KR20220097891A - 렌티바이러스 벡터 제형 - Google Patents

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KR20220097891A
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poloxamer
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lentiviral vector
seq
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KR1020227014395A
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Inventor
앤드류 크뢰치
이시드로 자라가
Original Assignee
바이오버라티브 테라퓨틱스 인크.
폰다지오네 텔레톤
오스페달레 산 라파엘 에스.알.엘.
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Abstract

개선된 안정성을 가지며 전신 투여에 적합한 렌티바이러스 벡터(LV) 제형, 및 이러한 LV 제형을 포함하는 약학 조성물이 제공된다. LV 제형의 전신 투여를 사용하여, 장애, 특히 혈액 장애를 치료하는 방법도 제공된다.

Description

렌티바이러스 벡터 제형
관련 출원
본 출원은 2019년 9월 30일에 출원된 미국 특허 가출원 제62/908,390호에 대한 우선권을 주장하며, 그 개시 전체가 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원에는 ASCII 형식으로 전자 제출되었고 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 서열 목록이 포함된다. 2020년 9월 28일자로 생성된 상기 ASCII 사본의 파일명은 "709718_SA9-472PC_SeqList_ST25.txt"이고 용량은 104,426바이트이다.
발명의 분야
본 개시는 질환의 치료에서 사용하기 위한 재조합 렌티바이러스 벡터(LV) 제형 및 관련된 약학 제품에 관한 것이다. 특히, 이는 LV 안정성 및 품질을 개선하면서도 출혈 장애, 예컨대 혈우병 A 및 혈우병 B를 포함하는 질환을 치료하기 위해 대상체에 전신 및 다른 유형의 투여에서 사용하는 데 적합한 제형에 관한 것이다.
렌티바이러스 벡터(LV) 및 다른 바이러스 벡터는 유전자 치료법을 위한 매력적인 도구이다(Thomas et al., 2003). LV는 비-분열 세포, 예컨대 간세포, 뉴런 및 조혈 줄기 세포를 포함하는 광범위한 조직을 형질도입시킬 수 있다. 또한, LV는 표적 세포 게놈 내로 통합되고 장기 트랜스유전자 발현을 제공할 수 있다.
유전자 치료법 및 백신 개발 분야에서 계속되고 있는 난제는 LV가 장기간 구조적으로 안정하고 생물학적으로 활성으로 유지되면서 아지테이션, 냉동/해동과 같은 조건, 및 일정 범위의 온도에서의 보관을 견딜 수 있도록 하는 비독성 액체 제형을 생성하는 것이다. LV 역가는 증가된 냉동/해동 주기 및 고온에서의 보관에 의해 2상 방식으로 감소하는 것이 관찰되었다(Kigashikawa and Chang 2001, Virology 280, 124-131). 유전자 치료법을 가장 효과적으로 만들기 위해, 이의 생물학적 활성 또는 효능을 유지하는 렌티바이러스 벡터를 갖는 것이 요망된다.
LV의 생물학적 활성은 적어도 (a) 코어 폴리뉴클레오티드, (b) 코어 폴리뉴클레오티드를 둘러싼 내부-연결된 캡시드 단백질의 쉘, 및 (c) 내부-연결된 캡시드 단백질의 쉘을 둘러싼 당단백질-포매된 지질막으로 구성되는 봉입된 구조의 배좌 온전성에 좌우된다. 유기 및 무기 약물과 달리, LV는 고도로 복잡한 생물학적 구조이며 사소한 화학적 또는 물리적 스트레스인자는 봉입된 구조의 구조적 온전성의 분해에 기여할 수 있다. 이러한 스트레스인자는 삼투압, 완충액, pH, 점도, 전해질, 아지테이션, 및 온도 변동을 포함한다. LV의 구조적 또는 배좌 온전성은 이의 생물학적 활성 또는 효능에 직접 연관된다. 따라서, LV는 변성, 가용성 및 불용성 응집, 침전 및 흡착을 포함하는 물리적 불안정성뿐만 아니라 가수분해, 탈아미드화, 및 산화를 포함하는 화학적 불안정성의 결과로서 효능을 소실할 수 있다. 임의의 이러한 유형의 분해는 저하된 생물학적 활성을 초래할 수 있고, 또한 증가된 독성 및/또는 변경된 면역원성을 갖는 부산물 또는 유도체의 형성을 잠재적으로 초래할 수 있다. 따라서 우수한 LV 제형은 합리적인 보관 기간뿐만 아니라 대상체에 대한 투여 시, 예컨대 전신 투여를 통해 독성의 저하를 보장하기 위해 결정적으로 중요하다. LV를 안정화하여(여기서 LV는 광범위한 조건에 걸쳐 안정함) 강력한 제형을 생성하는 비히클을 찾는 것은 완충액 유형, pH, 및 부형제의 세심한 최적화를 필요로 한다. 시험되는 각각의 조건 세트에 있어서, LV의 안정성은 상이한 실험 방법을 통해 측정될 필요가 있다. 따라서, 변화될 수 있는 모든 요인을 고려해보면, LV 제형화를 위한 최적 조건, 및 우수한 제형의 조성물을 확인하는 것은 선험적으로 예측 불가능하다.
이에 따라, 대상체에 대한 투여에 적합하고 일정 범위의 조건 하에서 LV의 양, 구조적 온전성, 및 효능을 보존함으로써 LV 안정성을 개선하는 제형을 제조할 필요성이 당분야에 존재한다. 본원에서, 본 발명자들은 다양한 조건 하에서 LV의 개선된 안정성을 실증하고 대상체에 대한 전신 투여에 적합한 제형을 개시한다.
본 개시는 렌티바이러스 벡터(LV)가 탄수화물(예를 들어, 수크로스), 계면활성제(예를 들어, 폴록사머 또는 폴리소르베이트), 및 염(예를 들어, NaCl 또는 다른 클로라이드 염)과 조합되어 TRIS-비함유 완충 시스템(예를 들어, 포스페이트 또는 히스티딘 완충액)을 포함하는 비히클에 현탁되는 경우, 개선된 안정성을 갖는 LV 제형이 달성될 수 있다는 예상치 못한 발견에 기반한다. 계면활성제가 지질막에 의해 결합된 입자를 탈안정화할 것이라는 점이 당분야에 공지되어 있으므로 계면활성제, 예를 들어, 폴록사머의 LV 안정성에 대한 기여는 놀라운 것이었다. 약 6.0 내지 약 7.5의 pH 범위(예를 들어, pH 6.5)의 LV 제형이 LV 표면 단백질(예를 들어, 캡시드 단백질 및 VSV-G 단백질)을 탈안정화하고 LV 탈조립 또는 분해를 촉진하는 대신, LV 안정성을 개선한다는 관찰도 놀라운 것이었다. 또한, 본 개시는 본 개시의 LV 제형이 대상체에 대한 전신 투여(예를 들어, 정맥내 투여)에 특히 적합함을 실증한다.
하나의 양태에서, 본 개시는 (a) 치료 유효 용량의 재조합 렌티바이러스 벡터; (b) TRIS-비함유 완충 시스템; (c) 염; (d) 계면활성제; 및 (e) 탄수화물을 포함하는 재조합 렌티바이러스 벡터 조제물을 제공하며, 약학 조성물은 인간 환자에 대한 전신 투여에 적합하다.
소정 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 VSV-G를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편을 포함한다.
소정 구현예에서, 완충 시스템은 포스페이트 완충액을 포함한다.
소정 구현예에서, 포스페이트 완충액의 농도는 5 mM 내지 30 mM이다.
소정 구현예에서, 포스페이트 완충액의 농도는 약 10 mM 내지 약 20 mM, 약 10 mM 내지 약 15 mM, 약 20 mM 내지 약 30 mM, 약 20 mM 내지 약 25 mM, 또는 약 15 mM 내지 약 20 mM이다.
소정 구현예에서, 염의 농도는 80 mM 내지 150 mM이다.
소정 구현예에서, 염의 농도는 약 100 mM, 약 110 mM, 약 130 mM, 또는 약 150 mM이다.
소정 구현예에서, 염은 클로라이드 염이다.
소정 구현예에서, 클로라이드 염은 NaCl이다.
소정 구현예에서, 계면활성제는 폴록사머이다.
소정 구현예에서, 폴록사머는 폴록사머 101(P101), 폴록사머 105(P105), 폴록사머 108(P108), 폴록사머 122(P122), 폴록사머 123(P123), 폴록사머 124(P124), 폴록사머 181(P181), 폴록사머 182(P182), 폴록사머 183(P183), 폴록사머 184(P184), 폴록사머 185(P185), 폴록사머 188(P188), 폴록사머 212(P212), 폴록사머 215(P215), 폴록사머 217(P217), 폴록사머 231(P231), 폴록사머 234(P234), 폴록사머 235(P235), 폴록사머 237(P237), 폴록사머 238(P238), 폴록사머 282(P282), 폴록사머 284(P284), 폴록사머 288(P288), 폴록사머 331(P331), 폴록사머 333(P333), 폴록사머 334(P334), 폴록사머 335(P335), 폴록사머 338(P338), 폴록사머 401(P401), 폴록사머 402(P402), 폴록사머 403(P403), 폴록사머 407(P407), 및 이의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
소정 구현예에서, 폴록사머는 폴록사머 188(P188)이다.
소정 구현예에서, 폴록사머는 폴록사머 407(P407)이다.
소정 구현예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트이다.
소정 구현예에서, 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60, 폴리소르베이트 80, 및 이의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
소정 구현예에서, 계면활성제의 농도는 0.01%(w/v) 내지 0.1%(w/v)이다.
소정 구현예에서, 계면활성제의 농도는 약 0.03%(w/v), 약 0.05%(w/v), 약 0.07%(w/v), 또는 약 0.09%(w/v)이다.
소정 구현예에서, 탄수화물의 농도는 0.5%(w/v) 내지 5%(w/v)이다.
소정 구현예에서, 탄수화물의 농도는 약 1%(w/v), 약 2%(w/v), 약 3%(w/v), 또는 약 4%(w/v)이다.
소정 구현예에서, 탄수화물은 수크로스이다.
소정 구현예에서, 완충 시스템 또는 조제물의 pH는 6.0 내지 8.0이다.
소정 구현예에서, pH는 6.0 내지 7.0이다.
소정 구현예에서, pH는 약 6.5이다.
소정 구현예에서, pH는 약 7.0 내지 약 8.0이다.
소정 구현예에서, pH는 약 7.3이다.
하나의 양태에서, 본 발명은 (a) 치료 유효 용량의 재조합 렌티바이러스 벡터; (b) 히스티딘 완충 시스템; (c) 염; (d) 계면활성제; 및 (e) 탄수화물을 포함하는 재조합 렌티바이러스 벡터 조제물에 대한 것이며, 약학 조성물은 인간 환자에 대한 전신 투여에 적합하다.
소정 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 VSV-G를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편을 포함한다.
소정 구현예에서, 히스티딘 완충액의 농도는 5 mM 내지 30 mM이다.
소정 구현예에서, 히스티딘 완충액의 농도는 약 10 mM 내지 약 20 mM, 약 10 mM 내지 약 15 mM, 약 20 mM 내지 약 30 mM, 약 20 mM 내지 약 25 mM, 또는 약 15 mM 내지 약 20 mM이다.
소정 구현예에서, 염의 농도는 80 mM 내지 150 mM이다.
소정 구현예에서, 염의 농도는 약 100 mM, 약 110 mM, 약 130 mM, 또는 약 150 mM이다.
소정 구현예에서, 염은 클로라이드 염이다.
소정 구현예에서, 클로라이드 염은 NaCl이다.
소정 구현예에서, 계면활성제는 폴록사머이다.
소정 구현예에서, 폴록사머는 폴록사머 101(P101), 폴록사머 105(P105), 폴록사머 108(P108), 폴록사머 122(P122), 폴록사머 123(P123), 폴록사머 124(P124), 폴록사머 181(P181), 폴록사머 182(P182), 폴록사머 183(P183), 폴록사머 184(P184), 폴록사머 185(P185), 폴록사머 188(P188), 폴록사머 212(P212), 폴록사머 215(P215), 폴록사머 217(P217), 폴록사머 231(P231), 폴록사머 234(P234), 폴록사머 235(P235), 폴록사머 237(P237), 폴록사머 238(P238), 폴록사머 282(P282), 폴록사머 284(P284), 폴록사머 288(P288), 폴록사머 331(P331), 폴록사머 333(P333), 폴록사머 334(P334), 폴록사머 335(P335), 폴록사머 338(P338), 폴록사머 401(P401), 폴록사머 402(P402), 폴록사머 403(P403), 폴록사머 407(P407), 및 이의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
소정 구현예에서, 폴록사머는 폴록사머 188(P188)이다.
소정 구현예에서, 폴록사머는 폴록사머 407(P407)이다.
소정 구현예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트이다.
소정 구현예에서, 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60, 폴리소르베이트 80, 및 이의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
소정 구현예에서, 계면활성제의 농도는 0.01%(w/v) 내지 0.1%(w/v)이다.
소정 구현예에서, 계면활성제의 농도는 약 0.03%(w/v), 약 0.05%(w/v), 약 0.07%(w/v), 또는 약 0.09%(w/v)이다.
소정 구현예에서, 탄수화물의 농도는 0.5%(w/v) 내지 5%(w/v)이다.
소정 구현예에서, 탄수화물의 농도는 약 1%(w/v), 약 2%(w/v), 약 3%(w/v), 또는 약 4%(w/v)이다.
소정 구현예에서, 탄수화물은 수크로스이다.
소정 구현예에서, 완충 시스템 또는 조제물의 pH는 6.0 내지 8.0이다.
소정 구현예에서, pH는 6.0 내지 7.0이다.
소정 구현예에서, pH는 약 6.5이다.
소정 구현예에서, pH는 약 7.0 내지 약 8.0이다.
소정 구현예에서, pH는 약 7.3이다.
하나의 양태에서, 본 발명은 (a) 치료 유효 용량의 재조합 렌티바이러스 벡터; (b) 포스페이트 완충 시스템; (c) 염; (d) 계면활성제; 및 (e) 탄수화물을 포함하는 재조합 렌티바이러스 벡터 조제물에 대한 것이며, 약학 조성물은 인간 환자에 대한 전신 투여에 적합하다.
소정 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 VSV-G를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편을 포함한다.
소정 구현예에서, 포스페이트 완충액의 농도는 5 mM 내지 30 mM이다.
소정 구현예에서, 포스페이트 완충액의 농도는 약 10 mM 내지 약 20 mM, 약 10 mM 내지 약 15 mM, 약 20 mM 내지 약 30 mM, 약 20 mM 내지 약 25 mM, 또는 약 15 mM 내지 약 20 mM이다.
소정 구현예에서, 염의 농도는 80 mM 내지 150 mM이다.
소정 구현예에서, 염의 농도는 약 100 mM, 약 110 mM, 약 130 mM, 또는 약 150 mM이다.
소정 구현예에서, 염은 클로라이드 염이다.
소정 구현예에서, 클로라이드 염은 NaCl이다.
소정 구현예에서, 계면활성제는 폴록사머이다.
소정 구현예에서, 폴록사머는 폴록사머 101(P101), 폴록사머 105(P105), 폴록사머 108(P108), 폴록사머 122(P122), 폴록사머 123(P123), 폴록사머 124(P124), 폴록사머 181(P181), 폴록사머 182(P182), 폴록사머 183(P183), 폴록사머 184(P184), 폴록사머 185(P185), 폴록사머 188(P188), 폴록사머 212(P212), 폴록사머 215(P215), 폴록사머 217(P217), 폴록사머 231(P231), 폴록사머 234(P234), 폴록사머 235(P235), 폴록사머 237(P237), 폴록사머 238(P238), 폴록사머 282(P282), 폴록사머 284(P284), 폴록사머 288(P288), 폴록사머 331(P331), 폴록사머 333(P333), 폴록사머 334(P334), 폴록사머 335(P335), 폴록사머 338(P338), 폴록사머 401(P401), 폴록사머 402(P402), 폴록사머 403(P403), 폴록사머 407(P407), 및 이의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
소정 구현예에서, 폴록사머는 폴록사머 188(P188)이다.
소정 구현예에서, 폴록사머는 폴록사머 407(P407)이다.
소정 구현예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트이다.
소정 구현예에서, 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60, 폴리소르베이트 80, 및 이의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
소정 구현예에서, 계면활성제의 농도는 0.01%(w/v) 내지 0.1%(w/v)이다.
소정 구현예에서, 계면활성제의 농도는 약 0.03%(w/v), 약 0.05%(w/v), 약 0.07%(w/v), 또는 약 0.09%(w/v)이다.
소정 구현예에서, 탄수화물의 농도는 0.5%(w/v) 내지 5%(w/v)이다.
소정 구현예에서, 탄수화물의 농도는 약 1%(w/v), 약 2%(w/v), 약 3%(w/v), 또는 약 4%(w/v)이다.
소정 구현예에서, 탄수화물은 수크로스이다.
소정 구현예에서, 완충 시스템 또는 조제물의 pH는 6.0 내지 8.0이다.
소정 구현예에서, pH는 6.0 내지 7.0이다.
소정 구현예에서, pH는 약 6.5이다.
소정 구현예에서, pH는 약 7.0 내지 약 8.0이다.
소정 구현예에서, pH는 약 7.3이다.
소정 구현예에서, 재조합 렌티바이러스 벡터는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 나타낸 인자 VIII(FVIII) 코딩 서열과 적어도 80% 동일한 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.
소정 구현예에서, 재조합 렌티바이러스 벡터는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 나타낸 인자 VIII(FVIII) 코딩 서열을 추가로 포함한다.
소정 구현예에서, 재조합 렌티바이러스 벡터는 SEQ ID NO: 3에 나타낸 인자 IX(FIX) 코딩 서열과 적어도 80% 동일한 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.
소정 구현예에서, 재조합 렌티바이러스 벡터는 SEQ ID NO: 3에 나타낸 인자 IX(FIX) 코딩 서열을 추가로 포함한다.
소정 구현예에서, 재조합 렌티바이러스 벡터는 강화된 트랜스티레틴(ET) 프로모터를 추가로 포함한다.
소정 구현예에서, 재조합 렌티바이러스 벡터는 SEQ ID NO: 7에 나타낸 miR-142에 대한 표적 서열과 적어도 90% 동일한 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.
소정 구현예에서, 재조합 렌티바이러스 벡터는 CHO 세포, HEK293 세포, BHK21 세포, PER.C6 세포, NSO 세포, 및 CAP 세포의 군으로부터 선택되는 전달감염된 숙주 세포로부터 단리된다.
소정 구현예에서, 숙주 세포는 CD47-양성 숙주 세포이다.
하나의 양태에서, 본 발명은 장애를 갖는 인간 환자를 치료하는 방법에 대한 것으로, 인간 환자에는 (a) 치료 유효 용량의 재조합 렌티바이러스 벡터; (b) TRIS-비함유 완충 시스템; (c) 염; (d) 계면활성제; 및 (e) 탄수화물을 포함하는 재조합 렌티바이러스 벡터 조제물이 투여되며, 약학 조성물은 인간 환자에 대한 전신 투여에 적합하다.
소정 구현예에서, 조제물은 인간 환자에게 전신 투여된다.
소정 구현예에서, 조제물은 정맥내 투여된다.
소정 구현예에서, 장애는 출혈 장애이다.
소정 구현예에서, 출혈 장애는 혈우병 A 또는 혈우병 B이다.
다른 양태에서, (a) 치료 유효 용량의 재조합 렌티바이러스 벡터; (b) TRIS-비함유 완충 시스템; (c) 염; (d) 계면활성제; 및 (e) 탄수화물을 포함하는 재조합 렌티바이러스 벡터 조제물이 제공되며, 완충 시스템 또는 조제물의 pH는 약 6.0 내지 약 7.5이고, 약학 조성물은 인간 환자에 대한 전신 투여에 적합하다.
소정의 예시적인 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 VSV-G를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편을 포함한다.
소정의 예시적인 구현예에서, 완충 시스템은 포스페이트 완충액 또는 히스티딘 완충액을 포함한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 포스페이트 완충액의 농도는 약 5 mM 내지 약 30 mM이다. 소정의 예시적인 구현예에서, 포스페이트 완충액의 농도는 약 10 mM 내지 약 20 mM, 약 10 mM 내지 약 15 mM, 약 20 mM 내지 약 30 mM, 약 20 mM 내지 약 25 mM, 또는 약 15 mM 내지 약 20 mM이다. 소정의 예시적인 구현예에서, 히스티딘 완충액의 농도는 약 5 mM 내지 약 30 mM이다. 소정의 예시적인 구현예에서, 히스티딘 완충액의 농도는 약 10 mM 내지 약 20 mM, 약 10 mM 내지 약 15 mM, 약 20 mM 내지 약 30 mM, 약 20 mM 내지 약 25 mM, 또는 약 15 mM 내지 약 20 mM이다.
소정의 예시적인 구현예에서, 염의 농도는 약 80 mM 내지 약 150 mM이다. 소정의 예시적인 구현예에서, 염의 농도는 약 100 mM, 약 110 mM, 약 130 mM, 또는 약 150 mM이다. 소정의 예시적인 구현예에서, 염은 클로라이드 염이다. 소정의 예시적인 구현예에서, 클로라이드 염은 NaCl이다.
소정의 예시적인 구현예에서, 계면활성제는 폴록사머이다. 소정의 예시적인 구현예에서, 폴록사머는 폴록사머 101(P101), 폴록사머 105(P105), 폴록사머 108(P108), 폴록사머 122(P122), 폴록사머 123(P123), 폴록사머 124(P124), 폴록사머 181(P181), 폴록사머 182(P182), 폴록사머 183(P183), 폴록사머 184(P184), 폴록사머 185(P185), 폴록사머 188(P188), 폴록사머 212(P212), 폴록사머 215(P215), 폴록사머 217(P217), 폴록사머 231(P231), 폴록사머 234(P234), 폴록사머 235(P235), 폴록사머 237(P237), 폴록사머 238(P238), 폴록사머 282(P282), 폴록사머 284(P284), 폴록사머 288(P288), 폴록사머 331(P331), 폴록사머 333(P333), 폴록사머 334(P334), 폴록사머 335(P335), 폴록사머 338(P338), 폴록사머 401(P401), 폴록사머 402(P402), 폴록사머 403(P403), 폴록사머 407(P407), 및 이의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 소정의 예시적인 구현예에서, 폴록사머는 폴록사머 188(P188)이다. 소정의 예시적인 구현예에서, 폴록사머는 폴록사머 407(P407)이다.
소정의 예시적인 구현예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트이다. 소정의 예시적인 구현예에서, 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60, 폴리소르베이트 80, 및 이의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 소정의 예시적인 구현예에서, 계면활성제의 농도는 약 0.01%(w/v) 내지 약 0.1%(w/v)이다. 소정의 예시적인 구현예에서, 계면활성제의 농도는 약 0.03%(w/v), 약 0.05%(w/v), 약 0.07%(w/v), 또는 약 0.09%(w/v)이다.
소정의 예시적인 구현예에서, 탄수화물의 농도는 약 0.5%(w/v) 내지 약 5%(w/v)이다. 소정의 예시적인 구현예에서, 탄수화물의 농도는 약 1%(w/v), 약 2%(w/v), 약 3%(w/v), 또는 약 4%(w/v)이다. 소정의 예시적인 구현예에서, 탄수화물은 수크로스이다.
소정의 예시적인 구현예에서, 조제물은 (a) 치료 유효 용량의 재조합 렌티바이러스 벡터; (b) 약 10 mM 포스페이트; (c) 약 100 mM 염화나트륨; (d) 약 0.05%(w/v) 폴록사머 188; 및 (e) 약 3%(w/v) 수크로스를 포함하며, 조제물의 pH는 약 7.3이고, 약학 조성물은 인간 환자에 대한 전신 투여에 적합하다.
소정의 예시적인 구현예에서, 조제물은 (a) 치료 유효 용량의 재조합 렌티바이러스 벡터; (b) 약 10 mM 포스페이트; (c) 약 130 mM 염화나트륨; (d) 약 0.05%(w/v) 폴록사머 188; 및 (e) 약 1%(w/v) 수크로스를 포함하며, 조제물의 pH는 약 7.3이고, 약학 조성물은 인간 환자에 대한 전신 투여에 적합하다.
소정의 예시적인 구현예에서, 조제물은 (a) 치료 유효 용량의 재조합 렌티바이러스 벡터; (b) 약 20 mM 히스티딘; (c) 약 100 mM 염화나트륨; (d) 약 0.05%(w/v) 폴록사머 188; 및 (e) 약 3%(w/v) 수크로스를 포함하며, 조제물의 pH는 약 6.5이고, 약학 조성물은 인간 환자에 대한 전신 투여에 적합하다.
소정의 예시적인 구현예에서, 조제물은 (a) 치료 유효 용량의 재조합 렌티바이러스 벡터; (b) 약 10 mM 포스페이트; (c) 약 100 mM 염화나트륨; (d) 약 0.05%(w/v) 폴록사머 188; 및 (e) 약 3%(w/v) 수크로스를 포함하며, 조제물의 pH는 약 7.0이고, 약학 조성물은 인간 환자에 대한 전신 투여에 적합하다.
소정의 예시적인 구현예에서, 조제물은 (a) 치료 유효 용량의 재조합 렌티바이러스 벡터; (b) 약 20 mM 히스티딘; (c) 약 100 mM 염화나트륨; (d) 약 0.05%(w/v) 폴록사머 188; 및 (e) 약 3%(w/v) 수크로스를 포함하며, 조제물의 pH는 약 7.0이고, 약학 조성물은 인간 환자에 대한 전신 투여에 적합하다.
소정의 예시적인 구현예에서, 재조합 렌티바이러스 벡터는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 나타낸 인자 VIII(FVIII) 코딩 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 재조합 렌티바이러스 벡터는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 나타낸 인자 VIII(FVIII) 코딩 서열을 포함하는 핵산을 포함한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 재조합 렌티바이러스 벡터는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 나타낸 인자 VIII(FVIII) 코딩 서열로 구성되는 핵산을 포함한다.
소정의 예시적인 구현예에서, 재조합 렌티바이러스 벡터는 SEQ ID NO: 3에 나타낸 인자 IX(FIX) 코딩 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 재조합 렌티바이러스 벡터는 SEQ ID NO: 3에 나타낸 인자 IX(FIX) 코딩 서열을 포함하는 핵산을 포함한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 재조합 렌티바이러스 벡터는 SEQ ID NO: 3에 나타낸 인자 IX(FIX) 코딩 서열로 구성되는 핵산을 포함한다.
소정의 예시적인 구현예에서, 재조합 렌티바이러스 벡터는 강화된 트랜스티레틴(ET) 프로모터를 포함한다.
소정의 예시적인 구현예에서, 재조합 렌티바이러스 벡터는 SEQ ID NO: 7에 나타낸 miR-142에 대한 표적 서열과 적어도 90% 동일한 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.
소정의 예시적인 구현예에서, 재조합 렌티바이러스 벡터는 CHO 세포, HEK293 세포, BHK21 세포, PER.C6 세포, NSO 세포, 및 CAP 세포의 군으로부터 선택되는 전달감염된 숙주 세포로부터 단리된다. 소정의 예시적인 구현예에서, 숙주 세포는 CD47-양성 숙주 세포이다.
다른 양태에서, 장애를 갖는 인간 환자를 치료하는 방법으로서, 본원에서 기재된 재조합 렌티바이러스 벡터 조제물을 인간 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법이 제공된다.
소정의 예시적인 구현예에서, 조제물은 인간 환자에게 전신 투여된다. 소정의 예시적인 구현예에서, 조제물은 정맥내 투여된다.
소정의 예시적인 구현예에서, 장애는 출혈 장애이다. 소정의 예시적인 구현예에서, 출혈 장애는 혈우병 A 또는 혈우병 B이다.
본 발명의 상기 및 다른 특징 및 이점은 첨부 도면과 함께 아래의 예시적인 구현예의 상세한 설명으로부터 보다 충분히 이해될 것이다. 특허 또는 출원 파일은 컬러로 제작된 적어도 하나의 도면을 포함한다. 컬러 도면(들)을 갖는 본 특허 또는 특허 출원 공보의 사본은 요청 및 필요한 요금 납부 시 해당 관청에 의해 제공될 것이다.
도 1은 비히클 포스페이트(10 mM 포스페이트, 100 mM NaCl, 3%(w/v) 수크로스, 0.05%(w/v) P188, pH 7.3) 내로의 가공 시 렌티바이러스 벡터(LV) 제형의 특성규명을 도시한다. 원료 의약품(DS) 풀은 명확한 단량체성 피크를 나타내며, 이는 최종 비히클 완충액(접선류 여과 - TFF 후) 내로의 초여과/투석여과 후 더 큰 크기로 약간 이동하고 일부 더 큰 입자가 존재한다. 이론에 구애받고자 하지 않으면서, 이는 물질의 가공 스트레스 동안 입자의 물리적 분해에 기인할 수 있다. 최종 DP는 0.22 μm 크기의 여과막을 통해 여과되었고 프로필은 가공 시작 시 DS 풀과 다시 일치한다. TFF 스트레스의 효과는 도 2a 및 도 2b에 나타낸 사진에서 시각적으로 확인될 수 있다.
도 2a 및 도 2b는 접선류 여과(TFF) 후 비히클 포스페이트(10 mM 포스페이트, 100 mM NaCl, 3%(w/v) 수크로스, 0.05%(w/v) P188, pH 7.3) 중(도 2a) 및 최종 원료 의약품(DS) 풀 중(도 2b) 렌티바이러스 벡터(LV)에 대한 살균 여과 효과를 도시한다.
도 3a 및 도 3b는 p24 ELISA를 사용하여 p24 농도에 의해 측정된 바와 같은, 1%(w/v) P188을 첨가하지 않은(도 3a) 및 1%(w/v) P188을 첨가한(도 3b) 비히클 TSSM(20 mM TRIS, 100 mM NaCl, 1%(w/v) 수크로스, 1%(w/v) 만니톨, pH 7.3) 중 렌티바이러스 벡터(LV)의 안정성을 도시한다.
도 4는 NanoSight를 사용하여 입자 농도 및 입자 크기에 의해 측정된 바와 같은, 아지테이션 시 비히클 TSSM(20 mM TRIS, 100 mM NaCl, 1%(w/v) 수크로스, 1%(w/v) 만니톨, pH 7.3) 중 렌티바이러스 벡터(LV)의 안정성을 도시한다. TSSM 제형을 사용하는 안정성 연구: 폴록소머 188(P188)을 포함시키거나 포함시키지 않고 나타낸 바와 같은, 20 mM Tris, 100 mM NaCl, 1%(w/v) 수크로스, 1%(w/v) 만니톨, pH 7.3. 측정은 NanoSight를 사용하여 수행하였다.
도 5a 및 도 5b는 NanoSight를 사용하여 입자 농도 및 입자 크기에 의해 측정된 바와 같은, 아지테이션 시 비히클 TSSM(20 mM TRIS, 100 mM NaCl, 1%(w/v) 수크로스, 1%(w/v) 만니톨, pH 7.3) 중 렌티바이러스 벡터(LV)의 안정성을 도시한다. 도 5a는 아지테이션 스트레스 시 렌티바이러스 입자의 크기가 약간 성장하는 것만 보임을 나타낸다. 메인 피크는 단량체성 렌티바이러스 벡터(약 130 nm)로 추정되며 더 작거나 더 큰 피크는 단량체성 입자의 분해일 수 있다. 도 5b는 1%(w/v) 폴록사머 188(P188)의 첨가가 렌티바이러스 입자를 방해하지 않았음을 나타낸다.
도 6a 및 도 6b는 ddPCR을 사용하여 TU/ml(도 6a) 및 T0의 %(도 6b)로 기능적 역가에 의해 측정된 바와 같은, 0일, 3일, 7일, 및 14일에 걸친 37℃에서 비히클 TSSM(20 mM TRIS, 100 mM NaCl, 1%(w/v) 수크로스, 1%(w/v) 만니톨, pH 7.3) 중 렌티바이러스 벡터(LV)의 안정성을 나타낸다. 도 6b는 시간 0에 대해 표준화된다. 각 군의 막대는 하기 일련의 희석을 나타낸다: 미희석(희석 없음), 20배 희석(20x), 100배 희석(100x).
도 7a 및 도 7b는 NanoSight를 사용하여 ddPCR 및 입자 농도를 사용하는 기능적 역가(TU/ml 단위)(도 7a) 또는 p24 데이터가 오버레이된 기능적 역가(도 7b)에 의해 측정된 바와 같은, 0일, 3일, 7일, 및 14일에 걸친 37℃에서 비히클 TSSM(20 mM TRIS, 100 mM NaCl, 1%(w/v) 수크로스, 1%(w/v) 만니톨, pH 7.3) 중 렌티바이러스 벡터(LV)의 안정성을 도시한다.
도 8a 및 도 8b. 도 8a는 NanoSight를 사용하여 입자 농도 및 입자 크기에 의해 측정된 바와 같은, 인큐베이션 시간(일 및 주 단위)의 함수로서 37℃에서 비히클 TSSM(20 mM TRIS, 100 mM NaCl, 1%(w/v) 수크로스, 1%(w/v) 만니톨, pH 7.3) 중 렌티바이러스 벡터(LV)의 안정성을 도시한다. 도 8b는 시간 경과에 따른 입자 크기 차이를 보다 명확히 확인하기 위한 log 척도 상 37℃ 안정성 실험의 결과를 보고하는 것이다.
도 9는 ddPCR을 사용하는 T0의 % 및 p24 ELISA를 사용하는 p24 농도로 기능적 역가에 의해 측정된 바와 같은, 인큐베이션 시간, 인큐베이션 온도, 아지테이션, 및 냉동/해동(F/T) 주기(일 단위)의 함수로서, 비히클 포스페이트 제형(10 mM 포스페이트, 100 mM NaCl, 3%(w/v) 수크로스, 0.05%(w/v) P188, pH 7.3) 중 렌티바이러스 벡터(LV)의 안정성을 도시한다.
도 10a 및 도 10b는 NanoSight를 사용하여 입자 농도 및 입자 크기 분포에 의해 측정된 바와 같은, 시간(일 단위)의 함수로서 포스페이트 제형(10 mM 포스페이트, 100 mM NaCl, 3%(w/v) 수크로스, 0.05%(w/v) P188, pH 7.3)을 사용하는 37℃에서 렌티바이러스 벡터(LV)의 안정성을 도시한다. 도 10a는 분해 피크의 차이를 보다 가시적으로 만들기 위해 1에 대해 표준화되는 NanoSight 데이터의 보고이다. 도 10b는 37℃ 인큐베이션에서 시간 경과에 따른 단량체성 피크의 감소를 나타내는 미가공 데이터를 제시한다.
도 11a 및 도 11b는 ddPCR을 사용하는 기능적 역가에 의해 측정된 바와 같은, 5 및 10주기의 냉동 및 해동(F/T)에 걸쳐 비교하는(도 11a), 그리고 실온(RT) 및 아지테이션(궤도 진탕기, 350 rpm)을 포함하는 RT에서의 3일을 비교하는(도 11b) 렌티바이러스 벡터(LV)의 안정성을 도시한다: 제형 1. 포스페이트 제형: 10 mM 포스페이트, 100 mM NaCl, 3%(w/v) 수크로스, 0.05%(w/v) P188, pH 7.3; 제형 2. 10 mM 포스페이트, 130 mM NaCl, 1%(w/v) 수크로스, 0.05%(w/v) P188, pH 7.3; 제형 3. 20 mM 히스티딘, 100 mM NaCl, 3%(w/v) 수크로스, 0.05%(w/v) P188, pH 6.5.
도 12a 및 도 12b는 NanoSight를 사용하여 입자수에 의해 측정된 바와 같은, 하기 3개 제형을 비교하는 렌티바이러스 벡터(LV)의 안정성을 도시한다): 제형 1(Phos). 포스페이트 제형: 10 mM 포스페이트, 100 mM NaCl, 3%(w/v) 수크로스, 0.05%(w/v) P188, pH 7.3; 제형 2(Phos. 고염). 10 mM 포스페이트, 130 mM NaCl, 1%(w/v) 수크로스, 0.05%(w/v) P188, pH 7.3; 제형 3(Hist). 20 mM 히스티딘, 100 mM NaCl, 3%(w/v) 수크로스, 0.05%(w/v) P188, pH 6.5. 도 12a는 실온(RT) 및 아지테이션(궤도 진탕기, 350 rpm)을 포함하는 RT에서의 3일 데이터를 나타내는 반면, 도 12b는 5 및 10주기의 냉동 및 해동(F/T)에 대한 데이터를 나타낸다.
도 13은 IV 백에 노출된 실온에서 6시간에 걸친 하나의 제형을 이용한 모의(mock) 사용-중 안정성 연구를 도시한다: 제형 1(포스페이트 완충액): 10 mM 포스페이트, 100 mM NaCl, 3%(w/v) 수크로스, 0.05%(w/v) P188, pH 7.3.
도 14는 1회 냉동 및 해동 주기(-80℃ 하룻밤 동안, 37℃ 수조에서 해동)에 걸친 용기 폐쇄(Schott 유형 1 유리 바이알 및 West CZ COP 바이알) 성능을 비교하는 제형 완충액 안정성 연구를 도시한다: 제형 1(포스페이트 완충액): 10 mM 포스페이트, 100 mM NaCl, 3%(w/v) 수크로스, 0.05%(w/v) P188, pH 7.3. 입자 농도는 Microflow Imaging(MFI)을 사용하여 수득하였다.
도 15는 1회 냉동 및 해동 주기(-80℃, 37℃ 수조에서 해동)에 걸쳐 Schott 유형 1 유리 바이알을 사용하는 바이알 변형 연구를 도시한다: 제형 1(포스페이트 완충액 단독): 10 mM 포스페이트, 100 mM NaCl, 3%(w/v) 수크로스, 0.05%(w/v) P188, pH 7.3. 데이터를 변형 거즈 및 열전쌍을 사용하여 수집하였다.
도 16a 내지 도 16c는 다양한 안정성 조건에 걸쳐 용기 폐쇄(Schott 유형 1 유리 바이알 및 West CZ 바이알) 성능을 비교하는 LVV 물질 상용성을 도시하며, 1FT = 1 주기의 냉동 및 해동; 2 hr = 실온에 대한 2 hr 노출; 3x 발포는 용기에서 가시적인 발포를 생성하는 피펫으로부터의 공격적 흡인 및 분배이고; 10x는 10배 희석에서의 동일한 안정성 파라미터이다. LVV는 기능적 역가(도 16a), p24 농도(도 16b), 및 입자 농도(도 16c)에 의해 측정된 바와 같은, 제형 1(포스페이트 완충액): 10 mM 포스페이트, 100 mM NaCl, 3%(w/v) 수크로스, 0.05%(w/v) P188, pH 7.3 중에 있었다. 데이터를 변형 거즈 및 열전쌍을 사용하여 수집하였다. 입자 농도는 NanoSight를 사용하여 수득하였다.
도 17은 10주기의 냉동 및 해동(F/T)에 걸쳐 2개 제형을 비교하고 실온(RT)에서의 1일 및 3일을 비교하는 안정성 연구를 도시한다: 제형 1(포스페이트 완충액): 10 mM 포스페이트, 100 mM NaCl, 3%(w/v) 수크로스, 0.05%(w/v) P188, pH 7.3; 제형 3(히스티딘 완충액). 20 mM 히스티딘, 100 mM NaCl, 3%(w/v) 수크로스, 0.05%(w/v) P188, pH 6.5.
도 18은 포스페이트 및 히스티딘 제형에 대한 장기 안정성(-80℃에서 냉동 보관된 9개월 시점(9 mo.)) 데이터를 도시한다: 제형 1(포스페이트): 10 mM 포스페이트, 100 mM NaCl, 3%(w/v) 수크로스, 0.05%(w/v) P188, pH 7.3; 제형 3(히스티딘). 20 mM 히스티딘, 100 mM NaCl, 3%(w/v) 수크로스, 0.05%(w/v) P188, pH 6.5.
도 19a 내지 도 19d는 기능적 역가(도 19a), 표준화된 기능적 역가(도 19b), p24 농도(도 19c), 및 입자 농도(도 19d)에 의해 측정된 바와 같은, 동일한 pH, 7.0에서 포스페이트 및 히스티딘 완충액을 비교하는 안정성 연구를 도시한다: 제형 4(포스페이트): 10 mM 포스페이트, 100 mM NaCl, 3%(w/v) 수크로스, 0.05%(w/v) P188, pH 7.0; 제형 5(히스티딘). 20 mM 히스티딘, 100 mM NaCl, 3%(w/v) 수크로스, 0.05%(w/v) P188, pH 7.0. 결과는 기능적 역가 단위로 나타내며 출발 물질(T0)의 백분율로서 표준화된다. 입자 농도는 NanoSight를 사용하여 수득하였다.
본 개시는, 특히, 재조합 렌티바이러스 벡터(LV)를 포함하는 LV의 조제물(제형) 및 약학 조성물을 제공한다. 본 개시는 또한 LV 조제물을 사용하여, 출혈 장애, 예컨대 혈우병 A 또는 혈우병 B를 포함하는 장애를 갖는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 본 개시는 LV 조제물을 생성하는 공정을 추가로 제공한다.
일반적으로, 본원에서 기재된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 생물리학, 면역학, 미생물학, 유전학, 그리고 단백질 및 핵산 화학과 관련하여 사용되는 명명법은 당분야에 잘 공지되어 있고 일반적으로 사용된다. 본원에서 제공된 방법 및 기법은 일반적으로, 달리 지시되지 않는 한 본 명세서 전체에 걸쳐 인용 및 논의되는 다양한 일반적이고 보다 구체적인 참고문헌에 기재된 바와 같이, 그리고 당분야에 잘 공지된 통상적인 방법에 따라 수행된다. 효소 반응 및 정제 기법은 당분야에서 일반적으로 성취되는 바와 같거나 본원에 설명된 바와 같이 제조업자의 사양에 따라 수행된다. 본원에서 기재된 분석 화학, 합성 유기 화학, 그리고 의약 및 약학 화학과 관련하여 이용되는 명명법 및 이의 실험실 절차 및 기법은 당분야에서 잘 공지되어 있고 일반적으로 사용된다. 화학 합성, 화학 분석, 약학 조제, 제형화 및 전달, 그리고 환자의 치료를 위한 표준 기법이 사용된다.
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 과학 및 기술 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 임의의 잠재적인 모호성이 있는 경우, 본원에 제공된 정의가 임의의 사전 또는 외부 정의보다 우선한다. 맥락상 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함하고 복수 용어는 단수를 포함한다. "또는"의 사용은 달리 언급하지 않는 한, "및/또는"을 의미한다. 용어 "포함하는"과, "포함하다" 및 "포함하였다"와 같은 다른 형태의 사용은 제한적이지 않다.
본 발명을 보다 쉽게 이해할 수 있도록, 소정 용어가 우선 정의된다.
