ES2328369T3 - Variantes de la region fc. - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo que comprende una variante de una región Fc humana original, o una de sus porciones que comprende la variante, en el que la variante comprende una sustitución de aminoácidos de una prolina por una leucina, histidina o isoleucina en una posición correspondiente a la prolina de la posición 247 de la secuencia de Fc humana según el formato del índice de EU de Kabat.

Description

Variantes de la región Fc.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a variantes de polipéptidos de la región Fc y a oligonucleótidos que codifican variantes de la región Fc. Específicamente, la presente invención proporciona composiciones que comprenden variantes nuevas de la región Fc, procedimientos para identificar variantes útiles de la región Fc y procedimientos para utilizar las variantes de la región Fc (por ejemplo para tratar enfermedades).

Antecedentes de la invención

En los seres humanos hay cinco tipos de inmunoglobulinas. Estos grupos se conocen como IgG, IgM, IgD, IgA e IgE, y se distinguen basándose en los isotipos del gen de la cadena pesada (gamma, mu, delta, alfa y épsilon, respectivamente). El isotipo más común es IgG, y está compuesto por dos polipéptidos de cadena pesada idénticos y dos polipéptidos de cadena ligera idénticos. Las dos cadenas pesadas están unidas una a la otra de manera covalente por medio de enlaces disulfuro y cada cadena ligera está unida a una cadena pesada por medio de un enlace disulfuro. Cada cadena pesada contiene aproximadamente 445 residuos de aminoácidos, y cada cadena ligera contiene aproximadamente 215 residuos de aminoácidos.

Cada cadena pesada contiene cuatro dominios característicos que se denominan por lo general dominio variable (VH), dominio pesado constante 1 (CH1), dominio pesado constante 2 (CH2) y dominio pesado constante 3 (CH3). Los dominios CH1 y CH2 están unidos por una región de bisagra (secciones interdominio) que proporciona flexibilidad a la Ig. Cada cadena ligera contiene dos dominios característicos que se denominan por lo general ligero variable (VL) y ligero constante (CL).

Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras se unen directamente al antígeno y son responsables de la diversidad y la especificidad de las Ig. Cada VL y VH tiene tres regiones determinantes de complementariedad (CDR, conocidas también como regiones hipervariables). Cuando el VL y el VH se juntan a través de interacciones de las cadenas pesada y ligera, las CDR forman una superficie de unión que entra en contacto con el antígeno.

Mientras que las regiones variables están involucradas en la unión del antígeno, los dominios constantes de la cadena pesada, principalmente CH2 y CH3, están involucrados en funciones diferentes de la unión al antígeno. Esta región, conocida generalmente como la región Fc, tiene muchas funciones importantes. Por ejemplo, la región Fc se une al complemento, que puede provocar la fagocitosis o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). La región Fc también se une a receptores de Fc, que pueden provocar la fagocitosis o la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). La región Fc también desempeña una función para ayudar a mantener la inmunoglobulina en circulación y tiene interacción con la proteína A, que se usa comúnmente para purificar la inmunoglobulina.

Ha habido recientemente un esfuerzo para mejorar las calidades inmunogénicas y las características de unión al antígeno de los anticuerpos. Por ejemplo, se han desarrollado anticuerpos monoclonales, quiméricos y humanizados para la inmunoterapia. Los ejemplos de anticuerpos que han sido aprobados para la inmunoterapia en seres humanos, con la enfermedad correspondiente, incluyen: RITUXAN (linfoma), SYNAGIS (enfermedad infecciosa), ZENEPAX (transplante de riñón), REMICADE (enfermedad de Crohn y artritis reumatoide), HERCEPTIN (carcinoma de mama) y EDRECOLOMAB (cáncer del colon). Sin embargo, existen muchos anticuerpos que han entrado en ensayos clínicos que no han recibido la aprobación por falta de eficacia o por otros problemas asociados.

Lo que resulta necesario, para mejorar la eficacia y acelerar la aprobación de otros anticuerpos terapéuticos, son composiciones y procedimientos para alterar las regiones Fc para generar polipéptidos variantes con propiedades mejoradas.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona un anticuerpo que comprende una variante de una región Fc original humana, o una de sus porciones que comprende la variante, en el que la variante comprende una sustitución de aminoácidos de una prolina por una leucina, histidina o isoleucina en una posición correspondiente a la prolina de la posición 247 en la secuencia del Fc humano según el formato del índice de EU de Kabat. La presente invención proporciona composiciones que comprenden una variante (o una secuencia de ácido nucleico que codifica la variante) de un polipéptido original que tiene al menos una porción de una región Fc, en las que la variante media la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) en presencia de células efectoras más eficazmente que el polipéptido original y comprende al menos una modificación de aminoácidos en la posición 247 en la región Fc. En formas de realización particulares, la variante comprende un anticuerpo (por ejemplo un anticuerpo anti CD20). En formas de realización de preferencia, la modificación de aminoácidos es P247L.

En algunas formas de realización, la presente invención proporciona un péptido (que contiene la modificación de aminoácidos P247L) que comprende la secuencia mostrada en la SEC ID Nº: 15. En otras formas de realización, la presente invención proporciona una secuencia de ácido nucleico que codifica una región CH2 con la modificación P247L (por ejemplo SEC ID Nº: 40). En algunas formas de realización, la presente invención proporciona una secuencia de aminoácidos que codifica una región CH2 con la modificación P247L que comprende la SEC ID Nº: 15. En ciertas formas de realización, la presente invención proporciona un péptido (que contiene la modificación L251F) con la secuencia mostrada en SEC ID Nº: 16. En otras formas de realización, la presente invención proporciona una secuencia de ácido nucleico que codifica una región CH2 con la modificación L251F (por ejemplo SEC ID Nº: 41). En otras formas de realización, la presente invención proporciona una secuencia de aminoácidos que codifica una región CH2 con la modificación L251F que comprende la SEC ID Nº: 16.

En algunas formas de realización, la presente invención proporciona composiciones que comprenden una variante (o una secuencia de ácido nucleico que codifica la variante) de un polipéptido original que tiene al menos una porción de una región Fc, en las que la variante comprende al menos una modificación de aminoácidos en la posición 247 en la región Fc seleccionada de P247H, P247I y P247L.

En algunas formas de realización, la presente invención proporciona composiciones que comprenden una variante de un polipéptido original que tiene al menos una porción de una región Fc, en las que la variante media la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) en presencia de células efectoras más eficazmente que el polipéptido original y comprende al menos una modificación de aminoácidos en la posición 247 en la región Fc. En otras formas de realización, la presente invención proporciona procedimientos que comprenden; a) proporcionar; i) una composición que comprende una variante de un polipéptido original que tiene al menos una porción de una región Fc, en la que la variante media la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) en presencia de células efectoras más eficazmente que el polipéptido original y comprende al menos una modificación de aminoácidos en la posición 247 en la región Fc, y ii) un sujeto con uno o más síntomas de una enfermedad; y b) administrar la composición al sujeto bajo condiciones tales que se reduzca al menos uno de los síntomas. En formas de realización particulares, la variante comprende un anticuerpo o inmunoadhesina, y el sujeto tiene síntomas de una enfermedad que responde a anticuerpos o inmunoadhesinas.

En ciertas formas de realización, la variante comprende al menos una porción de la región Fc (por ejemplo 40%, 50%, 60%, 80% o 90% o más de una región Fc que contiene la modificación de aminoácidos). En algunas formas de realización, las variantes de polipéptidos comprenden una región CH2 o CH3. En otras formas de realización, las composiciones comprenden una secuencia de aminoácidos que comprende la SEC ID Nº: 13. En algunas formas de realización, las composiciones comprenden una secuencia de aminoácidos que comprenden la SEC ID Nº: 14. En algunas formas de realización, las composiciones comprenden una secuencia de aminoácidos que comprenden la SEC ID Nº: 15. En ciertas formas de realización, las composiciones comprenden una secuencia de ácido nucleico que comprende la SEC ID Nº: 39 y/o SEC ID Nº: 39 y/o SEC ID Nº: 40 o sus complementos, o secuencias que se unen a las SEC ID Nº: 38, 39 ó 40 bajo condiciones de alta rigurosidad. En otras formas de realización, la presente invención proporciona células huésped (por ejemplo células CHO), y vectores que comprenden la SEC ID Nº: 38 y/o SEC ID Nº: 39 y/o SEC ID Nº: 40. En formas de realización particulares, la presente invención proporciona un medio legible por ordenador, en las que el medio legible por ordenador codifica una representación de SEC ID Nº: 13, 14, 15, 38, 39 ó 40.

En ciertas formas de realización, la variante del polipéptido media la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) en presencia de células efectoras más eficazmente que el polipéptido original. En algunas formas de realización, la variante del polipéptido comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo policlonal, anticuerpo monoclonal, anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado, o fragmento de Fc). En algunas formas de realización, el polipéptido original comprende una región Fc de IgG humana. En otras formas de realización, el polipéptido original comprende una región Fc de IgG1, IgG2, IgG3 ó IgG4 humanas. En otras formas de realización, el polipéptido original comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEC ID
Nº: 1-12.

En formas de realización de preferencia, la modificación de aminoácidos es P247H, P247I o P247L. En ciertas formas de realización, la variante del polipéptido comprende una segunda, tercera, cuarta, etc. modificación de aminoácidos en la región Fc (véase, por ejemplo Tabla1). En algunas formas de realización, la variante es un polipéptido expresado por CHO.

En otras formas de realización, las composiciones comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica una variante de un polipéptido original que comprende al menos una porción de una región Fc, en las que la variante media la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) en presencia de células efectoras más eficazmente que el polipéptido original, y comprende al menos una modificación de aminoácidos en la posición 247, en la región Fc. En algunas formas de realización, las composiciones comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido variante de Fc que media la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) en presencia de células efectoras más eficazmente que el polipéptido original, en las que el polipéptido variante de Fc comprende una modificación de aminoácidos en la posición del aminoácido 247 del mismo.

En otras formas de realización, las composiciones comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica una variante de un polipéptido original que comprende al menos una porción de una región Fc, en las que la variante media la depleción de células diana en un ensayo en sangre entera más eficazmente que el polipéptido original, y comprende al menos una modificación de aminoácidos en la posición 247 del mismo en la región Fc. En algunas formas de realización, las composiciones comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido variante de Fc que media la depleción de células diana en un ensayo en sangre entera más eficazmente que el polipéptido original, en las que el polipéptido variante de Fc comprende una modificación de aminoácidos en la posición 247 del mismo.

En ciertas formas de realización, las variantes de la presente invención, y las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las variantes, se proporcionan con al menos otro componente en un kit. Por ejemplo, un kit puede comprender al menos un tipo de variante e instrucciones escritas para usar la variante. El kit puede contener también tampones y otros reactivos útiles.

En algunas formas de realización, la presente invención proporciona procedimientos que comprenden, a) proporcionar; i) células que expresan el antígeno diana (CD20, por ejemplo), ii) una composición que comprende una variante de un polipéptido original que tiene al menos una porción de una región Fc, en la que la variante comprende al menos una modificación de aminoácidos en la región Fc, y iii) células efectoras (PMBC enriquecidas de donador(es)
humano(s), por ejemplo), y b) poner las células diana en contacto con la composición y las células efectoras bajo condiciones tales que la variante se una a las células diana (por ejemplo, por medio de un ligando que se expresa en la superficie celular) y c) medir la muerte de las células diana (liberación de LDH o cromo 51, por ejemplo).

En otras formas de realización, la presente invención proporciona procedimientos que comprenden, a) proporcionar; i) muestras de sangre entera que contienen células que expresan el antígeno diana (células B que expresan CD20, por ejemplo) y ii) una composición que comprende una variante de un polipéptido original que tiene al menos una porción de una región Fc, en la que la variante comprende al menos una modificación de aminoácidos en la región Fc y b) poner las células diana en contacto con la composición bajo condiciones tales que la variante se una a las células diana (por ejemplo, por medio del ligando de CD20 que se expresa en la superficie celular) y c) medir la desaparición de las células diana (Análisis Facs con otro marcador de células B, tal como CD19, por ejemplo).

En algunas formas de realización, la presente invención proporciona procedimientos para identificar variantes mejoradas de especies dobles, que comprenden; a) proporcionar; i) células diana, ii) una composición que comprende una variante candidata de un polipéptido original que tiene una región Fc, en la que la variante candidata comprende al menos una modificación de aminoácidos en la región Fc, y en la que la variante candidata media la citotoxicidad de las células diana en presencia de una primera especie de células efectoras más eficazmente que el polipéptido original, y iii) células efectoras de la segunda especie, y b) incubar la composición con las células diana bajo condiciones tales que la variante candidata se una a las células diana generando de esta manera células diana unidas a la variante, c) mezclar las células efectoras de la segunda especie con las células diana unidas a la variante candidata, d) medir la citotoxicidad de las células diana (por ejemplo, mediada por la variante candidata), e) determinar si la variante candidata media la citotoxicidad de las células diana en presencia de las células efectoras de la segunda especie más eficazmente que el polipéptido original. En algunas formas de realización, el procedimiento comprende también seleccionar los polipéptidos originales de la misma manera con las células efectoras de la segunda especie. En otras formas de realización, las etapas b) y c) se llevan a cabo simultáneamente. En formas de realización particulares, el procedimiento comprende además la etapa f) identificar una variante candidata como una variante mejorada de especies dobles que media la citotoxicidad de las células diana en presencia de las células efectoras de la segunda especie más eficazmente que el polipéptido original. En otras formas de realización, el procedimiento comprende además la etapa f) identificar una variante candidata como una variante mejorada de especies dobles que media la citotoxicidad de las células diana en presencia de las células efectoras de la segunda especie aproximadamente 1,2 veces (o aproximadamente 1,5 veces, 5 veces o aproximadamente 10 veces) más eficazmente que el polipéptido original (por ejemplo, se observa aproximadamente 1,2 veces más lisis de células diana).

En otras formas de realización, la presente invención proporciona procedimientos para identificar variantes mejoradas de especies dobles, que comprenden; a) proporcionar; i) células diana, ii) una composición que comprende una variante candidato de un polipéptido original que tiene una región Fc, en la que la variante candidata comprende al menos una modificación de aminoácidos en la región Fc, iii) células efectoras de la primera especie, y iv) células efectoras de la segunda especie, y b) incubar la composición con las células diana bajo condiciones tales que la variante candidata se una a las células diana generando de esta manera células diana unidas a la variante candidata, c) mezclar las células efectoras de la primera especie con las células diana unidas a la variable candidata, d) medir la citotoxicidad de las células diana (por ejemplo, mediada por la variante candidata), e) determinar que la variante candidata media la citotoxicidad de las células diana en presencia de las células efectoras de la primera especie más eficazmente que el polipéptido original, f) mezclar las células efectoras de la segunda especie con las células diana unidas a la variante candidata (por ejemplo, como se generaron en la etapa b), g) medir la citotoxicidad de las células diana (por ejemplo, mediada por la variante candidata), h) determinar si la variante candidata media la citotoxicidad de las células diana en presencia de las células efectoras de la segunda especie más eficazmente que el polipéptido original.

En formas de realización particulares, el procedimiento comprende además una etapa para determinar la capacidad del polipéptido original para mediar la citotoxicidad de las células diana en presencia de la primera especie y/o la segunda especie. Por ejemplo, los procedimientos pueden comprender además mezclar las células efectoras de la primera o segunda especie con células diana unidas al polipéptido original, y a continuación medir la citotoxicidad de las células diana (por ejemplo, determinar un valor tal que haya un valor para comparar frente a las variantes).

En ciertas formas de realización, el procedimiento comprende además la etapa g) administrar la variante mejorada de especies dobles al animal de prueba, en las que el animal de prueba es un miembro de la segunda especie. En otras formas de realización, el procedimiento comprende además, previo a la etapa a), una etapa de selección de la variante candidata en un ensayo de unión al receptor de Fc (FcR). En ciertas formas de realización, el ensayo de unión al FcR es un ensayo de unión al receptor neonatal de Fc (FcRn).

En algunas formas de realización, el procedimiento comprende además, previo a la etapa a), una etapa de selección de la variante candidata en un ensayo CDC (Véase, por ejemplo, la sección IV a continuación). En algunas formas de realización, las células efectoras de la primera especie son células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC). En otras formas de realización, las células efectoras de la primera especie son PBMC de ratón o PBMC de rata. En ciertas formas de realización, las células efectoras de la segunda especie son PBMC de ratón o PBMC de rata. En formas de realización particulares, las células efectoras de la segunda especie son PBMC humanas.

En algunas formas de realización, la presente invención proporciona los procedimientos para identificar las variantes mejoradas de especies dobles que comprenden; a) proporcionar; i) una composición que comprende una variante candidata de un polipéptido original que tiene una región Fc, en la que la variante candidata comprende al menos una modificación de aminoácidos en la región Fc, y en la que la variante candidata media la CDC más eficazmente que el polipéptido original, y iii) una fuente de complemento de la segunda especie, y b) incubar la composición con la segunda especie del complemento; y c) determinar si la variante candidata media la CDC más eficazmente que el polipéptido original. En formas de realización particulares, el procedimiento comprende además la etapa d) identificar una variante candidata como una variante mejorada de especies dobles.

En algunas formas de realización, las células diana son células humanas (por ejemplo, que sobreexpresan uno o más de los siguientes antígenos asociados a tumores: CD20, CD22, CD23, CD40, CD63, receptor de EGF, receptor de her-2, antígeno de membrana específico de la próstata, carbohidrato Y de Lewis, gangliósidos GD_{2} y GD_{3}, lamp-1, CO-029, L6 y ephA2). En ciertas formas de realización, la variante comprende un anticuerpo, o una de sus porciones, específico para las células diana. En otras formas de realización, la variante candidata media la citotoxicidad de las células diana en presencia de las células efectoras de la primera especie aproximadamente 1,2 veces más eficazmente que el polipéptido original. En algunas formas de realización, la etapa e) comprende realizar una reacción de control con el polipéptido original. En otras formas de realización, la medición comprende cuantificar la muerte de células diana o la lisis de células diana. En otras formas de realización, las células diana infectadas con virus (por ejemplo VIH, CMV, hepatitis B o RSV, por ejemplo) u organismos microbianos (por ejemplo, Staphylococcus, Streptococcus, Pseudomonas, etc.). En ciertas formas de realización, las células diana son organismos microbianos (por ejemplo, Staphylococcus, Streptococcus, Pseudomonas, etc.). En algunas formas de realización, las células diana se reemplazan con virus (por ejemplo, VIH, CMV, hepatitis B o RSV).

En algunas formas de realización, la presente invención proporciona composiciones que comprenden un polipéptido, en las que el polipéptido comprende; i) una estructura humana no modificada (por ejemplo, no se han realizado alteraciones a la estructura humana que se presenta en la naturaleza), y ii) una región Fc variante. En ciertas formas de realización, la estructura humana no modificada es una estructura germinal humana. En otras formas de realización, la presente invención proporciona composiciones que comprenden un polipéptido, en las que el polipéptido comprende: i) al menos una secuencia CDR aleatorizada y ii) una región Fc variante. En otras formas de realización, la presente invención proporciona composiciones que comprenden un polipéptido, en las que el polipéptido comprende; i) una estructura humana no modificada (por ejemplo, una estructura germinal humana), ii) al menos una secuencia CDR aleatorizada, y iii) una región Fc variante.

Definiciones

Para facilitar una comprensión de la invención, a continuación se define una serie de términos.

Según se utiliza en el presente documento, los términos "sujeto" y "paciente" se refieren a cualquier animal, tal como un mamífero como un perro, gato, ave, ganado, y de preferencia un ser humano (por ejemplo un ser humano con una enfermedad).

Según se utiliza en el presente documento, los términos "molécula de ácido nucleico que codifica", "secuencia de ADN que codifica" y "ADN que codifica" se refieren al orden o a la secuencia de desoxirribonucleótidos a lo largo de una hebra de ácido desoxirribonucleico. El orden de estos desoxirribonucleótidos determina el orden de aminoácidos a lo largo de la cadena del polipéptido (proteína). La secuencia del ADN codifica por consiguiente la secuencia de aminoácidos.

Se dice que las moléculas de ADN tienen "extremos 5'" y "extremos 3'" porque los mononucleótidos se hacen reaccionar para generar oligonucleótidos o polinucleótidos de forma tal que el fosfato 5' de un anillo de pentosa del mononucleótido se una al oxígeno 3' de su vecino en una dirección a través de un enlace fosfodiéster. Por consiguiente, un extremo de un oligonucleótido o polinucleótido, se denomina "extremo 5'" si su fosfato 5' no está unido al oxígeno 3' de un anillo de pentosa del mononucleótido y se denomina "extremo 3'" si su oxígeno 3' no está unido al fosfato 5' de un anillo de pentosa del siguiente mononucleótido. Según se utiliza en el presente documento, una secuencia de ácido nucleico, incluso si es interna a un oligonucleótido o a un polinucleótido más grande, también puede decirse que tiene extremos 5' y 3'. En una molécula de ADN, ya sea lineal o circular, se hace referencia a elementos discretos como elementos "secuencia arriba" o 5' de los elementos "secuencia abajo" o 3'. Esta terminología refleja el hecho de que la transcripción procede de una manera 5' a 3' a lo largo de la hebra del ADN. Los elementos promotores y potenciadores que dirigen la transcripción de un gen ligado están localizados generalmente 5' o secuencia arriba de la región codificadora. Sin embargo, los elementos potenciadores pueden ejercer su efecto incluso cuando están localizados 3' del elemento promotor y de la región codificadora. Las señales de terminación de la transcripción y poliadenilación están localizadas 3' o secuencia abajo de la región codificadora.

Según se utiliza en el presente documento, el término "codón" o "triplete" se refiere a un triplete de tres monómeros de nucleótidos adyacentes que especifican uno de los veinte aminoácidos que se presentan en la naturaleza que se encuentran en la biosíntesis de polipéptidos. El término también incluye los codones sin sentido que no especifican ningún aminoácido.

Según se utiliza en el presente documento, los términos "un oligonucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido", "polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido" y "secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido" significa una secuencia de ácido nucleico que comprende la región codificadora de un polipéptido particular. La región codificadora puede estar presente en forma de ADNc, ADN genómico o ARN. Cuando está presente en forma de un ADN, el oligonucleótido o el polinucleótido puede tener hebra única (es decir, la hebra sentido) o hebra doble. Los elementos de control adecuados tales como potenciadores/promotores, uniones de empalme, señales de poliadenilación, etc. pueden estar colocados en estrecha proximidad con la región codificadora del gen si es necesario para permitir la iniciación apropiada de la transcripción y/o el procesamiento correcto del transcripto primario del ARN. Como alternativa, la región codificadora utilizada en los vectores de expresión de la presente invención pueden contener potenciadores/promotores, uniones de empalme, secuencias de intervención, señales de poliadenilación, etc. endógenos o una combinación de elementos de control endógenos y exógenos.

Según se utiliza en el presente documento, los términos "complementario" o "complementariedad" se utilizan con referencia a los polinucleótidos (es decir, una secuencia de nucleótidos) relacionados por las reglas de apareamiento de bases. Por ejemplo, para la secuencia "A-G-T", es complementaria a la secuencia "T-C-A". La complementariedad puede ser "parcial", en la que solamente algunas de las bases de los ácidos nucleicos se aparean correctamente según las reglas de apareamiento de bases. O, puede haber complementariedad "completa" o "total" entre los ácidos nucleicos. El grado de complementariedad entre las hebras de los ácidos nucleicos tiene efectos significativos en la eficacia y la fuerza de la hibridación entre las hebras de los ácidos nucleicos. Esto es de particular importancia en las reacciones de amplificación, así como en los procedimientos de detección que dependen de la unión entre los ácidos nucleicos.

Según se utiliza en el presente documento, el término "el complemento de" una secuencia dada se usa con referencia a la secuencia que es totalmente complementaria a la secuencia a lo largo de su longitud total. Por ejemplo, la secuencia A-G-T-A es "el complemento" de la secuencia T-C-A-T.

El término "homología" (cuando se usa con referencia a las secuencias de ácidos nucleicos) se refiere a un grado de complementariedad. Puede haber homología parcial u homología completa (es decir, identidad). Una secuencia parcialmente complementaria es una que inhibe al menos parcialmente la hibridación de una secuencia totalmente complementaria a un ácido nucleico diana y se la denomina usando el término funcional "sustancialmente homóloga". El término "inhibición de unión", cuando se usa con referencia a la unión de ácidos nucleicos, se refiere a la inhibición de unión causada por la competición de las secuencias homólogas por la unión a una secuencia diana. La inhibición de la hibridación de la secuencia totalmente complementaria a la secuencia diana puede examinarse usando un ensayo de hibridación (transferencia Southern o Northern, hibridación de disolución y similares) bajo condiciones de rigurosidad baja. Una sonda o secuencia sustancialmente homóloga competirá por e inhibirá la unión (es decir, la hibridación) de una secuencia completamente homóloga a una diana bajo condiciones de baja rigurosidad. Esto no significa que las condiciones de baja rigurosidad sean tales que se permita la unión no específica; las condiciones de baja rigurosidad requieren que la unión de dos secuencias una a la otra sea una interacción específica (es decir, selectiva). La ausencia de unión no específica puede analizarse por medio del uso de una segunda diana que carece incluso de un grado parcial de complementariedad (por ejemplo, menos de aproximadamente el 30% de identidad); en ausencia de unión no específica la sonda no hibridará a la segunda diana no complementaria.

La técnica conoce bien que pueden usarse numerosas condiciones equivalentes para comprender condiciones de baja rigurosidad; se consideran factores tales como la longitud y la naturaleza (ADN, ARN, composición de bases) de la sonda y la naturaleza de la diana (ADN, ARN, composición de bases, presente en disolución o inmovilizada, etc.) y la concentración de las sales y de los otros componentes (por ejemplo, la presencia o ausencia de formamida, sulfato de dextrano, polietilenglicol) y la disolución de hibridación puede variarse para generar condiciones de hibridación de baja rigurosidad diferentes de, pero equivalentes a, las condiciones presentadas anteriormente. Además, la técnica conoce las condiciones que promueven la hibridación bajo condiciones de rigurosidad alta (por ejemplo, aumentando la temperatura de la hibridación y/o las etapas de lavado, el uso de formamida en la disolución de hibridación,
etc.).

Una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, que codifica una región Fc variante o una de sus porciones) puede producir múltiples especies de ARN que se generan por empalmes diferenciales de la transcripción primaria del ARN. Los ADNc que son variantes de empalme del mismo gen contendrán regiones de identidad de secuencia o de homología completa (que representan la presencia del mismo exón o de una porción del mismo exón en ambos ADNc) y regiones de identidad incompleta (por ejemplo, que representan la presencia del exón "A" en el ADNc 1 en las que el ADNc 2 contiene en su lugar el exón "B"). Como los dos ADNc contienen regiones de identidad de secuencia, ambos hibridarán con una sonda derivada del gen completo o de porciones del gen que contienen las secuencias que se encuentran en ambos ADNc; las dos variantes de empalme son por consiguiente sustancialmente homólogas a una de tales sondas y una a la otra.

Cuando se usa con referencia a una secuencia de ácido nucleico de hebra única, el término "sustancialmente homólogo" se refiere a cualquier sonda que puede hibridar con (es decir, es el complemento de) la secuencia del ácido nucleico de hebra única bajo condiciones de rigurosidad baja.

Según se utiliza en el presente documento, el término "hibridación" se usa con referencia al apareamiento de ácidos nucleicos complementarios. La hibridación y la fuerza de la hibridación (es decir, la fuerza de la asociación entre los ácidos nucleicos) están afectadas por factores tales como el grado de complementariedad entre los ácidos nucleicos, la rigurosidad de las condiciones implicadas, la Tf del híbrido formado, y la relación G:C dentro de los ácidos nucleicos.

Según se utiliza en el presente documento, el término "T_{f}" se usa con referencia a la "temperatura de fusión". La temperatura de fusión es la temperatura a la que una población de moléculas de ácido nucleico de doble hebra se disocia por la mitad dando lugar a cadenas simples. La ecuación para calcular la T_{f} de los ácidos nucleicos es muy conocida en la técnica. Según se indica por las referencias convencionales, puede calcularse una simple estimación del valor de T_{f} por medio de la ecuación: T_{f} = 81,5 + 0,41 (% G + C), cuando un ácido nucleico está en disolución acuosa de NaCI 1 M (véase por ejemplo, Anderson y Young, Quantitative Filter Hybridization, en Nucleic Acid Hybridization [1985]). Otras referencias incluyen cálculos más sofisticados que consideran características estructurales así como de la secuencia para el cálculo de la T_{f}, y en algunos casos la T_{f} puede determinarse empíricamente comenzando con la T_{f} calculada y probando pequeños aumentos o disminuciones de la temperatura y examinando el efecto en la población de moléculas de ácido nucleico.

Según se utiliza en el presente documento el término "rigurosidad" se usa con referencia a las condiciones de temperatura, fuerza iónica, y la presencia de otros compuestos tales como disolventes orgánicos, bajo los que se llevan a cabo las hibridaciones de ácidos nucleicos. Los expertos en la técnica reconocerán que las condiciones de "rigurosidad" pueden alterarse variando los parámetros recientemente descritos individualmente o en combinación. Con condiciones de "rigurosidad alta", el apareamiento de las bases del ácido nucleico tendrá lugar solamente entre los fragmentos del ácido nucleico que tienen una alta frecuencia de secuencias de bases complementarias (por ejemplo, la hibridación bajo condiciones de la "rigurosidad alta" puede tener lugar entre homólogos con aproximadamente 85-100% de identidad, de preferencia aproximadamente 70-100% de identidad). Con condiciones de rigurosidad media, el apareamiento de las bases del ácido nucleico tendrá lugar entre los ácidos nucleicos con una frecuencia intermedia de secuencias de bases complementarias (por ejemplo, la hibridación bajo condiciones de "rigurosidad media" puede tener lugar entre homólogos con aproximadamente 50-70% de identidad). Por consiguiente, con frecuencia son necesarias condiciones de rigurosidad "débil" o "baja" con los ácidos nucleicos que derivan de organismos genéticamente diversos, ya que la frecuencia de secuencias complementarias es usualmente menor.

"Condiciones de alta rigurosidad", cuando se usa con referencia a la hibridación de ácidos nucleicos comprende condiciones equivalentes a la unión o hibridación a 42ºC en una disolución constituida por 5X SSPE (NaCl 43,8 g/l, NaH_{2}PO_{4} H_{2}O 6,9 g/ y EDTA 1,85 g/l, pH ajustado hasta 7,4 con NaOH), SDS al 0,5%, 5X reactivo de Denhardt y ADN de esperma de salmón desnaturalizado 100 \mug/ml seguida por el lavado en una disolución que comprende 0,1X SSPE, SDS al 1,0% a 42ºC cuando se utiliza una sonda de aproximadamente 500 nucleótidos de longitud.

"Condiciones de rigurosidad media", cuando se usa con referencia a la hibridación de ácidos nucleicos comprende las condiciones equivalentes a la unión o hibridación a 42ºC en una disolución constituida por 5X SSPE (NaCl 43,8 g/l, NaH_{2}PO_{4} H_{2}O 6,9 g/l y EDTA 1,85 g/l, pH ajustado hasta 7,4 con NaOH), SDS al 0,5%, 5X reactivo de Denhardt y ADN de esperma de salmón desnaturalizado 100 \mug/ml seguida por el lavado en una disolución que comprende 1,0X SSPE, SDS al 1,0% a 42ºC cuando se utiliza una sonda de aproximadamente 500 nucleótidos de longitud.

"Condiciones de baja rigurosidad " comprende las condiciones equivalentes a la unión o hibridación a 42ºC en una disolución constituida por 5X SSPE (NaCl 43,8 g/l, NaH_{2}PO_{4} H_{2}O 6,9 g/l y EDTA 1,85 g/l, pH ajustado hasta 7,4 con NaOH), SDS al 0,1%, 5X reactivo de Denhardt [50X reactivo de Denhardt contiene por 500 ml: Ficoll 5 g (Tipo 400, Pharmacia), BSA 5 g (Fraction V; Sigma)] y ADN de esperma de salmón desnaturalizado 100 \mug/ml seguida por el lavado en una disolución que comprende 5X SSPE, SDS al 1,0% a 42ºC cuando se utiliza una sonda de aproximadamente 500 nucleótidos de longitud.

