CN115279896A - 慢病毒载体配制品 - Google Patents

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A·克罗伊茨
I·扎拉加
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Fondazione Telethon
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Abstract

本文提供了慢病毒载体(LV)配制品和包含此类LV配制品的药物组合物，所述配制品和药物组合物具有改善的稳定性并且适于全身性给予。本文还提供了使用LV配制品的全身性给予来治疗障碍、尤其是血液障碍的方法。

Description

慢病毒载体配制品
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年9月30日提交的美国临时专利申请序列号62/908,390的优先权，将其公开内容通过引用以其整体特此并入。
序列表
本申请含有已经以ASCII格式电子提交并且通过引用以其整体特此并入的序列表。在2020年9月28日创建的所述ASCII副本命名为“709718_SA9-472PC_SeqList_ST25.txt”并且大小为104,426字节。
技术领域
本公开文本涉及用于治疗疾病的重组慢病毒载体(LV)的配制品和相关药物产品。具体地，本发明涉及改善LV稳定性和质量，同时还适用于全身性和其他类型给予至受试者以治疗疾病(包括出血障碍，如血友病A和血友病B)的配制品。
背景技术
慢病毒载体(LV)和其他病毒载体是用于基因疗法的有吸引力的工具(Thomas等人,2003)。LV可以转导众多种组织，包括非分裂细胞，如肝细胞、神经元和造血干细胞。此外，LV可以整合到靶细胞基因组中并提供长期的转基因表达。
基因疗法和疫苗开发领域中的一项持续挑战是产生无毒的液体配制品，所述液体配制品能够使LV在更长的时间段内保持结构稳定和生物学活性，并且能承受如搅拌、冷冻/解冻和在一定温度范围下储存的条件。已经观察到随着冷冻/解冻循环增加和在较高温度下的储存，LV滴度以双相方式降低(Kigashikawa和Chang 2001,Virology 280,124-131)。为了使基因疗法最有效，希望使慢病毒载体维持其生物学活性或效力。
LV的生物学活性取决于至少由以下组成的封闭结构的构造完整性：(a)核心多核苷酸，(b)围绕核心多核苷酸的互连衣壳蛋白的外壳，和(c)围绕互连衣壳蛋白的外壳的嵌入糖蛋白的脂质膜。与有机和无机药物不同，LV是高度复杂的生物结构，并且较小的化学或物理应力源可导致封闭结构的结构完整性劣化。此类应力源包括容积渗透压摩尔浓度、缓冲液、pH、粘度、电解质、搅拌和温度波动。LV的结构或构造完整性与其生物学活性或效力直接相关。因此，LV可能由于物理不稳定性(包括变性、可溶性和不溶性聚集、沉淀和吸附)以及化学不稳定性(包括水解、脱酰胺和氧化)而失去效力。这些劣化类型中的任一种都可能导致生物学活性降低，并且还可能潜在地导致形成具有增加的毒性和/或改变的免疫原性的副产物或衍生物。因此，良好的LV配制品不仅对于确保合理的贮存期限至关重要，而且对于确保在给予至受试者(如经由全身性给予)后的降低的毒性也是至关重要的。寻找稳定化LV以产生稳健的配制品(其中LV在宽范围的条件下均是稳定的)需要对缓冲液类型、pH和赋形剂进行精确优化。对于测试的每组条件，需要经由不同的实验方法测量LV的稳定性。因此，鉴于所有可能变化的因素，寻找用于配制LV的最佳条件是具有挑战性的，并且良好配制品的组成是先验不可预测的。
因此，本领域需要制备适于给予至受试者并且通过在一定条件范围下保持LV的数量、结构完整性和效力来改善LV稳定性的配制品。在本文中，我们公开了在各种条件下展示出改善的LV稳定性并且适于全身性给予至受试者的配制品。
发明内容
本公开文本是基于意料不到的发现，即当将LV悬浮在媒介物中时，可以实现具有改善的稳定性的慢病毒载体(LV)配制品，所述媒介物包含无TRIS缓冲体系(例如磷酸盐或组氨酸缓冲液)与碳水化合物(例如蔗糖)、表面活性剂(例如泊洛沙姆或聚山梨醇酯)和盐(例如NaCl或其他氯化物盐)的组合。表面活性剂(例如泊洛沙姆)对LV稳定性的贡献是令人惊讶的，因为在本领域中已知表面活性剂会使脂质膜结合的颗粒不稳定。以下观察结果也令人惊讶：在约6.0至约7.5的pH范围内(例如6.5的pH)的LV配制品改善了LV稳定性，而不是使LV表面蛋白(例如衣壳蛋白和VSV-G蛋白)不稳定和促进LV解体或分解。此外，本公开文本证明，本公开文本的LV配制品特别适于全身性给予(例如静脉内给予)至受试者。
在一方面，本公开文本提供了重组慢病毒载体制剂，所述重组慢病毒载体制剂包含：(a)治疗有效剂量的重组慢病毒载体；(b)无TRIS缓冲体系；(c)盐；(d)表面活性剂；和(e)碳水化合物，其中所述药物组合物适于全身性给予至人患者。
在某些实施方案中，所述慢病毒载体包含编码VSV-G或其片段的核苷酸序列。
在某些实施方案中，所述缓冲体系包括磷酸盐缓冲液。
在某些实施方案中，所述磷酸盐缓冲液的浓度在5mM与30mM之间。
在某些实施方案中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为约10至约20mM、约10至约15mM、约20至约30mM、约20至约25mM或约15至约20mM。
在某些实施方案中，所述盐的浓度在80mM与150mM之间。
在某些实施方案中，所述盐的浓度为约100mM、约110mM、约130mM或约150mM。
在某些实施方案中，所述盐是氯化物盐。
在某些实施方案中，所述氯化物盐是NaCl。
在某些实施方案中，所述表面活性剂是泊洛沙姆。
在某些实施方案中，所述泊洛沙姆选自泊洛沙姆101(P101)、泊洛沙姆105(P105)、泊洛沙姆108(P108)、泊洛沙姆122(P122)、泊洛沙姆123(P123)、泊洛沙姆124(P124)、泊洛沙姆181(P181)、泊洛沙姆182(P182)、泊洛沙姆183(P183)、泊洛沙姆184(P184)、泊洛沙姆185(P185)、泊洛沙姆188(P188)、泊洛沙姆212(P212)、泊洛沙姆215(P215)、泊洛沙姆217(P217)、泊洛沙姆231(P231)、泊洛沙姆234(P234)、泊洛沙姆235(P235)、泊洛沙姆237(P237)、泊洛沙姆238(P238)、泊洛沙姆282(P282)、泊洛沙姆284(P284)、泊洛沙姆288(P288)、泊洛沙姆331(P331)、泊洛沙姆333(P333)、泊洛沙姆334(P334)、泊洛沙姆335(P335)、泊洛沙姆338(P338)、泊洛沙姆401(P401)、泊洛沙姆402(P402)、泊洛沙姆403(P403)、泊洛沙姆407(P407)及其组合。
在某些实施方案中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆188(P188)。
在某些实施方案中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆407(P407)。
在某些实施方案中，表面活性剂是聚山梨醇酯。
在某些实施方案中，所述聚山梨醇酯选自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80及其组合。
在某些实施方案中，所述表面活性剂的浓度在0.01％(w/v)与0.1％(w/v)之间。
在某些实施方案中，所述表面活性剂的浓度为约0.03％(w/v)、约0.05％(w/v)、约0.07％(w/v)或约0.09％(w/v)。
在某些实施方案中，所述碳水化合物的浓度在0.5％(w/v)与5％(w/v)之间。
在某些实施方案中，所述碳水化合物的浓度为约1％(w/v)、约2％(w/v)、约3％(w/v)或约4％(w/v)。
在某些实施方案中，所述碳水化合物是蔗糖。
在某些实施方案中，所述缓冲体系或所述制剂的pH在6.0与8.0之间。
在某些实施方案中，所述pH在6.0与7.0之间。
在某些实施方案中，所述pH为约6.5。
在某些实施方案中，所述pH为约7.0至约8.0。
在某些实施方案中，所述pH为约7.3。
在一方面，本发明涉及重组慢病毒载体制剂，所述重组慢病毒载体制剂包含：(a)治疗有效剂量的重组慢病毒载体；(b)组氨酸缓冲体系；(c)盐；(d)表面活性剂；和(e)碳水化合物，其中所述药物组合物适于全身性给予至人患者。
在某些实施方案中，所述慢病毒载体包含编码VSV-G或其片段的核苷酸序列。
在某些实施方案中，所述组氨酸缓冲液的浓度在5mM与30mM之间。
在某些实施方案中，所述组氨酸缓冲液的浓度为约10至约20mM、约10至约15mM、约20至约30mM、约20至约25mM或约15至约20mM。
在某些实施方案中，盐的浓度在80mM与150mM之间。
在某些实施方案中，所述盐的浓度为约100mM、约110mM、约130mM或约150mM。
在某些实施方案中，所述盐是氯化物盐。
在某些实施方案中，所述氯化物盐是NaCl。
在某些实施方案中，所述表面活性剂是泊洛沙姆。
在某些实施方案中，所述泊洛沙姆选自泊洛沙姆101(P101)、泊洛沙姆105(P105)、泊洛沙姆108(P108)、泊洛沙姆122(P122)、泊洛沙姆123(P123)、泊洛沙姆124(P124)、泊洛沙姆181(P181)、泊洛沙姆182(P182)、泊洛沙姆183(P183)、泊洛沙姆184(P184)、泊洛沙姆185(P185)、泊洛沙姆188(P188)、泊洛沙姆212(P212)、泊洛沙姆215(P215)、泊洛沙姆217(P217)、泊洛沙姆231(P231)、泊洛沙姆234(P234)、泊洛沙姆235(P235)、泊洛沙姆237(P237)、泊洛沙姆238(P238)、泊洛沙姆282(P282)、泊洛沙姆284(P284)、泊洛沙姆288(P288)、泊洛沙姆331(P331)、泊洛沙姆333(P333)、泊洛沙姆334(P334)、泊洛沙姆335(P335)、泊洛沙姆338(P338)、泊洛沙姆401(P401)、泊洛沙姆402(P402)、泊洛沙姆403(P403)、泊洛沙姆407(P407)及其组合。
在某些实施方案中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆188(P188)。
在某些实施方案中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆407(P407)。
在某些实施方案中，表面活性剂是聚山梨醇酯。
在某些实施方案中，所述聚山梨醇酯选自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80及其组合。
在某些实施方案中，所述表面活性剂的浓度在0.01％(w/v)与0.1％(w/v)之间。
在某些实施方案中，所述表面活性剂的浓度为约0.03％(w/v)、约0.05％(w/v)、约0.07％(w/v)或约0.09％(w/v)。
在某些实施方案中，所述碳水化合物的浓度在0.5％(w/v)与5％(w/v)之间。
在某些实施方案中，所述碳水化合物的浓度为约1％(w/v)、约2％(w/v)、约3％(w/v)或约4％(w/v)。
在某些实施方案中，所述碳水化合物是蔗糖。
在某些实施方案中，所述缓冲体系或所述制剂的pH在6.0与8.0之间。
在某些实施方案中，所述pH在6.0与7.0之间。
在某些实施方案中，所述pH为约6.5。
在某些实施方案中，所述pH为约7.0至约8.0。
在某些实施方案中，所述pH为约7.3。
在一方面，本发明涉及重组慢病毒载体制剂，所述重组慢病毒载体制剂包含：(a)治疗有效剂量的重组慢病毒载体；(b)磷酸盐缓冲体系；(c)盐；(d)表面活性剂；和(e)碳水化合物，其中所述药物组合物适于全身性给予至人患者。
在某些实施方案中，所述慢病毒载体包含编码VSV-G或其片段的核苷酸序列。
在某些实施方案中，所述磷酸盐缓冲液的浓度在5mM与30mM之间。
在某些实施方案中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为约10至约20mM、约10至约15mM、约20至约30mM、约20至约25mM或约15至约20mM。
在某些实施方案中，所述盐的浓度在80mM与150mM之间。
在某些实施方案中，所述盐的浓度为约100mM、约110mM、约130mM或约150mM。
在某些实施方案中，所述盐是氯化物盐。
在某些实施方案中，所述氯化物盐是NaCl。
在某些实施方案中，所述表面活性剂是泊洛沙姆。
在某些实施方案中，所述泊洛沙姆选自泊洛沙姆101(P101)、泊洛沙姆105(P105)、泊洛沙姆108(P108)、泊洛沙姆122(P122)、泊洛沙姆123(P123)、泊洛沙姆124(P124)、泊洛沙姆181(P181)、泊洛沙姆182(P182)、泊洛沙姆183(P183)、泊洛沙姆184(P184)、泊洛沙姆185(P185)、泊洛沙姆188(P188)、泊洛沙姆212(P212)、泊洛沙姆215(P215)、泊洛沙姆217(P217)、泊洛沙姆231(P231)、泊洛沙姆234(P234)、泊洛沙姆235(P235)、泊洛沙姆237(P237)、泊洛沙姆238(P238)、泊洛沙姆282(P282)、泊洛沙姆284(P284)、泊洛沙姆288(P288)、泊洛沙姆331(P331)、泊洛沙姆333(P333)、泊洛沙姆334(P334)、泊洛沙姆335(P335)、泊洛沙姆338(P338)、泊洛沙姆401(P401)、泊洛沙姆402(P402)、泊洛沙姆403(P403)、泊洛沙姆407(P407)及其组合。
在某些实施方案中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆188(P188)。
在某些实施方案中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆407(P407)。
在某些实施方案中，表面活性剂是聚山梨醇酯。
在某些实施方案中，所述聚山梨醇酯选自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80及其组合。
在某些实施方案中，所述表面活性剂的浓度在0.01％(w/v)与0.1％(w/v)之间。
在某些实施方案中，所述表面活性剂的浓度为约0.03％(w/v)、约0.05％(w/v)、约0.07％(w/v)或约0.09％(w/v)。
在某些实施方案中，所述碳水化合物的浓度在0.5％(w/v)与5％(w/v)之间。
在某些实施方案中，所述碳水化合物的浓度为约1％(w/v)、约2％(w/v)、约3％(w/v)或约4％(w/v)。
在某些实施方案中，所述碳水化合物是蔗糖。
在某些实施方案中，所述缓冲体系或所述制剂的pH在6.0与8.0之间。
在某些实施方案中，所述pH在6.0与7.0之间。
在某些实施方案中，所述pH为约6.5。
在某些实施方案中，所述pH为约7.0至约8.0。
在某些实施方案中，所述pH为约7.3。
在某些实施方案中，所述重组慢病毒载体进一步包含与SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2所示的因子VIII(FVIII)编码序列至少80％相同的核苷酸序列。
在某些实施方案中，所述重组慢病毒载体进一步包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的因子VIII(FVIII)编码序列。
在某些实施方案中，所述重组慢病毒载体进一步包含与SEQ ID NO:3所示的因子IX(FIX)编码序列至少80％相同的核苷酸序列。
在某些实施方案中，所述重组慢病毒载体进一步包含SEQ ID NO:3所示的因子IX(FIX)编码序列。
在某些实施方案中，所述重组慢病毒载体进一步包含增强型运甲状腺素蛋白(ET)启动子。
在某些实施方案中，所述重组慢病毒载体进一步包含与SEQ ID NO:7所示的miR-142的靶序列至少90％相同的核苷酸序列。
在某些实施方案中，所述重组慢病毒载体从选自以下的转染宿主细胞中分离：CHO细胞、HEK293细胞、BHK21细胞、PER.C6细胞、NSO细胞和CAP细胞。
在某些实施方案中，所述宿主细胞是CD47阳性宿主细胞。
在一方面，本发明涉及治疗患有障碍的人患者的方法，其中向所述人患者给予重组慢病毒载体制剂，所述重组慢病毒载体制剂包含：(a)治疗有效剂量的重组慢病毒载体；(b)无TRIS缓冲体系；(c)盐；(d)表面活性剂；和(e)碳水化合物，其中所述药物组合物适于全身性给予至人患者。
在某些实施方案中，所述制剂全身性给予至所述人患者。
在某些实施方案中，所述制剂是静脉内给予的。
在某些实施方案中，所述障碍是出血障碍。
在某些实施方案中，所述出血障碍是血友病A或血友病B。
在另一方面，提供了重组慢病毒载体制剂，所述重组慢病毒载体制剂包含：(a)治疗有效剂量的重组慢病毒载体；(b)无TRIS缓冲体系；(c)盐；(d)表面活性剂；和(e)碳水化合物，其中所述缓冲体系或所述制剂的pH为约6.0至约7.5，并且其中所述药物组合物适于全身性给予至人患者。
在某些示例性实施方案中，所述慢病毒载体包含编码VSV-G或其片段的核苷酸序列。
在某些示例性实施方案中，所述缓冲体系包括磷酸盐缓冲液或组氨酸缓冲液。在某些示例性实施方案中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为约5mM至约30mM。在某些示例性实施方案中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为约10mM至约20mM、约10mM至约15mM、约20mM至约30mM、约20mM至约25mM、或约15mM至约20mM。在某些示例性实施方案中，所述组氨酸缓冲液的浓度为约5mM至约30mM。在某些示例性实施方案中，所述组氨酸缓冲液的浓度为约10mM至约20mM、约10mM至约15mM、约20mM至约30mM、约20mM至约25mM、或约15mM至约20mM。
在某些示例性实施方案中，所述盐的浓度为约80mM至约150mM。在某些示例性实施方案中，所述盐的浓度为约100mM、约110mM、约130mM或约150mM。在某些示例性实施方案中，所述盐是氯化物盐。在某些示例性实施方案中，所述氯化物盐是NaCl。
在某些示例性实施方案中，所述表面活性剂是泊洛沙姆。在某些示例性实施方案中，所述泊洛沙姆选自泊洛沙姆101(P101)、泊洛沙姆105(P105)、泊洛沙姆108(P108)、泊洛沙姆122(P122)、泊洛沙姆123(P123)、泊洛沙姆124(P124)、泊洛沙姆181(P181)、泊洛沙姆182(P182)、泊洛沙姆183(P183)、泊洛沙姆184(P184)、泊洛沙姆185(P185)、泊洛沙姆188(P188)、泊洛沙姆212(P212)、泊洛沙姆215(P215)、泊洛沙姆217(P217)、泊洛沙姆231(P231)、泊洛沙姆234(P234)、泊洛沙姆235(P235)、泊洛沙姆237(P237)、泊洛沙姆238(P238)、泊洛沙姆282(P282)、泊洛沙姆284(P284)、泊洛沙姆288(P288)、泊洛沙姆331(P331)、泊洛沙姆333(P333)、泊洛沙姆334(P334)、泊洛沙姆335(P335)、泊洛沙姆338(P338)、泊洛沙姆401(P401)、泊洛沙姆402(P402)、泊洛沙姆403(P403)、泊洛沙姆407(P407)及其组合。在某些示例性实施方案中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆188(P188)。在某些示例性实施方案中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆407(P407)。
在某些示例性实施方案中，所述表面活性剂是聚山梨醇酯。在某些示例性实施方案中，所述聚山梨醇酯选自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80及其组合。在某些示例性实施方案中，所述表面活性剂的浓度为约0.01％(w/v)至约0.1％(w/v)。在某些示例性实施方案中，所述表面活性剂的浓度为约0.03％(w/v)、约0.05％(w/v)、约0.07％(w/v)或约0.09％(w/v)。
在某些示例性实施方案中，所述碳水化合物的浓度为约0.5％(w/v)至约5％(w/v)。在某些示例性实施方案中，所述碳水化合物的浓度为约1％(w/v)、约2％(w/v)、约3％(w/v)或约4％(w/v)。在某些示例性实施方案中，所述碳水化合物是蔗糖。
在某些示例性实施方案中，所述制剂包含：(a)治疗有效剂量的重组慢病毒载体；(b)约10mM磷酸盐；(c)约100mM氯化钠；(d)约0.05％(w/v)泊洛沙姆188；和(e)约3％(w/v)蔗糖，其中所述制剂的pH为约7.3，并且其中所述药物组合物适于全身性给予至人患者。
在某些示例性实施方案中，所述制剂包含：(a)治疗有效剂量的重组慢病毒载体；(b)约10mM磷酸盐；(c)约130mM氯化钠；(d)约0.05％(w/v)泊洛沙姆188；和(e)约1％(w/v)蔗糖，其中所述制剂的pH为约7.3，并且其中所述药物组合物适于全身性给予至人患者。
在某些示例性实施方案中，所述制剂包含：(a)治疗有效剂量的重组慢病毒载体；(b)约20mM组氨酸；(c)约100mM氯化钠；(d)约0.05％(w/v)泊洛沙姆188；和(e)约3％(w/v)蔗糖，其中所述制剂的pH为约6.5，并且其中所述药物组合物适于全身性给予至人患者。
在某些示例性实施方案中，所述制剂包含：(a)治疗有效剂量的重组慢病毒载体；(b)约10mM磷酸盐；(c)约100mM氯化钠；(d)约0.05％(w/v)泊洛沙姆188；和(e)约3％(w/v)蔗糖，其中所述制剂的pH为约7.0，并且其中所述药物组合物适于全身性给予至人患者。
在某些示例性实施方案中，所述制剂包含：(a)治疗有效剂量的重组慢病毒载体；(b)约20mM组氨酸；(c)约100mM氯化钠；(d)约0.05％(w/v)泊洛沙姆188；和(e)约3％(w/v)蔗糖，其中所述制剂的pH为约7.0，并且其中所述药物组合物适于全身性给予至人患者。
在某些示例性实施方案中，所述重组慢病毒载体包含核酸，所述核酸包含与SEQID NO:1或SEQ ID NO:2所示的因子VIII(FVIII)编码序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的核苷酸序列。在某些示例性实施方案中，所述重组慢病毒载体包含核酸，所述核酸包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的因子VIII(FVIII)编码序列。在某些示例性实施方案中，所述重组慢病毒载体包含核酸，所述核酸由SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2所示的因子VIII(FVIII)编码序列组成。
在某些示例性实施方案中，所述重组慢病毒载体包含核酸，所述核酸包含与SEQID NO:3所示的因子IX(FIX)编码序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的核苷酸序列。在某些示例性实施方案中，所述重组慢病毒载体包含核酸，所述核酸包含SEQ ID NO:3所示的因子IX(FIX)编码序列。在某些示例性实施方案中，所述重组慢病毒载体包含核酸，所述核酸由SEQ ID NO:3所示的因子IX(FIX)编码序列组成。
在某些示例性实施方案中，所述重组慢病毒载体包含增强型运甲状腺素蛋白(ET)启动子。
在某些示例性实施方案中，所述重组慢病毒载体进一步包含与SEQ ID NO:7所示的miR-142的靶序列至少90％相同的核苷酸序列。
在某些示例性实施方案中，所述重组慢病毒载体从选自以下的转染宿主细胞中分离：CHO细胞、HEK293细胞、BHK21细胞、PER.C6细胞、NSO细胞和CAP细胞。在某些示例性实施方案中，所述宿主细胞是CD47阳性宿主细胞。
在另一方面，提供了治疗患有障碍的人患者的方法，所述方法包括向所述人患者给予本文所述的重组慢病毒载体制剂。
在某些示例性实施方案中，所述制剂全身性给予至所述人患者。在某些示例性实施方案中，所述制剂是静脉内给予的。
在某些示例性实施方案中，所述障碍是出血障碍。在某些示例性实施方案中，所述出血障碍是血友病A或血友病B。
附图说明
从以下说明性实施方案的详细描述结合附图将更充分地理解本发明的前述和其他特征和优点。所述专利或申请文件包含至少一幅彩色附图。在请求并支付必要的费用后，官方将会提供带有一幅或多幅彩色附图的本专利或专利申请公开案的副本。
图1描绘了对处理到媒介物磷酸盐(10mM磷酸盐，100mM NaCl，3％(w/v)蔗糖，0.05％(w/v)P188，pH 7.3)中后的慢病毒载体(LV)配制品的表征。原料药(DS)池显示出干净的单体峰，在超滤/渗滤到最终的媒介物缓冲液中之后(切向流过滤-TFF后)，所述峰略微漂移至较大的大小，并且存在一些较大的颗粒。不受理论的束缚，这可能是由于在处理材料的应力期间颗粒的物理劣化所致。最终DP已通过0.22μm大小的过滤膜进行过滤，并且分布曲线恢复为与开始处理时的DS池重合。TFF应力的影响可以在图2A至图2B所示的图片中可视地看到。
图2A至图2B描绘了无菌过滤对在切向流过滤(TFF)后在媒介物磷酸盐(10mM磷酸盐，100mM NaCl，3％(w/v)蔗糖，0.05％(w/v)P188，pH7.3)中(图2A)和在最终原料药(DS)池中(图2B)的慢病毒载体(LV)的影响。
图3A至图3B描绘了在不添加1％(w/v)P188的情况下(图3A)和在添加1％(w/v)P188的情况下(图3B)，慢病毒载体(LV)在媒介物TSSM(20mM TRIS，100mM NaCl，1％(w/v)蔗糖，1％(w/v)甘露醇，pH 7.3)中的稳定性，如使用p24 ELISA通过p24浓度测量的。
图4描绘了在搅拌时，慢病毒载体(LV)在媒介物TSSM(20mM TRIS，100mM NaCl，1％(w/v)蔗糖，1％(w/v)甘露醇，pH 7.3)中的稳定性，如使用NanoSight通过颗粒浓度和粒径测量的。使用TSSM配制品的稳定性研究：20mM Tris，100mM NaCl，1％(w/v)蔗糖，1％(w/v)甘露醇，pH 7.3，如在具有和没有Poloxomer 188(P188)的情况下所指示的。使用NanoSight进行测量。
图5A至图5B描绘了在搅拌时，慢病毒载体(LV)在媒介物TSSM(20mM TRIS，100mMNaCl，1％(w/v)蔗糖，1％(w/v)甘露醇，pH 7.3)中的稳定性，如使用NanoSight通过颗粒浓度和粒径测量的。图5A显示，在搅拌应力下，慢病毒颗粒的大小似乎仅略微增长。假定主峰是单体慢病毒载体(约130nm)，并且较小的较大峰可能是单体颗粒的劣化。图5B显示，添加1％(w/v)泊洛沙姆188(P188)不干扰慢病毒颗粒。
图6A至图6B描绘了在37℃下在0、3、7和14天内慢病毒载体(LV)在媒介物TSSM(20mM TRIS，100mM NaCl，1％(w/v)蔗糖，1％(w/v)甘露醇，pH 7.3)中的稳定性，如使用ddPCR通过以TU/ml计(图6A)和以T0％计(图6B)的功能滴度测量的。将图6B针对时间0进行归一化。每个条形组表示以下稀释系列：未稀释(无稀释)、20倍稀释(20x)、100倍稀释(100x)。
图7A至图7B描绘了在37℃下在0、3、7和14天内慢病毒载体(LV)在媒介物TSSM(20mM TRIS，100mM NaCl，1％(w/v)蔗糖，1％(w/v)甘露醇，pH 7.3)中的稳定性，如使用ddPCR通过功能滴度(以TU/ml计)和使用NanoSight通过颗粒浓度(图7A)或通过与p24数据叠加的功能滴度(图7B)测量的。
图8A至图8B.图8A描绘了在37℃下慢病毒载体(LV)在媒介物TSSM(20mM TRIS，100mM NaCl，1％(w/v)蔗糖，1％(w/v)甘露醇，pH 7.3)中随孵育时间(以天和周计)而变化的的稳定性，如使用Nanosight通过颗粒浓度和大小测量的。图8B以对数标度报告37℃稳定性实验的结果，以更清楚地看到粒径随时间的差异。
图9描绘了慢病毒载体(LV)在媒介物磷酸盐配制品(10mM磷酸盐，100mM NaCl，3％(w/v)蔗糖，0.05％(w/v)P188，pH 7.3)中随孵育时间、孵育温度、搅拌和冷冻/解冻(F/T)循环(以天计)而变化的稳定性，如使用ddPCR通过功能滴度(以T0％计)和使用p24 ELISA通过p24浓度测量的。
图10A至图10B描绘了使用磷酸盐配制品(10mM磷酸盐，100mM NaCl，3％(w/v)蔗糖，0.05％(w/v)P188，pH 7.3)的慢病毒载体(LV)在37℃下随时间(以天计)而变化的稳定性，如使用NanoSight通过颗粒浓度和粒径分布测量的。图10A报告了针对1进行归一化以使劣化峰的差异更明显的NanoSight数据。图10B呈现了原始数据，其显示出在37℃孵育下单体峰随时间的减小。
图11A至图11B描绘了慢病毒载体(LV)的稳定性，其比较了三种配制品：配制品1.磷酸盐配制品：10mM磷酸盐，100mM NaCl，3％(w/v)蔗糖，0.05％(w/v)P188，pH 7.3；配制品2.10mM磷酸盐，130mM NaCl，1％(w/v)蔗糖，0.05％(w/v)P188，pH 7.3；配制品3.20mM组氨酸，100mM NaCl，3％(w/v)蔗糖，0.05％(w/v)P188，pH 6.5；在5个和10个冷冻和解冻(F/T)循环期间(图11A)，并且在室温(RT)下以及在室温和搅拌(轨道式震荡器，350rpm)下比较3天(图11B)，如使用ddPCR通过功能滴度测量的。
图12A至图12B描绘了慢病毒载体(LV)的稳定性，其比较了三种配制品：配制品1(Phos).磷酸盐配制品：10mM磷酸盐，100mM NaCl，3％(w/v)蔗糖，0.05％(w/v)P188，pH7.3；配制品2(Phos.更高盐).10mM磷酸盐，130mM NaCl，1％(w/v)蔗糖，0.05％(w/v)P188，pH 7.3；配制品3(Hist).20mM组氨酸，100mM NaCl，3％(w/v)蔗糖，0.05％(w/v)P188，pH6.5，如使用NanoSight通过颗粒数量测量的。图12A示出了在室温(RT)下和在室温和搅拌(轨道式震荡器，350rpm)下3天的数据，而图12B示出了对于5个和10个冷冻和解冻(F/T)循环的数据。
图13描绘了使用以下一种配制品在室温下暴露于IV袋6小时期间的模拟使用中稳定性研究：配制品1(磷酸盐缓冲液)：10mM磷酸盐，100mM NaCl，3％(w/v)蔗糖，0.05％(w/v)P188，pH 7.3。
图14描绘了配制缓冲液稳定性研究，其比较了在一个冷冻和解冻循环(-80℃过夜，在37℃水浴中解冻)内的容器封闭(Schott 1型玻璃小瓶和West CZ COP小瓶)性能：配制品1(磷酸盐缓冲液)：10mM磷酸盐，100mM NaCl，3％(w/v)蔗糖，0.05％(w/v)P188，pH7.3。使用微流成像(MFI)获得颗粒浓度。
图15描绘了使用Schott 1型玻璃小瓶经过一个冷冻和解冻循环(-80C，在37℃水浴中解冻)的小瓶应变研究：配制品1(仅磷酸盐缓冲液)：10mM磷酸盐，100mM NaCl，3％(w/v)蔗糖，0.05％(w/v)P188，pH 7.3。使用应变仪和热电偶收集数据。
图16A至图16C描绘了LVV材料相容性，其比较了经过各种稳定性条件的容器封闭(Schott 1型玻璃小瓶和West CZ小瓶)性能，1FT＝1个冷冻和解冻循环，2hr＝暴露于室温2hr；3x泡沫是从吸液管快速(aggressive)抽吸和分配，从而在容器中产生可见的泡沫；10x是10倍稀释度下的相同稳定性参数。LVV是在配制品1(磷酸盐缓冲液)中：10mM磷酸盐，100mM NaCl，3％(w/v)蔗糖，0.05％(w/v)P188，pH 7.3；如通过功能滴度(图16A)、p24浓度(图16B)和颗粒浓度(图16C)测量的。使用应变仪和热电偶收集数据。使用NanoSight获得颗粒浓度。
图17描绘了稳定性研究，其比较了经过10个冷冻和解冻(F/T)循环的两种配制品并且比较了在室温下(RT)下1天和3天：配制品1(磷酸盐缓冲液)：10mM磷酸盐，100mM NaCl，3％(w/v)蔗糖，0.05％(w/v)P188，pH 7.3；配制品3(组氨酸缓冲液).20mM组氨酸，100mMNaCl，3％(w/v)蔗糖，0.05％(w/v)P188，pH 6.5。
图18描绘了磷酸盐和组氨酸配制品的长期稳定性(在-80℃冷冻储存的9个月时间点(9mo.))数据：配制品1(磷酸盐)：10mM磷酸盐，100mM NaCl，3％(w/v)蔗糖，0.05％(w/v)P188，pH 7.3；配制品3(组氨酸).20mM组氨酸，100mM NaCl，3％(w/v)蔗糖，0.05％(w/v)P188，pH 6.5。
图19A至图19D描绘了在相同pH 7.0下比较磷酸盐缓冲液与组氨酸缓冲液的稳定性研究：配制品4(磷酸盐)：10mM磷酸盐，100mM NaCl，3％(w/v)蔗糖，0.05％(w/v)P188，pH7.0；配制品5(组氨酸).20mM组氨酸，100mM NaCl，3％(w/v)蔗糖，0.05％(w/v)P188，pH7.0；如通过功能滴度(图19A)、归一化的功能滴度(图19B)、p24浓度(图19C)和颗粒浓度(图19D)测量的。将结果以功能滴度的单位示出并归一化为起始材料(T0)的百分比。使用NanoSight获得颗粒浓度。
具体实施方式
本公开文本尤其提供了慢病毒载体(LV)(包括重组LV)的制剂(配制品)和药物组合物。本公开文本还提供了使用LV制剂治疗患有障碍(包括出血障碍如血友病A或血友病B)的受试者的方法。本公开文本进一步提供了用于生产LV制剂的方法。
通常，关于本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、生物物理学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学所使用的术语是本领域熟知且常用的。除非另有指示，否则本文提供的方法和技术通常是根据本领域熟知并且如本说明书通篇引用和讨论的各个通用和更具体参考文献中所述的常规方法来进行。酶反应和纯化方法是根据制造商说明书来进行，如本领域通常所完成的或如本文所述。关于本文所述的分析化学、合成有机化学以及医药和药物化学的术语以及实验室程序和技术是本领域熟知且常用的。使用标准技术进行化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送，以及患者的治疗。
除非本文中另有定义，否则本文中所用的科学和技术术语具有本领域普通技术人员一般理解的含义。如果存在任何可能的歧义，本文提供的定义优先于任何字典或外部定义。除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。除非另外陈述，否则“或”的使用意指“和/或”。术语“包括(including)”以及其他形式如“包括(includes)”和“包括(included)”的使用是非限制性的。
为了可以更容易理解本发明，首先定义某些术语。
如本文所用，术语“载体”是指用于将核酸克隆和/或转移到宿主细胞中的任何媒介物。载体可以是复制子，另一核酸区段可以与其连接以实现所连接区段的复制。“复制子”是指在体内作为自主复制单元(即能够在其自身控制下复制)起作用的任何遗传元件(例如质粒、噬菌体、粘粒、染色体、病毒)。术语“载体”包括用于体外、离体或体内将核酸引入细胞的病毒载体和非病毒媒介物。很多载体是本领域已知且使用的，包括例如质粒、修饰的真核病毒或修饰的细菌病毒。通过将适当的多核苷酸片段连接到具有互补粘性末端的选择载体中，可以完成将多核苷酸插入合适的载体中。
如本文所用，短语“重组慢病毒载体”是指如下载体：其具有足够慢病毒遗传信息，以允许在包装组分分的存在下将RNA基因组包装到能够感染靶细胞的病毒颗粒中。靶细胞的感染可包括逆转录和整合到靶细胞基因组中。重组慢病毒载体携带将由载体递送至靶细胞中的非病毒编码序列。重组慢病毒载体在最终靶细胞内无法独立复制以产生感染性慢病毒颗粒。通常，重组慢病毒载体缺少功能性gag-pol和/或env基因和/或复制所必需的其他基因。本发明的载体可以被构造为分裂-内含子载体。
如本文所用，术语“治疗”是指改善或减轻障碍的一种或多种症状。治疗不一定是治愈。
如本文所用，术语“人患者”是指患有疾病或障碍并且需要针对该疾病或障碍的治疗的人类。
如本文所用，短语“全身性给予”是指向受试者开具或给予包含LV的药物组合物，使得将LV直接引入到受试者的血流中。全身性给予途径的例子包括但不限于静脉内，例如静脉内注射和静脉内输注，例如经由中心静脉通路。
如本文所用，术语“约”，当关于具体列举的数值使用时，意指所述值可以与所列举值相差不超过10％。例如，如本文所用，表述“约100”包括90和100以及它们之间的所有值(例如，90、91、92、93、94、95等)。A.包含无TRIS缓冲体系的慢病毒载体(LV)的配制品
在一方面，本发明涉及重组慢病毒载体制剂，所述重组慢病毒载体制剂包含：(a)有效剂量的重组慢病毒载体；(b)无TRIS缓冲体系；(c)盐；(d)表面活性剂；和(e)碳水化合物，其中所述药物组合物适于全身性给予至人患者。在某些实施方案中，所述载体包含编码VSV-G或其片段的核苷酸序列。在某些实施方案中，所述缓冲体系的pH为约6.0至约8.0。在某些实施方案中，所述缓冲体系的pH为约6.0至约7.5。在某些实施方案中，所述缓冲体系的pH为约6.0至约7.0。在某些实施方案中，所述缓冲体系的pH为约6.0至约8.0。在某些实施方案中，所述缓冲体系的pH为约6.5。在某些实施方案中，所述缓冲体系的pH为约7.3。在某些实施方案中，所述缓冲体系是磷酸盐缓冲液或组氨酸缓冲液。在某些实施方案中，所述磷酸盐或组氨酸缓冲液的浓度为约5mM至约30mM。在某些实施方案中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为约10mM至约20mM、约10mM至约15mM、约20mM至约30mM、约20mM至约25mM、或约15mM至约20mM。在某些实施方案中，所述盐是氯化物盐。在某些实施方案中，所述氯化物盐的浓度为约80mM至约150mM。在某些实施方案中，所述盐的浓度为约100mM、约110mM、约130mM或约150mM。在某些实施方案中，所述表面活性剂是泊洛沙姆或聚山梨醇酯。在某些实施方案中，所述泊洛沙姆或聚山梨醇酯的浓度为约0.01％(w/v)至约0.1％(w/v)。在某些实施方案中，所述碳水化合物是蔗糖。在某些实施方案中，所述碳水化合物的浓度为约0.5％(w/v)至约5％(w/v)。在某些实施方案中，所述氯化物盐是氯化钠(NaCl)。在某些实施方案中，所述泊洛沙姆选自泊洛沙姆101(P101)、泊洛沙姆105(P105)、泊洛沙姆108(P108)、泊洛沙姆122(P122)、泊洛沙姆123(P123)、泊洛沙姆124(P124)、泊洛沙姆181(P181)、泊洛沙姆182(P182)、泊洛沙姆183(P183)、泊洛沙姆184(P184)、泊洛沙姆185(P185)、泊洛沙姆188(P188)、泊洛沙姆212(P212)、泊洛沙姆215(P215)、泊洛沙姆217(P217)、泊洛沙姆231(P231)、泊洛沙姆234(P234)、泊洛沙姆235(P235)、泊洛沙姆237(P237)、泊洛沙姆238(P238)、泊洛沙姆282(P282)、泊洛沙姆284(P284)、泊洛沙姆288(P288)、泊洛沙姆331(P331)、泊洛沙姆333(P333)、泊洛沙姆334(P334)、泊洛沙姆335(P335)、泊洛沙姆338(P338)、泊洛沙姆401(P401)、泊洛沙姆402(P402)、泊洛沙姆403(P403)、泊洛沙姆407(P407)及其组合。在某些实施方案中，所述聚山梨醇酯选自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80及其组合。在某些实施方案中，所述磷酸盐或组氨酸缓冲液的pH为约6.1、约6.3、约6.5、约6.7、约6.9、约7.1、约7.3、约7.5、约7.7或约7.9。在某些实施方案中，所述磷酸盐或组氨酸缓冲液的浓度为约10mM、约15mM、约20mM或约25mM。在某些实施方案中，所述氯化物盐为约100mM、约110mM、约130mM或约150mM。在某些实施方案中，所述泊洛沙姆或聚山梨醇酯的浓度为约0.03％(w/v)、约0.05％(w/v)、约0.07％(w/v)或约0.09％(w/v)。在某些实施方案中，所述碳水化合物的浓度为约1％(w/v)、约2％(w/v)、约3％(w/v)或约4％(w/v)。在某些实施方案中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆188(P188)。在某些实施方案中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆407(P407)。
在某些实施方案中，本公开文本提供了重组慢病毒载体制剂，所述重组慢病毒载体制剂包含：(a)治疗有效剂量的重组慢病毒载体；(b)约10mM磷酸盐；(c)约100mM氯化钠；(d)约0.05％(w/v)泊洛沙姆188；和(e)约3％(w/v)蔗糖，其中所述制剂的pH为约7.3，并且其中所述药物组合物适于全身性给予至人患者。
在某些实施方案中，本公开文本提供了重组慢病毒载体制剂，所述重组慢病毒载体制剂包含：(a)治疗有效剂量的重组慢病毒载体；(b)约10mM磷酸盐；(c)约130mM氯化钠；(d)约0.05％(w/v)泊洛沙姆188；和(e)约1％(w/v)蔗糖，其中所述制剂的pH为约7.3，并且其中所述药物组合物适于全身性给予至人患者。
在某些实施方案中，本公开文本提供了重组慢病毒载体制剂，所述重组慢病毒载体制剂包含：(a)治疗有效剂量的重组慢病毒载体；(b)约20mM组氨酸；(c)约100mM氯化钠；(d)约0.05％(w/v)泊洛沙姆188；和(e)约3％(w/v)蔗糖，其中所述制剂的pH为约6.5，并且其中所述药物组合物适于全身性给予至人患者。
在某些实施方案中，本公开文本提供了重组慢病毒载体制剂，所述重组慢病毒载体制剂包含：(a)治疗有效剂量的重组慢病毒载体；(b)约10mM磷酸盐；(c)约100mM氯化钠；(d)约0.05％(w/v)泊洛沙姆188；和(e)约3％(w/v)蔗糖，其中所述制剂的pH为约7.0，并且其中所述药物组合物适于全身性给予至人患者。
在某些实施方案中，本公开文本提供了重组慢病毒载体制剂，所述重组慢病毒载体制剂包含：(a)治疗有效剂量的重组慢病毒载体；(b)约20mM组氨酸；(c)约100mM氯化钠；(d)约0.05％(w/v)泊洛沙姆188；和(e)约3％(w/v)蔗糖，其中所述制剂的pH为约7.0，并且其中所述药物组合物适于全身性给予至人患者。
A.1.慢病毒载体
慢病毒载体是更大逆转录病毒载体组的一部分(Coffin等人(1997)“Retroviruses”Cold Spring Harbor Laboratory Press编辑：J M Coffin,S M Hughes,HE Varmus第758-763页)。灵长类慢病毒的例子包括：人免疫缺陷病毒(HIV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。慢病毒家族与逆转录病毒的不同之处在于，慢病毒具有感染分裂细胞和非分裂细胞二者的能力(Lewis等人(1992)；Lewis和Emerman(1994))。
如本文所用，慢病毒载体是包含至少一个可衍生自慢病毒的组成部分的载体。优选地，该组成部分参与载体感染细胞、表达基因或复制的生物学机制。在重组慢病毒载体中，可以从病毒中除去复制所必需的一个或多个蛋白质编码区的至少一部分。这使得病毒载体具有复制缺陷。病毒基因组的部分也可以被转基因代替，从而使载体能够转导靶非分裂宿主细胞和/或将其基因组整合到宿主基因组中。
重组慢病毒通常是假型化的。假型化可以赋予一个或多个优点。例如，基于HIV的载体的env基因产物将这些载体限制为仅感染表达称为CD4的蛋白的细胞。但是，如果这些载体中的env基因已被来自其他RNA病毒的env序列取代，则它们可以具有更宽的感染谱(Verma和Somia(1997))。水疱性口炎病毒(VSV，一种弹状病毒)的包膜糖蛋白(G)是已显示能够对某些逆转录病毒进行假型化的包膜蛋白。假型化VSV-G载体可用于转导宽范围的哺乳动物细胞。并入非慢病毒假型化包膜(如VSV-G蛋白)得到这样的优点：载体颗粒可以被浓缩至高滴度而不损失感染性(Akkina等人(1996)J.Virol.70:2581-5)。慢病毒和逆转录病毒包膜蛋白显然无法承受超速离心过程中的剪切力，这可能是因为它们由两个非共价连接的亚基组成。亚基之间的相互作用可能被离心破坏。相比之下，VSV糖蛋白由单一单元构成。因此，VSV-G蛋白假型化可以提供潜在的优点。
慢病毒包括牛慢病毒组、马慢病毒组、猫慢病毒组、绵羊山羊慢病毒组和灵长类慢病毒组的成员。用于基因疗法的慢病毒载体的开发已经综述于Klimatcheva等人(1999)Frontiers in Bioscience 4:481-496中。适于基因疗法的慢病毒载体的设计和使用描述例如于美国专利号6,207,455和6,615,782中。慢病毒的例子包括但不限于HIV-1、HIV-2、HIV-1/HIV-2假型、HIV-1/SIV、FIV、山羊关节炎脑炎病毒(CAEV)、马感染性贫血病毒和牛免疫缺陷病毒。
在一些实施方案中，本公开文本的慢病毒载体是“第三代”慢病毒载体。如本文所用，术语“第三代”慢病毒载体是指具有第二代载体系统的特征，并且进一步缺少功能性tat基因的慢病毒包装系统，如其中tat基因已经缺失或失活的慢病毒包装系统。通常，将编码rev的基因提供于单独表达构建体上。参见例如，Dull等人(1998)J.Virol.72:8463-8471。如本文所用，“第二代”慢病毒载体系统是指缺少功能性辅助基因的慢病毒包装系统，如其中辅助基因vif、vpr、vpu和nef已缺失或失活的慢病毒包装系统。参见例如，Zufferey等人(1997)Nat.Biotechnol.15:871-875。如本文所用，“包装系统”是指一系列病毒构建体，其包含编码参与包装重组病毒的病毒蛋白的基因。通常，包装系统的构建体最后将被并入到包装细胞中。
在一些实施方案中，本公开文本的第三代慢病毒载体是自灭活的慢病毒载体。在一些实施方案中，慢病毒载体是VSV.G假型慢病毒载体。在一些实施方案中，慢病毒载体包含用于转基因表达的肝细胞特异性启动子。在一些实施方案中，肝细胞特异性启动子是增强型运甲状腺素蛋白启动子。在一些实施方案中，慢病毒载体包含miR-142的一个或多个靶序列，以减少对转基因产物的免疫应答。在一些实施方案中，将miR-142的一个或多个靶序列并入到本公开文本的慢病毒载体中允许期望的转基因表达谱。例如，并入miR-142的一个或多个靶序列可以抑制血管内和血管外造血谱系中的转基因表达，而在非造血细胞中维持转基因表达。在用本公开文本的慢病毒载体系统治疗的肿瘤易发小鼠中未检测到肿瘤发生。参见Brown等人(2007)Blood110:4144-52；Brown等人(2006)Nat.Ned.12:585-91；和Cantore等人(2015)Sci.Transl.Med.7(277):277ra28。
本公开文本的慢病毒载体包括编码特定蛋白(如本文所述的FVIII或FIX蛋白)的转基因的密码子优化多核苷酸。在一个实施方案中，FVIII或FIX蛋白的优化编码序列与表达控制序列可操作地连接。如本文所用，当将两个核酸序列以允许每个组分核酸序列保留其功能性的方式共价连接时，所述两个核酸序列是可操作地连接的。当将编码序列和基因表达控制序列以使编码序列的表达或转录和/或翻译置于基因表达控制序列的影响或控制下的方式共价连接时，称所述编码序列和基因表达控制序列是可操作连接的。如果在5'基因表达序列中启动子的诱导导致编码序列的转录，并且如果两个DNA序列之间的连接性质没有(1)导致引入移码突变，(2)干扰启动子区引导编码序列转录的能力，或(3)干扰相应的RNA转录物翻译成蛋白质的能力，则称所述两个DNA序列是可操作连接的。因此，如果基因表达序列能够实现编码核酸序列的转录，由此使得所得的转录物被翻译成所需的蛋白质或多肽，则所述基因表达序列将是与该编码核酸序列可操作地连接的。
在某些实施方案中，慢病毒载体是能够感染非分裂细胞的重组慢病毒的载体。在某些实施方案中，慢病毒载体是能够感染肝脏细胞(例如，肝细胞)的重组慢病毒的载体。慢病毒基因组和原病毒DNA通常具有在逆转录病毒中发现的三个基因：gag，pol和env，其侧接有两个长末端重复(LTR)序列。gag基因编码内部结构(基质、衣壳和核衣壳)蛋白；pol基因编码RNA引导的DNA聚合酶(逆转录酶)、蛋白酶和整合酶；并且env基因编码病毒包膜糖蛋白。5'和3'LTR用于促进病毒体RNA的转录和聚腺苷酸化。LTR含有病毒复制所必需的所有其他顺式作用序列。慢病毒具有另外的基因，包括vif、vpr、tat、rev、vpu、nef和vpx(在HIV-1、HIV-2和/或SIV中)。
与5'LTR相邻的是基因组逆转录(tRNA引物结合位点)和将病毒RNA有效衣壳化为颗粒(Psi位点)所必需的序列。如果衣壳化(或将逆转录病毒RNA包装成感染性病毒体)所必需的序列从病毒基因组中缺失，则顺式缺陷会阻止基因组RNA的衣壳化。
然而，所得的突变体仍然能够引导所有病毒体蛋白的合成。本公开文本提供了产生能够感染非分裂细胞的重组慢病毒的方法，所述方法包括用两种或更多种携带包装功能(即gag、pol和env以及rev和tat)的载体转染合适的宿主细胞。如下文将公开的，缺少功能性tat基因的载体对于某些应用是期望的。因此，例如，第一载体可提供编码病毒gag和病毒pol的核酸，并且另一载体可提供编码病毒env的核酸以产生包装细胞。将提供异源基因的载体(在本文中被鉴定为转移载体)引入到该包装细胞中产生生产细胞，其释放携带目的外源基因的感染性病毒颗粒。
