NO339556B1

NO339556B1 - Anti-CD20 antistoff og farmasøytisk sammensetning

Info

Publication number: NO339556B1
Application number: NO20071192A
Authority: NO
Inventors: Barrett W Allan; Ying Tang; Weidong Jiang; Jeffry Dean
Original assignee: Mentrik Biotech Llc
Priority date: 2004-08-04
Filing date: 2007-03-02
Publication date: 2017-01-02
Also published as: BRPI0514068B8; ES2426816T3; DK1776384T3; EA200700210A1; AU2005274905B2; JP2012136541A; KR20070038541A; JP2008511292A; EP2213683B1; IL180885A0; CN101001873A; AU2005274905A1; CA2573192C; EP2213683A1; BR122018016031B8; CA2573192A1; PL1776384T3; US7740847B2; CA2779559A1; BRPI0514068B1

Description

OPPFINNELSENS OMRÅDE

Foreliggende oppfinnelse vedrører anti-CD20 antistoff og farmasøytisk sammensetning. Det er beskrevet polypeptider som omfatter en ny variant av Fc-region. Spesielt en ny variant Fc-region ifølge foreliggende oppfinnelse, som omfatter minst én aminosyresubstitusjon beskrevet heri, som konfererer en endret effektorfunksjon eller endret serum halveringstid med et immunglobulin som omfatter variant Fc-regionen, sammenliknet med moder immunglobulinet som mangler denne aminosyresubstitusjonen. Det er også beskrevet en fremgangsmåte for å endre en effektorfunksjon i et monoklonalt antistoff, eller å utvide serumhalveringstiden til et polypeptid som en variant Fc-region ifølge foreliggende oppfinnelse operativt er festet til. Terapeutiske anvendelser av polypeptider, proteiner, spesielt monoklonale antistoffer, omfattende en variant Fc-region ifølge oppfinnelsen er også angitt.

OPPFINNELSENS BAKGRUNN

Det er minst sytten monoklonale antistoffer som i dag er godkjente i USA for human terapi anvendelse. Det er ytterligere flere hundre monoklonale antistoffer i kliniske forsøk, og flere tusen i prekliniske utprøvinger for behandling av ulike sykdommer eller forstyrrelser, inkludert for eksempel transplantasjonsawisning, cancer, betennelsessykdommer, sepsis, nefritt, Alzheimers sykdom, allergier, diabetes, autoimmune sykdommer, artritt, multippel sklerose og infeksjonssykdommer. Området for terapeutisk monoklonale antistoffer er anbrakt for hurtig vekst i de kommende årene. Etter vaksiner utgjør antistoffer (eller immunglobuliner, "lg") den nest mest vanlige type biofarmasøytiske middel som testes klinisk (Stockwin, L. H. et al., Biochemical Society Transactions, 31:433-436, 2003).

Genetisk konstruksjon har bidratt vesentlig til vekst i fagfeltet for terapeutisk monoklonale antistoffer. Effektiviteten til et mulig terapeutisk monoklonalt antistoff varierer ofte med beskjedne endringer i proteinsekvensen til antistoffet. En enkelt aminosyreendring i den variable regionen til et monoklonalt antistoff har muligheten for å endre affiniteten som antistoffet binder den antigene epitopen med, så vel som antistoffers egenskaper, slik som Kon hastighet eller K0fr hastighet. Slike aminosyreendringer kan bestemme suksess eller fiasko av et monoklonalt antistoff som et terapeutikum. På liknende måte kan beskjedne endringer i aminosyresekvensen i Fc-området til et monoklonalt antistoff gi store endringer i antistoffets effektorfunksjonsegenskaper eller et proteins halveringstid som Fc-regionen operativt er bundet til.

Et antistoffs Fc-region (dvs. de karboksyterminale endene til tungkjedene til et antistoff som spenner over doménene CH2, CH3og en del av hengselområdet (se figur 1)) er begrenset i variabilitet, og er involvert i å påvirke de fysiologiske rollene som antistoffet spiller. Effektorfunksj onene som kan tilskrives et antistoffs Fc-region varierer med klassen og underklassen av antistoff og inkluderer (i) binding av antistoffet via Fc-regionen til en spesifikk Fc-reseptor ("FcR") i en celle som utløser ulike biologiske reaksjoner, som for eksempel inkluderer fagocytose og destruksjon av antistoffbelagte partikler, fjerning av immunkomplekser, frigjøring av inflammatoriske formidlere, placental overføring av antistoffet og kontroll av immunglobulinproduksjon, (ii) komplementavhengig cytotoksisitet ("CDC") der Fc-regionen binder Clq komponenten av komplement, og derved starter den klassiske reaksjonsveien av komplementaktivering som fører til lysis av målet, (iii) antistoffavhengig celleformidlet cytotoksisitet ("ADCC") der visse humanimmune systemceller, for eksempel fagocytter og NK-celler via Fcy-reseptor binder til et antistoffs Fc-region via spesifikt antistoffbindende reseptorer på immuncellene, med påfølgende signaldestruksjon av helheten som antistoffet er bundet til, og (iv) binding til mastceller, basofiler og eosinofiler. Affiniteten som en Fc-region kan binde en bestemt FcR med, (for eksempel FcRn), eller nivået der en Fc-region kan formidle CDC- eller ADCC-aktivitet, er viktige faktorer for å bestemme virkeevne og halveringstid av terapeutiske proteiner, spesielt monoklonale antistoffer.

Spesifisert modifikasjon av aminosyrer i Fc-området til human IgG er et aktivt område av studie som gir informasjon om strukturfunksjon forhold som er relevant for utvikling av terapeutiske proteiner, spesielt monoklonale antistoffer (se for eksempel US 6 165 745 og PCT publikasjon WO2004/035752 med hensyn til endring av serumhalveringstid for et polypeptid som er operabelt bundet til et Fc-område, og US 6 737 056 og PCT publikasjon nr. WO2004/029207 med hensyn til endring til en effektorfunksjon av et monoklonalt antistoff omfattende et modifisert Fc-område).

WO 8807089 A tilveiebringer et antistoff med en endret effektorfunksjon, f. eks. endret affinitet for en effektorligand så som en Fc reseptor (FcR) på en celle eller Cl komponenten av komplementet, som blir produsert minst en aminosyreresidie i den konstante delen av antistoffet med forskjellig residie. Patentet refererer spesifikt til posisjonene 234, 236, 237, 318, 320 og 322 erstattet av alanin, 235 erstattet av glutaminsyre, 318 forandret til valin og 322 forandret til glutamin. Antistoffet nevnt i Fc regionvariantene ifølge foreliggende oppfinnelse refererer derimot til et humanisert anti-CD20 antistoff optimalisert for å forøke effektorfunksjonen i antistoff-avhengig celle-mediert cytotoksisitet (ADCC) med aminosyresubstitusjoner ved 247 og 339.

Idusogie E: et al. Mapping of the Cl q binding site on rituxan, a chimeric antibody with a human IgGl Fc. J Immunol. 2000, vol. 164, no. 8, side 4178-4184 beskriver et kimært antistoff anvendt i terapi av ikke-Hodgkin's B-celle lymfom og hvordan aminosyresubstitusjoner forøker komplement-avhengig cytotoksisitet (CDC). Aminosyresubstitusjonene refererer spesifikt til posisjonene 318, 320, 322, 329 og 331. Antistoffet beskrevet i Fc regionvariantene ifølge foreliggende oppfinnelse refererer derimot til et humanisert anti-CD20 antistoff optimalisert for å forøke effektorfunksjonen i antistoff-avhengige celle-mediert cytotoksisitet (ADCC) med aminosyresubstitusjoner ved 247 og 339.

Sarmay G. et al. Mapping and comparison of the interaction sites on the Fc region of IgG responsible for triggering antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC) through different types of human Fc gamma receptor. Mol Immunol. 1992, vol. 29, no. 5, side 633-639. Anti-NTP antistoffer blir her sammenlignet for induksjon av antistoffavhengig lysering av NIP-derivatiserte røde blodceller oppnådd ved prestimulerte U937 eller HL60 celler og av K celler. Disse kimære antistoffene har tunge kjeder som korresponderer med human IgG subklassene 1-4 og inkluderer seterettede mutanter av IgG3. Antistoffet beskrevet i Fc regionvariantene ifølge foreliggende oppfinnelse refererer til et humanisert anti-CD20 antistoff med forøket ADCC overfor B-celler, en hvit blodcelle.

Tan LK. ET AL. Influence of the hinge region on complement activation, Clq binding, and segmental flexibility in chimeric human immunoglobulins. Proe Nati Acad Sei U S A. 1990, vol. 87, no. 1, side 162-166, karakteriserer en serie av genetisk omkonstruerte kimære humane IgG2 og IgG4 anti-dansyl (DNS) antistoffer med identiske antistoff-kombingseter, men forskjellige hengselregion aminosyresammensetninger for å bestemme hvordan hengselsregionen influerer på fragment segmental fleksibilitet, Clq, og komplimentaktivering (CDC). Antistoffene nevnt i foreliggende oppfinnelse refererer derimot til et humanisert, IgGl anti-CD20 antistoff optimalisert for å forøket effektorfunksjonen i antistoff-avhengig celle-mediert cytotoksisitet (ADCC). Utviklingen av nye terapeutiske proteiner, spesielt monoklonale antistoffer, vil ha nytte av evnen til rasjonelt å konstruere et Fc-område med bestemte aminosyremodifikasjoner som konfererer en ønsket fordelaktig egenskap av antistoffet av interesse. Det vil ikke være forventet at alle monoklonale antistoffer forbedres som et legemiddel pga. den spesifikt samme aminosyremodifikasjon i Fc-området. Et terapeutisk, monoklonalt antistoff som binder et målantigen kan ha fordel av en økning i en bestemt effektorfunksjon, mens et annet terapeutisk monoklonalt antistoff som binder et annet målantigen kan ha fordel av en økning i en ulik effektorfunksjon, eller til og med en reduksjon. Et terapeutisk monoklonalt antistoff kan ha fordel av evnen til å binde en bestemt Fc-reseptor med høyere affinitet, mens et annet antistoff kan forbedres som legemiddel ved å binde Fc-reseptoren ved en lavere affinitet, og derfor bli fjernet fra kroppen med en raskere hastighet. Et bestemt Fc-område aminosyremodifikasjon eller substitusjon og resulterende effekt som vil gagne et terapeutisk antistoff vil avhenge av det antigene målet der antistoffet binder og/eller sykdommen eller forstyrrelsen som skal forbedres av antistoffet.

Fremgangsmåter og sammensetninger som endrer bestemte effektorfunksjoner som er assosiert med et antistoffs Fc-område er nødvendig for å forbedre egenskapene til eksisterende terapeutiske antistoffer, så vel som å generere nye terapeutiske antistoffer med ønskete egenskaper. Monoklonale antistoffer med forskjellige Fc-områder kan anvendes for behandling av ulike sykdommer eller forstyrrelser, som for eksempel inflammatoriske forstyrrelser, cancer, autoimmune forstyrrelser, cellesignaleringsforstyrrelser og infeksjonssykdommer. Fremgangsmåter og sammensetninger som endrer serumhalveringstiden av et terapeutisk protein, enten ved å øke halveringstiden og derved tillate færre doser, eller ved å redusere halveringstiden for derved å tillate hurtigere fjerning fra kroppen, vil også gagne generering av terapeutiske antistoffer, så vel som andre terapeutiske proteiner.

Hva som behøves for å forbedre et terapeutisk proteins virkeevne, særlig et monoklonalt antistoff er varianter av Fc-områder med forbedrete egenskaper.

SAMMENDRAG AV OPPFINNELSEN

Omfanget av oppfinnelsen er begrenset av kravene. Foreliggende oppfinnelse omfatter følgelig anti-CD20 antistoff, som omfatter: (a) en lettkjedevariabel region aminosyresekvens bestående av SEQ ID NO: 13; (b) en tungkjedevariabel region aminosyresekvens bestående av SEQ ID NO: 14;

og

(c) en moder Fc-regionvariant hvori moder Fc-regionen er en human IgGl Fc region og hvor Fc regionvarianten omfatter en aminosyresubstitusjon valgt fra gruppen bestående av 2471/339Q og 2471/33 9D.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre anti-CD20 antistoff ifølge krav 1, idet

moder Fc-regionen er en nativ human IgGl Fc-region.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre anti-CD20 antistoffet ifølge krav 1 eller

krav 2, idet Fc-varianten er 2471/339Q.

krav 2, idet Fc-varianten er 2471/339D.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre anti-CD20 antistoffet ifølge krav 3, idet det omfatter en lettkjede aminosyresekvens bestående av SEQ ID NO: 29 og en tungkjede aminosyresekvens bestående av SEQ ID NO: 31.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre anti-CD20 antistoffet ifølge krav 5, idet lettkjeden kodes av en nukleinsyresekvens omfattende SEQ ID NO: 30, og tungkjeden kodes av en nukleinsyresekvens omfattende SEQ ID NO: 32.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre anti-CD20 antistoffet ifølge krav 4, idet den omfatter en lettkjede aminosyresekvens bestående av SEQ ID NO: 29, og en tungkjede aminosyresekvens bestående av SEQ ID NO: 33.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre anti-CD20 antistoffet ifølge krav 7, idet lettkjeden kodes av en nukleinsyresekvens omfattende SEQ ID NO: 30, og tungkjeden kodes av en nukleinsyresekvens omfattende SEQ ID NO: 34.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre farmasøytisk sammensetning, omfattende

anti-CD20 antistoffet ifølge et hvilket som helst av kravene 1-8.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre farmasøytisk sammensetning ifølge krav

9, idet den ytterligere omfatter en farmasøytisk akseptabel bærer.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre anti-CD20 antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 1-8 for anvendelse for behandling av lymfom.

Foreliggende beskrivelse tilveiebringer varianter av Fc-områder, dvs. Fc-områder omfattende en aminosyresubstitusjon, beskrevet heri (se for eksempel tabell 1), som konfererer fordelaktige egenskaper av polypeptider omfattende nevnte Fc-områdevarianter.

Fc-posisjoner av et moder Fc-område der enhver aminosyresubstitusjon kan gjøres for å generere en Fc-områdevariant, inkluderer posisjonene 279, 341, 343 og 373 avFc-området, hvori nummereringen av restene, dvs. deres posisjonsnummer i Fc-området er den av EU-indeksen som i Kabat (se figur 2). Foreliggende beskrivelse tilveiebringer variant Fc-områder omfattende en aminosyresubstitusjon på posisjon 279, 341, 343 eller 373 av et moder Fc-område, eller enhver kombinasjon derav. Moder Fc-området kan eventuelt ha unaturlige aminosyrerester på andre posisjoner enn 279, 341, 343 og 373. De naturlige aminosyrerestene på disse posisjonene for human IgG er valin (279), glysin (341), prolin (343) og tyrosin (373).

I foretrukne utførelsesformer ifølge foreliggende beskrivelse er aminosyreresten som er substituert med den i moder Fc-området, en naturlig forekommende aminosyrerest. Om ikke annet er konstatert kan moder Fc-regionen være en naturlig eller unaturlig Fc-region, fortrinnsvis av human opprinnelse eller i det vesentlige av human opprinnelse. Aminosyresekvensen av moder Fc-området er fortrinnsvis den som er vist i SEQ ID NO: 1, 2, 3 eller 4. Fortrinnsvis har moder Fc-området en naturlig aminosyrerest til stede i posisjonen som skal erstattes for å generere en variant Fc-region. Det må forstås at en variant Fc-region er en moder Fc-region modifisert til å omfatte minst en aminosyresubstitusjon som beskrevet heri. I tillegg må det forstås at en moder Fc-region kan være ne fullengde Fc eller en del derav, som omfatter en aminosyrerest som skal substitueres for å generere Fc-område varianten.

Foreliggende beskrivelse tilveiebringe også polypeptider, fortrinnsvis monoklonale antistoffer omfattende en Fc-regionvariant (eller et funksjonelt fragment derav) omfattende minst én aminosyresubstitusjon i posisjon 279, 341, 343 eller 373, sammenliknet med moder Fc-regionen. Fc-regionvarianten som omfatter minst én aminosyresubstitusjon i Fc-posisjon 279, 341, 343 eller 373, kan også omfatte minst én ytterligere aminosyresubstitusjon i Fc-regionen, sammenliknet med aminosyreresten til stede i den naturlige Fc-regionen av samme type som Fc-regionvarianten.

I en utførelsesform omfatter en Fc-regionvariant (dvs. en variant av en moder Fc-region) minst 1, 2, 3 eller flere aminosyresubstitusjoner valgt fra de følgende: 235G, 235R, 236F, 236R, 236Y, 237K, 237N, 237R, 238E, 238G, 238H, 2381, 238L, 238V, 238W, 238Y, 244L, 245R, 247A, 247D, 247E, 247F, 247M, 247N, 247Q, 247R, 247S, 247T, 247W, 247Y, 248F, 248P, 248Q, 248W, 249L, 249M, 249N, 249P, 249Y, 251H, 2511, 251W, 254D, 254E, 254F, 254G, 254H, 2541, 254K, 254L, 254M, 254N, 254P, 254Q, 254R, 254V, 254W, 254Y, 255K, 255N, 256H, 2561, 256K, 256L, 256V, 256W, 256Y, 257A, 2571, 257M, 257N, 257S, 258D, 260S, 262L, 264S, 265K, 265S, 267H, 2671, 267K, 268K, 269N, 269Q, 27IT, 272H, 272K, 272L, 272R, 279A, 279D, 279F, 279G, 279H, 2791, 279K, 279L, 279M, 279N, 279Q, 279R, 279S, 279T, 279W, 279Y, 280T, 283F, 283G, 283H, 2831, 283K, 283L, 283M, 283P, 283R, 283T, 283W, 283Y, 285N, 286F, 288N, 288P, 292E, 292F, 292G, 2921, 292L, 293S, 293V, 301W, 304E, 307E, 307M, 312P, 315F, 315K, 315L, 315P, 315R, 316F, 316K, 317P, 317T, 318N, 318P, 318T, 332F, 332G, 332L, 332M, 332S, 332V, 332W, 339D, 339E, 339F, 339G, 339H, 3391, 339K, 339L, 339M, 339N, 339Q, 339R, 339S, 339W, 339Y, 341D, 341E, 341F, 341H, 3411, 341K, 341L, 341M, 341N, 341P, 341Q, 341R, 341S, 341T,

341V, 341W, 341Y, 343A, 343D, 343E, 343F, 343G, 343H, 3431, 343K, 343L, 343M, 343N, 343Q, 343R, 343S, 343T, 343V, 343W, 343Y, 373D, 373E, 373F, 373G, 373H, 3731, 373K, 373L, 373M, 373N, 373Q, 373R, 373S, 373T, 373V, 373W, 375R, 376E, 376F, 376G, 376H, 3761, 376L, 376M, 376N, 376P, 376Q, 376R, 376S, 376T, 376V, 376W, 376Y, 377G, 377K, 377P, 378N, 379N, 379Q, 379S, 379T, 380D, 380N, 380S, 380T, 382D, 382F, 382H, 3821, 382K, 382L, 382M, 382N, 382P, 382Q, 382R, 382S,

382T, 382V, 382W, 382Y, 385E, 385P, 386K, 423N, 424H, 424M, 424V, 426D, 426L, 427N, 429A, 429F, 429M, 430A, 430D, 430F, 430G, 430H, 4301, 430K, 430L, 430M, 430N, 430P, 430Q, 430R, 430S, 430T, 430V, 430W, 430Y, 431H, 43 IK, 431P, 432R, 432S, 438G, 438K, 438L, 438T, 438W, 439E, 439H, 439Q, 440D, 440E, 440F, 440G, 440H, 440,1 440K, 440L, 440M, 440Q, 440T, 440V eller 442K.

I en foretrukket utførelsesform omfatter en Fc-regionvariant minst 1, 2, 3 eller flere aminosyresubstitusjoner valgt fra de følgende: 235G, 236F, 236R, 236Y, 237K,

237N, 237R, 238E, 238G, 238H, 2381, 238L, 238V, 238W, 238Y, 245R, 247A, 247D, 247E, 247F, 247M, 247N, 247Q, 247R, 247T, 247W, 247Y, 248F, 248P, 248Q, 248W, 249L, 249M, 249N, 249P, 249Y, 251H, 2511, 251W, 254D, 254E, 254F, 254G, 254H, 2541, 254K, 254L, 254M, 254N, 254P, 254Q, 254R, 254V, 254W, 254Y, 255K, 255N, 256H, 2561, 256K, 256L, 256W, 257A, 2571, 257M, 257N, 257S, 258D, 260S, 262L, 264S, 265K, 265S, 267H, 2671, 267K, 268K, 269N, 269Q, 271T, 272H, 272K, 272R, 279A, 279D, 279G, 279H, 279N, 279Q, 279S, 279T, 279W, 279Y, 280T, 283F, 283H, 283K, 283M, 283R, 283W, 285N, 286F, 288N, 288P, 292E, 292G, 2921, 301W, 304E, 307E, 307M, 312P, 315F, 315L, 315P, 316F, 317P, 317T, 318N, 318P, 318T, 332L,

332M, 332R, 332S, 332W, 339D, 339F, 3391, 339K, 339M, 339N, 339Q, 339R, 339S, 339W, 339Y, 341D, 341E, 341F, 341H, 3411, 341K, 341L, 341M, 341N, 341P, 341Q, 341R, 341S, 341T, 341V, 341W, 341Y, 343D, 343E, 343G, 343H, 343K, 343N, 343Q, 343R, 343S, 343T, 343W, 343Y, 373D, 373E, 373G, 373H, 3731, 373K, 373L, 373M, 373Q, 373R, 373S, 373T, 373W, 375R, 376G, 376N, 376P, 376Q, 376R, 376S, 376T, 376V, 376W, 376Y, 377G, 377K, 377P, 378D, 378N, 379N, 379Q, 379T, 380N, 380S, 380T, 382D, 382F, 3821, 382K, 382L, 382Q, 382R, 382S, 382T, 382V, 382W, 382Y, 385E, 386K, 423N, 424H, 424M, 424V, 426D, 426L, 427N, 429A, 429F, 429M, 430A, 430D, 430F, 430G, 430H, 4301, 430K, 430L, 430M, 430N, 430P, 430Q, 430R, 430S, 430T, 430V, 430W, 430Y, 431H, 43IK, 431P, 432R, 432S, 438K, 438L, 438T, 438W, 439E, 440D, 4401 eller 440L.

Fc-regionvariantene karakteriseres fortrinnsvis ved å anvende én eller flere av de eksperimentelle fremgangsmåtene beskrevet heri. Slike Fc-regionvarianter konfererer en endret effektorfunksjon eller endret serumhalveringstid av et monoklonalt antistoff som omfatter en Fc-regionvariant eller en endret serumhalveringstid av et polypeptid som Fc-regionvarianten operabelt er bundet til.

Moder Fc-regionen av en Fc-regionvariant ifølge foreliggende oppfinnelse er fortrinnsvis en naturlig eller kodet bakterielinje Fc-region av human opprinnelse valgt fra gruppen bestående av IgG, IgA, IgE, IgM og IgD eller en polymorf variant derav, eller et funksjonelt fragment derav. Moder Fc-regionen er fortrinnsvis en IgG Fc-region, mer foretrukket er den en IgGl, IgG3 eller IgG4 Fc-region. Moder Fc-regionen kan eventuelt omfatte én eller flere ytterligere aminosyresubstitusjoner, som sammenliknet med den naturlige Fc-regionen som er en annen en de som her er beskrevet (dvs. de substitusjonene som er opplistet i tabell 1), særlig én eller flere aminosyresubstitusjoner som er kjent i fagfeltet, eller som er beskrevet i US 6 165 745 eller 6 737 056; eller PCT publikasjon WO2004/035752 eller WO2004/029207; om aminosyresubstitusjonen(e) er til stede i moder Fc-regionen vil slik(e) aminosyresubstitusjon(er) også være til stede i Fc-regionvarianten, og i et polypeptid som omfatter en Fc-regionvariant, med mindre den var i en posisjon som deretter ble substituert for å generere Fc-regionvarianten.

I en foretrukket utførelsesform er et monoklonalt antistoff som omfatter en Fc-regionvariant et kimært antistoff. I en mer foretrukket utførelsesformer er et monoklonalt antistoff som omfatter en Fc-regionvariant et humanisert antistoff eller et humant antistoff der rammeverksekvens og konstantregionsekvens som er til stede i antistoffet er hovedsakelig av human opprinnelse. Det kimære, humaniserte eller humane antistoff er fortrinnsvis et fullengde antistoff eller et enkeltkjede antistoff. Når et monoklonalt antistoff som omfatter en Fc-regionvariant skal anvendes som et humant terapeutikum, er Fc-regionen fortrinnsvis hovedsakelig av human opprinnelse.

Et polypeptid omfatter fortrinnsvis, eller er operabelt koblet til en Fc-regionvariant (dvs. "variant polypeptid") har minst én aminosyresubstitusjon i variant Fc-regionen, sammenliknet med moder Fc-regionen, og fremviser en endret effektorfunksjon eller endret serumhalveringstid, sammenliknet med den av polypeptidet som omfatter moder Fc-regionen av nevnte Fc-regionvariant, hvori den "minst ene aminosyresubstitusjonen i Fc-regionvarianten" er (i) enhver aminosyresubstitusjon i posisjon 279, 341, 343 eller 373 i Fc-regionen eller (ii) minst én av de følgende aminosyresubstitusjoner i Fc-regionen: 235G, 235R, 236F, 236R, 236Y, 237K, 237N, 237R, 238E, 238G, 238H, 2381, 238L, 238V, 238W, 238Y, 244L, 245R, 247A, 247D, 247E, 247F, 247M, 247N, 247Q, 247R, 247S, 247T, 247W, 247Y, 248F, 248P, 248Q, 248W, 249L, 249M, 249N, 249P, 249Y, 251H, 2511, 251W, 254D, 254E, 254F, 254G, 254H, 2541, 254K, 254L, 254M, 254N, 254P, 254Q, 254R, 254V, 254W, 254Y, 255K, 255N, 256H, 2561, 256K, 256L, 256V, 256W, 256Y, 257A, 2571, 257M, 257N, 257S, 258D, 260S, 262L, 264S, 265K, 265S, 267H, 2671, 267K, 268K, 269N, 269Q, 27IT, 272H, 272K, 272L, 272R, 279A, 279D, 279F, 279G, 279H, 2791, 279K, 279L, 279M, 279N, 279Q, 279R, 279S, 279T, 279W, 279Y, 280T, 283F, 283G, 283H, 2831, 283K, 283L, 283M, 283P, 283R, 283T, 283W, 283Y, 285N, 286F, 288N, 288P, 292E, 292F, 292G, 2921, 292L, 293S, 293V, 301W, 304E, 307E, 307M, 312P, 315F, 315K, 315L, 315P, 315R, 316F, 316K, 317P, 317T, 318N, 318P, 318T, 332F, 332G, 332L, 332M, 3325, 332V, 332W, 339D, 339E, 339F, 339G, 339H, 3391, 339K, 339L, 339M, 339N, 339Q, 339R, 339S, 339W, 339Y, 341D, 341E, 341F, 341H, 3411, 341K, 341L, 341M, 341N, 341P, 341Q, 341R, 341S, 341T, 341V, 341W, 341Y, 343A, 343D, 343E, 343F, 343G, 343H, 3431, 343K, 343L, 343M, 343N, 343Q, 343R, 343S, 343T, 343V, 343W, 343Y, 373D, 373E, 373F, 373G, 373H, 3731, 373K, 373L, 373M, 373N, 373Q, 373R, 373S, 373T, 373V, 373W, 375R, 376E, 376F, 376G, 376H, 3761, 376L, 376M, 376N, 376P, 376Q, 376R, 376S, 376T, 376V, 376W, 376Y, 377G, 377K, 377P, 378N, 379N, 379Q, 379S, 379T, 380D, 380N, 380S, 380T, 382D, 382F, 382H, 3821, 382K, 382L, 382M, 382N, 382P, 382Q, 382R, 382S, 382T, 382V, 382W, 382Y, 385E, 385P, 386K, 423N, 424H, 424M, 424V, 426D, 426L, 427N, 429A, 429F, 429M, 430A, 430D, 430F, 430G, 430H, 4301, 430K, 430L, 430M, 430N, 430P, 430Q, 430R, 430S, 430T, 430V, 430W, 430Y, 431H, 43 IK, 431P, 432R, 432S, 438G, 438K, 438L, 438T, 438W, 439E, 439H, 439Q, 440D, 440E, 440F, 440G, 440H, 4401, 440K, 440L, 440M, 440Q, 440T, 440V eller 442K, eller (iii) minst to aminosyresubstitusjoner som opplistet i (i) eller (ii) ovenfor, eller (iv) minst 1, 2 eller 3 aminosyresubstitusjoner som opplistet i (i) eller (ii) ovenfor i tillegg til minst en Fc-region aminosyresubstitusjon ikke opplistet i (i) eller (ii) ovenfor. Fortrinnsvis er den endrete effektorfunksjon en økning i ADCC, en reduksjon i ADCC, en økning i CDC, en reduksjon i CDC, en økning i Clq bindingsaffinitet, en reduksjon i Clq bindingsaffinitet, en økning i FcR (fortrinnsvis FcRn) bindingsaffinitet eller en reduksjon i FcR (fortrinnsvis FcRn) bindingsaffinitet, sammenliknet med nevnte polypeptid som mangler aminosyresubstitusjonen i Fc-regionen (dvs. moder Fc-region). Beskrivelsen tilveiebringer et monoklonalt antistoff omfattende en Fc-regionvariant omfattende minst en av de følgende aminosyresubstitusjoner i Fc-regionen: 247A, 247F, 247M, 247T, 247V, 247Y, 249E, 249Y, 254F, 254M, 254Y, 256A, 258D, 279A, 283A, 2831, 283K, 283M, 283R, 288N, 292A, 31 IA, 31 ID, 31 IN, 31 IT, 31IV, 311Y, 315L, 318N, 318P, 318T, 318V, 332T, 332V, 339D, 339F, 339G, 3391, 339K, 339M, 339N, 339Q, 339R, 339S, 339T, 376A, 376V, 377G, 377F, 379N, 380N, 380S, 382A, 3821, 385E, 427N, 429M, 434W, 4361, 440G, 440H, 4401 eller 440L, [fortrinnsvis 247A, 247F, 247M, 247T, 247V, 247Y, 254F, 254Y, 258D, 279A, 283M, 288N, 292A, 31 ID, 31 IN, 31 IT, 315L, 318N, 318P, 318T, 318V, 339D, 3391, 339K, 339M, 339N, 339Q, 339R, 339S, 376A, 376V, 377K, 379N, 380N, 382A, 4401 eller 440L], hvori det monoklonale antistoff som omfatter variant Fc-regionen fremviser forsterket ADCC sammenliknet med det monoklonale antistoff omfattende moder Fc-regionen.

Beskrivelsen tilveiebringer et monoklonalt antistoff som omfatter en Fc-regionvariant omfattende minst en av de følgende aminosyresubstitusjoner i Fc-regionen: 235Q, 235R, 235S, 236F, 236R, 236Y, 237E, 237K, 237N, 237R, 238E, 238G, 238H, 2381, 238L, 238V, 238W, 238Y, 247G, 247R, 249L, 249P, 250K, 250M, 250R, 251H, 2511, 251 W, 252Y, 254L, 254P, 254Q, 254T, 254V, 256V, 257A, 2571, 257M, 257N, 257S, 257V, 260S, 262L, 264S, 265H, 265K, 265S, 267G, 267H, 2671, 267K, 269N, 269Q, 270A, 270G, 270K, 270M, 270N, 27IT, 272H, 272K, 272L, 272N, 272R, 279D, 279F, 279K, 279L, 279W, 283D, 283F, 283G, 283H, 283L, 283W, 283Y, 285N, 288P, 292E, 292F, 292G, 2921, 293S, 293V, 301W, 304E, 307A, 307E, 307M, 311F, 3111, 31 IK, 31 IS, 312P, 314F, 3141, 314V, 314W, 315F, 315P, 316F, 317P, 327T, 328V, 329Y, 332G, 332K, 332L, 332R, 332W, 341D, 341E, 341F, 341H, 341L 341K, 341L, 341M, 341N, 341P, 341Q, 341R, 341S, 341T, 341W, 341Y, 343A, 343D, 343E, 343F, 343G, 343H, 343L, 343M, 343N, 343Q, 343R, 343S, 343T, 343V, 343W, 343Y, 373A, 373D, 373E, 373F, 373G, 3731, 373K, 373L, 373M, 373N, 373Q, 373R, 3738, 373T, 373V, 373W, 375R, 376A, 376E, 376F, 376G, 376H, 376W, 376Y, 379Q, 382D, 382S, 430H, 430K, 430N, 430Q, 430R, 430W, 432R, 432S, 4341, 440D, 440T, 440V eller 442K, [fortrinnsvis 235R, 236F, 236Y, 237E, 237K, 237N, 237R, 238E, 238G, 238H, 2381, 238L, 238V, 238W, 238Y, 247R, 250K, 251H, 254T, 2571, 257M, 257N, 257S, 257V, 265H, 265K, 265S, 267G, 267H, 2671, 267K, 269N, 269Q, 270A, 270G, 270K, 270M, 270N, 271T, 272N, 272R, 288P, 292E, 301W, 304E, 316F, 317P, 327T, 328V, 329Y, 332K, 332R, 341F, 341L 341M, 341P, 341Q, 341R, 341T, 341W, 341Y, 343W, 373A, 373E, 373G, 373S, 376A, 376W, 432R eller 432S], hvori det monoklonale antistoff som omfatter variant Fc-regionen fremviser en redusert ADCC aktivitet sammenliknet med det monoklonale antistoffet som omfatter moder Fc-regionen.

Beskrivelsen tilveiebringer et monoklonalt antistoff omfattende en variant Fc-region som omfatter minst en av de følgende aminosyresubstitusjoner i Fc-regionen: 238L, 244L, 245R, 249P, 252Y, 256P, 257A, 2571, 257M, 257N, 257S, 257V, 258D, 260S, 262L, 270K, 272L, 272R, 279A, 279D, 279G, 279H, 279M, 279N, 279Q, 279R, 279S, 279T, 279W, 279Y, 283A, 283D, 283F, 283G, 283H, 2831, 283K, 283L, 283N, 283P, 283Q, 283R, 283S, 283T, 283W, 283Y, 285N, 286F, 288N, 288P, 293V, 307E, 307M, 311A, 3111, 311K, 311L, 311M, 311V, 311W, 312P, 316K, 317P, 318N, 318T, 332F, 332H, 332K, 332L, 332M, 332R, 332S, 332W, 339N, 339T, 339W, 341P, 343E, 343H, 343K, 343Q, 343R, 343T, 343Y, 375R, 376G, 3761, 376M, 376P, 376T, 376V, 377K, 378D, 378N, 380N, 380S, 380T, 382F, 382H, 3821 382K, 382L, 382M, 382N, 382Q, 382R, 382S, 382T, 382V, 382W, 382Y, 423N, 427N, 430A, 430F, 430G, 430H, 4301, 430K, 430L, 430M, 430N, 430Q, 430R, 430S, 430T, 430V, 430Y, 431H, 43 IK, 434F, 434G, 434H, 434W, 434Y, 4361, 436L, 436T, 438K, 438L, 438T, 438W, 440K eller 442K, [fortrinnsvis 245R, 252Y, 256P, 257A, 2571, 257M, 257N, 257S, 257V, 258D, 260S, 262L, 279A, 279D, 279G, 279H, 279N, 279Q, 2798, 279T, 279W, 279Y, 283F, 283H, 283K, 283R, 285N, 286F, 307E, 307M, 3111, 311K, 311L, 311M, 312P, 318N, 318T, 332S, 339W, 343E, 343H, 343K, 343Q, 343R, 375R, 377K, 378D, 378N, 380S, 380T, 382F, 382K, 382Q, 382R, 3828, 382T, 382V, 382W, 382Y, 423N, 427N, 430A, 430F, 430H, 4301, 430L, 430M, 430N, 430Q, 430R, 430S, 430V, 430Y, 431H, 43 IK, 434F, 434G, 434H, 434W, 434Y, 4361, 436L, 438K, 438L eller 438W], hvori det monoklonale antistoff omfattende variant Fc-regionen fremviser forsterket FcRn bindingsaffinitet, sammenliknet med det monoklonale antistoff som omfatter moder Fc-regionen.

Beskrivelsen tilveiebringer et monoklonalt antistoff omfattende en variant Fc-region, som omfatter minst en av de følgende aminosyresubstitusjoner i Fc-regionen: 235Q, 236Y, 237K, 237R, 238E, 238G, 238H, 238W, 247A, 247D, 247E, 247F, 247G, 247H, 2471, 247L, 247M, 247N, 247Q, 247R, 247S, 247W, 247Y, 248A, 248F, 248P, 248Q, 248W, 249E, 249L, 249M, 249Y, 251F, 251H, 2511, 251W, 254D, 254E, 254F, 254G, 254H, 2541, 254K, 254L, 254M, 254N, 254P, 254Q, 254R, 254T, 254V, 254W, 254Y, 255K, 255N, 256F, 256H, 2561, 256K, 256M, 256R, 256W, 256Y, 264S, 265S, 265Y, 267G, 2671, 268D, 268K, 270A, 270M, 2791, 279K, 279L, 280T, 292E, 292F, 292G, 2921, 292L, 311D, 311E, 311F, 311G, 31 IN, 311R, 311Y, 315F, 315K, 315P, 316F, 317T, 326W, 327T, 339E, 339G, 339L, 339R, 341D, 341E, 341F, 3411, 341K, 341L, 341M, 341N, 341Q, 341R, 341S, 341T, 341V, 341W, 341Y, 343M, 343V, 343W, 373A, 373D, 373G, 373K, 373L, 373M, 373N, 373Q, 373S, 373T, 373V, 373W, 376H, 376L, 376W, 376Y, 424M, 424V, 426D, 429A, 429F, 429M, 430D, 430W, 431P, 432R, 432S, 439Q, 440A, 440D, 440E, 440F eller 440M, [fortrinnsvis 237R, 247D, 247E, 247F, 247H, 2471, 247L, 247M, 247N, 247Q, 247W, 247Y, 248A, 248F, 248P, 248Q, 248W, 249L, 249M, 249Y, 251H, 2511, 251W, 254D, 254E, 254F, 254G, 254H, 2541, 254K, 254M, 254N, 254P, 254Q, 254R, 254T, 254V, 254W, 254Y, 2551, 255N, 256F, 256H, 256K, 256M, 256R, 256W, 265Y, 280T, 292G, 2921, 31 ID, 311E, 311G, 31 IN, 315F, 315P, 316T, 317T, 327T, 341D, 341E, 341F, 3411, 341L, 341Y, 343W, 373A, 373G, 373M, 373Q, 376W, 376Y, 424M, 424V, 430D, 430W, 431P eller 432S], hvori det monoklonale antistoffet som omfatter variant Fc-regionen fremviser redusert FcRn bindingsaffinitet sammenliknet med det monoklonale antistoffet som omfatter moder Fc-regionen.