본원에서 사용되는 용어 "벡터"는 숙주 세포로의 핵산의 전달 및/또는 클로닝을 위한 임의의 비히클을 나타낸다. 벡터는 부착된 절편의 복제를 일으키기 위해 다른 핵산 절편이 부착될 수 있는 레플리콘일 수 있다. "레플리콘"은 생체내 복제의 자율 단위로서 기능을 하는, 즉 그 자체의 제어 하에서 복제할 수 있는 임의의 유전 요소(예를 들어, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 나타낸다. 용어 "벡터"는 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내 세포로 핵산을 도입하기 위한 바이러스 비히클 및 비바이러스 비히클 둘 모두를 포함한다. 많은 수의 벡터는 당분야에서 공지되고 사용되며, 이는 예를 들어 플라스미드, 변형된 진핵생물 바이러스 또는 변형된 박테리아 바이러스를 포함한다. 적합한 벡터로의 폴리뉴클레오티드의 삽입은 상보성 응착성 말단을 갖는 선택된 벡터로 적절한 폴리뉴클레오티드 단편을 결찰함으로써 달성될 수 있다.
본원에서 사용된 어구 "재조합 렌티바이러스 벡터"는 패키징 구성요소의 존재 하에서, 표적 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스 입자로 RNA 게놈의 패키징을 허용하는 충분한 렌티바이러스 유전 정보를 갖는 벡터를 나타낸다. 표적 세포의 감염은 역전사 및 표적 세포 게놈 내로의 통합을 포함할 수 있다. 재조합 렌티바이러스 벡터는 벡터에 의해 표적 세포로 전달될 비-바이러스 코딩 서열을 운반한다. 재조합 렌티바이러스 벡터는 최종 표적 세포 내에서 감염성 렌티바이러스 입자를 생성하기 위한 독립적 복제가 불가능하다. 보통 재조합 렌티바이러스 벡터에는 기능적 gag-pol 및/또는 env 유전자 및/또는 복제에 필수적인 다른 유전자가 결여되어 있다. 본 발명의 벡터는 분할-인트론 벡터로 구성될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "치료한다"는 장애의 하나 이상의 증상의 완화 또는 감소를 나타낸다. 치료가 반드시 근치일 필요는 없다.
본원에서 사용되는 용어 "인간 환자"는 질환 또는 장애를 갖고 있으며 상기 질환 또는 장애에 대한 치료를 필요로 하는 인간을 나타낸다.
본원에서 사용되는 어구 "전신 투여한다"는 LV가 대상체의 혈류 내로 직접 도입되도록 하는, 대상체에 대한 LV를 포함하는 약학 조성물의 처방 또는 제공을 나타낸다. 전신 투여 경로의 예는 비제한적으로 정맥내, 예를 들어, 중추 정맥 접근을 통한, 예를 들어, 정맥내 주입 및 정맥내 주사를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "약"은, 인용된 특정 수치를 참조하여 사용되는 경우, 당해 값이 인용된 값으로부터 10% 이하로 변할 수 있음을 의미한다. 예를 들면, 본원에서 사용되는 표현 "약 100"은, 90 및 110 그리고 이들 사이의 모든 값(예를 들면, 90, 91, 92, 93, 94, 95 등)을 포함한다.
A. TRIS-비함유 완충 시스템을 포함하는 렌티바이러스 벡터(LV) 제형
하나의 양태에서, 본 발명은(a) 유효 용량의 재조합 렌티바이러스 벡터; (b) TRIS-비함유 완충 시스템; (c) 염; (d) 계면활성제; 및 (e) 탄수화물을 포함하는 재조합 렌티바이러스 벡터 조제물에 대한 것이며, 약학 조성물은 인간 환자에 대한 전신 투여에 적합하다. 소정 구현예에서, 벡터는 VSV-G를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편을 포함한다. 소정 구현예에서, 완충 시스템의 pH는 약 6.0 내지 약 8.0이다. 소정 구현예에서, 완충 시스템의 pH는 약 6.0 내지 약 7.5이다. 소정 구현예에서, 완충 시스템의 pH는 약 6.0 내지 약 7.0이다. 소정 구현예에서, 완충 시스템의 pH는 약 6.0 내지 약 8.0이다. 소정 구현예에서, 완충 시스템의 pH는 약 6.5이다. 소정 구현예에서, 완충 시스템의 pH는 약 7.3이다. 소정 구현예에서, 완충 시스템은 포스페이트 완충액 또는 히스티딘 완충액이다. 소정 구현예에서, 포스페이트 또는 히스티딘 완충액의 농도는 약 5 mM 내지 약 30 mM이다. 소정 구현예에서, 포스페이트 완충액의 농도는 약 10 mM 내지 약 20 mM, 약 10 mM 내지 약 15 mM, 약 20 mM 내지 약 30 mM, 약 20 mM 내지 약 25 mM, 또는 약 15 mM 내지 약 20 mM이다. 소정 구현예에서, 염은 클로라이드 염이다. 소정 구현예에서, 클로라이드 염의 농도는 약 80 mM 내지 약 150 mM이다. 소정 구현예에서, 염의 농도는 약 100 mM, 약 110 mM, 약 130 mM, 또는 약 150 mM이다. 소정 구현예에서, 계면활성제는 폴록사머 또는 폴리소르베이트이다. 소정 구현예에서, 폴록사머 또는 폴리소르베이트의 농도는 약 0.01%(w/v) 내지 약 0.1%(w/v)이다. 소정 구현예에서, 탄수화물은 수크로스이다. 소정 구현예에서, 탄수화물의 농도는 약 0.5%(w/v) 내지 약 5%(w/v)이다. 소정 구현예에서, 클로라이드 염은 염화나트륨(NaCl)이다. 소정 구현예에서, 폴록사머는 폴록사머 101(P101), 폴록사머 105(P105), 폴록사머 108(P108), 폴록사머 122(P122), 폴록사머 123(P123), 폴록사머 124(P124), 폴록사머 181(P181), 폴록사머 182(P182), 폴록사머 183(P183), 폴록사머 184(P184), 폴록사머 185(P185), 폴록사머 188(P188), 폴록사머 212(P212), 폴록사머 215(P215), 폴록사머 217(P217), 폴록사머 231(P231), 폴록사머 234(P234), 폴록사머 235(P235), 폴록사머 237(P237), 폴록사머 238(P238), 폴록사머 282(P282), 폴록사머 284(P284), 폴록사머 288(P288), 폴록사머 331(P331), 폴록사머 333(P333), 폴록사머 334(P334), 폴록사머 335(P335), 폴록사머 338(P338), 폴록사머 401(P401), 폴록사머 402(P402), 폴록사머 403(P403), 폴록사머 407(P407), 및 이의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 소정 구현예에서, 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60, 폴리소르베이트 80, 및 이의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 소정 구현예에서, 포스페이트 또는 히스티딘 완충액의 pH는 약 6.1, 약 6.3, 약 6.5, 약 6.7, 약 6.9, 약 7.1, 약 7.3, 약 7.5, 약 7.7 또는 약 7.9이다. 소정 구현예에서, 포스페이트 또는 히스티딘 완충액의 농도는 약 10 mM, 약 15 mM, 약 20 mM, 또는 약 25 mM이다. 소정 구현예에서, 클로라이드 염은 약 100 mM, 약 110 mM, 약 130 mM, 또는 약 150 mM이다. 소정 구현예에서, 폴록사머 또는 폴리소르베이트의 농도는 약 0.03%(w/v), 약 0.05%(w/v), 약 0.07%(w/v), 또는 약 0.09%(w/v)이다. 소정 구현예에서, 탄수화물의 농도는 약 1%(w/v), 약 2%(w/v), 약 3%(w/v), 또는 약 4%(w/v)이다. 소정 구현예에서, 폴록사머는 폴록사머 188(P188)이다. 소정 구현예에서, 폴록사머는 폴록사머 407(P407)이다.
소정 구현예에서, 본 개시는 (a) 치료 유효 용량의 재조합 렌티바이러스 벡터; (b) 약 10 mM 포스페이트; (c) 약 100 mM 염화나트륨; (d) 약 0.05%(w/v) 폴록사머 188; 및 (e) 약 3%(w/v) 수크로스를 포함하는 재조합 렌티바이러스 벡터 조제물을 제공하며, 조제물의 pH는 약 7.3이고, 약학 조성물은 인간 환자에 대한 전신 투여에 적합하다.
소정 구현예에서, 본 개시는 (a) 치료 유효 용량의 재조합 렌티바이러스 벡터; (b) 약 10 mM 포스페이트; (c) 약 130 mM 염화나트륨; (d) 약 0.05%(w/v) 폴록사머 188; 및 (e) 약 1%(w/v) 수크로스를 포함하는 재조합 렌티바이러스 벡터 조제물을 제공하며, 조제물의 pH는 약 7.3이고, 약학 조성물은 인간 환자에 대한 전신 투여에 적합하다.
소정 구현예에서, 본 개시는 (a) 치료 유효 용량의 재조합 렌티바이러스 벡터; (b) 약 20 mM 히스티딘; (c) 약 100 mM 염화나트륨; (d) 약 0.05%(w/v) 폴록사머 188; 및 (e) 약 3%(w/v) 수크로스를 포함하는 재조합 렌티바이러스 벡터 조제물을 제공하며, 조제물의 pH는 약 6.5이고, 약학 조성물은 인간 환자에 대한 전신 투여에 적합하다.
소정 구현예에서, 본 개시는 (a) 치료 유효 용량의 재조합 렌티바이러스 벡터; (b) 약 10 mM 포스페이트; (c) 약 100 mM 염화나트륨; (d) 약 0.05%(w/v) 폴록사머 188; 및 (e) 약 3%(w/v) 수크로스를 포함하는 재조합 렌티바이러스 벡터 조제물을 제공하며, 조제물의 pH는 약 7.0이고, 약학 조성물은 인간 환자에 대한 전신 투여에 적합하다.
소정 구현예에서, 본 개시는 (a) 치료 유효 용량의 재조합 렌티바이러스 벡터; (b) 약 20 mM 히스티딘; (c) 약 100 mM 염화나트륨; (d) 약 0.05%(w/v) 폴록사머 188; 및 (e) 약 3%(w/v) 수크로스를 포함하는 재조합 렌티바이러스 벡터 조제물을 제공하며, 조제물의 pH는 약 7.0이고, 약학 조성물은 인간 환자에 대한 전신 투여에 적합하다.
A.1. 렌티바이러스 벡터
렌티바이러스 벡터는 더 큰 레트로바이러스 벡터 그룹의 일부이다(Coffin et al. (1997) "Retroviruses" Cold Spring Harbor Laboratory Press Eds: J M Coffin, S M Hughes, H E Varmus pp 758-763). 영장류 렌티바이러스의 예는 하기를 포함한다: 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 및 유인원 면역결핍 바이러스(SIV). 렌티바이러스 패밀리는 렌티바이러스가 분열 및 비-분열 세포 둘 모두를 감염시키는 능력을 갖는다는 점에서 레트로바이러스와 다르다(Lewis et al. (1992); Lewis and Emerman (1994)).
본원에서 사용된 바와 같은 렌티바이러스 벡터는 렌티바이러스로부터 유도 가능한 적어도 하나의 구성요소를 포함하는 벡터이다. 바람직하게는, 그 구성요소 부분은 벡터가 세포를 감염시키거나, 유전자를 발현하거나, 복제되는 생물학적 기전에 관여된다. 재조합 렌티바이러스 벡터에서 복제를 위해 필수적인 하나 이상의 단백질 코딩 영역 중 적어도 일부는 바이러스로부터 제거될 수 있다. 이는 바이러스 벡터를 복제-결함으로 만든다. 바이러스 게놈의 일부가 또한 트랜스유전자로 대체되며, 이에 따라 벡터가 표적 비-분열 숙주 세포를 형질도입시킬 수 있고/있거나 그 게놈을 숙주 게놈 내로 통합시킬 수 있도록 한다.
재조합 렌티바이러스는 보통 위유형화된다(pseudotyped). 위유형화는 하나 이상의 장점을 부여할 수 있다. 예를 들어, HIV 기반 벡터의 env 유전자 산물은 이들 벡터가 CD4로 불리는 단백질을 발현하는 세포만 감염시키도록 제한할 것이다. 그러나 이들 벡터에서 env 유전자가 다른 RNA 바이러스로부터의 env 서열로 치환된 경우, 이들은 더 넓은 감염 스펙트럼을 가질 수 있다(Verma and Somia (1997)). 랩도바이러스인 수포성 구내염 바이러스(VSV)의 외피 당단백질(G)은 소정 레트로바이러스를 위유형화할 수 있는 것으로 나타난 외피 단백질이다. 위유형화된 VSV-G 벡터는 광범위한 포유류 세포를 형질도입시키기 위해 사용될 수 있다. 비-렌티바이러스 위유형화 외피, 예컨대 VSV-G 단백질의 혼입은 벡터 입자가 감염성 손실 없이 높은 역가로 농축될 수 있다는 장점을 제공한다(Akkina et al. (1996) J. Virol. 70:2581-5). 렌티바이러스 및 레트로바이러스 외피 단백질은 아마도 이들이 2개의 비-공유 연결된 서브유닛으로 구성되므로, 초여과 동안 명백하게 전단력을 견딜 수 없다. 서브유닛 간 상호작용은 원심분리에 의해 손상될 수 있다. 대조적으로 VSV 당단백질은 단일 단위로 이루어진다. 따라서 VSV-G 단백질 위유형화는 잠재적 장점을 제공할 수 있다.
렌티바이러스는 소 렌티바이러스 그룹, 말 렌티바이러스 그룹, 고양이 렌티바이러스 그룹, 양, 염소 렌티바이러스 그룹 및 영장류 렌티바이러스 그룹의 구성원을 포함한다. 유전자 치료법을 위한 렌티바이러스 벡터의 개발은 문헌[Klimatcheva et al. (1999) Frontiers in Bioscience 4:481-496]에 개관되어 있다. 유전자 치료법에 적합한 렌티바이러스 벡터의 설계 및 사용은 예를 들어 미국 특허 제6,207,455호 및 제6,615,782호에 기재되어 있다. 렌티바이러스의 예는 HIV-1, HIV-2, HIV-1/HIV-2 슈도형, HIV-1/SIV, FIV, 염소 관절염 뇌염 바이러스(CAEV), 말 감염성 빈혈 바이러스, 및 소 면역결핍 바이러스를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 본 개시의 렌티바이러스 벡터는 "3세대" 렌티바이러스 벡터이다. 본원에서 사용되는 용어 "3세대" 렌티바이러스 벡터는 2세대 벡터 시스템의 특성을 갖고, 기능성 tat 유전자가 추가로 결여된 렌티바이러스 패키징 시스템, 예컨대, tat 유전자가 결실되거나 불활성화된 것을 나타낸다. 전형적으로 rev를 인코딩하는 유전자는 별개의 발현 작제물 상에 제공된다. 예를 들어, 문헌[Dull et al. (1998) J. Virol. 72: 8463-8471]을 참고한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "2세대" 렌티바이러스 벡터 시스템은 기능성 보조 유전자가 결여된 렌티바이러스 패키징 시스템, 예컨대 보조 유전자 vif, vpr, vpu 및 nef가 결실되거나 불활성화된 것을 나타낸다. 예를 들어, 문헌[Zufferey et al. (1997) Nat. Biotechnol. 15:871-875]을 참고한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "패키징 시스템"은 재조합 바이러스 패키징에 관여하는 바이러스 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함하는 바이러스 작제물 세트를 나타낸다. 전형적으로 패키징 시스템의 작제물은 궁극적으로 패키징 세포 내로 혼입될 것이다.
일부 구현예에서, 본 개시의 3세대 렌티바이러스 벡터는 자가 불활성화 렌티바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 VSV.G 위형 렌티바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 트랜스유전자 발현을 위한 간세포 특이적 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 간세포 특이적 프로모터는 강화된 트랜스티레틴 프로모터이다. 일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 트랜스유전자 산물에 대한 면역 반응을 감소시키기 위해 miR-142에 대한 하나 이상의 표적 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, miR-142에 대한 하나 이상의 표적 서열을 본 개시의 렌티바이러스 벡터 내로 혼입하는 것은 요망되는 트랜스유전자 발현 프로필을 허용한다. 예를 들어, miR-142에 대한 하나 이상의 표적 서열의 혼입은 혈관내 및 혈관외 조혈 계통에서 트랜스유전자 발현을 억제할 수 있는 반면, 비조혈 세포에서는 트랜스유전자 발현이 유지된다. 본 개시의 렌티바이러스 벡터 시스템으로 처리된 종양 취약 마우스에서는 종양발생이 검출되지 않았다. 문헌[Brown et al. (2007) Blood 110:4144-52, Brown at al. (2006) Nat. Ned. 12:585-91, 및 Cantore et al. (2015) Sci. Transl. Med. 7(277):277ra28]을 참고한다.
본 개시의 렌티바이러스 벡터는 특정 단백질, 예컨대 본원에서 기재된 FVIII 또는 FIX 단백질을 인코딩하는 트랜스유전자의 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 하나의 구현예에서, FVIII 또는 FIX 단백질에 대한 최적화된 코딩 서열은 발현 제어 서열에 작동 가능하게 연결된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 2개의 핵산 서열은 각 구성요소 핵산 서열이 그 기능을 유지하도록 하는 방식으로 공유적으로 연결되는 경우 작동 가능하게 연결된 것이다. 코딩 서열 및 유전자 발현 제어 서열은 이들이 코딩 서열의 발현 또는 전사 및/또는 번역을 유전자 발현 제어 서열의 영향 또는 제어 하에 두는 방식으로 공유적으로 연결되는 경우 작동 가능하게 연결된 것이라고 한다. 5' 유전자 발현 서열에서의 프로모터의 유도가 코딩 서열의 전사를 초래하는 경우 및 두 DNA 서열 간 연결의 성질이 (1) 프레임-이동 돌연변이의 도입을 초래하지 않거나, (2) 코딩 서열의 전사를 지시하는 프로모터 영역의 능력을 방해하지 않거나, (3) 상응하는 RNA 전사체가 단백질로 번역되는 능력을 방해하지 않는 경우 상기 두 DNA 서열은 작동 가능하게 연결된 것이라고 한다. 따라서, 생성된 전사체가 요망되는 단백질 또는 폴리펩티드로 번역되도록 유전자 발현 서열이 코딩 핵산 서열의 전사에 영향을 미칠 수 있는 경우 유전자 발현 서열은 코딩 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 것이다.
소정 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 비-분열 세포를 감염시킬 수 있는 재조합 렌티바이러스의 벡터이다. 소정 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 간 세포(예를 들어, 간세포)를 감염시킬 수 있는 재조합 렌티바이러스의 벡터이다. 렌티바이러스 게놈과 프로바이러스 DNA는 전형적으로 레트로바이러스에서 발견되는 3가지 유전자인 gag, pol 및 env를 가지며, 이들은 2개의 긴 말단 반복체(LTR) 서열이 측면에 있다. gag 유전자는 내부 구조(매트릭스, 캡시드 및 뉴클레오캡시드) 단백질을 인코딩하며; pol 유전자는 RNA-지시 DNA 폴리머라제(역전사효소), 프로테아제 및 인테그라제를 인코딩하고; env 유전자는 바이러스 외피 당단백질을 인코딩한다. 5’ 및 3' LTR은 비리온 RNA의 전사 및 폴리아데닐화를 촉진하는 역할을 한다. LTR은 바이러스 복제에 필요한 다른 모든 시스-작용 서열을 포함한다. 렌티바이러스는 vif, vpr, tat, rev, vpu, nef 및 vpx(HIV-l, HIV-2 및/또는 SIV에서)를 포함하는 추가 유전자를 갖는다.
5' LTR에 인접하여 게놈의 역전사에 필요한 서열(tRNA 프라이머 결합 부위) 및 바이러스 RNA의 입자로의 효율적인 캡시드화에 필요한 서열(Psi 부위)이 있다. 캡시드화(또는 레트로바이러스 RNA의 감염성 비리온으로의 패키징)에 필요한 서열이 바이러스 게놈에서 누락된 경우, 시스 결함으로 인해 게놈 RNA의 캡시드화가 방지된다.
그러나, 생성된 돌연변이체는 모든 비리온 단백질의 합성을 지시할 수 있는 상태로 남아 있다. 본 개시는 비-분열 세포를 감염시킬 수 있는 재조합 렌티바이러스를 생성하는 방법으로서, 패키징 기능, 즉 gag, pol 및 env와, rev 및 tat를 운반하는 2개 이상의 벡터로 적합한 숙주 세포를 형질감염시키는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다. 본원에서 아래에 개시될 바와 같이, 기능성 tat 유전자가 결여된 벡터가 소정 응용에 있어서 요망된다. 따라서, 예를 들어, 제1 벡터는 바이러스 gag 및 바이러스 pol을 인코딩하는 핵산을 제공할 수 있고 다른 벡터는 패키징 세포를 생산하기 위한 바이러스 env를 인코딩하는 핵산을 제공할 수 있다. 본원에서 전달 벡터로 확인되는, 이종성 유전자를 제공하는 벡터를 그 패키징 세포 내로 도입하면 관심 외래 유전자를 운반하는 감염성 바이러스 입자를 방출하는 생산체 세포가 생성된다.
상기에 나타낸 벡터 및 외래 유전자의 구성에 따르면, 제2 벡터는 바이러스 외피(env) 유전자를 인코딩하는 핵산을 제공할 수 있다. env 유전자는 레트로바이러스를 포함하여 거의 모든 적합한 바이러스로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, env 단백질은 인간 및 다른 종의 세포의 형질도입을 허용하는 양쪽성 외피 단백질이다.
레트로바이러스 유래 env 유전자의 예는 하기를 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 몰로니(Moloney) 쥣과 백혈병 바이러스(MoMuLV 또는 MMLV), 하비(Harvey) 쥣과 육종 바이러스(HaMuSV 또는 HSV), 쥣과 유방 종양 바이러스(MuMTV 또는 MMTV), 긴팔 원숭이 백혈병 바이러스(GaLV 또는 GALV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 및 라우스(Rous) 육종 바이러스(RSV). 다른 env 유전자, 예컨대 수포성 구내염 바이러스(VSV) 단백질 G(VSV-G), 간염 바이러스 및 인플루엔자의 유전자가 또한 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스 env 핵산 서열은 본원의 다른 곳에서 기재된 조절 서열과 작동 가능하게 연합된다. 소정 구현예에서, 본 개시의 제형 완충액은 렌티바이러스 안정성을 부여하며, 특히 VSV-G를 포함하는 렌티바이러스에 있어서, 장기 냉동 보관을 제공한다. 본 개시의 제형 완충액은, 특히 VSV-G를 포함하는 렌티바이러스에 있어서, 냉동 및 해동뿐만 아니라 승온에 노출될 시 강화된 렌티바이러스 안정성을 제공한다.
소정 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 비-분열 세포를 형질도입시키는 벡터의 능력을 손상시키지 않고 HIV 병독성 유전자 env, vif, vpr, vpu 및 nef가 결실된 것이다. 일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 3' LTR의 U3 영역의 결실을 포함한다. U3 영역의 결실은 완전 결실 또는 부분 결실일 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에서 기재된 FVIII 뉴클레오티드 서열을 포함하는 본 개시의 렌티바이러스 벡터는 (a) gag, pol, 또는 gag 및 pol 유전자를 포함하는 제1 뉴클레오티드 서열 및 (b) 이종성 env 유전자를 포함하는 제2 뉴클레오티드 서열로 세포를 형질감염시킬 수 있으며; 렌티바이러스 벡터는 기능성 tat 유전자가 결여되어 있다. 다른 구현예에서, 세포는 rev 유전자를 포함하는 제4 뉴클레오티드 서열로 추가로 형질감염된다. 소정 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 vif, vpr, vpu, vpx 및 nef, 또는 이의 조합으로부터 선택되는 기능성 유전자가 결여되어 있다.
소정 구현예에서, 본 개시의 렌티바이러스 벡터는 gag 단백질, Rev-반응 요소, 중앙 폴리퓨린 트랙(cPPT) 또는 이의 임의의 조합을 인코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 그의 표면 상에 렌티바이러스 벡터 또는 인코딩된 FVIII 폴리펩티드의 표적화 및/또는 활성을 개선하는 하나 이상의 폴리펩티드를 발현한다. 하나 이상의 폴리펩티드는 렌티바이러스 벡터에 의해 인코딩될 수 있거나 숙주 세포로부터 렌티바이러스 벡터의 발아(budding) 동안 혼입될 수 있다. 렌티바이러스 생성 동안, 바이러스 입자는 생산 숙주 세포로부터 발아되어 나온다. 발아 공정 동안, 바이러스 입자는 숙주 세포의 지질막으로부터 유래되는 지질 코트를 취한다. 그 결과, 바이러스 입자의 지질 코트는 이전에 숙주 세포의 표면 상에 존재했던 막 결합 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 인간 대상체에게 투여된 후 렌티바이러스 벡터에 대한 면역 반응을 억제하는 하나 이상의 폴리펩티드를 그의 표면 상에서 발현한다. 일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터의 표면은 하나 이상의 CD47 분자를 포함한다. CD47은 인간 세포 상에서 도처에서 발현되는 "자가 마커" 단백질이다. CD47의 표면 발현은 CD47과 대식구 발현-SIRPα의 상호작용을 통해 대식구-유도된, 내인성 세포의 식균작용을 억제한다. 높은 수준의 CD47을 발현하는 세포는 생체 내에서 인간 대식구에 의해 표적화되고 파괴될 가능성이 더 적다.
일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 그의 표면 상에 고농도의 CD47 폴리펩티드 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 높은 발현 수준의 CD47을 갖는 세포주에서 생성된다. 소정 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 CD47고 세포에서 생성되며, 세포는 세포막 상에서의 CD47의 발현이 높다. 특정 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 CD47고 HEK 293T 세포에서 생성되며, HEK 293T는 세포막 상에서의 CD47의 발현이 높다. 일부 구현예에서, HEK 293T 세포는 비변형 HEK 293T 세포에 비해 CD47의 발현이 증가되도록 변형된다. 소정 구현예에서, CD47은 인간 CD47이다.
일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 주조직 적합성 복합체 클래스 I(MHC-I)의 표면 발현이 거의 없거나 전혀 없다. 표면 발현된 MHC-I은 감염을 나타내는 단백질 단편과 같은, "비-자기" 단백질의 펩티드 단편을 세포 내로부터 디스플레이하여, 세포에 대한 면역 반응을 촉진한다. 일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 MHC-I저 세포에서 생성되며, 세포는 세포막 상에서 MHC-I의 발현의 감소를 갖는다. 일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 MHC-I-(또는 "MHC-I비함유", "MHC-1음성" 또는 "MHC-음성") 세포에서 생성되며, 세포는 MHC-I의 발현을 결여한다.
특정 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 고농도의 CD47 폴리펩티드를 포함하고 MHC-I 폴리펩티드가 결여된 지질 코트를 포함한다. 소정 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 CD47고/MHC-I저 세포주, 예를 들어 CD47고/MHC-I저 HEK 293T 세포주에서 생성된다. 일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 CD47고/MHC-I비함유 세포주, 예를 들어 CD47고/MHC-I비함유 HEK 293T 세포주에서 생성된다.
렌티바이러스 벡터의 예는 미국 특허 제9,050,269호 및 국제 공개 제WO9931251호, 제W09712622호, 제W09817815호, 제W09817816호, 및 제WO9818934호에 개시되며, 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 본 개시는 표 1에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 포함하는 렌티바이러스 벡터를 제공한다.
[표 1]
서열
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
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Figure pct00009
Figure pct00010
본 개시의 렌티바이러스 벡터는 5x1010 TU/kg 이하, 109 TU/kg 이하, 또는 108 TU/kg 이하의 용량으로 투여되는 경우 치료적으로 유효하다. 이러한 투여량에서, 본 개시의 렌티바이러스 벡터의 투여는 대상체에서의 기저 수준에 대해, 대조군 렌티바이러스 벡터를 투여받은 대상체에서의 수준에 비해, 대조군 핵산 분자를 투여받은 대상체에서의 수준에 비해, 또는 대조군 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩티드의 투여 후 대상체에서의 수준에 비해 이를 필요로 하는 대상체에서의 혈장 FVIII 활성의 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 11배, 적어도 약 12배, 적어도 약 13배, 적어도 약 14배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배, 적어도 약 45배, 적어도 약 50배, 적어도 약 55배, 적어도 약 60배, 적어도 약 65배, 적어도 약 70배, 적어도 약 75배, 적어도 약 80배, 적어도 약 85배, 적어도 약 90배, 적어도 약 95배, 적어도 약 100배, 적어도 약 110배, 적어도 약 120배, 적어도 약 130배, 적어도 약 140배, 적어도 약 150배, 적어도 약 160배, 적어도 약 170배, 적어도 약 180배, 적어도 약 190배, 또는 적어도 약 200배 증가를 초래할 수 있다.
소정 구현예에서, 예를 들어 트랜스유전자, 예컨대 최적화된 FVIII 트랜스유전자에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 miRNA 표적 서열을 렌티바이러스 벡터 내에 포함시키는 것이 유용할 것이다. 따라서, 본 개시는 또한 최적화된 FVIII 또는 최적화된 FIX 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결되거나 달리 렌티바이러스 벡터 내에 삽입된 적어도 하나의 miRNA 서열 표적을 제공한다. 렌티바이러스 벡터에 포함된 miRNA 표적 서열의 하나 초과의 카피는 시스템의 효율성을 증가시킬 수 있다.
상이한 miRNA 표적 서열도 포함된다. 예를 들어, 하나 초과의 트랜스유전자를 발현하는 렌티바이러스 벡터는 동일하거나 상이할 수 있는 하나 초과의 miRNA 표적 서열의 제어 하의 트랜스유전자를 가질 수 있다. miRNA 표적 서열은 탠덤으로 있을 수 있지만, 다른 배열도 포함된다. miRNA 표적 서열을 포함하는 트랜스유전자 발현 카세트는 또한 안티센스 배향으로 렌티바이러스 벡터 내에 삽입될 수 있다. 안티센스 배향은 생산체 세포에 달리 독성이 있을 수 있는 유전자 산물의 발현을 피하기 위한 바이러스 입자의 생산에 유용할 수 있다.
다른 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 동일하거나 상이한 miRNA 표적 서열의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 8개 카피를 포함한다. 소정 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 어떠한 miRNA 표적 서열도 포함하지 않는다. miRNA 표적 서열을 포함할지 여부(및 얼마나 포함할지 여부)의 선택은 의도된 조직 표적, 필요한 발현 수준 등과 같은 공지된 파라미터에 의해 가이드될 것이다.
하나의 구현예에서, 표적 서열은 골수 수임 전구세포에서 가장 효과적으로 발현을 차단하고 더 원시적인 HSPC에서 적어도 부분적으로 발현을 차단하는 것으로 보고된 miR-223 표적이다. miR-223 표적은 과립구, 단핵구, 대식구, 골수 수지상 세포를 포함하는 분화된 골수 세포에서 발현을 차단할 수 있다. miR-223 표적은 또한 림프 또는 적혈구 계통에서 강력한 트랜스유전자 발현에 의존하는 유전자 치료법 응용에 적합할 수 있다. miR-223 표적은 또한 인간 HSC에서 매우 효과적으로 발현을 차단할 수 있다.
다른 구현예에서, 표적 서열은 miR142 표적(tccataaagtaggaaacactaca (SEQ ID NO: 7))이다. 하나의 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 miR-142 표적 서열의 4개의 카피를 포함한다. 소정 구현예에서, miR-142(142T)와 같은 조혈-특이적 마이크로RNA의 상보성 서열은 렌티바이러스 벡터의 3’ 비번역 영역 내로 혼입되어, 트랜스유전자-인코딩 전사체가 miRNA 매개 하향조절에 민감해지게 만든다. 상기 방법에 의해, 조혈 계통 항원 제시 세포(APC)에서는 트랜스유전자 발현이 방지될 수 있는 한편, 비-조혈 세포에서는 유지될 수 있다(Brown et al., Nat Med 2006). 이 전략은 트랜스유전자 발현에 엄격한 전사후 제어를 부과할 수 있고 따라서 트랜스유전자의 안정적인 전달 및 장기간 발현을 가능하게 한다. 일부 구현예에서, miR-142 조절은 형질도입된 세포의 면역 매개된 제거를 방지하고/하거나 항원-특이적 조절 T 세포(T reg)를 유도하고 트랜스유전자-인코딩 항원에 대한 강력한 면역학적 관용성을 매개한다.
일부 구현예에서, 표적 서열은 miR181 표적이다. 문헌[Chen C-Z and Lodish H, Seminars in Immunology (2005) 17(2):155-165]에는 마우스 골수 내에서 B 세포에서 특이적으로 발현되는 miRNA인 miR-181이 개시되어 있다(Chen and Lodish, 2005). 이것에는 또한 일부 인간 miRNA가 백혈병과 연관됨이 개시되어 있다.
표적 서열은 miRNA에 대해 완전히 또는 부분적으로 상보성일 수 있다. 용어 "완전히 상보성인"은 표적 서열이 이를 인식하는 miRNA의 서열에 대해 100% 상보성인 핵산 서열을 가짐을 의미한다. 용어 "부분적으로 상보성인"은 표적 서열이 이를 인식하는 miRNA의 서열에 대해 단지 부분적으로 상보성이며, 이에 의해 부분적 상보성 서열이 여전히 miRNA에 의해 인식된다는 것을 의미한다. 바꾸어 말하면, 본 개시의 맥락에서 부분적 상보성 표적 서열은 상응하는 miRNA를 인식하고 그 miRNA를 발현하는 세포에서 트랜스유전자 발현의 방지 또는 감소를 수행하는 데 효과적이다. miRNA 표적 서열의 예는 WO2007/000668호, WO2004/094642호, WO2010/055413호, 또는 WO2010/125471호에 기재되어 있으며, 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
A.2. 제형의 부형제, 담체, 및 다른 구성분
유전자 치료법의 목적을 위해, 렌티바이러스 벡터(LV)는 종종 전신으로, 즉 환자의 혈류 내로 직접 투여된다. 따라서, 독성이 아니지만 여전히 LV의 안정성 및 효능을 유지하는 LV의 제형을 생성하는 것은 널리 관심을 받고 있다. 전신 투여에 적합한 LV 제형을 생성하기 위한 비히클을 시험하는 경우, 소정 핵심 원칙을 유념해야 한다. 제형이 투여되는 대상체에 최소 쇼크를 보장하기 위해, pH, 이온 농도, 및 삼투압은 생리적 조건에 매칭하도록 최적화되어야 한다. (pH, 이온 농도, 및 삼투압을 각각 조절하기 위한) 완충액, 염, 및 탄수화물의 조합은 선험적으로 결정 가능하지 않으며 실험적으로 시험되어야 한다.
예를 들어, 미국 제20170073702A1호는 TSSM 비히클(20 mM TRIS, 100 mM NaCl, 1%(w/v) 수크로스, 1%(w/v) 만니톨, pH 7.3)을 개시하며, 이는 포유류로의 전신 투여에서 비독성으로 예측될 수 있었다. 그러나, TSSM 단독 또는 LV와의 조합을 사용하는 제형은 마우스에 독성인 것으로 확인되었다(실시예 2 참고). 그러나 놀랍게도, 포스페이트 비히클(10 mM 포스페이트, 100 mM NaCl, 3%(w/v) 수크로스, 0.05%(w/v) P188, pH 7.3) 또는 히스티딘 비히클(20 mM 히스티딘, 100 mM NaCl, 3%(w/v) 수크로스, 0.05%(w/v) P188, pH 6.5)이 사용된 경우, 제형은 마우스에 독성이 아니었다.
선험적으로 예측되지 않았으나, 포스페이트 비히클을 포함하는 제형은 TSSM 제형에 비해 LV의 더 높은 안정성 및 온전성을 초래하였다(실시예 3 및 실시예 4). 예상치 못하게, 히스티딘 비히클은 포스페이트 비히클보다 LV에 대해 더 큰 안정성을 부여하였다(실시예 4). 히스티딘 제형의 상기 핵심 특징, 즉 중성 pH(pH 7.3)의 포스페이트 또는 TRIS 완충액 대비 더 낮은 pH(pH 6.5)를 갖는 비히클과 렌티바이러스 벡터의 상용성은 적어도 하기 이유로 놀라운 것이었다. VSV-G 외피 단백질은 렌티바이러스 벡터의 중요한 구성요소이며, 이는 세포 내로의 그 감염성을 촉진한다. VSV-G의 pI(등전점)는 대략 5로, 이는 용액의 pH가 pI에 가까워짐에 따라, 단백질 상의 전하가 더 중성이 됨을 의미한다. 단백질의 전하가 더 중성이 됨에 따라, 서로를 끌어당기는 이의 능력이 더 크고 이는 응집(분해 기전)을 야기하고 이에 따라 감염시키는 능력을 소실할 수 있다.
포스페이트 및 히스티딘 제형에서 계면활성제, 폴록사머 188(P188)의 혼입이 TSSM 제형 대비 증가된 LV 안정성 및 온전성을 부여하는 것도 놀라운 것이었다. 계면활성제는 LV의 외부 지질막 외피를 탈안정화하고, 이에 따라 LV 안정성 및 온전성을 감소시킬 것으로 예측되었으므로, 이는 예상되지 않았다. 유사하게, 제형으로부터의 만니톨의 제거가 더 높은 LV 안정성 및 온전성을 갖는 제형을 초래할 것임은 선행적으로 자명하지 않았다(실시예 3 및 실시예 4).
이와 같이, 본원에서 기재된 발견에 기반하여, TRIS-비함유 완충 시스템을 포함하는 렌티바이러스 벡터 조제물은 증가된 렌티바이러스 벡터 안정성 및 온전성을 제공하는 것으로 확인되었다. 당업자에게는 TRIS-비함유 완충 시스템이 TRIS(트리스(하이드록시메틸)아미노메탄, 트로메타민, 또는 THAM으로도 공지됨)를 포함하지 않는 임의의 완충 시스템을 나타냄이 이해될 것이다. 소정 구현예에서, TRIS-비함유 완충 시스템은 포스페이트를 포함한다. 소정 구현예에서, TRIS-비함유 완충 시스템은 히스티딘을 포함한다.
소정 구현예에서, TRIS-비함유 완충 시스템 또는 조제물의 pH는 약 6.0 내지 약 8.0이다. 소정 구현예에서, TRIS-비함유 완충 시스템 또는 조제물의 pH는 약 6.0 내지 약 7.5이다. 소정 구현예에서, TRIS-비함유 완충 시스템 또는 조제물의 pH는 약 6.0 내지 약 7.0이다. 소정 구현예에서, TRIS-비함유 완충 시스템 또는 조제물의 pH는 약 7.0 내지 약 8.0이다. 소정 구현예에서, TRIS-비함유 완충 시스템 또는 조제물의 pH는 약 6.5이다. 소정 구현예에서, TRIS-비함유 완충 시스템 또는 조제물의 pH는 약 7.3이다.
당업자는 표적 pH 또는 표적 pH 범위를 유지하기 위해 본원에서 개시된 조제물의 TRIS-비함유 완충 시스템에서 사용될 적합한 완충액 구성요소를 결정할 수 있을 것이다. 소정 구현예에서, TRIS-비함유 완충 시스템은 약 6.0 내지 약 8.0의 유효 pH 완충 범위를 갖는 완충액 구성요소를 포함한다. 소정 구현예에서, TRIS-비함유 완충 시스템은 약 6.0 내지 약 7.5의 유효 pH 완충 범위를 갖는 완충액 구성요소를 포함한다. 소정 구현예에서, TRIS-비함유 완충 시스템은 약 6.0 내지 약 7.0의 유효 pH 완충 범위를 갖는 완충액 구성요소를 포함한다. 소정 구현예에서, TRIS-비함유 완충 시스템은 약 7.0 내지 약 8.0의 유효 pH 완충 범위를 갖는 완충액 구성요소를 포함한다. 소정 구현예에서, TRIS-비함유 완충 시스템은 pH 6.5를 유지할 수 있는 유효 pH 완충 범위를 갖는 완충액 구성요소를 포함한다. 소정 구현예에서, TRIS-비함유 완충 시스템은 pH 7.3를 유지할 수 있는 유효 pH 완충 범위를 갖는 완충액 구성요소를 포함한다.
본원에 개시된 렌티바이러스 유전자 치료법 벡터, 또는 본 개시의 숙주 세포(예를 들어, 본원에 개시된 렌티바이러스 유전자 치료법 벡터에 의해 표적화되는 간세포)를 함유하는 조성물은 적합한 약학적으로 허용 가능한 담체를 함유할 수 있다. 예를 들어, 이들은 활성 화합물을 작용 부위에 대한 전달용으로 설계된 제조물로 가공하는 것을 촉진하는 부형제 및/또는 보조제를 함유할 수 있다.
약학 조성물은 볼루스 주사에 의한 비경구 투여(즉, 정맥내, 피하 또는 근육내)용으로 제형화될 수 있다. 주사용 제형은 단위 투여형, 예를 들어 보존제가 첨가된 앰플 또는 다회 용량 용기에 제공될 수 있다. 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액 또는 에멀션과 같은 형태를 취할 수 있고, 제형화제, 예컨대 현탁제, 안정제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 활성 성분은 적합한 비히클, 예를 들어 발열원 비함유수로 구성하기 위한 분말 형태일 수 있다.
비경구 투여에 적합한 제형은 또한 수용성 형태, 예를 들어 수용성 염인 활성 화합물의 수용액을 포함한다. 또한, 적절한 유성 주사 현탁액으로서 활성 화합물의 현탁액이 투여될 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 비히클은 지방 오일, 예를 들어 참기름, 또는 합성 지방산 에스테르, 예를 들어 에틸 올레에이트 또는 트리글리세리드를 포함한다. 수성 주사 현탁액은, 예를 들어 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 소르비톨 및 덱스트란을 포함하는, 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 함유할 수 있다. 선택적으로, 현탁액은 또한 안정제를 함유할 수 있다. 리포솜은 또한 세포 또는 간질 공간 내로의 전달을 위해 본 개시의 분자를 캡슐화하기 위해 사용될 수 있다. 예시적인 약학적으로 허용 가능한 담체는 생리적으로 상용성인 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제, 물, 식염수, 인산염 완충 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등이다. 일부 구현예에서, 조성물은 등장화제, 예를 들어 당, 폴리알코올, 예컨대 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 포함한다. 다른 구현예에서, 조성물은 활성 성분의 보관 수명 또는 효율성을 향상시키는 약학적으로 허용 가능한 물질, 예컨대 습윤제 또는 소량의 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 유화제, 보존제 또는 완충액을 포함한다.
본 개시의 조성물은, 예를 들어 액체(예를 들어, 주사용 및 주입용 용액), 분산액, 현탁액, 반고체 및 고체 투여형을 포함하는 다양한 형태일 수 있다. 바람직한 형태는 투여 방식 및 치료 응용에 좌우된다.
조성물은 용액, 마이크로 에멀션, 분산액, 리포솜 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 규칙화된 구조로 제형화될 수 있다. 살균 주사용 용액은 상기 열거된 성분 중 하나 또는 이의 조합을 포함하는 적절한 용매 중에, 필요한 양의 활성 성분을 혼입하고, 이어서 필요한 경우, 여과 살균하여 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산 매질 및 상기 열거된 것으로부터의 필요한 기타 성분을 함유하는 살균 비히클 내로 활성 성분을 혼입하여 제조된다. 살균 주사용 용액의 제조를 위한 살균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 이전에 살균 여과된 용액으로부터 활성 성분와 임의의 요망되는 추가 성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 동결 건조이다. 용액의 적절한 유동성은, 예를 들어 코팅, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우에 필요한 입자 크기의 유지에 의해 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 주사용 조성물의 장기간 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 조성물 중에 포함시켜 일으킬 수 있다.