根据载体和外源基因的上述构型，第二载体可提供编码病毒包膜(env)基因的核酸。env基因可源自几乎任何合适的病毒，包括逆转录病毒。在一些实施方案中，env蛋白是双嗜性包膜蛋白，其允许转导人和其他物种的细胞。
逆转录病毒来源的env基因的例子包括但不限于：莫洛尼鼠白血病病毒(MoMuLV或MMLV)、哈维鼠肉瘤病毒(HaMuSV或HSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV或MMTV)、长臂猿白血病病毒(GaLV或GALV)、人免疫缺陷病毒(HIV)和劳斯肉瘤病毒(RSV)。也可以使用其他env基因，如水泡性口炎病毒(VSV)蛋白G(VSV-G)、肝炎病毒的env基因和流感病毒的env基因。在一些实施方案中，病毒env核酸序列与本文其他地方所述的调节序列可操作地缔合。在某些实施方案中，本公开文本的配制缓冲液赋予慢病毒稳定性并提供长期冷冻储存，特别是对于包含VSV-G的慢病毒。本发明的配制缓冲液在冷冻和解冻以及暴露于升高的温度时提供增强的慢病毒稳定性，特别是对于包含VSV-G的慢病毒。
在某些实施方案中，慢病毒载体缺失HIV毒力基因env、vif、vpr、vpu和nef，而不损害载体转导非分裂细胞的能力。在一些实施方案中，慢病毒载体包含3'LTR的U3区的缺失。U3区的缺失可以是完全缺失或部分缺失。
在一些实施方案中，包含本文所述的FVIII核苷酸序列的本公开文本的慢病毒载体可以在细胞中用以下来转染：(a)包括gag、pol或gag和pol基因的第一核苷酸序列和(b)包括异源env基因的第二核苷酸序列；其中慢病毒载体缺少功能性tat基因。在其他实施方案中，将细胞进一步用包括rev基因的第四核苷酸序列转染。在某些实施方案中，慢病毒载体缺少选自vif、vpr、vpu、vpx和nef或其组合的功能性基因。
在某些实施方案中，本公开文本的慢病毒载体包含一个或多个编码gag蛋白、Rev响应元件、中央聚嘌呤区(cPPT)或其任何组合的核苷酸序列。
在一些实施方案中，慢病毒载体在其表面上表达一种或多种改善慢病毒载体或编码的FVIII多肽的靶向和/或活性的多肽。一种或多种多肽可以由慢病毒载体编码，或者可以在慢病毒载体从宿主细胞中出芽的过程中被并入。在慢病毒产生期间，病毒颗粒从生产宿主细胞中出芽。在出芽过程中，病毒颗粒带有脂质包衣，所述脂质包衣源自宿主细胞的脂质包衣。因此，病毒颗粒的脂质包衣可包括先前存在于宿主细胞表面上的膜结合多肽。
在一些实施方案中，慢病毒载体在其表面上表达一种或多种多肽，所述一种或多种多肽在给予至人受试者后抑制对慢病毒载体的免疫应答。在一些实施方案中，慢病毒载体的表面包含一个或多个CD47分子。CD47是一种“自身标记”蛋白，其在人细胞上遍在表达。CD47的表面表达通过CD47与巨噬细胞表达的SIRPα的相互作用抑制巨噬细胞诱导的对内源性细胞的吞噬作用。表达高水平CD47的细胞在体内不太可能被人巨噬细胞靶向和破坏。
在一些实施方案中，慢病毒载体在其表面上包含高浓度的CD47多肽分子。在一些实施方案中，慢病毒载体在具有高表达水平的CD47的细胞系中产生。在某些实施方案中，慢病毒载体在CD47高细胞中产生，其中所述细胞在细胞膜上具有高的CD47表达。在特定的实施方案中，慢病毒载体在CD47高HEK 293T细胞中产生，其中HEK 293T在细胞膜上具有高的CD47表达。在一些实施方案中，将HEK 293T细胞修饰为相对于未修饰的HEK 293T细胞具有增加的CD47表达。在某些实施方案中，CD47是人CD47。
在一些实施方案中，慢病毒载体几乎没有或没有主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的表面表达。表面表达的MHC-I展示来自细胞内的“非自身”蛋白的肽片段，如指示感染的蛋白片段，从而促进了针对细胞的免疫应答。在一些实施方案中，慢病毒载体在MHC-I低细胞中产生，其中所述细胞在细胞膜上具有降低的MHC-I表达。在一些实施方案中，慢病毒载体在MHC-I-(或“MHC-I无”、“MHC-1阴性”或“MHC-阴性”)细胞中产生，其中所述细胞缺少MHC-I的表达。
在特定的实施方案中，慢病毒载体包含脂质包衣，所述脂质包衣包含高浓度的CD47多肽并且缺少MHC-I多肽。在某些实施方案中，慢病毒载体在CD47高/MHC-I低细胞系，例如CD47高/MHC-I低HEK 293T细胞系中产生。在一些实施方案中，慢病毒载体在CD47高/MHC-I无细胞系，例如CD47高/MHC-I无HEK 293T细胞系中产生。
慢病毒载体的例子披露于美国专利号9,050,269和国际公开号WO9931251、WO9712622、WO9817815、WO9817816和WO9818934中，将所述专利通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，本公开文本提供了包含分离的核酸分子的慢病毒载体，所述分离的核酸分子包含包括表1中所示的核苷酸序列的核苷酸序列。
表1：序列
Figure BDA0003568611620000231
Figure BDA0003568611620000241
Figure BDA0003568611620000251
Figure BDA0003568611620000261
Figure BDA0003568611620000271
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Figure BDA0003568611620000291
Figure BDA0003568611620000301
当以5x1010TU/kg或更低、109TU/kg或更低、或108TU/kg或更低的剂量给予时，本公开文本的慢病毒载体是治疗有效的。在此类剂量下，关于受试者中的基础水平、相对于给予了对照慢病毒载体的受试者中的水平、相对于给予了对照核酸分子的受试者中的水平、或相对于给予了由对照核酸分子编码的多肽后的受试者中的水平，本公开文本的慢病毒载体的给予可以导致有需要的受试者中血浆FVIII活性增加至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约45倍、至少约50倍、至少约55倍、至少约60倍、至少约65倍、至少约70倍、至少约75倍、至少约80倍、至少约85倍、至少约90倍、至少约95倍、至少约100倍、至少约110、至少约120倍、至少约130倍、至少约140倍、至少约150倍、至少约160倍、至少约170倍、至少约180倍、至少约190倍或至少约200倍。
在某些实施方案中，有用的是在慢病毒载体内包括一个或多个miRNA靶序列，所述miRNA靶序列例如与转基因，如优化FVIII转基因可操作地连接。因此，本公开文本还提供了至少一个与优化FVIII或优化FIX核苷酸序列可操作地连接或以其他方式插入慢病毒载体内的miRNA序列靶标。慢病毒载体中包括的多于一个拷贝的miRNA靶序列可以增加系统的有效性。
还包括不同miRNA靶序列。例如，表达多于一种转基因的慢病毒载体可以具有在多于一个可以相同或不同的miRNA靶序列控制下的转基因。miRNA靶序列可以是串联的，但是也包括其他排列。含有miRNA靶序列的转基因表达盒也能以反义定向插入慢病毒载体内。反义定向可用于产生病毒颗粒，以避免原本可能对生产细胞有毒的基因产物的表达。
在其他实施方案中，慢病毒载体包含1、2、3、4、5、6、7或8个拷贝的相同或不同的miRNA靶序列。在某些实施方案中，慢病毒载体不包括任何miRNA靶序列。是否要包括miRNA靶序列(以及数量)的选择将依据已知参数如计划的组织靶标、所需的表达水平等来指导。
在一个实施方案中，靶序列是miR-223靶标，已经报道其可在骨髓定向祖细胞中最有效地阻断表达，以及在更原始的HSPC中至少部分阻断表达。miR-223靶标可以在分化的髓样细胞(包括粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、髓样树突细胞)中阻断表达。miR-223靶标还可以适于依赖于淋巴或红细胞谱系中的稳健转基因表达的基因疗法应用。miR-223靶标还可以在人HSC中非常有效地阻断表达。
在另一个实施方案中，靶序列是miR142靶标(tccataaagtaggaaacactaca(SEQ IDNO:7))。在一个实施方案中，慢病毒载体包含4个拷贝的miR-142靶序列。在某些实施方案中，将造血特异性微小RNA(如miR-142(142T))的互补序列并入慢病毒载体的3'非翻译区中，使得编码转基因的转录物易发生miRNA介导的下调。通过这种方法，可以在造血谱系抗原呈递细胞(AP C)中防止转基因表达，同时在非造血细胞中维持所述转基因表达(Brown等人,Nat Med 2006)。这种策略可以对转基因表达施加严格的转录后控制，并且由此使得能够稳定递送和长期表达转基因。在一些实施方案中，miR-142调节防止经转导细胞的免疫介导的清除和/或诱导抗原特异性调节T细胞(T reg)，并且介导对转基因编码抗原的稳健的免疫耐受。
在一些实施方案中，靶序列是miR181靶标。Chen C-Z和Lodish H,Seminars inImmunology(2005)17(2):155-165披露了miR-181，它是在小鼠骨髓内的B细胞中特异性表达的miRNA(Chen和Lodish,2005)。所述文献还披露，一些人miRNA与白血病相关。
靶序列可以与miRNA完全或部分互补。术语“完全互补”意指，靶序列的核酸序列与识别所述靶序列的miRNA的序列100％互补。术语“部分互补”意指，靶序列与识别所述靶序列的miRNA的序列仅部分互补，借此部分互补的序列仍然被miRNA识别。换句话说，在本公开文本的上下文中，部分互补的靶序列有效识别相应miRNA，并且实现在表达该miRNA的细胞中防止或减少转基因表达。miRNA靶序列的例子描述于以下文献中：WO 2007/000668、WO2004/094642、WO 2010/055413或WO 2010/125471，将上述文献通过引用以其整体并入本文。
A.2.配制品的赋形剂、载体和其他成分
出于基因疗法的目的，慢病毒载体(LV)通常被全身性地给予，即直接进入患者的血流中。因此，产生无毒但仍保持LV的稳定性和效力的LV配制品具有广泛的意义。在测试媒介物以产生适于全身性给予的LV配制品时，必须牢记某些核心原则。为了确保对给予配制品的受试者的冲击最小，必须优化pH、离子浓度和容积渗透压摩尔浓度以匹配生理条件。缓冲液、盐和碳水化合物的组合(分别用于调节pH、离子浓度和容积渗透压摩尔浓度)不是可先验确定的，并且必须通过实验进行测试。
例如，US20170073702A1披露TSSM媒介物(20mM TRIS，100mM NaCl，1％(w/v)蔗糖，1％(w/v)甘露醇，pH 7.3)，其可能已经被预测为在对哺乳动物的全身性给予中是无毒的。然而，发现(参见实施例2)使用单独的或与LV组合的TSSM的配制品对小鼠有毒。然而，令人惊讶的是，当使用磷酸盐媒介物(10mM磷酸盐，100mM NaCl，3％(w/v)蔗糖，0.05％(w/v)P188，pH 7.3)或组氨酸媒介物(20mM组氨酸，100mM NaCl，使用3％(w/v)的蔗糖，0.05％(w/v)P188，pH 6.5)时，配制品对小鼠无毒。
因为先验无法预测，与TSSM配制品相比，具有磷酸盐媒介物的配制品导致LV的更高稳定性和完整性(实施例3和实施例4)。意料不到的是，组氨酸媒介物比磷酸盐媒介物赋予LV更大的稳定性(实施例4)。组氨酸配制品的这一关键特征，即与磷酸盐或TRIS缓冲液的中性pH(pH 7.3)相比，慢病毒载体与媒介物的较低pH(pH 6.5)的相容性至少出于以下原因而令人惊讶。VSV-G包膜蛋白是慢病毒载体的重要组分，其有利于慢病毒载体对细胞的感染性。VSV-G的pI(等电点)为大约5，其意味着随着溶液的pH接近pI，蛋白质上的电荷变得更中性。随着蛋白质的电荷变得更中性，它们相互吸引的能力更强，并且这可能导致聚集(劣化机制)，从而丧失感染能力。
同样令人惊讶的是，与TSSM配制品相比，在磷酸盐和组氨酸配制品中包含表面活性剂泊洛沙姆188(P188)赋予了增加的LV稳定性和完整性。这是意料不到的，因为据预测表面活性剂会使LV的外脂质膜包膜不稳定，从而降低LV的稳定性和完整性。类似地，将甘露醇从配制品中去除将不是先验明显的，以产生具有更高LV稳定性和完整性的配制品(实施例3和实施例4)。
这样，基于本文所述的发现，发现包含无TRIS缓冲体系的慢病毒载体制剂提供增加的慢病毒载体稳定性和完整性。本领域技术人员将理解，无TRIS缓冲体系是指不包含TRIS(也称为三(羟甲基)氨基甲烷、三甲胺或THAM)的任何缓冲体系。在某些实施方案中，无TRIS缓冲体系包含磷酸盐。在某些实施方案中，无TRIS缓冲体系包含组氨酸。
在某些实施方案中，无TRIS缓冲体系或制剂的pH为约6.0至约8.0。在某些实施方案中，无TRIS缓冲体系或制剂的pH为约6.0至约7.5。在某些实施方案中，无TRIS缓冲体系或制剂的pH为约6.0至约7.0。在某些实施方案中，无TRIS缓冲体系或制剂的pH为约7.0至约8.0。在某些实施方案中，无TRIS缓冲体系或制剂的pH为约6.5。在某些实施方案中，无TRIS缓冲体系或制剂的pH为约7.3。
技术人员将能够确定在本文公开的制剂的无TRIS缓冲体系中使用的合适的缓冲组分，以维持目标pH或目标pH范围。在某些实施方案中，无TRIS缓冲体系包含有效pH缓冲范围为约6.0至约8.0的缓冲组分。在某些实施方案中，无TRIS缓冲体系包含有效pH缓冲范围为约6.0至约7.5的缓冲组分。在某些实施方案中，无TRIS缓冲体系包含有效pH缓冲范围为约6.0至约7.0的缓冲组分。在某些实施方案中，无TRIS缓冲体系包含有效pH缓冲范围为约7.0至约8.0的缓冲组分。在某些实施方案中，无TRIS缓冲体系包含有效pH缓冲范围可维持6.5的pH的缓冲组分。在某些实施方案中，无TRIS缓冲体系包含有效pH缓冲范围可维持为7.3的pH的缓冲组分。
包含本文公开的慢病毒基因疗法载体或本公开文本的宿主细胞(例如，用本文公开的慢病毒基因疗法载体靶向的肝细胞)的组合物可以含有合适的药学上可接受的载体。例如，所述组合物可以含有有助于将活性化合物加工成设计用于递送至作用位点的制剂的赋形剂和/或助剂。
药物组合物可以经配制用于通过推注注射进行肠胃外给予(即静脉内、皮下或肌内)。注射用配制品可以以单位剂型存在，例如在添加有防腐剂的安瓿中或多剂量容器中。组合物可以采取诸如以下等形式：于油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳液，并且含有配制剂如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。可替代地，活性成分可以呈粉末形式，用于用合适媒介物(例如，无热原水)来构造。
适于肠胃外给予的配制品还包括呈水溶性形式(例如，水溶性盐)的活性化合物的水溶液。另外，可以给予作为适当油性注射悬浮液的活性化合物的悬浮液。适宜亲脂溶剂或媒介物包括脂肪油(例如，芝麻油)或合成脂肪酸酯(例如，油酸乙酯或甘油三酯)。水性注射悬浮液可以含有增加悬浮液粘度的物质，包括例如羧甲基纤维素钠、山梨醇和葡聚糖。任选地，悬浮液还可以含有稳定剂。脂质体还可以用于包封本公开文本的分子，用于递送至细胞或间质空间中。示例性药学上可接受的载体是生理上相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂、水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等。在一些实施方案中，组合物包含等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露醇、山梨醇)或氯化钠。在其他实施方案中，组合物包含增强活性成分的贮存期限或有效性的药学上可接受的物质(如润湿剂)或少量辅助物质(如润湿或乳化剂、防腐剂或缓冲剂)。
本公开文本的组合物可以呈多种形式，包括例如液体(例如，可注射和可输注的溶液)、分散体、悬浮液、半固体和固体剂型。优选形式取决于给予模式和治疗应用。
组合物可以配制为溶液、微乳液、分散体、脂质体或其他适于高药物浓度的有序结构。无菌可注射溶液可以通过以下方式制备：将活性成分以所需量并入视需要具有上文所列举成分中的一种或组合的适当溶剂中，之后过滤灭菌。通常，分散体是通过以下方式来制备：将活性成分并入无菌媒介物中，所述媒介物含有基础分散介质和来自上文所列举的那些成分的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选制备方法为真空干燥和冷冻干燥，所述真空干燥和冷冻干燥由先前无菌过滤的溶液产生活性成分和任何另外所需成分的粉末。可以例如通过以下方式维持溶液的适当流动性：通过使用包衣如卵磷脂，在分散体情况下通过维持所需粒径，以及通过使用表面活性剂。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中包含延迟吸收的药剂来实现，所述药剂例如单硬脂酸盐和明胶。
活性成分可以用受控释放配制品或装置来配制。此类配制品和装置的例子包括植入物、经皮贴剂和微包封递送系统。可以使用生物可降解的生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备此类配制品和装置的方法是本领域已知的。参见例如，Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson编辑,Marcel Dekker,Inc.,纽约,1978。
可注射长效配制品可以通过以下方式来制备：形成药物于生物可降解聚合物(如聚丙交酯-聚乙交酯)中的微包封基质。根据药物与聚合物的比率以及所采用聚合物的性质，可以控制药物释放速率。其他示例性生物可降解聚合物是聚原酸酯和聚酐。可注射长效配制品还可以通过将药物捕集于脂质体或微乳液中来制备。
可以将补充性活性化合物并入组合物中。在一个实施方案中，用另一凝血因子或其变体、片段、类似物或衍生物配制本公开文本的嵌合蛋白。例如，凝血因子包括但不限于因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII、因子XIII、凝血酶原、纤维蛋白原、血管性血友病因子或重组可溶性组织因子(rsTF)或前述任一种的激活形式。凝血因子或止血剂还可以包括抗纤维蛋白溶药，例如ε-氨基己酸、氨甲环酸。
可以调节剂量方案以提供最佳所需反应。例如，可以给予单次推注，可以随时间给予若干次分开剂量，或者可以如治疗情况的紧迫性所示成比例地减少或增加剂量。有利的是以剂量单位形式配制肠胃外组合物，以便于剂量的给予和统一。参见例如，Remington'sPharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.,宾夕法尼亚州伊斯顿1980)。
除了活性化合物以外，液体剂型还可以含有惰性成分，如水、乙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯。
适宜药物载体的非限制性例子也描述于E.W.Martin的Remington'sPharmaceutical Sciences中。赋形剂的一些例子包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、水稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂乳粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。组合物还可以含有pH缓冲试剂以及润湿或乳化剂。
对于口服给予，药物组合物可以采取通过常规手段制备的片剂或胶囊的形式。还可以将组合物制备为液体，例如糖浆或悬浮液。液体可以包括悬浮剂(例如，山梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪)、乳化剂(卵磷脂或阿拉伯胶)、非水性媒介物(例如，扁桃仁油、油性酯、乙醇或分馏植物油)和防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)。制剂还可以包括矫味剂、着色剂和甜味剂。可替代地，组合物可以作为干产物存在，用于用水或另一种适宜媒介物来构造。
对于经颊给予，组合物可以采取根据常规方案的片剂或锭剂的形式。
对于通过吸入给予，根据本公开文本使用的化合物便捷地以含有或不含赋形剂的雾化气溶胶的形式或以气溶胶喷雾剂的形式从任选地具有推进剂的加压包或雾化器递送，所述推进剂是例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟甲烷、二氧化碳或其他适宜气体。在加压气溶胶的情况下，剂量单位可以通过提供阀以递送计量量来确定。例如用于吸入器或吹入器中的明胶的胶囊和药筒可以配制为含有化合物与合适粉末基质(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
药物组合物还可以经配制用于作为例如含有常规栓剂基质(如可可脂或其他甘油酯)的栓剂或保留灌肠剂经直肠给予。
在一个实施方案中，药物组合物包含慢病毒载体和药学上可接受的载体，所述慢病毒载体包含编码具有因子VIII或因子IX活性的多肽的优化的核酸分子。在另一个实施方案中，药物组合物包含宿主细胞(例如，肝细胞)和药学上可接受的载体，所述宿主细胞包含慢病毒载体，所述慢病毒载体包含编码具有因子VIII或因子IX活性的多肽的优化的核酸分子。
在一些实施方案中，组合物是通过选自以下的途径来给予：局部给予、眼内给予、肠胃外给予、鞘内给予、硬膜下给予和口服给予。肠胃外给予可以是静脉内或皮下给予。
确保治疗性配制品从实验室转变为具有高且一致质量的可制造且可销售产品的基本方面是它们在剂型中的稳定性。由于其复杂的化学和结构，蛋白质(如病毒的表面蛋白和衣壳蛋白)易发生各种形式的物理和化学劣化，从而可能损害最终药物产品的生物学功效和安全性。例如，蛋白质聚集是关键的质量属性，所述质量属性对于基于蛋白质的产品要定期监测并且对于确定产品贮存期限是关键的。从根本上讲，蛋白质聚集与蛋白质天然形式的稳定性相关联，其在非天然细胞(例如非天然哺乳动物细胞)中的生长通常与增加的聚集速率和程度相关联。因此，毫不奇怪的是，通常通过使用旨在增加蛋白质构象稳定性的赋形剂或配制条件来介导在产品贮存期限期间控制和最小化聚集(动力学稳定性)的尝试。本质上，目的是使蛋白质稳定处于其天然构象，以使有聚集能力的“非天然”种类的群体最小化。通常使用糖和多元醇(如蔗糖、海藻糖、甘露醇、山梨糖醇等)使蛋白质稳定处于其天然状态并降低聚集速率。然而，使用这些稳定剂的不希望效应是溶液粘度的浓度依赖性增加。
溶液粘度是蛋白质产品(尤其是在高蛋白质浓度下配制的那些)的关键属性，并且它可能显著影响产品的效用和成功。产品的可制造性和患者或保健从业者的最终使用与溶液无缝流动的能力紧密相关。例如，高粘度可能需要使用专用给予装置或方案，所述装置或方案可能并不总是适合于所需群体，从而限制了产品的使用。在其他情况下，高溶液粘度可能需要应用可能对蛋白质的稳定性产生负面影响的制造技术(例如高温处理)。因此，通常在高蛋白质浓度的溶液中采用降粘赋形剂(如盐和氨基酸)。然而，这些赋形剂可能对蛋白质的稳定性产生负面影响，从而导致与缺少降粘剂的高粘度对照溶液相比，溶液的聚集速率有所增加。本质上，常用的稳定剂和降粘赋形剂可能对产品性能产生相反的作用，从而使产品开发复杂化。
可注射产品(大多数基于蛋白质的产品)需要考虑的另一个关键属性是其重量渗透压摩尔浓度。虽然静脉内溶液通常需要等渗，但皮下溶液通常是高渗的。实际上，文献中有证据表明，在皮下给予后，高渗配制品产生增强的蛋白质生物利用度(Fathallah,A.M.等人,Biopharm Drug Dispos.2015年3月；36(2):115-25)。因此，在临床开发阶段期间，需要仔细监测和表征在患者群体中溶液重量渗透压摩尔浓度(以及因此张度)对注射位点不适和/或反应以及生物利用度的影响。
配制品有时可以含有可能赋予某些益处的表面活性剂(如泊洛沙姆和聚山梨醇酯)。泊洛沙姆是非离子聚(环氧乙烷)(PEO)-聚(环氧丙烷)(PPO)共聚物。它们在药物配制品中用作表面活性剂、乳化剂、增溶剂、分散剂和体内吸收增强剂。泊洛沙姆是具有以下核心式的合成三嵌段共聚物：(PEO)a-(PPO)b-(PEO)a。所有泊洛沙姆均具有相似的化学结构，但其分子量以及亲水性PEO嵌段和疏水性PPO嵌段的组成不同。两种最常用的泊洛沙姆是分子量范围为7680至9510Da的泊洛沙姆188(a＝80，b＝27)和分子量范围为9840至14600Da的泊洛沙姆407(a＝101，b＝56)。其他泊洛沙姆包括：泊洛沙姆101(P101)、泊洛沙姆105(P105)、泊洛沙姆108(P108)、泊洛沙姆122(P122)、泊洛沙姆123(P123)、泊洛沙姆124(P124)、泊洛沙姆181(P181)、泊洛沙姆182(P182)、泊洛沙姆183(P183)、泊洛沙姆184(P184)、泊洛沙姆185(P185)、泊洛沙姆212(P212)、泊洛沙姆215(P215)、泊洛沙姆217(P217)、泊洛沙姆231(P231)、泊洛沙姆234(P234)、泊洛沙姆235(P235)、泊洛沙姆237(P237)、泊洛沙姆238(P238)、泊洛沙姆282(P282)、泊洛沙姆284(P284)、泊洛沙姆288(P288)、泊洛沙姆331(P331)、泊洛沙姆333(P333)、泊洛沙姆334(P334)、泊洛沙姆335(P335)、泊洛沙姆338(P338)、泊洛沙姆401(P401)、泊洛沙姆402(P402)和泊洛沙姆403(P403)。
聚山梨醇酯是在一些药物和食物制备配制品中使用的一类乳化剂。聚山梨醇酯是源自被脂肪酸酯化的乙氧基化脱水山梨糖醇(山梨糖醇的衍生物)的油状液体。聚山梨醇酯的常见品牌名称包括Scattics、Alkest、Canarcel和Tween。聚山梨醇酯的命名约定通常如下：聚山梨醇酯x(聚氧乙烯(y)脱水山梨糖醇单'z')，其中x与聚氧乙烯脱水山梨糖醇所缔合的脂肪酸(z)的类型有关，并且y是指在聚山梨醇酯分子中发现的氧乙烯-(CH2CH2O)-基团的总数。聚山梨醇酯的例子包括：(a)聚山梨醇酯20(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯)、(b)聚山梨醇酯40(聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单棕榈酸酯)、(c)聚山梨醇酯60(聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单硬脂酸酯)、和(d)聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)。
B.用于治疗血液障碍的慢病毒载体(LV)配制品
在一方面，本发明涉及重组慢病毒载体制剂，所述重组慢病毒载体制剂包含：(a)有效剂量的重组慢病毒载体；(b)无TRIS缓冲体系；(c)盐；(d)表面活性剂；(e)碳水化合物，和(f)与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的因子VIII(FVIII)编码序列或SEQ ID NO:3所示的因子IX(FIX)编码序列至少80％相同的核苷酸序列，其中所述药物组合物适于全身性给予至人患者。在某些实施方案中，所述载体包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的因子VIII(FVIII)编码序列。在某些实施方案中，所述载体包含SEQ ID NO:3所示的因子IX(FIX)编码序列。
在另一方面，本发明提供了重组慢病毒载体制剂，所述重组慢病毒载体制剂包含：(a)治疗有效剂量的重组慢病毒载体；(b)无TRIS缓冲体系；(c)盐；(d)表面活性剂；和(e)碳水化合物，其中所述重组慢病毒载体包含核酸，所述核酸包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的因子VIII(FVIII)编码序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的核苷酸序列或与SEQ ID NO:3所示的因子IX(FIX)编码序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的核苷酸序列，并且其中所述药物组合物适于全身性给予至人患者。在某些实施方案中，所述重组慢病毒载体包含核酸，所述核酸包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的因子VIII(FVIII)编码序列。在某些实施方案中，所述重组慢病毒载体包含核酸，所述核酸包含SEQ ID NO:3所示的因子IX(FIX)编码序列。在某些实施方案中，所述重组慢病毒载体包含核酸，所述核酸由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的因子VIII(FVIII)编码序列组成。在某些实施方案中，所述重组慢病毒载体包含核酸，所述核酸由SEQID NO:3所示的因子IX(FIX)编码序列组成。
在某些实施方案中，所述缓冲体系的pH为约6.0至约8.0。在某些实施方案中，所述缓冲体系的pH为约6.0至约7.5。在某些实施方案中，所述缓冲体系的pH为约6.0至约7.0。在某些实施方案中，所述缓冲体系的pH为约6.0至约8.0。在某些实施方案中，所述缓冲体系的pH为约6.5。在某些实施方案中，所述缓冲体系的pH为约7.3。在某些实施方案中，所述缓冲体系是磷酸盐缓冲液或组氨酸缓冲液。在某些实施方案中，所述磷酸盐或组氨酸缓冲液的浓度为约5mM至约30mM。在某些实施方案中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为约10mM至约20mM、约10mM至约15mM、约20mM至约30mM、约20mM至约25mM、或约15mM至约20mM。在某些实施方案中，所述盐是氯化物盐。在某些实施方案中，所述氯化物盐的浓度为约80mM至约150mM。在某些实施方案中，所述盐的浓度为约100mM、约110mM、约130mM或约150mM。在某些实施方案中，所述表面活性剂是泊洛沙姆或聚山梨醇酯。在某些实施方案中，所述泊洛沙姆或聚山梨醇酯的浓度为约0.01％(w/v)至约0.1％(w/v)。在某些实施方案中，所述碳水化合物是蔗糖。在某些实施方案中，所述碳水化合物的浓度为约0.5％(w/v)至约5％(w/v)。在某些实施方案中，所述氯化物盐是氯化钠(NaCl)。在某些实施方案中，所述泊洛沙姆选自泊洛沙姆101(P101)、泊洛沙姆105(P105)、泊洛沙姆108(P108)、泊洛沙姆122(P122)、泊洛沙姆123(P123)、泊洛沙姆124(P124)、泊洛沙姆181(P181)、泊洛沙姆182(P182)、泊洛沙姆183(P183)、泊洛沙姆184(P184)、泊洛沙姆185(P185)、泊洛沙姆188(P188)、泊洛沙姆212(P212)、泊洛沙姆215(P215)、泊洛沙姆217(P217)、泊洛沙姆231(P231)、泊洛沙姆234(P234)、泊洛沙姆235(P235)、泊洛沙姆237(P237)、泊洛沙姆238(P238)、泊洛沙姆282(P282)、泊洛沙姆284(P284)、泊洛沙姆288(P288)、泊洛沙姆331(P331)、泊洛沙姆333(P333)、泊洛沙姆334(P334)、泊洛沙姆335(P335)、泊洛沙姆338(P338)、泊洛沙姆401(P401)、泊洛沙姆402(P402)、泊洛沙姆403(P403)、泊洛沙姆407(P407)及其组合。在某些实施方案中，所述聚山梨醇酯选自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80及其组合。在某些实施方案中，所述磷酸盐或组氨酸缓冲液的pH为约6.1、约6.3、约6.5、约6.7、约6.9、约7.1、约7.3、约7.5、约7.7或约7.9。在某些实施方案中，所述磷酸盐或组氨酸缓冲液的浓度为约10mM、约15mM、约20mM或约25mM。在某些实施方案中，所述氯化物盐为约100mM、约110mM、约130mM或约150mM。在某些实施方案中，所述泊洛沙姆或聚山梨醇酯的浓度为约0.03％(w/v)、约0.05％(w/v)、约0.07％(w/v)或约0.09％(w/v)。在某些实施方案中，所述碳水化合物的浓度为约1％(w/v)、约2％(w/v)、约3％(w/v)或约4％(w/v)。在某些实施方案中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆188(P188)。在某些实施方案中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆407(P407)。
在某些实施方案中，本公开文本提供了重组慢病毒载体制剂，所述重组慢病毒载体制剂包含：(a)治疗有效剂量的重组慢病毒载体；(b)约10mM磷酸盐；(c)约100mM氯化钠；(d)约0.05％(w/v)泊洛沙姆188和(e)约3％(w/v)蔗糖，其中所述制剂的pH值为约7.3，其中所述药物组合物适于全身性给予至人患者，并且其中所述重组慢病毒载体包含核酸，所述核酸包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的因子VIII(FVIII)编码序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:3所示的IX因子(FIX)编码序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的核苷酸序列，并且其中所述药物组合物适于全身性给予至人患者。在某些实施方案中，所述重组慢病毒载体包含核酸，所述核酸包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的因子VIII(FVIII)编码序列。在某些实施方案中，所述重组慢病毒载体包含核酸，所述核酸包含SEQ ID NO:3所示的因子IX(FIX)编码序列。在某些实施方案中，所述重组慢病毒载体包含核酸，所述核酸由SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2所示的因子VIII(FVIII)编码序列组成。在某些实施方案中，所述重组慢病毒载体包含核酸，所述核酸由SEQ ID NO:3所示的因子IX(FIX)编码序列组成。
在某些实施方案中，本公开文本提供了重组慢病毒载体制剂，所述重组慢病毒载体制剂包含：(a)治疗有效剂量的重组慢病毒载体；(b)约10mM磷酸盐；(c)约130mM氯化钠；(d)约0.05％(w/v)泊洛沙姆188和(e)约1％(w/v)蔗糖，其中所述制剂的pH值为约7.3，其中所述药物组合物适于全身性给予至人患者，并且其中所述重组慢病毒载体包含核酸，所述核酸包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的因子VIII(FVIII)编码序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:3所示的IX因子(FIX)编码序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的核苷酸序列，并且其中所述药物组合物适于全身性给予至人患者。在某些实施方案中，所述重组慢病毒载体包含核酸，所述核酸包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的因子VIII(FVIII)编码序列。在某些实施方案中，所述重组慢病毒载体包含核酸，所述核酸包含SEQ ID NO:3所示的因子IX(FIX)编码序列。在某些实施方案中，所述重组慢病毒载体包含核酸，所述核酸由SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2所示的因子VIII(FVIII)编码序列组成。在某些实施方案中，所述重组慢病毒载体包含核酸，所述核酸由SEQ ID NO:3所示的因子IX(FIX)编码序列组成。
在某些实施方案中，本公开文本提供了重组慢病毒载体制剂，所述重组慢病毒载体制剂包含：(a)治疗有效剂量的重组慢病毒载体；(b)约20mM组氨酸；(c)约100mM氯化钠；(d)约0.05％(w/v)泊洛沙姆188和(e)约3％(w/v)蔗糖，其中所述制剂的pH值为约6.5，其中所述药物组合物适于全身性给予至人患者，并且其中所述重组慢病毒载体包含核酸，所述核酸包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的因子VIII(FVIII)编码序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:3所示的IX因子(FIX)编码序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的核苷酸序列，并且其中所述药物组合物适于全身性给予至人患者。在某些实施方案中，所述重组慢病毒载体包含核酸，所述核酸包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的因子VIII(FVIII)编码序列。在某些实施方案中，所述重组慢病毒载体包含核酸，所述核酸包含SEQ ID NO:3所示的因子IX(FIX)编码序列。在某些实施方案中，所述重组慢病毒载体包含核酸，所述核酸由SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2所示的因子VIII(FVIII)编码序列组成。在某些实施方案中，所述重组慢病毒载体包含核酸，所述核酸由SEQ ID NO:3所示的因子IX(FIX)编码序列组成。
在某些实施方案中，本公开文本提供了重组慢病毒载体制剂，所述重组慢病毒载体制剂包含：(a)治疗有效剂量的重组慢病毒载体；(b)约10mM磷酸盐；(c)约100mM氯化钠；(d)约0.05％(w/v)泊洛沙姆188和(e)约3％(w/v)蔗糖，其中所述制剂的pH值为约7.0，其中所述药物组合物适于全身性给予至人患者，并且其中所述重组慢病毒载体包含核酸，所述核酸包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的因子VIII(FVIII)编码序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:3所示的IX因子(FIX)编码序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的核苷酸序列，并且其中所述药物组合物适于全身性给予至人患者。在某些实施方案中，所述重组慢病毒载体包含核酸，所述核酸包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的因子VIII(FVIII)编码序列。在某些实施方案中，所述重组慢病毒载体包含核酸，所述核酸包含SEQ ID NO:3所示的因子IX(FIX)编码序列。在某些实施方案中，所述重组慢病毒载体包含核酸，所述核酸由SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2所示的因子VIII(FVIII)编码序列组成。在某些实施方案中，所述重组慢病毒载体包含核酸，所述核酸由SEQ ID NO:3所示的因子IX(FIX)编码序列组成。
在某些实施方案中，本公开文本提供了重组慢病毒载体制剂，所述重组慢病毒载体制剂包含：(a)治疗有效剂量的重组慢病毒载体；(b)约20mM组氨酸；(c)约100mM氯化钠；(d)约0.05％(w/v)泊洛沙姆188和(e)约3％(w/v)蔗糖，其中所述制剂的pH值为约7.0，其中所述药物组合物适于全身性给予至人患者，并且其中所述重组慢病毒载体包含核酸，所述核酸包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的因子VIII(FVIII)编码序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:3所示的IX因子(FIX)编码序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的核苷酸序列，并且其中所述药物组合物适于全身性给予至人患者。在某些实施方案中，所述重组慢病毒载体包含核酸，所述核酸包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的因子VIII(FVIII)编码序列。在某些实施方案中，所述重组慢病毒载体包含核酸，所述核酸包含SEQ ID NO:3所示的因子IX(FIX)编码序列。在某些实施方案中，所述重组慢病毒载体包含核酸，所述核酸由SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2所示的因子VIII(FVIII)编码序列组成。在某些实施方案中，所述重组慢病毒载体包含核酸，所述核酸由SEQ ID NO:3所示的因子IX(FIX)编码序列组成。
在某些实施方案中，所述重组慢病毒载体包含编码VSV-G或其片段的核苷酸序列。在某些实施方案中，所述重组慢病毒载体包含增强型运甲状腺素蛋白(ET)启动子。在某些实施方案中，所述重组慢病毒载体包含与SEQ ID NO:7所示的miR-142的靶序列至少90％相同的核苷酸序列。
在某些实施方案中，所述重组慢病毒载体从包括以下的转染宿主细胞中分离：CHO细胞、HEK293细胞、BHK21细胞、PER.C6细胞、NSO细胞和CAP细胞。在某些实施方案中，所述宿主细胞是CD47阳性宿主细胞。
在某些实施方案中，所述制剂全身性给予至所述人患者。在某些实施方案中，所述制剂是静脉内给予的。
在某些实施方案中，所述缓冲体系的pH在6.0与8.0之间。在某些实施方案中，所述缓冲体系是磷酸盐缓冲液或组氨酸缓冲液。在某些实施方案中，所述磷酸盐或组氨酸缓冲液的浓度在5mM与30mM之间。在某些实施方案中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为约10至约20mM、约10至约15mM、约20至约30mM、约20至约25mM或约15至约20mM。在某些实施方案中，所述盐是氯化物盐。在某些实施方案中，所述氯化物盐的浓度在80mM与150mM之间。在某些实施方案中，所述盐的浓度为约100mM、约110mM、约130mM或约150mM。在某些实施方案中，所述表面活性剂是泊洛沙姆或聚山梨醇酯。在某些实施方案中，所述泊洛沙姆或聚山梨醇酯的浓度在0.01％(w/v)与0.1％(w/v)之间。在某些实施方案中，所述碳水化合物是蔗糖。在某些实施方案中，所述碳水化合物的浓度在0.5％(w/v)与5％(w/v)之间。在某些实施方案中，所述氯化物盐是NaCl。在某些实施方案中，所述泊洛沙姆选自泊洛沙姆101(P101)、泊洛沙姆105(P105)、泊洛沙姆108(P108)、泊洛沙姆122(P122)、泊洛沙姆123(P123)、泊洛沙姆124(P124)、泊洛沙姆181(P181)、泊洛沙姆182(P182)、泊洛沙姆183(P183)、泊洛沙姆184(P184)、泊洛沙姆185(P185)、泊洛沙姆188(P188)、泊洛沙姆212(P212)、泊洛沙姆215(P215)、泊洛沙姆217(P217)、泊洛沙姆231(P231)、泊洛沙姆234(P234)、泊洛沙姆235(P235)、泊洛沙姆237(P237)、泊洛沙姆238(P238)、泊洛沙姆282(P282)、泊洛沙姆284(P284)、泊洛沙姆288(P288)、泊洛沙姆331(P331)、泊洛沙姆333(P333)、泊洛沙姆334(P334)、泊洛沙姆335(P335)、泊洛沙姆338(P338)、泊洛沙姆401(P401)、泊洛沙姆402(P402)、泊洛沙姆403(P403)、泊洛沙姆407(P407)及其组合。在某些实施方案中，所述聚山梨醇酯选自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80及其组合。在某些实施方案中，所述磷酸盐或组氨酸缓冲液的pH为6.1、6.3、6.5、6.7、6.9、7.1、7.3、7.5、7.7或7.9。在某些实施方案中，所述磷酸盐或组氨酸缓冲液的浓度为10mM、15mM、20mM或25mM。在某些实施方案中，所述氯化物盐为100mM、110mM、130mM或150mM。在某些实施方案中，所述泊洛沙姆或聚山梨醇酯的浓度为0.03％(w/v)、0.05％(w/v)、0.07％(w/v)或0.09％(w/v)。在某些实施方案中，所述碳水化合物的浓度为1％(w/v)、2％(w/v)、3％(w/v)或4％(w/v)。在某些实施方案中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆188(P188)。在某些实施方案中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆407(P407)。
在一方面，本发明涉及重组慢病毒载体制剂，所述重组慢病毒载体制剂包含：(a)有效剂量的重组慢病毒载体；(b)无TRIS缓冲体系；(c)盐；(d)表面活性剂；(e)碳水化合物，和(f)增强型运甲状腺素蛋白(ET)启动子，其中所述药物组合物适于全身性给予至人患者。在某些实施方案中，所述载体进一步包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的因子VIII(FVIII)编码序列或SEQ ID NO:3所示的因子IX(FIX)编码序列至少80％相同的核苷酸序列，其中所述药物组合物适于全身性给予至人患者。在某些实施方案中，所述载体包含SEQID NO:1或SEQ ID NO:2所示的因子VIII(FVIII)编码序列。在某些实施方案中，所述载体包含SEQ ID NO:3所示的因子IX(FIX)编码序列。
在某些实施方案中，所述载体进一步包含编码VSV-G或其片段的核苷酸序列。在某些实施方案中，所述缓冲体系的pH在6.0与8.0之间。在某些实施方案中，所述缓冲体系是磷酸盐缓冲液或组氨酸缓冲液。在某些实施方案中，所述磷酸盐或组氨酸缓冲液的浓度在5mM与30mM之间。在某些实施方案中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为约10至约20mM、约10至约15mM、约20至约30mM、约20至约25mM或约15至约20mM。在某些实施方案中，所述盐是氯化物盐。在某些实施方案中，所述氯化物盐的浓度在80mM与150mM之间。在某些实施方案中，所述盐的浓度为约100mM、约110mM、约130mM或约150mM。在某些实施方案中，所述表面活性剂是泊洛沙姆或聚山梨醇酯。在某些实施方案中，所述泊洛沙姆或聚山梨醇酯的浓度在0.01％(w/v)与0.1％(w/v)之间。在某些实施方案中，所述碳水化合物是蔗糖。在某些实施方案中，所述碳水化合物的浓度在0.5％(w/v)与5％(w/v)之间。在某些实施方案中，所述氯化物盐是NaCl。在某些实施方案中，所述泊洛沙姆选自泊洛沙姆101(P101)、泊洛沙姆105(P105)、泊洛沙姆108(P108)、泊洛沙姆122(P122)、泊洛沙姆123(P123)、泊洛沙姆124(P124)、泊洛沙姆181(P181)、泊洛沙姆182(P182)、泊洛沙姆183(P183)、泊洛沙姆184(P184)、泊洛沙姆185(P185)、泊洛沙姆188(P188)、泊洛沙姆212(P212)、泊洛沙姆215(P215)、泊洛沙姆217(P217)、泊洛沙姆231(P231)、泊洛沙姆234(P234)、泊洛沙姆235(P235)、泊洛沙姆237(P237)、泊洛沙姆238(P238)、泊洛沙姆282(P282)、泊洛沙姆284(P284)、泊洛沙姆288(P288)、泊洛沙姆331(P331)、泊洛沙姆333(P333)、泊洛沙姆334(P334)、泊洛沙姆335(P335)、泊洛沙姆338(P338)、泊洛沙姆401(P401)、泊洛沙姆402(P402)、泊洛沙姆403(P403)、泊洛沙姆407(P407)及其组合。在某些实施方案中，所述聚山梨醇酯选自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80及其组合。在某些实施方案中，所述磷酸盐或组氨酸缓冲液的pH为6.1、6.3、6.5、6.7、6.9、7.1、7.3、7.5、7.7或7.9。在某些实施方案中，所述磷酸盐或组氨酸缓冲液的浓度为10mM、15mM、20mM或25mM。在某些实施方案中，所述氯化物盐为100mM、110mM、130mM或150mM。在某些实施方案中，所述泊洛沙姆或聚山梨醇酯的浓度为0.03％(w/v)、0.05％(w/v)、0.07％(w/v)或0.09％(w/v)。在某些实施方案中，所述碳水化合物的浓度为1％(w/v)、2％(w/v)、3％(w/v)或4％(w/v)。在某些实施方案中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆188(P188)。在某些实施方案中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆407(P407)。在一方面，本发明涉及重组慢病毒载体制剂，所述重组慢病毒载体制剂包含：(a)有效剂量的重组慢病毒载体；(b)无TRIS缓冲体系；(c)盐；(d)表面活性剂；(e)碳水化合物；和(f)与SEQ ID NO:7所示的miR-142的靶序列至少90％相同的核苷酸序列，其中所述药物组合物适于全身性给予至人患者。在某些实施方案中，所述载体进一步包含增强型运甲状腺素蛋白(ET)启动子。在某些实施方案中，所述载体进一步包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的因子VIII(FVIII)编码序列或SEQ ID NO:3所示的因子IX(FIX)编码序列至少80％相同的核苷酸序列。在某些实施方案中，所述载体包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的因子VIII(FVIII)编码序列。在某些实施方案中，所述载体包含SEQ ID NO:3所示的因子IX(FIX)编码序列。
