X 2700 X X 270K X
X X 270fJJ X X X 270N X X
272H
X X X X X
272L
X
X
X
X
X
X
X
X
X
279" X X
279F
X X
X
279G X
279L
X
X
X
X
X
X
279M X 279N X
279Q X X
279R
X 279S
X X
219T
X 279W X X X
279Y
X X
280A X
X 280K X
X X X
283A X
X 2830 X
X 283F X X X
283G
X X
X
283H X X X
2831 X X X
283K X X X
283L X X
X
X
X
·283N
X
X
283P
X
X
X
283R X X X
283S X X
283T
X 28SW X
X X
283Y X X
285N
X X 286F
X 288N X X 288P X X 292A X
X
292E X X
X X
292G X X
X X 292L
X X 293S X
X
293V
X X 301W
X
X
304E
X 3Q7A
X X X 307E
X X
X
307M X X X
31 tA X X
X
X
31 1 E
X X
31 1F X
X X
31 1G
X
31 11
X X X 31 1K X X
X
X
X
31 1M
X
X
31 1R
X X
31 1N X
X
X
X
31 1T X
)(
311V X
X
X
31 1W
X X
311Y X
X
X
X X
X
314F
X X X 3141 X
X 314V X X X
314W X X
X
·314Y
X 315F X X
X
X X
315L X
X
315P X X
X
315R
X
X X
X
3161<
X
X
317P X X
X
31'n
X X )( )( X
X
X X X X
318V X 326W X
X X
327T X X
X
328V
X X
329Y X
X
330K X
X
330R
X332A X
3320 X X
332E X
X
332F
X
X
332G
X
X X
X
X X
X
332l X X
X
332M 332N X 3320 X
332R X X 332S X X 332T X X 332V X X 332W X X X 332Y X 3390 X X
X X 339F X X 339G X X X 339H
X 3391 X X 339K X X 339L X
339M X
X 339N X X X
339Q X X 339R X X X 339S X X
339T X X X 339W X X 339Y X 3410 X X X 341 E X X X 341F X X X 341H X X 3411 X X X 341 K X X X 341L X X X 341M X X X 341N X X X 341 P X X X 341Q X X X 341R X X X 341 S X X X 341T X X X 341V X X 341W X X X 341Y X X X 343A X X 3430 X X 343E X X X 343F X
X
343G X X
343H X X X
3431 X
343K X X
343l X
343M X X X X
343N X X
3430 x x
X
343R X X X
3435 X X
343T X X X
343V X 343W X X X X
343Y X X
373A X X
3730 X X X
X
373E X X
373F X X
373G X X
373H X
3731 X
373l
X X X X X X
373M 313N 3730 373R 3735 313T
X X X X X X X X X X X X X X X X X
376A
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
376E
X
316F
X X
3700
X X X
376H
X X X
376'
X
3761
X X
376M
X
376N
X
376P
X X
3760
X
376R
X
376S
X
376T
X X
380S X
X
X
380T
X
X
38204 X 3820
X X382F X
X
X
382H
X
3821 X
X
X
382K
X
382L
X
X
382M
X
382N
X
X382P X
X
X
382R
X
X 382S X X X
382T
X
382V
X
X
382W
X
X
382Y
X
X 385E X X
385P X
386K X
423N X X424H 376V X X X
376W
X X
376Y
X X
377G X 377K X X 377P
X
X
X
378N
X
379N X
X
X
X
3798 X X
X X
X
X
X
X
X
X X
X
424V
X X X X
427N X X
X
429A
X X
X
429F
X X
X
X X
429M X
430A X X X X
X
430F X 430G X X X
430H X X
430K
X X X X X
430l X X 430M X X 430N X X X
X
430P
4300 X X X
430A X X
430V
X X X X X X
430W X X X X
430Y X X
431 H X 431 K X 431 P
X X 432R X
X X
432S X X X X
434G X X
434H X 434' X X X X
434W X X 434Y X X 4361 X X X 436L X 436T X X
X
438G 438K X
X
438l X 438T X X X
438W X X
439E 439H X X X
X X
440A
X
4400 X X
440E
X X
440F
X440G X 440H X X
4401 X X 440K X X 4401.. X X X .woM X X 4<40N 4400 X 440R 4<40T X 440V X 44(N1 440Y X 442K X X
Variantes sometidas a prueba en anticuerpo anti-CD20, región Fc de IgG1
Tabla 3 ADCC potenciada
Posición+ Sustitución de aminoácido
247 A, F. M, I, L, M, T, V, Y 24 9 E, Y 251 F 254 F. M, Y 256 A, M 258 O 268 D, E 279 A 280 A, K 283 A, t i K, M, R 2SS N 292 A 311 A, D. N, T, V, Y 315 L liS N, P. T. V 330 K 332 '1'; V 339 D, F, G, 1, K, M, N, Q, R, S, T 376 A, V 3?7 G, K 319 N 380 N, S 3S2 A, 1 385 E 427 N 429 M 434 W 436 1
+ Posición de aminoácido de Fc según la numeración de EU
Por ejemplo, en la posición 249: 249E o 249Y
Tabla 4 ADCC disminuida
Posición+
23S 236
238 247 249 250 251 252 2S4 256 257 260 262 264
265 267
270 271 272
283 285
292 293 301
307 311 312 314 liS
31"7
327 328 329 332
375 R 376 A, E. P, G. H; W. y 37S Q 382 O, S 429 A, F 430 H. K, N, O. R, W 432 R, S 434 1 440 D, T, V 442
+ Posición de aminoácido de Fe según la numeración de EU
Tabla 5 Afinidad de unión a FcRn potenciada Tabla 6 Afinidad de unión a FcRn disminuida
423 N 427 N 430 A, F, G, H, 1, K, L, M, N, Q, R, 431 H, K 434 F. G, H, W, y 436 1, L, T 438 K, L. T, W 440 K 442 K
S, T, V, Y
+ Posición de aminoácido de Fc según la numeración de EU
Posición+ Sustitución de aminoácido
235 O 236 'l 237 K, R 238 E. G, H. W 247 A, D, E, F, G, H, 1. L, M, N, Q, R, S, 248 A. F. p, Q, W 249 E, L, M, Y 251 F. H, 1, ti 254 D, E, F, G, H, l. K. L, M, N, P, O. R, 255 K, N 256 F, H, l. K. M, R, W. y 264 S 265 S, Y 267 G. 1 268 D, K 270 A, M 279 l., K, L 280 T 292 E, F, G, I, L 311 D, E, F. G, N, R, Y 315 F, K, P 316 F 317 T 326 M 327 T 339 E, G. L. R 341 D, E. F, l, K, L, M, N. Q, R. S, T, V, 343 M, V, M 373 A, D. G. K, L, M, N, Q, S, T, V, W 376 H. L, M, Y 424 M, V 426 D 429 A, F. M 430 D, W 431 P 432 R. S 434 1 439 Q440 A. D.
M. Y T, V, M, Y W, y
+ Posición de aminoácido de Fc según la numeración de EU
Tabla 7 CDC potenciada
236 y 244 L
W
D, Q,
24?
S,N,
A,
E,
248 F, P, O. W 249 E, L, M, N, p. Y 250 K, R 251 F, H, 1,
W
L, M. R. Y
254 A, F.
255 X G, l. L, M, P,
O. W, y
260 S 268 D Y279 O. S, 280 X, T
H. 1, X, L. M, N. P, R, S, W
292 L
A. M
311 F, I, X, L, M, T, V, W, y 312 P
V. W,
F,
y
L.
R
F, K. K
317 P, T 318 N, T 332 A. D, E, F, G, H, L, M, N, Q. s, T, V, W. y 339 D, F, G, H, 11 K, N, Q, R, S, T, W. y
D, E, F, H, l. K, L, M, N, p. O, R, S. T. V. 1f, y
W.343 A, D, E, G, H, K, L, M, N, Q. R, S, y
D, E, F, H, 1, K, L, M, N. Q,
w
375 R R, S, T, VL,
Q,
376 A, F, G, H,
p.
377 P
N, Q, S, T
A, S, T
382 I, L, Q. V
386 K
426 D, L 429 A, F, M
W,
L.
V,
D, F, G, H, 1,
N, R, S, T,
A,
K,
M,
y
431 H, P
S
W, y
438 L, W 440 O, y
+ Posición de aminoácido de Fc según la numeración de EU
Tabla 8 CDC disminuida
Posición+ Sustitución de aminoácido
235 G, S 236 R 237 E, k, N, R 23B A, E, G, H, 1, L, V, W, y 245 R 247 N, 1, L, T, Y 250 M 252 Y 254 D, E, 1, P, O. T, V 255 N 257 A, l. M, N, S, V 262 L 264 S 265 H, Y 267 G. N, 1, K 268 K 269 N, O 270 G, M, N 271 T 272 N, L, N 292 A 293 S 301 W 307 E 311 E, S 316 F 318 P 321 T 328 V 329 Y 330 K. R 332 E, M 343 1 373 S 376 D 380 O 382 D. Fi N, P, R, S, W, y 385 E, P 423 N 424 H, M.
+ Posición de aminoácido de Fc según la numeración de EU
Los siguientes ejemplos se proporcionan con el fin de demostrar e ilustrar adicio
nalmente determinadas realizaciones preferidas y aspectos de la presente invención y no deben interpretarse como limitativos del alcance de la misma. EJEMPLO I -Selección de Fc variantes en de ADCC Este ejemplo describe cómo se seleccionan regiones Fc variantes, en el contexto de un anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo anti-CD20) en un ensayo de ADCC.
i. Aislamiento de células mononucleares de Se obtienen aproximadamente 50 mi de sangre periférica a partir de un donante sano y se diluyen 1:2 con solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,0. Se mezclan las disoluciones agitando suavemente el tubo. Se recubren de manera cuidadosa aproximadamente 12 mi de Histopaque-1077 (n.o de cat. de Sigma 1077-1 ) bajo la muestra de sangre diluida seguido por centrifugación en una centrífuga Sorvall RT6000B con rotor flotante a 1000 rpm durante 10 mino con freno desactivado. Se descarta la fase superior del gradiente mediante aspiración y se recoge la interfase que contiene CMSP, de color blanco, y se lava 3 veces con solución salina equilibrada de Hank (n.o de cat. de Gibco 14025-092). Se suspende el sedimento celular lavado en aproximadamente 20 mi de medios RPMI 1640 que contienen suero bovino fetal al 10% (FBS) (n.o de cat. de Omega Scientific FB-01). Se dividen las CMSP resuspendidas en dos matraces de cultivo T-175 y se añaden 30 mi de RPMI que contiene FBS al 10% a cada uno, seguido por incubación durante la noche en un incubador a 37°C, CO2 al 5%. Al día siguiente se recogen las CMSP no adherentes en tubos Falcon de 50 mi, se centrifugan como anteriormente y se resuspenden en RPMI que contiene FBS al 1 % que carece de rojo de fenol. Se diluye 10 veces una pequeña parte de las células resuspendidas y se cuentan usando un hemocitómetro. Se colocan las CMSP restantes en el incubador hasta que se necesitan.
Pueden obtenerse líneas de células B que expresan CD20 Wil.2 y SKW6.4 de ATCC y hacerse crecer según se recomienda. Un día antes de usarse, se dividen 2 veces las células. Al día siguiente se ajusta el número de células hasta 4 X 105 células/mi y se añaden alícuotas de 50 111 (20.000 células/pocillo) a una placa de cultivo tisular de 96 pocillos.
iii. Diluciones de
Antes de la selección, se expresa IgG que comprende una variante de Fc de la presente invención, se purifica y se cuantifica usando un ELlSA convencional. Para la selección de ADCC de un único punto primaria, se diluyen variantes de IgG hasta 40 ng/ml en medios RPMI que contienen FBS al 1 % que carece de rojo de fenol. Se diluye 4 veces la concentración de IgG final en el ensayo (es decir, concentración final de 10 ng/ml). Se añaden alícuotas de cincuenta microlitros de IgG a las células diana y se incuban durante aproximadamente 15 minutos a 37°C antes de añadir las células efectoras a las células diana opsonizadas.
Cuando se realizan titulaciones de IgG, se varía la concentración de IgG en el intervalo de desde aproximadamente 0,0001 hasta 1 Ilg/ml. Se preparan diluciones de IgG usando una placa de microtitulación de 96 pocillos diluyendo las muestras en RPMI que contiene FBS al 1 % que carece de rojo de fenol. Entonces se añaden las muestras de IgG diluidas a la placa de ensayo que contiene las células di
ana.
iv.
Células efectoras Se ajusta la concentración de CMSP de modo que la razón de efector con respecto a diana está en el intervalo de 10-20: 1 (es decir, 2-4 X 106 células/mI). Se añaden cien microlitros de las CMSP resuspendidas a cada pocillo de las células diana opsonizadas. Se incuban las placas a 37°C en presencia de CO2 al 5% durante 3-4 horas.
v. Detección de liberación de lactato Se mide la lisis de células diana detectando la liberación de enzima LDH a partir del citoplasma de células dañadas en el sobrenadante de cultivo. Tras la incubación de las células diana opsonizadas con las células efectoras, se centrifugan las placas de ensayo a 2000 rpm durante 5 minutos. Cuidadosamente, se retiran
aproximadamente 75 J.LI del sobrenadante de cultivo celular mientras que se evitan los residuos y las células sedimentadas. Se añade este sobrenadante directamente a una placa de microtitulación y a esto se le añaden 75 J.LI de reactivo de detección de LDH (n.o de cat. de Rache 1 644 793). Entonces se incuba la placa durante aproximadamente 15-30 mino y se lee la absorbancia a 490 nm usando un lector de microplacas Vmax Kinetic de Molecular Devices.
vi. Análisis de datos Todos los ensayos de selección de ADCC se realizan por duplicado. Cada placa de ensayo contiene controles para determinar la lisis de diana espontánea, lisis de efector más diana espontánea en ausencia de IgG y lisis total de células diana. La lisis total de células diana se alcanza mediante la adición de Triton X-100 a1 1% a las células diana. Se incluyen controles de tipo natural en cada placa de ensayo y se calcula el promedio de la señal de ensayo de ADCC. Se resta el valor de fondo, obtenido a partir de los controles de lisis espontánea, de cada muestra. Se resta el valor de fondo, obtenido a partir de la IgG diluida, de cada muestra. Se convierten los datos de valores de absorbancia en porcentajes de lisis específica basándose en los controles de lisis espontánea y total. Se calcula el porcentaje de lisis específica a partir de la siguiente ecuación: porcentaje de lisis específica = (A490 experimental -A490 de fondo)/(A490 máxima -A490 de fondo) X 100, en la que la A490 de fondo es la suma de la A490 obtenida a partir de las células efectoras y diana en ausencia de IgG y el fondo de IgG debido a LDH contaminante presente en los sobrenadantes de IgG en bruto. Se normaliza el porcentaje de la actividad de variante de Fc con respecto al promedio de los controles de tipo naturalo Se calcula el promedio del porcentaje de la actividad normalizada para placas de ensayo por duplicado y se calcula la desviación estándar entre placas de ensayo individuales para cada muestra.
vii. Resultados En las tablas 9 (sustituciones individuales) y 10 (sustituciones combinatorias) a continuación se muestra la actividad específica de ADCC relativa. Los valores de CDC notificados en la tabla 9 se generan tal como se describe en el ejemplo 2 en el presente documento y el valor del ensayo de unión a FcRn notificado en la tabla 9 se genera tal como se describe en el ejemplo 3 en el presente documento.
En las tablas 1 y 2 anteriores se resumen adicionalmente los resultados. Las sustituciones combinatorias que producen un valor de ADCC superior a cualquier sustitución individual sola son: 247F,339D; 2471,339D; 247L,339D; 247L,339T; Y 2471,339Q. Las sustituciones combinatorias que producen una ADCC inferior al
5 80% de la ADCC de tipo natural aunque tenían una ADCC superior a la del tipo natural cuando se sometieron a prueba solas son: 247A,339D; 247Y,339H; 2471,3391; 247T,3391; 247L,339N; 247A,339Q; Y 247A,339R. Las sustituciones combinatorias que producen una ADCC inferior al 10% de la ADCC de tipo natural aunque tenían una ADCC superior a la del tipo natural cuando se sometieron a
10 prueba solas son: 2471,3391; 247T,3391; Y 247L,339N.