Los siguientes términos se usan para describir las relaciones de secuencias entre dos o más polinucleótidos: "secuencia de referencia", "identidad de secuencia" y "porcentaje de identidad de secuencia". Una "secuencia de referencia" es una secuencia definida utilizada como base para una comparación de secuencias; una secuencia de referencia puede ser una subserie de una secuencia más grande, por ejemplo, como un segmento de una secuencia de ADNc de longitud total dada en un listado de secuencias o puede comprender una secuencia completa del gen. Generalmente, una secuencia de referencia tiene una longitud de al menos 25 nucleótidos, y con frecuencia al menos 50 nucleótidos de longitud (por ejemplo, puede usarse cualquiera de las SEC ID Nº: 32-37 como una secuencia de referencia). Puesto que dos polinucleótidos pueden cada uno (1) comprender una secuencia (es decir, una porción de la secuencia completa del polinucleótido) que es similar entre los dos polinucleótidos, y (2) pueden comprender además una secuencia que es divergente entre los dos polinucleótidos, las comparaciones de secuencias entre dos (o más) polinucleótidos se realizan típicamente comparando secuencias de los dos polinucleótidos sobre una "ventana de la comparación" para identificar y comparar las regiones locales de similitud de secuencia. Una "ventana de comparación", como se usa en el presente documento, se refiere a un segmento conceptual de al menos 20 posiciones de nucleótidos adyacentes en la que una secuencia del polinucleótido puede compararse con una secuencia de referencia de al menos 20 nucleótidos adyacentes y en la que la porción de la secuencia del polinucleótido en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, huecos) del 20 por ciento o menos en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para la alineación óptima de las dos secuencias. La alineación óptima de las secuencias para alinear una ventana de comparación puede realizarse por medio del algoritmo de homología local de Smith y Waterman [Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)], por medio del algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch [Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)], por el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman [Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85: 2444 (1988)], por implementaciones computerizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), o por inspección, y se selecciona la mejor alineación (es decir, que da lugar al porcentaje más alto de homología sobre la ventana de comparación) generada por los diversos procedimientos. El término "identidad de secuencia" significa que dos secuencias de polinucleótidos son idénticas (es decir, nucleótido a nucleótido) sobre la ventana de comparación. El término "porcentaje de identidad de secuencia" se calcula comparando dos secuencias alineadas de manera óptima sobre la ventana de comparación, determinando el número de posiciones en que se presentan las bases idénticas del ácido nucleico (por ejemplo, A, T, C, G, U o I) en ambas secuencias para dar el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de la ventana), y multiplicando el resultado por 100 para dar el porcentaje de identidad de secuencia. La ventana de comparación, según se usa en la presente solicitud, es la longitud completa de la secuencia de referencia expuesta (es decir, si se expone la SEC ID Nº: 33 como la secuencia de referencia, el porcentaje de identidad de secuencia se compara sobre la longitud completa de la SEC ID Nº: 33).

Según se utiliza en el presente documento, el término "sonda" se refiere a un oligonucleótido (es decir, una secuencia de nucleótidos), ya sea que se presente naturalmente como en un producto de digestión por restricción purificado o se produzca sintéticamente, de manera recombinante o por medio de amplificación por PCR, que es capaz de hibridar con otro oligonucleótido de interés. Una sonda puede ser de hebra única o de doble hebra. Las sondas son útiles en la detección, la identificación y el aislamiento de secuencias de genes particulares. Está contemplado que cualquier sonda utilizada en la presente invención puede marcarse con cualquier "molécula informadora", de modo que sea detectable en cualquier sistema de detección, incluyendo, pero no limitado a sistemas enzimáticos (por ejemplo, ELISA, así como ensayos histoquímicos basados en enzimas), fluorescentes, radioactivos y luminiscentes. No es la intención que la presente invención esté limitada a cualquiera de los sistemas de detección o marcadores particulares.

Según se utiliza en el presente documento, el término "reacción en cadena de la polimerasa" ("PCR") se refiere al procedimiento descrito en las Patentes de EEUU Nº 4.683.195, 4.683.202 y 4.965.188, que describen un procedimiento para aumentar la concentración de un segmento de una secuencia diana en una mezcla de ADN genómico sin clonación o purificación. Este procedimiento para amplificar la secuencia diana está constituido por la introducción de un gran exceso de cebadores de dos oligonucleótidos a la mezcla del ADN que contiene la secuencia diana deseada, seguida por una secuencia precisa de ciclos térmicos en presencia de una polimerasa de ADN. Los dos cebadores son complementarios a sus hebras respectivas de la secuencia diana de doble hebra. Para que tenga efecto la amplificación, se desnaturaliza la mezcla y a continuación se hibridan los cebadores a sus secuencias complementarias dentro de la molécula diana. Tras la hibridación, se extienden los cebadores con una polimerasa para formar un nuevo par de hebras complementarias. Las etapas de desnaturalización, hibridación del cebador y extensión de la polimerasa pueden repetirse muchas veces (es decir, la desnaturalización, la hibridación y la extensión constituyen un "ciclo"; puede haber numerosos "ciclos") para obtener una alta concentración de un segmento amplificado de la secuencia diana deseada. La longitud del segmento amplificado de la secuencia diana deseada se determina por las posiciones relativas de los cebadores uno respecto al otro, y por consiguiente, esta longitud es un parámetro controlable. En virtud del aspecto repetitivo del proceso, se hace referencia al procedimiento como la "reacción en cadena de la polimerasa" (de aquí en adelante "PCR"). Como los segmentos amplificados deseados de la secuencia diana se convierten en las secuencias predominantes (en términos de concentración) en la mezcla, se dice que están "amplificados por PCR".

Con PCR, es posible amplificar una única copia de una secuencia diana específica en el ADN genómico hasta un nivel detectable por varias metodologías diferentes (por ejemplo, hibridación con una sonda marcada; incorporación de cebadores biotinilados seguida por la detección con conjugado de avidina-enzima; incorporación de trifosfatos del desoxinucleótido marcados con ^{32}P, tales como dCTP o dATP, en el segmento amplificado). Además del ADN genómico, cualquier oligonucleótido o secuencia de polinucleótidos puede amplificarse con la serie adecuada de moléculas de cebadores. En particular, los segmentos amplificados creados por el procedimiento de PCR mismo son, en sí mismos, moldes eficaces para las siguientes amplificaciones por PCR.

El término "aislado" cuando se usa con relación a un ácido nucleico, como en "un oligonucleótido aislado" o "polinucleótido aislado" se refiere a una secuencia del ácido nucleico que se identifica y se separa de al menos un ácido nucleico contaminante con el que está normalmente asociado en su fuente natural. El ácido nucleico aislado está presente en una forma o configuración que es diferente de la que se encuentra en la naturaleza. Por consiguiente, las moléculas de ácido nucleico aisladas se distinguen de las moléculas de ácido nucleico como existe en las células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico aislada incluye una molécula de ácido nucleico contenida en las células que normalmente expresan el polipéptido donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una ubicación cromosómica diferente de la de las células naturales. El ácido nucleico, el oligonucleótido o el polinucleótido aislado pueden estar presentes en forma de hebra única o de doble hebra. Cuando un ácido nucleico, un oligonucleótido o un polinucleótido aislado va a utilizarse para expresar una proteína, el oligonucleótido o el polinucleótido contendrá como mínimo la secuencia sentido o codificadora (es decir, el oligonucleótido o el polinucleótido pueden ser de hebra única), pero pueden contener tanto la hebra sentido como la antisentido o complementaria (es decir, el oligonucleótido o el polinucleótido pueden ser de doble hebra).

Según se utiliza en el presente documento el término "porción" cuando se usa con referencia a una secuencia de nucleótidos (como en "una porción de una secuencia de nucleótidos dada") se refiere a fragmentos de esa secuencia. Los fragmentos pueden variar en tamaño desde diez nucleótidos hasta la secuencia de nucleótidos completa menos un nucleótido (por ejemplo, 10 nucleótidos, 20, 30, 40, 50, 100, 200, etc.).

Según se utiliza en el presente documento el término "porción" cuando se usa con referencia a una secuencia de aminoácidos (como en "una porción de una secuencia de aminoácidos dada") se refiere a fragmentos de esa secuencia. Los fragmentos pueden variar en tamaño desde seis aminoácidos hasta la secuencia de aminoácidos completa menos un aminoácido (por ejemplo, 6 aminoácidos, 10, 20, 30, 40, 75, 200, etc.).

Según se utiliza en el presente documento, el término "purificado" o "purificar" se refiere a la eliminación de contaminantes de una muestra. Por ejemplo, los anticuerpos específicos de antígeno pueden purificarse por la eliminación de proteínas diferentes de inmunoglobulinas contaminantes; estos pueden también purificarse por la eliminación de la inmunoglobulina que no se une al mismo antígeno. La eliminación de las proteínas diferentes de inmunoglobulinas y/o la eliminación de las inmunoglobulinas que no se unen a un antígeno particular dan lugar a un aumento en el porcentaje de inmunoglobulinas específicas de antígeno en la muestra. En otro ejemplo, los polipéptidos recombinantes específicos de antígeno se expresan en células huésped bacterianas y los polipéptidos se purifican por eliminación de las proteínas de la célula huésped; de este modo aumenta el porcentaje de polipéptidos recombinantes específicos de antígeno en la muestra.

El término "molécula de ADN recombinante", según se utiliza en el presente documento, se refiere a una molécula de ADN que comprende segmentos de ADN unidos juntos por medio de técnicas de biología molecular.

El término "proteína recombinante" o "polipéptido recombinante", según se utiliza en el presente documento, se refiere a una molécula de proteína que se expresa a partir de una molécula de ADN recombinante.

El término "proteína nativa", como se usa en el presente documento, indica que una proteína no contiene los residuos de aminoácidos codificados por secuencias de vectores; es decir, la proteína nativa contiene solamente los aminoácidos que se encuentran en la proteína como se presenta comúnmente en la naturaleza. Una proteína nativa puede producirse por medios recombinantes o puede aislarse de una fuente que se presenta en la naturaleza.

El término "transferencia Southern", se refiere al análisis de ADN en geles de agarosa o de acrilamida para fraccionar el ADN según el tamaño seguido por la transferencia del ADN del gel a un soporte sólido, tal como nitrocelulosa o una membrana de nailon. A continuación se pone el ADN inmovilizado en contacto con una sonda marcada para detectar las especies de ADN complementarias a la sonda utilizada. El ADN puede escindirse con enzimas de restricción antes de la electroforesis. Tras la electroforesis, el ADN puede despurinarse y desnaturalizarse parcialmente antes o durante la transferencia al soporte sólido. Las transferencias Southern son una herramienta convencional de los biólogos moleculares (J. Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, NY, pág. 9.31-9.58 [1989]).

El término "transferencia Northern", según se utiliza en el presente documento, se refiere al análisis del ARN por electroforesis del ARN en geles de agarosa para fraccionar el ARN según el tamaño seguido por la transferencia del ARN del gel a un soporte sólido, tal como nitrocelulosa o una membrana de nailon. A continuación se pone el ARN en contacto con una sonda marcada para detectar las especies del ARN complementarias a la sonda utilizada. Las transferencias Northern son una herramienta convencional de los biólogos moleculares (J. Sambrook, y col., supra, pág. 7.39-7. 52 [1989]).

El término "transferencia Western" se refiere al análisis de proteína(s) (o polipéptidos) inmovilizados sobre un soporte tal como nitrocelulosa o una membrana. Las proteínas se hacen correr en geles de acrilamida para separar las proteínas; seguido por la transferencia de la proteína del gel a un soporte sólido, tal como nitrocelulosa o una membrana de nailon. A continuación se exponen las proteínas inmovilizadas a los anticuerpos con reactividad contra un antígeno de interés. La unión de los anticuerpos puede detectarse por medio de diversos procedimientos, incluido el uso de anticuerpos marcados radioactivamente.

El término "determinante antigénico", según se utiliza en el presente documento, se refiere a la porción de un antígeno que hace contacto con un anticuerpo particular (es decir, un epítopo). Cuando se usa una proteína o un fragmento de una proteína para inmunizar un animal huésped, numerosas regiones de la proteína pueden inducir la producción de anticuerpos que se unen específicamente a una región dada o a una estructura tridimensional en la proteína; se hace referencia a estas regiones o estructuras como determinantes antigénicos. Un determinante antigénico puede competir con el antígeno intacto (es decir, el "inmunógeno" utilizado para provocar la respuesta inmune) por la unión a un anticuerpo.

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El término "transgén", según se utiliza en el presente documento, se refiere a un gen extraño, heterólogo o autólogo que se coloca en un organismo introduciendo el gen en huevos recientemente fertilizados o en embriones tempranos. El término "gen extraño" se refiere a cualquier ácido nucleico (por ejemplo, secuencia genética) que se introduce en el genoma de un animal por medio de manipulaciones experimentales y puede incluir secuencias genéticas que se encuentran en ese animal, siempre y cuando el gen introducido no resida en la misma ubicación en que lo hace el gen que se presenta en la naturaleza. El término "gen autólogo" tiene la intención de abarcar las variantes (por ejemplo, los polimorfismos o mutantes) del gen que se presenta en la naturaleza. Por consiguiente, el término transgén abarca el reemplazo del gen que se presenta en la naturaleza con una forma variante del gen.

Según se utiliza en el presente documento, el término "vector" se usa con referencia a las moléculas de ácido nucleico que transfieren el(los) segmento(s) de ADN de una célula a otra. El término "vehículo" se utiliza algunas veces indistintamente con "vector".

El término "vector de expresión", según se utiliza en el presente documento, se refiere a una molécula de ADN recombinante que contiene una secuencia codificadora deseada y las secuencias de ácidos nucleicos adecuadas necesarias para la expresión de la secuencia codificadora unida de manera operativa en un organismo huésped particular. Las secuencias de ácidos nucleicos necesarias para la expresión en procariotas incluyen usualmente un promotor, un operador (opcional) y un sitio de unión de ribosomas, frecuentemente junto con otras secuencias. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, potenciadores y señales de terminación y de poliadenilación.

Según se utiliza en el presente documento, el término "célula huésped" se refiere a cualquier célula eucariota o procariota (por ejemplo, células bacterianas tales como E. coli, células CHO, células de levaduras, células de mamíferos, células de aves, células de anfibios, células de plantas, células de peces y células de insectos), localizada in vitro o in vivo. Por ejemplo, las células huésped pueden estar localizadas en un animal transgénico.

Los términos "transfección" y "transformación", según se utilizan en el presente documento, se refieren a la introducción de ADN extraño en las células (por ejemplo células eucariotas y procariotas). La transfección puede llevarse a cabo por una diversidad de medios conocidos en la técnica que incluyen la coprecipitación de ADN con fosfato de calcio, la transfección mediada por DEAE-dextrano, la transfección mediada por polibreno, la electroporación, la microinyección, la fusión de liposomas, la lipofección, la fusión de protoplastos, la infección retroviral y la biolística.

El término "transfección estable" o "transfectado de manera estable" se refiere a la introducción e integración del ADN extraño en el genoma de la célula transfectada. El término "transfectante estable" se refiere a una célula que tiene ADN extraño integrado de manera estable en el ADN genómico.

El término "transfección transitoria" o "transfectado de manera transitoria" se refiere a la introducción de ADN extraño en una célula en la que el ADN extraño no se integra en el genoma de la célula transfectada. El ADN extraño persiste en el núcleo de la célula transfectada durante varios días. Durante este tiempo el ADN extraño está sometido a los controles reguladores que gobiernan la expresión de los genes endógenos en los cromosomas. El término "transfectante transitorio" se refiere a las células que han tomado el ADN extraño pero que pueden no haber integrado este ADN.

El término "coprecipitación con fosfato de calcio" se refiere a una técnica para introducir ácidos nucleicos en una célula. La captación de ácidos nucleicos por las células se potencia cuando el ácido nucleico se presenta como un coprecipitado de fosfato de calcio-ácido nucleico. La técnica original de Graham y de van der Eb (Graham and van der Eb, Virol., 52: 456 [1973]), ha sido modificada por varios grupos para optimizar las condiciones para los tipos de células particulares. La técnica es muy consciente de estas numerosas modificaciones.

Una "composición que comprende una secuencia de polinucleótidos dada", según se utiliza en el presente documento, se refiere ampliamente a cualquier composición que contiene la secuencia de polinucleótidos dada. La composición puede comprender una disolución acuosa. Las composiciones que comprenden las secuencias de polinucleótidos que codifican, por ejemplo, una región variante de Fc o sus fragmentos, pueden usarse como sondas de hibridación. En este caso, las secuencias de polinucleótidos que codifican la región variante de Fc se utilizan típicamente en una disolución acuosa que contiene sales (por ejemplo, NaCI), detergentes (por ejemplo, SDS) y otros componentes (por ejemplo, disolución de Denhardt, leche en polvo, ADN de esperma de salmón, etc.).

El término "compuesto de prueba" o "compuesto candidato" se refiere a cualquier entidad química, compuesto farmacéutico, fármaco, y similares que pueden usarse para tratar o prevenir una enfermedad, una afección, un padecimiento, o un trastorno de la función corporal, o de otra manera alterar el estado fisiológico o celular de una muestra. Los compuestos de prueba comprenden los compuestos terapéuticos conocidos y potenciales. Puede determinarse que un compuesto de prueba es terapéutico por selección usando los procedimientos de selección de la presente invención. Un "compuesto terapéutico conocido" se refiere a un compuesto terapéutico que se ha mostrado (por ejemplo, a través de ensayos con animales o experiencia anterior con la administración a seres humanos) que es eficaz en tal tratamiento o prevención.

Según se utiliza en el presente documento, el término "respuesta", cuando se usa con referencia a un ensayo, se refiere a la generación de un señal detectable (por ejemplo, acumulación de la proteína informadora, aumento en la concentración de iones, acumulación de un producto químico detectable).

Según se utiliza en el presente documento, el término "gen informador" se refiere a un gen que codifica una proteína que puede analizarse. Los ejemplos de genes informadores incluyen, pero no se limitan a, la luciferasa (Véase, por ejemplo, deWet y col., Mol. Cell. Biol. 7: 725 [1987] y la Patente de EEUU Nº 6.074.859), la proteína fluorescente verde (GFP) (por ejemplo, Número de Acceso del GenBank U43284; una serie de variantes de la GFP están disponibles comercialmente de CLONTECH Laboratories, Palo Alto, CA), la acetiltransferasa del cloranfenicol, la \beta-galactosidasa, la fosfatasa alcalina y la peroxidasa del rábano picante.

Según se utiliza en el presente documento, los términos "memoria de ordenador" y "dispositivo de memoria de ordenador" se refieren a cualquier medio de almacenamiento legible por un procesador del ordenador. Los ejemplos de memoria de ordenador incluyen, pero no se limitan a, RAM, ROM, chips de ordenador, disco de vídeo digital (DVD), discos compactos (CD), discos rígidos (HDD) y cinta magnética.

Según se utiliza en el presente documento, el término "medio legible por ordenador" se refiere a cualquier dispositivo o sistema para almacenar y proporcionar la información (por ejemplo, los datos e instrucciones) a un procesador del ordenador. Los ejemplos de medios legibles por ordenador incluyen, pero no se limitan a, DVD, CD, discos rígidos, cinta magnética y servidores para medios de transmisión en redes.

Según se utiliza en el presente documento, la frase "el medio legible por ordenador codifica una representación" de una secuencia de ácido nucleico o de aminoácidos, se refiere al medio legible por ordenador que tiene almacenado en el mismo la información, que cuando se suministra a un procesador, permite presentar la secuencia del ácido nucleico o la secuencia de aminoácidos a un usuario (por ejemplo impresa o presentada en una pantalla de visualización).

Según se utiliza en el presente documento, los términos "procesador" y "unidad central de procesamiento" o "CPU" se usan indistintamente y se refieren a un dispositivo que es capaz de leer un programa de una memoria del ordenador (por ejemplo, ROM u otra memoria del ordenador) y realizar una serie de etapas según el programa.

Según se utiliza en el presente documento, la numeración de los residuos de aminoácidos en una cadena pesada de inmunoglobulina usa el formato del índice de EU como en Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5º Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). El "formato del índice EU como en Kabat" se refiere a la numeración de los residuos del anticuerpo EU IgG1 humano.

Según se utiliza en el presente documento un "polipéptido original" es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que puede cambiarse o alterarse (por ejemplo, se realiza una sustitución, una adición o una deleción de aminoácidos) para producir una variante. En formas de realización de preferencia, el polipéptido original comprende al menos una porción de una región Fc que se presenta en la naturaleza o de una región Fc con modificaciones de la secuencia de aminoácidos (por ejemplo, adiciones, deleciones y/o sustituciones). En algunas formas de realización, están específicamente contempladas las variantes que son más cortas o más largas que el polipéptido original. En formas de realización particularmente de preferencia, el polipéptido original difiere en la función (por ejemplo, función de efector, unión, etc.) comparado con una variante.

Según se utiliza en el presente documento, el término "variante de un polipéptido original" se refiere a un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la del polipéptido original en al menos una modificación de aminoácidos. En ciertas formas de realización, la variante comprende al menos una porción de una región Fc (por ejemplo, al menos el 40%, el 50%, el 75% o el 90% de una región Fc). En formas de realización de preferencia, la variante comprende una región Fc de un polipéptido original con al menos una modificación de aminoácidos.

Según se utiliza en el presente documento, el término "región Fc" se refiere una región C terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina (por ejemplo, según se muestra en la Figura 1). La "región Fc" puede ser una región Fc de la secuencia nativa o una región Fc variante. Aunque los límites generalmente aceptados de la región Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina podrían variar, se define generalmente que la región Fc de la cadena pesada de IgG humana se extiende desde un residuo de aminoácido en la posición Cys226, o desde Pro230, hasta el extremo carboxilo terminal de la misma. En algunas formas de realización, las variantes comprenden solamente porciones de la región Fc y pueden o no incluir el extremo carboxilo terminal. La región Fc de una inmunoglobulina comprende generalmente dos dominios constantes, CH2 y CH3. En algunas formas de realización, están contempladas las variantes que tienen uno o más de los dominios constantes. En otras formas de realización, están contempladas las variantes sin tales dominios constantes (o con sólo porciones de tales dominios constantes).

Según se utiliza en el presente documento, el "dominio CH2" (también denominado dominio "C\gamma2") comprende por lo general la extensión de residuos que va desde aproximadamente el aminoácido 231 hasta aproximadamente el aminoácido 340 en una región Fc (por ejemplo en la región Fc de la IgG humana). El dominio CH2 es único en que no está apareado estrechamente con otro dominio. Más bien, dos cadenas de hidratos de carbono ramificadas unidas por N se interponen entre los dos dominios CH2 de una molécula de IgG nativa intacta.

Según se utiliza en el presente documento, "el dominio CH3" (también denominado dominio "C\gamma3") comprende por lo general la extensión de los residuos del extremo C terminal a un dominio CH2 en una región Fc (por ejemplo, desde aproximadamente el residuo de aminoácido 341 hasta aproximadamente el residuo de aminoácido 447 de una región Fc de IgG humana).

Según se utiliza en el presente documento, una región Fc puede tener "funciones de efector" que son responsables de activar o disminuir una actividad biológica (por ejemplo en un sujeto). Los ejemplos de las funciones de efector incluyen, pero no se limitan a: unión de C1q; citotoxicidad dependiente del complemento (CDC); unión del receptor de Fc; citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC); fagocitosis; regulación negativa de los receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptor de células B; BCR), etc. Tales funciones de efector pueden requerir que la región Fc se combine con un dominio de unión (por ejemplo un dominio variable del anticuerpo) y pueden evaluarse usando diversos ensayos (por ejemplo ensayo de unión de Fc, ensayos de ADCC, ensayo de CDC, depleción de células diana de muestras de sangre entera o fraccionada, etc.).

Según se utiliza en el presente documento, el término "región Fc de secuencia nativa" o "región Fc de tipo natural" se refiere a una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la secuencia de aminoácidos de una región Fc que se encuentra comúnmente en la naturaleza. Las regiones Fc humanas de secuencia nativa de ejemplo incluyen una región Fc de IgG1 humana de secuencia nativa (alotipos f y a,z); región Fc de IgG2 humana de secuencia nativa; región Fc de IgG3 humana de secuencia nativa; y región Fc de IgG4 humana de secuencia nativa así como sus variantes que se presentan en la naturaleza. Están contempladas otras secuencias y pueden obtenerse fácilmente de diversos sitios web (por ejemplo, del sitio web de NCBI).

Según se utiliza en el presente documento, el término "región Fc variante" se refiere a la secuencia de aminoácidos que difiere de la de una región Fc de secuencia nativa (o sus porciones) en virtud de al menos una modificación de aminoácidos (por ejemplo, sustitución, inserción o deleción), incluyendo las variantes heterodiméricas en las que las secuencias de las subunidades de cadena pesada pueden diferir una de la otra. En formas de realización de preferencia, la región Fc variante tiene al menos una sustitución de aminoácidos comparada con una región Fc de secuencia nativa (por ejemplo desde aproximadamente una hasta aproximadamente diez sustituciones de aminoácidos, y de preferencia desde aproximadamente una hasta aproximadamente cinco sustituciones de aminoácidos en una región Fc de secuencia nativa). En formas de realización de preferencia, las regiones Fc variantes tendrán al menos aproximadamente 80% de homología con una región Fc de secuencia nativa, de preferencia al menos aproximadamente 90% de homología, y de más preferencia al menos aproximadamente 95% de homología.

Según se utiliza en el presente documento, el término "homología", cuando se usa con referencia a las secuencias de aminoácidos, se refiere al porcentaje de residuos en una variante de la secuencia de aminoácidos que son idénticos con la secuencia de aminoácidos nativa tras alinear las secuencias e introducir huecos, de ser necesario, para conseguir el máximo porcentaje de homología.

El término "polipéptido que contiene la región Fc" se refiere a un polipéptido, tal como un anticuerpo o una inmunoadhesina (véase las definiciones a continuación), que comprende una región Fc.

Los términos "receptor de Fc" y "FcR" se usan para describir un receptor que se une a una región Fc (por ejemplo, la región Fc de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo). El término incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de las IgG maternas al feto.

Según se utiliza en el presente documento, la frase "citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos" y "ADCC" se refieren a una reacción mediada por células en la que las células citotóxicas (por ejemplo, no específicas) que expresan los FcR (por ejemplo, las células asesinas naturales (NK), los neutrófilos y los macrófagos) reconocen el anticuerpo unido en una célula diana y provocan posteriormente la lisis de las células diana. Las células principales para mediar la ADCC, las células NK, expresan Fc\gammaRIII, mientras que los monocitos expresan Fc\gammaRI, Fc\gammaRII y Fc\gammaRIII.

Según se utiliza en el presente documento, la frase "células efectoras" se refiere a los leucocitos que expresan uno o más FcR y llevan a cabo funciones de efector. De preferencia, las células expresan al menos Fc\gammaRIII y llevan a cabo una función de efector de la ADCC. Los ejemplos de leucocitos que median la ADCC incluyen las células mononucleares de la sangre periférica (PBMC), las células asesinas naturales (NK), los monocitos, las células T citotóxicas y los neutrófilos. Las células efectoras pueden aislarse de una fuente nativa (por ejemplo de sangre).

Según se utiliza en el presente documento, la frase "sangre entera" se refiere a muestras de sangre no fraccionada.

Según se utiliza en el presente documento, una variante de polipéptido con afinidad de unión de FcR o la actividad de ADCC "alterada" es una que tiene actividad de unión de FcR y/o actividad de ADCC aumentada (es decir incrementada) o disminuida (es decir reducida) comparada con un polipéptido original o con un polipéptido que comprende una región Fc de la secuencia nativa. Una variante de polipéptido que "exhibe unión aumentada" a un FcR une al menos un FcR con mejor afinidad que el polipéptido original. Una variante de polipéptido que "exhibe unión disminuida" a un FcR, une al menos un FcR con peor afinidad que el polipéptido original. Tales variantes que exhiben unión disminuida a un FcR pueden tener poca unión o unión no apreciable a un FcR, por ejemplo, 0-20% de unión al FcR comparado con un polipéptido original. Una variante de polipéptido que une un FcR con "mejor afinidad" que un polipéptido original, es una que une uno o más de los FcR identificados anteriormente con mayor afinidad de unión que el anticuerpo original, cuando las cantidades de variante de polipéptido y polipéptido original en un ensayo de unión son esencialmente las mismas, y todas las otras condiciones son idénticas. Por ejemplo, una variante de polipéptido con mejor afinidad de unión de FcR puede exhibir una mejora (es decir aumento) de desde aproximadamente 1,10 veces hasta aproximadamente 100 veces (más típicamente desde aproximadamente 1,2 veces hasta aproximadamente 50 veces) en la afinidad de unión de FcR comparado con el polipéptido original, donde la afinidad de unión de FcR se determina, por ejemplo, en un ensayo ELISA.

Según se utiliza en el presente documento, una "modificación de aminoácido" se refiere a un cambio en la secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos dada. Las modificaciones de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, una sustitución, inserción y/o deleción de aminoácidos. En formas de realización de preferencia, la modificación de aminoácidos es una sustitución (por ejemplo en una región Fc de un polipéptido original).

Según se utiliza en el presente documento, una "modificación del aminoácido en" una posición especificada (por ejemplo en la región Fc) se refiere a la sustitución o deleción de residuo especificado, o la inserción de al menos de un residuo de aminoácido adyacente al residuo especificado. Por inserción "adyacente" a un residuo especificado se entiende la inserción dentro de uno a dos de sus residuos. La inserción puede ser en el extremo N-terminal o C-terminal al residuo especificado.

Según se utiliza en el presente documento, una "sustitución de aminoácidos" se refiere al reemplazo de al menos un residuo de aminoácido existente en una secuencia de aminoácidos dada con otro residuo de aminoácido diferente de "reemplazo". El residuo o residuos de reemplazo pueden ser "residuos de aminoácido que se presentan en la naturaleza" (es decir codificados por el código genético) y pueden seleccionarse de: alanina (Ala); arginina (Arg); asparagina (Asn); ácido aspártico (ASP); cisteína (Cys); glutamina (Gln); ácido glutámico (Glu); glicina (Gly); histidina (Gys); isoleucina (Ile); leucina (Leu); lisina (Lys); metionina (Met); fenilalanina (Phe); prolina (Pro); serina (Ser); treonina (Thr); triptofano (Trp); tirosina (Tyr); y valina (Val). La sustitución con uno o más residuos de aminoácido que no se presentan en la naturaleza también está incluida por la definición de una sustitución de aminoácidos en el presente documento. Un "residuo de aminoácido que no se presentan en la naturaleza" se refiere a un residuo, diferente de los residuos de aminoácidos que se presentan en la naturaleza presentados anteriormente, que es capaz de unirse de manera covalente en posición adyacente a los residuos de aminoácidos en una cadena de polipéptidos. Los ejemplos de residuos de aminoácidos que no se presentan en la naturaleza incluyen norleucina, ornitina, norvalina, homoserina y otros residuos de aminoácido análogos tales como los descritos en Ellman y col. Meth. Enzym. 202: 301-336 (1991).

Según se utiliza en el presente documento, el término "inserción de aminoácidos" se refiere a la incorporación de al menos un aminoácido en una secuencia de aminoácidos dada. En formas de realización de preferencia, una inserción será usualmente la inserción de uno o dos residuos de aminoácidos. En otras formas de realización, la inserción incluye inserciones de péptidos mayores (por ejemplo la inserción de aproximadamente tres hasta aproximadamente cinco o incluso hasta aproximadamente diez residuos de aminoácidos).

Según se utiliza en el presente documento, el término "deleción de aminoácidos" se refiere a la eliminación de al menos un residuo de aminoácido de una secuencia de aminoácidos dada.

El término "señal de ensayo" se refiere a la señal de salida de cualquier procedimiento de detección de interacciones proteína-proteína, incluidos pero no limitados a, mediciones de absorbancia de ensayos colorimétricos, intensidad fluorescente, o desintegraciones por minuto. El formato del ensayo puede incluir procedimientos ELISA, facs, u otros procedimientos. Un cambio en la "señal de ensayo" puede reflejar un cambio en la viabilidad celular y/o un cambio en la cinética de disociación, en la cinética de asociación, o ambas. Una "señal de ensayo más elevada" se refiere al número de la señal de salida medido que es mayor que otro número (por ejemplo una variante puede tener un número medido más elevado (mayor) en un ensayo ELISA comparado con el polipéptido original). Una señal de ensayo "más baja" se refiere al número de la señal de la salida medido que es más pequeño que otro número (por ejemplo una variante
puede tener un número medido más bajo (más pequeño) en un ensayo ELISA comparado con el polipéptido original).

El término "afinidad de unión" se refiere a la constante de equilibrio de disociación (expresada en unidades de concentración) asociada con cada interacción de unión entre el receptor de Fc y Fc. La afinidad de unión está directamente relacionada con la relación de la cinética de disociación (informada generalmente en unidades de inversa del tiempo, por ejemplo segundos^{-1}) dividida por la cinética de asociación (generalmente informada en unidades de concentración por unidad de tiempo, por ejemplo molar / segundo). En general no es posible establecer de manera inequívoca si los cambios en las constantes de equilibrio de disociación se deben a diferencias en las asociaciones, disociaciones o a ambas, a menos que se determinen experimentalmente estos parámetros (por ejemplo, por medio de mediciones BIACORE o SAPIDYNE).

Según se utiliza en el presente documento, el término "región de bisagra" se refiere a la extensión de aminoácidos en la IgC1 humana que se extiende desde Glu216 hasta Pro230 de la IgG1 humana. Las regiones de bisagra de otros isotipos de IgG pueden alinearse con la secuencia de IgG1 colocando el primer y último residuo cisteína que forman enlaces S-S entre las cadenas pesadas en las mismas posiciones.

Según se utiliza en el presente documento, el término "región de bisagra inferior" de una región Fc se refiere a la extensión de residuos de aminoácidos en posición inmediatamente C-terminal a la región de bisagra (por ejemplo los residuos 233 a 239 de la región Fc de IgG1).