在某些实施方案中，所述载体进一步包含编码VSV-G或其片段的核苷酸序列。在某些实施方案中，所述缓冲体系的pH在6.0与8.0之间。在某些实施方案中，所述缓冲体系是磷酸盐缓冲液或组氨酸缓冲液。在某些实施方案中，所述磷酸盐或组氨酸缓冲液的浓度在5mM与30mM之间。在某些实施方案中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为约10至约20mM、约10至约15mM、约20至约30mM、约20至约25mM或约15至约20mM。在某些实施方案中，所述盐是氯化物盐。在某些实施方案中，所述氯化物盐的浓度在80mM与150mM之间。在某些实施方案中，所述盐的浓度为约100mM、约110mM、约130mM或约150mM。在某些实施方案中，所述表面活性剂是泊洛沙姆或聚山梨醇酯。在某些实施方案中，所述泊洛沙姆或聚山梨醇酯的浓度在0.01％(w/v)与0.1％(w/v)之间。在某些实施方案中，所述碳水化合物是蔗糖。在某些实施方案中，所述碳水化合物的浓度在0.5％(w/v)与5％(w/v)之间。在某些实施方案中，所述氯化物盐是NaCl。在某些实施方案中，所述泊洛沙姆选自泊洛沙姆101(P101)、泊洛沙姆105(P105)、泊洛沙姆108(P108)、泊洛沙姆122(P122)、泊洛沙姆123(P123)、泊洛沙姆124(P124)、泊洛沙姆181(P181)、泊洛沙姆182(P182)、泊洛沙姆183(P183)、泊洛沙姆184(P184)、泊洛沙姆185(P185)、泊洛沙姆188(P188)、泊洛沙姆212(P212)、泊洛沙姆215(P215)、泊洛沙姆217(P217)、泊洛沙姆231(P231)、泊洛沙姆234(P234)、泊洛沙姆235(P235)、泊洛沙姆237(P237)、泊洛沙姆238(P238)、泊洛沙姆282(P282)、泊洛沙姆284(P284)、泊洛沙姆288(P288)、泊洛沙姆331(P331)、泊洛沙姆333(P333)、泊洛沙姆334(P334)、泊洛沙姆335(P335)、泊洛沙姆338(P338)、泊洛沙姆401(P401)、泊洛沙姆402(P402)、泊洛沙姆403(P403)、泊洛沙姆407(P407)及其组合。在某些实施方案中，所述聚山梨醇酯选自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80及其组合。在某些实施方案中，所述磷酸盐或组氨酸缓冲液的pH为6.1、6.3、6.5、6.7、6.9、7.1、7.3、7.5、7.7或7.9。在某些实施方案中，所述磷酸盐或组氨酸缓冲液的浓度为10mM、15mM、20mM或25mM。在某些实施方案中，所述氯化物盐为100mM、110mM、130mM或150mM。在某些实施方案中，所述泊洛沙姆或聚山梨醇酯的浓度为0.03％(w/v)、0.05％(w/v)、0.07％(w/v)或0.09％(w/v)。在某些实施方案中，所述碳水化合物的浓度为1％(w/v)、2％(w/v)、3％(w/v)或4％(w/v)。在某些实施方案中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆188(P188)。在某些实施方案中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆407(P407)。
在一方面，本发明涉及重组慢病毒载体制剂，其中所述重组慢病毒载体从包括以下的转染宿主细胞中分离：CHO细胞、HEK293细胞、BHK21细胞、PER.C6细胞、NSO细胞和CAP细胞，其中所述重组慢病毒载体制剂包括：(a)有效剂量的重组慢病毒载体；(b)无TRIS缓冲体系；(c)盐；(d)表面活性剂；和(e)碳水化合物，其中所述药物组合物适于全身性给予至人患者。在某些实施方案中，所述宿主细胞是CD47阳性宿主细胞。在某些实施方案中，所述载体进一步包含增强型运甲状腺素蛋白(ET)启动子。在某些实施方案中，所述载体进一步包含与SEQ ID NO:7所示的miR-142的靶序列至少90％相同的核苷酸序列。在某些实施方案中，所述载体进一步包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的因子VIII(FVIII)编码序列或SEQ ID NO:3所示的因子IX(FIX)编码序列至少80％相同的核苷酸序列。在某些实施方案中，所述载体包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的因子VIII(FVIII)编码序列。在某些实施方案中，所述载体包含SEQ ID NO:3所示的因子IX(FIX)编码序列。
在某些实施方案中，所述载体进一步包含编码VSV-G或其片段的核苷酸序列。在某些实施方案中，所述缓冲体系的pH在6.0与8.0之间。在某些实施方案中，所述缓冲体系是磷酸盐缓冲液或组氨酸缓冲液。在某些实施方案中，所述磷酸盐或组氨酸缓冲液的浓度在5mM与30mM之间。在某些实施方案中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为约10至约20mM、约10至约15mM、约20至约30mM、约20至约25mM或约15至约20mM。在某些实施方案中，所述盐是氯化物盐。在某些实施方案中，所述氯化物盐的浓度在80mM与150mM之间。在某些实施方案中，所述盐的浓度为约100mM、约110mM、约130mM或约150mM。在某些实施方案中，所述表面活性剂是泊洛沙姆或聚山梨醇酯。在某些实施方案中，所述泊洛沙姆或聚山梨醇酯的浓度在0.01％(w/v)与0.1％(w/v)之间。在某些实施方案中，所述碳水化合物是蔗糖。在某些实施方案中，所述碳水化合物的浓度在0.5％(w/v)与5％(w/v)之间。在某些实施方案中，所述氯化物盐是NaCl。在某些实施方案中，所述泊洛沙姆选自泊洛沙姆101(P101)、泊洛沙姆105(P105)、泊洛沙姆108(P108)、泊洛沙姆122(P122)、泊洛沙姆123(P123)、泊洛沙姆124(P124)、泊洛沙姆181(P181)、泊洛沙姆182(P182)、泊洛沙姆183(P183)、泊洛沙姆184(P184)、泊洛沙姆185(P185)、泊洛沙姆188(P188)、泊洛沙姆212(P212)、泊洛沙姆215(P215)、泊洛沙姆217(P217)、泊洛沙姆231(P231)、泊洛沙姆234(P234)、泊洛沙姆235(P235)、泊洛沙姆237(P237)、泊洛沙姆238(P238)、泊洛沙姆282(P282)、泊洛沙姆284(P284)、泊洛沙姆288(P288)、泊洛沙姆331(P331)、泊洛沙姆333(P333)、泊洛沙姆334(P334)、泊洛沙姆335(P335)、泊洛沙姆338(P338)、泊洛沙姆401(P401)、泊洛沙姆402(P402)、泊洛沙姆403(P403)、泊洛沙姆407(P407)及其组合。在某些实施方案中，所述聚山梨醇酯选自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80及其组合。在某些实施方案中，所述磷酸盐或组氨酸缓冲液的pH为6.1、6.3、6.5、6.7、6.9、7.1、7.3、7.5、7.7或7.9。在某些实施方案中，所述磷酸盐或组氨酸缓冲液的浓度为10mM、15mM、20mM或25mM。在某些实施方案中，所述氯化物盐为100mM、110mM、130mM或150mM。在某些实施方案中，所述泊洛沙姆或聚山梨醇酯的浓度为0.03％(w/v)、0.05％(w/v)、0.07％(w/v)或0.09％(w/v)。在某些实施方案中，所述碳水化合物的浓度为1％(w/v)、2％(w/v)、3％(w/v)或4％(w/v)。在某些实施方案中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆188(P188)。在某些实施方案中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆407(P407)。
在一方面，本发明涉及治疗患有障碍的人患者的方法，其中向所述人患者全身性地给予重组慢病毒载体制剂，所述重组慢病毒载体制剂包含：(a)(a)有效剂量的重组慢病毒载体；(b)无TRIS缓冲体系；(c)盐；(d)表面活性剂；和(e)碳水化合物，其中所述药物组合物适于全身性给予至人患者。在某些实施方案中，所述制剂全身性给予至所述人患者。在某些实施方案中，所述制剂是静脉内给予的。
在某些实施方案中，所述障碍是出血障碍。在某些实施方案中，所述出血障碍是血友病A或血友病B。
在某些实施方案中，所述载体进一步包含增强型运甲状腺素蛋白(ET)启动子。在某些实施方案中，所述载体进一步包含与SEQ ID NO:7所示的miR-142的靶序列至少90％相同的核苷酸序列。在某些实施方案中，所述载体进一步包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的因子VIII(FVIII)编码序列或SEQ ID NO:3所示的因子IX(FIX)编码序列至少80％相同的核苷酸序列。在某些实施方案中，所述载体包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的因子VIII(FVIII)编码序列。在某些实施方案中，所述载体包含SEQ ID NO:3所示的因子IX(FIX)编码序列。
在某些实施方案中，所述载体进一步包含编码VSV-G或其片段的核苷酸序列。在某些实施方案中，所述缓冲体系的pH在6.0与8.0之间。在某些实施方案中，所述缓冲体系是磷酸盐缓冲液或组氨酸缓冲液。在某些实施方案中，所述磷酸盐或组氨酸缓冲液的浓度在5mM与30mM之间。在某些实施方案中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为约10至约20mM、约10至约15mM、约20至约30mM、约20至约25mM或约15至约20mM。在某些实施方案中，所述盐是氯化物盐。在某些实施方案中，所述氯化物盐的浓度在80mM与150mM之间。在某些实施方案中，所述盐的浓度为约100mM、约110mM、约130mM或约150mM。在某些实施方案中，所述表面活性剂是泊洛沙姆或聚山梨醇酯。在某些实施方案中，所述泊洛沙姆或聚山梨醇酯的浓度在0.01％(w/v)与0.1％(w/v)之间。在某些实施方案中，所述碳水化合物是蔗糖。在某些实施方案中，所述碳水化合物的浓度在0.5％(w/v)与5％(w/v)之间。在某些实施方案中，所述氯化物盐是NaCl。在某些实施方案中，所述泊洛沙姆选自泊洛沙姆101(P101)、泊洛沙姆105(P105)、泊洛沙姆108(P108)、泊洛沙姆122(P122)、泊洛沙姆123(P123)、泊洛沙姆124(P124)、泊洛沙姆181(P181)、泊洛沙姆182(P182)、泊洛沙姆183(P183)、泊洛沙姆184(P184)、泊洛沙姆185(P185)、泊洛沙姆188(P188)、泊洛沙姆212(P212)、泊洛沙姆215(P215)、泊洛沙姆217(P217)、泊洛沙姆231(P231)、泊洛沙姆234(P234)、泊洛沙姆235(P235)、泊洛沙姆237(P237)、泊洛沙姆238(P238)、泊洛沙姆282(P282)、泊洛沙姆284(P284)、泊洛沙姆288(P288)、泊洛沙姆331(P331)、泊洛沙姆333(P333)、泊洛沙姆334(P334)、泊洛沙姆335(P335)、泊洛沙姆338(P338)、泊洛沙姆401(P401)、泊洛沙姆402(P402)、泊洛沙姆403(P403)、泊洛沙姆407(P407)及其组合。在某些实施方案中，所述聚山梨醇酯选自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80及其组合。在某些实施方案中，所述磷酸盐或组氨酸缓冲液的pH为6.1、6.3、6.5、6.7、6.9、7.1、7.3、7.5、7.7或7.9。在某些实施方案中，所述磷酸盐或组氨酸缓冲液的浓度为10mM、15mM、20mM或25mM。在某些实施方案中，所述氯化物盐为100mM、110mM、130mM或150mM。在某些实施方案中，所述泊洛沙姆或聚山梨醇酯的浓度为0.03％(w/v)、0.05％(w/v)、0.07％(w/v)或0.09％(w/v)。在某些实施方案中，所述碳水化合物的浓度为1％(w/v)、2％(w/v)、3％(w/v)或4％(w/v)。在某些实施方案中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆188(P188)。在某些实施方案中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆407(P407)。
B.1.出血障碍
出血障碍是由于血液在血管损伤位点形成凝块的能力受损所致。有若干种类型的出血障碍，包括血友病A、血友病B、血管性血友病和罕见因子缺乏症。血友病A起因于因子VIII的基因突变或表达不足引起的因子VIII(FVIII)的缺乏，而血友病B起因于因子IX的基因突变或表达不足引起的因子IX(FIX)的缺乏。
根据美国疾病控制和预防中心，大约每5,000例活产就有1例患血友病。在美国，有约20,000人患有血友病。所有人种和种族都受到影响。血友病A比血友病B多四倍，同时超过一半的血友病A患者患有严重形式的血友病。罹患血友病的人终其一生都需要广泛的医学监测。在没有干预的情况下，患病个体遭受关节内的自发性出血，这产生严重的疼痛和令人虚弱的行动受限。出血至肌肉中导致血液在这些组织中积累，而咽喉和颈部中的自发性出血，如果未及时治疗，可引起窒息。肾出血和术后、小的意外伤害或拔牙后的重度出血也是普遍的。
本文公开了用于在有需要的受试者中治疗出血疾病或病症的配制品。出血疾病或病症选自出血凝血障碍、关节积血、肌肉出血、口腔出血、出血症、出血至肌肉中、口腔出血症、创伤、头部创伤(trauma capitis)、胃肠出血、颅内出血、腹内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神经系统出血、咽后间隙出血、腹膜后间隙出血、髂腰肌鞘出血及其任何组合。在仍其他实施方案中，安排受试者进行手术。在又其他实施方案中，治疗是预防性的或按需的。
使用稳定且有效的慢病毒载体(LV)配制品的基因疗法显示通过将因子VIII或因子IX基因稳定整合到细胞中从而导致表达足够水平的功能性因子VIII或因子IX来治疗罹患血友病A或B的个体的巨大前景。
已经探索了体细胞基因疗法作为出血障碍的可能治疗方法。基因疗法由于其通过在单次给予编码相应凝血因子的载体后持续内源性产生FVIII或FIX来治愈疾病的潜力而成为特别有吸引力的血友病治疗方法。血友病A(缺乏FVIII)和血友病B(缺乏FIX)非常适合于基因替代方法，因为其临床表现可完全归因于缺少以微小量(200ng/ml)在血浆中循环的单一基因产物(FVIII或FIX)。
慢病毒由于其大容量和经由整合持续表达转基因的能力而作为基因递送媒介物逐渐引人注目。已经在众多离体细胞疗法临床计划中评估慢病毒，其具有有希望的功效和安全性概况，在过去十年中获得了广泛的经验。随着慢病毒在体内基因疗法中的使用日益普及，本领域需要提供增强慢病毒的稳定性以便长期储存的改善的配制品。
本公开文本通过提供赋予慢病毒稳定性(从而提供长期冷冻储存)的配制缓冲液或媒介物满足了本领域的重要需求。在某些示例性实施方案中，在给予途径是全身给予的情况下，配制缓冲液赋予慢病毒稳定性并提供长期冷冻储存。在一些实施方案中，将慢病毒在纯化后处理到本公开文本的配制缓冲液或媒介物中。配制后，将慢病毒冷冻储存。本发明的配制缓冲液或媒介物提供增强的在冷冻和解冻时以及暴露于升高的温度时的稳定性。
本文提供了慢病毒载体，所述慢病毒载体包含密码子优化FVIII序列或密码子优化FIX序列，当在基因疗法中使用时，所述序列在受试者中展示出增加的表达并且潜在地产生更大的治疗功效。本公开文本的实施方案涉及如本文所述的包含编码具有FVIII活性的多肽的一种或多种密码子优化核酸分子的慢病毒载体、或包含编码具有FIX活性的多肽的一种或多种密码子优化核酸分子的慢病毒载体、包含所述慢病毒载体的宿主细胞(例如，肝细胞)、以及所公开的慢病毒载体的使用方法(例如，使用本文公开的慢病毒载体对出血障碍的治疗)。在某些实施方案中，在按比例放大处理过程中，将慢病毒载体包装到慢病毒中，将所述慢病毒处理到本公开文本的配制缓冲液或媒介物中。
通常，本文公开的治疗方法涉及给予包含含有编码FVIII凝血因子的至少一种密码子优化核酸序列的核酸分子的慢病毒载体或包含含有编码FIX凝血因子的至少一种密码子优化核酸序列的核酸分子的慢病毒载体。在一些实施方案中，将编码FVIII凝血因子的核酸序列与合适的表达控制序列可操作地连接，在一些实施方案中将所述表达控制序列并入慢病毒载体(例如复制缺陷型慢病毒病毒载体)中。在一些实施方案中，将编码FIX凝血因子的核酸序列与合适的表达控制序列可操作地连接，在一些实施方案中将所述表达控制序列并入慢病毒载体(例如复制缺陷型慢病毒病毒载体)中。
本公开文本提供了在有需要的受试者中治疗出血障碍(例如，血友病A或血友病B)的方法，所述方法包括向受试者给予至少一个剂量的慢病毒载体，所述慢病毒载体包含含有编码具有FVIII或FIX活性的多肽的核苷酸序列的核酸分子。在某些实施方案中，将慢病毒载体包装到慢病毒中，所述慢病毒被处理到本发明的配制缓冲液中。在某些实施方案中，编码具有FVIII活性的多肽的核苷酸序列包括具有与SEQ ID NO:1所示的核酸序列(如表1所示)具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％或至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性的核苷酸序列。在某些实施方案中，编码具有FVIII活性的多肽的核苷酸序列由SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列(如表1所示)组成。在某些实施方案中，编码具有FVIII活性的多肽的核苷酸序列包括具有与SEQ ID NO:2所示的核酸序列(如表1所示)至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％或至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性的核苷酸序列。在某些实施方案中，编码具有FVIII活性的多肽的核苷酸序列由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列(如表1所示)组成。在某些实施方案中，编码具有FIX活性的多肽的核苷酸序列包括具有与SEQ ID NO:3所示的核酸序列(如表1所示)至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％或至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性的核苷酸序列。在某些实施方案中，编码具有FIX活性的多肽的核苷酸序列由SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列(如表1所示)组成。
本公开文本提供了在有需要的受试者中治疗出血障碍(例如，血友病A或血友病B)的方法，所述方法包括向受试者给予至少一个剂量的慢病毒载体，所述慢病毒载体包含含有编码具有FVIII或FIX活性的多肽的核苷酸序列的核酸分子。在某些实施方案中，将慢病毒载体包装到慢病毒中，所述慢病毒被处理到本发明的配制缓冲液或媒介物中。在某些实施方案中，向受试者给予5x1010或更少转导单位/kg(TU/kg)(或109TU/kg或更少、或108TU/kg或更少)的至少一个剂量的如本文所述的慢病毒载体，所述慢病毒载体包含含有编码具有FVIII或FIX活性的多肽的核苷酸序列的核酸分子。
在一些实施方案中，剂量为约5.0x1010TU/kg、约4.9x1010TU/kg、约4.8x1010TU/kg、约4.7x1010TU/kg、约4.6x1010TU/kg、约4.5x1010TU/kg、约4.4x1010TU/kg、约4.3x1010TU/kg、约4.2x1010TU/kg、约4.1x1010TU/kg、约4.0x1010TU/kg、约3.9x1010TU/kg、约3.8x1010TU/kg、约3.7x1010TU/kg、约3.6x1010TU/kg、约3.5x1010TU/kg、约3.4x1010TU/kg、约3.3x1010TU/kg、约3.2x1010TU/kg、约3.1x1010TU/kg、约3.0x1010TU/kg、约2.9x1010TU/kg、约2.8x1010TU/kg、约2.7x1010TU/kg、约2.6x1010TU/kg、约2.5x1010TU/kg、约2.4x1010TU/kg、约2.3x1010TU/kg、约2.2x1010TU/kg、约2.1x1010TU/kg、约2.0x1010TU/kg、约1.9x1010TU/kg、约1.8x1010TU/kg、约1.7x1010TU/kg、约1.6x1010TU/kg、约1.5x1010TU/kg、约1.4x1010TU/kg、约1.3x1010TU/kg、约1.2x1010TU/kg、约1.1x1010TU/kg、或约1.0x1010TU/kg。
在一些实施方案中，剂量为约9.9x109TU/kg、约9.8x109TU/kg、约9.7x109TU/kg、约9.6x109TU/kg、约9.5x109TU/kg、约9.4x109TU/kg、约9.3x109TU/kg、约9.2x109TU/kg、约9.1x109TU/kg、约9.0x109TU/kg、约8.9x109TU/kg、约8.8x109TU/kg、约8.7x109TU/kg、约8.6x109TU/kg、约8.5x109TU/kg、约8.4x109TU/kg、约8.3x109TU/kg、约8.2x109TU/kg、约8.1x109TU/kg、约8.0x109TU/kg、约7.9x109TU/kg、约7.8x109TU/kg、约7.7x109TU/kg、约7.6x109TU/kg、约7.5x109TU/kg、约7.4x109TU/kg、约7.3x109TU/kg、约7.2x109TU/kg、约7.1x109TU/kg、约7.0x109TU/kg、约6.9x109TU/kg、约6.8x109TU/kg、约6.7x109TU/kg、约6.6x109TU/kg、约6.5x109TU/kg、约6.4x109TU/kg、约6.3x109TU/kg、约6.2x109TU/kg、约6.1x109TU/kg、约6.0x109TU/kg、约5.9x109TU/kg、约5.8x109TU/kg、约5.7x109TU/kg、约5.6x109TU/kg、约5.5x109TU/kg、约5.4x109TU/kg、约5.3x109TU/kg、约5.2x109TU/kg、约5.1x109TU/kg、约5.0x109TU/kg、约4.9x109TU/kg、约4.8x109TU/kg、约4.7x109TU/kg、约4.6x109TU/kg、约4.5x109TU/kg、约4.4x109TU/kg、约4.3x109TU/kg、约4.2x109TU/kg、约4.1x109TU/kg、约4.0x109TU/kg、约3.9x109TU/kg、约3.8x109TU/kg、约3.7x109TU/kg、约3.6x109TU/kg、约3.5x109TU/kg、约3.4x109TU/kg、约3.3x109TU/kg、约3.2x109TU/kg、约3.1x109TU/kg、约3.0x109TU/kg、约2.9x109TU/kg、约2.8x109TU/kg、约2.7x109TU/kg、约2.6x109TU/kg、约2.5x109TU/kg、约2.4x109TU/kg、约2.3x109TU/kg、约2.2x109TU/kg、约2.1x109TU/kg、约2.0x109TU/kg、约1.9x109TU/kg、约1.8x109TU/kg、约1.7x109TU/kg、约1.6x109TU/kg、约1.5x109TU/kg、约1.4x109TU/kg、约1.3x109TU/kg、约1.2x109TU/kg、约1.1x109TU/kg、或约1.0x109TU/kg。
在一些实施方案中，剂量为约9.9x108TU/kg、约9.8x108TU/kg、约9.7x108TU/kg、约9.6x108TU/kg、约9.5x108TU/kg、约9.4x108TU/kg、约9.3x108TU/kg、约9.2x108TU/kg、约9.1x108TU/kg、约9.0x108TU/kg、约8.9x108TU/kg、约8.8x108TU/kg、约8.7x108TU/kg、约8.6x108TU/kg、约8.5x108TU/kg、约8.4x108TU/kg、约8.3x108TU/kg、约8.2x108TU/kg、约8.1x108TU/kg、约8.0x108TU/kg、约7.9x108TU/kg、约7.8x108TU/kg、约7.7x108TU/kg、约7.6x108TU/kg、约7.5x108TU/kg、约7.4x108TU/kg、约7.3x108TU/kg、约7.2x108TU/kg、约7.1x108TU/kg、约7.0x108TU/kg、约6.9x108TU/kg、约6.8x108TU/kg、约6.7x108TU/kg、约6.6x108TU/kg、约6.5x108TU/kg、约6.4x108TU/kg、约6.3x108TU/kg、约6.2x108TU/kg、约6.1x108TU/kg、约6.0x108TU/kg、约5.9x108TU/kg、约5.8x108TU/kg、约5.7x108TU/kg、约5.6x108TU/kg、约5.5x108TU/kg、约5.4x108TU/kg、约5.3x108TU/kg、约5.2x108TU/kg、约5.1x108TU/kg、约5.0x108TU/kg、约4.9x108TU/kg、约4.8x108TU/kg、约4.7x108TU/kg、约4.6x108TU/kg、约4.5x108TU/kg、约4.4x108TU/kg、约4.3x108TU/kg、约4.2x108TU/kg、约4.1x108TU/kg、约4.0x108TU/kg、约3.9x108TU/kg、约3.8x108TU/kg、约3.7x108TU/kg、约3.6x108TU/kg、约3.5x108TU/kg、约3.4x108TU/kg、约3.3x108TU/kg、约3.2x108TU/kg、约3.1x108TU/kg、约3.0x108TU/kg、约2.9x108TU/kg、约2.8x108TU/kg、约2.7x108TU/kg、约2.6x108TU/kg、约2.5x108TU/kg、约2.4x108TU/kg、约2.3x108TU/kg、约2.2x108TU/kg、约2.1x108TU/kg、约2.0x108TU/kg、约1.9x108TU/kg、约1.8x108TU/kg、约1.7x108TU/kg、约1.6x108TU/kg、约1.5x108TU/kg、约1.4x108TU/kg、约1.3x108TU/kg、约1.2x108TU/kg、约1.1x108TU/kg、或约1.0x108TU/kg。
在一些实施方案中，剂量小于5.0x1010TU/kg、小于4.9x1010TU/kg、小于4.8x1010TU/kg、小于4.7x1010TU/kg、小于4.6x1010TU/kg、小于4.5x1010TU/kg、小于4.4x1010TU/kg、小于4.3x1010TU/kg、小于4.2x1010TU/kg、小于4.1x1010TU/kg、小于4.0x1010TU/kg、小于3.9x1010TU/kg、小于3.8x1010TU/kg、小于3.7x1010TU/kg、小于3.6x1010TU/kg、小于3.5x1010TU/kg、小于3.4x1010TU/kg、小于3.3x1010TU/kg、小于3.2x1010TU/kg、小于3.1x1010TU/kg、小于3.0x1010TU/kg、小于2.9x1010TU/kg、小于2.8x1010TU/kg、小于2.7x1010TU/kg、小于2.6x1010TU/kg、小于2.5x1010TU/kg、小于2.4x1010TU/kg、小于2.3x1010TU/kg、小于2.2x1010TU/kg、小于2.1x1010TU/kg、小于2.0x1010TU/kg、小于1.9x1010TU/kg、小于1.8x1010TU/kg、小于1.7x1010TU/kg、小于1.6x1010TU/kg、小于1.5x1010TU/kg、小于1.4x1010TU/kg、小于1.3x1010TU/kg、小于1.2x1010TU/kg、小于1.1x1010TU/kg、或小于1.0x1010TU/kg。
在一些实施方案中，剂量小于9.9x109TU/kg、小于9.8x109TU/kg、小于9.7x109TU/kg、小于9.6x109TU/kg、小于9.5x109TU/kg、小于9.4x109TU/kg、小于9.3x109TU/kg、小于9.2x109TU/kg、小于9.1x109TU/kg、小于9.0x109TU/kg、小于8.9x109TU/kg、小于8.8x109TU/kg、小于8.7x109TU/kg、小于8.6x109TU/kg、小于8.5x109TU/kg、小于8.4x109TU/kg、小于8.3x109TU/kg、小于8.2x109TU/kg、小于8.1x109TU/kg、小于8.0x109TU/kg、小于7.9x109TU/kg、小于7.8x109TU/kg、小于7.7x109TU/kg、小于7.6x109TU/kg、小于7.5x109TU/kg、小于7.4x109TU/kg、小于7.3x109TU/kg、小于7.2x109TU/kg、小于7.1x109TU/kg、小于7.0x109TU/kg、小于6.9x109TU/kg、小于6.8x109TU/kg、小于6.7x109TU/kg、小于6.6x109TU/kg、小于6.5x109TU/kg、小于6.4x109TU/kg、小于6.3x109TU/kg、小于6.2x109TU/kg、小于6.1x109TU/kg、小于6.0x109TU/kg、小于5.9x109TU/kg、小于5.8x109TU/kg、小于5.7x109TU/kg、小于5.6x109TU/kg、小于5.5x109TU/kg、小于5.4x109TU/kg、小于5.3x109TU/kg、小于5.2x109TU/kg、小于5.1x109TU/kg、小于5.0x109TU/kg、小于4.9x109TU/kg、小于4.8x109TU/kg、小于4.7x109TU/kg、小于4.6x109TU/kg、小于4.5x109TU/kg、小于4.4x109TU/kg、小于4.3x109TU/kg、小于4.2x109TU/kg、小于4.1x109TU/kg、小于4.0x109TU/kg、小于3.9x109TU/kg、小于3.8x109TU/kg、小于3.7x109TU/kg、小于3.6x109TU/kg、小于3.5x109TU/kg、小于3.4x109TU/kg、小于3.3x109TU/kg、小于3.2x109TU/kg、小于3.1x109TU/kg、小于3.0x109TU/kg、小于2.9x109TU/kg、小于2.8x109TU/kg、小于2.7x109TU/kg、小于2.6x109TU/kg、小于2.5x109TU/kg、小于2.4x109TU/kg、小于2.3x109TU/kg、小于2.2x109TU/kg、小于2.1x109TU/kg、小于2.0x109TU/kg、小于1.9x109TU/kg、小于1.8x109TU/kg、小于1.7x109TU/kg、小于1.6x109TU/kg、小于1.5x109TU/kg、小于1.4x109TU/kg、小于1.3x109TU/kg、小于1.2x109TU/kg、小于1.1x109TU/kg、或小于1.0x109TU/kg。
在一些实施方案中，剂量小于9.9x108TU/kg、小于9.8x108TU/kg、小于9.7x108TU/kg、小于9.6x108TU/kg、小于9.5x108TU/kg、小于9.4x108TU/kg、小于9.3x108TU/kg、小于9.2x108TU/kg、小于9.1x108TU/kg、小于9.0x108TU/kg、小于8.9x108TU/kg、小于8.8x108TU/kg、小于8.7x108TU/kg、小于8.6x108TU/kg、小于8.5x108TU/kg、小于8.4x108TU/kg、小于8.3x108TU/kg、小于8.2x108TU/kg、小于8.1x108TU/kg、小于8.0x108TU/kg、小于7.9x108TU/kg、小于7.8x108TU/kg、小于7.7x108TU/kg、小于7.6x108TU/kg、小于7.5x108TU/kg、小于7.4x108TU/kg、小于7.3x108TU/kg、小于7.2x108TU/kg、小于7.1x108TU/kg、小于7.0x108TU/kg、小于6.9x108TU/kg、小于6.8x108TU/kg、小于6.7x108TU/kg、小于6.6x108TU/kg、小于6.5x108TU/kg、小于6.4x108TU/kg、小于6.3x108TU/kg、小于6.2x108TU/kg、小于6.1x108TU/kg、小于6.0x108TU/kg、小于5.9x108TU/kg、小于5.8x108TU/kg、小于5.7x108TU/kg、小于5.6x108TU/kg、小于5.5x108TU/kg、小于5.4x108TU/kg、小于5.3x108TU/kg、小于5.2x108TU/kg、小于5.1x108TU/kg、小于5.0x108TU/kg、小于4.9x108TU/kg、小于4.8x108TU/kg、小于4.7x108TU/kg、小于4.6x108TU/kg、小于4.5x108TU/kg、小于4.4x108TU/kg、小于4.3x108TU/kg、小于4.2x108TU/kg、小于4.1x108TU/kg、小于4.0x108TU/kg、小于3.9x108TU/kg、小于3.8x108TU/kg、小于3.7x108TU/kg、小于3.6x108TU/kg、小于3.5x108TU/kg、小于3.4x108TU/kg、小于3.3x108TU/kg、小于3.2x108TU/kg、小于3.1x108TU/kg、小于3.0x108TU/kg、小于2.9x108TU/kg、小于2.8x108TU/kg、小于2.7x108TU/kg、小于2.6x108TU/kg、小于2.5x108TU/kg、小于2.4x108TU/kg、小于2.3x108TU/kg、小于2.2x108TU/kg、小于2.1x108TU/kg、小于2.0x108TU/kg、小于1.9x108TU/kg、小于1.8x108TU/kg、小于1.7x108TU/kg、小于1.6x108TU/kg、小于1.5x108TU/kg、小于1.4x108TU/kg、小于1.3x108TU/kg、小于1.2x108TU/kg、小于1.1x108TU/kg、或小于1.0x108TU/kg。
在一些实施方案中，剂量在1x108TU/kg与5x1010TU/kg之间、在1.5x108TU/kg与5x1010TU/kg之间、在2x108TU/kg与5x1010TU/kg之间、在2.5x108TU/kg与5x1010TU/kg之间、在3x108TU/kg与5x1010TU/kg之间、在3.5x108TU/kg与5x1010TU/kg之间、在4x108TU/kg与5x1010TU/kg之间、在4.5x108TU/kg与5x1010TU/kg之间、在5x108TU/kg与5x1010TU/kg之间、在5.5x108TU/kg与5x1010TU/kg之间、在6x108TU/kg与5x1010TU/kg之间、在6.5x108TU/kg与5x1010TU/kg之间、在7x108TU/kg与5x1010TU/kg之间、在7.5x108TU/kg与5x1010TU/kg之间、在8x108TU/kg与5x1010TU/kg之间、在8.5x108TU/kg与5x1010TU/kg之间、在9x108TU/kg与5x1010TU/kg之间、在9.5x108TU/kg与5x1010TU/kg之间、在1x109TU/kg与5x1010TU/kg之间、在1.5x109TU/kg与5x1010TU/kg之间、在2x109TU/kg与5x1010TU/kg之间、在2.5x109TU/kg与5x1010TU/kg之间、在3x109TU/kg与5x1010TU/kg之间、在3.5x109TU/kg与5x1010TU/kg之间、在4x109TU/kg与5x1010TU/kg之间、在4.5x109TU/kg与5x1010TU/kg之间、在5x109TU/kg与5x1010TU/kg之间、在5.5x109TU/kg与5x1010TU/kg之间、在6x109TU/kg与5x1010TU/kg之间、在6.5x109TU/kg与5x1010TU/kg之间、在7x109TU/kg与5x1010TU/kg之间、在7.5x109TU/kg与5x1010TU/kg之间、在8x109TU/kg与5x1010TU/kg之间、在8.5x109TU/kg与5x1010TU/kg之间、在9x109TU/kg与5x1010TU/kg之间、在9.5x109TU/kg与5x1010TU/kg之间、在1010TU/kg与5x1010TU/kg之间、在1.5x1010TU/kg与5x1010TU/kg之间、在2x1010TU/kg与5x1010TU/kg之间、在2.5x1010TU/kg与5x1010TU/kg之间、在3x1010TU/kg与5x1010TU/kg之间、在3.5x1010TU/kg与5x1010TU/kg之间、在4x1010TU/kg与5x1010TU/kg之间、或在4.5x1010TU/kg与5x1010TU/kg之间。
在一些实施方案中，剂量在1x108TU/kg与5x1010TU/kg之间、在1x108TU/kg与4.5x1010TU/kg之间、在1x108TU/kg与4x1010TU/kg之间、在1x108TU/kg与3.5x1010TU/kg之间、在1x108TU/kg与3x1010TU/kg之间、在1x108TU/kg与2.5x1010TU/kg之间、在1x108TU/kg与2x1010TU/kg之间、在1x108TU/kg与1.5x1010TU/kg之间、在1x108TU/kg与1010TU/kg之间、在1x108TU/kg与9x109TU/kg之间、在1x108TU/kg与8.5x109TU/kg之间、在1x108TU/kg与8x109TU/kg之间、在1x108TU/kg与7.5x109TU/kg之间、在1x108TU/kg与7x109TU/kg之间、在1x108TU/kg与6.5x109TU/kg之间、在1x108TU/kg与6x109TU/kg之间、在1x108TU/kg与5.5x109TU/kg之间、在1x108TU/kg与5x109TU/kg之间、在1x108TU/kg与4.5x109TU/kg之间、在1x108TU/kg与4x109TU/kg之间、在1x108TU/kg与3.5x109TU/kg之间、在1x108TU/kg与3x109TU/kg之间、在1x108TU/kg与2.5x109TU/kg之间、在1x108TU/kg与2x109之间、在1x108TU/kg与1.5x109TU/kg之间、在1x108TU/kg与1x109TU/kg之间、在1x108TU/kg与9.5x108TU/kg之间、在1x108TU/kg与9x108TU/kg之间、在1x108TU/kg与8.5x108TU/kg之间、在1x108TU/kg与8x108TU/kg之间、在1x108TU/kg与7.5x108TU/kg之间、在1x108TU/kg与7x108TU/kg之间、在1x108TU/kg与6.5x108TU/kg之间、在1x108TU/kg与6x108TU/kg之间、在1x108TU/kg与5.5x108TU/kg之间、在1x108TU/kg与5x108TU/kg之间、在1x108TU/kg与4.5x108TU/kg之间、在1x108TU/kg与4x108TU/kg之间、在1x108TU/kg与3.5x108TU/kg之间、在1x108TU/kg与3x108TU/kg之间、在1x108TU/kg与2.5x108TU/kg之间、在1x108TU/kg与2x108之间、或在1x108TU/kg与1.5x108TU/kg之间。
在一些实施方案中，剂量在1x1010TU/kg与2x1010TU/kg之间、在1.1x1010TU/kg与1.9x1010TU/kg之间、在1.2x1010TU/kg与1.8x1010TU/kg之间、在1.3x1010TU/kg与1.7x1010TU/kg之间、或在1.4x1010TU/kg与1.6x1010TU/kg之间。在一些实施方案中，剂量为约1.5x1010TU/kg。在一些实施方案中，剂量为1.5x1010TU/kg。
在一些实施方案中，剂量在1x109TU/kg与2x109TU/kg之间、在1.1x109TU/kg与1.9x109TU/kg之间、在1.2x109TU/kg与1.8x109TU/kg之间、在1.3x109TU/kg与1.7x109TU/kg之间、或在1.4x109TU/kg与1.6x109TU/kg之间。在一些实施方案中，剂量为1.5x109TU/kg。在某些实施方案中，剂量为约3.0x109TU/kg。
在一些实施方案中，相对于给予了对照慢病毒载体的受试者中的血浆FVIII活性，在给予本公开文本的慢病毒载体后24小时、36小时或48小时的血浆FVIII活性增加。在一些实施方案中，相对于给予了对照核酸分子的受试者中的血浆FVIII活性，在给予本公开文本的慢病毒载体后24小时、36小时或48小时的血浆FVIII活性增加。
在一些实施方案中，相对于给予了对照慢病毒载体的受试者中的血浆FIX活性，在给予本公开文本的慢病毒载体后24小时、36小时或48小时的血浆FIX活性增加。在一些实施方案中，相对于给予了对照核酸分子的受试者中的血浆FIX活性，在给予本公开文本的慢病毒载体后24小时、36小时或48小时的血浆FIX活性增加。
在一些实施方案中，相对于给予了对照慢病毒载体或对照核酸分子的受试者，在给予本公开文本的慢病毒载体后约6小时、约12小时、约18小时、约24小时、约36小时、约48小时、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天天、约15天、约16天、约17天、约18天、约19天、约20天、约21天、约22天、约23天、约24天、约25天、约26天、约27天或约28天，血浆FVIII或血浆FIX活性增加。
在一些实施方案中，关于受试者中的基础水平，相对于给予了对照慢病毒载体或对照核酸分子的受试者中的水平，受试者中的血浆FVIII或血浆FIX活性增加了至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约45倍、至少约50倍、至少约55倍、至少约60倍、至少约65倍、至少约70倍、至少约75倍、至少约80倍、至少约85倍、至少约90倍、至少约95倍、至少约100倍、至少约110倍、至少约120倍、至少约130倍、至少约140倍、至少约150倍、至少约160倍、至少约170倍、至少约180倍、至少约190倍、或至少约200倍。
在一些实施方案中，慢病毒载体以单剂量或多剂量给予。在一些实施方案中，慢病毒载体剂量被一次给予或分成多个亚剂量，例如两个亚剂量、三个亚剂量、四个亚剂量、五个亚剂量、六个亚剂量或多于六个亚剂量。在一些实施方案中，给予多于一种慢病毒载体。
在一些实施方案中，将慢病毒载体的剂量重复给予至少两次、至少三次、至少四次、至少五次、至少六次、至少七次、至少八次、至少九次、或至少十次。在一些实施方案中，慢病毒载体经由静脉内注射给予。
在一些实施方案中，受试者是小儿科受试者。在一些实施方案中，受试者是成人受试者。
在一些实施方案中，慢病毒载体包含至少一种组织特异性启动子，即将调节具有FVIII活性的多肽或具有FIX活性的多肽在特定组织或细胞类型中的表达的启动子。在一些实施方案中，慢病毒载体中的组织特异性启动子选择性增强具有FVIII活性的多肽在靶肝细胞中的表达。在一些实施方案中，选择性增强具有FVIII活性的多肽在靶肝细胞中的表达的组织特异性启动子包括mTTR启动子。在一些实施方案中，选择性增强具有FIX活性的多肽在靶肝细胞中的表达的组织特异性启动子包括APOA2启动子、SERPINA1(hAAT)启动子、mTTR启动子、MIR122启动子、ET启动子(GenBank号AY661265；还参见Vigna等人,MolecularTherapy 11(5):763(2005))或其任何组合。在一些实施方案中，靶肝细胞是肝细胞。
由于慢病毒载体可以转导所有肝细胞类型，因此可以通过在慢病毒载体中使用不同的启动子来控制转基因(例如，FVIII或FIX)在不同细胞类型中的表达。因此，慢病毒载体可包含将控制FVIII转基因或FIX转基因在不同组织或细胞类型(如不同肝组织或细胞类型)中的表达的特异性启动子。因此，在一些实施方案中，慢病毒载体可包含将控制FVIII转基因或FIX转基因在肝内皮组织中的表达的内皮特异性启动子、或将控制FVIII转基因或FIX转基因在肝细胞中的表达的肝细胞特异性启动子、或二者。
在一些实施方案中，慢病毒载体包含控制FVIII转基因或FIX转基因在除肝脏以外的组织中的表达的一种或多种组织特异性启动子。在一些实施方案中，将分离的核酸分子稳定地整合到靶细胞或靶组织的基因组中，例如，在肝细胞的基因组中或在肝内皮细胞的基因组中。
在一些实施方案中，本公开文本的慢病毒载体中的分离的核酸分子进一步包含编码异源氨基酸序列(例如，半衰期延长剂)的异源核苷酸序列。在一些实施方案中，异源氨基酸序列是免疫球蛋白恒定区或其部分、XTEN、转铁蛋白、白蛋白或PAS序列。在一些实施方案中，异源氨基酸序列与由核苷酸序列编码的氨基酸序列的N末端或C末端连接，或者在选自表2的一个或多个插入位点插入由核苷酸序列编码的氨基酸序列中的两个氨基酸之间。异源核苷酸序列在本文中进一步进行描述。
在一些实施方案中，具有FVIII活性的多肽是人FVIII。在一些实施方案中，具有FVIII活性的多肽是全长FVIII。在一些实施方案中，具有FVIII活性的多肽是B结构域缺失的FVIII。
在一些实施方案中，具有FIX活性的多肽是人FIX。在一些实施方案中，具有FIX活性的多肽是全长FIX。在一些实施方案中，具有FIX活性的多肽是人FIX的变体。在某些实施方案中，具有FIX活性的多肽是人FIX的R338L变体。在某些实施方案中，具有FIX活性的多肽是帕多瓦(Padua)变体。
本文公开的慢病毒载体可以在哺乳动物(例如人患者中)体内使用，使用基因治疗方法治疗选自以下的出血疾病或障碍将是治疗上有益的：出血凝血障碍、关节积血、肌肉出血、口腔出血、出血症、出血至肌肉中、口腔出血症、创伤、头部创伤、胃肠出血、颅内出血、腹内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神经系统出血、咽后间隙出血、腹膜后间隙出血和髂腰肌鞘出血。在一个实施方案中，出血疾病或障碍是血友病。在另一个实施方案中，出血疾病或障碍是血友病A。在另一个实施方案中，出血疾病或障碍是血友病B。
在一些实施方案中，在给予至患者之前，将靶细胞(例如肝细胞)用本文公开的慢病毒载体进行体外处理。在某些实施方案中，在给予至患者之前，将靶细胞(例如肝细胞)用本文公开的慢病毒载体进行体外处理。在又另一个实施方案中，在给予至患者之前，将来自患者的细胞(例如肝细胞)用本文公开的慢病毒载体进行离体处理。
在一些实施方案中，相对于生理上正常的循环FVIII水平，在给予本文公开的慢病毒载体(例如以1010TU/kg或更低、109TU/kg或更低、或108TU/kg或更低给予)后，血浆FVIII活性增加了至少约100％、至少约110％、至少约120％、至少约130％、至少约140％、至少约150％、至少约160％、至少约170％、至少约180％、至少约190％、至少约200％、至少约210％、至少约220％、至少约230％、至少约240％、至少约250％、至少约260％、至少约270％、至少约280％、至少约290％、或至少约300％。
在一些实施方案中，相对于生理上正常的循环FIX水平，在给予本文公开的慢病毒载体(例如以1010TU/kg或更低、109TU/kg或更低、或108TU/kg或更低给予)后，血浆FIX活性增加了至少约100％、至少约110％、至少约120％、至少约130％、至少约140％、至少约150％、至少约160％、至少约170％、至少约180％、至少约190％、至少约200％、至少约210％、至少约220％、至少约230％、至少约240％、至少约250％、至少约260％、至少约270％、至少约280％、至少约290％、或至少约300％。
在一个实施方案中，相对于生理上正常的循环FVIII水平，在给予本公开文本的慢病毒载体后，血浆FVIII活性增加了至少约3,000％至约5,000％。在一些实施方案中，相对于给予了对照慢病毒载体或对照核酸分子的受试者，在给予本文所述的包含编码具有因子VIII(FVIII)活性的多肽的密码子优化基因的慢病毒载体后，血浆FVIII活性增加了至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍、至少约100倍、至少约110倍、至少约120倍、至少约130倍、至少约140倍、至少约150倍、至少约160倍、至少约170倍、至少约180倍、至少约190倍、或至少约200倍。
在一个实施方案中，相对于生理上正常的循环FIX水平，在给予本公开文本的慢病毒载体后，血浆FIX活性增加了至少约3,000％至约5,000％。在一些实施方案中，相对于给予了对照慢病毒载体或对照核酸分子的受试者，在给予本文所述的包含编码具有因子IX(FIX)活性的多肽的密码子优化基因的慢病毒载体后，血浆FIX活性增加了至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍、至少约100倍、至少约110倍、至少约120倍、至少约130倍、至少约140倍、至少约150倍、至少约160倍、至少约170倍、至少约180倍、至少约190倍、或至少约200倍。