Beskrivelsen omfatter et monoklonalt antistoff omfattende en variant Fc-region som omfatter minst én av de følgende aminosyresubstitusj onene i Fc-regionen: 236Y, 244L, 247A, 247D, 247E, 247G, 247N, 247Q, 247R, 247S, 247W, 248F, 248P, 248Q, 248W, 249E, 249L, 249M, 249N, 249P, 249Y, 251F, 251H, 2511, 251W, 254A, 254F, 254K, 254L, 254M, 254R, 254Y, 255K, 256A, 256G, 2561, 256L, 256M, 256P, 256Q, 256W, 256Y, 260S, 268D, 279Q, 279S, 279W, 279Y, 280K, 280T, 283F, 283G, 283H, 2831, 283K, 283L, 283M, 283N, 283P, 283R, 283S, 283W, 292L, 307A, 307M, 311F, 3111, 311K, 311L, 31 IM, 311T, 3111V, 311W, 311Y, 312P, 314F, 3141, 314V, 314W, 314Y, 315F, 315K, 315L, 315P, 315R, 316K, 317P, 317T, 318N, 318T, 332A, 332D, 332E, 332F, 332G, 332L, 332M, 332Q, 332S, 332T, 332V, 332W, 332Y, 339D, 339F, 339G, 339H, 3391, 339K, 339N, 339Q, 339R, 339S, 339T, 339W, 339Y, 341D, 341E, 341F, 341H, 3411, 341K, 341L, 341M, 341N, 341P, 341Q, 341R, 341S, 341T, 341V, 341W, 341Y, 343A, 343D, 343E, 343G, 343H, 343K, 343L, 343M, 343N, 343Q, 343R, 343S, 343T, 343W, 343Y, 373D, 373E, 373F, 373H, 3731, 373K, 373L, 373M, 373N, 373Q, 373R, 373T, 373V, 373W, 375R, 376A, 376F, 376G, 376H, 376L, 376N, 376P, 376Q, 376R, 376S, 376T, 376V, 377P, 379N, 379Q, 379S, 379T, 380A, 380N, 380S, 380T, 3821, 382L, 382Q, 382V, 386K, 426D, 426L, 429A, 429F, 429M, 430A, 430D, 430F, 430G, 430H, 4301, 430K, 430L, 430M, 430N, 430P, 430R, 430S, 430T, 430V, 430W, 430Y, 431H, 431P, 432R, 432S, 434W, 434Y, 438L, 438W, 440Q eller 440Y, [fortrinnsvis 236Y, 248F, 248P, 248Q, 248W, 249E, 249L, 249M, 249N, 249Y, 251H, 2511, 251W, 254F, 254K, 254L, 254M, 254R, 254Y, 255K, 256A, 256G, 2561, 256L, 256M, 256P, 256Q, 256W, 260S, 280K, 283W, 307M, 311F, 3111, 31 IK, 31 IL, 31 IM, 311T, 31IV, 311W, 311Y, 3141, 314V, 314W, 314Y, 315P, 317P, 332D, 332L, 332M, 332S, 332W, 339D, 339F, 3391, 339K, 339N, 339S, 339W, 339Y, 341D, 341E, 341F, 341H, 3411, 341K, 341L, 341M, 341N, 341P, 341Q, 341R, 341S, 341T, 341V, 341W, 341Y, 343D, 343E, 343G, 343H, 343K, 343N, 343Q, 343R, 343S, 343T, 343W, 343Y, 373E, 373F, 373H, 3731, 373K, 373L, 373Q, 373R, 373T, 373W, 376A, 376G, 376N, 376P, 376Q, 376R, 376S, 376T, 376V, 377P, 379N, 379Q, 379T, 3821, 382L, 386K, 426D, 426L, 429F, 429M, 430A, 430D, 430F, 430G, 430H, 4301, 430K, 430L, 430M, 430N, 430P, 430R, 430S, 430T, 430V, 430W, 430Y, 431H, 431P, 434Y, 438L eller 440Y], hvori det monoklonale antistoff omfatter variant Fc-regionen som fremviser forsterket CDC aktivitet sammenliknet med det monoklonale antistoff som omfatter moder Fc-regionen.

Beskrivelsen tilveiebringer et monoklonalt antistoff som omfatter en Fc-regionvariant omfattende minst en av de følgende aminosyresubstitusjoner i Fc-regionen: 235G, 235S, 236R, 237E, 237K, 237N, 237R, 238A, 238E, 238G, 238H, 2381, 238L, 238V, 238W, 238Y, 245R, 247H, 2471, 247L, 247T, 247Y, 250M, 252Y, 254D, 254E, 2541, 254P, 254Q, 254T, 254V, 255N, 257A, 2571, 257M, 257N, 257S, 257V, 262L, 264S, 265H, 265Y, 267G, 267H, 2671, 267K, 268K, 269N, 269Q, 270G, 270M, 270N, 27IT, 272H, 272L, 272N, 292A, 293S, 301W, 307E, 311E, 311S, 316F, 318P, 327T, 328V, 329Y, 330K, 330R, 332E, 332M, 3431, 373S, 378D, 380D, 382D, 382F, 382N, 382P, 382R, 382S, 382W, 382Y, 385E, 385P, 423N, 424H, 424M eller 427N [fortrinnsvis 235G, 235S, 236R, 237E, 237K, 237N, 237R, 238A, 238E, 238G, 238H, 2381, 238L, 238V, 238W, 238Y, 245R, 2471, 247L, 247T, 250M, 257A, 2571, 257M, 262L, 264S, 267G, 267H, 2671, 267K, 268K, 269N, 269Q, 270G, 270M, 270N, 271T, 272H, 301W, 31 IS, 327T, 329Y, 330K, 378D, 385E, 423N eller 424H], hvori det monoklonale antistoff omfatter variant Fc-regionen som fremviser redusert CDC aktivitet sammenliknet med det monoklonale antistoff som omfatter moder Fc-regionen.

Beskrivelsen omfatter også et monoklonalt antistoff som omfatter en Fc-regionvariant ifølge oppfinnelsen, hvori nevnte antistoff spesielt binder et humant målantigen. Fortrinnsvis er målantigenet valgt fra gruppen bestående av (CD3, CD20, CD25, TNFa, Her2/neu, CD33, CD52, EGFR, EpCAM, MUC1, GD3, CEA, CA125, HLA-DR, TGFp, VEGF, GDF8, GDF11, ghrelin, eller enhver forløper eller funksjonelt fragment derav.

Beskrivelsen tilveiebringer et variant polypeptid omfattende en variant Fc-region som omfatter minst én av de følgende aminosyresubstitusj onene i Fc-regionen: 23 8L, 244L, 245R, 249P, 252Y, 256P, 257A, 2571, 257M, 257N, 2575, 257V, 258D, 260S, 262L, 270K, 272L, 272R, 279A, 279D, 279G, 279H, 279M, 279N, 279Q, 279R, 279S, 279T, 279W, 279Y, 283A, 283D, 283F, 283G, 283H, 2831, 283K, 283L, 283N, 283P, 283Q, 283R, 283S, 283T, 283W, 283Y, 285N, 286F, 288N, 288P, 293V, 307E, 307M, 311A, 3111, 311K, 311L, 311M, 311V, 311W, 312P, 316K, 317P, 318N, 318T, 332F, 332H, 332K, 332L, 332M, 332R, 332S, 332W, 339N, 339T, 339W, 341P, 343E, 343H, 343K, 343Q, 343R, 343T, 343Y, 375R, 376G, 3761, 376M, 376P, 376T, 376V, 377K, 378D, 378N, 380N, 380S, 380T, 382F, 382H, 3821, 382K, 382L, 382M, 382N, 382Q, 382R, 382S, 382T, 382V, 382W, 382Y, 423N, 427N, 430A, 430F, 430G, 430H, 4301, 430K, 430L, 430M, 430N, 430Q, 430R, 430S, 430T, 430V, 430Y, 431H, 43 IK, 434F, 434G, 434H, 434W, 434Y, 4361, 436L, 436T, 438K, 438L, 438T, 438W, 440K eller 442K, [fortrinnsvis 245R, 252Y, 256P, 257A, 2571, 257M, 257N, 257S, 257V, 258D, 260S, 262L, 279A, 279D, 279G, 279H, 279N, 279Q, 279S, 279T, 279W, 279Y, 283F, 283H, 283K, 283R, 285N, 286F, 307E, 307M, 3111, 311K, 311L, 311M, 312P, 318N, 318T, 332S, 339W, 343E, 343H, 343K, 343Q, 343R, 375R, 377K, 378D, 378N, 380S, 380T, 382F, 382K, 382Q, 382R, 382S, 382T, 382V, 382W, 382Y, 423N, 427N, 430A, 430F, 430H, 4301, 430L, 430M, 430N, 430Q, 430R, 430S, 430V, 430Y, 431H, 43 IK, 434F, 434G, 434H, 434W, 434Y, 4361, 436L, 438K, 438L eller 438W], hvori variantpolypeptidet fremviser forsterket serumhalveringstid sammenliknet med moderpolypeptidet (dvs. et polypeptid som er identisk til variantpolypeptidet, men som mangler aminosyresubstitusj onen opplistet her ovenfor).

Beskrivelsen tilveiebringer et variantpolypeptid omfattende en variant Fc-region omfattende minst en av de følgende aminosyresubstitusj onene i Fc-regionen: 235Q, 236Y, 237K, 237R, 238E, 238G, 238H, 238W, 247A, 247D, 247E, 247F, 247G, 247H, 2471, 247L, 247M, 247N, 247Q, 247R, 247S, 247W, 247Y, 248A, 248F, 248P, 248Q, 248W, 249E, 249L, 249M, 249Y, 251F, 251H, 2511, 251W, 254D, 254E, 254F, 254G, 254H, 2541, 254K, 254L, 254M, 254N, 254P, 254Q, 254R, 254T, 254V, 254W, 254Y, 255K, 255N, 256F, 256H, 2561, 256K, 256M, 256R, 256W, 256Y, 264S, 265S, 265Y, 267G, 2671, 268D, 268K, 270A, 270M, 2791, 279K, 279L, 280T, 292E, 292F, 292G, 2921, 292L, 311D, 311E, 311F, 311G, 31 IN, 311R, 311Y, 315F, 315K, 315P, 316F, 317T, 326W, 327T, 339E, 339G, 339L, 339R, 341D, 341E, 341F, 3411, 341K, 341L, 341M, 341N, 341Q, 341R, 341S, 341T, 341V, 341W, 341Y, 343M, 343V, 343W, 373A, 373D, 373G, 373K, 373L, 373M, 373N, 373Q, 373S, 373T, 373V, 373W, 376H, 376L, 376W, 376Y, 424M, 424V, 426D, 429A, 429F, 429M, 430D, 430W, 431P, 432R, 432S, 439Q, 440D, 440E, 440F eller 440M [fortrinnsvis 237R, 247D, 247E, 247F, 247H, 247L, 247M, 247N, 247Q, 247W, 247Y, 248A, 248F, 248P, 248Q, 248W, 249L, 249M, 249Y, 251H, 2511, 251W, 254D, 254E, 254F, 254G, 254H, 2541, 254K, 254M, 254N, 254P, 254Q, 254R, 254T, 254V, 254W, 254Y, 255K, 255N, 256F, 256H, 256K, 256M, 256R, 256W, 265Y, 280T, 292G, 2921, 311D, 311E, 311G, 31 IN, 315F, 315P, 316T, 317T, 327T, 341D, 341E, 341F, 3411, 341L, 341Y, 343W, 373A, 373G, 373M, 373Q, 376W, 376Y, 424M, 424V, 430D, 430W, 431P eller 432S], hvori variantpolypeptidet fremviser redusert serumhalveringstid sammenliknet med moderpolypeptidet (dvs. et polypeptid som er identisk til variantpolypeptidet, men som mangler aminosyresubstitusj onen opplistet her ovenfor).

I en utførelsesform i beskrivelsen tilveiebringes en fremgangsmåte for å øke ADCC aktiviteten til et monoklonalt antistoff, fortrinnsvis et terapeutisk monoklonalt antistoff (eller et funksjonelt fragment derav), omfattende konstruksjon av en nukleinsyre omfattende en nukleinsyre som koder en variant Fc-region, omfattende minst én av de følgende aminosyresubstitusjoner: 247A, 247F, 247H, 2471, 247L, 247M, 247T, 247V, 247Y, 249E, 249Y, 251F, 254F, 254M, 254Y, 256A, 256M, 258D, 268D, 268E, 279A, 280A, 280K, 283A, 2831, 283K, 283M, 283R, 288N, 292A, 31 IA, 31 ID, 31 IN, 31 IT, 31IV, 311Y, 315L, 318N, 318P, 318T, 318V, 330K, 332T, 332V, 339D, 339F, 339G, 3391, 339K, 339M, 339N, 339Q, 339R, 339S, 339T, 376A, 376V, 377G, 377K, 379N, 380N, 380S, 382A, 3821, 385E, 427N, 429M, 434W, 4361, 440G, 440H, 4401 eller 440L [fortrinnsvis 247 A, 247F, 247M, 247T, 247V, 247Y, 254F, 254Y, 258D, 279A, 283M, 288N, 292A, 31 ID, 31 IN, 31 IT, 315L, 318N, 318P, 318T, 318V, 339D, 3391, 339K, 339M, 339N, 339Q, 339R, 339S, 376A, 376V, 377K, 379N, 380N, 382A, 4401 eller 440L. Nukleinsyremolekylet som koder variant Fc-regionen kan konstrueres (for eksempel fra et nukleinsyremolekyl som koder en moder Fc-region eller en naturlig Fc-region) for å omfatte minst én aminosyresubstitusjon som opplistet ovenfor, enten mens nukleinsyremolekylet er operabelt festet til ytterligere antistoffkodende nukleinsyre, (for eksempel nukleinsyresekvensen som koder det gjenværende av lg tungkjeden), eller fremgangsmåten kan videre omfatte etterfølgende funksjonell festing av nukleinsyren som koder variant Fc-regionen (dvs. etter introduksjon av minst én aminosyresubstitusjon opplistet ovenfor) til ytterligere antistoffkodende nukleinsyre. Fremgangsmåten kan også omfatte ekspresjon og rensing av det monoklonale antistoffet omfattende variant Fc-regionen. Fremgangsmåten kan videre omfatte ekspresjon og rensing av det monoklonale antistoffet omfattende moder Fc-regionen. Fremgangsmåten kan også omfatte måling av ADCC aktiviteten av det monoklonale antistoffet omfattende variant Fc-regionen og det monoklonale antistoffet, omfattende moder Fc-regionen med enhver fremgangsmåte tilgjengelig i fagfeltet, eller som beskrevet heri. Fremgangsmåten kan også omfatte valg av et monoklonalt antistoff omfattende en variant Fc-region med ADCC aktivitet større enn den av det monoklonale antistoff omfattende moder Fc-regionen (dvs. forsterket, fortrinnsvis med minst 5 %, 10 %, 12 %, 14 %, 16 %, 18 %, 20 % eller mer). Beskrivelsen omfatter videre et monoklonalt antistoff eller et funksjonelt fragment derav, omfattende en variant Fc-region produsert ved fremgangsmåten.

I en utførelsesform tilveiebringer beskrivelsen en fremgangsmåte for å redusere ADCC aktivitet av et monoklonalt antistoff, fortrinnsvis et terapeutisk monoklonalt antistoff (eller et funksjonelt fragment derav), omfattende å konstruere en nukleinsyre som omfatter en nukleinsyre som koder en variant Fc-region omfattende minst én av de følgende aminosyresubstitusjoner: 235Q, 235R, 235S, 236F, 236R, 236Y, 237E, 237K, 237N, 237R, 238E, 238G, 238H, 2381, 238L, 238V, 238W, 238Y, 247G, 247R, 249L, 249P, 250K, 250M, 250R, 251H, 2511, 251W, 252Y, 254L, 254P, S254Q, 254T, 254V, 256V, 257A, 2571, 257M, 257N, 257S, 257V, 260S, 262L, 264S, 265H, 265K, 265S, 267G, S267H, 2671, 267K, 269N, 269Q, 270A, 270G, 270K, 270M, 270N, 27IT, 272H, 272K, 272L, 272N, 272R, 279D, 279F, 279K, 279L, 279W, 283D, 283F, 283 G, 283H, 283L, 283T, 283W, 283Y, 285N, 288P, 292E, 292F, 292G, 2921, 293S, 293V, 301W, 304E, 307A, 307E, 307M, 311F, 3111, 311K, 311S, 312P, 314F, 3141, 314V, 314W, 315F, 315P, 316F, 317P, 327T, 328V, 329Y, 332G, 332K, 332L, 332R, 332W, 341D, 341E, 341F, 341H, 3411, 341K, 341L, 341M, 341N, 341P, 341Q, 341R, 341S, 341T, 341W, 341Y, 343A, 343D, 343E, 343F, 343G, 343H, 343L, 343M, 343N, 343Q, 343R, 343S, 343T, 343V, 343W, 343Y, 373A, 373D, 373E, 373F, 373G, 3731, 373K, 373L, 373M, 373N, 373Q, 373R, 373S, 373T, 373V, 373W, 375R, 376A, 376E, 376F, 376G, 376H, 376W, 376Y, 379Q, 382D; 382S, 429A, 429F, 430H, 430K, 430N, 430Q, 430R, 430W, 432R, 432S, 4341, 440D, 440T, 440V eller 442K [fortrinnsvis 23 5R, 236F, 236R, 236Y, 237E, 237K, 237N, 237R, 238E, 238G, 238H, 2381, 238L, 238V, 238W, 238Y, 247R, 249P, 250K, 251H, 254T, 2571, 257M, 257N, 2575, 257V, 265H, 265K, 265S, 267G, 267H, 2671, 267K, 269N, 269Q, 270A, 270G, 270K, 270M, 270N, 271T, 272R, 288P, 292E, 301W, 304E, 316F, 317P, 327T, 329Y, 332K, 332R, 341F, 3411, 341M, 341P, 341Q, 341R, 341T, 341W, 341Y, 343W, 373A, 373E, 373G, 373S, 376W, 429A, 432R eller 432S].

Nukleinsyremolekylet som koder variant Fc-regionen kan konstrueres (for eksempel fra et nukleinsyremolekyl som koder en moder Fc-region eller en naturlig Fc-region) for å omfatte minst én aminosyresubstitusjon som opplistet ovenfor, enten mens nukleinsyremolekylet er operabelt festet til ytterligere antistoffkodende nukleinsyre, (for eksempel nukleinsyresekvensen som koder det gjenværende av lg tungkjeden), eller fremgangsmåten kan ytterligere omfatte påfølgende operabel festing av nukleinsyren som koder Fc-variantregionen (dvs. etter introduksjon av minst én aminosyresubstitusjon opplistet ovenfor) til ytterligere antistoffkodende nukleinsyre. Fremgangsmåten kan også omfatte ekspresjon og rensing av det monoklonale antistoffet som omfatter variant Fc-regionen. Fremgangsmåten kan også omfatte ekspresjon og rensing av det monoklonale antistoffet som omfatter moder Fc-regionen. Fremgangsmåten kan også omfatte måling av ADCC aktivitet av det monoklonale antistoffet omfattende variant Fc-regionen, og av det monoklonale antistoffet som omfatter moder Fc-regionen ved enhver fremgangsmåte tilgjengelig i fagfeltet, eller som beskrevet heri. Fremgangsmåten kan også omfatte valg av et monoklonalt antistoff omfattende en variant Fc-region med ADCC aktivitet mindre en den av det monoklonale antistoffet omfattende moder Fc-regionen (dvs. redusert, fortrinnsvis med minst 5 %, 10 %, 12 %, 14 %, 16 %, 18 %, 20 % eller mer). Beskrivelsen omfatter også et monoklonalt antistoff eller et funksjonelt fragment derav, omfattende en variant Fc-region produsert med fremgangsmåten.

I en utførelsesform tilveiebringer beskrivelsen en fremgangsmåte for å øke FcRn bindingsaffiniteten av et monoklonalt antistoff, fortrinnsvis et terapeutisk monoklonalt antistoff (eller funksjonelt fragment derav), omfattende konstruksjon av en nukleinsyre omfattende en nukleinsyre som koder en variant Fc-region omfattende minst en av de følgende aminosyresubstitusjonene: 238L, 244L, 245R, 249P, 252Y, 256P, 257A, 2571, 257M, 257N, 257S, 257V, 258D, 260S, 262L, 270K, 272L, 272R, 279A, 279D, 279G, 279H, 279M, 279N, 279Q, 279R, 279S, 279T, 279W, 279Y, 283A, 283D, 283F, 283G, 283H, 2831, 283K, 283L, 283N, 283P, 283Q, 283R, 283S, 283T, 283W, 283Y, 285N, 286F, 288N, 288P, 293V, 307A, 307E, 307M, 311A, 3111, 311K, 311L, 311M, 311V, 311W, 312P, 316K, 317P, 318N, 318T, 332F, 332H, 332K, 332L, 332M, 332R, 332S, 332W, 339N, 339T, 339W, 341P, 343E, 343H, 343K, 343Q, 343R, 343T, 343Y, 375R, 376G, 3761, 376M, 376P, 376T, 376V, 377K, 378D, 378N, 380N, 380S, 380T, 382F, 382H, 3821, 382K, 382L, 382M, 382N, 382Q, 382R, 382S, 382T, 382V, 382W, 382Y, 423N, 427N, 430A, 430F, 430G, 430H, 4301, 430K, 430L, 430M, 430N, 430Q, 430R, 430S, 430T, 430V, 430Y, 431H, 43IK, 434F, 434G, 434H, 434W, 434Y, 4361, 436L, 436T, 438K, 438L, 438T, 438W, 440K eller 442K [fortrinnsvis 245R, 252Y, 256P, 257A, 2571, 257M, 257N, 257S, 257V, 258D, 262L, 279A, 279D, 279G, 279H, 279N, 279Q, 279S, 279T, 279W, 279Y, 283F, 283H, 283K, 283R, 285N, 286F, 307A, 307E, 307M, 3111, 31 IK, 31 IL, 31 IM, 312P, 318N, 318T, 3328, 339W, 343E, 343H, 343K, 343Q, 343R, 375R, 377K, 378D, 378N, 380S, 380T, 382F, 382K, 382Q, 382R, 382S, 382T, 382V, 382W, 382Y, 423N, 427N, 430A, 430F, 430H, 4301, 430L, 430M, 430N, 430Q, 430R, 430S, 430V, 430Y, 431H, 431K, 434F, 434G, 434H, 434W, 434Y, 4361, 436L, 438K, 438L eller 43 8W]. Nukleinsyremolekylet som koder variant Fc-regionen kan konstrueres (for eksempel fra et nukleinsyremolekyl som koder en moder Fc-region eller en naturlig Fc-region) for å omfatte minst én aminosyresubstitusjon som opplistet ovenfor, enten mens nukleinsyremolekylet er operabelt festet til ytterligere antistoffkodende nukleinsyre, (for eksempel nukleinsyresekvensen som koder det gjenværende av lg tungkjeden), eller kan fremgangsmåten ytterligere omfatte påfølgende operabelt festing av nukleinsyren som koder variant Fc-regionen (dvs. etter introduksjon av minst én aminosyresubstitusjon opplistet ovenfor) til ytterligere antistoffkodende nukleinsyre. Fremgangsmåten kan også omfatte ekspresjon og rensing av det monoklonale antistoffet omfattende variant Fc-regionen. Fremgangsmåten kan også omfatte ekspresjon og rensing av det monoklonale antistoffet omfattende moder Fc-regionen. Fremgangsmåten kan også omfatte måling av FcRn bindingsaffinitet av det monoklonale antistoffet omfattende variant Fc-regionen, og av det monoklonale antistoffet omfattende moder Fc-regionen med enhver fremgangsmåte tilgjengelig i fagfeltet, eller som beskrevet heri. Fremgangsmåten kan også omfatte valg av et monoklonalt antistoff omfattende en variant Fc-region med FcRn bindingsaffinitet som er større enn FcRn bindingsaffiniteten av det monoklonale antistoffet omfattende moder Fc-regionen (dvs. forsterket, fortrinnsvis med minst 5 %, 10 %, 12 %, 14 %, 16 %, 18 %, 20 % eller mer). Beskrivelsen omfatter ytterligere et monoklonalt antistoff, eller et funksjonelt fragment derav omfattende en variant Fc-region produsert ved fremgangsmåten.

I en utførelsesform tilveiebringer beskrivelsen en fremgangsmåte for å øke in vivo serumhalveringstiden av et polypeptid, fortrinnsvis et terapeutisk polypeptid, omfattende konstruksjon av en nukleinsyre, omfattende en nukleinsyre som koder en variant Fc-region omfattende minst én av de følgende aminosyresubstitusj onene: 23 8L, 244L, 245R, 249P, 252Y, 256P, 257A, 2571, 257M, 257N, 257S, 257V, 258D, 260S, 262L, 270K, 272L, 272R, 279A, 279D, 279G, 279H, 279M, 279N, 279Q, 279R, 279S, 279T, 279W, 279Y, 283A, 283D, 283F, 283G, 283H, 2831, 283K, 283L, 283N, 283P, 283Q, 283R, 283S, 283T, 283W, 283Y, 285N, 286F, 288N, 288P, 293V, 307A, 307E, 307M, 31 IA, 3111, 311K, 311L, 31 IM, 31IV, 311W, 312P, 316K, 317P, 318N, 318T, 332F, 332H, 332K, 332L, 332M, 332R, 332S, 332W, 339N, 339T, 339W, 341P, 343E, 343H, 343K, 343Q, 343R, 343T, 343Y, 375R, 376G, 3761, 376M, 376P, 376T, 376V, 377K, 378D, 378N, 380N, 380S, 380T, 382F, 382H, 3821, 382K, 382L, 382M, 382N, 382Q, 382R, 382S, 382T, 382V, 382W, 382Y, 423N, 427N, 430A, 430F, 430G, 430H, 4301, 430K, 430L, 430M, 430N, 430Q, 430R, 430S, 430T, 430V, 430Y, 431H, 43 IK, 434F, 434G, 434H, 434W, 434Y, 4361, 436L, 436T, 438K, 438L, 438T, 438W, 440K eller 442K, [fortrinnsvis 245R, 252Y, 256P, 257A, 2571, 257M, 257N, 257S, 257V, 258D, 262L, 279A, 279D, 279G, 279H, 279N, 279Q, 279S, 279T, 279W, 279Y, 283F, 283H, 283K, 283R, 285N, 286F, 307A, 307E, 307M, 3111, 31 IK, 31 IL, 31 IM, 312P, 318N, 318T, 332S, 339W, 343E, 343H, 343K, 343Q, 343R, 375R, 377K, 378D, 378N, 380S, 380T, 382F, 382K, 382Q, 382R, 382S, 382T, 382V, 382W, 382Y, 423N, 427N, 430A, 430F, 430H, 4301, 430L, 430M, 430N, 430Q, 430R, 430S, 430V, 430Y, 431H, 431K, 434F, 434G, 434H, 434W, 434Y, 4361, 436L, 438K, 438L eller 438W]. Nukleinsyremolekylet som koder variant Fc-regionen kan være operabelt koblet til et nukleinsyremolekyl som koder et terapeutisk protein. Nukleinsyremolekylet som koder en variant Fc-region kan konstrueres (for eksempel fra et nukleinsyremolekyl som koder en moder Fc-region eller en naturlig Fc-region) til å omfatte minst én aminosyresubstitusjon som opplistet ovenfor, mens nukleinsyremolekylet er operabelt festet til en ytterligere polypeptidkodende nukleinsyre (for eksempel nukleinsyresekvensen som koder ikke-Fc-regionen av fusjonsproteinet), eller fremgangsmåten kan ytterligere omfatte påfølgende operabel festing av nukleinsyren som koder variant Fc-regionen etter introduksjon av minst den ene aminosyresubstitusj onen opplistet ovenfor for nukleinsyre som koder en ikke-Fc- fusjonspartner. Fremgangsmåten kan ytterligere omfatte ekspresjon og rensing av polypeptidet omfattende variant Fc-regionen. Fremgangsmåten kan også omfatte ekspresjon og rensing av polypeptidet omfattende moder Fc-regionen. Fremgangsmåten kan også omfatte måling av in vivo serum halveringstid av polypeptidet, omfattende variant Fc-regionen og polypeptidet omfattende moder Fc-regionen med enhver fremgangsmåte tilgjengelig i fagfeltet, eller som beskrevet heri. Fremgangsmåten kan også omfatte valg av et polypeptid omfattende en variant Fc-region, hvori polypeptidet har øket in vivo serumhalveringstid sammenliknet med den av polypeptidet omfattende moder Fc-regionen (dvs. forsterket, fortrinnsvis med minst 5%, 10 %, 12 %, 14 %, 16 %, 18 %, 20 % eller mer). Beskrivelsen omfatter også et polypeptid (dvs. et fusjonspolypeptid) omfattende en variant Fc-region produsert med fremgangsmåten.

I en utførelsesform tilveiebringer beskrivelsen en fremgangsmåte for å redusere FcRn bindingsaffinitet av et monoklonalt antistoff, fortrinnsvis et terapeutisk monoklonalt antistoff (eller funksjonelt fragment derav), omfattende konstruksjon av en nukleinsyre som koder en variant Fc-region, omfattende minst en av de følgende aminosyresubstitusjonene: 235Q, 236Y, 237K, 237R, 238E, 238G, 238H, 238W, 247A, 247D, 247E, 247F, 247G, 247H, 2471, 247L, 247M, 247N, 247Q, 247R, 247S, 247W, 247Y, 248A, 248F, 248P, 248Q, 248W, 249E, 249L, 249M, 249Y, 251F, 251H, 2511, 251W, 254D, 254E, 254F, 254G, 254H, 2541, 254K, 254L, 254M, 254N, 254P, 254Q, 254R, 254T, 254V, 254W, 254Y, 255K, 255N, 256F, 256H, 2561, 256K, 256M, 256R, 256W, 256Y, 264S, 265S, 265Y, 267G, 2671, 268D, 268K, 270A, 270M, 2791, 279K, 279L, 280T, 292E, 292F, 292G, 2921, 292L, 31 ID, 311E, 311F, 311G, 31 IN, 31 IR, 311Y, 315F, 315K, 315P, 316F, 317T, 326W, 327T, 339E, 339G, 339L, 339R, 341D, 341E, 341F, 3411, 341K, 341L, 341M, 341N, 341Q, 341R, 341S, 341T, 341V, 341W, 341Y, 343M, 343V, 343W, 373A, 373D, 373G, 373K, 373L, 373M, 373N, 373Q, 373S, 373T, 373V, 373W, 376H, 376L, 376W, 376Y, 424M, 424V, 426D, 429A, 429F, 429M, 430D, 430W, 431P, 432R, 432S, 4341, 439Q, 440A, 440D, 440E, 440F eller 440M [fortrinnsvis 23 7R, 247D, 247E, 247F, 247H, 247L, 247M, 247N, 247Q, 247W, 247Y, 248A, 248F, 248P, 248Q, 249L, 249M, 249Y, 251H, 2511, 251W, 254D, 254E, 254F, 254G, 254H, 2541, 254K, 254M, 254N, 254P, 254R, 254T, 254V, 254W, 254Y, 255K, 255N, 256F, 256H, 256K, 256M, 256R, 256W, 265Y, 280T, 292G, 2921, 31 ID, 311E, 311G, 31 IN, 315F, 315P, 316T, 317T, 327T, 341D, 341E, 341F, 341L, 341Y, 343W, 373A, 373G, 373M, 373Q, 376W, 376Y, 424M, 424V, 430D, 430W, 431P eller 432S]. Nukleinsyremolekylet som koder en variant Fc-region kan konstrueres (for eksempel fra et nukleinsyremolekyl som koder en moder Fc-region eller en naturlig Fc- region) til å omfatte minst en aminosyresubstitusjon som opplistet ovenfor, mens nukleinsyren som koder variant Fc-regionen er operabelt festet til en nukleinsyre som koder ytterligere antistoffsekvens, (for eksempel nukleinsyresekvensen som koder det gjenværende av lg tungkjeden), eller fremgangsmåten kan også omfatte påfølgende operabel festing av nukleinsyren som koder variant Fc-regionen etter introduksjon av minst den ene aminosyresubstitusj onen opplistet ovenfor, til ytterligere antistoffkodende nukleinsyre. Fremgangsmåten kan videre omfatte ekspresjon og rensing av det monoklonale antistoffet omfattende variant Fc-regionen. Fremgangsmåten kan videre omfatte ekspresjon og rensing av det monoklonale antistoffet omfattende moder Fc-regionen. Fremgangsmåten kan også omfatte måling av FcRn bindingsaffinitet av det monoklonale antistoffet omfattende variant Fc-regionen og av det monoklonale antistoffet omfattende moder Fc-regionen ved enhver fremgangsmåte tilgjengelig i fagfeltet eller som beskrevet heri. Fremgangsmåten kan ytterligere omfatte valg av et monoklonalt antistoff omfattende en variant Fc-region med FcRn bindingsaffinitet mindre enn den av det monoklonale antistoffet omfattende moder Fc-regionen (dvs. redusert, fortrinnsvis med minst 5 %, 10 %, 12 %, 14 %, 16 %, 18 %, 20 % eller mer). Beskrivelsen omfatter også et monoklonalt antistoff (omfattende en variant Fc-region) produsert med fremgangsmåten.

I en annen utførelsesform tilveiebringer beskrivelsen en fremgangsmåte for å redusere in vivo serumhalveringstiden for et polypeptid, fortrinnsvis et terapeutisk polypeptid, omfattende konstruksjon av en nukleinsyre som koder en variant Fc-region som omfatter minst én av de følgende aminosyresubstitusjon ene: 235Q, 236Y, 237K, 237R, 238E, 238G, 238H, 238W, 247A, 247D, 247E, 247F, 247G, 247H, 2471, 247L, 247M, 247N, 247Q, 247R, 247S, 247W, 247Y, 248A, 248F, 248P, 248Q, 248W, 249E, 249L, 249M, 249Y, 251F, 251H, 2511, 251W, 254D, 254E, 254F, 254G, 254H, 2541, 254K, 254L, 254M, 254N, 254P, 254Q, 254R, 254T, 254V, 254W, 254Y, 255K, 255N, 256F, 256H, 2561, 256K, 256M, 256R, 256W, 256Y, 264S, 265S, 265Y, 267G, 2671, 268D, 268K, 270A, 270M, 2791, 279K, 279L, 280T, 292E, 292F, 292G, 2921, 292L, 31 ID, 311E, 311F, 311G, 311N, 311R, 311Y, 315F, 315K, 315P, 316F, 317T, 326W, 327T, 339E, 339G, 339L, 339R, 341D, 341E, 341F, 3411, 341K, 341L, 341M, 341N, 341Q, 341R, 341S, 341T, 341V, 341W, 341Y, 343M, 343V, 343W, 373A, 373D, 373G, 373K, 373L, 373M, 373N, 373Q, 373S, 373T, 373V, 373W, 376H, 376L, 376W, 376Y, 424M, 424V, 426D, 429A, 429F, 429M, 430D, 430W, 431P, 432R, 432S, 4341, 439Q, 440A, 440D, 440E, 440F eller 440M [fortrinnsvis 237R, 247D, 247E, 247F, 247H, 2471, 247M, 247N, 247Q, 247W, 247Y, 248A, 248F, 248P, 248Q, 249L, 249M, 249Y, 251H, 2511, 251W, 254D, 254E, 254F, 254G, 254H, 2541, 254K, 254M, 254N, 254P, 254R, 254T, 254V, 254W, 254Y, 255K, 255N, 256F, 256H, 256K, 256M, 256R, 256W, 265Y, 280T, 292G, 2921, 31 ID, 311E, 311G, 31 IN, 315F, 315P, 316T, 317T, 327T, 341D, 341E, 341F, 341L, 341Y, 343W, 373A, 373G, 373M, 373Q, 376W, 376Y, 424M, 424V, 430D, 430W, 431P eller 432S]. Nukleinsyren som koder Fc-variantregionen kan være operabelt festet til nukleinsyren som koder et terapeutisk protein. Nukleinsyremolekylet som koder en variant Fc-region kan konstrueres (for eksempel fra et nukleinsyremolekyl som koder en moder Fc-region eller en naturlig Fc-region) til å omfatte minst én aminosyresubstitusjon som opplistet ovenfor, mens nukleinsyremolekylet er operabelt festet til ytterligere polypeptidkodende nukleinsyre (for eksempel nukleinsyresekvensen som koder ikke-Fc-regionen av fusjonsproteinet), eller fremgangsmåten kan ytterligere omfatte påfølgende operabel festing av nukleinsyren som koder variant Fc-regionen etter introduksjon av minst den ene aminosyresubstitusjon opplistet ovenfor til nukleinsyre som koder en ikke-Fc-fusjonspartner. Fremgangsmåten kan også omfatte ekspresjon og rensing av polypeptidet omfattende variant Fc-regionen. Fremgangsmåten kan også omfatte ekspresjon og rensing av polypeptidet som omfatter moder Fc-regionen. Fremgangsmåten kan også omfatte måling av in vivo serumhalveringstid av polypeptidet som omfatter variant Fc-regionen og av polypeptidet omfattende moder Fc-regionen med enhver fremgangsmåte tilgjengelig i fagfeltet, eller som beskrevet heri. Fremgangsmåten kan også omfatte valg av et polypeptid omfattende en variant Fc-region hvori polypeptidet har redusert in vivo serumhalveringstid sammenliknet med den av polypeptidet som omfatter moder Fc-regionen (dvs. redusert, fortrinnsvis med minst 5 %, 10 %, 12 %, 14 %, 16 %, 18 %, 20 % eller mer). Beskrivelsen omfatter også et polypeptid (dvs. et fusjonspolypeptid) omfattende en variant Fc-region produsert med fremgangsmåten.