Tabla 9
WT* Posición y ADCC % de FcRn, pH % de DCD % de n= variantes * CV 6,0 CV CV
WT (a.z) 100 100 100 L 235A 87 23.2 102 11.9 67 7.9 2
87 16.2
35.8 2
L
235E 80 17.4
L 235G 93
85 21.2 58 46.0 2
L 235Q 06 1.8 81 14.4 98 25.1 2 L 235R 45 10.5 93 34.1 110 13.8 2 L 235S 92 2.0 85 40.0 O 262.9 2 G 236F O 942.1 88 7.9 O 283.3 2 G 236A O 228.7 101 20.6 14 110.1 4 G 236Y 8 72.7 76 10.0 168 0.3 2 G 231E O 89.2 93 35.0 36 28.8 4
G
237K o 11 3.3
G
237N O 107.5 91 16.3 31 .5 4
G
237R O 81 .3 56 60.6 28 10.S 4
49.S238A O 205.8 90 9.6
...
p
24 101 .0 P 238E O 20.6 76
...
P 238G O 92.8
23 120.5 4
4
P 238H O 48.9 72 11.4 1 1
6.4
54.1 4p 2381 O 180.4
P 23Bl O
13.6 34 50.1 4
P 238V 46 11.8 102 8.3 67 192 ... p 238W O 66.6 87 5.4 23 103.4 ...
P 238Y O 34.0
15.8 16 288.8 4
P 244l 77 23.4 124 9.6 134 6.0 2 P 245R 62 15.0 188 . 72 42 5.3 2 P 247A 122 16.2 97 0.3 116 0. 9 2
1.1 2
P 2470 95 23.4
8.7 118 0.0 2
P 247E 95 1 0.3
71 34.1 6
P
247F 144
6 1258.9
4.2 137
82 '6.1
35 252.4 79
6
P 247H 145 11.2
P 2471 14Q
198.3 6
79 30.7
33.7 O 722.7
P 247L
144 10.1
7.2 6P 247M 127 21.0 18 1599.0
P 247N 91
37.2
38.7
4.0 2
P 247Q 103 8.5 26 294.3 137 3.7 .. P 247R 58 15.5 72 1.2 127 4.9 2
15.0 130 2.6 2
P 2475 106 37 34.8 10P 247T 129
P 247V 120 13.5 Na na na na 2
O 1314.2 122 0.5 2
p 247W 102
na
7.1 6
P
143
15 119.9 1 02 2.4 2
K 248A 100
K 248F 107 18.0 O 559.4 202 4.0 2
K 248P 103 9.1 34 99.4 226 1.3 2
38 174 17.9 2
K 2480 101 30 54.5 166 8.3 2
K 248W 102
O
16.1
1 10 6.7 78 22.4
..
O 249L 73 1.4 15 1 79.9
O 249M 101 9.6 50 4.5 163 1 .2 2
..
O 249N 94 1 5.9 1 12 14.0 255 1 0.9
21 .0 1 19 0.2 2
O 249P
4.0
41 28.3 170 6.6 2
O 249Y
96 30.1 199 1 3.5 6
T 2SOK 38
T 250M 78 11.0 165 7.4 47 6.6 4
T 250R
62 34.0 288 13.9 4
l 251F 125 6.0 64 47.6 160
l 251H 59 11.6
1 333.3 190 18.8 2
L 251 . 84 9.8
na
17.3
L 251W 95
2.9 O
M 252Y 61 5.8 964 27.9 62 46.1 4 253A 103 6.1 O 12.0 81 23.9 4
S 254A 99
20.1 7
733.0 139
7 113.9 74 31 .2 2
S 2540 101 14.2
S
254E
107.9 72
S 2S4F 121 11,2 O 1081.4 206 14.4 6 S 254G 100 14.1 7 86.8 102 6.1 2
4
S 254H 108 20.0 O 74.3 85
S 254. 99 2.5 25
64.3 80
S 254K 109 14.8 9 n.2 137 6.1 2 S 254L 89 9.8 74 12.6 227 12.1 6 S 254M 89 11.9 O 212.1 248 13.4 6
S
254N 90
13.3 8 76
S 254P 78 17.7 3 141.4 75 25.2 2
25.2 2
S 2540 84 12.6 9 121.2
.. _----------
254R 99--1.3 ----14--128:-2--------152--. 4.8 2
S
54 32 34.7 75 12.1 S 254T
2
S 254V 68 40.5 31 40.5
S 254W 98 6.0 O 116.1 188 7.1 6 S 254Y 117 9.4 O 129.1 21 1 1 5.7 6
R
255K
96
41 65.9 276 9.3 4
R 255N 84 17.7 27 162.7 81 18.1 2 T 256A 115 16.5 160 3.0 190 19.6 2 T 2560 97 5.3 544 10.6 86 232 6 T 256E 91 12.9 339 8.4 104 7.2 6 T 256F 119 3.3 5 435.0 1 28 26.6 2 T 256G 95 20.0 162 80 221 24.5 2
.
T 256H 103 6.3 26 6.1 91 11.9 2 T 2561 93 11.5 72 3.7 157 16.2 4 T 256K 100 6.7 31 20.6 92 20.2 2 T 256L 93 3.9 78 60.5 267 22.7 4
T 256M 122
17.4
78.9 200 1 4
.8 10
T 256N 102 7.2 229 6. 4 86 23.2 2 T 256P 109 11.8 190 6. 1 260 11.8 8 T 2560 100 172 64 14.2 152 11.3 4
60.0 71 47.1
T 2S6R 94 8.8 33 T 256S 103 5.3 1 69 3.1 101 15.9 2 1 14 30.5 109 11.0 2
T 256V 82 11.1
T 256W 96 8.5
84.5 170 14.•
T 256Y
7.2 68 18.6 127 18.0
P 2S7A 86 11.5 319 15.0 34 53.7 4
P
16.4
1 022 14.5 46 22.4 6
P 257M 26 11.0 835 19.1 48 48.4
P 257N 27 13. 1 867 15.1 62 31 .4
P 257S 28 28.8
6.8 46
P 257V 18 97 .9
41.S Z1 143.5
e 2580 1 15 7.0 361 20.5 110 9.6 4 124 7.4 171 17.1 2
T 260S 93 5.6
V 262L 61 2.9 525 15.1 30 48.0 V 264S 10 39.8 78 20.0 50 36.7 2 79 36.1 Bl D.S 2
o 265H 8 118.9
o 265K 1 0 146.2 107 34.3 84 46.4
o 2655 9 106.3 66 28.9 103 13.3 2
7.6 33 88. 8 62 21 .5 2
o 265Y 3
18.1 4
S 267G 29 8.6 86 0.9 60
16.8 47 41 .1 4
S 267H o 48.4 86
S 267. o 78.0 83 11.8 so 31.8 4
47.1 4
S 267K o 73. 3 102 14.2 26 H 2680 110 7.8 68 32.4 122 10.7 6
17.8 100 8.4 8
H 266E 110 8.3 126
24 11 2.7 4
H 268K 98 17.6 86
E
269N
74.0
30 69.4 4
22 82.8 4
E 2690 47 3.6 98
o 270A 41 35.5 87 6.0 36
o 2700 o 1 02.2 108 16.5 37 21.8 4
o 270K 1S 465.5 122 8.4 o 462.9 4
o 270M 49 19.2 81 5.2 25 606.9 4
o 210N 28 1185..2 94
8.2
103.7 4
P 271T 26 53.9 96 20.4 32 89.1 4 E 272H 73 13.6 1 57 23.0 53 34.8 2
28.7 4E 272K 70 8.9 320 20.4
E 272L 78 21 .1 129 3.9 34.6 2
E 272N
90
7.5
3.3
1.2 2
E 272R 50 2.1
21.2 2
V 219A
1 14
14.6
5.0
V 2790 87 12.1 367 0.3 98 8.5 2
V 219F 81 4.8 113 14.3
10.0 2
V 2796 98 2.4 256 1 1 .6 1 09 1 8.0 2
22.7 6
V 279H 79 28.1 173 29.6 21.0 2
V 2791 101 1.6 83
V 279K 91 1.5 79
V 279l 96
13.9
V 279M 107 8.3 122 3.5 91 10.3 2 V 279N 102 32.0 204 19.5 85 50.2 6 V 2790 85 28.3 1 81 B.O 139 8.1 6
V 279A 105 4.8 130
V 2795 94 29.8 242
122 16.7
V 279T 95 15.5 26S 6.9
12.8 10
V 27fN1 68 24.8 162 22.8 1 25
O 280K 1 37 47.6 120 272 1 92
O 280T 108 na 60 12.6 122 8.7 4 E 283A 107 2. 1 126 02 96 17.9 2 E 2830 84 8.4 1 10 4.0 92 1 0.3 2 E 283F 74 0.1 168 38.6 1 27 20.4 2
E 283G
3. 1 137
135 8.5 2
15.9 2
.
E 283H 87 61 206 6.5
E 2831 106 1.9 1 43 5.6 126 12.3 2 e 283K 1 09 5.8 246 5.1 133 8.0 2
E 283L 92
126
0.1
E 283M 112 7.4 95 13.8 120 2.4 2
6
E 283N 102 3.8 1 1 9 7.4 135 11.8 4E 283P 97 11.9 136 3.9
E 2830 95
117 8.0 122 22.9 2
144
E 283R 1 02 0.3 282 8.1
e 2835 91 1.5 1 43 11.1 119 12.3 2
.
E 283T 103 3.2 1 43 12.4 108 1 1 0 2
E 283W 90 2.8 117
2.1 1.3
E 283Y 81 6.7 142 4.1 136 17.2 2
H 285N 93 2.6 202 19.8 113 21.1 N 286F 107 7.1 301 32.3 108 16.1 4
K 288N 1 10 8.7 162 118 19.1 4
K
288P 45 1.1 11 9 3.0 116 15.7 2
A
292A 11 4 2.9 85 67.5 74 21.1 4
R
292E 35 21 .4 65 48.5 92 32. 1 2
R
292F 73 16.4 64 7.6 101 8.3 2
A 292G 94 2.5
60
119 32.8
2R 2921 79 1.5 56 23.6 1 06
R 292L 96 3.9 68 40.0 123 7.2 2 E 2938 68 7,4 101 23.0 98 0. 1 2 E 293V 73 12.5 127 18.0 107 24.0 2
A 301W 5 105.4 119 18.1 49 31.1 4 S 304 E 24 32.9 101 8.7 122 1 1 .3 2
115 6.5 4
T 307A 87 4.4
T
307E 88
34.6 81 2.4 4
150 6. 5 4
302
T 307M 82 5.3
o 3l 1A 1 06 2.4 139 7.0 89 28.3 2 Q 3110 1 1 1 6.0 38 22.2 83 13.6 2 Q 31 1 E 102 1.7 46 17.7 78 0.7 2
o 31 1F 89 6.9 64
21 2 20.7
o 31 1G 98 1 .9 58 21 .5 92 9.6 2
o 31 11 9.6 236 11.3 88.2
5.5 170 9.3
o 311K 80
186 9.2 1 91 8.1 ..
o 31 1l 107 6.7
Q 31 1 N 115
172 67.9 4
8.0 89
O 311P 99
14 84.5 170 14.4 2Q 31 1R 96
97 10.5 O
B6 8.8
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23. 4 2
10.2 131 14.0 168
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4
1.7 558 19.5 240
31 1V 108
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94 0.3 21 1 25.0 2
31 1 Y 107 3.0
a
97 1.4 546 16.1 148 11.6 2
D 312P
42 41.2 108 5.5 2
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L 314F 70
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1 3.0 86
184 14.2 4
65 14.0 21 128.8
L 314V
79 11.0 5 80.2 1 90
L 314W
238 3.2 4
l 314V 87 13.6 64 140 15.3 2
12.8 51
N 315F
3.5 88 10.2 1 48 8.2 2 N 315K 108
103 10.5 145
31 SL 112 6.2
N
289.1 231
N 315P 62 10.2
N 315A 96 24.4
34 72.4 81 10.0 2
G 316F 54 26.0
G 3161< 77 28.8 131 8.9
1 90 4.7 4
145 1.6
21 .5
K 317P 54
118 4.0 2
K
99 10.9 49
123 7.2 21 6 7.5
E 318N
79 17.0
E 31 8P 120 10.8
56.8 118 10.5
31ST 1 09 5.7 304
E
114 21 .2 95 11.5 4
3.4
E 318V 1 1 6
93 5.7
17.9
K 326W
54 19.5 7 206.2 2
327T 4 13.4
A
13.9 4
1 01 6.3 56
L 328V 76 3.2
107 13.2 25
41 .S
P 329Y
23.9 6
51 .4
A 330K 134
31
121 39.4
A 330R 103 S.S
96 27.6 130 5.0 4
100 6.1
1 332A
78 33.7 151 11.5 6
I 3320 143
86 22.2 143
332E 168
1 49 11.0
332F 97 14.5
94 1.4 121 11.5 2
19.8
332G
1.1 150 11.5 2
B2 4,3 129
7.0 67 15.5 2
12 114.5
332K
2.6 154
94 0.9 127
332L
128 16.1
98 2.2
16.1 1 37
95 1 5.3 92
332N
98 7.9 148 8.5
8.4
3320 99
88 30.0
332R 12 135.5 114
263 64.1 177 16.5
3325
332T 1 1 2 7.5 100
332V 109 1.1 115 1 9. 5 147 25.1 2 332W 81 16.8 123 3.7 150 9.7 2
332Y 93 13.1 93 12.3 152
80
26.4
A 3390 131 10.4 75 4.2 91 0.1 2A 339E 100
A 339F 104 3.3 120 24.6 217 8.5 6
A 339G
6.5 118 0.3 2
A 339H 1 1 4 23.4 107 10.0 136 0.5 2
A 331M 136 14.6 80
205 22.8 6
A 339K 1 29 24.2 83 29.0 201 21 .0 6
A 339l 97 8.7
83 9.8 104
A 339M 1 1 5 6.8 111 7.2 57 8.8 2
A
110 6.3 146 3.5 240 17.5 4
A 3390 128 15.8 102 19.8 138 11.0 6 A 339A 117 14.4 82 13.4 128 2.1 2
A
124 13.0 95 23.6 1 70 . 22.5 6
A 339T 142 14.2 138 6.2 220 20.2 10 A 33M 92 13.4 156 11.4 243 10.6 6
A
97 17.0 92 19.8 265 21 .9 10
G 3410 62 6.9 52 37.8 172 3.5 2
G
341E
18.1 161
G 341F 24 100.8 52 41.9 227 14.7 6
G 34t H 54 9.3
SS
245 16.0
G 341 1 44 15.5 36 17.2 173 5.3 2 G 341 K n 3.9 67 18.9 161 2.6 2 G 341l 64 24.3 54 19.8 171 4.2 2
39.8 79
G 341 M
232 11.1 6
9.1 53 1 7.0G 341N 83
G 341 P 35 47.2 127 9.9 228 16.2 6
G 3410 59 1 8.7 72 1.0 166 7.7 2
G
341 R
14.9
1.4 168 7.5 2
G
341 5 65 26.6 55 12.2 224 9.2 6
G
341T O 866.0 68 54.0 176 10.0 2
G
341 V 65 171.0 69 15.0 213 9.5 4
76 8.9
1 78
14
G 341W
5.2 184 14.3 2
26
G 341 Y
18.6 110
P 343A
157 1 8.3 2
P 3430 69 11.5 102
1 57 17.6 2P 343E as 34.9 345 1058.4 4
P 343F
20.6 89 13.0
14.9 244 11.1 6
P 343G 75 29.1
191 1.2 159 3.1 2
P 343H 78 33.8
P 3431 92 26.8
9.1
232
2.6
P 343K 74 37.7
P 343l 63 17.2 125 3.8
p 343M 60 35.1 83 13.7 134 1 8.7
P 343N 67 8.9 105
19.9
P 3430 72 0.5 442 14.0 178 3.0 2
179 9.9
P 343R 94 1.3 198
P 343S 84
14.3 207
P 343T 69 4.2 126 16.1 151 4.4 2
77
107 12.0 2
P 343V 70 1.9
P 343W
22.3
56 6.4 194 17.9 2
P 343Y 63 9.9 112 7.2 270 14.4 6
Y
56
3.7 33 1 5.0 121 28.7 2
Y 3730 74 17. 7 74 32.5 227 10.2 6
V 373E 41 23.6 106 20.8
19.5 2
Y 373F 76 2.6 110 12.7 117 1.0 2
Y 373G 39 21.6 38
25.4
Y 373H 79 34.2 100 13.9 1 69 8.2 4
Y
6S
9.0 73 14.0 154 6.4 2
Y
373K 76 12.2 70 2.9 246 6.9 6
V
373l 76 21.4 66 17.0 189 6.2 6
Y
373M 78 1.2 53 25.8 11 5 3.2 2
Y 373N 64 21.5 61
23.3
12.1
Y 3730 63 11.0 55 24.7 1 58 17.7 2 Y 373R 81 20.5 101 24.1 221 4.0 6
Y
3738 52 3.7 74 1.9 72 24.8 2
Y
70 3.0 82 16.6 151 5.7 2
2. 1 69 14.3 115 1.1 2
V 373V
75
237 20.8
Y 373W n
1.1
15.9
S 375R 69 10.9 595
O 37SA 1 1 1 18.2 155 26.7 1 80 5.2 2 O 376E 85 12.3 82 29.5 98 13.5 2 O 376F 84 7.3 1 1 6 1 2.6 119 8.6 2
O 376G 73 3.1 135 3.9
0.6 2
O 376H 74 16.1 81 18.6 118 5.6 2
O 3761 100 14.1 144 7.2 101 50.5 10
O 376l 88 16.7 78 3.0 142 32 2 129 1.4 91 15.1 2