활성 성분은 방출 제어형 제형 또는 장치로 제형화될 수 있다. 이러한 제형 및 장치의 예는 임플란트, 경피 패치 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 포함한다. 생분해성, 생체적합성 중합체, 예를 들어 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이러한 제형 및 장치의 제조 방법은 당분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참고한다.
주사용 데포 제형은 생분해성 중합체, 예컨대 폴리락티드-폴리글리콜리드 중 약물의 마이크로캡슐화된 매트릭스를 형성하여 제조될 수 있다. 약물 대 중합체의 비, 및 사용된 중합체의 성질에 따라, 약물 방출 속도가 제어될 수 있다. 다른 예시적인 생분해성 중합체는 폴리오르토에스테르 및 폴리무수물이다. 데포 주사용 제형은 또한 리포솜 또는 마이크로에멀션 중 약물을 포획하여 제조될 수 있다.
보충 활성 화합물이 조성물 내로 혼입될 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 개시의 키메라 단백질은 다른 응고 인자, 또는 이의 변이체, 단편, 유사체 또는 유도체와 함께 제형화된다. 예를 들어, 응고 인자는 인자 V, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 XI, 인자 XII, 인자 XIII, 프로트롬빈, 피브리노겐, 폰 빌레브란트 인자 또는 재조합 가용성 조직 인자(rsTF) 또는 임의의 전술한 것의 활성화 형태를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 지혈제의 응고 인자는 또한 항-섬유소용해 약물, 예를 들어 엡실론-아미노-카프르산, 트라넥삼산을 포함할 수 있다.
투여량 요법은 요망되는 최적 반응을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수 있거나, 여러 분할 용량이 시간에 걸쳐 투여될 수 있거나, 용량이 치료 상황의 응급성에 의해 시사된 바대로 비례하여 감소되거나 증가될 수 있다. 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여량 단위 형태로 비경구 조성물을 제형화하는 것이 유리하다. 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., Easton, Pa. 1980)]을 참고한다.
활성 화합물에 더하여, 액체 투여형은 불활성 성분, 예컨대 물, 에틸 알코올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 디메틸포름아미드, 오일, 글리세롤, 테트라하이드로푸르푸릴 알코올, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르를 함유할 수 있다.
적합한 약학 담체의 비제한적 예는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences by E. W. Martin]에 또한 기재되어 있다. 부형제의 몇몇 예는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카 겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 조성물은 pH 완충 시약, 및 습윤제 또는 유화제를 또한 함유할 수 있다.
경구 투여를 위해, 약학 조성물은 통상적인 수단에 의해 제조된 정제 또는 캡슐의 형태를 취할 수 있다. 조성물은 또한 액체, 예를 들어 시럽 또는 현탁액으로서 제조될 수 있다. 액체는 현탁제(예를 들어, 소르비톨 시럽, 셀룰로스 유도체 또는 수소화된 식용 지방), 유화제(레시틴 또는 아카시아), 비수성 비히클(예를 들어, 아몬드유, 오일 에스테르, 에틸 알코올 또는 분별화된 식물성 오일) 및 보존제(예를 들어, 메틸 또는 프로필-p-하이드록시벤조에이트 또는 소르브산)를 포함할 수 있다. 조제물은 또한 착향제, 착색제 및 감미제를 포함할 수 있다. 대안적으로, 조성물은 물 또는 다른 적합한 비히클로의 구성을 위한 건조 산물로서 제공될 수 있다.
협측 투여를 위해, 조성물은 통상적인 프로토콜에 따라 정제 또는 로젠지의 형태를 취할 수 있다.
흡입에 의한 투여를 위해, 본 개시에 따라 사용하기 위한 화합물은 편리하게는 부형제를 포함하거나 포함하지 않는 분무 에어로졸의 형태로 또는 선택적으로 분사제, 예를 들어 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로메탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 가스를 갖는 가압 팩 또는 분무기로부터의 에어로졸 스프레이의 형태로 전달된다. 가압 에어로졸의 경우에, 투여량 단위는 계량된 양을 전달하기 위한 밸브를 제공하여 결정될 수 있다. 예를 들어 흡입기 또는 취입기에서 사용하기 위한 젤라틴의, 캡슐 및 카트리지는 화합물 및 적합한 분말 기제, 예컨대 락토스 또는 전분의 분말 혼합물을 함유하여 제형화될 수 있다.
또한 약학 조성물은 예를 들어 통상적인 좌약 기제, 예컨대 코코아 버터 또는 다른 글리세라이드를 함유하는 좌약 또는 정체 관장으로서 직장 투여를 위해 제형화될 수 있다.
하나의 구현예에서, 약학 조성물은 인자 VIII 또는 인자 IX 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 최적화된 핵산 분자를 포함하는 렌티바이러스 벡터, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 다른 구현예에서, 약학 조성물은 인자 VIII 또는 인자 IX 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 최적화된 핵산 분자를 포함하는 렌티바이러스 벡터를 포함하는 숙주 세포(예를 들어, 간세포), 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 국소 투여, 안구내 투여, 비경구 투여, 척추강내 투여, 경막하 투여 및 경구 투여로 구성되는 군으로부터 선택되는 경로에 의해 투여된다. 비경구 투여는 정맥내 또는 피하 투여일 수 있다.
치료 제형을 실험 단계에서 일관된 고품질의 제조 및 판매용 제품으로의 전환을 보장하기 위한 기본적인 측면은 투여형에서의 이의 안정성이다. 이의 복잡한 화학 및 구조로 인해, 단백질, 예컨대 바이러스의 표면 및 캡시드 단백질은 최종 완제 의약품의 생물학적 유효성 및 안전성을 손상시킬 수 있는 다양한 형태의 물리적 및 화학적 분해에 민감하다. 예를 들어 단백질 응집은 단백질 기반 제품에 대해 일상적으로 모니터링되는 핵심 품질 속성이며, 제품 보관 수명의 결정에 중요하다. 기본적인 수준에서, 단백질 응집은 천연 형태의 단백질의 안정성과 연관되며, 비천연 세포(예를 들어, 비천연 포유류 세포)에서의 성장은 일반적으로 응집 속도 및 정도의 증가와 연관된다. 따라서, 제품 유통 기한 동안 응집을 제어하고 최소화하려는 시도(동역학적 안정성)가 종종 단백질의 배좌 안정성을 증가시키기 위한 제형화 조건 또는 부형제의 사용을 통해 매개된다는 것은 놀라운 일이 아니다. 본질적으로, 목적은 응집 능력이 있는 "비천연" 종의 집단을 최소화하기 위해 천연 배좌의 단백질을 안정화하는 것이다. 천연 상태의 단백질을 안정화시키고 응집 속도를 줄이기 위해 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 소르비톨 등과 같은 당 및 폴리올이 종종 사용된다. 그러나, 이러한 안정제 사용의 원치 않는 효과는 용액 점도의 농도-의존적 증가이다.
용액 점도는 단백질 제품, 특히 높은 단백질 농도로 제형화된 단백질 제품의 핵심 속성이며 제품의 유용성 및 성공에 결정적인 영향을 미칠 수 있다. 제품의 제조 가능성 및 환자 또는 의료 종사자의 최종 사용은 끊김 없이 흐르는 용액의 능력과 밀접하게 연관된다. 예를 들어, 높은 점도는 요망되는 집단에 항상 적합하지는 않을 수 있는 특수 투여 장치 또는 프로토콜의 사용을 필요로 하여, 제품의 사용을 제한할 수 있다. 다른 경우에, 용액 점도가 높으면 단백질의 안정성에 부정적인 영향을 미칠 수 있는 제조 기술(예를 들어, 고온 처리)의 적용이 필요할 수 있다. 따라서, 높은 단백질 농도의 용액에서 염 및 아미노산과 같은 점도 감소 부형제를 사용하는 것은 드문 일이 아니다. 그러나, 이러한 부형제는 단백질의 안정성에 부정적인 영향을 미침으로써, 점도 감소제가 결여된 고점도 대조군 용액에 비해 응집 속도가 증가된 용액을 생성할 수 있다. 본질적으로, 흔히 사용되는 안정제 및 점도 감소 부형제는 제품 성능에 대해 역효과를 가짐으로써, 그 개발을 복잡하게 만들 수 있다.
고려해야 할 주사용 제품(대부분 단백질 기반 제품)에 대한 다른 중요한 속성은 그 삼투압이다. 정맥내 용액은 일반적으로 등장성이어야 하지만, 피하 용액이 고장성인 것은 드문 일은 아니다. 실제로, 피하 투여 후 향상된 단백질 생체이용률을 초래하는 고장성 제형에 대한 문헌 상 증거가 존재한다(Fathallah, A.M. et al, Biopharm Drug Dispos. 2015 Mar; 36(2):115-25). 따라서, 주사 부위의 불편함 및/또는 반응뿐만 아니라 환자 집단의 생체이용률에 대한 용액 삼투압(및 이에 따른 장성)의 영향은 임상 개발 단계에서 주의 깊게 모니터링되고 특성규명되어야 한다.
제형은 때때로 계면활성제, 예컨대 폴록사머 및 폴리소르베이트를 함유할 수 있고, 이는 소정 이점을 부여할 수 있다. 폴록사머는 비이온성 폴리(에틸렌 옥사이드)(PEO)-폴리(프로필렌 옥사이드)(PPO) 공중합체이다. 이들은 약학 제형에서 계면활성제, 유화제, 가용화제, 분산제, 및 생체내 흡수 향상제로서 사용된다. 폴록사머는 하기 코어 화학식을 갖는 합성 트리블록 공중합체이다: (PEO)a-(PPO)b-(PEO)a. 모든 폴록사머는 유사학 화학적 구조를, 그러나 상이한 분자량 및 조성의 친수성 PEO 블록 및 소수성 PPO 블록을 갖는다. 가장 일반적으로 사용되는 폴록사머 중 2가지는 7680 Da 내지 9510 Da 범위의 분자량을 갖는 폴록사머 188(a=80, b=27), 및 9840 Da 내지 14600 Da 범위의 분자량을 갖는 폴록사머 407(a=101, b=56)이다. 다른 폴록사머는 하기를 포함한다: 폴록사머 101(P101), 폴록사머 105(P105), 폴록사머 108(P108), 폴록사머 122(P122), 폴록사머 123(P123), 폴록사머 124(P124), 폴록사머 181(P181), 폴록사머 182(P182), 폴록사머 183(P183), 폴록사머 184(P184), 폴록사머 185(P185), 폴록사머 212(P212), 폴록사머 215(P215), 폴록사머 217(P217), 폴록사머 231(P231), 폴록사머 234(P234), 폴록사머 235(P235), 폴록사머 237(P237), 폴록사머 238(P238), 폴록사머 282(P282), 폴록사머 284(P284), 폴록사머 288(P288), 폴록사머 331(P331), 폴록사머 333(P333), 폴록사머 334(P334), 폴록사머 335(P335), 폴록사머 338(P338), 폴록사머 401(P401), 폴록사머 402(P402), 및 폴록사머 403(P403).
폴리소르베이트는 일부 약품 및 식품 조제물 제형에서 사용되는 유화제의 한 클래스이다. 폴리소르베이트는 지방산으로 에스테르화된, 소르비톨의 유도체인 에톡실화된 소르비탄으로부터 유도된 유성 액체이다. 폴리소르베이트의 일반적인 상표명은 Scattics, Alkest, Canarcel, 및 Tween을 포함한다. 폴리소르베이트에 대한 명명 관례는 보통 하기와 같다: 폴리소르베이트 x(폴리옥시에틸렌(y) 소르비탄 모노'z')로서, x는 폴리옥시에틸렌 소르비탄과 연합된 지방산의 유형(z)에 관련되며 y는 폴리소르베이트 분자에서 확인되는 옥시에틸렌 -(CH2CH2O)- 기의 총 수를 나타낸다. 폴리소르베이트의 예는 하기를 포함한다: (a) 폴리소르베이트 20(폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노라우레이트), (b) 폴리소르베이트 40(폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노팔미테이트), (c) 폴리소르베이트 60(폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노스테아레이트), 및 (d) 폴리소르베이트 80(폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노올레에이트).
B. 혈액 장애의 치료에서 사용하기 위한 렌티바이러스 벡터(LV) 제형
하나의 양태에서, 본 발명은 (a) 유효 용량의 재조합 렌티바이러스 벡터; (b) TRIS-비함유 완충 시스템; (c) 염; (d) 계면활성제; (e) 탄수화물, 및 (f) SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 나타낸 인자 VIII(FVIII) 코딩 서열 또는 SEQ ID NO: 3에 나타낸 인자 IX(FIX) 코딩 서열과 적어도 80% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 렌티바이러스 벡터 조제물에 대한 것이며, 약학 조성물은 인간 환자에 대한 전신 투여에 적합하다. 소정 구현예에서, 벡터는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 나타낸 인자 VIII(FVIII) 코딩 서열을 포함한다. 소정 구현예에서, 벡터는 SEQ ID NO: 3에 나타낸 인자 IX(FIX) 코딩 서열을 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 (a) 치료 유효 용량의 재조합 렌티바이러스 벡터; (b) TRIS-비함유 완충 시스템; (c) 염; (d) 계면활성제; 및 (e) 탄수화물을 포함하는 재조합 렌티바이러스 벡터 조제물을 제공하며, 재조합 렌티바이러스 벡터는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 나타낸 인자 VIII(FVIII) 코딩 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일한 뉴클레오티드 서열 또는 SEQ ID NO: 3에 나타낸 인자 IX(FIX) 코딩 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함하고, 약학 조성물은 인간 환자에 대한 전신 투여에 적합하다. 소정 구현예에서, 재조합 렌티바이러스 벡터는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 나타낸 인자 VIII(FVIII) 코딩 서열을 포함하는 핵산을 포함한다. 소정 구현예에서, 재조합 렌티바이러스 벡터는 SEQ ID NO: 3에 나타낸 인자 IX(FIX) 코딩 서열을 포함하는 핵산을 포함한다. 소정 구현예에서, 재조합 렌티바이러스 벡터는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 나타낸 인자 VIII(FVIII) 코딩 서열로 구성되는 핵산을 포함한다. 소정 구현예에서, 재조합 렌티바이러스 벡터는 SEQ ID NO: 3에 나타낸 인자 IX(FIX) 코딩 서열로 구성되는 핵산을 포함한다.
소정 구현예에서, 완충 시스템의 pH는 약 6.0 내지 약 8.0이다. 소정 구현예에서, 완충 시스템의 pH는 약 6.0 내지 약 7.5이다. 소정 구현예에서, 완충 시스템의 pH는 약 6.0 내지 약 7.0이다. 소정 구현예에서, 완충 시스템의 pH는 약 6.0 내지 약 8.0이다. 소정 구현예에서, 완충 시스템의 pH는 약 6.5이다. 소정 구현예에서, 완충 시스템의 pH는 약 7.3이다. 소정 구현예에서, 완충 시스템은 포스페이트 완충액 또는 히스티딘 완충액이다. 소정 구현예에서, 포스페이트 또는 히스티딘 완충액의 농도는 약 5 mM 내지 약 30 mM이다. 소정 구현예에서, 포스페이트 완충액의 농도는 약 10 mM 내지 약 20 mM, 약 10 mM 내지 약 15 mM, 약 20 mM 내지 약 30 mM, 약 20 mM 내지 약 25 mM, 또는 약 15 mM 내지 약 20 mM이다. 소정 구현예에서, 염은 클로라이드 염이다. 소정 구현예에서, 클로라이드 염의 농도는 약 80 mM 내지 약 150 mM이다. 소정 구현예에서, 염의 농도는 약 100 mM, 약 110 mM, 약 130 mM, 또는 약 150 mM이다. 소정 구현예에서, 계면활성제는 폴록사머 또는 폴리소르베이트이다. 소정 구현예에서, 폴록사머 또는 폴리소르베이트의 농도는 약 0.01%(w/v) 내지 약 0.1%(w/v)이다. 소정 구현예에서, 탄수화물은 수크로스이다. 소정 구현예에서, 탄수화물의 농도는 약 0.5%(w/v) 내지 약 5%(w/v)이다. 소정 구현예에서, 클로라이드 염은 염화나트륨(NaCl)이다. 소정 구현예에서, 폴록사머는 폴록사머 101(P101), 폴록사머 105(P105), 폴록사머 108(P108), 폴록사머 122(P122), 폴록사머 123(P123), 폴록사머 124(P124), 폴록사머 181(P181), 폴록사머 182(P182), 폴록사머 183(P183), 폴록사머 184(P184), 폴록사머 185(P185), 폴록사머 188(P188), 폴록사머 212(P212), 폴록사머 215(P215), 폴록사머 217(P217), 폴록사머 231(P231), 폴록사머 234(P234), 폴록사머 235(P235), 폴록사머 237(P237), 폴록사머 238(P238), 폴록사머 282(P282), 폴록사머 284(P284), 폴록사머 288(P288), 폴록사머 331(P331), 폴록사머 333(P333), 폴록사머 334(P334), 폴록사머 335(P335), 폴록사머 338(P338), 폴록사머 401(P401), 폴록사머 402(P402), 폴록사머 403(P403), 폴록사머 407(P407), 및 이의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 소정 구현예에서, 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60, 폴리소르베이트 80, 및 이의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 소정 구현예에서, 포스페이트 또는 히스티딘 완충액의 pH는 약 6.1, 약 6.3, 약 6.5, 약 6.7, 약 6.9, 약 7.1, 약 7.3, 약 7.5, 약 7.7 또는 약 7.9이다. 소정 구현예에서, 포스페이트 또는 히스티딘 완충액의 농도는 약 10 mM, 약 15 mM, 약 20 mM, 또는 약 25 mM이다. 소정 구현예에서, 클로라이드 염은 약 100 mM, 약 110 mM, 약 130 mM, 또는 약 150 mM이다. 소정 구현예에서, 폴록사머 또는 폴리소르베이트의 농도는 약 0.03%(w/v), 약 0.05%(w/v), 약 0.07%(w/v), 또는 약 0.09%(w/v)이다. 소정 구현예에서, 탄수화물의 농도는 약 1%(w/v), 약 2%(w/v), 약 3%(w/v), 또는 약 4%(w/v)이다. 소정 구현예에서, 폴록사머는 폴록사머 188(P188)이다. 소정 구현예에서, 폴록사머는 폴록사머 407(P407)이다.
소정 구현예에서, 본 개시는 (a) 치료 유효 용량의 재조합 렌티바이러스 벡터; (b) 약 10 mM 포스페이트; (c) 약 100 mM 염화나트륨; (d) 약 0.05%(w/v) 폴록사머 188; 및 (e) 약 3%(w/v) 수크로스를 포함하는 재조합 렌티바이러스 벡터 조제물을 제공하며, 조제물의 pH는 약 7.3이고, 약학 조성물은 인간 환자에 대한 전신 투여에 적합하고, 재조합 렌티바이러스 벡터는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 나타낸 인자 VIII(FVIII) 코딩 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일한 뉴클레오티드 서열, 또는 SEQ ID NO: 3에 나타낸 인자 IX(FIX) 코딩 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함하고, 약학 조성물은 인간 환자에 대한 전신 투여에 적합하다. 소정 구현예에서, 재조합 렌티바이러스 벡터는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 나타낸 인자 VIII(FVIII) 코딩 서열을 포함하는 핵산을 포함한다. 소정 구현예에서, 재조합 렌티바이러스 벡터는 SEQ ID NO: 3에 나타낸 인자 IX(FIX) 코딩 서열을 포함하는 핵산을 포함한다. 소정 구현예에서, 재조합 렌티바이러스 벡터는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 나타낸 인자 VIII(FVIII) 코딩 서열로 구성되는 핵산을 포함한다. 소정 구현예에서, 재조합 렌티바이러스 벡터는 SEQ ID NO: 3에 나타낸 인자 IX(FIX) 코딩 서열로 구성되는 핵산을 포함한다.
소정 구현예에서, 본 개시는 (a) 치료 유효 용량의 재조합 렌티바이러스 벡터; (b) 약 10 mM 포스페이트; (c) 약 130 mM 염화나트륨; (d) 약 0.05%(w/v) 폴록사머 188; 및 (e) 약 1%(w/v) 수크로스를 포함하는 재조합 렌티바이러스 벡터 조제물을 제공하며, 조제물의 pH는 약 7.3이고, 약학 조성물은 인간 환자에 대한 전신 투여에 적합하고, 재조합 렌티바이러스 벡터는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 나타낸 인자 VIII(FVIII) 코딩 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일한 뉴클레오티드 서열, 또는 SEQ ID NO: 3에 나타낸 인자 IX(FIX) 코딩 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함하고, 약학 조성물은 인간 환자에 대한 전신 투여에 적합하다. 소정 구현예에서, 재조합 렌티바이러스 벡터는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 나타낸 인자 VIII(FVIII) 코딩 서열을 포함하는 핵산을 포함한다. 소정 구현예에서, 재조합 렌티바이러스 벡터는 SEQ ID NO: 3에 나타낸 인자 IX(FIX) 코딩 서열을 포함하는 핵산을 포함한다. 소정 구현예에서, 재조합 렌티바이러스 벡터는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 나타낸 인자 VIII(FVIII) 코딩 서열로 구성되는 핵산을 포함한다. 소정 구현예에서, 재조합 렌티바이러스 벡터는 SEQ ID NO: 3에 나타낸 인자 IX(FIX) 코딩 서열로 구성되는 핵산을 포함한다.
소정 구현예에서, 본 개시는 (a) 치료 유효 용량의 재조합 렌티바이러스 벡터; (b) 약 20 mM 히스티딘; (c) 약 100 mM 염화나트륨; (d) 약 0.05%(w/v) 폴록사머 188; 및 (e) 약 3%(w/v) 수크로스를 포함하는 재조합 렌티바이러스 벡터 조제물을 제공하며, 조제물의 pH는 약 6.5이고, 약학 조성물은 인간 환자에 대한 전신 투여에 적합하고, 재조합 렌티바이러스 벡터는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 나타낸 인자 VIII(FVIII) 코딩 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일한 뉴클레오티드 서열, 또는 SEQ ID NO: 3에 나타낸 인자 IX(FIX) 코딩 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함하고, 약학 조성물은 인간 환자에 대한 전신 투여에 적합하다. 소정 구현예에서, 재조합 렌티바이러스 벡터는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 나타낸 인자 VIII(FVIII) 코딩 서열을 포함하는 핵산을 포함한다. 소정 구현예에서, 재조합 렌티바이러스 벡터는 SEQ ID NO: 3에 나타낸 인자 IX(FIX) 코딩 서열을 포함하는 핵산을 포함한다. 소정 구현예에서, 재조합 렌티바이러스 벡터는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 나타낸 인자 VIII(FVIII) 코딩 서열로 구성되는 핵산을 포함한다. 소정 구현예에서, 재조합 렌티바이러스 벡터는 SEQ ID NO: 3에 나타낸 인자 IX(FIX) 코딩 서열로 구성되는 핵산을 포함한다.
소정 구현예에서, 본 개시는 (a) 치료 유효 용량의 재조합 렌티바이러스 벡터; (b) 약 10 mM 포스페이트; (c) 약 100 mM 염화나트륨; (d) 약 0.05%(w/v) 폴록사머 188; 및 (e) 약 3%(w/v) 수크로스를 포함하는 재조합 렌티바이러스 벡터 조제물을 제공하며, 조제물의 pH는 약 7.0이고, 약학 조성물은 인간 환자에 대한 전신 투여에 적합하고, 재조합 렌티바이러스 벡터는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 나타낸 인자 VIII(FVIII) 코딩 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일한 뉴클레오티드 서열, 또는 SEQ ID NO: 3에 나타낸 인자 IX(FIX) 코딩 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함하고, 약학 조성물은 인간 환자에 대한 전신 투여에 적합하다. 소정 구현예에서, 재조합 렌티바이러스 벡터는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 나타낸 인자 VIII(FVIII) 코딩 서열을 포함하는 핵산을 포함한다. 소정 구현예에서, 재조합 렌티바이러스 벡터는 SEQ ID NO: 3에 나타낸 인자 IX(FIX) 코딩 서열을 포함하는 핵산을 포함한다. 소정 구현예에서, 재조합 렌티바이러스 벡터는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 나타낸 인자 VIII(FVIII) 코딩 서열로 구성되는 핵산을 포함한다. 소정 구현예에서, 재조합 렌티바이러스 벡터는 SEQ ID NO: 3에 나타낸 인자 IX(FIX) 코딩 서열로 구성되는 핵산을 포함한다.
소정 구현예에서, 본 개시는 (a) 치료 유효 용량의 재조합 렌티바이러스 벡터; (b) 약 20 mM 히스티딘; (c) 약 100 mM 염화나트륨; (d) 약 0.05%(w/v) 폴록사머 188; 및 (e) 약 3%(w/v) 수크로스를 포함하는 재조합 렌티바이러스 벡터 조제물을 제공하며, 조제물의 pH는 약 7.0이고, 약학 조성물은 인간 환자에 대한 전신 투여에 적합하고, 재조합 렌티바이러스 벡터는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 나타낸 인자 VIII(FVIII) 코딩 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일한 뉴클레오티드 서열, 또는 SEQ ID NO: 3에 나타낸 인자 IX(FIX) 코딩 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함하고, 약학 조성물은 인간 환자에 대한 전신 투여에 적합하다. 소정 구현예에서, 재조합 렌티바이러스 벡터는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 나타낸 인자 VIII(FVIII) 코딩 서열을 포함하는 핵산을 포함한다. 소정 구현예에서, 재조합 렌티바이러스 벡터는 SEQ ID NO: 3에 나타낸 인자 IX(FIX) 코딩 서열을 포함하는 핵산을 포함한다. 소정 구현예에서, 재조합 렌티바이러스 벡터는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 나타낸 인자 VIII(FVIII) 코딩 서열로 구성되는 핵산을 포함한다. 소정 구현예에서, 재조합 렌티바이러스 벡터는 SEQ ID NO: 3에 나타낸 인자 IX(FIX) 코딩 서열로 구성되는 핵산을 포함한다.
소정 구현예에서, 재조합 렌티바이러스 벡터는 VSV-G를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편을 포함한다. 소정 구현예에서, 재조합 렌티바이러스 벡터는 강화된 트랜스티레틴(ET) 프로모터를 포함한다. 소정 구현예에서, 재조합 렌티바이러스 벡터는 SEQ ID NO: 7에 나타낸 miR-142에 대한 표적 서열과 적어도 90% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
소정 구현예에서, 재조합 렌티바이러스 벡터는 CHO 세포, HEK293 세포, BHK21 세포, PER.C6 세포, NSO 세포, 및 CAP 세포를 포함하는 전달감염된 숙주 세포로부터 단리된다. 소정 구현예에서, 숙주 세포는 CD47-양성 숙주 세포이다.
소정 구현예에서, 조제물은 인간 환자에게 전신 투여된다. 소정 구현예에서, 조제물은 정맥내 투여된다.
소정 구현예에서, 완충 시스템의 pH는 6.0 내지 8.0이다. 소정 구현예에서, 완충 시스템은 포스페이트 완충액 또는 히스티딘 완충액이다. 소정 구현예에서, 포스페이트 또는 히스티딘 완충액의 농도는 5 mM 내지 30 mM이다. 소정 구현예에서, 포스페이트 완충액의 농도는 약 10 mM 내지 약 20 mM, 약 10 mM 내지 약 15 mM, 약 20 mM 내지 약 30 mM, 약 20 mM 내지 약 25 mM, 또는 약 15 mM 내지 약 20 mM이다. 소정 구현예에서, 염은 클로라이드 염이다. 소정 구현예에서, 클로라이드 염의 농도는 80 mM 내지 150 mM이다. 소정 구현예에서, 염의 농도는 약 100 mM, 약 110 mM, 약 130 mM, 또는 약 150 mM이다. 소정 구현예에서, 계면활성제는 폴록사머 또는 폴리소르베이트이다. 소정 구현예에서, 폴록사머 또는 폴리소르베이트의 농도는 0.01%(w/v) 내지 0.1%(w/v)이다. 소정 구현예에서, 탄수화물은 수크로스이다. 소정 구현예에서, 탄수화물의 농도는 0.5%(w/v) 내지 5%(w/v)이다. 소정 구현예에서, 클로라이드 염은 NaCl이다. 소정 구현예에서, 폴록사머는 폴록사머 101(P101), 폴록사머 105(P105), 폴록사머 108(P108), 폴록사머 122(P122), 폴록사머 123(P123), 폴록사머 124(P124), 폴록사머 181(P181), 폴록사머 182(P182), 폴록사머 183(P183), 폴록사머 184(P184), 폴록사머 185(P185), 폴록사머 188(P188), 폴록사머 212(P212), 폴록사머 215(P215), 폴록사머 217(P217), 폴록사머 231(P231), 폴록사머 234(P234), 폴록사머 235(P235), 폴록사머 237(P237), 폴록사머 238(P238), 폴록사머 282(P282), 폴록사머 284(P284), 폴록사머 288(P288), 폴록사머 331(P331), 폴록사머 333(P333), 폴록사머 334(P334), 폴록사머 335(P335), 폴록사머 338(P338), 폴록사머 401(P401), 폴록사머 402(P402), 폴록사머 403(P403), 폴록사머 407(P407), 및 이의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 소정 구현예에서, 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60, 폴리소르베이트 80, 및 이의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 소정 구현예에서, 포스페이트 또는 히스티딘 완충액의 pH는 6.1, 6.3, 6.5, 6.7, 6.9, 7.1, 7.3, 7.5, 7.7, 또는 7.9이다. 소정 구현예에서, 포스페이트 또는 히스티딘 완충액의 농도는 10 mM, 15 mM, 20 mM, 또는 25 mM이다. 소정 구현예에서, 클로라이드 염은 100 mM, 110 mM, 130 mM, 또는 150 mM이다. 소정 구현예에서, 폴록사머 또는 폴리소르베이트의 농도는 0.03%(w/v), 0.05%(w/v), 0.07%(w/v), 또는 0.09%(w/v)이다. 소정 구현예에서, 탄수화물의 농도는 1%(w/v), 2%(w/v), 3%(w/v), 또는 4%(w/v)이다. 소정 구현예에서, 폴록사머는 폴록사머 188(P188)이다. 소정 구현예에서, 폴록사머는 폴록사머 407(P407)이다.
하나의 양태에서, 본 발명은 (a) 유효 용량의 재조합 렌티바이러스 벡터; (b) TRIS-비함유 완충 시스템; (c) 염; (d) 계면활성제; (e) 탄수화물, 및 (f) 강화된 트랜스티레틴(ET) 프로모터를 포함하는 재조합 렌티바이러스 벡터 조제물에 대한 것이며, 약학 조성물은 인간 환자에 대한 전신 투여에 적합하다. 소정 구현예에서, 벡터는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 나타낸 인자 VIII(FVIII) 코딩 서열 또는 SEQ ID NO: 3에 나타낸 인자 IX(FIX) 코딩 서열과 적어도 80% 동일한 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하며, 약학 조성물은 인간 환자에 대한 전신 투여에 적합하다. 소정 구현예에서, 벡터는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 나타낸 인자 VIII(FVIII) 코딩 서열을 포함한다. 소정 구현예에서, 벡터는 SEQ ID NO: 3에 나타낸 인자 IX(FIX) 코딩 서열을 포함한다.
소정 구현예에서, 벡터는 VSV-G를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편을 추가로 포함한다. 소정 구현예에서, 완충 시스템의 pH는 6.0 내지 8.0이다. 소정 구현예에서, 완충 시스템은 포스페이트 완충액 또는 히스티딘 완충액이다. 소정 구현예에서, 포스페이트 또는 히스티딘 완충액의 농도는 5 mM 내지 30 mM이다. 소정 구현예에서, 포스페이트 완충액의 농도는 약 10 mM 내지 약 20 mM, 약 10 mM 내지 약 15 mM, 약 20 mM 내지 약 30 mM, 약 20 mM 내지 약 25 mM, 또는 약 15 mM 내지 약 20 mM이다. 소정 구현예에서, 염은 클로라이드 염이다. 소정 구현예에서, 클로라이드 염의 농도는 80 mM 내지 150 mM이다. 소정 구현예에서, 염의 농도는 약 100 mM, 약 110 mM, 약 130 mM, 또는 약 150 mM이다. 소정 구현예에서, 계면활성제는 폴록사머 또는 폴리소르베이트이다. 소정 구현예에서, 폴록사머 또는 폴리소르베이트의 농도는 0.01%(w/v) 내지 0.1%(w/v)이다. 소정 구현예에서, 탄수화물은 수크로스이다. 소정 구현예에서, 탄수화물의 농도는 0.5%(w/v) 내지 5%(w/v)이다. 소정 구현예에서, 클로라이드 염은 NaCl이다. 소정 구현예에서, 폴록사머는 폴록사머 101(P101), 폴록사머 105(P105), 폴록사머 108(P108), 폴록사머 122(P122), 폴록사머 123(P123), 폴록사머 124(P124), 폴록사머 181(P181), 폴록사머 182(P182), 폴록사머 183(P183), 폴록사머 184(P184), 폴록사머 185(P185), 폴록사머 188(P188), 폴록사머 212(P212), 폴록사머 215(P215), 폴록사머 217(P217), 폴록사머 231(P231), 폴록사머 234(P234), 폴록사머 235(P235), 폴록사머 237(P237), 폴록사머 238(P238), 폴록사머 282(P282), 폴록사머 284(P284), 폴록사머 288(P288), 폴록사머 331(P331), 폴록사머 333(P333), 폴록사머 334(P334), 폴록사머 335(P335), 폴록사머 338(P338), 폴록사머 401(P401), 폴록사머 402(P402), 폴록사머 403(P403), 폴록사머 407(P407), 및 이의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 소정 구현예에서, 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60, 폴리소르베이트 80, 및 이의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 소정 구현예에서, 포스페이트 또는 히스티딘 완충액의 pH는 6.1, 6.3, 6.5, 6.7, 6.9, 7.1, 7.3, 7.5, 7.7, 또는 7.9이다. 소정 구현예에서, 포스페이트 또는 히스티딘 완충액의 농도는 10 mM, 15 mM, 20 mM, 또는 25 mM이다. 소정 구현예에서, 클로라이드 염은 100 mM, 110 mM, 130 mM, 또는 150 mM이다. 소정 구현예에서, 폴록사머 또는 폴리소르베이트의 농도는 0.03%(w/v), 0.05%(w/v), 0.07%(w/v), 또는 0.09%(w/v)이다. 소정 구현예에서, 탄수화물의 농도는 1%(w/v), 2%(w/v), 3%(w/v), 또는 4%(w/v)이다. 소정 구현예에서, 폴록사머는 폴록사머 188(P188)이다. 소정 구현예에서, 폴록사머는 폴록사머 407(P407)이다. 하나의 양태에서, 본 발명은 (a) 유효 용량의 재조합 렌티바이러스 벡터; (b) TRIS-비함유 완충 시스템; (c) 염; (d) 계면활성제; (e) 탄수화물, 및 (f) SEQ ID NO: 7에 나타낸 miR-142에 대한 표적 서열과 적어도 90% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 렌티바이러스 벡터 조제물에 대한 것이며, 약학 조성물은 인간 환자에 대한 전신 투여에 적합하다. 소정 구현예에서, 벡터는 강화된 트랜스티레틴(ET) 프로모터를 추가로 포함한다. 소정 구현예에서, 벡터는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 나타낸 인자 VIII(FVIII) 코딩 서열 또는 SEQ ID NO: 3에 나타낸 인자 IX(FIX) 코딩 서열과 적어도 80% 동일한 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 소정 구현예에서, 벡터는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 나타낸 인자 VIII(FVIII) 코딩 서열을 포함한다. 소정 구현예에서, 벡터는 SEQ ID NO: 3에 나타낸 인자 IX(FIX) 코딩 서열을 포함한다.
소정 구현예에서, 벡터는 VSV-G를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편을 추가로 포함한다. 소정 구현예에서, 완충 시스템의 pH는 6.0 내지 8.0이다. 소정 구현예에서, 완충 시스템은 포스페이트 완충액 또는 히스티딘 완충액이다. 소정 구현예에서, 포스페이트 또는 히스티딘 완충액의 농도는 5 mM 내지 30 mM이다. 소정 구현예에서, 포스페이트 완충액의 농도는 약 10 mM 내지 약 20 mM, 약 10 mM 내지 약 15 mM, 약 20 mM 내지 약 30 mM, 약 20 mM 내지 약 25 mM, 또는 약 15 mM 내지 약 20 mM이다. 소정 구현예에서, 염은 클로라이드 염이다. 소정 구현예에서, 클로라이드 염의 농도는 80 mM 내지 150 mM이다. 소정 구현예에서, 염의 농도는 약 100 mM, 약 110 mM, 약 130 mM, 또는 약 150 mM이다. 소정 구현예에서, 계면활성제는 폴록사머 또는 폴리소르베이트이다. 소정 구현예에서, 폴록사머 또는 폴리소르베이트의 농도는 0.01%(w/v) 내지 0.1%(w/v)이다. 소정 구현예에서, 탄수화물은 수크로스이다. 소정 구현예에서, 탄수화물의 농도는 0.5%(w/v) 내지 5%(w/v)이다. 소정 구현예에서, 클로라이드 염은 NaCl이다. 소정 구현예에서, 폴록사머는 폴록사머 101(P101), 폴록사머 105(P105), 폴록사머 108(P108), 폴록사머 122(P122), 폴록사머 123(P123), 폴록사머 124(P124), 폴록사머 181(P181), 폴록사머 182(P182), 폴록사머 183(P183), 폴록사머 184(P184), 폴록사머 185(P185), 폴록사머 188(P188), 폴록사머 212(P212), 폴록사머 215(P215), 폴록사머 217(P217), 폴록사머 231(P231), 폴록사머 234(P234), 폴록사머 235(P235), 폴록사머 237(P237), 폴록사머 238(P238), 폴록사머 282(P282), 폴록사머 284(P284), 폴록사머 288(P288), 폴록사머 331(P331), 폴록사머 333(P333), 폴록사머 334(P334), 폴록사머 335(P335), 폴록사머 338(P338), 폴록사머 401(P401), 폴록사머 402(P402), 폴록사머 403(P403), 폴록사머 407(P407), 및 이의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 소정 구현예에서, 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60, 폴리소르베이트 80, 및 이의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 소정 구현예에서, 포스페이트 또는 히스티딘 완충액의 pH는 6.1, 6.3, 6.5, 6.7, 6.9, 7.1, 7.3, 7.5, 7.7, 또는 7.9이다. 소정 구현예에서, 포스페이트 또는 히스티딘 완충액의 농도는 10 mM, 15 mM, 20 mM, 또는 25 mM이다. 소정 구현예에서, 클로라이드 염은 100 mM, 110 mM, 130 mM, 또는 150 mM이다. 소정 구현예에서, 폴록사머 또는 폴리소르베이트의 농도는 0.03%(w/v), 0.05%(w/v), 0.07%(w/v), 또는 0.09%(w/v)이다. 소정 구현예에서, 탄수화물의 농도는 1%(w/v), 2%(w/v), 3%(w/v), 또는 4%(w/v)이다. 소정 구현예에서, 폴록사머는 폴록사머 188(P188)이다. 소정 구현예에서, 폴록사머는 폴록사머 407(P407)이다.
하나의 양태에서, 본 발명은 재조합 렌티바이러스 벡터 조제물에 대한 것이며, 재조합 렌티바이러스 벡터는 CHO 세포, HEK293 세포, BHK21 세포, PER.C6 세포, NSO 세포, 및 CAP 세포를 포함하는 전달감염된 숙주 세포로부터 단리되고, 재조합 렌티바이러스 벡터 조제물은 (a) 유효 용량의 재조합 렌티바이러스 벡터; (b) TRIS-비함유 완충 시스템; (c) 염; (d) 계면활성제; 및 (e) 탄수화물을 포함하고, 약학 조성물은 인간 환자에 대한 전신 투여에 적합하다. 소정 구현예에서, 숙주 세포는 CD47-양성 숙주 세포이다. 소정 구현예에서, 벡터는 강화된 트랜스티레틴(ET) 프로모터를 추가로 포함한다. 소정 구현예에서, 벡터는 SEQ ID NO: 7에 나타낸 miR-142에 대한 표적 서열과 적어도 90% 동일한 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 소정 구현예에서, 벡터는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 나타낸 인자 VIII(FVIII) 코딩 서열 또는 SEQ ID NO: 3에 나타낸 인자 IX(FIX) 코딩 서열과 적어도 80% 동일한 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 소정 구현예에서, 벡터는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 나타낸 인자 VIII(FVIII) 코딩 서열을 포함한다. 소정 구현예에서, 벡터는 SEQ ID NO: 3에 나타낸 인자 IX(FIX) 코딩 서열을 포함한다.
소정 구현예에서, 벡터는 VSV-G를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편을 추가로 포함한다. 소정 구현예에서, 완충 시스템의 pH는 6.0 내지 8.0이다. 소정 구현예에서, 완충 시스템은 포스페이트 완충액 또는 히스티딘 완충액이다. 소정 구현예에서, 포스페이트 또는 히스티딘 완충액의 농도는 5 mM 내지 30 mM이다. 소정 구현예에서, 포스페이트 완충액의 농도는 약 10 mM 내지 약 20 mM, 약 10 mM 내지 약 15 mM, 약 20 mM 내지 약 30 mM, 약 20 mM 내지 약 25 mM, 또는 약 15 mM 내지 약 20 mM이다. 소정 구현예에서, 염은 클로라이드 염이다. 소정 구현예에서, 클로라이드 염의 농도는 80 mM 내지 150 mM이다. 소정 구현예에서, 염의 농도는 약 100 mM, 약 110 mM, 약 130 mM, 또는 약 150 mM이다. 소정 구현예에서, 계면활성제는 폴록사머 또는 폴리소르베이트이다. 소정 구현예에서, 폴록사머 또는 폴리소르베이트의 농도는 0.01%(w/v) 내지 0.1%(w/v)이다. 소정 구현예에서, 탄수화물은 수크로스이다. 소정 구현예에서, 탄수화물의 농도는 0.5%(w/v) 내지 5%(w/v)이다. 소정 구현예에서, 클로라이드 염은 NaCl이다. 소정 구현예에서, 폴록사머는 폴록사머 101(P101), 폴록사머 105(P105), 폴록사머 108(P108), 폴록사머 122(P122), 폴록사머 123(P123), 폴록사머 124(P124), 폴록사머 181(P181), 폴록사머 182(P182), 폴록사머 183(P183), 폴록사머 184(P184), 폴록사머 185(P185), 폴록사머 188(P188), 폴록사머 212(P212), 폴록사머 215(P215), 폴록사머 217(P217), 폴록사머 231(P231), 폴록사머 234(P234), 폴록사머 235(P235), 폴록사머 237(P237), 폴록사머 238(P238), 폴록사머 282(P282), 폴록사머 284(P284), 폴록사머 288(P288), 폴록사머 331(P331), 폴록사머 333(P333), 폴록사머 334(P334), 폴록사머 335(P335), 폴록사머 338(P338), 폴록사머 401(P401), 폴록사머 402(P402), 폴록사머 403(P403), 폴록사머 407(P407), 및 이의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 소정 구현예에서, 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60, 폴리소르베이트 80, 및 이의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 소정 구현예에서, 포스페이트 또는 히스티딘 완충액의 pH는 6.1, 6.3, 6.5, 6.7, 6.9, 7.1, 7.3, 7.5, 7.7, 또는 7.9이다. 소정 구현예에서, 포스페이트 또는 히스티딘 완충액의 농도는 10 mM, 15 mM, 20 mM, 또는 25 mM이다. 소정 구현예에서, 클로라이드 염은 100 mM, 110 mM, 130 mM, 또는 150 mM이다. 소정 구현예에서, 폴록사머 또는 폴리소르베이트의 농도는 0.03%(w/v), 0.05%(w/v), 0.07%(w/v), 또는 0.09%(w/v)이다. 소정 구현예에서, 탄수화물의 농도는 1%(w/v), 2%(w/v), 3%(w/v), 또는 4%(w/v)이다. 소정 구현예에서, 폴록사머는 폴록사머 188(P188)이다. 소정 구현예에서, 폴록사머는 폴록사머 407(P407)이다.