"C1q" es un polipéptido que incluye un sitio de unión para la región Fc de una inmunoglobulina. C1q junto con dos serina proteasas, C1r y C1s, forma el complejo C1, el primer componente de la vía de la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).

Según se utiliza en el presente documento, el término "anticuerpo" se usa en el sentido más amplio y cubre específicamente los anticuerpos monoclonales (incluidos los anticuerpos monoclonales de longitud total), los anticuerpos policlonales, los anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), y los fragmentos de anticuerpos siempre que exhiban la actividad biológica deseada.

Según se utiliza en el presente documento, el término "fragmentos de anticuerpo" se refiere a una porción de un anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpos de cadena única; péptidos Fc o de Fc', Fab y fragmentos de Fab, y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. Los fragmentos de anticuerpos conservan de preferencia al menos parte de la bisagra y opcionalmente la región CH1 de una cadena pesada de IgG. En otras formas de realización de preferencia, los fragmentos de anticuerpo comprenden al menos una porción de la región CH2 o la región CH2 completa.

Según se utiliza en el presente documento, el término "fragmento funcional", cuando se usa con referencia a un anticuerpo monoclonal, tiene la intención de referirse a una porción del anticuerpo monoclonal que todavía conserva una actividad funcional. Una actividad funcional puede ser, por ejemplo, la actividad o especificidad de unión al antígeno. Los fragmentos funcionales de los anticuerpos monoclonales incluyen, por ejemplo, cadenas pesadas o ligeras individuales o sus fragmentos, tales como VL, VH y Fd; fragmentos monovalentes, tales como Fv, Fab, y Fab'; fragmentos bivalentes tales como F(ab')_{2}; Fv de cadena única (scFv); y fragmentos de Fc. Tales términos están descritos en, por ejemplo, Harlowe and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York (1989); Molec. Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference (Myers, R.A. (ed.), Nueva York: VCH Publisher, Inc.); Huston y col., Cell Biophysics, 22:189-224 (1993); Pluckthun and Skerra, Meth. Enzymol., 178:497-515 (1989) y en Day, E.D., Advanced Immunochemistry, Second Ed., Wiley-Liss, Inc., Nueva York, NY (1990). El término fragmento funcional tiene la intención de incluir, por ejemplo, los fragmentos producidos por digestión con proteasas o reducción de un anticuerpo monoclonal y por medio de procedimientos de ADN recombinante conocidos por los expertos en la técnica.

Según se utiliza en el presente documento, las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos que contienen secuencias mínimas, o ninguna secuencia, derivada de inmunoglobulina no humana. En su mayoría, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en los que los residuos de una región hipervariable del receptor están reemplazados por los residuos de una región hipervariable de la especie no humana (anticuerpo donador) tales como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad, y capacidad deseadas. En algunos casos, se reemplazan los residuos de la región marco estructural de Fv (FR) de la inmunoglobulina humana por los residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donador. Estas modificaciones se realizan por lo general para refinar más el rendimiento del anticuerpo. En general el anticuerpo humanizado comprenderá substancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todos o substancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todos o substancialmente todos los residuos FR son los de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado puede también comprender al menos una porción de una región constante (Fc) de inmunoglobulina, típicamente la de una inmunoglobulina humana. Los ejemplos de procedimientos usados para generar anticuerpos humanizados están descritos en la Patente de EEUU 5.225.539 de Winter y col.

Según se utiliza en el presente documento, el término "región hipervariable" se refiere a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión del antígeno. La región hipervariable comprende residuos de aminoácidos de una "región determinante de complementariedad" o "CDR" (es decir los residuos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada; Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)), y/o los residuos de un "bucle hipervariable" (es decir los residuos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada; Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)). Los residuos del "marco estructural" o "FR" son los residuos del dominio variable diferentes de los residuos de la región hipervariable según se definió en el presente documento.

Según se utiliza en el presente documento, el término "inmunoadhesina" designa las moléculas análogas a anticuerpos que combinan el dominio de unión de una proteína "adhesina" heteróloga (por ejemplo un receptor, ligando o enzima) con un dominio constante de inmunoglobulina. Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden una fusión de la secuencia de aminoácidos de la adhesina con la especificidad de unión deseada que es diferente del sitio de reconocimiento y unión del antígeno (sitio de combinación del antígeno) de un anticuerpo (es decir es "heterólogo") con una secuencia del dominio constante de la inmunoglobulina.

Según se utiliza en el presente documento, el término "dominio de unión del ligando" se refiere a cualquier receptor nativo o a cualquier región o derivado del mismo que conserva al menos una capacidad de unión del ligando cualitativa de un receptor nativo correspondiente. En ciertas formas de realización, el receptor es de un polipéptido de superficie celular que tiene un dominio extracelular que es homólogo a un miembro de la familia de supergenes de las inmunoglobulinas. Otros receptores, que no son miembros de la familia de supergenes de las inmunoglobulinas pero que no obstante están específicamente cubiertos por esta definición, son los receptores para las citocinas, y en particular los receptores con actividad tirosina cinasa (tirosina cinasas receptoras), los miembros de la superfamilia del receptor de hematopoyetina y del factor de crecimiento de los nervios, y las moléculas de adhesión celular (por ejemplo las selectinas E, l, y P).

Según se utiliza en el presente documento, el término "dominio de unión del receptor" se refiere a cualquier ligando nativo para un receptor, incluidas las moléculas de adhesión celular, o cualquier región o derivado de tal ligando nativo que conserva al menos una capacidad de unión del receptor cualitativa de un ligando nativo correspondiente.

Según se utiliza en el presente documento, el término "quimera de anticuerpo-inmunoadhesina" comprende una molécula que combina al menos a un dominio de unión de un anticuerpo con al menos una inmunoadhesina. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, las quimeras biespecíficas CD4-IgG descritas en Berg y col., PNAS (USA) 88: 4723-4727 (1991) y Chamow y col., J. Immunol., 153: 4268 (1994).

Según se utiliza en el presente documento, un polipéptido "aislado" es uno que se ha identificado y se ha separado y/o se ha recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que podrían interferir con los usos terapéuticos o de diagnóstico para el polipéptido, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. En ciertas formas de realización, el polipéptido aislado está purificado (1) hasta más del 95% en peso de los polipéptidos según se determina por el método de Lowry, y de preferencia, más del 99% en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos N-terminal o interna por medio del uso de un secuenciador de copa giratoria, o (3) hasta homogeneidad por SDS-page bajo condiciones reductoras o no reductoras usando azul de Coomassie, o azul de plata. El polipéptido aislado incluye el polipéptido in situ dentro de células recombinantes ya que al menos un componente del entorno natural del polipéptido no estará presente. Sin embargo, por lo general, el polipéptido aislado se preparará por medio de al menos una etapa de purificación.

Según se utiliza en el presente documento, el término "tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o preventivas. Los que necesitan tratamiento incluyen aquellos que ya tienen el trastorno así como aquellos en los que debe prevenirse el trastorno.

Según se utiliza en el presente documento, el término "trastorno" se refiere a cualquier afección que podría beneficiarse del tratamiento con una variante de polipéptido, incluidos trastornos o enfermedades crónicos y agudos (por ejemplo afecciones patológicas que predisponen a un paciente para un trastorno particular). En ciertas formas de realización, el trastorno es el cáncer.

Según se utiliza en el presente documento, los términos "cáncer" y "canceroso" describen o se refieren a la afección fisiológica en los mamíferos que está caracterizada típicamente por el crecimiento celular no regulado. Los ejemplos del cáncer incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, y leucemia. Los ejemplos más particulares de tales cánceres incluyen el cáncer de células escamosas, el cáncer de pulmón microcítico, el cáncer de pulmón no microcítico, el adenocarcinoma de pulmón, el carcinoma escamoso de pulmón, el cáncer del peritoneo, el cáncer hepatocelular, el cáncer gastrointestinal, el cáncer pancreático, el glioblastoma, el cáncer cervical, el cáncer de ovario, el cáncer de hígado, el cáncer de vejiga, el hepatoma, el cáncer de mama, el cáncer de colon, el cáncer colorrectal, el carcinoma endometrial o uterino, el carcinoma de las glándulas salivares, el cáncer de riñón, el cáncer de hígado, el cáncer de próstata, el cáncer vulvar, el cáncer de tiroides, el carcinoma hepático y diversos tipos de cáncer de cabeza y cuello.

Según se utiliza en el presente documento, la frase "cáncer que expresa HER2" es uno que comprende células que tienen la proteína del receptor HER2 (por ejemplo, Número de acceso de Genebank X03363) presente en su superficie celular, tal que un anticuerpo anti-HER2 es capaz de unirse al cáncer.

Según se utiliza en el presente documento, el término "marcador" se refiere a un compuesto o composición detectable que está conjugado directa o indirectamente a un polipéptido. El marcador puede ser detectable por sí mismo (por ejemplo, marcadores de radioisótopos o marcadores fluorescentes) o, en el caso de un marcador enzimático, pueden catalizar la alteración química de un compuesto o composición substrato que es detectable.

Según se utiliza en el presente documento, los términos "elemento de control", "secuencia de control" y "elemento regulador" se refieren a un elemento genético que controla algunos aspectos de la expresión de las secuencias de ácidos nucleicos. Por ejemplo, un promotor es un elemento regulador que facilita la iniciación de la transcripción de una región codificadora unida de manera operativa. Otros elementos reguladores incluyen señales de empalme, señales de poliadenilación, señales de terminación, etc. Los elementos de control que son adecuados para los procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia de operador, y un sitio de unión de ribosomas. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación, y potenciadores.

Según se utiliza en el presente documento, el ácido nucleico está "unido de manera operativa" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN de una secuencia previa o de un líder secretor está unido de manera operativa a un ADN para un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está unido de manera operativa a una secuencia codificadora si afecta a transcripción de la secuencia; o un sitio de unión de ribosomas está unido de manera operativa a una secuencia codificadora si está posicionado para facilitar la traducción. En formas de realización de preferencia, "unido de manera operativa" significa que las secuencias de ADN unidas son contiguas, y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en el marco de lectura. Sin embargo los potenciadores, por ejemplo, no tienen que ser contiguos. El enlace puede llevarse a cabo, por ejemplo, por unión de sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no existen, pueden usarse adaptadores o conectores de oligonucleótidos sintéticos según la práctica convencional.

Según se utiliza en el presente documento, las expresiones "célula", "línea celular" y "cultivo celular" se usan indistintamente y tales denominaciones incluyen todas la progenie. Por consiguiente, las palabras "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula primaria y los cultivos derivados de la misma independientemente del número de transferencias. También se entiende que toda la progenie puede no ser precisamente idéntica en el contenido de ADN, por mutaciones deliberadas o involuntarias. Se incluye la progenie mutante que tiene la misma función o actividad biológica tal como se identificó en la célula originalmente transformada. Cuando se tenga la intención de realizar denominaciones distintas, resultará claro a partir del contexto.

Según se utiliza en el presente documento, "analito" se refiere a una sustancia que se va a analizada. El analito de preferencia es una región Fc que contiene el polipéptido, en la que se va a analizar la capacidad para unirse a un receptor de Fc.

Según se utiliza en el presente documento, el término "receptor" se refiere a un polipéptido capaz de unir al menos un ligando. El receptor de preferencia es un receptor de superficie celular o soluble que tiene un dominio extracelular de unión al ligando y, opcionalmente, otros dominios (por ejemplo dominio transmembranario, dominio intracelular y/o anclaje de membrana). Un receptor a evaluarse en un ensayo descrito en el presente documento puede ser un receptor intacto o uno de sus fragmentos o derivados (por ejemplo una proteína de fusión que comprende el dominio de unión del receptor fusionado a unos o más polipéptidos heterólogos). Además, el receptor en el que se evaluarán las propiedades de unión puede estar presente en una célula o puede estar aislado y opcionalmente recubierto en una placa de ensayo u otra fase sólida o puede marcarse directamente y usarse como una sonda.

Según se utiliza en el presente documento, la frase "polipéptido expresado en CHO" se refiere a un polipéptido que se ha expresado de manera recombinante en células del ovario de hámster chino (CHO).

Según se utiliza en el presente documento, el término "enfermedad sensible a anticuerpos" se refiere a cualquier enfermedad o afección médica que se muestra que es tratable, al menos en parte, con terapia de anticuerpos. Los ejemplos de tales enfermedades y afecciones médicas incluyen, pero son no se limitan a, linfoma (que se muestra que es tratable con RITUXAN), enfermedad infecciosa (que se muestra que es tratable con SYNAGIS), el transplante renal (el ZENAPAX ha mostrado ser útil), la enfermedad de Crohn y la artritis reumatoide (que se muestra que es tratable con REMICADE), el carcinoma de mama (que se muestra que es tratable con HERCEPTIN), y el cáncer del colon (que se muestra que es tratable con EDRECOLOMAB). Según se utiliza en el presente documento, el término "enfermedad sensible a las inmunoadhesinas" se refiere a cualquier enfermedad o afección médica que se muestra que es tratable, al menos en parte, con terapia de inmunoadhesinas.

Según se utiliza en el presente documento una variante de polipéptido que "media la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) en presencia de células efectoras humanas más eficazmente" que un anticuerpo original es uno que, in vitro o in vivo, es substancialmente más eficaz para mediar la ADCC, cuando las cantidades de variante de polipéptido y anticuerpo original usadas en el ensayo son esencialmente las mismas. Por ejemplo, una de tales variantes causa una mayor cantidad de lisis de células diana en un ensayo de ADCC dado que el polipéptido original en un ensayo de ADCC idéntico. Tales variantes pueden identificarse, por ejemplo, usando un ensayo de ADCC, pero pueden utilizarse también otros ensayos o procedimientos para determinar la actividad de ADCC (por ejemplo modelos animales). En formas de realización de preferencia, la variante de polipéptido es desde aproximadamente 1,2 veces, 1,5 veces, 50 veces, 100 veces, aproximadamente 500 veces, o aproximadamente 1000 veces más eficaz para mediar la ADCC que el polipéptido original.

Según se utiliza en el presente documento, una variante del polipéptido que "media la depleción de células B dependiente de anticuerpos de la sangre entera de manera más eficaz" que el anticuerpo original es una que, in vitro o in vivo es substancialmente más eficaz para mediar la depleción de células B, cuando las cantidades de variante de polipéptido y anticuerpo original usadas en el ensayo son esencialmente las mismas. Por ejemplo, una de tales variantes causa un mayor grado de depleción de células B en un ensayo dado que el polipéptido original en un ensayo idéntico. También, tales variantes pueden deplecionar células B en el mismo grado pero en concentraciones más bajas que las necesarias del polipéptido original en un ensayo idéntico. Tales variantes pueden identificarse, por ejemplo, usando un ensayo de ADCC, pero pueden utilizarse también otros ensayos o procedimientos para determinar la actividad de ADCC (por ejemplo modelos animales). En formas de realización de preferencia, el aumento en la depleción relativa al polipéptido original es independiente del genotipo de FcRIIIa en la posición 158 (V o F) y del genotipo de FcRIIa en la posición 131 (H o R), y la variante de polipéptido es desde aproximadamente 1,2 veces, 1,5 veces, 50 veces, 100 veces, aproximadamente 500 veces, o aproximadamente 1000 veces más eficaz para mediar la depleción de células B que el polipéptido original.

El término "síntomas de una enfermedad sensible a anticuerpos o inmunoadhesinas" se refiere a los síntomas generalmente asociados con una enfermedad particular. Por ejemplo, los síntomas normalmente asociados con la enfermedad de Crohn incluyen: dolor abdominal, diarrea, hemorragia rectal, pérdida de peso, fiebre, pérdida del apetito, deshidratación, anemia, distensión, fibrosis, intestinos inflamados y desnutrición.

La frase "bajo condiciones tales que se reduzcan los síntomas" se refiere a cualquier grado de reducción cualitativa o cuantitativa en los síntomas detectables de una enfermedad sensible a anticuerpos o inmunoadhesinas, incluidos pero no limitados a, un impacto detectable en la tasa de recuperación de la enfermedad (por ejemplo tasa de ganancia de peso), o la reducción de al menos uno de los síntomas normalmente asociados con la enfermedad particular (por ejemplo, si la enfermedad sensible a anticuerpos o inmunoadhesinas fuera la enfermedad de Crohn, una reducción en al menos uno de los siguientes síntomas: dolor abdominal, diarrea, hemorragia rectal, pérdida de peso, fiebre, pérdida del apetito, deshidratación, anemia, distensión, fibrosis, intestinos inflamados y desnutrición).

Descripción de la invención

La presente invención proporciona variantes de polipéptidos de la región Fc y oligonucleótidos que codifican las variantes de la región Fc. Específicamente, la presente invención proporciona composiciones que comprenden variantes de la región Fc nuevas, procedimientos para identificar variantes de la región Fc útiles, y procedimientos para utilizar las variantes de la región Fc para tratar enfermedades. La descripción de la invención se proporciona a continuación en las siguientes secciones: I.) Regiones Fc del anticuerpo; II.) Regiones Fc variantes; III. ) Variantes de combinación; IV.) Ensayos de polipéptidos variantes; V.) Moléculas de ejemplo que contienen región Fc variante; VI.) Secuencias nucleicas que codifican variantes de la región Fc; VII.) Usos terapéuticos y formulaciones;
VIII.) Otros usos de las regiones Fc variantes.

I. Regiones Fc del anticuerpo

Según se describió anteriormente, los anticuerpos tienen regiones, principalmente las regiones CH2 y CH3, que están involucradas en funciones diferentes de la unión al antígeno. Juntas, estas regiones se conocen generalmente como la región Fc, y tienen varias funciones efectoras mediadas por la unión de moléculas efectoras.

Las funciones efectoras mediadas por la región Fc del anticuerpo pueden dividirse en dos categorías: (1) funciones efectoras que actúan tras la unión del anticuerpo a un antígeno (estas funciones implican, por ejemplo, la participación de la cascada del complemento o de células que llevan receptores de Fc (FcR)); y (2) funciones efectoras que actúan independientemente de la unión al antígeno (estas funciones confieren, por ejemplo, persistencia en el circulación y la capacidad de transferirse a través de barreras celulares por medio de transcitosis). Por ejemplo, la unión del componente C1 del complemento a los anticuerpos activa el sistema del complemento. Tras la opsonización, la activación del complemento es importante en la lisis de los patógenos celulares. La activación del complemento estimula también la respuesta inflamatoria y puede estar también involucrada en la hipersensibilidad autoinmune. Además, los anticuerpos se unen a las células a través de la región Fc, con un sitio de unión al receptor de Fc en la región Fc del anticuerpo que se une a un receptor de Fc (FcR) en una célula. Existe una serie de receptores de Fc que son específicos para diferentes clases de anticuerpo, incluidos IgG (receptores gamma), IgE (receptores eta), IgA (receptores alfa) e IgM (receptores mu). Aunque la presente invención no está limitada a ningún mecanismo particular, la unión del anticuerpo a los receptores de Fc en las superficies celulares provoca una serie de respuestas biológicas importantes y diversas que incluyen el engolfamiento y la destrucción de partículas recubiertas de anticuerpos, el aclaramiento de complejos inmunes, la lisis de células diana recubiertas de anticuerpos por medio de células asesinas (llamada citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos, o ADCC), la liberación de mediadores inflamatorios, la transferencia placentaria y el control de la producción de inmunoglobulinas.

Varias funciones efectoras de los anticuerpos están mediadas por receptores de Fc (FcRs), que se unen a la región Fc de un anticuerpo. Los FcRs se definen por su especificidad por isotipos de inmunoglobulinas; los receptores de Fc para anticuerpos IgG se denominan Fc\gammaR, para IgE se denominan Fc\varepsilonR, para IgA se denominan Fc\alphaR y así sucesivamente. Se han identificado tres subclases de Fc\gammaR: Fc\gammaRI (CD64), Fc\gammaRII (CD32) y Fc\gammaRIII (CD16).

Como cada subclase de Fc\gammaR está codificada por dos o tres genes, y el empalme alternativo de ARN da lugar a múltiples transcriptos, existe una amplia diversidad en las isoformas de Fc\gammaR. Los tres genes que codifican la subclase Fc\gammaRI (Fc\gammaRIA, Fc\gammaRIB y Fc\gammaRIC) están agrupados en la región 1q21.1 del brazo largo del cromosoma 1; los genes que codifican las isoformas de Fc\gammaRII (Fc\gammaRIIA, Fc\gammaRIIB y Fc\gammaRIIC) y los dos genes que codifican Fc\gammaRIII (Fc\gammaRIIIA y Fc\gammaRIIIB) están todos agrupados en la región 1q22. Estos subtipos de FcR diferentes se expresan en diferentes tipos celulares (véase, por ejemplo, Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-492 (1991)). Por ejemplo, en los seres humanos, Fc\gammaRIIIB se encuentra solamente en los neutrófilos, mientras que Fc\gammaRIIIA se encuentra en los macrófagos, monocitos, células asesinas naturales (NK), y en una subpoblación de células T. Particularmente, Fc\gammaRIIIA está presente en las células NK, uno de los tipos de células implicados en la ADCC.

El receptor de Fc\gammaRIIIA (CD16) humano tiene un polimorfismo común en la posición 158 en su dominio extracelular que codifica una fenilalanina o una valina en esta posición. El alelo de V de Fc\gammaRIIIA tiene mayor afinidad para la IgG1 humana que el alelo F. El alelo V158 también media de manera más eficaz la ADCC. Los datos clínicos han mostrado una correlación entre el genotipo del receptor de Fc\gammaRIIIA en pacientes sometidos a tratamiento con Rituxan y la respuesta terapéutica. Se ha mostrado que tanto la respuesta clínica y molecular como el tiempo hasta la progresión es superior en los pacientes homocigotas para el genotipo Fc\gammaRIIIA-158V (aproximadamente el 20% de la población). En cambio, los pacientes heterocigotas u homocigotas para el genotipo Fc\gammaRIIIA-158F de menor afinidad (aproximadamente el 80% de la población) responden de manera más pobre. Estos datos sugieren que las mutaciones de Fc que aumentan la actividad ADCC de los portadores de 158F podría aumentar la eficacia clínica de la terapia para el cáncer basada en anticuerpos. También está presente un polimorfismo genético en el receptor de Fc\gammaRIIA (CD32) humano en la posición 131 en su dominio extracelular que codifica una histidina (H) o una arginina (R) en esta posición. Se ha encontrado que el polimorfismo en la posición 131 afecta su capacidad para unirse a la IgG humana. Datos recientes también muestran una correlación entre el polimorfismo en la posición 131 de Fc\gammaRIIA y la respuesta clínica al Rituxan. Los pacientes homocigotas para el alelo de H131 tienen una tasa de respuesta significativamente más alta que los otros 2 grupos.

Fc\gammaRI, de Fc\gammaRII y de Fc\gammaRIII son receptores de la superfamilia de inmunoglobulinas (IgSF); Fc\gammaRI tiene tres dominios de IgSF en su dominio extracelular, mientras que Fc\gammaRII y Fc\gammaRIII tienen solo dos dominios de IgSF en sus dominios extracelulares.

Otro tipo de receptor de Fc es el receptor neonatal de Fc (FcRn). El FcRn es estructuralmente similar al complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) y está constituido por una cadena \alpha unida de manera no covalente a la microglobulina \beta2.

II. Regiones Fc variantes

La presente invención proporciona variantes de polipéptidos, secuencias de ácidos nucleicos que codifican variantes de polipéptidos y procedimientos para generar variantes de polipéptidos. De preferencia, las variantes de polipéptidos de la presente invención difieren de un polipéptido original en al menos una modificación de aminoácido. El polipéptido "original", "de tipo natural", "de partida" o "no variante" comprende de preferencia al menos una porción de una región Fc del anticuerpo, y puede prepararse usando técnicas disponibles en la técnica para generar polipéptidos que comprenden una región Fc o una de sus porciones. En formas de realización de preferencia, el polipéptido original es un anticuerpo. El polipéptido original puede, sin embargo, ser cualquier otro polipéptido que comprende al menos una porción de una región Fc (por ejemplo una inmunoadhesina). En ciertas formas de realización, una región Fc variante puede generarse (por ejemplo según los procedimientos divulgados en el presente documento) y puede fusionarse a un polipéptido heterólogo de elección, tal como un dominio variable del anticuerpo o un dominio de unión de un receptor o ligando.

En formas de realización de preferencia, el polipéptido original comprende una región Fc o una de sus porciones funcionales. En general, la región Fc del polipéptido original comprenderá una región Fc de la secuencia nativa, y de preferencia una región Fc de la secuencia nativa humana. Sin embargo, la región Fc del polipéptido original puede tener una o más alteraciones o modificaciones de la secuencia de aminoácidos preexistentes de una región Fc de la secuencia nativa. Por ejemplo, la actividad de unión de C1q de la región Fc pudo haberse alterado previamente o la afinidad de unión de Fc\gammaR de la región Fc pudo haberse alterado. En otras formas de realización, la región Fc del polipéptido original es conceptual (por ejemplo representación mental o una representación visual en un ordenador o en el papel) y, aunque no existe físicamente, el ingeniero de anticuerpos puede decidir sobre una secuencia de aminoácidos de la región Fc variante deseada y puede generar un polipéptido que comprende esa secuencia o una ADN que codifica la secuencia de aminoácidos de la región Fc variante deseada. Sin embargo, en formas de realización de preferencia, está disponible un ácido nucleico que codifica una región Fc de un polipéptido original y esta secuencia de ácido nucleico se altera para generar una secuencia de ácido nucleico variante que codifica la región Fc variante.

El ácido nucleico que codifica una variante del polipéptido original puede prepararse por medio de procedimientos conocidos en la técnica usando las pautas de la presente memoria descriptiva para las secuencias particulares. Estos procedimientos incluyen, pero no se limitan a, la preparación por mutagénesis dirigida al sitio (o mediada por oligonucleótidos), la mutagénesis por PCR, y la mutagénesis de casetes de un ácido nucleico que codifica el polipéptido preparado previamente. La mutagénesis dirigida al sitio es un procedimiento de preferencia para preparar variantes. Esta técnica es bien conocida en la técnica (véase, por ejemplo, Carter y col. Nucleic. Acids Res. 13: 4431-4443 (1985) y Kunkel y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488 (1987). Brevemente, al llevar a cabo la mutagénesis del ADN dirigida al sitio, se altera el ADN de partida hibridando en primer lugar simultáneamente uno o múltiples oligonucleótidos que codifican la(s) mutación(ones) deseada(s) con una única hebra de tal ADN de partida. Tras la hibridación, se usa una ADN polimerasa para sintetizar una segunda hebra completa, usando el(los) oligonucleótido(s) hibridado(s)
como un cebador, y usando la hebra única del ADN de partida como un molde y se usa una ADN ligasa para ligar la segunda hebra para formar un ADN circular, de doble hebra. Por consiguiente, el oligonucleótido que codifica la mutación deseada se incorpora en el ADN de doble hebra resultante.

La mutagénesis por PCR es también adecuada producir secuencias de aminoácidos variantes del polipéptido de partida (véase, por ejemplo, Vallette y col., Nuc. Acids Res. 17: 723-733 (1989)). Brevemente, cuando se usan pequeñas cantidades de ADN molde como material de partida en una PCR, pueden usarse cebadores que difieren ligeramente en la secuencia de la región correspondiente en un ADN molde para generar cantidades relativamente grandes de un fragmento de ADN específico que difiere de la secuencia del molde sólo en las posiciones donde los cebadores difieren del molde.

Otro procedimiento para preparar variantes, la mutagénesis de casetes, se basa en la técnica descrita de Wells y col., Gene 34: 315-323 (1985). El material de partida es el plásmido (u otro vector) que comprende el ADN del polipéptido de partida a mutar. Se identifica(n) el(los) codón(es) en el ADN de partida a mutar. Debe haber un único sitio de endonucleasa de restricción en cada lado del(los) sitio(s) de mutación(es) identificado(s). Si no existen tales sitios de restricción, pueden generarse usando el procedimiento de mutagénesis mediado por oligonucleótidos descrito anteriormente para introducirlos en localizaciones adecuadas en el ADN del polipéptido de partida. Se corta el ADN del plásmido en estos sitios para linealizarlos. Se sintetiza un oligonucleótido de doble hebra que codifica la secuencia del ADN entre los sitios de restricción pero que contiene la(s) mutación(es) deseada(s) usando procedimientos convencionales, en el que las dos hebras del oligonucleótido se sintetizan por separado y a continuación se hibridan juntas usando técnicas convencionales. Este oligonucleótido de doble hebra se denomina la casete. Esta casete se diseña para que tenga extremos 5' y 3' que sean compatibles con los extremos del plásmido linealizado, de manera que pueda ligarse directamente al plásmido. Este plásmido contiene ahora la secuencia de ADN mutada.

Como alternativa, o además, puede determinarse la secuencia de aminoácido deseada que codifica una variante de polipéptido, y puede generarse sintéticamente una secuencia de ácido nucleico que codifica tal secuencia de aminoácidos de la variante.

La secuencia de aminoácidos del polipéptido original puede modificarse para generar una región Fc variante con afinidad o actividad de unión al receptor de Fc alteradas in vitro y/o in vivo y/o actividad de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) alterada in vitro y/o in vivo. La secuencia de aminoácidos del polipéptido original puede también modificarse para generar una región Fc variante con propiedades de unión al complemento y/o semivida de circulación alteradas.

Pueden llevarse a cabo modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas de la región Fc seleccionando sustituciones que difieren significativamente en su efecto alterando (a) la estructura de la cadena principal del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación de lámina o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o la carga de la cadena lateral, (d) la interacción con carbohidratos, o (e) la flexibilidad del movimiento del dominio. Los residuos que se presentan en la naturaleza se dividen en clases basándose en propiedades comunes de la cadena lateral:

(1) hidrófobos: norleucina, met, ala, val, leu, ile;

(2) hidrófilos neutros: cys, ser, thr;

(3) ácidos: ASP, glu;

(4) básicos: asn, gln, his, lys, arg;

(5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: gly, pro; y

(6) aromáticos: trp, tyr, phe.

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Las sustituciones no conservadoras supondrán el intercambio de un miembro de una de estas clases por un miembro de otra clase. Las sustituciones conservadoras supondrán el intercambio de un miembro de una de estas clases por otro miembro de la misma clase.

Como se demuestra en los Ejemplos a continuación, uno puede construir una variante de región Fc con actividad alterada (función(es) efectora(s) y farmacocinética). Uno puede, por ejemplo, modificar uno o más residuos de aminoácidos de la región Fc para alterar (por ejemplo aumentar o disminuir) la actividad de ADCC. En formas de realización de preferencia, una modificación comprende uno o más de los residuos de la región Fc identificados en el presente documento (véase, por ejemplo, Ejemplo 2, y el Documento WO0042072). En general, uno puede realizar una sustitución de aminoácidos en uno o más de los residuos de la región Fc identificados en el presente documento como que tienen efecto sobre la actividad de ADCC para generar tal variante de la región Fc. En formas de realización de preferencia, no se delecionarán o sustituirán más de uno hasta aproximadamente diez residuos de la región Fc. Las regiones Fc que en el presente documento comprenden una o más modificaciones de aminoácidos (por ejemplo sustituciones) conservarán de preferencia al menos aproximadamente 80%, y de preferencia al menos aproximadamente 90%, y de más preferencia al menos aproximadamente 95%, de la secuencia de la región Fc original o de una región Fc humana de secuencia nativa.

Uno puede también realizar variantes de la región Fc por inserción de aminoácidos, cuyas variantes tienen función efectora alterada. Por ejemplo, uno puede introducir al menos un residuo de aminoácido (por ejemplo uno a dos residuos de aminoácidos y generalmente no más de diez residuos) adyacente a una o más posiciones de la región Fc identificadas en el presente documento como que impactan en la unión de FcR. Por "adyacente" se entiende entre uno a dos residuos de aminoácidos de un residuo de la región Fc identificados en el presente documento. Tales variantes de la región Fc pueden exhibir actividad de unión a FcR y/o ADCC aumentada o disminuida con relación a la molécula original. Para generar tales variantes de inserción, uno puede evaluar una estructura cocristalina de un polipéptido que comprende una región de unión de un FcR (por ejemplo el dominio extracelular del FcR de interés) y la región Fc en la que se insertarán el(los) residuos de aminoácido(s) (véase, por ejemplo, Sondermann y col. Nature 406: 267 (2000); Deisenhofer, Biochemistry 20 (9): 2361-2370 (1981); y Burmeister y col., Nature 342: 379-383, (1994), para diseñar de manera racional una variante de la región Fc con, por ejemplo, capacidad de unión a FcR aumentada. En formas de realización de preferencia, tal(es) inserción(es) se realizan en un bucle de la región Fc, pero no en la estructura secundaria (es decir en una hebra \beta) de la región Fc.

Introduciendo las modificaciones adecuadas en la secuencia de aminoácidos en una región Fc original, uno puede generar una región Fc variante que (a) media la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) en presencia de células efectoras humanas más o menos eficazmente y/o (b) media la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) en presencia de complemento humano más o menos eficazmente y/o (c) se une a un receptor de Fc gamma (Fc\gammaR) o a un receptor neonatal de Fc (FcRn) con la afinidad deseada a diferentes valores de pH que el polipéptido original. Tales variantes de la región Fc comprenderán generalmente al menos una modificación de aminoácido en la región Fc.