O 376M 86 21.6
O a76N 93 14.5
94
24.2
14.9
O 376P 85 15.1 203 12.9 153 19.6 6
22.7
1 9.9 4
O 3760 88 5.0
12.3 166 4.6 2
O 376R 95 6.0
O 3768 85 21 .4 1 34 27.3 209 25.3 2
O
102 20.0 160 11.2 224 1 0. 1 6
O 376V 11 2 8.1 251 15.0 210 11.1 1 2
53 22.0 1 171 9.9 89 34.8 2
O
4.2
25.8 98 39.9 2
O
377G
92 7.6
2.4 76 28.8
377K 117 10.0 167 27.7
•
99
11.3
32.4 245 6.5 4
163 13.9 19 91.9 6
A 3780 98 6.6
A 378N 101 7.1 180 3.0 90
V 379N 96 19.5 74 39.0 204 5.5 4 V 3790 113 3.2 85 27.3 21 8 4.1 4
V 319S 80 18.4 86
137 1.4 2
3791 101 1 6.6 109 1 4.9 237 22 4
E 380A 106 3.2 152 28.8 1 39 4.2 2 E 3800 102 2.1 73 44.2 78 0.1 2
19.0 139
E 380N 111 7.7 142
E 3805 1 10 8.5 230 24.1 131 0.1 2 E 380T 100 1.2 1 72 11.0 115 4.8 2 103 7.8 82 29.6 2
E 382A 1 10 6.0 3820 95 0.8 73 25.7 80 34. 2 2
e
1 6.6 67 28.2 6
e 382F 1 21 13.8 222
2.8 84
E 382H 89 1 7.9 135
E 3821
109
6.2 219 5.4 6
153 30.2 92 15.6 4
e 3B2K 96 2.6 E 382L 93 1 6.5 126 11.1 156 7.7 2 E 382M 89 1 4. 6 1 35 8.6 126 20.3 2
5.2 69 4.5 2
E 3B2N 99 1.1 137 122 22.0 69 1 4.6 2
E 382P 85 16.8
E 3820 105 12.2 162 12.0 1 40 19.3 2 e 382R 104 8.4 165 2.7 85 3.0 4
E 3825 85
151 10.0 75 4.1 2
E 382T 89 10.2 172 5.2 109 30.0 2 E 3B2V 83 32.5 173 6.2 167 0.4 2 E 382W 97 10.5 172 5.2 73 1.9 2
11.5 1 88 14.5 78 3.3 4
E 3B2Y
98 18.8 o 1586.3 2
108
G 385E
101 23.2 82 15.8 2
G 3B5P 100 3.2
o 3B6K 96 9.5 115 4.8 266 1.6 4
27.5
F 423N 107 8.5 158 2.1 48 2
29.8 f17 7.3 58 9.3 2
S 424H 1 16 S 424M 91 3.5 60 60.0 15 14.4 2 S 424V 103 9.3 57 35.4 115 10.5 4 S 4260 1 05 24.3 65 10.0 31 8 12.7 4
S 42el 91 35.3 117
193 20.4 4
V 427N 108 5.5 192 5.9 64 23.1 2
H
429A
81 .7
61 11.4 147 1.9 2
H 429F 70 11.1 77 16.5 288 12.8 4 H 429M 103 0.7
83 12.2 173 3.2 2
E 430A 100 8.3 119 6.6 204 7.1 2 190 4.6 4
E 4300 96 8.2 44 25.5 E 430F 111 1 3. 0 218 19.4 203 8. 1 2
e 430G 97 7.8 1 31 10.6 e 430H 91 7.7 192 8.0 227 4.2 6
e 4301 87
308 6.6 297 17.2 6
E 4301( 66 9.5 131 12.6 203 16.0 4
1 0.6 6
E 430L 98 33.3
8.7 2Z1 4.6
e 430M 102 16.1
E 43QN 82 24.6 171 13.0 162 2.2 2 E 430P 103 13.1 86 1 6.7 254 23.5 8
8. 3 320 12.8 97 4.9 8
E 4300
6.6 227 7.9 8
E 430R 75 7.5
E 430S
88
3.4
221 18.5 2183
E 430T 82 22.9 1 37 23.7 249 8.2 6
281 7.0 278 17.5 6
E
430V 79
430W
8.3 11 95.0 171 5.4 2
E
e 430Y n 44.5 126 12.5 231 na 2 A 431 H 81 44.0 151 11.5 236 na 2
A 431 K 98 26.6 176
4.4
113 2
A 431 P 62 1 2.0 29 13.8 21 0 8.0 2
15.6
115 2
L 432R 68 23. 1 38
L 4328 58 55.4
3.6 124 0.2 2
N 434F na na 1008 1.4 na na 4 N 434G 105 17.9 358 20.2 26 128.9 4
N 434H 90 12.9 855 20.4 57 9.1 6
81 9.3 6 125.4 73 8.9 2
N
1.7 2
N 434W 108 6.6 1335 18.8
N 434Y 106
1615 38.8 291 15.5 4
V 4361 119 18.0 194 24.2 35 8.7 2
Y 4361 112 27.2 172 8.1 00 16.3 4 Y 436T 90 35.0 115 7.2 48 20.3 · 2 a 438G 93 32.1 98 14.4 68 26.2 2
o 438K 99 31 .7 169 12.3 1 1 6 43.0 2
200 1 4.7 100 5.5 4
a 438L 94
126 9.5 56 26.8 2
o 4381 96
Q 438W 93 32.5 164 8.2 126 1.7 2
94 9.0 53 40.3 2
K 439E 103 28.9 K 439H 91 37.3 99 0.9 n 11.8 2 2
K 4390 90 38.2 74 0.9 64 26.5 S 440A 79 42.3 82 2.0 85 22.5 2
S 4400 82 18.4 72
99 9.4
S
104 4.0
73 2.8 87 35.3 2
S
440F 1 1 1 16. 1 87 8.2 73 18.5 2
S
4406 1 06 1.9 1 01 8.1 83 8.5 2
S
440H 108 2. 1 11 0 2.1 96 18.3 2
S
4401 121 1.9 96 6.2 86 2.6 2

440K 116 16.7
132
71 4
S 440L 112
4.5 4
126 2.2 77
S 440M 84 51 .0 80 8.2 81 20.6 2 S 440N 78 34.3 82 25.4 108 15.8 2
S
«00 73 43. 1
81 33.S
16.6
2
91 1 1.3 88 16.2
29.8 2
S 440R
89
2.1
2
S 440T
39.0 115 17.4
S 440V 85 11.3 98 18.7 110 16.4 2 S 440W 114 17.6 as 13.8 132 14.8 2 S 440V 109 6.8 100 14.2 224 1 4.1 16
S
442K
51.9 138
100
11.1
Na = no disponible o no realizado
* Por ejemplo, L235A indica una Fc en el que la leucina presente en el aminoácido de Fc número 235 (según la numeración de EU) se ha sustituido por un residuo de alanina sometido a prueba en este caso: la región Fc es una Fc de IgG1 , el anticuerpo es un anticuerpo anti-CD20.
Tabla 10 Variantes de combinación -AOCC
Variante ADCC promedio como % de n= %dewt CD
Tipo natural 100 2.42 2
247A,3390 11.50 2
247H 3390 4
2471 3390 187.21 2
2
126.46 4.71 2
247F.339H 101 .54
11 4.24 4.91 2
2471 339H 126.94 2
247L.339H 120.92 2
241T 339H
97.96
247V. 339H 74.75
------
""
96.95 3.05 2
11 6.53 5.52 2 247H 339' 108.27 2.97 2 2471.3391 -4.07 2 2 247T 3391 9.51
241Y.3391
13.51
241F 339K 105.85 10.1 1 2
2471 339K 91.41 2
2
241Y.339K 2
332E 2
247A.339N 9.91 2 247F 339N 8.95 2
119.62 2
114 4 247Y 339N 2
69.94 8.45 2
247F 3390 2.35 2
2471 3390 2
4.58 2
119.70 2
2.24 2
68.57 8.33 2
11.85 2 2
2471,339R 16.31 2 2
12.1 1 2
98.58 13.09 2 247L.339T 1 48. 48 4
wt = tipo natural % de CV=
n = número de muestras medidas y calculado su promedio
Tabla 11 Variantes de combinación con potenciación de ADCC
Variante de Fc ADCC CE50 (ng/ml)
Tipo natural
6.8
247L
2.2
330K
3. 1
332E
339T
3.8
247L, 330K
0.73
247L, 3391'
2.0
330Kt 332E
0.73
330K. 339T
2.0
332E. 339T 1.0
332E. 339T
0.75
247L. 3301{. 332E
0.25
339T
330K, 332E. 339T 0.25
5
2471.., 330K, 332a 339T 0.25 . . * Las actividades de ADCC se calcularon a partir de curvas de titulación Tabla 12 Variantes de combinación
Mutación Tipo natural 247H339D
ADCC 100 118 % de CV 8.5 FcRn6.0 100 NID % de CV N/O CDC 100 NID % de CV NID n= 4
184 50 5.9 43 1.3 22471251 F330R332E
124 11.3
247L251 F376. 77 29.7 61
247L332E 168 78 6.2 6
8.1
247l332E376I 137
8.0 76
247T339N 114 4.8 NI[) NIO NJD NJD 4 251 F332E 147 12.4 72 2.2 196 2.6 6
251F332E3761 136 15.9 68 5.0 160 10.9 4
2.9 102
251F3761 114
8.1
268 1.2
10.0 2
256P3111 107 0.2
19.5 190 4.5256P314V332E440V 146 3.1
3.0 226 9.4
256P314V440V 112 22.6
256P332E 174 16.3 121 8.2
256P332E440Y 184 117 6.5 230 10.0 2
256P4300 109 2.6 299
256P434H
1.2 342 2.9
256P440V 169 19.7 122 0.7 247 26.6 2
52 409
3.9 61
25713111434H 48 12.2 553 4.9 75 8.8 6 25714300 26 8.' 304 0.6 55 12.9 4
2571434H 6.3 14.0 2
2680332E 137 12.4 92 13.7 128 4.1 4
268E332E 178 5.3 88 2.0 160
1.2 72 2272R279L 56 0.2
279A288N 107 3.9 NIO NID NIO NID 4 279A288N311T318V 110 9.0 N/O NID NID NID 4
NID NIO NID NID 4279A288N318N 110 NJO NIO NIO NIO 4279A288N318T 116
279A288N318V 118 8.8 NJO NID NIO NIO 4 279A311T31BT 110 7.9 NIO NID NiO NID 4
NJO NID NiO NIO
..
288N311T318T
115
31 ,T318T
107
314V332E440Y
156
filiO NID NIO NIO 4
0.0
82 0.95.4
8.5 108 2.6 2314Y440Y 125 12.7 43 0.3 22.9 88330K3320
33OK332E 202 5.6 94 0.0 42 1.0 2 330A3320 152 6.3 88 6.3 44 1.5 2 33OR332E 161 4.3 94 2.1 59 4.0 4
332E3761 132 8.6 102 5.2 6
332E376V 139 1.9 132 3.5 261 8.6 6 332E440Y 203 13.0 94 5.7 159 5.9 ..
343R345D
16.0 1.6
3.3
376V4300 92 1.5 212 4.2 256 12.2 ..
376V430R
84 2.7 188 9.1
1.0
376V434H 97 3.3
Tabla 13 Variantes de combinación
Mutación
FcRn6.0 % de CV n=
Tipo natural
100
2580272R 2580283R
25BD286F
2580307E 258031 11
258D376V
382.'
41 1.1
445.0
-
237.1
522.0
415.1
8.2 2
3.7 2
1.7 2
4.8 2
7.0 2
4.3 2
272R283R
21 .7 2
338.4 8.8 2 272R31 H
272A286F
396.1 14.4 2
368.7 8.1 2
272R376V
2790307E
522.4 8.8 2
400.2 1.1 2
283R31 11
531 .3 6.1 2
474.8 1.1 2
283A376V
431.2 3.8 2
286F307E
412.3 0.0 2
286F31 11
348.9 1.5 2
286F376V
410.1 4.3 2
307E376V
413.5 38.1 2
311 1376V
2 -Caracterización de la actividad de CDC de variantes Este ejemplo describe cómo se determina la actividad de CDC de diversas regiones Fc variantes.
5 Este ensayo se lleva a cabo usando complemento humano (Quidel Corp., n.o de cat. Al 13) con células 15 Ramos (n.o de RA 1) (n.o de registro de ATCC CRL1596). Se cultivan células Ramos en medios RPMI1640 de Gibco que contienen FBS al 10% a 37°C y C02 al 5%. El día antes del ensayo, se siembran las células
10 a 1 x 106 células en un matraz T175. Al día siguiente, se resuspenden las células hasta 3,57 x 105 células/mi en RPM 11640 sin rojo de fenal que contiene FBS al 1 %. Se distribuyen 70
de células por pocillo en una placa de fondo plano Costar 3917. Para la curva de titulación, se prepara IgG con una región Fc variante en una dilución en serie de 3 veces en medios RPM11640. Para el ensayo de explo
15 ración de biblioteca de un único punto, se normaliza variante de IgG expresada de manera transitoria en sobrenadante de cultivo a 1 Ilg/ml en medios de simulación. Se añaden treinta microlitros de IgG variante (es decir, concentración final de 200 ng/ml) y 50 111 de complemento humano (Quidel Corp., n.o de cat. de A1 13) diluido
1:5 en RPMI 1640 + FBS al 1 % a la célula diana y se mezcla bien mediante pipe20 tea suave. Se incuban las placas a 37°C en presencia de C02 al 5% durante 1,5 horas. Tras la adición de 15 IlI/pocillo de Alamar Blue (Serotec, n.o de cat. BUF012B) continúa la incubación durante la noche. Después se mide la señal de fluorescencia mediante un lector de multidetector EnVision 21 00 de PerkinElmer con excitación a 560 nm y emisión a 590 nm.
ii. Análisis de datos Todos los ensayos de un único punto se realizan por duplicado. Cada placa de ensayo contiene controles para lisis de células diana espontáneas mediante complemento humano en ausencia de IgG y lisis máxima de células diana en presen
10 cia de Triton X-1 00 aI 1%. Se incluyen tres controles de tipo natural en cada placa de ensayo y se calcula el promedio de la señal de ensayo de CDC. Se resta el valor de fondo, obtenido a partir de control de lisis espontánea, de cada muestra. Se convierten los datos de señales de fluorescencia a porcentaje de lisis específica basándose en controles de lisis espontánea y máxima. Se calcula el porcentaje de lisis específica a partir de la siguiente ecuación: porcentaje de lisis específica = (señal de fluorescencia experimental -señal espontánea)/(señal de lisis máxima señal espontánea) X 100. Entonces se calcula el porcentaje de actividad de variante de Fc con respecto al promedio de tres controles de tipo natural. Se calcula el promedio de las actividades en porcentaje con respecto a tipo natural para pla
20 cas de ensayo por duplicado y se calcula la desviación estándar entre placas de ensayo individuales.