하나의 양태에서, 본 발명은 장애를 가진 인간 환자를 치료하는 방법에 대한 것이며, 인간 환자에는 (a) (a) 유효 용량의 재조합 렌티바이러스 벡터; (b) TRIS-비함유 완충 시스템; (c) 염; (d) 계면활성제; 및 (e) 탄수화물을 포함하는 재조합 렌티바이러스 벡터 조제물이 전신 투여되고, 약학 조성물은 인간 환자에 대한 전신 투여에 적합하다. 소정 구현예에서, 조제물은 인간 환자에게 전신 투여된다. 소정 구현예에서, 조제물은 정맥내 투여된다.
소정 구현예에서, 장애는 출혈 장애이다. 소정 구현예에서, 출혈 장애는 혈우병 A 또는 혈우병 B이다.
소정 구현예에서, 벡터는 강화된 트랜스티레틴(ET) 프로모터를 추가로 포함한다. 소정 구현예에서, 벡터는 SEQ ID NO: 7에 나타낸 miR-142에 대한 표적 서열과 적어도 90% 동일한 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 소정 구현예에서, 벡터는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 나타낸 인자 VIII(FVIII) 코딩 서열 또는 SEQ ID NO: 3에 나타낸 인자 IX(FIX) 코딩 서열과 적어도 80% 동일한 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 소정 구현예에서, 벡터는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 나타낸 인자 VIII(FVIII) 코딩 서열을 포함한다. 소정 구현예에서, 벡터는 SEQ ID NO: 3에 나타낸 인자 IX(FIX) 코딩 서열을 포함한다.
소정 구현예에서, 벡터는 VSV-G를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편을 추가로 포함한다. 소정 구현예에서, 완충 시스템의 pH는 6.0 내지 8.0이다. 소정 구현예에서, 완충 시스템은 포스페이트 완충액 또는 히스티딘 완충액이다. 소정 구현예에서, 포스페이트 또는 히스티딘 완충액의 농도는 5 mM 내지 30 mM이다. 소정 구현예에서, 포스페이트 완충액의 농도는 약 10 mM 내지 약 20 mM, 약 10 mM 내지 약 15 mM, 약 20 mM 내지 약 30 mM, 약 20 mM 내지 약 25 mM, 또는 약 15 mM 내지 약 20 mM이다. 소정 구현예에서, 염은 클로라이드 염이다. 소정 구현예에서, 클로라이드 염의 농도는 80 mM 내지 150 mM이다. 소정 구현예에서, 염의 농도는 약 100 mM, 약 110 mM, 약 130 mM, 또는 약 150 mM이다. 소정 구현예에서, 계면활성제는 폴록사머 또는 폴리소르베이트이다. 소정 구현예에서, 폴록사머 또는 폴리소르베이트의 농도는 0.01%(w/v) 내지 0.1%(w/v)이다. 소정 구현예에서, 탄수화물은 수크로스이다. 소정 구현예에서, 탄수화물의 농도는 0.5%(w/v) 내지 5%(w/v)이다. 소정 구현예에서, 클로라이드 염은 NaCl이다. 소정 구현예에서, 폴록사머는 폴록사머 101(P101), 폴록사머 105(P105), 폴록사머 108(P108), 폴록사머 122(P122), 폴록사머 123(P123), 폴록사머 124(P124), 폴록사머 181(P181), 폴록사머 182(P182), 폴록사머 183(P183), 폴록사머 184(P184), 폴록사머 185(P185), 폴록사머 188(P188), 폴록사머 212(P212), 폴록사머 215(P215), 폴록사머 217(P217), 폴록사머 231(P231), 폴록사머 234(P234), 폴록사머 235(P235), 폴록사머 237(P237), 폴록사머 238(P238), 폴록사머 282(P282), 폴록사머 284(P284), 폴록사머 288(P288), 폴록사머 331(P331), 폴록사머 333(P333), 폴록사머 334(P334), 폴록사머 335(P335), 폴록사머 338(P338), 폴록사머 401(P401), 폴록사머 402(P402), 폴록사머 403(P403), 폴록사머 407(P407), 및 이의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 소정 구현예에서, 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60, 폴리소르베이트 80, 및 이의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 소정 구현예에서, 포스페이트 또는 히스티딘 완충액의 pH는 6.1, 6.3, 6.5, 6.7, 6.9, 7.1, 7.3, 7.5, 7.7, 또는 7.9이다. 소정 구현예에서, 포스페이트 또는 히스티딘 완충액의 농도는 10 mM, 15 mM, 20 mM, 또는 25 mM이다. 소정 구현예에서, 클로라이드 염은 100 mM, 110 mM, 130 mM, 또는 150 mM이다. 소정 구현예에서, 폴록사머 또는 폴리소르베이트의 농도는 0.03%(w/v), 0.05%(w/v), 0.07%(w/v), 또는 0.09%(w/v)이다. 소정 구현예에서, 탄수화물의 농도는 1%(w/v), 2%(w/v), 3%(w/v), 또는 4%(w/v)이다. 소정 구현예에서, 폴록사머는 폴록사머 188(P188)이다. 소정 구현예에서, 폴록사머는 폴록사머 407(P407)이다.
B.1. 출혈 장애
출혈 장애는 혈관 손상 부위에서 혈액의 응괴를 형성하는 능력의 손상 결과이다. 혈우병 A, 혈우병 B, 폰 빌레브란트병, 및 희귀 인자 결핍을 포함하는 몇몇 유형의 출혈 장애가 존재한다. 혈우병 A는 인자 VIII에 대해 돌연변이되거나 저발현되는 유전자에 의해 야기되는 인자 VIII(FVIII)의 결핍으로 인해 발생하는 반면, 혈우병 B는 인자 IX에 대해 돌연변이되거나 저발현되는 유전자에 의해 야기되는 인자 IX(FIX)의 결핍으로 인해 발생한다.
미국 질환 통제 예방 센터(Center for Disease Control and Prevention)에 따르면, 혈우병은 생존 5,000명 중 대략 1명에서 일어난다. 미국에는 약 20,000명의 혈우병 환자가 존재한다. 모든 인종 및 민족 그룹이 영향을 받는다. 혈우병 A는 혈우병 B보다 4배 더 많은 반면, 혈우병 A를 갖는 환자의 절반 초과가 중증 형태의 혈우병을 갖는다. 혈우병을 앓는 환자는 이의 수명에 걸쳐 광범위한 의학적 모니터링을 필요로 한다. 개입의 부재 하에, 이환 환자는 관절에서 자연 출혈을 겪으며, 이는 중증 통증 및 쇠약화 부동을 일으킨다. 근육 내로의 출혈은 이들 조직에서 혈액의 축적을 초래하는 반면, 목구멍 및 목에서의 자연 출혈은 즉시 치료되지 않는 경우 질식을 야기할 수 있다. 수술, 사소한 우발적 손상, 또는 발치 후의 신장 출혈 및 중증 출혈도 만연한다.
출혈 질환 또는 질병의 치료를 필요로 하는 대상체에서 출혈 질환 또는 질병을 치료하기 위해 사용되는 제형이 본원에서 개시된다. 출혈 질환 또는 질병은 출혈 응고 장애, 혈관절증, 근육 출혈, 구강 출혈, 대출혈, 근육으로의 대출혈, 구강 대출혈, 외상, 두부 외상, 위장관 출혈, 두개내 대출혈, 복부내 대출혈, 흉곽내 대출혈, 골절, 중추 신경계 출혈, 후인두 공간에서의 출혈, 후복막 공간에서의 출혈, 장요근초에서의 출혈 및 이의 임의의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 다른 구현예에서, 대상체는 수술을 받을 예정이다. 다른 구현예에서, 치료는 예방적 또는 대증적 치료이다.
안정하고 강력한 렌티바이러스 벡터(LV) 제형을 사용하는 유전자 치료법은 적절한 수준의 기능적 인자(Favor) VIII 또는 인자 IX의 발현을 초래하는 인자 VIII 또는 인자 IX 유전자의 세포 내로의 안정한 통합을 통해 혈우병 A 또는 B를 앓는 개체를 치료하는 데 있어서 큰 전망을 나타낸다.
체세포 유전자 치료법은 출혈 장애에 대한 가능한 치료로서 탐색되었다. 유전자 치료법은 각각의 응고 인자를 인코딩하는 벡터의 단회 투여 후 FVIII 또는 FIX의 연속 내인성 생성을 통해 질환을 근치할 그 가능성 때문에 혈우병에 대해 특히 매력적인 치료이다. 혈우병 A(FVIII의 결핍) 및 혈우병 B(FIX의 결핍)는 그 임상 발현이 전적으로 혈장에서 소량(200 ng/ml)으로 순환하는 단일 유전자 산물(FVIII 또는 FIX)의 결여에 기인할 수 있으므로 유전자 대체 접근에 매우 적합하다.
렌티바이러스는 이의 큰 용량 및 통합을 통해 트랜스유전자 발현을 유지하는 능력으로 인해 유전자 전달 비히클로서 두드러지고 있다. 렌티바이러스는 수많은 생체 외 세포 치료법 임상 프로그램에서 평가되었으며, 유망한 유효성 및 안전성 프로필을 갖고, 지난 10년 간 다양한 경험을 획득하였다. 렌티바이러스 생체내 유전자 치료법의 사용이 유명세를 얻음에 따라, 장기 보관을 위해 렌티바이러스의 안정성을 향상시키는 개선된 제형을 제공할 필요성이 당분야에 존재한다.
본 개시는 렌티바이러스 안정성을 부여하고, 장기 냉동 보관을 제공하는, 제형 완충액, 또는 비히클을 제공함으로써 당분야에서의 중요한 필요성을 충족한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 제형 완충액은 투여 경로가 전신인 경우 렌티바이러스 안정성을 부여하고 장기 냉동 보관을 제공한다. 일부 구현예에서, 렌티바이러스는 정제 후 본 개시의 제형 완충액, 또는 비히클 내로 가공된다. 제형화 시, 렌티바이러스는 냉동 보관된다. 본 발명의 제형 완충액, 또는 비히클은 냉동 및 해동뿐만 아니라 승온에 대한 노출 시 향상된 안정성을 부여한다.
유전자 치료법 방법에서 사용되는 경우 대상체에서 증가된 발현을 실증하고 잠재적으로 더 큰 치료 유효성을 초래하는 코돈 최적화된 FVIII 서열 또는 코돈 최적화된 FIX 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터가 본원에서 제공된다. 본 개시의 구현예는 본원에서 기재된 바와 같은 FVIII 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 코돈 최적화된 핵산 분자를 포함하는 렌티바이러스 벡터, 또는 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 코돈 최적화된 핵산 분자를 포함하는 렌티바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터를 포함하는 숙주 세포(예를 들어, 간세포), 및 개시된 렌티바이러스 벡터의 사용 방법(예를 들어, 본원에서 개시된 렌티바이러스 벡터를 사용하는 출혈 장애에 대한 치료)에 대한 것이다. 소정 구현예에서, 스케일-업 가공 동안, 렌티바이러스 벡터는 본 개시의 제형 완충액, 또는 비히클 내로 가공되는 렌티바이러스 내로 패키징된다.
일반적으로, 본원에서 개시된 치료 방법에는 FVIII 응고 인자를 인코딩하는 적어도 하나의 코돈 최적화된 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 렌티바이러스 벡터, 또는 FIX 응고 인자를 인코딩하는 적어도 하나의 코돈 최적화된 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 렌티바이러스 벡터의 투여가 관여된다. 일부 구현예에서, FVIII 응고 인자를 인코딩하는 핵산 서열은 적합한 발현 제어 서열에 작동 가능하게 연결되며, 이는 일부 구현예에서 렌티바이러스 벡터(예를 들어, 복제-결함 렌티바이러스 바이러스 벡터) 내로 혼입된다. 일부 구현예에서, FIX 응고 인자를 인코딩하는 핵산 서열은 적합한 발현 제어 서열에 작동 가능하게 연결되며, 이는 일부 구현예에서 렌티바이러스 벡터(예를 들어, 복제-결함 렌티바이러스 바이러스 벡터) 내로 혼입된다.
본 개시는 출혈 장애(예를 들어, 혈우병 A 또는 혈우병 B)의 치료를 필요로 하는 대상체에서 출혈 장애를 치료하는 방법으로서, FVIII 또는 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 적어도 1개 용량의 렌티바이러스 벡터를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다. 소정 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 본 발명의 제형 완충액 내로 가공되는 렌티바이러스 내로 패키징된다. 소정 구현예에서, FVIII 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 표 1에 나타낸 바와 같은, SEQ ID NO: 1에 나타낸 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 또는 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 100%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 소정 구현예에서, FVIII 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 표 1에 나타낸 바와 같은, SEQ ID NO: 1에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 구성된다. 소정 구현예에서, FVIII 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 표 1에 나타낸 바와 같은, SEQ ID NO: 2에 나타낸 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 또는 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 100%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 소정 구현예에서, FVIII 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 표 1에 나타낸 바와 같은, SEQ ID NO: 2에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 구성된다. 소정 구현예에서, FIX 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 표 1에 나타낸 바와 같은, SEQ ID NO: 3에 나타낸 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 또는 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 100%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 소정 구현예에서, FIX 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 표 1에 나타낸 바와 같은, SEQ ID NO: 3에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 구성된다.
본 개시는 출혈 장애(예를 들어, 혈우병 A 또는 혈우병 B)의 치료를 필요로 하는 대상체에서 출혈 장애를 치료하는 방법으로서, FVIII 또는 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 적어도 1개 용량의 렌티바이러스 벡터를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다. 소정 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 본 발명의 제형 완충액, 또는 비히클 내로 가공되는, 렌티바이러스 내로 패키징된다. 소정 구현예에서, 대상체에는 본원에서 기재된 바와 같은 FVIII 또는 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 적어도 1개 용량의 5x1010 이하의 형질도입 단위/kg(TU/kg)(또는 109 TU/kg 이하, 또는 108 TU/kg 이하)의 렌티바이러스 벡터가 투여된다.
일부 구현예에서, 용량은 약 5.0x1010 TU/kg, 약 4.9x1010 TU/kg, 약 4.8x1010 TU/kg, 약 4.7x1010 TU/kg, 약 4.6x1010 TU/kg, 약 4.5x1010 TU/kg, 약 4.4x1010 TU/kg, 약 4.3x1010 TU/kg, 약 4.2x1010 TU/kg, 약 4.1x1010 TU/kg, 약 4.0x1010 TU/kg, 약 3.9x1010 TU/kg, 약 3.8x1010 TU/kg, 약 3.7x1010 TU/kg, 약 3.6x1010 TU/kg, 약 3.5x1010 TU/kg, 약 3.4x1010 TU/kg, 약 3.3x1010 TU/kg, 약 3.2x1010 TU/kg, 약 3.1x1010 TU/kg, 약 3.0x1010 TU/kg, 약 2.9x1010 TU/kg, 약 2.8x1010 TU/kg, 약 2.7x1010 TU/kg, 약 2.6x1010 TU/kg, 약 2.5x1010 TU/kg, 약 2.4x1010 TU/kg, 약 2.3x1010 TU/kg, 약 2.2x1010 TU/kg, 약 2.1x1010 TU/kg, 약 2.0x1010 TU/kg, 약 1.9x1010 TU/kg, 약 1.8x1010 TU/kg, 약 1.7x1010 TU/kg, 약 1.6x1010 TU/kg, 약 1.5x1010 TU/kg, 약 1.4x1010 TU/kg, 약 1.3x1010 TU/kg, 약 1.2x1010 TU/kg, 약 1.1x1010 TU/kg, 또는 약 1.0x1010 TU/kg이다.
일부 구현예에서, 용량은 약 9.9x109 TU/kg, 약 9.8x109 TU/kg, 약 9.7x109 TU/kg, 약 9.6x109 TU/kg, 약 9.5x109 TU/kg, 약 9.4x109 TU/kg, 약 9.3x109 TU/kg, 약 9.2x109 TU/kg, 약 9.1x109 TU/kg, 약 9.0x109 TU/kg, 약 8.9x109 TU/kg, 약 8.8x109 TU/kg, 약 8.7x109 TU/kg, 약 8.6x109 TU/kg, 약 8.5x109 TU/kg, 약 8.4x109 TU/kg, 약 8.3x109 TU/kg, 약 8.2x109 TU/kg, 약 8.1x109 TU/kg, 약 8.0x109 TU/kg, 약 7.9x109 TU/kg, 약 7.8x109 TU/kg, 약 7.7x109 TU/kg, 약 7.6x109 TU/kg, 약 7.5x109 TU/kg, 약 7.4x109 TU/kg, 약 7.3x109 TU/kg, 약 7.2x109 TU/kg, 약 7.1x109 TU/kg, 약 7.0x109 TU/kg, 약 6.9x109 TU/kg, 약 6.8x109 TU/kg, 약 6.7x109 TU/kg, 약 6.6x109 TU/kg, 약 6.5x109 TU/kg, 약 6.4x109 TU/kg, 약 6.3x109 TU/kg, 약 6.2x109 TU/kg, 약 6.1x109 TU/kg, 약 6.0x109 TU/kg, 약 5.9x109 TU/kg, 약 5.8x109 TU/kg, 약 5.7x109 TU/kg, 약 5.6x109 TU/kg, 약 5.5x109 TU/kg, 약 5.4x109 TU/kg, 약 5.3x109 TU/kg, 약 5.2x109 TU/kg, 약 5.1x109 TU/kg, 약 5.0x109 TU/kg, 약 4.9x109 TU/kg, 약 4.8x109 TU/kg, 약 4.7x109 TU/kg, 약 4.6x109 TU/kg, 약 4.5x109 TU/kg, 약 4.4x109 TU/kg, 약 4.3x109 TU/kg, 약 4.2x109 TU/kg, 약 4.1x109 TU/kg, 약 4.0x109 TU/kg, 약 3.9x109 TU/kg, 약 3.8x109 TU/kg, 약 3.7x109 TU/kg, 약 3.6x109 TU/kg, 약 3.5x109 TU/kg, 약 3.4x109 TU/kg, 약 3.3x109 TU/kg, 약 3.2x109 TU/kg, 약 3.1x109 TU/kg, 약 3.0x109 TU/kg, 약 2.9x109 TU/kg, 약 2.8x109 TU/kg, 약 2.7x109 TU/kg, 약 2.6x109 TU/kg, 약 2.5x109 TU/kg, 약 2.4x109 TU/kg, 약 2.3x109 TU/kg, 약 2.2x109 TU/kg, 약 2.1x109 TU/kg, 약 2.0x109 TU/kg, 약 1.9x109 TU/kg, 약 1.8x109 TU/kg, 약 1.7x109 TU/kg, 약 1.6x109 TU/kg, 약 1.5x109 TU/kg, 약 1.4x109 TU/kg. 약 1.3x109 TU/kg, 약 1.2x109 TU/kg, 약 1.1x109 TU/kg, 또는 약 1.0x109 TU/kg이다.
일부 구현예에서, 용량은 약 9.9x108 TU/kg, 약 9.8x108 TU/kg, 약 9.7x108 TU/kg, 약 9.6x108 TU/kg, 약 9.5x108 TU/kg, 약 9.4x108 TU/kg, 약 9.3x108 TU/kg, 약 9.2x108 TU/kg, 약 9.1x108 TU/kg, 약 9.0x108 TU/kg, 약 8.9x108 TU/kg, 약 8.8x108 TU/kg, 약 8.7x108 TU/kg, 약 8.6x108 TU/kg, 약 8.5x108 TU/kg, 약 8.4x108 TU/kg, 약 8.3x108 TU/kg, 약 8.2x108 TU/kg, 약 8.1x108 TU/kg, 약 8.0x108 TU/kg, 약 7.9x108 TU/kg, 약 7.8x108 TU/kg, 약 7.7x108 TU/kg, 약 7.6x108 TU/kg, 약 7.5x108 TU/kg, 약 7.4x108 TU/kg, 약 7.3x108 TU/kg, 약 7.2x108 TU/kg, 약 7.1x108 TU/kg, 약 7.0x108 TU/kg, 약 6.9x108 TU/kg, 약 6.8x108 TU/kg, 약 6.7x108 TU/kg, 약 6.6x108 TU/kg, 약 6.5x108 TU/kg, 약 6.4x108 TU/kg, 약 6.3x108 TU/kg, 약 6.2x108 TU/kg, 약 6.1x108 TU/kg, 약 6.0x108 TU/kg, 약 5.9x108 TU/kg, 약 5.8x108 TU/kg, 약 5.7x108 TU/kg, 약 5.6x108 TU/kg, 약 5.5x108 TU/kg, 약 5.4x108 TU/kg, 약 5.3x108 TU/kg, 약 5.2x108 TU/kg, 약 5.1x108 TU/kg, 약 5.0x108 TU/kg, 약 4.9x108 TU/kg, 약 4.8x108 TU/kg, 약 4.7x108 TU/kg, 약 4.6x108 TU/kg, 약 4.5x108 TU/kg, 약 4.4x108 TU/kg, 약 4.3x108 TU/kg, 약 4.2x108 TU/kg, 약 4.1x108 TU/kg, 약 4.0x108 TU/kg, 약 3.9x108 TU/kg, 약 3.8x108 TU/kg, 약 3.7x108 TU/kg, 약 3.6x108 TU/kg, 약 3.5x108 TU/kg, 약 3.4x108 TU/kg, 약 3.3x108 TU/kg, 약 3.2x108 TU/kg, 약 3.1x108 TU/kg, 약 3.0x108 TU/kg, 약 2.9x108 TU/kg, 약 2.8x108 TU/kg, 약 2.7x108 TU/kg, 약 2.6x108 TU/kg, 약 2.5x108 TU/kg, 약 2.4x108 TU/kg, 약 2.3x108 TU/kg, 약 2.2x108 TU/kg, 약 2.1x108 TU/kg, 약 2.0x108 TU/kg, 약 1.9x108 TU/kg, 약 1.8x108 TU/kg, 약 1.7x108 TU/kg, 약 1.6x108 TU/kg, 약 1.5x108 TU/kg, 약 1.4x108 TU/kg. 약 1.3x108 TU/kg, 약 1.2x108 TU/kg, 약 1.1x108 TU/kg, 또는 약 1.0x108 TU/kg이다.
일부 구현예에서, 용량은 5.0x1010 TU/kg 미만, 4.9x1010 TU/kg 미만, 4.8x1010 TU/kg 미만, 4.7x1010 TU/kg 미만, 4.6x1010 TU/kg 미만, 4.5x1010 TU/kg 미만, 4.4x1010 TU/kg 미만, 4.3x1010 TU/kg 미만, 4.2x1010 TU/kg 미만, 4.1x1010 TU/kg 미만, 4.0x1010 TU/kg 미만, 3.9x1010 TU/kg 미만, 3.8x1010 TU/kg 미만, 3.7x1010 TU/kg 미만, 3.6x1010 TU/kg 미만, 3.5x1010 TU/kg 미만, 3.4x1010 TU/kg 미만, 3.3x1010 TU/kg 미만, 3.2x1010 TU/kg 미만, 3.1x1010 TU/kg 미만, 3.0x1010 TU/kg 미만, 2.9x1010 TU/kg 미만, 2.8x1010 TU/kg 미만, 2.7x1010 TU/kg 미만, 2.6x1010 TU/kg 미만, 2.5x1010 TU/kg 미만, 2.4x1010 TU/kg 미만, 2.3x1010 TU/kg 미만, 2.2x1010 TU/kg 미만, 2.1x1010 TU/kg 미만, 2.0x1010 TU/kg 미만, 1.9x1010 TU/kg 미만, 1.8x1010 TU/kg 미만, 1.7x1010 TU/kg 미만, 1.6x1010 TU/kg 미만, 1.5x1010 TU/kg 미만, 1.4x1010 TU/kg 미만, 1.3x1010 TU/kg 미만, 1.2x1010 TU/kg 미만, 1.1x1010 TU/kg 미만, 또는 1.0x1010 TU/kg 미만이다.
일부 구현예에서, 용량은 9.9x109 TU/kg 미만, 9.8x109 TU/kg 미만, 9.7x109 TU/kg 미만, 9.6x109 TU/kg 미만, 9.5x109 TU/kg 미만, 9.4x109 TU/kg 미만, 9.3x109 TU/kg 미만, 9.2x109 TU/kg 미만, 9.1x109 TU/kg 미만, 9.0x109 TU/kg 미만, 8.9x109 TU/kg 미만, 8.8x109 TU/kg 미만, 8.7x109 TU/kg 미만, 8.6x109 TU/kg 미만, 8.5x109 TU/kg 미만, 8.4x109 TU/kg 미만, 8.3x109 TU/kg 미만, 8.2x109 TU/kg 미만, 8.1x109 TU/kg 미만, 8.0x109 TU/kg 미만, 7.9x109 TU/kg 미만, 7.8x109 TU/kg 미만, 7.7x109 TU/kg 미만, 7.6x109 TU/kg 미만, 7.5x109 TU/kg 미만, 7.4x109 TU/kg 미만, 7.3x109 TU/kg 미만, 7.2x109 TU/kg 미만, 7.1x109 TU/kg 미만, 7.0x109 TU/kg 미만, 6.9x109 TU/kg 미만, 6.8x109 TU/kg 미만, 6.7x109 TU/kg 미만, 6.6x109 TU/kg 미만, 6.5x109 TU/kg 미만, 6.4x109 TU/kg 미만, 6.3x109 TU/kg 미만, 6.2x109 TU/kg 미만, 6.1x109 TU/kg 미만, 6.0x109 TU/kg 미만, 5.9x109 TU/kg 미만, 5.8x109 TU/kg 미만, 5.7x109 TU/kg 미만, 5.6x109 TU/kg 미만, 5.5x109 TU/kg 미만, 5.4x109 TU/kg 미만, 5.3x109 TU/kg 미만, 5.2x109 TU/kg 미만, 5.1x109 TU/kg 미만, 5.0x109 TU/kg 미만, 4.9x109 TU/kg 미만, 4.8x109 TU/kg 미만, 4.7x109 TU/kg 미만, 4.6x109 TU/kg 미만, 4.5x109 TU/kg 미만, 4.4x109 TU/kg 미만, 4.3x109 TU/kg 미만, 4.2x109 TU/kg 미만, 4.1x109 TU/kg 미만, 4.0x109 TU/kg 미만, 3.9x109 TU/kg 미만, 3.8x109 TU/kg 미만, 3.7x109 TU/kg 미만, 3.6x109 TU/kg 미만, 3.5x109 TU/kg 미만, 3.4x109 TU/kg 미만, 3.3x109 TU/kg 미만, 3.2x109 TU/kg 미만, 3.1x109 TU/kg 미만, 3.0x109 TU/kg 미만, 2.9x109 TU/kg 미만, 2.8x109 TU/kg 미만, 2.7x109 TU/kg 미만, 2.6x109 TU/kg 미만, 2.5x109 TU/kg 미만, 2.4x109 TU/kg 미만, 2.3x109 TU/kg 미만, 2.2x109 TU/kg 미만, 2.1x109 TU/kg 미만, 2.0x109 TU/kg 미만, 1.9x109 TU/kg 미만, 1.8x109 TU/kg 미만, 1.7x109 TU/kg 미만, 1.6x109 TU/kg 미만, 1.5x109 TU/kg 미만, 1.4x109 TU/kg 미만, 1.3x109 TU/kg 미만, 1.2x109 TU/kg 미만, 1.1x109 TU/kg 미만, 또는 1.0x109 TU/kg 미만이다.
일부 구현예에서, 용량은 9.9x108 TU/kg 미만, 9.8x108 TU/kg 미만, 9.7x108 TU/kg 미만, 9.6x108 TU/kg 미만, 9.5x108 TU/kg 미만, 9.4x108 TU/kg 미만, 9.3x108 TU/kg 미만, 9.2x108 TU/kg 미만, 9.1x108 TU/kg 미만, 9.0x108 TU/kg 미만, 8.9x108 TU/kg 미만, 8.8x108 TU/kg 미만, 8.7x108 TU/kg 미만, 8.6x108 TU/kg 미만, 8.5x108 TU/kg 미만, 8.4x108 TU/kg 미만, 8.3x108 TU/kg 미만, 8.2x108 TU/kg 미만, 8.1x108 TU/kg 미만, 8.0x108 TU/kg 미만, 7.9x108 TU/kg 미만, 7.8x108 TU/kg 미만, 7.7x108 TU/kg 미만, 7.6x108 TU/kg 미만, 7.5x108 TU/kg 미만, 7.4x108 TU/kg 미만, 7.3x108 TU/kg 미만, 7.2x108 TU/kg 미만, 7.1x108 TU/kg 미만, 7.0x108 TU/kg 미만, 6.9x108 TU/kg 미만, 6.8x108 TU/kg 미만, 6.7x108 TU/kg 미만, 6.6x108 TU/kg 미만, 6.5x108 TU/kg 미만, 6.4x108 TU/kg 미만, 6.3x108 TU/kg 미만, 6.2x108 TU/kg 미만, 6.1x108 TU/kg 미만, 6.0x108 TU/kg 미만, 5.9x108 TU/kg 미만, 5.8x108 TU/kg 미만, 5.7x108 TU/kg 미만, 5.6x108 TU/kg 미만, 5.5x108 TU/kg 미만, 5.4x108 TU/kg 미만, 5.3x108 TU/kg 미만, 5.2x108 TU/kg 미만, 5.1x108 TU/kg 미만, 5.0x108 TU/kg 미만, 4.9x108 TU/kg 미만, 4.8x108 TU/kg 미만, 4.7x108 TU/kg 미만, 4.6x108 TU/kg 미만, 4.5x108 TU/kg 미만, 4.4x108 TU/kg 미만, 4.3x108 TU/kg 미만, 4.2x108 TU/kg 미만, 4.1x108 TU/kg 미만, 4.0x108 TU/kg 미만, 3.9x108 TU/kg 미만, 3.8x108 TU/kg 미만, 3.7x108 TU/kg 미만, 3.6x108 TU/kg 미만, 3.5x108 TU/kg 미만, 3.4x108 TU/kg 미만, 3.3x108 TU/kg 미만, 3.2x108 TU/kg 미만, 3.1x108 TU/kg 미만, 3.0x108 TU/kg 미만, 2.9x108 TU/kg 미만, 2.8x108 TU/kg 미만, 2.7x108 TU/kg 미만, 2.6x108 TU/kg 미만, 2.5x108 TU/kg 미만, 2.4x108 TU/kg 미만, 2.3x108 TU/kg 미만, 2.2x108 TU/kg 미만, 2.1x108 TU/kg 미만, 2.0x108 TU/kg 미만, 1.9x108 TU/kg 미만, 1.8x108 TU/kg 미만, 1.7x108 TU/kg 미만, 1.6x108 TU/kg 미만, 1.5x108 TU/kg 미만, 1.4x108 TU/kg 미만, 1.3x108 TU/kg 미만, 1.2x108 TU/kg 미만, 1.1x108 TU/kg 미만, 또는 1.0x108 TU/kg 미만이다.
일부 구현예에서, 용량은 1x108 TU/kg 내지 5x1010 TU/kg, 1.5x108 TU/kg 내지 5x1010 TU/kg, 2x108 TU/kg 내지 5x1010 TU/kg, 2.5x108 TU/kg 내지 5x1010 TU/kg, 3x108 TU/kg 내지 5x1010 TU/kg, 3.5x108 TU/kg 내지 5x1010 TU/kg, 4x108 TU/kg 내지 5x1010 TU/kg, 4.5x108 TU/kg 내지 5x1010 TU/kg, 5x108 TU/kg 내지 5x1010 TU/kg, 5.5x108 TU/kg 내지 5x1010 TU/kg, 6x108 TU/kg 내지 5x1010 TU/kg, 6.5x108 TU/kg 내지 5x1010 TU/kg, 7x108 TU/kg 내지 5x1010 TU/kg, 7.5x108 TU/kg 내지 5x1010 TU/kg, 8x108 TU/kg 내지 5x1010 TU/kg, 8.5x108 TU/kg 내지 5x1010 TU/kg, 9x108 TU/kg 내지 5x1010 TU/kg, 9.5x108 TU/kg 내지 5x1010 TU/kg, 1x109 TU/kg 내지 5x1010 TU/kg, 1.5x109 TU/kg 내지 5x1010 TU/kg, 2x109 TU/kg 내지 5x1010 TU/kg, 2.5x109 TU/kg 내지 5x1010 TU/kg, 3x109 TU/kg 내지 5x1010 TU/kg, 3.5x109 TU/kg 내지 5x1010 TU/kg, 4x109 TU/kg 내지 5x1010 TU/kg, 4.5x109 TU/kg 내지 5x1010 TU/kg, 5x109 TU/kg 내지 5x1010 TU/kg, 5.5x109 TU/kg 내지 5x1010 TU/kg, 6x109 TU/kg 내지 5x1010 TU/kg, 6.5x109 TU/kg 내지 5x1010 TU/kg, 7x109 TU/kg 내지 5x1010 TU/kg, 7.5x109 TU/kg 내지 5x1010 TU/kg, 8x109 TU/kg 내지 5x1010 TU/kg, 8.5x109 TU/kg 내지 5x1010 TU/kg, 9x109 TU/kg 내지 5x1010 TU/kg, 9.5x109 TU/kg 내지 5x1010 TU/kg, 1010 TU/kg 내지 5x1010 TU/kg, 1.5x1010 TU/kg 내지 5x1010 TU/kg, 2x1010 TU/kg 내지 5x1010 TU/kg, 2.5x1010 TU/kg 내지 5x1010 TU/kg, 3x1010 TU/kg 내지 5x1010 TU/kg, 3.5x1010 TU/kg 내지 5x1010 TU/kg, 4x1010 TU/kg 내지 5x1010 TU/kg, 또는 4.5x1010 TU/kg 내지 5x1010 TU/kg이다.
일부 구현예에서, 용량은 1x108 TU/kg 내지 5x1010 TU/kg, 1x108 TU/kg 내지 4.5x1010 TU/kg, 1x108 TU/kg 내지 4x1010 TU/kg, 1x108 TU/kg 내지 3.5x1010 TU/kg, 1x108 TU/kg 내지 3x1010 TU/kg, 1x108 TU/kg 내지 2.5x1010 TU/kg, 1x108 TU/kg 내지 2x1010 TU/kg, 1x108 TU/kg 내지 1.5x1010 TU/kg, 1x108 TU/kg 내지 1010 TU/kg, 1x108 TU/kg 내지 9x109 TU/kg, 1x108 TU/kg 내지 8.5x109 TU/kg, 1x108 TU/kg 내지 8x109 TU/kg, 1x108 TU/kg 내지 7.5x109 TU/kg, 1x108 TU/kg 내지 7x109 TU/kg, 1x108 TU/kg 내지 6.5x109 TU/kg, 1x108 TU/kg 내지 6x109 TU/kg, 1x108 TU/kg 내지 5.5x109 TU/kg, 1x108 TU/kg 내지 5x109 TU/kg, 1x108 TU/kg 내지 4.5x109 TU/kg, 1x108 TU/kg 내지 4x109 TU/kg, 1x108 TU/kg 내지 3.5x109 TU/kg, 1x108 TU/kg 내지 3x109 TU/kg, 1x108 TU/kg 내지 2.5x109 TU/kg, 1x108 TU/kg 내지 2x109, 1x108 TU/kg 내지 1.5x109 TU/kg, 1x108 TU/kg 내지 1x109 TU/kg, 1x108 TU/kg 내지 9.5x108 TU/kg, 1x108 TU/kg 내지 9x108 TU/kg, 1x108 TU/kg 내지 8.5x108 TU/kg, 1x108 TU/kg 내지 8x108 TU/kg, 1x108 TU/kg 내지 7.5x108 TU/kg, 1x108 TU/kg 내지 7x108 TU/kg, 1x108 TU/kg 내지 6.5x108 TU/kg, 1x108 TU/kg 내지 6x108 TU/kg, 1x108 TU/kg 내지 5.5x108 TU/kg, 1x108 TU/kg 내지 5x108 TU/kg, 1x108 TU/kg 내지 4.5x108 TU/kg, 1x108 TU/kg 내지 4x108 TU/kg, 1x108 TU/kg 내지 3.5x108 TU/kg, 1x108 TU/kg 내지 3x108 TU/kg, 1x108 TU/kg 내지 2.5x108 TU/kg, 1x108 TU/kg 내지 2x108, 또는 1x108 TU/kg 내지 1.5x108 TU/kg이다.
일부 구현예에서, 용량은 1x1010 TU/kg 내지 2x1010 TU/kg, 1.1x1010 TU/kg 내지 1.9x1010 TU/kg, 1.2x1010 TU/kg 내지 1.8x1010 TU/kg, 1.3x1010 TU/kg 내지 1.7x1010 TU/kg, 또는 1.4x1010 TU/kg 내지 1.6x1010 TU/kg이다. 일부 구현예에서, 용량은 약 1.5x1010 TU/kg이다. 일부 구현예에서, 용량은 1.5x1010 TU/kg이다.
일부 구현예에서, 용량은 1x109 TU/kg 내지 2x109 TU/kg, 1.1x109 TU/kg 내지 1.9x109 TU/kg, 1.2x109 TU/kg 내지 1.8x109 TU/kg, 1.3x109 TU/kg 내지 1.7x109 TU/kg, 또는 1.4x109 TU/kg 내지 1.6x109 TU/kg이다. 일부 구현예에서, 용량은 1.5x109 TU/kg이다. 소정 구현예에서, 용량은 약 3.0 x 109 TU/kg이다.
일부 구현예에서, 본 개시의 렌티바이러스 벡터의 투여 24시간, 36시간 또는 48시간 후 혈장 FVIII 활성은 대조군 렌티바이러스 벡터를 투여받은 대상체에서의 혈장 FVIII 활성에 비해 증가된다. 일부 구현예에서, 본 개시의 렌티바이러스 벡터의 투여 24시간, 36시간 또는 48시간 후 혈장 FVIII 활성은 대조군 핵산 분자를 투여받은 대상체에서의 혈장 FVIII 활성에 비해 증가된다.
일부 구현예에서, 본 개시의 렌티바이러스 벡터의 투여 24시간, 36시간 또는 48시간 후 혈장 FIX 활성은 대조군 렌티바이러스 벡터를 투여받은 대상체에서의 혈장 FIX 활성에 비해 증가된다. 일부 구현예에서, 본 개시의 렌티바이러스 벡터의 투여 24시간, 36시간 또는 48시간 후 혈장 FIX 활성은 대조군 핵산 분자를 투여받은 대상체에서의 혈장 FIX 활성에 비해 증가된다.
일부 구현예에서, 혈장 FVIII 또는 혈장 FIX 활성은 본 개시의 렌티바이러스 벡터의 투여 약 6시간, 약 12시간, 약 18시간, 약 24시간, 약 36시간, 약 48시간, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 8일, 약 9일, 약 10일, 약 11일, 약 12일, 약 13일, 약 14일, 약 15일, 약 16일, 약 17일, 약 18일, 약 19일, 약 20일, 약 21일, 약 22일, 약 23일, 약 24일, 약 25일, 약 26일, 약 27일, 또는 약 28일 후 대조군 렌티바이러스 벡터 또는 대조군 핵산 분자를 투여받은 대상체에 비해 증가된다.
일부 구현예에서, 대상체에서의 혈장 FVIII 또는 혈장 FIX 활성은 대상체에서의 기저 수준에 대해, 대조군 렌티바이러스 벡터 또는 대조군 핵산 분자를 투여받은 대상체에서의 수준에 비해 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 11배, 적어도 약 12배, 적어도 약 13배, 적어도 약 14배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배, 적어도 약 45배, 적어도 약 50배, 적어도 약 55배, 적어도 약 60배, 적어도 약 65배, 적어도 약 70배, 적어도 약 75배, 적어도 약 80배, 적어도 약 85배, 적어도 약 90배, 적어도 약 95배, 적어도 약 100배, 적어도 약 110배, 적어도 약 120배, 적어도 약 130배, 적어도 약 140배, 적어도 약 150배, 적어도 약 160배, 적어도 약 170배, 적어도 약 180배, 적어도 약 190배, 또는 적어도 약 200배 증가된다.
일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 단회 용량 또는 다회 용량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터의 용량은 한 번에 투여되거나 다회의 하위 용량, 예를 들어, 2개의 하위 용량, 3개의 하위 용량, 4개의 하위 용량, 5개의 하위 용량, 또는 6개 이상의 하위 용량으로 나누어진다. 일부 구현예에서, 하나 초과의 렌티바이러스 벡터가 투여된다.
일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터의 용량은 적어도 2회, 적어도 3회, 적어도 4회, 적어도 5회, 적어도 6회, 적어도 7회, 적어도 8회, 적어도 9회, 또는 적어도 10회 반복 투여된다. 일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 정맥내 주사를 통하여 투여된다.
일부 구현예에서, 대상체는 소아 대상체이다. 일부 구현예에서, 대상체는 성인 대상체이다.
일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 적어도 하나의 조직 특이적 프로모터, 즉 특정 조직 또는 세포 유형에서 FVIII 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드의 발현을 조절할 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터에서의 조직 특이적 프로모터는 표적 간 세포에서 FVIII 활성을 갖는 폴리펩티드의 발현을 선택적으로 향상시킨다. 일부 구현예에서, 표적 간 세포에서 FVIII 활성을 갖는 폴리펩티드의 발현을 선택적으로 향상시키는 조직 특이적 프로모터는 mTTR 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 간 세포에서 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드의 발현을 선택적으로 향상시키는 조직 특이적 프로모터는 APOA2 프로모터, SERPINA1(hAAT) 프로모터, mTTR 프로모터, MIR122 프로모터, ET 프로모터(GenBank No. AY661265; 또한 문헌[Vigna et al., Molecular Therapy 11(5):763 (2005)] 참고), 또는 이의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 간 세포는 간세포이다.