I en annen utførelsesform tilveiebringer beskrivelsen en fremgangsmåte for å øke CDC aktiviteten av et monoklonalt antistoff, fortrinnsvis et terapeutisk monoklonalt antistoff, omfattende konstruksjon av Fc-regionen til antistoffet for å omfatte minst én av de følgende aminosyresubstitusjonene: 236Y, 244L, 247A, 247D, 247E, 247G, 247N, 247Q, 247R, 247S, 247W, 248F, 248P, 248Q, 248W, 249E, 249L, 249M, 249N, 249P, 249Y, 250K, 250R, 251F, 251H, 2511, 251W, 254A, 254F, 254K, 254L, 254M, 254R, 254Y, 255K, 256A, 256G, 2561, 256L, 256M, 256P, 256Q, 256W, 256Y, 260S, 268D, 279Q, 279S, 279W, 279Y, 280K, 280T, 283F, 283G, 283H, 2831, 283K, 283L, 283M, 283N, 283P, 283R, 283S, 283W, 292L, 307A, 307M, 311F, 3111, 311K, 311L, 311M, 311T, 31IV, 311W, 311Y, 312P, 314F, 3141, 314V, 314W, 314Y, 315F, 315K, 315L, 315P, 315R, 316K, 317P, 317T, 318N, 318T, 332A, 332D, 332E, 332F, 332G, 332H, 332L, 332M, 332N, 332Q, 332S, 332T, 332V, 332W, 332Y, 339D, 339F, 339G, 339H, 3391, 339K, 339N, 339Q, 339R, 339S, 339T, 339W, 339Y, 341D, 341E, 341F, 341H, 3411, 341K, 341L, 341M, 341N, 341P, 341Q, 341R, 341S, 341T, 341V, 341W, 341Y, 343A, 343D, 343E, 343G, 343H, 343K, 343L, 343M, 343N, 343Q, 343R, 343S, 343T, 343W, 343Y, 373D, 373E, 373F, 373H, 3731, 373K, 373L, 373M, 373N, 373Q, 373R, 373T, 373V, 373W, 375R, 376A, 376F, 376G, 376H, 376L, 376N, 376P, 376Q, 376R, 376S, 376T, 376V, 377P, 379N, 379Q, 379S, 379T, 380A, 380N, 380S, 380T, 3821, 382L, 382Q, 382V, 386K, 426D, 426L, 429A, 429F, 429M, 430A, 430D, 430F, 430G, 430H, 4301, 430K, 430L, 430M, 430N, 430P, 430R, 430S, 430T, 430V, 430W, 430Y, 431H, 431P, 432R, 432S, 434W, 434Y, 438L, 438W, 440Q eller 440Y [fortrinnsvis 236Y, 248F, 248P, 248Q, 248W, 249E, 249L, 249M, 249N, 249Y, 2501, 250R, 251H, 2511, 251W, 254A, 254F, 254K, 254L, 254M, 254R, 254Y, 255K, 256A, 256G, 2561,

256L, 256M, 256P, 256Q, 256W, 260S, 280K, 283W, 307M, 311F, 3111, 31 IK, 31 IL, 31 IM, 311T, 31IV, 311W, 311Y, 3141, 314V, 314W, 314Y, 315P, 317P, 332D, 332L, 332M, 332S, 332W, 332Y, 339D, 339F, 3391, 339K, 339N, 339S, 339T, 339W, 339Y, 341D, 341E, 341F, 341H, 3411, 341K, 341L, 341M, 341N, 341P, 341Q, 341R, 341S,

341T, 341V, 341W, 341Y, 343D, 343E, 343G, 343H, 343K, 343N, 343Q, 343R, 343S, 343T, 343W, 343Y, 373D, 373E, 373H, 3731, 373K, 373L, 373Q, 373R, 373T, 373W, 376A, 376G, 376N, 376P, 376Q, 376R, 376S, 376T, 376V, 377P, 379N, 379Q, 379T, 3821, 382L, 386K, 426D, 426L, 429F, 429M, 430A, 430D, 430F, 430G, 430H, 4301, 430K, 430L, 430M, 430N, 430P, 430R, 430S, 430T, 430V, 430W, 430Y, 431H, 431P, 432R, 434Y, 438L eller 440Y]. Nukleinsyremolekylet som koder en variant Fc-region kan være konstruert (for eksempel fra et nukleinsyremolekyl som koder en moder Fc-region eller en naturlig Fc-region) for å omfatte minst én aminosyresubstitusjon som opplistet ovenfor, mens nukleinsyremolekylet er operabelt festet til ytterligere antistoffkodende nukleinsyre, (for eksempel nukleinsyresekvensen som koder det gjenværende av lg tungkjeden), eller fremgangsmåten kan ytterligere omfatte påfølgende operabel festing av nukleinsyren som koder variant Fc-regionen etter

introduksjon av minst den ene aminosyresubstitusj onen opplistet ovenfor til ytterligere antistoffkodende nukleinsyre. Fremgangsmåten kan også omfatte ekspresjon og rensing av det monoklonale antistoffet som omfatter variant Fc-regionen. Fremgangsmåten kan også omfatte ekspresjon og rensing av det monoklonale antistoffet omfattende moder Fc-regionen. Fremgangsmåten kan også omfatte måling av CDC aktiviteten av det monoklonale antistoffet omfattende variant Fc-regionen og av det monoklonale

antistoffet omfattende moder Fc-regionen med enhver tilgjengelig fremgangsmåte i fagfeltet, eller som beskrevet heri. Fremgangsmåten kan ytterligere omfatte valg av et monoklonalt antistoff omfattende en variant Fc-region med CDC aktivitet som er større enn den av det monoklonale antistoffet, omfattende moder Fc-regionen (dvs. forsterket, fortrinnsvis med minst 5 %, 10 %, 12 %, 14 %, 16 %, 18 %, 20 % eller mer). Beskrivelsen omfatter ytterligere et monoklonalt antistoff omfattende en variant Fc-region produsert med fremgangsmåten.

I en annen utførelsesform tilveiebringer beskrivelsen en fremgangsmåte for å redusere CDC responsen av et monoklonalt antistoff, fortrinnsvis et terapeutisk monoklonalt antistoff, omfattende konstruksjon av Fc-regionen til antistoffet for å omfatte minst én av de følgende aminosyresubstitusj onene: 235G, 235S, 236R, 237E, 237K, 237N, 237R, 238A, 238E, 238G, 238H, 2381, 238L, 238V, 238W, 238Y, 245R, 247H, 247L, 247L, 247T, 247Y, 250M, 252Y, 254D, 254E, 2541, 254P, 254Q, 254T, 254V, 255N, 257A, 2571, 257M, 257N, 257S, 257V, 262L, 264S, 265H, 265Y, 267G, 267H, 2671, 267K, 268K, 269N, 269Q, 270G, 270M, 270N, 271T, 272H, 272L, 272N, 292A, 293S, 301W, 307E, 311E, 31 IS, 316F, 318P, 327T, 328V, 329Y, 330K, 330R, 332K, 339E, 339M, 3431, 373S, 378D, 380D, 382D, 382F, 382N, 382P, 382R, 382S, 382W, 382Y, 385E, 385P, 423N, 424H, 424M eller 427N [fortrinnsvis 235G, 235S, 236R, 237E, 237K, 237N, 237R, 238A, 238E, 238G, 238H, 2381, 238L, 238V, 238W, 238Y, 245R, 2471, 247L, 247T, 250M, 257A, 2571, 257M, 262L, 264S, 267G, 267H, 2671, 267K, 268K, 269N, 269Q, 270G, 270M, 270N, 271T, 272H, 301W, 31 IS, 327T, 329Y, 330K, 330R, 378D, 385E, 423N eller 424H]. Nukleinsyremolekylet som koder en variant Fc-region kan være konstruert (for eksempel fra et nukleinsyremolekyl som koder en moder Fc-region eller en naturlig Fc-region) til å omfatte minst én aminosyresubstitusjon som opplistet ovenfor, mens nukleinsyremolekylet er operabelt festet til ytterligere antistoffkodende nukleinsyre (for eksempel nukleinsyresekvensen som koder det gjenværende av lg tungkjeden), eller fremgangsmåten kan ytterligere omfatte påfølgende operabel festing av nukleinsyren som koder variant Fc-regionen etter introduksjon av minst den ene aminosyresubstitusj onen opplistet ovenfor til ytterligere antistoffkodende nukleinsyre. Fremgangsmåten kan ytterligere omfatte ekspresjon og rensing av det monoklonale antistoffet omfattende Fc-regionen. Fremgangsmåten kan også omfatte ekspresjon og rensing av det monoklonale antistoffet omfattende moder Fc-regionen. Fremgangsmåten kan også omfatte måling av CDC aktiviteten av det monoklonale antistoffet omfattende variant Fc-regionen, og det monoklonale antistoffet omfattende moder Fc-regionen med enhver fremgangsmåte tilgjengelig i fagfeltet, eller som beskrevet her. Fremgangsmåten kan ytterligere omfatte valg av et monoklonalt antistoff omfattende en variant Fc-region med CDC aktivitet mindre enn den av det monoklonale antistoffet omfattende moder Fc-regionen (dvs. redusert, fortrinnsvis med minst 5 %, 10 %, 12 %, 14 %, 16 %, 18 %, 20 % eller mer). Beskrivelsen omfatter ytterligere et monoklonalt antistoff omfattende en variant Fc-region produsert med fremgangsmåten.

I en annen utførelsesform tilveiebringer beskrivelsen et isolert nukleinsyremolekyl omfattende et nukleinsyremolekyl som koder en variant Fc-region ifølge oppfinnelsen, eller et funksjonelt fragment derav. Mer foretrukket omfatter det isolerte nukleinsyremolekylet en nukleinsyre som koder et polypeptid omfattende en Fc-regionvariant ifølge oppfinnelsen. Fortrinnsvis er Fc-region polypeptidvarianten som kodes av nevnte nukleinsyre en aminosyresubstitusjon som vist i tabell 1, sammenliknet med moder Fc-regionvarianten. Polypeptidet er fortrinnsvis et monoklonalt antistoff, og mer foretrukket er det monoklonale antistoffet et fullengde antistoff eller et enkeltkjedet antistoff. Det monoklonale antistoffet kan være kimært, humanisert eller humant.

I en annen utførelsesform tilveiebringer beskrivelsen en vektor, fortrinnsvis (men ikke begrenset til) et plasmid, en rekombinant ekspresjonsvektor, en gjærekspresjonsvektor eller en retroviral ekspresjonsvektor, omfattende et polynukleotid som koder et polypeptid som omfatter en Fc-regionvariant polypeptid ifølge oppfinnelsen.

I en annen utførelsesform tilveiebringer beskrivelsen en vertscelle omfattende et nukleinsyremolekyl ifølge foreliggende oppfinnelse. En vertscelle omfatter fortrinnsvis én eller flere vektorer eller konstruksjoner omfattende et nukleinsyremolekyl ifølge foreliggende oppfinnelse. Vertscellen er en celle som en vektor ifølge oppfinnelsen blir introdusert til (for eksempel via transformasjon, transduksjon, infeksjon, transfeksjon, elektroporering og liknende), nevnte vektor omfatter et polynukleotid som koder et polypeptid omfattende en Fc-regionvariant polypeptid. Eventuelt kan vektoren være stabilt inkorporert i vertscellens kromosom. Vertscelletyper inkluderer pattedyrceller, bakterieceller, planteceller og gjærceller. Vertscellen er fortrinnsvis en CHO-celle, en COS-celle, en SP2/0-celle, en NSO-celle, en gjærcelle eller et derivat eller etterkommer av enhver foretrukket celletype.

I en annen utførelsesform tilveiebringer beskrivelsen en farmasøytisk sammensetning omfattende et polypeptid omfattende en Fc-regionvariant, eller et funksjonelt fragment derav. Polypeptidet er fortrinnsvis et monoklonalt antistoff, mer foretrukket er det et terapeutisk monoklonalt antistoff. Det monoklonale antistoffet kan være kimært, humanisert eller humant. Polypeptidet kan være et annet polypeptid enn et antistoff som har fordel av endret serumhalveringstid som konfererer polypeptidet ved å være operabelt festet til, og uttrykkes samtidig med en Fc-regionvariant ifølge oppfinnelsen. Den farmasøytiske sammensetningen kan også omfatte en farmasøytisk akseptabel bærer. I nevnte farmasøytiske sammensetning er polypeptidet omfattende Fc-regionvarianten den aktive ingrediens. Den farmasøytiske sammensetningen omfatter fortrinnsvis en homogen eller i det vesentlige en homogen populasjon av monoklonalt antistoff omfattende en Fc-regionvariant ifølge oppfinnelsen. Den farmasøytiske sammensetningen for terapeutisk anvendelse er fortrinnsvis steril og kan være frysetørket.

Beskrivelsen tilveiebringer en fremgangsmåte for å inhibere proteinaktivitet i et pattedyr, fortrinnsvis et menneske med behov derav, omfattende tilførsel av en terapeutisk effektiv mengde eller forebyggende effektiv mengde av et polypeptid (fortrinnsvis et monoklonalt antistoff) omfattende en Fc-regionvariant ifølge oppfinnelsen til nevnte pattedyr. Polypeptidet som fortrinnsvis omfatter Fc-regionvarianten er en proteinbindingspartner som skal inhiberes. Beskrivelsen tilveiebringer også en fremgangsmåte for å behandle eller forebygge en sykdom eller forstyrrelse som lindres ved inhibisjon av signaltransduksjon som resulterer fra bindingen av et monoklonalt antistoff omfattende en Fc-regionvariant ifølge oppfinnelsen til dens antigeniske epitop, som omfatter tilførsel til en pasient (for eksempel et menneske) med behov for slik behandling eller forebygging av en terapeutisk eller forebyggende effektiv mengde av et monoklonalt antistoff.

Beskrivelsen omfatter en produsert artikkel omfattende et pakningsmateriale og et polypeptid omfattende et Fc-regionvariant polypeptid ifølge oppfinnelsen som foreligger inni nevnte pakningsmateriale. Beskrivelsen omfatter også sammensetninger som omfatter monoklonale antistoffer og heterologe polypeptider som omfatter en Fc-regionvariant beskrevet heri, og en fysiologisk eller farmasøytisk akseptabel bærer eller fortynningsmiddel.

I noen utførelsesformer tilveiebringer foreliggende beskrivelse et polypeptid omfattende: (i) en umodifisert, human rammeverksregion ("FR") (for eksempel at ingen endringer er gjort med en naturlig forekommende humant rammeverk), og (ii) en Fc- regionvariant. I bestemte utførelsesformer er det umodifiserte, humane rammeverk en human kjønnscelle rammeverk. I andre utførelsesformer tilveiebringer foreliggende beskrivelse sammensetninger omfattende et polypeptid, hvori polypeptidet omfatter: (i) minst én tilfeldig CDR-sekvens, og (ii) en Fc-regionvariant ifølge beskrivelsen. I ytterligere utførelsesformer tilveiebringer foreliggende oppfinnelse sammensetninger omfattende et polypeptid, hvori polypeptidet omfatter: (i) et umodifisert, humant rammeverk (for eksempel human kjønnscelle rammeverk), og (ii) minst én tilfeldig CDR-sekvens, og (iii) en Fc-regionvariant.

Foreliggende beskrivelsen betrakter også terapeutiske og diagnostiske anvendelser for monoklonale antistoffer, heterologe polypeptider som omfatter en Fc-regionvariant angitt heri.

BESKRIVELSE AV FIGURENE

Figur 1 viser et skjematisk fremstilling av et IgG-molekyl med de forskjellige regioner og merkete seksjoner. Figur 2 viser en oppstilling av ulike parentale Fc aminosyresekvenser, inkludert humant IgGl ((SEQ ID NO: 1) med ikke-a og a allotyper vist), humant IgG2 (SEQ ID NO: 2), humant IgG3 (SEQ ID NO: 3), humant IgG4 (SEQ ID NO: 4), murint IgGl (SEQ ID NO: 5), murint IgG2A (SEQ ID NO: 6), murint IgG2B (SEQ ID NO: 7) og murint IgG3

(SEQ ID NO: 8).

Figur 3 viser ulike aminosyresekvenser inkludert CH2 regionen (SEQ ID NO: 9) og CH3-regionen (SEQ ID NO: 10) av humant IgGl, så vel som en f allotype (SEQ ID NO: 11) og en z allotype (SEQ ID NO: 12) sekvenser av humant IgGl som inkluderer CH1, hengsel, CH2 og CH3-regioner.

Figur 4 viser ulike aminosyresekvenser omfattet innen:

(a) lettkjede variabelregionen (LCVR) fra anti-CD20 antistoff (I) (SEQ ID NO: 13); (b) tungkjede variabelregionen (HCVR) fra anti-CD20 antistoff (I) (SEQ ID NO: 14); (c) LCVR fra anti-CD20 antistoff (II) (SEQ ID NO: 15); og HCVR fra anti-CD20 antistoff (n) (SEQ ID NO: 16). Figur 4e viser aminosyresekvenser omfattet innen den variable regionen fra et anti-CD20 antistoff. (Se US foreløpig søknad 60/471 958 registrert 20. mai 2003, og US patent 5 843 439). Figur 5a viser den fullstendige lettkjede aminosyresekvensen for anti-CD20 antistoff AME 133.

Figur 5b viser den fullstendige lettkjede nukleinsyresekvensen for AME 133.

Figur 6 viser aminosyre- og nukleinsyresekvensene for den fullstendig tungkjede fra tre foretrukne varianter av anti-CD20 antistoffet AME 133. Figur 6a viser aminosyresekvensen til den fullstendige tungkjeden av 2471/339Q-varianten. Figur 6b viser nukleinsyresekvensen til den fullstendige tungkjeden av 247I/339Q-varianten. Figur 6c viser aminosyresekvensen til den fullstendige tungkjeden av 2471/339D-varianten. Figur 6d viser nukleinsyresekvensen til den fullstendige tungkjeden av 247I/339D-varianten. Figur 6e viser aminosyresekvensen til den fullstendige tungkjeden av 378D-varianten. Figur 6f viser nukleinsyresekvensen til den fullstendige tungkjeden av 378D-varianten.

DETALJERT BESKRIVELSE

Gjennom den foreliggende beskrivelse og kravene er nummereringen av aminosyrerestene i en immunglobulin tungkjede (Fc-region) den av EU-indeksen som i Kabat et al., Sequences of Proteins oflmmunologicallnterest, 5. utg. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). "EU-indeksen som i Kabat" refererer til rest-nummereringen av det humane IgG antistoff, og er gjenspeilet her i figur 2. For eksempel, i posisjon 438, human IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 og murint IgG3 har alle en Q aminosyre, mens murint IgGl har en I-aminosyre, murint IgG2A har en T-aminosyre, og murint IgG2B har en K aminosyre. Videre er substitusjoner navngitt her med aminosyreposisjonsnummeret der substitusjonen forekommer, fulgt av aminosyren som substitueres for den nærværende i moder Fc-regionen i den samme posisjonen (for eksempel angir 249G en glysinrest som substitueres for den nærværende i posisjon 249 av moder Fc-regionen). Nummeret refererer til posisjonen i humant IgGl uansett om moder Fc-regionen er humant IgGl eller ikke; dersom moder Fc-regionen ikke er humant IgGl refererer numrene til den homologe posisjonen i moder Fc-regionen om den ble oppstilt med humant IgGl i den posisjonen.

Betegnelsen "subjekt" og "pasient" slik den anvendes her, refererer til et dyr der et polypeptid omfattende en Fc-regionvariant ifølge oppfinnelsen kan anvendes terapeutisk, inkludert et menneske så vel som andre pattedyr (slik som husdyr (for eksempel hund, katt), sportsdyr (for eksempel hest) og kjøttproduserende dyr (for eksempel storfe, svin og får)), som kan ha fordel av slik terapi.

"Behandling eller forebygging" slik det anvendes her refererer til en sykdom eller forstyrrelse som assosieres med unormale verdier for et protein eller fordelaktighet ved endring av en aktivitet eller proteinnivå.

Betegnelsen "isolert" er en nukleinsyre som, når den anvendes i samband til en nukleinsyre, er identifisert og separert fra minst én forurensende nukleinsyre som den ordinært assosieres med i sin naturlige kilde. Isolert nukleinsyre er i en form eller handling som er ulik den som finnes naturlig. Isolerte nukleinsyremolekyler utmerker seg derfor fra nukleinsyremolekylet slik det eksisterer i naturlige celler. Et isolert nukleinsyremolekyl inkluderer et nukleinsyremolekyl som eksisterer i celler som ordinært uttrykker polypeptidet som kodes deri, hvor for eksempel nukleinsyremolekylet er i et plasmid eller i en kromosomal plass som er ulik fra den i naturlige celler. Den isolerte nukleinsyren kan være til stede i en enkel- eller dobbeltrådet form. Når et isolert nukleinsyremolekyl skal anvendes for å uttrykke et protein, vil oligonukleotidet eller polynukleotidet minst inneholde senstråden eller den kodende tråden, men kan inneholde både sens- og antisenstråder (dvs. kan være dobbeltrådet).

Et nukleinsyremolekyl er "operabelt koblet" eller "operabelt festet" når det er plassert i et funksjonelt forhold med et annet nukleinsyremolekyl. For eksempel er en promoter eller enhancer operabelt koblet til en kodende sekvens med nukleinsyre dersom den påvirker transkripsjonen av sekvensen; eller et ribosombindingssete er operabelt koblet til en kodende sekvens av nukleinsyre dersom det er posisjonert slik at den fremmer translasjon. Et nukleinsyremolekyl som koder en Fc-regionvariant er operabelt koblet til et nukleinsyremolekyl som koder et heterologt protein (dvs. et protein eller et funksjonelt fragment derav, som ikke omfatter en Fc-region, slik det eksisterer naturlig) dersom det er posisjonert slik at det uttrykte fusjonsproteinet omfatter det heterologe proteinet eller et funksjonelt fragment derav, sammenføyd enten oppstrøms eller nedstrøms til Fc-regionvariantpolypeptidet; det heterologe proteinet kan være øyeblikkelig tilstøtende til Fc-regionvariantpolypeptidet eller kan være separert derfra ved en koblingssekvens med enhver lengde og sammensetning. Likeledes er et polypeptid (anvendt synonymt her med "protein") molekyl "operabelt koblet" eller "operabelt festet" når det er plassert i et funksjonelt forhold med et annet polypeptid.

Betegnelsen "funksjonelt fragment" slik den anvendes her med referanse til et polypeptid eller protein (for eksempel en Fc-regionvariant, eller et monoklonalt antistoff) refererer til fragmenter av et protein som bevarer minst én funksjon av fullengde polypeptidet. Fragmentene kan variere i størrelse fra seks aminosyrer til hele aminosyresekvensen av fullengde polypeptidet minus en aminosyre. Et funksjonelt fragment av et Fc-regionvariant polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse bevarer minst én "aminosyresubstitusjon" slik det er definert heri. Et funksjonelt fragment av et Fc-regionvariant polypeptid bevarer minst én funksjon kjent i fagfeltet for å være assosiert med Fc-regionen (for eksempel ADCC, CDC, Fc-reseptorbinding, C1Q binding, nedregulering av celleoverflatereseptorer, eller kan for eksempel øke in vivo eller in vitro halveringstiden til et polypeptid som det operabelt er bundet til).

Betegnelsen "renset" eller "rense" refererer til den vesentlige fjerning av minst en kontaminant fra en prøve. Et antigenspesifikt antistoff kan for eksempel renses ved fullstendig eller i det vesentlige å fjerne (minst 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, mer foretrukket minst 96 %, 97 %, 98 % eller 99 %) av minst et kontaminerende ikke-immunglobulinprotein; det kan også renses ved å fjerne immunglobulinproteinet som ikke binder til det samme antigenet. Fjerningen av ikke-immunglobulinproteiner og/eller fjerning av immunglobuliner som ikke binder et spesifikt antigen, resulterer i en prosentøkning av antigenspesifikke immunglobuliner i prøven. I et annet eksempel renses et polypeptid (for eksempel et immunglobulin) som uttrykkes i bakterievertsceller ved fullstendig eller i det vesentlige fjerning av vertscelleproteiner; den prosentvise del av polypeptidet øker derved i prøven.

Betegnelsen "naturlig" når den refererer til et polypeptid (for eksempel Fc-region) anvendes her for å angi at polypeptidet har en aminosyresekvens bestående av aminosyresekvensen til polypeptidet som det vanligvis forekommer naturlig eller en naturlig forekommende polymorfisme derav. Et naturlig polypeptid (for eksempel naturlig Fc-region) kan produseres med rekombinante midler eller kan isoleres fra en naturlig forekommende kilde.

Betegnelsen "ekspresjonsvektor" slik den anvendes her refererer til et rekombinant DNA-molekyl inneholdende en ønsket kodende sekvens og egnete nukleinsyresekvenser som er nødvendige for ekspresjonen av den operabelt koblete sekvensen i en spesifikk vertsorganisme.

Betegnelsen "vertscelle" slik den anvendes her refererer til enhver eukaryot eller prokaryot celle (for eksempel bakterieceller som E. coli, CHO-celler, gjærceller, pattedyrceller, apeceller, amfibieceller, planteceller, fiskeceller og insektceller), om de er lokalisert in vitro, in situ eller in vivo. Vertsceller kan for eksempel være lokalisert i et transgent dyr.

Betegnelsen "moder polypeptid" slik den anvendes her refererer til et polypeptid som omfatter en aminosyresekvens som kan være byttet eller endret (for eksempel en aminosyresubstitusjon) for å produsere en variant (dvs. variant polypeptid). I foretrukne utførelsesformer omfatter moder polypeptidet minst én del av en naturlig eller unaturlig Fc-region, dvs. en naturlig forekommende Fc-region eller en Fc-region med minst én aminosyresekvensmodifikasjon. I noen utførelsesformer er også varianter som er kortere eller lengre enn moder polypeptidet spesifikt tiltenkt. I spesielt foretrukne utførelsesformer avviker moder polypeptidet i funksjon (for eksempel forsterket eller redusert effektorfunksjon, reseptorbinding, in vivo eller in vitro halveringstid, osv.), sammenliknet med varianten.

Betegnelsen "variant av et moder polypeptid" slik den anvendes her refererer til et polypeptid omfattende en aminosyresekvens som avviker fra den fra moder

polypeptidet med minst én aminosyresubstitusjon. I bestemte utførelsesformer omfatter varianten minst 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % eller 90 %, mest foretrukket med minst 95 %, 97 % eller 99 % av en Fc-region (dvs. en "del" av Fc-regionen). I foretrukne utførelsesformer omfatter en variant Fc-region av et moder polypeptid minst en aminosyresubstitusjon fra moder polypeptidet, der substitusjonen er

i Fc-regionen. Moder polypeptidet kan være, men behøver ikke være et naturlig polypeptid.

Betegnelsen "Fc-region" slik den anvendes her refererer til en C-terminalregion av en immunglobulintungkjede (for eksempel som vist i figur 1). "Fc-regionen" kan være en naturlig sekvens Fc-region eller en variant Fc-region. Selv om de generelt aksepterte grensene av Fc-regionen til et immunglobulintungkjede kan variere, defineres vanligvis den humane IgG tungkjede Fc-regionen å strekke seg fra en aminosyrerest i posisjon Cys226, eller fra Pro230 til karboksylterminalen derav. I noen utførelsesformer omfatter varianter bare deler av Fc-regionen og kan inkludere, men behøver ikke å inkludere karboksyterminalen. Fc-regionen til et immunglobulin omfatter generelt to konstante doméner, CH2 og CH3, som vist i figur 1.1 noen utførelsesformer er varianter som har ett eller flere av de konstante doméner tiltenkt. I andre utførelsesformer er varianter uten slike konstante doméner (eller bare med deler av slike konstante doméner) tiltenkt.

"CH2 doménet" av en human IgG Fc-region (også referert til som "Cy2" doméne) strekker seg vanligvis fra omkring aminosyre 231 til omkring aminosyre 340 (se figur 2). CH2 doménet er enestående fordi det ikke er tett paret med et annet doméne. To N-koblete, forgrenete karbohydratkjeder er innskutt mellom de to CH2 doménene av et intakt naturlig IgG molekyl.

"CH3 doménet" av en human IgG Fc-region (også referert til som "Cy3" doméne) er generelt strekket av restene fra C-terminalen til et CH2 doméne i en Fc-region med utstrekning fra omkring aminosyrerest 341 til omkring aminosyrerest 447 (se figur 2).

En "funksjonell Fc-region" besitter en "effektorfunksjon" av en naturlig sekvens Fc-region. Minst én effektorfunksjon av et polypeptid som omfatter en Fc-regionvariant ifølge foreliggende oppfinnelse, kan være forsterket eller redusert med hensyn til et polypeptid som omfatter en naturlig Fc-region eller moder Fc-regionen av varianten. Eksempler på effektorfunksjoner inkluderer, men er ikke begrenset til Clq binding; komplementavhengig cytotoksisitet (CDC); Fc-reseptorbinding; antistoffavhengig celleformidlet cytotoksisitet (ADCC); fagocytose; nedregulering av celleoverflatereseptorer (for eksempel B-cellereseptorer; BCR), osv. Slike effektorfunksjoner kan kreve at Fc-regionen er operabelt koblet til et bindingsdoméne (for eksempel et antistoffvariabelt doméne) og kan bestemmes ved bruk av forskjellige analyser (for eksempel Fc-bindingsanalyse, ADCC-analyse, CDC-analyse, målcelleutarming fra fullstendige eller fraksjonerte blodprøver, osv.).

En "naturlig sekvens Fc-region" eller "villtype Fc-region" refererer til en aminosyresekvens som er identisk til aminosyresekvensen av en Fc-region som vanligvis finnes naturlig. Eksemplarisk naturlige sekvenser human Fc-regioner er vist i figur 2, og inkluderer en naturlig sekvens human IgGl Fc-region, (f og a,z allotyper, dvs. ikke-A og A allotyper); naturlig sekvens human IgG2 Fc-region; naturlig sekvens human IgG3 Fc-region; og naturlig sekvens human IgG4 Fc-region, så vel som naturlig forekommende varianter derav. Naturlige sekvenser av murine Fc-regioner er også vist i figur 2.

En "Fc-regionvariant" omfatter en aminosyresekvens som avviker fra den av en naturlig sekvens Fc-region (eller fragment derav) med kraft av minst én "aminosyresubstitusjon" som definert heri. I foretrukne utførelsesformer har Fc-regionvarianten minst én aminosyresubstitusjon sammenliknet med en naturlig sekvens Fc-region eller i Fc-regionen av et moder polypeptid, fortrinnsvis 1, 2, 3, 4 eller 5 aminosyresubstitusjoner i en naturlig sekvens Fc-region eller i Fc-regionen til moder polypeptidet. I en alternativ utførelsesform kan en Fc-regionvariant genereres ifølge fremgangsmåtene angitt heri, og denne Fc-regionvarianten kan sammensmeltes med et heterologt polypeptid etter valg, slik som et antistoffvariabelt doméne eller et ikke-antistoff polypeptid, for eksempel bindingsdoménet av en reseptor eller ligand.

Betegnelsen "derivat" slik den anvendes her i sammenhengen av polypeptider, refererer til et polypeptid som omfatter en aminosyresekvens som er endret ved introduksjon av en aminosyrerest substitusjon. Betegnelsen "derivat" refererer også til et polypeptid som har blitt modifisert ved kovalent festing av enhver type molekyl til polypeptidet. Uten å være begrensende kan for eksempel et antistoff modifiseres ved for eksempel glykosylering, acetylering, pegylering, fosforylering, amidering og derivatisering ved kjente beskyttende/blokkerende grupper, proteolytisk spalting, kobling til en cellulær ligand eller annet protein, osv. Et derivatisert polypeptid kan produseres ved kjemiske modifiseringer ved bruk av teknikker kjent i fagfeltet og inkluderer, uten å være begrensende til spesifikk kjemisk kløving, acetylering, formylering, metabolsk syntese av tunicamycin, osv. Et derivatisert polypeptid kan også besitte en liknende eller identisk funksjon som polypeptidet som det ble avledet fra. Det forstås at et polypeptid som omfatter en Fc-regionvariant ifølge foreliggende oppfinnelse kan være et derivat som definert heri, fortrinnsvis forekommer derivatiseringen innenfor Fc-regionen.

"Vesentlig av human opprinnelse" slik det uttrykkes her med referanse til et polypeptid (for eksempel en Fc-region eller et monoklonalt antistoff), angir at polypeptidet har en aminosyresekvens som er minst 80 %, minst 85 %, mer foretrukket minst 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, eller enda mer foretrukket er den minst 95 %, 96 %, 97 %, 98 % eller 99 % homolog til det naturlige, humane polypeptidet.

Betegnelsen "Fc-reseptor" eller "FcR" anvendes for å beskrive en reseptor som binder til en Fc-region (for eksempel et antistoffs Fc-region). Den foretrukne FcR er en naturlig sekvens FcR. En foretrukket FcR er dessuten én som binder et IgG antistoff (en y-reseptor), og inkluderer reseptorer av FcyRI-, FcyRII-, FcyRIII-underklasser, inkludert alleliske varianter og alternative spleiseformer av disse reseptorene. FcyRII reseptorer inkluderer FcyRII A (en "aktiverende reseptor") og FcyRUB (en "inhiberende reseptor"), som har liknende aminosyresekvenser som primært avviker i de cytoplasmiske doméner derav. FcRer er gjennomgått i Ravetch og Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991); Capel et al, Immunomethods 4:25-34 (1994); og de Haas et al., J. Lab. Clin. Med.

126:330-41 (1995). En annen foretrukket FcR inkluderer den neonatale reseptoren FcRn, som er ansvarlig for overføring av moderlige IgGer til fosteret (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976), og Kim et al, J. Immunol. 24:249 (1994)). Andre FcRer, inkludert de som skal identifiseres i fremtiden, er omsluttet heri med betegnelsen "FcR".

Uttrykket "antistoffavhengig celleformidlet cytotoksisitet" og "ADCC" refererer til en celleformidlet reaksjon der uspesifikke cytotoksiske celler (for eksempel uspesifikk) som uttrykker FcRer (for eksempel Naturlige Dreper ("NK") celler, nøytrofiler og makrofager) gjenkjenner bundet antistoff i en målcelle, og forårsaker så lysis av målcellene. De primære celler for formidling av ADCC og NK-celler, uttrykker bare FcyRIII, mens monocytter uttrykker FcyRI, FcyRII og FcyRIII.

Uttrykket "effektorceller" slik det anvendes her refererer til leukocytter (fortrinnsvis humane) som uttrykker én eller flere FcRer og utfører effektorfunksjoner. Cellene uttrykker fortrinnsvis minst FcyRIII og utfører ADCC effektorfunksjoner. Eksempler på leukocytter som formidler ADCC inkluderer PBMC, NK-celler, monocytter, cytotoksiske T-celler og nøytrofiler. Effektorcellene kan isoleres fra en naturlig kilde (for eksempel fra blod eller PBMCer).

Et variant polypeptid med "endret" FcRn bindingsaffinitet er ett som enten har forsterket (dvs. øket, større eller høyere) eller minket (dvs. redusert, avtatt eller mindre) FcRn bindingsaffinitet, sammenliknet med variantens moderpolypeptid eller til et polypeptid som omfatter en naturlig region når det måles ved pH 6,0. Et variant polypeptid som fremviser øket binding eller øket bindingsaffinitet til en FcRn binder FcRn med høyere affinitet enn moder polypeptidet. Et variant polypeptid som fremviser redusert binding eller redusert bindingsaffinitet til en FcRn, binder FcRn med lavere affinitet enn dens moderpolypeptid. Slike varianter som fremviser redusert binding til en FcRn kan besitte liten eller ingen merkbar binding til en FcRn, for eksempel 0-20 % binding til FcRn sammenliknet med et moderpolypeptid. Et variant polypeptid som binder en FcRn med "forsterket affinitet", sammenliknet med dets moderpolypeptid, er ett som binder FcRn med høyere bindingsaffinitet enn moderpolypeptidet, når mengdene av variant polypeptid og moderpolypeptid i en bindingsanalyse i det vesentlige er de samme, og alle andre betingelser er identiske. Et variant polypeptid med forsterket FcRn bindingsaffinitet kan for eksempel fremvise fra omkring 1,10 ganger til omkring 100 ganger (mer vanlig fra omkring 1,2 ganger til omkring 50 ganger) økning i FcRn bindingsaffinitet, sammenliknet med moderpolypeptidet, hvor FcRn bindingsaffiniteten bestemmes, for eksempel i en ELISA analyse eller en annen tilgjengelig fremgangsmåte for fagfolk i fagfeltet.

"Aminosyresubstitusjon" slik uttrykket anvendes her refererer til erstatningen av minst én eksisterende aminosyrerest i en gitt aminosyresekvens med en annen ulik "erstatnings" aminosyrerest. Erstatningsresten(e) kan være "naturlig forekommende aminosyrerester" (dvs. som kodes av den genetiske koden), og som velges fra: alanin (Ala); arginin (Arg); asparagin (Asn); asparginsyre (Asp); cystein (Cys); glutamin (Gin); glutaminsyre (Glu); glysin (Gly); histidin (His); isoleusin (Ile): leusin (Leu); lysin (Lys); metionin (Met); fenylalanin (Phe); prolin (Pro); serin (Ser); treonin (Thr); tryptofan (Trp); tyrosin (Tyr); og valin (Val). Substitusjon med én eller flere unaturlig forekommende aminosyrerester omsluttes også av definisjonen av en aminosyresubstitusjon heri. En "unaturlig forekommende aminosyrerest" refererer til en annen rest enn de naturlig forekommende aminosyrerester opplistet ovenfor, som er i stand til kovalent å binde tilstøtende aminosyrerester i en polypeptidkjede. Eksempler på unaturlig forekommende aminosyrerester inkluderer norleusin, ornitin, norvalin, homoserin og andre aminosyreresteanaloger slik som de beskrevet av Ellman et al., Meth. Enzym. 202:301-336 (1991).

Betegnelsen "testsignal" refererer til resultatet fra en fremgangsmåte for å påvise protein-protein interaksjoner, inkludert uten begrensning til absorbansmåling fra kolorimetriske analyser, fluorescensintensitet eller desintegrasjon pr. minutt. Analyseformater kan inkludere ELISA, facs eller andre fremgangsmåter. En endring i "testsignalet" kan reflektere en endring i cellelevedyktighet og/eller en endring i kinetisk "off-rate", "on-rate" eller begge deler. Et "høyere testsignal" refererer til det målte resultattallet som er større enn et annet tall (for eksempel kan en variant ha et høyere (større) målt tall i en ELISA analyse, sammenliknet med moderpolypeptidet). Et "lavere" testsignal refererer til det målte resultattallet som er mindre enn det andre tallet (for eksempel kan en variant ha et lavere (mindre) målt tall i en ELISA analyse, sammenliknet med moderpolypeptidet).

Betegnelsen "bindingsaffinitet" refererer til likevektsdissosiasjonskonstanten (uttrykkes i konsentrasjonsenheter) assosiert med hver Fc-reseptorbindingsinteraksjon. Bindingsaffiniteten er direkte knyttet til forholdet av kinetisk "off-rate" (generelt rapportert i enheter av invers tid, for eksempel sekunder"<1>) dividert med kinetisk "on-rate" (generelt rapportert i enheter av konsentrasjon pr. enhetstid, for eksempel molar/sekund). Generelt er det ikke mulig utvetydig å uttrykke om endringer i likevektsdissosiasjonskonstanter er forårsaket av ulikheter i "on-rate", "off-rate" eller begge, med mindre begge disse parametrene er eksperimentelt bestemt (for eksempel ved BIACORE eller SAPIDYNE målinger).