3 -Caracterización de la unión a FcRn Este ejemplo describe ensayos para determinar la unión de receptor neonatal de 25 Fc (FcRn) a IgG con una región Fc variante.
Se recubre una placa de ELlSA de 96 pocillos con fondo en U (Costar) con 50 IlI/pocillo de Neutravidin 2 Ilg/ml (Pierce Biotechnology, n.o de cat. 3 1000) en tampón carbonato 50 mM (pH 9,3) a 4°C durante la noche. Se retira la NeutraAvi30 din no unida y se lava la placa tres veces con PBST (PBS que contiene Tween 20 al 0,1%). Se aplican cincuenta microlitros de FcRn soluble marcado con biotina a 2,5 Ilg/ml en PBS por pocillo y se incuban a temperatura ambiente durante 1 h. Después se añaden 75 III de tampón de bloqueo de caseína (Pierce Biotechnolo
gy, n.o de cat. 37528) a la placa durante 1 hora. Entonces se lava la placa de ELISA con PBST y se incuba con 50 fll/pocillo de IgG variante. Para la curva de titulación, se prepara IgG que va a someterse a prueba mediante una dilución en serie de 3 veces en tampón de unión a FcRn (NaP04 100 mM, Tween-20 al 0,05%, opcionalmente a pH diferentes (desde 6,0 hasta 7,4». Para la selección de un único punto, se normaliza IgG variante expresada de manera transitoria en sobrenadante de cultivo hasta una concentración final de 50 ng/ml y se ajusta el pH con tampón de unión a FcRn a 6,0. En las siguientes etapas, se usa tampón de unión a FcRn a pH correspondiente para lavar la placa y diluir los reactivos. Se lleva a cabo la reacción de unión a temperatura ambiente durante 1 h. Tras tres lavados, se detecta la IgG unida mediante conjugado (Fab'h de cabra anti-Fab humanoHRP durante 1 h. Se desarrolla actividad HRP en sustrato de HRP de Pierce (Turbo TMB-ELlSA, n.o de cat. 34022) durante 5-30 minutos. Se detiene la reacción mediante adición de 50 fll de H2S04 2 M Y se lee la absorbancia a 450 nm con un lector de microplacas VMAX (Molecular Devices).
EJEMPLO 4 -de seres humanos con variante de Fc 1332E anti-CD20 Estudios in vitro y modelos de tumor murinos (Clynes RA, et al. Nat Med. 6:443 (2000» proporcionan evidencias de que la ADCC desempeña un papel en los efectos antitumorales de anticuerpos anti-CD20, tales como RITUXAN. Puede tratarse a pacientes humanos con anticuerpos de variante de Fc 1332E anti-CD20 o RITUXAN, de una manera similar a la dada a conocer en Cartron et al., Blood
99:754 (2002). Por ejemplo, pacientes que presentan enfermedad en estadio 11 a IV según la clasificación de Ann-Arbor, que tienen al menos un sitio de enfermedad medible, y baja carga tumoral según los criterios de GELF, pueden tratarse con un total de cuatro dosis de aproximadamente 375 mg/m2 de una variante de Fc anti-CD20 o con RITUXAN administrados mediante infusión intravenosa (días 1, 8, 15 Y 22). El criterio de valoración de la eficacia principal es la tasa de respuesta objetiva, es decir, la proporción de pacientes que alcanzan o bien remisión completa (RC), o bien RC no confirmada (RCnc) o bien respuesta parcial (RP) según criterios recientemente propuestos por un comité de expertos internacional.
La respuesta clínica puede evaluarse en el mes dos (M2). También puede evaluarse a los pacientes para determinar la progresión a 1 año (M12).
Pueden compararse las tasas de respuesta objetiva a M2 y M12 para pacientes tratados con RITUXAN o variante de Fc anti-CD20 de tal manera que puedan cuantificarse las actividades ADCC mejoradas proporcionadas por una variante de Fc. Puede repetirse el mismo ejemplo con otras variantes anti-CD20 (véanse, por ejemplo, las tablas 1-10 en el presente documento).
Adicionalmente, la potencia potenciada de las variantes puede permitir diferentes vías de administración, inyecciones menos frecuentes y/o administración de dosis menores.
Lista de secuencias
<1 10> Applied Molecular Evolution (AME)
<120> Regiones Fc variantes
<130> x16877
<140> Documento US 60/643.718
<141>
<150> Documento US 60/638.442
<151>
<1 50> Documento US 60/609.101
<151>
<1 50> Documento US 60/604.339
<151>
<150> Documento US 60/602.953
<151>
<1 50> Documento US 60/598.855
<151>
<160> 36
<170> Patentln versión 3.3
<210> 1
<211> 218
<212> PRT
<213> Horno sapiens
<400> 1
pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly pro Ser val phe Leu phe pro pro1 5 10 15
Lys Pro Lys ASp Thr Leu Met Ile ser Arg Thr pro Glu val Thr Cys 20 25 30
val val val ASp val ser His Glu Asp pro Glu val Lys phe Asn Trp 35 40 45
Tyr val ASp Gly val Glu val His Asn Ala Lys Thr Lys pro Arg Glu 50 55 60
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg val val Ser val Leu Thr val Leu 65 70 75 80
His Gln ASP Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys cys Lys val Ser Asn 85 90
Lys Ala Leu pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile ser Lys Ala Lys Gly 100 105 110
Met Thr Lys Asn Gln val Ser Leu Thr cys Leu val Lys Gly Phe Tyr 130 135 140
pro ser ASp Ile Ala val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 145 150 155 160
Asn Tyr Lys Thr Thr pro Pro val Leu ASp ser ASp Gl y ser phe phe 165 170 175
Leu Tyr ser Lys Leu Thr val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 180 185 190
val Phe ser Cys Ser val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 195 200 205
Gl n Lys ser Leu Ser Leu Ser pro Gl y Lys 210 215
5 <210> 2
<211> 217
<212> PRT
<213> Horno sapiens
<400> 2
Pro Ala Pro pro val Ala Gly Pro Ser val Phe Leu phe pro pro Lys 1 5 10 15
pro Lys ASP Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu val Thr cys val 20 25 30
val val ASp val Ser His Glu ASp Pro Glu val Gln phe Asn Trp Tyr 35 40 45
val ASp Gly val Glu val His Asn Ala Lys Thr LyS pro Arg Glu Glu 50 55 60
Gln phe Asn Ser Thr Phe Arg val val Ser val Leu Thr val val His 65 70 75 80
Gln ASp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys val Ser Asn Lys 85 90 95
Gly Leu pro Ala pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln 100 105 110
Glu Glu Met 115 120
pro Arg Glu Pro Gln val Tyr Thr Leu pro Pro Ser
Th r
Asn Gln val ser Leu Thr Cys Leu val Lys Gly phe Tyr Pro 135 140
Gln pro Glu AS" Asn 145 150
ser ASP Ile Ala val Glu Trp Glu ser Asn 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu ASp Ser ASp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr val ASP Lys ser Arg Trp Gln Gln Gly AS" val 180 185 190
Phe Ser
Ser val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215
<210> 3
<211> 218
5 <212> PRT
<21 3> Horno sapiens
<400> 3
pro Ala pro Gl u leu leu Gly Gly pro Ser val phe leu phe pro pro 1 5 10 15
Lys Pro Lys ASp Thr Leu Met Ile ser Arg Thr Pro Glu val Thr Cys 20 25 30
val val val ASp val ser His Glu ASp Pro Glu val Gln Phe Lys Trp 35 40 45
Tyr Val ASP Gly val Glu val His Asn Ala Lys Thr lys Pro Arg Glu
SO
SS 60
Glu Gln phe Asn ser Thr Phe Arg val val Ser val Leu Thr val Leu 65 70 75 80
His Gln ASP Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys cys Lys val ser Asn 85 90 95
Lys Ala Leu Pro Ala pro Ile Glu Lys Thr Ile ser Lys Thr Lys Gly 100 105 110
Gln pro Arg Glu pro Gln val Tyr Thr Leu pro Pro ser Arg Glu Glu 115 120 125
Met Thr Lys Asn Gln val Ser Leu Thr Cys Leu val Lys Gly Phe Tyr130 135 140
Pro Ser ASP Ile Ala val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln pro Glu Asn 145 150 155 160
Asn Tyr Asn Thr Thr pro pro Met Leu Asg Ser ASp Gly ser phe phe 165 17 175
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr val ASp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 180 185 190
Ile phe Ser cys Ser val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr 195 200 205
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser pro Gl y Lys 210 215
<210> 4
<211> 218 5 <212> PRT
<21 3> Homo sapiens
<400> 4
pro Ala pro Glu phe Leu Gly Gly pro ser val phe Leu Phe Pro pro 1 5 10 15
Lys pro Lys ASp Thr Leu Met rle Ser Arg Thr Pro Glu val Thr Cys 20 25 30
val val val ASp val Ser Gln Glu ASp pro Glu val Gln Phe Asn Trp 35 40 45
Tyr val ASp Gly val Glu val His Asn Ala Lys Thr Lys pro Arg Glu 50 55 60
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg val val ser val Leu Thr val Leu 65 70 75 80
His Gln ASP Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys val Ser Asn 85 90 95
Lys Gly Leu pro ser Ser rle Glu Lys Thr rle ser Lys Ala Lys Gly 100 105 110
Met Thr Lys Asn Gln val Ser Leu Thr Cys Leu val Lys Gly Phe Tyr 130 135 140
pro ser ASp rle Ala val Glu Trp Glu ser Asn Gly Gln pro Glu Asn 145 150 155 160
Asn Tyr Lys Thr Thr pro Pro val Leu ASp ser ASp Gly Ser phe Phe 165 170 175
val
Phe Ser Cys195 Ser val Met Hi s Gl u Al a 200 Leu Hi s Asn 205 Hi s Tyr Thr
5
Gln Ser Leu <210> 5 <21 1> 215 <21 2> PRT <213> Mus sp. <400> 5 ser Leu Ser 215 Leu Gl y Lys
Thr val Pro Glu val ser Ser val Phe Ile phe Pro pro Lys pro Lys1 5 10 15
ASp val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys val Thr cys val val val 20 25 30
ASp Ile Ser Lys ASp ASp Pro Glu val Gln phe Ser Trp Phe val ASp 35 40 45
ASp val Glu val His Thr Ala Gln Thr Gln pro Arg Glu Glu Gln Phe 50 55 60
Asn Ser Thr Phe Arg Ser val ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln ASp 65 70 75 80
Cys Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg val Asn Ser Ala Ala Phe 85 90 95
Pro Ala pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly
Pro Lys 100 105
Ala pro Gln val Tyr Thr Ile pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys 115 120 125
Ile Thr val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln pro Ala Glu Asn Tyr Lys
145 . 150 155 160
Lys
Leu Asn val 180 Gln Lys Se r Asn Trp Gl u Al a Gl y 185 Asn Thr 190 Phe Th r
cys
Ser val 195 Leu Hi s Gl u Gl y Leu Hi s 200 Asn H; S Hi s Thr Gl u 205 Lys ser
Leu ser Hi s 210 <21 0> 6
Ser pro Gl y Lys 215
<21 1> 218
5
<212> PRT
<21 3> Mus sp. <400> 6
Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly pro Ser val phe Ile phe Pro Pro 1 5 10 15 Lys Ile Lys ASp val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile val Thr cys 20 25 30 val val val ASp val Ser Glu ASp ASp Pro ASp val Gln Ile Ser Trp 35 40 45 phe val Asn Asn val Glu val H;S Thr Ala Gln Thr Gln Thr H;s Arg
50 55 60 Glu ASp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg val val Ser Ala Leu Pro Ile Gln 65 70 75 80
H;S Gln ASP Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys cys Lys val Asn Asn 85 90 95 Lys ASp Leu pro Ala Pro Ile Glu Thr Ile Ser Lys pro Lys Gly 100 110 Ser val Ala Pro Gln val val Leu Pro Pro pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln val Thr Leu Thr Cys Met val Thr ASp phe Met
130 135 140 Pro Glu ASp Ile Tyr val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu 145 150 155 160
Asn Tyr lyS Asn Thr Glu Pro Val Leu ASp Ser ASp Gly ser Tyr phe 165 170 175 Met Tyr Ser Lys Leu Arg val Gl u
Lys Asn Trp val Glu Arg Asn
UO
O
Ser Tyr Ser Cys ser val val H;S Glu Gly Leu H;s Asn His H;S Thr 195 200 205
Thr Lys Ser Phe ser Arg Thr Pro Gly Lys 210 215
<210> 7
<211> 218 5 <212> PRT
<21 3> Mus sp.
<400> 7
pro Ala Pro Asn Leu Glu Gly Gly pro ser val phe ¡le phe Pro Pro 1 5 10 15
Asn Ile Lys ASp val Leu Met Ile ser leu Thr pro Lys val Thr Cys 20 25 30
val val val ASp val Ser Glu ASp ASP pro ASp val Gln Ile ser Trp 35 40 45
Phe val Asn Asn val Glu val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg50 55 60
Glu ASp Tyr Asn ser Thr ¡le Arg val val ser His Leu Pro ¡le Gln 65 70 75 80
His Gln ASP Trp Met Ser Gly Lys Glu phe Lys cys Lys val Asn Asn 85 90 95
Lys ASP Leu pro Ser pro Ile Glu
Thr ¡le ser LYS pro Lys Gly 100
110 Leu val
Ala pro Gln val Tyr Thr Leu pro pro pro Ala Glu Gln 120 125
Leu Ser Arg Lys ASP val ser Leu Thr Cys Leu val val Gl y phe Asn 130 135 140
pro Gly ASp ¡le Ser val Glu Trp Thr Ser Asn Gly His Thr Glu Glu 145 150 155 160
Asn Tyr Lys Asp Thr Ala Pro val Leu ASp Ser ASP Gly Ser
Phe 165 170
¡le Tyr Ser Lys Leu Asn Met Lys Thr Ser Lys Trp Glu Lys Thr ASP 180 185 190
Ser phe ser Cys Asn val Arg H;S Glu Gly Leu Lys Asn Tyr Tyr Leu 195 200 205
Lys
Thr Ile Ser Arg Ser pro Gly Lys 215
<210> 8
<211> 218 5 <21 2> PRT
<21 3> Mus sp.