En formas de realización de preferencia, la región Fc del polipéptido original es una región Fc humana, por ejemplo una región Fc nativa humana de IgG1 (alotipos f y a,z), IgG2, IgG3, IgG4 humanas, y todos los alotipos conocidos o descubiertos de cualquier especie. Tales regiones tienen secuencias tales como las que se muestran en la Figura 2 (SEC ID Nº: 1-8), Figura 3 (SEC ID Nº: 9-12), y Figura 5 (SEC ID Nº: 32-37).

En ciertas formas de realización, para generar una región Fc con mejor actividad de ADCC, el polipéptido original tiene de preferencia actividad de ADCC preexistente (por ejemplo, el polipéptido original comprende una región Fc de IgG1 humana o de IgG3 humana). En algunas formas de realización, una variante con mejor ADCC media la ADCC substancialmente de manera más eficaz que un anticuerpo con una secuencia nativa de la región Fc de IgG1 o de IgG3 (por ejemplo P247L).

En formas de realización de preferencia, se introduce(n) modificación(es) de aminoácido(s) en los dominios CH2 y/o CH3 de una región Fc. Las posiciones de aminoácido útiles a modificar para generar una región Fc variante de IgG con actividad de ADCC alterada incluyen cualquiera o más de una de las posiciones de aminoácidos: 247, 251, 256, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 300, 301, 303, 305, 307, 309, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 360, 373, 376, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438, 439, ó 440 de la región Fc. En formas de realización de preferencia, la región Fc original usada como el molde para generar tales variantes comprende una región Fc de IgG humana.

En ciertas formas de realización, las composiciones de la presente invención proporcionan composiciones que comprenden una variante de un polipéptido original que tiene una región Fc, en las que la variante media la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) en presencia de células efectoras, y comprenden al menos una modificación de aminoácido en la posición 247 en la región Fc. En ciertas formas de realización, la modificación del aminoácido es P247L. En otras formas de realización, la modificación del aminoácido es P247I o P247H.

Las variantes de polipéptidos descritas anteriormente pueden someterse a otras modificaciones, dependiendo del uso deseado o previsto del polipéptido. Tales modificaciones pueden incluir, por ejemplo, otra alteración de la secuencia de aminoácidos (sustitución, inserción y/o deleción de residuos de aminoácidos), modificaciones de carbohidratos, fusión a polipéptido(s) heterólogo(s) y/o modificaciones covalentes. Tales otras modificaciones pueden realizarse previo a, simultáneamente con, o tras la(s) modificación(es) de aminoácidos descritas anteriormente que dan como resultado una alteración de la unión al receptor de Fc y/o de la actividad de ADCC.

Como alternativa o además, puede ser útil combinar modificaciones de aminoácidos con una o más de otras modificaciones de aminoácidos que alteran la unión a C1q y/o la función de citotoxicidad dependiente del complemento de la función Fc. El polipéptido de partida de particular interés en el presente documento es uno que se une a C1q y que exhibe citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Las sustituciones de aminoácidos descritas en el presente documento pueden servir para alterar la capacidad del polipéptido de partida para unirse a C1q y/o para modificar su función de citotoxicidad dependiente del complemento (por ejemplo, para reducir y, de preferencia anular estas funciones efectoras). Sin embargo, los polipéptidos que comprenden sustituciones en una o más de las posiciones descritas con mejor unión a C1q y/o mejor función de citotoxicidad dependiente del complemento CDC están contemplados en el presente documento. Por ejemplo, el polipéptido de partida puede ser incapaz de unirse a C1q y/o mediar la CDC y puede modificarse según las enseñanzas del presente documento de manera tal que adquiera estas otras funciones efectoras. Además, los polipéptidos con actividad de unión a C1q preexistente, que opcionalmente tienen también la capacidad de mediar la CDC pueden modificarse de manera tal que se mejore una o ambas de estas actividades. Las modificaciones de aminoácidos que alteran C1q y/o modifican su función de citotoxicidad dependiente del complemento se describen, por ejemplo, en el Documento WO0042072.

Como se ha dado a conocer anteriormente, uno puede diseñar una región Fc o una de sus porciones con función efectora alterada, por ejemplo, modificando la actividad de CDC y/o la actividad de ADCC. Por ejemplo, uno puede generar una región Fc variante con mejor actividad de CDC y mejor actividad de ADCC (por ejemplo, teniendo mejoradas tanto la actividad de ADCC como la actividad de CDC). Como alternativa, donde uno desea que la función efectora se reduzca o anule, uno puede generar una región Fc variante con actividad de CDC reducida y/o actividad de ADCC reducida. En otras formas de realización, uno puede aumentar una sola de estas actividades, y opcionalmente también reducir la otra actividad, por ejemplo, generar una variante de la región Fc con mejor actividad de ADCC, pero actividad de CDC reducida y viceversa. Además, uno puede generar una región Fc variante con afinidad de unión a FcRn, proteína A, y/u otras proteínas de unión de Fc modificadas.

Otro tipo de sustitución de aminoácidos sirve para alterar el patrón de glicosilación del polipéptido. Esto puede llevarse a cabo, por ejemplo, delecionando uno o más restos de carbohidratos que se encuentran en el polipéptido, y/o adicionando uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el polipéptido. Como alternativa, esto puede llevarse a cabo de manera indirecta alterando aminoácidos diferentes de los del sitio de glicosilación o por medio de ingeniería sobre las células. La glicosilación de los polipéptidos está típicamente ligada a N o ligada a O. Ligada a N se refiere a la unión del resto carbohidrato a la cadena lateral de un residuo asparagina. Las secuencias de péptidos asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del resto carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. Por consiguiente, la presencia de cualquiera de estas secuencias de péptidos en un polipéptido crea un potencial sitio de glicosilación. La glicosilación ligada a O se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxi aminoácido, más comúnmente serina o treonina, aunque también pueden usarse 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.

La adición de sitios de glicosilación al polipéptido se lleva a cabo de manera conveniente alterando la secuencia de aminoácidos de manera tal que contenga una o más de las secuencias de tripéptidos descritas anteriormente (para los sitios de glicosilación ligados a N). La alteración puede realizarse también por medio de la adición de, o sustitución por, uno o más residuos serina o treonina a la secuencia del polipéptido original (para los sitios de glicosilación ligados a O). Una variante de glicosilación de ejemplo tiene una sustitución de aminoácidos del residuo Asn 297 de la cadena pesada.

En algunas formas de realización, la presente invención proporciona composiciones que comprenden una variante de un polipéptido original que tiene una región Fc, en las que la variante comprende al menos una modificación de aminoácidos de residuos de superficie (Véase, por ejemplo, Deisenhofer, Biochemistry, 28; 20(9): 2361-2370, abril de 1981, y el Documento WO0042072). En algunas formas de realización, la presente invención proporciona composiciones que comprenden una variante de un polipéptido original que tiene una región Fc, en las que la variante comprende al menos una modificación de aminoácidos de residuos no superficiales. En otras formas de realización, la presente invención comprende una variante de un polipéptido original que tiene una región Fc, en las que la variante comprende al menos una modificación de aminoácidos superficiales y al menos una modificación de aminoácidos no superficiales.

III. Variantes de combinación

En algunas formas de realización, las variantes del presente documento comprenden dos o más modificaciones de aminoácidos (por ejemplo sustituciones). Tales variantes de combinación pueden producirse, por ejemplo, seleccionando dos o más de las modificaciones de aminoácidos detalladas anteriormente. La Tabla 1 a continuación proporciona combinaciones de ejemplo de dos o más sustituciones de aminoácidos. Por ejemplo, la primera fila de la Tabla 1 muestra combinaciones posibles de P247H con las otras sustituciones de aminoácidos en las posiciones 251, 256, 268, 280.330, 332, 339, 378 y 440 (por ejemplo esta fila muestra combinaciones de dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, y diez modificaciones de aminoácidos).

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1

1

Las variantes de la combinación mostradas en la Tabla 1 y otras variantes de combinación (tales como las divulgadas en el documento WO0042072) pueden probarse para una actividad dada (por ejemplo actividad de unión a FcR, actividad de ADCC, y actividad de CDC) en una diversidad de ensayos (Véase, sección IV, a continuación). Con respecto a esto, pueden identificarse variantes de combinación útiles.

En ciertas formas de realización de preferencia, las variantes de combinación de la presente invención tienen una modificación de aminoácidos que aumenta la actividad de ADCC, y una modificación de aminoácidos que aumenta la afinidad de unión al receptor neonatal de Fc (FcRn) (por ejemplo, a pH 6,0, pero no a pH 7,0 ó 7,4). En otras formas de realización, las variantes de la combinación de la presente invención tienen una modificación de aminoácidos de superficie, y una modificación de aminoácidos no superficiales. Pueden generarse otras variantes de combinación combinando dos o más de las modificaciones de aminoácidos descritas en el presente documento, o al menos una de las modificaciones de aminoácidos descritas en el presente documento con las descritas en el Documento WO0042072.

IV. Ensayos de polipéptidos variantes

La presente invención proporciona diversos ensayos para seleccionar variantes de la región Fc. Los ensayos de selección pueden usarse para hallar o confirmar variantes útiles. Por ejemplo, pueden seleccionarse variantes de combinación (Véase Tabla 1) para hallar variantes con unión a FcR alterada, y/o actividad de ADCC alterada y/o actividad de CDC alterada (por ejemplo actividad de ADCC o de CDC aumentada o disminuida) y/o capacidad modificada para deplecionar células diana (células B, por ej.) de la sangre entera. También, como se describe a continuación, los ensayos de la presente invención pueden utilizarse para hallar o confirmar variantes que tienen actividad terapéutica beneficiosa en un sujeto (por ejemplo tal como un ser humano con síntomas de una enfermedad sensible a anticuerpos o inmunoadhesinas). Puede utilizarse una diversidad de tipos de ensayo para evaluar cualquier cambio en una variante comparada con el polipéptido original (Véase, ensayos de selección proporcionados en el Documento WO0042072). A continuación se describen otros ensayos de ejemplo.

En formas de realización de preferencia, las variantes de la presente invención son anticuerpos que conservan esencialmente la capacidad de unirse a un antígeno (a través de una región de unión al antígeno no modificada o de una región de unión al antígeno modificada) comparado con el polipéptido no variante (original) (por ejemplo la capacidad de unión no es de preferencia peor que aproximadamente 20 veces o no es peor que aproximadamente 5 veces que la del polipéptido no variante). La capacidad de unión de la variante del polipéptido al antígeno puede determinarse usando técnicas tales como ELISA, análisis de separación de células activadas por fluorescencia (FACS) o radioinmunoprecipitación (RIA), por ejemplo.

Los ensayos de unión de receptores de Fc (FcR) pueden utilizarse para evaluar las variantes de la presente invención. Por ejemplo, puede medirse la unión de los receptores de Fc tales como Fc\gammaRI, Fc\gammaRIIa, Fc\gammaRIIb, Fc\gammaRIII, FcRn, etc., valorando la variante del polipéptido y midiendo la variante del polipéptido unida usando un anticuerpo que se une específicamente a la variante del polipéptido en un formato de ELISA (véase Ejemplos a continuación). Por ejemplo, puede seleccionarse una variante que comprende un anticuerpo en un ensayo ELISA convencional para determinar la unión a un FcRn a pH 6,0 y a pH 7,0 ó 7,4. Puede usarse una superficie sólida recubierta con estreptavidina o Neutravidina para capturar FcRn marcados con biotina de cualquier especie, tal como ratón o ser humano. Tras bloquear, el receptor de captura puede incubarse con polipéptidos variantes (anticuerpos) diluidos en tampones a pH 6,0 ó pH 7,0. En la siguiente etapa, se añade una molécula específica para anticuerpos humanos (por ejemplo (Fab')2 anti-Fab humana de cabra conjugado a una enzima). A continuación puede añadirse un substrato para determinar la cantidad de unión del polipéptido variante al FcRn inmovilizado a pH 6,0 ó pH 7,0 ó 7,4. Los resultados de este ensayo pueden compararse con la capacidad del polipéptido original (no variante) para unirse al mismo FcR. En otras formas de realización de preferencia, los componentes para llevar a cabo un ELISA (por ejemplo con FcRn) para seleccionar variantes están empaquetados en un kit (por ejemplo con instrucciones de uso).

Puede usarse también un ensayo de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) para seleccionar las variantes de la presente invención. Los ensayos de ADCC pueden realizarse in vitro o in vivo. Para evaluar la actividad de ADCC de una variante de polipéptido puede realizarse un ensayo de ADCC in vitro usando proporciones variables de efector:diana. Un ensayo de ADCC de ejemplo podría usar una línea celular diana que expresa cualquiera de los siguientes antígenos diana: CD20, CD22, CD33, CD40, CD63, receptor de EGF, receptor de her-2, antígeno de membrana específico de la próstata, carbohidrato Y de Lewis, gangliósidos GD_{2} y GD_{3}, lamp-1, CO-029, L6, y ephA2. Las células efectoras pueden obtenerse de un donador sano (por ejemplo en el día del experimento) y de PBMC purificadas usando Histopaque (Sigma). A continuación se preincuban las células diana con una variante de IgG a concentraciones de, por ejemplo, 0,1-1.000 ng/ml durante aproximadamente 30 minutos antes de mezclar con las células efectoras en proporciones de efector: diana de, por ejemplo, 40:1, 20:1 y 10:1. A continuación puede medirse la actividad de ADCC colorimétricamente usando un Kit de Detección de Citotoxicidad (Roche Molecular Biochemicals) para cuantificar la muerte celular y la lisis basándose en la medición de la actividad de la lactato deshidrogenasa (LDH) liberada del citosol de las células dañadas en el sobrenadante. La actividad de ADCC puede medirse también, para ensayos de células diana cargadas con Cromo 51, midiendo el Cromo 51 liberado resultante. La citotoxicidad celular independiente de anticuerpos puede determinarse midiendo la actividad de LDH de células diana y efectoras en ausencia del anticuerpo. La liberación total puede medirse después de la adición de Tritón X-100 al 1% a la mezcla de células diana y efectoras. La incubación de las células diana y efectoras puede llevarse a cabo durante un período de tiempo optimizado (0,54-18 horas) a 37ºC en CO_{2} al 5,0% y a continuación seguido por centrifugación de las placas de ensayo. Los sobrenadantes pueden posteriormente transferirse a 96 placas de pocillos e incubarse con reactivo de detección de LDH durante 30 minutos a 25ºC. A continuación puede medirse la absorbancia de la muestra a 490 nm usando un lector de microplacas. Posteriormente puede calcularse el porcentaje de citotoxicidad usando la siguiente ecuación: citotoxicidad % = valor experimental-control bajo/control alto-control bajo X 100%. El porcentaje de citotoxicidad de anti CD20 y de las variantes puede a continuación compararse directamente con la cantidad igual de RITUXAN para proporcionar una medición de eficacia relativa. Un ensayo de ADCC de ejemplo podría usar células SKW6.4 que sobreexpresan el antígeno CD20 (por ejemplo adquiridas de la American Type Culture Collection) como la fuente de células diana. En la técnica se conocen muchas variaciones de este ensayo (Véase, por ejemplo, Zuckerman y col., CRC Crit Rev Microbiol 1978; 7(1):1-26).

Las células efectoras útiles para tales ensayos incluyen, pero no se limitan a, linfocitos citolíticos naturales (NK), macrófagos, y otras células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Como alternativa, o además, la actividad de ADCC de las variantes de polipéptidos de la presente invención puede evaluarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el divulgado en Clynes y col. PNAS (USA) 95: 652-656 (1998).

Las variantes de la presente invención pueden también seleccionarse para activación del complemento. Para evaluar la activación del complemento, puede llevarse a cabo un ensayo de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) (Véase, por ejemplo Gazzano-Santoro y col., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996)). Por ejemplo, pueden diluirse diversas concentraciones de la variante y de polipéptido en complemento humano con tampón. Las células que expresan el antígeno a que se une la variante del polipéptido pueden diluirse hasta una densidad de aproximadamente 1 x 10^{6} células/ml. Las mezclas de la variante de polipéptido, complemento humano diluido y células que expresan el antígeno pueden añadirse a placas de 96 pocillos de cultivo tisular de base plana y pueden dejarse incubar durante 2 horas a 37ºC y CO_{2} al 5% para facilitar la lisis de las células mediada por el complemento. A continuación pueden añadirse 50 \mul de azul Alamar (Accumed Internacional) a cada pocillo e incubarse durante la noche a 37ºC. La absorbancia puede medirse usando un fluorímetro de 96 pocillos con excitación en 530 nm y emisión a 590 nm. Los resultados pueden expresarse en unidades de fluorescencia relativa (RFU). Las concentraciones de las muestras pueden calcularse a partir de una curva patrón y la actividad por ciento, comparada con el polipéptido no variante, puede informarse para el polipéptido variante de interés.

En ciertas formas de realización, las variantes de la presente invención no activan el complemento. Por ejemplo, una variante de polipéptido exhibe aproximadamente 0-10% de actividad de CDC en este ensayo comparado con un anticuerpo de control que tiene una región Fc de IgGI no mutada. De preferencia la variante no parece tener ninguna actividad de CDC (por ejemplo por encima del fondo) en el ensayo de CDC anterior. En otras formas de realización, se encuentra que las variantes de la presente invención tienen CDC aumentada comparada con un polipéptido original (por ejemplo, exhibiendo aproximadamente dos veces hasta aproximadamente cien veces (o mayor) mejora en la actividad de CDC in vitro o in vivo cuando se comparan los valores de CI50).

Las variantes de la presente invención pueden también seleccionarse para depleción de células diana en un ensayo de sangre entera. Por ejemplo, pueden seleccionarse diversas concentraciones de la variante de polipéptido con especificidad de diana CD20 para la depleción de células B en un ensayo de sangre entera usando facs (Vugmeyster y col., 2003 Cytometry 52A, 101-109). Se incuba sangre recién extraída con concentraciones variables de la variante de polipéptido a 37ºC y CO_{2} al 5% durante 4 horas (el tiempo puede variarse). Tras la incubación, los glóbulos rojos se lisan por indicaciones del fabricante con un reactivo de cloruro de amonio (Beckton-Dickinson Nº de catálogo 555899) y se detectan por facs usando un anticuerpo marcado fluorescente específico para las células B (anti-CD 19, por ejemplo). Los resultados pueden expresarse como % de depleción de las células B con relación a una muestra no tratada o a una muestra incubada con un anticuerpo irrelevante (que no produce depleción).

En formas de realización de preferencia, la variante depleciona las células B con más eficacia que el polipéptido original. Una variante puede deplecionar las células B, por ejemplo, hasta aproximadamente dos veces o más, y de preferencia alrededor de cinco veces o más. También, una variante puede exhibir mayor potencia para deplecionar las células B. Por ejemplo, una variante puede deplecionar el mismo porcentaje de células B con relación al polipéptido original, pero utilizar cinco veces menos, y de preferencia aproximadamente 10 veces menos anticuerpo. La depleción de células diana mediada por variantes puede ser aproximadamente 5 veces hasta aproximadamente 100 veces, y de preferencia desde aproximadamente 5 veces hasta a aproximadamente 1000 veces mejor comparada con el polipéptido original.

Las variantes de la presente invención pueden seleccionarse también in vivo. Puede utilizarse cualquier tipo de ensayo in vivo. Un ejemplo particular de un tipo de ensayo se proporciona a continuación. Este ensayo de ejemplo permite la evaluación preclínica de las variantes de Fc in vivo. Una variante a probar puede incorporarse en la región Fc de un anticuerpo particular que se sabe que tiene alguna actividad. Por ejemplo, puede incorporarse una variante en la región Fc de una IgG anti-CD20 por medio de mutagénesis. Esto permite comparar una IgG original y una IgG variante de Fc directamente con RITUXAN (que se sabe que promueve la regresión tumoral). La evaluación preclínica puede realizarse en 2 fases (una fase farmacocinética y una farmacodinámica). El objetivo de los estudios farmacocinéticos de Fase I es determinar si hay diferencias en la tasa de aclaramiento entre una IgG variante de Fc y el anticuerpo con actividad conocida in vivo (por ejemplo RITUXAN). Las diferencias en la tasa de aclaramiento pueden provocar diferencias en el nivel de estado estacionario de IgG en el suero. Como tales, si se detectan diferencias en las concentraciones del estado estacionario, éstas deben normalizarse para permitir la realización de comparaciones precisas. El objetivo de los estudios farmacodinámicos de Fase II es determinar el efecto de la mutación de Fc sobre, en este caso, el crecimiento tumoral. Estudios previos con RITUXAN usaron una única dosis que inhibió completamente el crecimiento tumoral. Como esto no permite medir diferencias cuantitativas, debe utilizarse un intervalo de dosis.

La comparación farmacocinética de Fase I de una variante de Fc, la Fc original de tipo natural, y RITUXAN puede realizarse de la siguiente manera. Primero, pueden inyectarse 40 \mug por animal por vía intravenosa y cuantificarse los niveles plasmáticos de IgG a las 0, 25, 5, 1, 24, 48, 72, 96, 120, 168 y 336 horas. Los datos pueden ajustarse, por ejemplo, usando un programa de farmacocinética (WinNonLin) que usa un modelo farmacocinético bicompartimental de orden cero para obtener la tasa de aclaramiento. Puede usarse la tasa de aclaramiento para definir el nivel plasmático del estado estacionario con la siguiente ecuación: C = Dosis/(tasa de aclaramiento X \tau), donde \tau es el intervalo entre dosis y C es el nivel plasmático en el estado estacionario. Los experimentos de farmacocinéticos pueden realizarse en ratones que no tienen tumores con, por ejemplo, un mínimo de 5 ratones por punto temporal.

Puede utilizarse un modelo animal para la siguiente fase de la siguiente manera.

Pueden implantarse 10^{6} células Raji por vía subcutánea en el flanco derecho de ratones CB17-SCID. Puede comenzarse el bolo intravenoso de la variante de Fc, la Fc del tipo natural, y RITUXAN inmediatamente después de la implantación y continuarse hasta que el tamaño del tumor sea superior a 2 cm de diámetro. El volumen del tumor puede determinarse cada lunes, miércoles y viernes midiendo la longitud, la anchura, y la profundidad del tumor usando un calibre (volumen del tumor = W x L x D). Una representación gráfica del volumen del tumor frente al tiempo dará la tasa de crecimiento del tumor para el cálculo farmacodinámico. Debe usarse un mínimo de aproximadamente 10 animales por grupo.

La comparación farmacodinámica de Fase II de la variante de Fc, la Fc del tipo natural, y RITUXAN puede realizarse de la siguiente manera. Basándose en datos publicados, RITUXAN en concentración de 10 \mug/g semanalmente inhibió completamente el crecimiento tumoral in vivo (Clynes y col., Nat. Med. abril de 2000; 6 (4): 443-446, 2000). Por consiguiente, puede probarse un intervalo de dosis semanal de 10 \mug/g, 5 \mug/g, 1 \mug/g, 0,5 \mug/g, y 0 \mug/g. El nivel plasmático del estado estacionario en el que la tasa de crecimiento tumoral se inhibe en un 50% puede determinarse gráficamente por la relación entre el nivel plasmático del estado estacionario y la eficacia. El nivel plasmático del estado estacionario puede calcularse como se describe anteriormente. De ser necesario, \tau puede ajustarse por consiguiente para cada variante de Fc y la Fc de tipo natural dependiendo de sus propiedades farmacocinéticas para alcanzar el nivel plasmático del estado estacionario comparable al RITUXAN. Los valores farmacodinámicos estadísticamente mejores de la variante de Fc en comparación con el polipéptido original (por ejemplo Fc de tipo natural) y RITUXAN indicarán por lo general que la variante de Fc confiere mejor actividad in vivo.

Pueden realizarse otras comparaciones farmacodinámicas de las variantes de Fc, la Fc de tipo natural, y RITUXAN en monos cynomolgus como se describió previamente (Reff y col., Blood 83, 435-445, 1994). Puede usarse una respuesta a la dosis para la depleción de las células B periféricas y para las células B de nódulos linfáticos para comparar las potencias relativas de las variantes de Fc con Fc de tipo natural y Rituxan administrados por vía intravenosa y/o por vía subcutánea. Los valores farmacodinámicos estadísticamente mejores de la variante de Fc en comparación con el polipéptido original (por ejemplo Fc de tipo natural) y RITUXAN indicarán por lo general que la variante de Fc confiere mejor actividad in vivo.

En otras formas de realización, las variantes de la presente invención se seleccionan de manera tal que se identifiquen las variantes que son terapéuticamente útiles en al menos dos especies. Tales variantes se denominan en el presente documento "variantes mejoradas de especies dobles", y son particularmente útiles para identificar las variantes que son terapéuticas en seres humanos, y también demuestran (o tienen probabilidad de demostrar) eficacia en un modelo animal. Al respecto, la presente invención proporciona procedimientos para identificar variantes que tienen una gran probabilidad de ser aprobadas para pruebas clínicas en seres humanos ya que los datos en modelos animales respaldarán probablemente cualquier aplicación de prueba en seres humanos realizada para agencias reguladoras gubernamentales (por ejemplo Food and Drug Administration de los EEUU).

En ciertas formas de realización, las variantes mejoradas de especies dobles se identifican realizando en primer lugar un ensayo de ADCC usando células efectoras humanas para hallar variantes mejoradas, y a continuación realizando un segundo ensayo de ADCC usando células efectoras de ratón, rata, o de un primate no humano para identificar una subserie de variantes mejoradas que son variantes mejoradas de especies dobles. En algunas formas de realización, la presente invención proporciona procedimientos para identificar variantes mejoradas de especies dobles, que comprenden; a) proporcionar; i) células diana, ii) una composición que comprende una variante candidata de un polipéptido original que tiene al menos una porción de una región Fc, en la que la variante candidata comprende al menos una modificación de aminoácidos en la región Fc, y en la que la variante candidata media la citotoxicidad de las células diana en presencia de las células efectoras de una primera especie (por ejemplo ser humano) de manera más eficaz que el polipéptido original, y iii) células efectoras de la segunda especie (por ejemplo ratón, rata, o primate no humano), y b) incubar la composición con las células diana bajo condiciones tales que la variante candidata se una a las células diana generando de esta manera células diana unidas a la variante candidata, c) mezclar las células efectoras de la segunda especie con las células diana unidas a la variante candidata, y d) medir la citotoxicidad de las células diana mediada por la variante candidata. En ciertas formas de realización, el procedimiento comprende además la etapa e) determinar si la variante candidata media la citotoxicidad de células diana en presencia de las células efectoras de la segunda especie de manera más eficaz que el polipéptido original. En algunas formas de realización, el procedimiento comprende además la etapa f) identificar una variante candidata como una variante mejorada de especies dobles que media la citotoxicidad de células diana en presencia de las células efectoras de la segunda especie de manera más eficaz que el polipéptido original. En formas de realización de preferencia, las variantes de especies dobles identificadas se seleccionan a continuación in vivo en uno o más ensayos de animales.

En ciertas formas de realización, las variantes mejoradas de especies dobles se identifican realizando primero un ensayo de sangre entera usando sangre humana para hallar variantes mejoradas, y a continuación realizando un segundo ensayo de sangre entera usando sangre de ratón, rata, o de primate no humano para identificar una subserie de variantes mejoradas que son variantes mejoradas de especies dobles. En algunas formas de realización, la presente invención proporciona procedimientos para identificar variantes mejoradas de especies dobles que comprenden; a) proporcionar; i) células diana, ii) una composición que comprende una variante candidata de un polipéptido original que tiene al menos una porción de una región Fc, en la que la variante candidata comprende al menos una modificación de aminoácidos en la región Fc, y en la que la variante candidata media la depleción de las células diana en presencia de la sangre de la primera especie (por ejemplo ser humano) de manera más eficaz que el polipéptido original, y iii) sangre de la segunda especie (por ejemplo ratón, rata, o primate no humano), y b) incubar la composición con las células diana bajo condiciones tales que la variante candidata se una a las células diana generando de esta manera células diana unidas a la variante candidata, c) mezclar la sangre de la segunda especie con las células diana unidas a la variante candidata, y d) medir la depleción de las células diana mediada por la variante candidata. En ciertas formas de realización, el procedimiento comprende además la etapa e) determinar si la variante candidata media la depleción de células diana en presencia de la sangre de la segunda especie de manera más eficaz que el polipéptido original. En algunas formas de realización, el procedimiento comprende además la etapa f) identificar una variante candidata como una variante mejorada de especies dobles que media la depleción de células diana en presencia de la sangre de la segunda especie de manera más eficaz que el polipéptido original. En formas de realización de preferencia, las variantes de especies dobles identificadas se seleccionan a continuación in vivo en uno o más ensayos de animales.

En ciertas formas de realización, las variantes mejoradas de especies dobles se identifican llevando a cabo cualquiera de los ensayos anteriores usando componentes humanos (por ejemplo células humanas, receptores de Fc humanos, etc.) para identificar variantes mejoradas, y a continuación realizando el mismo ensayo (o un ensayo diferente) con componentes de animales no humanos (por ejemplo células de ratón, receptores de Fc de ratón, etc.). Al respecto, puede identificarse una subserie de variantes que funcionan bien según un criterio dado tanto en ensayos basados en seres humanos como en ensayos basados en la segunda especie.

Un procedimiento de ejemplo para identificar variantes mejoradas de especies dobles es el siguiente. Primero, se muta una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos una porción de una región Fc de IgG tal que la secuencia de aminoácidos expresada tenga al menos un cambio de aminoácidos, generando de esta manera una variante. La variante de IgG expresada se caracteriza a continuación en un ensayo de ADCC usando PBMC humanas o una subserie (células NK o macrófagos, por ejemplo). Si se encuentra actividad de ADCC mejorada, entonces se selecciona la variante en un segundo ensayo de ADCC usando PBMC de ratón o de rata. Como alternativa, o además, puede realizarse un ensayo con la variante para la unión a líneas celulares o a receptores clonados de roedores. Finalmente, si se encuentra que la variante está mejorada en el segundo ensayo, convirtiéndola en una variante doble mejorada, entonces la variante se selecciona in vivo en ratones o ratas.

V. Moléculas que contienen regiones Fc variantes de ejemplo

Las regiones Fc variantes de la presente invención pueden ser parte de moléculas más grandes. Las moléculas más grandes pueden ser, por ejemplo, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos biespecíficos, inmunoadhesinas, etc. Como tales, resulta evidente que hay una gran variedad de aplicaciones para las regiones Fc variantes de la presente invención.

A. Anticuerpos que contienen regiones Fc variantes

En formas de realización de preferencia, la molécula que contiene regiones Fc variantes (por ejemplo polipéptido) es un anticuerpo. Las técnicas para producir anticuerpos se describen a continuación.

(i) Selección y preparación de antígenos

En general, cuando la molécula que contiene regiones Fc variantes es un anticuerpo, el anticuerpo, se dirige contra un antígeno de interés. De preferencia, el antígeno es un polipéptido y la administración del anticuerpo a un mamífero que padece una enfermedad o trastorno puede dar como resultado un beneficio terapéutico en ese mamífero. Sin embargo, pueden utilizarse también anticuerpos dirigidos contra antígenos no polipeptídicos (tales como antígenos de glicolípidos asociados a tumores; véase la Patente de EE.UU. 5.091.178).

Los antígenos de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, moléculas tales como renina; una hormona de crecimiento, incluidas la hormona de crecimiento humana y la hormona de crecimiento bovina; un factor liberador de hormona de crecimiento; hormona paratiroidea; hormona estimulante de la tiroides; lipoproteínas; alfa-1-antitripsina; cadena A de la insulina; cadena B de la insulina; proinsulina; hormona estimulante del folículo; calcitonina; hormona luteinizante; glucagón; factores de coagulación tales como el factor VIIIC, el factor IX, el factor tisular (TF) y el factor de von Willebrand; factores anticoagulantes tales como Proteína C; factor natriurético atrial; tensioactivo pulmonar; un activador del plasminógeno, tal como uroquinasa o activador del plasminógeno de orina humana o de tipo tisular (t-PA); bombesina; trombina; factor de crecimiento hematopoyético; factor de necrosis tumoral alfa y beta; encefalinasa; RANTES (regulado por activación, normalmente expresado y secretado en células T); proteína inflamatoria de macrófagos humanos (MIP-1-alfa); una albúmina sérica tal como la albúmina sérica humana; sustancia inhibidora de Müller; cadena A de la relaxina; cadena B de la relaxina; prorrelaxina; péptido asociado a gonadotropina de ratón; una proteína microbiana, tal como beta-lactamasa; ADNasa; IgE; un antígeno asociado a linfocito T citotóxico (CTLA), tal como CTLA-4; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); receptores para hormonas o factores de crecimiento; proteína A o D; factores reumatoides; un factor neurotrófico tal como factor neurotrófico derivado de hueso (BDNF), neurotrofina-3, -4, -5 ó -6 (NT-3, NT-4, NT-5 ó NT-6), o un factor de crecimiento nervioso; factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF); factor de crecimiento de fibroblastos tal como \alphaFGF y \betaFGF; factor de crecimiento epidérmico (EGF); factor de crecimiento transformante (TGF) tal como TGF-alfa y TGF-beta, incluidos TGF-1, TGF-2, TGF-3, TGF-4 ó TGF-5; factor de crecimiento análogo a la insulina-l y -II (IGF-I e IGF-II); des(1-3)-IGF-I (IGF-I de cerebro), proteínas de unión de factor de crecimiento análogo a la insulina; proteínas CD tales como CD3, CD4, CD8, CD19 y CD20; eritropoyetina; factores osteoinductores; inmunotoxinas; una proteína morfogénica ósea (BMP); un interferón tal como interferón-alfa, -beta, y -gamma; factores estimuladores de colonias (CSFs), por ejemplo, M-CSF, GM-CSF y G-CSF; interleucinas (ILs), por ejemplo, IL-1 hasta IL-10; superóxido dismutasa; receptores de células T; proteínas de membranas superficiales; factor acelerador de la degradación; antígeno viral tal como, por ejemplo, una parte de la cubierta del SIDA; proteínas de transporte; receptores de localización; adresinas; proteínas reguladoras; integrinas tales como CD11a, CD11b, CD11c, CD18, una ICAM, VLA-4 y VCAM; un antígeno asociado a tumor tal como el receptor HER2, HER3 o HER4; un miembro de una vía de apoptosis; y los fragmentos de cualquiera de los polipéptidos anteriormente presentados.