렌티바이러스 벡터가 모든 간 세포 유형을 형질도입시킬 수 있으므로, 다른 세포 유형에서의 트랜스유전자(예를 들어, FVIII 또는 FIX)의 발현은 렌티바이러스 벡터에서 상이한 프로모터를 사용하여 제어할 수 있다. 따라서, 렌티바이러스 벡터는 상이한 조직 또는 세포 유형, 예컨대 상이한 간 조직 또는 세포 유형에서 FVIII 트랜스유전자 또는 FIX 트랜스유전자의 발현을 제어할 특이적 프로모터를 포함할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 간 내피 조직에서 FVIII 트랜스유전자 또는 FIX 트랜스유전자의 발현을 제어할 내피 특이적 프로모터, 또는 간세포에서 FVIII 트랜스유전자 또는 FIX 트랜스유전자의 발현을 제어할 간세포 특이적 프로모터, 또는 둘 모두를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 간 이외의 조직에서 FVIII 트랜스유전자 또는 FIX 트랜스유전자의 발현을 제어하는 조직 특이적 프로모터 또는 조직 특이적 프로모터들을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 핵산 분자는 표적 세포 또는 표적 조직의 게놈, 예를 들어 간세포의 게놈 또는 간 내피 세포의 게놈 내로 안정적으로 통합된다.
일부 구현예에서, 본 개시의 렌티바이러스 벡터에서의 단리된 핵산 분자는 이종성 아미노산 서열(예를 들어, 반감기 연장제)을 인코딩하는 이종성 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 이종성 아미노산 서열은 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 부분, XTEN, 트랜스페린, 알부민 또는 PAS 서열이다. 일부 구현예에서, 이종성 아미노산 서열은 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 연결되거나, 표 2으로부터 선택되는 1개 이상의 삽입 부위에서 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열에서의 2개의 아미노산 사이에 삽입된다. 이종성 뉴클레오티드 서열이 본원에서 추가로 기재된다.
일부 구현예에서, FVIII 활성을 갖는 폴리펩티드는 인간 FVIII이다. 일부 구현예에서, FVIII 활성을 갖는 폴리펩티드는 전장 FVIII이다. 일부 구현예에서, FVIII 활성을 갖는 폴리펩티드는 B 도메인 결실 FVIII이다.
일부 구현예에서, FIX 활성을 갖는 폴리펩티드는 인간 FIX이다. 일부 구현예에서, FIX 활성을 갖는 폴리펩티드는 전장 FIX이다. 일부 구현예에서, FIX 활성을 갖는 폴리펩티드는 인간 FIX의 변이체이다. 소정 구현예에서, FIX 활성을 갖는 폴리펩티드는 인간 FIX의 R338L 변이체이다. 소정 구현예에서, FIX 활성을 갖는 폴리펩티드는 Padua 변이체이다.
본원에서 개시되는 렌티바이러스 벡터는 출혈 응고 장애, 혈관절증, 근육 출혈, 구강 출혈, 대출혈, 근육으로의 대출혈, 구강 대출혈, 외상, 두부 외상, 위장관 출혈, 두개내 대출혈, 복부내 대출혈, 흉곽내 대출혈, 골절, 중추 신경계 출혈, 후인두 공간에서의 출혈, 후복막 공간에서의 출혈 및 장요근초에서의 출혈로 구성되는 군으로부터 선택되는 출혈 질환 또는 장애의 치료에 대한 유전자 치료법 접근을 사용하여 포유류, 예를 들어 인간 환자에서 생체내 사용될 수 있고 치료적으로 유익할 것이다. 하나의 구현예에서, 출혈 질환 또는 장애는 혈우병이다. 다른 구현예에서, 출혈 질환 또는 장애는 혈우병 A이다. 다른 구현예에서, 출혈 질환 또는 장애는 혈우병 B이다.
일부 구현예에서, 표적 세포(예를 들어, 간세포)는 환자에게 투여되기 전에, 본원에서 개시된 렌티바이러스 벡터로 시험관 내 처리된다. 소정 구현예에서, 표적 세포(예를 들어, 간세포)는 환자에게 투여되기 전에 본원에서 개시된 렌티바이러스 벡터로 시험관 내 처리된다. 다른 구현예에서, 환자로부터의 세포(예를 들어, 간세포)는 환자에게 투여되기 전에 본원에서 개시된 렌티바이러스 벡터로 생체 외 처리된다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 렌티바이러스 벡터(예를 들어, 1010 TU/kg 이하, 109 TU/kg 이하, 또는 108 TU/kg 이하로 투여됨)의 투여 후 혈장 FVIII 활성은 생리학적 정상 순환 FVIII 수준에 비해 적어도 약 100%, 적어도 약 110%, 적어도 약 120%, 적어도 약 130%, 적어도 약 140%, 적어도 약 150%, 적어도 약 160%, 적어도 약 170%, 적어도 약 180%, 적어도 약 190%, 적어도 약 200%, 적어도 약 210%, 적어도 약 220%, 적어도 약 230%, 적어도 약 240%, 적어도 약 250%, 적어도 약 260%, 적어도 약 270%, 적어도 약 280%, 적어도 약 290%, 또는 적어도 약 300% 증가된다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 렌티바이러스 벡터(예를 들어, 1010 TU/kg 이하, 109 TU/kg 이하, 또는 108 TU/kg 이하로 투여됨)의 투여 후 혈장 FIX 활성은 생리학적 정상 순환 FIX 수준에 비해 적어도 약 100%, 적어도 약 110%, 적어도 약 120%, 적어도 약 130%, 적어도 약 140%, 적어도 약 150%, 적어도 약 160%, 적어도 약 170%, 적어도 약 180%, 적어도 약 190%, 적어도 약 200%, 적어도 약 210%, 적어도 약 220%, 적어도 약 230%, 적어도 약 240%, 적어도 약 250%, 적어도 약 260%, 적어도 약 270%, 적어도 약 280%, 적어도 약 290%, 또는 적어도 약 300% 증가된다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 렌티바이러스 벡터의 투여 후 혈장 FVIII 활성은 생리학적 정상 순환 FVIII 수준에 비해 적어도 약 3,000% 내지 약 5,000% 증가된다. 일부 구현예에서, 본원에서 기재된 인자 VIII(FVIII) 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 코돈-최적화된 유전자를 포함하는 렌티바이러스 벡터의 투여 후, 혈장 FVIII 활성은 대조군 렌티바이러스 벡터 또는 대조군 핵산 분자를 투여받은 대상체에 비해 적어도 약 10배, 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 40배, 적어도 약 50배, 적어도 약 60배, 적어도 약 70배, 적어도 약 80배, 적어도 약 90배, 적어도 약 100배, 적어도 약 110배, 적어도 약 120배, 적어도 약 130배, 적어도 약 140배, 적어도 약 150배, 적어도 약 160배, 적어도 약 170배, 적어도 약 180배, 적어도 약 190배, 또는 적어도 약 200배 증가된다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 렌티바이러스 벡터의 투여 후 혈장 FIX 활성은 생리학적 정상 순환 FIX 수준에 비해 적어도 약 3,000% 내지 약 5,000% 증가된다. 일부 구현예에서, 본원에서 기재된 인자 IX(FIX) 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 코돈-최적화된 유전자를 포함하는 렌티바이러스 벡터의 투여 후, 혈장 FIX 활성은 대조군 렌티바이러스 벡터 또는 대조군 핵산 분자를 투여받은 대상체에 비해 적어도 약 10배, 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 40배, 적어도 약 50배, 적어도 약 60배, 적어도 약 70배, 적어도 약 80배, 적어도 약 90배, 적어도 약 100배, 적어도 약 110배, 적어도 약 120배, 적어도 약 130배, 적어도 약 140배, 적어도 약 150배, 적어도 약 160배, 적어도 약 170배, 적어도 약 180배, 적어도 약 190배, 또는 적어도 약 200배 증가된다.
본 개시는 또한 출혈 장애(예를 들어, 혈우병 A 또는 혈우병 B와 같은 출혈 장애)의 치료, 예방, 또는 완화를 필요로 하는 대상체에서 출혈 장애를 치료하거나, 예방하거나, 완화시키는 방법으로서, FVIII 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 포함하는 치료 유효량의 렌티바이러스 벡터를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다.
본 개시의 렌티바이러스 벡터에 의한 치료, 개선 및 예방은 우회 치료법일 수 있다. 우회 치료법을 제공받는 대상체는 이미 응고 인자, 예를 들어 FVIII 또는 FIX에 대한 억제제가 생겼을 수 있거나 응고 인자 억제제가 생기게 한다.
본 개시의 렌티바이러스 벡터는 섬유소 응괴의 형성을 촉진함으로써 지혈 장애를 치료 또는 예방한다. 본 개시의 핵산 분자에 의해 인코딩된 FVIII 또는 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드는 응고 캐스케이드의 구성원을 활성화할 수 있다. 응고 인자는 외인성 경로, 내인성 경로 또는 이들 둘 모두에 참여할 수 있다.
본 개시의 렌티바이러스 벡터는 FVIII 또는 FIX로 치료 가능한 것으로 공지된 지혈 장애를 치료하는 데 사용될 수 있다. 본 개시의 방법을 사용하여 치료될 수 있는 지혈 장애는 혈우병 A, 혈우병 B, 폰 빌레브란트병, 인자 XI 결핍(PTA 결핍), 인자 XII 결핍뿐만 아니라 피브리노겐, 프로트롬빈, 인자 V, 인자 VII, 인자 X 또는 인자 XIII의 결핍 또는 구조적 이상, 혈관절증, 근육 출혈, 구강 출혈, 대출혈, 근육으로의 대출혈, 구강 대출혈, 외상, 두부 외상, 위장관 출혈, 두개내 대출혈, 복부내 대출혈, 흉곽내 대출혈, 골절, 중추 신경계 출혈, 후인두 공간에서의 출혈, 후복막 공간에서의 출혈 및 장요근초에서의 출혈을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
대상체에게 투여하기 위한 조성물은 FVIII 응고 인자 또는 FIX 응고 인자(유전자 치료법 응용을 위해)와, FVIII 또는 FIX 폴리펩티드 분자를 인코딩하는 본 개시의 최적화된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 렌티바이러스 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 투여용 조성물은 생체 내, 시험관 내 또는 생체 외에서 본 개시의 렌티바이러스 벡터와 접촉된 세포이다.
일부 구현예에서, 지혈 장애는 유전성 장애이다. 하나의 구현예에서, 대상체는 혈우병 A를 갖는다. 다른 구현예에서, 지혈 장애는 FVIII 결핍의 결과이다. 다른 구현예에서, 지혈 장애는 결함성 FVIII 응고 인자의 결과일 수 있다. 하나의 구현예에서, 대상체는 혈우병 B를 갖는다. 다른 구현예에서, 지혈 장애는 FIX 결핍의 결과이다. 다른 구현예에서, 지혈 장애는 결함성 FIX 응고 인자의 결과일 수 있다.
다른 구현예에서, 지혈 장애는 후천성 장애일 수 있다. 후천성 장애는 기저 속발성 질환 또는 질병으로 인해 발생할 수 있다. 비관련된 질병은 제한으로서가 아니라 예를 들어, 암, 자가 면역 질환 또는 임신일 수 있다. 후천성 장애는 노령이나 기저 속발성 장애를 치료하기 위한 약물(예를 들어, 암 화학치료법)로 인해 발생할 수 있다.
본 개시는 또한 지혈 장애 또는 지혈 장애의 획득을 초래하는 속발성 질환 또는 질병을 갖지 않는 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 개시는 따라서 일반 지혈제를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법으로서, 치료 유효량의 본 개시의 렌티바이러스 벡터를 투여하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 하나의 구현예에서, 일반 지혈제를 필요로 하는 대상체는 수술을 받고 있거나 곧 받을 예정이다. 본 개시의 렌티바이러스 벡터는 예방제로서 수술 전 또는 후에 투여될 수 있다.
본 개시의 렌티바이러스 벡터는 급성 출혈 에피소드를 제어하기 위해 수술 중에 또는 수술 후에 투여될 수 있다. 수술은 간 이식, 간 절제 또는 줄기 세포 이식을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
다른 구현예에서, 본 개시의 렌티바이러스 벡터는 지혈 장애가 없는 급성 출혈 에피소드를 갖는 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있다. 급성 출혈 에피소드는 중증 외상, 예를 들어 수술, 자동차 사고, 상처, 열상 총상 또는 제어되지 않는 출혈을 초래하는 임의의 다른 외상성 이벤트로 인해 발생할 수 있다.
렌티바이러스 벡터는 지혈 장애를 갖는 대상체를 예방적으로 치료하는 데 사용될 수 있다. 렌티바이러스 벡터는 또한 지혈 장애가 있는 대상체에서 급성 출혈 에피소드를 치료하는 데 사용될 수 있다.
다른 구현예에서, 본원에 개시된 렌티바이러스 벡터의 투여 및/또는 FVIII 단백질 또는 FIX 단백질의 후속 발현은 대상체에서 면역 반응을 유도하지 않는다. 일부 구현예에서, 면역 반응은 FVIII 또는 FIX에 대한 항체의 발생을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 반응은 사이토카인 분비를 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 반응은 B 세포, T 세포, 또는 B 세포와 T 세포 둘 모두의 활성화를 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 반응은 억제성 면역 반응이고, 대상체에서의 면역 반응은 면역 반응이 발생하지 않은 대상체에서의 FVIII의 활성에 비해 FVIII 단백질의 활성을 감소시킨다. 소정 구현예에서, 본 개시의 렌티바이러스 벡터를 투여함에 의한 FVIII 단백질의 발현은 FVIII 단백질, 또는 단리된 핵산 분자 또는 렌티바이러스 벡터로부터 발현된 FVIII 단백질에 대한 억제성 면역 반응을 방지한다. 일부 구현예에서, 면역 반응은 억제성 면역 반응이고, 대상체에서의 면역 반응은 면역 반응이 발생하지 않은 대상체에서의 FIX의 활성에 비해 FIX 단백질의 활성을 감소시킨다. 소정 구현예에서, 본 개시의 렌티바이러스 벡터를 투여함에 의한 FIX 단백질의 발현은 FIX 단백질, 또는 단리된 핵산 분자 또는 렌티바이러스 벡터로부터 발현된 FIX 단백질에 대한 억제성 면역 반응을 방지한다.
소정 구현예에서, 본 개시의 렌티바이러스 벡터는 지혈을 촉진하는 적어도 하나의 다른 제제와 조합되어 투여된다. 지혈을 촉진하는 상기 다른 제제로는 응고 활성이 입증된 치료제가 있다. 예로서, 그러나 제한으로서가 아니라, 지혈제는 인자 V, 인자 VII, 인자 IX, 인자 X, 인자 XI, 인자 XII, 인자 XIII, 프로트롬빈 또는 피브리노겐 또는 임의의 전술한 것의 활성화된 형태를 포함할 수 있다. 응고 인자 또는 지혈제는 또한 항-섬유소용해 약물, 예를 들어 엡실론-아미노-카프르산, 트라넥삼산을 포함할 수 있다.
본 개시의 하나의 구현예에서, 조성물(예를 들어, 렌티바이러스 벡터)은 FVIII이 대상체에게 투여되는 경우 활성화 가능한 형태로 존재하는 것이다. 본 개시의 하나의 구현예에서, 조성물(예를 들어, 렌티바이러스 벡터)은 FIX가 대상체에게 투여되는 경우 활성화 가능한 형태로 존재하는 것이다. 이러한 활성화 가능한 분자는 대상체에게 투여한 후 응고 부위에서 생체내 활성화될 수 있다.
본 개시의 렌티바이러스 벡터는 정맥내, 피하, 근육내 또는 임의의 점막 표면을 통해, 예를 들어, 경구, 설하, 협측, 설하, 비강, 직장, 질 또는 폐 경로를 통해 투여될 수 있다. 렌티바이러스 벡터는 요망되는 부위로의 벡터의 느린 방출을 허용하는 바이오폴리머 고체 지지체 내에 임플란트될 수 있거나 이에 연결될 수 있다.
하나의 구현예에서, 렌티바이러스 벡터의 투여 경로는 비경구이다. 본원에서 사용되는 용어 비경구란 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 피하, 직장 또는 질 투여를 포함한다. 정맥내 형태의 비경구 투여가 바람직하다. 모든 이들 형태의 투여가 본 개시의 범위 내인 것으로 명백히 고려되나, 투여를 위한 형태는 특히 정맥내 또는 동맥내 주사 또는 점적주입을 위한 주사용 용액일 것이다. 보통, 주사에 적합한 약학 조성물은 완충액(예를 들어, 아세테이트, 포스페이트 또는 시트레이트 완충액), 계면활성제(예를 들어, 폴리소르베이트), 선택적으로 안정제(예를 들어, 인간 알부민) 등을 포함할 수 있다. 그러나, 본원의 교시내용과 양립하는 다른 방법에서, 렌티바이러스 벡터는 유해한 세포 집단 부위에 직접 전달됨으로써 치료제에 대한 이환 조직의 노출을 증가시킬 수 있다.
비경구 투여를 위한 조제물은 살균 수용액 또는 비수용액, 현탁액 및 에멀션을 포함한다. 비수용성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 오일 및 에틸 올레에이트와 같은 주사용 유기 에스테르이다. 수용성 담체는, 염수 및 완충 매질을 포함하는, 물, 알코올성/수성 용액, 에멀션 또는 현탁액을 포함한다. 본 개시에서, 약학적으로 허용 가능한 담체는 0.01 M 내지 0.1 M, 그리고 바람직하게는 0.05 M 포스페이트 완충액 또는 0.8% 염수를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 다른 흔한 비경구 비히클은 인산나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 락테이트화 링거액 또는 신전유를 포함한다. 정맥내 비히클은 링거 덱스트로스에 기반한 것 등과 같은 전해질 보충물, 유체 및 영양 보충물 등을 포함한다. 예를 들어, 항미생물제, 항산화제, 킬레이팅제 및 불활성 기체 등과 같은 보존제 및 기타 첨가제가 또한 존재할 수 있다.
더 구체적으로, 주사용으로 적합한 약학 조성물은 살균 수용액(수용성인 경우) 또는 분산액 및 살균 주사 용액 또는 분산액의 즉석 조제를 위한 살균 분말을 포함한다. 이러한 경우에, 조성물은 살균되어야 하고, 용이한 주사 가능성이 존재하는 정도의 유체여야 한다. 이는 제조 및 보관 조건 하에서 안정해야 하고, 바람직하게는 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용으로부터 보존될 것이다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 코팅, 예를 들어, 레시틴의 사용, 분산액의 경우에서 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.
미생물의 작용 방지는 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에, 조성물 내에 등장화제, 예를 들어, 당, 폴리알코올, 예를 들어, 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사용 조성물의 흡수 연장은 조성물 내에 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시킴으로써 일으킬 수 있다.
임의의 경우, 살균 주사용 용액은, 본원에 나열된 성분 중 하나 또는 그 조합과 함께, 적절한 용매 내로 활성 화합물(예컨대, 단독의 또는 다른 활성제와 조합된 폴리펩티드)을 요구되는 양으로 혼입시키고, 필요한 경우, 그 후 여과 살균함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산 매질 및 상기 열거된 것들로부터 필요한 다른 성분을 함유하는 살균 비히클 내로 활성 화합물을 혼입시킴으로써 제조된다. 살균 주사용 용액의 제조를 위한 살균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법으로는 활성 성분 + 이전에 살균 여과된 용액으로부터의 임의의 추가의 요망되는 성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 동결-건조가 있다. 주사용 조제물은 당분야에 공지된 방법에 따라 무균 조건 하에서 가공되고, 용기, 예컨대 앰풀, 백, 병, 시린지 또는 바이알 내로 충전되고, 밀봉된다. 또한, 조제물은 패키징되어 키트의 형태로 판매될 수 있다. 상기 제조 항목은 바람직하게는 관련 조성물이 응고 장애를 앓고 있거나 응고 장애에 걸리기 쉬운 대상체의 치료에 유용함을 나타내는 라벨 또는 패키지 인서트를 가질 것이다.
또한 약학 조성물은 예를 들어 통상적인 좌약 기제, 예컨대 코코아 버터 또는 다른 글리세라이드를 함유하는 좌약 또는 정체 관장으로서 직장 투여를 위해 제형화될 수 있다.
질병의 치료를 위한 본 개시의 조성물의 유효 용량은 투여 수단, 표적 부위, 환자의 생리학적 상태, 환자가 인간인지 동물인지의 여부, 투여되는 다른 투약, 및 치료가 예방적인지 또는 치료적인지의 여부를 포함하는 많은 다양한 요인에 좌우된다. 대개, 환자는 인간이지만, 트랜스제닉 포유류가 포함되는 비-인간 포유류도 치료받을 수 있다. 안전성 및 유효성을 최적화하기 위해, 당업자에게 공지된 일상적인 방법을 사용하여 치료 투여량이 적정될 수 있다.
렌티바이러스 벡터는 단회 용량 또는 다회 용량으로 투여될 수 있으며, 다회 용량은 연속적으로 또는 특정 시간 간격으로 투여될 수 있다. 최적의 용량 범위 및/또는 투여 일정을 결정하기 위해 시험관 내 검정을 사용할 수 있다. 응고 인자 활성을 측정하는 시험관 내 검정은 당분야에 공지되어 있다. 추가로, 유효 용량은 동물 모델(예를 들어, 혈우병 개)에서 얻은 용량 반응 곡선으로부터 외삽될 수 있다(Mount et al. 2002, Blood 99 (8): 2670).
상기 범위 중간에 있는 용량도 본 개시의 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 대상체에는 매일, 격일, 매주 또는 실험적 분석에 의해 결정된 임의의 다른 일정에 따라 이러한 용량이 투여될 수 있다. 하나의 예시적인 치료는 장기간, 예를 들어, 적어도 6개월에 걸친 다회 투여량으로 투여하는 것을 수반한다.
본 개시의 렌티바이러스 벡터는 여러 번 투여될 수 있다. 단회 투여량 사이의 간격은, 일간, 주간, 월간 또는 연간이 될 수 있다. 간격은 또한 환자에서의 변형된 폴리펩티드 또는 항원의 혈중 수준을 측정함으로써 지시되는 바와 같이 불규칙할 수 있다. 본 개시의 렌티바이러스 벡터의 투여량 및 빈도는 환자에서 트랜스유전자에 의해 인코딩되는 FVIII 폴리펩티드 또는 FIX 폴리펩티드의 반감기에 좌우된다.
본 개시의 렌티바이러스 벡터의 투여량 및 투여 빈도는 치료가 예방적인지 또는 치료적인지의 여부에 따라 좌우될 수 있다. 예방적 응용에서, 본 개시의 렌티바이러스 벡터를 함유하는 조성물은 환자의 저항성을 향상시키거나 질환의 영향을 최소화하기 위해 아직 질환 상태에 있지 않은 환자에게 투여된다. 이러한 양은 "예방적 유효 용량"으로 정의된다. 긴 기간에 걸쳐서 상대적으로 낮은 투여량이 상대적으로 드문 간격으로 투여된다. 일부 환자는 그들의 남은 일생 동안 치료를 받는 것을 계속한다.
본 개시의 렌티바이러스 벡터는 선택적으로 (예컨대, 예방적 또는 치료적) 치료를 필요로 하는 장애 또는 질병을 치료하는 데 효과적인 다른 제제와 조합되어 투여될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 보조 치료법과 함께 또는 보조 치료법과 조합되어 본 개시의 렌티바이러스 벡터를 투여하는 것은 치료법 및 개시된 폴리펩티드의 순차적 투여, 동시 투여, 동일 시공간 투여, 동반 투여, 공존 또는 동시발생적 투여 또는 적용을 의미한다. 당업자는 조합 치료 요법의 다양한 구성요소의 투여 또는 적용이 치료의 전반적 효율성을 향상시키기 위해 시간 지정될 수 있음을 이해할 것이다. 당업자(예를 들어, 의사)는 선택된 보조 치료법 및 본 발명의 명세서의 교시내용에 기반하여 과도한 실험 없이 효과적인 조합 치료 요법을 용이하게 인식할 수 있을 것이다.
본 개시의 렌티바이러스 벡터는 (예를 들어, 조합 치료 요법을 제공하기 위한) 제제 또는 제제들과 함께 또는 조합되어 사용될 수 있다는 것이 또한 이해될 것이다. 본 개시의 렌티바이러스 벡터와 조합될 수 있는 예시적인 제제는 치료받는 특정 장애에 대한 현행 관리 표준을 대표하는 제제를 포함한다. 이러한 제제는 성질상 화학적 제제이거나 생물학적 제제일 수 있다. 용어 "생물학적 제제" 또는 "생물학 제제"는 치료제로서 사용하기 위한 살아있는 유기체 및/또는 이의 산물로부터 제조된 임의의 약학 활성제를 나타낸다.
본 개시의 렌티바이러스 벡터와 조합되어 사용될 제제의 양은 대상체 별로 다를 수 있거나 당분야에 공지된 것에 따라 투여될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Bruce A Chabner et al., Antineoplastic Agents, in Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics 1233-1287 ((Joel G. Hardman et al., eds., 9th ed. 1996)]을 참고한다. 다른 구현예에서, 관리 표준과 일치하는 양의 그러한 제제가 투여된다.
소정 구현예에서, 본 개시의 렌티바이러스 벡터는 면역억제제, 항-알러지제 또는 항염증제와 함께 투여된다. 이러한 제제는 일반적으로 본원에서 치료받는 대상체의 면역계를 억제하거나 차폐하는 작용을 하는 물질을 나타낸다. 이러한 제제는 사이토카인 생성을 억제하거나, 자가 항원 발현을 하향조절하거나 억제하거나, MHC 항원을 차폐하는 물질을 포함한다. 이러한 제제의 예는 2-아미노-6-아릴-5-치환 피리미딘; 아자티오프린; 시클로포스파미드; 브로모크립틴; 다나졸; 답손; 글루타르알데히드; MHC 항원 및 MHC 단편에 대한 항-개별특이형 항체; 시클로스포린 A; 스테로이드, 예컨대 글루코코르티코스테로이드, 예를 들어 프레드니손, 메틸프레드니솔론 및 덱사메타손; 항-인터페론-γ, -β 또는 -α 항체, 항-종양 괴사 인자-α 항체, 항-종양 괴사 인자-β 항체, 항-인터루킨-2 항체 및 항-IL-2 수용체 항체를 포함하는 사이토카인 또는 사이토카인 수용체 길항제; 항-CD11a 및 항-CD18 항체를 포함하는 항-LFA-1 항체; 항-L3T4 항체; 이종성 항-림프구 글로불린; 범-T 항체; LFA-3 결합 도메인을 포함하는 가용성 펩티드; 스트렙토키나제; TGF-β; 스트렙토도르나제; FK506; RS-61443; 데옥시스퍼구알린; 및 라파마이신을 포함한다. 소정 구현예에서, 제제는 항히스타민제이다. 본원에서 사용된 바와 같이, "항히스타민제"는 히스타민의 생리학적 효과를 길항하는 제제이다. 항히스타민제의 예로는 클로르페니라민, 디펜히드라민, 프로메타진, 크로몰린 나트륨, 아스테미졸, 아자타딘 말레에이트, 브로페니라민 말레에이트, 카르비녹사민 말레에이트, 세티리진 하이드로클로라이드, 클레마스틴 푸마레이트, 시프로헵타딘 하이드로클로라이드, 덱스브롬페니라민 말레에이트, 덱스클로르페니라민 말레에이트, 디멘히드리네이트, 디펜히드라민 하이드로클로라이드, 독실아민 숙시네이트, 펙소펜다딘 하이드로클로라이드, 테르페나딘 하이드로클로라이드, 하이드록시진 하이드로클로라이드, 로라티딘, 메클리진 하이드로클로라이드, 트리펠라나민 시트레이트, 트리펠레나민 하이드로클로라이드 및 트리프롤리딘 하이드로클로라이드가 있다.
면역 억제제, 항-알러지제 또는 항염증제가 렌티바이러스 벡터 투여 요법에 포함될 수 있다. 예를 들어, 면역 억제제 또는 항염증제의 투여는 개시된 렌티바이러스 벡터의 투여 전에 시작될 수 있고, 그 후 하나 이상의 용량으로 계속될 수있다. 소정 구현예에서, 면역억제제 또는 항염증제는 렌티바이러스 벡터에 대한 예비투약으로서 투여된다.
앞서 논의된 바와 같이, 본 개시의 렌티바이러스 벡터는 응고 장애의 생체 내 처료를 위해 약학 유효량으로 투여될 수 있다. 이와 관련하여, 본 개시의 렌티바이러스 벡터는 활성제의 안정성을 촉진하고 투여를 촉진하도록 제형화될 수 있음이 이해될 것이다. 바람직하게는, 본 개시에 따른 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 비독성 살균 담체, 예컨대 생리 식염수, 비독성 완충액, 보존제 등을 포함한다. 물론, 본 개시의 약학 조성물은 약학 유효량의 폴리펩티드를 제공하기 위해 단회 또는 다회 용량으로 투여될 수 있다.
응고 시스템의 기능을 평가하기 위해 다음의 다수의 시험을 이용할 수 있다: 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT) 시험, 비색성 분석, ROTEM® 검정, 프로트롬빈 시간(PT) 시험(INR 결정에도 사용됨), (종종 클라우스(Clauss) 방법에 의한) 피브리노겐 시험, 혈소판 계수, (종종 PFA-100에 의한) 혈소판 기능 시험, TCT, 출혈 시간, 혼합 시험(환자의 혈장이 정상 혈장과 혼합되면 이상이 교정되는지 여부), 응고 인자 검정, 항인지질 항체, D-이량체, 유전자 검사(예를 들어, 인자 V 라이덴, 프로트롬빈 돌연변이 G20210A), 희석 러셀 사독 시간(dRVVT), 기타 혈소판 기능 시험, 트롬보엘라스토그래피(TEG 또는 소노클롯(Sonoclot)), 트롬보엘라스토메트리(TEM®, 예를 들어, ROTEM®), 또는 유글로불린 용해 시간(ELT).
aPTT 시험은 "고유(intrinsic)" 응고 경로(접촉 활성화 경로로도 나타냄) 및 공통 응고 경로 둘 모두의 유효성을 측정하는 성능 지표이다. 이러한 시험은 일반적으로 구입 가능한 재조합 응고 인자, 예를 들어 FVIII 또는 FIX의 응고 활성을 측정하는 데 사용된다. 이는 외인성 경로를 측정하는 프로트롬빈 시간(PT)과 함께 사용된다.
ROTEM® 분석은 지혈의 전체 역학에 대한 정보를 제공한다: 응고 시간, 응괴 형성, 응괴 안정성 및 용해. 트롬보엘라스토메트리에서의 상이한 파라미터는 혈장 응고 시스템, 혈소판 기능, 섬유소 용해, 또는 이러한 상호작용에 영향을 미치는 많은 요인의 활성에 좌우된다. 이러한 검정은 2차 지혈에 대한 완전한 관점을 제공할 수 있다.
B.2. 조직 특이적 발현
소정 구현예에서, 예를 들어 최적화된 FVIII 트랜스유전자에 작동 가능하게 연결된, 하나 이상의 miRNA 표적 서열을 렌티바이러스 벡터 내에 포함시키는 것이 유용할 것이다. 따라서, 본 개시는 또한 최적화된 FVIII 또는 최적화된 FIX 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결되거나 달리 렌티바이러스 벡터 내에 삽입된 적어도 하나의 miRNA 서열 표적을 제공한다. 렌티바이러스 벡터에 포함된 miRNA 표적 서열의 하나 초과의 카피는 시스템의 효율성을 증가시킬 수 있다.
상이한 miRNA 표적 서열도 포함된다. 예를 들어, 하나 초과의 트랜스유전자를 발현하는 렌티바이러스 벡터는 동일하거나 상이할 수 있는 하나 초과의 miRNA 표적 서열의 제어 하의 트랜스유전자를 가질 수 있다. miRNA 표적 서열은 탠덤으로 있을 수 있지만, 다른 배열도 포함된다. miRNA 표적 서열을 포함하는 트랜스유전자 발현 카세트는 또한 안티센스 배향으로 렌티바이러스 벡터 내에 삽입될 수 있다. 안티센스 배향은 생산체 세포에 달리 독성이 있을 수 있는 유전자 산물의 발현을 피하기 위한 바이러스 입자의 생산에 유용할 수 있다.
다른 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 동일하거나 상이한 miRNA 표적 서열의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 8개 카피를 포함한다. 소정 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 어떠한 miRNA 표적 서열도 포함하지 않는다. miRNA 표적 서열을 포함할지 여부(및 얼마나 포함할지 여부)의 선택은 의도된 조직 표적, 필요한 발현 수준 등과 같은 공지된 파라미터에 의해 가이드될 것이다.
하나의 구현예에서, 표적 서열은 골수 수임 전구세포에서 가장 효과적으로 발현을 차단하고 더 원시적인 HSPC에서 적어도 부분적으로 발현을 차단하는 것으로 보고된 miR-223 표적이다. miR-223 표적은 과립구, 단핵구, 대식구, 골수 수지상 세포를 포함하는 분화된 골수 세포에서 발현을 차단할 수 있다. miR-223 표적은 또한 림프 또는 적혈구 계통에서 강력한 트랜스유전자 발현에 의존하는 유전자 치료법 응용에 적합할 수 있다. miR-223 표적은 또한 인간 HSC에서 매우 효과적으로 발현을 차단할 수 있다.
다른 구현예에서, 표적 서열은 miR142 표적(tccataaagtaggaaacactaca(SEQ ID NO: 7))이다. 하나의 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 4개 카피의 miR-142 표적 서열을 포함한다. 소정 구현예에서, miR-142(142T)와 같은 조혈-특이적 마이크로RNA의 상보성 서열은 렌티바이러스 벡터의 3’ 비번역 영역 내로 혼입되어, 트랜스유전자-인코딩 전사체가 miRNA 매개 하향조절에 민감해지게 만든다. 상기 방법에 의해, 조혈 계통 항원 제시 세포(APC)에서는 트랜스유전자 발현이 방지될 수 있는 한편, 비-조혈 세포에서는 유지될 수 있다(Brown et al., Nat Med 2006). 이 전략은 트랜스유전자 발현에 엄격한 전사 후 제어를 부과할 수 있고 따라서 트랜스유전자의 안정한 전달 및 장기 발현을 가능하게 한다. 일부 구현예에서, miR-142 조절은 형질도입된 세포의 면역 매개된 제거를 방지하고/하거나 항원-특이적 조절 T 세포(T reg)를 유도하고 트랜스유전자-인코딩 항원에 대한 강력한 면역학적 관용성을 매개한다.
일부 구현예에서, 표적 서열은 miR181 표적이다. 문헌[Chen C-Z and Lodish H, Seminars in Immunology (2005) 17(2):155-165]에는 마우스 골수 내에서 B 세포에서 특이적으로 발현되는 miRNA인 miR-181이 개시되어 있다(Chen and Lodish, 2005). 이것에는 또한 일부 인간 miRNA가 백혈병과 연관됨이 개시되어 있다.
표적 서열은 miRNA에 대해 완전히 또는 부분적으로 상보성일 수 있다. 용어 "완전히 상보성인"은 표적 서열이 이를 인식하는 miRNA의 서열에 대해 100% 상보성인 핵산 서열을 가짐을 의미한다. 용어 "부분적으로 상보성인"은 표적 서열이 이를 인식하는 miRNA의 서열에 대해 단지 부분적으로 상보성이며, 이에 의해 부분적 상보성 서열이 여전히 miRNA에 의해 인식된다는 것을 의미한다. 바꾸어 말하면, 본 개시의 맥락에서 부분적 상보성 표적 서열은 상응하는 miRNA를 인식하고 그 miRNA를 발현하는 세포에서 트랜스유전자 발현의 방지 또는 감소를 수행하는 데 효과적이다. miRNA 표적 서열의 예는 WO2007/000668호, WO2004/094642호, WO2010/055413호, 또는 WO2010/125471호에 기재되어 있으며, 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
B.3. 이종성 뉴클레오티드 서열
일부 구현예에서, 단리된 핵산 분자는 이종성 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 핵산 분자는 적어도 하나의 이종성 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 이종성 뉴클레오티드 서열은 5' 말단에서, 3' 말단에서 본 개시의 FVIII 또는 VIX 코딩 서열과 연결되거나, 중간에 삽입될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 이종성 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 이종성 아미노산 서열은 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 FVIII 아미노산 서열 또는 FIX 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 연결되거나, FVIII 아미노산 서열 또는 FIX 아미노산 서열에서의 2개의 아미노산 사이에 삽입된다. 일부 구현예에서, 이종성 아미노산 서열은 표 2로부터 선택되는 하나 이상의 삽입 부위에서 FVIII 폴리펩티드의 2개의 아미노산 사이에 삽입될 수 있다. 일부 구현예에서, 이종성 아미노산 서열은 이의 전체가 본원에 참조로 포함되는, 국제 공개 제WO 2013/123457 A1호 및 제WO 2015/106052 A1호 또는 미국 공개 제2015/0158929 A1호에 개시된 임의의 부위에서 본 개시의 핵산 분자에 의해 인코딩된 FVIII 폴리펩티드 내에 삽입될 수 있다.
일부 구현예에서, 이종성 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 이종성 아미노산 서열은 B 도메인 또는 이의 단편 내에 삽입된다. 일부 구현예에서, 이종성 아미노산 서열은 성숙 인간 FVIII(SEQ ID NO: 4)의 아미노산 745에 상응하는 아미노산의 바로 하류에서 FVIII 내에 삽입된다. 하나의 특정 구현예에서, FVIII는 성숙 인간 FVIII(SEQ ID NO: 4)에 상응하는 아미노산 746 내지 1646의 결실을 포함하고, 이종성 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 이종성 아미노산 서열은 성숙 인간 FVIII(SEQ ID NO: 4)에 상응하는 아미노산 745의 바로 하류에 삽입된다.
[표 2]
이종성 모이어티 삽입 부위
Figure pct00011
주: 삽입 부위는 성숙 인간 FVIII(SEQ ID NO: 4)의 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치를 나타냄.
다른 구현예에서, 단리된 핵산 분자는 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 8개의 이종성 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 모든 이종성 뉴클레오티드 서열은 동일하다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 이종성 뉴클레오티드 서열은 다른 이종성 뉴클레오티드 서열과 상이하다. 일부 구현예에서, 본 개시는 2개, 3개, 4개, 5개, 6개의, 또는 7개 초과의 탠덤으로 된 이종성 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 이종성 뉴클레오티드 서열은 아미노산 서열을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 이종성 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열은 FVIII 분자의 반감기를 증가시킬 수 있는 이종성 모이어티("반감기 연장제")이다.
일부 구현예에서, 이종성 모이어티는, 본 개시의 단백질에 혼입되는 경우, 생체내 반감기의 연장과 연관된 비구조화된 또는 구조화된 특성을 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드이다. 비제한적 예는 알부민, 알부민 단편, 면역글로불린의 Fc 단편, 인간 융모성 생식선 자극호르몬의 β 서브유닛의 C 말단 펩티드(CTP), HAP 서열, XTEN 서열, 트랜스페린 또는 이의 단편, PAS 폴리펩티드, 폴리글리신 링커, 폴리세린 링커, 알부민 결합 모이어티, 또는 이들 폴리펩티드의 임의의 단편, 유도체, 변이체, 또는 조합을 포함한다. 하나의 특정 구현예에서, 이종성 아미노산 서열은 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 부분, 트랜스페린, 알부민 또는 PAS 서열이다.
일부 양태에서, 이종성 모이어티는 폰 빌레브란트 인자 또는 이의 단편을 포함한다. 다른 관련된 양태에서, 이종성 모이어티는 비폴리펩티드 모이어티, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 하이드록시에틸 전분(HES), 폴리시알산, 또는 이들 요소의 임의의 유도체, 변이체, 또는 조합에 대한 부착 부위(예를 들어, 시스테인 아미노산)를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 이종성 모이어티는 비폴리펩티드 모이어티, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 하이드록시에틸 전분(HES), 폴리시알산, 또는 이들 요소의 임의의 유도체, 변이체, 또는 조합에 대한 부착 부위로서 기능을 하는 시스테인 아미노산을 포함한다.
하나의 특정 구현예에서, 제1 이종성 뉴클레오티드 서열은 당분야에 공지된 반감기 연장 분자인 제1 이종성 모이어티를 인코딩하고, 제2 이종성 뉴클레오티드 서열은 또한 당분야에 공지된 반감기 연장 분자일 수 있는 제2 이종성 모이어티를 인코딩한다. 소정 구현예에서, 제1 이종성 모이어티(예를 들어, 제1 Fc 모이어티) 및 제2 이종성 모이어티(예를 들어, 제2 Fc 모이어티)는 서로 연합되어 이량체를 형성한다. 하나의 구현예에서, 제2 이종성 모이어티는 제2 Fc 모이어티이고, 제2 Fc 모이어티는 제1 이종성 모이어티, 예를 들어 제1 Fc 모이어티에 연결되거나 이것과 연합된다. 예를 들어, 제2 이종성 모이어티(예를 들어, 제2 Fc 모이어티)는 링커에 의해 제1 이종성 모이어티(예를 들어, 제1 Fc 모이어티)에 연결되거나 공유 또는 비공유 결합에 의해 제1 이종성 모이어티와 연합될 수 있다.
일부 구현예에서, 이종성 모이어티는 적어도 약 10개, 적어도 약 100개, 적어도 약 200개, 적어도 약 300개, 적어도 약 400개, 적어도 약 500개, 적어도 약 600개, 적어도 약 700개, 적어도 약 800개, 적어도 약 900개, 적어도 약 1000개, 적어도 약 1100개, 적어도 약 1200개, 적어도 약 1300개, 적어도 약 1400개, 적어도 약 1500개, 적어도 약 1600개, 적어도 약 1700개, 적어도 약 1800개, 적어도 약 1900개, 적어도 약 2000개, 적 어도 약 2500개, 적어도 약 3000개 또는 적어도 약 4000개의 아미노산을 포함하거나, 본질적으로 이로 구성되거나, 이로 구성되는 폴리펩티드이다.
다른 구현예에서, 이종성 모이어티는 약 100개 내지 약 200개의 아미노산, 약 200개 내지 약 300개의 아미노산, 약 300개 내지 약 400개의 아미노산, 약 400개 내지 약 500개의 아미노산, 약 500개 내지 약 600개의 아미노산, 약 600개 내지 약 700개의 아미노산, 약 700개 내지 약 800개의 아미노산, 약 800개 내지 약 900개의 아미노산, 또는 약 900개 내지 약 1000개의 아미노산을 포함하거나, 본질적으로 이로 구성되거나, 이로 구성되는 폴리펩티드이다.
소정 구현예에서, 이종성 모이어티는 이의 생물학적 활성 또는 기능에 유의미하게 영향을 미치지 않으면서 FVIII 또는 FIX 단백질의 하나 이상의 약동학적 특성을 개선한다.
소정 구현예에서, 이종성 모이어티는 본 개시의 FVIII 또는 FIX 단백질의 생체 내 및/또는 시험관 내 반감기를 증가시킨다. 다른 구현예에서, 이종성 모이어티는 본 개시의 FVIII 또는 FIX 단백질 또는 이의 단편(예를 들어, FVIII 또는 FIX 단백질의 단백분해 절단 후 이종성 모이어티를 포함하는 단편)의 가시화 또는 국재화를 촉진한다. 본 개시의 FVIII 또는 FIX 단백질 또는 이의 단편의 가시화 및/또는 위치는 생체 내, 시험관 내, 생체 외, 또는 이의 조합일 수 있다.