<400> 8
Pro pro Gly Asn Ile Leu Gly Gly pro ser val Phe Ile phe pro pro1 5 10 15
Lys pro Lys ASp Ala Leu Met Ile Ser Leu Thr pro Lys val Thr cys 20 25 30
val val val ASp val Ser Gl u ASP ASp Pro ASp val Hi s val Ser Trp 35 40 45
Phe val ASp Asn Lys Glu val His Thr Ala Trp Thr Gln pro Arg Glu 50 55 60
Ala Gln Tyr Asn ser Thr Phe Arg val val Ser Ala Leu pro Ile Gln 65 70 75 80
His Gln ASp Trp Met Arg Gly Lys Glu Phe Lys cys Lys val Asn Asn 85 90 95
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
Thr Ile Ser Lys pro Lys Gly 100
Arg Ala Gln Thr Pro Gln val Tyr Thr Ile Pro pro Pro Arg Glu Gln 115 120 125
Met ser Lys Lys Lys val Ser Leu Thr cys Leu val Th r Asn Phe phe
UO U5 UO ser Glu Ala Ile ser val Glu Trp Glu Arg Asn Gly Glu Leu Glu Gln 145 150 155 160
ASp Tyr Lys Asn Thr pro pro Ile Leu ASp Ser ASp Gly Thr
phe 165 170
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr val ASp Thr ASP Ser Trp Leu Gln Gly Glu O 5 O
Ile phe Thr Cys Ser val val His Glu Ala Leu His Asn His His Thr 195 200 205
Gln LYS Asn Leu ser Arg ser pro Gly Lys 210 215
<210> 9
<211> 110 5 <212> PRT
<21 3> Horno sapiens
<400> 9
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly pro Ser val phe Leu Phe Pro Pro Lys1 5 10 15
Pro Lys ASP Thr Leu Me Ile ser Arg Thr Pro Glu val Thr Cys val 20 25 30
val val ASP val ser Hi s Gl u ASP Pro Gl u val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45
val ASP Gly val Glu val His Asn Ala Lys Thr lys pro Arg Glu Glu 50 55 60
Gl n Tyr Asn Ser Thr
Arg val val ser val Leu Thr val Leu Hi s 65
75 SO Gl n ASp Trp Leu n Gly Lys Glu Tyr s Cys Lys val Ser ;n Lys
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys100 105 110
<210> 10
<211> 107
<212> PRT 5 <21 3> Horno sapiens
<400> 10
Gly Gln pro Arg Glu pro Gln val Tyr Thr Leu Pro Pro ser Arg Glu 1 5 10 15
Glu Met Thr Lys Asn Gln val Ser leu Thr Cys Leu val
Gly Phe 20 25
Tyr pro ser ASp Ile Ala val Glu Trp Glu ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro val Leu ASP Ser ASp Gly Ser phe 50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr val ASp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80
Asn val phe Ser
ser val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr90 95
Thr Gln Lys Ser Leu ser Leu Ser pro Gly Lys 100 105
<210> 11
<211> 330 10 <21 2> PRT
<21 3> Horno sapiens
<400> 11
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser val Phe pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15
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Pro Ala pro Glu Leu Leu Gly Gly pro Se, val Phe Leu Phe pro pro
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val val val ASp val Ser His Glu ASp pro Glu val Lys phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr val ASp Gly val Glu val H;S Asn Ala Lys Thr Lys pro
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Leu val Lys Gl y Phe Tyr 245
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val phe Ser cys Ser val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320
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20 25 30
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35 40 45
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55 ro
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pro Ala Pro Glu leu leu Gly Gly pro Ser val phe leu phe pro Pro
115 120 125
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val val val ASp val Ser His Glu ASp Pro Glu val Lys phe Asn Trp
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Glu
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210 215 220
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leu Thr lys Asn Gln val Ser leu Thr
leu val lyS Gly phe Tyr
pro ser ASP Ile Ala val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln pro Glu Asn
260 265 270
Ser Phe Phe
Asn Tyr
Leu Tyr ser Lys Leu Th r val ASp Lys ser Arg Trp Gl n Gl n Asn val
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Cys
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<223> Constructo sintético
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<220>
<223> Constructo sintético
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225 230 235 240
Gl y pro Ser val Phe leu phe Pro Pro lys pro lys ASp Thr leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu val Thr Cys val val val ASp val Ser His
260 265 270
val Glu val
Glu ASp pro Glu val lys phe Asn Trp Tyr val ASP
275 280
His Asn Ala lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg val val Ser val leu Thr val Leu His Gln ASp Trp Leu Asn
305 310 315
Lys Glu Tyr lys Cys Lys val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Gln Pro Arg Glu Pro Gln val Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
340 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg ASp Glu Leu Thr Lys Asn Gln val Ser
355 360 365
Leu Thr cys Leu val Lys Gly phe Tyr Pro Ser ASP Ile ASP val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
Lys Th r Thr Pro Pro
400385 390
val Leu ASp Ser ASp Gl y Ser Phe Phe Leu Tyr ser lys Leu Thr val
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn val phe Ser cys Ser val MetASP Lys Ser
425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
pro Gly Lys
<21 0> 36
<211> 1356
<212> ADN 5 <21 3> Artificial
<220>
<223> Constructo sintético
<400> 36
gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60 tcctgtaagg gttctggccg tacatttacc agttacaata tgcactgggt gcgccagatg 120 CCcgggaaag gcctggagtg gatgggggct atttatccct tgacgggtga tacttcctac 180 aatcagaagt cgaaactcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcag caccgcctac 240 ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gagatcgact 300 tacgtgggcg gtgactggca gttcgatgtc tggggcaagg ggaccacggt caccgtctcc 360 tcagcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420 gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480 tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540
tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600
acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaggttgag 660 cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720 ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780 cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900 aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960 aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1020 tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggac 1080 gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1140 atcgacgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260 tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320 acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaatga 1356

Claims (12)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Anticuerpo anti-CD20 que comprende:
    (a)
    una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera que consiste en SEO ID NO: 13;
    (b)
    una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada que consiste en SEO ID NO: 14; y
    (c)
    una variante de una región Fc original, en el que la región Fc original es una región Fc de IgG1 humana y en el que la región Fc variante comprende una sustitución de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en 2471/3390 y 2471/339D.
  2. 2.
    Anticuerpo anti-CD20 según la reivindicación 1, en el que la región Fc original es una región Fc de IgG1 humana nativa.
  3. 3.
    Anticuerpo anti-CD20 según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la variante de Fc es 2471/3390.
    Anticuerpo anti-CD20 según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el
    que la variante de Fc es 2471/339D.
  4. 5. Anticuerpo anti-CD20 según la reivindicación 3, que comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que consiste en SEO ID NO: 29 y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que consiste en SEO ID NO: 31 .
    Anticuerpo anti-CD20 según la reivindicación 5, en el que la cadena ligera
    se codifica por una secuencia de ácido nucleico que comprende SEO ID NO: 30 y la cadena pesada se codifica por una secuencia de ácido nucleico que comprende SEO ID NO: 32.
  5. 7. Anticuerpo anti-C020 según la reivindicación 4, que comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que consiste en SEQ ID NO: 29 y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que consiste en SEQ ID NO: 33.
    Anticuerpo anti-C020 según la reivindicación 7, en el que la cadena ligera
    se codifica por una secuencia de ácido nucleico que comprende SEQ ID NO: 30 y la cadena pesada se codifica por una secuencia de ácido nucleico que comprende
    SEQ ID NO: 34.
    10 9. Composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-C020 según cualquiera de las reivindicaciones 1-8.
  6. 10. Composición farmacéutica según la reivindicación 9, que comprende además un portador farmacéuticamente aceptable.
  7. 11. Anticuerpo anti-C020 según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, para su uso en el tratamiento de linfoma.
    a r4
    M1.11.41.1M.111.11.1
    4M
    ."""
    mwsw a-s p.emftsw
    SS5EUIM
  8. 6.1
    = xxRii ii
    .1ZZtr,°C0 263212 ttEEt.
    gFRE RE
    oaox
    U
    eeeg
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    gg
    121/114 W MOO a m
    R 222tttt
    liEi551 Hirds
  9. 0. M
    W t 0 a a a (A GO a a
  10. 4.4 ripoo.mo-orom
    t tttti4tt
    cia aidaaOaa 4-i4.44..4.4 mmr.
    04 444044N4
    iiiiiii
    M1.44.4FO4.. M4-4
    EgER222 caopooac
    ESESEREg
    m..mommw
    reining
    ssn3stss
    32332225 2222225a
    FEE EgE ozza g sa
    1111 1 i ii
    FIG. 4
    A. (SEQ ID NO: 13)
    EIVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASSSVP YIHWYQQKPG QAPRLLIYAT SALASGIPDR FSGSGSGTDF TLTISRLEPE DFAVYYCQQW LSNPPTF
    B. (SEQ ID NO: 14)
    EVQLVQSGAE VKKPGESLKI SCKGSGRTFT SYNMHWVRQM PGKGLEWMGA IYPLTGDTSY NQKSKLQVTI SADKSISTAY LQWSSLKASD TAMYYCARST YVGGDWQFDV W
    C. LCVR de anti-CD20 (I/) (SEQ ID NO: 15)
    QIVLSQSPAI LSASPGEKVT MTCRASSSVS YIHWFQQKPG SSPKPWIYAT SNLASGVPVR FSGSGSGTSY SLTISRVEAE DAATYYCQOW TSNPPTF
    D. HCVR de anti-CD20 (II ) (SEQ ID NO: 16)
    OVOLQQPGAE LVKAGASVKM SCKASGYTFT SYNMHWVKQT PGRGLEWIGA IYPGNGDTSY NQKFKGKATL TADKSS STAY MQLSSLTSED SAVYYCARST YYGGDWYFNV W
    E.
    Anti CD20- ( I )
    LCVR CDR1
    ( SEQ ID NO: 17 ) : RASSSVPYIH
    LCVR CDR2
    ( SEQ ID NO: 1 8 ) : ATSAIAS
    LcyR CDR3
    ( SEQ ID NO: 1 9 ) : QQWLSNPPT
    HCVR CDR1 (SEQ ID NO: 20) : GRTFTSYNMH HCVR CDR2 (SEQ ID NO: 21 ) : AIYPLTGDTSYNQKSKL HCVR CDR3 (SEQ ID NO: 22 ) : STYVGGDWQFDV
    Anti-CD20 (II ) LCVR CDR1 (SEQ ID NO: 23 ) : RASSSVSYIH LCVR CDR2 (SEQ ID NO: 24 ) : ATSNLAS LCVR CDR3 (SEQ ID NO: 25 ) : QQWTSNPPT
    HCVR CDR1 (SEQ ID NO: 26 ) : GYTFTSYNMH HCVR CDR2 (SE0 ID NO: 27 ) : AIYPGNGDTSYNQKFKG HCVR CDR3 (SEQ ID NO: 28 ) : STYYGGDWYFNV
    FIG. 5
    A.SZQ ID NO:29: Secuencla de aminoacidos de la cadena ligera completa de ANZ 13a
    E I VLTQS PGTLSLS PG ERATLSCRASS SVPY I HWYQQKPGQAPRLL I YATSALASG I PDR
    FSGSGSGTDFTLT I S RLEP ED FAVYYCQQWL SNPPTFGQGTKLE I KRIVAAPSVF I FPPS
    DEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQ14KVDNALQSGNSOESVTEODSKDSTYSLSSTLTL
    SKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
    -
    La region constante esta subrayada
    S.SZQ ID NO:30: Secuencia de Acid° nucleic° de la cadena ligera completa de ANZ 133
    GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCrTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACC CTCTCCTGCAGGGCCAGCTCAAGTGTACCGTACATCCACTGGTACCAGCAGAAACCTGGC CAGGOTCC-CAGGCTECTMT-CTAT-GCCAGATCGGETC-7GGGTTCTGGOATCCCAGACAGG TTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAA GATTMGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTGGCTGAGTAACCCACCCACTTTTGGCCAGGGG ACCAAGCTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCT GATGAGC.AGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCC AGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAG
    AGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGC CTCAGCAGCACCCTGACGCTG AGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTG AGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
    FIG. 6
    SEQ ID 110:31: Becuencia de amin*Acidos de la cadena pesada
    complota de ANN 133 (variants 247I/339Q)
    EVOLVDSGAEVKKPGESLICISCKGSGRTFTSYNMHWVROMPGXGLEWMGAITPLTGDTSY
    MKSKLQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARSTrOGGDWQFDVWGKG7TVTVS
    SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS
    SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNWPSNTKVDICKVEPKSCDMITCPPCPAPELLG
    GPSVFLMICTICOTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVIMOMDGVEVHNAKTKPREEQY
    NSTYRVVSVLTVLHOWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKQKGQPREPWYTLPPSRD
    ELTKNWSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDMR
    WWGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
    - La region constante esta subrayada; las variantes estan en negrita
  11. 8.8110 ID NO: 32: Becuencia de Acido nucleic* de la cadena pesada
    miscast& de ANC 133 (variants 247I/339Q)
    GAGGTGCAGCTGOTGCAGTCTGGAGCAGAGGTGAAAAAGCCCGOGGACTCTCTGAAGATC
    TCCTGTAAGGGTTCTGGCCGTACATTTACCAGTTACAATATGCACTGGGTGCGCCAGATG
    CCCGGGAAAGGCCTGGAGTGGATGGGGGCTATTTATCCCTTGACGGGTGATACTTCCTAC
    AATCAGAAGTOGAAACTCCAGGTCACCATCTCAGCCGACAAGTCCATCAGCACCGCCTAC
    CTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCTCGGACACCGCCATGTATTACTGTGCGAGATCGACT
    TACGTGGGCGGTGACTGGCAGTTCGATGTCTGGGGCAAGGGGACCACGGTCACCGTCTCC
    TCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCT
    GGOGGCACAGCGGCCCTGGGCTOCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACIGGTG
    TCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCC
    TCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTOGGCACCCAG
    ACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTTGAG
    CCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGG
    GGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAAATCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACC
    CCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAAC
    TGGTACGTOGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTAC
    AACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGC
    AAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATC
    TCCAAACAGAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAC
    GAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGAC ATCGCCGTGGAGTOGGAGAGCAATOGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCC GTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGG TGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTAC ACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
    -
    Las variantes estan en negrita y subrayadas
    FIG. 6
    C. SEQ ID NO: 33: Becuencia de antinoicidoa de la cadena peeada complota de ANN 133 (247I/339D)
    EVOLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGRTFTSYNMHWVRQMPGICGLENMGAIYPLTGDTSY NQKSKLOVTISADICSISTAYLOWSSLICASDTAMYYCARSTYVGGDWQMVWGKOTTVTVS SASTKGPSVFPLAPSSICSTSGGTAALGCLVKDYFREPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNNKPSNTKVDKINEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG GPSVFLFPPKIKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKONSNKALPAPIEKTISKDKGQPREPQVYTLPPSRD ELTKNOVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNWPENNYKTTPPVLDSDGEWFLYSKLTVDKSR
    WOWNVFSCSVMHEALHNNYTQKSLSLSPGK
    _ La region constante est& subrayada; las variantes estfin en negrita
    D. 9ZQ ID NO: 34: Secuencia de Acid° nucleic° da la cadena pesada =caplet& de AIM 133 (247I/339D)
    GAGGTCCAGCTGGTGCAGTCTGGACCAGAGGTGAAMAGCCCGGGGAGTCTCTGAACATC TCCTGTAAGGGTTCTGGCCGTACATTTACCAGTTACAATATGCACTCTGGTGCGCCAGATG CCCGGGAAAGGCCTGGAGTGGATGGGGGCTATTTATCCCTTGACGGGTGATACTTCCTAC AATCAGAAGTCGAAACTCCAGGTCACCATCTCAGCCGACAAGTCCATCAGCACCGCCTAC CTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCTCGGACACCGCCATGTATTACTGTGCGAGATCGACT