本公开文本还提供了在有需要的受试者中治疗、预防或改善止血障碍(例如，出血障碍如血友病A或血友病B)的方法，所述方法包括向所述受试者给予治疗有效量的慢病毒载体，所述慢病毒载体包含含有编码具有FVIII活性的多肽或具有FIX活性的多肽的核苷酸序列的分离的核酸分子。
通过本公开文本的慢病毒载体进行的治疗、改善和预防可以是旁路疗法。接受旁路疗法的受试者可能已经产生针对凝血因子(例如，FVIII或FIX)的抑制剂，或者正在产生凝血因子抑制剂。
本公开文本的慢病毒载体通过促进纤维蛋白凝块的形成治疗或预防止血障碍。由本公开文本的核酸分子编码的具有FVIII或FIX活性的多肽可以激活凝血级联的成员。凝血因子可以是外在途径、内在途径或二者的参与者。
本公开文本的慢病毒载体可以用于治疗已知可用FVIII或FIX治疗的止血障碍。可以使用本公开文本的方法治疗的止血障碍包括但不限于血友病A、血友病B、血管性血友病、因子XI缺乏(PTA缺乏)、因子XII缺乏、以及纤维蛋白原、凝血酶原、因子V、因子VII、因子X或因子XIII的缺乏或结构异常、关节积血、肌肉出血、口腔出血、出血症、出血至肌肉中、口腔出血症、创伤、头部创伤、胃肠出血、颅内出血、腹内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神经系统出血、咽后间隙出血、腹膜后间隙出血和髂腰肌鞘出血。
用于给予至受试者的组合物包括慢病毒载体，所述慢病毒载体包含含有本公开文本的优化核苷酸序列的核酸分子，所述优化核苷酸序列编码FVIII凝血因子或FIX凝血因子(用于基因疗法应用)以及FVIII或FIX多肽分子。在一些实施方案中，用于给予的组合物是在体内、体外或离体与本公开文本的慢病毒载体接触的细胞。
在一些实施方案中，止血障碍是遗传性障碍。在一个实施方案中，受试者患有血友病A。在其他实施方案中，止血障碍是缺乏FVIII的结果。在其他实施方案中，止血障碍可能是缺陷性FVIII凝血因子的结果。在一个实施方案中，受试者患有血友病B。在其他实施方案中，止血障碍是缺乏FIX的结果。在其他实施方案中，止血障碍可能是缺陷性FIX凝血因子的结果。
在另一个实施方案中，止血障碍可以是获得性障碍。获得性障碍可能源自潜在的继发性疾病或病症。无关病症可以是(作为例子但不限制)癌症、自身免疫疾病或妊娠。获得性障碍可能起因于衰老或起因于治疗潜在继发性障碍的药物疗法(例如，癌症化学疗法)。
本公开文本还涉及治疗未患止血障碍或导致获得止血障碍的继发性疾病或病症的受试者的方法。本公开文本因此涉及治疗需要通用止血剂的受试者的方法，所述方法包括给予治疗有效量的本公开文本的慢病毒载体。例如，在一个实施方案中，需要通用止血剂的受试者正在进行或即将进行手术。本公开文本的慢病毒载体可以在手术之前或之后作为预防剂给予。
本公开文本的慢病毒载体可以在手术期间或之后给予以控制急性出血发作。手术可以包括但不限于肝移植、肝切除或干细胞移植。
在另一个实施方案中，本公开文本的慢病毒载体可以用于治疗未患止血障碍的患有急性出血发作的受试者。急性出血发作可能起因于严重创伤(例如，手术)、车祸、伤口、枪击撕裂(laceration gun shot)或导致不受控制的出血的任何其他创伤性事件。
慢病毒载体可以用于预防性治疗患有止血障碍的受试者。慢病毒载体还可以用于治疗患有止血障碍的受试者的急性出血发作。
在另一个实施方案中，本文公开的慢病毒载体的给予和/或FVIII蛋白或FIX蛋白的后续表达在受试者中不诱导免疫应答。在一些实施方案中，免疫应答包含产生针对FVIII或FIX的抗体。在一些实施方案中，免疫应答包含细胞因子分泌。在一些实施方案中，免疫应答包含激活B细胞、T细胞或B细胞和T细胞二者。在一些实施方案中，免疫应答是抑制性免疫应答，其中相对于未产生免疫应答的受试者中FVIII的活性，受试者的免疫应答降低FVIII蛋白的活性。在某些实施方案中，通过给予本公开文本的慢病毒载体表达FVIII蛋白预防针对FVIII蛋白或从分离的核酸分子或慢病毒载体表达的FVIII蛋白的抑制性免疫应答。在一些实施方案中，免疫应答是抑制性免疫应答，其中相对于未产生免疫应答的受试者中FIX的活性，受试者的免疫应答降低FIX蛋白的活性。在某些实施方案中，通过给予本公开文本的慢病毒载体表达FIX蛋白预防针对FIX蛋白或从分离的核酸分子或慢病毒载体表达的FIX蛋白的抑制性免疫应答。
在一些实施方案中，本公开文本的慢病毒载体与至少一种促进止血的其他药剂组合给予。促进止血的所述其他药剂是具有已证实的凝血活性的治疗剂。作为例子但不限制，止血剂可以包括因子V、因子VII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII、因子XIII、凝血酶原或纤维蛋白原或前述任一种的激活形式。凝血因子或止血剂还可以包括抗纤维蛋白溶药，例如ε-氨基己酸、氨甲环酸。
在本公开文本的一个实施方案中，组合物(例如，慢病毒载体)是FVIII以可在给予至受试者时激活的形式存在的组合物。在本公开文本的一个实施方案中，组合物(例如，慢病毒载体)是FIX以可在给予至受试者时激活的形式存在的组合物。这种可激活的分子可以在给予至受试者后在体内于凝血位点被激活。
本公开文本的慢病毒载体可以静脉内、皮下、肌内给予，或经由任何粘膜表面给予，例如口服、舌下、经颊、舌下、经鼻、经直肠、经阴道或经肺途径给予。可以将慢病毒载体植入生物聚合物固相支持体内或与所述固相支持体连接，从而允许将载体缓慢释放至所需位点。
在一个实施方案中，慢病毒载体的给予途径是肠胃外的。如本文所用的术语肠胃外包括静脉内、动脉内、腹膜内、肌内、皮下、直肠或阴道给予。肠胃外给予的静脉内形式是优选的。虽然所有这些给予形式都明确地考虑在本公开文本的范围内，但是给予形式可以是用于注射，特别是用于静脉内或动脉内注射或滴注的溶液。通常，适于注射的药物组合物可以包含缓冲液(例如乙酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液)、表面活性剂(例如聚山梨醇酯)、任选地稳定剂(例如人白蛋白)等。然而，在与本文的传授内容相容的其他方法中，可以将慢病毒载体直接递送至不良细胞群的位点，由此增加患病组织对治疗剂的暴露。
用于肠胃外给予的制剂包括无菌的水性或非水性溶液、悬浮液和乳液。非水性溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、以及可注射的有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水、醇性/水性溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。在本公开文本中，药学上可接受的载体包括但不限于0.01-0.1M且优选地0.05M磷酸盐缓冲液或0.8％盐水。其他常见的肠胃外媒介物包括磷酸钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏液或不挥发油。静脉内媒介物包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(如基于林格氏右旋糖的那些)等。也可以存在防腐剂和其他添加剂，如例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。
更具体地，适用于注射使用的药物组合物包括无菌的水性溶液(在水溶性的情况下)或分散体、以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。在此类情况下，组合物必须是无菌的并且应当是易于注射的程度的流体。其应在制造和储存条件下稳定，并且将优选地抵抗微生物(如细菌和真菌)的污染作用而保存。载体可以是溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。可以例如通过以下方式维持适当流动性：通过使用包衣如卵磷脂，在分散体情况下通过维持所需粒径，以及通过使用表面活性剂。
防止微生物的作用可以通过各种抗细菌以及抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等来实现。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在所述组合物中包含延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现。
在任何情况下，无菌可注射溶液可以通过以下方式制备：将活性化合物(例如，多肽自身或与其他活性剂组合)以所需量并入视需要具有上文所列举成分中的一种或组合的适当溶剂中，之后过滤灭菌。通常，分散体是通过以下方式来制备：将活性化合物并入无菌媒介物中，所述媒介物含有基础分散介质和来自上文所列举的那些成分的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选制备方法为真空干燥和冷冻干燥，所述真空干燥和冷冻干燥由先前无菌过滤的溶液产生活性成分和任何另外所需成分的粉末。将用于注射的制剂处理，填充至容器如安瓿、袋子、瓶子、注射器或小瓶中，并根据本领域已知的方法在无菌条件下密封。此外，制剂可以以试剂盒的形式包装和出售。此类制品优选具有标签或包装说明书，其指示相关组合物可用于治疗罹患或易患凝血障碍的受试者。
药物组合物还可以经配制用于作为例如含有常规栓剂基质(如可可脂或其他甘油酯)的栓剂或保留灌肠剂经直肠给予。
用于治疗病症的本公开文本的组合物的有效剂量根据许多不同因素而变化，所述因素包括给予方式、靶位点、患者的生理状态、患者是人还是动物、所给予的其他药物以及治疗是预防性的还是治疗性的。通常，患者是人，但也可以治疗非人哺乳动物，包括转基因哺乳动物。治疗剂量可以使用本领域技术人员已知的常规方法逐步增加，以优化安全性和功效。
慢病毒载体可以以单剂量或多剂量给予，其中多剂量可以连续或以特定的时间间隔给予。可以采用体外测定来确定用于给予的最佳剂量范围和/或时间计划。测量凝血因子活性的体外测定是本领域已知的。另外，可以从获自动物模型(例如血友病犬)的剂量-反应曲线外推有效剂量(Mount等人2002,Blood 99(8):2670)。
在上述范围内的中间剂量也旨在处于本公开文本的范围内。可以每日、隔日、每周或按根据经验分析确定的任何其他时间计划向受试者给予此类剂量。示例性治疗使得需要在例如至少六个月的延长时段内以多剂量给予。
可以在多个时机给予本公开文本的慢病毒载体。单个剂量之间的间隔可以是每日、每周、每月或每年。如通过测量患者中经修饰的多肽或抗原的血液水平所指示，间隔也可以是不规律的。本公开文本的慢病毒载体的剂量和频率根据由转基因编码的FVIII多肽或FIX多肽在患者体内的半衰期而变化。
本公开文本的慢病毒载体的给予的剂量和频率可以根据治疗是预防性的还是治疗性的而变化。在预防性应用中，将含有本公开文本的慢病毒载体的组合物给予至尚未处于疾病状态的患者，以增强患者的抵抗力或使疾病的影响最小化。将这种量定义为“预防有效剂量”。以相对不频繁的间隔在长时间段内给予相对低的剂量。一些患者在余生持续接受治疗。
本公开文本的慢病毒载体可以任选地与在需要治疗(例如，预防性或治疗性)的障碍或病症的治疗中有效的其他药剂组合给予。
如本文所用，与辅助疗法结合或组合的本公开文本的慢病毒载体的给予意指依序、同时、同延、并行、伴随或同期给予或施用所述疗法和所公开多肽。本领域技术人员应了解，组合治疗方案中各种组分的给予或施用可以定时以增强治疗的整体有效性。基于所选辅助疗法和本说明书的传授内容，技术人员(例如，医师)在不进行过度实验的情况下便能够容易地辨别有效的组合治疗方案。
应进一步了解，本公开文本的慢病毒载体可以与一种或多种药剂结合或组合使用(例如，以提供组合治疗方案)。可以与本公开文本的慢病毒载体组合的示例性药剂包括代表用于所治疗的特定障碍的当前护理标准的药剂。此类药剂在本质上可以是化学的或生物的。术语“生物剂(biologic)”或“生物剂(biologic agent)”是指预期用作治疗剂的从活的生物体和/或其产物制备的任何药学活性剂。
要与本公开文本的慢病毒载体组合使用的药剂的量可以随受试者变化，或者可以根据本领域的知识来给予。参见例如，Bruce A Chabner等人,Antineoplastic Agents,于Goodman&Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics 1233-1287(JoelG.Hardman等人编辑,第9版1996)。在另一个实施方案中，给予符合护理标准的量的这种药剂。
在某些实施方案中，本公开文本的慢病毒载体与免疫抑制剂、抗过敏剂或抗炎剂结合给予。这些药剂通常是指起到抑制或掩蔽本文所治疗的受试者的免疫系统的作用的物质。这些药剂包括抑制细胞因子产生、下调或抑制自身抗原表达或掩蔽MHC抗原的物质。此类药剂的例子包括2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶；硫唑嘌呤；环磷酰胺；溴麦角环肽；达那唑；氨苯砜；戊二醛；MHC抗原和MHC片段的抗独特型抗体；环孢菌素A；类固醇如糖皮质激素，例如泼尼松、甲泼尼龙和地塞米松；细胞因子或细胞因子受体拮抗剂，包括抗干扰素-γ、-β或-α抗体、抗肿瘤坏死因子-α抗体、抗肿瘤坏死因子-β抗体、抗白介素-2抗体和抗IL-2受体抗体；抗LFA-1抗体，包括抗CD11a和抗CD18抗体；抗L3T4抗体；异源抗淋巴细胞球蛋白；全T抗体；含有LFA-3结合结构域的可溶性肽；链激酶；TGF-β；链道酶；FK506；RS-61443；脱氧精胍菌素和雷帕霉素。在某些实施方案中，药剂是抗组胺剂。如本文所用，“抗组胺剂”是拮抗组胺的生理作用的药剂。抗组胺剂的例子是氯苯那敏、苯海拉明、异丙嗪、色甘酸钠、阿司咪唑(astemizole)、马来酸阿扎他定(azatadine)、马来酸溴苯那敏(bropheniramine)、马来酸卡比沙明(carbinoxamine)、盐酸西替利嗪(cetirizine)、富马酸氯马斯汀(clemastine)、盐酸塞庚啶(cyproheptadine)、马来酸右溴苯那敏、马来酸右氯苯那敏、茶苯海明(dimenhydrinate)、盐酸苯海拉明(diphenhydramine)、琥珀酸多西拉敏(doxylamine)、盐酸非索非那定(fexofendadine)、盐酸特非那定(terphenadine)、盐酸羟嗪、氯雷他定(loratidine)、盐酸美克洛嗪(meclizine)、柠檬酸曲吡那敏(tripelannamine)、盐酸曲吡那敏(tripelennamine)和盐酸曲普利啶(triprolidine)。
可以将免疫抑制剂、抗过敏剂或抗炎剂并入慢病毒载体给予方案中。例如，免疫抑制剂或抗炎剂的给予可以在所公开的慢病毒载体的给予之前开始，并且此后可以继续给予一个或多个剂量。在某些实施方案中，将免疫抑制剂或抗炎剂作为慢病毒载体的前驱药物进行给予。
如先前所讨论，本公开文本的慢病毒载体可以以药学有效量给予，以用于凝血障碍的体内治疗。在这一方面，应当理解，本公开文本的慢病毒载体可以被配制成有利于给予且促进活性剂的稳定性。优选地，根据本公开文本的药物组合物包含药学上可接受的、无毒的、无菌载体，如生理盐水、无毒缓冲液、防腐剂等。当然，本公开文本的药物组合物可以以单剂量或多剂量给予，以提供药学有效量的多肽。
多种测试可用于评估凝血系统的功能：激活部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)测试、生色测定、
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测定、凝血酶原时间(PT)测试(也用于确定INR)、纤维蛋白原测试(通常通过克劳斯法(Clauss method)进行)、血小板计数、血小板功能测试(通常通过PFA-100进行)、TCT、出血时间、混合测试(如果将患者的血浆与正常血浆混合，是否矫正异常)、凝血因子测定、抗磷脂抗体、D-二聚体、遗传测试(例如，因子V Leiden、凝血酶原突变G20210A)、稀释鲁塞尔蝰蛇毒时间(dRVVT)、杂项血小板功能测试、凝血弹性描记法(TEG或Sonoclot)、凝血弹性测定法(
Figure BDA0003568611620000691
例如
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)或优球蛋白溶解时间(ELT)。
aPTT测试是测量“内在”(也称为接触激活途径)和常见凝血途径二者的功效的表现指标。这个测试一般用于测量市售重组凝血因子(例如，FVIII或FIX)的凝血活性。其与测量外在途径的凝血酶原时间(PT)结合使用。
Figure BDA0003568611620000693
分析提供关于止血的整体动力学的信息：凝血时间、凝块形成、凝块稳定性和溶解。凝血弹性测定法中的不同参数依赖于血浆凝血系统的活性、血小板功能、纤维蛋白溶解或影响这些相互作用的许多因素。这个测定可以提供次级止血的全面见解。
B.2.组织特异性表达
在某些实施方案中，有用的是在慢病毒载体内包括一个或多个miRNA靶序列，所述miRNA靶序列例如与优化FVIII转基因可操作地连接。因此，本公开文本还提供了至少一个与优化FVIII或优化FIX核苷酸序列可操作地连接或以其他方式插入慢病毒载体内的miRNA序列靶标。慢病毒载体中包括的多于一个拷贝的miRNA靶序列可以增加系统的有效性。
还包括不同miRNA靶序列。例如，表达多于一种转基因的慢病毒载体可以具有在多于一个可以相同或不同的miRNA靶序列控制下的转基因。miRNA靶序列可以是串联的，但是也包括其他排列。含有miRNA靶序列的转基因表达盒也能以反义定向插入慢病毒载体内。反义定向可用于产生病毒颗粒，以避免原本可能对生产细胞有毒的基因产物的表达。
在其他实施方案中，慢病毒载体包含1、2、3、4、5、6、7或8个拷贝的相同或不同的miRNA靶序列。在某些实施方案中，慢病毒载体不包括任何miRNA靶序列。是否要包括miRNA靶序列(以及数量)的选择将依据已知参数如计划的组织靶标、所需的表达水平等来指导。
在一个实施方案中，靶序列是miR-223靶标，已经报道其可在骨髓定向祖细胞中最有效地阻断表达，以及在更原始的HSPC中至少部分阻断表达。miR-223靶标可以在分化的髓样细胞(包括粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、髓样树突细胞)中阻断表达。miR-223靶标还可以适于依赖于淋巴或红细胞谱系中的稳健转基因表达的基因疗法应用。miR-223靶标还可以在人HSC中非常有效地阻断表达。
在另一个实施方案中，靶序列是miR142靶标(tccataaagtaggaaacactaca(SEQ IDNO:7))。在一个实施方案中，慢病毒载体包含4个拷贝的miR-142靶序列。在某些实施方案中，将造血特异性微小RNA(如miR-142(142T))的互补序列并入慢病毒载体的3'非翻译区中，使得编码转基因的转录物易发生miRNA介导的下调。通过这种方法，可以在造血谱系抗原呈递细胞(APC)中防止转基因表达，同时在非造血细胞中维持所述转基因表达(Brown等人,Nat Med 2006)。这种策略可以对转基因表达施加严格的转录后控制，并且由此使得能够稳定递送和长期表达转基因。在一些实施方案中，miR-142调节防止经转导细胞的免疫介导的清除和/或诱导抗原特异性调节T细胞(T reg)，并且介导对转基因编码抗原的稳健的免疫耐受。
在一些实施方案中，靶序列是miR181靶标。Chen C-Z和Lodish H,Seminars inImmunology(2005)17(2):155-165披露了miR-181，它是在小鼠骨髓内的B细胞中特异性表达的miRNA(Chen和Lodish,2005)。所述文献还披露，一些人miRNA与白血病相关。
靶序列可以与miRNA完全或部分互补。术语“完全互补”意指，靶序列的核酸序列与识别所述靶序列的miRNA的序列100％互补。术语“部分互补”意指，靶序列与识别所述靶序列的miRNA的序列仅部分互补，借此部分互补的序列仍然被miRNA识别。换句话说，在本公开文本的上下文中，部分互补的靶序列有效识别相应miRNA，并且实现在表达该miRNA的细胞中防止或减少转基因表达。miRNA靶序列的例子描述于以下文献中：WO2007/000668、WO2004/094642、WO 2010/055413或WO 2010/125471，将上述文献通过引用以其整体并入本文。
B.3.异源核苷酸序列
在一些实施方案中，分离的核酸分子进一步包含异源核苷酸序列。在一些实施方案中，分离的核酸分子进一步包含至少一个异源核苷酸序列。异源核苷酸序列可以在5'端、3'端与本公开文本的FVIII或FIX编码序列连接，或者插入中间中。因此，在一些实施方案中，由异源核苷酸序列编码的异源氨基酸序列与由核苷酸序列编码的FVIII氨基酸序列或FIX氨基酸序列的N末端或C末端连接，或者插入所述FVIII氨基酸序列或所述FIX氨基酸序列中的两个氨基酸之间。在一些实施方案中，异源氨基酸序列可以在选自表2的一个或多个插入位点插入FVIII多肽的两个氨基酸之间。在一些实施方案中，异源氨基酸序列可以在以下文献中披露的任何位点处插入由本公开文本的核酸分子编码的FVIII多肽内：国际公开号WO 2013/123457 A1和WO 2015/106052A1或美国公开号2015/0158929A1，将上述文献通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，由异源核苷酸序列编码的异源氨基酸序列插入B结构域或其片段内。在一些实施方案中，异源氨基酸序列紧邻对应于成熟人FVIII(SEQ ID NO:4)的氨基酸745的氨基酸的下游插入FVIII内。在一个特定实施方案中，FVIII包含对应于成熟人FVIII(SEQ ID NO:4)的氨基酸746-1646的缺失，并且由异源核苷酸序列编码的异源氨基酸序列紧邻对应于成熟人FVIII(SEQ ID NO:4)的氨基酸745的下游插入。
表2：异源部分插入位点
Figure BDA0003568611620000711
注意：插入位点指示对应于成熟人FVIII(SEQ ID NO:4)的氨基酸位置的氨基酸位置。
在其他实施方案中，分离的核酸分子进一步包含2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个异源核苷酸序列。在一些实施方案中，所有异源核苷酸序列是相同的。在一些实施方案中，至少一个异源核苷酸序列与其他异源核苷酸序列不同。在一些实施方案中，本公开文本可以包含2个、3个、4个、5个、6个或多于7个串联的异源核苷酸序列。
在一些实施方案中，异源核苷酸序列编码氨基酸序列。在一些实施方案中，由异源核苷酸序列编码的氨基酸序列是可以增加FVIII分子的半衰期的异源部分(“半衰期延长剂”)。
在一些实施方案中，异源部分是具有非结构化或结构化特征的肽或多肽，所述特征在并入本公开文本的蛋白质中时与体内半衰期的延长相关。非限制性例子包括白蛋白、白蛋白片段、免疫球蛋白的Fc片段、人绒毛膜促性腺激素的β亚基的C末端肽(CTP)、HAP序列、XTEN序列、转铁蛋白或其片段、PAS多肽、聚甘氨酸接头、聚丝氨酸接头、白蛋白结合部分或者这些多肽的任何片段、衍生物、变体或组合。在一个特定实施方案中，异源氨基酸序列是免疫球蛋白恒定区或其部分、转铁蛋白、白蛋白或PAS序列。
在一些方面中，异源部分包括血管性血友病因子或其片段。在其他相关方面中，异源部分可以包括非多肽部分的附着位点(例如，半胱氨酸氨基酸)，所述非多肽部分是如聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)、聚唾液酸或者这些元件的任何衍生物、变体或组合。在一些方面中，异源部分包含用作非多肽部分的附着位点的半胱氨酸氨基酸，所述非多肽部分是例如聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)、聚唾液酸或者这些元件的任何衍生物、变体或组合。
在一个具体实施方案中，第一异源核苷酸序列编码为本领域已知的半衰期延长分子的第一异源部分，并且第二异源核苷酸序列编码也可以为本领域已知的半衰期延长分子的第二异源部分。在某些实施方案中，第一异源部分(例如，第一Fc部分)和第二异源部分(例如，第二Fc部分)彼此缔合形成二聚体。在一个实施方案中，第二异源部分是第二Fc部分，其中第二Fc部分与第一异源部分(例如，第一Fc部分)连接或缔合。例如，第二异源部分(例如，第二Fc部分)可以通过接头连接至第一异源部分(例如，第一Fc部分)，或者通过共价或非共价键与第一异源部分缔合。
在一些实施方案中，异源部分是如下多肽，其包含至少约10个、至少约100个、至少约200个、至少约300个、至少约400个、至少约500个、至少约600个、至少约700个、至少约800个、至少约900个、至少约1000个、至少约1100个、至少约1200个、至少约1300个、至少约1400个、至少约1500个、至少约1600个、至少约1700个、至少约1800个、至少约1900个、至少约2000个、至少约2500个、至少约3000个或至少约4000个氨基酸，基本上由所述氨基酸组成，或由所述氨基酸组成。
在其他实施方案中，异源部分是如下多肽，其包含约100个至约200个氨基酸、约200个至约300个氨基酸、约300个至约400个氨基酸、约400个至约500个氨基酸、约500个至约600个氨基酸、约600个至约700个氨基酸、约700个至约800个氨基酸、约800个至约900个氨基酸或约900个至约1000个氨基酸，基本上由所述氨基酸组成，或由所述氨基酸组成。
在某些实施方案中，异源部分改善FVIII或FIX蛋白的一种或多种药物代谢动力学特性，但不显著影响其生物学活性或功能。
在某些实施方案中，异源部分增加本公开文本的FVIII或FIX蛋白的体内和/或体外半衰期。在其他实施方案中，异源部分有助于本公开文本的FVIII或FIX蛋白或其片段(例如，在FVIII或FIX蛋白的蛋白质水解切割后包含异源部分的片段)的可视化或定位。本公开文本的FVIII或FIX蛋白或其片段的可视化和/或定位可以是体内的、体外的、离体的或其组合。
在其他实施方案中，异源部分增加本公开文本的FVIII或FIX蛋白或其片段(例如，在FVIII或FIX蛋白的蛋白质水解切割后包含异源部分的片段)的稳定性。如本文所用，术语“稳定性”是指本领域公认的响应环境条件(例如升高或降低的温度)维持FVIII或FIX蛋白的一种或多种物理特性的量度。在某些方面中，物理特性可以是维持FVIII或FIX蛋白的共价结构(例如，不存在蛋白质水解切割、不期望的氧化或脱酰胺作用)。在其他方面，物理特性也可以是处于正确折叠状态的FVIII或FIX蛋白的存在(例如，不存在可溶性或不溶性聚集体或沉淀物)。
在一方面，FVIII或FIX蛋白的稳定性是通过测定FVIII或FIX蛋白的生物物理特性来测量，所述生物物理特性例如热稳定性、pH解折叠谱、糖基化的稳定去除、溶解度、生化功能(例如，结合至蛋白质、受体或配体的能力)等和/或其组合。在另一方面，通过相互作用的结合亲和力证明生化功能。在一方面，蛋白质稳定性的量度是热稳定性，即对热激发的抗性。稳定性可以使用本领域中已知的方法来测量，如HPLC(高效液相色谱)、SEC(尺寸排阻色谱)、DLS(动态光散射)等。测量热稳定性的方法包括但不限于差式扫描量热法(DSC)、差式扫描荧光测定法(DSF)、圆二色性(CD)和热激发测定。
在某些方面中，由本公开文本的核酸分子编码的FVIII或FIX蛋白包含至少一种半衰期延长剂，即关于缺少这种异源部分的相应FVIII或FIX蛋白的体内半衰期增加FVIII或FIX蛋白的体内半衰期的异源部分。FVIII或FIX蛋白的体内半衰期可以通过本领域技术人员已知的任何方法来确定，例如活性测定(生色测定或一步式凝血aPTT测定)、ELISA、ROTEMTM等。
在一些实施方案中，一种或多种半衰期延长剂的存在导致FVIII或FIX蛋白的半衰期与缺少这一种或多种半衰期延长剂的相应蛋白质的半衰期相比有所增加。包含半衰期延长剂的FVIII或FIX蛋白的半衰期比缺少这种半衰期延长剂的相应FVIII或FIX蛋白的体内半衰期长至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍或至少约12倍。
在一个实施方案中，包含半衰期延长剂的FVIII或FIX蛋白的半衰期比缺少这种半衰期延长剂的相应蛋白质的体内半衰期长约1.5倍至约20倍、约1.5倍至约15倍或约1.5倍至约10倍。在另一个实施方案中，与缺少这种半衰期延长剂的相应蛋白质的体内半衰期相比，包含半衰期延长剂的FVIII或FIX蛋白的半衰期延长约2倍至约10倍、约2倍至约9倍、约2倍至约8倍、约2倍至约7倍、约2倍至约6倍、约2倍至约5倍、约2倍至约4倍、约2倍至约3倍、约2.5倍至约10倍、约2.5倍至约9倍、约2.5倍至约8倍、约2.5倍至约7倍、约2.5倍至约6倍、约2.5倍至约5倍、约2.5倍至约4倍、约2.5倍至约3倍、约3倍至约10倍、约3倍至约9倍、约3倍至约8倍、约3倍至约7倍、约3倍至约6倍、约3倍至约5倍、约3倍至约4倍、约4倍至约6倍、约5倍至约7倍、或约6倍至约8倍。
在其他实施方案中，包含半衰期延长剂的FVIII或FIX蛋白的半衰期为至少约17小时、至少约18小时、至少约19小时、至少约20小时、至少约21小时、至少约22小时、至少约23小时、至少约24小时、至少约25小时、至少约26小时、至少约27小时、至少约28小时、至少约29小时、至少约30小时、至少约31小时、至少约32小时、至少约33小时、至少约34小时、至少约35小时、至少约36小时、至少约48小时、至少约60小时、至少约72小时、至少约84小时、至少约96小时或至少约108小时。
在仍其他实施方案中，包含半衰期延长剂的FVIII或FIX蛋白的半衰期为约15小时至约2周、约16小时至约1周、约17小时至约1周、约18小时至约1周、约19小时至约1周、约20小时至约1周、约21小时至约1周、约22小时至约1周、约23小时至约1周、约24小时至约1周、约36小时至约1周、约48小时至约1周、约60小时至约1周、约24小时至约6天、约24小时至约5天、约24小时至约4天、约24小时至约3天、或约24小时至约2天。
在一些实施方案中，包含半衰期延长剂的FVIII或FIX蛋白的每名受试者的平均半衰期为约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时(1天)、约25小时、约26小时、约27小时、约28小时、约29小时、约30小时、约31小时、约32小时、约33小时、约34小时、约35小时、约36小时、约40小时、约44小时、约48小时(2天)、约54小时、约60小时、约72小时(3天)、约84小时、约96小时(4天)、约108小时、约120小时(5天)、约6天、约7天(1周)、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天或约14天。
一种或多种半衰期延长剂可以融合至FVIII或FIX的C末端或N末端或者插入FVIII或FIX内。
B.3.a.免疫球蛋白恒定区或其部分
在另一方面，异源部分包含一个或多个免疫球蛋白恒定区或其部分(例如，Fc区)。在一个实施方案中，本公开文本的分离的核酸分子还包含编码免疫球蛋白恒定区或其部分的异源核酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白恒定区或其部分是Fc区。
免疫球蛋白恒定区由表示为CH(恒定重)结构域(CH1、CH2等)的结构域构成。根据同种型(即IgG、IgM、IgA、IgD或IgE)，恒定区可以由3个或4个CH结构域构成。一些同种型(例如IgG)恒定区还含有铰链区。参见Janeway等人2001,Immunobiology,GarlandPublishing,纽约州纽约。
用于产生本公开文本的FVIII蛋白的免疫球蛋白恒定区或其部分可以从多种不同来源获得。在一个实施方案中，免疫球蛋白恒定区或其部分源自人免疫球蛋白。然而，应理解，免疫球蛋白恒定区或其部分可以源自另一哺乳动物物种的免疫球蛋白，所述另一哺乳动物物种包括例如啮齿类动物(例如，小鼠、大鼠、兔、豚鼠)或非人灵长类动物(例如，黑猩猩、猕猴)物种。此外，免疫球蛋白恒定区或其部分可以源自任何免疫球蛋白类别(包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE)以及任何免疫球蛋白同种型(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)。在一个实施方案中，使用人同种型IgG1。
多个免疫球蛋白恒定区基因序列(例如，人恒定区基因序列)能以可公开获得的存放物的形式获得。可以选择具有特定效应子功能(或缺少特定效应子功能)或具有特定修饰以降低免疫原性的恒定区结构域序列。已经公开了许多抗体和抗体编码基因的序列并且合适的Ig恒定区序列(例如，铰链、CH2和/或CH3序列或其部分)可以使用本领域公认的技术源自这些序列。然后可以改变或合成使用任何前述方法获得的遗传物质以获得本公开文本的多肽。应进一步了解，本公开文本的范围涵盖恒定区DNA序列的等位基因、变体和突变。
免疫球蛋白恒定区或其部分的序列可以例如使用聚合酶链式反应和所选用于扩增目的结构域的引物来克隆。为了从抗体克隆免疫球蛋白恒定区或其部分的序列，可以从杂交瘤、脾脏或淋巴细胞分离mRNA，逆转录成DNA，并通过PCR扩增抗体基因。PCR扩增方法详细描述于以下文献中：美国专利号4,683,195；4,683,202；4,800,159；4,965,188；和例如“PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications”Innis等人编辑,AcademicPress,加利福尼亚州圣地亚哥(1990)；Ho等人1989.Gene 77:51；Horton等人1993.MethodsEnzymol.217:270)。PCR可以基于所公开的重链和轻链DNA和氨基酸序列由共有恒定区引物或由更具特异性的引物来起始。PCR还可以用于分离编码抗体轻链和重链的DNA克隆。在这种情况下，可以通过共有引物或较大同源探针(如小鼠恒定区探针)筛选文库。许多适于扩增抗体基因的引物组是本领域已知的(例如，基于纯化抗体的N末端序列的5'引物(Benhar和Pastan.1994.Protein Engineering 7:1509)；cDNA末端的快速扩增(Ruberti,F.等人1994.J.Immunol.Methods 173:33)；抗体前导序列(Larrick等人1989Biochem.Biophys.Res.Commun.160:1250)。抗体序列的克隆进一步描述Newman等人于1995年1月25日提交的美国专利号5,658,570中，将所述专利通过引用并入本文。
本文所用的免疫球蛋白恒定区可以包括所有结构域和铰链区或其部分。在一个实施方案中，免疫球蛋白恒定区或其部分包含CH2结构域、CH3结构域和铰链区，即Fc区或FcRn结合配偶体。
如本文所用，术语“Fc区”定义为多肽中对应于天然Ig的Fc区的部分，即如通过其两条重链的相应Fc结构域的二聚缔合所形成。天然Fc区与另一Fc区形成同二聚体。相比之下，如本文所用的术语“基因融合的Fc区”或“单链Fc区”(scFc区)是指合成二聚Fc区，其由基因连接于单条多肽链内(即，编码于单一连续基因序列中)的Fc结构域构成。参见国际公开号WO2012/006635，将其通过引用以其整体并入本文。
在一个实施方案中，“Fc区”是指单条Ig重链的如下部分，其始于铰链区中紧邻木瓜蛋白酶切割位点(即IgG中的残基216，以重链恒定区的第一个残基为114)上游，并终于抗体的C末端。因此，完整Fc区至少包含铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域。
免疫球蛋白恒定区或其部分可以是FcRn结合配偶体。FcRn在成人上皮组织中有活性并在肠腔、肺气道、鼻表面、阴道表面、结肠和直肠表面中表达(美国专利号号6,485,726)。FcRn结合配偶体是免疫球蛋白中结合至FcRn的部分。
已经从包括人在内的若干哺乳动物物种分离出FcRn受体。人FcRn、猴FcRn、大鼠FcRn和小鼠FcRn的序列是已知的(Story等人1994,J.Exp.Med.180:2377)。FcRn受体在相对低pH下结合IgG(但不结合其他免疫球蛋白类别，如IgA、IgM、IgD和IgE)，以内腔至浆膜方向跨细胞主动转运IgG，然后在间质液中发现的相对高pH下释放IgG。它在成人上皮组织中表达(美国专利.号6,485,726、6,030,613、6,086,875；WO 03/077834；US 2003-0235536A1)，所述上皮组织包括肺和肠上皮(Israel等人1997,Immunology 92:69)、肾脏近端的管状上皮(Kobayashi等人2002,Am.J.Physiol.Renal Physiol.282:F358)以及鼻上皮、阴道表面和胆管树表面。
可用于本公开文本中的FcRn结合配偶体涵盖可由FcRn受体特异性结合的分子，包括完整IgG、IgG的Fc片段和包括FcRn受体的完整结合区的其他片段。已经基于X射线晶体学描述了IgG的Fc部分中结合至FcRn受体的区域(Burmeister等人1994,Nature 372:379)。Fc与FcRn的主要接触区域接近CH2和CH3结构域的连接处。Fc-FcRn接触全部位于单条Ig重链内。FcRn结合配偶体包括完整IgG、IgG的Fc片段和IgG的包括FcRn的完整结合区的其他IgG片段。主要接触位点包括CH2结构域的氨基酸残基248、250-257、272、285、288、290-291、308-311和314以及CH3结构域的氨基酸残基385-387、428和433-436。对免疫球蛋白或免疫球蛋白片段或区域的氨基酸编号的参考均基于Kabat等人1991,Sequences of Proteinsof Immunological Interest,U.S.Department of Public Health,马里兰州贝塞斯达。
FcRn可以跨越上皮障壁有效穿梭结合至FcRn的Fc区或FcRn结合配偶体，由此提供全身给予所需治疗分子的非侵入性手段。另外，包含Fc区或FcRn结合配偶体的融合蛋白被表达FcRn的细胞内吞。但是这些融合蛋白未被标记以供降解，而是被再次回收至循环中，由此增加这些蛋白质的体内半衰期。在某些实施方案中，免疫球蛋白恒定区的部分是Fc区或FcRn结合配偶体，其通常通过二硫键和其他非特异性相互作用与另一Fc区或另一FcRn结合配偶体缔合，以形成二聚体和更高阶多聚体。
两个FcRn受体可以结合单个Fc分子。晶体学数据表明，每个FcRn分子结合Fc同二聚体的单一多肽。在一个实施方案中，将FcRn结合配偶体(例如，IgG的Fc片段)与生物活性分子连接提供口服、经颊、舌下、经直肠、经阴道、作为经鼻或经由肺途径给予的气溶胶、或经由眼部途径递送生物活性分子的手段。在另一个实施方案中，FVIII蛋白可以侵入性地给予，例如皮下、静脉内给予。
FcRn结合配偶体区域是可由FcRn受体特异性结合，随后通过Fc区的FcRn受体主动转运的分子或其部分。特异性结合是指两个分子形成在生理条件下相对稳定的复合物。特异性结合的特征在于高亲和力和低至中的容量，与之相区分，非特异性结合通常具有低亲和力和中至高的容量。通常，在亲和常数KA高于106M-1或高于108M-1时，将结合视为特异性的。如有必要，可以通过改变结合条件来减少非特异性结合而基本上不影响特异性结合。技术人员可以使用常规技术优化适当的结合条件，如分子浓度、溶液的离子强度、温度、允许结合的时间、阻断剂(例如，血清白蛋白、乳酪蛋白)浓度等。
在某些实施方案中，由本公开文本的核酸分子编码的FVIII蛋白包含一个或多个截短Fc区，但是其足以将Fc受体(FcR)结合特性赋予Fc区。例如，Fc区中结合至FcRn的部分(即，FcRn结合部分)包含IgG1的约氨基酸282-438，EU编号(主要接触位点是CH2结构域的氨基酸248、250-257、272、285、288、290-291、308-311和314以及CH3结构域的氨基酸残基385-387、428和433-436)。因此，本公开文本的Fc区可以包含FcRn结合部分或由所述FcRn结合部分组成。FcRn结合部分可以源自任何同种型(包括IgGl、IgG2、IgG3和IgG4)的重链。在一个实施方案中，使用来自人同种型IgG1的抗体的FcRn结合部分。在另一个实施方案中，使用来自人同种型IgG4的抗体的FcRn结合部分。
Fc区可以从多种不同来源获得。在一个实施方案中，多肽的Fc区源自人免疫球蛋白。然而，应理解，Fc部分可以源自另一哺乳动物物种的免疫球蛋白，所述另一哺乳动物物种包括例如啮齿类动物(例如，小鼠、大鼠、兔、豚鼠)或非人灵长类动物(例如，黑猩猩、猕猴)物种。此外，Fc结构域或其部分的多肽可以源自任何免疫球蛋白类别(包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE)以及任何免疫球蛋白同种型(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)。在另一个实施方案中，使用人同种型IgG1。
在某些实施方案中，Fc变体赋予至少一种由包含所述野生型Fc结构域的Fc部分赋予的效应子功能的变化(例如，Fc区结合至Fc受体(例如FcγRI、FcγRII或FcγRIII)或补体蛋白(例如，C1q)或触发抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、吞噬作用或补体依赖性细胞毒性(CDCC)的能力的改善或降低)。在其他实施方案中，Fc变体提供工程化半胱氨酸残基。
本公开文本的Fc区可以利用本领域公认的Fc变体，已知所述Fc变体可赋予效应子功能和/或FcR或FcRn结合的变化(例如，增强或降低)。具体来说，本公开文本的Fc区可以包括例如在以下文献中披露的一个或多个氨基酸位置处的变化(例如，取代)：国际PCT公开案WO 88/07089A1、WO 96/14339A1、WO 98/05787A1、WO 98/23289A1、WO 99/51642A1、WO 99/58572A1、WO 00/09560A2、WO 00/32767A1、WO 00/42072A2、WO 02/44215A2、WO 02/060919A2、WO 03/074569A2、WO 04/016750A2、WO 04/029207A2、WO 04/035752A2、WO 04/063351A2、WO 04/074455A2、WO 04/099249A2、WO 05/040217A2、WO 04/044859、WO 05/070963A1、WO 05/077981A2、WO 05/092925A2、WO 05/123780A2、WO 06/019447A1、WO 06/047350A2和WO 06/085967A2；美国专利公开号US 2007/0231329、US 2007/0231329、US2007/0237765、US 2007/0237766、US 2007/0237767、US 2007/0243188、US 2007/0248603、US 2007/0286859、US 2008/0057056；或美国专利5,648,260；5,739,277；5,834,250；5,869,046；6,096,871；6,121,022；6,194,551；6,242,195；6,277,375；6,528,624；6,538,124；6,737,056；6,821,505；6,998,253；7,083,784；7,404,956和7,317,091，将每篇文献通过引用并入本文。在一个实施方案中，可以在一个或多个所公开的氨基酸位置进行特定变化(例如，本领域中披露的一个或多个氨基酸的特定取代)。在另一个实施方案中，可以在一个或多个所公开氨基酸位置进行不同变化(例如，本领域中披露的一个或多个氨基酸位置的不同取代)。
IgG的Fc区或FcRn结合配偶体可以根据公认程序(如定点诱变等)来修饰，以产生将由FcRn结合的经修饰IgG或其Fc片段或部分。此类修饰包括远离FcRn接触位点的修饰以及在接触位点内的修饰，所述修饰保留或甚至增强与FcRn的结合。例如，可以在不显著损失Fc对FcRn的结合亲和力的情况下取代人IgG1 Fc(Fcγ1)中的以下单个氨基酸残基：P238A、S239A、K246A、K248A、D249A、M252A、T256A、E258A、T260A、D265A、S267A、H268A、E269A、D270A、E272A、L274A、N276A、Y278A、D280A、V282A、E283A、H285A、N286A、T289A、K290A、R292A、E293A、E294A、Q295A、Y296F、N297A、S298A、Y300F、R301A、V303A、V305A、T307A、L309A、Q311A、D312A、N315A、K317A、E318A、K320A、K322A、S324A、K326A、A327Q、P329A、A330Q、P331A、E333A、K334A、T335A、S337A、K338A、K340A、Q342A、R344A、E345A、Q347A、R355A、E356A、M358A、T359A、K360A、N361A、Q362A、Y373A、S375A、D376A、A378Q、E380A、E382A、S383A、N384A、Q386A、E388A、N389A、N390A、Y391F、K392A、L398A、S400A、D401A、D413A、K414A、R416A、Q418A、Q419A、N421A、V422A、S424A、E430A、N434A、T437A、Q438A、K439A、S440A、S444A和K447A，其中例如P238A表示在位置编号238处由丙氨酸取代的野生型脯氨酸。作为例子，一个具体实施方案并入N297A突变，从而去除高度保守的N糖基化位点。除了丙氨酸以外，可以在上文指定的位置用其他氨基酸取代野生型氨基酸。可以将突变单独引入Fc中，从而产生多于一百个与天然Fc不同的Fc区。另外，这些单独突变中的2个、3个或更多个的组合可以一起引入，从而产生另外数百个Fc区。
某些上述突变可以对Fc区或FcRn结合配偶体赋予新功能。例如，一个实施方案并入N297A，从而去除高度保守的N糖基化位点。这个突变的作用是降低免疫原性，由此增强Fc区的循环半衰期，并使Fc区不能结合至FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB和FcγRIIIA，并且不损害对FcRn的亲和力(Routledge等人1995,Transplantation 60:847；Friend等人1999,Transplantation 68:1632；Shi elds等人1995,J.Biol.Chem.276:6591)。作为从上述突变产生的新功能的另一例子，对FcRn的亲和力可以增加，在一些情况下超过野生型的所述亲和力。这种增加的亲和力可以反映增加的“缔合”率、降低的“解离”率或增加的“缔合”率与降低的“解离”率二者。相信可赋予增加的对FcRn的亲和力的突变的例子包括但不限于T256A、T307A、E380A和N434A(Shields等人2001,J.Biol.Chem.276:6591)。
另外，至少三种人Fcγ受体似乎识别IgG上于下铰链区内的结合位点，通常是氨基酸234-237。因此，如例如通过将人IgG1的氨基酸233-236“ELLG”(SEQ ID NO:8)替代为来自IgG2的相应序列“PVA”(一个氨基酸缺失)，可以从这个区域的突变产生新功能的另一例子和可能降低的免疫原性。已经显示，在已经引入此类突变时，介导多种效应子功能的FcγRI、FcγRII和FcγRIII不会结合至IgG1。Ward和Ghetie 1995,Therapeutic Immunology2:77和Armour等人1999,Eur.J.Immunol.29:2613。
在另一个实施方案中，免疫球蛋白恒定区或其部分包含铰链区或其部分中的与第二免疫球蛋白恒定区或其部分形成一个或多个二硫键的氨基酸序列。第二免疫球蛋白恒定区或其部分可以连接至第二多肽，使FVIII蛋白与第二多肽结合在一起。在一些实施方案中，第二多肽是增强子部分。如本文所用，术语“增强子部分”是指能够增强FVIII的促凝血活性的分子、其片段或多肽组分。增强子部分可以是辅因子，如可溶性组织因子(sTF)或促凝血肽。因此，在激活FVIII后，增强子部分可用于增强FVIII活性。
在某些实施方案中，由本公开文本的核酸分子编码的FVIII蛋白包含对免疫球蛋白恒定区或其部分的氨基酸取代(例如，Fc变体)，所述氨基酸取代改变Ig恒定区的抗原非依赖性效应子功能，特别是蛋白质的循环半衰期。
B.3.b.scFc区
在另一方面，异源部分包含scFc(单链Fc)区。在一个实施方案中，本公开文本的分离的核酸分子进一步包含编码scFc区的异源核酸序列。scFc区在同一线性多肽链内包含至少两个免疫球蛋白恒定区或其部分(例如，Fc部分或结构域(例如，2、3、4、5、6个或更多个Fc部分或结构域))，所述恒定区或部分能够折叠(例如，分子内或分子间折叠)以形成一个由Fc肽接头连接的功能性scFc区。例如，在一个实施方案中，本公开文本的多肽能够经由其scFc区结合至至少一种Fc受体(例如，FcRn、FcγR受体(例如，FcγRIII)或补体蛋白(例如，C1q))，以改善半衰期或触发免疫效应子功能(例如，抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、吞噬作用或补体依赖性细胞毒性(CDCC)和/或改善可制造性)。
B.3.c.CTP
在另一方面，异源部分包含人绒毛膜促性腺激素的β亚基的一种C末端肽(CTP)或其片段、变体或衍生物。已知插入重组蛋白中的一种或多种CTP肽增加该蛋白质的体内半衰期。参见例如，美国专利号5,712,122，将其通过引用以其整体并入本文。