다른 구현예에서, 이종성 모이어티는 본 개시의 FVIII 또는 FIX 단백질 또는 이의 단편(예를 들어, FVIII 또는 FIX 단백질의 단백분해 절단 후 이종성 모이어티를 포함하는 단편)의 안정성을 증가시킨다. 본원에서 사용되는 용어 "안정성"은 환경 조건(예를 들어, 상승되거나 저하된 온도)에 반응하는 FVIII 또는 FIX 단백질의 하나 이상의 물리적 특성 유지에 대한 당분야에서 인식된 척도를 나타낸다. 소정 양태에서, 물리적 특성은 FVIII 또는 FIX 단백질의 공유 구조의 유지(예를 들어, 단백분해 절단, 원치않는 산화 또는 탈아미드화의 부재)일 수 있다. 다른 양태에서, 물리적 특성은 또한 적절히 폴딩된 상태의 FVIII 또는 FIX 단백질의 존재(예를 들어, 가용성 또는 불용성 응집 또는 침전의 부재)일 수 있다.
하나의 양태에서, FVIII 또는 FIX 단백질의 안정성은 FVIII 또는 FIX 단백질의 생물리적 특성, 예를 들어 열 안정성, pH 비폴딩 프로필, 글리코실화의 안정한 제거, 용해도, 생화학적 기능(예를 들어, 단백질, 수용체 또는 리간드에 결합하는 능력) 등, 및/또는 이의 조합을 검정함으로써 측정된다. 다른 양태에서, 생화학적 기능은 상호작용의 결합 친화도에 의해 실증된다. 하나의 양태에서, 단백질 안정성의 척도는 열 안정성, 즉 열 자극에 대한 저항성이다. 안정성은 당분야에 공지된 방법, 예컨대 HPLC(고성능 액체 크로마토그래피), SEC(크기 배제 크로마토그래피), DLS(동적 광 산란) 등을 사용하여 측정될 수 있다. 열 안정성을 측정하는 방법은 시차 주사 열량계(DSC), 시차 주사 형광측정법(DSF), 원편광 이색성(CD) 및 열 챌린지 검정을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
소정 양태에서, 본 개시의 핵산 분자에 의해 인코딩되는 FVIII 또는 FIX 단백질은 적어도 하나의 반감기 연장제, 즉 이러한 이종성 모이어티가 결여된 상응하는 FVIII 또는 FIX 단백질의 생체 내 반감기와 관련하여 FVIII 또는 FIX 단백질의 생체 내 반감기를 증가시키는 이종성 모이어티를 포함한다. FVIII 또는 FIX 단백질의 생체 내 반감기는 당업자에게 공지된 임의의 방법, 예를 들어 활성 검정(비색 검정 또는 1단계 응고 aPTT 검정), ELISA, ROTEMTM 등에 의해 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 반감기 연장제의 존재는 이러한 하나 이상의 반감기 연장제가 결여된 상응하는 단백질의 반감기와 비교하여 FVIII 또는 FIX 단백질의 반감기가 증가되게 한다. 반감기 연장제를 포함하는 FVIII 또는 FIX 단백질의 반감기는 이러한 반감기 연장제가 결여된 상응하는 FVIII 또는 FIX 단백질의 생체 내 반감기보다 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 11배 또는 적어도 약 12배 더 길다.
하나의 구현예에서, 반감기 연장제를 포함하는 FVIII 또는 FIX 단백질의 반감기는 이러한 반감기 연장제가 결여된 상응하는 단백질의 생체 내 반감기보다 약 1.5배 내지 약 20배, 약 1.5배 내지 약 15배 또는 약 1.5배 내지 약 10배 더 길다. 다른 구현예에서, 반감기 연장제를 포함하는 FVIII 또는 FIX 단백질의 반감기는 이러한 반감기 연장제가 결여된 상응하는 단백질의 생체내 반감기와 비교하여 약 2배 내지 약 10배, 약 2배 내지 약 9배, 약 2배 내지 약 8배, 약 2배 내지 약 7배, 약 2배 내지 약 6배, 약 2배 내지 약 5배, 약 2배 내지 약 4배, 약 2배 내지 약 3배, 약 2.5배 내지 약 10배, 약 2.5배 내지 약 9배, 약 2.5배 내지 약 8배, 약 2.5배 내지 약 7배, 약 2.5배 내지 약 6배, 약 2.5배 내지 약 5배, 약 2.5배 내지 약 4배, 약 2.5배 내지 약 3배, 약 3배 내지 약 10배, 약 3배 내지 약 9배, 약 3배 내지 약 8배, 약 3배 내지 약 7배, 약 3배 내지 약 6배, 약 3배 내지 약 5배, 약 3배 내지 약 4배, 약 4배 내지 약 6배, 약 5배 내지 약 7배, 또는 약 6배 내지 약 8배 연장된다.
다른 구현예에서, 반감기 연장제를 포함하는 FVIII 또는 FIX 단백질의 반감기는 적어도 약 17시간, 적어도 약 18시간, 적어도 약 19시간, 적어도 약 20시간, 적어도 약 21시간, 적어도 약 22시간, 적어도 약 23시간, 적어도 약 24시간, 적어도 약 25시간, 적어도 약 26시간, 적어도 약 27시간, 적어도 약 28시간, 적어도 약 29시간, 적어도 약30시간, 적어도 약 31시간, 적어도 약 32시간, 적어도 약 33시간, 적어도 약 34시간, 적어도 약 35시간, 적어도 약 36시간, 적어도 약 48시간, 적어도 약 60시간, 적어도 약 72시간, 적어도 약 84시간, 적어도 약 96시간 또는 적어도 약 108시간이다.
다른 구현예에서, 반감기 연장제를 포함하는 FVIII 또는 FIX 단백질의 반감기는 약 15시간 내지 약 2주, 약 16시간 내지 약 1주, 약 17시간 내지 약 1주, 약 18시간 내지 약 1주, 약 19시간 내지 약 1주, 약 20시간 내지 약 1주, 약 21시간 내지 약 1주, 약 22시간 내지 약 1주, 약 23시간 내지 약 1주, 약 24시간 내지 약 1주, 약 36시간 내지 약 1주, 약 48시간 내지 약 1주, 약 60시간 내지 약 1주, 약 24시간 내지 약 6일, 약 24시간 내지 약 5일, 약 24시간 내지 약 4일, 약 24시간 내지 약 3일 또는 약 24시간 내지 약 2일이다.
일부 구현예에서, 반감기 연장제를 포함하는 FVIII 또는 FIX 단백질의 대상체 당 평균 반감기는 약 15시간, 약 16시간, 약 17시간, 약 18시간, 약 19시간, 약 20시간, 약 21시간, 약 22시간, 약 23시간, 약 24시간(1일), 약 25시간, 약 26시간, 약 27시간, 약 28시간, 약 29시간, 약 30시간, 약 31시간, 약 32시간, 약 33시간, 약 34시간, 약 35시간, 약 36시간, 약 40시간, 약 44시간, 약 48시간(2일), 약 54시간, 약 60시간, 약 72시간(3일), 약 84시간, 약 96시간(4일), 약 108시간, 약 120시간(5일), 약 6일, 약 7일(1주), 약 8일, 약 9일, 약 10일, 약 11일, 약 12일, 약 13일 또는 약 14일이다.
하나 이상의 반감기 연장제는 FVIII 또는 FIX의 C-말단 또는 N-말단에 융합되거나 FVIII 또는 FIX 내에 삽입될 수 있다.
B.3.a. 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 부분
다른 양태에서, 이종성 모이어티는 하나 이상의 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 부분(예를 들어, Fc 영역)을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 개시의 단리된 핵산 분자는 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 부분을 인코딩하는 이종성 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 부분은 Fc 영역이다.
면역글로불린 불변 영역은 CH(불변 중쇄) 도메인(CH1, CH2 등)으로 칭해지는 도메인으로 이루어진다. 이소형(즉, IgG, IgM, IgA IgD 또는 IgE)에 따라, 불변 영역은 3개 또는 4개의 CH 도메인으로 이루어질 수 있다. 몇몇 이소형(예를 들어, IgG) 불변 영역은 또한 힌지 영역을 함유한다. 문헌[Janeway et al. 2001, Immunobiology, Garland Publishing, N.Y., N.Y.]을 참고한다.
본 개시의 FVIII 단백질을 생성하기 위한 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 부분은 여러 상이한 공급원으로부터 얻어질 수 있다. 하나의 구현예에서, 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 부분은 인간 면역글로불린으로부터 유래된다. 그러나, 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 부분이 예를 들어 설치류(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 기니 피그) 또는 비인간 영장류(예를 들어, 침팬지, 마카크) 종을 포함하는 다른 포유류 종의 면역글로불린으로부터 유래될 수 있음이 이해된다. 더욱이, 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 부분은 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE를 포함하는 임의의 면역글로불린 클래스, 및 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하는 임의의 면역글로불린 이소형으로부터 유래될 수 있다. 하나의 구현예에서, 인간 이소형 IgG1이 사용된다.
다양한 면역글로불린 불변 영역 유전자 서열(예를 들어, 인간 불변 영역 유전자 서열)은 공개적으로 접근 가능한 기탁의 형태로 이용 가능하다. 면역원성을 감소시키기 위해 특정한 변형을 갖거나 특정한 효과기 기능을 갖는(또는 특정한 효과기 기능이 결여된) 불변 영역 도메인 서열이 선택될 수 있다. 항체 및 항체-인코딩 유전자의 많은 서열은 공개되어 있고, 적합한 Ig 불변 영역 서열(예를 들어, 힌지, CH2, 및/또는 CH3 서열, 또는 이의 부분)은 당분야에서 인식된 기법을 사용하여 이들 서열로부터 유래될 수 있다. 그후, 임의의 전술한 방법을 사용하여 얻은 유전 물질은 본 개시의 폴리펩티드를 얻도록 변경되거나 합성될 수 있다. 본 개시의 범위가 불변 영역 DNA 서열의 대립유전자, 변이체 및 돌연변이를 포괄한다는 것이 추가로 이해될 것이다.
예를 들어, 관심 도메인을 증폭시키도록 선택되는 프라이머 및 폴리머라제 연쇄 반응을 사용하여, 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 부분의 서열이 클로닝될 수 있다. 항체로부터의 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 부분의 서열의 클로닝을 위해, mRNA가 하이브리도마, 비장 또는 림프 세포로부터 단리되고, DNA로 역전사되고, 항체 유전자가 PCR에 의해 증폭될 수 있다. PCR 증폭 방법은 미국 특허 제4,683,195호; 제4,683,202호; 제4,800,159호; 제4,965,188호; 및 예를 들어 문헌["PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications" Innis et al. eds., Academic Press, San Diego, CA (1990); Ho et al. 1989. Gene 77:51; Horton et al. 1993. Methods Enzymol. 217:270)]에 기재되어 있다. PCR은 공개된 중쇄 및 경쇄 DNA 및 아미노산 서열에 기반하여 공통 불변 영역 프라이머에 의해 또는 더 특이적인 프라이머에 의해 개시될 수 있다. PCR은 또한 항체 경쇄 및 중쇄를 인코딩하는 DNA 클론을 단리하기 위해 사용될 수 있다. 이 경우에, 라이브러리는 공통 프라이머 또는 더 큰 상동성 프로브, 예컨대 마우스 불변 영역 프로브에 의해 스크리닝될 수 있다. 항체 유전자의 증폭에 적합한 많은 프라이머 세트가 당분야에 공지되어 있다(예를 들어, 정제된 항체의 N-말단 서열에 기반한 5' 프라이머(Benhar and Pastan. 1994. Protein Engineering 7:1509); cDNA 말단의 신속한 증폭(Ruberti, F. et al. 1994. J. Immunol. Methods 173:33); 항체 리더 서열(Larrick et al. 1989 Biochem. Biophys. Res. Commun. 160:1250). 항체 서열의 클로닝은 1995년 1월 25일자로 출원된 Newman 등의 미국 특허 제5,658,570호에 추가로 기재되며, 이는 본원에 참조로 포함된다.
본원에서 사용되는 면역글로불린 불변 영역은 모든 도메인 및 힌지 영역 또는 이의 부분을 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 부분은 CH2 도메인, CH3 도메인, 및 힌지 영역, 즉 Fc 영역 또는 FcRn 결합 파트너를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "Fc 영역"은 천연 Ig의 Fc 영역에 상응하는 폴리펩티드의 부분, 즉 그 2개의 중쇄의 각각의 Fc 도메인의 이량체 연합에 의해 형성된 것으로 정의된다. 천연 Fc 영역은 다른 Fc 영역과 동종이량체를 형성한다. 반대로, 본원에서 사용되는 용어 "유전적으로 융합된 Fc 영역" 또는 "단쇄 Fc 영역"(scFc 영역)은 단일 폴리펩티드 사슬 내에서 유전적으로 연결된(즉, 단일 인접 유전자 서열 형태로 인코딩된) Fc 도메인으로 이루어진 합성 이량체 Fc 영역을 나타낸다. 본원에 그 전체가 참조로 포함되는, 국제 공개 제WO 2012/006635호를 참고한다.
하나의 구현예에서, "Fc 영역"은 파파인 절단 부위(즉, IgG 내의 잔기 216, 중쇄 불변 영역의 첫 번째 잔기는 114로 간주함)의 바로 상류의 힌지 영역에서 시작하여 항체의 C-말단에서 종료되는 단일 Ig 중쇄의 부분을 나타낸다. 따라서, 완전한 Fc 영역은 적어도 힌지 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다.
면역글로불린 불변 영역 또는 이의 부분은 FcRn 결합 파트너일 수 있다. FcRn은 성인 상피 조직에서 활성을 갖고, 장의 내강, 폐 기도, 코 표면, 질 표면, 결장 및 직장 표면에서 발현된다(미국 특허 제6,485,726호). FcRn 결합 파트너는 FcRn에 결합하는 면역글로불린의 부분이다.
FcRn 수용체는 인간을 포함하는 몇몇 포유류 종으로부터 단리되었다. 인간 FcRn, 원숭이 FcRn, 래트 FcRn 및 마우스 FcRn의 서열은 공지되어 있다(Story et al. 1994, J. Exp. Med. 180:2377). FcRn 수용체는 상대적으로 낮은 pH에서 IgG에 결합하고(그러나 다른 면역글로불린 클래스, 예컨대 IgA, IgM, IgD 및 IgE에는 결합하지 않음), 내강에서 장막 방향으로 세포경유로 IgG를 능동적으로 수송하고, 그 후 간질액에서 확인되는 상대적으로 더 높은 pH에서 IgG를 방출한다. 이는 폐 및 내장 상피 (Israel et al. 1997, Immunology 92:69) 신장 근위 세뇨관 상피(Kobayashi et al. 2002, Am. J. Physiol. Renal Physiol. 282:F358)뿐만 아니라 코 상피, 질 표면 및 담도계 표면을 포함하는 성체 상피 세포(미국 특허 제6,485,726호, 제6,030,613호, 제6,086,875호; WO 03/077834; 미국 제2003-0235536A1호)에서 발현된다.
본 개시에서 유용한 FcRn 결합 파트너는 전체 IgG, IgG의 Fc 단편, 및 FcRn 수용체의 완전한 결합 영역을 포함하는 다른 단편을 포함하여 FcRn 수용체에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 분자를 포괄한다. FcRn 수용체에 결합하는 IgG의 Fc 부분의 영역은 X선 결정학에 기반하여 기재되었다(Burmeister et al. 1994, Nature 372:379). Fc와 FcRn의 주요 접촉 영역은 CH2 도메인과 CH3 도메인의 접합부에 가깝게 있다. Fc-FcRn 접촉은 모두 단일 Ig 중쇄 내에 있다. FcRn 결합 파트너는 전체 IgG, IgG의 Fc 단편, 및 FcRn의 완전한 결합 영역을 포함하는 IgG의 다른 단편을 포함한다. 주요 접촉 부위는 CH2 도메인의 아미노산 잔기 248, 250 내지 257, 272, 285, 288, 290 내지 291, 308 내지 311 및 314 및 CH3 도메인의 아미노산 잔기 385 내지 387, 428 및 433 내지 436을 포함한다. 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편 또는 영역의 아미노산 넘버링에 대하여 이루어진 언급은 모두 문헌[Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Public Health, Bethesda, Md.]에 기반한다.
FcRn에 결합된 Fc 영역 또는 FcRn 결합 파트너는 FcRn에 의해 상피 장벽을 가로질러 효과적으로 셔틀링될 수 있어서, 요망되는 치료 분자를 전신 투여하기 위한 비침습적인 수단을 제공한다. 추가로, Fc 영역 또는 FcRn 결합 파트너를 포함하는 융합 단백질은 FcRn을 발현하는 세포에 의해 세포내이입된다. 그러나 분해에 대해 표시되는 것 대신에, 이들 융합 단백질은 다시 순환으로 재순환되어서, 이들 단백질의 생체내 반감기가 증가된다. 소정 구현예에서, 면역글로불린 불변 영역의 부분은 전형적으로 디설피드 결합 및 다른 비특이적 상호작용을 통해 다른 Fc 영역 또는 다른 FcRn 결합 파트너와 연합하여 이량체 및 더 고차원 다량체를 형성하는 Fc 영역 또는 FcRn 결합 파트너이다.
2개의 FcRn 수용체가 단일 Fc 분자에 결합할 수 있다. 결정학적 데이터는 각각의 FcRn 분자가 Fc 동종이량체의 단일 폴리펩티드에 결합함을 제시한다. 하나의 구현예에서, 생물학적 활성 분자에 FcRn 결합 파트너, 예를 들어 IgG의 Fc 단편을 연결하는 것은 경구로, 협측으로, 설하로, 직장으로, 질로, 비강 투여되는 에어로졸로서 또는 폐 경로를 통해, 또는 안구 경로를 통해 생물학적 활성 분자를 전달하는 수단을 제공한다. 다른 구현예에서, FVIII 단백질은 침습적으로, 예를 들어 피하로, 정맥내로 투여될 수 있다.
FcRn 결합 파트너 영역은 FcRn 수용체에 의해 특이적으로 결합될 수 있고, 그 결과 Fc 영역의 FcRn 수용체에 의해 능동 수송되는 분자 또는 이의 부분이다. 특이적으로 결합된이란 2개의 분자가 생리적 조건 하에서 상대적으로 안정한 복합체를 형성함을 나타낸다. 특이적 결합은 보통 내지는 높은 능력과 함께 저 친화도를 보통 갖는 비특이적 결합과는 구별되는, 높은 친화도 및 낮은 내지는 보통의 능력을 특징으로 한다. 전형적으로, 결합은 친화도 상수 KA가 106 M-1 초과 또는 108 M-1 초과인 경우 특이적인 것으로 간주된다. 필요한 경우, 결합 조건을 변화시킴으로써 특이적 결합에 실질적으로 영향을 미치지 않고도 비특이적 결합을 감소시킬 수 있다. 적절한 결합 조건, 예컨대 분자의 농도, 용액의 이온 강도, 온도, 결합에 허용된 시간, 차단제(예를 들어, 혈청 알부민, 밀크 카제인)의 농도 등은 일상적인 기법을 이용하여 당업자에 의해 최적화될 수 있다.
소정 구현예에서, 본 개시의 핵산 분자에 의해 인코딩된 FVIII 단백질은 하나 이상의 절단된 Fc 영역을 포함하며 이는 그럼에도 불구하고 Fc 영역에 Fc 수용체(FcR) 결합 특성을 부여하기에 충분하다. 예를 들어, FcRn에 결합하는 Fc 영역의 부분(즉, FcRn 결합 부분)은 EU 넘버링으로 IgG1의 대략 아미노산 282 내지 438(1차 접촉 부위는 CH2 도메인의 아미노산 248, 250 내지 257, 272, 285, 288, 290 내지 291, 308 내지 311, 및 314 및 CH3 도메인의 아미노산 잔기 385 내지 387, 428, 및 433 내지 436임)을 포함한다. 따라서, 본 개시의 Fc 영역은 FcRn 결합 부분을 포함하거나 이로 구성될 수 있다. FcRn 결합 부분은 IgGl, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하는 임의의 이소형의 중쇄로부터 유래될 수 있다. 하나의 구현예에서, 인간 이소형 IgG1의 항체로부터의 FcRn 결합 부분이 사용된다. 다른 구현예에서, 인간 이소형 IgG4의 항체로부터의 FcRn 결합 부분이 사용된다.
Fc 영역은 다수의 상이한 공급원으로부터 얻어질 수 있다. 하나의 구현예에서, 폴리펩티드의 Fc 영역은 인간 면역글로불린으로부터 유래된다. 그러나, Fc 모이어티가 예를 들어 설치류(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 기니 피그) 또는 비인간 영장류(예를 들어, 침팬지, 마카크) 종을 포함하는 다른 포유류 종의 면역글로불린으로부터 유래될 수 있음이 이해된다. 더욱이, Fc 도메인의 폴리펩티드 또는 이의 부분은 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE를 포함하는 임의의 면역글로불린 클래스 및 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하는 임의의 면역글로불린 이소형으로부터 유래될 수 있다. 다른 구현예에서, 인간 이소형 IgG1이 사용된다.
소정 구현예에서, Fc 변이체는 상기 야생형 Fc 도메인을 포함하는 Fc 모이어티에 의해 부여된 적어도 하나의 효과기 기능의 변화(예를 들어, Fc 수용체(예를 들어, FcγRI, FcγRII 또는 FcγRIII) 또는 보체 단백질(예를 들어, C1q)에 결합하거나, 항체 의존성 세포독성(ADCC), 식균작용 또는 보체 의존성 세포독성(CDCC)을 촉발하는 Fc 영역의 능력 개선 또는 감소)를 부여한다. 다른 구현예에서, Fc 변이체는 조작된 시스테인 잔기를 제공한다.
본 개시의 Fc 영역은 효과기 기능 및/또는 FcR 또는 FcRn 결합의 변화(예를 들어, 향상 또는 감소)를 부여하는 것으로 공지된 당분야에서 인식된 Fc 변이체를 사용할 수 있다. 구체적으로, 본 개시의 Fc 영역은 예를 들어, 국제 PCT 공개 제WO88/07089A1호, 제WO96/14339A1호, 제WO98/05787A1호, 제WO98/23289A1호, 제WO99/51642A1호, 제WO99/58572A1호, 제WO00/09560A2호, 제WO00/32767A1호, 제WO00/42072A2호, 제WO02/44215A2호, 제WO02/060919A2호, 제WO03/074569A2호, 제WO04/016750A2호, 제WO04/029207A2호, 제WO04/035752A2호, 제WO04/063351A2호, 제WO04/074455A2호, 제WO04/099249A2호, 제WO05/040217A2호, 제WO04/044859호, 제WO05/070963A1호, 제WO05/077981A2호, 제WO05/092925A2호, 제WO05/123780A2호, 제WO06/019447A1호, 제WO06/047350A2호, 및 제WO06/085967A2호; 미국 특허 공개 제US2007/0231329호, 제US2007/0231329호, 제US2007/0237765호, 제US2007/0237766호, 제US2007/0237767호, 제US2007/0243188호, 제US2007/0248603호, 제US2007/0286859호, 제US2008/0057056호; 또는 미국 특허 제5,648,260호; 제5,739,277호; 제5,834,250호; 제5,869,046호; 제6,096,871호; 제6,121,022호; 제6,194,551호; 제6,242,195호; 제6,277,375호; 제6,528,624호; 제6,538,124호; 제6,737,056호; 제6,821,505호; 제6,998,253호; 제7,083,784호; 제7,404,956호, 및 제7,317,091호(이들 각각은 본원에 참조로 포함됨)에 개시된 아미노산 위치 중 하나 이상에서의 변화(예를 들어, 치환)를 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 특정 변화(예를 들어, 당분야에 개시된 하나 이상의 아미노산의 특정 치환)이 하나 이상의 개시된 아미노산 위치에서 이루어질 수 있다. 다른 구현예에서, 하나 이상의 개시된 아미노산 위치에서 상이한 변화(예를 들어, 당분야에 개시된 하나 이상의 아미노산 위치의 상이한 치환)가 이루어질 수 있다.
IgG의 Fc 영역 또는 FcRn 결합 파트너는 FcRn에 의해 결합될 변형된 IgG 또는 Fc 단편 또는 이의 부분을 생성하도록 잘 인식된 절차, 예컨대 부위 지정 돌연변이유발 등에 따라 변형될 수 있다. 이러한 변형은 FcRn 접촉 부위로부터 먼 변형뿐만 아니라 FcRn에 대한 결합을 보존하거나 심지어 향상시키는 접촉 부위 내의 변형을 포함한다. 예를 들어, 인간 IgG1 Fc(Fc□1)에서의 하기 단일 아미노산 잔기가 FcRn에 대한 Fc 결합 친화도의 유의미한 손실 없이 치환될 수 있다: P238A, S239A, K246A, K248A, D249A, M252A, T256A, E258A, T260A, D265A, S267A, H268A, E269A, D270A, E272A, L274A, N276A, Y278A, D280A, V282A, E283A, H285A, N286A, T289A, K290A, R292A, E293A, E294A, Q295A, Y296F, N297A, S298A, Y300F, R301A, V303A, V305A, T307A, L309A, Q311A, D312A, N315A, K317A, E318A, K320A, K322A, S324A, K326A, A327Q, P329A, A330Q, P331A, E333A, K334A, T335A, S337A, K338A, K340A, Q342A, R344A, E345A, Q347A, R355A, E356A, M358A, T359A, K360A, N361A, Q362A, Y373A, S375A, D376A, A378Q, E380A, E382A, S383A, N384A, Q386A, E388A, N389A, N390A, Y391F, K392A, L398A, S400A, D401A, D413A, K414A, R416A, Q418A, Q419A, N421A, V422A, S424A, E430A, N434A, T437A, Q438A, K439A, S440A, S444A, 및 K447A(여기서 예를 들어 P238A는 위치 번호 238에서 야생형 프롤린이 알라닌에 의해 치환된 것을 나타냄). 예로서, 구체적인 구현예는 N297A 돌연변이를 혼입하여 고도로 보존된 N-글리코실화 부위를 제거한다. 알라닌에 더하여, 다른 아미노산이 상기 특정된 위치에서 야생형 아미노산을 치환할 수 있다. 돌연변이는 Fc 내로 단독으로 도입되어, 천연 Fc와 구별되는 100개 초과의 Fc 영역을 생성할 수 있다. 추가로, 이들 개별 돌연변이의 2개, 또는 3개 이상의 조합이 함께 도입되어, 수 백개 초과의 Fc 영역을 생성할 수 있다.
소정의 상기 돌연변이는 Fc 영역 또는 FcRn 결합 파트너 상에 새로운 기능성을 부여할 수 있다. 예를 들어, 하나의 구현예는 N297A를 혼입하여 고도로 보존된 N-글리코실화 부위를 제거한다. 상기 돌연변이의 효과는 면역원성을 감소시켜서, Fc 영역의 순환 반감기를 향상시키고, Fc 영역이 FcRn에 대한 친화도를 손상시키지 않으면서 FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB 및 FcγRIIIA에 결합할 수 없게 하는 것이다(Routledge et al. 1995, Transplantation 60:847; Friend et al. 1999, Transplantation 68:1632; Shields et al. 1995, J. Biol. Chem. 276:6591). 상기 기재된 돌연변이로부터 생긴 새로운 기능성의 추가 예로서, FcRn에 대한 친화도가 몇몇 경우에 야생형의 친화도를 넘어 증가될 수 있다. 이러한 증가된 친화도는 증가된 "온(on)" 속도, 감소된 "오프(off)" 속도 또는 증가된 "온" 속도 및 감소된 "오프" 속도 둘 모두를 반영할 수 있다. FcRn에 대한 증가된 친화도를 부여하는 것으로 생각되는 돌연변이의 예는 T256A, T307A, E380A, 및 N434A를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다(Shields et al. 2001, J. Biol. Chem. 276:6591).
추가로, 적어도 3개의 인간 Fc 감마 수용체가 하부 힌지 영역, 일반적으로 아미노산 234 내지 237 내에서 IgG 상의 결합 부위를 인식하는 것으로 보인다. 따라서, 새로운 기능성 및 잠재적인 감소된 면역원성의 다른 예는 예를 들어 인간 IgG1의 아미노산 233 내지 236 "ELLG"(SEQ ID NO: 8)를 IgG2로부터의 상응하는 서열 "PVA"(1개의 아미노산 결실을 가짐)로 대체하여, 상기 영역의 돌연변이로부터 생길 수 있다. 이러한 돌연변이가 도입되었을 때, 다양한 효과기 기능을 매개하는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII이 IgG1에 결합하지 않을 것임이 나타났다. 문헌[Ward and Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2:77 및 Armour et al. 1999, Eur. J. Immunol. 29:2613].
다른 구현예에서, 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 부분은 제2 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 부분과 하나 이상의 디설피드 결합을 형성하는 힌지 영역 또는 이의 부분에서의 아미노산 서열을 포함한다. 제2 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 부분은 제2 폴리펩티드에 연결되어, FVIII 단백질과 제2 폴리펩티드가 함께 있게 할 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드는 인핸서 모이어티이다. 본원에서 사용되는 용어 "인핸서 모이어티"는 FVIII의 전응고 활성을 향상시킬 수 있는 폴리펩티드의 분자, 이의 단편 또는 구성요소를 나타낸다. 인핸서 모이어티는 보조 인자, 예컨대 가용성 조직 인자(sTF) 또는 전응고 펩티드일 수 있다. 따라서, FVIII의 활성화 시, 인핸서 모이어티는 FVIII 활성을 향상시킬 수 있다.
소정 구현예에서, 본 개시의 핵산 분자에 의해 인코딩된 FVIII 단백질은 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 부분에 대한 아미노산 치환(예를 들어, Fc 변이체)을 포함하며, 이는 Ig 불변 영역의 항원 독립적 효과기 기능, 특히 단백질의 순환 반감기를 변경한다.
B.3.b. scFc 영역
다른 양태에서, 이종성 모이어티는 scFc(단일쇄 Fc) 영역을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 개시의 단리된 핵산 분자는 scFc 영역을 인코딩하는 이종성 핵산 서열을 추가로 포함한다. scFc 영역은 Fc 펩티드 링커에 의해 연결된 하나의 기능성 scFc 영역을 형성하기 위해 폴딩할(예를 들어, 분자내 또는 분자간 폴딩할) 수 있는 적어도 2개의 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 부분(예를 들어, Fc 모이어티 또는 도메인(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개 이상의 Fc 모이어티 또는 도메인))을 동일 선형 폴리펩티드 사슬 내에 포함한다. 예를 들어, 하나의 구현예에서, 본 개시의 폴리펩티드는 반감기를 개선하거나 면역 효과기 기능(예를 들어, 항체 의존성 세포독성(ADCC), 식균작용 또는 보체 의존성 세포독성(CDCC))을 촉발하고/하거나, 제조 가능성을 개선하기 위해, 그 scFc 영역을 통해, 적어도 하나의 Fc 수용체(예를 들어, FcRn, FcγR 수용체(예를 들어, FcγRIII) 또는 보체 단백질(예를 들어, C1q))에 결합될 수 있다.
B.3.c. CTP
다른 양태에서, 이종성 모이어티는 인간 융모성 생식선 자극호르몬의 β 서브유닛의 1개의 C 말단 펩티드(CTP) 또는 이의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함한다. 재조합 단백질 내로 삽입된 하나 이상의 CTP 펩티드는 그 단백질의 생체내 반감기를 증가시키는 것으로 공지되어 있다. 예를 들어, 본원에 그 전체가 참조로 포함되는, 미국 특허 제5,712,122호를 참고한다.
예시적인 CTP 펩티드는 DPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPIL(SEQ ID NO: 9) 또는 SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ ID NO: 10)를 포함한다. 예를 들어, 참조로 포함되는, 미국 특허 출원 공개 제US 2009/0087411 A1호를 참고한다.
B.3.d. XTEN 서열
일부 구현예에서, 이종성 모이어티는 하나 이상의 XTEN 서열, 이의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이 "XTEN 서열"은 주로 작은 친수성 아미노산으로 구성되는 천연 비발생, 실질적 비반복 서열을 갖는 연장된 길이의 폴리펩티드를 나타내고, 서열은 생리적 조건 하에서 적은 정도의 2차 또는 3차 구조를 갖거나 2차 또는 3차 구조를 갖지 않는다. 이종성 모이어티로서, XTEN은 반감기 연장 모이어티로서 역할을 할 수 있다. 부가적으로, XTEN은 향상된 약동학 파라미터 및 용해도 특성을 포함하지만 이에 제한되지 않는 요망되는 특성을 제공할 수 있다.
본 개시의 단백질 내로의 XTEN 서열 함유 이종성 모이어티의 혼입은 단백질에 하기 유리한 특성: 배좌 유연성, 향상된 수용해도, 높은 정도의 프로테아제 내성, 낮은 면역원성, 포유류 수용체에 대한 낮은 결합 또는 증가된 유체역학(또는 Stokes) 반경 중 하나 이상을 부여할 수 있다.
소정 양태에서, XTEN 서열은 더 긴 생체 내 반감기 또는 증가된 곡선 하 면적(AUC)과 같은 약동학적 특성을 증가시킬 수 있어서, 본 개시의 단백질은 생체 내에 머물고, XTEN 이종성 모이어티가 없는 것을 제외하고는 동일한 단백질과 비교하여 증가된 시기 동안 전응고 활성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본 개시에 유용한 XTEN 서열은 약 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 150개, 200개, 250개, 300개, 350개, 400개, 450개, 500개, 550개, 600개, 650개, 700개, 750개, 800개, 850개, 900개, 950개, 1000개, 1200개, 1400개, 1600개, 1800개, 또는 2000개 초과의 아미노산 잔기를 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드이다. 소정 구현예에서, XTEN은 약 20개 초과 내지 약 3000개의 아미노산 잔기, 30개 초과 내지 약 2500개의 잔기, 40개 초과 내지 약 2000개의 잔기, 50개 초과 내지 약 1500개의 잔기, 60개 초과 내지 약 1000개의 잔기, 70개 초과 내지 약 900개의 잔기, 80개 초과 내지 약 800개의 잔기, 90개 초과 내지 약 700개의 잔기, 100개 초과 내지 약 600개의 잔기, 110개 초과 내지 약 500개의 잔기 또는 120개 초과 내지 약 400개의 잔기를 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드이다. 하나의 특정 구현예에서, XTEN은 42개보다 긴 아미노산 및 144개보다 짧은 아미노산의 길이의 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시의 XTEN 서열은 서열 모티프와 적어도 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 5개 내지 14개(예를 들어, 9개 내지 14개)의 아미노산 잔기 또는 아미노산 서열의 하나 이상의 서열 모티프를 포함할 수 있고, 모티프는 글리신(G), 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T), 글루타메이트(E) 및 프롤린(P)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 4개 내지 6개 유형의 아미노산(예를 들어, 5개의 아미노산)을 포함하거나, 본질적으로 이로 구성되거나, 이로 구성된다. 미국 제2010-0239554 A1호를 참고한다.
일부 구현예에서, XTEN은 비중첩 서열 모티프를 포함하고, 서열의 약 80% 또는 적어도 약 85% 또는 적어도 약 90% 또는 약 91% 또는 약 92% 또는 약 93% 또는 약 94% 또는 약 95% 또는 약 96% 또는 약 97% 또는 약 98% 또는 약 99% 또는 약 100%는 표 3으로부터 선택되는 단일 모티프 패밀리로부터 선택되는 비중첩 서열의 다수의 단위로 구성되어, 패밀리 서열을 생성한다.
본원에서 사용된 바와 같은, "패밀리"는 XTEN이 표 3으로부터의 단일 모티프 카테고리로부터만 선택되는 모티프; 즉 AD, AE, AF, AG, AM, AQ, BC, 또는 BD XTEN을 갖고, 패밀리 모티프로부터의 것이 아닌 XTEN에서의 임의의 다른 아미노산은 필요한 특성을 달성하도록, 예컨대 인코딩 뉴클레오티드에 의한 제한효소 부위의 혼입, 절단 서열의 혼입을 허용하거나 FVIII에 대한 더 우수한 연결을 달성하도록 선택된다는 것을 의미한다. XTEN 패밀리의 일부 구현예에서, XTEN 서열은 AD 모티프 패밀리 또는 AE 모티프 패밀리 또는 AF 모티프 패밀리 또는 AG 모티프 패밀리 또는 AM 모티프 패밀리 또는 AQ 모티프 패밀리 또는 BC 패밀리 또는 BD 패밀리의 비중첩 서열 모티프의 다수의 단위를 포함하고, 생성된 XTEN은 상기 기재된 범위의 상동성을 나타낸다. 다른 구현예에서, XTEN은 표 3의 모티프 패밀리 중 2개 이상으로부터의 모티프 서열의 다수의 단위를 포함한다.
이들 서열은 하기에 더 충분히 기재된, 모티프의 아미노산 조성에 의해 부여된 순 전하, 친수성, 2차 구조의 결여 또는 반복성의 결여와 같은 특성을 포함하는, 요망되는 물리적/화학적 특성을 달성하도록 선택될 수 있다. 이 단락에 기재된 이상의 구현예에서, XTEN 내로 혼입되는 모티프는 약 36개 내지 약 3000개의 아미노산 잔기의 XTEN을 달성하도록 본원에서 기재된 방법을 사용하여 선택되고 조립될 수 있다.
[표 3]
12개 아미노산의 XTEN 서열 모티프 및 모티프 패밀리
Figure pct00012
Figure pct00013
* 다양한 순열로 함께 사용될 때 "패밀리 서열"을 생성하는 개별 모티프 서열을 나타냄
본 개시의 키메라 단백질에서 이종성 모이어티로서 사용될 수 있는 XTEN 서열의 예는, 예를 들어 미국 특허 공개 제2010/0239554 A1호, 제2010/0323956 A1호, 제2011/0046060 A1호, 제2011/0046061 A1호, 제2011/0077199 A1호, 또는 제2011/0172146 A1호, 또는 국제 특허 공개 제WO 2010/091122 A1호, 제WO 2010/144502 A2호, 제WO 2010/144508 A1호, 제WO 2011/028228 A1호, 제WO 2011/028229 A1호, 또는 제WO 2011/028344 A2호에 개시되어 있으며, 각각 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
XTEN은 FVIII 내로의 삽입 또는 이에 대한 연결을 위해 다양한 길이를 가질 수 있다. 하나의 구현예에서, XTEN 서열(들)의 길이는 융합 단백질에서 달성될 특성 또는 기능에 기반하여 선택된다. 의도된 특성 또는 기능에 따라, XTEN은 캐리어로서 역할을 할 수 있는 짧은 길이 또는 중간 길이의 서열 또는 더 긴 서열일 수 있다. 소정 구현예에서, XTEN은 약 6개 내지 약 99개의 아미노산 잔기의 짧은 절편, 약 100개 내지 약 399개의 아미노산 잔기의 중간 길이, 및 약 400개 내지 약 1000개 및 최대 약 3000개의 아미노산 잔기의 더 긴 길이를 포함한다. 따라서, FVIII 내로 삽입되거나 이에 연결된 XTEN은 약 6개, 약 12개, 약 36개, 약 40개, 약 42개, 약 72개, 약 96개, 약 144개, 약 288개, 약 400개, 약 500개, 약 576개, 약 600개, 약 700개, 약 800개, 약 864개, 약 900개, 약 1000개, 약 1500개, 약 2000개, 약 2500개 또는 최대 약 3000개의 아미노산 잔기의 길이를 가질 수 있다. 다른 구현예에서, XTEN 서열은 약 6개 내지 약 50개, 약 50개 내지 약 100개, 약 100개 내지 150개, 약 150개 내지 250개, 약 250개 내지 400개, 약 400개 내지 약 500개, 약 500개 내지 약 900개, 약 900개 내지 1500개, 약 1500개 내지 2000개 또는 약 2000개 내지 약 3000개의 아미노산 잔기의 길이이다.
FVIII 내로 삽입되거나 이에 연결된 XTEN의 정확한 길이는 FVIII의 활성에 부정적으로 영향을 미치지 않으면서 변할 수 있다. 하나의 구현예에서, 본원에서 사용되는 하나 이상의 XTEN은 42개의 아미노산, 72개의 아미노산, 144개의 아미노산, 288개의 아미노산, 576개의 아미노산 또는 864개의 아미노산 길이를 갖고, 하나 이상의 XTEN 패밀리 서열; 즉, AD, AE, AF, AG, AM, AQ, BC 또는 BD로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시에서 사용된 XTEN 서열은 AE42, AG42, AE48, AM48, AE72, AG72, AE108, AG108, AE144, AF144, AG144, AE180, AG180, AE216, AG216, AE252, AG252, AE288, AG288, AE324, AG324, AE360, AG360, AE396, AG396, AE432, AG432, AE468, AG468, AE504, AG504, AF504, AE540, AG540, AF540, AD576, AE576, AF576, AG576, AE612, AG612, AE624, AE648, AG648, AG684, AE720, AG720, AE756, AG756, AE792, AG792, AE828, AG828, AD836, AE864, AF864, AG864, AM875, AE912, AM923, AM1318, BC864, BD864, AE948, AE1044, AE1140, AE1236, AE1332, AE1428, AE1524, AE1620, AE1716, AE1812, AE1908, AE2004A, AG948, AG1044, AG1140, AG1236, AG1332, AG1428, AG1524, AG1620, AG1716, AG1812, AG1908, AG2004, 및 이의 임의의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다. 미국 제2010-0239554 A1호를 참고한다. 하나의 특정 구현예에서, XTEN은 AE42, AE72, AE144, AE288, AE576, AE864, AG 42, AG72, AG144, AG288, AG576, AG864, 또는 이의 임의의 조합을 포함한다.
본 개시의 키메라 단백질에서 이종성 모이어티로서 사용될 수 있는 예시적인 XTEN 서열은 XTEN AE42-4(SEQ ID NO: 41), XTEN 144-2A(SEQ ID NO: 42), XTEN A144-3B(SEQ ID NO: 43), XTEN AE144-4A(SEQ ID NO: 44), XTEN AE144-5A(SEQ ID NO: 45), XTEN AE144-6B(SEQ ID NO: 46), XTEN AG144-1(SEQ ID NO: 47), XTEN AG144-A(SEQ ID NO: 48), XTEN AG144-B(SEQ ID NO: 49), XTEN AG144-C(SEQ ID NO: 50), 및 XTEN AG144-F(SEQ ID NO: 51)를 포함한다. 하나의 특정 구현예에서, XTEN은 SEQ ID NO: 52에 의해 인코딩된다.
일부 구현예에서, XTEN의 아미노산의 100% 미만은 글리신(G), 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T), 글루타메이트(E) 및 프롤린(P)으로부터 선택되거나, 서열의 100% 미만은 본원에 제공된 XTEN 서열 또는 표 3으로부터의 서열 모티프로 구성된다. 이러한 구현예에서, XTEN의 나머지 아미노산 잔기는 임의의 다른 14개의 천연 L-아미노산으로부터 선택되지만, 친수성 아미노산으로부터 우선적으로 선택될 수 있어서, XTEN 서열은 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 적어도 약 99%의 친수성 아미노산을 함유한다.