    TACGTGGGCGGTGACTGGCAGTTCGATGTCTGGGGCAAGGGGACCACCGTCACCGTCTCC TCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGCTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGACCACCTCT GGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGCTGACCGTG TCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCC TCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAG ACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTTGAG CCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCrGAACTCCTGGGG GGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAAATCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACC CCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAAC TGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTAC AACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGC AAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCACCCCCCATCGAGAAAACCATC TCCAAAGACAAACGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAC GAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTrCTATCCCAGCGAC ATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCC GTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGG TGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGC.ATGAGGCTCTGCACAACCACTAC
    ACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
    -
    Las variantes est/in en negrita y subrayadas
    FIG. 6
  12. 8.880 ID NO:35: ffeauenala de anInoacidos da la aadena pemada couplet* de A= 133 (378D)
    EVQLVQSGAEVKKPG ES LKI SCKGSGRT FTSYNMHWVRQM PGKG LEWMGA I YPLTGDTSY
    NQKSKLQVTI SADKS I STAYLQWSE LKASDTAMYYCARSTYVGGDWQ FDVWG KGTTVTVS
    SASTKGPSVFPLAPS S KSTSGGTAALGCLVKDY PPE PVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQS
    SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTY I CNVNI1KP SNTKVDKKVE PKS CDKTHTCPPCPAP ELLG
    GPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY
    NS TYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPAP I EKT I SKAKGQPREPQVYTLPPS RD
    ELTKNQVSLTCLVKG FY PSDI DVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGS FFL YSKLTVDKSR
    WOOGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK
    -La region constante est& subrayada; la variante esta en negrita
    F. SIZQ ID NO: 36: 8eauenaia de Aaldo nucleic* de la a-olden* pesada ---icampleta de ANN 133 (378D)
    GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCAGAGGTGAAAAAGCCCGGGGAGTCTCTGAAGATC
    TCCTGTAAGGGTTCTGGCCGTACATTTACCAGTTACAATATGCACTGGGTGCGCCAGATG
    CCCGGGAAAGGCCTGGAGTGGATGGGGGCTATTTATCCC'TTGACGGGTGATACTTCCTAC
    AATCAGAAGTCGAAACTCCAGGTCACCATCTCAGCCGACAAGTCCATCAGCACCGCCTAC
    CTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCTCGGACACCGCCATGTATTACTGTGCGAGATCGACT TACGTGGGCGGTGACTGGCAGrTCGATGTCTGGGGCAAGGGGACCACCIGTCACCGTCTCC TCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCT GGGGGCACAGCGGC CCTGOGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTG TCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCC TCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAG ACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTTGAG CCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTG CCCAGCACCTGAACTCCTGGGG GGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACC CTCATGATCTCCCGGACC CCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAAC TGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAG CCGCGGGAGGAGCAGTAC AACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGC AAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAAC.AAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATC
    TCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAC GAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGAC ATCGACGTGCAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCC GTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGG
    TGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACC.ACTAC ACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
    -
    La variante esta en negrita y subrayada
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7183387B1 (en) 1999-01-15 2007-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
PT1176195E (pt) 1999-04-09 2013-07-18 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Processo para controlar a actividade de uma molécula funcional sob o ponto de vista imunológico
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
WO2002044394A2 (en) * 2000-11-29 2002-06-06 University Of Southern California Targetet retoviral vectors for cancer immunotherapy
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
US20070122406A1 (en) * 2005-07-08 2007-05-31 Xencor, Inc. Optimized proteins that target Ep-CAM
US8946387B2 (en) 2002-08-14 2015-02-03 Macrogenics, Inc. FcγRIIB specific antibodies and methods of use thereof
US8968730B2 (en) 2002-08-14 2015-03-03 Macrogenics Inc. FcγRIIB specific antibodies and methods of use thereof
US7960512B2 (en) 2003-01-09 2011-06-14 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
WO2004063351A2 (en) 2003-01-09 2004-07-29 Macrogenics, Inc. IDENTIFICATION AND ENGINEERING OF ANTIBODIES WITH VARIANT Fc REGIONS AND METHODS OF USING SAME
US20090010920A1 (en) 2003-03-03 2009-01-08 Xencor, Inc. Fc Variants Having Decreased Affinity for FcyRIIb
US8388955B2 (en) 2003-03-03 2013-03-05 Xencor, Inc. Fc variants
EP1619951B1 (en) * 2003-04-21 2011-06-22 Epeius Biotechnologies Corporation Methods and compositions for treating disorders
US20090123428A1 (en) * 2003-04-21 2009-05-14 Hall Frederick L Pathotropic targeted gene delivery system for cancer and other disorders
US20070178066A1 (en) 2003-04-21 2007-08-02 Hall Frederick L Pathotropic targeted gene delivery system for cancer and other disorders
US9051373B2 (en) 2003-05-02 2015-06-09 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
JP2007503206A (ja) 2003-08-22 2007-02-22 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド 変更されたエフェクター機能を有する改良された抗体およびその抗体を産生する方法
EP1761563A4 (en) 2004-05-10 2008-05-14 Macrogenics Inc HUMANIZED gamma RIIB SPECIFIC ANTIBODIES AND METHODS OF USE
WO2006085967A2 (en) * 2004-07-09 2006-08-17 Xencor, Inc. OPTIMIZED ANTI-CD20 MONOCONAL ANTIBODIES HAVING Fc VARIANTS
RS20070027A (en) 2004-07-26 2008-11-28 Biogen Idec Ma Inc., Anti-cd154 antibodies
US7740847B2 (en) 2004-08-04 2010-06-22 Applied Molecular Evolution, Inc. Variant Fc regions
CA2587766A1 (en) 2004-11-10 2007-03-01 Macrogenics, Inc. Engineering fc antibody regions to confer effector function
DK2325207T3 (en) 2004-11-12 2017-06-06 Xencor Inc Fc variants with altered binding to FcRn
US8546543B2 (en) 2004-11-12 2013-10-01 Xencor, Inc. Fc variants that extend antibody half-life
US8367805B2 (en) 2004-11-12 2013-02-05 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
US8802820B2 (en) * 2004-11-12 2014-08-12 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
US20110123440A1 (en) * 2005-03-29 2011-05-26 Genevieve Hansen Altered Antibody FC Regions and Uses Thereof
WO2006113665A2 (en) 2005-04-15 2006-10-26 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
US9284375B2 (en) 2005-04-15 2016-03-15 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
US11254748B2 (en) 2005-04-15 2022-02-22 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
US9963510B2 (en) 2005-04-15 2018-05-08 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
JP2009500344A (ja) * 2005-07-01 2009-01-08 メディミューン，エルエルシー マルチドメインタンパク質治療薬を製造するための統合的手法
US7923538B2 (en) 2005-07-22 2011-04-12 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Recombinant antibody composition
AU2006279945B2 (en) 2005-08-10 2012-04-12 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant FC regions and methods of using same
CA2625619A1 (en) 2005-10-14 2007-04-26 Medimmune, Inc. Cell display of antibody libraries
EP4342995A3 (en) 2006-03-31 2024-05-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for controlling blood pharmacokinetics of antibodies
EP4218801A3 (en) 2006-03-31 2023-08-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody modification method for purifying bispecific antibody
EP2032159B1 (en) 2006-06-26 2015-01-07 MacroGenics, Inc. Combination of fcgammariib antibodies and cd20-specific antibodies and methods of use thereof
EP2029173B1 (en) 2006-06-26 2016-07-20 MacroGenics, Inc. Fc riib-specific antibodies and methods of use thereof
US8652466B2 (en) 2006-12-08 2014-02-18 Macrogenics, Inc. Methods for the treatment of disease using immunoglobulins having Fc regions with altered affinities for FcγRactivating and FcγRinhibiting
US8465741B2 (en) 2006-12-20 2013-06-18 Mmrglobal, Inc. Antibodies and methods for making and using them
AU2013202392B2 (en) * 2006-12-20 2016-02-25 Mmrglobal, Inc. Antibodies and methods for making and using them
JP5721951B2 (ja) 2007-03-22 2015-05-20 バイオジェン アイデック マサチューセッツ インコーポレイテッド 抗体、抗体誘導体、および抗体断片を含む、ｃｄ１５４に特異的に結合する結合タンパク質ならびにその使用
CN101861168B (zh) 2007-05-07 2014-07-02 米迪缪尼有限公司 抗-icos抗体及其在治疗肿瘤、移植和自身免疫病中的应用
US20090155275A1 (en) 2007-07-31 2009-06-18 Medimmune, Llc Multispecific epitope binding proteins and uses thereof
PL2187965T3 (pl) 2007-08-17 2020-05-18 Purdue Research Foundation Koniugaty wiążący psma ligand-łącznik i sposoby ich zastosowania
WO2009041643A1 (ja) 2007-09-26 2009-04-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cdrのアミノ酸置換により抗体の等電点を改変する方法
US8795667B2 (en) 2007-12-19 2014-08-05 Macrogenics, Inc. Compositions for the prevention and treatment of smallpox
CA2708871C (en) 2007-12-21 2017-11-21 Medimmune Limited Binding members for interleukin-4 receptor alpha (il-4r.alpha.) - 173
US8092804B2 (en) 2007-12-21 2012-01-10 Medimmune Limited Binding members for interleukin-4 receptor alpha (IL-4Rα)-173
EP3825329A1 (en) 2007-12-26 2021-05-26 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to fcrn
US20110033378A1 (en) 2008-01-18 2011-02-10 Medlmmune, Llc. Cysteine Engineered Antibodies For Site-Specific Conjugation
US8669349B2 (en) 2008-04-02 2014-03-11 Macrogenics, Inc. BCR-complex-specific antibodies and methods of using same
SG189730A1 (en) 2008-04-02 2013-05-31 Macrogenics Inc Her2/neu-specific antibodies and methods of using same
JP4954326B2 (ja) 2008-04-11 2012-06-13 中外製薬株式会社 複数分子の抗原に繰り返し結合する抗原結合分子
US8314213B2 (en) 2008-04-18 2012-11-20 Xencor, Inc. Human equivalent monoclonal antibodies engineered from nonhuman variable regions
EP2318048B1 (en) * 2008-07-21 2019-05-29 Immunomedics, Inc. Structural variants of antibodies for improved therapeutic characteristics
EP3524620A1 (en) * 2008-10-14 2019-08-14 Genentech, Inc. Immunoglobulin variants and uses thereof
EP2358392B1 (en) 2008-11-12 2019-01-09 MedImmune, LLC Antibody formulation
EP2445520A4 (en) 2009-06-22 2013-03-06 Medimmune Llc MANIPULATED FC REGIONS FOR LOCAL SPECIFIC CONJUGATION
US9493578B2 (en) 2009-09-02 2016-11-15 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
WO2011044368A1 (en) 2009-10-07 2011-04-14 Macrogenics, Inc. Fc region-containing polypeptides that exhibit improved effector function due to alterations of the extent of fucosylation, and methods for their use
WO2011091078A2 (en) 2010-01-19 2011-07-28 Xencor, Inc. Antibody fc variants with enhanced complement activity
US9951324B2 (en) 2010-02-25 2018-04-24 Purdue Research Foundation PSMA binding ligand-linker conjugates and methods for using
HUE045487T2 (hu) 2010-03-04 2019-12-30 Macrogenics Inc B7-H3-ra reaktív antitestek, immunológiailag aktív fragmenseik és alkalmazásaik
US8802091B2 (en) 2010-03-04 2014-08-12 Macrogenics, Inc. Antibodies reactive with B7-H3 and uses thereof
TWI667346B (zh) 2010-03-30 2019-08-01 中外製藥股份有限公司 促進抗原消失之具有經修飾的FcRn親和力之抗體
WO2012009705A1 (en) 2010-07-15 2012-01-19 Zyngenia, Inc. Ang-2 binding complexes and uses thereof
AU2011286024B2 (en) 2010-08-02 2014-08-07 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
EP2603526A1 (en) 2010-08-13 2013-06-19 Medimmune Limited Monomeric polypeptides comprising variant fc regions and methods of use
WO2012022734A2 (en) 2010-08-16 2012-02-23 Medimmune Limited Anti-icam-1 antibodies and methods of use
WO2012032080A1 (en) 2010-09-07 2012-03-15 F-Star Biotechnologische Forschungs- Und Entwicklungsges.M.B.H Stabilised human fc
NZ607510A (en) 2010-09-10 2014-10-31 Apexigen Inc Anti-il-1 beta antibodies and methods of use
RU2013122843A (ru) * 2010-10-20 2014-11-27 Морфотек, Инк. Гликоформы антитела против фолатного рецептора альфа
PT2647707T (pt) 2010-11-30 2018-11-15 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agente terapêutico indutor de toxicidade
EP4231014A3 (en) 2010-11-30 2024-03-20 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to plurality of antigen molecules repeatedly
EP3252076B1 (en) 2011-01-14 2019-09-04 The Regents Of The University Of California Diagnostic use of antibodies against ror-1 protein
CA2827170A1 (en) 2011-02-11 2012-08-16 David M. Hilbert Monovalent and multivalent multispecific complexes and uses thereof
US20140093496A1 (en) 2011-02-25 2014-04-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Fc-gamma-RIIb-SPECIFIC Fc ANTIBODY
WO2012118813A2 (en) 2011-03-03 2012-09-07 Apexigen, Inc. Anti-il-6 receptor antibodies and methods of use
WO2012122513A2 (en) 2011-03-10 2012-09-13 Omeros Corporation Generation of anti-fn14 monoclonal antibodies by ex-vivo accelerated antibody evolution
EP3590965A1 (en) 2011-03-29 2020-01-08 Roche Glycart AG Antibody fc variants
ES2608835T3 (es) 2011-04-13 2017-04-17 Bristol-Myers Squibb Company Proteínas de fusión Fc que comprenden nuevos enlazadores o disposiciones
MX339239B (es) 2011-04-29 2016-05-18 Apexigen Inc Anticuerpos anti-cd40 y metodos de uso.
AU2012259162C1 (en) 2011-05-21 2020-05-21 Macrogenics, Inc. Deimmunized serum-binding domains and their use for extending serum half-life
WO2012162561A2 (en) 2011-05-24 2012-11-29 Zyngenia, Inc. Multivalent and monovalent multispecific complexes and their uses
CA2839539C (en) 2011-06-30 2021-06-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Heterodimerized polypeptide
UA117901C2 (uk) 2011-07-06 2018-10-25 Ґенмаб Б.В. Спосіб посилення ефекторної функції вихідного поліпептиду, його варіанти та їх застосування
WO2013025446A2 (en) 2011-08-12 2013-02-21 Omeros Corporation Anti-fzd10 monoclonal antibodies and methods for their use
WO2013047729A1 (ja) 2011-09-30 2013-04-04 中外製薬株式会社 標的抗原に対する免疫応答を誘導する抗原結合分子
EP2762493B1 (en) 2011-09-30 2021-06-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule promoting disappearance of antigens having plurality of biological activities
TW201726745A (zh) 2011-09-30 2017-08-01 中外製藥股份有限公司 促進抗原消失的抗原結合分子
TW201326209A (zh) * 2011-09-30 2013-07-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd 具有促進抗原清除之ＦｃＲｎ結合域的治療性抗原結合分子
NZ721184A (en) 2011-09-30 2018-08-31 Dana Farber Cancer Inst Inc Therapeutic peptides
ES2732712T3 (es) 2011-10-31 2019-11-25 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Molécula de unión a antígeno que tiene una conjugación regulada entre la cadena pesada y la cadena ligera
WO2013067098A1 (en) 2011-11-02 2013-05-10 Apexigen, Inc. Anti-kdr antibodies and methods of use
ES2749349T3 (es) 2011-11-07 2020-03-19 Medimmune Llc Proteínas de unión multiespecíficas y multivalentes y usos de las mismas
KR20210074395A (ko) * 2011-11-30 2021-06-21 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 면역 복합체를 형성하는 세포내로의 운반체（캐리어）를 포함하는 의약
WO2013093809A1 (en) 2011-12-23 2013-06-27 Pfizer Inc. Engineered antibody constant regions for site-specific conjugation and methods and uses therefor
TWI593705B (zh) 2011-12-28 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Humanized anti-epiregulin antibody and cancer therapeutic agent containing the antibody as an active ingredient
KR102041412B1 (ko) * 2011-12-30 2019-11-11 한미사이언스 주식회사 면역글로불린 Ｆｃ 단편 유도체
MX370668B (es) * 2012-02-24 2019-12-19 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Molécula de unión al antígeno para promover la pérdida de antígeno a través de fc gamma riib.