Betegnelsen "hengselregion" slik den benyttes her, refererer til utstrekningen av aminosyrer i det humane IgGl som strekker seg fra Glu216 til Pro230 av humant IgGl. Hengselregioner av andre IgG isotyper kan oppstilles med IgGl sekvensen ved å plassere de første og siste cysteinrestene som danner felles tungkjede S-S bindinger i de samme posisjonene.

"Clq" er et polypeptid som inkluderer et bindingssete for Fc-regionen av et immunglobulin. Clq danner sammen med serinproteasene Clr og Cls komplekset Cl, som er den første komponenten i CDC reaksjonsveien.

Betegnelsen "antistoff' benyttes her omvekslende med "immunglobulin" eller "lg", og anvendes i sin bredeste betydning, og dekker spesifikt monoklonale antistoffer (inkludert fullengde monoklonale antistoffer), polyklonale antistoffer, flerspesifikke antistoffer (for eksempel bispesifikke antistoffer), og antistoffragmenter så lenge de viser ønsket biologisk eller funksjonell aktivitet. Enkeltkjedeantistoffer og kimære, humane, humaniserte eller primatiserte (CDR-podete) antistoffer, så vel som kimære eller CDR-podete enkeltkjedeantistoffer og liknende, omfattende deler avledet fra ulike arter er også omfattet av foreliggende beskrivelse, og også betegnelsen "antistoff. De ulike deler av disse antistoffer kan kjemisk sammenføyes ved konvensjonelle teknikker syntetisk, eller kan fremstilles som et sammenhengende protein ved anvendelse av genetiske konstruksjonsteknikker. Nukleinsyrer som koder et kimært eller humanisert kjede kan for eksempel uttrykkes for å produsere et sammenhengende protein. Se for eksempel US 4 816 567; EP 0 125 023 Bl; US 4 816 397;

EP 0 120 694 Bl; WO 86/01533; EP 0 194 276 Bl; US 5 225 539; EP 0 239 400 Bl; US 5 585 089; og US 5 698 762. Se også Newman, R. et al, BioTechnology, 10:1455-1460, 1993, med hensyn til primatisert antistoff, og Ladner et al, US 4 946 778 og Bird, R. E. et al, Science, 242:423-426, 1988, med hensyn til enkeltkjedeantistoffer. Det må forstås at alle former av antistoffene som omfatter en Fc-region (eller del derav) er omsluttet heri innen betegnelsen "antistoff. Antistoffet kan også være merket med en påvisbar merking, immobilisert på en fast fase og/eller konjugert med en heterolog forbindelse (for eksempel et enzym eller toksin) ifølge fremgangsmåter kjent i fagfeltet.

Betegnelsen "antistoffragmenter" slik den anvendes her, refererer til en del av et intakt antistoff. Eksempler på antistoffragmenter inkluderer uten å være begrenset til lineære antistoff; enkeltkjedeantistoffmolekyler; Fc- eller Fc'-peptider, Fab og Fab-fragmenter, og flerspesifikke antistoffer dannet fra antistoffragmenter. Antistoffragmentene inneholder minst én del av hengselregionen, og eventuelt av CH1-regionen av en IgG tungkjede. I andre foretrukne utførelsesformer omfatter antistoffragmentene minst én del av CH2-regionen eller hele CH2-regionen.

Betegnelsen "funksjonelt fragment" når den anvendes her med referanse til et monoklonalt antistoff har betydningen å referere til en del av det monoklonale antistoffet som fortsatt innehar en funksjonell aktivitet. Denne aktiviteten kan for eksempel være en antigenbindingsaktivitet eller spesifikt en reseptorbindingsaktivitet, en effektorfunksjonsaktivitet og liknende. Monoklonalt antistoffunksjonelle fragmenter inkluderer for eksempel individuelle tunge eller lette kjeder og fragmenter derav, slik som VL, VH og Fd; monovalente fragmenter som Fv, Fab og Fab'; toverdige fragmenter som F(ab')2; enkeltkjede Fv (scFv); og Fc-fragmenter. Slike betegnelser er for eksempel beskrevet av Harlowe og Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989); Molec. Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference (Myers, R. A. (red.), New York; VCH Publisher, Inc.) Huston et al, Cell Biophysics, 22:189-224 (1993); Pluckthun og Skerra, Meth. Enzymol., 178:497-515 (1989) og avDay, E. D., Advanced Immunochemistry, 2. utg., Wiley-Liss, Inc., New York, NY (1990). Betegnelsen funksjonelt fragment er ment å inkludere for eksempel fragmenter produsert ved proteasefordøying eller reduksjon av et monoklonalt antistoff og ved rekombinante DNA-fremgangsmåter, kjent for de med dyktighet i faget.

Betegnelsen "fragment" refererer til et polypeptid omfattende en aminosyresekvens med minst 5, 15, 20, 25, 40, 50, 70, 90, 100 eller flere sammenhengende aminosyrerester av aminosyresekvensen til et annet polypeptid. I en foretrukket utførelsesform bibeholder et fragment av et polypeptid minst én funksjon av fullengde polypeptidet.

Betegnelsen "kimært antistoff" inkluderer monovalente eller polyvalente immunglobuliner. Et monovalent, kimært antistoff er en dimér dannet av en kimært tungkjede assosiert gjennom disulfidbroer med en kimær lettkjede. Et bivalent, kimært antistoff er en tetramer dannet av to tungkjede-lettkjede dimérer som assosieres gjennom minst én disulfidbro. En kimær tungkjede av et antistoff for anvendelse i mennesker omfatter en antigenbindende region avledet fra tungkjeden av et ikkehumant antistoff, forbundet til minst en del av en human tungkjedekonstant region, som CH1 eller CH2. en kimær lettkjede av et ast for anvendelse i mennesker omfatter en antigenbindende region avledet fra lettkjeden av et ikkehumant antistoff, forbundet til minst en del av en human lettkjedekonstant region (CL). Antistoffer, fragmenter eller derivater som har kimære tungkjeder og lettkjeder av den samme eller ulik variabel region bindingsspesifisitet, kan også fremstilles ved hensiktsmessig assosiasjon av de individuelle polypeptidkjedene, i henhold til kjente fremgangsmåtetrinn. Med denne tilnærmingen dyrkes verter som uttrykker kimære, tungkjeder separat fra verter som uttrykker kimære lettkjeder, og immunglobulinkjedene gjenvinnes separat og assosieres deretter. Alternativt kan vertene dyrkes samtidig og kjedene tillatt spontant assosiasjon i dyrkingsmediet, fulgt av gjenvinning av det samlete immunglobulin eller fragment, eller både tung- og lettkj edene kan uttrykkes i den samme vertscellen. Fremgangsmåter for produksjon av kimære antistoffer er kjent i fagfeltet (se for eksempel US 6 284 471; 5 807 715; 4 816 567; og 4816 397).

Betegnelsen "humaniserte" former av ikkehumane (for eksempel murine) antistoffer (dvs. humaniserte antistoffer) er antistoffer som inneholder en minimal sekvens eller ingen sekvens, avledet fra ikke-humant immunglobulin. For det meste er humaniserte antistoffer er humane immunglobuliner (resipient antistoff) der rester fra en hypervariabel region av mottaker erstattes av rester fra en hypervariabel region fra en ikke-human art (donor antistoff) slik som mus, rotte, kanin eller ikke-humane primater som har den ønskete spesifisitet, affinitet og kapasitet. I noen tilfeller erstattes rammeverksregion (FR) rester av det humane immunglobulin med korresponderende ikke-humane rester. Humaniserte antistoffer kan også omfatte rester som ikke er funnet i resipient antistoffet eller i donor antistoffet. Disse modifikasjonene gjøres generelt for ytterligere å foredle antistoffets ytelse. Generelt vil det humaniserte antistoffet omfatte hovedsakelig alle av minst ett, og vanligvis to variable doméner, der alle eller i det vesentlige alle av de hypervariable sløyfene (CDRer) korresponderer til de med et ikke-humant immunglobulin, og alle eller i det vesentlige alle av FR-restene er de av en human immunglobulinsekvens. Det humaniserte antistoffet kan også omfatte minst en del av en immunglobulinkonstantregion (Fc), vanligvis de av et humant immunglobulin. En eksemplarisk fremgangsmåte som anvendes for fremstilling av humaniserte antistoffer er beskrevet i US 5 225 539.

Betegnelsen "immunadhesiv" utpeker antistoffliknende molekyler som kombinerer bindingsdoménet av et heterologt "adhesin" protein (for eksempel en reseptor, ligand eller enzym) med et immunglobulinkonstant doméne. Strukturelt omfatter immunadhesiner en fusjon av adhesin aminosyresekvensen med den ønskete bindingsspesifisiteten som er en annen enn antigengjenkjennings- og bindingssetet (antigen kombinert med sete) av et antistoff (dvs. er "heterologt") med en immunglobulinkonstant doménesekvens.

Betegnelsen "ligandbindingsdoméne" refererer til enhver naturlig reseptor eller derivat derav, som bibeholder minst en kvalitativ ligandbindingsevne med en tilsvarende naturlig reseptor. I visse utførelsesformer er reseptoren fra et celleoverflatepolypeptid som har et ekstracellulært doméne som er homologt med et medlem av immunglobulin supergenfamilien. Andre reseptorer som ikke er medlemmer av immunglobulinsupergenfamilien, men ikke desto mindre spesifikt er dekket av denne definisjonen, er cytokinreseptorer, og særlig reseptorer med tyrosinkinaseaktivitet (reseptor tyrosin kinaser), medlemmer av hematopoietin og nervevekstfaktor reseptorsuperfamilier, og celleadhesjonsmolekyler (for eksempel E-, L- og P-selektiner).

Betegnelsen "reseptorbindingsdoméne" refererer til enhver naturlig ligand for en reseptor, inkludert for eksempel celleadhesjonsmolekyler, eller enhver region eller derivat av slik naturlig ligand som bibeholder minst en kvalitativ reseptorbindingsevne av en korresponderende, naturlig ligand.

Betegnelsen "antistoff-immunadhesin kimær" omfatter et molekyl som kombinerer minst ett bindingsdoméne av et antistoff med minst ett immunadhesin. Eksempler inkluderer, men er ikke begrenset til de bispesifikke CD4-IgGkimærer beskrevet av Berg et al, PNAS (USA), 88:4723-4727 (1991) og Charnow et al, J. Immunol., 153:4268(1994).

Betegnelsen et "isolert" polypeptid er et polypeptid som har blitt identifisert og separert og/eller gjenvunnet fra en komponent fra dets naturlig omgivelse. Forurensende komponenter fra dets naturlige omgivelse er materialer som vil interferere med diagnostiske eller terapeutiske anvendelser for polypeptidet, og kan inkludere enzymer, hormoner og andre proteinholdige eller ikke-proteinholdige løsninger. I visse utførelsesformer er det isolerte polypeptidet renset (1) til mer enn 95 vektprosent av polypeptider, som bestemt ved Lowry fremgangsmåten, og fortrinnsvis til mer enn 99 vektprosent, (2) til en grad tilstrekkelig for å oppnå minst 15 N-terminal rester eller intern aminosyresekvens ved bruk av en "spinning cup" sekvensator, eller (3) til homogenisert ved SDS-PAGE under reduserende eller ikke-reduserende betingelser ved å benytte coomassie blå eller sølv farging. Isolert polypeptid inkluderer polypeptidet in situ i rekombinante celler siden minst én komponent av polypeptidets naturlige omgivelse ikke vil være til stede. Ordinært vil imidlertid et isolert polypeptid bli fremstilt ved minst ett rensetrinn.

Betegnelsen "behandling" refererer til både terapeutisk behandling og profylaktisk eller forebyggende mål. De subjekter eller pasienter med behov for behandling inkluderer de som allerede har forstyrrelsen, så vel som de der forstyrrelsen skal forhindres.

Betegnelsen "forstyrrelse" og "sykdom" anvendes omvekslende for å referere til enhver tilstand som vil ha nytte av et variant polypeptid (et polypeptid omfattende en Fc-regionvariant ifølge oppfinnelsen), inkludert kroniske og akutte forstyrrelser eller sykdommer (for eksempel patologiske tilstander som kan disponere en pasient til en spesiell forstyrrelse. I visse utførelsesformer er forstyrrelsen cancer. I visse utførelsesformer benyttes betegnelsen "autoimmun sykdom" omvekslende med betegnelsen "autoimmun forstyrrelse" for å referere til en tilstand i et subjektkarakterisert vedcellulær-, vev- og/eller organskade forårsaket av en immunologisk reaksjon i subjektet mot dets egne celler, vev og/eller organer. Betegnelsen "inflammatorisk sykdom" benyttes omvekslende med betegnelsen "inflammatorisk forstyrrelse" for å referere til en tilstand i et subjekt,karakterisert vedinflammasjon. Autoimmune tilstander kan, men behøver ikke være assosiert med inflammasjon. Inflammasjon kan, men behøver ikke å være forårsaket av autoimmun forstyrrelse. Visse forstyrrelser kan karakteriseres som både autoimmune og inflammatoriske forstyrrelser.

Betegnelsen "cancer" og "cancerartet" refererer til eller beskriver den fysiologiske tilstanden i pattedyr som vanligvis karakteriseres ved uregulert cellevekst. Eksempler på cancer inkluderer, men er ikke begrenset til karsinom, lymfom, blastom, sarkom og leukemi. Flere spesielle eksempler på slike cancere inkluderer plateepitelcellecancer, småcellelungecancer, ikke-småcellelungecancer, adenokarsinom i lungen, plateepitelkarsinom i lungen, bukhinnecancer, hepatocellulær cancer, gastrointestinal cancer, pankreascancer, glioblastom, livmorhalscancer, ovariecancer, levercancer, urinblærecancer, hepatom, brystcancer, tykktarmscancer, kolorektal cancer, endometrial eller uterinkarsinom, spyttkjertelkarsinom, nyrecancer, prostatacancer, vulvacancer, tyroid cancer, hepatisk karsinom og forskjellige typer av hode og halscancer. Betegnelsen "merke" refererer til en påvisbar forbindelse eller sammensetning som direkte eller indirekte er konjugert til et polypeptid. Merket kan i seg selv være påvisbart (for eksempel radioaktive isotopmerker eller fluorescerende merker) eller i tilfellet av et enzymatisk merke, kan kjemisk endring av en substrat forbindelse eller sammensetning som er påvisbar katalyseres.

Betegnelsen "reseptor" refererer til et polypeptid som er i stand til å binde minst én ligand. Den foretrukne reseptoren er en celleoverflatereseptor eller oppløselig reseptor med et ekstracellulært ligandbindende doméne, og eventuelt andre doméner (for eksempel transmembrane doméner, intracellulært doméne og/eller membrananker). En reseptor som skal vurderes i en prøve beskrevet heri, kan være en intakt reseptor eller et fragment eller derivat derav (for eksempel et fusjonsprotein som omfatter bindingsdoménet til reseptoren som er sammensmeltet til én eller flere heterologe polypeptider). Reseptoren som skal vurderes for sine bindingsegenskaper kan dessuten være til stede i en celle eller være isolert og eventuelt belagt på en analyseplate eller annen fast fase, eller være direkte merket og anvendt som en probe.

Betegnelsen "antistoffreaktiv sykdom" refererer til enhver sykdom eller medisinsk tilstand som viser seg å være mulig å behandle, minst delvis med antistoffterapi. Eksempler på slike sykdommer og medisinske tilstander inkluderer, men er ikke begrenset til lymfom (som er vist å kunne behandles med RITUXAN), infeksjonssykdom (respiratorisk syncytiavirus som er vist å kunne behandles med SYNAGIS), nyretransplantasjon (ZENAPAX er vist å være behjelpelig), Crohns sykdom og reumatoid artritt (vist å kunne behandles med REMICADE), brystkarsinom (vist å kunne behandles med HERCEPTIN), og tykktarmscancer (vist å kunne behandles med EDRECOLOMAB). Betegnelsen "immunadhesiv reaktiv sykdom" refererer til enhver sykdom eller medisinsk tilstand som har vist å kunne behandles, i det minste delvis, med immunadhesin terapi.

Et variant polypeptid som "formidler antistoffavhengig celleformidlet cytotoksisitet (ADCC) i nærvær av humane effektorceller mer effektivt" enn et moder antistoff, slik det anvendes heri, er ett som in vitro eller in vivo er vesentlig mer effektivt i å formidle ADCC, når mengdene av variant polypeptid og moder ast og moder antistoff som anvendes i analysen er i det vesentlige de samme. En slik variant forårsaker for eksempel en større mengde av målcelle lysering i en gitt ADCC analyse enn moder polypeptidet i en identisk ADCC analyse. Slike varianter kan identifiseres ved for eksempel anvendelse av en ADCC analyse, men andre analyser eller fremgangsmåter for bestemmelse av ADCC aktivitet kan også anvendes (for eksempel dyremodeller). I foretrukne utførelsesformer er variant polypeptidet fra omkring 1,2, 1,3 eller 1,4 ganger, 1,5 ganger, 50 ganger, 100 ganger, 500 ganger eller 1000 ganger mer effektivt i å formidle ADCC enn moder polypeptidet.

Betegnelsen "symptomer på en antistoff- eller immunadhesin-reaktiv sykdom" refererer til de symptomer som generelt assosieres med en spesiell sykdom. Symptomene som normalt forbindes med Crohns sykdom inkluderer abdominal smerte, diaré, rektal blødning, vekttap, feber, appetittap, dehydrering, anemi, distensjon, fibrose, tarmbetennelse og feilernæring. Frasen "under tilstander slik at symptomene er redusert" refererer til enhver grad av kvalitativ eller kvantitativ reduksjon av påvisbare symptomer av enhver antistoff- eller immunadhesin-reaktiv sykdom, inkluderer, men er ikke begrenset til en påvisbar innvirkning på helbredelseshastigheten fra sykdom (for eksempel vektøkningshastighet), eller reduksjonen av minst et av symptomene som vanligvis forbindes med den bestemte sykdommen (for eksempel dersom den antistoff- eller immunadhesinresponsive sykdommen var Crohns sykdom, en reduksjon i minst én av de følgende symptomene: Abdominal smerte, diaré, rektal blødning, vekttap, feber, appetittap, dehydrering, anemi, distensjon, fibrose, tarmbetennelse og feilernæring).

Monoklonale antistoffer og reseptorer

Et fullengde antistoff ("Immunglobulin" eller "lg") slik det eksisterer naturlig, er et immunglobulinmolekyl bestående av fire peptidkjeder, to tunge (H) kjeder (omkring 50-70 kDa når fullengde), og to lette (L) kjeder (omkring 25 kDa når fullengde) som er innbyrdes forbundet med disulfidbindinger. Den aminoterminale delen av hver kjede inkluderer en variabel region på omkring 100-110 eller flere aminosyrer som er primært ansvarlige for antigengjenkjenning. Den karboksyterminale del av hver kjede definerer en konstant region som primært er ansvarlig for effektorfunksjon.

Lettkjeder klassifiseres som k eller A, og karakteriseres ved en bestemt konstansregion. Tungkjeder klassifiseres som y, u, a, 8 eller e, og definerer antistoffets isotype henholdsvis som IgG, IgM, IgA, IgD og IgE. Hver tungkjedetype karakteriseres ved en bestemt konstantregion.

Hver tungkjede omfattes av en tungkjedevariabel region (her "HCVR") og en tungkjede konstantregion. Tungkjedekonstantregionen omfattes av tre doméner (CH1, CH2 og CH3) for IgG, IgD og IgA; og fire doméner (CH1, CH2, CH3 og CH4) for IgM og IgE. Hver lettkjede omfattes av en lettkjedevariabelregion (her "LCVR"), og en lettkjedekonstantregion. Lettkjedekonstantregionen omfattes av CL-doménet. HCVR-og LCVR-regionene kan også inndeles i regioner av hypervariabilitet, betegnet komplementaritetsbestemmende regioner (CDR'er), innsatt med regioner som er mer konserverte, betegnet rammeverksregioner (FR). Hver HCVR og LCVR er sammensatt av tre CDR og fire FR, arrangert fra den aminoterminale til den karboksyterminale enden i den følgende rekkefølgen: FRI, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Anvisningen av aminosyrer til hvert doméne er i samsvar med godt kjente konvensjoner [for eksempel Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", National Institutes of Health, Bethesda, Md (1991)]. Et antistoffs funksjonelle evne til å binde et bestemt antigen bestemmes kollektivt av de seks CDRer. Selv et enkelt, variabelt doméne som imidlertid bare omfatter tre CDRer som er spesifikke for et antigen, kan ha evnen til å gjenkjenne og binde antigen, men med en lavere affinitet enn et fullstendig Fab.

Monoklonale antistoffer kan produseres ved for eksempel hybridomteknikker godt kjent i fagfeltet, så vel som rekombinante teknologier, phag display teknologier, syntetiske teknologier eller kombinasjoner av slike teknologier lett kjent i fagfeltet. Betegnelsen "monoklonalt antistoff" er ikke begrenset til antistoffer produsert ved hybridom teknologi. "Monoklonalt antistoff refererer til et antistoff som er avledet fra en enkelt kopi eller klon, inkludert for eksempel enhver eukaryot, prokaryot eller fag-klon, og ikke fremgangsmåten der det produseres. Et "monoklonalt antistoff" kan være et intakt (fullstendig eller fullengde) antistoff, et hovedsakelig intakt antistoff, et funksjonelt fragment av et antistoff, eller det kan være et kimært-, humant- eller humanisert antistoff.

En populasjon av "monoklonale antistoffer" refererer til en homogen eller hovedsakelig homogen (eller ren) antistoffpopulasjon (dvs. minst omkring 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, men mer foretrukket minst omkring 97 % eller 98 %, mest foretrukket minst 99 % av antistoffene i populasjonen er identiske og vil konkurrere i en ELISA analyse for det samme antigen eller epitop.

Betegnelsen "spesifikt binder" eller "fortrinnsvis binder" refererer til situasjonen der ett medlem av et spesifikt bindingspar ikke betydelig binder til andre molekyler enn dets spesifikke bindingspartner(e). betegnelsen er også anvendbar hvor for eksempel et antigenbindende doméne av et antistoff ifølge oppfinnelsen er spesifikt for en bestemt epitop som bæres av en rekke antigener, i det tilfellet vil det spesifikke antistoffet som bærer det antigenbindende doménet være i stand til å binde til de ulike antigener som bærer epitopen.

Fc-regionen refererer til den delen av et intakt antistoff, for eksempel IgG generert ved fordøying med papain enzymet (se figur 1). Fc-regionen er en homodimér der hver kjede omfattes av en del av hengselregionen så vel som CH2- og CH3-doménene. Fc-regionen er en dimér pga. internkjede disulfidbroer som dannes mellom hengselregionene og flere ikke-kovalente bindinger mellom CH3-doménene. IgG er den mest rikelige klassen av lg i kroppen, som utgjør omkring 75 % av det totale immunglobulinet, og distribueres likt innenfor de intra- og ekstravaskulære gruppene. Veldig lite IgG produseres under de tidlige trinnene av primærresponsen til antigen, men er den viktigste form av antistoff som produseres under den sekundære responsen. Slik det er beskrevet ovenfor har antistoffene regioner, primært CH2- og CH3-regionene, som er involvert i ikke-antigenbindingsfunksjoner. Sammen er disse regionene og en del av linkersekvensen generelt kjent som Fc-regionen, og har flere effektorfunksjoner som formidles ved binding av effektormolekyler.

Effektorfunksjoner som formidles av antistoff-Fc-regionen kan inndeles i to grupper: (1) effektorfunksjoner som opererer etter binding av antistoff til et antigen (disse funksjonene involverer for eksempel deltagelse av kompiementkaskaden eller Fc-reseptoren (FcR)-bærende celler); og (2) effektorfunksjoner som opererer uavhengig av antigenbinding (disse funksjoner konfererer for eksempel utholdenhet i sirkulasjonen og evnen til å overføres over cellulære barrierer ved transcytose). Binding av Clq-komponenten av komplement til antistoffer aktiverer for eksempel komplementsystemet. Etter opsonisering er aktivering av komplement viktig i lysis av cellepatogener. Aktiveringen av komplement stimulerer også den inflammatoriske responsen, og kan også være involvert i autoimmun hypersensitivitet. Antistoffer binder også til celler via Fc-regionen med et Fc-reseptor bindingssete på antistoff-Fc-regionen som binder til en FcR på en celle. Mange FcRer er spesifikke for ulike antistoffklasser, inkludert IgG, IgE, IgA og IgM. Mens foreliggende oppfinnelse ikke er begrenset til noen spesifikk mekanisme, utløser binding av antistoff til FcR på celleoverflater en rekke viktige og mangfoldige, biologiske responser, inkludert sluking og destruksjon av antistoffbelagte partikler, fjerning av immunkomplekser, lysis av antistoffbelagte målceller ved dreperceller (ADCC), frigjøring av inflammatoriske formidlere, placental overføring og kontroll av immunglobulinproduksjon.

Flere antistoff effektorfunksjoner formidles av FcR, som binder et antistoffs Fc-region. FcR defineres ved deres spesifisitet for immunglobulin isotyper, Fc-reseptorer for IgG-antistoffer refereres til som FcyR, for IgE som FceR, for IgA som FcaR, og så videre. Tre underklasser av FcyR er identifisert: FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) og FcyRIII (CD 16).

Da hver FcyR underklasse kodes av to eller tre gener, og alternativ RNA-spleising fører til flere transkripter, eksisterer et stort utvalg i FcyR-isoformer. De tre genene som koder FcyRI-underklassen (FcyRIA, FcyRIB og FcyRIC) er klynget sammen i region I q21.1 av den lange armen av kromosom 1; genene som koder FcyRU-isoformer (FcyRIIA, FcyRUB og FcyRIIC) og de to genene som koder FcyRIII (FcyRUIA og FcyRIIIB) er alle sammenklynget i region lq22. Disse forskjellige FcR undertypene uttrykkes på forskjellige celletyper (se for eksempel Ravetch og Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-492 (1991)). I mennesker er FcyRIUB funnet bare på nøytrofiler, mens FcyRIII A er funnet på makrofager, monocytter, NK-celler og en underpopulasjon av T-celler. Særlig FcyRIIIA er til stede på NK-celler, som er en av celletypene som er innblandet i ADCC.

Human FcyRIIIA (CD16) reseptor har en alminnelig polymorfisme i posisjon 158 i sitt ekstracellulære doméne som koder enten en fenylalanin eller valin i denne posisjon. V-allelet av FcyRIIIA har en høyere affinitet til humant IgG enn F-allelet. VI 58-allelet formidler også ADCC mer effektivt. Kliniske data viser en sammenheng mellom genotypen av FcyRIIIA-reseptor i pasienter som gjennomgår Rituxan-behandling og terapeutisk respons. Både kliniske og molekylære responser og tid til progresjon ble vist å være overlegne i pasienter som er homozygot for FcyRIIIA-158V genotypen (omkring 20 % av populasjonen). I motsetning til dette responderer heterozygote eller homozygote pasienter dårligere for den lavere affinitets FcyRIIIA-158F genotypen (omkring 80 % av populasjonen). Disse dataene antyder at Fc-mutasjoner som forsterker ADCC-aktivitet til bærerne av 158F kan forsterke den kliniske virkeevnen til antistoffbasert cancerterapi. En genetisk polymorfisme er også til stede i human FcyRIIA (CD32) reseptor i posisjon 131 i dens ekstracellulære doméne som enten koder for et histidin (H) eller arginin (R) i denne posisjonen. Polymorfismen i posisjon 131 er funnet å påvirke dens evne til å binde til humant IgG. Nyere data viser også en sammenheng mellom FcyRIIA i posisjon 131 polymorfismen og klinisk respons til Rituxan. Pasienter som er homozygote for Hl31-allelet hadde betydelig høyere responshastighet i forhold til de andre to gruppene.

FcyRI, FcyRII og FcyRIII er immunglobulinsuperfamilie (IgSF) reseptorer; FcyRI har tre IgSF-doméner i sitt ekstracellulære doméne, mens FcyRII og FcyRIII bare har to IgSF-doméner i sine ekstracellulære doméner. En annen type Fc-reseptorer er den neonatale Fc-reseptoren (FcRn). FcRn er strukturelt lik det viktige histokompabilitetskomplekset (MHC), og består av en a-kjede ikke-kovalent bundet til P2-mikroglobulin.

Fc-regionvarianter

Foreliggende beskrivelse tilveiebringer variant polypeptider, nukleinsyresekvenser som koder variant polypeptidene og fremgangsmåter for å generere variant polypeptider. Variant polypeptidene ifølge foreliggende beskrivelse er fortrinnsvis forskjellige fra et moderpolypeptid med minst én aminosyremodifikasjon, fortrinnsvis en aminosyresubstitusjon. Et "moder"-, "villtype"-, "utgangs"- eller "ikke-variant"-polypeptid omfatter fortrinnsvis minst en del av et antistoff Fc-region, og aminosyresubstitusj onen i polypeptidvarianten forekommer innenfor Fc-regionen. et moderpolypeptid omfattende en Fc-region kan fremstilles ved anvendelse av teknikker tilgjengelige i fagfeltet for å generere polypeptider omfattende en Fc-region eller del derav, i foretrukne utførelsesformer er moderpolypeptidet et antistoff. Moderpolypeptidet kan imidlertid være ethvert annet polypeptid omfattende minst én del av en Fc-region (for eksempel et immunadhesin). Fc-regiondelen i moderpolypeptidet kan være en naturlig eller en unaturlig sekvens, fortrinnsvis er den en naturlig sekvens av human opprinnelse. I bestemte utførelsesformer kan en Fc-regionvariant genereres (for eksempel i henhold til fremgangsmåtene angitt heri) og kan fusjoneres til et heterologt polypeptid etter ønske, slik som et antistoffvariabelt doméne eller bindingsdoméne av en reseptor eller ligand, eller ethvert terapeutisk polypeptid.

I foretrukne utførelsesformer omfatter moderpolypeptidet en Fc-region eller en funksjonell del derav. Generelt vil Fc-regionen av moderpolypeptidet omfatte en naturlig sekvens Fc-region, og fortrinnsvis en human, naturlig sekvens Fc-region. Fc-regionen av moderpolypeptidet kan imidlertid ha én eller flere forhåndseksisterende aminosyresekvensendringer eller -modifikasjoner (for eksempel en aminosyresubstitusjon) fra en naturlig sekvens Fc-region. Clq-bindingsaktiviteten av Fc-regionen kan for eksempel tidligere ha blitt endret, eller FcyR-bindingsaffiniteten av Fc-regionen kan ha blitt endret. Den ønskete Fc-regionvarianten eller nukleinsyren som koder Fc-regionvarianten av interesse kan konstrueres, mens den ikke er festet til den ønskete fusjonspartneren av Fc-regionvarianten (for eksempel en antistoffvariabel region, et heterologt protein), og så deretter konstruert for å bli operabelt festet dertil. I ytterligere utførelsesformer er moderpolypeptid-Fc-regionen begrepsmessig (for eksempel mentalt tenkt eller en visuell representasjon på en datamaskin eller på papir) og, mens dette ikke fysisk eksisterer, kan den som konstruerer antistoffet bestemme en ønsket Fc-region-aminosyresekvensvariant og generere et polypeptid omfattende den sekvensen eller et DNA som koder den ønskete Fc-region-aminosyresekvensen. I foretrukne utførelsesformer er imidlertid en nukleinsyre tilgjengelig som koder en Fc-region av et moderpolypeptid, og denne nukleinsyresekvensen er endret for å generere en nukleinsyresekvensvariant som koder Fc-regionvarianten.

Nukleinsyre som koder en variant av moderpolypeptidet (eller simpelthen en variant Fc-region) kan fremstilles ved fremgangsmåter kjent i fagfeltet ved å benytte veiledningen av den foreliggende spesifikasjonen for bestemte sekvenser. Disse fremgangsmåtene inkluderer, men er ikke begrenset til fremstilling ved setestyrt (eller oligonukleotidformidlet) mutagenese. PCR-mutagenese (for eksempel Vallette et al, Nuc. Acids Res., 17:723:733 (1989), og kassett mutagenese (for eksempel Wells et al, Gene, 34:315-323 (1985) av en tidligere fremstilt nukleinsyre som koder polypeptidet. Setestyrt mutagenese er en foretrukket fremgangsmåte for å fremstille varianter. Denne teknikken er godt kjent i fagfeltet (se for eksempel Carter et al, Nucleic Acids Res., 13:4431-4443 (1985) og Kunkel et al, Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 82:488 (1987)).

Alternativt eller i tillegg kan den ønskete aminosyresekvensen som koder en polypeptidvariant bestemmes, og en nukleinsyresekvens som koder en slik aminosyresekvens av polypeptidvarianten (dvs. polypeptid omfattende en Fc-regionvariant omfattende en aminosyresubstitusjon som beskrevet heri) genereres syntetisk. Dette er fortsatt betraktet å være en Fc-regionvariant av en moder-Fc-region, selv om moder-Fc-regionen ikke var den molekylære forløperen av Fc-regionvarianten, men i stedet var aminosyresekvensen av Fc-regionen til stede i modermolekylet i fravær av den ønskete aminosyresubstitusj onen.

Aminosyresekvensen av moderpolypeptidet kan modifiseres for å generere en Fc-regionvariant med endret Fc-reseptorbindingsaffinitet eller aktivitet in vitro og/eller in vivo; og/eller endret ADCC-aktivitet in vitro og/eller in vivo; og/eller endret CDC-aktivitet in vitro og/eller in vivo. Aminosyresekvensen av moderpolypeptidet kan også modifiseres for å generere en Fc-regionvariant med endrete

komplementbindingsegenskaper og/eller sirkulasjonshalveringstid.

Vesentlige modifikasjoner i de biologiske egenskapene til Fc-regionen kan gjennomføres ved å velge aminosyresubstitusjoner som avviker betydelig i sine effekter ved endring av (a) strukturen av polypeptidets ryggrad i substitusjonsområdet, for eksempel som et ark av spiralformet konformasjon, (b) ladningen eller hydrofobisiteten av molekylet ved målsetet, eller størrelsen av sidekjeden, (d) interaksjon med karbohydrat, eller (e) fleksibilitet av doménebevegelse. Naturlig forekommende rester inndeles i klasser basert på vanlige sidekjedeegenskaper: (1) hydrofobe: norleusin, met, ala, val, leu, ile; (2) nøytralt hydrofile: cys, ser, thr; (3) sure: asp, glu; (4) basiske: asn, gin, his, lys, arg;

(5) rester som påvirker kjedeorientering: gly, pro; og

(6) aromatiske: trp, tyr, phe.

Ikke-konservative substitusjoner vil medføre utbytting av et medlem fra én av disse klasser til et medlem av en annen klasse. Konservative substitusjoner vil medføre utbytting av et medlem fra én av disse klasser til et annet medlem fra den samme klassen.

Som det vises i eksemplene nedenfor, kan det konstrueres en Fc-regionvariant med endret aktivitet (effektorfunksjon(er) og/eller farmakokinetikker). Modifikasjon av én eller flere aminosyrerester i Fc-regionen kan for eksempel utføres for å endre (for eksempel øke eller redusere) ADCC-aktivitet eller CDC-aktivitet eller FcRn bindingsaffinitet. I foretrukne utførelsesformer er en modifikasjon en substitusjon som opplistet i Tabell 1 heri. Generelt gjøres en aminosyresubstitusjon ved én eller flere av Fc-regionrestene identifisert her som å påvirke ADCC-aktivitet for å generere en slik Fc-regionvariant. I foretrukne utførelsesformer blir ikke mer enn én til omkring ti Fc-regionrester substituert. Fc-regionene heri omfatter én eller flere aminosyresubstitusjoner vil fortrinnsvis beholde minst omkring 80 %, og fortrinnsvis minst omkring 90 %, mest foretrukket minst omkring 95 % av moder Fc-regionsekvensen eller av en naturlig, human Fc-regionsekvens.

Ved å introdusere passende aminosyresubstitusj on(er) i moder Fc-region, kan det genereres en Fc-regionvariant som (når sammenliknet med moder Fc-regionen) (a) formidler ADCC i nærvær av humane effektorceller mer eller mindre effektivt og/eller (b) formidler CDC i nærvær av humant komplement mer eller mindre effektivt og/eller (c) binder Clq med ønsket affinitet og/eller (d) binder en Fcy-reseptor (FcyR) eller Fc-neonatal reseptor (FcRn) med ønsket affinitet. Slike Fc-regionvarianter omfatter generelt minst en aminosyremodifikasjon i Fc-regionen. Fortrinnsvis er modifikasjonen en aminosyresubstitusjon, mer foretrukket er den en aminosyresubstitusjon som opplistet i tabellene 1-9 heri.

I foretrukne utførelsesformer er moderpolypeptid-Fc-regionen en human Fc-region eller funksjonelt fragment derav, for eksempel en naturlig human Fc-region humant IgGl (f og a,z allotyper), IgG2, IgG3, IgG4 og alle allotyper som er kjent eller oppdaget fra enhver art. slike regioner har naturlige sekvenser som for eksempel de som er vist i figur 2 (SEQ ID NO: 1 til 8), og figur (SEQ ID NO: 9 til 12) heri.

I visse utførelsesformer, for å generere en Fc-regionvariant med forsterket ADCC-aktivitet, har moderpolypeptidet fortrinnsvis en på forhånd eksisterende ADCC-aktivitet (for eksempel omfatter moderpolypeptidet en human IgGl - eller human IgG3-Fc-region). I noen utførelsesformer har en variant forsterket ADCC-aktivitet (for eksempel større nivåer sammenliknet med modermolekylet i henhold til en ADCC-test, beskrevet heri), sammenliknet moderpolypeptidet, dvs. et monoklonalt antistoff omfattende at Fc-regionvarianten har forsterket ADCC-aktivitet, sammenliknet under identiske forhold til et monoklonalt antistoff omfattende moder-Fc-regionen eller en naturlig IgGl eller IgG3 Fc-regionsekvens, men på annen måte identisk til det monoklonale antistoffet som omfatter Fc-regionvarianten.

I foretrukne utførelsesformer introduseres aminosyresubstitusj on(er) i CH2- og/eller CH3-doménene av en Fc-region. I foretrukne utførelsesformer omfatter moder-Fc-regionen, som anvendes som templat for å generere slike varianter, en human IgG-Fc-region.