콘쥬게이션 작제물에서 이용된 XTEN에서의 소수성 아미노산의 함량은 5% 미만 또는 2% 미만 또는 1% 미만의 소수성 아미노산 함량일 수 있다. XTEN의 구축에서 덜 선호되는 소수성 잔기는 트립토판, 페닐알라닌, 티로신, 류신, 이소류신, 발린 및 메티오닌을 포함한다. 추가로, XTEN 서열은 하기 아미노산을 5% 미만 또는 4% 미만 또는 3% 미만 또는 2% 미만 또는 1% 미만으로 함유하거나 함유하지 않을 수 있다: 메티오닌(예를 들어, 산화를 피하기 위하여), 또는 아스파라긴 및 글루타민(탈아미드화를 피하기 위하여).
하나 이상의 XTEN 서열은 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열의 C-말단 또는 N-말단에서 삽입되거나 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열에서 2개의 아미노산 사이에 삽입될 수 있다. 예를 들어, XTEN은 표 2로부터 선택되는 하나 이상의 삽입 부위에서 2개의 아미노산 사이에 삽입될 수 있다. XTEN 삽입에 허용 가능한 FVIII 내의 부위의 예는, 예를 들어 국제 공개 제WO 2013/123457 A1호 또는 미국 공개 제2015/0158929 A1호에서 확인될 수 있고, 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
B.3.e. 알부민, 또는 이의 단편, 유도체 또는 변이체
일부 구현예에서, 이종성 모이어티는 알부민 또는 이의 기능성 단편을 포함한다. 그 전장 형태에서 609개의 아미노산의 단백질인 인간 혈청 알부민(HSA, 또는 HA)은 혈청의 삼투압의 상당한 비율에 관여하고, 또한 내인성 및 외인성 리간드의 캐리어로서 역할을 한다. 본원에서 사용되는 용어 "알부민"은 전장 알부민, 또는 이의 기능적 단편, 변이체, 유도체 또는 유사체를 포함한다. 알부민 또는 이의 단편 또는 변이체의 예는 미국 특허 공개 제2008/0194481 A1호, 제2008/0004206 A1호, 제2008/0161243 A1호, 제2008/0261877 A1호 또는 제2008/0153751 A1호, 또는 PCT 출원 공개 제WO 2008/033413 A2호, 제WO 2009/058322 A1호 또는 제WO 2007/021494 A2호에 개시되어 있고, 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 핵산 분자에 의해 인코딩된 FVIII 단백질은 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 부분(예를 들어, Fc 영역), PAS 서열, HES 및 PEG로 구성되는 군으로부터 선택되는 제2 이종성 모이어티에 추가로 연결된 알부민, 이의 단편 또는 변이체를 포함한다.
B.3.f. 알부민 결합 모이어티
소정 구현예에서, 이종성 모이어티는 알부민 결합 펩티드, 박테리아 알부민 결합 도메인, 알부민 결합 항체 단편, 또는 이의 임의의 조합을 포함하는, 알부민 결합 모이어티이다.
예를 들어, 알부민 결합 단백질은 박테리아 알부민 결합 단백질, 항체 또는 도메인 항체를 포함하는 항체 단편일 수 있다(미국 특허 제6,696,245호 참고). 알부민 결합 단백질은, 예를 들어 박테리아 알부민 결합 도메인, 예컨대 연쇄상구균 단백질 G의 도메인일 수 있다(Konig, T. and Skerra, A. (1998) J. Immunol. Methods 218, 73-83). 콘쥬게이션 파트너로서 사용될 수 있는 알부민 결합 펩티드의 다른 예는 예를 들어 미국 특허 출원 공개 제2003/0069395호 또는 Dennis 등의 문헌[ Dennis et al. (2002) J. Biol. Chem. 277, 35035-35043]에 기재된 바와 같이 Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys(SEQ ID NO:52) 콘센서스 서열을 갖는 것이며, Xaa1은 Asp, Asn, Ser, Thr, 또는 Trp이고; Xaa2는 Asn, Gln, His, Ile, Leu, 또는 Lys이고; Xaa3은 Ala, Asp, Phe, Trp, 또는 Tyr이고; Xaa4는 Asp, Gly, Leu, Phe, Ser, 또는 Thr이다.
문헌[Kraulis et al., FEBS Lett. 378:190-194 (1996) and Linhult et al., Protein Sci. 11:206-213 (2002)]에 개시된 바와 같은 연쇄상구균 단백질 G로부터의 도메인 3은 박테리아 알부민 결합 도메인의 예이다. 알부민 결합 펩티드의 예는 코어 서열 DICLPRWGCLW(SEQ ID NO: 54)를 갖는 일련의 펩티드를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Dennis et al., J. Biol. Chem. 2002, 277: 35035-35043 (2002)]을 참고한다. 알부민 결합 항체 단편의 예는 문헌[Muller and Kontermann, Curr. Opin. Mol. Ther. 9:319-326 (2007); Roovers et al., Cancer Immunol. Immunother. 56:303-317 (2007), 및 Holt et al., Prot. Design Sci., 21:283-288 (2008)]에 개시되어 있고, 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 이러한 알부민 결합 모이어티의 예는 문헌[Trussel et al., Bioconjugate Chem. 20:2286-2292 (2009)]에 개시된 바와 같은 2-(3-말레이미도프로판아미도)-6-(4-(4-요오도페닐)부탄아미도) 헥사노에이트("Albu" 태그)이다.
지방산, 특히 장쇄 지방산(LCFA) 및 장쇄 지방산 유사 알부민 결합 화합물이 본 개시의 FVIII 단백질의 생체 내 반감기를 연장시키기 위해 사용될 수 있다. LCFA 유사 알부민 결합 화합물의 예는 16-(l-(3-(9-(((2,5-디이옥소피롤리딘-l-일옥시)카보닐옥시)-메틸)-7-설포-9H-플루오렌-2-일아미노)-3-옥소프로필)-2,5-디옥소피롤리딘-3-일티오) 헥사데칸산이다(예를 들어, 국제 공개 제WO 2010/140148호 참고).
B.3.g. PAS 서열
다른 구현예에서, 이종성 모이어티는 PAS 서열이다. 본원에서 사용된 바와 같이, PAS 서열은 알라닌 및 세린 잔기를 주로 포함하거나 알라닌, 세린 및 프롤린 잔기를 주로 포함하는 아미노산 서열을 의미하고, 아미노산 서열은 생리적 조건 하에서 랜덤 코일 배좌를 형성한다. 따라서, PAS 서열은 키메라 단백질에서 이종성 모이어티의 부분으로 사용될 수 있는 알라닌, 세린 및 프롤린을 포함하거나, 본질적으로 이로 구성되거나, 이로 구성되는 빌딩 블록, 아미노산 중합체 또는 서열 카세트이다. 그러나, 당업자는 알라닌, 세린 및 프롤린 이외의 잔기가 PAS 서열에서 부차적 구성분으로서 부가되는 경우 아미노산 중합체가 또한 랜덤 코일 배좌를 형성할 수 있다는 것을 알고 있다.
본원에서 사용되는 용어 "부차적 구성분"은 알라닌, 세린 및 프롤린 이외의 아미노산이 소정의 정도로, 예를 들어 최대 약 12%, 즉 PAS 서열의 100개 중 약 12개의 아미노산, 최대 약 10%, 즉 PAS 서열의 100개 중 약 10개의 아미노산, 최대 약 9%, 즉 100개 중 약 9개의 아미노산, 최대 약 8%, 즉 100개 중 약 8개의 아미노산, 약 6%, 즉 100개 중 약 6개의 아미노산, 약 5%, 즉 100개 중 약 5개의 아미노산, 약 4%, 즉 100개 중 약 4개의 아미노산, 약 3%, 즉 100개 중 약 3개의 아미노산, 약 2%, 즉 100개 중 약 2개의 아미노산, 약 1%, 즉 100개 중 약 1개의 아미노산으로 PAS 서열에서 부가될 수 있다는 것을 의미한다. 알라닌, 세린 및 프롤린과 상이한 아미노산은 Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Thr, Trp, Tyr, 및 Val으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.
생리적 조건 하에, PAS 서열 스트레치는 랜덤 코일 배좌를 형성하고 이에 의해 FVIII 단백질에 대한 증가된 생체 내 및/또는 시험관 내 안정성을 매개할 수 있다. 랜덤 코일 도메인이 스스로 안정한 구조 또는 기능을 채택하지 않으므로, FVIII 단백질에 의해 매개된 생물학적 활성은 본질적으로 보존된다. 다른 구현예에서, 랜덤 코일 도메인을 형성하는 PAS 서열은 특히 혈장에서의 단백분해, 면역원성, 등전점/정전기 거동, 세포 표면 수용체에 대한 결합 또는 내재화와 관련하여 생물학적으로 불활성이지만, 여전히 생분해성이고, 이는 합성 중합체, 예컨대 PEG에 비해 명확한 장점을 제공한다.
랜덤 코일 배좌를 형성하는 PAS 서열의 비제한적 예는 ASPAAPAPASPAAPAPSAPA(SEQ ID NO: 55), AAPASPAPAAPSAPAPAAPS(SEQ ID NO: 56), APSSPSPSAPSSPSPASPSS(SEQ ID NO: 57), APSSPSPSAPSSPSPASPS(SEQ ID NO: 58), SSPSAPSPSSPASPSPSSPA(SEQ ID NO: 59), AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA(SEQ ID NO: 60) 및 ASAAAPAAASAAASAPSAAA(SEQ ID NO: 61) 또는 이의 임의의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. PAS 서열의 추가 예는, 예를 들어 미국 특허 공개 제2010/0292130 A1호 및 PCT 출원 공개 제WO 2008/155134 A1호에 공지되어 있다.
B.3.h. HAP 서열
소정 구현예에서, 이종성 모이어티는 글리신 풍부 호모-아미노산 중합체(HAP)이다. HAP 서열은 적어도 50개의 아미노산, 적어도 100개의 아미노산, 120개의 아미노산, 140개의 아미노산, 160개의 아미노산, 180개의 아미노산, 200개의 아미노산, 250개의 아미노산, 300개의 아미노산, 350개의 아미노산, 400개의 아미노산, 450개의 아미노산 또는 500개의 아미노산 길이를 갖는 글리신의 반복 서열을 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, HAP 서열은 HAP 서열에 융합되거나 연결된 모이어티의 반감기를 연장시킬 수 있다. HAP 서열의 비제한적 예는 (Gly)n, (Gly4Ser)n 또는 S(Gly4Ser)n을 포함하지만, 이에 제한되지 않으며, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20이다. 하나의 구현예에서, n은 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40이다. 다른 구현예에서, n은 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 200이다.
B.3.i. 트랜스페린 또는 이의 단편
소정 구현예에서, 이종성 모이어티는 트랜스페린 또는 이의 단편이다. 임의의 트랜스페린이 본 개시의 FVIII 단백질을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 예로서, 야생형 인간 TF(TF)는, 유전자 중복으로부터 기원하는 것으로 보이는, 2개의 주요 도메인, N(약 330개의 아미노산) 및 C(약 340개의 아미노산)를 갖는 대략 75 KDa(글리코실화를 설명하는 것이 아님)의 679개 아미노산 단백질이다. GenBank 등록 번호 NM001063, XM002793, M12530, XM039845, XM 039847 및 S95936(www.ncbi.nlm.nih.gov/)을 참고하며, 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 트랜스페린은 2개의 도메인, N 도메인 및 C 도메인을 포함한다. N 도메인은 2개의 하위도메인, N1 도메인 및 N2 도메인을 포함하고, C 도메인은 2개의 하위도메인, C1 도메인 및 C2 도메인을 포함한다.
하나의 구현예에서, 트랜스페린 이종성 모이어티는 트랜스페린 스플라이스 변이체를 포함한다. 하나의 예에서, 트랜스페린 스플라이스 변이체는 인간 트랜스페린의 스플라이스 변이체, 예를 들어 Genbank 등록 번호 AAA61140일 수 있다. 다른 구현예에서, 키메라 단백질의 트랜스페린 부분은 트랜스페린 서열의 하나 이상의 도메인, 예를 들어 N 도메인, C 도메인, N1 도메인, N2 도메인, C1 도메인, C2 도메인 또는 이의 임의의 조합을 포함한다.
B.3.j. 제거 수용체(clearance receptor)
소정 구현예에서, 이종성 모이어티는 제거 수용체, 이의 단편, 변이체 또는 유도체이다. LRP1은 인자 X와 같은 다양한 단백질의 수용체 매개된 제거에 연루된 600 kDa 내재성 막 단백질이다. 예를 들어, 문헌[Narita et al., Blood 91:555-560 (1998)]을 참고한다.
B.3.k. 폰 빌레브란트 인자 또는 이의 단편
소정 구현예에서, 이종성 모이어티는 폰 빌레브란트 인자(VWF) 또는 이의 하나 이상의 단편이다.
VWF(F8VWF로도 공지됨)는 혈장에 존재하고 내피(바이벨-팔라드 소체에서), 거핵구(혈소판의 α-과립) 그리고 내피하 결합 조직에서 구성적으로 생성되는 거대한 다량체성 당단백질이다. 기본 VWF 단량체는 2813개의 아미노산 단백질이다. 모든 단량체는 특이적 기능을 갖는 다수의 특이적 도메인, D' 및 D3 도메인(이들은 함께 VIII 인자에 결합함), A1 도메인(이는 혈소판 GPIb-수용체, 헤파린, 및/또는 가능하게는 콜라겐에 결합함), A3 도메인(이는 콜라겐에 결합함), C1 도메인(여기서, RGD 도메인은 이것이 활성화되는 경우 혈소판 인테그린 αIIbβ3에 결합함) 및 단백질의 C 말단에서의 "시스테인 노트(knot)" 도메인(VWF가 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 전환 성장 인자-β(TGFβ) 및 β-인간 융모성 생식선 자극호르몬(βHCG)과 공유함)을 함유한다.
인간 VWF에 대한 2813개의 단량체 아미노산 서열은 Genbank에서 등록 번호 NP000543.2로 보고된다. 인간 VWF를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 Genbank에서 등록 번호 NM000552.3으로 보고된다. SEQ ID NO: 62는 Genbank 등록 번호 NM000552.3으로 보고된 아미노산 서열이다. D' 도메인은 SEQ ID NO: 62의 아미노산 764 내지 866을 포함한다. D3 도메인은 SEQ ID NO: 62의 아미노산 867 내지 1240을 포함한다.
혈장에서, FVIII의 95% 내지 98%는 전장 VWF와 단단한 비공유 복합체로 순환한다. 상기 복합체의 형성은 생체내 FVIIII의 적절한 혈장 수준의 유지에 중요하다. 문헌[Lenting et al., Blood. 92(11): 3983-96 (1998); Lenting et al., J. Thromb. Haemost. 5(7): 1353-60 (2007)]. FVIII이 중쇄에서의 위치 372 및 740 및 경쇄에서의 위치 1689에서 단백분해로 인해 활성화될 때, FVIII에 결합된 VWF는 활성화된 FVIII로부터 제거된다.
소정 구현예에서, 이종성 모이어티는 전장 폰 빌레브란트 인자이다. 다른 구현예에서, 이종성 모이어티는 폰 빌레브란트 인자 단편이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 본원에서 사용되는 용어 "VWF 단편" 또는 "VWF 단편들"은 FVIII와 상호작용하고, 전장 VWF에 의해 FVIII에 보통 제공되는 적어도 하나 이상의 특성을 보유하는, 예를 들어 FVIIIa로의 조기 활성화를 방지하고/하거나, 조기 단백분해를 방지하고/하거나, 조기 제거를 초래할 수 있는 인지질 막과의 연합을 방지하고/하거나, VWF 결합된 FVIII이 아니라 네이키드 FVIII에 결합할 수 있는 FVIII 제거 수용체에 대한 결합을 방지하고/하거나, FVIII 중쇄 및 경쇄 상호작용을 안정화하는 임의의 VWF 단편을 의미한다. 특정 구현예에서, 이종성 모이어티는 VWF의 D3 도메인 및 D' 도메인을 포함하는(VWF) 단편이다. D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하는 VWF 단편은 A1 도메인, A2 도메인, A3 도메인, D1 도메인, D2 도메인, D4 도메인, B1 도메인, B2 도메인, B3 도메인, C1 도메인, C2 도메인, CK 도메인, 이의 하나 이상의 단편, 및 이의 임의의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 VWF 도메인을 추가로 포함할 수 있다. VWF 단편에 융합된 FVIII 활성을 갖는 폴리펩티드의 추가 예는 2012년 7월 3일에 출원된 미국 특허 가출원 제61/667,901호 및 미국 공개 제2015/0023959 A1호에 개시되어 있고, 이들 둘 모두는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
B.3.l. 링커 모이어티
소정 구현예에서, 이종성 모이어티는 펩티드 링커이다.
본원에서 사용되는 용어 "펩티드 링커" 또는 "링커 모이어티"는 폴리펩티드 사슬의 선형 아미노산 서열에서 2개의 도메인을 연결하는 펩티드 또는 폴리펩티드 서열(예를 들어, 합성 펩티드 또는 폴리펩티드 서열)을 나타낸다.
일부 구현예에서, 펩티드 링커를 인코딩하는 이종성 뉴클레오티드 서열은 본 개시의 최적화된 FVIII 폴리뉴클레오티드 서열과, 예를 들어 상기 기재된 이종성 모이어티 중 하나, 예컨대 알부민을 인코딩하는 이종성 뉴클레오티드 서열 사이에 삽입될 수 있다. 펩티드 링커는 키메라 폴리펩티드 분자에 유연성을 제공할 수 있다. 링커는 전형적으로 절단되지 않지만, 이러한 절단이 바람직할 수 있다. 하나의 구현예에서, 이들 링커는 가공 동안 제거되지 않는다.
본 개시의 키메라 단백질에 존재할 수 있는 링커의 유형은 절단 부위(즉, 프로테아제 절단 부위 기질, 예를 들어 인자 XIa, Xa 또는 트롬빈 절단 부위)를 포함하고, 절단 부위의 N 말단 또는 C 말단 또는 양측에 추가 링커를 포함할 수 있는 프로테아제 절단성 링커이다. 이들 절단성 링커는 본 개시의 작제물 내로 혼입되는 경우 이종성 절단 부위를 갖는 키메라 분자를 생성한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 핵산 분자에 의해 인코딩된 FVIII 폴리펩티드는 단일 폴리펩티드 사슬에 포함된 Fc 영역을 형성하도록 cscFc 링커를 통해 연결된 2개 이상의 Fc 도메인 또는 모이어티를 포함한다. cscFc 링커는 적어도 하나의 세포내 가공 부위, 즉 세포내 효소에 의해 절단되는 부위가 측면에 있다. 적어도 하나의 세포내 가공 부위에서의 폴리펩티드의 절단은 적어도 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 폴리펩티드를 생성한다.
다른 펩티드 링커는, 예를 들어 FVIII 단백질을 Fc 영역에 연결하기 위해, 본 개시의 작제물에서 선택적으로 사용될 수 있다. 본 개시와 관련하여 사용될 수 있는 일부 예시적인 링커는, 예를 들어 하기에 더 상세하게 기재된 GlySer 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
하나의 구현예에서, 펩티드 링커는 합성, 즉 천연 비발생이다. 하나의 구현예에서, 펩티드 링커는 아미노산의 제1 선형 서열을 자연에서는 천연 연결되지 않거나 유전자 융합되지 않는 아미노산의 제2 선형 서열에 연결시키거나 유전자 융합시키는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드(또는 폴리펩티드)(천연 발생일 수 있거나 아닐 수 있음)를 포함한다. 예를 들어, 하나의 구현예에서 펩티드 링커는 천연 발생 폴리펩티드의 변형된 형태인(예를 들어, 돌연변이, 예컨대 부가, 치환 또는 결실을 포함함) 천연 비발생 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 펩티드 링커는 천연 비발생 아미노산을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 펩티드 링커는 자연에서는 발생하지 않는 선형 서열로 발생하는 천연 발생 아미노산을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 펩티드 링커는 천연 발생 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 소정 구현예에서, 펩티드 링커는 동일한 Fc 모이어티를 융합시켜서, 동종이량체성 scFc 영역을 형성하기 위해 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 펩티드 링커는 상이한 Fc 모이어티(예를 들어, 야생형 Fc 모이어티 및 Fc 모이어티 변이체)를 융합시켜서, 이종이량체성 scFc 영역을 형성하기 위해 사용될 수 있다.
다른 구현예에서, 펩티드 링커는 gly-ser 링커를 포함하거나 이로 구성된다. 하나의 구현예에서, scFc 또는 cscFc 링커는 면역글로불린 힌지의 적어도 일부 및 gly-ser 링커를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "gly-ser 링커"는 글리신 및 세린 잔기로 구성되는 펩티드를 나타낸다. 소정 구현예에서, 상기 gly-ser 링커는 펩티드 링커의 2개의 다른 서열 사이에 삽입될 수 있다. 다른 구현예에서, gly-ser 링커는 펩티드 링커의 다른 서열의 한 말단 또는 양 말단에 부착된다. 다른 구현예에서, 2개 이상의 gly-ser 링커는 펩티드 링커에서 연속하여 혼입된다. 하나의 구현예에서, 본 개시의 펩티드 링커는 상부 힌지 영역(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 분자로부터 유래됨)의 적어도 일부, 중간 힌지 영역(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 분자로부터 유래됨)의 적어도 일부 및 일련의 gly/ser 아미노산 잔기를 포함한다.
본 개시의 펩티드 링커는 적어도 하나의 아미노산의 길이이고, 다양한 길이일 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 개시의 펩티드 링커는 약 1개 내지 약 50개 아미노산 길이이다. 이 맥락에서 사용된 바와 같이 용어 "약"은 +/- 2개의 아미노산 잔기를 나타낸다. 링커 길이는 양의 정수이어야 하므로, 약 1개 내지 약 50개 아미노산 길이의 길이는 1개 내지 3개로부터 48개 내지 52개까지의 아미노산의 길이를 의미한다. 다른 구현예에서, 본 개시의 펩티드 링커는 약 10개 내지 약 20개 아미노산 길이이다. 다른 구현예에서, 본 개시의 펩티드 링커는 약 15개 내지 약 50개 아미노산 길이이다. 다른 구현예에서, 본 개시의 펩티드 링커는 약 20개 내지 약 45개 아미노산 길이이다. 다른 구현예에서, 본 개시의 펩티드 링커는 약 15개 내지 약 35개 또는 약 20개 내지 약 30개 아미노산 길이이다. 다른 구현예에서, 본 개시의 펩티드 링커는 약 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 500개, 1000개 또는 2000개 아미노산 길이이다. 하나의 구현예에서, 본 개시의 펩티드 링커는 20개 또는 30개 아미노산 길이이다.
일부 구현예에서, 펩티드 링커는 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 10개, 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 60개, 적어도 70개, 적어도 80개, 적어도 90개 또는 적어도 100개 아미노산을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 펩티드 링커는 적어도 200개, 적어도 300개, 적어도 400개, 적어도 500개, 적어도 600개, 적어도 700개, 적어도 800개, 적어도 900개 또는 적어도 1,000개 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 펩티드 링커는 적어도 약 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 150개, 200개, 300개, 400개, 500개, 600개, 700개, 800개, 900개, 1000개, 1100개, 1200개, 1300개, 1400개, 1500개, 1600개, 1700개, 1800개, 1900개 또는 2000개 아미노산을 포함할 수 있다. 펩티드 링커는 1개 내지 5개의 아미노산, 1개 내지 10개의 아미노산, 1개 내지 20개의 아미노산, 10개 내지 50개의 아미노산, 50개 내지 100개의 아미노산, 100개 내지 200개의 아미노산, 200개 내지 300개의 아미노산, 300개 내지 400개의 아미노산, 400개 내지 500개의 아미노산, 500개 내지 600개의 아미노산, 600개 내지 700개의 아미노산, 700개 내지 800개의 아미노산, 800개 내지 900개의 아미노산 또는 900개 내지 1000개 아미노산을 포함할 수 있다.
펩티드 링커는 당분야에 공지된 기법을 사용하여 폴리펩티드 서열 내로 도입될 수 있다. 변형은 DNA 서열 분석에 의해 확인될 수 있다. 생성되는 폴리펩티드의 안정한 생성을 위해 숙주 세포를 형질전환하기 위해 플라스미드 DNA가 사용될 수 있다.
B.3.m. 단량체-이량체 하이브리드
일부 구현예에서, 이종성 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 본 개시의 단리된 핵산 분자는 FVIII을 포함하는 단량체-이량체 하이브리드 분자를 인코딩한다.
본원에서 사용되는 용어 "단량체-이량체 하이브리드"는 디설피드 결합에 의해 서로 연합된 제1 폴리펩티드 사슬 및 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하는 키메라 단백질을 나타내고, 예를 들어, 제1 사슬은 인자 VIII 및 제1 Fc 영역을 포함하고, 제2 사슬은 FVIII이 없는 제2 Fc 영역을 포함하거나, 본질적으로 이로 구성되거나, 이로 구성된다. 따라서 단량체-이량체 하이브리드 작제물은 적어도 하나의 응고 인자를 갖는 단량체 양태 및 2개의 Fc 영역을 갖는 이량체 양태를 포함하는 하이브리드이다.
B.3.n. 발현 제어 요소
일부 구현예에서, 본 개시의 핵산 분자 또는 벡터는 적어도 하나의 발현 제어 서열을 추가로 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이 발현 제어 서열은 이것이 작동 가능하게 연결된 코딩 핵산의 효율적인 전사 및 번역을 촉진하는, 임의의 조절 뉴클레오티드 서열, 예컨대 프로모터 서열 또는 프로모터-인핸서 조합이다. 예를 들어, 본 개시의 단리된 핵산 분자는 적어도 하나의 전사 제어 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
유전자 발현 제어 서열은, 예를 들어 포유류 또는 바이러스 프로모터, 예컨대 구성적 또는 유도성 프로모터일 수 있다. 구성적 포유류 프로모터는 하기 유전자: 하이포잔틴 포스포리보실 트랜스퍼라제(HPRT), 아데노신 데아미나제, 피루베이트 키나제에 대한 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 및 다른 구성적 프로모터를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 진핵 세포에서 구성적으로 기능하는 예시적인 바이러스 프로모터는, 예를 들어 사이토메갈로바이러스(CMV), 시미안 바이러스(예를 들어, SV40), 파필로마 바이러스, 아데노바이러스, 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 라우스 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 몰로니 백혈병 바이러스의 긴 말단 반복체(LTR) 및 다른 레트로바이러스로부터의 프로모터, 및 단순 포진 바이러스의 티미딘 키나제 프로모터를 포함한다.
다른 구성적 프로모터는 당업자에게 공지되어 있다. 본 개시의 유전자 발현 서열로서 유용한 프로모터는 또한 유도성 프로모터를 포함한다. 유도성 프로모터는 유도제의 존재 하에 발현된다. 예를 들어, 메탈로티오나인 프로모터는 소정 금속 이온의 존재 하에 전사 및 번역을 촉진하도록 유도된다. 다른 유도성 프로모터는 당업자에게 공지되어 있다.
하나의 구현예에서, 본 개시는 조직 특이적 프로모터 및/또는 인핸서의 제어 하의 트랜스유전자의 발현을 포함한다. 다른 구현예에서, 프로모터 또는 다른 발현 제어 서열은 선택적으로 간 세포에서 트랜스유전자의 발현을 향상시킨다. 간 특이적 프로모터의 예는 마우스 티레틴 프로모터(mTTR), 내인성 인간 인자 VIII(F8) 프로모터, 내인성 인간 인자 IX(F9) 프로모터, 인간 알파-1-안티트립신 프로모터(hAAT), 인간 알부민 최소 프로모터 및 마우스 알부민 프로모터를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 프로모터는 mTTR 프로모터를 포함한다. mTTR 프로모터는 문헌[R. H. Costa et al., 1986, Mol. Cell. Biol. 6:4697]에 기재되어 있다. F8 프로모터는 문헌[Figueiredo and Brownlee, 1995, J. Biol. Chem. 270:11828-11838]에 기재되어 있다. 소정 구현예에서, 프로모터는 미국 특허 공개 제US2019/0048362호에 개시된 바와 같은 임의의 mTTR 프로모터(예를 들어, mTTR202 프로모터, mTTR202opt 프로모터, mTTR482 프로모터)를 포함하며, 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
발현 수준은 하나 이상의 인핸서를 사용하여 치료 유효성을 달성하도록 추가로 향상될 수 있다. 하나 이상의 인핸서는 단독으로 또는 하나 이상의 프로모터 요소와 함께 제공될 수 있다. 전형적으로, 발현 제어 서열은 복수의 인핸서 요소 및 조직 특이적 프로모터를 포함한다. 하나의 구현예에서, 인핸서는 α-1-마이크로글로불린/비쿠닌 인핸서의 하나 이상의 카피를 포함한다(Rouet et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:20765-20773; Rouet et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23:395-404; Rouet et al., 1998, Biochem. J. 334:577-584; Ill et al., 1997, Blood Coagulation Fibrinolysis 8:S23-S30). 다른 구현예에서, 인핸서는 EBP, DBP, HNF1, HNF3, HNF4, HNF6과 같은 간 특이적 전사 인자의 결합 부위로부터 유래되며, Enh1은 HNF1, (센스)-HNF3, (센스)-HNF4, (안티센스)-HNF1, (안티센스)-HNF6, (센스)-EBP, (안티센스)-HNF4(안티센스)를 포함한다.
특정 예에서, 본 개시에 유용한 프로모터는 GenBank 번호 Ay661265로도 공지된, SEQ ID NO: 63(즉, ET 프로모터)를 포함한다. 또한, 문헌[Vigna et al., Molecular Therapy 11(5):763 (2005)]을 참고한다. 다른 적합한 벡터 및 유전자 조절 요소의 예가 제WO 02/092134호, 유럽 특허 1395293, 또는 미국 특허 제6,808,905호, 제7,745,179호 또는 제7,179,903호에 기재되어 있으며, 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
일반적으로, 발현 제어 서열은, 필요한 경우, 각각 전사 및 번역의 개시에 관여된 5' 비전사 및 5' 비번역 서열, 예컨대 TATA 박스, 캡핑 서열, CAAT 서열 등을 포함해야 한다. 특히, 이러한 5' 비전사 서열은 작동 가능하게 연결된 코딩 핵산의 전사 제어를 위한 프로모터 서열을 포함하는 프로모터 영역을 포함할 것이다. 유전자 발현 서열은 요망되는 경우 선택적으로 인핸서 서열 또는 상류 활성화제 서열을 포함한다.
실시예
실시예 1 - 재조합 렌티바이러스 벡터(LV) 조제물
다양한 스트레스 조건(예를 들어 냉동 및 해동(F/T), 승온(37℃), 아지테이션)에 대한 벡터의 노출 및 시간 경과에 따른 변화 모니터링에 의해 렌티바이러스 벡터 완제 의약품 안정성을 평가하였다. 안정성을 결정하는 방법은 하기를 포함하였다: 기능적 역가에 대한 ddPCR, p24 농도에 대한 p24 ELISA, 및 입자 크기 분포 및 입자 농도에 대한 NanoSight. 기능적 역가는 세포-기반 검정(HEK293)이며, 이에 의해 LV를 세포와 인큐베이션하여, 세포성 게놈 내로 통합될 수 있게 하고, 추출하고, DNA를 ddPCR로 측정한다. ELISA 기반 p24 방법은 키트-기반 방법(Invitrogen)이며, 여기서 바이러스 캡시드 단백질, p24를 측정하고, 총 입자 농도와 관련시킨다. NanoSight는 입자의 브라운 운동을 사용하여 용액 중 LV 입자의 크기 및 농도를 평가하는 방법이다.
기능적 역가는 용량 정의 파라미터이며 핵심 메트릭(metric)이다. 이는 LV가 안정한지 및 이에 따라 이의 페이로드를 세포 내로 통합할 수 있는지에 대한(약물의 유효성 및 작용 기전에 관련됨) 정보를 제공한다. 기능적 역가는 용량 정의 기준이다.
벡터 생산 및 측정
HEK293T 세포 내로의 일시적 4-플라스미드 공동전달감염에 의해 VSV-위유형화 3세대 렌티바이러스 벡터(LV)를 생산하고 OXB 특허(미국 제9,169,491 B2호)에 기재된 바와 같이 음이온-교환에 의해 정제하였다. 벡터 입자를 처음에 기능적 역가 및 HIV-I gag p24 항원 면역포획(NEN Life Science Products)에 의해 분석하여 적절한 전달감염, 생산, 및 정제 수율을 보장하였다. 모든 벡터에 있어서 농축된 벡터 발현 역가, 또는 기능적 역가는 1-10E8 TU/mL 형질도입 단위293T(TU)/ml부터의 범위였다.
세포 배양
부착성 HEK293T 세포를 렌티벡터로 형질도입하여 기능적 역가를 측정하였다. 세포를 3회 분할한 후 게놈 DNA 단리를 위해 수확하였다. 렌티벡터 특이적 프라이머 및 프로브를 사용하여 액적 디지털 PCR(ddPCR)에 의해 게놈 DNA에서 LV 통합을 측정하였다. HEK293T 부착성 세포를 10% 우태 혈청(FBS; Gibco) 및 페니실린-스트렙토마이신 및 글루타민의 조합으로 보충된 이스코브 변형 둘베코 배지(IMDM; Gibco) 중에 유지하였다.
비히클(제형) 내로의 LV 가공
정제 후 LV 물질(원료 의약품 - DS)을 풀링하고 중공 섬유막을 사용하여 각각의 제형 완충액 내로 완충액 교환하였다. DS를 먼저 대략 10배 농축한 후 농축된 DS 부피의 6배의 각 제형 완충액으로 교환하였다(예를 들어 1 mL의 농축된 DS 당 6 mL 완충액). 최종 제형화된 LV를 완제 의약품(DP)으로 간주하였고 안정성에 대해 시험하였다. 도 7a 및 도 7b, 및 도 8a 및 도 8b는 비히클 TSSM(20 mM Tris, 100 mM NaCl, 1%(w/v) 수크로스, 1%(w/v) 만니톨, pH 7.3)으로부터 비히클 포스페이트(제형 1)(10 mM 포스페이트, 100 mM NaCl, 3%(w/v) 수크로스, 0.05%(w/v) P188, pH 7.3) 내로의 재가공 시 제형의 특성규명을 나타낸다. TSSM에 부가하여, 본원에서는 4개의 대안적 제형을 시험하였다: 제형 2(포스페이트 고염). 10 mM 포스페이트, 130 mM NaCl, 1%(w/v) 수크로스, 0.05%(w/v) P188, pH 7.3; 제형 3(히스티딘). 20 mM 히스티딘, 100 mM NaCl, 3%(w/v) 수크로스, 0.05%(w/v) P188, pH 6.5; 제형 4(포스페이트 pH 7.0). 10 mM 포스페이트, 100 mM NaCl, 3%(w/v) 수크로스, 0.05%(w/v) P188, pH 7.0; 제형 5(히스티딘 pH 7.0). 20 mM 히스티딘, 100 mM NaCl, 3%(w/v) 수크로스, 0.05%(w/v) P188, pH 7.0.
실시예 2 - 렌티바이러스 벡터(LV) 조제물의 생체내 투여
5주령 CD-1 및 C57BL6 마우스를 Charles Rivers Laboratories로부터 구입하여 특정-병원체-비함유 조건에서 유지하였다. 6마리의 수컷 HemA 마우스를 Charles River에 수용된, 본 발명자들의 콜로니로부터 수득하였다. 벡터 + 비히클 또는 비히클 단독 투여를 마우스에서 꼬리 정맥 주사 또는 관자 정맥 주사에 의해 수행하였다. 모든 동물 절차를 Bioverativ/Sanofi IACUC(동물 프로토콜 547)에 의해 승인된 프로토콜에 따라 수행하였다. 3개의 상이한 제형을 시험하였다: (1) 20 mM Tris, 100 mM NaCl, 1%(w/v) 수크로스, 1%(w/v) 만니톨, pH 7.3(TSSM); (2) 10 mM 포스페이트, 100 mM NaCl, 3%(w/v) 수크로스, 0.05%(w/v) P188, pH 7.3(포스페이트); 및 (3) 20 mM 히스티딘, 100 mM NaCl, 3%(w/v) 수크로스, 0.05%(w/v) P188, pH 6.5(히스티딘)(표 4).
[표 4]
LV 조제물의 생체내 투여
Figure pct00014
제형: 비히클(TSSM) 단독, 및 LV를 포함하는 비히클(TSSM)
단회 정맥내 투여 후 C57BL6 및 CD-1 성체 마우스에서 LV-coFIX를 사용하여 용량 반응 연구를 수행하였다. 11마리의 수컷 C57BL6 마우스(5주령) 및 11마리의 수컷 CD-1 마우스(5주령)를 사용하였다. 투여된 용량은 하기와 같았다: 6E10(n=3), 2E10(n=4), 및 7.5E9(n=4) TU/kg. 제형 비히클은 TSSM 완충액이었다.
C57BL6 및 CD-1 마우스에 TSSM 완충액 중 제형화된 LV-FIX 벡터를 투여하였다. 6E10 TU/kg 용량을 13.3 내지 15 ml/kg로 희석 없이 그대로 제공하였다. 다른 2개의 더 낮은 용량은 투여 전 PBS 중에 희석하였다. 각 계통의 3마리의 마우스에 고용량을 제공하였다. 6E10 TU/kg 용량의 주사 시 바로, 1마리의 C57BL6 마우스가 심장 정지로 사망하였다. 군 내의 다른 마우스는 대략 30분 후 유해 효과를 나타내었다. 본 발명자들은 과도한 그루밍, 이어서 거친 코트, 무관심 및 비활동을 관찰하였다. 이들 마우스는 주사 1시간 후 회복되는 것으로 보였다. 고용량(6E10 TU/kg) 군의 마우스만 유해 효과를 나타내었다. 희석된 용량을 제공받은 마우스는 유해 효과를 전혀 나타내지 않았다. 이후, 2마리의 CD-1 및 2마리의 C57BL6 마우스에 10 ml/kg 내지 15 ml/kg로 단지 TSSM 비히클 제형 완충액 단독을 제공하였다. 이들 마우스도 약 1시간 후 표준화된 주사 후 유해 효과(과도한 그루밍, 이어서 거친 코트, 무관심, 및 비활동)를 나타내었다. 결과를 표 4에 요약한다.
제형: 비히클(포스페이트) 단독
HemA 마우스를 사용하여 용량 반응 연구를 수행하였다. 3마리의 수컷 HemA 마우스(9주령)를 사용하였다. 투여된 용량은 15 mL/kg이었다. 제형 비히클은 포스페이트 완충액이었다.
3마리의 HemA 마우스에 15 ml/kg 포스페이트 제형 완충액을 투여하여 임의의 유해한 생체내 효과를 시험하였다. 마우스를 다음 2일 동안 면밀히 관찰하였다. TSSM 제형 완충액으로 나타난 과도한 그루밍, 거친 코트, 무관심, 및 비활동을 포함하는 유해 효과는 주지되지 않았다.
제형: LV를 포함하는 비히클(포스페이트)
관자 정맥 주사에 의해 HemA 새끼 마우스에서 LV-coFVIII-6XTEN을 사용하여 용량 반응 연구를 수행하였다. 22마리의 수컷 및 암컷 HemA 새끼 마우스(2일령)를 사용하였다. 투여된 용량은 하기와 같았다: 3E9 TU/kg 및 1.5E9 TU/kg. 제형 비히클은 포스페이트 완충액이었다.
2일령 마우스에 관자 정맥 주사에 의해 3E9 TU/kg 또는 1.5E9 TU/kg로 포스페이트 완충액 중 제형화된 LV-FVIIIXTEN을 투여하였다. 고용량(3E9)을 희석 없이 제공하였다. 주사 후 이들 마우스에서는 유해 효과가 나타나지 않았다.
제형: 비히클(히스티딘) 단독
HemA 마우스를 사용하여 용량 반응 연구를 수행하였다. 3마리의 수컷 HemA 마우스(19주령)를 사용하였다. 투여된 용량은 15 mL/kg이었다. 제형 비히클은 히스티딘 완충액이었다.
3마리의 HemA 마우스에 15 ml/kg 히스티딘 제형 완충액을 투여하여 임의의 유해한 생체내 효과를 시험하였다. 마우스를 다음 2일 동안 면밀히 관찰하였다. TSSM 제형 완충액으로 나타난 과도한 그루밍, 거친 코트, 무관심, 및 비활동을 포함하는 유해 효과는 주지되지 않았다.
제형: LV를 포함하는 비히클(히스티딘)
꼬리 정맥 주사에 의해 관용화된 성체 HemA 마우스에서 LV-coFVIII-6XTEN을 사용하여 용량 반응 연구를 수행하였다. 4마리의 수컷 HF8 마우스(12주령)를 사용하였다. 투여된 용량은 15 mL/kg이었다. 제형 비히클은 히스티딘 완충액이었다.
4마리의 관용화된 HemA 마우스(HF8)에 히스티딘 제형 완충액 중 제형화된 15 ml/kg LV-FVIIIXTEN 벡터를 투여하였다. TSSM 제형으로 나타난 과도한 그루밍, 거친 코트, 무관심, 및 비활동을 포함하는 유해 효과는 주지되지 않았다.
요약하면, 마우스에 각각의 제형에 대한 벡터 + 비히클 또는 비히클 단독을 주사하였다. 표 4는 TSSM 주사(벡터 + 비히클 및 비히클 단독 둘 모두)가 1마리의 치명성을 포함하여, 마우스에 대해 유해한 독성 효과를 가졌음을 나타낸다. 반대로, 포스페이트 및 히스티딘 제형, 벡터 + 비히클 또는 비히클 단독은 마우스에서 반응을 초래하지 않았다(독성 효과 없음).
실시예 3 - 비히클 TSSM을 사용하는 제형의 시험
아지테이션, 냉동-해동, 및 온도 조건
1%(w/v) P188의 최종 농도에 있어서, 1%(w/v) P188을 첨가하거나 첨가하지 않은 TSSM 제형(벡터 + 비히클)의 안정성을, 제형에 아지테이션, 냉동-해동(F/T) 주기(5 및 10), 및 6 시간 실온 인큐베이션을 가하여 시험하였다(도 3a 및 도 3b, 도 4, 도 5a 및 도 5b, 표 5). 벡터의 안정성을 기능적 역가, p24 농도, 및 입자 크기 및 분포(NanoSight)를 결정하여 측정하였다. 도 3a 및 도 3b, 도 4, 도 5a 및 도 5b, 및 표 5에 나타낸 바와 같이, P188을 포함하거나 포함하지 않는 제형에 있어서 상이한 조건 하에서 벡터 안정성의 유의미한 변화는 존재하지 않았다. 벡터 온전성을 NanoSight를 사용하여 입자 크기 측정에 의해 결정하였다.
[표 5]
비히클 TSSM을 사용하는 제형의 시험
Figure pct00015
* 1 ng/mL p24 = 1.25E7 입자/mL로 가정함(NT = 시험하지 않음)
희석 조건
TSSM 제형(벡터 + 비히클)을 1x, 20x, 및 100x로 희석하고, 37℃에서 인큐베이션하고, 0일차, 3일차, 7일차, 및 14일차에 ddPCR을 통해 기능적 역가를 측정함으로써 안정성을 결정하였다. 도 6a 및 도 6b는 희석이 승온에서 2주에 걸쳐 안정성에 대해 효과를 갖지 않았음을 나타낸다.