WO2013147153A1 (ja) 2012-03-29 2013-10-03 株式会社未来創薬研究所 抗ｌａｍｐ５抗体およびその利用
EP2857419B1 (en) 2012-05-30 2021-01-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule for eliminating aggregated antigens
WO2013180200A1 (ja) 2012-05-30 2013-12-05 中外製薬株式会社 標的組織特異的抗原結合分子
CN104736174B (zh) 2012-07-06 2019-06-14 根马布私人有限公司 具有三重突变的二聚体蛋白质
DK2869845T3 (da) * 2012-07-06 2019-12-09 Genmab Bv Dimert protein med tredobbelte mutationer
WO2014009465A1 (en) 2012-07-13 2014-01-16 Roche Glycart Ag Bispecific anti-vegf/anti-ang-2 antibodies and their use in the treatment of ocular vascular diseases
NZ705370A (en) 2012-08-24 2018-06-29 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Fcγriib-specific fc region variant
US11236168B2 (en) 2012-08-24 2022-02-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Mouse FcγammaRII-specific Fc antibody
CN104918957B (zh) 2012-10-30 2018-11-16 埃派斯进有限公司 抗-cd40抗体及其使用方法
CA2886987C (en) 2012-11-08 2022-07-12 Eleven Biotherapeutics, Inc. Il-6 antagonists and uses thereof
SG10201706618UA (en) 2012-11-15 2017-09-28 Endocyte Inc Conjugates for treating diseases caused by psma expressing cells
EP2928923B1 (en) 2012-12-10 2020-01-22 Biogen MA Inc. Anti-blood dendritic cell antigen 2 antibodies and uses thereof
EP4119947A1 (en) 2012-12-21 2023-01-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Gpc3-targeting drug which is administered to patient responsive to gpc3-targeting drug therapy
TWI693073B (zh) 2012-12-21 2020-05-11 日商中外製藥股份有限公司 對ｇｐｃ３標的治療劑療法為有效之患者投與的ｇｐｃ３標的治療劑
US10766960B2 (en) 2012-12-27 2020-09-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Heterodimerized polypeptide
KR20220156667A (ko) * 2013-01-10 2022-11-25 젠맵 비. 브이 인간 IgG1 Fc 영역 변이체 및 그의 용도
US10065987B2 (en) 2013-02-12 2018-09-04 Bristol-Myers Squibb Company High pH protein refolding methods
EP2956468B1 (en) 2013-02-12 2020-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Tangential flow filtration based protein refolding methods
US9487587B2 (en) 2013-03-05 2016-11-08 Macrogenics, Inc. Bispecific molecules that are immunoreactive with immune effector cells of a companion animal that express an activating receptor and cells that express B7-H3 and uses thereof
AP2015008740A0 (en) 2013-03-14 2015-09-30 Macrogenics Inc Bispecific molecules that are immunoreactive with immune effector cells that express an activating receptor and an antigen expressed by a cell infected by a virus and uses thereof
US10035860B2 (en) 2013-03-15 2018-07-31 Biogen Ma Inc. Anti-alpha V beta 6 antibodies and uses thereof
EA201591559A1 (ru) 2013-03-15 2016-03-31 Дана-Фарбер Кэнсер Инститьют, Инк. Терапевтические пептиды
CA2907181C (en) 2013-03-15 2023-10-17 Viktor Roschke Multivalent and monovalent multispecific complexes and their uses
CN105392801A (zh) 2013-03-15 2016-03-09 比奥根Ma公司 使用抗αvβ5抗体治疗和预防急性肾损伤
DK3460054T3 (da) 2013-03-15 2021-01-18 Atyr Pharma Inc Histidyl-tRNA-syntetase-Fc-konjugater
WO2014144466A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Biogen Idec Ma Inc. Anti-alpha v beta 6 antibodies and uses thereof
KR102318483B1 (ko) 2013-04-02 2021-10-27 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 Ｆｃ영역 개변체
JPWO2014208482A1 (ja) 2013-06-24 2017-02-23 中外製薬株式会社 ヒト化抗Ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ抗体を有効成分として含む腺癌以外の非小細胞肺癌の治療剤
UA116479C2 (uk) 2013-08-09 2018-03-26 Макродженікс, Інк. БІСПЕЦИФІЧНЕ МОНОВАЛЕНТНЕ Fc-ДІАТІЛО, ЯКЕ ОДНОЧАСНО ЗВ'ЯЗУЄ CD32B I CD79b, ТА ЙОГО ЗАСТОСУВАННЯ
US11384149B2 (en) 2013-08-09 2022-07-12 Macrogenics, Inc. Bi-specific monovalent Fc diabodies that are capable of binding CD32B and CD79b and uses thereof
EP2839842A1 (en) 2013-08-23 2015-02-25 MacroGenics, Inc. Bi-specific monovalent diabodies that are capable of binding CD123 and CD3 and uses thereof
EP2840091A1 (en) 2013-08-23 2015-02-25 MacroGenics, Inc. Bi-specific diabodies that are capable of binding gpA33 and CD3 and uses thereof
AU2014312190A1 (en) 2013-08-28 2016-02-18 Bioasis Technologies Inc. CNS-targeted conjugates of antibodies
ES2837392T3 (es) 2013-10-02 2021-06-30 Medimmune Llc Anticuerpos anti-influenza A neutralizantes y usos de los mismos
WO2015057939A1 (en) 2013-10-18 2015-04-23 Biogen Idec Ma Inc. Anti-s1p4 antibodies and uses thereof
EP3495355A1 (en) 2013-10-18 2019-06-12 Deutsches Krebsforschungszentrum Labeled inhibitors of prostate specific membrane antigen (psma), their use as imaging agents and pharmaceutical agents for the treatment of prostate cancer
TW202043467A (zh) 2013-12-04 2020-12-01 日商中外製藥股份有限公司 因應化合物濃度使抗原結合能力變化的抗原結合分子及其資料庫
BR112016012358A2 (pt) 2013-12-06 2017-09-26 Dana Farber Cancer Inst Inc peptídios terapêuticos
US8986691B1 (en) 2014-07-15 2015-03-24 Kymab Limited Method of treating atopic dermatitis or asthma using antibody to IL4RA
US8980273B1 (en) 2014-07-15 2015-03-17 Kymab Limited Method of treating atopic dermatitis or asthma using antibody to IL4RA
GB201403875D0 (en) 2014-03-05 2014-04-16 Cantargia Ab Novel antibodies and uses thereof
EP3116903A2 (en) 2014-03-14 2017-01-18 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Vaccine compositions and methods for restoring nkg2d pathway function against cancers
EP3130606B1 (en) 2014-04-07 2021-10-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Immunoactivating bispecific antibodies
EP3141603A4 (en) 2014-05-08 2017-12-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Gpc3-targeted therapeutic agent for administration to patients for whom gpc3-targeted therapeutic agent therapy is effective
CA2947157A1 (en) 2014-05-13 2015-11-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha T cell-redirected antigen-binding molecule for cells having immunosuppression function
EP3888690A3 (en) * 2014-05-16 2021-10-20 MedImmune, LLC Molecules with altered neonate fc receptor binding having enhanced therapeutic and diagnostic properties
DK3151921T3 (da) 2014-06-06 2019-12-02 Bristol Myers Squibb Co Antistoffer mod glucocorticoid-induceret tumornekrosefaktor- receptorer (gitr) og anvendelser deraf
GB201413913D0 (en) 2014-08-06 2014-09-17 Cantargia Ab Novel antibodies and uses thereof
MA40764A (fr) 2014-09-26 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité
EP3201227A4 (en) 2014-09-29 2018-04-18 Duke University Bispecific molecules comprising an hiv-1 envelope targeting arm
KR102636726B1 (ko) 2014-11-07 2024-02-13 에프. 호프만 라-로셰 엘티디 향상된 il-6 항체
PT3221346T (pt) 2014-11-21 2020-10-23 Bristol Myers Squibb Co Anticorpos compreendendo regiões constantes de cadeia pesada modificadas
MX2017006624A (es) 2014-11-21 2017-08-21 Bristol Myers Squibb Co Anticuerpos contra cd73 y sus usos.
EA201791366A1 (ru) 2014-12-19 2018-02-28 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Антитела к c5 и способы их применения
MY181199A (en) 2014-12-19 2020-12-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-myostatin antibodies, polypeptides containing variant fc regions, and methods of use
MA40662B1 (fr) 2014-12-23 2020-12-31 Bristol Myers Squibb Co Anticorps contre tigit
US10188759B2 (en) 2015-01-07 2019-01-29 Endocyte, Inc. Conjugates for imaging
CN107108729A (zh) 2015-02-05 2017-08-29 中外制药株式会社 包含离子浓度依赖性的抗原结合结构域的抗体，fc区变体，il‑8‑结合抗体，及其应用
KR20180012747A (ko) 2015-04-06 2018-02-06 서브도메인, 엘엘씨 드 노보 결합 도메인 함유 폴리펩티드 및 그의 용도
CA2987410A1 (en) 2015-05-29 2016-12-08 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies against ox40 and uses thereof
EP3322735A4 (en) 2015-07-15 2019-03-13 Zymeworks Inc. BISPECIFIC ANTIGEN-BINDING CONSTRUCTS CONJUGATED TO A MEDICINAL PRODUCT
BR112018002432A2 (pt) 2015-09-18 2018-09-18 Chugai Pharmaceutical Co Ltd anticorpos de ligação à il-8 e usos dos mesmos
WO2017086367A1 (ja) 2015-11-18 2017-05-26 中外製薬株式会社 免疫抑制機能を有する細胞に対するｔ細胞リダイレクト抗原結合分子を用いた併用療法
EP3378488A4 (en) 2015-11-18 2019-10-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha METHOD FOR ENHANCING THE HUMORAL IMMUNE RESPONSE
AU2016356780A1 (en) 2015-11-19 2018-06-28 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies against glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor (GITR) and uses thereof
CA3007033A1 (en) * 2015-12-01 2017-06-08 Genmab B.V. Anti-dr5 antibodies and methods of use thereof
US11359009B2 (en) 2015-12-25 2022-06-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-myostatin antibodies and methods of use
EP3398965A4 (en) 2015-12-28 2019-09-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha METHOD FOR PROMOTING THE EFFICACY OF PURIFYING A POLYPEPTIDE CONTAINING AN FC REGION
CN109476740A (zh) 2016-03-04 2019-03-15 百时美施贵宝公司 利用抗cd73抗体的联合治疗
SG11201807936VA (en) 2016-03-14 2018-10-30 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Cell injury inducing therapeutic drug for use in cancer therapy
TWI759287B (zh) 2016-03-15 2022-04-01 日商中外製藥股份有限公司 使用ｐｄ－１軸結合拮抗劑和抗ｇｐｃ３抗體治療癌症的方法
US20190077870A1 (en) 2016-03-16 2019-03-14 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Engineered trail for cancer therapy
EP3442574A4 (en) 2016-04-15 2019-12-11 MacroGenics, Inc. NOVEL B7-H3 BINDING MOLECULES, THEIR ANTIBODY-MEDICINAL CONJUGATES AND METHODS OF USE
JP7012665B6 (ja) 2016-05-09 2023-12-14 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー Ｔｌ１ａ抗体およびその使用
CN117683135A (zh) 2016-07-14 2024-03-12 百时美施贵宝公司 针对tim3的抗体及其用途
US20190330318A1 (en) 2016-07-25 2019-10-31 Biogen Ma Inc. Anti-hspa5 (grp78) antibodies and uses thereof
US11858980B2 (en) 2016-08-02 2024-01-02 Visterra, Inc. Engineered polypeptides and uses thereof
KR20230079499A (ko) 2016-08-05 2023-06-07 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 Il-8 관련 질환의 치료용 또는 예방용 조성물
MA45919A (fr) 2016-08-12 2019-06-19 Janssen Biotech Inc Conception d'anticorps modifiés et d'autres molécules contenant un domaine fc présentant des fonctions d'agonisme et d'effecteur améliorées
WO2018044970A1 (en) 2016-08-31 2018-03-08 University Of Rochester Human monoclonal antibodies to human endogenous retrovirus k envelope (herv-k) and uses thereof
SG10201607778XA (en) 2016-09-16 2018-04-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-Dengue Virus Antibodies, Polypeptides Containing Variant Fc Regions, And Methods Of Use
GB201619652D0 (en) 2016-11-21 2017-01-04 Alligator Bioscience Ab Novel polypeptides
WO2018098363A2 (en) 2016-11-23 2018-05-31 Bioverativ Therapeutics Inc. Bispecific antibodies binding to coagulation factor ix and coagulation factor x
JP7191833B2 (ja) 2017-01-30 2022-12-19 中外製薬株式会社 抗スクレロスチン抗体およびその使用
WO2018151821A1 (en) 2017-02-17 2018-08-23 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies to alpha-synuclein and uses thereof
CA3052837A1 (en) 2017-02-28 2018-09-07 Seattle Genetics, Inc. Cysteine mutated antibodies for conjugation
JP2020509037A (ja) 2017-02-28 2020-03-26 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ ワクチンに対する免疫応答を増強するための、ａｄｃｃが増強された抗ｃｔｌａ−４抗体の使用
WO2018185284A1 (en) 2017-04-07 2018-10-11 Miltenyi Biotec Gmbh POLYPEPTIDES WITH MUTANT HUMAN IgG4
AU2018256435A1 (en) 2017-04-20 2019-11-07 Atyr Pharma, Inc. Compositions and methods for treating lung inflammation
WO2018213097A1 (en) 2017-05-15 2018-11-22 University Of Rochester Broadly neutralizing anti-influenza monoclonal antibody and uses thereof
KR20220167342A (ko) 2017-05-25 2022-12-20 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 변형된 중쇄 불변 영역을 포함하는 항체
US11149094B2 (en) 2017-06-05 2021-10-19 Janssen Biotech, Inc. Engineered multispecific antibodies and other multimeric proteins with asymmetrical CH2-CH3 region mutations
EP3684413A1 (en) 2017-09-20 2020-07-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Dosage regimen for combination therapy using pd-1 axis binding antagonists and gpc3 targeting agent
US11230601B2 (en) 2017-10-10 2022-01-25 Tilos Therapeutics, Inc. Methods of using anti-lap antibodies
KR20200096769A (ko) 2017-11-14 2020-08-13 아르셀엑스, 인크. D-도메인 함유 폴리펩타이드 및 이의 용도
CA3082410A1 (en) 2017-11-14 2019-05-23 Arcellx, Inc. Multifunctional immune cell therapies
WO2019126536A1 (en) 2017-12-20 2019-06-27 Alexion Pharmaceuticals Inc. Humanized anti-cd200 antibodies and uses thereof
US20210087267A1 (en) 2017-12-20 2021-03-25 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Liquid formulations of anti-cd200 antibodies
WO2019140229A1 (en) 2018-01-12 2019-07-18 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies against tim3 and uses thereof
US20210107988A1 (en) * 2018-01-24 2021-04-15 Genmab B.V. Polypeptide variants and uses thereof
JP2018138022A (ja) * 2018-02-23 2018-09-06 ゲンマブ ビー．ブイ． ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域変異体およびその使用
CN116327926A (zh) 2018-03-15 2023-06-27 中外制药株式会社 对寨卡病毒具有交叉反应性的抗登革热病毒抗体及使用方法
CA3092589A1 (en) 2018-03-21 2019-09-26 Five Prime Therapeutics, Inc. Antibodies binding to vista at acidic ph
WO2019183551A1 (en) 2018-03-23 2019-09-26 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies against mica and/or micb and uses thereof
PE20201343A1 (es) 2018-04-02 2020-11-25 Bristol Myers Squibb Co Anticuerpos anti-trem-1 y usos de los mismos
EP3787678A1 (en) 2018-05-03 2021-03-10 University Of Rochester Anti-influenza neuraminidase monoclonal antibodies and uses thereof
JP7372237B2 (ja) * 2018-06-04 2023-10-31 中外製薬株式会社 細胞質内での半減期が変化した抗原結合分子
PE20211604A1 (es) 2018-07-09 2021-08-23 Five Prime Therapeutics Inc Anticuerpos de union a ilt4
KR20210031722A (ko) 2018-07-11 2021-03-22 파이브 프라임 테라퓨틱스, 인크. 산성 pH에서 VISTA에 결합하는 항체
TW202035445A (zh) 2018-10-10 2020-10-01 美商帝洛斯療法股份有限公司 抗lap抗體變異體及其用途
EP3887397A1 (en) 2018-11-28 2021-10-06 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies comprising modified heavy constant regions
CN113227134A (zh) 2018-12-05 2021-08-06 株式会社梅花治疗 抗体的Fc区变体
WO2020118011A1 (en) 2018-12-06 2020-06-11 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Anti-alk2 antibodies and uses thereof
BR112021014106A2 (pt) 2019-01-22 2021-10-13 Bristol-Myers Squibb Company Anticorpos contra subunidade alfa de il-7r e usos dos mesmos
US20220153875A1 (en) 2019-03-19 2022-05-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule containing antigen-binding domain of which binding activity to antigen is changed depending on mta, and library for obtaining said antigen-binding domain
CN113993896A (zh) 2019-04-08 2022-01-28 比奥根Ma公司 抗整联蛋白抗体及其用途
US20220193237A1 (en) 2019-04-18 2022-06-23 Bristol-Myers Squibb Company Ipilimumab variants with enhanced specificity for binding at low ph
US20220372139A1 (en) 2019-07-15 2022-11-24 Bristol-Myers Squibb Company Anti-trem-1 antibodies and uses thereof
US20220332817A1 (en) 2019-07-15 2022-10-20 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies against human trem-1 and uses thereof
AU2020350689A1 (en) 2019-09-19 2022-03-31 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies binding to VISTA at acidic pH
CA3179369A1 (en) 2020-04-01 2021-10-07 Kyowa Kirin Co., Ltd. Antibody composition
US20230107644A1 (en) 2020-04-01 2023-04-06 University Of Rochester Monoclonal antibodies against the hemagglutinin (ha) and neuraminidase (na) of influenza h3n2 viruses
EP4132971A1 (en) 2020-04-09 2023-02-15 Merck Sharp & Dohme LLC Affinity matured anti-lap antibodies and uses thereof
KR20230002261A (ko) 2020-04-28 2023-01-05 더 락커펠러 유니버시티 항-sars-cov-2 중화 항체 및 이의 사용 방법
WO2021231732A1 (en) 2020-05-15 2021-11-18 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies to garp
JP7048665B2 (ja) * 2020-05-22 2022-04-05 ゲンマブ ビー．ブイ． ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域変異体およびその使用
US20230357341A1 (en) 2020-06-10 2023-11-09 Bica Therapeutics Inc. Fusion protein containing erythropoietin polypeptide
MX2023000500A (es) * 2020-07-10 2023-04-12 Invetx Inc Composiciones para aumentar la semivida de un agente terapeutico en felinos y modos de uso.