For å generere en Fc-regionvariant med forsterket CDC-aktivitet, har moderpolypeptidet i visse utførelsesformer fortrinnsvis en forhåndseksisterende CDC-aktivitet. I noen utførelsesformer har en variant forsterket CDC-aktivitet (for eksempel høyere nivåer sammenliknet med modermolekylet i henhold til en CDC-test beskrevet heri) sammenliknet med moderpolypeptidet, dvs. et monoklonalt antistoff omfattende Fc-regionvarianten har forsterket CDC-aktivitet sammenliknet under identiske forhold til et monoklonalt antistoff omfattende moder-Fc-regionen eller en naturlig IgGl- eller IgG3-Fc-regionsekvens, men på annen identisk til det monoklonale antistoffet som omfatter Fc-regionvarianten.

Polypeptidvariantene beskrevet heri kan underkastes ytterligere modifikasjoner, avhengig av ønsket eller tiltenkt anvendelse av polypeptidet. Slike modifikasjoner kan for eksempel involvere ytterligere endring av aminosyresekvensen (substitusjon, innsetting og/eller sletting av aminosyrerester), karbohydratmodifikasjoner, fusjon til heterologe polypeptid(er) og/eller kovalente modifikasjoner. Slike ytterligere modifikasjoner kan gjøres før, samtidig eller etter aminosyremodiifkasjonen(e) angitt heri, som resulterer i en endring av Fc-reseptorbinding og/eller ADCC-aktivitet og/eller CDC-aktivitet.

Alternativt eller i tillegg kan det være nyttig å kombinere aminosyresubstitusjoner med én eller flere ytterligere aminosyresubstitusjoner som endrer Clq-binding og/eller CDC-funksjon av Fc-regionen. Utgangspolypeptidet kan for eksempel være ute av stand til å binde til Clq og/eller formidle CDC, og kan modifiseres i henhold til lærdommen heri, slik at disse ytterligere effektorfunksjoner oppnås. Polypeptider med forhåndseksisterende Clq-bindigsaktivitet, som eventuelt ytterligere har evnen til å formidle CDC, kan dessuten modifiseres slik at én eller begge disse aktiviteter forsterkes (eller alternativt reduseres). Visse Fc-region aminosyremodifikasjoner som endrer Clq-binding og/eller modifiserer CDC-aktivitet er beskrevet heri (se tabell 2, 7, 8 og 10), og for eksempel WO0042072.

Som angitt ovenfor kan en Fc-region eller del derav konstrueres som har endret effektorfunksjon, for eksempel ved å modifisere CDC-aktivitet og/eller ADCC-aktivitet. For eksempel kan en Fc-regionvariant med forbedret CDC- og ADCC-aktivitet genereres. Alternativt, der en effektorfunksjon ønskes redusert eller fjernet, kan det konstrueres en Fc-regionvariant med redusert CDC-aktivitet og/eller redusert ADCC-aktivitet. I andre utførelsesformer kan bare en av disse aktivitetene økes, og eventuelt også redusere den andre aktiviteten, for eksempel å generere en Fc-regionvariant med forbedret ADCC-aktivitet, men redusert CDC-aktivitet, og omvendt. Det kan konstrueres en Fc-regionvariant med modifisert bindingsaffinitet til FcRn, protein A og/eller andre Fc-bindingsproteiner.

I noen utførelsesformer tilveiebringer foreliggende beskrivelse sammensetninger omfattende en variant av et moderpolypeptid, hvori moderpolypeptidet omfatter en Fc-region (eller del derav) og hvori varianten omfatter minst en overflaterest aminosyremodifikasjon i Fc-regionen (se for eksempel Deisenhofer, Biochemistry, 20:2361-70, april 1981, og WO0042072). I alternative utførelsesformer tilveiebringer foreliggende beskrivelse sammensetninger omfattende en variant polypeptid med en Fc-region, hvori varianten omfatter minst én ikke-overlfaterest aminosyremodifikasjon i Fc-regionen. I ytterligere utførelsesformer omfatter foreliggende beskrivelsen en variant av et moderpolypeptid med en Fc-region der varianten omfatter minst en overflate aminosyremodifikasjon og minst én ikke-overflate aminosyremodifikasjon, begge i Fc-regionen.

Kombinasj onsvarianter

I noen utførelsesformer omfatter en Fc-regionvariant to eller flere aminosyremodifikasjoner (for eksempel substitusjoner). Slike kombinasj onsvarianter kan for eksempel produseres ved å velge to eller flere av aminosyresubstitusj onene beskrevet ovenfor (se for eksempel Tabell 1), eller én eller flere aminosyresubstitusjoner som opplistet i Tabell 1, i tillegg til en substitusjon kjent i fagfeltet.

Kombinasj onsvariantene vist i Tabell 10 og andre kombinasj onsvarianter (slik som de substitusjonene angitt i WO0042072 anvender i kombinasjon med de angitt heri) kan analyseres for en gitt aktivitet (for eksempel FcRn-bindingsaktivitet, ADCC-aktivitet og CDC-aktivitet) i en rekke analyser (se eksempler nedenfor). Med hensyn til dette kan nyttige kombinasj onsvarianter identifiseres.

I visse foretrukne utførelsesformer har de mange aminosyresubstitusjoner som er til stede i en Fc-regionvariant en aminosyresubstitusjon som øker ADCC-aktivitet, og en aminosyresubstitusjon som øker neonatal Fc-reseptor (FcRn) bindingsaffinitet (for eksempel ved pH 6,0) av polypeptidet som omfatter Fc-regionvarianten. I andre utførelsesformer har kombinasj onsvariantene én overflateaminosyre i en Fc-regionvariant ifølge foreliggende oppfinnelse, og én ikke-overflate aminosyremodifikasjon. Ytterligere kombinasj onsvarianter i Fc-regionvariantene ifølge foreliggende oppfinnelse kan genereres ved å kombinere to eller flere av aminosyresubstitusj onene beskrevet heri, eller minst én av aminosyresubstitusj onene beskrevet heri med de som er beskrevet i for eksempel WO0042072.

Polypeptidvariant analyser

Foreliggende beskrivelse tilveiebringer forskjellige analyser for å screene Fc-regionvariantpolypeptider omfattende en Fc-regionvariant. Screeningsanalyser kan anvendes for å finne eller bekrefte nyttige varianter. Kombinasj onsvarianter (se for eksempel tabell 10), kan for eksempel screenes for å finne varianter med endret FcR-binding, og/eller endret ADCC- og/eller endret CDC-aktivitet (for eksempel øket eller redusert ADCC- eller CDC-aktivitet) og/eller modifisert evne til å utarme målceller (for eksempel B-celler) fra helblod. Som beskrevet nedenfor kan også analysene anvendes for å finne eller bekrefte varianter som har nytte av terapeutisk aktivitet i et subjekt (for eksempel et menneske med symptomer på en antistoff- eller immunadhesin-responsiv sykdom). En rekke analysetyper kan anvendes for å evaluere enhver endring i en variant, sammenliknet med moderpolypeptidet (screeningsanalyser er gitt, for eksempel i WO0042072). Ytterligere analyseeksempler er beskrevet nedenfor.

I foretrukne utførelsesformer er en polypeptidvariant (for eksempel polypeptid omfattende en Fc-regionvariant, eller en funksjonell del derav) et monoklonalt antistoff som i det vesentlige beholder evnen til å spesifikt binde et antigen (via en umodifisert eller modifisert antigenbindende region), sammenliknet med moderpolypeptidet (for eksempel er bindingsevnen fortrinnsvis mindre enn 20 ganger, 10 ganger, 7 ganger eller mindre enn omkring 5 ganger enn den av moderpolypeptidet). Polypeptidvariantens bindingsevne til antigen kan bestemmes med teknikker som ELISA, fluorescensaktivert cellesorterings (FACS) analyser, eller radioimmunopresipitering (RIA), for eksempel kan FcR-bindingsanalyser anvendes for å evaluere variantene ifølge foreliggende oppfinnelse. Binding av Fc-reseptorer som FcyRI, FcyRUa, FcyRIJb, FcyRIII, FcRn og så videre, kan måles ved å tritere en polypeptidvariant og måle bundet polypeptidvariant ved å bruke et antistoff som binder til polypeptidvarianten i et ELIS A-format (se Eksempler nedenfor). En variant som omfatter et antistoff kan screenes i en standard ELISA-analyse for å bestemme binding til et FcRn ved pH 6,0 og pH 7,0 eller pH 7,4. En fast overflate belagt med streptavidin eller neutravidin kan anvendes for å fange biotinmerket FcRn fra enhver art, slik som mus eller menneske. Etter blokkering kan innfangingsreseptoren inkuberes med polypeptidvarianter (for eksempel antistoffer) fortynnet i buffere ved pH 6,0 eller pH 7,0.1 det påfølgende trinnet tilsettes et molekyl som er spesifikt for humane antistoffer (for eksempel geite (Fab')2antihumant-Fab konjugert til et enzym). Deretter kan et substrat tilsettes for å bestemme bindingsmengden av polypeptidvarianten til det immobiliserte FcRn med pH 6,0 eller pH 7,0 eller pH 7,4. Dette analyseresultatet kan så sammenliknes med moder (ikke-variant) polypeptidets evne til å binde det samme FcR. I andre foretrukne utførelsesformer er komponentene som utfører en ELISA (for eksempel med FcRn) for å screene varianter, pakket i et sett (for eksempel med instruksjoner for anvendelse).

En ADCC-analyse kan også utføres for å screene variantene. ADCC-analyser kan utføres in vitro eller in vivo. For å bestemme ADCC-aktivitet av en polypeptidvariant på in vitro, kan ADCC-analyse utføres ved anvendelse av forskjellige forhold mellom effektor og mål. En eksemplarisk ADCC-analyse kan anvende en målcellelinje som uttrykker hvilken som helst av de følgende målantigener: CD20, CD22, CD33, CD40, CD63, EGF-reseptor, her-2 reseptor, prostata spesifikk membran antigen, Lewis Y karbohydrat, GD2 og GD3 gangliosider, lamp-i, CO-029, L6 og ephA2. Effektorceller kan oppnås fra en frisk donor (for eksempel på eksperimentdagen) og PBMC renset med Histopaque (Sigma). Målceller forhåndsinkuberes med et IgG omfattende en Fc-regionvariant ifølge oppfinnelsen ved for eksempel 0,1-1,000 ng/ml i omkring 30 minutter før blanding med effektorceller ved effektor:mål forhold på for eksempel 40:1, 20:1 og 10:1. ADCC-aktivitet kan så måles kolorimetrisk med et Cytotoxicity Detection Kit (Roche Molecular Biochemicals) for kvantitering av celledød og lysis basert på målingen av laktat dehydrogenase (LDH) aktivitet frigjort fra cytosol i ødelagte celler i supernatanten. ADCC-aktivitet kan også måles for krom målcelleanalyser ved å måle det resulterende frigjorte krom 51. antistoffuavhengig cellulær cytotoksisitet kan bestemmes ved å måle LDH-aktivitet fra mål- og effektorceller i fravær av antistoff. Fullstendig frigivelse kan måles etter tilsetting av 1 % Triton X-100 til blandingen av mål- og effektorceller. Inkubasjon av mål- og effektorceller kan utføres for en optimalisert tidsperiode (0,54 - 18 timer) i 37 °C i 5,0 % CO2, og så sentrifugere analyseplatene. Supernatantene kan så overføres til 96-brønns plater og inkuberes med LDH-påvisningsreagens i 30 minutter i 25 °C. Absorbansprøven kan så måles ved 490 nm med en mikroplateleser. Den cytotoksiske prosenten kan da beregnes ved å bruke likningen: % cytotoksisitet = eksperimentell verdi - lav kontroll/ høy kontroll- lav kontroll x 100 %. Prosent cytotoksisitet av anti-CD20 og varianter kan så sammenliknes direkte med lik mengde RITUXAN for å få en måling av den relative effektiviteten. En eksemplarisk ADCC-analyse kan anvende SKW6.4-celler som overuttrykker CD20 antigenet (for eksempel innkjøpt fra American Type Culture Collection) som kilde for målceller. Mange varianter av denne analysen er kjent i fagfeltet (for eksempel Zuckerman et al., CRC Crit. Rev. Microbiol, 1978; 7(1): 1-26).

Nyttige effektorceller for slik analyse inkluderer uten begrensning, NK-celler, makrofager og andre PBMC. Alternativt eller ytterligere kan ADCC-aktivitet av polypeptidvariantene ifølge foreliggende oppfinnelse bestemmes in vivo, for eksempel i en dyremodell, slik som angitt i Clynes et al, PNAS (USA) 95:652-656 (1998)).

Variantene kan også screenes for komplementaktivering. For å bestemme komplementaktivering kan en CDC-analyse utføres (se for eksempel Gazzano-Santoro et al, J. Immunol. Methods, 202:163 (1996)). Ulike konsentrasjoner av polypeptidvarianten og humant komplement kan for eksempel fortynnes med buffer. Celler som uttrykker antigenet som polypeptidvarianten binder til, kan fortynnes til en tetthet på 1 x IO<6>celler/ml. Blandinger av polypeptidvariant, fortynnet humant komplement og celler som uttrykker antigenet kan tilsettes til en flatbunnet 96-brønns plate med vevskultur, og inkuberes i 2 timer i 37 °C og med 5 % CO2for å forenkle komplementformidlet cellelysis. 50 ml alamarblått (Accumed International) kan så tilsettes hver brønn, og inkuberes over natten i 37 °C. Absorbansen kan måles med et 96-brønns fluorimeter med stimulering ved 530 nm og emisjon ved 590 nm. Resultatene kan så uttrykkes i relative fluorescensenheter (RFU). Konsentrasjonen i prøven kan så beregnes fra en standard kurve, og prosentvis aktivitet sammenliknet med ikkevariant-polypeptid kan rapporteres for polypeptidvarianten av interesse.

I visse utførelsesformer aktiverer ikke polypeptidvarianter komplement, eller aktiverer komplement dårlig. En polypeptidvariant viser for eksempel omkring 0-10 % CDC-aktivitet i denne analysen, sammenliknet med et kontrollantistoff som har en ikke-mutert IgGl Fc-region. Fortrinnsvis synes ikke varianten å ha CDC-aktivitet (for eksempel over bakgrunn) i CDC-analysen ovenfor. I andre utførelsesformer er en polypeptidvariant ifølge foreliggende oppfinnelse funnet å ha forsterket CDC sammenliknet med et moderpolypeptid (for eksempel som fremviser omkring 1,1, 1,5, 1,7 eller 2 ganger, til omkring 100 ganger (eller mer) forsterkning i CDC-aktivitet in vitro eller in vivo når IC50verdier sammenliknes).

Polypeptidvarianter kan også screenes for utarming av målceller i en helblodanalyse. Ulike konsentrasjoner av polypeptidvarianten med CD20 målspesifisitet kan for eksempel screenes for utarming av B-celler i en helblodanalyse ved anvendelse av facs (Vugmeyster et al, 2003, Cytometry 52A, 101-109). Frisktappet blod inkuberes med forskjellige konsentrasjoner av polypeptidvariant i 37 °C og med 5 % CO2i 4 timer (tiden kan varieres). Etter inkubasjon lyseres røde blodceller i henhold til produsentens retningslinjer med et ammoniumkloridreagens (Beckton-Dickinson kat. nr. 555899) og B-celler påvises ved facs som anvender et fluorescensmerket antistoff spesifikt for B-celler (for eksempel anti-CD19). Resultatene kan uttrykkes som prosent utarming av B-celler relativt til enten behandlet eller ubehandlet prøve, eller en prøve inkubert med et irrelevant (ikke utarmende) antistoff.

I foretrukne utførelsesformer utarmer en polypeptidvariant B-celler mer effektivt enn moderpolypeptidet. En polypeptidvariant kan utarme B-celler, for eksempel til omkring to ganger eller i større grad enn moderpolypeptidet, og fortrinnsvis omkring fem ganger eller mer. En variant kan også fremvise større kraft i å utarme B-celler, den kan for eksempel utarme den samme prosentvise del av B-celler relativt til moderpolypeptidet, men anvender omkring fem ganger mindre antistoff, fortrinnsvis ti ganger mindre antistoff. Målcelleutarming formidlet av varianter kan være omkring 2-, 3-, 5- til omkring 1000 ganger større, og fortrinnsvis fra omkring 5 ganger til omkring 1000 ganger forbedret, sammenliknet med moderpolypeptidet.

Variantene kan også screenes in vivo. Enhver type in vivo analyse kan anvendes. Et spesielt eksempel på en analysetype er gitt nedenfor. Dette analyseeksemplet tillater preklinisk evaluering av Fc-varianter in vivo. En variant som skal testes kan innlemmes i Fc-regionen til et spesifikt antistoff, som er kjent for å ha noe aktivitet. En variant kan for eksempel innlemmes i Fc-regionen til et anti-CD20 IgG ved mutagenese. Dette tillater en moder IgG og Fc-variant IgG å direkte bli sammenliknet med RITUXAN (kjent for å promotere tumorregresjon). Den prekliniske evalueringen kan gjøres i to faser (en farmakokinetisk og farmakodynamisk fase). Målet for fase I av de farmakokinetiske studiene er å bestemme om det er ulikheter i rensehastigheten mellom en Fc-variant IgG og antistoffet med kjent in vivo aktivitet (for eksempel RITUXAN). Ulikheter i rensehastigheten kan forårsake ulikheter i det stabile nivået av IgG i serum. Om slike forskjeller påvises i de stabile konsentrasjonene, må de normaliseres for å muliggjøre nøyaktige sammenlikninger. Målet for fase II farmakodynamiske studier er å bestemme innvirkningen på Fc-mutasjoner ved tumorvekst, i dette tilfellet. Tidligere studier med RITUXAN anvendte en enkelt dose som fullstendig inhiberte tumorvekst. Da dette ikke tillater måling av kvantitative forskjeller, bør en størrelsesdosering anvendes.

Fase I farmakokinetisk sammenlikning av en Fc-variant, villtype moder-Fc og RITUXAN kan utføres ved for eksempel den følgende måte: Først kan 40 ug (eller annen dose som skal testes) injiseres intravenøst i hvert dyr, og plasmanivået av IgG kvantitert ved 0, 0,25, 0,5, 1, 24, 48, 72, 96, 120, 168 og 336 timer. Dataene kan tilpasses for eksempel ved bruk av et farmakokinetisk program (WinNonLin) som anvender en null forsinkelses toroms farmakokinetisk modell for å oppnå rensingshastigheten. Rensehastigheten kan anvendes for å definere stabiltilstanden av plasmanivå med den følgende likningen: C = dose/rensehastighet x T), der T er intervallet mellom doser, og C er plasmanivået ved stabiltilstand. Farmakokinetiske eksperimenter kan utføres i ikke-tumorbærende mus med for eksempel minimum fem mus pr. tidspunkt.

Et eksempel på en dyremodell kan anvendes for den neste fasen på følgende måte. Høyre flanke på CB17-SCK) mus kan implanteres med IO<6>Rajiceller subkutant. Intravenøs bolus av Fc-antistoffvarianten, villtype Fc-antistoff og RITUXAN kan begynne straks etter implantasjon og fortsette inntil tumorstørrelsen har større diameter enn 2 cm. Tumorvolum kan bestemmes hver mandag, onsdag og fredag ved å måle lengde, bredde og dybde på tumoren ved bruk av en kalibreringsmål (tumorvolum = L x B x D). En avmerking av tumorvolum versus tid vil gi tumorveksthastighet for den farmakodynamiske beregningen. Det bør brukes minst 10 dyr i hver gruppe.

Fase II farmakodynamisk sammenlikning av Fc-antistoffvarianten, villtype Fc-antistoff og RITUXAN kan utføres på følgende måte. Basert på offentlige data inhiberte RITUXAN med 10 ug/g ukentlig tumorvekst fullstendig in vivo (Clynes et al., Nat. Med., 6:443-446, 2000). Derfor kan en ukentlig dose testes som er i området på 10 ug/g, 5 ug/g, 1 ug/g, 0,5 ug/g og 0 ug/g. Det stabile plasmanivået der tumorveksthastighet inhiberes med 50 % kan grafisk bestemmes ved forholdet mellom stabilt plasmanivå og effektivitet. Det stabile plasmanivå kan beregnes som beskrevet ovenfor. Om nødvendig kan x justeres i henhold til hver Fc-antistoffvariant og villtype Fc-antistoff, avhengig av deres farmakokinetiske egenskaper for å oppnå sammenliknbar stabilt plasmanivå som RITUXAN. Statistisk forbedrete farmakodynamiske verdier av Fc-antistoffvarianten i sammenlikning med moderpolypeptidet (for eksempel villtype Fc-antistoff) og RITUXAN, vil generelt angi at den Fc-antistoffvarianten konfererer forbedret aktivitet in vivo.

Ytterligere farmakokinetisk sammenlikning av Fc-antistoffvarianter, villtype Fc-antistoffer og RITUXAN kan utføres i cynomologe aper, som beskrevet tidligere (Reff et al., Blood, 83:435-445, 1994). En doserespons for utarming av perifere B-celler og lymfeknute B-celler kan anvendes for å sammenlikne den relative styrken til Fc-variantene med villtype-Fc og RITUXAN, tilført intravenøst og/eller subkutant. Statistisk forbedrete farmakodynamiske verdier av Fc-varianten, sammenliknet med moderpolypeptidet (for eksempel Fc-villtype) og RITUXAN, vil generelt angi at Fc-antistoffvarianten konfererer forbedret aktivitet in vivo.

I ytterligere utførelsesformer screenes variantene (dvs. polypeptid omfattende en Fc-regionvariant ifølge oppfinnelsen, eller en funksjonell del derav), slik at variantene som er nyttige for terapeutisk anvendelse i minst to arter identifiseres. Slike varianter refereres til heri som "dobbel-art forbedrete varianter", og er spesielt nyttige for å identifisere varianter som terapeutiske i mennesker, og som også demonstrerer (eller sannsynligvis kan demonstrere) virkeevne i en dyremodell. Med hensyn til dette tilveiebringer foreliggende oppfinnelse fremgangsmåter for å identifisere varianter som har en stor sjanse til å bli godkjent for human, klinisk utprøving, fordi dyremodelldata sannsynligvis vil støtte enhver human utprøvingssøknad som gjøres til styresmaktens reguleringsdepartementer (for eksempel US Food and Drug Administration).

I visse utførelsesformer identifiseres dobbel-art forbedrete varianter ved først å utføre en ADCC-analyse ved bruk av humane effektorceller for å finne forbedrete varianter, og så utføre en andre ADCC-analyse ved å bruke muse-, rotte- eller ikke-humane primateffektorceller for å identifisere et sub-sett av de forbedrete variantene som er dobbel-art forbedrete varianter. I noen utførelsesformer tilveiebringer foreliggende beskrivelse fremgangsmåter for å identifisere dobbel-art forbedrete varianter, omfattende a) å tilveiebringe: i) målceller, ii) en sammensetning omfattende en variantkandidat av et moderpolypeptid som minst har en del av en Fc-region, hvor variantkandidaten omfatter minst en aminosyresubstitusjon i Fc-regionen, og hvor variantkandidaten formidler målcellecytotoksisitet i nærvær av en første art (for eksempel menneske) av effektorceller mer effektivt enn moderpolypeptidet, og iii) andre arter (for eksempel mus, rotte eller ikke-human primat) effektorceller, og b) inkubering av sammensetningen med målcellene under betingelser slik at variantkandidaten binder målcellene, som derved genererer variantkandidatbunde målceller, c) blanding av effektorceller fra den andre artens med variantkandidatens bundne målceller, og d) måling av målcellecytotoksisitet formidlet av variantkandidaten.

I visse utførelsesformer omfatter fremgangsmåten også trinn e) å bestemme om variantkandidaten formidler målcellecytotoksisitet i nærvær av effektorcellene fra den andre mer effektivt enn moderpolypeptidet. I noen utførelsesformer omfatter fremgangsmåten også trinn f) å identifisere en variantkandidat som en dobbel-art forbedret variant som formidler målcellecytotoksisitet i nærvær av effektorceller fra den andre art mer effektivt enn moderpolypeptidet. I foretrukne utførelsesformer identifiseres dobbel-artsvariantene og screenes så in vivo i én eller flere dyretester.

I visse utførelsesformer identifiseres dobbel-artsforbedrete varianter først ved å utføre en helblodstest ved anvendelse av humant blod for å finne forbedrete varianter, og så utføre en andre helblodstest ved anvendelse av muse-, rotte- eller ikke-humant primatblod for å identifisere et sub-sett av de forbedrete variantene som er dobbel-artsforbedrete varianter. I noen utførelsesformer tilveiebringer foreliggende oppfinnelse fremgangsmåter for å identifisere dobbel-artsforbedrete varianter, som omfatter: a) å tilveiebringe: i) målceller, ii) en sammensetning omfattende en variantkandidat av et moderpolypeptid som minst har en del av en Fc-region, hvor variantkandidat omfatter minst en aminosyresubstitusjon i Fc-regionen, og hvor variantkandidaten formidler målcelleutarming i nærvær av en første art (for eksempel humant) blod mer effektivt enn moderpolypeptidet, og iii) andre art (for eksempel muse-, rotte- eller ikke-humat primat) blod, og b) å inkubere sammensetningen med målcellene under betingelser slik at variantkandidaten binder målcellene, som derved genererer variantkandidatbundne målceller, c) å blande den andre artens blod med de variantkandidatbunde målceller, og

d) å måle målcelleutarming formidlet av variantkandidaten. I visse utførelsesformer omfatter fremgangsmåten ytterligere trinn e) å bestemme om variantkandidaten

formidler målcelleutarming i nærvær av den andre artens blod mer effektivt enn moderpolypeptidet. I noen utførelsesformer omfatter fremgangsmåten ytterligere trinn f) å identifisere en variantkandidat som en dobbel-artsforbedret variant som formidler målcelleutarming i nærvær av den andre artens blod mer effektivt enn moderpolypeptidet. I foretrukne utførelsesformer identifiseres dobbel-artsvarianter og screenes så in vivo i én eller flere dyretester.

I visse utførelsesformer identifiseres dobbel-artsforbedrete varianter ved å utføre enhver av testene ovenfor ved bruk av humane komponenter (for eksempel humane celler, human FcR, osv.) for å identifisere forbedrete varianter, og så kjøre den samme testen (eller en ulik analyse) med ikke-humane dyrekomponenter (for eksempel museceller, muse-FcR, osv.). Med hensyn til dette kan et sub-sett av varianter identifiseres som virker godt i henhold til et gitt kriterium i både menneskebaserte tester, og en andre art basert på tester.

Eksempel på fremgangsmåte for å identifisere dobbel-arter av forbedrete varianter er som følger. En nukleinsyresekvens som minst koder en del av en IgG Fc-region muteres først slik at aminosyresekvensen som uttrykkes minst har én aminosyreendring, som derved genererer en variant. Denne uttrykte IgG-varianten karakteriseres så i en ADCC-test ved bruk av human PBMC eller et sub-sett (for eksempel NK-celler eller makrofager). Om forsterket ADCC-aktivitet finnes, screenes varianten i en andre ADCC-test ved bruk av muse- eller rotte-PBMCer. Alternativt eller i tillegg kan en test utføres med varianten for å binde til klonete gnagerreseptorer eller cellelinjer. Til slutt dersom varianten er funnet å være forbedret i den andre testen som gjør den til en dobbelforbedret variant, screenes varianten in vivo i mus eller rotter.

Eksemplarisk Fc-regionvariantinneholdende molekyler

Fc-regionvariantene kan være en del av større molekyler. De større molekylene kan for eksempel være monoklonale antistoffer, polyklonale antistoffer, kimære antistoffer, humaniserte antistoffer, bispesifikke antistoffer, immunoadhesiner, osv. Alternativt kan en Fc-regionvariant være funksjonelt festet til et ikke-antistoff polypeptid hvorved det kan konferere en endret (øket eller redusert) halveringstid. På denne måten er det tydelig at det er et bredt område for anvendelser for Fc-regionvariantene.

Antistoffer inneholdende Fc-regionvarianter

I foretrukne utførelsesformer er Fc-regionvarianten som inneholder molekylet (for eksempel polypeptid) et antistoff. Teknikker for å produsere antistoffer er beskrevet nedenfor.

( i) Antigenseleksjon og fremstilling

Når Fc-regionvarianten som inneholder molekylet (for eksempel polypeptid) generelt er et antistoff, rettes antistoffet mot et antigen av interesse. Antigenet er fortrinnsvis et polypeptid, og tilførsel av antistoffet til et pattedyr som lider av en sykdom eller forstyrrelse som kan ha fordel fra en reduksjon i mengde eller aktivitet av antigenmolekylet, kan resultere i en terapeutisk fordel i det pattedyret. Antistoffer rettet mot ikke-polypeptidantigener (slik som tumor assosierte glykolipidantigener; se US 5 091 178), kan imidlertid også anvendes.

Eksempler på antigener inkluderer, men er ikke begrenset til molekyler som renin; et veksthormon inkludert humant veksthormon og bovint veksthormon; veksthormon frigjørende faktor; paratyroidhormon; tyroidstimulerende hormon; lipoproteiner; a-i-antitrypsin; insulin A-kjede; insulin B-kjede; proinsulin; follikkelstimulerende hormon; kalsitonin; luteiniserende hormon; glukagon; koagulasjonsfaktorer som faktor VJJIC, faktor IX, vevsfaktor (TF) og von Willebrands faktor; antikoagulerende faktorer som protein C; atrial natriuretisk faktor; lungeoverflatestoff; en plasminogenaktivator som urokinase eller human urin eller vevstype plasminogen aktivator (t-PA); bombesin; trombin; hemopoietisk vekstfaktor; tumornekrose faktor-a og -P; enkefalinase; RANTES (regulert på aktivert normal T-celle uttrykt og utskilt); human makrofag betennelsesprotein (MIP-1-a); et serumalbumin som humant serumalbumin; Muellerian- inhiberende substans; relaxin A-kjede; relaxin B-kjede; prorelaxin; muse-gonadotropinassosiert peptid; et mikrobielt protein som P-laktamase; DNase; IgE; et cytotoksisk T-lymfocyttassosiert antigen (CTLA), slik som CTLA-4; inhibin; aktivin; vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF); reseptorer for hormoner eller vekstfaktorer; protein A eller D; reumatoide faktorer; en neurotrofisk faktor som beinavledet neurotrofisk faktor (BDNF), neurotrofin-3,-4,-5 eller-6 (NT-3, NT-4, NT-5 eller NT-6), eller en nervefaktor; blodplateavledet vekstfaktor (PDGF); fibroblast vekstfaktor som et FGF og ,FGF; epidermal vekstfaktor (EGF); transformerende vekstfaktor (TGF), slik som TGF-a og TGF-p\ inkludert TGF-1, TGF-2, TGF-3, TGF-4 eller TGF-5; insulinliknende vekstfaktor-I og -II (IGF-I og IGF-II); des (l-3)-IGF-I (hjerne IGF-I), insulinliknende vekstfaktorbindingsproteiner; CD proteiner som CD3, CD4, CD8, CD 19 og CD20; erytropoietin; osteoinduktive faktorer; immuntoksiner; et bein-morfogenisk protein (BMP); en vekstdifferensierende faktor (for eksempel GDF8); et interferon som interferon-a, -P og -y; kolonistimulerende faktorer (CSF'er), for eksempel M-CSF, GM-CSF og G-CSF; interleukiner (IL'er), for eksempel IL-I til IL-25; superoksid dismutase; T-25 cellereseptorer; overflatemembranproteiner; forvitringsakselererende faktor; viralt antigen som for eksempel en del av AIDS-hylsteret; transportproteiner; hjemvendende reseptorer; addressiner; regulatoriske proteiner; integriner som CDlla, CDllb, CDllc, CD18, etlCAM, VLA4 og VCAM; et tumorassosiert antigen som HER2-, HER3- eller HER4-reseptor; ghrelin; et medlem av en apoptose reaksjonsvei; og fragmenter eller forløpere av enhver av de ovenfor opplistete polypeptidene.

Foretrukne antigener inkluderer, men er ikke begrenset til CD-proteiner som CD3, CD4, CD8, CD 19, CD20 og CD34; medlemmer av ErbB-reseptorfamilien som EGF-reseptoren, HER2-, HER3- eller HER4-reseptor; celleadhesjonsmolekyler som LFA-1, Macl, p 150.95, VLA-4, ICAM-1, VCAM, a4/p7-integrin og (Xv/p3 integrin inkluderer enten en 5 eller subenheter derav (for eksempel anti-CDI Ia, anti-CD18 eller anti-CDI Ib antistoffer); vekstfaktorer som VEGF; vevsfaktor (TF); a-interferon (a-IFN); vekstdifferensierende faktorer, for eksempel GDF-8; et interleukin som IL-8; IgE; blodgruppe antigener; flk2/flt3 reseptor; fedme (OB) reseptor; mpl-reseptor; CTLA-4; protein C og ghrelin.

Oppløselige antigener eller fragmenter derav, eventuelt konjugert til andre molekyler, kan anvendes som immunogener for å generere antistoffer. For transmembrane molekyler som reseptorer, kan fragmenter av disse (for eksempel det ekstracellulære doménet av en reseptor) anvendes som immunogenet. Alternativt kan celler som uttrykker det transmembrane molekylet anvendes som immunogenet. Slike celler kan avledes fra en naturlig kilde (for eksempel cancer cellelinjer) eller kan være celler som er transformerte ved rekombinante teknikker for å uttrykke det transmembrane molekylet. Andre antigener og former av dette som er nyttige for å fremstille antistoffer vil være tydelig for de i fagfeltet.

( ii) Polyklonale antistoffer

Foreliggende beskrivelse tilveiebringer polyklonale antistoffer med Fc-regionvarianter. For eksempel kan et humant immunglobulin repertoar inneholde modifiserte IgGl konstantregioner som kan transplanteres inn i immunglobulin-inaktiverte mus, som resulterer i mus som uttrykker et IgG repertoar inneholdende modifiserte Fc-regioner (se for eksempel Mendez, MJ et al., Nature Genetics 15:146 (1997)). Polyklonale antistoffer dyrkes fortrinnsvis i dyr ved flere subkutane (sc) eller intraperitoneale (ip) injeksjoner av det relevante antigen, og en adjuvans. Det kan være nyttig å konjugere det relevante antigen til et protein som er immunogent i arten som skal immuniseres (for eksempel albueskjell-hemocyanin, serumalbumin, bovint tyroglobulin eller soyabønne trypsininhibitor) ved anvendelse av et bifunksjonelt eller derivatiserende middel (for eksempel maleimidbenzoyl sulfosuksinimidester for konjugering gjennom cysteinrester, N-hydroksysuksinimid for konjugering gjennom lysinrester, glutaraldehyd, ravsyreanhydrid, SOC12 eller R1N=C=NR, hvor R og RI er ulike alkylgrupper. Eksempler av en generell immuniseringsprotokoll for en kanin og mus er som følger. Dyrene immuniseres mot antigenet, immunogene konjugater eller derivater ved å kombinere for eksempel 100 ug eller 5 ug av proteinet eller konjugatet (for eksempel for henholdsvis en kanin eller mus) med 3 volumer av Freunds fullstendige adjuvans og så injisere løsningen intradermalt på flere steder. En måned senere forsterkes dyrene med 1/5 eller 1/10 av den opprinnelige mengden peptid eller konjugat i Freunds fullstendige adjuvans ved subkutan injeksjon på flere steder. 7 til 14 dager senere blodtappes dyrene og serumet testes for antistofftiter. Dyrene forsterkes inntil titeren flater ut. Dyrene forsterkes fortrinnsvis med konjugatet av det samme antigen, men konjugert til et ulikt protein og/eller gjennom forskjellig krysskoblings reagens. Konjugater kan også lages i rekombinant cellekultur som proteinfusjoner. I tillegg er aggregerende midler som alun er passende benyttet for å forsterke immunresponsen.

( Hi) Monoklonale antistoffer

Foreliggende beskrivelse tilveiebringer monoklonale antistoffer med Fc-regioner.

Monoklonale antistoffer kan lages på mange måter, inkludert anvendelse av hybridomfremgangsmåten (for eksempel som beskrevet av Kohler et al., Nature, 256:495, 1975), eller ved rekombinant» DNA-fremgangsmåter (for eksempel US 4 816 567).

Ved hybridomfremgangsmåten immuniseres en mus eller annet egnet vertscelledyr, slik som en hamster eller makakape, for å frembringe lymfocytter som produserer eller er i stand til å produsere antistoffer som spesifikt vil binde til proteinet som anvendes for immunisering. Alternativt kan lymfocytter immuniseres in vitro. Lymfocytter fuseres deretter med myelomceller ved anvendelse av en egnet fuseringsmiddel, slik som polyetylenglykol for å danne en hybriodomcelle. Hybridomcellene som på denne måten utsåes og dyrkes i et egnet dyrkingsmedium som fortrinnsvis inneholder én eller flere substanser som inhiberer vekst eller overlevelse av de ikke-fuserte parentale myelomcellene. Dersom de parentale myelomcellene for eksempel mangler enzymet hypoxantin guanin fosforibosyltransferase (HGPRT eller HPRT), vil vanligvis dyrkingsmediet for hybridomene inkludere hypoxantin, aminopterin og tymidin (HAT-medium), og disse substansene hindrer vekst av HGPRT-manglende celler.

Foretrukne myelomceller er de som fuserer effektivt, støtter stabil høynivåproduksjon av antistoff ved de valgte antistoffproduserende celler, og som er sensitive til et medium, slik som HAT-medium. Blant disse er foretrukne myelom cellelinjer er murine myelomlinjer, som de avledet fra MOPC-21 og MPC-11 musetumorer, som er tilgjengelige fra Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, USA, og SP-2 eller X63-Ag8-653 celler tilgjengelige fra American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA. Humane myelom og musehumane heteromyelomcellelinjer er også beskrevet for produksjon av humane monoklonale antistoffer (for eksempel Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)).

Dyrkingsmedium som hybridomceller dyrkes i testes for produksjon av monoklonale antistoffer rettet mot antigenet. Bindingsspesifisiteten til monoklonale antistoffer som produseres av hybridomceller, bestemmes fortrinnsvis ved immunpresipitering eller ved en in vitro bindingsanalyse, slik som RIA eller ELISA. Etter at hybridomceller som produserer antistoffer med ønsket spesifisitet, affinitet og/eller aktivitet er identifisert, kan klonene subklones ved å begrense fortynningsfremgangsmåter og dyrke ved standard fremgangsmåter. Egnet dyrkingsmedium til dette formål inkluderer for eksempel D-MEM eller RPMI-1640 medium. I tillegg kan hybridomceller dyrkes in vivo som ascites-tumorer i dyr. De monoklonale antistoffene utskilt av subklonene separeres passende fra dyrkingsmediet, ascites væske, eller serum av konvensjonelle immunglobulin rensingsfremgangsmåter, slik som for eksempel protein A-sefarose, hydroksylapatit kromatografi, gél elektroforese, dialyse eller affinitetskromatografi.