Los antígenos de preferencia incluyen, pero no se limitan a, las proteínas CD tales como CD3, CD4, CD8, CD19, CD20 y CD34; los miembros de la familia de receptores ErbB tales como el receptor de EGF, el receptor HER2, HER3 o HER4; moléculas de adhesión celular tales como LFA-1, Mac1, p150.95, VLA-4, ICAM-1, VCAM, integrina a4/p7, y la integrina Xv/p3 incluidas sus subunidades (por ejemplo anticuerpos anti-CD11a, anti-CD18 o anti-CD11b); factores de crecimiento tales como VEGF; factor tisular (TF); interferón alfa (a-IFN); una interleucina tal como IL-8; IgE; antígenos de los grupos sanguíneos; receptor flk2/flt3; receptor de la obesidad (OB); receptor mpl; CTLA-4; proteína C, etc.

Pueden usarse antígenos solubles o sus fragmentos, conjugados opcionalmente a otras moléculas, como inmunógenos para generar los anticuerpos. Para las moléculas transmembranarias, tales como receptores, pueden usarse fragmentos de éstas (por ejemplo el dominio extracelular de un receptor) como el inmunógeno. Como alternativa, pueden usarse células que expresan la molécula transmembranaria como el inmunógeno. Tales células pueden obtenerse de una fuente natural (por ejemplo líneas celulares de cáncer) o pueden ser células que se han transformado mediante técnicas recombinantes para expresar la molécula transmembranaria. Resultarán evidentes para los expertos en la técnica otros antígenos y sus formas útiles para preparar anticuerpos.

(ii) Anticuerpos policlonales

La presente invención proporciona anticuerpos policlonales con regiones Fc variantes. Por ejemplo, puede transplantarse un repertorio de inmunoglobulinas humanas que contienen regiones constantes G1 modificadas en ratones inactivados para las inmunoglobulinas, dando como resultado la expresión en el ratón de un repertorio de IgG que contiene las regiones Fc modificadas (véase por ejemplo Mendez, MJ y col., Nature Genetics 15:146 (1997). Los anticuerpos policlonales se generan de preferencia en animales por medio de múltiples inyecciones subcutáneas (sc) o intraperitoneales (ip) del antígeno relevante y un adyuvante. Puede ser útil conjugar el antígeno relevante a una proteína que es inmunogénica en la especie a inmunizar (por ejemplo hemocianina de lapa californiana, albúmina sérica, tiroglobulina bovina o inhibidor de tripsina de soja) mediante el uso de un agente bifuncional o derivatizador (por ejemplo, éster de maleimidobenzoil sulfosuccinimida para la conjugación por medio de residuos de cisteína, N-hidroxisuccinimida para la conjugación por medio de residuos de lisina, glutaraldehído, anhídrido succínico, SOCl_{2} o R1N=C=NR, en el que R y R1 son grupos alquilo diferentes).

Los ejemplos de un protocolo de inmunización general para un conejo y un ratón son los siguientes. Los animales se inmunizan contra el antígeno, conjugados inmunogénicos o derivados combinando, por ejemplo, 100 \mug ó 5 \mug de la proteína o conjugado (para un conejo o ratón, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund, y se inyecta la disolución por vía intradérmica en múltiples sitios. Un mes más tarde se estimulan los animales con una dosis de refuerzo de 1/5 a 1/10 la cantidad original del péptido o conjugado en adyuvante completo de Freund mediante inyección subcutánea en múltiples sitios. Siete a catorce días más tarde se extrae sangre a los animales y se analiza el valor de anticuerpos en el suero. Se administran dosis de refuerzo a los animales hasta que el valor alcanza una meseta. De preferencia, el animal se refuerza con el conjugado del mismo antígeno, pero conjugado a una proteína diferente y/o por medio de un agente de entrecruzamiento diferente. Los conjugados también pueden producirse en cultivo de células recombinantes en forma de fusiones de proteínas. Además, se usan de manera adecuada agentes agregantes tales como alumbre para potenciar la respuesta inmune.

(iii) Anticuerpos monoclonales

La presente invención proporciona anticuerpos monoclonales con regiones Fc variantes. Los anticuerpos monoclonales pueden producirse en una serie de formas, incluido el procedimiento del hibridoma (por ejemplo como está descrito por Kohler y col., Nature, 256:495, 1975), o por medio de procedimientos de ADN recombinante (por ejemplo, Patente de EE.UU. Nº 4.816.567).

En el procedimiento del hibridoma, se inmuniza un ratón u otro animal huésped apropiado, tal como un hámster o un mono macaco, para producir linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unirán de manera específica a la proteína usada para la inmunización. Como alternativa, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro. Los linfocitos se fusionan a continuación con células de mieloma mediante el uso de un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma. Las células de hibridoma preparadas de esta manera se siembran y se cultivan en un medio de cultivo adecuado que contiene de preferencia una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma originales sin fusionar. Por ejemplo, si las células de mieloma originales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas incluirá típicamente hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), cuyas sustancias evitan el crecimiento de las células deficientes de HGPRT.

Las células de mieloma de preferencia son las que se fusionan de manera eficaz, mantienen una producción estable de elevado nivel de anticuerpo por las células productoras de anticuerpo seleccionadas, y son sensibles a un medio tal como el medio HAT. Entre éstas, las líneas celulares de mieloma de preferencia son las líneas de mieloma murinas, tales como las derivadas de los tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, EEUU, y las células SP-2 o X63-Ag8-653 disponibles de la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, EEUU. Se han descrito también líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma de ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)).

El medio de cultivo en el que crecen las células de hibridoma se analiza para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. De preferencia, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina por medio de inmunoprecipitación o por medio de un ensayo de unión in vitro, tal como un radioinmunoensayo (RIA) o un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). Después de identificar las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones pueden subclonarse mediante procedimientos de dilución limitante y cultivarse por medio de procedimientos convencionales. Los medios de cultivo adecuados para este objeto incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden cultivarse in vivo como tumores ascíticos en un animal. Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan de manera adecuada del medio de cultivo, líquido ascítico o suero mediante procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas tales como, por ejemplo, proteína A-Sepharose, cromatografía con hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.

El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aísla y se secuencia fácilmente mediante el uso de procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse de manera específica a los genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos monoclonales). Las células de hibridoma sirven como una fuente de preferencia de tal ADN. Una vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresión, que se transfectan a continuación a células hospedadoras tales como células de E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO), o células de mieloma que no producen de otra forma proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. La producción recombinante de anticuerpos se describe con más detalle a continuación.

En algunas formas de realización, pueden aislarse anticuerpos o fragmentos de anticuerpos de bibliotecas de anticuerpos en fagos generadas mediante el uso de las técnicas descritas en, por ejemplo, McCafferty y col., Nature, 348:552-554 (1990), Clackson y col., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks y col., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, usando bibliotecas de fagos. Las publicaciones posteriores describen la producción de anticuerpos humanos de elevada afinidad (intervalo nM) mediante ordenamiento aleatorio de cadenas (Marks y col., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), así como la infección combinatoria y la recombinación in vivo como estrategia para construir bibliotecas de fagos muy grandes (por ejemplo, Waterhouse y col., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)). Por consiguiente, estas técnicas, y técnicas similares, son alternativas viables a las técnicas de hibridomas de anticuerpos monoclonales tradicionales para el aislamiento de anticuerpos monoclonales.

También, puede modificarse el ADN, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificadora de los dominios constantes de las cadenas pesadas y ligeras humanas en lugar de las secuencias homólogas murinas (por ejemplo, Patente de EEUU Nº 4.816.567 y Morrison, y col., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)), o uniendo de manera covalente a la secuencia codificadora de la inmunoglobulina toda o parte de la secuencia codificadora de un polipéptido que no es una inmunoglobulina.

Típicamente, tales polipéptidos que no son inmunoglobulinas se sustituyen por los dominios constantes de un anticuerpo, o se sustituyen por los dominios variables de un sitio de combinación con un antígeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprende un sitio de combinación con un antígeno que tiene especificidad por un antígeno y otro sitio de combinación con un antígeno que tiene especificidad por un antígeno diferente.

(iv) Anticuerpos humanizados y humanos

La presente invención proporciona anticuerpos humanizados y humanos con regiones Fc variantes. En formas de realización de preferencia, un anticuerpo humanizado comprende secuencias de aminoácidos de anticuerpos humanos junto con residuos de aminoácidos que no son de anticuerpos humanos. En algunas formas de realización, las secuencias humanas en un anticuerpo humanizado comprenden las regiones marco estructural (FR) y las secuencias o residuos que no son de anticuerpo humano comprenden una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR).

Cabe destacar que las FR y CDR pueden definirse basándose en la numeración de residuos de aminoácidos en las regiones variables de la cadena pesada y ligera. El término región determinante de complementariedad, o CDR tiene la intención de significar los sitios de combinación no contiguos del antígeno que se encuentran dentro de la región variable de ambas cadenas de polipéptidos, de la cadena pesada y ligera. Estas regiones están definidas por Kabat y col. (J. Biol. Chem. 252: 6609-6616 (1977) y Kabat y col. Sequences of Proteins of Immunological Interest (1991); "Kabat"), Chothia y col. (J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987); "Chothia") y MacCallum y col. (J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996); "MacCallum"), donde las definiciones incluyen solapamientos o subseries de residuos de aminoácidos cuando se comparan una con la otra. Sin embargo, la aplicación de cualquiera de estas definiciones solas (por ejemplo, la definición de Kabat) o en combinación (solo a manera de ejemplo, la definición combinada de Kabat y Chothia) para referirse a una CDR de un anticuerpo (incluido un anticuerpo humanizado) tiene la intención de estar dentro del ámbito del término según se define y usa en el presente documento. Los residuos de aminoácidos que abarcan las CDR según se definen por medio de cada una de las referencias citadas anteriormente se exponen a continuación en la Tabla 6 como una comparación.

TABLA 6 Definiciones de CDR

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También, el término "marco estructural" cuando se usa con referencia a una región variable del anticuerpo tiene la intención de significar todos los residuos de aminoácidos fuera de las regiones CDR dentro de la región variable de un anticuerpo. Por consiguiente, un marco estructural de región variable tiene una longitud de entre aproximadamente 100 y 120 aminoácidos pero tiene la intención de referirse sólo a los aminoácidos fuera de las CDR. El término "región del marco estructural" tiene la intención de significar cada dominio del marco estructural que está separado por las CDR. Por consiguiente, para el ejemplo específico de una región variable de la cadena pesada y para las CDR según están definidas por Kabat, la región marco estructural 1 (FR1) corresponde al dominio de la región variable que abarca los aminoácidos 1-30; la región 2 (FR2) corresponde al dominio de la región variable que abarca los aminoácidos 36-49; la región 3 (FR3) corresponde al dominio de la región variable que abarca los aminoácidos 66-94; y la región 4 (FR4) corresponde al dominio de la región variable desde el aminoácido 103 hasta el final de la región variable. Las regiones marco estructural para la cadena ligera están separadas de manera similar por cada una de las regiones variables CDR de la cadena ligera. De manera similar, usando la definición de CDR por Chothia o MacCallum o cualquier combinación de definiciones de CDR, los límites del marco estructural están separados por los respectivos extremos terminales de CDR como se describió anteriormente. No obstante las múltiples definiciones de CDR, en algunas formas de realización, resulta de preferencia usar la definición de Kabat para definir las CDR.

Los residuos en un anticuerpo humanizado que no son de un anticuerpo humano pueden ser residuos o secuencias importados de derivados de otras especies (incluidas pero no limitadas a ratón), o estas secuencias pueden ser secuencias aleatorias de aminoácidos (por ejemplo, generadas a partir de secuencias aleatorias de ácidos nucleicos), que se insertan en la secuencia del anticuerpo humanizado. Como se indicó anteriormente, las secuencias de aminoácidos humanos en un anticuerpo humanizado son de preferencia las regiones marco, mientras que los residuos que no son de un anticuerpo humano (ya sea derivados de otra especie o de secuencias aleatorias de aminoácidos) corresponden de preferencia a las CDR. Sin embargo, en algunas formas de realización, una o más regiones marco estructural pueden contener uno o más residuos de aminoácidos no humanos. En casos de alteraciones o modificaciones (por ejemplo, por introducción de un residuo no humano) a un marco estructural de otra manera humano, es posible que la región marco estructural alterada o modificada esté adyacente a un CDR modificado de otra especie o a una secuencia aleatoria de CDR, mientras que en otras formas de realización, una región marco estructural alterada no está adyacente a una secuencia de CDR alterada de otra especie o a una secuencia aleatoria de CDR. En algunas formas de realización, las secuencias marco estructural de un anticuerpo son totalmente humanas (es decir se realizan cambios del marco estructural al marco estructural humano). En formas de realización de preferencia, las secuencias marco estructural de un anticuerpo humanizado son totalmente de línea germinal humana (es decir no se realizan cambios del marco estructural al marco estructural de línea germinal humana).

Los residuos de aminoácidos no humanos de otras especies, o de una secuencia aleatoria, se denominan frecuentemente residuos "importados", que típicamente se toman de un dominio variable "importado". La humanización puede realizarse esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (por ejemplo, Jones y col., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann y col., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen y col., Science, 239:1534-1536 (1988)), sustituyendo secuencias de CDRs o CDR de roedor (u otro mamífero) por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. También, pueden generarse anticuerpos en los que se ha sustituido sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto por la secuencia correspondiente de una especie no humana (por ejemplo Patente de EEUU Nº 4.816.567). En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los que ciertos residuos de CDR y posiblemente ciertos residuos de FR se sustituyen por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedor, o como se indicó anteriormente, en los que las secuencias de CDR se han sustituido por secuencias aleatorias. Sólo a manera de ejemplo no limitante, los procedimientos para conferir afinidad de unión del CDR donador a un marco estructural de región variable del anticuerpo aceptor se describen en el Documento WO 01/27160 A1 y en las Solicitudes de EEUU 09/434.870 y 09/982.464.

La elección de los dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, a usar en la producción de los anticuerpos humanizados es importante para reducir la antigenicidad. Según el procedimiento denominado del "mejor ajuste", se selecciona la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor a humanizar frente a la biblioteca completa de las secuencias de los dominios variables humanos conocidos. La secuencia humana que es la más cercana a la del roedor se acepta entonces como el marco estructural (FR) humano para el anticuerpo humanizado (por ejemplo, Sims y col., J. Immunol., 151:2296 (1993) y Chothia y col., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). Otro procedimiento usa un marco estructural particular derivado de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. Puede usarse el mismo marco estructural para varios anticuerpos humanizados diferentes (por ejemplo, Carter y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta y col., J. Immunol., 151:2623 (1993)).

En otras formas de realización, no hay necesidad de "preseleccionar" un marco estructural particular del anticuerpo humano (es decir no hay necesidad de seleccionar un marco estructural humano con la mayor homología o identidad de secuencia a un anticuerpo candidato a humanizar). En estas formas de realización, puede usarse un marco estructural humano común o universal para aceptar una o más CDR no humanas. En la forma de realización de preferencia, se usa un marco estructural único, universal, totalmente humano como el marco estructural para que todos los anticuerpos a humanizar, independientemente de su homología con la(s) secuencia(s) del marco estructural de los anticuerpos candidatos. Al respecto, pueden generarse anticuerpos humanizados sin realizar ningún cambio en la región del marco estructural. Este marco estructural universal, totalmente humano puede aceptar a continuación una o más secuencias de CDR. En una forma de realización, la o las secuencias de CDR son las secuencias de CDR de un anticuerpo de otra especie (por ejemplo ratón o rata) que se han modificado en comparación con la CDR correspondiente en el anticuerpo intacto de la otra especie (es decir hay introducción simultánea de la CDR y modificación de la CDR introducida en el marco estructural humano universal). La modificación corresponde a uno o más cambios de aminoácidos (en la CDR modificada) en comparación con la CDR correspondiente en el anticuerpo intacto de la otra especie. En una forma de realización, todos los residuos de aminoácidos en la CDR están incluidos en una biblioteca, mientras que en otras formas de realización, no todos los residuos de aminoácido de la CDR están incluidos en una biblioteca. En otra forma realización, la o las secuencias de CDR son secuencias aleatorias, que sustituyen a las secuencias de la
CDR.

En formas de realización de preferencia, los anticuerpos se humanizan con mantenimiento de una afinidad elevada por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. En algunas formas de realización, la afinidad del anticuerpo humanizado por el antígeno es más alta que la afinidad del correspondiente anticuerpo intacto, no humanizado o fragmento o porción del mismo (por ejemplo, el anticuerpo de roedor candidato). Al respecto, en algunas formas de realización, los anticuerpos humanizados se preparan mediante un procedimiento de análisis de las secuencias originales y diversos productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias originales y humanizadas. Los modelos de inmunoglobulinas tridimensionales están disponibles comúnmente y son conocidos para los expertos en la técnica. Hay disponibles programas informáticos que ilustran y visualizan las estructuras conformacionales tridimensionales probables de las secuencias de inmunoglobulinas candidatas seleccionadas. La inspección de estas visualizaciones permite el análisis de la función probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de los residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antígeno. De esta manera, los residuos de FR pueden seleccionarse y combinarse de las secuencias receptora e importada, de forma que se consigue la característica deseada del anticuerpo, tal como la afinidad aumentada por el/los antígeno(s) diana. En general, los residuos de CDR están implicados de forma directa y muy sustancialmente en influir en la unión al antígeno.

Pueden utilizarse una diversidad de procedimientos específicos, bien conocidos por los expertos en la técnica, para introducir CDR de anticuerpos (o secuencias aleatorias que sustituyen a las CDR de anticuerpos) en marcos estructurales de anticuerpos (véase, por ejemplo, las Solicitudes de EEUU 09/434879 y 09/982464). En algunas formas de realización, pueden usarse oligos superpuestos para sintetizar un gen de anticuerpo o una porción del mismo (por ejemplo, un gen que codifica un anticuerpo humanizado). En otras formas de realización, puede llevarse a cabo la mutagénesis de un molde de anticuerpo usando los métodos de Kunkel (infra), por ejemplo para introducir una CDR modificada o para sustituir una CDR por una secuencia aleatoria. En algunas formas de realización, las regiones variables de cadenas ligeras y pesadas se humanizan por separado, y a continuación se expresan conjuntamente como una región variable humanizada. En otras formas de realización, las regiones variables humanizadas constituyen la región variable de un anticuerpo intacto. En algunas formas de realización, la región Fc del anticuerpo intacto que comprende una región variable humanizada se ha modificado (por ejemplo, se ha realizado al menos una modificación de aminoácidos en la región Fc). Por ejemplo, un anticuerpo que se ha humanizado con CDR aleatorizada y sin cambios del marco estructural puede comprender al menos una modificación de aminoácidos en la
región Fc.

En otras formas de realización, se utilizan animales transgénicos (por ejemplo ratones) que son capaces, tras la inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulinas endógenas. Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigota del gen de la región de unión de la cadena pesada (JH) de anticuerpos en ratones mutantes quiméricos y de línea germinal da como resultado la inhibición completa de la producción de anticuerpos endógenos. La transferencia de la colección de genes de inmunoglobulina de la línea germinal humana en tales ratones mutantes de línea germinal dará como resultado la producción de anticuerpos humanos tras la exposición al antígeno. Véase, por ejemplo, Jakobovits y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993) y Jakobovits y col., Nature, 362:255-258 (1993). Los anticuerpos humanos pueden obtenerse también de bibliotecas de expresión en fagos (por ejemplo, Hoogenboom y col., J. Mol. Biol., 227:381 (1991) y Vaughan y col. Nature Biotech 14:309 (1996)).

La presente invención proporciona procedimientos para generar anticuerpos humanizados (y fragmentos de anticuerpo) que comprenden al menos una modificación de aminoácidos en la región Fc (comparado con un polipéptido original que tiene una región Fc). A continuación se analizan otros procedimientos para generar tales anticuerpos humanizados. La presente invención también proporciona composiciones que comprenden los anticuerpos y los fragmentos de anticuerpos generados por estos procedimientos. En gran medida, los procedimientos de humanización que se analizan a continuación, y otros procedimientos de humanización (por ejemplo analizados anteriormente), pueden combinarse con las variantes de Fc de la presente invención. Al respecto, pueden construirse anticuerpos humanizados con regiones Fc únicas, alteradas, según la presente invención.

En algunas formas de realización, se proporciona un procedimiento para construir una población de ácidos nucleicos que codifican regiones variables alteradas de cadenas pesadas, que comprende: a) proporcionar una representación de la primera y segunda secuencia de aminoácidos de referencia, comprendiendo la primera secuencia de referencia la secuencia de una región variable donadora de cadena pesada, comprendiendo la región variable donadora i) regiones del marco estructural y ii) tres regiones determinantes de complementariedad según se definen por medio de las definiciones de Kabat y de Chothia combinadas; comprendiendo la segunda secuencia de referencia la secuencia de una región variable aceptora de cadena pesada que comprende regiones del marco estructural; b) sintetizar a) los primeros oligonucleótidos que codifican porciones de la región del marco estructural de la región variable aceptora de cadena pesada, en el que las porciones de las regiones del marco estructural cuando se comparan con la segunda secuencia de referencia no están modificadas; y b) una población de segundos oligonucleótidos, que codifica cada una i) al menos una porción de una primera región determinante de complementariedad que se ha modificado, seleccionada la primera región determinante de complementariedad del grupo constituido por HCDR1, HCDR2 y HCDR3, en los que la primera región determinante de complementariedad modificada comprende un aminoácido diferente en una o más posiciones cuando se compara con las regiones determinantes de complementariedad donadoras correspondientes de la primera secuencia de referencia, y ii) una o más porciones de las regiones del marco estructural sin modificar que son capaces de hibridar con los primeros oligonucleótidos; c) mezclar los primeros oligonucleótidos con la población de segundos oligonucleótidos para crear superposición de oligonucleótidos; y d) tratar la superposición de oligonucleótidos bajo condiciones tales que se construya una población de ácidos nucleicos que codifican regiones variables de cadenas pesadas alteradas, en los que las regiones del marco estructural codificadas por los ácidos nucleicos que codifican regiones variables alteradas de cadenas pesadas no están modificadas con respecto a la segunda secuencia de referencia.

En algunas formas de realización, la representación de la primera y segunda secuencia de referencia está en forma electrónica. En algunas formas de realización, el procedimiento comprende además la etapa de (E) coexpresar la población de ácidos nucleicos que codifican regiones variables de cadenas pesadas alteradas con un ácido nucleico que codifica regiones variables de cadenas ligeras para producir una población diversa de regiones variables heteroméricas alteradas. En algunas formas de realización, la síntesis comprende sintetizar químicamente. En algunas formas de realización, el aceptor es humano. En algunas formas de realización, el tratamiento de la etapa D) comprende la extensión por medio de una polimerasa.

En algunas formas de realización, se proporciona un procedimiento para construir una población de ácidos nucleicos que codifican regiones variables alteradas de cadenas ligeras, que comprende: a) proporcionar una representación de la primera y segunda secuencia de aminoácidos de referencia, comprendiendo la primera secuencia de referencia la secuencia de una región variable donadora de cadena ligera, comprendiendo la región variable donadora i) regiones del marco estructural y ii) tres regiones determinantes de complementariedad según se definen por medio de las definiciones de Kabat y de Chothia combinadas; comprendiendo la segunda secuencia de referencia la secuencia de una región variable aceptora de cadena ligera que comprende regiones del marco estructural; b) sintetizar a) los primeros oligonucleótidos que codifican porciones de la región del marco estructural de la región variable aceptora de cadena ligera, en los que las porciones de las regiones del marco estructural cuando se comparan con la segunda secuencia de referencia no están modificadas; y b) una población de segundos oligonucleótidos, que codifica cada una i) al menos una porción de una primera región determinante de complementariedad que se ha modificado, la primera región determinante de complementariedad seleccionada del grupo constituido por LCDR1, LCDR2 y LCDR3, en los que la primera región determinante de complementariedad modificada comprende un aminoácido diferente en una o más posiciones cuando se compara con las regiones determinantes de complementariedad donadoras correspondientes de la primera secuencia de referencia, y ii) una o más porciones de las regiones del marco estructural sin modificar que son capaces de hibridar con los primeros oligonucleótidos; c) mezclar los primeros oligonucleótidos con la población de segundos oligonucleótidos para crear superposición de oligonucleótidos; y d) tratar la superposición de oligonucleótidos bajo condiciones tales que se construya una población de ácidos nucleicos que codifican regiones variables de cadenas ligeras alteradas, en los que las regiones del marco estructural codificadas por los ácidos nucleicos que codifican regiones variables alteradas de cadenas ligeras no están modificadas con respecto a la segunda secuencia de referencia.

En algunas formas de realización, la representación de la primera y segunda secuencia de referencia está en forma electrónica. En algunas formas de realización, el procedimiento comprende además la etapa de (E) coexpresar la población de ácidos nucleicos que codifican regiones variables de cadenas ligeras alteradas con un ácido nucleico que codifica regiones variables de cadenas pesadas para producir una población diversa de regiones variables heteroméricas alteradas. En algunas formas de realización, la síntesis comprende sintetizar químicamente. En algunas formas de realización, el aceptor es humano. En algunas formas de realización, el tratamiento de la etapa D) comprende la extensión por medio de una polimerasa.

En algunas formas de realización, está contemplado un procedimiento para construir una población de ácidos nucleicos que codifican regiones variables alteradas de cadenas pesadas, que comprende: A) proporcionar una representación de la primera y segunda secuencia de aminoácidos de referencia, comprendiendo la primera secuencia de referencia la secuencia de una región variable donadora de cadena pesada, comprendiendo la región variable donadora i) regiones del marco estructural y ii) tres regiones determinantes de complementariedad según se definen por medio de las definiciones de Kabat y de Chothia combinadas; comprendiendo la segunda secuencia de referencia la secuencia de una región variable aceptora de cadena pesada que comprende regiones del marco estructural; B) sintetizar a) una población de primeros oligonucleótidos que codifican cada uno al menos una porción de una primera región determinante de complementariedad seleccionada del grupo constituido por HCDR1, HCDR2 y HCDR3, en los que la primera región determinante de complementariedad modificada comprende un aminoácido diferente en una o más posiciones cuando se compara con las regiones determinantes de complementariedad donadoras correspondientes de la primera secuencia de referencia; y b) segundos oligonucleótidos que codifican i) porciones de la región del marco estructural de la región variable de cadenas pesadas aceptora, en los que las porciones de las regiones del marco estructural cuando se comparan con la secuencia de referencia no están modificadas e, ii) una o más porciones de una región determinante de complementariedad que es capaz de hibridar con la población de primeros oligonucleótidos; C) mezclar la población de primeros oligonucleótidos con los segundos oligonucleótidos para crear superposición de oligonucleótidos; y D) tratar la superposición de oligonucleótidos bajo condiciones tales que se construya una población de ácidos nucleicos que codifican regiones variables de cadenas pesadas alteradas, en los que las regiones del marco estructural codificadas por los ácidos nucleicos que codifican regiones variables alteradas de cadenas pesadas no están modificadas con respecto a la segunda secuencia de referencia.

En algunas formas de realización, la representación de la primera y segunda secuencia de referencia está en forma electrónica. En algunas formas de realización, el procedimiento comprende además la etapa de (E) coexpresar la población de ácidos nucleicos que codifican regiones variables de cadenas pesadas alteradas con un ácido nucleico que codifica regiones variables de cadenas ligeras para producir una población diversa de regiones variables heteroméricas alteradas. En algunas formas de realización, la síntesis comprende sintetizar químicamente. En algunas formas de realización, el aceptor es humano. En algunas formas de realización, el tratamiento de la etapa D) comprende la extensión por medio de una polimerasa.

En otras formas de realización, se proporciona un procedimiento para construir una población de ácidos nucleicos que codifican regiones variables alteradas de cadenas ligeras, que comprende: A) proporcionar una representación de la primera y segunda secuencia de aminoácidos de referencia, comprendiendo la primera secuencia de referencia la secuencia de una región variable donadora de cadena ligera, comprendiendo la región variable donadora i) regiones del marco estructural y ii) tres regiones determinantes de complementariedad según se definen por medio de las definiciones de Kabat y de Chothia combinadas; comprendiendo la segunda secuencia de referencia la secuencia de una región variable aceptora de cadena ligera que comprende regiones del marco estructural; B) sintetizar a) una población de primeros oligonucleótidos que codifican cada uno al menos una porción de una primera región determinante de complementariedad seleccionada del grupo constituido por LCDR1, LCDR2 y LCDR3, en los que la primera región determinante de complementariedad modificada comprende un aminoácido diferente en una o más posiciones cuando se compara con las regiones determinantes de complementariedad donadoras correspondientes de la primera secuencia de referencia; y b) segundos oligonucleótidos que codifican i) porciones de la región del marco estructural de la región variable de cadenas ligeras aceptora, en los que las porciones de las regiones del marco estructural cuando se comparan con la secuencia de referencia no están modificadas e, ii) una o más porciones de una región determinante de complementariedad que es capaz de hibridar con la población de primeros oligonucleótidos; C) mezclar la población de primeros oligonucleótidos con los segundos oligonucleótidos para crear superposición de oligonucleótidos; y D) tratar la superposición de oligonucleótidos bajo condiciones tales que se construya una población de ácidos nucleicos que codifican regiones variables de cadenas ligeras alteradas, en los que las regiones del marco estructural codificadas por los ácidos nucleicos que codifican regiones variables alteradas de cadenas ligeras no están modificadas con respecto a la segunda secuencia de referencia.

En algunas formas de realización, la representación de la primera y segunda secuencia de referencia está en forma electrónica. En algunas formas de realización, el procedimiento comprende además la etapa de (E) coexpresar la población de ácidos nucleicos que codifican regiones variables de cadenas ligeras alteradas con un ácido nucleico que codifica regiones variables de cadenas pesadas para producir una población diversa de regiones variables heteroméricas alteradas. En algunas formas de realización, la síntesis comprende sintetizar químicamente. En algunas formas de realización, el aceptor es humano. En algunas formas de realización, el tratamiento de la etapa D) comprende la extensión por medio de una polimerasa.

En otras formas de realización, está contemplado un procedimiento para construir una población de ácidos nucleicos que codifican regiones variables alteradas de cadenas pesadas, que comprende: a) proporcionar una representación de la primera y segunda secuencia de aminoácidos de referencia, comprendiendo la primera secuencia de referencia la secuencia de una región variable donadora de cadena pesada, comprendiendo la región variable donadora i) regiones del marco estructural y ii) tres regiones determinantes de complementariedad, comprendiendo la segunda secuencia de referencia una región variable de cadena pesada; b) sintetizar una población de secuencias genéticas de anticuerpos de regiones variables de cadenas pesadas alteradas, en los que las regiones del marco estructural de las regiones variables de cadenas pesadas alteradas son idénticas a las regiones del marco estructural de la segunda secuencia de referencia y al menos una primera CDR de las regiones variables del anticuerpo alterado se ha modificado, en los que la primera CDR modificada comprende un aminoácido diferente en una o más posiciones cuando se compara con la CDR donadora correspondiente de la primera secuencia de referencia.

En algunas formas de realización, la representación de la primera y segunda secuencia de referencia está en forma electrónica. En algunas formas de realización, el procedimiento comprende además la etapa de (E) coexpresar la población de ácidos nucleicos que codifican regiones variables de cadenas pesadas alteradas con un ácido nucleico que codifica regiones variables de cadenas ligeras para producir una población diversa de regiones variables heteroméricas alteradas. En algunas formas de realización, el aceptor es humano. En algunas formas de realización, la síntesis implica el uso de oligonucleótidos superpuestos. En algunas formas de realización, las CDR están definidas por medio de la definición de Kabat.