상이한 시기 동안의 인큐베이션
TSSM 제형(벡터 + 비히클)을 0일, 3일, 7일, 또는 14일 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 안정성은 ddPCR을 통해 기능적 역가를 결정함으로써 측정한 반면, 입자 온전성(입자 농도)은 Nanosight 또는 p24 ELISA를 사용하여 측정하였다. 인큐베이션 시간의 함수로서 안정성 및 벡터 온전성(입자 농도)을 도 7a 및 도 7b, 및 도 8a 및 도 8b에 나타낸 바와 같이 결정하였다. 벡터 안정성은 인큐베이션 시간이 증가함에 따라 감소한 반면, 입자 농도는 증가하였다.
37℃에서의 연장된 인큐베이션
TSSM 제형(벡터 + 비히클)을 0일, 3일, 1주, 또는 2주 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 입자 크기 분포를 Nanosight를 사용하여 측정하였다. 도 7a 및 도 7b, 및 도 8a 및 도 8b에 나타낸 바와 같이, 인큐베이션 시간이 연장되면서 입자 크기 분포가 넓어졌지만, 입자 농도는 증가하였다. 결과는 하기와 같이 설명할 수 있다. 37℃ 온도에 대한 장기간 노출은 캡시드의 분해를 야기하여 ELISA에서 측정되는 보다 명백한 p24를 초래하므로, 총 입자 농도는 증가하는 반면 감염도는 감소한다. 또한, 분해되는 바이러스는 보다 작은 크기의 종 증가를 야기한다.
실시예 4 - 비히클 포스페이트 및 히스티딘을 사용하는 제형의 시험
포스페이트 제형
렌티바이러스 벡터(LV) 제형을 비히클 포스페이트(10 mM 포스페이트, 100 mM NaCl, 3%(w/v) 수크로스, 0.05%(w/v) P188, pH 7.3) 내로의 가공 시 특성규명하였다. 입자 크기 및 분포를 Nanosight를 사용하여 측정하였다(도 1). 도 1은 원료 의약품(DS) 풀에 대해 깨끗한 단량체성 피크를 나타내는 Nanosight로부터의 결과를 나타내는 선도이며, 이는 최종 비히클 완충액(접선류 여과 - TFF 후) 내로의 초여과/투석여과 후 일부 더 큰 입자의 존재가 출현하면서 약간 더 큰 입자 크기로 이동한다. 이론에 구애받고자 하지 않으면서, 이는 물질의 가공 스트레스 동안 입자의 물리적 분해에 기인할 수 있다. 최종 완제 의약품(DP)은 0.22 μm 크기의 여과막을 통해 여과되는 경우 가공 시작 시 DS 풀과 일치하도록 되돌아오는 입자 크기 및 분포 프로필을 생성한다. TFF 스트레스는 도 2a 및 도 2b에서의 사진에서 시각적으로 나타난다.
벡터 안정성을 아지테이션, 37℃에서의 인큐베이션, 기간, 및 희석을 포함하는 상이한 조건 하에서 포스페이트 제형(벡터 + 비히클)에 대해 시험하였다(도 9 및 도 10a 및 도 10b).
도 10a 및 도 10b는 37℃에서 1주에 걸친 포스페이트 완충액에 대한 NanoSight 크기 데이터를 나타낸다. 인큐베이션 시간에 걸쳐 고분자량 종의 약간의 증가뿐만 아니라 총 입자의 전반적 저하가 존재한다. 데이터는 RT 또는 37℃에서 안정성 경과에 걸쳐 도 9에 나타낸 기능 역가의 손실이 도 10a 및 도 10b에서 관찰된 입자의 물리적 손실에 상응할 수 있음을 제시한다.
임상 투여 동안 전형적인 주입 시나리오 과정에 걸친 포스페이트 제형의 안정성을 평가하기 위해 모의 사용-중 연구를 수행하였다. LVV 물질을 포스페이트 비히클로 희석하고 빈 IV 백 내로 주사하였다. 데이터를 실온에서 6시간에 걸쳐 수집하였다(도 13). 안정성 연구는 기능적 역가 또는 p24에 의한 손실 징후를 나타내지 않고, 이는 벡터가 연구 기간에 걸쳐 안정하였음을 시사한다.
전향적 용기 폐쇄 시스템과의 상용성을 시험하기 위해, Schott 유형 1 유리 바이알뿐만 아니라 West CZ COP 바이알에서 벡터 및 포스페이트 비히클의 안정성을 조사하기 위한 연구를 수행하였다(도 14, 도 15, 및 도 16a 내지 도 16c). 데이터는 유형 1 또는 CZ 바이알에서 비히클 단독으로 처리된 경우 유의미한 입자가 생성되지 않았음을 시사한다(도 14). 냉동 및 해동 동안 바이알 상에서 변형을 평가하기 위해, 변형 거즈를 유리 바이알에 접착시키고 2시간의 기간 동안 -80℃ 냉동고에 배치한 후 37℃ 수조에서 신속 가온하였다(도 15). 연구는 바이알 상에서 인식 가능한 양의 변형을 시사하지 않으며, 이는 소정 바이알을 손상시키는 것으로 문헌에 나타난, 5 mL의 상대적으로 높은 충전 부피에서, 포스페이트 제형이 용기 상에 높은 스트레스를 부여하지 않음을 제시할 것이다. LVV 물질을 또한 도 16a 내지 도 16c에 나타낸, 각각의 용기와의 상용성에 대해 시험하였다. 각각의 시험(형질도입 역가(도 16a), p24(도 16b), 및 입자 농도(도 16c))을 통해, 벡터의 상용성 안정성 및 온전성이 존재하고, 이는 용기 폐쇄 포맷인 유리 및 플라스틱 바이알 둘 모두와의 상용성을 시사하였다.
포스페이트 및 히스티딘 제형 비교
벡터 안정성을 상이한 스트레스 조건 하에서 포스페이트(제형 1 및 제형 2) 및 히스티딘(제형 3) 제형(벡터 + 비히클)에 대해 시험하였다(도 11a 및 도 11b, 도 12a 및 도 12b). 냉동-해동 사이클링 연구에서 두 포스페이트 제형 모두 사이클링의 함수로서 기능적 역가가 감소한다는 것이 관찰되었다. 대조적으로, 히스티딘 제형은 기능적 손실을 나타내지 않았고 안정하게 유지되었다. 실온 유지뿐만 아니라 아지테이션 스트레스 조건 동안, 포스페이트 제형은 고수준의 기능적 손실을 (정량 하한까지) 나타내었다. 놀랍게도, 히스티딘 제형은 3일 동안 실온에서의 인큐베이션 또는 3일 동안 아지테이션에 의해 영향을 받지 않고 유지되었다. 부가적으로, 포스페이트 제형(제형 1 및 제형 2 비교)에 있어서 더 많은 염화나트륨의 첨가 및 수크로스의 감소는 벡터 안정성에 영향을 미치지 않았다.
별도의 물질 조제물에서, 안정성 연구의 재시험을 도 11a 및 도 11b에서 실증하고 반복하여 도 17에서 보고하였다. 기능적 역가의 손실은 포스페이트 제형에 있어서만큼 극적이지는 않았으나, 히스티딘 및 포스페이트 제형 간 경향은 일관된다.
9개월의 과정에 걸쳐, 포스페이트 제형 1 및 히스티딘 제형 3 완충액 둘 모두의 냉동(-80℃), 안정성 연구는 안정한 LVV DP를 가능하게 하는 것으로 보였다(도 18). 기능적 역가에 기반하여, 데이터는 검정의 가변성 내에서, -80℃에서의 보관에 걸쳐 임의의 물질 손실이 존재하지 않았음을 제시한다.
마지막으로, 완충액 단독(포스페이트 및 히스티딘)의 효과를 평가하기 위해, 2개 제형을 동일하게, 동일한 pH, 7.0에서 제조하였다. 즉, 제형 4와 제형 5 간의 유일한 차이는 완충액 구성요소(포스페이트 또는 히스티딘)였다. 제조 공정의 맥락에서, 두 제형 모두는 모두 초여과 및 투석여과(TFF)뿐만 아니라 말단 살균 여과에 걸쳐 유사하게 거동하는 것으로 보인다(표 6).
[표 6]
접선류 여과를 사용하는 제형 4(포스페이트) 및 제형 5(히스티딘)의 조제물. 샘플을 6배 부피의 각각의 제형에 대해 투석여과한 후, 몇 배 부피로 초여과(농축)하였다.
Figure pct00016
각 제형의 제조 시, 완충액 구성요소를 비교하기 위해 안정성 연구를 수행하였다. 도 19a 내지 도 19d는 두 제형의 LVV 안정성 간의 사소한 차이만 존재하였다는 발견(기능적 및 표준화된 기능적 역가, p24 및 입자 농도에 걸친 안정성 조건의 함수로 나타냄)을 요약한다. 이는 도 11a 및 도 11b, 도 12a 및 도 12b, 및 도 13에 제시된 결과가 완충액 조성(포스페이트 또는 히스티딘)이 아닌 pH(7.3 및 6.5)의 차이에 기인한 안정성의 가변 수준을 반영하는 것으로 보임을 제시하는 것으로 보인다.
SEQUENCE LISTING <110> BIOVERATIV THERAPEUTICS INC. <120> LENTIVIRAL VECTOR FORMULATIONS <130> 709718: SA9-472PC <150> US 62/908,390 <151> 2019-09-30 <160> 63 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4371 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide sequence <400> 1 atgcagattg agctgtccac ttgtttcttc ctgtgcctcc tgcgcttctg tttctccgcc 60 actcgccggt actaccttgg agccgtggag ctttcatggg actacatgca gagcgacctg 120 ggcgaactcc ccgtggatgc cagattcccc ccccgcgtgc caaagtcctt cccctttaac 180 acctccgtgg tgtacaagaa aaccctcttt gtcgagttca ctgaccacct gttcaacatc 240 gccaagccgc gcccaccttg gatgggcctc ctgggaccga ccattcaagc tgaagtgtac 300 gacaccgtgg tgatcaccct gaagaacatg gcgtcccacc ccgtgtccct gcatgcggtc 360 ggagtgtcct actggaaggc ctccgaagga gctgagtacg acgaccagac tagccagcgg 420 gaaaaggagg acgataaagt gttcccgggc ggctcgcata cttacgtgtg gcaagtcctg 480 aaggaaaacg gacctatggc atccgatcct ctgtgcctga cttactccta cctttcccat 540 gtggacctcg tgaaggacct gaacagcggg ctgattggtg cacttctcgt gtgccgcgaa 600 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Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ala Ser Pro 1 5 10 15 Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser 20 25 30 Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro 35 40 45 Gly Ser Ser Pro Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Thr Pro Gly 50 55 60 Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser 65 70 75 80 Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro 85 90 95 Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Thr 100 105 110 Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala 115 120 125 Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro 130 135 140 <210> 51 <211> 144 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic amino acid sequence <400> 51 Gly Ser Ser Pro Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Ser Ser Pro 1 5 10 15 Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser 20 25 30 Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro 35 40 45 Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala 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aagggtcacc agcgggctcg 420 cccaccagca ctgaagaagg tgcctcgagc 450 <210> 53 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic amino acid sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is Asp, Asn, Ser, Thr, or Trp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is Asn, Gln, His, Ile, Leu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is Ala, Asp, Phe, Trp, or Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is Asp, Gly, Leu, Phe, Ser, or Thr <400> 53 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 54 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic amino acid sequence <400> 54 Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp 1 5 10 <210> 55 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic amino acid sequence <400> 55 Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro 1 5 10 15 Ser Ala Pro Ala 20 <210> 56 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic amino acid sequence <400> 56 Ala Ala Pro Ala Ser Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ser Ala Pro Ala Pro 1 5 10 15 Ala Ala Pro Ser 20 <210> 57 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic amino acid sequence <400> 57 Ala Pro Ser Ser Pro Ser Pro Ser Ala Pro Ser Ser Pro Ser Pro Ala 1 5 10 15 Ser Pro Ser Ser 20 <210> 58 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic amino acid sequence <400> 58 Ala Pro Ser Ser Pro Ser Pro Ser Ala Pro Ser Ser Pro Ser Pro Ala 1 5 10 15 Ser Pro Ser <210> 59 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic amino acid sequence <400> 59 Ser Ser Pro Ser Ala Pro Ser Pro Ser Ser Pro Ala Ser Pro Ser Pro 1 5 10 15 Ser Ser Pro Ala 20 <210> 60 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic amino acid sequence <400> 60 Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ser Ala Pro Pro Ala Ala Ala Ser Pro 1 5 10 15 Ala Ala Pro Ser Ala Pro Pro Ala 20 <210> 61 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic amino acid sequence <400> 61 Ala Ser Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ser Ala Pro 1 5 10 15 Ser Ala Ala Ala 20 <210> 62 <211> 2813 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic amino acid sequence <400> 62 Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile 1 5 10 15 Leu Pro Gly Thr Leu Cys Ala Glu Gly Thr Arg Gly Arg Ser Ser Thr 20 25 30 Ala Arg Cys Ser Leu Phe Gly Ser Asp Phe Val Asn Thr Phe Asp Gly 35 40 45 Ser Met Tyr Ser Phe Ala Gly Tyr Cys Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Gly 50 55 60 Cys Gln Lys Arg Ser Phe Ser Ile Ile Gly Asp Phe Gln Asn Gly Lys 65 70 75 80 Arg Val Ser Leu Ser Val Tyr Leu Gly Glu Phe Phe Asp Ile His Leu 85 90 95 Phe Val Asn Gly Thr Val Thr Gln Gly Asp Gln Arg Val Ser Met Pro 100 105 110 Tyr Ala Ser Lys Gly Leu Tyr Leu Glu Thr Glu Ala Gly Tyr Tyr Lys 115 120 125 Leu Ser Gly Glu Ala Tyr Gly Phe Val Ala Arg Ile Asp Gly Ser Gly 130 135 140 Asn Phe Gln Val Leu Leu Ser Asp Arg Tyr Phe Asn Lys Thr Cys Gly 145 150 155 160 Leu Cys Gly Asn Phe Asn Ile Phe Ala Glu Asp Asp Phe Met Thr Gln 165 170 175 Glu Gly Thr Leu Thr Ser Asp Pro Tyr Asp Phe Ala Asn Ser Trp Ala 180 185 190 Leu Ser Ser Gly Glu Gln Trp Cys Glu Arg Ala Ser Pro Pro Ser Ser 195 200 205 Ser Cys Asn Ile Ser Ser Gly Glu Met Gln Lys Gly Leu Trp Glu Gln 210 215 220 Cys Gln Leu Leu Lys Ser Thr Ser Val Phe Ala Arg Cys His Pro Leu 225 230 235 240 Val Asp Pro Glu Pro Phe Val Ala Leu Cys Glu Lys Thr Leu Cys Glu 245 250 255 Cys Ala Gly Gly Leu Glu Cys Ala Cys Pro Ala Leu Leu Glu Tyr Ala 260 265 270 Arg Thr Cys Ala Gln Glu Gly Met Val Leu Tyr Gly Trp Thr Asp His 275 280 285 Ser Ala Cys Ser Pro Val Cys Pro Ala Gly Met Glu Tyr Arg Gln Cys 290 295 300 Val Ser Pro Cys Ala Arg Thr Cys Gln Ser Leu His Ile Asn Glu Met 305 310 315 320 Cys Gln Glu Arg Cys Val Asp Gly Cys Ser Cys Pro Glu Gly Gln Leu 325 330 335 Leu Asp Glu Gly Leu Cys Val Glu Ser Thr Glu Cys Pro Cys Val His 340 345 350 Ser Gly Lys Arg Tyr Pro Pro Gly Thr Ser Leu Ser Arg Asp Cys Asn 355 360 365 Thr Cys Ile Cys Arg Asn Ser Gln Trp Ile Cys Ser Asn Glu Glu Cys 370 375 380 Pro Gly Glu Cys Leu Val Thr Gly Gln Ser His Phe Lys Ser Phe Asp 385 390 395 400 Asn Arg Tyr Phe Thr Phe Ser Gly Ile Cys Gln Tyr Leu Leu Ala Arg 405 410 415 Asp Cys Gln Asp His Ser Phe Ser Ile Val Ile Glu Thr Val Gln Cys 420 425 430 Ala Asp Asp Arg Asp Ala Val Cys Thr Arg Ser Val Thr Val Arg Leu 435 440 445 Pro Gly Leu His Asn Ser Leu Val Lys Leu Lys His Gly Ala Gly Val 450 455 460 Ala Met Asp Gly Gln Asp Val Gln Leu Pro Leu Leu Lys Gly Asp Leu 465 470 475 480 Arg Ile Gln His Thr Val Thr Ala Ser Val Arg Leu Ser Tyr Gly Glu 485 490 495 Asp Leu Gln Met Asp Trp Asp Gly Arg Gly Arg Leu Leu Val Lys Leu 500 505 510 Ser Pro Val Tyr Ala Gly Lys Thr Cys Gly Leu Cys Gly Asn Tyr Asn 515 520 525 Gly Asn Gln Gly Asp Asp Phe Leu Thr Pro Ser Gly Leu Ala Glu Pro 530 535 540 Arg Val Glu Asp Phe Gly Asn Ala Trp Lys Leu His Gly Asp Cys Gln 545 550 555 560 Asp Leu Gln Lys Gln His Ser Asp Pro Cys Ala Leu Asn Pro Arg Met 565 570 575 Thr Arg Phe Ser Glu Glu Ala Cys Ala Val Leu Thr Ser Pro Thr Phe 580 585 590 Glu Ala Cys His Arg Ala Val Ser Pro Leu Pro Tyr Leu Arg Asn Cys 595 600 605 Arg Tyr Asp Val Cys Ser Cys Ser Asp Gly Arg Glu Cys Leu Cys Gly 610 615 620 Ala Leu Ala Ser Tyr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Arg Gly Val Arg Val 625 630 635 640 Ala Trp Arg Glu Pro Gly Arg Cys Glu Leu Asn Cys Pro Lys Gly Gln 645 650 655 Val Tyr Leu Gln Cys Gly Thr Pro Cys Asn Leu Thr Cys Arg Ser Leu 660 665 670 Ser Tyr Pro Asp Glu Glu Cys Asn Glu Ala Cys Leu Glu Gly Cys Phe 675 680 685 Cys Pro Pro Gly Leu Tyr Met Asp Glu Arg Gly Asp Cys Val Pro Lys 690 695 700 Ala Gln Cys Pro Cys Tyr Tyr Asp Gly Glu Ile Phe Gln Pro Glu Asp 705 710 715 720 Ile Phe Ser Asp His His Thr Met Cys Tyr Cys Glu Asp Gly Phe Met 725 730 735 His Cys Thr Met Ser Gly Val Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asp Ala Val 740 745 750 Leu Ser Ser Pro Leu Ser His Arg Ser Lys Arg Ser Leu Ser Cys Arg 755 760 765 Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp Asn Leu Arg Ala Glu 770 775 780 Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr Asp Leu Glu Cys Met 785 790 795 800 Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro Pro Gly Met Val Arg 805 810 815 His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys Pro Cys Phe His Gln 820 825 830 Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Gly Cys Asn Thr 835 840 845 Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr Asp His Val Cys Asp 850 855 860 Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly 865 870 875 880 Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp 885 890 895 Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys 900 905 910 Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu 915 920 925 Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn Val Lys 930 935 940 Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val Val Glu Ser Gly Arg 945 950 955 960 Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg 965 970 975 His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys Val 980 985 990 Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp Leu Thr 995 1000 1005 Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn 1010 1015 1020 Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro 1025 1030 1035 Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met Lys Gln 1040 1045 1050 Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val Phe 1055 1060 1065 Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val 1070 1075 1080 Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala 1085 1090 1095 Cys Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln 1100 1105 1110 His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln 1115 1120 1125 Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu 1130 1135 1140 Trp Arg Tyr Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln 1145 1150 1155 His Pro Glu Pro Leu Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys 1160 1165 1170 His Ala His Cys Pro Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln 1175 1180 1185 Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly 1190 1195 1200 Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp 1205 1210 1215 Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys Asp Val Val Asn Leu Thr 1220 1225 1230 Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Gly Gly Leu Val Val Pro Pro Thr 1235 1240 1245 Asp Ala Pro Val Ser Pro Thr Thr Leu Tyr Val Glu Asp Ile Ser 1250 1255 1260 Glu Pro Pro Leu His Asp Phe Tyr Cys Ser Arg Leu Leu Asp Leu 1265 1270 1275 Val Phe Leu Leu Asp Gly Ser Ser Arg Leu Ser Glu Ala Glu Phe 1280 1285 1290 Glu Val Leu Lys Ala Phe Val Val Asp Met Met Glu Arg Leu Arg 1295 1300 1305 Ile Ser Gln Lys Trp Val Arg Val Ala Val Val Glu Tyr His Asp 1310 1315 1320 Gly Ser His Ala Tyr Ile Gly Leu Lys Asp Arg Lys Arg Pro Ser 1325 1330 1335 Glu Leu Arg Arg Ile Ala Ser Gln Val Lys Tyr Ala Gly Ser Gln 1340 1345 1350 Val Ala Ser Thr Ser Glu Val Leu Lys Tyr Thr Leu Phe Gln Ile 1355 1360 1365 Phe Ser Lys Ile Asp Arg Pro Glu Ala Ser Arg Ile Thr Leu Leu 1370 1375 1380 Leu Met Ala Ser Gln Glu Pro Gln Arg Met Ser Arg Asn Phe Val 1385 1390 1395 Arg Tyr Val Gln Gly Leu Lys Lys Lys Lys Val Ile Val Ile Pro 1400 1405 1410 Val Gly Ile Gly Pro His Ala Asn Leu Lys Gln Ile Arg Leu Ile 1415 1420 1425 Glu Lys Gln Ala Pro Glu Asn Lys Ala Phe Val Leu Ser Ser Val 1430 1435 1440 Asp Glu Leu Glu Gln Gln Arg Asp Glu Ile Val Ser Tyr Leu Cys 1445 1450 1455 Asp Leu Ala Pro Glu Ala Pro Pro Pro Thr Leu Pro Pro Asp Met 1460 1465 1470 Ala Gln Val Thr Val Gly Pro Gly Leu Leu Gly Val Ser Thr Leu 1475 1480 1485 Gly Pro Lys Arg Asn Ser Met Val Leu Asp Val Ala Phe Val Leu 1490 1495 1500 Glu Gly Ser Asp Lys Ile Gly Glu Ala Asp Phe Asn Arg Ser Lys 1505 1510 1515 Glu Phe Met Glu Glu Val Ile Gln Arg Met Asp Val Gly Gln Asp 1520 1525 1530 Ser Ile His Val Thr Val Leu Gln Tyr Ser Tyr Met Val Thr Val 1535 1540 1545 Glu Tyr Pro Phe Ser Glu Ala Gln Ser Lys Gly Asp Ile Leu Gln 1550 1555 1560 Arg Val Arg Glu Ile Arg Tyr Gln Gly Gly Asn Arg Thr Asn Thr 1565 1570 1575 Gly Leu Ala Leu Arg Tyr Leu Ser Asp His Ser Phe Leu Val Ser 1580 1585 1590 Gln Gly Asp Arg Glu Gln Ala Pro Asn Leu Val Tyr Met Val Thr 1595 1600 1605 Gly Asn Pro Ala Ser Asp Glu Ile Lys Arg Leu Pro Gly Asp Ile 1610 1615 1620 Gln Val Val Pro Ile Gly Val Gly Pro Asn Ala Asn Val Gln Glu 1625 1630 1635 Leu Glu Arg Ile Gly Trp Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ile Gln Asp 1640 1645 1650 Phe Glu Thr Leu Pro Arg Glu Ala Pro Asp Leu Val Leu Gln Arg 1655 1660 1665 Cys Cys Ser Gly Glu Gly Leu Gln Ile Pro Thr Leu Ser Pro Ala 1670 1675 1680 Pro Asp Cys Ser Gln Pro Leu Asp Val Ile Leu Leu Leu Asp Gly 1685 1690 1695 Ser Ser Ser Phe Pro Ala Ser Tyr Phe Asp Glu Met Lys Ser Phe 1700 1705 1710 Ala Lys Ala Phe Ile Ser Lys Ala Asn Ile Gly Pro Arg Leu Thr 1715 1720 1725 Gln Val Ser Val Leu Gln Tyr Gly Ser Ile Thr Thr Ile Asp Val 1730 1735 1740 Pro Trp Asn Val Val Pro Glu Lys Ala His Leu Leu Ser Leu Val 1745 1750 1755 Asp Val Met Gln Arg Glu Gly Gly Pro Ser Gln Ile Gly Asp Ala 1760 1765 1770 Leu Gly Phe Ala Val Arg Tyr Leu Thr Ser Glu Met His Gly Ala 1775 1780 1785 Arg Pro Gly Ala Ser Lys Ala Val Val Ile Leu Val Thr Asp Val 1790 1795 1800 Ser Val Asp Ser Val Asp Ala Ala Ala Asp Ala Ala Arg Ser Asn 1805 1810 1815 Arg Val Thr Val Phe Pro Ile Gly Ile Gly Asp Arg Tyr Asp Ala 1820 1825 1830 Ala Gln Leu Arg Ile Leu Ala Gly Pro Ala Gly Asp Ser Asn Val 1835 1840 1845 Val Lys Leu Gln Arg Ile Glu Asp Leu Pro Thr Met Val Thr Leu 1850 1855 1860 Gly Asn Ser Phe Leu His Lys Leu Cys Ser Gly Phe Val Arg Ile 1865 1870 1875 Cys Met Asp Glu Asp Gly Asn Glu Lys Arg Pro Gly Asp Val Trp 1880 1885 1890 Thr Leu Pro Asp Gln Cys His Thr Val Thr Cys Gln Pro Asp Gly 1895 1900 1905 Gln Thr Leu Leu Lys Ser His Arg Val Asn Cys Asp Arg Gly Leu 1910 1915 1920 Arg Pro Ser Cys Pro Asn Ser Gln Ser Pro Val Lys Val Glu Glu 1925 1930 1935 Thr Cys Gly Cys Arg Trp Thr Cys Pro Cys Val Cys Thr Gly Ser 1940 1945 1950 Ser Thr Arg His Ile Val Thr Phe Asp Gly Gln Asn Phe Lys Leu 1955 1960 1965 Thr Gly Ser Cys Ser Tyr Val Leu Phe Gln Asn Lys Glu Gln Asp 1970 1975 1980 Leu Glu Val Ile Leu His Asn Gly Ala Cys Ser Pro Gly Ala Arg 1985 1990 1995 Gln Gly Cys Met Lys Ser Ile Glu Val Lys His Ser Ala Leu Ser 2000 2005 2010 Val Glu Leu His Ser Asp Met Glu Val Thr Val Asn Gly Arg Leu 2015 2020 2025 Val Ser Val Pro Tyr Val Gly Gly Asn Met Glu Val Asn Val Tyr 2030 2035 2040 Gly Ala Ile Met His Glu Val Arg Phe Asn His Leu Gly His Ile 2045 2050 2055 Phe Thr Phe Thr Pro Gln Asn Asn Glu Phe Gln Leu Gln Leu Ser 2060 2065 2070 Pro Lys Thr Phe Ala Ser Lys Thr Tyr Gly Leu Cys Gly Ile Cys 2075 2080 2085 Asp Glu Asn Gly Ala Asn Asp Phe Met Leu Arg Asp Gly Thr Val 2090 2095 2100 Thr Thr Asp Trp Lys Thr Leu Val Gln Glu Trp Thr Val Gln Arg 2105 2110 2115 Pro Gly Gln Thr Cys Gln Pro Ile Leu Glu Glu Gln Cys Leu Val 2120 2125 2130 Pro Asp Ser Ser His Cys Gln Val Leu Leu Leu Pro Leu Phe Ala 2135 2140 2145 Glu Cys His Lys Val Leu Ala Pro Ala Thr Phe Tyr Ala Ile Cys 2150 2155 2160 Gln Gln Asp Ser Cys His Gln Glu Gln Val Cys Glu Val Ile Ala 2165 2170 2175 Ser Tyr Ala His Leu Cys Arg Thr Asn Gly Val Cys Val Asp Trp 2180 2185 2190 Arg Thr Pro Asp Phe Cys Ala Met Ser Cys Pro Pro Ser Leu Val 2195 2200 2205 Tyr Asn His Cys Glu His Gly Cys Pro Arg His Cys Asp Gly Asn 2210 2215 2220 Val Ser Ser Cys Gly Asp His Pro Ser Glu Gly Cys Phe Cys Pro 2225 2230 2235 Pro Asp Lys Val Met Leu Glu Gly Ser Cys Val Pro Glu Glu Ala 2240 2245 2250 Cys Thr Gln Cys Ile Gly Glu Asp Gly Val Gln His Gln Phe Leu 2255 2260 2265 Glu Ala Trp Val Pro Asp His Gln Pro Cys Gln Ile Cys Thr Cys 2270 2275 2280 Leu Ser Gly Arg Lys Val Asn Cys Thr Thr Gln Pro Cys Pro Thr 2285 2290 2295 Ala Lys Ala Pro Thr Cys Gly Leu Cys Glu Val Ala Arg Leu Arg 2300 2305 2310 Gln Asn Ala Asp Gln Cys Cys Pro Glu Tyr Glu Cys Val Cys Asp 2315 2320 2325 Pro Val Ser Cys Asp Leu Pro Pro Val Pro His Cys Glu Arg Gly 2330 2335 2340 Leu Gln Pro Thr Leu Thr Asn Pro Gly Glu Cys Arg Pro Asn Phe 2345 2350 2355 Thr Cys Ala Cys Arg Lys Glu Glu Cys Lys Arg Val Ser Pro Pro 2360 2365 2370 Ser Cys Pro Pro His Arg Leu Pro Thr Leu Arg Lys Thr Gln Cys 2375 2380 2385 Cys Asp Glu Tyr Glu Cys Ala Cys Asn Cys Val Asn Ser Thr Val 2390 2395 2400 Ser Cys Pro Leu Gly Tyr Leu Ala Ser Thr Ala Thr Asn Asp Cys 2405 2410 2415 Gly Cys Thr Thr Thr Thr Cys Leu Pro Asp Lys Val Cys Val His 2420 2425 2430 Arg Ser Thr Ile Tyr Pro Val Gly Gln Phe Trp Glu Glu Gly Cys 2435 2440 2445 Asp Val Cys Thr Cys Thr Asp Met Glu Asp Ala Val Met Gly Leu 2450 2455 2460 Arg Val Ala Gln Cys Ser Gln Lys Pro Cys Glu Asp Ser Cys Arg 2465 2470 2475 Ser Gly Phe Thr Tyr Val Leu His Glu Gly Glu Cys Cys Gly Arg 2480 2485 2490 Cys Leu Pro Ser Ala Cys Glu Val Val Thr Gly Ser Pro Arg Gly 2495 2500 2505 Asp Ser Gln Ser Ser Trp Lys Ser Val Gly Ser Gln Trp Ala Ser 2510 2515 2520 Pro Glu Asn Pro Cys Leu Ile Asn Glu Cys Val Arg Val Lys Glu 2525 2530 2535 Glu Val Phe Ile Gln Gln Arg Asn Val Ser Cys Pro Gln Leu Glu 2540 2545 2550 Val Pro Val Cys Pro Ser Gly Phe Gln Leu Ser Cys Lys Thr Ser 2555 2560 2565 Ala Cys Cys Pro Ser Cys Arg Cys Glu Arg Met Glu Ala Cys Met 2570 2575 2580 Leu Asn Gly Thr Val Ile Gly Pro Gly Lys Thr Val Met Ile Asp 2585 2590 2595 Val Cys Thr Thr Cys Arg Cys Met Val Gln Val Gly Val Ile Ser 2600 2605 2610 Gly Phe Lys Leu Glu Cys Arg Lys Thr Thr Cys Asn Pro Cys Pro 2615 2620 2625 Leu Gly Tyr Lys Glu Glu Asn Asn Thr Gly Glu Cys Cys Gly Arg 2630 2635 2640 Cys Leu Pro Thr Ala Cys Thr Ile Gln Leu Arg Gly Gly Gln Ile 2645 2650 2655 Met Thr Leu Lys Arg Asp Glu Thr Leu Gln Asp Gly Cys Asp Thr 2660 2665 2670 His Phe Cys Lys Val Asn Glu Arg Gly Glu Tyr Phe Trp Glu Lys 2675 2680 2685 Arg Val Thr Gly Cys Pro Pro Phe Asp Glu His Lys Cys Leu Ala 2690 2695 2700 Glu Gly Gly Lys Ile Met Lys Ile Pro Gly Thr Cys Cys Asp Thr 2705 2710 2715 Cys Glu Glu Pro Glu Cys Asn Asp Ile Thr Ala Arg Leu Gln Tyr 2720 2725 2730 Val Lys Val Gly Ser Cys Lys Ser Glu Val Glu Val Asp Ile His 2735 2740 2745 Tyr Cys Gln Gly Lys Cys Ala Ser Lys Ala Met Tyr Ser Ile Asp 2750 2755 2760 Ile Asn Asp Val Gln Asp Gln Cys Ser Cys Cys Ser Pro Thr Arg 2765 2770 2775 Thr Glu Pro Met Gln Val Ala Leu His Cys Thr Asn Gly Ser Val 2780 2785 2790 Val Tyr His Glu Val Leu Asn Ala Met Glu Cys Lys Cys Ser Pro 2795 2800 2805 Arg Lys Cys Ser Lys 2810 <210> 63 <211> 577 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide sequence <400> 63 ctcgaggtca attcacgcga gttaataatt accagcgcgg gccaaataaa taatccgcga 60 ggggcaggtg acgtttgccc agcgcgcgct ggtaattatt aacctcgcga atattgattc 120 gaggccgcga ttgccgcaat cgcgaggggc aggtgacctt tgcccagcgc gcgttcgccc 180 cgccccggac ggtatcgata agcttaggag cttgggctgc aggtcgaggg cactgggagg 240 atgttgagta agatggaaaa ctactgatga cccttgcaga gacagagtat taggacatgt 300 ttgaacaggg gccgggcgat cagcaggtag ctctagagga tccccgtctg tctgcacatt 360 tcgtagagcg agtgttccga tactctaatc tccctaggca aggttcatat ttgtgtaggt 420 tacttattct ccttttgttg actaagtcaa taatcagaat cagcaggttt ggagtcagct 480 tggcagggat cagcagcctg ggttggaagg agggggtata aaagcccctt caccaggaga 540 agccgtcaca cagatccaca agctcctgcc accatgg 577

Claims (48)

  1. 재조합 렌티바이러스 벡터 조제물로서,
    (a) 치료 유효 용량의 재조합 렌티바이러스 벡터;
    (b) TRIS-비함유 완충 시스템;
    (c) 염;
    (d) 계면활성제; 및
    (e) 탄수화물을 포함하며,
    약학 조성물이 인간 환자에 대한 전신 투여에 적합한, 조제물.
  2. 제1항에 있어서, 완충 시스템 또는 조제물의 pH가 약 6.0 내지 약 8.0인, 조제물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 완충 시스템 또는 조제물의 pH가 약 6.0 내지 약 7.5인, 조제물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 완충 시스템 또는 조제물의 pH가 약 6.0 내지 약 7.0인, 조제물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 완충 시스템 또는 조제물의 pH가 약 6.5인, 조제물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 완충 시스템 또는 조제물의 pH가 약 7.0 내지 약 8.0인, 조제물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 완충 시스템 또는 조제물의 pH가 약 7.3인, 조제물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 렌티바이러스 벡터가 VSV-G를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편을 포함하는, 조제물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 완충 시스템이 포스페이트 완충액 또는 히스티딘 완충액을 포함하는, 조제물.
  10. 제9항에 있어서, 포스페이트 완충액의 농도가 약 5 mM 내지 약 30 mM인, 조제물.
  11. 제10항에 있어서, 포스페이트 완충액의 농도가 약 10 mM 내지 약 20 mM, 약 10 mM 내지 약 15 mM, 약 20 mM 내지 약 30 mM, 약 20 mM 내지 약 25 mM, 또는 약 15 mM 내지 약 20 mM인, 조제물.
  12. 제9항에 있어서, 히스티딘 완충액의 농도가 약 5 mM 내지 약 30 mM인, 조제물.
  13. 제12항에 있어서, 히스티딘 완충액의 농도가 약 10 mM 내지 약 20 mM, 약 10 mM 내지 약 15 mM, 약 20 mM 내지 약 30 mM, 약 20 mM 내지 약 25 mM, 또는 약 15 mM 내지 약 20 mM인, 조제물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 염의 농도가 약 80 mM 내지 약 150 mM인, 조제물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 염의 농도가 약 100 mM, 약 110 mM, 약 130 mM, 또는 약 150 mM인, 조제물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 염이 클로라이드 염인, 조제물.
  17. 제16항에 있어서, 클로라이드 염이 NaCl인, 조제물.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 계면활성제가 폴록사머인, 조제물.
  19. 제18항에 있어서, 폴록사머가 폴록사머 101(P101), 폴록사머 105(P105), 폴록사머 108(P108), 폴록사머 122(P122), 폴록사머 123(P123), 폴록사머 124(P124), 폴록사머 181(P181), 폴록사머 182(P182), 폴록사머 183(P183), 폴록사머 184(P184), 폴록사머 185(P185), 폴록사머 188(P188), 폴록사머 212(P212), 폴록사머 215(P215), 폴록사머 217(P217), 폴록사머 231(P231), 폴록사머 234(P234), 폴록사머 235(P235), 폴록사머 237(P237), 폴록사머 238(P238), 폴록사머 282(P282), 폴록사머 284(P284), 폴록사머 288(P288), 폴록사머 331(P331), 폴록사머 333(P333), 폴록사머 334(P334), 폴록사머 335(P335), 폴록사머 338(P338), 폴록사머 401(P401), 폴록사머 402(P402), 폴록사머 403(P403), 폴록사머 407(P407), 및 이의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 조제물.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 폴록사머가 폴록사머 188(P188)인, 조제물.
  21. 제18항 또는 제19항에 있어서, 폴록사머가 폴록사머 407(P407)인, 조제물.
  22. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 계면활성제가 폴리소르베이트인, 조제물.
  23. 제22항에 있어서, 폴리소르베이트가 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60, 폴리소르베이트 80, 및 이의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 조제물.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 계면활성제의 농도가 약 0.01%(w/v) 내지 약 0.1%(w/v)인, 조제물.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 계면활성제의 농도가 약 0.03%(w/v), 약 0.05%(w/v), 약 0.07%(w/v), 또는 약 0.09%(w/v)인, 조제물.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 탄수화물의 농도가 약 0.5%(w/v) 내지 약 5%(w/v)인, 조제물.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 탄수화물의 농도가 약 1%(w/v), 약 2%(w/v), 약 3%(w/v), 또는 약 4%(w/v)인, 조제물.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 탄수화물이 수크로스인, 조제물.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 치료 유효 용량의 재조합 렌티바이러스 벡터;
    (b) 약 10 mM 포스페이트;
    (c) 약 100 mM 염화나트륨;
    (d) 약 0.05%(w/v) 폴록사머 188; 및
    (e) 약 3%(w/v) 수크로스
    를 포함하며, 조제물의 pH가 약 7.3이고, 약학 조성물이 인간 환자에 대한 전신 투여에 적합한, 조제물.
  30. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 치료 유효 용량의 재조합 렌티바이러스 벡터;
    (b) 약 10 mM 포스페이트;
    (c) 약 130 mM 염화나트륨;
    (d) 약 0.05%(w/v) 폴록사머 188; 및
    (e) 약 1%(w/v) 수크로스
    를 포함하며, 조제물의 pH가 약 7.3이고, 약학 조성물이 인간 환자에 대한 전신 투여에 적합한, 조제물.
  31. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 치료 유효 용량의 재조합 렌티바이러스 벡터;
    (b) 약 20 mM 히스티딘;
    (c) 약 100 mM 염화나트륨;
    (d) 약 0.05%(w/v) 폴록사머 188; 및
    (e) 약 3%(w/v) 수크로스
    를 포함하며, 조제물의 pH가 약 6.5이고, 약학 조성물이 인간 환자에 대한 전신 투여에 적합한, 조제물.
  32. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 치료 유효 용량의 재조합 렌티바이러스 벡터;
    (b) 약 10 mM 포스페이트;
    (c) 약 100 mM 염화나트륨;
    (d) 약 0.05%(w/v) 폴록사머 188; 및
    (e) 약 3%(w/v) 수크로스
    를 포함하며, 조제물의 pH가 약 7.0이고, 약학 조성물이 인간 환자에 대한 전신 투여에 적합한, 조제물.
  33. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 치료 유효 용량의 재조합 렌티바이러스 벡터;
    (b) 약 20 mM 히스티딘;
    (c) 약 100 mM 염화나트륨;
    (d) 약 0.05%(w/v) 폴록사머 188; 및
    (e) 약 3%(w/v) 수크로스
    를 포함하며, 조제물의 pH가 약 7.0이고, 약학 조성물이 인간 환자에 대한 전신 투여에 적합한, 조제물.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 렌티바이러스 벡터가 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 나타낸 인자 VIII(FVIII) 코딩 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는, 조제물.
  35. 제34항에 있어서, 재조합 렌티바이러스 벡터가 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 나타낸 인자 VIII(FVIII) 코딩 서열을 포함하는 핵산을 포함하는, 조제물.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 재조합 렌티바이러스 벡터가 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 나타낸 인자 VIII(FVIII) 코딩 서열로 구성되는 핵산을 포함하는, 조제물.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 렌티바이러스 벡터가 SEQ ID NO: 3에 나타낸 인자 IX(FIX) 코딩 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는, 조제물.
  38. 제37항에 있어서, 재조합 렌티바이러스 벡터가 SEQ ID NO: 3에 나타낸 인자 IX(FIX) 코딩 서열을 포함하는 핵산을 포함하는, 조제물.
  39. 제37항 또는 제38항에 있어서, 재조합 렌티바이러스 벡터가 SEQ ID NO: 3에 나타낸 인자 IX(FIX) 코딩 서열로 구성되는 핵산을 포함하는, 조제물.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 렌티바이러스 벡터가 강화된 트랜스티레틴(ET) 프로모터를 포함하는, 조제물.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 렌티바이러스 벡터가 SEQ ID NO: 7에 나타낸 miR-142에 대한 표적 서열과 적어도 90% 동일한 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는, 조제물.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 렌티바이러스 벡터가 CHO 세포, HEK293 세포, BHK21 세포, PER.C6 세포, NSO 세포, 및 CAP 세포의 군으로부터 선택되는 전달감염된 숙주 세포로부터 단리되는, 조제물.
  43. 제42항에 있어서, 숙주 세포가 CD47-양성 숙주 세포인, 조제물.
  44. 장애를 갖는 인간 환자를 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항의 재조합 렌티바이러스 벡터 조제물을 인간 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  45. 제44항에 있어서, 조제물이 인간 환자에게 전신 투여되는, 방법.
  46. 제44항 또는 제45항에 있어서, 조제물이 정맥내 투여되는, 방법.
  47. 제44항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 장애가 출혈 장애인, 방법.
  48. 제47항에 있어서, 출혈 장애가 혈우병 A 또는 혈우병 B인, 방법.
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