DNA som koder de monoklonale antistoffene isoleres enkelt og sekvenseres ved anvendelse av konvensjonelle fremgangsmåter (for eksempel ved bruk av oligonukleotidprober som kan binde spesifikt til gener som koder de tunge og lette kjedene av de monoklonale antistoffene). Hybridomcellene tjener som en foretrukket kilde av slikt DNA. Straks de er isolert kan DNA'et plasseres i ekspresjonsvektorer, som så transfekteres inn i vertsceller, slik som E. coli celler, ape COS-celler, kinahamster ovarie (CHO) celler eller myelomceller som ikke på annen måte produserer immunglobulinprotein, for å oppnå syntesen av monoklonale antistoffer i de rekombinante vertscellene. Rekombinant produksjon av antistoffer beskrives mer detaljert nedenfor.

I noen utførelsesformer isoleres antistoffer eller antistoffragmenter fra antistoff fagbiblioteker, som genereres ved bruk av teknikkene beskrevet for eksempel av McCafferty et al, Nature, 348:552554 (1990), Clackson et al, Nature, 352:624-628

(1991), og Marks et al, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), beskriver isolasjon av murine og humane antistoffer, ved anvendelse av fag biblioteker. Følgende publikasjoner beskriver produksjon av høyaffinitets (nM område) humane antistoffer ved kjedeskyfling (Marks et al, BioTechnology, 10:779-783 (1992)), så vel som kombinasj onsinfeksj on og in vivo rekombinasjon som en strategi for å konstruere veldig store fag biblioteker (for eksempel Waterhouse et al, Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266

(1993)). Disse og liknende teknikker er således levedyktige alternativer til tradisjonelle monoklonale antistoff hybridomteknikker som er godt kjent i fagfeltet for isolasjon av monoklonale antistoffer. DNA kan også være modifisert, for eksempel ved å erstatte den kodende sekvensen for humane tung- og lettkjede konstante doméner i stedet for de homologe murine sekvensene (for eksempel US 4 816 567, og Morrison et al, Proe. Nat. Acad. Sei USA, 81:6851 (1984), eller ved kovalent sammenføyning til den immunglobulinkodende sekvensen alt eller en del av den kodende sekvensen for et ikke-immunglobulinpolypeptid.

Vanligvis substitueres slike ikke-immunglobulinpolypeptider for de konstante doméner av et antistoff, eller de substitueres for de variable doméner av et antigenkombinerende sete av et antistoff for å skape et kimært toverdig antistoff omfattende et antigenkombinerende sete med spesifisitet for et antigen og et annet antigenkombinerende sete som har spesifisitet for et annet antigen.

( iv) Humaniserte og humane antistoffer

Foreliggende beskrivelse tilveiebringer humaniserte og humane antistoffer med Fc-regionvarianter. I foretrukne utførelsesformer omfatter et humanisert antistoff humane antistoff aminosyresekvenser sammen med aminosyrerester som ikke er fra et humant antistoff. I noen utførelsesformer omfatter de humane sekvensene i et humanisert antistoff rammeverkregionene ("FR'er") og sekvensene eller restene som ikke er fra et humant antistoff, omfatter én eller flere CDR'er. Det verdt å merke seg at FRer og CDRer kan defineres basert på aminosyrerestnummerering i de tunge regionene og VL-regionene. Betegnelsen CDR har betydningen de ikke tilstøtende antigenkombinerende setene som finnes i den variable regionen av både tung- og lettkjedepolypeptider. Disse regionene er definerte av Kabat et al, (J. Biol. Chem., 252:6609-6616 (1977) og Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest (1991); "Kabat", Chothia et al, (J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987); "Chothia" og MacCallum et al, (J. Mol. Biol., 262:732-745 (1996); "MacCallum", hvor definisjonene inkluderer overlappende eller undergrupper av aminosyrerester når de sammenliknes mot hverandre. Ikke desto mindre er anvendelsen av enhver av disse definisjonene alene (for eksempel Kabat definisjonen) eller i kombinasjon (bare som eksempel, den kombinerte definisjonen av Kabat og Chothia) for å referere til en CDR av et antistoff (som inkluderer et humanisert antistoff), er ment å være innefor rekkevidden av betegnelsen som er definert og anvendt heri.

Betegnelsen "rammeverk" når den benyttes som referanse til en antistoffvariabel region har også betydningen alle aminosyrerestene på utsiden av CDR-regionene innenfor den variable antistoffregionen. Et variabelt regionrammeverk er derfor mellom omkring 100-120 aminosyrer i lengde, men er ment å bare referere til de aminosyrer på utsiden av CDR'ene. Betegnelsen "rammeverksregion" har betydningen hvert doméne av rammeverket som er separert ved CDRene. For det spesifikke eksemplet av en VH-region og for CDRene, som definert av Kabat, korresponderer derfor rammeverksregion 1 (FRI) til doménet av den variable regionen som omfatter aminosyrene 1-30; rammeverksregion 2 (FR2) korresponderer til doménet av den variable regionen som omfatter aminosyrene 36-49; rammeverksregion 3 (FR3) korresponderer til doménet av den variable regionen som omfatter aminosyrene 66-94; og rammeverksregion 4 (FR4) korresponderer til doménet av den variable regionen fra aminosyre 103 til enden av den variable regionen. FR'ene for lettkjeden separeres på liknende måte ved hver av de lettkjedevariable region CDR'er. På liknende måte ved å anvende definisjonen av CDRer ved Chothia eller MacCallum, eller enhver kombinasjon av CDR-definisjoner, separeres rammeverksgrensene av de respektive CDR-terminalene, som beskrevet ovenfor, til tross for de mange definisjoner av CDRer er det noen utførelsesformer foretrukket å anvende Kabat-definisjonen for å definere CDRer.

Restene i et humanisert antistoff som ikke er fra et humant antistoff, kan være rester eller sekvenser importert fra eller avledet fra en annen art (som inkluderer, men er ikke begrenset til mus), eller disse sekvensene kan være tilfeldige aminosyresekvenser (for eksempel generert fra tilfeldige nukleinsyresekvenser), som er innsatt i den humaniserte antistoffsekvensen. Som bemerket ovenfor er de humane aminosyresekvensene i et humanisert antistoff fortrinnsvis FRene, mens restene som ikke er fra et humant antistoff (enten avledet fra annen art eller tilfeldige aminosyresekvenser) korresponderer fortrinnsvis til CDRene. I noen utførelsesformer kan imidlertid én eller flere FRer inneholde én eller flere ikke-humane aminosyrerester. I tilfeller av endringer eller modifikasjoner (for eksempel ved introduksjon av en ikke-human rest) til et ellers humant rammeverk, er det mulig for den endrete eller modifiserte FR å være tilstøtende til en modifisert CDR fra en annen art eller en tilfeldig CDR-sekvens, mens i andre utførelsesformer er en endret FR ikke er tilstøtende til en endret CDR-sekvens fra en annen art eller en tilfeldig CDR-sekvens. I noen utførelsesformer er rammeverksekvensene av et humanisert antistoff fullstendig humane (dvs. ingen rammeverksendringer er gjort til det humane rammeverket). I foretrukne utførelsesformer er rammeverksekvensene av et humanisert antistoff bare human kjønnscellelinje (dvs. ingen rammeverksendringer er gjort til rammeverket fra den humane kjønnscellelinjen).

Ikke-humane aminosyrerester fra andre arter, eller en tilfeldig sekvens refereres ofte til som "importerte" rester, som vanligvis tas fra et "import" variabelt doméne. Humanisering kan hovedsakelig utføres ved å følge fremgangsmåten av Winter og medarbeidere (for eksempel Jones et al, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al, Science, 239:1534-1536 (1988)) ved å substituere gnager (eller andre pattedyr) CDRer eller CDR-sekvenser for de korresponderende sekvensene av et humant antistoff. Antistoffer hvor hovedsakelig mindre enn et intakt variabelt doméne er substituert med den korresponderende sekvensen fra en ikke-human art, kan også genereres (for eksempel US 4 816 567). I praksis er humaniserte antistoffer vanligvis humane antistoffer hvor noen CDR-rester og muligens noen FR-rester substitueres med rester fra analoge seter i gnager antistoffer, eller som anført ovenfor, der CDR-sekvenser substitueres ved tilfeldige sekvenser. Ved hjelp av bare ikke-begrensende eksempel er fremgangsmåter for å overdra donor CDR-bindingsaffinitet til en antistoffakseptorvariabel region rammeverk beskrevet i WO 01/27160 Al, og i US patentsøknad serienr. 09/434 870 og 09/982 464.

Valget av humane, variable doméner, både lette og tunge, som skal anvendes i å lage de humaniserte antistoffer er viktig for å redusere antigenisitet. Ifølge den såkalte beste tilpasnings fremgangsmåte screenes sekvensen av det variable doménet fra et gnager antistoff som skal humaniseres, mot hele biblioteket av kjente humanvariable doménesekvenser. Den humane sekvensen som er nærmest den til gnageren, aksepteres som det humane rammeverk (FR) for det humaniserte antistoff (se for eksempel Sims et al, J. Immunol., 151:2296 (1993), og Chothia et al, J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). En annen fremgangsmåte bruker et spesielt rammeverk avledet fra konsensussekvensen av alle humane antistoffer av en spesiell undergruppe av lette eller tunge kjeder. Det samme rammeverket kan anvendes for forskjellige humaniserte antistoffer (for eksempel Carter et al, Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 89:4285 (1992); Presta et al, J. Immunol., 151:2623 (1993)).

I andre utførelsesformer er det ikke behov for å "forhåndsvelge" et bestemt, humant

antistofframmeverk (dvs. det er ikke nødvendig å velge et humant rammeverk med den nærmeste homologien eller sekvensidentitet til et gitt antistoff som skal humaniseres). I disse utførelsesformer kan et vanlig eller universalt, humant rammeverk anvendes for å akseptere én eller flere ikke-humane CDR'er. I den foretrukne utførelsesformen er et enkelt universalt fullstendig humant rammeverk anvendt som rammeverket for alle antistoffer som skal humaniseres, uten hensyn til dets homologi til rammeverksekvensen(e) til kandidatantistoffene. I denne sammenheng kan humaniserte antistoffer genereres uten endringer i rammeverksregionen. Dette universale, fullstendige rammeverk kan da akseptere én eller flere CDR-sekvenser. I en utførelsesform er den ene eller flere CDR-sekvenser, CDR-sekvenser fra et antistoff fra en annen art (for eksempel mus eller rotte) som er modifisert, sammenliknet med den korresponderende CDR i det intakte antistoffet fra den andre arten (dvs. det er samtidig introduksjon av CDRen og modifikasjon av den CDR som introduseres i det universale, humane rammeverket). Modifikasjonen korresponderer til én eller flere aminosyreendringer (i den modifiserte CDR), sammenliknet med den korresponderende

CDR i det intakte antistoffet fra den andre arten. I en utførelsesform inkluderes alle aminosyrerestene i CDRen i et bibliotek, mens i andre utførelsesformer er ikke alle CDR-aminosyrerestene inkludert i et bibliotek. I en annen utførelsesform er den ene eller flere CDR-sekvenser tilfeldige sekvenser, som erstatter CDR-sekvenser.

I foretrukne utførelsesformer humaniseres antistoffer som beholder høy affinitet for antigenet og andre fordelaktige, biologiske egenskaper. I noen utførelsesformer er affiniteten til det humaniserte antistoff for antigenet større enn affiniteten av det korresponderende ikke-humaniserte, intakte antistoff eller fragment eller del derav (for eksempel kandidat gnagerantistoffet). I denne sammenheng fremstilles noen humaniserte antistoffer i noen utførelsesformer ved en analysefremgangsmåte av de parenterale sekvensene, og ulike begrepsmessige humaniserte produkter ved anvendelse av tredimensjonale modeller av de parenterale og humaniserte sekvensene. Tredimensjonale immunglobulinmodeller er alminnelig tilgjengelige, og er kjent i fagfeltet. Dataprogrammer som illustrerer og viser mulige tredimensjonalt tilpassete strukturer av valgte kandidatimmunglobulinsekvenser er tilgjengelige. Inspeksjon av disse presentasjonene tillater analyse av den trolige rolle av restene i funksjonen av kandidatimmunglobulinsekvensen, dvs. analysen av rester som påvirker kandidatimmunglobulinets evne til å binde dets antigen. På denne måten kan FR-rester velges og kombineres fra mottakeren og importsekvenser, slik at det ønskete antistoffets egenskaper, som øket affinitet til målantigenet/målantigenene oppnås. Generelt er CDR-restene direkte og i det vesentlige involvert i å påvirke antigenbinding.

En rekke spesifikke fremgangsmåter som er godt kjent i fagfeltet, kan anvendes for å introdusere antistoff-CDRer (eller tilfeldige sekvenser som erstatter antistoff-CDR'er) i antistofframmeverk (se for eksempel US søknad 09/434 879 og 09/982 464). I noen utførelsesformer kan overlappende oligoer anvendes for å syntetisere et antistoffgen eller del derav (for eksempel et gen som koder et humanisert antistoff). I andre utførelsesformer kan mutagenese av et antistofftemplat utføres ved anvendelse av fremgangsmåtene til Kunkel ( infra), for eksempel for å introdusere en modifisert CDR eller en tilfeldig sekvens for å erstatte en CDR. I noen utførelsesformer humaniseres lett- og tungkjedevariable regioner separat, og deretter uttrykkes disse samtidig som en humanisert, variabel region. I andre utførelsesformer utgjør humaniserte, variable regioner den variable regionen til et intakt antistoff. I noen utførelsesformer omfatter Fc-regionen til det intakte antistoff en humanisert variabel region som er modifisert (for eksempel er minst en aminosyremodifikasjon gjort i Fc-regionen). Et antistoff som er humanisert med tilfeldig CDR og ingen rammeverkendringer, kan for eksempel omfatte minst en aminosyremodifikasjon i Fc-regionen.

I alternative utførelsesformer anvendes transgene dyr (for eksempel mus) som ved immunisering er i stand til å produsere en fullskala humane antistoffer i fravær av endogen immunglobulinproduksjon. Det er for eksempel beskrevet at den homozygote slettingen av det antistofftungkjedesammenføyende region (JH) genet i kimære og kjønnscellelinje mutante mus resulterer i fullstendig inhibering av endogen antistoffproduksjon. Overføring av den humane kjønnscellelinje-genoppstillingen i slike kjønnscellelinje mutante mus vil resultere i produksjon av humane antistoffer ved antigenutfordring (se for eksempel Jakobovits et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 90:2551 (1993) og Jakobovits et al, Nature, 362:255-258 (1993)). Humane antistoffer kan også avledes fra fag-fremvisningsbiblioteker (for eksempel Hoogenboom et al, J. Mol. Biol., 227:381 (1991), og Vaughan et al, Nature Biotech., 14:309 (1996)).

Foreliggende beskrivelse tilveiebringer fremgangsmåter for å generere humaniserte antistoffer (og antistoffragmenter) omfattende minst én aminosyresubstitusjon som opplistet i tabell 1 heri, i Fc-regionen (sammenliknet med et moderpolypeptid omfattende en Fc-region uten aminosyresubstitusjonen). Diskutert nedenfor er ytterligere fremgangsmåter for å generere slike humaniserte antistoffer. Foreliggende beskrivelse tilveiebringer også sammensetninger omfattende antistoffene og antistoffragmenter som genereres ved disse fremgangsmåtene. Det er viktig at de humaniserte fremgangsmåtene som diskuteres nedenfor, og andre humaniserte fremgangsmåter (for eksempel de diskutert ovenfor), kan kombineres med Fc-regionvariantene. Med hensyn til dette kan humaniserte antistoffer med endrete, unike Fc-regioner konstrueres.

I noen utførelsesformer tilveiebringes en fremgangsmåte for å konstruere en populasjon av endrete VH-regionkodende nukleinsyrer, som omfatter: a) å tilveiebringe en representasjon av første og andre referanseaminosyresekvenser, der den første referansesekvensen omfatter en donor VH-regionsekvens, der den donorvariable regionen omfatter i) FR'er, og ii) tre CDRer som definert ved de kombinerte definisjonene til Kabat og Chothia; den andre referansesekvensen omfatter sekvensen fra en akseptor VH-region omfattende FR er; b) å syntetisere de første oligonukleotidene som koder deler av FRene av akseptor VH-regionen, hvori delene av FR'ene, når de sammenliknes med den andre referansesekvensen er umodifiserte; og en populasjon av andre oligonukleotider, som hver koder i) minst én del av en første CDR som er modifisert, den første CDR er valgt fra gruppen bestående av HCDR1, HCDR2 og HCDR3, hvori den modifiserte første CDR omfatter en annen aminosyre ved én eller flere posisjoner når den sammenliknes med de korresponderende donor-CDR'ene fra den første referansesekvensen, og ii) én eller flere deler av umodifiserte FRer som er i stand til å hybridisere til de første oligonukleotidene; c) å blande de første oligonukleotidene med populasjonen av andre oligonukleotider for å konstruere overlappende oligonukleotider; og d) å behandle de overlappende oligonukleotider under betingelser slik at en populasjon av endret VH-regionkodende nukleinsyrer konstrueres, hvori FR ene som kodes av de endrete VH-regionkodende nukleinsyrene er umodifiserte med hensyn til den andre referansesekvensen.

I andre utførelsesformer tilveiebringes en fremgangsmåte for konstruksjon av en populasjon av endrete VL-regionkodende nukleinsyrer, som omfatter: a) å tilveiebringe en representasjon av første og andre referanseaminosyresekvenser, der den første referansesekvensen omfatter en donor VL-regionsekvens, der den donorvariable regionen omfatter i) FR'er, og ii) tre CDRer som definert ved de kombinerte definisjonene til Kabat og Chothia; den andre referansesekvensen omfatter sekvensen fra en akseptor VL-region omfattende FRer; b) å syntetisere de første oligonukleotidene som koder deler av FR'ene av akseptor VL-regionen, hvori delene av FR'ene, når de sammenliknes med den andre referansesekvensen er umodifiserte; og en populasjon av andre oligonukleotider, som hver koder i) minst én del av en første CDR som er modifisert, den første CDR er valgt fra gruppen bestående av LCDR1, LCDR2 og LCDR3, hvor den modifiserte første CDR omfatter en annen aminosyre ved én eller flere posisjoner når den sammenliknes med de korresponderende donor-CDR'ene fra den første referansesekvensen, og ii) én eller flere deler av umodifiserte FRer som er i stand til å hybridisere til de første oligonukleotidene; c) å blande de første oligonukleotidene med populasjonen av andre oligonukleotider for å konstruere overlappende oligonukleotider; og d) å behandle de overlappende oligonukleotider under betingelser slik at en populasjon av endret VL-regionkodende nukleinsyrer konstrueres, hvori FR ene som kodes av de endrete VL-regionkodende nukleinsyrene er umodifiserte med hensyn til den andre referansesekvensen.

I noen utførelsesformer betraktes en fremgangsmåte for konstruksjon av en populasjon av endrete VH-regionkodende nukleinsyrer, som omfatter: a) å tilveiebringe en representasjon av første og andre referanseaminosyresekvenser, der den første referansesekvensen omfatter en donor VH-regionsekvens, der den donorvariable regionen omfatter i) FR'er, og ii) tre CDR'er som definert ved de kombinerte definisjonene til Kabat og Chothia; den andre referansesekvensen omfatter sekvensen fra en akseptor VH-region omfattende FRer; b) å syntetisere en populasjon av de første oligonukleotidene som hver koder minst en del av en første CDR, valgt fra gruppen bestående av HCDR1, HCDR2 og HCDR3, hvori den modifiserte første CDR omfatter en annen aminosyre ved én eller flere posisjoner når den sammenliknes med de korresponderende donor-CDRene fra den første referansesekvensen; og andre oligonukleotider som koder i) deler av FR'ene av akseptor VH-regionen, hvori delene av FR'ene når de sammenliknes med referansesekvensen er umodifiserte, og ii) én eller flere deler av en CDR som er i stand til å hybridisere til populasjonen av første oligonukleotidene; c) å blande populasjonen av første oligonukleotider med de andre oligonukleotidene for å konstruere overlappende oligonukleotider; og d) å behandle de overlappende oligonukleotider under betingelser slik at en populasjon av endret VH-regionkodende nukleinsyrer konstrueres, hvori FRene som kodes av de endrete VH-regionkodende nukleinsyrene er umodifiserte med hensyn til den andre referansesekvensen.

I andre utførelsesformer tilveiebringes en fremgangsmåte for konstruksjon av en populasjon av endrete VL-regionkodende nukleinsyrer, som omfatter: A) å tilveiebringe en representasjon av første og andre referanseaminosyresekvenser, der den første referansesekvensen omfatter en donor VL-regionsekvens, der den donorvariable regionen omfatter i) FR'er, og ii) tre CDRer som definert ved de kombinerte definisjonene til Kabat og Chothia; den andre referansesekvensen omfatter sekvensen fra en akseptor VL-region omfattende FRer; B) å syntetisere a) en populasjon første oligonukleotider som hver koder minst en del av en første CDR, valgt fra gruppen bestående av LCDR1, LCDR2 og LCDR3, hvori den modifiserte første CDR omfatter en annen aminosyre ved én eller flere posisjoner når den sammenliknes med de korresponderende donor-CDRene fra den første referansesekvensen; og b) andre oligonukleotider som koder i) deler av FR'ene av akseptor VL-regionen, hvori delene av FR'ene når de sammenliknes med referansesekvensen er umodifiserte, og ii) én eller flere deler av en CDR som er i stand til å hybridisere til populasjonen av første oligonukleotider; c) å blande populasjonen av første oligonukleotider med de andre oligonukleotidene for å konstruere overlappende oligonukleotider; og d) å behandle de overlappende oligonukleotider under betingelser slik at en populasjon av endret VL-regionkodende nukleinsyrer konstrueres, hvori FRene som kodes av de endrete VL- regionkodende nukleinsyrene er umodifiserte med hensyn til den andre referansesekvensen.

I noen utførelsesformer er representasjonen av første og andre referansesekvenser i elektronisk form. I noen utførelsesformer omfatter fremgangsmåten ytterligere trinnene av e) samtidig ekspresjon av populasjonen av endrete VH-regionkodende nukleinsyrer med en lettkjedevariabel regionkodende nukleinsyre for å produsere en mangfoldig populasjon av endrete heteromere variable regioner. I noen utførelsesformer omfatter syntetiseringen kjemisk syntetisering. I noen utførelsesformer er akseptoren human. I noen utførelsesformer omfatter behandlingstrinnet (d) utvidelse ved en polymerase.

I andre utførelsesformer betraktes en fremgangsmåte for å konstruere en populasjon av endrete VH-regionkodende nukleinsyrer, som omfatter: a) å tilveiebringe en representasjon av første og andre referanseaminosyresekvenser, der den første referansesekvensen omfatter en donor VH-regionsekvens, der den donorvariable regionen omfatter i) FR'er, og ii) tre CDR'er, den andre referansesekvensen omfatter en VH-region; b) å syntetisere en populasjon av endret VH-regionantistoffgensekvenser, hvori FRene av de endrete VH-regionene er identiske til FRene av den andre referansesekvensen og minst en CDR av de endrete antistoffvariable regionene er modifisert, hvori den modifiserte, første CDR omfatter en annen aminosyre på en eller flere posisjoner når den sammenliknes med den korresponderende donor CDR av den første referansesekvensen.

I noen utførelsesformer betraktes en fremgangsmåte for å konstruere en populasjon av endrete VL-regionkodende nukleinsyrer, som omfatter: a) å tilveiebringe en representasjon av første og andre referanseaminosyresekvenser, der den første referansesekvensen omfatter en donor VL-regionsekvens, der den donorvariable regionen omfatter i) FR'er, og ii) tre CDRer, den andre referansesekvensen omfatter sekvensen av en akseptor VL-region som omfatter FRer; b) å syntetisere en populasjon av endret VL-regionantistoffgensekvenser, hvori FR'ene av de endrete VL-regionene er identiske til FRene av den andre referansesekvensen og minst en første CDR av den endrete antistoff-VL-regionen er modifisert, hvori den modifiserte, første CDR omfatter en annen aminosyre på en eller flere posisjoner når den sammenliknes med den korresponderende donor CDR av den første referansesekvensen.

I noen utførelsesformer er representasjonen av første og andre referansesekvenser i elektronisk form. I noen utførelsesformer omfatter fremgangsmåten ytterligere trinnet av samtidig ekspresjon av populasjonen av endrete VL-regionkodende nukleinsyrer med en VH-regionkodende nukleinsyre for å produsere en mangfoldig populasjon av endrete heteromere, variable regioner. I noen utførelsesformer er akseptaren human. I noen utførelsesformer involverer syntetiseringen anvendelse av overlappende oligonukleotider.

I andre utførelsesformer betraktes en fremgangsmåte for å konstruere en populasjon av endrete VH-regionkodende nukleinsyrer, som omfatter: a) å tilveiebringe en representasjon av en referanseaminosyresekvens, der referansesekvensen omfatter sekvensen av en akseptor-VH-region, omfattende FR'er; b) å syntetisere en populasjon av endrete VH-regionantistoffgensekvenser, hvori FR'ene av de endrete VH-regionene er identiske til FR'ene av referansesekvensen, og minst én første CDR av de endrete antistoffvariable regionene, som omfatter en tilfeldig aminosyresekvens.

I andre utførelsesformer betraktes en fremgangsmåte for å konstruere en populasjon av endrete VL-regionkodende nukleinsyrer, som omfatter: a) å tilveiebringe en representasjon av en referanseaminosyresekvens, der referansesekvensen omfatter sekvensen av en akseptor VL-region, som omfatter FRer; b) å syntetisere en populasjon av endrete VL-regionantistoffgensekvenser, hvori FR'ene av de endrete VL-regionene er identiske til FR'ene av referansesekvensen, og minst en første CDR av de endrete antistoff-VL-regionene omfatter en tilfeldig aminosyresekvens.

I andre utførelsesformer betraktes en fremgangsmåte for å konstruere en populasjon av endrete VH-regionkodende nukleinsyrer, som omfatter: a) å tilveiebringe en representasjon av en referanseaminosyresekvens, der referansesekvensen omfatter sekvensen av en human akseptor VH-region, som omfatter FR'er; b) å syntetisere en populasjon av endret VH-regionantistoffgensekvenser, hvori FRene av de endrete VH-regionene er identiske til FR'ene av den humane referansesekvensen, og minst en første CDR av de endrete antistoffvariable regionene omfatter en tilfeldig aminosyresekvens. I noen utførelsesformer er representasjonen av den humane referansesekvensen i elektronisk form.

I andre utførelsesformer betraktes en fremgangsmåte for å konstruere en populasjon av endrete VL-regionkodende nukleinsyrer, som omfatter: a) å tilveiebringe en representasjon av en referanseaminosyresekvens, der referansesekvensen omfatter sekvensen av en human akseptor VL-region, som omfatter FR'er; b) å syntetisere en populasjon av endret VL-regionantistoffgensekvenser, hvori FR'ene av de endrete VL-regionene er identiske til FR'ene av den humane referansesekvensen, og minst en første CDR av de endrete antistoff-VL-regionene omfatter en tilfeldig aminosyresekvens.

I noen utførelsesformer er representasjonen av referansesekvensen i elektronisk form. I noen utførelsesformer omfatter fremgangsmåten ytterligere trinnet av samtidig ekspresjon av populasjonen av endrete VL-regionkodende nukleinsyrer med en VH-regionkodende nukleinsyre for å produsere en mangfoldig populasjon av endrete heteromere, variable regioner. I noen utførelsesformer involverer syntetiseringen anvendelse av overlappende oligonukleotider. I noen utførelsesformer er CDR'ene definert med definisjonen til Kabat.

I noen utførelsesformer modifiseres én eller flere FR på samme tid med introduksjonen av én eller flere modifiserte CDR. I alternative utførelsesformer er de modifiserte rammeverk tilstøtende de modifiserte CDR.

I noen utførelsesformer tilveiebringer foreliggende beskrivelse fremgangsmåter for konstruksjon av en populasjon av endrete VH-regionkodende nukleinsyrer, som omfatter: A) å tilveiebringe en representasjon av første og andre referanseaminosyresekvenser, der den første referansesekvensen omfatter en donor VH-regionsekvens, der den donorvariable regionen omfatter i) FRer, og ii) tre CDRer som definert ved de kombinerte definisjonene til Kabat og Chothia; den andre referanseaminosyresekvensen omfatter sekvensen av en akseptor VH-region omfattende FR'er; B) å syntetisere a) en første populasjon av oligonukleotider, som omfatter oligonukleotider som koder en modifisert VH-region FR, eller del derav, hvori VH-region FR, eller del derav inneholder et flertall av endrete aminosyrer ved én eller flere posisjoner når den sammenliknes med akseptor rammeverksregionsekvensen, hvori rammeverksposisj onene som er endret er valgt blant akseptor rammeverksposisj onene av den andre referansesekvensen som avviker på den korresponderende posisjonen,

sammenliknet med donor rammeverksposisj onene av den første referansesekvensen; og

b) en andre populasjon av oligonukleotider, som hver koder i) minst en modifisert CDR eller del derav, hvori den modifiserte CDR eller del derav omfatter en annen aminosyre

ved én eller flere posisjoner når den sammenliknes med den korresponderende donor-CDR-aminosyrereferansesekvensen; og ii) én eller flere deler av tilstøtende FR'er som

er i stand til å hybridisere den første populasjonen av oligonukleotider; og c) å blande populasjonen av første oligonukleotider med de andre oligonukleotidene for å konstruere overlappende oligonukleotider; og d) å behandle de overlappende oligonukleotider under betingelser slik at en populasjon av endret VH-regionkodende nukleinsyrer konstrueres. I visse utførelsesformer er representasjonen av første og andre referansesekvenser i elektronisk form. I alternative utførelsesformer omfatter fremgangsmåtene ytterligere trinnet av e) å samtidig uttrykke populasjonen av endret VH-regionkodende nukleinsyrer med en VL-regionkodende nukleinsyre for å produsere en mangfoldig populasjon av endrete, heteromere variable regioner. I ytterligere utførelsesformer omfatter syntetiseringen kjemisk syntetisering. I noen utførelsesformer er akseptoren human. I foretrukne utførelsesformer er én eller flere av den mangfoldige populasjonen av endrete heteromere variable regioner del av et antistoff som omfatter en Fc-region, hvori Fc-regionen omfatter minst én aminosyresubstitusjon sammenliknet med et moderpolypeptid som har en Fc-region.

I andre utførelsesformer tilveiebringer foreliggende beskrivelse fremgangsmåter for konstruksjon av en populasjon av endrete VL-regionkodende nukleinsyrer, som omfatter: A) å tilveiebringe en representasjon av første og andre referanseaminosyresekvenser, der den første referansesekvensen omfatter en donor VL-regionsekvens, der den donorvariable regionen omfatter i) FR'er, og ii) tre CDR'er som definert ved de kombinerte definisjonene til Kabat og Chothia; den andre referanseaminosyresekvensen omfatter sekvensen av en akseptor VL-region omfattende FR'er; B) å syntetisere a) en første populasjon av oligonukleotider, som omfatter oligonukleotider som koder en modifisert VL-region FR, eller del derav, hvori VL-region rammeverksregionen eller del derav inneholder et flertall av endrete aminosyrer ved én eller flere posisjoner, sammenliknet med akseptor rammeverksregionsekvensen, hvori rammeverksposisj onene som er endret er valgt blant akseptor rammeverksposisj onene av den andre referansesekvensen som avviker på den korresponderende posisjonen, sammenliknet med donor rammeverksposisjonene av den første referansesekvensen; og b) en andre populasjon av oligonukleotider, som hver koder i) minst en modifisert CDR eller del derav, hvori den modifiserte CDR eller del derav omfatter en annen aminosyre ved én eller flere posisjoner, sammenliknet med den korresponderende donor-CDR-aminosyrereferansesekvensen; og ii) én eller flere deler av tilstøtende FR'er som er i stand til å hybridisere den første populasjonen av oligonukleotider; og c) å blande populasjonen av første oligonukleotider med de andre oligonukleotidene for å konstruere overlappende oligonukleotider; og d) å behandle de overlappende oligonukleotider under betingelser slik at en populasjon av endret VL-regionkodende nukleinsyrer konstrueres. I en annen utførelsesform er representasjonen av første og andre referansesekvenser i elektronisk form. I ytterligere utførelsesformer omfatter fremgangsmåtene ytterligere trinnet av e) å samtidig uttrykke populasjonen av endret VL-regionkodende nukleinsyrer med en tungkjede variabelregionkodende nukleinsyre for å produsere en mangfoldig populasjon av endrete, heteromere variable regioner.

I noen utførelsesformer omfatter fremgangsmåtene a) å tilveiebringe en representasjon av første og andre referanseaminosyresekvenser, der den første referansesekvensen omfatter en donor VH-regionsekvens, der den donorvariable regionen omfatter i) FR'er, og ii) tre CDR'er som definert ved de kombinerte definisjonene til Kabat og Chothia; den andre referanseaminosyresekvensen omfatter sekvensen av en akseptor VH-region omfattende FRer; b) å syntetisere a) en første populasjon av oligonukleotider, som omfatter oligonukleotider som koder en modifisert VH-region rammeverksregion, eller del derav, hvori VH-region FR, eller del derav inneholder et flertall av endrete aminosyrer ved én eller flere posisjoner, sammenliknet med akseptor FR referansesekvensen, hvori rammeverksposisj onene som er endret er valgt blant akseptor rammeverksposisj onene av den andre referansesekvensen som avviker på den korresponderende posisjonen, sammenliknet med donor rammeverksposisjonene av den første referansesekvensen; og b) en andre populasjon av oligonukleotider, som hver koder i) minst en modifisert CDR eller del derav, hvori den modifiserte CDR eller del derav omfatter en annen aminosyre ved én eller flere posisjoner, sammenliknet med den korresponderende donor-CDR-aminosyrereferansesekvensen; og ii) én eller flere deler av tilstøtende FR'er som er i stand til å hybridisere til den første populasjonen av oligonukleotider; og c) å blande populasjonen av første oligonukleotider med de andre oligonukleotidene for å konstruere overlappende oligonukleotider; og d) å forlenge de overlappende oligonukleotider med en DNA-polymerase under betingelser slik at en populasjon av endret VH-regionkodende nukleinsyrer konstrueres.

I andre utførelsesformer tilveiebringer foreliggende beskrivelse fremgangsmåter for konstruksjon av en populasjon av endrete VL-regionkodende nukleinsyrer, som omfatter: A) å tilveiebringe en representasjon av første og andre referanseaminosyresekvenser, der den første referansesekvensen omfatter en donor VL-regionsekvens, der den donorvariable regionen omfatter i) FRer, og ii) tre CDRer som definert ved de kombinerte definisjonene til Kabat og Chothia; den andre referanseaminosyresekvensen omfatter sekvensen av en akseptor VL-region omfattende FR'er; B) å syntetisere a) en første populasjon av oligonukleotider, som omfatter oligonukleotider som koder en modifisert VL-region FR, eller del derav, hvori VL-region FR eller del derav inneholder et flertall av endrete aminosyrer ved én eller flere posisjoner, sammenliknet med akseptor FR-referansesekvensen, hvori rammeverksposisjonene som er endret er valgt blant akseptor rammeverksposisjonene av den andre referansesekvensen som avviker i den korresponderende posisjonen,

sammenliknet med donor rammeverksposisjonene av den første referansesekvensen; og

ved én eller flere posisjoner, sammenliknet med den korresponderende donor-CDR-aminosyrereferansesekvensen; og ii) én eller flere deler av tilstøtende FR'er som er i stand til å hybridisere til den første populasjonen av oligonukleotider; og c) å blande populasjonen av første oligonukleotider med de andre oligonukleotidene for å konstruere overlappende oligonukleotider; og d) å forlenge de overlappende oligonukleotider med en DNA-polymerase under betingelser slik at en populasjon av endret VL-regionkodende nukleinsyrer konstrueres.

I noen utførelsesformer introduseres én eller flere modifikasjoner i rammeverket samtidig med introduksjon av én eller flere modifiserte CDR. De modifiserte CDR'er kan omfatte én eller flere aminosyreendringer i sammenlikning med den korresponderende CDR av en referansesekvens. I visse utførelsesformer omfatter fremgangsmåtene å konstruere en populasjon av endret VH-regionkodende nukleinsyrer, som omfatter a) å tilveiebringe en representasjon av første og andre referanseaminosyresekvenser, der den første referansesekvensen omfatter en donor VH-regionsekvens, der den donorvariable regionen omfatter i) FRer, og ii) tre CDRer som definert ved de kombinerte definisjonene til Kabat og Chothia; den andre referanseaminosyresekvensen omfatter sekvensen av en akseptor VH-region omfattende FR'er; b) å syntetisere i) en første populasjon av oligonukleotider, som hver koder minst én modifisert CDR, hvori den modifiserte CDR omfatter en annen aminosyre ved én eller flere posisjoner, sammenliknet med den korresponderende donor-CDR-aminosyrereferansesekvensen; og ii) en andre populasjonen av oligonukleotider, omfattende oligonukleotider som koder modifiserte deler av et VH-regionrammeverk, den modifiserte delen inneholder et flertall av endrete aminosyrer i én eller flere posisjoner, sammenliknet med akseptor rammeverksregion referansesekvensen, hvori rammeverksposisjonene som er endret er valgt blant akseptor rammeverksposisjonene av den andre referansesekvensen som avviker ved den korresponderende posisjonen, sammenliknet med donor rammeverkposisj onene av den første referansesekvensen; c) å blande populasjonen av første oligonukleotider med de andre oligonukleotidene under betingelser slik at minst en del av oligonukleotidene hybridiserer for å konstruere overlappende oligonukleotider; og d) å behandle de overlappende oligonukleotider under betingelser slik at en populasjon av endret VH-regionkodende nukleinsyrer konstrueres. I visse utførelsesformer er representasjonen av første og andre referansesekvenser i elektronisk form. I ytterligere utførelsesformer omfatter fremgangsmåtene ytterligere trinnet av e) å samtidig uttrykke populasjonen av endret VH-regionkodende nukleinsyrer med en VL-regionkodende nukleinsyre for å produsere en mangfoldig populasjon av endrete heteromere, variable regioner. I andre utførelsesform er akseptaren human.