En algunas formas de realización, está contemplado un procedimiento para construir una población de ácidos nucleicos que codifican regiones variables alteradas de cadenas ligeras, que comprende: a) proporcionar una representación de la primera y segunda secuencia de aminoácidos de referencia, comprendiendo la primera secuencia de referencia la secuencia de una región variable donadora de cadena ligera, comprendiendo la región variable donadora i) regiones del marco estructural y ii) tres regiones determinantes de complementariedad; comprendiendo la segunda secuencia de referencia la secuencia de una región variable de cadena ligera aceptora que comprende regiones del marco estructural; b) sintetizar una población de secuencias genéticas de anticuerpos de regiones variables de cadenas ligeras alteradas, en los que las regiones del marco estructural de las regiones variables de cadenas ligeras alteradas son idénticas a las regiones del marco estructural de la segunda secuencia de referencia y al menos una primera CDR de la región variable de cadena ligera del anticuerpo alterado se ha modificado, en el que la primera CDR modificada comprende un aminoácido diferente en una o más posiciones cuando se compara con la CDR donadora correspondiente de la primera secuencia de referencia.

En algunas formas de realización, la representación de la primera y segunda secuencia de referencia está en forma electrónica. En algunas formas de realización, el procedimiento comprende además la etapa de (E) coexpresar la población de ácidos nucleicos que codifican regiones variables de cadenas ligeras alteradas con un ácido nucleico que codifica regiones variables de cadenas pesadas para producir una población diversa de regiones variables heteroméricas alteradas. En algunas formas de realización, el aceptor es humano. En algunas formas de realización, la síntesis implica el uso de oligonucleótidos superpuestos.

En aún otras formas de realización, está contemplado un procedimiento para construir una población de ácidos nucleicos que codifican regiones variables alteradas de cadenas pesadas, que comprende: a) proporcionar una representación de una secuencia de aminoácidos de referencia, comprendiendo la secuencia de referencia la secuencia de una región variable de cadena pesada aceptora, que comprende regiones del marco estructural; b) sintetizar una población de secuencias genéticas de anticuerpos de regiones variables de cadenas pesadas alteradas, en los que las regiones del marco estructural de las regiones variables de cadenas pesadas alteradas son idénticas a las regiones del marco estructural de la secuencia de referencia y al menos una primera CDR de la región variable del anticuerpo alterado comprende una secuencia aleatoria de aminoácidos.

En algunas formas de realización, la representación de la secuencia de referencia está en forma electrónica. En algunas formas de realización, el procedimiento comprende además la etapa de (E) coexpresar la población de ácidos nucleicos que codifican regiones variables de cadenas pesadas alteradas con un ácido nucleico que codifica regiones variables de cadenas ligeras para producir una población diversa de regiones variables heteroméricas alteradas. En algunas formas de realización, el aceptor es humano. En algunas formas de realización, la síntesis implica el uso de oligonucleótidos superpuestos. En algunas formas de realización, las CDR están definidas por medio de la definición de Kabat.

En otras formas de realización, está contemplado un procedimiento para construir una población de ácidos nucleicos que codifican regiones variables alteradas de cadenas ligeras, que comprende: a) proporcionar una representación de una secuencia de aminoácidos de referencia, comprendiendo la secuencia de referencia la secuencia de una región variable de cadena ligera aceptora, que comprende regiones del marco estructural; b) sintetizar una población de secuencias genéticas de anticuerpos de regiones variables de cadenas ligeras alteradas, en los que las regiones del marco estructural de las regiones variables de cadenas ligeras alteradas son idénticas a las regiones del marco estructural de la secuencia de referencia y al menos una primera CDR de la región variable de cadenas ligeras del anticuerpo alterado comprende una secuencia aleatoria de aminoácidos.

En algunas formas de realización, la representación de la secuencia de referencia está en forma electrónica. En algunas formas de realización, el procedimiento comprende además la etapa de (E) coexpresar la población de ácidos nucleicos que codifican regiones variables de cadenas ligeras alteradas con un ácido nucleico que codifica regiones variables de cadenas pesadas para producir una población diversa de regiones variables heteroméricas alteradas. En algunas formas de realización, el aceptor es humano. En algunas formas de realización, la síntesis implica el uso de oligonucleótidos superpuestos. En algunas formas de realización, las CDR están definidas por medio de la definición de Kabat.

En aún otras formas de realización, está contemplado un procedimiento para construir una población de ácidos nucleicos que codifican regiones variables alteradas de cadenas pesadas, que comprende: a) proporcionar una representación de una secuencia de aminoácidos de referencia, comprendiendo la secuencia de referencia la secuencia de una región variable de cadena pesada aceptora humana, que comprende regiones del marco estructural; b) sintetizar una población de secuencias genéticas de anticuerpos de regiones variables de cadenas pesadas alteradas, en los que las regiones del marco estructural de las regiones variables de cadenas pesadas alteradas son idénticas a las regiones del marco estructural de la secuencia de referencia humana y al menos una primera CDR de las regiones variables del anticuerpo alterado comprende una secuencia aleatoria de aminoácidos. En algunas formas de realización, la representación de la secuencia de referencia humana está en forma electrónica. En algunas formas de realización, el procedimiento comprende además la etapa de (E) coexpresar la población de ácidos nucleicos que codifican regiones variables de cadenas pesadas alteradas con un ácido nucleico que codifica regiones variables de cadenas ligeras para producir una población diversa de regiones variables heteroméricas alteradas. En algunas formas de realización, la síntesis implica el uso de oligonucleótidos superpuestos. En algunas formas de realización, las CDR están definidas por medio de la definición de Kabat.

En otras formas de realización, está contemplado un procedimiento para construir una población de ácidos nucleicos que codifican regiones variables alteradas de cadenas ligeras, que comprende: a) proporcionar una representación de una secuencia de aminoácidos de referencia, comprendiendo la secuencia de referencia la secuencia de una región variable de cadena ligera aceptora humana, que comprende regiones del marco estructural; b) sintetizar una población de secuencias genéticas de anticuerpos de regiones variables de cadenas ligeras alteradas, en los que las regiones del marco estructural de las regiones variables de cadenas ligeras alteradas son idénticas a las regiones del marco estructural de la secuencia de referencia humana y al menos una primera CDR de las regiones variables de las cadenas ligeras del anticuerpo alterado comprende una secuencia aleatoria de aminoácidos.

En algunas formas de realización, la representación de la secuencia de referencia está en forma electrónica. En algunas formas de realización, el procedimiento comprende además la etapa de (E) coexpresar la población de ácidos nucleicos que codifican regiones variables de cadenas ligeras alteradas con un ácido nucleico que codifica regiones variables de cadenas pesadas para producir una población diversa de regiones variables heteroméricas alteradas. En algunas formas de realización, la síntesis implica el uso de oligonucleótidos superpuestos. En algunas formas de realización, las CDR están definidas por medio de la definición de Kabat.

En algunas formas de realización, una o más regiones del marco estructural se modifican simultáneamente con la introducción de una o más CDR modificadas. En otras formas de realización los marcos estructurales modificados están adyacentes a las CDR modificadas.

En algunas formas de realización, la presente invención proporciona procedimientos para construir una población de ácidos nucleicos que codifican regiones variables alteradas de cadenas pesadas, que comprenden: a) proporcionar una representación de la primera y segunda secuencia de aminoácidos de referencia, comprendiendo la primera secuencia de aminoácidos de referencia la secuencia de una región variable donadora de cadena pesada, comprendiendo la región variable donadora i) regiones del marco estructural y ii) tres regiones determinantes de complementariedad según se definen por medio de las definiciones de Kabat y de Chothia combinadas; comprendiendo la segunda secuencia de referencia la secuencia de una región variable aceptora de cadena pesada que comprende regiones del marco estructural; b) sintetizar a) una primera población de oligonucleótidos, que comprende oligonucleótidos que codifican una región del marco estructural de la región variable de cadenas pesadas modificadas, o una de sus porciones, en los que la región del marco estructural de la región variable de cadenas pesadas, o una de sus porciones, contiene una pluralidad de aminoácidos cambiados en una o más posiciones cuando se compara con la secuencia de referencia de la región del marco estructural aceptor, en los que las posiciones del marco estructural que se cambian se seleccionan entre las posiciones del marco estructural aceptor de la segunda secuencia de referencia que difiere en la posición correspondiente comparada con las posiciones del marco estructural donador de la primera secuencia de referencia; y b) una segunda población de oligonucleótidos, que codifica cada una i) al menos una región determinante de complementariedad modificada, o una de sus porciones, en los que la región determinante de complementariedad modificada, o una de sus porciones, comprende un aminoácido diferente en una o más posiciones cuando se compara con la secuencia de aminoácidos de referencia de la región determinante complementaria donadora y ii) una o más porciones de las regiones del marco estructural adyacente que son capaces de hibridar con la primera población de oligonucleótidos; y c) mezclar la primera y segunda poblaciones de oligonucleótidos para crear oligonucleótidos superpuestos; y d) tratar los oligonucleótidos superpuestos bajo condiciones tales que se construya una población de ácidos nucleicos que codifican regiones variables de cadenas pesadas alteradas. En ciertas formas de realización, la representación de la primera y segunda secuencia de referencia está en forma electrónica. En otras formas de realización, los procedimientos comprenden además la etapa de (e) coexpresar la población de ácidos nucleicos que codifican regiones variables de cadenas pesadas alteradas con un ácido nucleico que codifica regiones variables de cadenas ligeras para producir una población diversa de regiones variables heteroméricas alteradas. En otras formas de realización, la síntesis comprende sintetizar químicamente. En algunas formas de realización, el aceptor es humano. En formas de realización de preferencia, la o las poblaciones diversas de regiones variables heteroméricas alteradas son parte de un anticuerpo que comprende una región Fc, en el que la región Fc comprende al menos una modificación de aminoácidos comparada con el polipéptido original que tiene una región Fc.

En otras formas de realización, la presente invención proporciona procedimientos para construir una población de ácidos nucleicos que codifican regiones variables alteradas de cadenas ligeras, que comprenden: a) proporcionar una representación de la primera y segunda secuencia de aminoácidos de referencia, comprendiendo la primera secuencia de aminoácidos de referencia la secuencia de una región variable donadora de cadena ligera, comprendiendo la región variable donadora i) regiones del marco estructural y ii) tres regiones determinantes de complementariedad según se definen por medio de las definiciones de Kabat y de Chothia combinadas; comprendiendo la segunda secuencia de referencia la secuencia de una región variable aceptora de cadena ligera que comprende regiones del marco estructural; b) sintetizar a) una primera población de oligonucleótidos, que comprende oligonucleótidos que codifican una región del marco estructural de la región variable de cadenas ligeras modificadas, o una de sus porciones, en los que la región del marco estructural de la región variable de cadenas ligeras, o una de sus porciones, contiene una pluralidad de aminoácidos cambiados en una o más posiciones cuando se compara con la secuencia de referencia de la región del marco estructural aceptor, en los que las posiciones del marco estructural que se cambian se seleccionan entre las posiciones del marco estructural aceptor de la segunda secuencia de referencia que difiere en la posición correspondiente comparada con las posiciones del marco estructural donador de la primera secuencia de referencia; y b) una segunda población de oligonucleótidos, que codifica cada una i) al menos una región determinante de complementariedad modificada, o una de sus porciones, en los que la región determinante de complementariedad modificada, o una de sus porciones, comprende un aminoácido diferente en una o más posiciones cuando se compara con la secuencia de aminoácidos de referencia de la región determinante complementaria donadora y ii) una o más porciones de las regiones del marco estructural adyacente que son capaces de hibridar con la primera población de oligonucleótidos; y c) mezclar la primera y segunda poblaciones de oligonucleótidos para crear oligonucleótidos superpuestos; y d) tratar los oligonucleótidos superpuestos bajo condiciones tales que se construya una población de ácidos nucleicos que codifican regiones variables de cadenas ligeras alteradas. En otras formas de realización, la representación de la primera y segunda secuencia de referencia está en forma electrónica. En otras formas de realización, los procedimientos comprenden además la etapa de (e) coexpresar la población de ácidos nucleicos que codifican regiones variables de cadenas ligeras alteradas con un ácido nucleico que codifica regiones variables de cadenas pesadas para producir una población diversa de regiones variables heteroméricas alteradas.

En algunas formas de realización, los procedimientos comprenden: a) proporcionar una representación de la primera y segunda secuencia de aminoácidos de referencia, comprendiendo la primera secuencia de aminoácidos de referencia la secuencia de una región variable donadora de cadena pesada, comprendiendo la región variable donadora i) regiones del marco estructural y ii) tres regiones determinantes de complementariedad según se definen por medio de las definiciones de Kabat y de Chothia combinadas; comprendiendo la segunda secuencia de referencia la secuencia de una región variable aceptora de cadena pesada que comprende regiones del marco estructural; b) sintetizar a) una primera población de oligonucleótidos, que comprende oligonucleótidos que codifican una región del marco estructural de la región variable de cadenas pesadas modificadas, o una de sus porciones, en los que la región del marco estructural de la región variable de cadenas pesadas, o una de sus porciones, contiene una pluralidad de aminoácidos cambiados en una o más posiciones cuando se compara con la secuencia de referencia de la región del marco estructural aceptor, en los que las posiciones del marco estructural que se cambian se seleccionan entre las posiciones del marco estructural aceptor de la segunda secuencia de referencia que difiere en la posición correspondiente comparada con las posiciones del marco estructural donador de la primera secuencia de referencia; y b) una segunda población de oligonucleótidos, que codifica cada una i) al menos una región determinante de complementariedad modificada, o una de sus porciones, en los que la región determinante de complementariedad modificada, o una de sus porciones, comprende un aminoácido diferente en una o más posiciones cuando se compara con la secuencia de aminoácidos de referencia de la región determinante complementaria donadora y ii) una o más porciones de las regiones del marco estructural adyacente que son capaces de hibridar con la primera población de oligonucleótidos; y c) mezclar la primera y segunda poblaciones de oligonucleótidos para crear oligonucleótidos superpuestos; y d) extender los oligonucleótidos superpuestos con una ADN polimerasa bajo condiciones tales que se construya una población de ácidos nucleicos que codifican regiones variables de cadenas pesadas alteradas.

En aún otras formas de realización, la presente invención proporciona procedimientos para construir una población de ácidos nucleicos que codifican regiones variables alteradas de cadenas ligeras, que comprenden: a) proporcionar una representación de la primera y segunda secuencia de aminoácidos de referencia, comprendiendo la primera secuencia de aminoácidos de referencia la secuencia de una región variable donadora de cadena ligera, comprendiendo la región variable donadora i) regiones del marco estructural y ii) tres regiones determinantes de complementariedad según se definen por medio de las definiciones de Kabat y de Chothia combinadas; comprendiendo la segunda secuencia de referencia la secuencia de una región variable aceptora de cadena ligera que comprende regiones del marco estructural; b) sintetizar a) una primera población de oligonucleótidos, que comprende oligonucleótidos que codifican una región del marco estructural de la región variable de cadenas ligeras modificadas, o una de sus porciones, en los que la región del marco estructural de la región variable de cadenas ligeras, o una de sus porciones, contiene una pluralidad de aminoácidos cambiados en una o más posiciones cuando se compara con la secuencia de referencia de la región del marco estructural aceptor, en los que las posiciones del marco estructural que se cambian se seleccionan entre las posiciones del marco estructural aceptor de la segunda secuencia de referencia que difiere en la posición correspondiente comparada con las posiciones del marco estructural donador de la primera secuencia de referencia; y b) una segunda población de oligonucleótidos, que codifica cada una i) al menos una región determinante de complementariedad modificada, o una de sus porciones, en los que región determinante de complementariedad modificada, o una de sus porción, comprende un aminoácido diferente en una o más posiciones cuando se compara con la secuencia de aminoácidos de referencia de la región determinante complementaria donadora y ii) una o más porciones de las regiones del marco estructural adyacente que son capaces de hibridar con la primera población de oligonucleótidos; y c) mezclar la primera y segunda poblaciones de oligonucleótidos para crear oligonucleótidos superpuestos; y d) extender los oligonucleótidos superpuestos con una ADN polimerasa bajo condiciones tales que se construya una población de ácidos nucleicos que codifican regiones variables de cadenas ligeras alteradas.

En algunas formas de realización, se introducen una o más modificaciones en el marco estructural, simultáneamente con la introducción de una o más CDR modificadas. Las CDR modificadas pueden comprender una o más alteraciones de aminoácidos en comparación con la CDR correspondiente de una secuencia de referencia. En ciertas formas de realización, los procedimientos para construir una población de ácidos nucleicos que codifican regiones variables alteradas de cadenas pesadas, comprenden: a) proporcionar una representación de la primera y segunda secuencia de aminoácidos de referencia, comprendiendo la primera secuencia de aminoácidos de referencia la secuencia de una región variable donadora de cadena pesada, comprendiendo la región variable donadora i) regiones del marco estructural y ii) tres regiones determinantes de complementariedad según se definen por medio de las definiciones de Kabat y de Chothia combinadas; comprendiendo la segunda secuencia de referencia la secuencia de una región variable aceptora de cadena pesada que comprende regiones del marco estructural; b) sintetizar i) una primera población de oligonucleótidos, que codifican cada uno al menos una región determinante de complementariedad modificada, en los que la región determinante de complementariedad modificada comprende un aminoácido diferente en una o más posiciones cuando se compara con la correspondiente secuencia de referencia de aminoácidos de la región determinante de complementariedad donadora; y ii) una segunda población de oligonucleótidos, que comprende oligonucleótidos que codifican porciones modificadas de un marco estructural de la región variable de cadenas pesadas, conteniendo la porción modificada una pluralidad de aminoácidos cambiados en una o más posiciones cuando se compara con la secuencia de referencia de la región del marco estructural aceptor, en los que las posiciones del marco estructural que se cambian se seleccionan entre las posiciones del marco estructural aceptor de la segunda secuencia de referencia que difiere en la posición correspondiente comparada con las posiciones del marco estructural donador de la primera secuencia de referencia; c) mezclar la primera y segunda poblaciones de oligonucleótidos bajo condiciones tales que al menos una porción de los oligonucleótidos hibride para crear oligonucleótidos superpuestos; y d) tratar los oligonucleótidos superpuestos bajo condiciones tales que se construya una población de ácidos nucleicos que codifican regiones variables de cadenas pesadas alteradas. En ciertas formas de realización, la representación de la primera y segunda secuencia de referencia está en forma electrónica. En otras formas de realización, el procedimiento comprende además la etapa de (e) coexpresar la población de ácidos nucleicos que codifican regiones variables de cadenas pesadas alteradas con un ácido nucleico que codifica regiones variables de cadenas ligeras para producir una población diversa de regiones variables heteroméricas alteradas. En otras formas de realización, el aceptor es humano.

En otras formas de realización, la presente invención proporciona procedimientos para construir una población de ácidos nucleicos que codifican regiones variables alteradas de cadenas ligeras, que comprenden: a) proporcionar una representación de la primera y segunda secuencia de aminoácidos de referencia, comprendiendo la primera secuencia de aminoácidos de referencia la secuencia de una región variable donadora de cadena ligera, comprendiendo la región variable donadora i) regiones del marco estructural y ii) tres regiones determinantes de complementariedad según se definen por medio de las definiciones de Kabat y de Chothia combinadas; comprendiendo la segunda secuencia de referencia la secuencia de una región variable aceptora de cadena ligera que comprende regiones del marco estructural; b) sintetizar i) una primera población de oligonucleótidos, que codifican cada uno al menos una región determinante de complementariedad modificada, en los que la región determinante de complementariedad modificada comprende un aminoácido diferente en una o más posiciones cuando se compara con la correspondiente secuencia de referencia de aminoácidos de la región determinante de complementariedad donadora; y ii) una segunda población de oligonucleótidos, que comprende oligonucleótidos que codifican porciones modificadas de un marco estructural de la región variable de cadenas ligeras, conteniendo la porción modificada una pluralidad de aminoácidos cambiados en una o más posiciones cuando se compara con la secuencia de referencia de la región del marco estructural aceptor, en los que las posiciones del marco estructural que se cambian se seleccionan entre las posiciones del marco estructural aceptor de la segunda secuencia de referencia que difiere en la posición correspondiente comparada con las posiciones del marco estructural donador de la primera secuencia de referencia; c) mezclar la primera y segunda poblaciones de oligonucleótidos bajo condiciones tales que al menos una porción de los oligonucleótidos hibride para crear oligonucleótidos superpuestos; y d) tratar los oligonucleótidos superpuestos bajo condiciones tales que se construya una población de ácidos nucleicos que codifican regiones variables de cadenas ligeras alteradas.

En ciertas formas de realización, pueden generarse anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que comprenden una variante de Fc y una región variante de cadenas pesadas alteradas. Por ejemplo, en algunas formas de realización, la presente invención proporciona procedimientos para construir una población de ácidos nucleicos que codifican regiones variables alteradas de cadenas pesadas, que comprenden: a) proporcionar una representación de la primera y segunda secuencia de aminoácidos de referencia, comprendiendo la primera secuencia de aminoácidos de referencia la secuencia de una región variable donadora de cadena pesada, comprendiendo la región variable donadora i) regiones del marco estructural y ii) tres regiones determinantes de complementariedad según se definen por medio de las definiciones de Kabat y de Chothia combinadas; comprendiendo la segunda secuencia de referencia la secuencia de una región variable aceptora de cadena pesada que comprende regiones del marco estructural; b) sintetizar A) primeros oligonucleótidos, que codifican porciones de las regiones del marco estructural de la región variable de cadena pesada aceptora, en los que las porciones de las regiones del marco estructural cuando se comparan con la segunda secuencia de referencia no están modificadas; y B) una población de segundos oligonucleótidos, que codifican cada uno i) al menos una porción de una primera región determinante de complementariedad que se ha modificado, seleccionada la primera región determinante de complementariedad del grupo constituido por HCDR1, HCDR2 y HCDR3, en los que la primera región determinante de complementariedad modificada comprende un aminoácido diferente en una o más posiciones cuando se compara con las regiones determinantes de complementariedad donadoras correspondientes de la primera secuencia de referencia y ii) una o más porciones de las regiones del marco estructural sin modificar que son capaces de hibridar con los primeros oligonucleótidos; c) mezclar los primeros oligonucleótidos con la población de segundos oligonucleótidos para crear oligonucleótidos superpuestos; y d) tratar los oligonucleótidos superpuestos bajo condiciones tales que se construya una población de ácidos nucleicos que codifican regiones variables de cadenas pesadas alteradas, en los que las regiones del marco estructural codificadas por los ácidos nucleicos que codifican regiones variables alteradas de cadenas pesadas no están modificadas con respecto a la segunda secuencia de referencia. En algunas formas de realización, los procedimientos comprenden además la etapa de (E) coexpresar la población de ácidos nucleicos que codifican regiones variables de cadenas pesadas alteradas con un ácido nucleico que codifica regiones variables de cadenas ligeras para producir una población diversa de regiones variables heteroméricas alteradas.

En otras formas de realización, la presente invención proporciona procedimientos para construir una población de ácidos nucleicos que codifican regiones variables alteradas de cadenas ligeras, que comprenden: a) proporcionar una representación de la primera y segunda secuencia de aminoácidos de referencia, comprendiendo la primera secuencia de aminoácidos de referencia la secuencia de una región variable donadora de cadena ligera, comprendiendo la región variable donadora i) regiones del marco estructural y ii) tres regiones determinantes de complementariedad según se definen por medio de las definiciones de Kabat y de Chothia combinadas; comprendiendo la segunda secuencia de referencia la secuencia de una región variable aceptora de cadena ligera que comprende regiones del marco estructural; b) sintetizar a) primeros oligonucleótidos, que codifican porciones de las regiones del marco estructural de la región variable de cadena ligera aceptora, en los que las porciones de las regiones del marco estructural cuando se comparan con la segunda secuencia de referencia no están modificadas; y b) una población de segundos oligonucleótidos, que codifican cada uno i) al menos una porción de una primera región determinante de complementariedad que se ha modificado, seleccionada la primera región determinante de complementariedad del grupo constituido por LCDR1, LCDR2 y LCDR3, en los que la primera región determinante de complementariedad modificada comprende un aminoácido diferente en una o más posiciones cuando se compara con las regiones determinantes de complementariedad donadoras correspondientes de la primera secuencia de referencia y ii) una o más porciones de las regiones del marco estructural sin modificar que son capaces de hibridar con los primeros oligonucleótidos; c) mezclar los primeros oligonucleótidos con la población de segundos oligonucleótidos para crear oligonucleótidos superpuestos; y d) tratar los oligonucleótidos superpuestos bajo condiciones tales que se construya una población de ácidos nucleicos que codifican regiones variables de cadenas ligeras alteradas, en los que las regiones del marco estructural codificadas por los ácidos nucleicos que codifican regiones variables de cadenas ligeras alteradas no están modificadas con respecto a la segunda secuencia de referencia.

En otras formas de realización, la presente invención proporciona procedimientos para construir una población de ácidos nucleicos que codifican regiones variables alteradas de cadenas pesadas, que comprenden: A) proporcionar una representación de la primera y segunda secuencia de aminoácidos de referencia, comprendiendo la primera secuencia de aminoácidos de referencia la secuencia de una región variable donadora de cadena pesada, comprendiendo la región variable donadora i) regiones del marco estructural y ii) tres regiones determinantes de complementariedad según se definen por medio de las definiciones de Kabat y de Chothia combinadas; comprendiendo la segunda secuencia de referencia la secuencia de una región variable aceptora de cadena pesada que comprende regiones del marco estructural; B) sintetizar a) una población de primeros oligonucleótidos, que codifican cada uno al menos una porción de una primera región determinante de complementariedad seleccionada del grupo constituido por HCDR1, HCDR2 y HCDR3, en los que la primera región determinante de complementariedad modificada comprende un aminoácido diferente en una o más posiciones cuando se compara con las regiones determinantes de complementariedad donadoras correspondientes de la primera secuencia de referencia; y b) segundos oligonucleótidos que codifican i) porciones de las regiones del marco estructural de la región variable aceptora de cadenas pesadas, en los que las porciones de las regiones del marco estructural cuando se comparan con la secuencia de referencia no están modificadas y ii) una o más porciones de una región determinante de complementariedad que es capaz de hibridar con la población de primeros oligonucleótidos; C) mezclar la población de primeros oligonucleótidos con los segundos oligonucleótidos para crear oligonucleótidos superpuestos; y D) tratar los oligonucleótidos superpuestos bajo condiciones tales que se construya una población de ácidos nucleicos que codifican regiones variables de cadenas pesadas alteradas, en los que las regiones del marco estructural codificadas por los ácidos nucleicos que codifican regiones variables de cadenas pesadas alteradas no están modificadas con respecto a la segunda secuencia de referencia. En ciertas formas de realización, los procedimientos comprenden además la etapa de (E) coexpresar la población de ácidos nucleicos que codifican regiones variables de cadenas pesadas alteradas con un ácido nucleico que codifica regiones variables de cadenas ligeras para producir una población diversa de regiones variables heteroméricas alteradas.

En otras formas de realización, la presente invención proporciona procedimientos para construir una población de ácidos nucleicos que codifican regiones variables alteradas de cadenas ligeras, que comprenden: A) proporcionar una representación de la primera y segunda secuencia de aminoácidos de referencia, comprendiendo la primera secuencia de aminoácidos de referencia la secuencia de una región variable donadora de cadena ligera, comprendiendo la región variable donadora i) regiones del marco estructural y ii) tres regiones determinantes de complementariedad según se definen por medio de las definiciones de Kabat y de Chothia combinadas; comprendiendo la segunda secuencia de referencia la secuencia de una región variable aceptora de cadena ligera que comprende regiones del marco estructural; B) sintetizar a) una población de primeros oligonucleótidos, que codifican cada uno al menos una porción de una primera región determinante de complementariedad seleccionada del grupo constituido por LCDR1, LCDR2 y LCDR3, en los que la primera región determinante de complementariedad modificada comprende un aminoácido diferente en una o más posiciones cuando se compara con las regiones determinantes de complementariedad donadoras correspondientes de la primera secuencia de referencia y b) segundos oligonucleótidos que codifican i) porciones de las regiones del marco estructural de la región variable aceptora de cadenas ligeras, en los que las porciones de las regiones del marco estructural cuando se comparan con la secuencia de referencia no están modificadas y ii) una o más porciones de una región determinante de complementariedad que es capaz de hibridar con la población de primeros oligonucleótidos; C) mezclar la población de primeros oligonucleótidos con los segundos oligonucleótidos para crear oligonucleótidos superpuestos; y D) tratar los oligonucleótidos superpuestos bajo condiciones tales que se construya una población de ácidos nucleicos que codifican regiones variables de cadenas ligeras alteradas, en los que las regiones del marco estructural codificadas por los ácidos nucleicos que codifican regiones variables de cadenas ligeras alteradas no están modificadas con respecto a la segunda secuencia de referencia.

En otras formas de realización, la presente invención proporciona procedimientos para mejorar la afinidad de unión de una región variable del anticuerpo humanizado mutada, que comprende: a) proporcionar una secuencia de ácido nucleico que codifica una primera región variable del anticuerpo humanizado mutada, comprendiendo la región variable mutada (i) un marco estructural del anticuerpo humano de tipo natural, (ii) tres regiones determinantes de complementariedad de cadenas pesadas no humanas, e (iii) tres regiones determinantes de complementariedad de cadenas ligeras no humanas, en los que las regiones determinantes de complementariedad se definen por medio de las definiciones de Kabat y de Chothia combinadas, en los que al menos una de las regiones determinantes de complementariedad de cadenas ligeras es una región determinante de complementariedad de cadenas ligeras que contiene mutación que comprende al menos un aminoácido diferente en al menos una posición cuando se compara con la región determinante de complementariedad no humana correspondiente, y en los que la primera región variable del anticuerpo mutado tiene una mayor afinidad de unión que la región variable del anticuerpo no mutado correspondiente; b) mutar la secuencia del ácido nucleico que codifica la primera región variable del anticuerpo mutado bajo condiciones tales que se codifique una segunda región variable del anticuerpo humanizado mutado, comprendiendo la segunda región variable del anticuerpo humanizado mutado al menos otro aminoácido diferente en al menos una posición en la región determinante de complementariedad de cadenas ligeras que contiene mutación, la mutación adicional en combinación con la primera mutación dando como resultado una mayor afinidad de unión. En algunas formas de realización, la región determinante de complementariedad de cadenas ligeras que contiene mutación de la primera región variable del anticuerpo humanizado mutado es la región determinante de complementariedad 3 (LCDR3). En otras formas de realización, al menos una de las regiones determinantes de complementariedad de cadenas pesadas no humanas de la primera región variable del anticuerpo humanizado mutado comprende una mutación, tal que se codifique un aminoácido diferente en al menos una posición cuando se compara con la región determinante de complementariedad no humana de tipo natural correspondiente. En otras formas de realización, la mutación de la región determinante de complementariedad de cadenas pesadas está en HCDR3.

En algunas formas de realización, la presente invención proporciona procedimientos para modificar simultáneamente al menos una región determinante de complementariedad (CDR) y al menos una región del marco estructural (FR) mientras se construye una población de ácidos nucleicos que codifican regiones variables alteradas de cadenas pesadas, que comprenden: a) proporcionar una representación de la primera y segunda secuencia de aminoácidos de referencia, comprendiendo la primera secuencia de aminoácidos de referencia la secuencia de una región variable donadora de cadena pesada, comprendiendo la región variable donadora i) cuatro regiones del marco estructural y ii) tres regiones determinantes de complementariedad según se definen por medio de las definiciones de Kabat y de Chothia combinadas; comprendiendo la segunda secuencia de referencia la secuencia de una región variable aceptora de cadena pesada que comprende cuatro regiones del marco estructural, según se definen por medio de las definiciones de Kabat y de Chothia combinadas; b) sintetizar i) para cada región del marco estructural a modificar, una población de oligonucleótidos, que codifican cada una región del marco estructural modificada, o una de sus porciones, conteniendo la región del marco estructural modificada, o una de sus porciones, una pluralidad de aminoácidos cambiados en una o más posiciones cuando se comparan con la región del marco estructural correspondiente en la secuencia de referencia de la región variable de cadenas pesadas aceptora, en los que las posiciones de la región del marco estructural que están cambiadas se seleccionan entre las posiciones del marco estructural aceptor de la segunda secuencia de referencia que difieren en la posición correspondiente comparadas con las posiciones de la región del marco estructural donador de la primera secuencia de referencia; y ii) para cada región determinante de complementariedad a modificar, una población de oligonucleótidos, que codifican cada una, una región determinante de complementariedad modificada, o una de sus porciones, en los que la región determinante de complementariedad modificada comprende un aminoácido diferente en una o más posiciones cuando se compara con la secuencia de referencia de aminoácidos de la región determinante de complementariedad donadora correspondiente; y iii) para cada una de cualquiera de las regiones del marco estructural restantes y no modificadas, oligonucleótidos que codifican la región del marco estructural, o una de sus porciones, que tienen la misma secuencia que la región del marco estructural correspondiente de la segunda secuencia aceptora de referencia; y iv) para cada una de cualquiera de las regiones determinantes de complementariedad restantes y no modificadas, oligonucleótidos que codifican la región determinante de complementariedad, o una de sus porciones, que tiene la misma secuencia que la región determinante de complementariedad correspondiente de la primera secuencia donadora de referencia, en los que, los oligonucleótidos individuales desde i) hasta iv) que codifican porciones adyacentes de la región variable de cadenas pesadas tienen secuencias superpuestas en sus extremos; y c) mezclar los oligonucleótidos y las poblaciones de oligonucleótidos sintetizadas en la etapa b) bajo condiciones tales que las secuencias superpuestas de oligonucleótidos individuales hibriden para crear oligonucleótidos superpuestos; y d) tratar los oligonucleótidos superpuestos bajo condiciones tales que se forme una población de nucleótidos que codifican regiones variables de cadenas pesadas alteradas. En ciertas formas de realización, la representación de la primera y segunda secuencia de referencia está en forma electrónica. En otras formas de realización, la región del marco estructural a modificar se selecciona del grupo constituido por HFR1, HFR2 y HFR3. En otras formas de realización, la región determinante de complementariedad a modificar es HCDR3. En otras formas de realización, el procedimiento comprende además la etapa de (e) coexpresar la población de ácidos nucleicos que codifican regiones variables de cadenas pesadas con un ácido nucleico que codifica regiones variables de cadenas ligeras para producir una población diversa de regiones variables heteroméricas alteradas. En diferentes formas de realización, el procedimiento comprende además la etapa de (e) coexpresar la población de ácidos nucleicos que codifican regiones variables de cadenas pesadas con una población de ácidos nucleicos que codifican regiones variables de cadenas ligeras para producir una población diversa de regiones variables heteroméricas alteradas.