US11919945B2 (en) 2020-11-04 2024-03-05 The Rockefeller University Neutralizing anti-SARS-CoV-2 antibodies
AU2021399453A1 (en) 2020-12-18 2023-07-27 Zhuhai Trinomab Pharmaceutical Co., Ltd. Respiratory syncytial virus-specific binding molecule
US11479610B2 (en) 2020-12-23 2022-10-25 Cantargia Ab Anti-IL1RAP antibody
US20220227844A1 (en) 2021-01-15 2022-07-21 The Rockefeller University Neutralizing anti-sars-cov-2 antibodies
JP2024514530A (ja) 2021-04-02 2024-04-02 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 切断型ｃｄｃｐ１に対する抗体およびその使用
EP4334343A2 (en) 2021-05-06 2024-03-13 The Rockefeller University Neutralizing anti-sars- cov-2 antibodies and methods of use thereof
WO2023147399A1 (en) 2022-01-27 2023-08-03 The Rockefeller University Broadly neutralizing anti-sars-cov-2 antibodies targeting the n-terminal domain of the spike protein and methods of use thereof
WO2023191766A1 (en) * 2022-03-28 2023-10-05 Intervexion Therapeutics, Llc ANTIBODIES WITH ALTERED FcRn AFFINITY
US20240132622A1 (en) 2022-07-22 2024-04-25 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies Binding to Human PAD4 and Uses Thereof
WO2024107749A1 (en) 2022-11-16 2024-05-23 Attralus, Inc. Fusion proteins that bind amyloid and the transferrin receptor and uses thereof

Family Cites Families (97)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5618920A (en) 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
US5985599A (en) 1986-05-29 1999-11-16 The Austin Research Institute FC receptor for immunoglobulin
IL84285A (en) 1986-10-27 1993-03-15 Int Genetic Engineering Chimeric antibody with specificity to human tumor antigen
US6893625B1 (en) 1986-10-27 2005-05-17 Royalty Pharma Finance Trust Chimeric antibody with specificity to human B cell surface antigen
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
DE3883899T3 (de) 1987-03-18 1999-04-22 Sb2 Inc Geänderte antikörper.
US4861579A (en) 1988-03-17 1989-08-29 American Cyanamid Company Suppression of B-lymphocytes in mammals by administration of anti-B-lymphocyte antibodies
GB8916400D0 (en) 1989-07-18 1989-09-06 Dynal As Modified igg3
GB9022543D0 (en) 1990-10-17 1990-11-28 Wellcome Found Antibody production
EP0556285A4 (en) 1990-11-05 1993-10-27 Bristol-Myers Squibb Company Synergistic therapy with combinations of anti-tumor antibodies and biologically active agents
GB9105245D0 (en) 1991-03-12 1991-04-24 Lynxvale Ltd Binding molecules
AU4116793A (en) 1992-04-24 1993-11-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
US5736137A (en) 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
DE69329503T2 (de) 1992-11-13 2001-05-03 Idec Pharma Corp Therapeutische Verwendung von chimerischen und markierten Antikörpern, die gegen ein Differenzierung-Antigen gerichtet sind, dessen Expression auf menschliche B Lymphozyt beschränkt ist, für die Behandlung von B-Zell-Lymphoma
US5550362A (en) 1992-11-20 1996-08-27 Intermec Corporation Method and apparatus for calibrating a bar code scanner
CA2163345A1 (en) 1993-06-16 1994-12-22 Susan Adrienne Morgan Antibodies
US5417972A (en) 1993-08-02 1995-05-23 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Method of killing B-cells in a complement independent and an ADCC independent manner using antibodies which specifically bind CDIM
GB9316989D0 (en) 1993-08-16 1993-09-29 Lynxvale Ltd Binding molecules
US5595721A (en) 1993-09-16 1997-01-21 Coulter Pharmaceutical, Inc. Radioimmunotherapy of lymphoma using anti-CD20
IL114909A (en) 1994-08-12 1999-10-28 Immunomedics Inc Immunoconjugates and humanized antibodies specific for b-cell lymphoma and leukemia cells
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6750334B1 (en) 1996-02-02 2004-06-15 Repligen Corporation CTLA4-immunoglobulin fusion proteins having modified effector functions and uses therefor
WO1997034631A1 (en) 1996-03-18 1997-09-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobin-like domains with increased half lives
US5834597A (en) 1996-05-20 1998-11-10 Protein Design Labs, Inc. Mutated nonactivating IgG2 domains and anti CD3 antibodies incorporating the same
AU3968897A (en) 1996-08-02 1998-02-25 Bristol-Myers Squibb Company A method for inhibiting immunoglobulin-induced toxicity resulting from the use of immunoglobulins in therapy and in vivo diagnosis
WO1998023289A1 (en) 1996-11-27 1998-06-04 The General Hospital Corporation MODULATION OF IgG BINDING TO FcRn
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
US6183744B1 (en) 1997-03-24 2001-02-06 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B-cell malignancies using anti-CD22 antibodies
US6306393B1 (en) 1997-03-24 2001-10-23 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B-cell malignancies using anti-CD22 antibodies
DE19721700C1 (de) 1997-05-23 1998-11-19 Deutsches Krebsforsch Mutierter OKT3-Antikörper
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
JP3919235B2 (ja) 1997-06-13 2007-05-23 ジェネンテク，インコーポレイテッド 抗体製剤
EP0994903B1 (en) 1997-06-24 2005-05-25 Genentech, Inc. Methods and compositions for galactosylated glycoproteins
AU759779B2 (en) 1997-10-31 2003-05-01 Genentech Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
US6242195B1 (en) 1998-04-02 2001-06-05 Genentech, Inc. Methods for determining binding of an analyte to a receptor
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
ATE375365T1 (de) 1998-04-02 2007-10-15 Genentech Inc Antikörper varianten und fragmente davon
US6528624B1 (en) 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
EA004107B1 (ru) 1998-08-11 2003-12-25 Айдек Фармацевтикалс Корпорэйшн Комбинированная терапия в-клеточных лимфом, предусматривающая введение антитела против cd20
AU770555B2 (en) 1998-08-17 2004-02-26 Abgenix, Inc. Generation of modified molecules with increased serum half-lives
US6224866B1 (en) 1998-10-07 2001-05-01 Biocrystal Ltd. Immunotherapy of B cell involvement in progression of solid, nonlymphoid tumors
AU761844C (en) 1998-11-09 2004-09-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Treatment of hematologic malignancies associated with circulating tumor cells using chimeric anti-CD20 antibody
ATE454166T1 (de) 1998-11-09 2010-01-15 Biogen Idec Inc Behandlung von patienten die eine knochenmarktransplantation oder eine transplantation peripherer blutstammzellen erhalten mit anti-cd20 antikörpern
US6632926B1 (en) 1998-11-18 2003-10-14 Genentech, Inc. Antibody variants
GB9900009D0 (en) * 1999-01-04 1999-02-24 Ml Lab Plc Gene therapy
KR101077001B1 (ko) 1999-01-15 2011-10-26 제넨테크, 인크. 효과기 기능이 변화된 폴리펩티드 변이체
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US6897044B1 (en) 1999-01-28 2005-05-24 Biogen Idec, Inc. Production of tetravalent antibodies
DK1176981T3 (da) 1999-05-07 2006-04-10 Genentech Inc Behandling af autoimmune sygdomme med antagonister som binder til B celleoverflademarkörer
US7074403B1 (en) 1999-06-09 2006-07-11 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of autoimmune disorders using antibodies which target B-cells
ITMI991299A1 (it) 1999-06-11 2000-12-11 Consiglio Nazionale Ricerche Uso di anticorpi contro antigeni di superficie per il trattamento della malattia trapianto contro ospite
CN101264324A (zh) 1999-07-12 2008-09-17 杰南技术公司 应用结合cd20的拮抗剂阻断对外来抗原的免疫应答
CA2378646A1 (en) 1999-08-11 2001-02-15 Idec Pharmaceuticals Corporation Treatment of patients having non-hodgkins lymphoma with bone marrow involvement with anti-cd20 antibodies
US8557244B1 (en) 1999-08-11 2013-10-15 Biogen Idec Inc. Treatment of aggressive non-Hodgkins lymphoma with anti-CD20 antibody
AU6929100A (en) 1999-08-23 2001-03-19 Biocrystal Limited Methods and compositions for immunotherapy of b cell involvement in promotion ofa disease condition comprising multiple sclerosis
WO2001055217A1 (en) 2000-01-27 2001-08-02 Medimmune, Inc. Ultra high affinity neutralizing antibodies
ATE336514T1 (de) 2000-02-11 2006-09-15 Merck Patent Gmbh Steigerung der zirkulierenden halbwertzeit von auf antikörpern basierenden fusionsproteinen
AU8729101A (en) 2000-03-31 2001-10-15 Idec Pharma Corp Combined use of anti-cytokine antibodies or antagonists and anti-CD20 for the treatment of B cell lymphoma
AU5345901A (en) 2000-04-13 2001-10-30 Univ Rockefeller Enhancement of antibody-mediated immune responses
JP2003531178A (ja) 2000-04-25 2003-10-21 アイデック ファーマスーティカルズ コーポレイション 中枢神経系リンパ腫治療用のリツキシマブのクモ膜下投与
EP2052742A1 (en) 2000-06-20 2009-04-29 Biogen Idec Inc. Treatment of B-cell associated diseases such as malignancies and autoimmune diseases using a cold anti-CD20 antibody/radiolabeled anti-CD22 antibody combination
AU2002213357A1 (en) 2000-10-20 2002-05-06 Idec Pharmaceuticals Corporation Variant igg3 rituxan r and therapeutic use thereof
EP1355919B1 (en) 2000-12-12 2010-11-24 MedImmune, LLC Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
CN1494553A (zh) 2001-01-29 2004-05-05 IDECҩ�﹫˾ 改变的抗体及其使用方法
JP2005500018A (ja) 2001-04-02 2005-01-06 アイデック ファーマスーティカルズ コーポレイション ＧｎＴＩＩＩと同時発現する組換え抗体
ATE507839T1 (de) 2001-04-02 2011-05-15 Genentech Inc Kombinationstherapie
WO2003061694A1 (en) 2001-05-10 2003-07-31 Seattle Genetics, Inc. Immunosuppression of the humoral immune response by anti-cd20 antibodies
US7321026B2 (en) 2001-06-27 2008-01-22 Skytech Technology Limited Framework-patched immunoglobulins
CN101914158A (zh) 2002-02-14 2010-12-15 免疫医疗公司 抗cd 20抗体及其融合蛋白和使用方法
US20040002587A1 (en) 2002-02-20 2004-01-01 Watkins Jeffry D. Fc region variants
AU2003217912A1 (en) 2002-03-01 2003-09-16 Xencor Antibody optimization
US20040132101A1 (en) * 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
WO2005056606A2 (en) * 2003-12-03 2005-06-23 Xencor, Inc Optimized antibodies that target the epidermal growth factor receptor
US7425620B2 (en) 2002-08-14 2008-09-16 Scott Koenig FcγRIIB-specific antibodies and methods of use thereof
CN101987871A (zh) 2002-09-27 2011-03-23 赞科股份有限公司 优化的Fc变体及其产生方法
KR20090088973A (ko) 2002-10-17 2009-08-20 젠맵 에이/에스 Ｃｄ20에 대한 인간 모노클로날 항체
SI2289936T1 (sl) 2002-12-16 2017-10-30 Genentech, Inc. Imunoglobulinske variante in njihove uporabe
WO2004063351A2 (en) * 2003-01-09 2004-07-29 Macrogenics, Inc. IDENTIFICATION AND ENGINEERING OF ANTIBODIES WITH VARIANT Fc REGIONS AND METHODS OF USING SAME
WO2004091657A2 (en) 2003-04-09 2004-10-28 Genentech, Inc. Therapy of autoimmune disease in a patient with an inadequate response to a tnf-alpha inhibitor
CA2897608C (en) 2003-05-09 2018-07-31 Duke University Cd20-specific antibodies and methods employing same
AR044388A1 (es) 2003-05-20 2005-09-07 Applied Molecular Evolution Moleculas de union a cd20
US8147832B2 (en) 2003-08-14 2012-04-03 Merck Patent Gmbh CD20-binding polypeptide compositions and methods
LT2380911T (lt) 2003-11-05 2018-07-10 Roche Glycart Ag Antigeną surišančios molekulės, pasižyminčios padidintu fc receptoriaus surišimo afiniškumu ir efektoriaus funkcija
DK1706424T3 (da) * 2004-01-12 2009-11-02 Applied Molecular Evolution FC-region varianter
US7850962B2 (en) 2004-04-20 2010-12-14 Genmab A/S Human monoclonal antibodies against CD20
WO2006085967A2 (en) 2004-07-09 2006-08-17 Xencor, Inc. OPTIMIZED ANTI-CD20 MONOCONAL ANTIBODIES HAVING Fc VARIANTS
AU2005272993B2 (en) 2004-07-15 2010-02-11 Xencor, Inc Optimized Fc variants
US7740847B2 (en) 2004-08-04 2010-06-22 Applied Molecular Evolution, Inc. Variant Fc regions
AR052774A1 (es) 2004-10-08 2007-04-04 Wyeth Corp Inmunoterapia para trastornos autoinmunes
DK2325207T3 (en) 2004-11-12 2017-06-06 Xencor Inc Fc variants with altered binding to FcRn
FR2879204B1 (fr) 2004-12-15 2007-02-16 Lab Francais Du Fractionnement Anticorps cytotoxique dirige contre les proliferations hematopoietiques lymphoides de type b.
JP2008526998A (ja) 2005-01-13 2008-07-24 ジェネンテック・インコーポレーテッド 治療方法
DOP2006000029A (es) 2005-02-07 2006-08-15 Genentech Inc Antibody variants and uses thereof. (variantes de un anticuerpo y usos de las mismas)
WO2006105338A2 (en) 2005-03-31 2006-10-05 Xencor, Inc. Fc VARIANTS WITH OPTIMIZED PROPERTIES

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