I andre utførelsesformer tilveiebringer foreliggende beskrivelse fremgangsmåter for konstruksjon av en populasjon av endrete VL-regionkodende nukleinsyrer, som omfatter: A) å tilveiebringe en representasjon av første og andre referanseaminosyresekvenser, der den første referanseaminosyresekvensen omfatter en donor VL-regionsekvens, der den donorvariable regionen omfatter i) FR'er, og ii) tre CDR'er som definert ved de kombinerte definisjonene til Kabat og Chothia; den andre referanseaminosyresekvensen omfatter sekvensen av en akseptor VL-region omfattende FR'er; B) å syntetisere i) en første populasjon av oligonukleotider, som hver koder for minst en modifisert CDR, hvori den modifiserte CDR omfatter en annen aminosyre ved én eller flere posisjoner, sammenliknet med den korresponderende donor-CDR-aminosyrereferansesekvensen; og ii) en andre populasjonen av oligonukleotider, som omfatter oligonukleotider som koder modifiserte deler av et VL-regionrammeverk, den modifiserte delen inneholder et flertall av endrete aminosyrer ved én eller flere posisjoner, sammenliknet med akseptor FR referansesekvensen, hvori rammeverksposisjonene som er endret er valgt blant akseptor rammeverksposisjonene av den andre referansesekvensen som avviker ved den korresponderende posisjonen, sammenliknet med donor rammeverksposisjonene av den første referansesekvensen; c) å blande populasjonen av første oligonukleotider med de andre oligonukleotidene under betingelser slik at minst en del av oligonukleotidene hybridiserer for å konstruere overlappende oligonukleotider; og d) å behandle de overlappende oligonukleotider under betingelser slik at en populasjon med endret VL-regionkodende nukleinsyrer konstrueres.

I visse utførelsesformer kan antistoffene eller antistoffragmentene som omfatter en Fc-variant og en endret tungkjedevariantregion genereres. I noen utførelsesformer tilveiebringer for eksempel foreliggende beskrivelse fremgangsmåter for å konstruere en populasjon av endrete VH-regionkodende nukleinsyrer, som omfatter: A) å tilveiebringe en representasjon av første og andre referanseaminosyresekvenser, der den første referansesekvensen omfatter en donor VH-regionsekvens, der den donorvariable regionen omfatter i) FR'er, og ii) tre CDR'er som definert ved de kombinerte definisjonene til Kabat og Chothia; den andre referansesekvensen omfatter sekvensen fra en akseptor VH-region omfattende FRer; B) å syntetisere a) de første oligonukleotider som koder deler av FRene av akseptor VH-region, hvori delene av FR'ene når de sammenliknes med referansesekvensen er umodifiserte; og b) en populasjon av andre oligonukleotider, som hver koder i) minst en del av en første CDR som er modifisert, den første CDR valgt fra gruppen bestående av HCDR1, HCDR2 og HCDR3, hvori den modifiserte første CDR omfatter en annen aminosyre ved én eller flere posisjoner, sammenliknet med de korresponderende donor-CDRene fra den første referansesekvensen; og ii) én eller flere deler av umodifiserte FRer som er i stand til å hybridisere til de første oligonukleotidene; c) å blande de første oligonukleotider med de andre oligonukleotidene for å konstruere overlappende oligonukleotider; og d) å behandle de overlappende oligonukleotider under betingelser slik at en populasjon av endret VH-regionkodende nukleinsyrer konstrueres, hvori FRene som kodes av de endrete VH-regionkodende nukleinsyrene er umodifiserte med hensyn til den andre referansesekvensen. I noen utførelsesformer omfatter fremgangsmåten ytterligere trinnet å samtidig uttrykke populasjonen av endret VH-regionkodende nukleinsyrer med en VL-regionkodende nukleinsyre for å produsere en mangfoldig populasjon av endrete, heteromere variable regioner.

I andre utførelsesformer tilveiebringer foreliggende beskrivelse fremgangsmåter for konstruksjon av en populasjon av endrete VL-regionkodende nukleinsyrer, som omfatter: A) å tilveiebringe en representasjon av første og andre referanseaminosyresekvenser, der den første referansesekvensen omfatter en donor VL-regionsekvens, der den donorvariable regionen omfatter i) FRer, og ii) tre CDRer som definert ved de kombinerte definisjonene til Kabat og Chothia; den andre referansesekvensen omfatter sekvensen fra en akseptor VL-region omfattende FRer; B) å syntetisere a) første oligonukleotider som koder deler av FRene av akseptor-VL-regionen, hvori delene av FRene, sammenliknet med den andre referansesekvensen er umodifisert; og b) en populasjon av andre oligonukleotider, som hver koder i) minst én del av en første CDR som er modifisert, den første CDR er valgt fra gruppen bestående av bestående av LCDR1, LCDR2 og LCDR3, hvori den modifiserte første CDR omfatter en annen aminosyre ved én eller flere posisjoner, sammenliknet med de korresponderende donor-CDRene fra den første referansesekvensen; og ii) én eller flere deler av umodifiserte FRer som er i stand til å hybridisere til de første oligonukleotider;

c) å blande populasjonen av første oligonukleotider med de andre oligonukleotidene for å konstruere overlappende oligonukleotider; og d) å behandle de overlappende

oligonukleotider under betingelser slik at en populasjon av endret VL-regionkodende nukleinsyrer konstrueres, hvori FRene som kodes av de endrete VL-regionkodende nukleinsyrene er umodifiserte med hensyn til den andre referansesekvensen.

I andre utførelsesformer tilveiebringer foreliggende beskrivelse fremgangsmåter for konstruksjon av en populasjon av endrete VH-regionkodende nukleinsyrer, som omfatter: A) å tilveiebringe en representasjon av første og andre referanseaminosyresekvenser, der den første referansesekvensen omfatter en donor VL-regionsekvens, der den donorvariable regionen omfatter i) FRer, og ii) tre CDRer som definert ved de kombinerte definisjonene til Kabat og Chothia; den andre referansesekvensen omfatter sekvensen fra en akseptor VH-region omfattende FRer; B) å syntetisere a) en populasjon av første oligonukleotider, som hver koder for minst en del av en første CDR valgt fra gruppen bestående av HCDR1, HCDR2 og HCDR3, hvori den modifiserte første CDR omfatter en annen aminosyre ved én eller flere posisjoner, sammenliknet med de korresponderende donor-CDR'ene fra den første referansesekvensen; og b) andre oligonukleotider som koder i) deler av FRene av akseptor-VH-regionen, hvor delene av FR'ene, sammenliknet med referansesekvensen er umodifiserte, og ii) én eller flere deler av en CDR som er i stand til å hybridisere til populasjonen av første oligonukleotider; og C) å blande populasjonen av første oligonukleotider med de andre oligonukleotidene for å konstruere overlappende oligonukleotider; og D) å behandle de overlappende oligonukleotider under betingelser slik at en populasjon av endret VH-regionkodende nukleinsyrer konstrueres, hvori FR'ene som kodes av de endrete VH-regionkodende nukleinsyrene er umodifiserte med hensyn til den andre referansesekvensen.

I visse utførelsesformer omfatter fremgangsmåtene trinnet å samtidig uttrykke populasjonen av endrete VH-regionkodende nukleinsyrer med en VL-regionkodende nukleinsyre for å produsere en mangfoldig populasjon av endrete, heteromere, variable regioner.

I andre utførelsesformer tilveiebringer foreliggende beskrivelse fremgangsmåter for konstruksjon av en populasjon av endrete VL-regionkodende nukleinsyrer, som omfatter: A) å tilveiebringe en representasjon av første og andre referanseaminosyresekvenser, der den første referansesekvensen omfatter en donor VL-regionsekvens, der den donorvariable regionen omfatter i) FR'er, og ii) tre CDR'er som definert ved de kombinerte definisjonene til Kabat og Chothia; den andre referansesekvensen omfatter sekvensen fra en akseptor VL-region omfattende FRer; B) å syntetisere a) en populasjon av første oligonukleotider, som hver koder for minst en del av en første CDR valgt fra gruppen bestående av LCDR1, LCDR2 og LCDR3, hvori den modifiserte første CDR omfatter en annen aminosyre ved én eller flere posisjoner, sammenliknet med de korresponderende donor-CDR'ene fra den første referansesekvensen; og b) andre oligonukleotider som koder i) deler av FRene av akseptor-VL-regionen, hvor delene av FRene, sammenliknet med referansesekvensen er umodifiserte, og ii) én eller flere posisjoner av en CDR som er i stand til å hybridisere til populasjonen av første oligonukleotider; og C) å blande populasjonen av første oligonukleotider med de andre oligonukleotidene for å konstruere overlappende oligonukleotider; og D) å behandle de overlappende oligonukleotider under betingelser slik at en populasjon av endret VL-regionkodende nukleinsyrer konstrueres, hvori FR'ene som kodes av de endrete VL-regionkodende nukleinsyrene er umodifiserte med hensyn til den andre referansesekvensen.

I andre utførelsesformer tilveiebringer foreliggende beskrivelse fremgangsmåter for å forbedre bindingsaffiniteten av en mutert, humanisert antistoffvariabel region, som omfatter: a) å tilveiebringe en nukleinsyresekvens som koder en første mutert humanisert antistoffvariabel region, der den muterte variabel regionen omfatter i) et villtypehumant antistofframmeverk, ii) tre ikkehumane tungkjede-CDRer og iii) tre ikkehumane lettkjede-CDR'er, hvor CDRene er definert ved de kombinerte definisjonene til Kabat og Chothia; hvor minst én av lettkjede-CDR'ene er en mutasjonsinneholdende lettkjede-CDR, med minst én annen aminosyre ved minst en posisjon, sammenliknet med den korresponderende villtype, ikkehumane CDR, og hvori den første muterte antistoffvariable regionen har en større bindingsaffinitet enn den korresponderende, ikkemuterte antistoffvariable regionen; b) å mutere nukleinsyresekvensen som koder den første muterte antistoffvariable regionen under betingelser slik at en andre mutert, humanisert antistoffvariabel region kodes, og den andre muterte humaniserte antistoffvariable regionen omfatter minst en ytterligere annen aminosyre på minst en posisjon i den mutasjonsinneholdende lettkjede-CDR'en, og den ytterligere mutasjonen i kombinasjon med den første mutasjonen resulterer i større bindingsaffinitet. I noen utførelsesformer er den mutasjonsinneholdende lettkjede-CDR av den første humaniserte antistoffvariable regionen CDR3 (LCDR3).

I andre utførelsesformer omfatter minst én av de ikkehumane tungkjede-CDR'ene av den første muterte, humaniserte antistoffvariable regionen en mutasjon, slik at en annen aminosyre kodes på minst én posisjon, sammenliknet med den korresponderende villtype, ikkehumane CDR. I ytterligere utførelsesformer er tungkjede-CDR-mutasjonen i HCDR3.

I noen utførelsesformer tilveiebringer foreliggende beskrivelse fremgangsmåter for samtidig modifikasjon av minst én CDR og minst én FR, mens det konstrueres en populasjon av endret VH-regionkodende nukleinsyrer, omfattende: a) å tilveiebringe en representasjon av første og andre referanseaminosyresekvenser, der den første referanseaminosyresekvensen omfatter en donor VH-regionsekvens, der den donorvariable regionen omfatter i) fire FR'er, og ii) tre CDRer som definert ved de kombinerte definisjonene til Kabat og Chothia; den andre referanseaminosyresekvensen omfatter sekvensen av en akseptor VH-region som omfatter fire FR'er, som definert ved de kombinerte definisjonene til Kabat og Chothia; b) å syntetisere i) for hver FR som skal modifiseres, en populasjon av oligonukleotider, som hver koder for minst en modifisert FR eller del derav, der den modifiserte FR eller del derav inneholder et flertall av endrete aminosyrer ved én eller flere posisjoner, sammenliknet med den korresponderende rammeverksregionen i akseptor-VH-regionreferansesekvensen, hvori FR-posisjonene som er endret er valgt blant akseptor rammeverksposisjonene i den andre referansesekvensen, som avviker ved den korresponderende posisjonen, sammenliknet med donor rammeverksregionposisj onene av den første referansesekvensen; og ii) for hver CDR som skal modifiseres, en populasjon av oligonukleotider, som hver koder en modifisert CDR eller del derav, hvor den modifiserte CDR omfatter en annen aminosyre ved én eller flere posisjoner, sammenliknet med den korresponderende donor-CDR-aminosyrereferansesekvensen; og iii) for hver gjenværende og umodifisert FR, oligonukleotider som koder FR eller del derav som har den samme sekvensen som den korresponderende FR av den andre referanse akseptorsekvensen; og iv) for hver gjenværende og umodifisert CDR og oligonukleotider som koder CDR'en eller del derav, som har den samme sekvensen som den korresponderende CDR av den første referanse donorsekvensen, hvor individuelle oligonukleotider fra (i) til (iv) som koder tilstøtende deler av VH-regionen har overlappende sekvenser på sine ender; og c) å blande oligonukleotidene og populasjonene av oligonukleotider syntetisert i trinn (b) under betingelser slik at de overlappende sekvensene av individuelle oligonukleotider hybridiserer for å konstruere overlappende oligonukleotider; og d) å behandle de overlappende oligonukleotider under betingelser slik at en populasjon med endret VH-regionkodende nukleotider konstrueres. I visse utførelsesformer er representasjonen av første og andre referansesekvenser i elektronisk form. I ytterligere utførelsesformer er rammeverksregionen som skal modifiseres valgt fra gruppen bestående av HFR1, HFR2 og HFR3.1 andre utførelsesformer er CDR'ene som skal modifiseres HCDR3.1 andre utførelsesformer omfatter fremgangsmåten videre trinnet av e) å samtidig uttrykke populasjonen av VH-regionkodende nukleinsyrer med en VL-regionkodende nukleinsyre for å produsere en mangfoldig populasjon av endrete, heteromere variable regioner. I andre utførelsesformer omfatter fremgangsmåten også trinnet av e) å samtidig uttrykke populasjonen av VH-regionkodende nukleinsyrer med en populasjon av VL-regionkodende nukleinsyre for å produsere en mangfoldig populasjon av endrete, heteromere variable regioner.

I andre utførelsesformer anvender fremgangsmåtene for samtidig modifikasjon minst én CDR og minst én FR mens det konstrueres en populasjon av endrete VL-regionkodende nukleinsyrer, hvori nevnte fremgangsmåte omfatter: a) å tilveiebringe en representasjon av første og andre referanseaminosyresekvenser, der den første referanseaminosyresekvensen omfatter en donor VL-regionsekvens, der den donorvariable regionen omfatter i) fire FR'er, og ii) tre CDRer som definert av de kombinerte definisjonene til Kabat og Chothia; den andre referanseaminosyresekvensen omfatter sekvensen av en akseptor VL-region som omfatter fire FR'er, som definert av de kombinerte definisjonene til Kabat og Chothia; b) å syntetisere i) for hver FR som skal modifiseres, en populasjon av oligonukleotider, som hver koder for minst en modifisert FR eller del derav, der den modifiserte FR eller del derav inneholder et flertall av endrete aminosyrer ved én eller flere posisjoner, sammenliknet med den korresponderende rammeverksregionen i akseptor-VL-regionreferansesekvensen, hvori FR-posisj onene som er endret er valgt blant akseptor FR-posisjonene i den andre referansesekvensen, som avviker ved den korresponderende posisjonen, sammenliknet med donor FR-posisjonene av den første referansesekvensen; og ii) for hver CDR som skal modifiseres, en populasjon av oligonukleotider, som hver koder en modifisert CDR eller del derav, hvor den modifiserte CDR omfatter en annen aminosyre ved én eller flere posisjoner, sammenliknet med den korresponderende donor-CDR- aminosyrereferansesekvensen; og iii) for hver gjenværende og umodifisert FR-region, oligonukleotider som koder FR eller del derav som har den samme sekvensen som den korresponderende FR av den andre referanseakseptorsekvensen; og iv) for hver gjenværende og umodifisert CDR og oligonukleotider som koder CDR en eller del derav, som har den samme sekvensen som den korresponderende CDR av den første referansedonorsekvensen, hvor individuelle oligonukleotider fra (i) til (iv) som koder tilstøtende deler av VL-regionen, har overlappende sekvenser på sine ender; og c) å blande oligonukleotidene og populasjonene av oligonukleotider syntetisert i trinn (b) under betingelser slik at de overlappende sekvensene av individuelle oligonukleotider hybridiserer for å konstruere overlappende oligonukleotider; og d) å behandle de overlappende oligonukleotider under betingelser slik at en populasjon med endret VL-regionkodende nukleotider konstrueres. I visse utførelsesformer omfatter fremgangsmåtene også trinnet av å samtidig uttrykke populasjonen av VL-regionkodende nukleinsyrer med en VH-regionkodende nukleinsyre for å produsere en mangfoldig populasjon av endrete, heteromere, variable regioner.

( v) Flerspesifikke antistoffer

Foreliggende beskrivelse tilveiebringer flerspesifikke antistoffer omfattende en Fc-regionvariant. Flerspesifikke antistoffer har bindingsspesifisiteter for minst to ulike antigener. Mens slike molekyler normalt bare vil binde to antigener (dvs. bispesifikke antistoffer, BsAbs), er antistoffer med ytterligere spesifisiteter, slik som trispesifikke antistoffer omsluttet ved dette uttrykket når det anvendes heri. Eksempler på BsAbs inkluderer uten å være begrenset til de med én arm rettet mot et tumorcelleantigen, og den andre armen rettet mot et cytotoksisk utløsermolekyl, slik som anti-FcyRI/anti-CD15, anti-pl 85HER2/FcyRIII (CD 16), anti-CD3/anti-malign B-celle (D1D0), anti-CD3/antipl 85HER2, anti-CD3/anti-p97, anti-CD3/anti-nyrecellekarsinom, anti-CD3/anti-OVCAR-3, anti-CD3/L-D I (anti-tykktarmskarsinom), anti-CD3/anti-melanocyttstimulerende hormonanalog, anti-EGF reseptor/anti-CD3, anti-CD3/anti-CAMAI, anti-CD3/anti-CD19, anti-CD3/MoV18, anti-nervecelleadhesjonsmolekyl (NCAM)/anti-CD3, anti-folatbindende protein (FBP)/anti-CD3, anti-pan karsinomassosiert antigen (AMOC-31)/anti-CD3; BsAbs med en arm som binder spesifikt til et tumorantigen, og en arm som binder til et toksin, slik som anti-saporin/anti-id-1, anti-CD22/anti-saporin, anti-CD7/anti-saporin, anti-CD38/anti-saporin, anti-CEA/anti-risin A-kjede, anti-interferon-a (IFN-a)/anti-hybridomidiotype, anti-CEA/anti-vinca alkaloid; BsAbs for omdannende enzymaktiverte promedikamenter som anti-CD30/anti-alkalisk fosfatase (som katalyserer omdannelse av mitomycinfosfat promedikament til mitomycinalkohol); BsAbs som kan anvendes som fibrinolytiske midler, slik som anti-fibrin/anti-vevsplasminogenaktivator (tPA), anti-fibrin/antiurokinasetype plasminogenaktivator (uPA); BsAbs for målretting av immunkomplekser til celleoverflatereseptorer som anti-lav tetthets lipoprotein (LDL)/anti-FcR (for eksempel FcyRI, FcyRII eller FcyRIII); BsAbs for anvendelse i terapi ved infeksjonssykdommer som anti-CD3/anti-herpes simplex virus (HSV), anti-T-cellereseptor: CD3 kompleks/anti-influenza, anti-FcyR/anti-HIV; BsAbs for tumorpåvisning in vitro eller in vivo, slik som anti-CEA/anti-EOTUBE, anti-CEA/anti-DPTA, anti-pl85HER2/anti-hapten; BsAbs som vaksineadjuvanser; og BsAbs som diagnostiske verktøy, som anti-kaninlgG/anti-ferritin, anti-pepperrotperoksidase (HRP)/anti-hormon, anti-somatostatin/anti-substans P, anti-HRP/anti- FITC, anti-CEA/anti-p-galaktosidase.

Eksempler på trispesifikke antistoffer inkluderer, men er ikke begrenset til anti-CD3/anti-CD4/anti-CD37, anti-CD3/anti-CD5/anti-CD37 og anti-CD3/anti-CD8/anti-CD37. Bispesifikke antistoffer kan fremstilles som fullengde antistoffer eller antistoffragmenter (for eksempel F(ab')2bispesifikke antistoffer). Fremgangsmåter for å konstruere bispesifikke antistoffer er kjent i fagfeltet. Tradisjonell produksjon av fullengde bispesifikke antistoffer er basert på samtidig ekspresjon av to immunglobulintungkjede- lettkjede par, hvor de to kjedene har ulike spesifisiteter (for eksempel Millstein et al, Nature, 305:537-539 (1983)). På grunn av den tilfeldige sortering av immunglobulin tung- og lettkjeder, produserer disse hybridomene (kvadromer) en potensiell blanding av ti forskjellige antistoffmolekyler der bare ett har den korrekte bispesifikke strukturen. Rensing av det korrekte molekylet kan utføres ved affinitetskromatografitrinn. Liknende fremgangsmåter er angitt i WO93/08829, og Traunecker et al, EMBO J., 10:3655-3659 (1991).

I en annen tilnærming fusjoneres antistoffvariable doméner med de ønskete bindingsspesifisiteter (antistoff-antigen kombinerende seter) til immunglobulinkonstante doménesekvenser. Fusjoneringen er fortrinnsvis med et immunglobulin tungkjedekonstant doméne, omfattende minst en del av hengselet, CH2 og CH3 regionene. Det foretrekkes å ha den første tungkjedekonstantregionen (CH1) inneholdende det nødvendige setet for lettkjedebinding, som er til stede i minst én av fusjonene. DNA som koder immunglobulintungkjedefusjonene, og dersom ønskelig immunglobulinlettkjeden, innsettes i separate ekspresjonsvektorer, og infiseres samtidig i en passende vertsorganisme. Dette sørger for stor fleksibilitet i å justere de innbyrdes proporsjoner av de tre polypeptidfragmentene i utførelsesformer når ulike forhold av de tre polypeptidkjedene anvendes i konstruksjoner gir optimale utbytter. Det er imidlertid mulig å innsette de kodende sekvensene for to eller alle tre polypeptidkj edene i en ekspresjonsvektor når ekspresjonen av minst to polypeptidkj eder i like forhold resulterer i store utbytter eller når forholdene ikke er av betydning. I en foretrukket utførelsesform av denne fremgangsmåten er de bispesifikke antistoffer som består av en hybrid immunglobulintungkjede med en første bindingsspesifisitet i en arm, og et hybrid immunglobulintungkjede- lettkjedepar (som gir en andre bindingsspesifisitet) i den andre armen (se for eksempel WO94/04690). I henhold til en annen fremgangsmåte beskrevet i WO96/27011 kan grenseflaten mellom et par av antistoffmolekyler konstrueres for å maksimere prosentandelen av heterodimerer som er gjenvunnet fra rekombinant cellekultur. Spesifikke antistoffer inkluderer også krysskoblete eller "heterokonjugat" antistoffer. Ett av antistoffene i heterokonjugatet kan for eksempel kobles til avidin, og det andre til biotin.

B. Immunadhesinmolekyler

Foreliggende beskrivelse tilveiebringer også immunadhesinmolekyler omfattende en Fc-regionvariant. Én type immunadhesin konstruksjon kombinerer bindingsdoménene av adhesinet (for eksempel det ekstracellulære doménet (ECD) av en reseptor) med Fc-regionen av en immunglobulintungkjede (for eksempel en Fc-regionvariant). Ved fremstilling av immunadhesiner, vil vanligvis nukleinsyre som koder adhesinbindingsdoménet fusjoneres ved C-terminalen til nukleinsyre som koder N-terminalen av en immunglobulinkonstantdoménesekvens, imidlertid er N-terminale fusjoner også mulig.

I slike fusjoner vil vanligvis det kodete, kimære polypeptidet beholde minst det funksjonelt aktive hengsle, CH2 og CH3 doméner av konstantregionen av en immunglobulintungkjede. Fusjoner lages også av den C-terminale ende av Fc-delen av et konstant doméne, eller øyeblikkelig N-terminal for CH1 av tungkjeden eller den korresponderende regionen av lettkjeden. Det nøyaktige setet der fusjonen konstrueres er ikke kritisk; bestemte seter er godt kjent og kan velges for å optimalisere den biologiske aktivitet, sekresjon eller bindingsegenskaper til immunadhesinet.

I noen utførelsesformer fusjoneres adhesinsekvensen til den N-terminale ende av Fc-regionvariant av immunglobulin Gl. det er mulig å fusjonere den fullstendige tungkjedekonstante regionen til adhesinsekvensen. I foretrukne utførelsesformer er imidlertid en sekvens som begynner i hengselregionen rett oppstrøms for papainkløvingssetet som definerer IgG Fc-kjemisk (dvs. rest 216 ved å ta den første resten av tungkjedekonstantregionen til å være 114), eller analoge seter av andre immunglobuliner anvendes i fusjonen. I visse foretrukne utførelsesformer fusjoneres adhesinaminosyresekvensen til (a) hengselregionen og CH2 og CH3 eller (b) CH1, hengsel, CH2 og CH3 doménene av en IgG tungkjede. I noen utførelsesformer er immunadhesinene bispesifikke. Alternativt kan adhesinsekvensene innsettes mellom immunglobulintungkjede- og lettkjedesekvenser, slik at immunglobulin som omfatter en kimær tungkjede oppnås. I slike utførelsesformer kan adhesinsekvensene fusjoneres til den 3' ende av en immunglobulintungkjede i hver arm av et immunglobulin, enten mellom hengsel og CH2 doménet eller mellom CH2 og CH3 doménene (se for eksempel Hoogenboom et al, Mol. Immunol., 28:1027-1037 (1991).

Selv om nærværet av en immunglobulinlettkjede ikke er nødvendig i immunadhesinene ifølge foreliggende oppfinnelse, kan en immunglobulinlettkjede være til stede, enten kovalent assosiert til et adhesin-immunglobulintungkjedefusjonspolypeptid, eller direkte fusjonert til adhesinet. I det førstnevnte tilfellet uttrykkes DNA som koder en immunglobulinlettkjede vanligvis samtidig med DNA'et som koder adhesin-immunglobulintungkjedefusjonsproteinet. Ved sekresjon assosieres hybridet av tungkjede og lettkjede kovalent for å tilveiebringe en immunglobulin-liknende struktur, som omfatter to disulfidbundne immunglobulintungkjede-lettkjedepar. Egnete fremgangsmåter for fremstilling av slike strukturer er for eksempel angitt i US 4 816 567.

I foretrukne utførelsesformer konstrueres immunadhesiner ved å fusjonere cDNA-sekvensen som koder adhesindelen i leseramme med en immunglobulin cDNA-sekvens. Fusjon til genomiske immunglobulinfragmenter kan imidlertid også anvendes. Den sistnevnte type fusjon krever generelt tilstedeværelse av Ig-regulatoriske sekvenser for ekspresjon. CDNA'er som koder IgG tungkjedekonstante regioner kan isoleres, basert på publiserte sekvenser fra cDNA-bibliotek avledet fra milt eller perifere blodlymfocytter ved hybridisering eller ved PCR-teknikker. CDNA som koder "adhesinet" og immunglobulindelene av immunadhesinet kan innsettes i tandem i en plasmidvektor som styrer effektiv ekspresjon i de valgte vertscellene.

Endret halveringstid av polypeptidvarianter

Den neonatale Fc-reseptoren "FcRn" er et viktig histokompabilitetskompleks (MHC) homolog som ikke bare leverer IgG mor/barn-barrieren under svangerskapsperioden, men involveres også i regulering av IgG serumhalveringstid. For en nylig FcRn gjennomgåelse, se Ghetie, V. og E. S. Ward, Annu. Rev. Immunol., 18:739-766, 2000. FcRn binder til IgG på en pH-avhengig måte med binding forekommende ved lett sur pH og lite eller ingen påvisbar binding ved pH 7,4. Det er postulert at IgG tas opp ved FcRn-uttrykkende celler, og entrer sure endosomer hvor FcRn-IgG interaksjon forekommer. IgGene transporteres så til celleoverflaten og frigjøres ved nær nøytral pH. IgGer som ikke binder FcRn etter opptak i celler entrer lysosomale avdelinger og degraderes. I samsvar med denne modellen er hypotesen at polypeptider som omfatter en Fc-regionvariant som binder til FcRn med øket affinitet har en lenger serumhalveringstid enn de med mindre affinitet.

FcRn's rolle som en IgG transportør viser at Fc-regionvarianter med endret affinitet til FcRn kan ha terapeutisk anvendelse, enten i sammenhengen av et monoklonalt antistoff eller når det er funksjonelt festet til et heterologt protein, dvs. et ikke-antistoff. Terapeutiske polypeptider som vil ha fordeler av å bli raskt fjernet fra subjektet eller pasienten, eller ved å ikke bli transportert over en placental membran, for eksempel radioaktivt merkete polypeptider, vil dra fordel av å være funksjonelt festet til en Fc-region som viser redusert FcRn-bindingsaffinitet. Polypeptider som vil dra fordel fra en lengre serumhalveringstid, og derfor trenger tilførsel færre ganger eller ved å bli transportert over en placental membran, vil alternativt fortrinnsvis være funksjonelt festet til en Fc-region som viser forsterket FcRn-bindingsaffinitet (se tabell 2, 5 og 6). Mange kombinasjoner av Fc-egenskaper betraktes, for eksempel en Fc-region med forsterket FcRn-bindingsaffinitet, men liten eller ingen CDC- eller ADCC-aktivitet, kan genereres ved å inkorporere én eller flere Fc-aminosyresubstitusjoner som forsterker FcRn-bindingsaffinitet, som opplistet i tabell 2, inn i for eksempel en IgG4 moder-Fc-region, eller inn i en IgGl-moder-Fc-region i kombinasjon med aminosyresubstitusjon som reduserer CDC- og ADCC-aktivitet.

Foretrukne polypeptider som vil ha fordel av øket serumhalveringstid ved å funksjonelt festes til en Fc-regionvariant ifølge oppfinnelsen som viser forsterket FcRn-bindingsaffinitet sammenliknet med moderpolypeptidet er mammalske terapeutiske polypeptider som inkluderer molekyler som for eksempel renin; veksthormon, humant veksthormon; bovint veksthormon; frigjørende veksthormonfaktor; ghrelin; paratyroidhormon; tyroidstimulerende hormon; lipoprotein; insulin A-kjede;

insulin B-kjede; a-antitrypsin; PAI-1; proinsulin; trombopoietin; follikkelstimulerende hormon; kalsitonin; luteinisierende hormon; glukagoner; koagulasjonsfaktorer som faktor VniC, faktor IX, vevsfaktor og von Willdebrands faktor; antikoagulasjonsfaktorer som Protein C; atrial natriuretisk faktor; lunge overflatestoff; en plasminogenaktivator som urokinase eller human urin eller vevs-type plasminogen aktivator (t-PA); bombesin; trombin; hemopoietisk vekstfaktor; interleukiner, for eksempel IL-1 til IL-10, IL-20; tumornekrosefaktor-a og -P; enkefalinase; et serumalbumin som et humant serumalbumin; mullerian-inhiberende substans;

relaxin A-kjede; relaxin B-kjede; prorelaxin; muse-gonadotropin-assosiert peptid; et mikrobielt protein som P-laktamase; Dnase; inhibin; aktivin; vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF); reseptorer for hormoner eller vekstfaktorer; integrin;

protein A eller D; reumatoide faktorer; en neurotrofisk faktor som hjerne-avledet neurotrofisk faktor (BDNF), neurotrofin-3, -4, -5 eller -6 (NT-3, NT-4, NT-5 eller NT-6), eller en nervevekstfaktor som NGF-P, kardiotrofiner (hjerte hypertrofi faktor) slik som kardiotrofin-1 (CT-1); blodplatederivert vekstfaktor (PDGR); fibroblastvekstfaktor som aFGF og bFGF, epidermal vekstfaktor (EGF) eller dens reseptor; transformerende vekstfaktor (TGF) som TGF-a og TGF-P, inkludert TGF-pi, TGF-P2, TGF-P3, TGF-P4 eller TGF-P5; insulinliknende vekstfaktor-I og -II; des(l-3)-IGF-I (hjerne IGF-I), insulinliknende vekstfaktorbindende proteiner; CD proteiner som CD-3, CD-4, CD-8 og CD-19; erytropoietin; osteoinduktive faktorer;

immuntoksiner; et beinmorfogent protein, en vekstdifferensierende faktor (for eksempel GDF-8); et interferon som interferon-a, -P og -y; kolonistimulerende faktorer (CSF'er), for eksempel M-CSF; GM-CSF og G-CSF; et anti-HER-2 antistoff uten en naturlig Fc-region av et IgG; et anti-RSV antistoff uten en naturlig Fc-region av IgG; superoksiddismutase; T-cellereseptorer; overflatemembranproteiner; nedbrytningsakselererende faktor; viralt antigen slik som for eksempel en del av et HrV-1 hylster; transportprotein; hjemvendende reseptorer; addressiner; regulatoriske proteiner; antistoffer uten en naturlig Fc-region av et IgG; og fragmenter eller forløpere av ethvert av de ovenfor opplistete polypeptidene.

Fc-regionvarianten som omfatter en aminosyresubstitusjon som konfererer en endret serumhalveringstid til polypeptidet (dvs. forsterket FcRn-bindingsaffinitet) det operabelt er festet til, er fortrinnsvis operabelt festet til den karboksy- eller aminoterminale ende av polypeptidet av interesse, som derved genererer et fusjonsprotein.

Nukleinsyresekvenser som koder Fc-regionvarianter

Foreliggende beskrivelse tilveiebringer også nukleinsyresekvenser som koder Fc-regionvarianter, så vel som sammensetninger, vektorer og vertsceller som omfatter nukleinsyresekvenser som koder Fc-regionvarianter. Foreliggende beskrivelse tilveiebringer også rekombinante fremgangsmåter for å produsere Fc-regionvariant.

For rekombinant produksjon av varianter isoleres generelt nukleinsyre som koder varianten og innsettes i en vektor. Vertsceller kan infiseres med vektoren som derved tillater nukleinsyresekvensen å bli amplifisert, og/eller peptidvarianten produseres. Nukleinsyresekvenser som koder peptidvariantene ifølge foreliggende oppfinnelse kan isoleres og sekvenseres ved anvendelse av konvensjonelle fremgangsmåter (for eksempel ved bruk av oligonukleotidprober som er i stand til å binde spesifikt til nukleinsyre som koder varianten). Nukleinsyresekvensen som koder varianten er generelt operabelt koblet til andre elementer, som en signalsekvens (for eksempel sekretoriske signalsekvenser), et startsted for replikasjon, minst ett markørgen, en enhancer, en promoter, en transkripsjonsterminator. I visse utførelsesformer infiseres vertsceller stabilt med nukleinsyre som koder en variant for å generere en cellelinje som uttrykker en bestemt variant. I foretrukne utførelsesformer uttrykkes varianten i CHO-, NSO-, SP2/0-, PER.C6- eller HEK293-celler. Rekombinante fremgangsmåter er godt kjent i fagfeltet.

Nukleinsyresekvenser kan muteres slik at Fc-regionvarianter kan produseres. En nukleinsyresekvens som koder en moder-Fc-region (for eksempel SEQ ID NO: 1-12), kan for eksempel muteres slik at minst en aminosyreendring resulterer når nukleinsyresekvensen uttrykkes. Nukleinsyresekvenser som minst koder en del av en moder-Fc-region kan også for eksempel muteres for å produsere aminosyresekvenser som omfatter minst én del av en Fc-regionvariant.

I bestemte utførelsesformer anvendes kodonbasert syntese for å generere muterte sekvenser. Eksempler på kodonbasert syntese inkluderer for eksempel de som er beskrevet i US 5 264 563; 5 523 388; og 5 808 022.1 korthet kan kodonbasert syntese utføres ved sekvensiell kobling av monomérer på separate støtter for å danne minst to ulike tupletter. Koblingen kan utføres i separate reaksjonsbeholdere, og så blande støttene fra reaksjonsbeholderne, og dele de blandete støttene inn i flere separate reaksjonsbeholdere, og repetere koblingen, blande og inndele trinnene én eller flere ganger i reaksjonsbeholderne, som avslutter med et blande- eller deletrinn. Oligonukleotidene kan også kløves fra støttene.

Terapeutisk anvendelser og formuleringer

I noen utførelsesformer tilveiebringer foreliggende beskrivelse terapeutiske formuleringer omfattende variantene som beskrives heri. Slike sammensetninger kan for eksempel inkludere en polypeptidvariant (eller del derav), som tilveiebringes sammen med fysiologisk akseptable væsker, geléer, faste bærere, fortynningsmidler, adjuvanser, bindemidler og kombinasjoner derav (se for eksempel Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. utg., Osol, A., red. (1980)).

Polypeptidvarianter kan i tillegg anvendes sammen med, før eller etter andre terapeutiske midler, som inkluderer, men er ikke begrenset til salicylater, steroider, immunundertrykkende midler, antistoffer eller antibiotika. Bestemte terapeutiske midler som kan anvendes med variantene ifølge foreliggende oppfinnelse inkluderer, men er ikke begrenset til de følgende azobenzenforbindelsene (US 4 312 806), benzylsubstituerte rodaminderivater (US 5 216 002), sink L-karnosinsalter (US 5 238 931), 3-fenyl-5-karboksypyrazoler og isotiazoler (US 5 294 630) IL-10

(US 5 368 854), kinolin leukotrien synteseinhibitorer (US 5 391 555), 2'-halo-2'-deoksyadenosin (US 5 506 213), fenol- og benzamidforbindelser (US 5 552 439), tributyrin (US 5 569 680), visse peptider (US 5 756 449), omega-3 polyumettete syrer (US 5 792 795), VLA-4 blokkere (US 5 932 214), prednisolonmetasulfobenzoat (US 5 834 021), cytokindempende midler (US 5 888 969), og nikotin (US 5 889 028).

Polypeptidvarianter kan anvendes sammen med midler som reduserer levedyktigheten eller formeringsevnen til en celle. Midler som reduserer levedyktigheten eller formeringsevnen til en celle kan fungere på en rekke måter, for eksempel inkludert inhiberings-DNA-syntese, inhibering av celledeling, indusere apoptose eller indusere ikke-apoptose celledreping. Spesifikke eksempler på cytotoksiske og cytostatiske midler inkluderer, men er ikke begrenset til antiviralt protein av kermesbær, abrin, risin og enhver av deres A-kjeder, doxorubicin, cisplatin, jod-131, yttrium-90, rhenium-188, bismut-212, taxol, 5-fluoruracil VP-16, bleomycin, metotrexat, vindesin, adriamycin, vincristin, vinblastin, BCNU, mitomycin og syklofosfamid og bestemte cytokiner som TNF-a og TNF-p. Cytotoksiske eller cytostatiske midler kan således for eksempel inkludere radionuklider, kjemoterapeutiske medikamenter, proteiner og lektiner. Terapeutiske sammensetninger kan for eksempel inneholde tilsetninger som normalt benyttes, slik som bindermidler, fyllstoffer, bærere, konserveringsmidler, stabiliserende midler, emulgatorer, buffere og hjelpestoffer, som for eksempel farmasøytisk grad av mannitol, laktose, stivelse, magnesiumstearat, natriumsakkarin, cellulose, magnesiumkarbonat og liknende. Disse sammensetningene inneholder vanligvis 1-95 % aktiv ingrediens, fortrinnsvis 2-70 % aktiv ingrediens.