En otras formas de realización, se utilizan los procedimientos para modificar simultáneamente al menos una región determinante de complementariedad (CDR) y al menos una región del marco estructural (FR) mientras se construye una población de ácidos nucleicos que codifican regiones variables alteradas de cadenas ligeras, en los que dichos procedimientos comprenden: a) proporcionar una representación de la primera y segunda secuencia de aminoácidos de referencia, comprendiendo la primera secuencia de aminoácidos de referencia la secuencia de una región variable donadora de cadena ligera, comprendiendo la región variable donadora i) cuatro regiones del marco estructural y ii) tres regiones determinantes de complementariedad según se definen por medio de las definiciones de Kabat y de Chothia combinadas; comprendiendo la segunda secuencia de referencia la secuencia de una región variable aceptora de cadena ligera que comprende cuatro regiones del marco estructural, según se definen por medio de las definiciones de Kabat y de Chothia combinadas; b) sintetizar i) para cada región del marco estructural a modificar, una población de oligonucleótidos, que codifican cada una región del marco estructural modificada, o una de sus porciones, conteniendo la región del marco estructural modificada, o una de sus porciones, una pluralidad de aminoácidos cambiados en una o más posiciones cuando se comparan con la región del marco estructural correspondiente en la secuencia de referencia de la región variable de cadenas ligeras aceptora, en los que las posiciones de la región del marco estructural que están cambiadas se seleccionan entre las posiciones del marco estructural aceptor de la segunda secuencia de referencia que difieren en la posición correspondiente comparadas con las posiciones de la región del marco estructural donador de la primera secuencia de referencia; y ii) para cada región determinante de complementariedad a modificar, una población de oligonucleótidos, que codifican cada una, una región determinante de complementariedad modificada, o una de sus porciones, en los que la región determinante de complementariedad modificada comprende un aminoácido diferente en una o más posiciones cuando se compara con la secuencia de referencia de aminoácidos de la región determinante de complementariedad donadora correspondiente; y iii) para cada una de cualquiera de las regiones del marco estructural restantes y no modificadas, oligonucleótidos que codifican la región del marco estructural, o una de sus porciones, que tienen la misma secuencia que la región del marco estructural correspondiente de la segunda secuencia aceptora de referencia; y iv) para cada una de cualquiera de las regiones determinantes de complementariedad restantes y no modificadas, oligonucleótidos que codifican la región determinante de complementariedad, o una de sus porciones, que tiene la misma secuencia que la región determinante de complementariedad correspondiente de la primera secuencia donadora de referencia, en los que, los oligonucleótidos individuales desde i) hasta iv) que codifican porciones adyacentes de la región variable de cadenas ligeras tienen secuencias superpuestas en sus extremos; y c) mezclar los oligonucleótidos y las poblaciones de oligonucleótidos sintetizadas en la etapa b) bajo condiciones tales que las secuencias superpuestas de oligonucleótidos individuales hibriden para crear oligonucleótidos superpuestos; y d) tratar los oligonucleótidos superpuestos bajo condiciones tales que se forme una población de nucleótidos que codifican regiones variables de cadenas ligeras alteradas. En ciertas formas de realización, los procedimientos comprenden además la etapa de e) coexpresar la población de ácidos nucleicos que codifican regiones variables de cadenas ligeras con una población de ácidos nucleicos que codifican regiones variables de cadenas pesadas para producir una población diversa de regiones variables heteroméricas alteradas.

(v) Anticuerpos multiespecíficos

La presente invención proporciona anticuerpos multiespecíficos que comprenden una región Fc variante. Los anticuerpos multiespecíficos tienen especificidades de unión para al menos dos antígenos diferentes. Aunque tales moléculas normalmente sólo se unirán a dos antígenos (es decir, anticuerpos biespecíficos, BsAbs), los anticuerpos con especificidades adicionales tales como los anticuerpos triespecíficos están abarcados por esta expresión cuando se usa en el presente documento. Los ejemplos de BsAbs incluyen, pero no se limitan a, aquellos con un brazo dirigido contra un antígeno de una célula tumoral y el otro brazo dirigido contra una molécula que provoca la citotoxicidad, tal como anti-Fc\gammaRI/anti-CD15, anti-p185HER2/Fc\gammaRIII (CD16), anti-CD3/anti-célula B maligna (1D10), anti-CD3/anti-p185HER2, anti-CD3/anti-p97, anti-CD3/anti-carcinoma de células renales, anti-CD3/anti-OVCAR-3, anti-CD3/L-D1 (anti-carcinoma de colon), anti-CD3/anti-análogo de la hormona estimulante de melanocitos, anti-receptor de EGF/anti-CD3, anti-CD3/anti-CAMA1, anti-CD3/anti-CD19, anti-CD3/MoV18, anti-molécula de adhesión celular neural (NCAM)/anti-CD3, anti-proteína de unión al folato (FBP)/anti-CD3, anti-antígeno asociado a carcinomas (AMOC-31)/anti-CD3; BsAbs con un brazo que se une específicamente a un antígeno tumoral y otro brazo que se une a una toxina tal como anti-saporina/anti-ld-1, antiCD22/anti-saporina, anti-CD7/anti-saporina, anti-CD38/anti-saporina, anti-CEA/anti-cadena A de la ricina, antiinterferón-a (IFN-a)/anti-idiotipo de hibridoma, anti-CEA/anti-alcaloide de la vinca; BsAbs para profármacos activados por enzima convertidora tales como anti-CD30/anti-fosfatasa alcalina (que cataliza la conversión del profármaco fosfato de mitomicina a alcohol de mitomicina); BsAbs que pueden usarse como agentes fibrinolíticos tal como anti-fibrina/anti-activador tisular del plasminógeno (tPA), anti-fibrina/anti-activador del plasminógeno de tipo urocinasa (uPA); BsAbs para dirigir inmunocomplejos a receptores de superficie celular tales como anti-lipoproteína de baja densidad (LDL)/anti-receptor de Fc (por ejemplo, Fc\gammaRI, Fc\gammaRII o Fc\gammaRIII); BsAbs para uso en la terapia de enfermedades infecciosas tal como anti-CD3/anti-virus herpes simplex (HSV), anti-receptor de células T:complejo CD3/anti-gripe, anti-Fc\gammaR/anti-HIV; BsAbs para la detección de tumores in vitro o in vivo tales como anti-CEA/anti-EOTUBE, anti-CEA/anti-DPTA, anti-p185HER2/anti-hapteno; BsAbs como adyuvantes de vacunas; y BsAbs como herramientas diagnósticas tales como anti-IgG de conejo/anti-ferritina, anti-peroxidasa de rábano picante (HRP)/anti-hormona, anti-somatostatina/anti-sustancia P, anti-HRP/anti-FITC, anti-CEA/anti-p-galactosidasa. Los ejemplos de anticuerpos triespecíficos incluyen, pero no se limitan a, anti-CD3/anti-CD4/anti-CD37, anti-CD3/anti-CD5/anti-CD37 y anti-CD3/anti-CD8/anti-CD37. Los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse como anticuerpos de longitud completa o como fragmentos de anticuerpos (por ejemplo anticuerpos biespecíficos
F(ab')2).

Los procedimientos para producir anticuerpos biespecíficos se conocen en la técnica. La producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud completa se basa en la coexpresión de dos pares cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, en los que las dos cadenas tienen especificidades diferentes (por ejemplo, Millstein y col., Nature, 305:537-539 (1983)). Debido a la mezcla aleatoria de las cadenas pesadas y ligeras de la inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas de anticuerpos diferentes, de las que solamente una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, puede realizarse por medio de etapas de cromatografía de afinidad. Se describen procedimientos similares en el documento WO 93/08829 y en Traunecker y col., EMBO J., 10:3655-3659 (1991).

En otro enfoque, se fusionan los dominios variables de anticuerpos con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) con las secuencias de los dominios constantes de inmunoglobulina. La fusión es de preferencia con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones de la bisagra, CH2 y CH3. Resulta de preferencia tener presente en al menos una de las fusiones la primera región constante de la cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para la unión de la cadena ligera. Los ADN que codifican las fusiones de la cadena pesada de la inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de la inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y se cotransfectan en un organismo huésped adecuado. Esto proporciona una gran flexibilidad al ajustar las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptido en las formas de realización cuando las proporciones desiguales de las tres cadenas polipeptídicas usadas en la construcción proporcionan los rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias codificadoras de dos o de las tres cadenas polipeptídicas en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas polipeptídicas en proporciones iguales da como resultado rendimientos elevados, o cuando las proporciones no son de interés particular. En una forma de realización de preferencia de este enfoque, los anticuerpos biespecíficos están compuestos de una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo, y un par cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo (véase, por ejemplo el Documento WO 94/04690). Según otro enfoque descrito en el Documento WO 96/27011, puede producirse la interface entre un par de moléculas de anticuerpos para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan del cultivo de células recombinantes. Los anticuerpos biespecíficos también incluyen anticuerpos entrecruzados o "heteroconjugados". Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado puede estar acoplado a la avidina y el otro a la biotina.

B. Moléculas de Inmunoadhesina

La presente invención también proporciona moléculas de inmunoadhesinas que comprenden una región Fc variante. Un tipo de diseño de inmunoadhesinas combina el/los dominio(s) de unión de la adhesina (por ejemplo el dominio extracelular (ECD) de un receptor) con la región Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina (por ejemplo, una región Fc variante). Normalmente, cuando se preparan las inmunoadhesinas de la presente invención, el ácido nucleico que codifica el dominio de unión de la adhesina se fusionará con el extremo C-terminal al ácido nucleico que codifica el extremo N-terminal de una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina, sin embargo también son posibles las fusiones N-terminales.

Típicamente, en tales fusiones el polipéptido quimérico codificado mantendrá al menos los dominios funcionalmente activos de la bisagra, CH2 y CH3 de la región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina. Las fusiones se producen también en el extremo C-terminal de la porción Fc de un dominio constante, o de forma inmediatamente N-terminal al CH1 de la cadena pesada o de la región correspondiente de la cadena ligera. El sitio exacto en el que se produce la fusión no es crítico; se conocen sitios particulares y pueden seleccionarse para optimizar la actividad biológica, la secreción o las características de unión de la inmunoadhesina.

En algunas formas de realización, la secuencia de adhesina se fusiona al extremo N-terminal de la región Fc variante de la inmunoglobulina G1. Es posible fusionar toda la región constante de la cadena pesada a la secuencia de adhesina. Sin embargo, en las formas de realización de preferencia, se usa en la fusión una secuencia que comienza en la región de la bisagra justo secuencia arriba del sitio de escisión con papaína que define químicamente el Fc de IgG (es decir, el residuo 216, tomando como primer residuo de la región constante de la cadena pesada el 114), o los sitios análogos de otras inmunoglobulinas. En ciertas formas de realización de preferencia, la secuencia de aminoácidos de la adhesina se fusiona a (a) la región de la bisagra y CH2 y CH3 o (b) los dominios CH1, bisagra, CH2 y CH3, de una cadena pesada de IgG. En algunas formas de realización, las inmunoadhesinas son biespecíficas.

Como alternativa, las secuencias de adhesina pueden insertarse entre las secuencias de la cadena pesada y de la cadena ligera de la inmunoglobulina, tal que se obtiene una inmunoglobulina que comprende una cadena pesada quimérica. En tal forma de realización, las secuencias de adhesina pueden fusionarse al extremo 3' de una cadena pesada de inmunoglobulina en cada brazo de una inmunoglobulina, ya sea entre la bisagra y el dominio CH2, o entre los dominios CH2 y CH3 (véase, por ejemplo, Hoogenboom, y col., Mol. Immunol. 28:1027-1037 (1991)).

Aunque la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina no es necesaria en las inmunoadhesinas de la presente invención, podría haber presente una cadena ligera de inmunoglobulina asociada de manera covalente al polipéptido de fusión adhesina-cadena pesada de inmunoglobulina, o fusionada directamente a la adhesina. En el primer caso, el ADN que codifica una cadena ligera de inmunoglobulina se coexpresa típicamente con el ADN que codifica la proteína de fusión adhesina-cadena pesada de inmunoglobulina. Tras la secreción, la cadena pesada híbrida y la cadena ligera estarán asociadas de forma covalente para proporcionar una estructura similar a inmunoglobulina que comprende dos pares cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina unidas por enlaces disulfuros. Los procedimientos adecuados para la preparación de tales estructuras se desvelan, por ejemplo, en la patente de EE.UU. Nº 4.816.567.

En formas de realización de preferencia, las inmunoadhesinas se construyen fusionando en el marco de lectura la secuencia de ADNc que codifica la porción de adhesina a una secuencia de ADNc de inmunoglobulina. Sin embargo, puede usarse también la fusión a fragmentos genómicos de inmunoglobulina. Generalmente, el último tipo de fusión requiere la presencia de secuencias reguladoras de Ig para la expresión. Los ADNc que codifican las regiones constantes de la cadena pesada de IgG pueden aislarse basándose en las secuencias publicadas de las bibliotecas de ADNc derivadas de linfocitos de bazo o de sangre periférica, mediante técnicas de hibridación o mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los ADNc que codifican las partes de "adhesina" y de inmunoglobulina de la inmunoadhesina se insertan en tándem en un vector plasmídico que dirige la expresión eficaz en las células huésped elegidas.

VI. Secuencias nucleicas que codifican variantes de la región Fc

La presente invención también proporciona secuencias de ácidos nucleicos que codifican variantes de la región Fc, así como composiciones, vectores y células huésped que comprenden secuencias de ácidos nucleicos que codifican variantes de la región Fc. La presente invención también proporciona procedimientos recombinantes para producir variantes de la región Fc.

Generalmente, para la producción recombinante de variantes, se aísla el ácido nucleico que codifica la variante y se inserta en un vector. Las células huésped pueden transfectarse con el vector, permitiendo de esta manera que se amplifique la secuencia del ácido nucleico, y/o que se produzca el péptido variante. Las secuencias de ácido nucleico que codifican las variantes del péptido de la presente invención pueden aislarse y secuenciarse usando procedimientos convencionales (por ejemplo usando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente al ácido nucleico que codifica la variante). Generalmente, la secuencia del ácido nucleico que codifica la variante está unida de manera operativa a otros elementos, tales como una secuencia señal (por ejemplo secuencia de señal secretora), un origen de replicación, al menos un gen marcador, un potenciador, un promotor, o un terminador de la transcripción. En ciertas formas de realización, las células huésped se transfectan de manera estable con el ácido nucleico que codifica la variante para generar una línea celular que expresa una variante particular. En formas de realización de preferencia, las variantes se expresan en células CHO, NSO, Sp2/0, PER.C6 o HEK293. Los procedimientos recombinantes se conocen bien en la técnica.

Las secuencias de ácido nucleico pueden mutarse tal que puedan producirse las regiones Fc variantes. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que codifica una región Fc original (por ejemplo SEC ID Nº: 32) puede mutarse de manera tal que cambie al menos un aminoácido cuando se exprese la secuencia del ácido nucleico. También, las secuencias del ácido nucleico que codifican al menos una porción de una región Fc original pueden mutarse para producir secuencias de aminoácidos que comprenden al menos una porción de una variante de la región Fc. Por ejemplo, puede mutarse SEC ID Nº: 32, tal que dé como resultado al menos una secuencia de aminoácidos (véase, por ejemplo, SEC ID Nº: 38, SEC ID Nº: 39, SEC ID Nº: 40, SEC ID Nº: 41, SEC ID Nº: 42, SEC ID Nº: 43, SEC ID Nº: 44, SEC ID Nº: 45, SEC ID Nº: 46, SEC ID Nº: 47, SEC ID Nº: 48, SEC ID Nº: 49, SEC ID Nº: 50, SEC ID Nº: 51, SEC ID Nº: 52, SEC ID Nº: 53, SEC ID Nº: 54, SEC ID Nº: 55, y SEC ID Nº: 56).

En ciertas formas de realización, se utiliza la síntesis basada en codones para generar secuencias mutadas. Los ejemplos de síntesis basada en codones incluyen, por ejemplo, los descritos en las Patentes de EEUU Nº 5.264.563. 5.523.388 y 5.808.022. Brevemente, la síntesis basada en codones puede llevarse a cabo acoplando secuencialmente los monómeros en soportes separados para formar al menos dos tripletes diferentes. El acoplamiento puede llevarse a cabo en recipientes de reacción separados, mezclando a continuación los soportes de los recipientes de reacción, y separando los soportes mezclados en dos o más recipientes de reacción separados, y repitiendo las etapas de acoplamiento, mezclado y separación una o más veces en los recipientes de reacción, finalizando con una etapa de mezclado o separación. Además, los oligonucleótidos pueden escindirse de los soportes.

VII. Usos terapéuticos y formulaciones

En algunas formas de realización, la presente invención proporciona las formulaciones terapéuticas que comprenden las variantes descritas en el presente documento. No es la intención que la presente invención esté limitada por la naturaleza particular de la composición terapéutica. Por ejemplo, tales composiciones pueden incluir una variante de polipéptido (o una de su porciones), proporcionada junto con líquidos, geles, vehículos sólidos, diluyentes, adyuvantes y excipientes fisiológicamente tolerables, y combinaciones de los mismos (Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences 16ª edition, Osol, A. Ed. (1980).

Además, las variantes de polipéptido pueden usarse junto con otros agentes terapéuticos, incluidos, pero no limitados a, salicilatos, esteroides, inmunosupresores, anticuerpos o antibióticos. Los agentes terapéuticos particulares que pueden usarse con las variantes de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, los siguientes agentes: compuestos de azobenceno (Patente de EEUU Nº 4.312.806), derivados de rodamina sustituidos con bencilo (Patente de EEUU Nº 5.216.002), sales de cinc de L-carnosina (Patente de EEUU Nº 5.238.931), 3-fenil-5-carboxipirazoles e isotiazoles (Patente de EEUU Nº 5.294.630), IL-10 (Patente de EEUU Nº 5.368.854), inhibidores de la síntesis de quinolina leucotrienos (Patente de EEUU Nº 5.391.555), 2'-halo-2'desoxiadenosina (Patente de EEUU Nº 5.506.213), compuestos de fenol y benzamida (Patente de EEUU Nº 5.552.439), tributirina (Patente de EEUU Nº 5.569.680), ciertos péptidos (Patente de EEUU Nº 5.756.449), ácidos omega-3 poliinsaturados (Patente de EEUU Nº 5.792.795), bloqueadores de VLA-4 (Patente de EEUU Nº 5.932.214), metasulfobenzoato de prednisolona (Patente de EEUU Nº 5.834.021), agentes de retención de citocinas (Patente de EEUU Nº 5.888.969) y nicotina (Patente de EEUU Nº 5.889.028).

Las variantes de polipéptido pueden usarse junto con agentes que reducen la viabilidad o el potencial proliferativo de una célula. Los agentes que reducen la viabilidad o el potencial proliferativo de una célula pueden actuar en una variedad de formas incluidas, por ejemplo, la inhibición de la síntesis del ADN, la inhibición de la división celular, la inducción de la apoptosis, o la inducción de la muerte celular no apoptótica. Los ejemplos específicos de agentes citotóxicos y citostáticos, incluyen, pero no se limitan a, la proteína antiviral del Pokeweed, abrina, ricina, y cada una de sus cadenas A, doxorrubicina, cisplastino, yodo-131, itrio-90, renio-188, bismuto-212, taxol, 5-fluorouracilo VP-16, bleomicina, metotrexato, vindesina, adriamicina, vincristina, vinblastina, BCNU, mitomicina y ciclofosfamida y ciertas citocinas tales como TNF-\alpha y TNF-\beta. Por consiguiente, los agentes citotóxicos o citoestáticos pueden incluir, por ejemplo, radionucleidos, fármacos quimioterapéuticos, proteínas y lectinas.

Las composiciones terapéuticas pueden contener, por ejemplo, aditivos normalmente utilizados tales como ligantes, cargas, vehículos, conservantes, agentes estabilizadores, emulsivos, tampones y excipientes como, por ejemplo, manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, de calidad farmacéutica, y similares. Estas composiciones contienen típicamente 1%-95% del componente activo, de preferencia 2%-70% del componente activo.

Las variantes de polipéptido de la presente invención pueden también mezclarse con diluyentes o excipientes que son compatibles y fisiológicamente tolerables. Los diluyentes y excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, disolución salina, dextrosa, glicerol, y similares, y sus combinaciones. Además, si se desea, las composiciones pueden contener cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsivos, estabilizadores o agentes tamponadores del pH.

En algunas formas de realización, las composiciones terapéuticas de la presente invención se preparan como disoluciones líquidas o suspensiones, como vaporizaciones, o en formas sólidas. Las formulaciones orales incluyen usualmente aditivos usados normalmente tales como ligantes, cargas, vehículos, conservantes, estabilizadores, emulsivos, tampones y excipientes como, por ejemplo, manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, de calidad farmacéutica, y similares. Estas composiciones toman la forma de disoluciones, suspensiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida, o polvos y contienen típicamente 1%-95% del componente activo, de preferencia 2%-70%.Un ejemplo de una composición oral útil para administrar las composiciones terapéuticas de la presente invención se describe en la Patente de EEUU Nº 5.643.602.

Otras formulaciones que son adecuadas para otras formas de administración, tales como la administración tópica, incluyen pomadas, tinturas, cremas, lociones, parches transdérmicos, y supositorios. Para las pomadas y las cremas, los ligantes, vehículos y excipientes tradicionales incluyen, por ejemplo, polietilenglicoles o triglicéridos. Un ejemplo de un procedimiento de administración tópica se describe en la Patente de EEUU Nº 5.834.016. Pueden utilizarse también otros procedimientos de administración por medio de liposomas (Véase, por ejemplo, Patentes de EEUU Nº 5.851.548 y 5.711.964).

Las formulaciones pueden también contener más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular a tratar, de preferencia aquellos con actividades complementarias que no tienen efecto adverso uno con otro. Tales moléculas están presentes de manera adecuada en la combinación en cantidades que son eficaces para el fin destinado.

También pueden prepararse preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos de preparaciones de liberación sostenida adecuados incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen la variante de polipéptido, cuyas matrices están en la forma de artículos de diferente formato, por ejemplo, películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida, incluyen, pero no se limitan a, poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (2-hidroxietilmetacrilato), o poli (vinilalcohol)), polilactidas, copolímeros de ácido L-glutámico y \gamma etil-L-glutamato, copolímeros de etileno-acetato de vinilo no degradables, de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como LUPRON DEPOT (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida), y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Mientras que los polímeros tales como etileno-acetato de vinilo y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante períodos de tiempo más cortos.

Las variantes de polipéptido de la presente invención pueden usarse para tratar un sujeto. Tal tratamiento puede administrarse a un sujeto con una enfermedad, o puede administrarse de manera profiláctica a un sujeto (por ejemplo a un sujeto con predisposición a una enfermedad). Los ejemplos de afecciones que pueden tratarse incluyen, pero no se limitan a, cáncer (por ejemplo donde la variante de polipéptido se une al receptor HER2, CD20 o al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF)); afecciones alérgicas tales como el asma (con un anticuerpo anti-IgE); y trastornos mediados por LFA-1 (por ejemplo donde la variante de polipéptido es un anticuerpo anti-LFA-1 o anti-ICAM-1), etc.

En formas de realización de preferencia, las variantes usadas para tratar sujetos comprenden anticuerpos o inmunoadhesinas. También en formas de realización de preferencia, las enfermedades tratadas son enfermedades sensibles a anticuerpos o inmunoadhesinas. Los ejemplos de enfermedades sensibles a anticuerpos incluyen las enfermedades y afecciones médicas tales como: linfoma (que se mostró que es tratable con RITUXAN, un anticuerpo anti-CD20), enfermedades infecciosas (que se mostró que son tratables con SYNAGIS, un anticuerpo dirigido contra la proteína F del virus sincitial respiratorio); transplante renal (ZENAPAX, un anticuerpo anti receptor de IL-2, ha mostrado ser útil), enfermedad de Crohn y artritis reumatoide (que se mostró que son tratables con REMICADE, un anticuerpo anti-TNF alfa), carcinoma de mama (que se mostró que es tratable con HERCEPTIN, un anticuerpo anti-HER2) y cáncer del colon (que se mostró que es tratable con EDRECOLOMAB, un anticuerpo de anti-17-1A).

En algunas formas de realización, se utiliza una variante de polipéptido con actividad de ADCC mejorada (por ejemplo el P247L) en el tratamiento de enfermedades o trastornos donde se deseada la destrucción o eliminación de tejido de microorganismos extraños. Por ejemplo, la variante puede usarse para tratar el cáncer; trastornos inflamatorios; infecciones (por ejemplo infecciones bacterianas, virales, fúngicas o por levaduras); y otras condiciones (tales como el bocio) en los que se desea la eliminación de tejidos. En otras formas de realización, la variante de polipéptido tiene actividad de ADCC disminuida (por ejemplo la variante 1332R o 1332K). Tales variantes pueden usarse para tratar enfermedades o trastornos donde se desea un polipéptido que contiene región Fc con semivida prolongada, pero el polipéptido de preferencia no tiene funciones efectoras indeseables. Por ejemplo, el polipéptido que contiene región Fc puede ser un anticuerpo anti-factor tisular (TF); un anticuerpo anti-IgE; y un anticuerpo anti-integrina (por ejemplo un anticuerpo anti-\alpha4\beta7). El mecanismo de acción deseado de tales polipéptidos que contienen región Fc puede ser el bloqueo de pares de unión ligando-receptor. Además, el polipéptido que contiene región Fc con actividad de ADCC disminuida puede ser un anticuerpo agonista.

Las variantes de polipéptido de la presente invención pueden administrarse por cualquier medio adecuado, incluidas la administración parenteral, subcutánea, tópica, intraperitoneal, intrapulmonar e intranasal, y, la administración intralesión (por ejemplo para el tratamiento inmunosupresor local). Las infusiones parenterales incluyen la administración intramuscular, intravenosa, intrarterial, intraperitoneal, o subcutánea. Además, la variante de polipéptido se administrada de manera adecuada por medio de infusión pulsada, en particular con dosis decrecientes de la variante de polipéptido. De preferencia, la dosificación se administra por medio de inyecciones, de más preferencia inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica.

Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la dosificación adecuada de la variante de polipéptido dependerá del tipo de enfermedad a tratar, de la gravedad y el curso de la enfermedad, de si la variante de polipéptido se administra con fines preventivos o terapéuticos, de la terapia previa, de los antecedentes clínicos del paciente y de la respuesta a la variante de polipéptido, y según el criterio del médico actuante. La variante de polipéptido se administra de manera adecuada al paciente de una vez o durante una serie de tratamientos.

Por ejemplo, según el tipo y la gravedad de la enfermedad, aproximadamente 1 \mug/kg hasta 15 mg/kg (por ejemplo, 0,120 mg/kg) de la variante de polipéptido es una dosificación candidata inicial para la administración al paciente, ya sea, por ejemplo, por una o más administraciones separadas, o por infusión continua. Una dosis diaria típica variará desde aproximadamente 1 \mug/kg hasta 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para las administraciones repetidas durante varios días o más, según la afección, el tratamiento se mantiene hasta que los síntomas se reducen de manera suficiente o se eliminan. El progreso de esta terapia se controla fácilmente por medio de técnicas y ensayos convencionales, y puede usarse para ajustar la dosis para alcanzar un efecto terapéutico.

Una cantidad terapéuticamente eficaz de una variante de polipéptido a administrar es el nivel de dosificación requerido para un paciente tal que se reduzcan los síntomas de la enfermedad que se está tratando. La variante de polipéptido no necesariamente se formula, pero sí opcionalmente, con uno o más agentes actualmente usados para prevenir o tratar el trastorno en cuestión. La cantidad eficaz de tales otros agentes depende de la cantidad de variante de polipéptido presente en la formulación, del tipo de trastorno o tratamiento, y de otros distintos factores analizados anteriormente.

VIII. Otros usos de las regiones Fc variantes

Las variantes, y las secuencias de ácidos nucleicos que codifican variantes, de la presente invención pueden usarse de muchas formas. Por ejemplo, las variantes de la presente invención pueden usarse en ensayos de selección de fármacos. Por ejemplo, pueden evaluarse compuestos candidatos por su capacidad para alterar o interferir con las funciones efectoras de Fc poniendo en contacto una variante con el compuesto candidato y determinando la unión del compuesto candidato a la variante. La variante puede inmovilizarse usando procedimientos conocidos en la técnica tales como la unión de una proteína de fusión GST-variante a una perla polimérica que contiene glutatión. Se construye un gen quimérico que codifica una proteína de fusión de GST fusionando el ADN que codifica la variante de interés al ADN que codifica el extremo carboxilo terminal de GST (Véase por ejemplo, Smith y col., Gene 67: 31 [1988]). A continuación se transforma la construcción de fusión en un sistema de expresión adecuado (por ejemplo, E. coli XA90) en el que puede inducirse la expresión de la proteína de fusión de GST con isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG). La inducción con IPTG dará lugar a la proteína de fusión como el principal constituyente de las proteínas celulares, soluble. Las proteínas de fusión pueden purificarse por medio de procedimientos conocidos por los expertos en la técnica, incluida la purificación por medio de cromatografía de afinidad de glutatión. La unión del compuesto candidato a la variante se correlaciona con la capacidad del compuesto para interrumpir una o más funciones efectoras.

En otro procedimiento de selección, la variante o un FcR seleccionado se inmovilizan usando procedimientos conocidos en la técnica, tal como la adsorción sobre placas de microvaloración de plástico o la unión específica de una proteína de fusión de GST a una perla polimérica que contiene glutatión. Por ejemplo, se une GST-variante a perlas de glutatión-Sepharose. La variante inmovilizada se pone a continuación en contacto con un receptor de Fc y un compuesto candidato. A continuación se elimina el péptido no unido y se solubiliza el complejo y se analiza para determinar la cantidad de péptido marcado unido. Una disminución en la unión es una indicación de que el compuesto candidato inhibe la interacción de la variante con el receptor de Fc. Este procedimiento de selección es particularmente útil con variantes de la presente invención que muestran un nivel aumentado de unión al receptor de Fc (por ejemplo, mientras que muchos receptores de Fc originales son receptores de baja afinidad, tales como Fc\gammaRIII, Fc\gammaRIIb, y Fc\gammaRIIa). Una variación de este procedimiento permite seleccionar los compuestos que son capaces de interrumpir un complejo variante/receptor de Fc previamente formado. Por ejemplo, en algunas formas de realización se inmoviliza un complejo que comprende una variante unida a un receptor de Fc como se describe anteriormente y se pone en contacto con un compuesto candidato. La disolución del complejo por el compuesto candidato se correlaciona con la capacidad del compuesto para interrumpir o inhibir la interacción entre la variante que se está probando y el receptor de Fc. Al respecto, pueden identificarse compuestos (por ejemplo compuestos útiles para tratar enfermedades humanas, tales como enfermedades autoinmunes) con potencial terapéutico (por ejemplo en seres humanos).

Otra técnica para seleccionar fármacos proporciona una selección de alto rendimiento para compuestos que tienen afinidad de unión adecuada a péptidos variantes y está descrita en detalle en el Documento WO 84/03564. Brevemente, se sintetizan grandes cantidades de diferentes compuestos de prueba de péptidos pequeños en un substrato sólido, tales como alfileres plásticos o alguna otra superficie. Los compuestos peptídicos de prueba se hacen reaccionar a continuación con péptidos variantes y se lavan. Los péptidos variantes unidos se detectan a continuación por medio de procedimientos bien conocidos en la técnica.