示例性CTP肽包括DPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPIL(SEQ ID NO:9)或SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ ID NO:10)。参见例如，美国专利申请公开号US2009/0087411 A1，将其通过引用并入。
B.3.d.XTEN序列
在一些实施方案中，异源部分包含一个或多个XTEN序列、其片段、变体或衍生物。如本文所用，“XTEN序列”是指具有非天然存在的基本上不重复的序列的延伸长度的多肽，其主要由小亲水性氨基酸构成，并且所述序列在生理条件下具有较低程度的或不具有二级或三级结构。作为异源部分，XTEN可以用作半衰期延长部分。另外，XTEN可以提供所需特性，包括但不限于增强的药物代谢动力学参数和溶解度特征。
将包含XTEN序列的异源部分并入本公开文本的蛋白质中可以赋予蛋白质以下有利特性中的一种或多种：构象柔性、增强的水溶解度、高蛋白酶抗性程度、低免疫原性、与哺乳动物受体的低结合或增加的流体力学(或斯托克斯(Stokes))半径。
在某些方面，XTEN序列可以增加药物代谢动力学特性，如较长体内半衰期或增加的曲线下面积(AUC)，使得与相同的但不具有XTEN异源部分的蛋白质相比，本公开文本的蛋白质在增加的时间段中停留在体内并且具有促凝血活性。
在一些实施方案中，可用于本公开文本的XTEN序列是具有大于约20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1200、1400、1600、1800或2000个氨基酸残基的肽或多肽。在某些实施方案中，XTEN是具有大于约20至约3000个氨基酸残基、大于30至约2500个残基、大于40至约2000个残基、大于50至约1500个残基、大于60至约1000个残基、大于70至约900个残基、大于80至约800个残基、大于90至约700个残基、大于100至约600个残基、大于110至约500个残基、或大于120个至大约400个残基的肽或多肽。在一个特定实施方案中，XTEN包含长度长于42个氨基酸且短于144个氨基酸的氨基酸序列。
本公开文本的XTEN序列可以包含一个或多个5至14(例如，9至14)个氨基酸残基的序列基序或与所述序列基序至少80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，其中所述基序包含4至6种类型的选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)的氨基酸(例如，5种氨基酸)，基本上由所述氨基酸组成或由所述氨基酸组成。参见US 2010-0239554 A1。
在一些实施方案中，XTEN包含非重叠序列基序，其中约80％、或至少约85％、或至少约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％或约100％的序列由选自从表3选择的单一基序家族的非重叠序列的多个单元组成，从而得到家族序列。
如本文所用，“家族”意指，XTEN具有仅选自表3的单一基序类别的基序；即，AD、AE、AF、AG、AM、AQ、BC或BD XTEN，并且选择XTEN中并非来自家族基序的任何其他氨基酸以实现所需特性，如允许通过编码核苷酸并入限制位点、并入切割序列，或实现与FVIII的更佳连接。在XTEN家族的一些实施方案中，XTEN序列包含AD基序家族、或AE基序家族、或AF基序家族、或AG基序家族、或AM基序家族、或AQ基序家族、或BC家族或BD家族的非重叠序列基序的多个单元，所得XTEN展现出上述同源性范围。在其他实施方案中，XTEN包含来自表3的两个或更多个基序家族的基序序列的多个单元。
可以选择这些序列以实现所需的物理/化学特征，包括如净电荷、亲水性、二级结构缺少或重复性缺少等特性，这些特性由基序的氨基酸组成赋予，下面将更全面地描述。在本段中的上述实施方案中，可以使用本文所述的方法选择和组装并入XTEN中的基序，以实现具有约36至约3000个氨基酸残基的XTEN。
表3. 12个氨基酸的XTEN序列基序和基序家族
基序家族* 基序序列 SEQ ID NO:
AD GESPGGSSGSES 11
AD GSEGSSGPGESS 12
AD GSSESGSSEGGP 13
AD GSGGEPSESGSS 14
AE,AM GSPAGSPTSTEE 15
AE,AM,AQ GSEPATSGSETP 16
AE,AM,AQ GTSESATPESGP 17
AE,AM,AQ GTSTEPSEGSAP 18
AF,AM GSTSESPSGTAP 19
AF,AM GTSTPESGSASP 20
AF,AM GTSPSGESSTAP 21
AF,AM GSTSSTAESPGP 22
AG,AM GTPGSGTASSSP 23
AG AM GSSTPSGATGSP 24
AG,AM GSSPSASTGTGP 25
AG,AM GASPGTSSTGSP 26
AQ GEPAGSPTSTSE 27
AQ GTGEPSSTPASE 28
AQ GSGPSTESAPTE 29
AQ GSETPSGPSETA 30
AQ GPSETSTSEPGA 31
AQ GSPSEPTEGTSA 32
BC GSGASEPTSTEP 33
BC GSEPATSGTEPS 34
BC GTSEPSTSEPGA 35
BC GTSTEPSEPGSA 36
BD GSTAGSETSTEA 37
BD GSETATSGSETA 38
BD GTSESATSESGA 39
BD GTSTEASEGSAS 40
*表示单独基序序列，其在以各种排列一起使用时得到“家族序列”
可以用作本公开文本的嵌合蛋白中的异源部分的XTEN序列的例子披露于例如以下文献中：美国专利公开号2010/0239554 A1、2010/0323956 A1、2011/0046060 A1、2011/0046061 A1、2011/0077199 A1或2011/0172146 A1，或者国际专利公开号WO 2010/091122A1、WO 2010/144502 A2、WO 2010/144508 A1、WO 2011/028228 A1、WO 2011/028229 A1或WO 2011/028 344 A2，将每篇文献通过引用以其整体并入本文。
XTEN可以具有不同的长度用于插入FVIII中或连接至FVIII。在一个实施方案中，基于融合蛋白中要实现的特性或功能来选择一个或多个XTEN序列的长度。根据预期的特性或功能，XTEN可以是可以充当载体的短序列或中等长度序列或更长的序列。在某些实施方案中，XTEN包括约6至约99个氨基酸残基的短区段、约100至约399个氨基酸残基的中等长度和约400至约1000以及多达约3000个氨基酸残基的较长长度。因此，插入FVIII中或连接至FVIII的XTEN可以具有约6、约12、约36、约40、约42、约72、约96、约144、约288、约400、约500、约576、约600、约700、约800、约864、约900、约1000、约1500、约2000、约2500或多达约3000个氨基酸残基的长度。在其他实施方案中，XTEN序列的长度为约6至约50、约50至约100、约100至150、约150至250、约250至400、约400至约500、约500至约900、约900至1500、约1500至2000或约2000至约3000个氨基酸残基。
插入FVIII中或连接至FVIII的XTEN的精确长度可以在不对FVIII的活性造成不利影响的情况下变化。在一个实施方案中，本文使用的一个或多个XTEN的长度为42个氨基酸、72个氨基酸、144个氨基酸、288个氨基酸、576个氨基酸或864个氨基酸，并且可以选自一个或多个XTEN家族序列；所述家族即AD、AE、AF、AG、AM、AQ、BC或BD。
在一些实施方案中，用于本公开文本中的XTEN序列与选自以下的序列至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同：AE42、AG42、AE48、AM48、AE72、AG72、AE108、AG108、AE144、AF144、AG144、AE180、AG180、AE216、AG216、AE252、AG252、AE288、AG288、AE324、AG324、AE360、AG360、AE396、AG396、AE432、AG432、AE468、AG468、AE504、AG504、AF504、AE540、AG540、AF540、AD576、AE576、AF576、AG576、AE612、AG612、AE624、AE648、AG648、AG684、AE720、AG720、AE756、AG756、AE792、AG792、AE828、AG828、AD836、AE864、AF864、AG864、AM875、AE912、AM923、AM1318、BC864、BD864、AE948、AE1044、AE1140、AE1236、AE1332、AE1428、AE1524、AE1620、AE1716、AE1812、AE1908、AE2004A、AG948、AG1044、AG1140、AG1236、AG1332、AG1428、AG1524、AG1620、AG1716、AG1812、AG1908、AG2004及其任何组合。参见US 2010-0239554 A1。在一个特定实施方案中，XTEN包含AE42、AE72、AE144、AE288、AE576、AE864、AG 42、AG72、AG144、AG288、AG576、AG864或其任何组合。
可以用作本公开文本的嵌合蛋白中的异源部分的示例性XTEN序列包括XTENAE42-4(SEQ ID NO:41)、XTEN 144-2A(SEQ ID NO:42)、XTEN A144-3B(SEQ ID NO:43)、XTEN AE144-4A(SEQ ID NO:44)、XTEN AE144-5A(SEQ ID NO:45)、XTEN AE144-6B(SEQ IDNO:46)、XTEN AG144-1(SEQ ID NO:47)、XTEN AG144-A(SEQ ID NO:48)、XTEN AG144-B(SEQID NO:49)、XTEN AG144-C(SEQ ID NO:50)和XTEN AG144-F(SEQ ID NO:51)。在一个特定实施方案中，XTEN由SEQ ID NO:52编码。
在一些实施方案中，XTEN的小于100％的氨基酸选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)，或者小于100％的序列由来自表3的序列基序或本文所提供的XTEN序列组成。在此类实施方案中，XTEN的其余氨基酸残基选自其他14种天然L-氨基酸中的任一种，但是可以优先地选自亲水氨基酸，使得XTEN序列含有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少约99％的亲水氨基酸。
缀合构建体中所利用的XTEN中疏水氨基酸的含量可以为小于5％、或小于2％、或小于1％疏水氨基酸含量。在XTEN构建中不太有利的疏水残基包括色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和甲硫氨酸。另外，XTEN序列可以含有小于5％或小于4％或小于3％或小于2％或小于1％或无以下氨基酸：甲硫氨酸(例如，以避免氧化)、或天冬酰胺和谷氨酰胺(以避免脱酰胺)。
所述一个或多个XTEN序列可以插入由核苷酸序列编码的氨基酸序列的C末端或N末端处，或者插入由核苷酸序列编码的氨基酸序列中的两个氨基酸之间。例如，XTEN可以在选自表2的一个或多个插入位点插入两个氨基酸之间。FVIII内可允许XTEN插入的位点的例子可在例如国际公开号WO 2013/123457 A1或美国公开号2015/0158929 A1中找到，将所述文献通过引用以其整体并入本文。
B.3.e.白蛋白或其片段、衍生物或变体
在一些实施方案中，异源部分包含白蛋白或其功能片段。人血清白蛋白(HSA，或HA)是全长形式有609个氨基酸的蛋白质，负责大部分血清渗透压，并且还起到内源和外源配体的载体的作用。如本文所用的术语“白蛋白”包括全长白蛋白或其功能性片段、变体、衍生物或类似物。白蛋白或其片段或变体的例子披露于以下文献中：美国专利公开号2008/0194481 A1、2008/0004206 A1、2008/0161243 A1、2008/0261877 A1或2008/0153751 A1或PCT申请公开号WO 2008/033413 A2、WO 2009/058322 A1或WO 2007/021494 A2，将所述文献通过引用以其整体并入本文。
在一个实施方案中，由本公开文本的核苷酸分子编码的FVIII蛋白包含进一步连接至第二异源部分的白蛋白、其片段或变体，所述第二异源部分选自免疫球蛋白恒定区或其部分(例如，Fc区)、PAS序列、HES和PEG。
B.3.f.白蛋白结合部分
在某些实施方案中，异源部分是白蛋白结合部分，其包含白蛋白结合肽、细菌白蛋白结合结构域、白蛋白结合抗体片段或其任何组合。
例如，白蛋白结合蛋白可以是细菌白蛋白结合蛋白、抗体或抗体片段，包括结构域抗体(参见美国专利号6,696,245)。例如，白蛋白结合蛋白可以是细菌白蛋白结合结构域，如一种链球菌蛋白G(Konig,T.和Skerra,A.(1998)J.Immunol.Methods 218,73-83)。可以用作缀合配偶体的白蛋白结合肽的其他例子是例如具有Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys(SEQ ID NO:52)共有序列的那些白蛋白结合肽，其中Xaa1是Asp、Asn、Ser、Thr、或Trp；Xaa2是Asn、Gln、His、Ile、Leu、或Lys；Xaa3是Ala、Asp、Phe、Trp、或Tyr；并且Xaa4是Asp、Gly、Leu、Phe、Ser、或Thr，如美国专利申请公开号2003/0069395或Dennis等人(Dennis等人(2002)J.Biol.Chem.277,35035-35043)中所述。
来自链球菌蛋白G的结构域3(如由Kraulis等人,FEBS Lett.378:190-194(1996)和Linhult等人,Protein Sci.11:206-213(2002)所披露)是细菌白蛋白结合结构域的例子。白蛋白结合肽的例子包括具有核心序列DICLPRWGCLW(SEQ ID NO:54)的一系列肽。参见例如，Dennis等人,J.Biol.Chem.2002,277:35035-35043(2002)。白蛋白结合抗体片段的例子披露于以下文献中：Muller和Kontermann,Curr.Opin.Mol.Ther.9:319-326(2007)；Roovers等人,Cancer Immunol.Immunother.56:303-317(2007)；和Holt等人,Prot.Eng.Design Sci.,21:283-288(2008)，将所述文献通过引用以其整体并入本文。这种白蛋白结合部分的例子是2-(3-马来酰亚胺基丙酰胺基)-6-(4-(4-碘苯基)丁酰胺基)己酸酯(“Albu”标签)，如Trussel等人,Bioconjugate Chem.20:2286-2292(2009)所披露的。
脂肪酸、特别是长链脂肪酸(LCFA)和长链脂肪酸样白蛋白结合化合物可以用于延长本公开文本的FVIII蛋白的体内半衰期。LCFA样白蛋白结合化合物的例子是16-(1-(3-(9-(((2,5-二氧代吡咯烷-1-基氧基)羰氧基)-甲基)-7-磺基-9H-芴-2-基氨基)-3-氧代丙基)-2,5-二氧代吡咯烷-3-基硫基)十六烷酸(参见例如，WO 2010/140148)。
B.3.g.PAS序列
在其他实施方案中，异源部分是PAS序列。如本文所用的PAS序列意指主要包含丙氨酸和丝氨酸残基或主要包含丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸残基的氨基酸序列，所述氨基酸序列在生理条件下形成随机螺旋构象。因此，PAS序列是包含丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸、基本上由所述氨基酸组成或由所述氨基酸组成的构造块、氨基酸聚合物或序列盒，其可以用作嵌合蛋白中异源部分的一部分。然而，技术人员知道，在添加除了丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸以外的残基作为PAS序列中的次要成分时，氨基酸聚合物也可以形成随机螺旋构象。
如本文所用的术语“次要成分”意指，可以在PAS序列中添加除了丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸以外的氨基酸至某种程度，例如，高达约12％，即PAS序列的100个氨基酸中的约12个；高达约10％，即PAS序列的100个氨基酸中的约10个；高达约9％，即100个氨基酸中的约9个；高达约8％，即100个氨基酸中的约8个；约6％，即100个氨基酸中的约6个；约5％，即100个氨基酸中的约5个；约4％，即100个氨基酸中的约4个；约3％，即100个氨基酸中的约3个；约2％，即100个氨基酸中的约2个；约1％，即100个氨基酸中的约1个。不同于丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸的氨基酸可选自Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Trp、Tyr、和Val。
在生理条件下，PAS序列延伸段形成随机螺旋构象，由此可以介导增加的FVIII蛋白的体内和/或体外稳定性。由于随机螺旋结构域自身不具有稳定结构或功能，基本上保留了由FVIII蛋白介导的生物学活性。在其他实施方案中，形成随机螺旋结构域的PAS序列具有生物惰性，尤其关于血浆中的蛋白质水解、免疫原性、等电点/静电行为、与细胞表面受体的结合或内化，但仍然是生物可降解的，这提供了优于合成聚合物如PEG的明显优势。
形成随机螺旋构象的PAS序列的非限制性例子包括选自以下的氨基酸序列：ASPAAPAPASPAAPAPSAPA(SEQ ID NO:55)、AAPASPAPAAPSAP APAAPS(SEQ ID NO:56)、APSSPSPSAPSSPSPASPSS(SEQ ID NO:57)、APSSPSPSAPSSPSPASPS(SEQ ID NO:58)、SSPSAPSPSSPASPSPSS PA(SEQ ID NO:59)、AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA(SEQ ID NO:60)和ASAAAPAAASAAASAPSAAA(SEQ ID NO:61)或其任何组合。PAS序列的另外例子可从以下文献中得知：例如美国专利公开号2010/0292130A1和PCT申请公开号WO 2008/155134 A1。
B.3.h.HAP序列
在某些实施方案中，异源部分是富含甘氨酸的同氨基酸聚合物(HAP)。HAP序列可以包含甘氨酸的重复序列，所述重复序列的长度为至少50个氨基酸、至少100个氨基酸、120个氨基酸、140个氨基酸、160个氨基酸、180个氨基酸、200个氨基酸、250个氨基酸、300个氨基酸、350个氨基酸、400个氨基酸、450个氨基酸或500个氨基酸。在一个实施方案中，HAP序列能够延长融合至或连接至HAP序列的部分的半衰期。HAP序列的非限制性例子包括但不限于(Gly)n、(Gly4Ser)n或S(Gly4Ser)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一个实施方案中，n为20、21、22、23、24、25、26、26、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40。在另一个实施方案中，n为50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200。
B.3.i.转铁蛋白或其片段
在某些实施方案中，异源部分是转铁蛋白或其片段。任何转铁蛋白都可以用于制备本公开文本的FVIII蛋白。作为例子，野生型人TF(TF)是679个氨基酸的蛋白质，大约75KDa(不计糖基化)，具有似乎源自基因重复的两个主要结构域N(约330个氨基酸)和C(约340个氨基酸)。参见GenBank登录号NM001063、XM002793、M12530、XM039845、XM 039847和S95936(www.ncbi.nlm.nih.gov/)，它们都是通过引用以其整体并入本文。转铁蛋白包含两个结构域N结构域和C结构域。N结构域包含两个子结构域，即N1结构域和N2结构域，并且C结构域包含两个子结构域，即C1结构域和C2结构域。
在一个实施方案中，转铁蛋白异源部分包括转铁蛋白剪接变体。在一个例子中，转铁蛋白剪接变体可以是人转铁蛋白的剪接变体，例如Genbank登录号AAA61140。在另一个实施方案中，嵌合蛋白的转铁蛋白部分包括转铁蛋白序列的一个或多个结构域，例如N结构域、C结构域、N1结构域、N2结构域、C1结构域、C2结构域或其任何组合。
B.3.j.清除受体
在某些实施方案中，异源部分是清除受体、其片段、变体或衍生物。LRP1是600kDa膜内在蛋白，其参与受体介导的多种蛋白质(如因子X)的清除。参见例如，Narita等人,Blood 91:555-560(1998)。
B.3.k.血管性血友病因子或其片段
在某些实施方案中，异源部分是血管性血友病因子(VWF)或其一个或多个片段。
VWF(也称为F8VWF)是存在于血浆中的大多聚糖蛋白，并且在内皮(在怀布尔-帕拉德体(Weibel-Palade body)中)、巨核细胞(血小板的α颗粒)和内皮下结缔组织中组成性地产生。基本VWF单体是2813个氨基酸的蛋白质。每个单体含有多个具有特定功能的特定结构域，即D'和D3结构域(其一起结合至因子VIII)、A1结构域(其结合至血小板GPIb-受体、肝素和/或可能地胶原)、A3结构域(其结合至胶原)、C1结构域(其中RGD结构域在被激活时结合至血小板整联蛋白αIIbβ3)以及在蛋白质C末端的“半胱氨酸结”结构域(其为VWF与源自血小板的生长因子(PDGF)、转化生长因子-β(TGFβ)和β-人绒毛膜促性腺激素(βHCG)所共有)。
人VWF的2813单体氨基酸序列是作为Genbank中的登录号NP000543.2来报道。编码人VWF的核苷酸序列是作为Genbank中的登录号NM000552.3来报道。SEQ ID NO:62是以Genbank登录号NM000552.3报道的氨基酸序列。D'结构域包括SEQ ID NO:62的氨基酸764至866。D3结构域包括SEQ ID NO:62的氨基酸867至1240。
在血浆中，95％-98％的FVIII以与全长VWF的紧密非共价复合物来循环。这种复合物的形成对于在体内维持适当的FVIIII血浆水平是重要的。Lenting等人,Blood.92(11):3983-96(1998)；Lenting等人,J.Thromb.Haemost.5(7):1353-60(2007)。在FVIII由于重链中的位置372和740以及轻链中的位置1689的蛋白质水解而被激活时，从激活的FVIII去除结合至FVIII的VWF。
在某些实施方案中，异源部分是全长血管性血友病因子。在其他实施方案中，异源部分是血管性血友病因子片段。如本文所用，本文所用的术语“VWF片段(VWF fragment)”或“VWF片段(VWF fragments)”意指任何VWF片段，其与FVIII相互作用并保留至少一种或多种通常由全长VWF提供给FVIII的特性，所述特性是例如防止过早激活为FVIIIa、防止过早蛋白质水解、防止与磷脂质膜的缔合(可导致过早清除)、防止与可以结合裸FVIII而不是VWF结合FVIII的FVIII清除受体结合和/或稳定FVIII重链和轻链相互作用。在具体实施方案中，异源部分是包含VWF的D'结构域和D3结构域的(VWF)片段。包含D'结构域和D3结构域的VWF片段还可以包含选自以下的VWF结构域：A1结构域、A2结构域、A3结构域、D1结构域、D2结构域、D4结构域、B1结构域、B2结构域、B3结构域、C1结构域、C2结构域、CK结构域、其一个或多个片段及其任何组合。融合至VWF片段的具有FVIII活性的多肽的其他例子披露于以下文献中：2012年7月3日提交的美国临时专利申请号61/667,901和美国公开号2015/0023959A1，将这两篇文献都通过引用以其整体并入本文。
B.3.l.接头部分
在某些实施方案中，异源部分是肽接头。
如本文所用，术语“肽接头”或“接头部分”是指连接多肽链的线性氨基酸序列中的两个结构域的肽或多肽序列(例如，合成肽或多肽序列)。
在一些实施方案中，可以将编码肽接头的异源核苷酸序列插入本公开文本的优化FVIII多核苷酸序列与编码例如上述异源部分之一(如白蛋白)的异源核苷酸序列之间。肽接头可以向嵌合多肽分子提供柔性。接头通常不被切割，但是可能需要这种切割。在一个实施方案中，在加工期间不去除这些接头。
可以存在于本公开文本的嵌合蛋白中的接头类型是蛋白酶可切割的接头，其包含切割位点(即，蛋白酶切割位点底物，例如因子XIa、Xa或凝血酶切割位点)并且其可以在切割位点的N末端或C末端或两侧上包括另外的接头。这些可切割接头在并入本公开文本的构建体中时产生具有异源切割位点的嵌合分子。
在一个实施方案中，由本公开文本的核酸分子编码的FVIII多肽包含两个或更多个Fc结构域或部分，所述Fc结构域或部分于单条多肽链中经由cscFc接头连接以形成Fc区。cscFc接头侧接有至少一个细胞内加工位点，即由细胞内酶切割的位点。多肽在所述至少一个细胞内加工位点的切割产生包含至少两条多肽链的多肽。
其他肽接头可以任选地用于本公开文本的构建体中，例如以将FVIII蛋白连接至Fc区。可以结合本公开文本使用的一些示例性接头包括例如更详细地描述于下文中的包含GlySer氨基酸的多肽。
在一个实施方案中，肽接头是合成的，即非天然存在的。在一个实施方案中，肽接头包括包含如下氨基酸序列的肽(或多肽)(其可以是或可以不是天然存在的)，所述氨基酸序列将在自然界中并非与其天然地连接或遗传融合的第一线性氨基酸序列与第二线性氨基酸序列连接或遗传融合。例如，在一个实施方案中，肽接头可以包含非天然存在的多肽，其是天然存在的多肽的修饰形式(例如，包含突变，如添加、取代或缺失)。在另一个实施方案中，肽接头可以包含非天然存在的氨基酸。在另一个实施方案中，肽接头可以包含存在于在自然界中不存在的线性序列中的天然存在的氨基酸。在仍另一个实施方案中，肽接头可以包含天然存在的多肽序列。
例如，在某些实施方案中，肽接头可以用于融合相同的Fc部分，由此形成同二聚scFc区。在其他实施方案中，肽接头可以用于融合不同的Fc部分(例如野生型Fc部分和Fc部分变体)，由此形成异二聚scFc区。
在另一个实施方案中，肽接头包含gly-ser接头或由所述gly-ser接头组成。在一个实施方案中，scFc或cscFc接头包含免疫球蛋白铰链的至少一部分和gly-ser接头。如本文所用，术语“gly-ser接头”是指由甘氨酸和丝氨酸残基组成的肽。在某些实施方案中，所述gly-ser接头可以插入肽接头的两个其他序列之间。在其他实施方案中，gly-ser接头连接于肽接头的另一序列的一个或两个末端。在又其他实施方案中，两个或更多个gly-ser接头串联并入肽接头中。在一个实施方案中，本公开文本的肽接头包含上铰链区的至少一部分(例如，源自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4分子)、中铰链区的至少一部分(例如，源自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4分子)和一系列gly/ser氨基酸残基。
本公开文本的肽接头的长度为至少一个氨基酸并且可以具有变化的长度。在一个实施方案中，本公开文本的肽接头的长度为约1至约50个氨基酸。如在此上下文中所用，术语“约”指示+/-两个氨基酸残基。由于接头长度必须是正整数，长度为约1至约50个氨基酸的长度意指长度为1-3至48-52个氨基酸的长度。在另一个实施方案中，本公开文本的肽接头的长度为约10至约20个氨基酸。在另一个实施方案中，本公开文本的肽接头的长度为约15至约50个氨基酸。在另一个实施方案中，本公开文本的肽接头的长度为约20至约45个氨基酸。在另一个实施方案中，本公开文本的肽接头的长度为约15至约35或约20至约30个氨基酸。在另一个实施方案中，本公开文本的肽接头的长度为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、500、1000或2000个氨基酸。在一个实施方案中，本公开文本的肽接头的长度为20或30个氨基酸。
在一些实施方案中，肽接头可以包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90或至少100个氨基酸。在其他实施方案中，肽接头可以包含至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900或至少1,000个氨基酸。在一些实施方案中，肽接头可以包含至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900或2000个氨基酸。肽接头可以包含1-5个氨基酸、1-10个氨基酸、1-20个氨基酸、10-50个氨基酸、50-100个氨基酸、100-200个氨基酸、200-300个氨基酸、300-400个氨基酸、400-500个氨基酸、500-600个氨基酸、600-700个氨基酸、700-800个氨基酸、800-900个氨基酸或900-1000个氨基酸。
可以使用本领域中已知的技术将肽接头引入多肽序列中。可以通过DNA序列分析来确认修饰。可以使用质粒DNA转化宿主细胞用于稳定产生所产生的多肽。
B.3.m.单体-二聚体杂合物
在一些实施方案中，本公开文本的进一步包含异源核苷酸序列的分离的核酸分子编码包含FVIII的单体-二聚体杂合分子。
本文所用的术语“单体-二聚体杂合物”是指包含通过二硫键相互缔合的第一多肽链和第二多肽链的嵌合蛋白，其中，例如，第一链包含因子VIII和第一Fc区，并且第二链包含无FVIII的第二Fc区、基本上由所述第二Fc区组成或由所述第二Fc区组成。因此，单体-二聚体杂合构建体是包含仅具有一种凝血因子的单体方面和具有两个Fc区的二聚体方面的杂合物。
B.3.n.表达控制元件
在一些实施方案中，本公开文本的核酸分子或载体进一步包含至少一个表达控制序列。如本文所用的表达控制序列是任何调节性核苷酸序列，如启动子序列或启动子-增强子组合，其有利于与其可操作地连接的编码核酸的有效转录和翻译。例如，本公开文本的分离核酸分子可以与至少一个转录控制序列可操作地连接。
基因表达控制序列可以是例如哺乳动物或病毒启动子，如组成型或诱导型启动子。组成型哺乳动物启动子包括但不限于以下基因的启动子：次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)、腺苷脱氨酶、丙酮酸激酶、β-肌动蛋白启动子和其他组成型启动子。在真核细胞中组成型起作用的示例性病毒启动子包括例如来自巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒(例如SV40)、乳头瘤病毒、腺病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、劳斯氏肉瘤病毒、巨细胞病毒、莫洛尼氏白血病毒的长末端重复序列(LTR)和其他逆转录病毒的启动子，以及单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子。
其他组成型启动子是本领域普通技术人员已知的。可用作本公开文本的基因表达序列的启动子还包括诱导型启动子。诱导型启动子是在诱导剂存在下表达。例如，在某些金属离子存在下诱导金属硫蛋白启动子以促进转录和翻译。其他诱导型启动子是本领域普通技术人员已知的。
在一个实施方案中，本公开文本包括转基因在组织特异性启动子和/或增强子控制下的表达。在另一个实施方案中，启动子或其他表达控制序列选择性地增强转基因在肝细胞中的表达。肝脏特异性启动子的例子包括但不限于小鼠运甲状腺素蛋白启动子(mTTR)、内源人因子VIII(F8)启动子、内源人因子IX(F9)启动子、人α-1-抗胰蛋白酶启动子(hAAT)、人白蛋白最小启动子和小鼠白蛋白启动子。在一个特定实施方案中，启动子包括mTTR启动子。mTTR启动子描述于R.H.Costa等人,1986,Mol.Cell.Biol.6:4697中。F8启动子描述于Figueiredo和Brownlee,1995,J.Biol.Chem.270:11828-11838中。在某些实施方案中，启动子包括mTTR启动子(例如，mTTR202启动子、mTTR202opt启动子、mTTR482启动子)中的任一种，如美国专利公开号US2019/0048362中所披露，将所述文献通过引用以其整体并入本文。
可以使用一种或多种增强子进一步增强表达水平以实现治疗功效。一种或多种增强子可以单独提供，或与一种或多种启动子元件一起提供。通常，表达控制序列包含多个增强子元件和组织特异性启动子。在一个实施方案中，增强子包括一个或多个拷贝的α-1-微球蛋白/比库宁蛋白(bikunin)增强子(Rouet等人,1992,J.Biol.Chem.267:20765-20773；Rouet等人,1995,Nucleic Acids Res.23:395-404；Rouet等人,1998,Biochem.J.334:577-584；Ill等人,1997,Blood Coagulation Fibrinolysis 8:S23-S30)。在另一个实施方案中，增强子源自肝脏特异性转录因子结合位点，如EBP、DBP、HNF1、HNF3、HNF4、HNF6和Enh1，包含HNF1、(有义)-HNF3、(有义)-HNF4、(反义)-HNF1、(反义)-HNF6、(有义)-EBP、(反义)-HNF4(反义)。
在特定例子中，可用于本公开文本的启动子包含SEQ ID NO:63(即，ET启动子)，其还作为GenBank号AY661265而已知。还参见Vigna等人,Molecular Therapy 11(5):763(2005)。其他合适载体和基因调节元件的例子描述于以下文献中：WO 02/092134、EP1395293或美国专利号6,808,905、7,745,179或7,179,903，将所述文献通过引用以其整体并入本文。
通常，表达控制序列应视需要包括分别涉及转录和翻译的起始的5'非转录序列和5'非翻译序列，如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。特别地，此类5'非转录序列将包括启动子区，所述启动子区包括用于可操作地连接的编码核酸的转录控制的启动子序列。基因表达序列任选地根据需要包括增强子序列或上游激活子序列。
实施例
实施例1–重组慢病毒载体(LV)制剂
慢病毒载体药物产品稳定性是通过将载体暴露于各种应力条件(例如冷冻和解冻(F/T)、升高的温度(37℃)、搅拌)并监测随时间的变化来评估的。确定稳定性的方法包括：用于功能滴度的ddPCR、用于p24浓度的p24ELISA、以及用于粒径分布和颗粒浓度的NanoSight。功能滴度是一种基于细胞的测定(HEK293)，其中将LV与细胞一起孵育，使其整合到细胞基因组中，进行提取，并通过ddPCR测量DNA。基于ELISA的p24方法是基于试剂盒的方法(Invitrogen)，其中测量病毒衣壳蛋白p24并且其与总颗粒浓度相关。NanoSight是一种利用颗粒的布朗运动来评价溶液中LV颗粒的大小和浓度的方法。
功能滴度是剂量定义参数并且是关键度量。它提供了关于LV是否稳定以及因此可以将其有效载荷整合到细胞中的信息(与药物的功效和作用机制相关)。功能滴度是剂量定义标准。
载体产生和测量
如OXB专利(US 9,169,491 B2)中所述，通过将四种质粒瞬时共转染到HEK293T细胞中来产生VSV假型化的第三代慢病毒载体(LV)，并通过阴离子交换进行纯化。最初通过功能滴度和HIV-I gag p24抗原免疫捕获(NEN Life Science Products)分析载体颗粒，以确保适当的转染、产生和纯化产量。对于所有载体，浓缩的载体表达滴度或功能滴度的范围为1-10E8 TU/mL转导单位293T(TU)/ml。
细胞培养
通过用慢病毒载体转导贴壁HEK293T细胞来测量功能滴度。将细胞分割三次，然后收获用于基因组DNA分离。使用慢病毒载体特异性引物和探针通过液滴数字PCR(ddPCR)在基因组DNA中测量LV整合。将HEK293T贴壁细胞维持在Iscove氏改良的Dulbecco氏培养基(IMDM；Gibco)中，所述培养基补充有10％胎牛血清(FBS；Gibco)和青霉素-链霉素和谷氨酰胺的组合。
将LV处理到媒介物中(配制)
纯化后，将LV材料(原料药-DS)合并，并且使用中空纤维膜将其缓冲液交换到相应配制缓冲液中。首先将DS浓缩大约10倍，然后用六倍于浓缩DS的体积的相应配制缓冲液交换(例如，每1mL浓缩DS，用6mL缓冲液)。最终配制的LV被认为是药物产品(DP)，并测试其稳定性。图7A至图7B和图8A至图8B示出了在从媒介物TSSM(20mM Tris，100mM NaCl，1％(w/v)蔗糖，1％(w/v)甘露醇，pH 7.3)再处理到媒介物磷酸盐(配制品1)(10mM磷酸盐，100mMNaCl，3％(w/v)蔗糖，0.05％(w/v)P188，pH 7.3)中之后，对配制品的表征。除TSSM之外，本文还测试了四种替代性配制品：配制品2(磷酸盐更高盐).10mM磷酸盐，130mM NaCl，1％(w/v)蔗糖，0.05％(w/v)P188，pH 7.3；配制品3(组氨酸).20mM组氨酸，100mM NaCl，3％(w/v)蔗糖，0.05％(w/v)P188，pH 6.5；配制品4(磷酸盐pH 7.0).10mM磷酸盐，100mM NaCl，3％(w/v)蔗糖，0.05％(w/v)P188，pH 7.0；配制品5(组氨酸pH 7.0).20mM组氨酸，100mM NaCl，3％(w/v)蔗糖，0.05％(w/v)P188，pH 7.0。
实施例2–慢病毒载体(LV)制剂的体内给予
从Charles Rivers Laboratories购买了5周龄CD-1和C57BL6小鼠，并将其维持在无特定病原体的条件下。从我们在Charles River饲养的集落获得6只HemA雄性小鼠。在小鼠中通过尾静脉注射或颞静脉注射进行载体加媒介物或单独媒介物的给予。根据由Bioverativ/Sanofi IACUC批准的方案(动物方案547)进行所有动物程序。测试了三种不同的配制品：(1)20mM Tris，100mM NaCl，1％(w/v)蔗糖，1％(w/v)甘露醇，pH 7.3(TSSM)；(2)10mM磷酸盐，100mM NaCl，3％(w/v)蔗糖，0.05％(w/v)P188，pH 7.3(磷酸盐)；和(3)20mM组氨酸，100mM NaCl，3％(w/v)蔗糖，0.05％(w/v)P188，pH 6.5(组氨酸)(表4)。
表4：LV制剂的体内给予
Figure BDA0003568611620000971
配制品：单独媒介物(TSSM)以及媒介物(TSSM)和LV
在单次静脉内给予后，使用LV-coFIX在C57BL6和CD-1成年小鼠中进行剂量反应研究。使用11只雄性C57BL6小鼠(5周龄)和11只雄性CD-1小鼠(5周龄)。所给予的剂量如下：6E10(n＝3)、2E10(n＝4)和7.5E9(n＝4)TU/kg。配制媒介物是TSSM缓冲液。
用配制于TSSM缓冲液中的LV-FIX载体对C57BL6和CD-1小鼠进行给药。6E10 TU/kg剂量是在不稀释的情况下以13.3-15ml/kg直接给予。在给予前，将其他两个较低剂量在PBS中稀释。向每个品系的三只小鼠给予高剂量。注射6E10 TU/kg剂量后，立即有一只C57BL6小鼠发生心脏骤停并且死亡。大约半小时后，组中的其他小鼠展现出不良影响。我们观察到过度理毛，然后观察到皮毛粗糙、精神萎靡和不活跃。这些小鼠似乎在注射后一小时后恢复。只有高剂量(6E10 TU/kg)组中的小鼠显示出不良影响。接受稀释剂量的小鼠完全没有显示出不良影响。后来，以10-15ml/kg向2只CD-1小鼠和2只C57BL6小鼠给予仅单独的TSSM媒介物配制缓冲液。这些小鼠在注射后也展现出不良影响(过度理毛，然后皮毛粗糙、精神萎靡和不活跃)，所述不良影响在约一小时后正常化。结果汇总于表4中。
配制品：单独的媒介物(磷酸盐)
使用HemA小鼠进行剂量反应研究。使用了3只雄性HemA小鼠(9周龄)。所给予的剂量为15ml/kg。配制媒介物是磷酸盐缓冲液。
用15ml/kg磷酸盐配制缓冲液对三只HemA小鼠进行给药，以测试任何不良的体内影响。在接下来的2天内密切观察小鼠。没有注意到任何不良影响，包括使用TSSM配制缓冲液时见到的过度理毛、皮毛粗糙、精神萎靡和不活跃。
配制品：媒介物(磷酸盐)和LV
通过颞静脉注射在HemA小鼠幼崽中使用LV-coFVIII-6XTEN进行剂量反应研究。使用了22只雄性和雌性HemA幼崽(2日龄)。所给予的剂量如下：3E9和1.5E9 TU/kg。配制媒介物是磷酸盐缓冲液。
通过颞静脉注射以3E9或1.5E9 TU/kg向两日龄小鼠给予配制于磷酸盐缓冲液中的LV-FVIIIXTEN。在不稀释的情况下给予高剂量(3E9)。注射后，在这些小鼠中未见到不良影响。
配制品：单独的媒介物(组氨酸)
使用HemA小鼠进行剂量反应研究。使用了3只雄性HemA小鼠(19周龄)。所给予的剂量为15ml/kg。配制媒介物是组氨酸缓冲液。
用15ml/kg组氨酸配制缓冲液对三只HemA小鼠进行给药，以测试任何不良的体内影响。在接下来的2天内密切观察小鼠。没有注意到任何不良影响，包括使用TSSM配制缓冲液时见到的过度理毛、皮毛粗糙、精神萎靡和不活跃。
配制品：媒介物(组氨酸)和LV
通过尾静脉注射在耐受的成年HemA小鼠中使用LV-coFVIII-6XTEN进行剂量反应研究。使用了4只雄性HF8小鼠(12周龄)。所给予的剂量为15ml/kg。配制媒介物是组氨酸缓冲液。
用配制于组氨酸配制缓冲液中的15ml/kg LV-FVIIIXTEN载体对四只耐受的HemA小鼠(HF8)进行给药。没有注意到任何不良影响，包括使用TSSM配制品时见到的过度理毛、皮毛粗糙、精神萎靡和不活跃。
概括地说，对于每种配制品，向小鼠注射载体加媒介物或单独的媒介物。表4显示，TSSM注射(载体加媒介物和单独的媒介物二者)对小鼠具有不良毒性影响，包括一只死亡。相反地，磷酸盐和组氨酸配制品(载体加媒介物或单独的媒介物)在小鼠中没有产生反应(没有毒性影响)。
实施例3–对使用媒介物TSSM的配制品的测试
搅拌、冷冻-解冻和温度条件
通过使配制品经受搅拌、冷冻-解冻(F/T)循环(5个和10个)以及6小时室温孵育来测试添加或不添加1％(w/v)P188(最终浓度为1％(w/v)P188)的TSSM配制品(载体加媒介物)的稳定性(图3A至图3B、图4、图5A至图5B、表5)。通过测定功能滴度、p24浓度以及粒径和分布(NanoSight)来测量载体的稳定性。如图3A至图3B、图4、图5A至图5B和表5所示，对于具有或没有P188的配制品，在不同条件下，载体稳定性没有显著变化。使用NanoSight通过粒径测量来确定载体完整性。
表5：对使用媒介物TSSM的配制品的测试
Figure BDA0003568611620000991
Figure BDA0003568611620001001
*假设1ng/mL p24＝1.25E7个颗粒/mL(NT＝未测试)
稀释条件
将TSSM配制品(载体加媒介物)稀释1倍、20倍和100倍，在37℃下孵育，并在第0、3、7和14天通过经由ddPCR测量功能滴度来确定稳定性。图6A和图6B显示，在升高的温度下两周内，稀释对稳定性没有影响。
持续不同时间段的孵育
将TSSM配制品(载体加媒介物)在37℃下孵育0、3、7或14天。通过经由ddPCR确定功能滴度来测量稳定性，同时使用Nanosight或p24 ELISA测量颗粒完整性(颗粒浓度)。确定了随孵育时间变化的稳定性和载体完整性(颗粒浓度)，如图7A至图7B和图8A至图8B所示。随着孵育时间增加，载体稳定性降低，而颗粒浓度增加。
在37℃下的延长孵育
将TSSM配制品(载体加媒介物)在37℃下孵育0天、3天、1周或2周。使用Nanosight测量粒径分布。如图7A至图7B和图8A至图8B所示，对于延长的孵育时间，粒径分布变宽，同时颗粒浓度增加。结果可以解释如下。总颗粒浓度在增加，而感染性在降低，这是因为长期暴露于37℃温度会使衣壳破裂，从而导致ELISA中测量的p24更加明显。此外，病毒破裂导致较小尺寸的物质增加。
实施例4–测试使用媒介物磷酸盐和组氨酸的配制品
磷酸盐配制品
在处理到媒介物磷酸盐(10mM磷酸盐，100mM NaCl，3％(w/v)蔗糖，0.05％(w/v)P188，pH 7.3)中之后，对慢病毒载体(LV)配制品进行表征。使用Nanosight测量粒径和分布(图1)。图1是示出了Nanosight的结果的曲线图，其显示出原料药(DS)池的干净单体峰，在超滤/渗滤到最终的媒介物缓冲液中之后(切向流过滤-TFF后)，所述峰略微漂移至较大的粒径，且显现出一些较大颗粒的存在。不受理论的束缚，这可能是由于在处理材料的应力期间颗粒的物理劣化所致。当通过0.22μm大小的滤膜过滤时，最终药物产品(DP)产生恢复为与开始处理时的DS池重合的粒径和分布曲线。TFF应力在图2A至图2B的照片中可视地示出。
在不同条件下测试了磷酸盐配制品(载体加媒介物)的载体稳定性，所述不同条件包括搅拌、在37℃下孵育、持续时间和稀释度(图9和图10A至图10B)。
图10A至图10B示出了在37℃下一周内磷酸盐缓冲液的NanoSight大小数据。在孵育时间内，较高分子量物质略有增加，并且总颗粒整体减少。数据表明，在RT或37℃下的稳定性过程中，图9所示的功能滴度的损失可能对应于图10A至图10B中观察到的颗粒的物理损失。
为了评估磷酸盐配制品在临床给予期间的典型输注场景过程中的稳定性，进行了模拟使用中研究。将LVV材料用磷酸盐媒介物稀释并注射到空的IV袋中。在室温下在6小时内收集数据(图13)。稳定性研究依据功能滴度或p24显示没有损失的迹象，这表明载体在研究的持续时间内是稳定的。
为了测试与前瞻性容器封闭系统的相容性，进行研究以检查载体和磷酸盐媒介物在Schott 1型玻璃小瓶以及West CZ COP小瓶中的稳定性(图14、图15和图16A至图16C)。数据表明，当在1型或CZ小瓶中仅用媒介物处理时，没有产生明显的颗粒(图14)。为了评估在冷冻和解冻过程中小瓶上的应变，将应变仪胶粘到玻璃小瓶并且置于-80℃冷冻器中2小时的时段，之后在37℃水浴中快速加温(图15)。研究表明，在小瓶上没有可感知的正应变，这将表明在该相对较高的5mL填充体积下，磷酸盐配制品不会对容器施加高应力，文献中已经显示高应力会损坏某些小瓶。还测试了LVV材料与各个容器的相容性，显示于图16A至图16C中。通过每个测试，即转导滴度(图16A)、p24(图16B)和颗粒浓度(图16C)，载体具有可比性稳定性和完整性，从而表明与两种容器封闭形式(即玻璃小瓶和塑料小瓶)的相容性。
磷酸盐和组氨酸配制品比较
在不同的应力条件下测试了磷酸盐(配制品1和配制品2)和组氨酸(配制品3)配制品(载体加媒介物)的载体稳定性(图11A至图11B、图12A至图12B)。在冷冻-解冻循环研究中，观察到两种磷酸盐配制品的功能滴度均随循环进行而降低。相比之下，组氨酸配制品没有显示出功能损失并且保持稳定。在保持室温以及搅拌应力条件过程中，磷酸盐配制品显示出高水平的功能损失(降至定量极限)。令人惊讶的是，组氨酸配制品仍不受在室温下孵育3天或搅拌3天的影响。另外，对于磷酸盐配制品(比较配制品1和配制品2)，添加更多氯化钠和减少蔗糖不影响载体稳定性。
在材料的单独制剂中，重复图11A至图11B中展示的稳定性研究的重新测试并报告在图17中。功能滴度的损失不像磷酸盐配制品那么剧烈，但是组氨酸配制品与磷酸盐配制品之间的趋势是一致的。
在9个月的冷冻(-80℃)稳定性研究过程中，磷酸盐配制品1和组氨酸配制品3缓冲液似乎都使得能实现稳定的LVV DP(图18)。基于功能滴度，数据表明，在-80℃下储存期间没有任何材料损失(在测定变异性内)。
最后，为了评价仅缓冲液(磷酸盐和组氨酸)的影响，以相同方式制备在相同pH7.0下的两种配制品。也就是说，配制品4与配制品5之间的唯一区别是缓冲组分(磷酸盐或组氨酸)。在制造过程的情境下，两种配制品在超滤和渗滤(TFF)以及最终无菌过滤中表现相似(表6)。
表6：使用切向流过滤制备配制品4(磷酸盐)和配制品5(组氨酸)。将样品针对六倍体积的相应配制品渗滤，然后超滤(浓缩)若干倍体积。
Figure BDA0003568611620001021
在制备相应的配制品后，进行稳定性研究以比较缓冲组分。图19A至图19D总结了在功能滴度和归一化功能滴度、p24和颗粒浓度上随稳定性条件变化示出的发现：任一种配制品的LVV稳定性之间仅存在微小差异。这似乎表明，图11A至图11B、图12A至图12B和图13中呈现的结果似乎反映了由于pH(7.3和6.5)而不是缓冲液组成(磷酸盐或组氨酸)的差异导致的变化的稳定性水平。
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ggcgaactcc ccgtggatgc cagattcccc ccccgcgtgc caaagtcctt cccctttaac 180
acctccgtgg tgtacaagaa aaccctcttt gtcgagttca ctgaccacct gttcaacatc 240
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ctgcccgggc tcatcggttg tcacagaaag tccgtgtact ggcacgtcat cggcatgggc 840
actacgcctg aagtgcactc catcttcctg gaagggcaca ccttcctcgt gcgcaaccac 900