Polypeptidvariantene kan også blandes med fortynnings- eller bindemidler som er forenlige og fysiologisk aksepterbare. Egnete fortynnings- og bindemidler er for eksempel vann, saltoppløsning, dekstrose, glyserol eller liknende, og kombinasjoner derav. I tillegg kan om ønskelig sammensetningene inneholde mindre mengder av hjelpestoffer, slik som fuktemidler eller emulgerende midler, stabiliserende midler eller pH-bufrende midler.

I noen utførelsesformer fremstilles de terapeutiske sammensetningene enten som flytende løsninger eller suspensjoner, som spray eller i faste former. Orale formuleringer inkluderer vanligvis slike normalt anvendte tilsetninger som bindemidler, fyllstoffer, bærere, konserveringsmidler, stabiliserende midler, emulgatorer, buffere og tilsetningsstoffer, som for eksempel farmasøytisk grad av mannitol, laktose, stivelse, magnesiumstearat, natriumsakkarin, cellulose, magnesiumkarbonat og liknende. Disse sammensetningene har form av løsninger, suspensjoner, tabletter, piller, kapsler, formuleringer med vedvarende frigivelse eller pulvere, og inneholder vanligvis 1-95 % aktiv ingrediens, fortrinnsvis 2-70 % aktiv ingrediens. Ett eksempel på en oral sammensetning som er nyttig for leveringen av de terapeutiske sammensetningene ifølge foreliggende oppfinnelse er beskrevet i

US 5 643 602.

Ytterligere formuleringer egnet for andre tilførselsmåter, slik som topikal tilførsel inkluderer salver, tinkturer, kremer, lotions, transdermalt plaster og stikkpiller. For salver og kremer kan tradisjonelle bindemidler, bærere og tilsetningsstoffer kan for eksempel inkludere polyalkylenglykoler eller triglyserider. Ett eksempel på en topikal leveringsfremgangsmåte er beskrevet i US 5 834 016. Andre liposomale leveringsfremgangsmåter kan også anvendes (se for eksempel US 5 851 548 og 5 711 964).

Formuleringene kan også inneholde mer enn én aktiv forbindelse som nødvendig for den bestemte indikasjonen som behandles, fortrinnsvis de med komplementære aktiviteter som ikke påvirker hverandre negativt. Slike molekyler er passende til stede i kombinasjon i mengder som er effektive for det påtenkte formålet.

Preparater for vedvarende frigivelse kan også fremstilles. Egnete eksempler på preparater med vedvarende frigivelse inkluderer halvgjennomtrengelige matriser av faste, hydrofobe polymérer inneholdende polypeptidvarianten, der disse matrisene har form av formete artikler, for eksempel film eller mikrokapsel. Eksempler på matriser med vedvarende frigivelse inkluderer, men er ikke begrenset til polyestere, hydrogelér (for eksempel poly (2-hydroksyetylmetakrylat) eller poly(vinylalkohol)), polylaktider, kopolymerer av L-glutaminsyre og y-etyl-L-glutamat, ikke-degraderbar etylen-vinylacetat, degraderbar melkesyre-glykolsyre kopolymerer, slik som LUPRON DEPOT (injiserbare mikrosfærer sammensatt av melkesyre-glykolsyre kopolymér og leuprolidacetat), og poly-D-(-)-3-hydroksysmørsyre. Mens polymérer som etylen-vinylacetat og melkesyre-glykolsyre muliggjør frigivelse av molekyler i mer enn 100 dager, frigjør visse hydrogelér proteiner for kortere tidsperioder.

Polypeptidvariantene kan anvendes for å behandle et subjekt. Slik behandling kan tilføres et subjekt med en sykdom, eller kan tilføres forebyggende til et subjekt (for eksempel til et subjekt som er predisponert for en sykdom). Eksempel på tilstander som kan behandles inkluderer, men er ikke begrenset til cancer (for eksempel hvor polypeptidvarianten binder HER2-reseptor, CD20 eller vaskulær endotel vekstfaktor (VEGF)); allergiske tilstander som astma (med et anti-IgE antistoff); og LFA-1-formidlete forstyrrelser (for eksempel hvor polypeptidvarianten er et anti-LFA-I eller anti-ICAM-I antistoff), osv.

I foretrukne utførelsesformer omfatter polypeptidvariantene som anvendes for å behandle subjekter antistoffer eller immunadhesiner. I foretrukne utførelsesformer er sykdommene som behandles også antistoff- eller immunadhesinresponsive sykdommer. Eksempler på antistoffresponsive sykdommer inkluderer sykdommer og medisinske tilstander som: lymfom (vist å kunne behandles med RITUXAN, et anti-CD20 antistoff), infeksjonssykdommer (vist å kunne behandles med SYNAGIS, et antistoff rettet mot F-proteinet av respiratorisk syncytialvirus), nyretransplantat (ZENAPAX, et anti-IL-2-reseptor antistoff som er vist å være nyttig), Crohns sykdom og reumatoid artritt (vist å kunne behandles med REMICADE, et anti-TNFa antistoff), brystkarsinom

(vist å kunne behandles med HERCEP1TN, et anti-20 HER2 antistoff), og tykktarmskreft (vist å kunne behandles med EDRECOLOMAB, et anti-17-1 A antistoff). Polypeptidvarianter som anvendes for cancerbehandling omfatter fortrinnsvis en Fc-region aminosyresubstitusjon ifølge oppfinnelsen som konfererer forsterket ADCC-aktivitet og/eller forsterket CDC-aktivitet ved polypeptidet.

I noen utførelsesformer anvendes et polypeptidvariant med forbedret ADCC-aktivitet i behandlingen av sykdommer eller forstyrrelser der nedbrytning eller eliminering av vev eller ukjente mikroorganismer er ønskelig. Varianten kan for eksempel benyttes for å behandle cancer; inflammatoriske lidelser; infeksjoner (for eksempel bakterielle, virale, sopp eller gjærinfeksjoner); og andre tilstander (slik som struma) hvor fjerning av vev er ønskelig. I andre utførelsesformer har polypeptidvarianten redusert ADCC-aktivitet. Slike varianter kan anvendes for å behandle sykdommer eller forstyrrelser der et Fc-regioninneholdende polypeptid med lang halveringstid er ønskelig, men polypeptidet har fortrinnsvis ikke uønskete effektorfunksjoner. For eksempel kan det Fc-regioninneholdende polypeptid være et anti-vevsfaktor (TF) antistoff; anti-IgE antistoff; og anti-integrin antistoff (for eksempel et anti-a 437 antistoff). Den ønskete virkningsmekanismen av slike Fc-regioninneholdende polypeptider kan være å blokkere ligandreseptorbindende par. Videre kan det Fc-regioninneholdende polypeptid med redusert ADCC-aktivitet være et agonistantistoff.

Polypeptidvarianter som anvendes for cancerbehandling vil fortrinnsvis omfatte en Fc-region aminosyresubstitusjon ifølge oppfinnelsen (se for eksempel tabell 2), som konfererer forsterket ADCC-aktivitet og/eller forsterket CDC-aktivitet ved polypeptidet.

Polypeptidvariantene kan tilføres ved ethvert egnet middel, inkludert parenteral, subkutan, topikal, intraperitoneal, intrapulmonar og intranasal, og intralesjonal tilførsel (for eksempel for lokal immunundertrykkende behandling). Parenterale infusjoner inkluderer intramuskulær, intravenøs, intraarterial, intraperitoneal eller subkutan tilførsel. I tillegg tilføres polypeptidvarianten passende ved pulsinfusjon, særlig med avtakende doseringer av polypeptidvarianten. Doseringen gis fortrinnsvis ved injeksjoner, mest foretrukket ved intravenøse eller subkutane injeksjoner, delvis avhengig av om tilførselen er kortvarig eller kronisk.

For forebyggingen eller behandlingen av sykdommer, vil den hensiktsmessige doseringen av polypeptidvariant være avhengig av typen sykdom som skal behandles, graden og forløpet av sykdommen, om polypeptidvarianten gis for forebyggende eller terapeutiske formål, tidligere behandling, pasientens kliniske historie og respons på polypeptidvarianten, og behandlende leges skjønn. Polypeptidvarianten er egnet for tilførsel til pasienten på et tidspunkt eller over en serie av behandlinger.

Avhengig av type grad av sykdommen er omkring 0,1 ug/kg til 15 mg/kg (for eksempel 0,120 mg/kg) av polypeptidvariant er en innledende kandidatdosering for tilførsel til pasienten, ved for eksempel én eller flere separate tilførsler eller ved kontinuerlig infusjon. En typisk daglig dosering kan variere fra omkring 1 ug/kg til 100 mg/kg eller mer, avhengig av faktorene nevnt ovenfor. For gjentatte tilførsler over flere dager eller mer, avhengig av tilstanden, forlenges behandlingen inntil symptomene er tilstrekkelig redusert eller er eliminert. Behandlingsfremdriften kontrolleres enkelt ved konvensjonelle teknikker og analyser, og kan anvendes for å justere doseringen for å oppnå en terapeutisk effekt.

Disse foreslåtte mengder polypeptidvariant er i stor grad gjenstand for terapeutisk skjønn. Nøkkelfaktoren er å velge en hensiktsmessig dose og tidsplanlegging for å oppnå resultatet. Faktorer for vurdering i denne sammenheng inkluderer den bestemte forstyrrelsen som behandles, pattedyret som behandles, den kliniske tilstanden til den individuelle pasient, årsak til forstyrrelsen, setet for levering av antistoffet, den bestemte typen av antistoff, fremgangsmåten for tilførsel, tidsplanleggingen for tilførsel, og andre faktorer kjent for medisinske utøvere.

En terapeutisk effektiv mengde av en polypeptidvariant som skal tilføres er det nødvendige doseringsnivået for en pasient, slik at sykdomssymptomene som behandles reduseres. En terapeutisk effektiv mengde kan i tillegg referere til mengden terapeutisk middel som er tilstrekkelig for forsinke eller minisere eller forhindre start av sykdom, for eksempel forsinke eller minisere eller forhindre spredning av cancer. En terapeutisk effektiv mengde kan referere til mengden av terapeutisk middel (for eksempel polypeptidvariant), men kan også referere til mengden av det terapeutiske middel som gir en terapeutisk fordel i behandlingen eller ledelsen av en sykdom i et subjekt. En terapeutisk effektiv mengde kan videre med hensyn til et terapeutisk middel ifølge oppfinnelsen referere til mengden terapeutisk middel alene, eller i kombinasjon med andre behandlinger som gir en terapeutisk fordel i behandlingen eller ledelsen av en sykdom i et subjekt. Polypeptidvarianten behøver ikke, men kan eventuelt formuleres med én eller flere midler som nå benyttes for å forebygge eller behandle forstyrrelsen det dreier seg om. Den effektive mengden av slike andre midler avhenger av mengden av polypeptidvariant til stede i formuleringen, typen forstyrrelse eller behandling, og andre faktorer diskutert ovenfor. Et første forebyggende eller terapeutisk middel (for eksempel polypeptidvariant eller polypeptid omfattende en Fc-regionvariant ifølge oppfinnelsen, eller funksjonelt fragment derav), kan tilføres før, samtidig med, eller etter tilførselen av et andre forebyggende eller terapeutisk middel til et subjekt med en forstyrrelse.

Terapeutiske midler kan fryses eller lyofiliseres for lagring og rekondisjonering i en egnet steril bærer før anvendelse. Lyofilisering og rekondisjonering kan føre til ulike grader av antistoff aktivitetstap. Det kan være nødvendig å justere doseringene for å kompensere. Generelt foretrekkes en pH mellom 6 og 8.

Anvendelsen av et monoklonalt antistoff som omfatter en Fc-regionvariant ifølge oppfinnelsen for behandling eller forhindring av minst én av de tidligere nevnte forstyrrelser (for eksempel cancer) der antigenet i det monoklonalt antistoffet binder, er skadelig eller som har fordel av reduserte antigennivåer betraktes heri. Anvendelsen av et antistoff omfattende en Fc-regionvariant ifølge foreliggende oppfinnelse for anvendelse i produksjonen av et medikament for behandling av minst en av de tidligere nevnte forstyrrelser betraktes.

Betegnelsene "behandling", "behandle" og liknende refererer til oppnåelsen av en ønsket farmakologisk og/eller fysiologisk virkning. Virkningen kan være forebyggende i betydningen av fullstendig eller delvis forebyggende av en sykdom eller symptomer derav og/eller kan være terapeutisk i betydningen av en delvis eller fullstendig helbredelse av en sykdom og/eller ugunstig innvirkning som kan tilskrives sykdommen. "Behandling" som benyttet heri, inkluderer tilførsel av en forbindelse ifølge oppfinnelsen for behandling av en sykdom eller tilstand i et pattedyr, spesielt et menneske, og inkluderer: (a) å forebygge sykdommen fra å opptre i et subjekt som kan være predisponert til sykdommen, men som ennå ikke er diagnostisert å ha den; (b) å inhibere sykdommen, dvs. å stoppe dens utvikling; og (c) å lindre sykdommen, dvs. å forårsake regresjon av sykdommen eller forstyrrelsen, eller lindre symptomer eller komplikasjoner derav. Doseringsregimer kan justeres for å gi best mulig ønsket respons (for eksempel en terapeutisk eller forebyggende respons). For eksempel kan en enkel bolus tilføres, flere oppdelte doser kan tilføres over tid, eller dosen kan forholdsmessig reduseres eller økes som angitt ved kravene til den terapeutiske situasjonen.

Anti-CD20 antistoffer

Et anti-CD20 antistoff som omfatter en Fc-regionvariant er beskrevet (se for eksempel Eksempel 4 og Figur 4). Et anti-CD20 antistoff en Fc-regionvariant eller deler derav omfattende aminosyresubstitusj onen, som opplistet i tabell 1 til 10 heri, anti-CD20 antistoffet kan også omfatte et peptid med sekvensen fremsatt i SEQ ID NO: 13, 14, 15 eller 16.1 en annen utførelsesform omfatter et anti-CD20 antistoff en Fc-regionvariant, eller del derav omfattende aminosyresubstitusj onen, som opplistet i tabell 1 til 10 heri, og omfatter videre peptider med sekvensene fremsatt i: a) SEQ ID NO: 13 og SEQ ID NO: 14;

b) SEQ ID NO: 15 og SEQ ID NO: 16,

c) SEQ ID NO: 17, 18, 19, 20, 21 og 22; eller

d) SEQ ID NO: 23, 24, 25, 26, 27 og 28.

Anti-CD20 antistoffet ifølge oppfinnelsen omfatter en Fc-regionvariant, omfattende

aminosyresubstitusjon(er) valgt fra gruppen bestående av:

a) 2471 og 339D; og b) 247Iog339Q

og omfatter videre en variabel region omfattende polypeptider med sekvensene:

SEQ ID NO: 13 og SEQ ID NO: 14.

Ytterligere anvendelser av Fc-regionvariant

Variantene og nukleinsyresekvensene som koder varianter ifølge foreliggende beskrivelse kan anvendes på mange måter. Varianter kan for eksempel anvendes medikament screeningsanalyser. Kandidatforbindelser kan for eksempel evalueres for deres evne til å endre eller interferere med Fc-effektorfunksjoner ved å kontakte en variant med kandidatforbindelsen og bestemme binding av kandidatforbindelsen til varianten. Varianten kan immobiliseres ved kjente fremgangsmåter i fagfeltet, som å binde et GST-variant fusjonsprotein til et polymér kuleinneholdende glutation. Et kimært gen som koder et GST-fusjonsprotein konstrueres ved å sammensmelte DNA som koder varianten av interesse til DNA'et som koder den karboksylterminale ende av GST (se for eksempel Smith et al., Gene, 67:31 (1988)). Det sammensmeltete konstrukt transformeres inn i et egnet ekspresjonssystem (for eksempel E. coli XA90), der ekspresjonen av det GST-fuserte proteinet kan induseres med isopropyl-f-D-tiogalaktopyranosid (IPTG). Induksjon med IPTG bør gi det fuserte proteinet som en viktig bestanddel av oppløselige, cellulære proteiner. Fusjonsproteinet kan renses ved fremgangsmåter som er kjent i fagfeltet, og inkluderer rensing ved glutation affinitetskromatografi. Binding av kandidatforbindelsen til varianten korreleres med forbindelsens evne til å ødelegge én eller flere effektorfunksjoner.

I en annen screeningsfremgangsmåte immobiliseres enten varianten eller en valgt FcR ved kjente fremgangsmåter i fagfeltet, slik som adsorpsjon til en plastikk mikrotiterplate eller spesifikk binding av et GST-fusjonsprotein til et polymér kuleinneholdene glutation. GST-variant er for eksempel bundet til glutation-sefarosekuler. Den immobiliserte varianten kontaktes så med en FcR og en kandidatforbindelse. Ubundet peptid fjernes deretter, og komplekset gjøres oppløselig og analyseres for å bestemme mengden bundet, merket peptid. En bindingsreduksjon er en indikasjon på at kandidatforbindelsen inhiberer interaksjonen av variant med FcR. Denne screeningsfremgangsmåten er spesielt nyttig med varianter ifølge foreliggende oppfinnelse, som viser øket nivå av En variasjon av denne fremgangsmåten tillater screening av forbindelser som er i stand til å ødelegge et tidligere variant/Fc-reseptor-kompleks. I noen utførelsesformer omfatter for eksempel et kompleks omfattende en variant som er bundet til en FcR immobilisert, som beskrevet ovenfor, og kontaktes med en kandidatforbindelse. Oppløsningen av komplekset med kandidatforbindelsen korrelerer med forbindelsens evne til å ødelegge eller inhibere interaksjonen mellom varianten som testes og FcR. Med hensyn til dette kan forbindelser med terapeutisk potensiale (for eksempel i mennesker) identifiseres (for eksempel forbindelser som er nyttige i behandling av humane sykdommer, slik som autoimmune sykdommer).

En annen teknikk for medikamentscreening tilveiebringer høyytelsesscreening for forbindelser som har egnet bindingsaffinitet til peptidvarianter, og er beskrevet detaljert i WO84/03564.1 korthet syntetiseres store antall av forskjellige peptidtestforbindelser på et fast substrat, slik som plastikknåler eller annen overflate. Peptidtestforbindelsene reageres med peptidvarianter og vaskes. Bundne peptidvarianter påvises deretter ved fremgangsmåter godt kjent i fagfeltet.

En annen teknikk anvender antistoffer rettet mot peptidvarianter. Slike antistoffer som er i stand til spesifikt å binde til peptidvarianter konkurrerer med en testforbindelse for å binde til en gitt variant. På denne måten kan antistoffene benyttes for å påvise tilstedeværelse av ethvert peptid som deler én eller flere antigen determinanter av peptidvarianten.

Foreliggende beskrivelse vurderer mange andre midler for å screene forbindelser. Eksemplene som er gitt ovenfor presenteres for kun å illustrere en rekke teknikker som er tilgjengelige. En person med ordinær dyktighet i fagfeltet vil forstå at mange andre screeningsfremgangsmåter kan anvendes.

Foreliggende beskrivelse vurderer særlig anvendelsen av cellelinjer som transfekteres med nukleinsyre som koder minst én Fc-regionvariant for screening av forbindelser med aktivitet, og særlig høyytelsesscreening av forbindelser for kombinatoriske bibliotek (for eksempel bibliotek som inneholder mer enn IO<4>forbindelser), cellelinjene av foreliggende oppfinnelse kan anvendes i er rekke av screeningsfremgangsmåter.

Variantene kan anvendes som et affinitetsrensemiddel. Varianten kan immobiliseres på en fast fase som Sephadex harpiks eller filterpapir ved fremgangsmåter godt kjent i fagfeltet. Den immobiliserte varianten kontaktes deretter med en prøve inneholdende antigenet som skal renses, og så vaskes støtten med et egnet løsemiddel som idet vesentlige fjerner alt materialet fra prøven med unntak av antigenet som skal renses, som er bundet til den immobiliserte polypeptidvarianten. Til slutt vaskes støtten med et annet egnet løsemiddel, slik som glysinbuffer, pH 5,0, som frigjør antigenet fra polypeptidvarianten.

Polypeptidvarianten kan også anvendes i diagnostiske tester (for eksempel for påvisning av ekspresjon av et antigen av interesse i spesifikke celler, vev eller serum). For diagnostiske anvendelser merkes varianten vanligvis med en påvisbar del (slike merker er også nyttige i Fc-regionanalysene beskrevet ovenfor), tallrike merker er tilgjengelige, inkludert uten begrensning, radioisotoper (for eksempel<3>5S,14C,12<5>I,<3>H og<1>31I), fluorescerende merker (for eksempel sjeldne jordchelater (europium chelater) eller fluorescein og dets derivater, rhodamin og dets derivater, dansyl, Lissamin, fycoerytrin og Texas rød), og ulike enzymsubstratmerker (se for eksempel US 4 275 149), og luciferase, luciferin, 2,3-dihydroftalazindioner, malatdehydrogenase, urease, peroksidase slik pepperrotperoksidase (HRPO), alkalisk fosfatase, 3-galaktosidase, glukoamylase, lysozym, sakkaridoksidaser (for eksempel glukoseoksidase, galaktoseoksidase og glukose-6-fosfatdehydrogenase), heterosykliske oksidaser (slik som uricase og xantinoksidase), laktoperoksidase, mikroperoksidase og liknende. Eksempler på enzymsubstratkombinasjoner inkluderer for eksempel: (i) pepperrotperoksidase (HRPO) med hydrogenperoksidase som et substrat, hvori hydrogenperoksidase oksiderer en fargeforløper (for eksempel ortofenylendiamin (OPD) eller 3,3,,5,5'-tetrametylbenzidinhydroklorid (TMB)); (ii) alkalisk fosfatase (AP) med paranitrofenylfosfat som kromogent substrat; og (iii) R-D-galaktosidase (R-D-Gai) med et kromogent substrat eller fluorogent substrat.

Variantene kan også anvendes for in vivo diagnostiske analyser. Polypeptidvarianten er for eksempel merket med en radioisotop slik at antigenet eller cellene som uttrykker det, kan lokaliseres ved bruk av immunoscintiografi.

Eksempler

De følgende eksemplene er gitt for å demonstrere og også illustrere bestemte, foretrukne utførelsesformer og aspekter ifølge foreliggende oppfinnelse.

EKSEMPEL 1 - Screening av Fc-regionvarianter i ADCC analyser Dette eksemplet beskriver hvordan Fc-regionvarianter i sammenheng med et antistoff (for eksempel anti-CD20) screenes i en ADCC-analyse.

i. Perifer blodmononukleaer celle ( PBMC) isolerinfi

Omkring 50 ml perifert blod er skaffet fra en frisk donor og fortynnes 1:2 med fosfatbufret saltoppløsning (PBS), pH 7,0. Løsningene blandes forsiktig svinging av røret. Omkring 12 ml Histopaque-1077 (Sigma kat. nr. 1077-1) legges forsiktig under den fortynnete blodprøven, fulgt av sentrifugering i en Sorvall RT6000B sentrifuge med svingende bøtterotor ved 1000 rpm i 10 minutter med brems av. Den øvre fasen av gradienten fjernes ved avsuging, og den hvitfargete PBMC-inneholdende interfasen samles og vaskes tre ganger med Hanks balanserte saltløsning (Gibco kat. nr. 14025-092). Den vaskete cellepelleten suspenderes i omkring 20 ml RPMI1640 medium inneholdende 10 % føtalbovint serum (FBS) (Omega Scientific kat. nr. FB-01). De resuspenderte PBMC splittes i to T-175 dyrkingskolber, og 30 ml RPMI inneholdende 10 % FBS tilsettes hver, fulgt av inkubering over natten i en 37 °C, 5 % C02-inkubator. Neste dag innsamles de ikke festete PBMC i 50 ml Falcon rør, sentrifugeres som ovenfor, og resuspenderes i RPMI inneholdende 1 % FBS uten fenolrødt. En liten del av de resuspenderte cellene fortynnes 10 ganger, og telles ved å bruke et hemocytometer. De gjenværende PBMCer plasseres i inkubatoren inntil anvendelse.

ii. Målcellelinie ( spesifikt for anti- CD20 ADCC analyser)

Wil.2 og SKW6.4 CD20-uttrykkende B-cellelinjer skaffes fra ATCC, og dyrkes som anbefalt. En dag før anvendelse splittes cellene to ganger. Neste dag justeres celleantallet til 4 x IO<5>celler/ml og 50 ul alikvoter (20.000 celler/brønn) tilsettes en 96-brønns vevdyrkingsplate.

iii. IgG- fortynninger

Før screening uttrykkes, renses og kvantiteres en IgG som omfatter en Fc-variant ifølge foreliggende oppfinnelse ved anvendelse av standard ELISA. For primær enkeltpunkt ADCC-screening fortynnes IgG-varianter til 40 ng/ml i RPMI medium inneholdende 1 % FBS uten fenolrødt. Den endelige IgG konsentrasjonen i analysen fortynnes 4 ganger

(dvs. 10 ng/ml sluttkonsentrasjon). 50 ml alikvoter av IgG tilsettes målcellene og inkuberes i 15 minutter ved 37 °C før tilsetting av effektorcellene til de opsoniserte målcellene.

Når IgG titreringer utføres, varieres IgG-konsentrajoner i området fra omkring 0,0001 til 1 ug/ml. IgG-fortynninger fremstilles ved bruk av en 96-brønns mikrotiterplate ved å fortynne prøvene i RPMI inneholdende 1 % FBS uten fenolrødt. De fortynnete IgG-prøvene tilsettes analyseplaten som inneholder målcellene.

iv. Effektorceller

Konsentrasjonen av PBMC justeres så effektor-til-mål forholdet er i området av 10-20:1 (dvs. 2-4 x IO<6>celler/ml). Ett hundre ul av de resuspenderte PBMCene tilsettes hver brønn av de opsoniserte målcellene. Platene inkuberes i 37 °C i nærvær av 5 % CO2i 3-4 timer.

v. Laktat- dehydrofienase n^ DH)- frigiøringspåvisning

Målcellelysis måles ved påvising av frigjøring av LDH-enzym fra cytoplasma fra ødelagte celler til dyrkingssupernatanten. Etter inkubasjon av de opsoniserte målcellene med effektorcellene sentrifugeres analyseplatene i 2000 rpm i fem minutter. Omkring 75 ul av celledyrkingssupernatanten fjernes varsomt, mens pelleterte celler og cellerester unngås. Denne supernatanten tilsettes direkte til en mikrotiterplate og til dette tilsettes 75 ul LDH påvisningsreagens (Roche, kat. nr. 1644794). Platen inkuberes deretter i omkring 15-30 minutter, og absorbans avleses ved 490 nm med en Molecular Devices Vmax kinetisk mikroplateleser.

vi. Data analyse

Alle ADCC screeningsanalyser utføres i duplikat. Hver testplate inneholder kontroller for spontan mållysis, spontan effektor pluss mållysis i fravær av IgG og målcelle total lysis. Total målcellelysis oppnås ved tilsetting av 1 % Triton X-100 til målcellene. Villtypekontroller er inkludert på hver analyseplate og på det gjennomsnittlige ADCC-analysesignalet. Bakgrunnsverdien som ble oppnådd fra de spontane lysiskontrollene subtraheres fra hver prøve. Bakgrunnsverdien som ble oppnådd fra det fortynnete IgG subtraheres fra hver prøve. Dataene konverteres fra absorbansverdier til prosentvis andel av spesifikk lysis, basert på de spontane og totale lysiskontrollene. Den prosentvise andelen av spesifikk lysis beregnes fra den følgende likning: prosentvis spesifisert lysis = (eksperimentell A490-bakgrunn A490)/(maksimal A490-bakgrunn A490) x 100, hvor bakgrunn A490 er summen av A490 oppnådd fra effektor- og målcellene i fravær av IgG, og IgG-bakgrunn pga. forurensende LDH som er til stede i IgG råstoff supernatantene. Den prosentvise andel av Fc-variantaktivitet normaliseres relativt til de gjennomsnittlige villtypekontrollene. Prosentandelen av den normaliserte aktivitet for duplikate testplater er gjennomsnittlig, og standard avvik mellom individuelle analyseplater beregnes for hver prøve.

vii. Resultater

Relativ ADCC spesifikk aktivitet er vist i tabell 9 (enkle substitusjoner) og 10 (kombinasjonsmessige substitusjoner) nedenfor. CDC-verdiene rapportert i tabell 9 er generert som beskrevet i Eksempel 2, og FcRn-bindingsanalyseverdien rapportert i tabell 9 er generert som i Eksempel 3. Resultatene er også oppsummert i tabell 1 og 2 ovenfor. De kombinasj onsmessige substitusjonene som ga en høyere ADCC verdi enn hver enkelt substitusjon alene er: 247F, 339D; 2471, 339D; 247L, 339D; 247L, 339T; og 2471, 339Q. De kombinasj onsmessige substitusjonene som ga ADCC lavere enn 80 % av villtype ADCC, selv om de hadde høyere villtype ADCC når de testet alene er: 247A, 339D; 247Y, 339H; 2471, 3391; 247T, 3391; 247L, 339N; 247A, 339Q; og 247A, 339R. De kombinasj onsmessige substitusjonene som ga ADCC lavere enn 10 % av villtype ADCC, selv om de hadde høyere villtype ADCC når de testet alene er : 2471, 3391; 247T, 3391; og 247L, 339N.

Eksempel 2 - Karakterisering av CDC-aktivitet av varianter Dette eksemplet beskriver hvordan CDC-aktivitet av ulike Fc-regionvarianter bestemmes.

Denne analysen utføres ved anvendelse av humant komplement (Quidel Corp., kat. nr. AI 13) på 15 Ramos (RA nr. 1) celle (ATCC kat. nr. CRL-1596). Ramos-celler dyrkes i Gibco RPMI 1640 medium inneholdende 10 % FBS ved 37 °C og 5 % C02. Dagen før analysen utsåes cellene med 1 x 106 celler i en Tl75 kolbe. Den påfølgende dag ble cellene resuspendert til 3,57 x 105 celler/ml i RPMI 1640 uten fenolrødt, inneholdende 1 % FBS. 70 ul celler/brønn ble fordelt til en Costar 3917 flatbunnet plate. For titreringskurve ble IgG med en Fc-regionvariant fremstilt i en 3-gangers seriefortynning i RPMI 1640 medium. For enkeltpunkt bibliotek screeningsanalyse, er transient uttrykt IgG variant i dyrkingssupernatant normalisert til 1 ug/ml i MOCK-medium. 30 ul IgG-variant (dvs. 200 ng/ml sluttkonsentrasjon) og 50 ul humant komplement (Quidel Corp., kat. nr. Al 13) 1:5 fortynnet i RPMI 1640 + 1 % FBS tilsettes målcellen og blandes godt ved forsiktig pipettering. Platene ble inkubert ved 37 °C i nærvær av 5 % CO2i 1,5 timer. Etter tilsetting av 15 ul/brønn av Alamar blått (Serotec, kat. nr. BUF012B) fortsatte inkuberingen over natten. Deretter ble fluorescenssignalet målt med Perkin Eimer EnVision 2100 multimerke leser med eksitasjon ved 560 nm og emisjon ved 590 nm.

ii . Dataanalyse

Alle enkeltpunkt analyser ble utført i duplikat. Hver testplate inneholdt kontroller for spontan målcellelysis med humant komplement i fravær av IgG og målcelle maksimal lysis i nærvær av 1 % Triton X-100. Tre villtype kontroller inkluderes på hver testplate, og beregnet gjennomsnittet av CDC-testsignalet. Bakgrunnsverdien som ble oppnådd fra den spontane lysiskontrollen er subtrahert fra hver prøve. Dataene er konvertert fra fluorescenssignaler til prosentvis andel av spesifikk lysis basert på spontane og maksimale lysiskontroller. Prosentandelen av spesifikk lysis er beregnet fra den følgende likningen: Prosentandel spesifikk lysis = (eksperimentell fluorescenssignal-spontansignal)/(maksimalt lysissignal-spontansignal) x 100. Prosentandelen av Fc-variantaktivitet over gjennomsnittet av tre villtypekontroller beregnes så. Det er beregnet gjennomsnitt av prosentandelaktiviteter over villtyper for duplikat analyseplater, og standard avvik mellom individuelle analyseplater er beregnet.

Eksempel 3 - Karakterisering av binding til FcRn

Dette eksempel beskriver analyser for Fc-neonatal reseptor (FcRn) binding til IgG med en Fc-regionvariant.

En U-bunnet 96-brønns ELISA-plate belegges (Costar) med 50 ul/brønn av 2 ug/ml Neutravidin (Pierce Biotechnology, kat. nr. 3 1000) i 50 mM karbonatbuffer (pH 9,3) i 4 °C over natten. Ubundet NeutraAvidin fjernes og platen vaskes tre ganger med PBST (PBS inneholdende 0,1 % Tween 20). 50 ul biotinmerket, oppløselig FcRn av 2,5 ug/ml i PBS tilføres hver brønn, og inkuberes i romtemperatur i 1 time. Så tilsettes 75 ul kasein blokkeringsbuffer (Pierce Biotechnology, kat. nr. 37528) til platen i 1 time. ELISA-platen vaskes så med PBST og inkuberes med 50 ul/brønn med IgG-variant. For titreringskurven fremstilles IgG som skal testet med en 3-gangers seriefortynning i FcRn-bindingsbuffer (100 mM NaP04, 0,05 % Tween-20, eventuelt med ulik pH (fra 6,0 til 7,4)). For enkeltpunkt screening normaliseres transient uttrykt IgG-variant i dyrkingssupernatant til en sluttkonsentrasjon på 50 ng/ml og pH justeres med FcRn bindingsbuffer til 6,0.1 de påfølgende trinn anvendes FcRn-bindingsbuffer med korresponderende pH for å vaske platen, og for å fortynne reagenser. Bindingsreaksjonen utføres i romtemperatur i 1 time. Etter tre vaskinger påvises bundet IgG med geit (Fab')2antihuman-Fab-HRP-konjugat i 1 time. HRP aktivitet er utviklet i Pierce's HRP substrat (Turbo TMB-ELISA, kat. nr. 34022) i 5-30 minutter. Reaksjonen stoppes ved tilsetting av 50 ul av 2 M H2SO4og absorbans ved 450 nm leses med en VMAX mikroplateleser (Molecular Devices).

EKSEMPEL 4 - anti-CD20-I332E Fc-variant humanterapi

Irt vitro studier og murine tumormodeller (Clynes RA. et al., Nat. Med. 6:443 (2000)) gir bevis for at ADCC spiller en rolle i anti-tumoreffektene av anti-CD20 antistoffer, slik som RITUXAN. Humane pasienter kan behandles med anti-CD20-I332E Fc-variant antistoffer eller RITUXAN, på en liknende måte til de som er angitt i Cartron et al., Blood 99:754 (2002). Pasienter som har trinn II til IV sykdom i henhold til Ann-Arbor klassifiseringen, som minst har ett målbart sykt sete, og lav tumorbyrde i henhold til GELF-kriteriene, kan for eksempel behandles med en total på fire omtrentlig 375 mg/m<2>doser av en anti-CD20-Fc-variant eller med RITUXAN, tilført ved intravenøs infusjon (på dagene 1, 8, 15 og 22). Den primære virkeevnens endepunkt er den objektive responshastigheten, dvs. andelen pasienter som oppnår enten fullstendig tilbakegang (CR), ubekreftet CR (Cru) eller delvis respons (PR), i henhold til kriteriene nylig foreslått ved et internasjonalt ekspertutvalg. Klinisk respons kan evalueres ved måned to (M2). Pasienter kan også evalueres for progresjon ved ett år (Ml2).

De objektive responshastighetene ved M2 og M12 for pasienter behandlet med RITUXAN eller anti-CD20-Fc-variant kan sammenliknes slik at de forbedrete ADCC-aktiviteter som er gitt ved en Fc-variant kan kvantifiseres. Dette samme eksemplet kan gjentas med andre anti-CD20 varianter (se for eksempel tabellene 1 -10).

Den forsterkete kraften av variantene kan også tillate forskjellige tilførselsruter, mindre hyppige injeksjoner og/eller tilførsel av mindre doser.

Claims

1. Anti-CD20 antistoff,karakterisert vedat det omfatter: (a) en lettkjedevariabel region aminosyresekvens bestående av SEQ ID NO: 13; (b) en tungkjedevariabel region aminosyresekvens bestående av SEQ ID NO: 14; og (c) en moder Fc-regionvariant hvori moder Fc-regionen er en human IgGl Fc region og hvor Fc regionvarianten omfatter en aminosyresubstitusjon valgt fra gruppen bestående av 2471/339Q og 2471/33 9D.

2. Anti-CD20 antistoff ifølge krav 1,karakterisert vedat moder Fc-regionen er en nativ human IgGl Fc-region.

3. Anti-CD20 antistoffet ifølge krav 1 eller krav 2,karakterisert vedat Fc-varianten er 247I7339Q.

4. Anti-CD20 antistoffet ifølge krav 1 eller krav 2,karakterisert vedat Fc-varianten er 247I7339D.

5. Anti-CD20 antistoffet ifølge krav 3,karakterisert vedat det omfatter en lettkjede aminosyresekvens bestående av SEQ ID NO: 29 og en tungkjede aminosyresekvens bestående av SEQ ID NO: 31.

6. Anti-CD20 antistoffet ifølge krav 5,karakterisert vedat lettkjeden kodes av en nukleinsyresekvens omfattende SEQ ID NO: 30, og tungkjeden kodes av en nukleinsyresekvens omfattende SEQ ID NO: 32.

7. Anti-CD20 antistoffet ifølge krav 4,karakterisert vedat den omfatter en lettkjede aminosyresekvens bestående av SEQ ID NO: 29, og en tungkjede aminosyresekvens bestående av SEQ ID NO: 33.

8. Anti-CD20 antistoffet ifølge krav 7,karakterisert vedat lettkjeden kodes av en nukleinsyresekvens omfattende SEQ ID NO: 30, og tungkjeden kodes av en nukleinsyresekvens omfattende SEQ ID NO: 34.

9. Farmasøytisk sammensetning,karakterisert vedat den omfatter anti-CD20 antistoffet ifølge et hvilket som helst av kravene 1-8.

10. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 9,karakterisert vedat den ytterligere omfatter en farmasøytisk akseptabel bærer.

11. Anti-CD20 antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 1-8 for anvendelse for behandling av lymfom.