Otra técnica utiliza anticuerpos dirigidos a péptidos variantes. Tales anticuerpos capaces de unirse específicamente a los péptidos variantes compiten con un compuesto de prueba por la unión a una variante dada. De esta manera, los anticuerpos pueden usarse para detectar la presencia de cualquier péptido que comparte uno o más determinantes antigénicos del péptido variante.

La presente invención contempla muchos otros medios para seleccionar compuestos. Los ejemplos proporcionados anteriormente se presentan solamente para ilustrar una variedad de técnicas disponibles. Un experto en la técnica apreciará que pueden usarse muchos otros procedimientos de selección.

En particular, la presente invención contempla el uso de líneas celulares transfectadas con ácido nucleico que codifica al menos una variante de la región Fc para seleccionar compuestos según la actividad, y en particular para seleccionar compuestos de bibliotecas combinatorias con alto rendimiento (por ejemplo, bibliotecas que contienen más de 10^{4} compuestos). Las líneas celulares de la presente invención pueden usarse en una variedad de procedimientos de selección.

Las variantes de la presente invención pueden utilizarse como un agente de purificación por afinidad. Por ejemplo, la variante puede inmovilizarse en una fase sólida tal como una resina Sephadex o un filtro de papel, usando procedimientos bien conocidos en la técnica. A continuación se pone en contacto la variante inmovilizada con una muestra que contiene el antígeno a purificar, y a partir de entonces se lava el soporte con un disolvente adecuado que eliminará sustancialmente todo el material en la muestra excepto el antígeno a purificar, que está unido a la variante de polipéptido inmovilizada. Finalmente, se lava el soporte con otro disolvente adecuado, tal como tampón de glicina, pH 5,0, que liberará el antígeno de la variante de polipéptido.

La variante de polipéptido puede también ser útil en ensayos de diagnóstico (por ejemplo, para detectar la expresión de un antígeno de interés en células específicas, tejidos o en suero). Para aplicaciones de diagnóstico, la variante se marcará típicamente con restos detectables (tales marcadores son también útiles en los ensayos de región Fc descritos anteriormente). Están disponibles numerosos marcadores, incluidos, pero no limitados a, radioisótopos (por ejemplo, ^{35}S, ^{14}C, ^{125}I, ^{3}H y ^{131}I), marcadores fluorescentes (por ejemplo quelatos de tierras raras (quelatos de europio) o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, Lissamine, ficoeritrina y rojo de Tejas), y diversos marcadores sustratos de enzimas (véase, por ejemplo, Patente de EEUU Nº 4.275.149, y luciferasa, luciferina, 2,3-dihidroftalazinedionas, malato deshidrogenasa, ureasa, peroxidasa tal como peroxidasa del rábano picante (HRPO), fosfatasa alcalina, \beta-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, oxidasas de sacáridos (por ejemplo, oxidasa de la glucosa, oxidasa de la galactosa, y deshidrogenasa de glucosa-6-fosfato), oxidasas heterocíclicas (tales como la uricasa y la oxidasa de xantina), lactoperoxidasa, microperoxidasa, y similares). Los ejemplos de las combinaciones de enzima-sustrato incluyen, por ejemplo: (i) peroxidasa de rábano picante (HRPO) con peroxidasa de hidrógeno como sustrato, en la que la peroxidasa de hidrógeno oxida un precursor de colorante (por ejemplo, diamina de ortofenileno (OPD) o clorhidrato de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB)); (ii) fosfatasa alcalina (AP) con para-Nitrofenil fosfato como sustrato cromogénico; y (iii) -D-galactosidasa (R-D-Gai) con un sustrato cromogénico o un substrato fluorogénico.

Las variantes de la presente invención pueden utilizarse también para ensayos de diagnóstico in vivo. Por ejemplo, se marca la variante de polipéptido con un radionucleido de manera que pueda localizarse el antígeno o las células que lo expresan usando inmunocentellografía.

Parte experimental

Los siguientes ejemplos se proporcionan para demostrar e ilustrar más ciertas formas de realización de preferencia y aspectos de la presente invención y no deben considerarse limitantes de su ámbito.

En la divulgación experimental siguiente, se aplican las siguientes abreviaturas: N (normal); M (molar); mM (milimolar); \muM (micromolar); mol (moles); mmol (milimoles); \mumol (micromoles); mnol (nanomoles); pmol (picomoles); g (gramos); mg (miligramos); \mug (microgramos); ng (nanogramos); l o L (litros); ml (mililitros); \mul (microlitros); cm (centímetros); milímetro (milímetros); \mum (micrometros); nm (nanometros); DS (sulfato de dextrano); y C (grados centígrados).

Ejemplo 1 Selección de variantes en ensayos de ADCC

Este ejemplo describe cómo se seleccionaron las variantes en un ensayo de ADCC. Todas las variantes seleccionadas fueron anticuerpos anti-CD20 (basado en la especificidad de la región variable).

i. Aislamiento de PBMC (células mononucleares de sangre periférica)

Se obtienen aproximadamente 50 ml de sangre periférica de un donador sano y se diluyen 1:2 con solución salina tamponada de fosfato (PBS), pH 7,0. Se mezclan las disoluciones agitando suavemente el tubo. Se forma cuidadosamente una capa con aproximadamente 12 ml de Histopaque-1077 (Sigma número de catálogo 1077-1) por debajo de la muestra de sangre diluida seguido por la centrifugación en una centrífuga Sorvall RT6000B con rotor basculante a 1000 rpm durante 10 minutos con el freno desconectado. Se elimina la fase superior del gradiente por aspiración y la interfase de color blanco, que contiene las PBMC, se recoge y se lava 3 veces con disolución salina equilibrada de Hanks (Gibco número de catálogo 14025-092). Se suspende el sedimento celular lavado en aproximadamente 20 ml de medio RPMI 1640 que contiene suero fetal de ternera al 10% (FBS) (Omega Scientific número de catálogo FB-01). Las PBMC resuspendidas se separan en dos matraces de cultivo T-175, y se añaden 30 ml de RPMI que contiene el FBS al 10% a cada uno seguido por la incubación durante la noche en una incubadora a 37ºC y CO_{2} al 5%. Al día siguiente se recogen las PBMC no adheridas en tubos Falcón de 50 ml, se centrifuga como anteriormente y se resuspende en RPMI que contiene FBS al 1% sin rojo de fenol. Se diluye una pequeña porción de las células resuspendidas diez veces y se cuentan utilizando un hemocitómetro. Las PBMC restantes se colocan en la incubadora hasta que es necesario.

ii. Línea celular diana (estas son específicas para ensayos de ADCC con anti-CD20)

Se obtuvieron las líneas de células B que expresan CD20, Wil.2 y SKW6.4 de la ATCC y se cultivaron según las recomendaciones. Un día antes del uso, las células se dividieron dos veces. Al día siguiente se ajusta el número de células hasta 4 x 10^{5} células/ml y se añaden alícuotas de 50 \mul (20.000 células/pocillo) a una placa de cultivo tisular de 96 pocillos.

iii. Diluciones de IgG

Antes de la selección, las variantes de IgG se expresan y cuantifican usando un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) convencional. Para la selección de ADCC primaria de único punto se diluyen las variantes de IgG hasta 40 ng/ml en el medio RPMI que contiene FBS al 1% sin rojo de fenol. La concentración final de IgG en el ensayo se diluirá 4 veces (es decir 10 ng/ml de concentración final). Se añaden alícuotas de cincuenta microlitros de IgG a las células diana y se incuba durante aproximadamente 15 minutos a 37ºC antes de añadir las células efectoras a las células diana opsonizadas.

Cuando se realizan las valoraciones de IgG, la concentración de IgG se varía en el intervalo entre aproximadamente 0,0001 y 1 \mug/ml. Se preparan diluciones de IgG usando una placa de microvaloración de 96 pocillos diluyendo las muestras en RPMI que contiene FBS al 1% sin rojo de fenol. A continuación se añaden las muestras de IgG diluidas a la placa de ensayo que contiene las células diana.

iv. Células efectoras

La concentración de las PBMC se ajusta para que la proporción de efector a diana esté en el intervalo de 10-20:1 (es decir 2-4 x 10^{6} células/ml). Se añaden cien microlitros de las PBMC resuspendidas a cada pocillo de las células diana opsonizadas. Las placas se incuban a 37ºC en presencia de CO_{2} al 5% durante 3-4 horas.

v. Detección de la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH)

La lisis de células diana se mide detectando la liberación de la enzima lactato deshidrogenasa desde el citoplasma de las células dañadas hacia el sobrenadante del cultivo. Tras la incubación de las células diana opsonizadas con las células efectoras, se centrifugan las placas de ensayo a 2000 rpm durante 5 minutos. Se retiran cuidadosamente aproximadamente de 75 \mul del sobrenadante del cultivo celular evitando las células y los detritos sedimentados. Este sobrenadante se añade directamente a una placa de microvaloración y a esta se le añaden 75 \mul de reactivo de detección del de LDH (Roche número de catálogo 1 644 793). A continuación se incuba la placa durante aproximadamente 15-30 minutos y se lee la absorbancia a 490 nm usando un lector de microplacas Molecular Devices Vmax Kinetic.

vi. Análisis de los datos

Todos los ensayos de selección de ADCC de punto único se analizan por duplicado. Cada placa de ensayo contiene controles para la lisis espontánea de la diana, efector espontáneo más lisis de la diana en ausencia de IgG y lisis total de células diana. La lisis total de células diana se consigue por medio de la adición de Tritón X-100 al 1% a las células diana. En cada placa se incluyen tres controles de tipo natural y se promedian las señales del ensayo de ADCC. El valor de fondo, obtenido de los controles de lisis espontánea, se resta de cada muestra. El valor de fondo, obtenido de la IgG diluida, se resta de cada muestra. Los datos se convierten de valores de absorbancia a porcentaje de lisis específica basándose en los controles de lisis espontánea y total. El porcentaje de lisis específica se calcula a partir de la siguiente ecuación: porcentaje de lisis específica = (A490 experimental-A490 del fondo)/(A490 máxima-A490 del fondo) X 100, donde A490 del fondo es la suma de la A490 obtenida del efector y de las células diana en ausencia de IgG y el fondo de IgG por LDH contaminante en los sobrenadantes de IgG brutos. El porcentaje de actividad de la variante de Fc se normaliza con relación a los controles de tipo natural promediados. Se promedia el porcentaje de actividad normalizada para placas de ensayo por duplicado y se calcula la desviación estándar entre placas de ensayo individuales para cada muestra.

vii. Resultados

En la Tabla 2 se muestra la actividad relativa específica de ADCC. Los valores de CDC informados en esta tabla se generaron como se describe en el Ejemplo 4 y los valores del ensayo de unión de FcRn en esta tabla se generaron como se describe en el Ejemplo 5.

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TABLA 2

3

TABLA 2 (continuación)

4

En este experimento, se opsonizaron las células SKW6.4 usando variantes de la región Fc de IgG de aminoácido único y de doble aminoácido seguido por la adición de PBMC en una relación de 15:1. La placa de ensayo se incubó a 37ºC en presencia de CO_{2} al 5% durante 3 horas, seguido por centrifugación. Se recogió una porción del sobrenadante y se transfirió a una placa de microvaloración y se detectó la actividad de LDH en el sobrenadante por medio de la adición de un volumen igual de sustrato de LDH. Tras el desarrollo del color se leyó la absorbancia a 490 nm. Se midió el fondo debido a la LDH contaminante en los sobrenadantes de IgG brutos y se restaron estos valores de fondo de los datos de A490 sin tratar. Estos datos revelan que comparado con el anticuerpo anti-CD20 de tipo natural, la actividad de ADCC de las variantes de aminoácido único A330K, A330R e I332E está aumentada. La combinación de A330K o A330R con la variante I332E mejora más la actividad de ADCC. Una IgG no específica no muestra actividad bajo estas condiciones de ensayo. La actividad de la variante I332 puede aumentarse más con glicosilación alterada (aumentando el contenido del perfil de GlcNAc, por ejemplo).

Los datos de ADCC representativos se obtuvieron usando IgG purificada. La representación gráfica mostró el porcentaje de citotoxicidad frente a la concentración de IgG para una IgG no específica, anti-CD20 de tipo natural y las variantes de la región Fc I332D e I332E.

El porcentaje de citotoxicidad se calculó basándose en la siguiente ecuación: citotoxicidad % = (A490 experimental-A490 del fondo)/(A490 máxima-A490 del fondo) X 100, donde A490 del fondo se obtiene del efector y de las células diana en ausencia de IgG. Los datos muestran que la actividad de ADCC de las variantes I332D e I332E está aumentada comparada con el tipo natural. Las células diana usadas en este experimento fueron SKW6.4 y se usó una relación de efector a diana de 15:1 en un ensayo de ADCC convencional de 3 horas.

La actividad de ADCC con esta especificidad particular de anti-CD20 y las líneas celulares Wil-2 y SKW6.4 es independiente de la afinidad de la región variable.

La porción extracelular del receptor RI de Fc gamma humano (CD64) con una etiqueta 6-his en el extremo C terminal añadida en lugar del dominio transmembranario putativo se expresó en células de HEK-293A y se purificó usando una columna de Ni. El receptor se recubrió durante la noche a 4ºC en una placa de ELISA y posteriormente se bloqueó la placa usando Superblock. Tras bloquear y lavar, se prepararon diluciones de IgG y se añadieron a la placa recubierta con el receptor seguido por la incubación a 37ºC durante 2 horas. La IgG no unida se eliminó por medio de lavado y el anticuerpo unido se detectó usando una dilución 1:1000 de un anticuerpo secundario anti-kappa humana conjugado con fosfatasa alcalina. Tras el lavado se detectó la IgG unida por adición del substrato de fosfatasa (monofosfato de fenolftaleína (PPMP) (JBL Scientific) con la absorbancia determinada colorimétricamente a 560 nm con un lector de microplacas VMAX (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Los datos se grafican como logaritmo de la concentración de IgG frente a absorbancia.

Ejemplo 2 Selección de variantes para depleción de células B en el ensayo de sangre entera

Este ejemplo describe la selección de variantes para depleción de células B en un ensayo de sangre entera.

i. Genotipado de Fc\gammaRIIA

Se aisló ADN genómico de muestras de sangre periférica usando el kit QiaAmp (Qiagen, número de catálogo 51104). Se amplificó Fc\gammaRIIA por medio de PCR usando los cebadores (5' GGAAAATCCCAGAAATTCTCGC 3'-SEC ID Nº: 61) y (5' CAACAGCCTGAC TACCTATTACGCGGG 3'-SEC ID Nº: 62). Los productos de la PCR se purificaron usando un kit de purificación de PCR MinElute (Qiagen, número de catálogo 28006) y se digirieron con la enzima de restricción, BstUI, a 60ºC durante 12 horas. Las muestras digeridas se analizaron en geles de agarosa al 3%. Todos los productos de PCR se cortan en un sitio interno de BstUI independiente del genotipo H o R. Los productos que poseen el alelo R se cortan en un sitio de BstUI adicional. Esto da como resultado la identificación del genotipo H/H por un fragmento de 337 pb, siendo identificado H/R por dos fragmentos de 337 pb y 316 pb y R/R identificado por un fragmento de 316 pb.

ii. Genotipado de Fc\gammaRIIIA

Se aisló ADN genómico de muestras de sangre periférica usando el kit QiaAmp (Qiagen, número de catálogo 51104). Se amplificó Fc\gammaRIIIA a partir del ADN genómico por medio de PCR usando los cebadores (5' ATATT
TACAGAATGGCA 3'-SEC ID Nº: 63) y (5' GGTGATGTTCACAGTCTCTGAAGACACATTTTTACTGTCAA 3'-SEC ID Nº: 64). Los productos de la PCR se purificaron usando un kit de purificación de PCR MinElute (Qiagen, número de catálogo 28006) y se digirieron con la enzima de restricción, HincII, a 37ºC durante 16 horas. Las muestras digeridas se analizaron en geles de agarosa NuSieve al 3%. HincII corta el alelo V pero no el alelo F. Por consiguiente F/F da un fragmento de 148 pb, F/V da tres fragmentos de 148, 109 y 39 pb y V/V da dos fragmentos de 109 y 39 pb.

iii. Ensayo de depleción de células B (usando sangre entera)

Se extrajo sangre periférica heparinizada de voluntarios sanos. La sangre se mezcló con la variante, Rituxan o una IgG no específica (control negativo) diluidos en tampón FACS (disolución salina tamponada de fosfato más suero fetal de ternera al 2%). Los tubos se incubaron durante cuatro horas a 37ºC y a continuación se tiñeron con fluoresceína-anti-CD45 (para identificar leucocitos) (BD, número de catálogo 555482) y ficoeritrina-anti-CD19 (para identificar células B) (BD, número de catálogo 555413) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los glóbulos rojos se lisaron por la adición de BD PharmLyse, (BD, número de catálogo 555899), se lavaron las muestras y se resuspendieron en tampón FACS para el análisis en un citómetro de flujo Becton Dickinson FACSort. Inmediatamente antes de análisis, se añadió yoduro de propidio (PI), concentración final 0,1 \mug/ml, a las muestras para discriminar entre células vivas y muertas. Los controles incluyeron células que se habían incubado con tampón de FACS solo, muestras no teñidas y muestras teñidas con un único color. Cada muestra se realizó por triplicado y se recogieron 10.000 acontecimientos negativos para PI dentro de la región de dispersión frontal/lateral (FSCSSC) de linfocitos. Los datos se analizaron usando el programa WinMDI. Para el análisis, se identificaron cinco linfocitos en base a las características de tinción positiva con CD45, negatividad para PI y FSC/SSC. En cada muestra se identificó el porcentaje de células CD 19+ con estas características. Los datos se expresaron como % de la media de células CD19+ más/menos 1 desviación estándar. Como alternativa, para facilitar la comparación entre donadores, los datos se expresaron como % de células CD19+ iniciales restantes es decir (linfocitos CD 19+ restantes tras el tratamiento %)/(linfocitos CD19+ en la muestra tratada con tampón FACS %) x 100.

Los datos de depleción de células B representativos demuestran que la variante I332E depleciona las células B con más potencia y en mayor medida que Rituxan en una muestra de sangre entera que contiene el genotipo VV (de la alta afinidad) del receptor Fc\gammaRIIIa.

Los datos de depleción de células B representativos demuestran que la variante I332E depleciona las células B con más potencia y en mayor medida que Rituxan en una muestra de sangre entera que contiene el genotipo FF (de la alta afinidad) del receptor Fc\gammaRIIIa. Se obtienen resultados similares cuando se realiza el ensayo con sangre entera que exhibe el genotipo VF (heterocigota) para el receptor de Fc\gammaRIIIa o con los genotipos HH, HR, o RR del receptor Fc\gammaRIIa (Tabla 3).

TABLA 3 Porcentaje de células B restantes en la depleción máxima

5

La figura 14 muestra los datos representativos de depleción de células B que demuestran que la variante A378D inesperadamente depleciona las células B de manera más potente y en mayor medida que las variantes con actividad igual o superior en los ensayos de ADCC y CDC in vitro.

Ejemplo 3 Determinación de la afinidad de la variante

Estos ejemplos describen cómo se determinó la afinidad (Kd) de la interacción entre Fc\gammaRIIa (genotipo FF) y Fc de tipo natural, u original, y la variante I332E.

i. Análisis de Kd de Fc\gammaRIIIa/IgG

El dominio extracelular soluble de Fc\gammaRIIla (158F) humano se expresó en células 293 y se purificó por unión a su etiqueta de 6 histidina fabricada en resina Ni-NTA.

Se acopló un tubo de perlas de azlactona (Sapidyne) con 1 mg de Fc\gammaRIII (158F) en tampón de bicarbonato de sodio de pH 9,3. La suspensión se centrifugó durante la noche a 4ºC, se lavó dos veces con PBS y se bloqueó usando tampón de bloqueo (tris 1M pH 7,4 + BSA al 1%) durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación se lavaron las perlas tres veces con PBS y se resuspendieron en 50 ml de PBS con azida al 0,01%. Se prepararon doce equilibradores, todos conteniendo IgG 7,5 nM y Fc\gammaRIII valorado desde 4 \muM hasta 1,95 nM en tampón de reacción (PBS pH 7,4, BSA al 0,1, azida al 01%) y se dejó equilibrar durante 16 horas a temperatura ambiente. Todos los experimentos se realizaron en tampón de reacción a temperatura ambiente con caudales de 0,5 ml/min. Tras empaquetar las perlas de Fc\gammaRIII en la celda de flujo del instrumento, se capturó IgG libre del primer equilibrador. A continuación se lavaron las perlas y se unieron. La IgG se detectó usando (Fab')2 anti-Fc humana de cabra conjugado a FITC (Jackson Immunochemicals). El proceso se repitió a continuación para los restantes 11 equilibradores y se determinó la Kd tras el análisis con el programa Kinexa Pro. Usando este enfoque, se determinó que la afinidad (Kd) de la interacción entre Fc\gammaRIIIa (genotipo FF) y Fc de tipo natural, u original era de 387 nM mientras que la afinidad de la variante I332E era de 52 nM. El anticuerpo glicosilado (GnTIII) exhibió una Kd de 83 NM mientras que una variante combinatoria (L256P, I332E) exhibió una Kd de 21 nM.

Ejemplo 4 Caracterización de la actividad de CDC de las variantes

Este ejemplo describe cómo se determinó la actividad de CDC de diversas variantes de la región Fc

i. Ensayo

Este ensayo se llevó a cabo usando complemento humano (Quidel Corp., número de catálogo A113) en células Ramos (RA Nº 1) (ATCC número de catálogo CRL-1596). Las células Ramos se cultivaron en medio RPMI1640 de Gibco que contenía FBS al 10%, a 37ºC y CO_{2} al 5%. El día antes del ensayo, se sembraron las células a razón de 1 x 10^{6} células en un matraz T175. Al día siguiente, se resuspendieron las células hasta 3,57 x 10^{5} células/ml en RPMI1640 sin rojo de fenol que contenía FBS al 1%. Se distribuyeron 70 \mul de células por pocillo a una placa de fondo plano Costar 3917. Para la curva de valoración, se preparó IgG variante en una dilución en serie de 3 veces en medio RPMI1640. Para el ensayo de selección de la biblioteca de único punto, se normalizó la variante de IgG expresada transitoriamente en el sobrenadante de cultivo hasta 1 \mug/ml en medio simulado. Se añadieron treinta microlitros de IgG variante (es decir 200 ng/ml de concentración final) y 50 \mul de complemento humano (Quidel Corp número de catálogo AI13) diluido 1:5 en RPMI1640 + FBS al 1% a la célula diana y se mezcló bien pipeteando suavemente. Las placas se incubaron a 37ºC en presencia de CO_{2} al 5% durante 1,5 horas. Tras la adición de 15 \mul/pocillo de Azul Alamar (Serotec, número de catálogo BUF012B) se siguió la incubación durante la noche. La mañana siguiente, se midió la señal de fluorescencia por medio de un lector multietiqueta EnVision 2100 de PerkinElmer con excitación a 560 nm y emisión a 590 nm.

ii. Análisis de los datos

Todos los ensayos de punto único se realizaron dos veces. Cada placa de ensayo contenía controles para la lisis espontánea de células diana por el complemento humano en ausencia de IgG y lisis máxima de células diana en presencia de Tritón X-100 al 1%. En cada placa se incluyeron tres controles de tipo natural y se promediaron las señales del ensayo de CDC. El valor de fondo, obtenido de los controles de lisis espontánea, se restó de cada muestra. Los datos se convirtieron de señales de fluorescencia a porcentaje de lisis específica basada en los controles de lisis espontánea y máxima. El porcentaje de lisis específica se calculó a partir de la siguiente ecuación: porcentaje de lisis específica = (señal de fluorescencia experimental-señal espontánea)/(señal de lisis máxima-señal espontánea) X 100. A continuación se calculó el porcentaje de actividad de la variante de Fc sobre el promedio de tres controles de tipo natural. Se promediaron los porcentajes de actividad sobre el tipo natural para placas de ensayo por duplicado y se calculó la desviación estándar entre placas de ensayo individuales.

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En este experimento, se lisaron las células Ramos usando variantes de la región Fc de IgG de aminoácido único y de doble aminoácido y el complemento humano. La placa de ensayo se incubó a 37ºC en presencia de CO_{2} al 5% durante 1,5 horas, seguido por la adición de 15 \mul de azul Alamar y la incubación durante la noche. Se midió la señal de fluorescencia y se graficó frente a las concentraciones de IgG. Estos datos revelan que, comparado con el anticuerpo anti-CD20 de tipo natural las actividades de CDC mejoraron ligeramente en los casos de las variantes de aminoácido único I332D, I332E, y mejoraron significativamente en los casos de T256P y S440Y y la combinación de T256P con I332E. En el caso de la variante A378D, la actividad de CDC disminuyó (Tabla 2).

Ejemplo 5 Caracterización de la unión a FcRn

Este Ejemplo describe los ensayos para la unión del receptor neonatal de Fc (FcRn) a la IgG variante. Se recubrió una placa de ELISA de fondo en U de 96 pocillos (Costar) con 50 \mul/pocillo de Neutravidina 2 \mug/ml (Pierce Biotechnology, número de catálogo 31000) en tampón de carbonato 50 mM (pH 9,3) a 4ºC durante la noche. Se eliminó la Neutravidina no unida y se lavó la placa tres veces con PBST (PBS que contenía Tween 20 al 0,1%). Se aplicaron 50 \mul/pocillo de FcRN soluble marcado con biotina a 2,5 \mug/ml en PBS y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación se añadieron 75 \mul de tampón de bloqueo de caseína (Pierce Biotechnology, número de catálogo 37528) a la placa durante 1 hora. A continuación se lavó la placa de ELISA lavada con PBST y se incubó con 50 \mul/pocillo de IgG variante. Para la curva de valoración, se preparó IgG variante por medio de una dilución en serie 3 veces en tampón de unión de FcRn (NaPO_{4}100 nM, Tween-20 al 0,05%) a diferentes pH desde 6,0 hasta 7,4. Para la selección de punto único, se normalizó la IgG variante expresada de manera transitoria en el sobrenadante de cultivo hasta una concentración final de 50 ng/ml (200 ng/ml para unión a pH 7,4) y se ajustó el pH con tampón de unión de FcRn hasta 6,0. En las siguientes etapas, se usó tampón de unión FcRn al pH correspondientemente para lavar la placa y diluir los reactivos. La reacción de unión se llevó a cabo a temperatura ambiente durante 1 hora. Tras tres lavados, se detectó la IgG unida por medio de (Fab')2 anti-Fab-humana de cabra conjugado a HRP durante 1 hora. La actividad de HRP se desarrolló en el sustrato de HRP de Pierce (Turbo TMB-ELISA, número de catálogo 34022) durante 5-30 minutos. La reacción se detuvo por la adición de 50 \mul de H_{2}SO_{4} 2 M y se leyó la absorbancia a 450 nm con un lector de microplacas VMAX (Molecular Devices).

Ejemplo 6 Terapia humana con la variante de Fc anti-CD20-I332E

Los estudios in vitro y los modelos de tumores murinos (Clynes RA, y col. Nat Med. 6: 443 (2000)) proporcionan pruebas de que la ADCC desempeña una función en los efectos antitumorales de los anticuerpos anti-CD20, tales como RITUXAN. Los pacientes humanos pueden tratarse con anticuerpos variantes de anti-CD20-I332E (Figuras 15 y 16), o RITUXAN, de manera similar a la divulgada en Cartron y col., Blood 99: 754 (2002). Por ejemplo, los pacientes que se presentan con enfermedad en estadio II a IV según la clasificación de Ann Arbor, que tienen al menos un sitio de enfermedad que puede medirse, y baja carga tumoral según los criterios de GELF, podrían tratarse con un total de cuatro dosis de aproximadamente 375 mg/m^{2} de una variante de Fc anti-CD20-I332E o con RITUXAN administrado por infusión intravenosa (días 1, 8,15 y 22). La variable de eficacia primaria es la tasa de respuesta objetiva, es decir, la proporción de pacientes que alcanzan la remisión completa (CR), la CR no confirmada (Cru), o la respuesta parcial (PR) según los criterios propuestos recientemente por un comité de expertos internacional. La respuesta clínica puede evaluarse en el mes dos (M2). También puede evaluarse la progresión de los pacientes en 1 año (M12).

Las tasas de respuesta objetiva en M2 y M12 para los pacientes tratados con RITUXAN o con anti-CD20-I332E pueden compararse de manera que puedan cuantificarse las actividades de ADCC mejoradas proporcionadas por las variantes I332E. Este mismo ejemplo podría repetirse con otras variantes anti-CD20 (por ejemplo I332D, P247L A330K, A339T, A378D, o combinaciones según se muestra en la Tabla 1).

Además, la potencia aumentada de las variantes puede permitir diferentes vías de administración, inyecciones menos frecuentes, y/o administración de dosis más pequeñas.

Aunque la invención se ha descrito con respecto a formas de realización específicas de preferencia, debe entenderse que la invención según se reivindica no debe limitarse indebidamente a tales formas de realización específicas. De hecho, se consideran diversas modificaciones de los modos descritos para llevar a cabo la invención que son obvias para los expertos en química y biología molecular o campos relacionados.

<110> Applied Molecular Evolution

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<120> Variantes de la región Fc

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<130> x-16757

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<150> 60/535.764

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<151> 12-01-2004

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<160> PatentIn version 3.3

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<210> 1

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<211> 218

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<212> PRT

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<213> Humano

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

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6

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

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<211> 217

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<212> PRT

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<213> Humano

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\hskip1cm

7

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<210> 3

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<211> 218

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<212> PRT

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<213> Humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\hskip1cm

8

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<210> 4

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<211> 218

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humano

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\hskip1cm

9

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 215

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Murino

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\hskip1cm

10

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 218

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Murino

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\hskip1cm

11

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<210> 7

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<211> 218

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<212>PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Murino

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\hskip1cm

12

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 218

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Murino

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\hskip1cm

13

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 110

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humano

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\hskip1cm

14

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 107

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\hskip1cm

15

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 330

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humano

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

16

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 330

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\hskip1cm

18

\hskip1cm

19

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\hskip1cm

20

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\hskip1cm

21

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\hskip1cm

22

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\hskip1cm

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\hskip1cm

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\hskip1cm

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humano

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

26

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

27

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

28

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

29

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humano

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\hskip1cm

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\hskip1cm

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\hskip1cm

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\hskip1cm

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humano

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

34

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

35

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

36

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

37

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humano

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\hskip1cm

38

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 990

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> HUMANO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\hskip1cm

39

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 93

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> HUMANO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\hskip1cm

41

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> HUMANO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\hskip1cm

42

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> HUMANO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\hskip1cm

43

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> HUMANO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\hskip1cm

44

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> HUMANO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\hskip1cm

45

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 93

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> HUMANO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\hskip1cm

46

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 93

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> HUMANO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\hskip1cm

47

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 93

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> HUMANO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\hskip1cm

48

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 93

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> HUMANO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\hskip1cm

49

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 93

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> HUMANO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\hskip1cm

50

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 93

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> HUMANO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\hskip1cm

51

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> HUMANO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\hskip1cm

52

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> HUMANO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\hskip1cm

53

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> HUMANO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\hskip1cm

54

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> HUMANO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\hskip1cm

55

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> HUMANO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\hskip1cm

56

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> HUMANO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\hskip1cm

57

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> HUMANO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\hskip1cm

58

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> HUMANO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

59

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> HUMANO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

60

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> HUMANO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

61

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> HUMANO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

62

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> HUMANO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

63

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> HUMANO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

64

Claims (13)

1. Un anticuerpo que comprende una variante de una región Fc humana original, o una de sus porciones que comprende la variante, en el que la variante comprende una sustitución de aminoácidos de una prolina por una leucina, histidina o isoleucina en una posición correspondiente a la prolina de la posición 247 de la secuencia de Fc humana según el formato del índice de EU de Kabat.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que la región Fc original es una IgG.

3. El anticuerpo de la reivindicación 1 ó 2, en el que la región Fc original es una subclase seleccionada del grupo constituido por IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.

4. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la región Fc humana original comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEC ID Nº: 1-4 y SEC ID Nº: 9-12.

5. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que la variante comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEC ID Nº: 13, SEC ID Nº: 14 y SEC ID Nº: 15.

6. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que la variante comprende una secuencia de aminoácidos según SEC ID Nº: 14.

7. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

8. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 7, en el que el anticuerpo monoclonal comprende dos polipéptidos de cadenas pesadas idénticos y dos polipéptidos de cadenas ligeras idénticos.

9. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo se une específicamente a CD20 humana.

10. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

11. Un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para uso en terapia.

12. Una secuencia de ácido nucleico que codifica una variante de la región Fc, en la que dicha secuencia de ácido nucleico comprende una secuencia seleccionada del grupo constituido por SEC ID Nº: 38, SEC ID Nº: 39 y SEC ID Nº: 40.

13. Una célula huésped aislada que comprende un vector, en la que dicho vector comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una variante de la región Fc, en la que dicha secuencia de ácido nucleico comprende una secuencia seleccionada del grupo constituido por SEC ID Nº: 38, SEC ID Nº: 39 y SEC ID Nº: 40.