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gacgacaaca gccccagctt catccagatt cgcagcgtgg ccaagaagca ccccaaaacc 1200
tgggtgcact acatcgcggc cgaggaagaa gattgggact acgccccgtt ggtgctggca 1260
cccgatgacc ggtcgtacaa gtcccagtat ctgaacaatg gtccgcagcg gattggcaga 1320
aagtacaaga aagtgcggtt catggcgtac actgacgaaa cgtttaagac ccgggaggcc 1380
attcaacatg agagcggcat tctgggacca ctgctgtacg gagaggtcgg cgataccctg 1440
ctcatcatct tcaaaaacca ggcctcccgg ccttacaaca tctaccctca cggaatcacc 1500
gacgtgcggc cactctactc gcggcgcctg ccgaagggcg tcaagcacct gaaagacttc 1560
cctatcctgc cgggcgaaat cttcaagtat aagtggaccg tcaccgtgga ggacgggccc 1620
accaagagcg atcctaggtg tctgactcgg tactactcca gcttcgtgaa catggaacgg 1680
gacctggcat cgggactcat tggaccgctg ctgatctgct acaaagagtc ggtggatcaa 1740
cgcggcaacc agatcatgtc cgacaagcgc aacgtgatcc tgttctccgt gtttgatgaa 1800
aacagatcct ggtacctcac tgaaaacatc cagaggttcc tcccaaaccc cgcaggagtg 1860
caactggagg accctgagtt tcaggcctcg aatatcatgc actcgattaa cggttacgtg 1920
ttcgactcgc tgcagctgag cgtgtgcctc catgaagtcg cttactggta cattctgtcc 1980
atcggcgccc agactgactt cctgagcgtg ttcttttccg gttacacctt taagcacaag 2040
atggtgtacg aagataccct gaccctgttc cctttctccg gcgaaacggt gttcatgtcg 2100
atggagaacc cgggtctgtg gattctggga tgccacaaca gcgactttcg gaaccgcgga 2160
atgactgccc tgctgaaggt gtcctcatgc gacaagaaca ccggagacta ctacgaggac 2220
tcctacgagg atatctcagc ctacctcctg tccaagaaca acgcgatcga gccgcgcagc 2280
ttcagccaga acccgcctgt gctgaagagg caccagcgag aaattacccg gaccaccctc 2340
caatcggatc aggaggaaat cgactacgac gacaccatct cggtggaaat gaagaaggaa 2400
gatttcgata tctacgacga ggacgaaaat cagtcccctc gctcattcca aaagaaaact 2460
agacactact ttatcgccgc ggtggaaaga ctgtgggact atggaatgtc atccagccct 2520
cacgtccttc ggaaccgggc ccagagcgga tcggtgcctc agttcaagaa agtggtgttc 2580
caggagttca ccgacggcag cttcacccag ccgctgtacc ggggagaact gaacgaacac 2640
ctgggcctgc tcggtcccta catccgcgcg gaagtggagg ataacatcat ggtgaccttc 2700
cgtaaccaag catccagacc ttactccttc tattcctccc tgatctcata cgaggaggac 2760
cagcgccaag gcgccgagcc ccgcaagaac ttcgtcaagc ccaacgagac taagacctac 2820
ttctggaagg tccaacacca tatggccccg accaaggatg agtttgactg caaggcctgg 2880
gcctacttct ccgacgtgga ccttgagaag gatgtccatt ccggcctgat cgggccgctg 2940
ctcgtgtgtc acaccaacac cctgaaccca gcgcatggac gccaggtcac cgtccaggag 3000
tttgctctgt tcttcaccat ttttgacgaa actaagtcct ggtacttcac cgagaatatg 3060
gagcgaaact gtagagcgcc ctgcaatatc cagatggaag atccgacttt caaggagaac 3120
tatagattcc acgccatcaa cgggtacatc atggatactc tgccggggct ggtcatggcc 3180
caggatcaga ggattcggtg gtacttgctg tcaatgggat cgaacgaaaa cattcactcc 3240
attcacttct ccggtcacgt gttcactgtg cgcaagaagg aggagtacaa gatggcgctg 3300
tacaatctgt accccggggt gttcgaaact gtggagatgc tgccgtccaa ggccggcatc 3360
tggagagtgg agtgcctgat cggagagcac ctccacgcgg ggatgtccac cctcttcctg 3420
gtgtactcga ataagtgcca gaccccgctg ggcatggcct cgggccacat cagagacttc 3480
cagatcacag caagcggaca atacggccaa tgggcgccga agctggcccg cttgcactac 3540
tccggatcga tcaacgcatg gtccaccaag gaaccgttct cgtggattaa ggtggacctc 3600
ctggccccta tgattatcca cggaattaag acccagggcg ccaggcagaa gttctcctcc 3660
ctgtacatct cgcaattcat catcatgtac agcctggacg ggaagaagtg gcagacttac 3720
aggggaaact ccaccggcac cctgatggtc tttttcggca acgtggattc ctccggcatt 3780
aagcacaaca tcttcaaccc accgatcata gccagatata ttaggctcca ccccactcac 3840
tactcaatcc gctcaactct tcggatggaa ctcatggggt gcgacctgaa ctcctgctcc 3900
atgccgttgg ggatggaatc aaaggctatt agcgacgccc agatcaccgc gagctcctac 3960
ttcactaaca tgttcgccac ctggagcccc tccaaggcca ggctgcactt gcagggacgg 4020
tcaaatgcct ggcggccgca agtgaacaat ccgaaggaat ggcttcaagt ggatttccaa 4080
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tatgtgaagg agttcctgat tagcagcagc caggacgggc accagtggac cctgttcttc 4200
caaaacggaa aggtcaaggt gttccagggg aaccaggact cgttcacacc cgtggtgaac 4260
tccctggacc ccccactgct gacgcggtac ttgaggattc atcctcagtc ctgggtccat 4320
cagattgcat tgcgaatgga agtcctgggc tgcgaggccc aggacctgta c 4371
<210> 2
<211> 4812
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸序列
<400> 2
atgcagattg agctgtccac ttgtttcttc ctgtgcctcc tgcgcttctg tttctccgcc 60
actcgccggt actaccttgg agccgtggag ctttcatggg actacatgca gagcgacctg 120
ggcgaactcc ccgtggatgc cagattcccc ccccgcgtgc caaagtcctt cccctttaac 180
acctccgtgg tgtacaagaa aaccctcttt gtcgagttca ctgaccacct gttcaacatc 240
gccaagccgc gcccaccttg gatgggcctc ctgggaccga ccattcaagc tgaagtgtac 300
gacaccgtgg tgatcaccct gaagaacatg gcgtcccacc ccgtgtccct gcatgcggtc 360
ggagtgtcct actggaaggc ctccgaagga gctgagtacg acgaccagac tagccagcgg 420
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aaggaaaacg gacctatggc atccgatcct ctgtgcctga cttactccta cctttcccat 540
gtggacctcg tgaaggacct gaacagcggg ctgattggtg cacttctcgt gtgccgcgaa 600
ggttcgctcg ctaaggaaaa gacccagacc ctccataagt tcatcctttt gttcgctgtg 660
ttcgatgaag gaaagtcatg gcattccgaa actaagaact cgctgatgca ggaccgggat 720
gccgcctcag cccgcgcctg gcctaaaatg catacagtca acggatacgt gaatcggtca 780
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gacctggggc agttccttct cttctgccac atctccagcc atcagcacga cggaatggag 1020
gcctacgtga aggtggactc atgcccggaa gaacctcagt tgcggatgaa gaacaacgag 1080
gaggccgagg actatgacga cgatttgact gactccgaga tggacgtcgt gcggttcgat 1140
gacgacaaca gccccagctt catccagatt cgcagcgtgg ccaagaagca ccccaaaacc 1200
tgggtgcact acatcgcggc cgaggaagaa gattgggact acgccccgtt ggtgctggca 1260
cccgatgacc ggtcgtacaa gtcccagtat ctgaacaatg gtccgcagcg gattggcaga 1320
aagtacaaga aagtgcggtt catggcgtac actgacgaaa cgtttaagac ccgggaggcc 1380
attcaacatg agagcggcat tctgggacca ctgctgtacg gagaggtcgg cgataccctg 1440
ctcatcatct tcaaaaacca ggcctcccgg ccttacaaca tctaccctca cggaatcacc 1500
gacgtgcggc cactctactc gcggcgcctg ccgaagggcg tcaagcacct gaaagacttc 1560
cctatcctgc cgggcgaaat cttcaagtat aagtggaccg tcaccgtgga ggacgggccc 1620
accaagagcg atcctaggtg tctgactcgg tactactcca gcttcgtgaa catggaacgg 1680
gacctggcat cgggactcat tggaccgctg ctgatctgct acaaagagtc ggtggatcaa 1740
cgcggcaacc agatcatgtc cgacaagcgc aacgtgatcc tgttctccgt gtttgatgaa 1800
aacagatcct ggtacctcac tgaaaacatc cagaggttcc tcccaaaccc cgcaggagtg 1860
caactggagg accctgagtt tcaggcctcg aatatcatgc actcgattaa cggttacgtg 1920
ttcgactcgc tgcagctgag cgtgtgcctc catgaagtcg cttactggta cattctgtcc 1980
atcggcgccc agactgactt cctgagcgtg ttcttttccg gttacacctt taagcacaag 2040
atggtgtacg aagataccct gaccctgttc cctttctccg gcgaaacggt gttcatgtcg 2100
atggagaacc cgggtctgtg gattctggga tgccacaaca gcgactttcg gaaccgcgga 2160
atgactgccc tgctgaaggt gtcctcatgc gacaagaaca ccggagacta ctacgaggac 2220
tcctacgagg atatctcagc ctacctcctg tccaagaaca acgcgatcga gccgcgcagc 2280
ttcagccaga acacatcaga gagcgccacc cctgaaagtg gtcccgggag cgagccagcc 2340
acatctgggt cggaaacgcc aggcacaagt gagtctgcaa ctcccgagtc cggacctggc 2400
tccgagcctg ccactagcgg ctccgagact ccgggaactt ccgagagcgc tacaccagaa 2460
agcggacccg gaaccagtac cgaacctagc gagggctctg ctccgggcag cccagccggc 2520
tctcctacat ccacggagga gggcacttcc gaatccgcca ccccggagtc agggccagga 2580
tctgaacccg ctacctcagg cagtgagacg ccaggaacga gcgagtccgc tacaccggag 2640
agtgggccag ggagccctgc tggatctcct acgtccactg aggaagggtc accagcgggc 2700
tcgcccacca gcactgaaga aggtgcctcg agcccgcctg tgctgaagag gcaccagcga 2760
gaaattaccc ggaccaccct ccaatcggat caggaggaaa tcgactacga cgacaccatc 2820
tcggtggaaa tgaagaagga agatttcgat atctacgacg aggacgaaaa tcagtcccct 2880
cgctcattcc aaaagaaaac tagacactac tttatcgccg cggtggaaag actgtgggac 2940
tatggaatgt catccagccc tcacgtcctt cggaaccggg cccagagcgg atcggtgcct 3000
cagttcaaga aagtggtgtt ccaggagttc accgacggca gcttcaccca gccgctgtac 3060
cggggagaac tgaacgaaca cctgggcctg ctcggtccct acatccgcgc ggaagtggag 3120
gataacatca tggtgacctt ccgtaaccaa gcatccagac cttactcctt ctattcctcc 3180
ctgatctcat acgaggagga ccagcgccaa ggcgccgagc cccgcaagaa cttcgtcaag 3240
cccaacgaga ctaagaccta cttctggaag gtccaacacc atatggcccc gaccaaggat 3300
gagtttgact gcaaggcctg ggcctacttc tccgacgtgg accttgagaa ggatgtccat 3360
tccggcctga tcgggccgct gctcgtgtgt cacaccaaca ccctgaaccc agcgcatgga 3420
cgccaggtca ccgtccagga gtttgctctg ttcttcacca tttttgacga aactaagtcc 3480
tggtacttca ccgagaatat ggagcgaaac tgtagagcgc cctgcaatat ccagatggaa 3540
gatccgactt tcaaggagaa ctatagattc cacgccatca acgggtacat catggatact 3600
ctgccggggc tggtcatggc ccaggatcag aggattcggt ggtacttgct gtcaatggga 3660
tcgaacgaaa acattcactc cattcacttc tccggtcacg tgttcactgt gcgcaagaag 3720
gaggagtaca agatggcgct gtacaatctg taccccgggg tgttcgaaac tgtggagatg 3780
ctgccgtcca aggccggcat ctggagagtg gagtgcctga tcggagagca cctccacgcg 3840
gggatgtcca ccctcttcct ggtgtactcg aataagtgcc agaccccgct gggcatggcc 3900
tcgggccaca tcagagactt ccagatcaca gcaagcggac aatacggcca atgggcgccg 3960
aagctggccc gcttgcacta ctccggatcg atcaacgcat ggtccaccaa ggaaccgttc 4020
tcgtggatta aggtggacct cctggcccct atgattatcc acggaattaa gacccagggc 4080
gccaggcaga agttctcctc cctgtacatc tcgcaattca tcatcatgta cagcctggac 4140
gggaagaagt ggcagactta caggggaaac tccaccggca ccctgatggt ctttttcggc 4200
aacgtggatt cctccggcat taagcacaac atcttcaacc caccgatcat agccagatat 4260
attaggctcc accccactca ctactcaatc cgctcaactc ttcggatgga actcatgggg 4320
tgcgacctga actcctgctc catgccgttg gggatggaat caaaggctat tagcgacgcc 4380
cagatcaccg cgagctccta cttcactaac atgttcgcca cctggagccc ctccaaggcc 4440
aggctgcact tgcagggacg gtcaaatgcc tggcggccgc aagtgaacaa tccgaaggaa 4500
tggcttcaag tggatttcca aaagaccatg aaagtgaccg gagtcaccac ccagggagtg 4560
aagtcccttc tgacctcgat gtatgtgaag gagttcctga ttagcagcag ccaggacggg 4620
caccagtgga ccctgttctt ccaaaacgga aaggtcaagg tgttccaggg gaaccaggac 4680
tcgttcacac ccgtggtgaa ctccctggac cccccactgc tgacgcggta cttgaggatt 4740
catcctcagt cctgggtcca tcagattgca ttgcgaatgg aagtcctggg ctgcgaggcc 4800
caggacctgt ac 4812
<210> 3
<211> 1383
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸序列
<400> 3
atgcagagag tcaacatgat tatggctgag tcacctgggc tgattactat ttgcctgctg 60
ggctacctgc tgtccgccga gtgtaccgtg ttcctggacc atgagaacgc aaataagatc 120
ctgaacaggc ccaaaagata caatagtggg aagctggagg aatttgtgca gggcaacctg 180
gagagagaat gcatggagga aaagtgtagc ttcgaggaag cccgcgaggt gtttgaaaat 240
acagagcgaa ccacagagtt ctggaagcag tatgtggacg gcgatcagtg cgagagcaac 300
ccctgtctga atggcggaag ttgcaaagac gatatcaact catacgaatg ctggtgtcct 360
ttcgggtttg aaggcaaaaa ttgcgagctg gacgtgacat gtaacattaa gaatggacgg 420
tgcgagcagt tttgtaaaaa ctctgccgat aataaggtgg tgtgcagctg tactgaagga 480
tatcgcctgg ctgagaacca gaagtcctgc gaaccagcag tgcccttccc ttgtgggagg 540
gtgagcgtct cccagacttc aaaactgacc agagcagaga cagtgtttcc cgacgtggat 600
tacgtcaaca gcactgaggc cgaaaccatc ctggacaaca ttactcagtc tacccagagt 660
ttcaatgact ttactcgggt ggtcgggggc gaggatgcta aaccaggcca gttcccctgg 720
caggtggtcc tgaacggaaa ggtggatgca ttttgcggag ggtctatcgt gaatgagaaa 780
tggattgtca ccgccgctca ctgcgtggaa accggagtca agatcacagt ggtcgctggg 840
gagcacaaca ttgaggaaac agaacatact gagcagaagc ggaatgtgat ccgcatcatt 900
cctcaccata actacaatgc agccatcaac aaatacaatc atgacattgc cctgctggaa 960
ctggatgagc ctctggtgct gaacagctac gtcactccaa tctgcattgc tgacaaagag 1020
tataccaata tcttcctgaa gtttggatca gggtacgtga gcggctgggg aagagtcttc 1080
cacaagggca ggagcgccct ggtgctccag tatctgcgag tgcctctggt cgatcgagct 1140
acctgtctgc tctctaccaa gtttacaatc tacaacaaca tgttctgcgc tgggtttcac 1200
gagggaggac gagactcctg tcagggcgat tctgggggcc cacatgtgac agaggtcgaa 1260
ggcaccagct tcctgactgg catcatttcc tggggagagg aatgtgcaat gaagggaaaa 1320
tacgggatct acaccaaagt gagccgctat gtgaactgga tcaaggaaaa aaccaaactg 1380
acc 1383
<210> 4
<211> 2332
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸序列
<400> 4
Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr
1 5 10 15
Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro
20 25 30
Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys
35 40 45
Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro
50 55 60
Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val
65 70 75 80
Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val
85 90 95
Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala
100 105 110
Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val
115 120 125
Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn
130 135 140
Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser
145 150 155 160
His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu
165 170 175
Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu
180 185 190
His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp
195 200 205
His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser
210 215 220
Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg
225 230 235 240
Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His
245 250 255
Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu
260 265 270
Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile
275 280 285
Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly
290 295 300
Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met
305 310 315 320
Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg
325 330 335
Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp
340 345 350
Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe
355 360 365
Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His
370 375 380
Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu
385 390 395 400
Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro
405 410 415
Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr
420 425 430
Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile
435 440 445
Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile
450 455 460
Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile
465 470 475 480
Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys
485 490 495
His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys
500 505 510
Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys
515 520 525
Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala
530 535 540
Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp
545 550 555 560
Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe
565 570 575
Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln
580 585 590
Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe
595 600 605
Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser
610 615 620
Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu
625 630 635 640
Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr
645 650 655
Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro
660 665 670
Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp
675 680 685
Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala
690 695 700
Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu
705 710 715 720
Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala
725 730 735
Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Ser Arg His Pro Ser Thr Arg
740 745 750
Gln Lys Gln Phe Asn Ala Thr Thr Ile Pro Glu Asn Asp Ile Glu Lys
755 760 765
Thr Asp Pro Trp Phe Ala His Arg Thr Pro Met Pro Lys Ile Gln Asn
770 775 780
Val Ser Ser Ser Asp Leu Leu Met Leu Leu Arg Gln Ser Pro Thr Pro
785 790 795 800
His Gly Leu Ser Leu Ser Asp Leu Gln Glu Ala Lys Tyr Glu Thr Phe
805 810 815
Ser Asp Asp Pro Ser Pro Gly Ala Ile Asp Ser Asn Asn Ser Leu Ser
820 825 830
Glu Met Thr His Phe Arg Pro Gln Leu His His Ser Gly Asp Met Val
835 840 845
Phe Thr Pro Glu Ser Gly Leu Gln Leu Arg Leu Asn Glu Lys Leu Gly
850 855 860
Thr Thr Ala Ala Thr Glu Leu Lys Lys Leu Asp Phe Lys Val Ser Ser
865 870 875 880
Thr Ser Asn Asn Leu Ile Ser Thr Ile Pro Ser Asp Asn Leu Ala Ala
885 890 895
Gly Thr Asp Asn Thr Ser Ser Leu Gly Pro Pro Ser Met Pro Val His
900 905 910
Tyr Asp Ser Gln Leu Asp Thr Thr Leu Phe Gly Lys Lys Ser Ser Pro
915 920 925
Leu Thr Glu Ser Gly Gly Pro Leu Ser Leu Ser Glu Glu Asn Asn Asp
930 935 940
Ser Lys Leu Leu Glu Ser Gly Leu Met Asn Ser Gln Glu Ser Ser Trp
945 950 955 960
Gly Lys Asn Val Ser Ser Thr Glu Ser Gly Arg Leu Phe Lys Gly Lys
965 970 975
Arg Ala His Gly Pro Ala Leu Leu Thr Lys Asp Asn Ala Leu Phe Lys
980 985 990
Val Ser Ile Ser Leu Leu Lys Thr Asn Lys Thr Ser Asn Asn Ser Ala
995 1000 1005
Thr Asn Arg Lys Thr His Ile Asp Gly Pro Ser Leu Leu Ile Glu
1010 1015 1020
Asn Ser Pro Ser Val Trp Gln Asn Ile Leu Glu Ser Asp Thr Glu
1025 1030 1035
Phe Lys Lys Val Thr Pro Leu Ile His Asp Arg Met Leu Met Asp
1040 1045 1050
Lys Asn Ala Thr Ala Leu Arg Leu Asn His Met Ser Asn Lys Thr
1055 1060 1065
Thr Ser Ser Lys Asn Met Glu Met Val Gln Gln Lys Lys Glu Gly
1070 1075 1080
Pro Ile Pro Pro Asp Ala Gln Asn Pro Asp Met Ser Phe Phe Lys
1085 1090 1095
Met Leu Phe Leu Pro Glu Ser Ala Arg Trp Ile Gln Arg Thr His
1100 1105 1110
Gly Lys Asn Ser Leu Asn Ser Gly Gln Gly Pro Ser Pro Lys Gln
1115 1120 1125
Leu Val Ser Leu Gly Pro Glu Lys Ser Val Glu Gly Gln Asn Phe
1130 1135 1140
Leu Ser Glu Lys Asn Lys Val Val Val Gly Lys Gly Glu Phe Thr
1145 1150 1155
Lys Asp Val Gly Leu Lys Glu Met Val Phe Pro Ser Ser Arg Asn
1160 1165 1170
Leu Phe Leu Thr Asn Leu Asp Asn Leu His Glu Asn Asn Thr His
1175 1180 1185
Asn Gln Glu Lys Lys Ile Gln Glu Glu Ile Glu Lys Lys Glu Thr
1190 1195 1200
Leu Ile Gln Glu Asn Val Val Leu Pro Gln Ile His Thr Val Thr
1205 1210 1215
Gly Thr Lys Asn Phe Met Lys Asn Leu Phe Leu Leu Ser Thr Arg
1220 1225 1230
Gln Asn Val Glu Gly Ser Tyr Asp Gly Ala Tyr Ala Pro Val Leu
1235 1240 1245
Gln Asp Phe Arg Ser Leu Asn Asp Ser Thr Asn Arg Thr Lys Lys
1250 1255 1260
His Thr Ala His Phe Ser Lys Lys Gly Glu Glu Glu Asn Leu Glu
1265 1270 1275
Gly Leu Gly Asn Gln Thr Lys Gln Ile Val Glu Lys Tyr Ala Cys
1280 1285 1290
Thr Thr Arg Ile Ser Pro Asn Thr Ser Gln Gln Asn Phe Val Thr
1295 1300 1305
Gln Arg Ser Lys Arg Ala Leu Lys Gln Phe Arg Leu Pro Leu Glu
1310 1315 1320
Glu Thr Glu Leu Glu Lys Arg Ile Ile Val Asp Asp Thr Ser Thr
1325 1330 1335
Gln Trp Ser Lys Asn Met Lys His Leu Thr Pro Ser Thr Leu Thr
1340 1345 1350
Gln Ile Asp Tyr Asn Glu Lys Glu Lys Gly Ala Ile Thr Gln Ser
1355 1360 1365
Pro Leu Ser Asp Cys Leu Thr Arg Ser His Ser Ile Pro Gln Ala
1370 1375 1380
Asn Arg Ser Pro Leu Pro Ile Ala Lys Val Ser Ser Phe Pro Ser
1385 1390 1395
Ile Arg Pro Ile Tyr Leu Thr Arg Val Leu Phe Gln Asp Asn Ser
1400 1405 1410
Ser His Leu Pro Ala Ala Ser Tyr Arg Lys Lys Asp Ser Gly Val
1415 1420 1425
Gln Glu Ser Ser His Phe Leu Gln Gly Ala Lys Lys Asn Asn Leu
1430 1435 1440
Ser Leu Ala Ile Leu Thr Leu Glu Met Thr Gly Asp Gln Arg Glu
1445 1450 1455
Val Gly Ser Leu Gly Thr Ser Ala Thr Asn Ser Val Thr Tyr Lys
1460 1465 1470
Lys Val Glu Asn Thr Val Leu Pro Lys Pro Asp Leu Pro Lys Thr
1475 1480 1485
Ser Gly Lys Val Glu Leu Leu Pro Lys Val His Ile Tyr Gln Lys
1490 1495 1500
Asp Leu Phe Pro Thr Glu Thr Ser Asn Gly Ser Pro Gly His Leu
1505 1510 1515
Asp Leu Val Glu Gly Ser Leu Leu Gln Gly Thr Glu Gly Ala Ile
1520 1525 1530
Lys Trp Asn Glu Ala Asn Arg Pro Gly Lys Val Pro Phe Leu Arg
1535 1540 1545
Val Ala Thr Glu Ser Ser Ala Lys Thr Pro Ser Lys Leu Leu Asp
1550 1555 1560
Pro Leu Ala Trp Asp Asn His Tyr Gly Thr Gln Ile Pro Lys Glu
1565 1570 1575
Glu Trp Lys Ser Gln Glu Lys Ser Pro Glu Lys Thr Ala Phe Lys
1580 1585 1590
Lys Lys Asp Thr Ile Leu Ser Leu Asn Ala Cys Glu Ser Asn His
1595 1600 1605
Ala Ile Ala Ala Ile Asn Glu Gly Gln Asn Lys Pro Glu Ile Glu
1610 1615 1620
Val Thr Trp Ala Lys Gln Gly Arg Thr Glu Arg Leu Cys Ser Gln
1625 1630 1635
Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr
1640 1645 1650
Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile
1655 1660 1665
Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp
1670 1675 1680
Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr
1685 1690 1695
Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Ser
1700 1705 1710
Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly Ser Val Pro
1715 1720 1725
Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp Gly Ser Phe
1730 1735 1740
Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly Leu
1745 1750 1755
Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val
1760 1765 1770
Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser
1775 1780 1785
Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg
1790 1795 1800
Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys
1805 1810 1815
Val Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys
1820 1825 1830
Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His
1835 1840 1845
Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu
1850 1855 1860
Asn Pro Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu
1865 1870 1875
Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu
1880 1885 1890
Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu
1895 1900 1905
Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly
1910 1915 1920
Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln
1925 1930 1935
Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile
1940 1945 1950
His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys
1955 1960 1965
Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe
1970 1975 1980
Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val
1985 1990 1995
Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu
2000 2005 2010
Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala
2015 2020 2025
Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr
2030 2035 2040
Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser
2045 2050 2055
Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val
2060 2065 2070
Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly
2075 2080 2085
Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile
2090 2095 2100
Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn
2105 2110 2115
Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser
2120 2125 2130
Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr
2135 2140 2145
Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg
2150 2155 2160
Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu
2165 2170 2175
Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser
2180 2185 2190
Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala
2195 2200 2205
Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val
2210 2215 2220
Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met
2225 2230 2235
Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr
2240 2245 2250
Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly
2255 2260 2265
His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe
2270 2275 2280
Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp
2285 2290 2295
Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp
2300 2305 2310
Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala
2315 2320 2325
Gln Asp Leu Tyr
2330
<210> 5
<211> 1604
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸序列
<400> 5
Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe
1 5 10 15
Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser
20 25 30
Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg
35 40 45
Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val
50 55 60
Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile
65 70 75 80
Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln
85 90 95
Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser
100 105 110
His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser
115 120 125
Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp
130 135 140
Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu
145 150 155 160
Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser
165 170 175
Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile
180 185 190
Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr
195 200 205
Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly
210 215 220
Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp
225 230 235 240
Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr
245 250 255
Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val
260 265 270
Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile
275 280 285
Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser
290 295 300
Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met
305 310 315 320
Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His
325 330 335
Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro
340 345 350
Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp
355 360 365
Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser
370 375 380
Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr
385 390 395 400
Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro
405 410 415
Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn
420 425 430
Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met
435 440 445
Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu
450 455 460
Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu
465 470 475 480
Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro
485 490 495
His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys
500 505 510
Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe
515 520 525
Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp
530 535 540
Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg
545 550 555 560
Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu
565 570 575
Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val
580 585 590
Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu
595 600 605
Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp
610 615 620
Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val
625 630 635 640
Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp
645 650 655
Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe
660 665 670
Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr
675 680 685
Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro
690 695 700
Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly
705 710 715 720
Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp
725 730 735
Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys
740 745 750
Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Thr Ser Glu Ser
755 760 765
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser
770 775 780
Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly
785 790 795 800
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
805 810 815
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly
820 825 830
Ser Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly
835 840 845
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala
850 855 860
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu
865 870 875 880
Ser Gly Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly
885 890 895
Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ala Ser Ser Pro
900 905 910
Pro Val Leu Lys Arg His Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln
915 920 925
Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met
930 935 940
Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro
945 950 955 960
Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu
965 970 975
Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn
980 985 990
Arg Ala Gln Ser Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln
995 1000 1005
Glu Phe Thr Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu
1010 1015 1020
Leu Asn Glu His Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu
1025 1030 1035
Val Glu Asp Asn Ile Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg
1040 1045 1050
Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln
1055 1060 1065
Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu
1070 1075 1080
Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Val Gln His His Met Ala Pro Thr
1085 1090 1095
Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val
1100 1105 1110
Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu
1115 1120 1125
Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly Arg Gln Val
1130 1135 1140
Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr
1145 1150 1155
Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala
1160 1165 1170
Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr
1175 1180 1185
Arg Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly
1190 1195 1200
Leu Val Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser
1205 1210 1215
Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe Ser Gly His
1220 1225 1230
Val Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr
1235 1240 1245
Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser
1250 1255 1260
Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu
1265 1270 1275
His Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys
1280 1285 1290
Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln
1295 1300 1305
Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala
1310 1315 1320
Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu
1325 1330 1335
Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile
1340 1345 1350
His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu
1355 1360 1365
Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys
1370 1375 1380
Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe
1385 1390 1395
Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn
1400 1405 1410
Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr
1415 1420 1425
Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu
1430 1435 1440
Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser
1445 1450 1455
Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala
1460 1465 1470
Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser
1475 1480 1485
Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln
1490 1495 1500
Val Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln
1505 1510 1515
Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu
1520 1525 1530
Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln
1535 1540 1545
Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr
1550 1555 1560
Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu
1565 1570 1575
Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met
1580 1585 1590
Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr
1595 1600
<210> 6
<211> 461
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸序列
<400> 6
Met Gln Arg Val Asn Met Ile Met Ala Glu Ser Pro Gly Leu Ile Thr
1 5 10 15
Ile Cys Leu Leu Gly Tyr Leu Leu Ser Ala Glu Cys Thr Val Phe Leu
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Asp His Glu Asn Ala Asn Lys Ile Leu Asn Arg Pro Lys Arg Tyr Asn
35 40 45
Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg Glu Cys
50 55 60
Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu Asn
65 70 75 80
Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly Asp Gln
85 90 95
Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Asp Ile
100 105 110
Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys
115 120 125
Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu Gln Phe
130 135 140
Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr Glu Gly
145 150 155 160
Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val Pro Phe
165 170 175
Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala
180 185 190
Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu Ala Glu
195 200 205
Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn Asp Phe
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Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe Pro Trp
225 230 235 240
Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly Ser Ile
245 250 255
Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu Thr Gly
260 265 270
Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu Thr Glu
275 280 285
His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His His Asn
290 295 300
Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu Leu Glu
305 310 315 320
Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile Cys Ile
325 330 335
Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser Gly Tyr
340 345 350
Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala Leu Val
355 360 365
Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys Leu Leu
370 375 380
Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly Phe His
385 390 395 400
Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val
405 410 415
Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser Trp Gly
420 425 430
Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Ser
435 440 445
Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr
450 455 460
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸序列
<400> 7
tccataaagt aggaaacact aca 23
<210> 8
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸序列
<400> 8
Glu Leu Leu Gly
1
<210> 9
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸序列
<400> 9
Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser
1 5 10 15
Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu
20 25 30
<210> 10
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸序列
<400> 10
Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg
1 5 10 15
Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln
20 25
<210> 11
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸序列
<400> 11
Gly Glu Ser Pro Gly Gly Ser Ser Gly Ser Glu Ser
1 5 10
<210> 12
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸序列
<400> 12
Gly Ser Glu Gly Ser Ser Gly Pro Gly Glu Ser Ser
1 5 10
<210> 13
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸序列
<400> 13
Gly Ser Ser Glu Ser Gly Ser Ser Glu Gly Gly Pro
1 5 10
<210> 14
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸序列
<400> 14
Gly Ser Gly Gly Glu Pro Ser Glu Ser Gly Ser Ser
1 5 10
<210> 15
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸序列
<400> 15
Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu
1 5 10
<210> 16
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸序列
<400> 16
Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro
1 5 10
<210> 17
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸序列
<400> 17
Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro
1 5 10
<210> 18
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸序列
<400> 18
Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro
1 5 10
<210> 19
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸序列
<400> 19
Gly Ser Thr Ser Glu Ser Pro Ser Gly Thr Ala Pro
1 5 10
<210> 20
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸序列
<400> 20
Gly Thr Ser Thr Pro Glu Ser Gly Ser Ala Ser Pro
1 5 10
<210> 21
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸序列
<400> 21
Gly Thr Ser Pro Ser Gly Glu Ser Ser Thr Ala Pro
1 5 10
<210> 22
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸序列
<400> 22
Gly Ser Thr Ser Ser Thr Ala Glu Ser Pro Gly Pro
1 5 10
<210> 23
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸序列
<400> 23
Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro
1 5 10
<210> 24
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸序列
<400> 24
Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro
1 5 10
<210> 25
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸序列
<400> 25
Gly Ser Ser Pro Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro
1 5 10
<210> 26
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸序列
<400> 26
Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro
1 5 10
<210> 27
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸序列
<400> 27
Gly Glu Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Ser Glu
1 5 10
<210> 28
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸序列
<400> 28
Gly Thr Gly Glu Pro Ser Ser Thr Pro Ala Ser Glu
1 5 10
<210> 29
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸序列
<400> 29
Gly Ser Gly Pro Ser Thr Glu Ser Ala Pro Thr Glu
1 5 10
<210> 30
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸序列
<400> 30
Gly Ser Glu Thr Pro Ser Gly Pro Ser Glu Thr Ala
1 5 10
<210> 31
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸序列
<400> 31
Gly Pro Ser Glu Thr Ser Thr Ser Glu Pro Gly Ala
1 5 10
<210> 32
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸序列
<400> 32
Gly Ser Pro Ser Glu Pro Thr Glu Gly Thr Ser Ala
1 5 10
<210> 33
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸序列
<400> 33
Gly Ser Gly Ala Ser Glu Pro Thr Ser Thr Glu Pro
1 5 10
<210> 34
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸序列
<400> 34
Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Thr Glu Pro Ser
1 5 10
<210> 35
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸序列
<400> 35
Gly Thr Ser Glu Pro Ser Thr Ser Glu Pro Gly Ala
1 5 10
<210> 36
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸序列
<400> 36
Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Pro Gly Ser Ala
1 5 10
<210> 37
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸序列
<400> 37
Gly Ser Thr Ala Gly Ser Glu Thr Ser Thr Glu Ala
1 5 10
<210> 38
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸序列
<400> 38
Gly Ser Glu Thr Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Ala
1 5 10
<210> 39
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸序列
<400> 39
Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Ser Glu Ser Gly Ala
1 5 10
<210> 40
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸序列
<400> 40
Gly Thr Ser Thr Glu Ala Ser Glu Gly Ser Ala Ser
1 5 10
<210> 41
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸序列
<400> 41
Gly Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly
1 5 10 15
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala
20 25 30
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Ala Ser Ser
35 40
<210> 42
<211> 144
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸序列
<400> 42
Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly
1 5 10 15
Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly
20 25 30
Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly
35 40 45
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu
50 55 60
Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu
65 70 75 80
Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly
85 90 95
Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu
100 105 110
Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu
115 120 125
Ser Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly
130 135 140
<210> 43
<211> 144
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸序列
<400> 43
Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser
20 25 30
Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly
35 40 45
Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu
50 55 60
Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly
65 70 75 80
Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly
85 90 95
Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu
100 105 110
Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser
115 120 125
Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly
130 135 140
<210> 44
<211> 144
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸序列
<400> 44
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala
1 5 10 15
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu
20 25 30
Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly
35 40 45
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu
50 55 60
Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu
65 70 75 80
Ser Gly Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly
85 90 95
Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser Pro Ala Gly
100 105 110
Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu
115 120 125
Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly
130 135 140
<210> 45
<211> 144
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸序列
<400> 45
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala
1 5 10 15
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu
20 25 30
Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly
35 40 45
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu
50 55 60
Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser
65 70 75 80
Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly
85 90 95
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
100 105 110
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser
115 120 125
Thr Glu Glu Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly
130 135 140
<210> 46
<211> 144
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸序列
<400> 46
Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu
20 25 30
Ser Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly
35 40 45
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala
50 55 60
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser
65 70 75 80
Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly
85 90 95
Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Glu Pro Ala
100 105 110
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu
115 120 125
Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly
130 135 140
<210> 47
<211> 144
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸序列
<400> 47
Pro Gly Ser Ser Pro Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Ser Ser
1 5 10 15
Pro Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr
20 25 30
Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser
35 40 45
Pro Gly Ser Ser Pro Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Ala Ser
50 55 60
Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr
65 70 75 80
Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser
85 90 95
Pro Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ala Ser
100 105 110
Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser
115 120 125
Ser Thr Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser
130 135 140
<210> 48
<211> 144
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸序列
<400> 48
Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Pro
1 5 10 15
Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Ser Ser Pro Ser Ala Ser Thr
20 25 30
Gly Thr Gly Pro Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro
35 40 45
Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Pro
50 55 60
Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser
65 70 75 80
Thr Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro
85 90 95
Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly
100 105 110
Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser
115 120 125
Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro
130 135 140
<210> 49
<211> 144
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸序列
<400> 49
Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ser Ser Thr
1 5 10 15
Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser
20 25 30
Thr Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro
35 40 45
Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Pro
50 55 60
Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Ser Ser Pro Ser Ala Ser Thr
65 70 75 80
Gly Thr Gly Pro Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro
85 90 95
Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro
100 105 110
Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser
115 120 125
Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro
130 135 140
<210> 50
<211> 144
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸序列
<400> 50
Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ala Ser Pro
1 5 10 15
Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser
20 25 30
Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro
35 40 45
Gly Ser Ser Pro Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Thr Pro Gly
50 55 60
Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser
65 70 75 80
Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro
85 90 95
Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Thr
100 105 110
Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala
115 120 125
Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro
130 135 140
<210> 51
<211> 144
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸序列
<400> 51
Gly Ser Ser Pro Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Ser Ser Pro
1 5 10 15
Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser
20 25 30
Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro
35 40 45
Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Pro
50 55 60
Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser
65 70 75 80
Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Pro Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro
85 90 95
Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ser Ser Thr
100 105 110
Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala
115 120 125
Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro
130 135 140
<210> 52
<211> 450
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸序列
<400> 52
ggcgcgccaa catcagagag cgccacccct gaaagtggtc ccgggagcga gccagccaca 60
tctgggtcgg aaacgccagg cacaagtgag tctgcaactc ccgagtccgg acctggctcc 120
gagcctgcca ctagcggctc cgagactccg ggaacttccg agagcgctac accagaaagc 180
ggacccggaa ccagtaccga acctagcgag ggctctgctc cgggcagccc agccggctct 240
cctacatcca cggaggaggg cacttccgaa tccgccaccc cggagtcagg gccaggatct 300
gaacccgcta cctcaggcag tgagacgcca ggaacgagcg agtccgctac accggagagt 360
gggccaggga gccctgctgg atctcctacg tccactgagg aagggtcacc agcgggctcg 420
cccaccagca ctgaagaagg tgcctcgagc 450
<210> 53
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为Asp、Asn、Ser、Thr或Trp
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (3)..(3)
<223> Xaa为Asn、Gln、His、Ile、Leu或Lys
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (4)..(4)
<223> Xaa为Ala、Asp、Phe、Trp或Tyr
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (5)..(5)
<223> Xaa为Asp、Gly、Leu、Phe、Ser或Thr
<400> 53
Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Cys
1 5
<210> 54
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸序列
<400> 54
Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp
1 5 10
<210> 55
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸序列
<400> 55
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Ser Ala Pro Ala
20
<210> 56
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸序列
<400> 56
Ala Ala Pro Ala Ser Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ser Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Ala Ala Pro Ser
20
<210> 57
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸序列
<400> 57
Ala Pro Ser Ser Pro Ser Pro Ser Ala Pro Ser Ser Pro Ser Pro Ala
1 5 10 15
Ser Pro Ser Ser
20
<210> 58
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸序列
<400> 58
Ala Pro Ser Ser Pro Ser Pro Ser Ala Pro Ser Ser Pro Ser Pro Ala
1 5 10 15
Ser Pro Ser
<210> 59
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸序列
<400> 59
Ser Ser Pro Ser Ala Pro Ser Pro Ser Ser Pro Ala Ser Pro Ser Pro
1 5 10 15
Ser Ser Pro Ala
20
<210> 60
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸序列
<400> 60
Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ser Ala Pro Pro Ala Ala Ala Ser Pro
1 5 10 15
Ala Ala Pro Ser Ala Pro Pro Ala
20
<210> 61
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸序列
<400> 61
Ala Ser Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ser Ala Pro
1 5 10 15
Ser Ala Ala Ala
20
<210> 62
<211> 2813
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸序列
<400> 62
Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Pro Gly Thr Leu Cys Ala Glu Gly Thr Arg Gly Arg Ser Ser Thr
20 25 30
Ala Arg Cys Ser Leu Phe Gly Ser Asp Phe Val Asn Thr Phe Asp Gly
35 40 45
Ser Met Tyr Ser Phe Ala Gly Tyr Cys Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Gly
50 55 60
Cys Gln Lys Arg Ser Phe Ser Ile Ile Gly Asp Phe Gln Asn Gly Lys
65 70 75 80
Arg Val Ser Leu Ser Val Tyr Leu Gly Glu Phe Phe Asp Ile His Leu
85 90 95
Phe Val Asn Gly Thr Val Thr Gln Gly Asp Gln Arg Val Ser Met Pro
100 105 110
Tyr Ala Ser Lys Gly Leu Tyr Leu Glu Thr Glu Ala Gly Tyr Tyr Lys
115 120 125
Leu Ser Gly Glu Ala Tyr Gly Phe Val Ala Arg Ile Asp Gly Ser Gly
130 135 140
Asn Phe Gln Val Leu Leu Ser Asp Arg Tyr Phe Asn Lys Thr Cys Gly
145 150 155 160
Leu Cys Gly Asn Phe Asn Ile Phe Ala Glu Asp Asp Phe Met Thr Gln
165 170 175
Glu Gly Thr Leu Thr Ser Asp Pro Tyr Asp Phe Ala Asn Ser Trp Ala
180 185 190
Leu Ser Ser Gly Glu Gln Trp Cys Glu Arg Ala Ser Pro Pro Ser Ser
195 200 205
Ser Cys Asn Ile Ser Ser Gly Glu Met Gln Lys Gly Leu Trp Glu Gln
210 215 220
Cys Gln Leu Leu Lys Ser Thr Ser Val Phe Ala Arg Cys His Pro Leu
225 230 235 240
Val Asp Pro Glu Pro Phe Val Ala Leu Cys Glu Lys Thr Leu Cys Glu
245 250 255
Cys Ala Gly Gly Leu Glu Cys Ala Cys Pro Ala Leu Leu Glu Tyr Ala
260 265 270
Arg Thr Cys Ala Gln Glu Gly Met Val Leu Tyr Gly Trp Thr Asp His
275 280 285
Ser Ala Cys Ser Pro Val Cys Pro Ala Gly Met Glu Tyr Arg Gln Cys
290 295 300
Val Ser Pro Cys Ala Arg Thr Cys Gln Ser Leu His Ile Asn Glu Met
305 310 315 320
Cys Gln Glu Arg Cys Val Asp Gly Cys Ser Cys Pro Glu Gly Gln Leu
325 330 335
Leu Asp Glu Gly Leu Cys Val Glu Ser Thr Glu Cys Pro Cys Val His
340 345 350
Ser Gly Lys Arg Tyr Pro Pro Gly Thr Ser Leu Ser Arg Asp Cys Asn
355 360 365
Thr Cys Ile Cys Arg Asn Ser Gln Trp Ile Cys Ser Asn Glu Glu Cys
370 375 380
Pro Gly Glu Cys Leu Val Thr Gly Gln Ser His Phe Lys Ser Phe Asp
385 390 395 400
Asn Arg Tyr Phe Thr Phe Ser Gly Ile Cys Gln Tyr Leu Leu Ala Arg
405 410 415
Asp Cys Gln Asp His Ser Phe Ser Ile Val Ile Glu Thr Val Gln Cys
420 425 430
Ala Asp Asp Arg Asp Ala Val Cys Thr Arg Ser Val Thr Val Arg Leu
435 440 445
Pro Gly Leu His Asn Ser Leu Val Lys Leu Lys His Gly Ala Gly Val
450 455 460
Ala Met Asp Gly Gln Asp Val Gln Leu Pro Leu Leu Lys Gly Asp Leu
465 470 475 480
Arg Ile Gln His Thr Val Thr Ala Ser Val Arg Leu Ser Tyr Gly Glu
485 490 495
Asp Leu Gln Met Asp Trp Asp Gly Arg Gly Arg Leu Leu Val Lys Leu
500 505 510
Ser Pro Val Tyr Ala Gly Lys Thr Cys Gly Leu Cys Gly Asn Tyr Asn
515 520 525
Gly Asn Gln Gly Asp Asp Phe Leu Thr Pro Ser Gly Leu Ala Glu Pro
530 535 540
Arg Val Glu Asp Phe Gly Asn Ala Trp Lys Leu His Gly Asp Cys Gln
545 550 555 560
Asp Leu Gln Lys Gln His Ser Asp Pro Cys Ala Leu Asn Pro Arg Met
565 570 575
Thr Arg Phe Ser Glu Glu Ala Cys Ala Val Leu Thr Ser Pro Thr Phe
580 585 590
Glu Ala Cys His Arg Ala Val Ser Pro Leu Pro Tyr Leu Arg Asn Cys
595 600 605
Arg Tyr Asp Val Cys Ser Cys Ser Asp Gly Arg Glu Cys Leu Cys Gly
610 615 620
Ala Leu Ala Ser Tyr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Arg Gly Val Arg Val
625 630 635 640
Ala Trp Arg Glu Pro Gly Arg Cys Glu Leu Asn Cys Pro Lys Gly Gln
645 650 655
Val Tyr Leu Gln Cys Gly Thr Pro Cys Asn Leu Thr Cys Arg Ser Leu
660 665 670
Ser Tyr Pro Asp Glu Glu Cys Asn Glu Ala Cys Leu Glu Gly Cys Phe
675 680 685
Cys Pro Pro Gly Leu Tyr Met Asp Glu Arg Gly Asp Cys Val Pro Lys
690 695 700
Ala Gln Cys Pro Cys Tyr Tyr Asp Gly Glu Ile Phe Gln Pro Glu Asp
705 710 715 720
Ile Phe Ser Asp His His Thr Met Cys Tyr Cys Glu Asp Gly Phe Met
725 730 735
His Cys Thr Met Ser Gly Val Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asp Ala Val
740 745 750
Leu Ser Ser Pro Leu Ser His Arg Ser Lys Arg Ser Leu Ser Cys Arg
755 760 765
Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp Asn Leu Arg Ala Glu
770 775 780
Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr Asp Leu Glu Cys Met
785 790 795 800
Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro Pro Gly Met Val Arg
805 810 815
His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys Pro Cys Phe His Gln
820 825 830
Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Gly Cys Asn Thr
835 840 845
Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr Asp His Val Cys Asp
850 855 860
Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly
865 870 875 880
Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp
885 890 895
Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys
900 905 910
Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu
915 920 925
Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn Val Lys
930 935 940
Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val Val Glu Ser Gly Arg
945 950 955 960
Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg
965 970 975
His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys Val
980 985 990
Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp Leu Thr
995 1000 1005
Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn
1010 1015 1020
Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro
1025 1030 1035
Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met Lys Gln
1040 1045 1050
Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val Phe
1055 1060 1065
Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val
1070 1075 1080
Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala
1085 1090 1095
Cys Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln
1100 1105 1110
His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln
1115 1120 1125
Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu
1130 1135 1140
Trp Arg Tyr Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln
1145 1150 1155
His Pro Glu Pro Leu Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys
1160 1165 1170
His Ala His Cys Pro Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln
1175 1180 1185
Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly
1190 1195 1200
Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp
1205 1210 1215
Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys Asp Val Val Asn Leu Thr
1220 1225 1230
Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Gly Gly Leu Val Val Pro Pro Thr
1235 1240 1245
Asp Ala Pro Val Ser Pro Thr Thr Leu Tyr Val Glu Asp Ile Ser
1250 1255 1260
Glu Pro Pro Leu His Asp Phe Tyr Cys Ser Arg Leu Leu Asp Leu
1265 1270 1275
Val Phe Leu Leu Asp Gly Ser Ser Arg Leu Ser Glu Ala Glu Phe
1280 1285 1290
Glu Val Leu Lys Ala Phe Val Val Asp Met Met Glu Arg Leu Arg
1295 1300 1305
Ile Ser Gln Lys Trp Val Arg Val Ala Val Val Glu Tyr His Asp
1310 1315 1320
Gly Ser His Ala Tyr Ile Gly Leu Lys Asp Arg Lys Arg Pro Ser
1325 1330 1335
Glu Leu Arg Arg Ile Ala Ser Gln Val Lys Tyr Ala Gly Ser Gln
1340 1345 1350
Val Ala Ser Thr Ser Glu Val Leu Lys Tyr Thr Leu Phe Gln Ile
1355 1360 1365
Phe Ser Lys Ile Asp Arg Pro Glu Ala Ser Arg Ile Thr Leu Leu
1370 1375 1380
Leu Met Ala Ser Gln Glu Pro Gln Arg Met Ser Arg Asn Phe Val
1385 1390 1395
Arg Tyr Val Gln Gly Leu Lys Lys Lys Lys Val Ile Val Ile Pro
1400 1405 1410
Val Gly Ile Gly Pro His Ala Asn Leu Lys Gln Ile Arg Leu Ile
1415 1420 1425
Glu Lys Gln Ala Pro Glu Asn Lys Ala Phe Val Leu Ser Ser Val
1430 1435 1440
Asp Glu Leu Glu Gln Gln Arg Asp Glu Ile Val Ser Tyr Leu Cys
1445 1450 1455
Asp Leu Ala Pro Glu Ala Pro Pro Pro Thr Leu Pro Pro Asp Met
1460 1465 1470
Ala Gln Val Thr Val Gly Pro Gly Leu Leu Gly Val Ser Thr Leu
1475 1480 1485
Gly Pro Lys Arg Asn Ser Met Val Leu Asp Val Ala Phe Val Leu
1490 1495 1500
Glu Gly Ser Asp Lys Ile Gly Glu Ala Asp Phe Asn Arg Ser Lys
1505 1510 1515
Glu Phe Met Glu Glu Val Ile Gln Arg Met Asp Val Gly Gln Asp
1520 1525 1530
Ser Ile His Val Thr Val Leu Gln Tyr Ser Tyr Met Val Thr Val
1535 1540 1545
Glu Tyr Pro Phe Ser Glu Ala Gln Ser Lys Gly Asp Ile Leu Gln
1550 1555 1560
Arg Val Arg Glu Ile Arg Tyr Gln Gly Gly Asn Arg Thr Asn Thr
1565 1570 1575
Gly Leu Ala Leu Arg Tyr Leu Ser Asp His Ser Phe Leu Val Ser
1580 1585 1590
Gln Gly Asp Arg Glu Gln Ala Pro Asn Leu Val Tyr Met Val Thr
1595 1600 1605
Gly Asn Pro Ala Ser Asp Glu Ile Lys Arg Leu Pro Gly Asp Ile
1610 1615 1620
Gln Val Val Pro Ile Gly Val Gly Pro Asn Ala Asn Val Gln Glu
1625 1630 1635
Leu Glu Arg Ile Gly Trp Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ile Gln Asp
1640 1645 1650
Phe Glu Thr Leu Pro Arg Glu Ala Pro Asp Leu Val Leu Gln Arg
1655 1660 1665
Cys Cys Ser Gly Glu Gly Leu Gln Ile Pro Thr Leu Ser Pro Ala
1670 1675 1680
Pro Asp Cys Ser Gln Pro Leu Asp Val Ile Leu Leu Leu Asp Gly
1685 1690 1695
Ser Ser Ser Phe Pro Ala Ser Tyr Phe Asp Glu Met Lys Ser Phe
1700 1705 1710
Ala Lys Ala Phe Ile Ser Lys Ala Asn Ile Gly Pro Arg Leu Thr
1715 1720 1725
Gln Val Ser Val Leu Gln Tyr Gly Ser Ile Thr Thr Ile Asp Val
1730 1735 1740
Pro Trp Asn Val Val Pro Glu Lys Ala His Leu Leu Ser Leu Val
1745 1750 1755
Asp Val Met Gln Arg Glu Gly Gly Pro Ser Gln Ile Gly Asp Ala
1760 1765 1770
Leu Gly Phe Ala Val Arg Tyr Leu Thr Ser Glu Met His Gly Ala
1775 1780 1785
Arg Pro Gly Ala Ser Lys Ala Val Val Ile Leu Val Thr Asp Val
1790 1795 1800
Ser Val Asp Ser Val Asp Ala Ala Ala Asp Ala Ala Arg Ser Asn
1805 1810 1815
Arg Val Thr Val Phe Pro Ile Gly Ile Gly Asp Arg Tyr Asp Ala
1820 1825 1830
Ala Gln Leu Arg Ile Leu Ala Gly Pro Ala Gly Asp Ser Asn Val
1835 1840 1845
Val Lys Leu Gln Arg Ile Glu Asp Leu Pro Thr Met Val Thr Leu
1850 1855 1860
Gly Asn Ser Phe Leu His Lys Leu Cys Ser Gly Phe Val Arg Ile
1865 1870 1875
Cys Met Asp Glu Asp Gly Asn Glu Lys Arg Pro Gly Asp Val Trp
1880 1885 1890
Thr Leu Pro Asp Gln Cys His Thr Val Thr Cys Gln Pro Asp Gly
1895 1900 1905
Gln Thr Leu Leu Lys Ser His Arg Val Asn Cys Asp Arg Gly Leu
1910 1915 1920
Arg Pro Ser Cys Pro Asn Ser Gln Ser Pro Val Lys Val Glu Glu
1925 1930 1935
Thr Cys Gly Cys Arg Trp Thr Cys Pro Cys Val Cys Thr Gly Ser
1940 1945 1950
Ser Thr Arg His Ile Val Thr Phe Asp Gly Gln Asn Phe Lys Leu
1955 1960 1965
Thr Gly Ser Cys Ser Tyr Val Leu Phe Gln Asn Lys Glu Gln Asp
1970 1975 1980
Leu Glu Val Ile Leu His Asn Gly Ala Cys Ser Pro Gly Ala Arg
1985 1990 1995
Gln Gly Cys Met Lys Ser Ile Glu Val Lys His Ser Ala Leu Ser
2000 2005 2010
Val Glu Leu His Ser Asp Met Glu Val Thr Val Asn Gly Arg Leu
2015 2020 2025
Val Ser Val Pro Tyr Val Gly Gly Asn Met Glu Val Asn Val Tyr
2030 2035 2040
Gly Ala Ile Met His Glu Val Arg Phe Asn His Leu Gly His Ile
2045 2050 2055
Phe Thr Phe Thr Pro Gln Asn Asn Glu Phe Gln Leu Gln Leu Ser
2060 2065 2070
Pro Lys Thr Phe Ala Ser Lys Thr Tyr Gly Leu Cys Gly Ile Cys
2075 2080 2085
Asp Glu Asn Gly Ala Asn Asp Phe Met Leu Arg Asp Gly Thr Val
2090 2095 2100
Thr Thr Asp Trp Lys Thr Leu Val Gln Glu Trp Thr Val Gln Arg
2105 2110 2115
Pro Gly Gln Thr Cys Gln Pro Ile Leu Glu Glu Gln Cys Leu Val
2120 2125 2130
Pro Asp Ser Ser His Cys Gln Val Leu Leu Leu Pro Leu Phe Ala
2135 2140 2145
Glu Cys His Lys Val Leu Ala Pro Ala Thr Phe Tyr Ala Ile Cys
2150 2155 2160
Gln Gln Asp Ser Cys His Gln Glu Gln Val Cys Glu Val Ile Ala
2165 2170 2175
Ser Tyr Ala His Leu Cys Arg Thr Asn Gly Val Cys Val Asp Trp
2180 2185 2190
Arg Thr Pro Asp Phe Cys Ala Met Ser Cys Pro Pro Ser Leu Val
2195 2200 2205
Tyr Asn His Cys Glu His Gly Cys Pro Arg His Cys Asp Gly Asn
2210 2215 2220
Val Ser Ser Cys Gly Asp His Pro Ser Glu Gly Cys Phe Cys Pro
2225 2230 2235
Pro Asp Lys Val Met Leu Glu Gly Ser Cys Val Pro Glu Glu Ala
2240 2245 2250
Cys Thr Gln Cys Ile Gly Glu Asp Gly Val Gln His Gln Phe Leu
2255 2260 2265
Glu Ala Trp Val Pro Asp His Gln Pro Cys Gln Ile Cys Thr Cys
2270 2275 2280
Leu Ser Gly Arg Lys Val Asn Cys Thr Thr Gln Pro Cys Pro Thr
2285 2290 2295
Ala Lys Ala Pro Thr Cys Gly Leu Cys Glu Val Ala Arg Leu Arg
2300 2305 2310
Gln Asn Ala Asp Gln Cys Cys Pro Glu Tyr Glu Cys Val Cys Asp
2315 2320 2325
Pro Val Ser Cys Asp Leu Pro Pro Val Pro His Cys Glu Arg Gly
2330 2335 2340
Leu Gln Pro Thr Leu Thr Asn Pro Gly Glu Cys Arg Pro Asn Phe
2345 2350 2355
Thr Cys Ala Cys Arg Lys Glu Glu Cys Lys Arg Val Ser Pro Pro
2360 2365 2370
Ser Cys Pro Pro His Arg Leu Pro Thr Leu Arg Lys Thr Gln Cys
2375 2380 2385
Cys Asp Glu Tyr Glu Cys Ala Cys Asn Cys Val Asn Ser Thr Val
2390 2395 2400
Ser Cys Pro Leu Gly Tyr Leu Ala Ser Thr Ala Thr Asn Asp Cys
2405 2410 2415
Gly Cys Thr Thr Thr Thr Cys Leu Pro Asp Lys Val Cys Val His
2420 2425 2430
Arg Ser Thr Ile Tyr Pro Val Gly Gln Phe Trp Glu Glu Gly Cys
2435 2440 2445
Asp Val Cys Thr Cys Thr Asp Met Glu Asp Ala Val Met Gly Leu
2450 2455 2460
Arg Val Ala Gln Cys Ser Gln Lys Pro Cys Glu Asp Ser Cys Arg
2465 2470 2475
Ser Gly Phe Thr Tyr Val Leu His Glu Gly Glu Cys Cys Gly Arg
2480 2485 2490
Cys Leu Pro Ser Ala Cys Glu Val Val Thr Gly Ser Pro Arg Gly
2495 2500 2505
Asp Ser Gln Ser Ser Trp Lys Ser Val Gly Ser Gln Trp Ala Ser
2510 2515 2520
Pro Glu Asn Pro Cys Leu Ile Asn Glu Cys Val Arg Val Lys Glu
2525 2530 2535
Glu Val Phe Ile Gln Gln Arg Asn Val Ser Cys Pro Gln Leu Glu
2540 2545 2550
Val Pro Val Cys Pro Ser Gly Phe Gln Leu Ser Cys Lys Thr Ser
2555 2560 2565
Ala Cys Cys Pro Ser Cys Arg Cys Glu Arg Met Glu Ala Cys Met
2570 2575 2580
Leu Asn Gly Thr Val Ile Gly Pro Gly Lys Thr Val Met Ile Asp
2585 2590 2595
Val Cys Thr Thr Cys Arg Cys Met Val Gln Val Gly Val Ile Ser
2600 2605 2610
Gly Phe Lys Leu Glu Cys Arg Lys Thr Thr Cys Asn Pro Cys Pro
2615 2620 2625
Leu Gly Tyr Lys Glu Glu Asn Asn Thr Gly Glu Cys Cys Gly Arg
2630 2635 2640
Cys Leu Pro Thr Ala Cys Thr Ile Gln Leu Arg Gly Gly Gln Ile
2645 2650 2655
Met Thr Leu Lys Arg Asp Glu Thr Leu Gln Asp Gly Cys Asp Thr
2660 2665 2670
His Phe Cys Lys Val Asn Glu Arg Gly Glu Tyr Phe Trp Glu Lys
2675 2680 2685
Arg Val Thr Gly Cys Pro Pro Phe Asp Glu His Lys Cys Leu Ala
2690 2695 2700
Glu Gly Gly Lys Ile Met Lys Ile Pro Gly Thr Cys Cys Asp Thr
2705 2710 2715
Cys Glu Glu Pro Glu Cys Asn Asp Ile Thr Ala Arg Leu Gln Tyr
2720 2725 2730
Val Lys Val Gly Ser Cys Lys Ser Glu Val Glu Val Asp Ile His
2735 2740 2745
Tyr Cys Gln Gly Lys Cys Ala Ser Lys Ala Met Tyr Ser Ile Asp
2750 2755 2760
Ile Asn Asp Val Gln Asp Gln Cys Ser Cys Cys Ser Pro Thr Arg
2765 2770 2775
Thr Glu Pro Met Gln Val Ala Leu His Cys Thr Asn Gly Ser Val
2780 2785 2790
Val Tyr His Glu Val Leu Asn Ala Met Glu Cys Lys Cys Ser Pro
2795 2800 2805
Arg Lys Cys Ser Lys
2810
<210> 63
<211> 577
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸序列
<400> 63
ctcgaggtca attcacgcga gttaataatt accagcgcgg gccaaataaa taatccgcga 60
ggggcaggtg acgtttgccc agcgcgcgct ggtaattatt aacctcgcga atattgattc 120
gaggccgcga ttgccgcaat cgcgaggggc aggtgacctt tgcccagcgc gcgttcgccc 180
cgccccggac ggtatcgata agcttaggag cttgggctgc aggtcgaggg cactgggagg 240
atgttgagta agatggaaaa ctactgatga cccttgcaga gacagagtat taggacatgt 300
ttgaacaggg gccgggcgat cagcaggtag ctctagagga tccccgtctg tctgcacatt 360
tcgtagagcg agtgttccga tactctaatc tccctaggca aggttcatat ttgtgtaggt 420
tacttattct ccttttgttg actaagtcaa taatcagaat cagcaggttt ggagtcagct 480
tggcagggat cagcagcctg ggttggaagg agggggtata aaagcccctt caccaggaga 540
agccgtcaca cagatccaca agctcctgcc accatgg 577

Claims (48)

1.一种重组慢病毒载体制剂，所述重组慢病毒载体制剂包含：
(a)治疗有效剂量的重组慢病毒载体；
(b)无TRIS缓冲体系；
(c)盐；
(d)表面活性剂；以及
(e)碳水化合物，
其中所述药物组合物适于全身性给予至人患者。
2.根据权利要求1所述的制剂，其中所述缓冲体系或所述制剂的pH为约6.0至约8.0。
3.根据权利要求1或2所述的制剂，其中所述缓冲体系或所述制剂的pH为约6.0至约7.5。
4.根据前述权利要求中任一项所述的制剂，其中所述缓冲体系或所述制剂的pH为约6.0至约7.0。
5.根据前述权利要求中任一项所述的制剂，其中所述缓冲体系或所述制剂的pH为约6.5。
6.根据前述权利要求中任一项所述的制剂，其中所述缓冲体系或所述制剂的pH为约7.0至约8.0。
7.根据前述权利要求中任一项所述的制剂，其中所述缓冲体系或所述制剂的pH为约7.3。
8.根据前述权利要求中任一项所述的制剂，其中所述慢病毒载体包含编码VSV-G或其片段的核苷酸序列。
9.根据前述权利要求中任一项所述的制剂，其中所述缓冲体系包括磷酸盐缓冲液或组氨酸缓冲液。
10.根据权利要求9所述的制剂，其中所述磷酸盐缓冲液的浓度为约5mM至约30mM。
11.根据权利要求10所述的制剂，其中所述磷酸盐缓冲液的浓度为约10mM至约20mM、约10mM至约15mM、约20mM至约30mM、约20mM至约25mM、或约15mM至约20mM。
12.根据权利要求9所述的制剂，其中所述组氨酸缓冲液的浓度为约5mM至约30mM。
13.根据权利要求12所述的制剂，其中所述组氨酸缓冲液的浓度为约10mM至约20mM、约10mM至约15mM、约20mM至约30mM、约20mM至约25mM、或约15mM至约20mM。
14.根据前述权利要求中任一项所述的制剂，其中所述盐的浓度为约80mM至约150mM。
15.根据前述权利要求中任一项所述的制剂，其中所述盐的浓度为约100mM、约110mM、约130mM或约150mM。
16.根据前述权利要求中任一项所述的制剂，其中所述盐是氯化物盐。
17.根据权利要求16所述的制剂，其中所述氯化物盐是NaCl。
18.根据前述权利要求中任一项所述的制剂，其中所述表面活性剂是泊洛沙姆。
19.根据权利要求18所述的制剂，其中所述泊洛沙姆选自泊洛沙姆101(P101)、泊洛沙姆105(P105)、泊洛沙姆108(P108)、泊洛沙姆122(P122)、泊洛沙姆123(P123)、泊洛沙姆124(P124)、泊洛沙姆181(P181)、泊洛沙姆182(P182)、泊洛沙姆183(P183)、泊洛沙姆184(P184)、泊洛沙姆185(P185)、泊洛沙姆188(P188)、泊洛沙姆212(P212)、泊洛沙姆215(P215)、泊洛沙姆217(P217)、泊洛沙姆231(P231)、泊洛沙姆234(P234)、泊洛沙姆235(P235)、泊洛沙姆237(P237)、泊洛沙姆238(P238)、泊洛沙姆282(P282)、泊洛沙姆284(P284)、泊洛沙姆288(P288)、泊洛沙姆331(P331)、泊洛沙姆333(P333)、泊洛沙姆334(P334)、泊洛沙姆335(P335)、泊洛沙姆338(P338)、泊洛沙姆401(P401)、泊洛沙姆402(P402)、泊洛沙姆403(P403)、泊洛沙姆407(P407)及其组合。
20.根据权利要求18或19所述的制剂，其中所述泊洛沙姆是泊洛沙姆188(P188)。
21.根据权利要求18或19所述的制剂，其中所述泊洛沙姆是泊洛沙姆407(P407)。
22.根据权利要求1-17中任一项所述的制剂，其中所述表面活性剂是聚山梨醇酯。
23.根据权利要求22所述的制剂，其中所述聚山梨醇酯选自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80及其组合。
24.根据前述权利要求中任一项所述的制剂，其中所述表面活性剂的浓度为约0.01％(w/v)至约0.1％(w/v)。
25.根据前述权利要求中任一项所述的制剂，其中表面活性剂的浓度为约0.03％(w/v)、约0.05％(w/v)、约0.07％(w/v)或约0.09％(w/v)。
26.根据前述权利要求中任一项所述的制剂，其中所述碳水化合物的浓度为约0.5％(w/v)至约5％(w/v)。
27.根据前述权利要求中任一项所述的制剂，其中所述碳水化合物的浓度为约1％(w/v)、约2％(w/v)、约3％(w/v)或约4％(w/v)。
28.根据前述权利要求中任一项所述的制剂，其中所述碳水化合物是蔗糖。
29.根据权利要求1-28中任一项所述的制剂，所述制剂包含：
(a)治疗有效剂量的重组慢病毒载体；
(b)约10mM磷酸盐；
(c)约100mM氯化钠；
(d)约0.05％(w/v)泊洛沙姆188；以及
(e)约3％(w/v)蔗糖，
其中所述制剂的pH为约7.3，并且其中所述药物组合物适于全身性给予至人患者。
30.根据权利要求1-28中任一项所述的制剂，所述制剂包含：
(a)治疗有效剂量的重组慢病毒载体；
(b)约10mM磷酸盐；
(c)约130mM氯化钠；
(d)约0.05％(w/v)泊洛沙姆188；以及
(e)约1％(w/v)蔗糖，
其中所述制剂的pH为约7.3，并且其中所述药物组合物适于全身性给予至人患者。
31.根据权利要求1-28中任一项所述的制剂，所述制剂包含：
(a)治疗有效剂量的重组慢病毒载体；
(b)约20mM组氨酸；
(c)约100mM氯化钠；
(d)约0.05％(w/v)泊洛沙姆188；以及
(e)约3％(w/v)蔗糖，
其中所述制剂的pH为约6.5，并且其中所述药物组合物适于全身性给予至人患者。
32.根据权利要求1-28中任一项所述的制剂，所述制剂包含：
(a)治疗有效剂量的重组慢病毒载体；
(b)约10mM磷酸盐；
(c)约100mM氯化钠；
(d)约0.05％(w/v)泊洛沙姆188；以及
(e)约3％(w/v)蔗糖，
其中所述制剂的pH为约7.0，并且其中所述药物组合物适于全身性给予至人患者。
33.根据权利要求1-28中任一项所述的制剂，所述制剂包含：
(a)治疗有效剂量的重组慢病毒载体；
(b)约20mM组氨酸；
(c)约100mM氯化钠；
(d)约0.05％(w/v)泊洛沙姆188；以及
(e)约3％(w/v)蔗糖，
其中所述制剂的pH为约7.0，并且其中所述药物组合物适于全身性给予至人患者。
34.根据前述权利要求中任一项所述的制剂，其中所述重组慢病毒载体包含核酸，所述核酸包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的因子VIII(FVIII)编码序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的核苷酸序列。
35.根据权利要求34所述的制剂，其中所述重组慢病毒载体包含核酸，所述核酸包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的因子VIII(FVIII)编码序列。
36.根据权利要求34或35所述的制剂，其中所述重组慢病毒载体包含核酸，所述核酸由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的因子VIII(FVIII)编码序列组成。
37.根据权利要求1-36中任一项所述的制剂，其中所述重组慢病毒载体包含核酸，所述核酸包含与SEQ ID NO:3所示的因子IX(FIX)编码序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的核苷酸序列。
38.根据权利要求37所述的制剂，其中所述重组慢病毒载体包含核酸，所述核酸包含SEQ ID NO:3所示的因子IX(FIX)编码序列。
39.根据权利要求37或38所述的制剂，其中所述重组慢病毒载体包含核酸，所述核酸由SEQ ID NO:3所示的因子IX(FIX)编码序列组成。
40.根据前述权利要求中任一项所述的制剂，其中所述重组慢病毒载体包含增强型运甲状腺素蛋白(ET)启动子。
41.根据前述权利要求中任一项所述的制剂，其中所述重组慢病毒载体进一步包含与SEQ ID NO:7所示的miR-142的靶序列至少90％相同的核苷酸序列。
42.根据前述权利要求中任一项所述的制剂，其中所述重组慢病毒载体从选自以下的转染宿主细胞中分离：CHO细胞、HEK293细胞、BHK21细胞、PER.C6细胞、NSO细胞和CAP细胞。
43.根据权利要求42所述的制剂，其中所述宿主细胞是CD47阳性宿主细胞。
44.一种治疗患有障碍的人患者的方法，所述方法包括向所述人患者给予根据前述权利要求中任一项所述的重组慢病毒载体制剂。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述制剂全身性给予至所述人患者。
46.根据权利要求44或45所述的方法，其中所述制剂是静脉内给予的。
47.根据权利要求44-46中任一项所述的方法，其中所述障碍是出血障碍。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述出血障碍是血友病A或血友病B。
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